אנטי קריספר
תהליך גילוי

מערכות CRISPR-Cas הן בעלות יכולת הסתגלות גבוהה ואזורי CRISPR נפוצים מאוד בגנומים של חיידקים וארכיאונים, דבר המעיד על כך שהמערכות האלו הן ככל הנראה היעילות ביותר להתמודדות עם חדירה של חומר גנטי זר לחיידק. לפני גילוי גני האנטי קריספר, הדרך היחידה שהייתה מוכרת למדע להתמודדות של הפאג'ים עם מערכות אלו הייתה מוטציות נקודתיות ואירועי רקומבינציה (שחלוף). מוטציות נקודתיות הן אירועים מיוחדים וחריגים שתדירותם נמוכה, אשר מתקבעים לאורך האבולוציה רק אם הם מקנים יתרון אבולוציוני, והן אפשרו לפאג'ים לבצע הדבקה מוצלחת למרות המצאות מערכות ה-CRISPR-Cas בחיידקים.
אנטי-קריספר התגלה לראשונה בפסאודומונס אארוגינוזה (Pseudomonas aeruginosa) בעקבות מחקר של מערכת I-F CRISPR-Cas. בניסוי לקחו שלושה פאג'ים רגישים למערכות CRISPR ורצו לבדוק את יעילות יצירת רובד נגיפי (פלאק), המהווה מדד למוות של חיידקים, על ידי הפאג'ים. הניסוי הראה במפתיע כי אחד מזני הפאג'ים הליזוגניים של הפסאודומונס אארוגינוזה, PA14(JBD30), הצליח לגדול. החוקרים ניסו להבין מה איפשר לאותם פאג'ים לגדול למרות מערכת הקריספר והגיעו למסקנה כי גנים המקודדים על-ידי הפאג'ים גרמו להשבתת מערכת ה-CRISPR-Cas של החיידק.
בשלב הראשון נמצאו חמישה חלבונים שונים שמשביתים את מערכת CRISPR-Cas מסוג I-F והם: AcrF1, AcrF2, AcrF3, AcrF4 ו-AcrF5. שמות חלבוני האנטי קריספר נקבעים על פי המערכת אותה הם מעכבים ועל פי סדר הגילוי שלהם. מאחר שחמשת החלבונים מעכבים מערכת מסוג I-F הם קיבלו את התחילית AcrF והמספר של כל אחד מהם נקבע בהתאם לסדר גילויים. על ידי בדיקה של חמשת גני האנטי קריספר האלו שעברו אינטגרציה לתוך גנום ה-PA14 בעקבות התקפת פאג', הראו כי ביטוי גנים אלו לא גרם לשינוי ברמת הביטוי של מערכת ה-CRISPR. השערה זו חוזקה על ידי בדיקת PCR שבה נבדקה הימצאותם של גני cas3 ו-csy3. מניסויים אלו הסיקו כי גני האנטי קריספר פועלים רק לאחר הביטוי של רכיבי מערכת ה-CRISPR.
גני האנטי קריספר מהווים הסבר אפשרי להמשך פעילות הפאג'ים ותקיפת החיידקים על-אף קיום מערכות ה-CRISPR-Cas. יתר על כן, נראה כי בעקבות השוני הקיים בין גני אנטי קריספר נוצרו גם מגוון רחב של מערכות CRISPR-Cas לאורך האבולוציה, ולעיתים אף קיימות מספר מערכות שונות בחיידק אחד. כלומר, מדובר בתהליך של קו-אבולוציה המתבססת על מרוץ חימוש בין יצירת מגוון גני אנטי קריספר לבין יצירות מערכות ההגנה השונות של החיידקים.
לאחר מחקר נוסף, התגלו עוד ארבע משפחות שונות של חלבונים קטנים יותר, AcrE1, AcrE2, AcrE3 ו-AcrE4, והראו כי הם מעכבים מערכות CRISPR-Cas מסוג I-E של פסאודומונס אארוגינוזה. הגנים המקודדים את ארבעת חלבונים אלו נגד מערכות מסוג I-E סמוכים על הגנום הנגיפי לאלו המקודדים את החלבונים נגד מערכת מסוג I-F.
תשעת הגנים שזוהו לא הכילו מוטיב רצפי שיכל היה להקל במציאת גני אנטי קריספר דומים או משפחות נוספות. חוקרים גילו כי פאג'ים שהכילו קידוד בגנום לגני אנטי קריספר הכילו בקר שעתוק שנקרא אנטי קריספר associated 1 (Aca1), בסמיכות לגנים של אנטי קריספר. על הקשר בין הגנים הללו העיד גם הממצא כי פאג'ים שלא הכילו כלל גני אנטי קריספר לא קודדו כלל ל-Aca1. שני החלקים האלו, גני אנטי קריספר ו-aca1 מהווים אופרון, כאשר חלבון הבקרה Aca שולט בביטוי של אנטי קריספר ושל גני aca כדי להבטיח פעילות אופטימלית במהלך מעגל ההדבקה של הפאג'. מחקרים ביואינפורמטיים שהתמקדו בחקר גנים בשיטת "חיזוי על פי אסוציאציה" (guilt-by-association), זיהו עוד גני אנטי קריספר בהתבסס על מיקומם בגנום – בקרבה לגנים המקודדים לחלבון הרגולטורי Aca1 באלמנטים גנטיים ניידים. בעקבות כך זוהו גנים הומולוגיים שחשבו שהם אנטי קריספר שהיו ממוקמים בסמיכות לגנים אחרים שהיו שונים מאלו של Aca1 מה שהוביל לגילוי משפחת החלבונים Aca2. כך זוהו עוד חמש משפחות נוספות מתוך קבוצת המערכות מסוג I-F (AcrF6, AcrF7, AcrF8, AcrF9 ו-AcrF10).
מערכות ה-CRISPR-Cas9 נמצאות כיום בשימוש נרחב בתחומי הביוטכנולוגיה והרפואה עבור עריכה גנטית. על כן הייתה חשיבות גדולה במיוחד לגילויי חלבוני אנטי קריספר אלו, שכן הם יכולים לשמש לבקרה על החלבונים אשר מבצעים את העריכה הגנטית וכך לייעל ולבקר אותה. על-ידי שימוש נוסף בכלים ביואינפורמטיים ושיטת ה"חיזוי על פי אסוציאציה" זוהו המעכבים הראשונים של מערכות CRISPR-Cas מסוג II. נמצאו שלוש משפחות של חלבונים קטנים (AcrIIC1, AcrIIC2 ו-AcrIIC3) החוסמים את פעילות מערכת CRISPR-Cas9 מסוג II-C ב-Neisseria meningitidis. כמו כן, נעשה שימוש בגישה ביואינפורמטית חלופית לגילוי מעכבים של מערכות CRISPR-Cas9 מסוג II-A. במחקר זוהו זני חיידקים שמקודדים מערכות CRISPR-Cas9 מסוג II-A שלכאורה תוקפים את הגנום שלהם עצמם. צורת גילוי נוספת נראית שיטת הזיהוי עצמי (self-targeting) לגילוי גנים חדשים כמועמדים לגני anti-CRISPR. השיטה נשענת על ההנחה שמערכת CRISPR-Cas פעילה ו-CRISPR RNA (crRNA) שמכוונות לגנום המארח לא יכולות להתקיים במקביל מבלי לגרום לזיהוי עצמי ומוות תאים. זאת מאחר שחלבוני anti-CRISPR שמקודדים באלמנטים גנטיים ניידים ומבוטאים באותו התא יכולים למנוע מוות של תאים שנגרם על ידי זיהוי עצמי על ידי השבתת מערכת CRISPR מה שמאפשר התמודדות עם מקרים של זיהוי. על ידי שימוש בשיטה הזו התגלו עוד ארבע משפחות חדשות של חלבוני אנטי קריספר (AcrIIA1, AcrIIA2, AcrIIA3 ו-AcrIIA4) המעכבים את מערכת ה-CRISPR-Cas מסוג II-A של Listeria monocytogenes. שניים מחלבוני האנטי קריספר, crIIA2 ו-AcrIIA4, נמצאו כיעילים כנגד חלבון CRISPR-Cas9 מסוג II-A של Streptococcus pyogenes, חלבון זה הוא החלבון העיקרי המשמש לעריכה גנטית.