מרי, מלכת הסקוטים
השיבה לסקוטלנד ונישואיה ללורד דרנלי > מרי והלורד דרנלי

מרי פגשה לראשונה את הנרי סטיוארט, לורד דרנלי, בפברואר 1561, זמן קצר לאחר מות בעלה הראשון. דרנלי היה בן דודה למחצה, יליד אנגליה, וצאצא של משפחת אצולה סקוטית ואנגלית. הוריו שלחו אותו לצרפת כביכול כדי להביע תנחומים, אך חשבו גם על אפשרות של נישואים בין בנם למרי. מרי התאהבה במהירות בדרנלי, שהיה גבוה ויפה תואר. למרות התנגדויות מצד חצר המלכות ומהמלכה אליזבת הראשונה, הם התחתנו בארמון הולירוד ב-29 ביולי. הנישואין עוררו מחלוקת רבה, בין היתר בגלל היותם בני דודים ראשונים וקתולים, ללא אישור מהאפיפיור. המדינאים האנגלים ויליאם ססיל והרוזן מלסטר פעלו להשגת אישורה של המלכה אליזבת לנסיעתו של דרנלי מסקוטלנד לאנגליה, שם שהה. אף על פי שיועציהם תמכו באיחוד בין השניים, אליזבת הראשונה חשה מאוימת מנישואים אלו, שכן הן מרי והן דרנלי היו צאצאים של מרגרט טיודור, דודתה של מרי, ולפיכך טענו שניהם לכתר האנגלי. לפיכך ילדיהם היו עתידים לרשת תביעה זו. עם זאת נראה כי נחישותה של מרי להינשא לדרנלי נבעה מרגש אישי ולא משיקולים פוליטיים. השגריר האנגלי, ניקולס ת'רוקמוטון, אף העיר כי "אומרים שהיא בוודאי מכושפת" וכי ניתן יהיה למנוע את הנישואים רק "באלימות". איחוד זה עורר את זעמה של אליזבת אשר סברה כי נישואים אלו לא היו צריכים להתקיים ללא אישורה, שכן דרנלי היה בן דודהּ ונתין אנגלי.
נישואיה של מרי לדרנלי הובילו את אחיה למחצה, הרוזן ממוריי, להצטרף למרד נרחב יחד עם לורדים פרוטסטנטים נוספים, ביניהם הלורד ארצ׳יבולד קמפבל. ב-26 באוגוסט 1565 עזבה מרי את אדינבורו כדי להתעמת עם המורדים. ב-30 באוגוסט נכנס מוריי לעיר, אך נטש אותה זמן קצר לאחר מכן. מרי שבה לעיר בחודש שלאחר מכן כדי לגייס חיילים נוספים. במהלך אירוע שנודע כ"Chaseabout Raid", מרי וכוחותיה, יחד עם מוריי והלורדים המורדים, נעו ברחבי סקוטלנד ללא עימות צבאי ישיר. מעמדה של מרי התחזק וכן שובו של ג'יימס הפברן, רוזן בות'וול מגלותו בצרפת. מוריי, שלא הצליח לגייס תמיכה מספקת, נמלט מאוחר יותר באוקטובר לאנגליה וביקש בה מקלט. מרי הרחיבה את המועצה הסודית שלה וכללה בה קתולים נוספים.
נישואיה של מרי, מלכת הסקוטים, להנרי סטיוארט, לורד דרנלי, היו רצופי קשיים מראשיתם. דרנלי התגלה כאדם יהיר וקפריזי, והיחסים בין בני הזוג התדרדרו במהירות. הוא עורר את חמת האצולה הסקוטית, והיה מעורב במספר תככים פוליטיים. הוא לא הסתפק במעמדו כבן זוגה של המלכה ודרש את "כתר הנישואין(אנ') ", אשר היה מעניק לו מעמד של שליט משותף בסקוטלנד ואף את הזכות לרשת את כס המלכות הסקוטי במקרה שיאריך ימים אחרי מרי. מרי סירבה לדרישתו, ובעקבות זאת החלו נישואיהם להתערער, אף על פי שעד אוקטובר 1565 נודע כי מרי בהיריון. דרנלי קינא בידידותה של מרי עם איש אמונה וסודה, דייוויד ריציו, אשר היו שמועות כי הוא ומרי ניהלו פרשת אהבים והוא אביו האמיתי של בנה. במרץ 1566, הצטרף דרנלי לקנוניה חשאית עם אצילים פרוטסטנטים. ב-9 במרץ, קבוצת קושרים, בליווי דרנלי, רצחה בדקירות סכין את ריצ'יו לעיני מרי ההרה, בעת סעודת ערב בארמון הולירוד. בליל ה-11–12 במרץ נמלטו דרנלי ומרי מהארמון. הלורדים המורדים לשעבר הושבו למועצה הסודית.
מרי ילדה את בנה היחיד, ג'יימס, ב-19 ביוני 1566 בטירת אדינבורו. הוא הוטבל כ"צ'ארלס ג'יימס" ב-17 בדצמבר 1566 בטקס קתולי שנערך בטירת סטירלינג. סנדקיו של ג'יימס היו שארל התשיעי, מלך צרפת, אליזבת הראשונה, מלכת אנגליה ואמנואלה פיליברטו, דוכס סבויה. רציחתו של דייוויד ריציו הובילה להידרדרות משמעותית ביחסיה עם דרנלי. מרי חלתה במחלה קשה שכללה הקאות תכופות, אובדן ראייה זמני, קשיי דיבור, פרכוסים ותקופות של אובדן הכרה. סברו כי היא על סף מוות עם זאת מצבה הבריאותי השתפר. סיבת מחלתה נותרה לא ידועה ובין האבחנות האפשריות נמנו תשישות פיזית ולחץ נפשי ופורפיריה. בפברואר 1565 עזב הנרי את לונדון לאדינבורו. בסוף ינואר 1567 שכנעה מרי את בעלה לשוב לאדינבורו. מרי נהגה לבקרו מדי יום, דבר שיצר רושם של פיוס בין השניים. בלילה שבין התשיעי בפברואר לבין העשירי בפברואר ביקרה מרי את בעלה בשעות הערב המוקדמות ולאחר מכן השתתפה בחגיגות נישואיו של אחד מאנשי ביתה. בשעות הבוקר המוקדמות אירע פיצוץ עז באחוזת שדה קירק או, אשר גרם להרס רב. דרנלי נמצא מת בגן הסמוך, ככל הנראה מחנק. על גופתו לא נמצאו סימני חנק או אלימות גלויים. בין החשודים במעורבות במותו נמנו הרוזן בות'וול וארצ'יבלד דאגלס, כומר דאגלס. עד סוף פברואר, רווחה ההערכה כי הרוזן בות'וול אחראי להתנקשות בחייו של דרנלי. לנוקס, אביו של דרנלי, דרש להעמיד את הרוזן בות'וול לדין בפני הפרלמנט הסקוטי, ומרי נענתה לדרישה. עם זאת, בקשתו של לנוקס לדחיית מועד המשפט לצורך איסוף ראיות נוספות נדחתה. בהיעדרו של לנוקס ומבלי שהוצגו ראיות כלשהן, זוכה הרוזן בות'וול לאחר משפט שנמשך שבע שעות בלבד, ב-12 באפריל. שבוע לאחר מכן, הצליח הרוזן בות'וול לשכנע מספר לורדים ובישופים לחתום על הסכם תמיכה בנישואיו למלכה. נסיבות מותו של דרנלי נותרו שנויות במחלוקת, אך רבים האשימו את מרי במעורבות ברצח. מותו של דרנלי סימן את תחילתה של נפילתה של מרי. היא הודחה מהכס הסקוטי וברחה לאנגליה, שם נכלאה על ידי אליזבת הראשונה.