HPLC
סוגי השיטות ב-HPLC > כרומטוגרפיית ניפוי על סמך גודל מולקולרי Size Exclusion Chromatography - SEC

כרומטוגרפיית ניפוי על סמך גודל מולקולרי מתוארת בספר Size Exclusion Chromatography. היא נקראת גם Gel Filtration Chromatography - GFC בעיקר בקרב מדעני מדעי החיים, ובקרב הכימאים האורגניים היא ידועה גם כ-Gel Permeation Chromatography - GPC. סוג זה של כרומטוגרפיה נועד להפריד חומרים גבוהי משקל מולקולרי, פולימרים, בעזרת עמודות - קולונות עשויות מג'ל מיוחד שמסנן אותם לפי גודלם כפי שמתואר בספר Column Handbook for Size Exclusion Chromatography. עמודה קלאסית טיפוסית היא בעלת אורך צינור של 25–30 ס"מ וקוטרו כ־3-10 מ"מ ארוזה בגרגרים בקוטר של 5–10 מיקרומטר, עשויים מג'ל מיוחד בעל נקבוביות גדולות מאוד. אריזת הקולונות משמשת כמעין נפה להבחנה בין מולקולות על פי גודלן. קוטר נקבוביות האריזה קובע איזה תחום משקלים מולקולריים תפריד הקולונה. כאשר החומרים בעלי המשקל המולקולרי הגבוה יותר לא מצליחים לחלחל דרך החלקיקים של אריזת העמודה הכרומטוגרפית, הם עוקפים את הגרגירים שבה וזורמים עם הפאזה הנעה שבין הגרגירים ויוצאים בזמן קצר יותר מאשר אלה שמצליחים לחלחל אל תוך חלקיקי האריזה ולעבור דרך ארוכה יותר. לכן סדר זמני היציאה הוא שקודם יוצאים החומרים הגדולים ואחריהם הקטנים יותר לפי סדר המשקלים המולקולריים.
כדי להרחיב את תחום המשקלים המולקולריים הניתנים לאנליזה מנמוכים מאוד, למשל כמה אלפים בודדים, עד לגבוהים מאוד, למשל מאות אלפים, נהוג לעיתים קרובות להשתמש במערך של קולונות בעלות אריזה בנקבוביות בגדלים שונים קשורות זו לזו בטור. כאשר מדובר בפולימרים בעלי פעילות ביולוגית, בדרך כלל הפאזות הנעות הן מימיות, ואילו כאשר מדובר בפולימרים סינתטיים וחומרים פלסטיים הפאזות הנעות בדרך כלל הן אל-מימיות. בדרך כלל מטרת ההפרדה היא לקבוע משקל מולקולרי, או יותר נכון פיזור המשקל המולקולרי של המומסים (Molecular size distribution).
הגלאים בהם משתמשים הם בעיקר גלאיי מקדם שבירה: Refractive Index (RI), בשל העובדה שפולימרים ביולוגיים כמו פוליסכרידים, או פולימרים אורגניים תעשייתיים הם חסרי בליעת אור בתחום ה-UV, אך נותנים תגובה טובה ורגישה מספיק בגלאי מקדם שבירה. כדי לגלות ולכמת חומרים פולימריים בעזרת גלאי מקדם השבירה, צריך להתקיים התנאי הבא: חייב להיות הפרש משמעותי בין ערך מקדם השבירה RI של הפאזה הנעה הנקייה לבין ערך מקדם השבירה RI של החומר המומס בתוך אותה הפאזה הנעה. כלומר ערך ה- ΔRI בין תמיסת החומר בפאזה הנעה לבין הפאזה הנעה הנקייה צריך להיות גדול מספיק כדי שהגלאי יבחין בחומר ויציג אותו כפיק בכרומטוגרמה.
כדי לקבוע פיזור משקל מולקולרי של מומסים חייבים קודם לכן לכייל את המערכת בעזרת חומרים ידועים, סטנדרטים, שמשקלם המולקולרי מוגדר וידוע, כמתואר בציור המצורף כאן.
הכיול נעשה כך שבונים גרף כיול שמקשר את זמני ההשהיה של קבוצת הסטנדרטים למשקלם המולקולרי. לאחר שקשר זה ידוע, ניתן להזריק למערכת חומרים שאינם ידועים ולקבוע את משקלם המולקולרי לפי זמני ההשהיה שלהם.
התשובה הסופית לאפיון משקלים מולקולריים של פולימרים ניתנת בדרך כלל ב"פיזור המשקל המולקולרי" שהוא בעצם פונקציה המתארת את הכמות היחסית של כל משקל מולקולרי, והיא מוצגת כמערך של המומנטים של הפיק המתאר את הפיזור הזה:
1st Moment = Mn (Number Average)
2nd Moment = Mw (Weight Average)
3rd Moment = Mz (Z Average)
4th Moment = Mz+1 (Z+1 Average)
Mw/Mn = Polydispersity
ככל שערך ה-Polydispersity גבוה יותר מ־1 החומר מורכב מאוכלוסייה בעלת פיזור גדול יותר של משקלים מולקולריים. המומנטים האלה קשורים גם לתכונות פיזיקליות של הפולימרים.
מאחר שזמני ההשהיה במכשיר כזה חייבים להימדד במדויק, כי מחשבים מהם משקל מולקולרי, יש חשיבות רבה מאוד לרמת הביצועים של מכשיר ה-HPLC בשמירה על קצב זרימה קבוע ומדויק. זמני ההשהיה מתייחסים ל-log MW, כלומר, בתנאים מסוימים שינוי ב־1% של קצב הזרימה יעלה או יוריד עד כ־10% מהמשקל המולקולרי של המומס. אחת הדרכים המקובלות להתמודד עם אי-דיוקים של משאבות ה-HPLC בעבודה עם GPC היא שימוש בחומרי ייחוס שנותנים פיק ייחוס (Reference Peak). בוחרים חומר שמופיע בסופה של הכרומטוגרמה ונותן אפשרות לנרמול של זמן ההשהיה. איפוס הגלאי נעשה על ידי מדידת הסיגנל שלו כאשר הפאזה הנעה ממלאת את שני התאים שבו, של הייחוס ושל הדוגמה. ואז, כאשר מגיע מומס אל תא הזרימה של הדוגמה הוא גורם לשינוי במקדם השבירה של האור העובר דרכו, וגורם להופעת סיגנל חיובי או שלילי, תלוי אם הוא מעלה או מוריד את מקדם השבירה. הסיגנל הזה הוא פרופורציונלי לריכוז הדוגמה. מאחר שמקדם השבירה רגיש ביותר לטמפרטורה חשוב מאוד להקפיד שהגלאי מצויד באמצעים שונים לשמירה טובה של טמפרטורות תאי הזרימה. בדרך כלל אחת הסיבות הנפוצות ביותר לחוסר היציבות של האותות בגלאים אלה (שמתבטא ב-Noise and drift של קו הבסיס - baseline) היא המבנה הלוקה בחסר של אמצעי השמירה על הטמפרטורה. כמו כן יש לוודא שהקולונות נמצאות בתנור השומר על הטמפרטורה, ומצויד באלמנט מחליף חום כדי שהתהליך כולו יתרחש בטמפרטורה אחידה.
המשקלים המולקולריים המתקבלים הם יחסיים בלבד לפי ההרכב הכימי של הסטנדרטים בהם השתמשו לכיול. לשם קבלת משקלים מולקולריים מוחלטים יש להשתמש בשיטות אפיון וגילוי נוספות כמו מד-צמיגות או מד פיזור אור, כפי שמתואר בספר Light Scattering, Size Exclusion Chromatography and Asymmetric Flow Field Flow Fractionation: Powerful Tools for the Characterization of Polymers, Proteins and Nanoparticles. יש לזכור שאם מחברים כמה גלאים בטור חייבים להביא בחשבון את הזמן שנדרש לחומר הנבדק לעבור ביניהם, מה שמכונה Delay - עיכוב.