ריצוף RNA
שיטות > הכנת ספריות

השלבים הכלליים של הכנת ספריית DNA משלים (cDNA) לצורך ריצוף מתוארים להלן, אם כי לעיתים קרובות יש הבדלים בין פלטפורמות.
בידוד ה-RNA – מבודדים את ה-RNA מרקמות ומערבבים אותו עם דאוקסירובונוקלאז (אנ') (DNase).‏ DNase מפחית את כמות ה-DNA הגנומי. כמות ה-RNA שהתפרק נמדדת באמצעות אלקטרופורזה בג'ל ובנימיות (אנ'), ומשמשת לחישוב 'מספר שלמוּת ה-RNA' (אנ') של הדגימה. מדד איכות זה של ה-RNA והכמות ההתחלתית הכוללת של ה-RNA נלקחים בחשבון במהלך השלבים הבאים: הכנת הספרייה, הריצוף והניתוח.
בחירה או הסרה של RNA – כדי לנתח את האותות שמעוניינים לבדוק, ניתן להשאיר את ה-RNA שבודַד כפי שהוא, לסנן מתוכו RNA בעל זנבות 3' שעברו פוליאדנילציה (poly(A)) כדי לקבל mRNA בלבד, עם כמה שפחות RNA ריבוזומלי (rRNA), ו/או לסנן מתוכו RNA שנקשר לרצפים ספציפיים (ראו את טבלת השיטות לבחירה והסרה של RNA, להלן). RNA עם זנבות poly(A) ‏ 3' כולל בעיקר רצפים בוגרים, מעובדים, מקודדים. בחירה של poly(A) מתבצעת על ידי ערבוב ה-RNA עם אוליגומרים של poly(T) המחוברים באופן קוולנטי למצע, בדרך כלל חרוזים מגנטיים. לבחירה של poly(A) יש מגבלות חשובות בזיהוי ביוטיפים של RNA. יש הרבה ביוטיפים של RNA שזנבותיהם לא עברו פוליאדנילציה, כולל הרבה תעתוקים של RNA שאינו מקודד ושל RNA שמקודד חלבוני ליבת היסטון, או שהבקרה שלהם היא באמצעות אורך זנב ה-poly(A) שלהם (למשל, ציטוקינים), ולכן הם עלולים לא להתגלות לאחר הבחירה של poly(A). יתר על כן, בחירה של poly(A) עלולה לגרום להטיה מוגברת כלפי 3', במיוחד עם RNA באיכות נמוכה יותר. ניתן להימנע ממגבלות אלו באמצעות הסרה של RNA ריבוזומלי (rRNA), המהווה בדרך כלל למעלה מ-90% מה-RNA בתא. הן השלב של העשרת ה-poly(A) והן השלב של הסרת ה-RNA הריבוזומלי הם עתירי עבודה ועלולים להכניס הטיות, ולכן פותחו גישות פשוטות יותר כדי להימנע מהשלבים הללו. כאשר מעוניינים לבדוק רצפי RNA קטנים, כגון miRNA, ניתן להמשיך ולבודד אותם על בסיס גודל בעזרת ג'לים לסינון (exclusion gels), חרוזים מגנטיים או ערכות מסחריות.
סינתוז cDNA – מבצעים תעתוק לאחור של ה-RNA ל-cDNA, הן מכיוון ש-DNA הוא יציב יותר והן כדי לאפשר הגברה (תוך שימוש ב-DNA פולימראז) ולמנף טכנולוגיית ריצוף DNA בוגרת יותר. הגברה לאחר תעתוק לאחור גורמת לאובדן הגדיליוּת (strandedness) של הרצפים, כלומר אובדן המידע האם מקורה של מולקולת ה-cDNA הוא בגדיל הקָרִיא או בגדיל המוּל-קָרִיא של ה-DNA. ניתן להימנע מאובדן הגדיליות באמצעות תיוג כימי או באמצעות ריצוף מולקולה בודדת. מבצעים חלוקה למקטעים ובחירה לפי גודל כדי להגיע למצב שכל הרצפים הם באורך המתאים למכונת הריצוף. ה-RNA, ה-cDNA, או שניהם מחולקים למקטעים בעזרת אנזימים, סוניקציה (אנ') או נבולייזרים (nebulizers). חלוקת ה-RNA למקטעים מפחיתה את הטיית ה-5' של תעתוק לאחור באופן אקראי ואת ההשפעה של אתרי ההיקשרות של התחלים, אך יש לה חיסרון – קצוות ה-5' וה-3' מומרים ל-DNA בצורה פחות יעילה. לאחר החלוקה למקטעים מבצעים בחירה לפי גודל, שבה או שמסירים רצפים קטנים או שבוחרים טווח צר של אורכי מקטעים. מכיוון שמולקולות RNA קטנות כמו miRNA הולכות לאיבוד, מנתחים אותן באופן עצמאי. ניתן לאנדקס את ה-cDNA של כל ניסוי באמצעות הקסאמר או אוקטמר שישמש כברקוד, כדי שיהיה אפשר לאגד את הניסויים הללו לנתיב אחד של ריצוף מרובה (multiplexed sequencing).
| אסטרטגיה | סוג ה-RNA הנפוץ ביותר | תכולת ה-RNA הריבוזומלי | תכולת RNA לא מעובד | שיטת בידוד |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| RNA כולל | כל הסוגים | גבוהה | גבוהה | אין |
| בחירת PolyA | מקודד | נמוכה | נמוכה | היברידיזציה (אנ') עם אוליגומרים של poly(dT) |
| הסרת rRNA | מקודד, לא מקודד | נמוכה | גבוהה | הסרת אוליגומרים משלימים ל-rRNA |
| לכידת RNA | הסוג המבוקש | נמוכה | בינונית | היברידיזציה עם גלאים משלימים לתעתיקים המבוקשים |