ציטראט סינתאז
מנגנון

| 0 | 1 | 2 |
| --- | --- | --- |

מימין לשמאל: חומצה ציטרית, אוקסלואצטט ואצטיל קואנזים A.
ציטראט סינתאז הוא בין האנזימים הספורים היכולים ליצור באופן ישיר קשר פחמן-פחמן בהיעדרם של יוני מתכת המשמשים כקו-פקטורים.
ציטראט סינתאז מקטלז את תגובת הדחיסה של שייר האצטט בעל 2 הפחמנים ממולקולת האצטיל קואנזים A עם מולקולת אוקסלואצטט בעלת 4 פחמנים, ליצירת ציטראט בעל 6 פחמנים. משוואת התגובה היא:
 Acetyl-CoA+oxaloacetate+H_{2}O\leftrightharpoons citrate+CoenzymeA
הסביבה של הציטראט והאוקסלואצטט (בתוך האנזים) ראויה לציון, משום שהם מוקפים לחלוטין (ובשלושה ממדים) במולקולות פולריות וטעונות. הסובסטרט, בין אם זה אוקסלואצטט או ציטראט, יוצר קשרי מימן או גשרי מלח עם שלושה שיירי ארגינין (329, 401 ו-421) ועם שני שיירי היסטידין (238 ו-320). גם His274 נוכח, ויוצר קשר מימן עם מולקולת חמצן (O-3) של הציטראט. אמנם המטען המדויק בו מוקף הסובסטרט אינו ידוע, אך ברור כי על הסובסטרט להיות מוקף במטען חיובי גדול כך שהאזור שמסביב לפחמן מס' 3 (C-3) של ציטראט או אוקסלואצטט יהיה פולרי במיוחד; דבר זה יגרום למטען חלקי חיובי על פחמן מס' 3, ולרגישות למתקפה נוקליאופילית (ראו בהמשך).
באשר לקואנזים A, קיימים באנזים 3 שיירי ארגינין (164, 324 ו-64) המשמשים כליגנדים עבור שלוש קבוצות הפוספט שלו; ראויה לציון גם כן העובדה, שלבד מאינטראקציות ספציפיות אלו - יתר האינטראקציות בין קואנזים A לציטראט סינתאז נעשות כולן על ידי קשרי מימן בין קואנזים A לשרשרת המרכזית של האנזים ולא על ידי שיירים צדדיים, דבר שאינו נפוץ. מלבד אטום הגופרית המרכיב את קבוצת התיול שלו, אף חלק מקואנזים A לא יוצר קשר עם הסובסטרטים האחרים במהלך הריאקציה.
השיירים המופיעים בשלשה הקטליטית מקטלזים את יצירת הציטראט מאצטיל CoA ומאוקסלואצטט דרך תגובת דחיסה אלדולית.
ניתן לחלק את הריאקציה ל-3 שלבים:
אנוליזיציה
תגובת דחיסה
הידרוליזה
בשלב הראשון מתרחשת תגובת אנוליזציה, במהלכה נוצר תוצר ביניים אנול, המכיל קשר כפול בין פחמן אלפא לפחמן בטא (במקום הקשר הכפול של קבוצת הקרבוניל) וכן קבוצת אלכוהול (OHׂׂ). בשלב זה השייר His274 מתפקד כחומצה (קרי: מוסר פרוטון) ואילו השייר Asp375 מתפקד כבסיס (קרי: מקבל פרוטון); אטום החמצן שבקבוצת הקרבוניל של האצטיל קואנזים A עובר פרוטונציה (הוספת פרוטון) על ידי שייר ההיסטידין, בו בזמן שקבוצת המתיל של האצטיל קואנזים A עוברת דה-פרוטונציה (שחרור פרוטון) על ידי שייר האספרטט. באופן זה נוצר תוצר הביניים אנול, שכן המתקפה של האספרטט יוצרת קשר כפול בין פחמן אלפא לפחמן בטא, ואילו הפרוטונוציה שעבר אטום החמצן של הקרובניל יצרה קבוצת הידרוקסיל (ראו באיור משמאל). האנזים למעשה יוצר בשלב זה תוצר ביניים נייטרלי ( {\ce {H2C=C(OH)-SCoA}}), מבלי לבזבז אנרגיה וליצור תוצר ביניים בעל מטען כמו אנולט למשל. הגאומטריה של שלב זה מסייעת לכך, שכן מעבר הפרוטון משייר ההיסטידין לאטום החמצן של הקרבוניל מתרחש בקו ישר באמצעות האורביטלים הבלתי קושרים של אטום החמצן ללא הפרעה של קשרי פאי של קבוצות אחרות במולקולה. בנוסף, קשר ה-C-H המשתתף בריאקציה עם שייר האספרטט (תורם את הפרוטון ויוצר קשר כפול) מסודר בצורה אופטימלית באופן שהוא כמעט אנכי לקבוצת האצטיל; כך, כאשר הקשר נשבר, זוג האלקטרונים שנותר על קבוצת האצטיל יכול להיות מצומד לענן אלקטרוני הפאי של הקרבוניל וכך נוצר קשר כפול בין פחמן האלפא לפחמן הבטא.
בשלב השני מתרחשת תגובת דחיסה, ובמהלכה נוצר תוצר הביניים ציטרואיל קואנזים A. בשלב זה השייר His320 הוא המשמש כחומצה, כך שאטום החמצן שבקבוצת הקרבוניל של האוקסלואצטט עובר פרוטונוציה על ידו. כמו בשלב הראשון, גם כאן אטום החמצן נמצא בעמדה מדויקת המאפשרת מעבר בקו ישר של הפרוטון אל האורביטלים הבלתי קושרים שלו. השייר His274 משמש הפעם כבסיס, וחנקן האפסילון שלו תוקף את קבוצת ההידרוקסיל של אצטיל קואנזים A ולוקח בחזרה את הפרוטון שתרם בשלב האנוליזציה באופן שנוצר אנולט; האנולט יוצר התקפה נוקלאופילית על הפחמן הקרבונילי של האוקסלואצטט, אשר בתורו גורם לדה-פרוטונוציה של חנקן האפסילון של His320 (שכאמור משמש בשלב זה כחומצה). כתוצאה מתגובת הסיפוח הנוקליאופילית נוצר תוצר הביניים ציטרואיל קואנזים A.
בשלב השלישי והאחרון של הריאקציה מתרחשת הידרוליזה של קבוצת התיאו-אסטר של ציטרואיל קואנזים A, אם כי הכימיה של שלב זה לא נתבררה די צרכה. על פי שיטה אחת, מולקולת מים עוברת דה-פרוטונציה על ידי מולקולה אחרת המשמשת כבסיס וזהותה לא ברורה, וזוג אלקטרונים בלתי קושרים של אחד מאטומי החמצן של המים יוצר התקפה נוקליאופילית על הפחמן הקרבונילי של ציטרואיל קואנזים A. בה בעת, חנקן האפסילון של His274 תוקף את קבוצת ההידרוקסיל של ציטרואיל קואנזים A ולוקח הפרוטון. מתקבל תוצר ביניים טטראהדרלי, ולבסוף פליטה של מולקולת S-CoA שעוברת פרוטונוציה לאחר מכן והופכת ל-SH-CoA (הצורה הרגילה של קואנזים A, עם קבוצת תיול); האנזים משחרר את התוצר הסופי - ציטראט (שלב 4 בסכימה), ושב למצבו הסגור. שיטה אחרת גורסת כי בשלב זה משתתף השייר Asp375, אשר יוצר קשר אנהידרידי שגורם לשחרור הקואנזים A, ולאחריו מתרחשת הידרוליזה של הקשר האנהידרידי לשחרור ציטראט
על אף שהשלבים האינדיבידואליים בריאקציה בכללותה שונים מאוד אחד מהשני, הקונפורמציה של האנזים זהה בכולן. כלומר, בקונפורמציה אחת בלבד מבצע ציטראט סינתאז קטליזה של כל השלבים השונים בריאקציה, באופן שנדרשים שינויים מינוריים במיקומם של מספר אטומים, רובם של הסובסטרט.