HPLC
עקרון פעולה

הקביעה הכמותית והזיהוי של החומרים הנבדקים נעשית כאשר הם המוכנסים אל המכשיר כדוגמאות נוזליות, מופרדים, ואז מתגלים בעזרת גלאים ל-HPLC, שעוזרים לזיהוי שלהם. הדיווח על כך נעשה בצורה ממוחשבת. התהליך המתרחש הוא כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה מאוד. הדוגמאות עם החומרים הנבדקים מוכנסות לעמדת הזרקה, משם הן מועברות אל תוך תווך זורם שמעביר אותם אל עמודה גלילית (קולונה Column אנ') הארוזה בחלקיקים נייחים שמרכיבים את הפאזה הנייחת (Stationary Phase). קוטר החלקיקים האלה נע בין כ-2 מיקרומטר עד כ־10-20 מיקרומטר, תלוי במטרת העבודה. התווך הזורם נקרא פאזה הנעה (Mobile phase), שהיא תמיסה נוזלית בהרכבים כימיים שונים. הפאזה הנעה זורמת כל הזמן דרך כל מרכיבי המערכת הכרומטוגרפיית וההרכב שלה משפיע על מידת הנדידה השונה של כל אחד ממרכיבי הדוגמה דרך העמודה, ובכך היא מסייעת להפריד ביניהם. גם ההרכב הכימי של הפאזה הנייחת, כלומר חלקיקי העמודה הכרומטוגרפית, משפיע על מידת ההשהייה של כל מרכיב ומרכיב בדוגמה הנבדקת. לאחר ההפרדה החומרים מופיעים בזמנים שונים זה מזה בגלאים הייעודיים שמאפשרים את חישוב הכמות שלהם וקביעת הזהות שלהם, כפי שמתואר בספר Liquid chromatography detectors.
כפי שניתן לראות בציור בו יש סכימה של המערכת הכרומטוגרפית, המכשיר בנוי ממשאבה ששואבת תערובת ממסים בהרכב ידוע ומדויק של הפאזה הנעה, שזורמת ללא הפסק דרך כל מרכיבי המערכת. קצבי הזרימה ב-HPLC אנליטי הנפוץ ביותר הם בסביבות 1 מ"ל לדקה, ויש גם שימושים אחרים במיקרו/ננו HPLC בקצבי זרימה נמוכים מזה בהרבה (מיקרוליטרים לדקה). כאשר המכשיר משמש לניקוי חומרים הוא נקרא HPLC פרפרטיבי - Preparative ואז הוא יכול להגיע לקצבי זרימה של ליטרים לדקה. הפאזה הנעה הנדחפת על ידי המשאבה, עוברת קודם כל דרך מערכת הדגימה וההזרקה, שדוגֶמת נפח מדויק מאוד מהדוגמה, ואז היא מעבירה אותו אל העמודה הכרומטוגרפיית (הקולונה) הארוזה בגרגרי הפאזה הנייחת ובדרך כלל נמצאת בתוך תנור ששומר על הטמפרטורה שלה קבועה. נדרשים לחצים גבוהים מאוד במשאבה כדי להזרים את הפאזה הנעה דרך העמודה הכרומטורפית, מכאן שם הטכניקה. מרכיבי הדוגמה מתעכבים בתוך העמודה בקצב שונה כל אחד לפי המבנה הכימי שלו, דבר שגורם להפרדתם זה מזה. משם הם מועברים על ידי הפאזה הנעה אל הגלאי, שמגלה אותם ועוקב אחרי יציאתם מבחינת זמנים וכמויות שלהם.
תמונה של מערכת HPLC אמיתית נפוצה, קיימת ועובדת, על פירוט חלקיה נמצאת בציור המצורף כאן.
הכימיה של ההפרדה מתוארת בספר HPLC columns: theory, technology, and practice. החומר ממנו בנויה הפאזה הנייחת נקרא גם 'מצע' (support). בין שתי הפאזות האלה יש הבדלים בתכונות הפיזיקליות-כימיות (לדוגמה, באופן הנפוץ ביותר הפאזה הנייחת היא הידרופובית והפאזה הנעה היא הידרופילית) המונעים מהן להתערבב. הפאזה הנעה זורמת כל הזמן ללא הפסקה דרך כל מרכיבי המערכת, כולל גם הדוגם והגלאי. הדוגמה שעומדת לעבור אנליזה מוכנסת לדוגם, וממנו עוברת מנה קבועה ממנה אל זרם הפאזה הנעה היישר אל העמודה הכרומטוגרפית. בתוך העמודה כל אחד ממרכיבי התערובת נמשך לפאזה הנחה בעוצמה שונה עקב שוני בתכונות הפיזיקליות או הכימיות שלו. לכן הפאזה הנחה מעכבת כל מרכיב במידה שונה על ידי הצמדה זמנית שלו אליה, מכאן שלכל מרכיב מהירות שונה, ולכן זמן השהות שלו במערכת שונה. כלומר, מרכיבי התערובת יוצאים מהקולונה בזמנים שונים, ובכך מופרדים.
בקצה הקולונה יש צינור שמוביל אל מתקן שנקרא גלאי (בגרסה הנפוצה בשימוש הגלאי הוא ספקטרופוטומטר הפועל באורכי הגל של אור נראה ואור אולטרא סגולי) שתפקידו לעקוב אחרי כל מרכיב ומרכיב, ולאתר את רגע היציאה שלו, ובעזרת שעון פנימי. המערכת מציינת את זמן השהות של החומר בקולונה, והוא נקרא זמן השהייה Retention Time. החומרים מתגלים בצורה של שיאים - Peaks - (פיקים) בתוך גרף שנקרא כרומטוגרמה - Chromatogram. זמן יציאתו של השיא שמייצג את החומר המסוים מאפשר זיהוי ראשוני של החומר וגובהו מאפשר חישוב כמותו, כפי שניתן ללמוד מתוך הספר Quantitative analysis using chromatographic techniques.