שעון מולקולרי
כיול

במקור, ההנחה הייתה ששיעור הטעויות בהכפלת DNA הוא קבוע – לא רק בזמן, אלא גם בכל המינים ובכל חלק של הגנום. מכיוון שהאנזימים שמכפילים את ה-DNA נבדלים מעט מאוד בין מינים שונים, ההנחה נראתה הגיונית.
הנחה זו התבררה מאוחר יותר כשגויה, כיוון שהיא מתעלמת מגורמים נוספים המשפיעים על קצב השינוי. לו פולינג או צוקרקנדל היו ביולוגים אבולוציוניים במקום ביולוגים ניסויים (או במקרה של פולינג, כלל לא ביולוג), סביר להניח שטעות זו הייתה מושכת את תשומת לבם.
תחומי המחקר ביולוגיה אבולוציונית ומולקולרית היו רחוקים מדי זה מזה בתקופתם, מה שגרם לכך שההנחה השגויה נתפסה כנכונה תקופה ארוכה עד שהחלו להתברר ממדי הטעות. ככל שהראיות המולקולריות הצטברו, הנחת הקצב הקבוע הוכחה כשגויה. למרות זאת, הנחת ה-MCH מהווה קירוב טוב במקרים פרטיים רבים, וניתן לבחון את הדיוק של שעונים מולקולריים אינדיבידואליים ולעשות בהם שימוש במקרים רבים. התיקון להנחה המקורית הוא בצורך לכייל את השעון המולקולרי בכל מקרה פרטי בעזרת עדויות חומריות כגון מאובנים, לפני שניתן לבסס עליהם מסקנות חזקות. המאובנים עצמם מתוארכים על ידי תארוך רדיומטרי של מספר צמדי איזוטפים שונים.
מאז ראשית שנות התשעים של המאה ה-20 תוארו דוגמאות של שיעורים לא אחידים של אבולוציה מולקולרית. בהנחה שמדובר במקרה של הרבה טקסונים, נמצא כי אין שיעור אחיד של אבולוציה מולקולרית, אפילו לא בתקופות זמן קצרות השוואתיות מבחינה אבולוציונית. נראה כי ליסעוראים יש שעון מולקולרי שבממוצע מתקדם בחצי מהירות ביחס לציפורים אחרות, ככל הנראה בגלל זמני דור ארוכים, ולהרבה צבים יש שעון מולקולרי שמתקדם בשמינית מהירות לעומת יונקים קטנים.
סביר להניח שהשפעות של אוכלוסייה קטנה מבלבלות גם כן את הניתוח של השעון המולקולרי; לדוגמה, האבולוציה של הברדלס, שעברה 2 צווארי בקבוק של אוכלוסייה, לא ניתנת לבדיקה תוך התבססות על מודל השעון המולקולרי. חוקרים כמו איילה והאנתרופולוג ג'פרי ה. שוורץ אתגרו את היפותזת השעון המולקולרי ברמה יסודית יותר. לפי מחקרו של איילה משנת 1999, ישנם 5 גורמים המתחברים זה אל זה ומערערים את המודל הסטנדרטי של השעון המולקולרי:
זמני דור משתנים - מוטציה מתקבעת בדרך כלל רק מדור אחד לאחר. ככל שפרק הזמן הזה קצר יותר, כך יותר מוטציות מתקבעות
גודל האוכלוסייה - מלבד ההשפעות של גודל אוכלוסייה קטן, המגוון הגנטי יגיע לנקודת שפל ככל שהאוכלוסיות יגדלו כיוון שהיתרון הכשירותי של כל מוטציה בודדת יקטן
הבדלים תלויי מין בעקבות מטבוליזם שונה, אקולוגיה, היסטוריה אבולוציונית וכדומה
תפקודים מתפתחים של החלבונים המקודדים - יכולים להשתפר על ידי ניצול רצפי DNA לא מקודדים או הדגשת מוטציות שקטות
שינויים בעוצמה של הברירה הטבעית
משתמשים בשעון המולקולרי פיתחו פתרונות עוקפים תוך שימוש במספר גישות סטטיסטיות כולל טכניקות של נראות מקסימלית ומאוחר יותר במודל של חוק בייס.
בפרט, מודלים שלוקחים בחשבון שינויים בקצב לרוחב אילנות יוחסין הוצעו על מנת להשיג הערכות טובות יותר של זמן ההתפלגות ופרמטרים אחרים שניתן להעריך מקצבי ההחלפה, כגון גודל האוכלוסייה האפקטיבי (אנ'). מודלים אלה מכונים "שעונים מולקולריים רגועים".
מודלים אלו, הנשענים על מדגם של מידע הטרו-כרונומטרי מהרצף, פותחו מפילוגנזה של נגיפים ומחקרים של DNA עתיק, שני תחומים של הביולוגיה האבולוציונית בהם ניתן לדגום רצפים בקנה מידה אבולוציוני, ובכך לספק מידע מכייל נוסף על זה המסופק בדרך כלל על ידי תיעוד המאובנים.
מודלים אלו מכונים "מודלים של שעון רגוע" כיוון שהם מייצגים עמדת ביניים בין היפותזת השעון המולקולרי "הקשוחה" ומודל השיעורים המרובים של פלסנסטיין, והם מתאפשרים דרך שימוש בטכניקות הסטטיסטיות של שרשרת מרקוב ושיטת מונטה קרלו (MCMC) החוקרות טווח נרחב של טופולוגיות עצים ומעריכות פרמטרים של מודל ההחלפה הנרחב.
גם מודלים אלו עדיין מבוססים על מסקנות סטטיסטיות ולא על ראיות ישירות ולפיכך, מבחינה מדעית אפילו שעון מולקולרי רגוע יכול רק לאשש אבל אף פעם לא "להוכיח" היפותזה. לבעיה זו ניגשים באמצעות שימוש בתיעוד מאובנים, שהוא בדרך כלל מספיק טוב ומתועד באופן מספיק כדי לספק ראיות מוצקות, על מנת לכייל את השעון המולקולרי בהתאם. מצד שני, בחקר האבולוציה של פתוגן או מחקרים של DNA עתיק, ניתן לעשות שימוש בדגימות סדרתיות.