ציטראט סינתאז
מבנה

ציטראט סינתאז המופק מלב חזיר והנחקר ביותר מורכב מ-437 חומצות אמינו, המאורגנים ל-2 תת-יחידות, אשר כל אחת מהן מורכבת מ-20 סלילי אלפא. כל תת-יחידה מורכבת מ-2 דומיינים, גדול וקטן; כמו כן, לכל תת-יחידה יש אתר פעיל עם אתר קשירה אחד לאוקסלואצטט או לאצטיל קואנזים A, המצוי ב"חריץ" שבין שני הדומיינים. סלילי האלפא מסומנים באותיות A עד T, כאשר הדומיין הגדול של כל תת-יחידה מורכב מסלילי האלפא A-M ו-S-T, ואילו תת-הדומיין הקטן של כל תת-יחידה מורכב מסלילי האלפא N-R.
| הרכב חומצות האמינו בציטראט סינתאז (ב-%)> חומצת אמינו | הרכב חומצות האמינו בציטראט סינתאז (ב-%)> חזיר | הרכב חומצות האמינו בציטראט סינתאז (ב-%)> יונה | הרכב חומצות האמינו בציטראט סינתאז (ב-%)> עש |
| --- | --- | --- | --- |
| ליזין | 5.9 | 6.7 | 8.9 |
| היסטידין | 3.3 | 2.6 | 2.6 |
| ארגינין | 4.3 | 5 | 3.7 |
| אספרטט | 9.3 | 10.2 | 9.8 |
| תראונין | 5.5 | 4.9 | 4.9 |
| סרין | 6.5 | 5.1 | 5.5 |
| גלוטמט | 10 | 10 | 10.6 |
| פרולין | 5.7 | 4.9 | 6 |
| גליצין | 8 | 8.5 | 8 |
| אלנין | 8.4 | 9.9 | 8.1 |
| ואלין | 6.4 | 7.5 | 7.8 |
| מתיונין | 3.4 | 3.3 | 2.2 |
| איזולאוצין | 4.4 | 6 | 4.6 |
| לאוצין | 11.9 | 9.3 | 10.2 |
| טירוזין | 4.2 | 2.7 | 3.6 |
| פנילאלנין | 3 | 3.4 | 3.5 |
האתר הפעיל של ציטראט סינתאז בצורה הפתוחה
האתר הפעיל של ציטראט סינתאז בצורה הסגורה
סלילי האלפא מורכבים מלמעלה מ-75% משיירי חומצות האמינו באנזים, ומדידה באמצעות דיכרואיות מעגלית (CD) מצביעה על כך שהם מהווים בין 40% ל-60% מהמבנים השניוניים של האנזים; למעשה, ציטראט סינתאז הוא האנזים הראשון שנתגלה ולו מבנה שניוני המורכב כמעט רק מסלילי אלפא. יתר חומצות האמינו מרכיבות מבנים בלתי רגילים מוארכים אחרים, מלבד 13 שיירים המרכיבים משטח בטא קטן המקשר בין סליל אלפא C לאחד מהמבנים המוארכים וממוקם בפני השטח של החלבון. ארבעה זוגות אנטי-מקבילים של סלילי אלפא מחברים בין 2 תתי היחידות, ויוצרים מעין "סנדוויץ'" של 8 סלילי אלפא מפותלים, המזכיר משטח בטא.
בחריץ שבין 2 תתי היחידות נמצא האתר הפעיל של האנזים, ובו 2 אתרי קשירה - האחד לציטראט או לאוקסלואצטט והשני לקואנזים A. האתר הפעיל מורכב מ-3 שיירים החיוניים לפעילותו (2 שיירי היסטידין ושייר אספרטט אחד; "שלשה קטליטית") - His274 בדומיין הגדול, ו-His320 ו-Asp375 בדומיין הקטן, להם סלקטיביות גבוהה באינטראקציות עם סובסטרטים. נמצא כי כאשר השייר His274 הוחלף בחומצות אמינו אחרות, האנזים היה בכל זאת פעיל, אם כי חל צמצום של כפי אלף בפעילותו. לעומת זאת, כאשר הוחלף השייר Asp375 בכל חומצת אמינו אחרת מלבד חומצה גלוטמית, האנזים לא היה פעיל כלל.
ציטראט סינתאז מסוגל לעבור שינויים קונפורמציונליים גדולים, ומוגדר כ"דוגמה קלאסית" למודל ההתאמה המושרית של קושלנד. האנזים מגיב לקשירה של הסובסטרטים ושל קואנזים A בתנועה של הדומיינים ובשינוי בארגון של חלק מהשיריים הפנימיים. למעשה, האנזים יכול לנוע בין 2 צורות עיקריות - סגור ופתוח. בצורה הסגורה, השיירים הקטליטיים שבאתר הפעיל המשמשות כליגנדים שקועים בתוך החריץ שבין הדומיינים, באופן שמצד אחד הוא אידיאלי לפעילות הקטליטית של האנזים (שכן מאפשר סביבה מבודדת מממס בעלת ספציפיות גבוהה) ומצד שני באופן שאינו מאפשר כניסה/שחרור של הסובסטרטים שלהם. בצורה הפתוחה, לעומת זאת, המולקולה נמצאת במצב המאפשר קשירה של סובסטרטים. צורה שלישית באה לידי ביטוי לאחר קשירת האוקסלואצטט; בצורה זו האתר הפעיל אינו לחלוטין במצב הסגור, מאחר שהשיירים Arg329, His320 ו-Asp375 נעים בין 0.8 ל-1.3 אנגסטרום מעמדותיהם, באופן המאפשר את שלב ההידרוליזה בזמן המתאים לאחר שלב הדחיסה (ראו בפרק המנגנון).
בעת השינוי הקונפורמציוני בין הצורה הפתוחה לסגורה מתרחשת תנועת סיבוב (רוטציה) של 19° על ידי הדומיין הקטן ביחס לדומיין הגדול, באופן שהדומיין הקטן של תת-יחידה אחת יוצר אינטראקציה עם הדומיין הגדול של תת-היחידה השנייה, וכן חלים שינויים באריזה של השיירים בפנים הדומיין הקטן. קוטיה ולאסק הציעו מנגנון של סדרת תנועות מוכוונות בין סלילי אלפא סמוכים כהסבר לשינוי הקונפורמציוני באנזים.
אצל הארכיאון התרמופילי Pyrococcus furiosus בעל הטמפרטורה האופטימלית של 100°, הליבה מכילה כמות גדולה של איזולאוצין כך שנוצרים צברים, לעומת ליבת החלבון אצל ציטראט סינתאז המופק מחזיר; בנוסף, מספר החללים הפנימיים (internal cavities) במצב הפתוח של האנזים אצל Pyrococcus furiosus נמוך יותר, וכן הלולאות המחברות בין חלק מסלילי האלפא קצרות יותר בחלק מהמקרים. עוד נמצא שוני מהותי באופן הקיפול של הקצה הקרבוקסילי של המונומר האחד על פני השטח של המונומר השני, לעומת האנזים שהופק מהחזיר. מסתבר שמאפיינים אלו תורמים לקומפקטיות של החלבון ולקישור הדוק יותר של תת-היחידות, דבר המאפשר לציטראט סינתאז בארכיאון זה להישאר פעיל ומקופל גם בטמפרטורות גבוהות. לעומת זאת, אופן הקשירה באתר הפעיל היה בעל מאפיינים דומים אצל 2 האנזימים, ומעבר לכך - חלה גם אקוויוולנטיות מבנית של השיירים הקטליטיים באתר הפעיל ומיקומם אף היה זהה, דבר המעיד על מנגנון קשירה זהה.