خلافت علی بن ابی‌طالب
نبرد صفین

مقالهٔ اصلی: نبرد صفین
علی بی‌درنگ پس از کامیابی در خاتمه دادن به شورش عایشه، طلحه و زبیر، به شام روی آورد. معاویه حاکم سرزمین شام بود. او در زمان عمر به فرمانداری این منطقه گماشته و در زمان عثمان در آنجا تثبیت شده بود.
علی نامه‌ای به معاویه نوشت و آن را به دست جریر بن عبدالله بجلی، فرماندار پیشین همدان که از سوی عثمان برگزیده شده بود، داد تا به دست معاویه برساند و از او بیعت بگیرد، ولی معاویه به بهانه‌های گوناگون جریر را در آن سرزمین نگه داشت و در این مدت دمشق را آمادهٔ نبرد با علی کرد. معاویه اقدام به جلب حمایت قبایل ساکن شام با شعار خونخواهی عثمان کرد. همچنین، وی حمایت عمرو عاص را که سیاستمدار و فرمانده نظامی توانایی بود، در ازای وعدهٔ حکومت مصر به دست آورد. وی تبلیغاتی را با استفاده از افرادی نظیر ولید بن عقبه و شُرَحْبیل بن سِمْط به راه انداخت و علی را به عنوان قاتل عثمان و دیگر مسلمانان به مردم معرفی کرد.
میان علی و معاویه چندین نامه نوشته شد و علی از حق قانونی خود به عنوان حاکم دفاع کرد. معاویه نامه‌های علی را با دیرکرد پاسخ می‌داد و در این میان خود را آمادهٔ نبرد با او می‌کرد. سپس نامه‌ای به علی فرستاد و به او پیشنهاد کرد که من حکومت تو را به شرطی می‌پذیرم که در جایگاه خود باقی بمانم و فرمانداری مصر را هم در دست بگیرم. چون علی این درخواست او را نپذیرفت، معاویه نامهٔ اعلان جنگ و درخواست قصاص قاتلان عثمان را به جریر داد تا به دست علی برساند. همچنین معاویه به خودمختار بودن شام به رهبری خودش اصرار ورزید؛ ولی علی مدعی بود که تمامی استان‌های حکومت اسلامی، باید به‌طور مساوی با مشکلات جامعهٔ مسلمانان روبرو شوند. معاویه در پاسخ به بهانهٔ مشارکت نداشتن در انتخاب علی، حامیان شامی خود را بسیج کرده و از بیعت با علی سر باز زد. از سوی دیگر، معاویه می‌کوشید تا مکاتبات و مراودات دیپلماتیک را از مردم شام مخفی کند، زیرا اگر آن‌ها درمی‌یافتند که وی مطالبهٔ حکومت شام و مصر را دارد، تبلیغاتی که برای خونخواهی عثمان به راه انداخته بود خنثی می‌شد.
میان شورش‌های طلحه و زبیر با شورش معاویه یک تفاوت اساسی بود: در مورد نخست، طلحه و زبیر به دنبال شورا و برگزیدن یک خلیفهٔ دیگر بودند، ولی معاویه ادعا می‌کرد که به خونخواهی عثمان برخاسته‌است و درخواست مجازات قاتلان وی را دارد. پوناوالا می‌نویسد علی معتقد بود که عثمان به این دلیل کشته شد که مردم به خاطر اعمال مستبدانهٔ وی تحت ظلم بودند؛ بنابراین قاتلانش مشمول مجازات نمی‌شوند. اما دفتری می‌نویسد که از بین شورشیان ضد خلافت عثمان (عرب‌های کوفی، بصری و مصری)، عثمان را عرب‌های مصری کشتند؛ و زمانی که معاویه ادعای خونخواهی کرده بود، علی دچار انفعال گشت؛ چرا که قاتلان اصلی گریخته بودند و حال آنکه افرادی دیگر، به نام قُرا، که جزو اطرافیان علی محسوب می‌شدند، در قتل عثمان هم شریک بودند. چون علی نمی‌خواست یا نمی‌توانست قاتلان عثمان را دستگیر و مجازات کند، معاویه بر علی شورید و مشروعیت خلافت او را به چالش کشید.
علی با وجود سختی‌های بسیار که در داخل برایش پیش آمده بود توانست در ذی الحجه ۳۶ هجری (مهٔ ۶۵۷ میلادی) سپاهی در عراق فراهم آورد و آن را روانهٔ صفین کند. چند زدوخورد میان دو سپاه صورت گرفت. تا آغاز ماه محرم که جنگ متوقف شد، یک ماه میان دو سپاه گفتگو صورت گرفت ولی هنگامی که کاملاً روشن شد که گفتگو بی‌نتیجه است، در ماه صفر (ژوئیهٔ ۶۵۷) جنگ دوباره از سر گرفته شد. در مجموع این جنگ سه ماه طول کشید که بیشتر آن به گفتگو میان دو سپاه سپری شد. جنگ برای هر دو گروه بسیار آسیب داشت و نتیجهٔ آن نامشخص بود تا آنجا که پس از یک هفته کارزار سخت، هنگامی که به نظر رسید سحرگاه فردا علی پیروز خواهد شد در شب آخر به نام لیلة الهریر (شب ناله)، عمرو عاص به معاویه پیشنهاد کرد تا سربازانش قرآن‌ها را بر سر نیزه بلند کنند تا در سپاه علی اختلاف و چند دستگی به وجود آید. معاویه که از اختلاف‌نظرها در سپاه علی آگاه بود از این وضعیت بهره‌برداری کرد و این پیشنهاد را پذیرفت.