آنتی‌بادی منوکلونال
تخلیص پادتن تک‌تیره

بعد از به دست آوردن نمونه از محیط کشت سلولی یا نمونه مایع آسیت، پادتن مطلوب باید استخراج شود. آلودگی‌های موجود در محیط کشت سلولی همان مواد موجود در آن شامل فاکتورهای رشد، هورمون‌ها و ترانسفرین‌ها هستند. بر خلاف آن، نمونه‌های آزمایشگاهی دارای پادتن‌های میزبان، پروتئازها، نوکلئازها، نوکلئیک اسیدها، و ویروس‌ها می‌باشند. در هر دو مورد، بقیه ترشحات سلول‌های هیبریدوما مثل سیتوکاین‌ها ممکن است وجود داشته باشند. همچنین آلودگی باکتریایی و وجود اندوتوکسین هم محتمل است. با توجه به پیچیدگی محیط کشت مورد نیاز در کشت سلول و بنابراین آلودگی‌های آنها، یک روش باید نسبت به بقیه ترجیح داده شود(in vivo,in vitro).
نمونه در ابتدا برای تخلیص متعادل یا آماده‌سازی می‌شود. سلول‌ها، بقایای سلولی، چربی‌ها و لخته‌ها در ابتدا باید حذف شوند، که اصولاً پس از فیلتراسیون با فیلتر۰٫۴۵ میکرولیتر توسط سانتریفوژ صورت می‌گیرد. این ذرات بزرگ می‌تواند به عنوان پدیده‌ای به نام ترسیب غشا در مراحل بعدی تخلیص مطرح شود. به علاوه، غلظت محصول در نمونه ممکن است کافی نباشد، به خصوص در مواقعی که پادتن مورد نظر توسط سلولی با سطح ترشح پایین تولید شود. در این مورد نمونه باید با سانتریفوژ یا دیالیز تغلیظ شود.
اغلب ناخالصی‌های باردار معمولاً آنیون‌هایی از جنس نوکلئیک اسیدها و اندوتوکسین‌ها هستند. معمولاً آن‌ها را با کروماتوگرافی تعویض یونی جدا می‌کنند. همچنین کروماتوگرافی تعویض کاتیونی، در pH پایین استفاده شده که پادتن مطلوب در ستون باقی‌مانده در حالی که آنیون‌ها عبور می‌کنند یا آنیون کروماتوگرافی در pH بالا استفاده شده که پادتن مطلوب از ستون رد شده در حالی که آنیون‌ها به ستون می‌چسبند. پروتئین‌های مختلفی همراه آنیون‌ها با توجه به نقطه ایزوالکتریکشان (pI) جدا می‌شوند. برای مثال، آلبومین pI برابر با ۴٫۸ دارد که به‌طور عمده‌ای کمتر از پادتن تک‌تیره‌است که دارای pI برابر با ۶٫۱ می‌باشند. به عبارت دیگر، در یک pH، میانگین بار مولکول‌های آلبومین بیشتر به سمت منفی سوق پیدا می‌کند. ترانسفرین، pI برابر با ۵٫۹ دارد بنابراین با این روش به راحتی نمی‌تواند جدا گردد. اختلاف pI حداقل باید ۱ باشد تا جداسازی به‌طور مناسبی انجام شود.
ترانسفرین را می‌توان با کروماتوگرافی حذفی با سایز جدا نمود. مزیت این روش در این است که آن یکی از قابل اعتمادترین روش‌های کروماتوگرافی است. از آنجایی که کار ما با پروتئین هاست، ویژگی‌هایی مثل بار و توانایی اتصال ثابت نیستند و با توجه به pH مولکولی که دارای پروتون یا فاقد آن است متفاوت می‌باشند در حالی که اندازه تقریباً ثابت می‌ماند. با این حال، این روش معایبی مثل تفکیک‌پذیری کم، ظرفیت کم و دفعات شست‌وشوی کم را دارد.
کمی سریعتر، روشی یک مرحله‌ای از جداسازی به نام کروماتوگرافی اتصال پروتئین A/G وجود دارد. پادتن به‌طور انتخابی به پروتئین A/G متصل شده بنابراین خلوص بالایی (عموماً بالاتر از ۸۰٪) می‌دهد. به هر حال، این روش ممکن است برای پادتن‌هایی که به آسانی آسیب می‌بینند مشکل ساز باشد چون شرایط سختی در آن استفاده می‌شود. یک pH پایین می‌تواند با شکستن باند اتصال پادتن را از ستون جدا نماید. به علاوه تأثیر احتمالی بر محصول، pH پایین می‌تواند سبب نشت پروتئین A/G از ستون شده و آن را در نمونه شسته شده ظاهر کند. سیستم‌های شست‌وشوی بافری ملایم که از غلظت‌های بالای نمکی استفاده می‌کنند نیز برای جلوگیری از مواجهه پادتن‌ها با pH پایین وجود دارند. هزینه‌ها نیز یک مسئله مهم هستند چون رزین پروتئین A/G از رزین‌های گران‌قیمت است.
برای رسیدن به بیشترین خلوص در یک مرحله، تخلیص اتصالی را می‌توان با استفاده از آنتی‌ژن برای داشتن بیشترین اختصاصیت پادتن به کار برد. در این روش، آنتی‌ژنی که برای جمع‌آوری پادتن استفاده می‌شود با پیوند کووالانسی به آگارز متصل شده‌است. اگر پادگن (آنتی‌ژن) یک پپتید باشد، آن را معمولاً با یک سیستئین انتهایی سنتز می‌کنند، که اجازه اتصال به یک پروتئین حامل را می‌دهد، مثل KLH در حین پیشروی و حمایت برای تخلیص. سپس محیط حاوی پادتن با آنتی‌ژن غیرمتحرک انکوبه شده، که به صورت کلی یا در هنگام عبور پادتن از ستون انجام می‌شود، که در آن به‌طور انتخابی متصل گردیده و در حالی که ناخالصی‌ها از ستون شسته می‌شوند می‌توان آن را حفظ نمود. سپس شست‌وشو با بافر pH پایین یا بافر پرنمک برای حاصل کردن پادتن تخلیص شده مورد استفاده قرار می‌گیرد.
برای انتخاب بیشتر پادتن‌ها، آن‌ها را می‌توان با استفاده از سدیم سولفات یا آمونیوم سولفات رسوب داد. پادتن‌ها در غلظت پایین نمک رسوب می‌کنند در حالی که اکثر پروتئین‌ها در غلظت‌های بالاتر رسوب می‌نمایند. مقدار مناسب نمک اگر اضافه شود بهترین جداسازی حاصل می‌شود. میزان نمک اضافی سپس باید با روشی مثل دیالیز از محلول خارج شود.
خلوص نهایی را با استفاده از یک کروماتوگرام می‌توان آنالیز کرد. هرگونه ناخالصی یک قله ایجاد می‌کند، و حجم زیر آن نشان دهنده مقدار آن است. به جای آن می‌توان الکتروفورز ژل یا الکتروفورز مویینه را به کار برد. ناخالصی‌ها سبب ایجاد باندهایی با شدت‌های مختلف می‌شوند که به مقدار آن مربوط می‌شود.