تثبیت آنزیم
روش‌ها

اصلی‌ترین روش‌های تثبیت آنزیمها عبارتند از: تثبیت از طریق جذب غیرکووالانسی، فعل و انفعالات یونی، اتصالات کووالانسی، اتصالات عرضی بین آنزیمها و به دام انداختن در یک ژل پلیمری یا کپسول می‌باشند.
روش‌های تثبیت آنزیم شامل اتصال کووالانسی، کپسوله سازی، به دام افتادن و جذب می‌باشد. این تکنیک‌ها شامل اتصال آنزیم به یک تکیه گاه جامد است که امکان حفظ آن در یک منطقه مشخص از فضا را فراهم می‌کند و در عین حال فعالیت کاتالیزوری خود را حفظ می‌کند. هر روشی مزایا و معایب خاص خود را دارد و انتخاب روش به نیازهای خاص کاربرد بستگی دارد. اتصال کووالانسی شامل تشکیل یک پیوند کووالانسی بین آنزیم و تکیه گاه است که یک اتصال قوی و پایدار ایجاد می‌کند. روش‌های کپسوله‌سازی و گیر افتادن شامل محصور کردن آنزیم در یک ماتریس پلیمری است، در حالی که جذب به غیر متکی است.
اتصال کووالانسی آنزیم به ماده پشتیبانی این روش‌های بی‌حرکتی به‌طور گسترده در کاربردهای مختلف صنعتی مورد استفاده قرار گرفته‌اند و مزایایی مانند افزایش پایداری، قابلیت استفاده مجدد و سهولت جداسازی از مخلوط واکنش را ارائه می‌کنند.
فیزیکی
جذب
یک روش ساده برای تثبیت برگشت‌پذیر، که شامل جذب آنزیم‌ها یا اتصال فیزیکی به یک ماده حمایتی می‌شود. جذب می‌تواند از طریق نیروهای غیر اختصاصی ضعیف، مانند واندروال، پیوندهای هیدروژنی، و برهمکنش‌های آبگریز صورت گیرد، در حالی که در پیوند یونی، آنزیم‌ها از طریق پیوندهای نمکی متصل می‌شوند.
جذب روی شیشه، دانه‌های آلژینات یا ماتریکس: آنزیم به قسمت بیرونی یک ماده بی اثر متصل می‌شود. به‌طور کلی، این روش در بین روش‌هایی که در اینجا ذکر شده‌است کندترین است. از آنجایی که جذب یک واکنش شیمیایی نیست، محل فعال آنزیم بی حرکت ممکن است توسط ماتریکس یا مهره مسدود شود و فعالیت آنزیم را تا حد زیادی کاهش دهد.
به دام افتادن
این یک تکنیک بی‌حرکتی فیزیکی غیرقابل برگشت است که می‌تواند به عنوان محدودیت فیزیکی آنزیم در یک منطقه/فضای مشخص در نظر گرفته شود. می‌توان از آن برای افزایش پایداری مکانیکی استفاده کرد و همچنین می‌تواند برای کاهش رویدادهای شستشوی آنزیم‌ها استفاده شود. از آنجایی که آنزیم در این فرایند از نظر شیمیایی با پلیمر/مواد الیاف/شبکه پشتیبانی نمی‌کند، با گذشت زمان از دناتوره شدن محافظت می‌شود.
اساساً، آنزیم در دانه‌های نامحلول یا میکروسفرها مانند دانه‌های آلژینات کلسیم به دام می‌افتد. با این حال، این مواد نامحلول مانع ورود بستر، و خروج محصولات می‌شود.
شیمیایی
پیوند متقابل
پیوند متقاطع: روش غیرقابل برگشت دیگری است که برای اتصال مولکول‌های آنزیم به مواد پشتیبانی نیاز ندارد. در این روش، مولکول‌های آنزیم‌ها به صورت کووالانسی به یکدیگر متصل می‌شوند تا ماتریکسی متشکل از تقریباً تنها آنزیم ایجاد کنند. این واکنش تضمین می‌کند که محل اتصال، محل فعال آنزیم را پوشش نمی‌دهد، فعالیت آنزیم تنها تحت تأثیر بی حرکتی قرار می‌گیرد. با این حال، انعطاف‌ناپذیری پیوندهای کووالانسی از خواص خود ترمیمی که توسط تک‌لایه‌های خودآرایش شده با شیمی‌جذب به نمایش گذاشته می‌شود، جلوگیری می‌کند. استفاده از یک مولکول فاصله دهنده مانند پلی (اتیلن گلیکول) در این مورد به کاهش مانع فضایی توسط بستر کمک می‌کند.
پیوند کووالانسی
آنزیم به صورت کووالانسی به یک تکیه گاه نامحلول (مانند سیلیکاژل یا دانه‌های پلیمری ماکرو متخلخل با گروه‌های اپوکسید) متصل می‌شود. این رویکرد قوی‌ترین برهمکنش آنزیم/پشتیبانی و بنابراین کمترین نشت پروتئین را در طول کاتالیز فراهم می‌کند.
فعالیت آنزیم که به صورت کووالانسی متصل می‌شود به عوامل مختلفی از جمله: شکل و اندازه ماده حامل، نوع روش جفت شدن، ترکیب و شرایط خاص جفت شدن مواد حامل بستگی دارد.
اتصال برچسب میل ترکیبی: یک روش تثبیت‌سازی است که روش‌های فیزیکی و شیمیایی را ترکیب می‌کند که در آن آنزیم‌ها ممکن است به یک سطح تثبیت شوند، به عنوان مثال. در یک ماده متخلخل، با استفاده از برچسب‌های پروتئین غیر کووالانسی یا کووالانسی. این فناوری برای اهداف خالص سازی پروتئین ایجاد شده‌است. این تکنیک به‌طور کلی قابل استفاده است و می‌تواند بدون خالص سازی آنزیمی قبلی و در نتیجه یک آماده‌سازی خالص انجام شود. شیشه متخلخل و مشتقات آن استفاده می‌شود، جایی که سطح متخلخل را می‌توان از نظر آبگریزی سازگار کرد تا با آنزیم مورد نظر مطابقت داشته باشد.
توزیع تصادفی در مقابل توزیع جهت دار
آنزیم‌های متعددی با اهمیت بیوتکنولوژیکی بر روی پایه‌های مختلف (غیر آلی، آلی، کامپوزیت و نانومواد) از طریق اتصال چند نقطه‌ای تصادفی تثبیت شده‌اند. با این حال، تثبیت از طریق اصلاح تصادفی شیمیایی منجر به یک جمعیت پروتئین ناهمگن می‌شود که در آن بیش از یک زنجیره جانبی (آمینو، کربوکسیل، تیول و غیره) موجود در پروتئین‌ها با پشتیبانی با کاهش بالقوه در فعالیت به دلیل محدودیت دسترسی سوبسترا به محل فعال مرتبط هستند.
در مقابل، در تثبیت آنزیم به سمت سایت، پشتیبانی می‌تواند به یک اسید آمینه خاص (معمولاً انتهای N یا C) در یک مولکول پروتئین دور از محل فعال مرتبط شود. به این ترتیب حداکثر فعالیت آنزیم به دلیل دسترسی آزاد سوبسترا به محل فعال حفظ می‌شود. این استراتژی‌ها عمدتاً شیمیایی هستند، اما ممکن است به روش‌های ژنتیکی و آنزیمی برای تولید گروه‌های عاملی (که در پروتئین وجود ندارند) روی آنزیم و ساپورت نیاز داشته باشند.
انتخاب روش SDCM به عوامل زیادی بستگی دارد، مانند نوع آنزیم (همولوگ سایکروفیلیک کمتر یا پایدارتر گرمادوست)، پایداری pH آنزیم، در دسترس بودن انتهای N یا C به معرف، عدم تداخل پایانه آنزیم با فعالیت آنزیم، نوع باقی مانده اسید آمینه کاتالیزوری، در دسترس بودن، قیمت و سهولت آماده‌سازی معرف‌ها. به عنوان مثال، تولید عملکردهای قابل کلیک مکمل (آلکین و آزید) بر روی ساپورت و آنزیم یکی از راحت‌ترین راه‌ها برای بی‌حرکت کردن آنزیم‌ها از طریق اصلاحات شیمیایی جهت‌دار مکان است.