استشراب السائل رفيع الإنجاز
التشغيل

يتم إدخال خليط العينة المراد فصله وتحليله، في حجم صغير منفصل (عادةً ميكروليتر)، في تيار الطور المتحرك المتسرب عبر العمود. تتحرك مكونات العينة عبر العمود بسرعات مختلفة، وهي تابعة لتأثيرات فيزيائية محددة مع مادة الامتصاص (وتسمى أيضًا الطور الساكن أو الثابت stationary phase). تعتمد سرعة كل مكون على طبيعته الكيميائية وعلى طبيعة الكيميائية للطور الساكن في العمود وعلى تركيب الطور المتحرك. يُطلق على الوقت الذي يتم فيه فصل مادة تحليلية معينة elution (يخرج من العمود) اسم وقت الاحتفاظ أو الاستبقاء retention time. وقت الاستبقاء المقاس في ظل ظروف معينة هو خاصية تعريف لتحليل معين.
تتوفر العديد من أنواع الأعمدة المختلفة، المليئة بمواد ممتزة متفاوتة في حجم الجسيمات وطبيعة سطحها («كيمياء السطح»). يتطلب استخدام مواد التعبئة ذات الأحجام الصغيرة للجسيمات استخدام ضغط تشغيلي أعلى (الضغط الخلفي backpressure) وعادة ما يحسن دقة الفصل الكروماتوغرافية (درجة الفصل للذروة بين مكونات المتتالية الخارجة من العمود). قد تكون الجسيمات الممتزة كارهة للماء hydrophobic أو قطبية بطبيعتها.
تشتمل الأطوار المتحركة الشائعة الاستخدام على أي مزيج قابل للامتزاج من الماء مع المذيبات العضوية المختلفة (الأكثر شيوعًا هي الأسيتونيتريل والميثانول). تستخدم بعض تقنيات HPLC أطوار متحركة خالية من الماء (انظر كروماتوغرافيا الطور الطبيعي normal-phase chromatography أدناه). قد يحتوي المكون المائي للطور المتحرك على أحماض (مثل حمض الفورميك أو الفوسفوريك أو ثلاثي فلورو أسيتيك) أو أملاح للمساعدة في فصل مكونات العينة. قد يظل تركيب الطور المتحرك ثابتًا (وضع الشطف المتساوي isocratic elution mode) أو متغيراً (وضع الشطف المتدرج gradient elution mode) أثناء التحليل الكروماتوغرافي. عادة ما يكون الشطف المتساوي فعالًا في فصل مكونات العينة التي تختلف اختلافًا كبيرًا في ألفتها الكيميائية مع الطور الثابت. في الشطف المتدرج، يتنوع تركيب الطور المتحرك نموذجيًا من قوة الشطف المنخفضة إلى عالية. تنعكس قوة الشطف للطور المتحرك من خلال أزمنة احتفاظ ذات قوة تصفية عالية والتي تنتج شطفًا سريعًا (أزمنة احتفاظ قصيرة). نموذجياً يمكن أن يبدأ برنامج التدرج للطور المتحرك في كروماتوغرافيا الطور المعكوس عند 5٪ أسيتونيتريل (في الماء أو محلول موقي مائي aqueous buffer) ويرتفع خطيًا إلى 95٪ أسيتونيتريل خلال 5-25 دقيقة. قد تكون فترات ثبات تركيب الطور المتحرك جزءًا من برنامج التدرج التشغيلي. على سبيل المثال، يمكن الاحتفاظ بتركيب الطور المتحرك ثابتًا عند تركيب 5٪ أسيتونيتريل لمدة 1-3 دقائق، ثم يجري تغيير خطي يصل إلى 95٪ أسيتونيتريل.
يعتمد التركيب المختار للطور المتحرك (ويسمى أيضًا الشاطف eluent) على شدة التفاعلات بين مكونات العينة المختلفة (analytes) والطور الساكن (على سبيل المثال، التفاعلات الكارهة للماء في كروماتوغرافيا السائلة ذات الطور المعكوس). اعتمادًا على الفتهم الكيميائية مع الطورين المتحرك والساكن تتوزع partition مكونات العينة المختلفة بين الاثنين أثناء عملية الفصل التي تحدث في العمود. تشبه عملية التوزيع partition تلك التي تحدث أثناء الاستخلاص السائل ـ السائل liquid–liquid extraction ولكنها مستمرة وليست تتم عبر مراحل تشغيلية step-wise. في هذا المثال، باستخدام التدرج اللوني للماء/الأسيتونتريل، ستتم إزالة المزيد من المكونات الكارهة للماء (الهيدروفوبية) من الطور الساكن (أي تخرج من العمود) في وقت متأخر، بمجرد أن يصبح الطور المتحرك أكثر تركيزًا في الأسيتونيتريل (أي في الطور المتحرك ذي قوة التصفية العالية من جراء تزايد هيدروفوبية المحلول الشاطف).
يعتمد اختيار مكونات الطور المتحرك والإضافات (مثل الأملاح أو الأحماض) وشروط التدرج على طبيعة العمود ومكونات العينة. غالبًا ما يتم إجراء سلسلة من العمليات التجريبية مع العينة من أجل إيجاد طريقة HPLC التي تعطي فصلًا مناسبًا.