تتابع الحمض النووي الريبي RNA
التحليل > التعبير (النسخ) التفاضلي

إن الاستخدام البسيط والأقوى في كثير من الأحيان لـ RNA-Seq هو إيجاد اختلافات في التعبير الجيني بين شرطين أو أكثر (على سبيل المثال، المعالجة مقابل غير المعالجة)؛ وتسمى هذه العملية التعبير التفاضلي. يشار إلى المخرجات بشكل متكرر على أنها جينات معبر عنها تفاضليًا (DEGs) ويمكن أن يتم تنظيم هذه الجينات إما إلى أعلى أو أسفل (أي، أعلى أو أقل في حالة الاهتمام). هناك العديد من الأدوات التي تؤدي تعبيرًا تفاضليًا. يتم تشغيل معظمها في R أو Python أو سطر أوامر Unix . الأدوات الشائعة الاستخدام تشمل DESeq ،  edgeR ،  و voom + limma ،   وكلها متوفرة من خلال موصل R / Bioconductor.  هذه هي الاعتبارات الشائعة عند تنفيذ التعبير التفاضلي:
المدخلات: تشمل مدخلات التعبير التفاضلي (1) مصفوفة تعبير RNA-Seq (جينات M X × عينات) و (2) مصفوفة تصميم تحتوي على ظروف تجريبية لعينات N. تحتوي أبسط مصفوفة التصميم على عمود واحد ، يقابل التسميات للحالة التي يجري اختبارها. يمكن أن تشمل المتغيرات الأخرى (يشار إليها أيضًا بعوامل أو ميزات أو تسميات أو معلمات) تأثيرات الدُفعات والمصنوعات المعروفة وأي بيانات وصفية قد تربك أو تتوسط في التعبير الجيني. بالإضافة إلى المتغيرات المشتركة المعروفة ، يمكن أيضًا تقدير المتغيرات المشتركة غير المعروفة من خلال أساليب التعلم الآلي غير الخاضعة للإشراف بما في ذلك تحليلات المكون الرئيسي والمتغير البديل  و PEER. غالبًا ما تستخدم التحليلات المتغيرة المخفية لبيانات RNA-Seq الخاصة بالأنسجة البشرية ، والتي تحتوي عادةً على قطع أثرية إضافية لم يتم التقاطها في البيانات الوصفية (على سبيل المثال ، الوقت الإقفاري ، الاستعانة بمؤسسات متعددة ، السمات السريرية الأساسية ، جمع البيانات عبر العديد من السنوات مع العديد من الموظفين).
الطرق: تستخدم معظم الأدوات إحصائيات الانحدار أو غير البارامترية لتحديد الجينات التي يتم التعبير عنها تفاضليًا ، وتكون إما قائمة على العد (DESeq2 ، limma ، edgeR) أو قائمة على التجميع (عن طريق القياس الكمي بدون محاذاة ، أو الكلب ،   Cuffdiff ،  Ballgown ). بعد الانحدار ، تستخدم معظم الأدوات إما معدل الخطأ العائلي (FWER) أو تعديلات قيمة الاكتشاف الخاطئ (FDR) لمراعاة الفرضيات المتعددة (في الدراسات البشرية ، ~ 20000 من جينات ترميز البروتين أو ~ 50000 نموذج حيوي).
المخرجات: يتكون المخرج النموذجي من صفوف تتوافق مع عدد الجينات وثلاثة أعمدة على الأقل، يتغير كل سجل من الجينات (تحويل سجل لنسبة التعبير في الظروف بين، مقياس حجم التأثير)، قيمة p، وp القيمة تعديلها لمقارنات متعددة. يتم تعريف الجينات على أنها ذات معنى من الناحية البيولوجية إذا نجحت في تحديد حجم التأثير (تغيير طية السجل) والأهمية الإحصائية. يجب تحديد هذه القطع بشكل مسبق بشكل مسبق، ولكن طبيعة تجارب RNA-Seq غالبًا ما تكون استكشافية، لذا يصعب التنبؤ بأحجام التأثير والقطع ذات الصلة في وقت مبكر.
مطبات: سبب وجود هذه الأساليب المعقدة هو تجنب عدد لا يحصى من المزالق التي يمكن أن تؤدي إلى أخطاء إحصائية وتفسيرات مضللة. المطبات تشمل زيادة معدلات إيجابية كاذبة (بسبب المقارنات المتعددة)، والتحف إعداد العينات، وعدم تجانس العينة (مثل الخلفيات الوراثية المختلطة)، وعينات مترابطة للغاية، في عداد المفقودين للتصاميم التجريبية متعددة المستويات، والتصميم التجريبي الفقراء. أحد الأخطاء البارزة هو عرض النتائج في Microsoft Excel. على الرغم من أنه مناسب، يقوم Excel تلقائيًا بتحويل بعض أسماء الجينات SEPT1 وDEC1 وMARCH2 إلى تواريخ أو أرقام الفاصلة العائمة.
اختيار الأدوات والقياس: هناك العديد من الجهود التي تقارن نتائج هذه الأدوات، حيث تميل DESeq2 إلى التفوق بشكل معتدل على الطرق الأخرى.      كما هو الحال مع الطرق الأخرى، يتكون القياس من مقارنة مخرجات الأداة مع بعضها البعض ومعاييرgolden المعروف.
تحاليل الدارجة للحصول على قائمة من الجينات المعبر عنها تفاضليًا تأتي في اثنين من النكهات، التحقق من صحة الملاحظات والاستدلال البيولوجي. نظرًا لمخاطر التعبير التفاضلي وRNA-Seq، يتم تكرار الملاحظات المهمة باستخدام (1) طريقة متعامدة في نفس العينات (مثل PCR في الوقت الفعلي) أو (2) تجربة أخرى، مسجلة مسبقًا في بعض الأحيان، في مجموعة جديدة. هذا الأخير يساعد على ضمان التعميم ويمكن متابعته عادةً مع التحليل التلوي لجميع الأفواج المجمعة. الطريقة الأكثر شيوعًا للحصول على فهم بيولوجي عالي المستوى للنتائج هي تحليل التخصيب الجيني، على الرغم من أنه يتم أحيانًا استخدام طرق الجينات المرشحة. يحدد إثراء مجموعة الجينات ما إذا كان التداخل بين مجموعتين من الجينات ذا دلالة إحصائية، وفي هذه الحالة يكون التداخل بين الجينات ومجموعات الجينات التي يتم التعبير عنها تفاضليًا من مسارات / قواعد البيانات المعروفة (مثل، الجينات الأنطولوجية، KEGG، الأنثروبولوجيا البشرية للأنماط) أو من التحليلات التكميلية في التحليل الجيني نفس البيانات (مثل شبكات التعبير المشترك). تشمل الأدوات الشائعة لإثراء مجموعة الجينات واجهات الويب (مثل، ENRICHR، g: profiler) وحزم البرامج. عند تقييم نتائج التخصيب، يكون أحد الأساليب البحثية هو البحث أولاً عن إثراء البيولوجيا المعروفة كتحقق من الصحة ومن ثم توسيع النطاق للبحث عن بيولوجيا جديدة.