استشراب السائل رفيع الإنجاز
أنواع الكروماتوغرافيا السائلة > كروماتوغرافيا السائلة ذات الطور العكسي

تحتوي HPLC ذات الطور العكسي (RP-HPLC) على طور ثابت غير قطبي وطور متحرك مائي قطبي معتدل. إحدى الأطور الثابتة الشائعة هي السيليكا التي تم تعديل سطحها باستخدام المادة RMe2SiCl، حيث R عبارة عن مجموعة ألكيل مستقيمة مثل C18H37 أو C8H17. مع مثل هذه الأطوار الثابتة، يكون وقت الاستبقاء أطول للجزيئات الأقل قطبية، بينما يتم التخلص من الجزيئات القطبية بسهولة أكبر (في وقت مبكر من التحليل). يمكن للمحلل المخبري زيادة أوقات الاحتفاظ عن طريق إضافة المزيد من الماء إلى الطور المتحرك؛ مما يجعل ألفة المادة التحليلية الكارهة للماء للطورالثابت الكاره للماء أقوى مقارنة بالطور المتحرك الأكثر مقاومة للماء الآن. وبالمثل، يمكن للمحلل المخبري تقليل وقت الاحتفاظ عن طريق إضافة المزيد من المذيبات العضوية إلى الطور المتحرك eluent. يتم استخدام RP-HPLC بشكل شائع لدرجة أنه غالبًا ما يشار إليه بشكل غير صحيح باسم "HPLC" دون مزيد من المواصفات. تستخدم صناعة الأدوية بانتظام نوع الكروماتوغرافيا RP-HPLC لضمان جودة الأدوية قبل إطلاقها.
يعمل RP-HPLC على مبدأ التفاعلات الكارهة للماء، والتي تنشأ من التناظر العالي في بنية الماء ثنائي القطب ويلعب الدور الأكثر أهمية في جميع العمليات في علوم الحياة. يسمح RP-HPLC بقياس هذه القوى التفاعلية. يتناسب ارتباط المادة المنحلة بالطور الثابت مع مساحة سطح التلامس حول الجزء غير القطبي من جزيء المادة المنحلة عند الارتباط بالرابط في الطورالثابت. هذا التأثير المضاد للذوبان تهيمن عليه قوة الماء من أجل «تقليل التجويف» حول المادة المنحلة وسلسلة C18 مقابل مجمع كليهما. الطاقة المنبعثة في هذه العملية تتناسب طرديًا مع التوتر السطحي للشاطف (الماء: 7.3 × 10 /6 جول / سم 2، الميثانول: 2.2 × 10 /6 جول / سم 2) والسطح الكارهة للماء من الحليلة والمرتبطة (المعقد) ligand على التوالي . يمكن تقليل الاحتباس عن طريق إضافة مذيب أقل قطبية (ميثانول، أسيتونتريل) إلى الطور المتحرك لتقليل التوتر السطحي للماء. يستخدم شطف التدرج هذا التأثير عن طريق التقليل التلقائي للقطبية والتوتر السطحي للطور المتحرك المائية أثناء التحليل.
تلعب الخصائص الهيكلية للجزيء المادة المنحلة دورًا مهمًا في خصائص الاحتفاظ به. بشكل عام، يتم الاحتفاظ بالتحليل ذي المساحة السطحية الكارهة للماء (C-H ، C-C ، والروابط الذرية غير القطبية عمومًا، مثل S-S وغيرها) لفترة أطول لأنه لا يتفاعل مع بنية الماء. من ناحية أخرى، فإن المواد المنحلة ذات المساحة السطحية القطبية الأعلى (التي يمنحها وجود المجموعات القطبية، مثل -OH أو -NH2 أو COO− أو -NH3 + في هيكلها) أقل احتفاظًا بها حيث يتم دمجها بشكل أفضل في الماء. تخضع مثل هذه التفاعلات لتأثيرات فراغية في تلك الجزيئات الكبيرة جدًا قد يكون لها وصول محدود فقط إلى مسام الطورالثابت، حيث تحدث التفاعلات مع الروابط السطحية (سلاسل الألكيل). عادة ما ينتج عن عائق السطح هذا احتباس أقل.
يزيد وقت الاستبقاء مع مساحة السطح الكارهة للماء (غير القطبية). تتخلص مركبات السلاسل المتفرعة بسرعة أكبر من الأيزومرات الخطية المقابلة لها بسبب تناقص مساحة السطح الإجمالية. وبالمثل يتم التخلص من المركبات العضوية ذات الروابط C-C المفردة في وقت لاحق من تلك التي تحتوي على رابطة ثلاثية C = C أو C-C ، حيث أن الرابطة المزدوجة أو الثلاثية أقصر من رابطة C-C مفردة.
بصرف النظر عن التوتر السطحي للطور المتحرك (القوة التنظيمية في هيكل eluent)، يمكن أن تؤثر معدلات الطور المتحرك الأخرى على الاحتفاظ بالمادة المنحلة. على سبيل المثال، تؤدي إضافة الأملاح غير العضوية إلى زيادة خطية معتدلة في التوتر السطحي للمحاليل المائية (حوالي 1.5 × 10 J7 جول/سم2 لكل مول لكلوريد الصوديوم، 2.5 × 10−7 جول/ سم2 لكل مول لـ (NH4) 2SO4)، ولأن إنتروبية entropy سطح التماس بين المذيبات والمادة المنحلة يتم التحكم فيها عن طريق التوتر السطحي، فإن إضافة الأملاح تميل إلى زيادة وقت الاستبقاء. تُستخدم هذه التقنية للفصل الطفيف واستعادة البروتينات وحماية نشاطها البيولوجي في تحليل البروتين (كروماتوغرافيا التفاعل الكارهة للماء، HIC).
عامل مهم آخر هو درجة الحموضة في الطور المتحرك لأنه يمكن أن يغير الطبيعة الكارهة للماء للمادة المنحلة. لهذا السبب، تستخدم معظم الطرق عامل تخزين مؤقت، مثل فوسفات الصوديوم، للتحكم في درجة الحموضة. تخدم المحاليل الموقية Buffers أغراضًا متعددة: التحكم في الأس الهيدروجيني، وتحييد الشحنة على سطح السيليكا في الطورالثابت والعمل كعوامل إقران أيون لتحييد شحنة التحليل. يضاف فورمات الأمونيوم بشكل شائع في قياس الطيف الكتلي لتحسين الكشف عن بعض المواد المنحلة عن طريق تكوين مقاربات الأمونيوم التحليلية. غالبًا ما يضاف حمض عضوي متطاير مثل حمض الأسيتيك، أو حمض الفورميك الأكثر شيوعًا، إلى الطور المتحرك إذا تم استخدام مقياس الطيف الكتلي لتحليل العمود المائل. يستخدم حمض Trifluoroacetic بشكل غير منتظم في تطبيقات قياس الطيف الكتلي نظرًا لثباته في الكاشف ونظام توصيل المذيبات، ولكن يمكن أن يكون فعالًا في تحسين الشبكية ntion من المواد المنحلة مثل الأحماض الكربوكسيلية في التطبيقات التي تستخدم أجهزة الكشف الأخرى، حيث أنه حمض عضوي قوي إلى حد ما. تختلف تأثيرات الأحماض والمحاليل الموقية باختلاف التطبيق ولكنها تعمل بشكل عام على تحسين دقة الكروماتوغرافيا.
من الصعب جدًا إتلاف أعمدة الطور المعكوس مقارنةً بأعمدة السيليكا العادية ؛ ومع ذلك، تتكون العديد من أعمدة الطور المعكوس من جزيئات السيليكا المشتقة من الألكيل ولا يجب استخدامها مع القواعد المائية لأنها ستدمر جسيم السيليكا الأساسي. يمكن استخدامها مع حمض مائي، ولكن لا ينبغي أن يتعرض العمود للحمض لفترة طويلة، حيث يمكن أن يؤدي ذلك إلى تآكل الأجزاء المعدنية لجهاز HPLC. يجب شطف أعمدة RP-HPLC بمذيب نظيف بعد استخدامها لإزالة الأحماض المتبقية أو المحاليل، وتخزينها في تركيبة مناسبة من المذيب. يجب أن يظل المحتوى المعدني لأعمدة HPLC منخفضًا إذا كان يجب الاحتفاظ بأفضل قدرة ممكنة لفصل المواد. الاختبار الجيد للمحتوى المعدني للعمود هو حقن عينة عبارة عن خليط من 2,2'- و 4,4'-bipyridine. نظرًا لأن 2,2'-bipy يمكن أن يخلب المعدن، فسيتم تشويه شكل ذروة 2,2'-bipy (ذيول) عندما توجد أيونات معدنية على سطح السيليكا. [بحاجة لمصدر] ..