الفحص المجهري ثنائي الفوتون
مفهوم

توظف الإثارة ثنائية الفوتون امتصاص ثنائي الفوتون، وهو مفهوم وصفته لأول مرة ماريا جوبرت ماير (1906-1972) في أطروحة الدكتوراه الخاصة بها في عام 1931، ولوحظ لأول مرة في عام 1961 في CaF2: Eu2 + الكريستال باستخدام الإثارة بالليزر بواسطة فولفغانغ كايزر. أظهر إسحاق أبيلا في عام 1962 في بخار السيزيوم أن الإثارة ثنائية الفوتون للذرات المفردة ممكنة.
يشتمل الفحص المجهري للإثارة ثنائية الفوتون على أوجه تشابه مع تقنيات الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر الأخرى مثل الفحص المجهري المتحد البؤر بالليزر وفحص رامان المجهري. تستخدم هذه التقنيات أشعة الليزر المركزة الممسوحة ضوئيًا في نمط نقطي لتوليد الصور، وكلاهما له تأثير التقسيم البصري. على عكس المجاهر متحد البؤر، لا تحتوي المجاهر متعددة الفوتون على فتحات ذات ثقوب تعطي المجاهر متحد البؤر جودة التقسيم البصري. التقسيم البصري الناتج عن مجاهر متعددة الفوتون هو نتيجة وظيفة انتشار نقطة الإثارة: وظيفة انتشار نقطة متعددة الفوتون عادةً ما تكون على شكل دمبل (أطول في المستوى xy)، مقارنة بوظيفة انتشار نقطة كرة الرجبي المستقيمة في البؤر المجاهر. يعتمد مفهوم الإثارة ثنائية الفوتون على فكرة أن فوتونين، لهما طاقة فوتونية أقل نسبيًا مما هو مطلوب لإثارة فوتون واحد، يمكنهما أيضًا إثارة فلوروفور في حدث كمومي واحد. يحمل كل فوتون ما يقرب من نصف الطاقة اللازمة لإثارة الجزيء. ينتج عن الإثارة الانبعاث اللاحق لفوتون مضان بنفس العائد الكمي الذي سينتج عن امتصاص الفوتون الفردي التقليدي. عادةً ما يكون الفوتون المنبعث طاقة أعلى (طول موجي أقصر) من أي من الفوتونين المثيرين. إن احتمال الامتصاص شبه المتزامن لفوتونين منخفض للغاية. لذلك، عادة ما تكون هناك حاجة إلى تدفق ذروة عالية من فوتونات الإثارة، وعادة ما يتم إنشاؤها بواسطة ليزر نبضي فيمتوثانية. الغرض من استخدام تأثير الفوتونين هو أن الانتشار المحوري لوظيفة انتشار النقطة أقل بكثير من إثارة الفوتون الفردي. نتيجة لذلك، تم تحسين المدى على طول البعد z، مما يسمح بقطع المقاطع البصرية الرقيقة. بالإضافة إلى ذلك، في كثير من الحالات المثيرة للاهتمام، يمكن تصميم شكل البقعة وحجمها لتحقيق أهداف مرغوبة محددة. تعد أشعة الليزر ذات الطول الموجي الأطول والطاقة المنخفضة (عادةً الأشعة تحت الحمراء) للمجاهر متعددة الفوتونات مناسبة تمامًا للاستخدام في تصوير الخلايا الحية لأنها تسبب ضررًا أقل من الليزر قصير الطول الموجي المستخدم عادةً لإثارة الفوتون الفردي، لذلك يمكن ملاحظة الخلايا من أجل فترات أطول مع تأثيرات سامة أقل.
تحتوي الفلوروفورات الأكثر استخدامًا على أطياف الإثارة في نطاق 400-500 نانومتر، في حين أن الليزر المستخدم لإثارة التألق ثنائي الفوتون يقع في نطاق ~ 700-1000 نانومتر (الأشعة تحت الحمراء) الذي تنتجه ليزر Ti-sapphire. إذا قام الفلوروفور بامتصاص فوتونين من الأشعة تحت الحمراء في وقت واحد، فسوف يمتص طاقة كافية ليرتفع إلى الحالة المثارة. سيصدر الفلوروفور بعد ذلك فوتونًا واحدًا بطول موجة يعتمد على نوع الفلوروفور المستخدم (عادةً في الطيف المرئي). نظرًا لامتصاص فوتونين أثناء إثارة حامل الفلور، تزداد احتمالية انبعاث الفلورسنت من الفلوروفور بشكل تربيعي مع شدة الإثارة. لذلك، يتم إنشاء المزيد من الفلورة ثنائية الفوتون حيث يتم تركيز شعاع الليزر بإحكام أكثر من المكان الذي يكون فيه أكثر انتشارًا. على نحو فعال، يقتصر الإثارة على الحجم البؤري الصغير (~ 1 فيمتوليتر)، مما يؤدي إلى درجة عالية من رفض الأشياء خارج التركيز. يعتبر توطين الإثارة ميزة أساسية مقارنة بمجاهر الإثارة أحادية الفوتون، والتي تحتاج إلى استخدام عناصر مثل الثقوب لرفض التألق خارج التركيز. ثم يتم جمع الفلورة من العينة بواسطة كاشف عالي الحساسية، مثل أنبوب مضاعف ضوئي. تصبح شدة الضوء المرصودة بكسل واحدًا في الصورة النهائية؛ يتم مسح النقطة المحورية عبر المنطقة المرغوبة من العينة لتشكيل جميع وحدات البكسل في الصورة.