ماري ملكة إسكتلندا
الزواج من اللورد دارنلي

في فبراير 1561 عندما كانت ماري في حداد على فرانسوا، التقت لفترة قصيرة بابن عمتها الأول هنري ستيوارت، لورد دارنلي، الذي كان والديه إيرل وكونتيسة لينوكس من الأرستقراطيين الاسكتلنديين وكذلك من ملاك الأراضي الإنجليزية، وكانا قد أرسلاه إلى فرنسا زعما منهما لتقديم التعازي بينما كانا يأملان في احتمال التقارب بين ابنهما وماري. وقد كان كل من ماري ودارنلي من أحفاد مارغريت تيودور، أخت هنري الثامن ملك إنجلترا، والنسب الأبوي لعائلة ستيوارد العريقة في إسكتلندا. يشارك دارنلي من سلالة ستيوارت الحديثة بعائلة هاملتون كسليل لماري ستيوارت، كونتيسة أران، ابنة جيمس الثاني ملك اسكتلندا. يوم السبت 17 فبراير 1565 التقيا مرة أخرى في قلعة وميس في إسكتلندا، بعدها وقعت ماري في حب ذلك «الفتى الطويل» (كما أطلقت عليه الملكة إليزابيث—كان طوله أكثر من ستة أقدام). وفي 29 يوليو 1565 تزوجا في قصر هوليرود، وبالرغم من أن كليهما كان كاثوليكيًا لم يتم الحصول على إعفاء بابوي لزواج أولاد العمومة من الدرجة الأولى.
عمل رجلي الدولة الإنجليزيان وليام سيسيل وإيرل ليستر لكي يحصل دارنلي على رخصة للسفر إلى إسكتلندا من موطنه إنجلترا. على الرغم من أن مستشاري إليزابيث هم من جلبوا الزوجين معًا، إلا أنها قد شعرت بالتهديد من هذا الزواج، لأنهما أحفاد عمتها، وكان لكل من ماري ودارنلي الحق في الوصول إلى العرش الإنجليزي وسيَرث أبنائهما إذا رزقا أحقية قوية بوراثة العرش. ويبدو أن إصرار ماري على الزواج كان نابعا من العاطفة بدلاً من الحساب. يقول السفير الإنجليزي نيكولاس ثروكمورتون «بالتأكيد أنها سحرت [يعني الملكة ماري]»، وأضاف أنه لا يمكن تجنب هذا الزواج إلا «بالعنف». وقد أغضب هذا الاتحاد الملكة إليزابيث، التي شعرت أنه لا ينبغي أن يكون الزواج قد تم إلا بإذنها، بصفة أن دارنلي يكون ابن عمتها وكذلك لأنه مواطن إنجليزي.
وبسبب زواج ماري من كاثوليكي بارز اضطر أخيها الغير شرعي إيرل موراي، أن ينضم إلى تمرد اللوردات البروتستانت، ومنهم اللورد «ارغيل» و «غلنكيرن». وفي 26 أغسطس 1565 انطلقت ماري من أدنبره لمواجهتهم، وفي اليوم الثلاثين دخل موراي أدنبرة، لكنه غادر بعدها بقليل بعد أن فشل في أخذ القلعة. ثم عادت ماري إلى أدنبره في الشهر التالي لتعزيز القوات. بدأت قوات ماري ولوردات موراي المتمردين يجوبون اسكتلندا دون الدخول في قتال مباشر، وقد عرفت هذه الغارة باسم «غارة المطاردة». تم تعزيز الأعداد لماري عن طريق الإفراج عن ابن اللورد هنتلي، وكذلك عودة جيمس هيبورن، إيرل بوثويل الرابع، من المنفى في فرنسا. لم يستطع موراي أن يحشد الدعم الكافي، وغادر اسكتلندا في أكتوبر ولجأ في إنجلترا. قامت ماري بتوسيع مجلسها الخاص جالبة كلا من الكاثوليك (أسقف روس جون ليزلي، وعمدة أدنبرة سيمون بريستون من كريغميلار) والبروتستانت (اللورد هانتلي الجديد، أسقف غالاوي ألكسندر جوردون، وجون ماكسويل من تيريغلز، والسير جيمس بلفور).
بدأ دارنلي بالعجرفة والكبر ولم يرضي موقفه بأن يكون قرين الملكة، بل طالب تاج الزوجية، وأن يشارك الملكة سلطانها في اسكتلندا مع الحق في إبقاء العرش الإسكتلندي له إذا توفيت زوجته. لكن ماري رفضت طلبه، وزاد التوتر بينهما على الرغم من أنها حملت منه في أكتوبر 1565. وكان يشعر بالغيرة من صداقتها مع سكرتيرها الخاص الكاثوليكي ديفيد ريزيو وهو موسيقار إيطالي قد قدم إلى اسكتلندا عام 1560، والذي أشيع أنه كان والد الطفل الذي في بطنها. ورأى النبلاء الاسكتلندين أن ريزيو قد نحاهم عن مكانتهم وحل محلهم، وارتابوا في أنه يناصر الكاثوليك، فإنهم تآمروا على قتله. وبحلول مارس 1566، دخل دارنلي في مؤامرة سرية مع لوردات بروتستانت، ومنهم الذين تمردوا ضد ماري في «غارة المطاردة». في 9 مارس، اقتحم دارنلي ومجموعة من المتآمرين حجرة الملكة حيث كانت تتناول العشاء مع ريزيو، وأمسك دارنلي الملكة واحتجزها، واندفع الآخرون إلى الحجرة، واقتادوا ريزيو خارجها، رغم احتجاجات واعتراضات ماري، وعلى السلم كالوا له بالطعنات حتى الموت. ودقّ أحدهم ناقوس الخطر في المدينة، فسار حشد كبير من المواطنين المسلحين إلى القصر، واقترحوا تمزيق ماري «إرباً» ولكن دارلني أقنعهم بالتفرق، وبقيت ماري طوال الليل وطيلة اليوم التالي سجينة في قصر هوليرود. وفي نفس الوقت لعبت على فزع دارلني وحبه لها، فساعدها وصحبها، عندما هربت في الليلة التالية ولجأت إلى قلعة دنبار ، وهناك أقسمت أن تنتقم، فأصدرت نداء إلى مؤيديها المخلصين، ليهبوا لنجدتها والدفاع عنها. وأعادت المتمردين السابقين إلى المجلس مثل اللورد موراي وأرغيل وجلينكايرن، وربما فعلت هذا رغبة في إشاعة الفرقة بين أعدائها.