Conditions: Diarrhea Metastatic Renal Cell Carcinoma Stage IV Renal Cell Cancer
Allocation: RANDOMIZED | Intervention model: PARALLEL
Enrollment: 21
Healthy volunteers: no

Brief summary:
This randomized clinical trial studies how well probiotic yogurt supplement works in reducing diarrhea in patients with kidney cancer that has spread from the primary site to other places in the body (metastatic) and that are being treated with vascular endothelial growth factor-tyrosine kinase inhibitor therapy. Studying samples of blood and stool from patients who eat probiotic yogurt and those who avoid probiotic yogurt may help doctors plan better treatment.

Detailed description:
PRIMARY OBJECTIVES:

I. To determine if adding Activia yogurt (containing Bifidobacterium lactis DN-173 010) to the diet of patients with metastatic renal cell carcinoma (mRCC) increases the level of Bifidobacterium spp in stool.

SECONDARY OBJECTIVES:

I. To determine if Activia reduces the incidence of diarrhea for mRCC patients treated with vascular endothelial growth factor - tyrosine kinase inhibitor (VEGF-TKI) therapy.

II. To compare pre-treatment levels of circulating T regulatory (Treg) cells and levels of peripheral signal transducers and activators of transcription 3 (STAT3) in patients with and without diarrhea with VEGF-TKI therapy, and correlate with Bifidobacterium, other bacteria, and Activia.

III. To determine if patients with the diarrhea in mRCC patients treated with VEGF-TKI therapy have a lower baseline of Bifidobacterium spp.

IV. To assess the change in global stool bacteriomic profile of patients receiving therapy with VEGF-TKI therapy with or without Activia.

V. To better assess the feasibility of stool collection and bacteriomic profiling.

VI. To explore association between psychosocial symptoms (anxiety and depression) and bacteriomic profile and gastrointestinal toxicity in mRCC patients receiving VEGF-TKI therapy therapy.

OUTLINE: Patients are randomized to 1 of 2 arms.

ARM I: Patients receive probiotic supplement Activia yogurt twice daily (QD) during weeks 2-13 of VEGF-TKI treatment.

ARM II: Patients avoid any intake of yogurt or yogurt-containing foods and refrain from taking/consuming other probiotic supplements for 3 months.

Arms:
arm 1: Patients receive probiotic supplement Activia yogurt QD during weeks 2-13 of VEGF-TKI treatment. arm 2: Patients avoid any intake of yogurt or yogurt-containing foods and refrain from taking/consuming other probiotic supplements for 3 months.

Interventions: intervention 1: Laboratory Biomarker Analysis intervention 2: Micronutrient-Fortified Probiotic Yogurt intervention 3: VEGF-TKI
Intervention descriptions: intervention 1: Correlative studies intervention 2: Receive Activia yogurt intervention 3: Must be received as standard of care chemotherapy

Protocol document:
Prot_SAP_000.pdf: 
Page 1 of 3 
IRB Protocol No. 16088 
 
Version Date:  06/12/2020 
Version:  09 
 
CITY OF HOPE NATIONAL MEDICAL CENTER 
1500 E. DUARTE ROAD 
DUARTE, CA 91010 
DEPARTMENT OF MEDICAL ONCOLOGY AND THERAPEUTICS RESEARCH 
TITLE: Assessment of the role of Bifidobacterium-containing food supplement Activia™ and 
Bacteriomic Profiling and Other Biomarkers Associated with Vascular Endothelial Growth Factor 
Tyrosine Kinase Inhibitor (VEGF-TKI)-Induced Diarrhea in Patients with Metastatic Renal Cell 
Carcinoma (mRCC)  
CITY OF HOPE PROTOCOL NUMBER: 
16088 
VERSION: 09 
Initial Submission 
Protocol dated   06/27/2016 
Version 00 
Amendment 1 
Amendment 2  
Amendment 3 
Amendment 4 
Amendment 5 
Amendment 6 
Amendment 7 
Amendment 8 
Amendment 9 
Protocol dated 05/25/2017 
Title page dated 01/31/2018 
Title page and Protocol dated 02/28/2018 
Title page and Protocol dated 10/30/2018 
Title page and Protocol dated 12/14/2018 
Title page and Protocol dated 02/25/2019 
Title page dated 06/25/19 
Title page and Protocol dated 06/26/2019 
Title page and Protocol dated 06/12/2020 
Version 01 
Version 02 
Version 03 
Version 04 
Version 05 
Version 06 
Version 07 
Version 08 
Version 09 
SPONSOR/IND NUMBER: 
City of Hope / N/A 
DISEASE SITE: 
Renal cell carcinoma 
STAGE (if applicable): 
N/A 
MODALITY: 
N/A 
PHASE/TYPE: 
Non-therapeutic / Prospective Sample Collection 
PRINCIPAL INVESTIGATOR: 
Sumanta Pal, M.D. 
City of Hope Comprehensive Cancer Center 
1500 E. Duarte Rd 
Duarte, CA 91010 
P: 626-256-4673 
F: 626-301-8233 
E-mail: spal@coh.org  
 
COLLABORATING INVESTIGATORS: 
 
Clayton Lau, M.D. 
Marcin Kortylewski, Ph.D. 
Huiqing Wu, M.D. 
Ravi Salgia, M.D. 
Tanya Dorff, M.D. 
Sarah Highlander, PhD at TGen  
 
STUDY STATISTICIANS: 
 
Paul Frankel, Ph.D. 
Sierra Min Li, Ph.D. 
PARTICIPATING SITES: 
City of Hope, Duarte, CA  


Page 2 of 3 
IRB Protocol No. 16088 
 
Version Date:  06/12/2020 
Version:  09 
FUNDING SUPPORT: 
Pfizer, Inc 


Page 1 of 35 
IRB Protocol No. 16088 
 
Version Date:  06/12/2020 
Version:  09 
 
CITY OF HOPE NATIONAL MEDICAL CENTER 
1500 E. DUARTE ROAD 
DUARTE, CA 91010 
DEPARTMENT OF MEDICAL ONCOLOGY AND THERAPEUTICS RESEARCH 
TITLE: Assessment of the role of Bifidobacterium‐containing food supplement Activia™ and 
Bacteriomic Profiling and Other Biomarkers Associated with Vascular Endothelial Growth Factor 
Tyrosine Kinase Inhibitor (VEGF‐TKI)‐Induced Diarrhea in Patients with Metastatic Renal Cell 
Carcinoma (mRCC)  
CITY OF HOPE PROTOCOL NUMBER: 
16088 
VERSION: 09 
Initial Submission 
Protocol dated   06/27/2016 
Version 00 
Amendment 1 
Amendment 2  
Amendment 3 
Amendment 4 
Amendment 5 
Amendment 6 
Amendment 7 
Amendment 8 
Amendment 9 
Protocol dated 05/25/2017 
Title page dated 01/31/2018 
Title page and Protocol dated 02/28/2018 
Title page and Protocol dated 10/30/2018 
Title page and Protocol dated 12/14/2018 
Title page and Protocol dated 02/25/2019 
Title page dated 06/25/19 
Title page and Protocol dated 06/26/2019 
Title page and Protocol dated 06/12/2020 
Version 01 
Version 02 
Version 03 
Version 04 
Version 05 
Version 06 
Version 07 
Version 08 
Version 09 
SPONSOR/IND NUMBER: 
City of Hope / N/A 
DISEASE SITE: 
Renal cell carcinoma 
STAGE (if applicable): 
N/A 
MODALITY: 
N/A 
PHASE/TYPE: 
Non‐therapeutic / Prospective Sample Collection 
PRINCIPAL INVESTIGATOR: 
Sumanta Pal, M.D. 
City of Hope Comprehensive Cancer Center 
1500 E. Duarte Rd 
Duarte, CA 91010 
P: 626‐256‐4673 
F: 626‐301‐8233 
E‐mail: spal@coh.org  
 
COLLABORATING INVESTIGATORS: 
 
Clayton Lau, M.D. 
Marcin Kortylewski, Ph.D. 
Huiqing Wu, M.D. 
Ravi Salgia, M.D. 
Tanya Dorff, M.D. 
Sarah Highlander, PhD at TGen  
 
STUDY STATISTICIANS: 
 
Paul Frankel, Ph.D. 
Sierra Min Li, Ph.D. 
PARTICIPATING SITES: 
City of Hope, Duarte, CA  


Page 2 of 35 
IRB Protocol No. 16088 
 
Version Date:  06/12/2020 
Version:  09 
 
FUNDING SUPPORT: 
Pfizer, Inc 


Bacteriomic Profiling Associated with Vascular Endothelial Growth Factor Tyrosine Kinase Inhibitor‐Induced Diarrhea 
Page 3 of 35 
IRB Protocol No. 16088 
 
Version Date:  06/12/2020 
Version:  09 
EXPERIMENTAL DESIGN SCHEMA 
 
Metastatic Renal Cell Carcinoma Patients  
About to Initiate Therapy with Vascular Endothelial Growth Factor Tyrosine Kinase Inhibitor (VEGF‐TKI)  
Patient Orientation/Education 
Week 9 
Review/Collect Study Log 
Week 13* 
Review/Collect Study Log 
Research Blood Sample 
Within 7 Days Prior to the Start of 
VEGF‐TKI 
Research Blood Sample 
Week 2 
Stool Sample Collection 
and Drop Off at FedEx 
Week 3 
Stool Sample Collection 
and Drop Off at FedEx 
Week 13* 
Stool Sample Collection 
and Drop Off at FedEx 
Week 4 
Stool Sample Collection 
and Drop Off at FedEx 
Data collection from Medical Record of: 
•
AEs 
•
Concomitant Medications 
•
VEGF‐TKI dose 
Response 
If randomized to dietary intervention, consumption of Activia yogurt.*** 
 Completion of Daily Log for: 
•
Diet 
•
Intake of Yogurt 
•
Stool Sample Frequency 
In the Clinic 
At Home 
Screening and Enrollment  
20 Participants 
Within 7 Days Prior to the 
Start of VEGF‐TKI 
Research Blood Sample 
Week 3 
Review/Collect Study Log 
Research Blood Sample 
** At onset of Diarrhea** 
Stool Sample Collection 
and Drop Off at FedEx 
Week 6 
Review/Collect Study Log 
***If randomized to dietary intervention, participant will be asked to consume one 4 oz serving of Activia vanilla 
yogurt in the morning and one 4 oz serving of Activia vanilla yogurt in the evening for the duration of the study. 
**Within 24 hours of onset of diarrhea following initiation of VEGF‐TKI, a stool sample is to be provided 
*If a participant ends VEGF‐TKI before week 13, a final sample is to be provided, and the study logs to that time point 
are to be collected. Study participation will end at that time. 
Randomization 


Bacteriomic Profiling Associated with Vascular Endothelial Growth Factor Tyrosine Kinase Inhibitor‐Induced Diarrhea 
Page 4 of 35 
IRB Protocol No. 16088 
 
Version Date:  06/12/2020 
Version:  09 
TABLE OF CONTENTS 
SECTION                                                                                                                                                      PAGE 
Experimental Design Schema ........................................................................................................... 3 
Table of Contents ............................................................................................................................. 4 
Abbreviations ................................................................................................................................... 5 
1.0 
Objectives ........................................................................................................................... 7 
2.0 
Background and rationale ................................................................................................... 7 
2.1 
Introduction and Rationale for Study .................................................................... 7 
2.2 
Overview and rationale of study design .............................................................. 10 
3.0 
Participant Number, Cohort Characteristics, Eligibility, and Involvement ....................... 11 
3.1 
Sample number and cohort characteristics ......................................................... 11 
3.2 
Eligibility ............................................................................................................... 11 
3.3 
Duration of Participation and Overview of What Is Expected From Participants 12 
4.0 
Study Activity Table .......................................................................................................... 13 
4.1 
Study Activity Table ............................................................................................. 13 
5.0 
Clinical Data Collection ..................................................................................................... 14 
5.1 
Participant Daily Diary ......................................................................................... 14 
5.2 
Data Collected from the Medical Record ............................................................ 14 
6.0 
Blood Specimens, assessment of Treg, STAT3 and MDSC ................................................ 14 
6.1 
Research Blood Specimen Collection and Transfer to Processing Laboratory .... 14 
6.2 
Initial Sample Processing – Isolation of PBMCs ................................................... 15 
6.3 
Sample Analysis ................................................................................................... 15 
7.0 
Dietary intervention, Stool Specimens, Bacteriomic Profiling .......................................... 15 
7.1 
Dietary Intervention............................................................................................. 15 
7.2 
Stool Specimen Collection ................................................................................... 16 
7.3 
Laboratory Processing and Analysis ..................................................................... 16 
8.0 
Statistical Considerations .................................................................................................. 17 
8.1 
Study Design and Statistical Analysis ................................................................... 18 
8.2 
Sample Size and Projected Accrual Rate and Study Duration ............................. 19 
9.0 
Human Subject Issues ....................................................................................................... 19 
9.1 
Recruitment of Subjects....................................................................................... 19 
9.2 
Advertisements .................................................................................................... 19 
9.3 
Informed Consent ................................................................................................ 19 
9.4 
Participant Withdrawal from Research ............................................................... 20 
9.5 
Study location and Performance Sites ................................................................. 20 


Bacteriomic Profiling Associated with Vascular Endothelial Growth Factor Tyrosine Kinase Inhibitor‐Induced Diarrhea 
Page 5 of 35 
IRB Protocol No. 16088 
 
Version Date:  06/12/2020 
Version:  09 
9.6 
Potential Risks and Benefits to Participation ....................................................... 20 
9.7 
Alternatives to Participation ................................................................................ 20 
9.8 
Financial Obligations and Compensation ............................................................ 21 
9.9 
Registration into MIDAS....................................................................................... 21 
9.10 
Confidentiality ...................................................................................................... 21 
10.0 
Data and Safety Monitoring, Unanticipated Problems and Adverse Event Reporting ..... 21 
10.1 
Definition of Risk Level......................................................................................... 21 
10.2 
Monitoring and Personnel Responsible for Monitoring ...................................... 21 
10.3 
Unanticipated Problems (UP) Involving Risks to Subjects or Others ................... 21 
10.4 
Deviations ............................................................................................................ 22 
10.5 
Reporting Deviations ........................................................................................... 22 
10.6 
Single Subject Exception (SSE) Amendment Request .......................................... 22 
11.0 
Institutional Review Board ................................................................................................ 22 
11.1 
Institutional Review Board ................................................................................... 22 
12.0 
References ........................................................................................................................ 22 
Appendix A: Stool Collection Procedure ........................................................................................ 24 
Appendix B:    Diet and Stool Frequency Log ................................................................................. 28 
Appendix C: At Home Sample Collection Kit Contents .................................................................. 31 
Appendix D: Yogurt‐Intake Log…………………………………………………………………………………………….28 
Appendix E: PHQ‐9…………………………………………………………………………………………………………………….34 
Appendix F: GAD‐7…………………………………………………………………………………………………………………….35 
ABBREVIATIONS 
Abbreviation 
Meaning 
AE 
Adverse event 
CFR 
Code of Federal Regulations 
COH 
City of Hope 
CRA 
Clinical research associate 
CRF 
Case report form 
CTCAE 
Common Terminology Criteria for Adverse Events 
DSMC 
Data Safety Monitoring Committee 
FDA 
GAD‐7 
Food and Drug Administration 
Generalized Anxiety Disorder  
GCP 
Good clinical practice 
ICF 
Informed consent form 
IRB 
Institutional review board 
MDSC 
Myeloid‐derived suppressor cells 
NCI 
National Cancer Institute 
PBMC 
PHQ‐9 
Peripheral blood mononuclear cells 
 Patient Health Questionnaire 
PI 
Principal investigator 
PMT 
Protocol monitoring team 


Bacteriomic Profiling Associated with Vascular Endothelial Growth Factor Tyrosine Kinase Inhibitor‐Induced Diarrhea 
Page 6 of 35 
IRB Protocol No. 16088 
 
Version Date:  06/12/2020 
Version:  09 
RPN 
Research patient number 
SAE 
Serious adverse event 
 
 


Bacteriomic Profiling Associated with Vascular Endothelial Growth Factor Tyrosine Kinase Inhibitor‐Induced Diarrhea 
Page 7 of 35 
IRB Protocol No. 16088 
 
Version Date:  06/12/2020 
Version:  09 
1.0 OBJECTIVES 
Primary objective 
 
To determine if adding Activia™ yogurt (containing Bifidobacterium lactis DN‐173 010) to the 
diet of patients with metastatic renal cell carcinoma (mRCC) increases the level of 
Bifidobacterium spp in stool.  
Secondary objectives  
 
To determine if Activia™ reduces the incidence of diarrhea for mRCC patients treated with 
vascular endothelial growth factor – tyrosine kinase inhibitor (VEGF‐TKI) therapy. 
 
To compare pre‐treatment levels of circulating Treg cells and levels of peripheral STAT3 in 
patients with and without diarrhea with VEGF‐TKI therapy, and correlate with Bifidobacterium, 
other bacteria, and Activia™. 
 
To determine if patients with the diarrhea in mRCC patients treated with VEGF‐TKI therapy have 
a lower baseline level of Bifidobacterium spp.  
 
To assess the change in global stool microbiome profile of patients receiving therapy with VEGF‐
TKI therapy with or without Activia™  
 
To better assess the feasibility of stool collection and bacteriomic profiling. 
 
To explore association between psychosocial symptoms (anxiety and depression) and 
bacteriomic profile and gastrointestinal toxicity in mRCC patients receiving VEGF‐TKI therapy.  
2.0 BACKGROUND AND RATIONALE 
2.1 Introduction and Rationale for Study 
Recent Developments in mRCC: A Crowded Landscape 
Over the past 6 years, a total of 6 targeted therapies have been approved for the treatment of mRCC.1  
These agents can be divided into two principal categories: (1) inhibitors of the vascular endothelial growth 
factor receptor (VEGFR), and (2) inhibitors of the mammalian target of rapamycin (mTOR).  The former 
category  includes  both  VEGF‐TKIs  such  as  axitinib,  sunitinib,  pazopanib  and  sorafenib,  as  well  as 
monoclonal  antibodies  such  as  bevacizumab  that  inhibit  VEGFR  through  ligand  binding.  National 
Comprehensive Cancer Network (NCCN) guidelines recommend use of vascular endothelial growth factor 
directed therapies across different lines of mRCC treatment. For example sunitinib, pazopanib, axitinib, 
sorafenib and bevacizumab (the latter in combination with interferon‐, IFN‐) is recommended for the 
first  and  subsequent  lines  of  mRCC  treatment  and  cabozantinib  in  the  second  and  further  lines  of 
treatment..2  In contrast, the two currently approved mTOR inhibitors are generally implemented in more 
selected settings – for instance, everolimus is used after failure of VEGF‐TKI therapy, while temsirolimus 
is used in patients with poor‐risk disease or non‐clear cell histology.  All together, VEGF‐TKIs are the most 
commonly utilized treatments in patients with mRCC in the United States. 3 
Limitations to Therapy: Managing Toxicity  
The multitude of available agents for mRCC often makes it challenging for the oncologist and patient to 
select the appropriate therapeutic strategy.  For instance, for the treatment‐naïve patient with mRCC, 
how might the oncologist choose between the monoclonal antibody bevacizumab, and VEGF‐TKIs?  There 
are no head to head comparisons between the agents, and thusly, the oncologist is virtually forced to 
make cross‐trials comparisons.  Aside from considering the efficacy of these therapies across studies, the 


Bacteriomic Profiling Associated with Vascular Endothelial Growth Factor Tyrosine Kinase Inhibitor‐Induced Diarrhea 
Page 8 of 35 
IRB Protocol No. 16088 
 
Version Date:  06/12/2020 
Version:  09 
oncologist may consider toxicity.  Diarrhea appears to be particularly problematic with VEGF‐TKI therapy, 
for example sunitinib nearly 50% of patients reporting some degree of diarrhea, usually first occurring 
within the first two cycles of therapy , and 10% of patients developing grade 3/4 toxicity (i.e., toxicities 
warranting dose modification or treatment discontinuation).4  In contrast, few patients experience severe 
diarrhea in association with bevacizumab therapy.5,6  The phenomenon of diarrhea appears to be quite 
consistent across VEGF‐TKIs, as seen in Table 1.  Notably, even VEGF‐TKIs used in the second line setting, 
such as axitinib, yield similar rates of diarrhea.7  The frequency of diarrhea encountered with these agents 
is quite startling.   
 
 
Bacteriomic Profiling: A Laboratory‐Based Biomarker of VEGF‐TKI Induced Diarrhea?  
Recent technological advances now allow for complete bacteriomic profiling of intestinal flora using 16S 
rRNA sequencing.8 Although such techniques have not been utilized specifically in the context of cancer 
therapeutics, there is existing data using fecal DNA sequencing that suggests the composition of intestinal 
flora can influence the development of diarrhea with specific cytotoxics.  For instance, in the context of 
irinotecan therapy, Stringer et al have performed an elegant series of experiments in preclinical models 
suggesting that ‐glucoronidase‐producing Escherichia coli (which metabolize irinotecan) may increase 
during  the  course  of  irinotecan  therapy.8    The  increase  in  E.  coli  in  turn  exacerbates  observed 
gastrointestinal toxicity.   
There is rationale for VEGF‐TKI therapy altering the intestinal flora.  Our group has previously published 
data suggesting an immune‐mediated effect of sunitinib, decreasing T‐regulatory (Treg) cell populations 
via  STAT3.9    Separately,  it  is  documented  that  Tregs  may  play  a  role  in  gut  homeostasis,  promoting 
tolerance of various luminal bacteria.10  Taken together, sunitinib and other VEGF‐TKI agents in the same 
therapeutic class may promote an autoimmune response that shifts the equilibrium of intestinal flora 
composition.   
Protective Effect of Probiotics 
In contrast, “gastrointestinal protective” bacterial, such as Bifidobacterium spp., decreased during the 
course of treatment. Notably, probiotic formulations including Bifidobacterium spp. have been noted to 
improve acute diarrhea in a multitude of settings.11,12  A recently completed randomized, phase II study 
comparing one such probiotic to placebo in patients receiving radiotherapy for cervical cancer showed an 
improvement in the incidence of diarrhea with probiotic treatment.13 


Bacteriomic Profiling Associated with Vascular Endothelial Growth Factor Tyrosine Kinase Inhibitor‐Induced Diarrhea 
Page 9 of 35 
IRB Protocol No. 16088 
 
Version Date:  06/12/2020 
Version:  09 
COH IRB 12096: A Pilot Study 
The current team of investigators embarked on a project 
sponsored  by  the  COH  Cancer  Center  Core  Grant.  We 
collected  random  stool  samples  from  a  cohort  of  23 
patients  with  mRCC  while  receiving  VEGF‐directed 
therapies.  Ultimately, 20 patients provided satisfactory 
samples  for  evaluation.    Amongst  these  patients,  the 
majority were treated with sunitinib or pazopanib. 16S 
rRNA profiling using the methods described herein was 
used  to  characterize  the  stool  bacterial  flora  of  these 
patients.  Patients  receiving  VEGF‐TKIs  with  mRCC 
appeared  to  have  less  relative  abundance  of 
Bifidobacterium  spp  as  compared  to  previous  reports 
based on healthy subjects. Patients also had higher levels 
of Bacteroides spp and lower levels of Prevotella spp were 
found in patients with diarrhea.  
We interpret the results of COH IRB 12096 cautiously, as there are several caveats to this work:   
1. The sample size is small,  
2. There was heterogeneity of treatments rendered 
3. Stool collections were done at random time points 
4. There was no control of dietary factors 
Despite the aforementioned limitations, COH IRB 12096 established the feasibility of stool collections and 
subsequent  bacteriomic  analysis  and  suggested  the  possibility  that  the  propensity  for  the  diarrhea 
observed could be due to the low abundance of Bifidobacterium spp observed in this patient population 
and  that  supplementing  with  Bifidobacterium  would  change  the  flora  and  also  change  the  relative 
abundance  of  Bacteroides.    An  SOP  for  stool  collection  and  analysis  was  developed  that  will  be 
implemented in the current study.  
Psychosocial aspects 
The management of psychosocial symptoms (anxiety and depression) has gained attention in cancer care. 
In this scenario, there is evidence showing the association between psychosocial and physical symptoms.13  
Gastrointestinal  symptoms,  particularly  diarrhea,  is  one  of  the  common  side  effects  among  cancer 
patients  who  are  receiving  sunitinib  therapy3,  and  it  is  known  that  mood  could  be  influenced  by 
gastrointenstinal manifestations and biological mechanisms (as abnormalities in the gut‐brain axis, shared 
genetic  factors,  inflammation)  in  gastrointestinal  chronic  inflammatory  diseases14‐16;  however  little  is 
known about the relationship between psychosocial symptoms, bacteriomic profile and gastrointestinal 
toxicity in mRCC patients. Therefore, future studies should be conducted in order to understand this 
association. 
To date, there is relatively limited data to characterize the symptoms of anxiety and depression in patients 
with renal cell carcinoma. There is no specific measure for assessing these symptoms in patients with 
mRCC, except for a recent guideline for screening, and assessment of anxiety and depressive symptoms 
in adults with cancer17. Generalized Anxiety Disorder (GAD)‐7 is recommended as a good measure to 
assess significant symptoms of anxiety, and the Patient Health Questionnaire for Depression (PHQ)‐9 of 
depression. Both measures are based on the Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (DSM). 


Bacteriomic Profiling Associated with Vascular Endothelial Growth Factor Tyrosine Kinase Inhibitor‐Induced Diarrhea 
Page 10 of 35 
IRB Protocol No. 16088 
 
Version Date:  06/12/2020 
Version:  09 
The  GAD‐718  is  a  one‐dimensional  self‐administered  scale  designed  to  assess  the  presence  of  the 
symptoms of anxiety. Score is calculated by simple addition of the answers to each item. Scores for all 7 
items range from 0 (not at all) and 3 (nearly every day). Therefore, the total scores ranges from 0 and 21, 
and may be categorized into four severity groups: minimal (0‐4), mild (5‐9), moderate (10‐14) and serious 
(14‐20).Questionnaire administration time is 5 minutes. 
The PHQ‐916 focuses on the nine signs and symptoms of depression from the DSM, and has a dual‐purpose, 
to establish a provisional disorder diagnosis and to provide a symptom severity score. High scores indicate 
increasing severity of depression. For a diagnosis of depression, five or more items must be scored as 
present more than half of the days or nearly every day. A PHQ‐9 score of 5‐9 indicates minimal depressive 
symptoms, a score of 10‐14 is minor depression or major depression that is mild, a score of 15‐19 is major 
depression,  moderately  severe,  and  a  score  >  20  indicates  major  depression,  sever.  Questionnaire 
administration time is 5 minutes.  
Patients will be assessed for anxiety and depression at 2 distinct time‐points: at baseline (before starting 
sunitinib ‐ T1) and at week 13 (T2) to match the proposed assessments of stools and gastrointestinal 
toxicity. 
 
2.2 Overview and rationale of study design 
Diarrhea  is  a  significant  toxicity  experienced  by  roughly  50%  of  patients  treated  with  VEGF‐TKIs. 
Identifying  a  pre‐treatment  biomarker  associated  with  treatment‐related  diarrhea  may  lead  to  the 
development of a pre‐treatment conditioning regimen. Data from our pilot study in metastatic renal cell 
carcinoma  (mRCC)  patients  undergoing  VEGF‐TKI  therapy  demonstrated  a  notably  low  abundance  of 
Bifidobacterium spp.  The primary objective of this study will be to ascertain whether or not the simple 
addition  of  Activia™  yogurt  (containing  Bifidobacterium  lactis  DN‐173  010)  will  reduce  this  dysbiosis.  
Changing the abundance of this species, and indirectly other species in the complex microbiota population 
prior to initiating therapy may decrease in VEGF‐TKI related diarrhea.   
Twenty patients with mRCC will be recruited prior to initiating standard of care therapy with VEGF‐TKIs, 
and will be followed for three months of therapy for specimen and data collection.  Patients will be treated 
according  to  NCCN  guideline  recommendations  for  each  VEGF‐TKI  agent.  An  intervention  will  be 
performed. Specifically, patients will be randomized to either a probiotic‐supplemented group (Activia™) 
or a probiotic‐restricted group using a permuted block design to ensure the 20 patients were assigned to 
the two groups with 1:1 ratio. Patients in the probiotic‐supplemented group will be asked to consume one 
4 oz serving of Activia vanilla yogurt in the morning and one 4 oz serving of Activia vanilla yogurt in the 
evening daily for the 3 month study period and patients in the probiotic‐restricted group will be asked to 
avoid any intake of yogurt or yogurt‐containing foods for the evaluation period of the study. 
Several stool collections will be performed. Stool samples will be collected prior to initiating VEGF‐TKI 
treatment,  one  week  after  initiating  therapy,  two  weeks  after  initiating  therapy,  three  weeks  after 
initiating therapy (i.e. after the first week off of therapy), three months (13 weeks) into VEGF‐TKI therapy, 
and at the onset of diarrhea. A stool specimen at the onset of diarrhea would reflect changes in the 
bacteriome that could potentially drive onset of this symptom.  Compliance with stool submission has not 
been an issue in our pilot study (IRB 12096).  All stool samples will be collected by the participant at home 
and sent via overnight shipping to the laboratory at City of Hope.  Participants will receive training on the 
sample collection process. Participants will also be asked to complete a diet log and stool frequency log 
that uses the CTCAE v4.0 definitions of diarrhea: 


Bacteriomic Profiling Associated with Vascular Endothelial Growth Factor Tyrosine Kinase Inhibitor‐Induced Diarrhea 
Page 11 of 35 
IRB Protocol No. 16088 
 
Version Date:  06/12/2020 
Version:  09 
 
Grade 1: Increase of <4 stools per day over baseline; mild increase in ostomy output compared to 
baseline 
 
Grade 2: Increase of 4 ‐ 6 stools per day over baseline; moderate increase in ostomy output 
compared to baseline 
 
Grade 3: Increase of >=7 stools per day over baseline; incontinence;hospitalization indicated; 
severe increase in ostomy output compared to baseline; limiting self care ADL 
 
Grade 4: Life‐threatening consequences;urgent intervention indicated 
 
Grade 5: Death 
For purposes of the current study, we are interested in characterizing the incurrence of all grade diarrhea 
(e.g., grade 1‐5 toxicity); however, the grade of diarrhea incurred will be specified. 
From the serial stool samples, Bifidobacterium spp. levels and stool bacteriomic profile over time will be 
assessed and associations will be examined between patients who experience diarrhea and those who do 
not.   
To explore potential confounding factors or associations of interest between the bacteriomic profile and 
the presence of diarrhea, data collection will include: intake of yogurt, general description of daily diet, 
prior anti‐cancer therapies, concomitant medications during the study period, and response to VEGF‐TKIs.  
These data will be collected from the participant’s medical record or from the participant’s daily log. 
As  differences  in  intestinal  flora  may  be  immune‐mediated,  pre‐treatment  levels  of  circulating  T‐
regulatory cells, myeloid derived suppressor cells and levels of peripheral STAT3 will be compared in 
patients with and without treatment‐related diarrhea.  For these analyses, participants will provide a 10‐
ml blood sample at the time of three stool specimen collections (prior to initiating VEGF‐TKIs, two weeks 
after initiating therapy, and three months into therapy). 
3.0 PARTICIPANT NUMBER, COHORT CHARACTERISTICS, ELIGIBILITY, AND INVOLVEMENT 
3.1 Sample number and cohort characteristics 
Twenty COH metastatic renal cell carcinoma patients about to undergo treatment with VEGF‐TKIs will be 
enrolled to a single cohort at COH.   
3.2 Eligibility 
Patient MRN: 
Patient Initials:  (L,F,M): 
3.2.1 
Inclusion Criteria 
Participants must meet the following criteria on screening examination to be eligible to participate in the 
study:  
___ 1. Age 18 or older  
___ 2. Cytologically or pathologically verified diagnosis of RCC 
___ 3. Diagnosis  of  RCC  that  is  defined  as  metastatic  by  standard  criteria  (AJCC  7th 
edition, 2010) 
___ 4. Planned  treatment  with  any  VEGF‐TKI  treatment  with  treatment  has  not  yet 
begun  
___ 5. Ability to understand and the willingness to sign a written informed consent 
___ 6. Ability to read and write English 


Bacteriomic Profiling Associated with Vascular Endothelial Growth Factor Tyrosine Kinase Inhibitor‐Induced Diarrhea 
Page 12 of 35 
IRB Protocol No. 16088 
 
Version Date:  06/12/2020 
Version:  09 
___ 7. Documented  consent  to  participation  to  include  the  following  study  specific 
procedures: 
a. Be able to provide to up to six serial stool collections at home and deliver to 
FedEx location that day as per standard operating procedure (Appendix A)  
b. Have three 10‐ml blood samples taken during a routine clinic visit 
c. To not take probiotic supplements except as oriented 
d. If  randomized  to  the  probiotic‐supplemented  group  (the  yogurt‐based 
supplement Activia), be willing to comply with daily intake and record this 
intake as a component of a dietary log. The patient will be asked not to take 
any yogurt or yogurt‐containing foods beyond this.   
e. If randomized to the probiotic‐restricted group, agree not to consume yogurt 
or yogurt‐containing foods  
Maintain a dietary log and stool frequency log (Appendix B)  
3.2.2 
Exclusion Criteria 
Prospective participants who meet any of the following criteria will not be eligible for admission into the 
study: 
___ 1. Patients with a known intolerance to lactose or other constituents of Activia 
___ 2. Patients  with  irritable  bowel  syndrome,  Crohn’s  disease,  or  other  clinically 
significant  GI  related  condition  that  might  confound  the  VEGF‐TKI‐related‐
diarrhea endpoint 
___ 3. Patients taking antibiotics or who plan to begin taking antibiotics.  
___ 4. Any other condition that would, in the Investigator’s judgment, contraindicate 
the  patient’s  participation  in  the  clinical  study  due  to  safety  concerns  or 
compliance with clinical study procedures (including compliance issues related to 
feasibility/logistics) 
3.2.3 
Inclusion of Women and Minorities 
The study is open to all patients who meet eligibility criteria, regardless of gender or ethnicity.  
3.3 Duration of Participation and Overview of What Is Expected From Participants 
Participants will be in the trial for roughly three and a half months, initiating with informed consent 
procedures prior to commencing VEGF‐TKIs and ending week 13 of VEGF‐TKI therapy.  Participants will 
provide five to six stool samples at home during participation, which they will then take to a local FedEx 
drop off location that same day. Participants will also provide three blood samples and complete a diet 
log and stool frequency log during participation. Half of all participants will be asked to consume vanilla 
yogurt twice a day during the study.  The product is widely available and will be purchased by participant; 
reimbursement  will  be  offered.    Participants  will  be  asked  to  refrain  from  taking/consuming  other 
probiotics. 


Bacteriomic Profiling Associated with Vascular Endothelial Growth Factor Tyrosine Kinase Inhibitor‐Induced Diarrhea 
Page 13 of 35 
IRB Protocol No. 16088 
 
Version Date:  06/12/2020 
Version:  09 
4.0 STUDY ACTIVITY TABLE 
4.1 Study Activity Table 
 
Screeninga 
Pre‐tx 
VEGF‐TKI treatmentb 
Wk 1 
Wk 2 
Wk3 
Wk 4 
Wk 13 
Informed consentc 
X 
 
 
 
 
 
 
Eligibility reviewd 
X 
 
 
 
 
 
 
Registratione 
X 
 
 
 
 
 
 
Participant orientationf 
 
Xf 
 
 
 
 
 
Research blood collectiong 
 
Xg 
 
 
Xg 
 
Xg 
Planned stool specimensh 
 
Xi 
 
Xj 
Xj 
Xj 
Xj 
Stool specimen at onset of diarrheah 
 
 
‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐Xk ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ 
Study log review/collection 
 
 
 
 
Xl 
 
Xl 
Data collection m 
 
 
X 
 
X 
 
X 
Dietary interventionn 
 
Xn 
 
Xn 
Xn 
Xn 
Xn 
PHQ‐9 and GAD‐7 o 
 
X 
 
 
 
 
X 
a. Screening procedures are to occur prior to research sample collection with the following caveat: 
If the sample is collected on the same day as completion of eligibility review, the informed consent 
and eligibility review must precede sample collection; registration must occur that very day but 
may be before or after sample collection.  
b. Participants  who  end  vascular  endothelial  growth  factor  tyrosine  kinase  inhibitor  (VEGF‐TKI) 
treatment prior to Week 13 will jump to the ‘Week 13’ assessments which will be performed 
within 1 week of the decision to end VEGF‐TKI treatment. 
c. Informed consent to occur before any study specific screening procedures. 
d. Inclusion/exclusion  criteria  are  found  in  Section  3.2.  Source  documentation  providing 
investigator’s confirmation that patient has met all eligibility criteria must be available prior to 
registration. 
e. Registration into MIDAS. 
f. 
Participants will receive training on completion of the diet log, stool frequency log, and stool 
specimen collection SOP by the clinician investigator.  This education will be noted in the medical 
record.  
g. One sample of blood for research will be collected within 7 days before start of VEGF‐TKI, at Week 
3 (+/‐ 1 week), and at Week 13. Efforts will be made to collect the sample at the time of routine 
blood sample collection. Blood will be collected into 10 mL CPT vacutainer tube, inverted slowly 
about 8‐10 times, maintained at RT and transported to pathology laboratory, who will ensure the 
sample  is  labeled  with  the  “COH    IRB  #16088”,  the  participants  RPN,  and  time  and  date  of 
collection, prior to transport to the Kortylewski laboratory.  The Kortylewski laboratory should be 
notified of planned samples via email (mkortylewski@coh.org or other designee) preferably at 
least a day in advance of sample collection. The sample should be brought to the Kortylewski as 
soon as possible for processing to begin within 4 hours of the time of collection. 
h. All stools samples to be collected at home and dropped off the same day to a FedEx location prior 
to that day’s FedEx pick‐up, per Stool Collection SOP (Appendix A). 
i. 
Pre‐treatment stool samples to be collected within 7 days of start of VEGF‐TKI.   
j. 
Week 2, Week 3, Week 4, and Week 13 stool samples to be provided any day Monday to Thursday 
on the designated week. 


Bacteriomic Profiling Associated with Vascular Endothelial Growth Factor Tyrosine Kinase Inhibitor‐Induced Diarrhea 
Page 14 of 35 
IRB Protocol No. 16088 
 
Version Date:  06/12/2020 
Version:  09 
k. If diarrhea is not incurred, submission of stool is not required. Sample to be collected as early as 
possible after the onset of diarrhea such that the sample can be collected and delivered to FedEx 
drop off (Monday‐Thursday only).  
l. 
Efforts will be made to review and/or collect the study log with participants on weeks 3, 6, 9, and 
13 which correspond to the times when patients taking VEGF‐TKI are usually seen (and assessed 
with CBC w/ dif and serum chemistry) after three weeks of treatment. It will not be a deviation if 
the visits to review/collect study logs are delayed or combined. 
m. Data will be collected and entered into eCRFs from the participant provided logs and the medical 
record.  Data to be collected within two weeks of the end of the defined study point. 
n. If patients are randomized to the probiotic‐supplemented group, they will be asked to purchase 
Activia vanilla yogurt. Patients will be asked to consume one 4 oz serving of Activia vanilla yogurt 
in the morning and one 4 oz serving of Activia vanilla yogurt in the evening beginning Week 2 and 
through Week 13.  
o. Symptoms of anxiety and depression will be assessed at the baseline (before start the treatment) 
and at the Week 13 (Section 8.0). 
 
 
5.0 CLINICAL DATA COLLECTION 
5.1 Participant Daily Diary 
Participants will be oriented to complete the daily study log, found in Appendix B. The log will be collected 
and reviewed during visits to the clinic at the end of each 3‐week treatment regimen (weeks 3, 6, 9 and 
13 of treatment). The following information from the diary will be entered into the study specific database 
for analysis: 
 
Diarrhea,  categorized  per  CTCAE  4.0  diarrhea  grading.    Please  note  that  the  patient  will  be 
instructed to consider diarrhea to be an increase in stool frequency of < 4 over baseline.  This 
definition is consistent with the CTCAE 4.0 terminology for grade 1 diarrhea.  
 
Stool specimen collection dates 
 
Yogurt intake, or intake of yogurt‐containing foods 
5.2 Data Collected from the Medical Record 
The following data will be obtained from the medical record and recorded in the study specific database:  
 
Age at registration, gender 
 
Prior anti‐cancer therapy 
 
Concurrent medications from the time of informed consent through end of participation 
 
VEGF‐TKI dose and administration 
 
Smoking status 
 
Response status (as noted by treating investigator: PD, SD, CR, PR)  
6.0 BLOOD SPECIMENS, ASSESSMENT OF TREG, STAT3 AND MDSC 
6.1 Research Blood Specimen Collection and Transfer to Processing Laboratory 
One 10ml CPT tube will be collected within 7 days before start of VEGF‐TKI, during week 3, and during 
week 13 (+/‐ 1 week).  The pre‐treatment sample may be collected on the morning of initiation of therapy, 
so long as the sample precedes VEGF‐TKI intake. Efforts will be made to collect the sample at the time of 


Bacteriomic Profiling Associated with Vascular Endothelial Growth Factor Tyrosine Kinase Inhibitor‐Induced Diarrhea 
Page 15 of 35 
IRB Protocol No. 16088 
 
Version Date:  06/12/2020 
Version:  09 
routine blood sample collection. Blood will be collected into 10 mL CPT vacuum tube, inverted slowly 
about 8‐10 times, maintained at room temperature. 
The sample will be labeled with the date, time of collection, IRB # 16088, and the participant’s unique 
research participant number, prior to the prompt transport to the laboratory of Dr. Marcin Korylewski for 
correlative analyses.   
The Kortylewski laboratory should be notified of planned samples via email (mkortylewski@coh.org) or 
other laboratory designee preferably at least a day in advance of sample collection.  
6.2 Initial Sample Processing – Isolation of PBMCs 
Processing of samples will occur at in the laboratory of Dr. Marcin Kortylewski. The 10ml CPT tube samples 
will be processed within 4 hours of collection to avoid degradation of the phosphomoieties (i.e., pSTAT3) 
assessed in this protocol.  CPT tubes will be centrifuged at 1800 x g (approximately 2800 rpm on a Sorvall 
RT6000 centrifuge) for 20 minutes at room temperature.  After centrifugation, plasma in the CPT tubes 
will be gently pipetted against the gel plug to dislodge cells stuck to the top of the gel.  The cell suspension 
will be transferred to a 50 mL conical polypropylene tube.  cRPMI will be added to a total of 40 mL.  A 10 
mL aliquot of cell suspension for counting will be removed.  The 50 mL tubes will then be centrifuged at 
250 x g for seven minutes at room temperature.  When centrifugation is complete, the supernatant will 
be aspirated.  PMBCs will be either cryopreserved or used fresh.   
6.3 Sample Analysis 
Analysis of samples for Treg, STAT3 and MDSC will occur in the laboratory of Dr. Marcin Kortylewski.  
Relevant  WBC  subsets  will  be  conducted  through  previously  reported  techniques.19  PBMCs  will  be 
immersed  in a mixture of PBS, 2% FCS and 0.1% (wt/vol) sodium azide with Fc III/IIR‐specific antibody to 
block  nonspecific  binding  and  stained  the  cells  with  different  combinations  of  fluorochrome‐coupled 
antibodies to CD11c, I‐Ab (MHC class II), CD86, CD11b, Gr1, CD49b, CD3, CD25 or Lag‐3, or with annexin V 
(BD Biosciences). We collected fluorescence data on FACSCalibur (Beckton Dickinson) and analyzed them 
using FlowJo software (Tree Star).  This method has been previously published by Chalmin et al.20 
7.0 DIETARY INTERVENTION, STOOL SPECIMENS, MICROBIOME PROFILING 
7.1 Dietary Intervention  
Using  methods  described  in  statistical  analysis,  patients  will  be  randomized  either  to  a  probiotic‐
supplemented group or a probiotic‐restricted group for 3 months.  If patients are randomized to the 
probiotic‐supplemented group, they will be asked to purchase Activia vanilla yogurt. Patients will be asked 
to consume one 4 oz serving of Activia vanilla yogurt in the morning and one 4 oz serving of Activia vanilla 
yogurt in the evening for a total of 3 months.  Patients will be cautioned not to take alternative Activia 
products, such as Activia Greek yogurt, Activia drinks, etc., and should not consume other flavors of Activia 
yogurt (i.e., fruit‐containing yogurt).  Patients will further be asked to be mindful of storage directions for 
Activia, as listed in the product label, and to further abide by expiry dates for the product.  Patients 
enrolled on this arm should not take other yogurt or yogurt‐containing foods, and should also refrain from 
probiotic supplements during the three month study period. Notably, methods for this randomization 
(i.e., recommendation of a dietary intervention without direct supply of actual food contents) replicates 
the format of a large prospective study published in the New England Journal of Medicine assessing the 
cardiac benefit of a Mediterranean diet.21 If patients are randomized to the probiotic‐restricted group, 
they will be asked to not take other yogurt or yogurt‐containing foods, and should also refrain from 
probiotic supplement during the 3 month study period.  At the conclusion of the 3‐month study period 
(or earlier if VEGF‐TKIis withdrawn due to progression or toxicity or the patient is taken off this protocol 


Bacteriomic Profiling Associated with Vascular Endothelial Growth Factor Tyrosine Kinase Inhibitor‐Induced Diarrhea 
Page 16 of 35 
IRB Protocol No. 16088 
 
Version Date:  06/12/2020 
Version:  09 
by patient or physician choice), patients may submit receipts to the study coordinator for reimbursement 
for Activia.  As discussed subsequently, the dietary logs should reflect all oral intake, including dietary 
interventions prescribed by this study.  
7.2 Stool Specimen Collection 
Fecal  material  will  be  collected  in  a  100  mL  collection  container  by  patients.    A  standard  operating 
procedure (SOP) has been generated for stool collection, as outlined in Appendix A. Stool collection kit 
contents  are  listed  in  Appendix  B.  A  copy  of  this  SOP  will  be  provided  to  the  patient  and  their 
understanding of the SOP will be documented by the PI.  
All samples will be collected by participants at home and dropped to a FedEx location on the day of sample 
collection  and  prior  to  that  day’s  final  delivery.    Samples  will  be  affixed  with  the  subject’s  research 
participant number and the date on which the sample was collected. The collection container will be 
placed in a FedEx box that is pre‐labeled with the address of Dr. Ravi Salgia’s laboratory. The sender 
address will be denoted as the City of Hope Duarte campus (1500 E. Duarte Rd) and will not show the 
subject’s personal address. The sample will arrive at Dr. Ravi Salgia’s laboratory the next day and will be 
stored in Dr. Ravi Salgia’s laboratory until processing and analysis.   
Samples will be collected pre‐treatment, week 2, week 3, week 4, and week 13 of VEGF‐TKI treatment.  
Participants who stop taking VEGF‐TKI prior to week 13 will have a final sample collected within a week of 
the decision to end VEGF‐TKI treatment. 
In addition, participants will be requested to provide a stool sample at the earliest feasible occasion 
following onset of diarrhea.  The specimen should be collected and dropped off to a FedEx location prior 
to that day’s final pickup on a Monday through Thursday.  
7.3 Laboratory Processing and Analysis 
All stool samples from subjects accrued to the study on or before the the date of this protocol will be sent 
to and stored in the laboratory of Dr. Ravi Salgia.  Stool stored  in Dr.  Ravi  Salgia’s laboratory will be 
transferred to Dr. Sarah K. Highlander’s laboratory at TGen North, to the attention of John Gillece (3051 
W. Shamrell Blvd, Suite 106, Flagstaff, AZ, 86005) for processing and final analysis. All stool samples from 
subjects accrued to the study after the date of this protocol will be sent directly to Dr. Sarah Highlander’s 
laboratory at TGen North in Flagstaff, AZ. 
Bacterial microbiome analysis 
Total genomic DNA will be isolated from 0.25 g of feces using the PowerSoil DNA isolation kit (Mo Bio, 
USA).    Purified  DNA  will  be  separated  on  a  1%  agarose  gel  and  quantified  by  densitometry  and 
spectrophotometry  (NanoDrop  1000;  Thermo  Scientific,  USA).    As  described  by  Stearns  et  al,  a    PCR 
protocol will be used to amplify bacterial 16S rRNA genes from all samples.8  Following PCR primers 
including Illumina part of adapter sequences will be used to amplify V4 and V5 regions. 
V4‐F: ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGTGCCAGCMGCCGCGGTAA.  
V4‐R: ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGTGCCAGCMGCCGCGGTAA.  
 V5‐F:  ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGATTAGATACCCTGGTAG. 
 V5‐R: GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCGTCAATTCMTTTGAGTTT.   
Complete Illumina adapter and barcodes will be added by another 5 cycles of PCR to make Illumina library. 
After  bioanalyzer  and  qPCR  checking  for  QC.  Multiple  libraries  will  be  mixed  equally.  Paired‐end  of 
sequencing (250bp or 300bp) will be performed by Illumina MiSeq V2/V3. Sequences will be clustered at 


Bacteriomic Profiling Associated with Vascular Endothelial Growth Factor Tyrosine Kinase Inhibitor‐Induced Diarrhea 
Page 17 of 35 
IRB Protocol No. 16088 
 
Version Date:  06/12/2020 
Version:  09 
a variety of percent identities using USEARCHalgorithm against the closed=reference.22 Taxonomy will 
then be assigned using the RDP 2.4 classifier as described in Smith et .al. 
Illumina MiSeq high throughput sequencing will be used to sequence the 16S rRNA gene. Libraries will be 
constructed for all samples by amplification of V4 or V5 region of bacterial 16S rRNA.  Barcodes will be 
created to uniquely index and label each sample for multiplex Illumina sequencing with paired end reads. 
Multiple test runs will be created first to ensure the validity in 16S rRNA amplification from the fecal 
samples and standard QC will be performed to examine the quality of multiplex Illumina sequencing.  Low‐
quality reads will be removed and only reads that are perfectly match the assembly will be kept for further 
downstream analysis. 
Fungal microbiome analysis 
DNA will be extracted from stool samples using the MagMax PowerMicrobiome extraction kit using the 
KingFisher Flex magnetic purification system (ThermoFisher, Waltham, MA). All DNAs will be validated for 
purity  and  integrity  by  agarose  gel  electrophoresis,  and  fungal  load  will  be  quantitated  using  the 
FungiQuant  TaqMan  assay  before  proceeding  to  sequencing.  DNAs  will  be  subjected  to  internally 
transcribed spacer gene sequencing using the )ITS4‐Fun AGCCTCCGCTTATTGATATGCTTAART and 5.8S‐Fun 
AACTTTYRRCAAYGGATCWCT primers with dual‐indexed bar codes as described by Kozich et al.14‐16 A DNA 
mock community that contains two fungal species will be sequenced as a positive control (Zymo, D6306) 
as  will  an  extraction  blank  as  a  negative  control.  Libraries  will  be  quantitated  using  KAPA  Library 
Quantification  Kit  (KAPA  Biosystems),  normalized  and  pooled  then  sequenced  on  the  Illumina  MiSeq 
instrument using the v2 kit (2 x250 bp) targeting 20,000 reads per sample.  
Demultiplexed ITS reads will be processed and clustered into operational taxonomic units (OTUs) using 
QIIME2.17 Demultiplexed reads will be denoised using dada2 then clustered into OTUs using q2‐dbotu. 
Taxonomic classification will be performed using feature‐classifier classify‐sklearn. Various QIIME2 plugins 
will be used to build a phylogenetic tree (phylogeny), calculate alpha diversity within samples (diversity 
plugin) and beta diversity between samples (diversity plugin). We have found that simple alpha diversity 
calculations, such as inverse Simpson diversity, Shannon and Chao estimates, and examination of the 
dominant genera in each sample provides a good first impression of the composition of the sample. We 
will use several different types of distance methods (Bray Curtis, UniFrac) to examine and compare the 
community  distribution  of  the  samples.  These  data  will  be  examined  by  multidimensional  scaling  or 
principal components analysis and heatmaps will be created using hclust2. 
Whole  metagenome  sequencing  provides  a  complete  picture  of  the  taxonomic  composition  of  a 
microbiome than does 16S rRNA gene or ITS sequencing and also permits predictions of microbiome 
function, which we can tie to metabolic and proteomic results. Metagenomics also has been used for the 
discovery of clinical biomarkers and will allow us to identify antibiotic resistance genes. Metagenomic 
DNA will be sequenced on the Illumina NextSeq platform to a depth of 2 Gb/sample.18‐19 Human reads will 
be  identified  by  mapping  them  to  the  human  genome  GRCh38.p7  using  BowTie2  and  they  will  be 
removed. Demultiplexed reads will be quality trimmed using Trimmomatic to remove adapters and low‐
quality bases and reads.20‐21 Trimmed metagenomic reads will be taxonomically profiled using MetaPhlAn 
2.0. Functional profiling of the metagenomes will be performed using HUMAnN2, which annotates open 
reading  frames  (ORFs)  and  generates  gene  family  abundances,  metabolic  pathway  coverage  and 
abundances. Antimicrobial resistance genes will be identified by mapping to a curated version of the 
Resfams database. Resistance genes of interest will be verified by targeted amplicon sequencing.22‐25 


Bacteriomic Profiling Associated with Vascular Endothelial Growth Factor Tyrosine Kinase Inhibitor‐Induced Diarrhea 
Page 18 of 35 
IRB Protocol No. 16088 
 
Version Date:  06/12/2020 
Version:  09 
8.0 STATISTICAL CONSIDERATIONS 
8.1 Study Design and Statistical Analysis 
Primary Objective: 
Compare the change from baseline Bifidobacterium spp. between the Activia group and the group 
without Activia.  
The  primary  measurement  is  the abundance of Bifidobacterium spp. in stool since probiotic 
formulations  including  Bifidobacterium  spp.  have  been  noted  to  improve  acute  diarrhea  in  a 
multitude  of  settings11,12  and  mRCC  patients  in  our  pilot  study  have  very  low  abundance  of 
Bifidobacterium spp.  The objective is to determine whether the levels of Bifidobacterium spp. 
increase in patients getting Activia™, and compare to a control group.   Operational taxonomic 
units (OTUs) for bacterial will be identified by QIIME and the relative abundance will be estimated 
as the percentage of reads belong to certain OUT. T‐test or mann‐whitney test will be used to test 
the difference in change from baseline in relative abundance for Bifidobacterium spp.  between 
patients with or without Activia™ added to the diet. If the data appear symmetrical and the t‐test 
is used, with 20 patients enrolled and 10 in each group, assuming equal variance in each group, 
using one‐sided t‐test at type I error of 0.05, we will have 80% power to detect a larger change in 
average abundance of Bifidobacterium spp in patients receiving Activia™ than those who are not 
randomized to take Activia™.   If abundance and change is too low in the non‐Activia™ arm to 
employ the t‐test, we will employ the Mann‐Whitney test.  A sample size of 10 in each group will 
have  85%  power  to  detect  a  probability  of  85%  that  an  observation  in  the  change  in 
Bifidobacterium spp abundance in the Activia ™ arm is larger than an observation in the change 
in the non‐Activia ™ arm using a Wilcoxon (Mann‐Whitney) rank‐sum test with a 0.050 one‐sided 
significance level.   
 
Secondary Objectives: 
1) To determine if the Activia™ reduces the incidence of diarrhea for mRCC patients treated with VEGF‐
TKIs. 
We will compare the rate of all grade diarrhea in patients who receive the dietary supplement and those 
who do note.  The rate of grade 3/4 diarrhea will also be compared between the two groups. A Fisher's 
exact test with a 0.050 one‐sided significance level will have 80% power to detect the difference 
between the Activia™ group proportion with diarrhea, 1, of 0.200 and a non‐Activia™ proportion, 2, of 
0.800 when the sample size in each group is 10. 
 
2) To compare pre‐treatment levels of circulating Treg cells and levels of peripheral STAT3 in patients 
with and without diarrhea with sunitinib therapy, and correlate with Bifidobacterium, other 
bacteria, and Activia™: 
Treg quantity is a secondary measurement and an analysis will be carried out to evaluate whether Tregs 
expression differs in patients who develop diarrhea with VEGF‐TKI therapy as compared to patients who 
do not. The distribution of the Treg quantity will be examined and log transformation may be applied if 
the distribution is skewed. Parametric or nonparametric test will be used to compare Tregs between the 
the diarrhea and non‐diarrhea groups, and between the Activia™ and non‐Activia™ groups.  
3) To determine if patients with the diarrhea in mRCC patients treated with VEGF‐TKI therapy have a 
lower baseline level of Bifidobacterium spp.  


Bacteriomic Profiling Associated with Vascular Endothelial Growth Factor Tyrosine Kinase Inhibitor‐Induced Diarrhea 
Page 19 of 35 
IRB Protocol No. 16088 
 
Version Date:  06/12/2020 
Version:  09 
Once diarrhea has occurred, the Bifidobacterium spp may be reduced.  We will compare the abundance 
of Bifidobacterium spp. Between diarrhea and non‐diarrhea patients and the change in Bifidobacteria in 
patients who subsequently get diarrhea.  
4) To explore association between psychosocial symptoms (anxiety and depression) and bacteriomic 
profile and gastrointestinal toxicity in mRCC patients treated with VEGF‐TKIs. We will dichotomize the 
population based on low or high depression (and subsequently low and high anxiety).  Using descriptive 
statistics, we will then assess differences in response rates, gastrointesntinal toxicity, microbial diversity 
and immune biomarkers.   
 
Other endpoints: 
Clustering  short  read  sequences,  identify  operational  taxomomic  units  (OTUs)  and  summarize 
microbiome profiles.  
QIIME will be used to cluster V5‐16S rRNA Solexa reads for each sample, at the level of 97% nucleotide sequence 
identity.    A  closed‐reference  OUT  picking  protocol  with  USEARCH  against  Greengenes  database  will  be  used. 
Taxonomy will be assigned using RDP classifier 2.4. The relative abundance of OTUs will be calculated at phylum‐, 
class‐, order‐genus‐ and species‐level taxa.  Weighted and unweighted UniFrac distances between samples will be 
calculated with a de novo tree constructed from representative sequences defining each OTU. A table of OTU counts 
per will be generated and used in combination with the tree to calculate beta diversity. The association between 
the subclusters and phenotypic variables will be studied. Principle coordinate analysis (PCoA) will be used 
to examine possible correlation between phylum/genus and other phenotypic variables.   
.  
Asssess the feasibility of stool collection and bacteriomic profiling.  
We  will  assess  the  feasibility  of  bacteriomic  profiling.    Specifically,  we  will  make  note  of  those  stool 
specimens for could not be performed.  Reasons for an inability to perform this analysis will be noted (for 
instance, insufficient DNA collection) and the number of specimens that could not be analyzed will be 
expressed as a proportion of the overall specimens collected.  These data will be integral for the future 
directions of this project, where stool collection will be performed for the same purposes in larger cohorts.    
8.2 Sample Size and Projected Accrual Rate and Study Duration 
Twenty participants will be metastatic renal cell carcinoma will enroll to the study.  Enrollment is expected 
to be completed in 3 years, and the study is expected to be completed in 3.5 years.  
9.0 HUMAN SUBJECT ISSUES 
9.1 Recruitment of Subjects 
Potential participants will be approached by their physicians or a member of the clinical staff and invited 
to participate within the outpatient clinic environment.  
9.2 Advertisements  
No publicly displayed advertisements will be used to recruit potential study participants.   
9.3 Informed Consent 
All participants will undergo standard written informed consent procedures as dictated by the City of Hope 
Human Research Protections Office prior to performing any screening procedures that are not part of 
standard‐of‐care.  Informed  consent  will  be  obtained  by  the  principal  investigator,  collaborating 


Bacteriomic Profiling Associated with Vascular Endothelial Growth Factor Tyrosine Kinase Inhibitor‐Induced Diarrhea 
Page 20 of 35 
IRB Protocol No. 16088 
 
Version Date:  06/12/2020 
Version:  09 
investigators, or other IRB designated personnel who will meet the training requirements established by 
the IRB. With the support of research personnel, he/she will explain the nature, duration, purpose of the 
study,  potential  risks,  alternatives  and  potential  benefits,  and  all  other  information  contained  in  the 
informed consent document.  In addition, they will review the experimental subject’s bill of rights and the 
HIPAA research authorization form.  Prospective research participants will be informed that they may 
withdraw  from  the  study  at  any  time  and  for  any  reason  without  prejudice.    Prospective  research 
participants will be afforded sufficient time to consider whether or not to participate in the research. 
9.4 Participant Withdrawal from Research 
At any time after signing the informed consent document, participants may elect to withdraw from future 
study procedures (stool sample) but permit clinical data collection to continue, or may elect to withdraw 
completely from the study whereby no additional samples or data will be collected.  In this later instance, 
data  and  samples  already  collected  will  continue  to  be  used  as  this  information  will  have  been  de‐
identified with the exception of the RPN. Participant withdrawal, including the nature of withdrawal, will 
be documented by the investigator as per standard COH practice.   
9.5  Study location and Performance Sites 
Participant involvement and data collection and blood sample analysis will be performed at City of Hope. 
Stool sample processing and analysis will be performed in Dr. Sarah K. Highlander’s laboratory at TGen 
North in Flagstaff, AZ.  
9.6 Potential Risks and Benefits to Participation 
9.6.1 
Potential risks to participation 
The  risks  and  discomforts  of  this  study  are  minimal.    The  risks  of  drawing  blood  include  temporary 
discomfort from the needle stick, minor bleeding, bruising, anemia, dizziness, and very rarely, an infection 
where the needle was inserted.  All blood specimens requested for this study will be collected at the time 
of routine procedures, as such there will not be any additional needle stick, and the risk to the participant 
will be minimized.  
The risks of establishing a data specimen repository and medical record data collection are minimal and 
include a  possible breach of confidentiality. The risk of breach in confidentiality will  be  mitigated  by 
following procedures detailed in Section 9.10. 
The risks of a dietary intervention with a yogurt product are minimal and include allergic reactions (if not 
previously known) and minor GI‐related complaints. 
Furthermore, the anxiety and depression assessment have a potential risk of a temporary emotional 
discomfort.  
9.6.2 
Potential benefits to participation 
There is no direct significant benefit to the research participant.  However, the participant may benefit 
from the knowledge that his/her participation may help others.  
9.6.3 
Potential benefits to others 
Information from this study is expected to contribute to the identification of biomarkers that may help 
inform treatment decisions by clinicians treating patients for cancer for which one  treatment option 
involves a VEGF‐TKI agent. 
9.7 Alternatives to Participation 
The patient can choose not to participate, and this will not impact their medical care in any way.  


Bacteriomic Profiling Associated with Vascular Endothelial Growth Factor Tyrosine Kinase Inhibitor‐Induced Diarrhea 
Page 21 of 35 
IRB Protocol No. 16088 
 
Version Date:  06/12/2020 
Version:  09 
9.8 Financial Obligations and Compensation 
In the event of physical injury to a research participant, resulting from research procedures, appropriate 
medical treatment will be available at the City of Hope to the injured research participant, however, 
financial compensation will not be available. 
The research participant will not be paid for taking part in this study. If randomized to the probiotic‐
supplemented group, reimbursement will be provided for this intervention if requested by the patient. 
9.9 Registration into MIDAS 
Research participants will be registered into MIDAS for this trial.   
9.10 Confidentiality 
This research will be conducted in compliance with federal and state of California requirements relating 
to protected health information (PHI).  
All samples will be coded prior to submission to the research laboratories. The coded identifier will be the 
COH research patient number (RPN), provided by the MIDAS system, which is devoid of direct participant 
identifiers. The key to the code is maintained in MIDAS which is a secure environment.  
All study related forms including consent documents and patient pill diaries will be stored in locked and 
secure locations.   
Medical  records  of  participants  will  be  securely  maintained  in  the  strictest  confidence,  according  to 
current legal requirements.  All information will be treated confidentially.  No identifiers will be used in 
any subsequent publication of these results.   
10.0 DATA AND SAFETY MONITORING, UNANTICIPATED PROBLEMS AND ADVERSE EVENT REPORTING 
10.1 Definition of Risk Level 
This is a Risk Level 2 study, as defined in the City of Hope Institutional Data and Safety Monitoring Plan 
[policy effective date:  07/09/14], because it involves blood sample collection, establishment of a data 
specimen repository, medical record data collection, and a dietary intervention with yogurt where the risk 
of harm is low.  
10.2 Monitoring and Personnel Responsible for Monitoring 
The Principal Investigator (PI) is responsible for monitoring protocol conduct and reporting to the City of 
Hope  (COH)  Data  and  Safety  Monitoring  Committee  (DSMC)  and  Institutional  Review  Board  (IRB)  as 
indicated in the sections below.   
10.3 Unanticipated Problems (UP) Involving Risks to Subjects or Others 
An unanticipated problem is any incident, experience or outcome that meets all three of the following 
criteria: 
1.  Unexpected (in terms of  nature, severity, or frequency) given the following: a) the research 
procedures that are described in the protocol‐related documents such as the IRB approved 
research  protocol,  informed  consent  document  or  Investigator  Brochure  (IB);  and  b)  the 
characteristics of the subject population being studied; AND 
2.  Related or possibly related to participation in the research (possibly related means there is a 
reasonable possibility that the incident, experience, or outcomes may have been caused by 
the procedures involved in the research); AND 


Bacteriomic Profiling Associated with Vascular Endothelial Growth Factor Tyrosine Kinase Inhibitor‐Induced Diarrhea 
Page 22 of 35 
IRB Protocol No. 16088 
 
Version Date:  06/12/2020 
Version:  09 
3.  Suggests  that  the  research  places  participants  or  others  at  greater  risk  of  harm  (including 
physical, psychological, economic, or social harm) than previously known or recognized. 
Any UP that occurs during the study conduct will be reported to the DSMC and IRB in accordance with the 
City of Hope’s Institutional policy [policy effective date:  05/14/14] using the electronic submission system, 
iRIS. 
10.4 Deviations 
A deviation is a divergence from a specific element of a protocol and that occurred without prior IRB 
approval.  Deviations from the approved protocol should be avoided, except when necessary to eliminate 
an immediate hazard to a research participant.  A Corrective and Preventative Action (CAPA) plan should 
be developed by the study staff and implemented promptly to avoid similar issues in the future.  All 
deviations from the protocol must be documented in study source documents and promptly reported to 
the DSMC and IRB.   
10.5 Reporting Deviations 
Investigators may deviate from the protocol to eliminate immediate hazards for the protection, safety, 
and well‐being of the study subjects without prior IRB approval.  For any such deviation, the PI will notify 
the DSMC and IRB, within 5 calendar days of its occurrence by electronic submission of a Deviation Notice 
via iRIS. 
10.6 Single Subject Exception (SSE) Amendment Request 
Deviations  from  the  written  protocol  that  are  not  done  to  eliminate  an  immediate  hazard(s)  for  the 
protection, safety and well‐being of study subjects but may increase risk and/or alter the protocol integrity 
require prior IRB approval.  The deviation is submitted as a Single Subject Exception (SSE) amendment 
request.  An IRB approved SSE does not need to be submitted as a protocol deviation to the DSMC.  The 
SSE should be submitted according to the IRB guidelines and COH Institutional Deviation Policy [policy 
effective date:  11/07/11] and submitted via iRIS. 
A deviation that is not an SSE (i.e., discovered after the occurrence) must be reported to the COH DSMC 
and  IRB  according  to  the  COH  Institutional  Deviation  Policy  [policy  effective  date:    11/07/11]  and 
submitted via iRIS. 
11.0 INSTITUTIONAL REVIEW BOARD 
11.1 Institutional Review Board 
In accordance with City of Hope policies, an Institutional Review Board (IRB) that complies with the federal 
regulations at 45 CFR 46 and 21 CFR 50, 56 and State of California Health and Safety code, Title 17,  must 
review and approve this protocol and the informed consent  form and process prior to initiation of the 
study.  All institutional, NCI, Federal, and State of California regulations must be fulfilled. 
This study must be approved by an appropriate institutional review committee as defined by Federal 
Regulatory Guidelines (Ref. Federal Register Vol. 46, No. 17, January 27, 1981, Part 56) and the Office for 
Protection from Research Risks Reports: Protection of Human Subjects (Code of Federal Regulations 45 
CFR 46).  
12.0 REFERENCES 
1. 
Pal SK, Figlin RA. Renal cell carcinoma therapy in 2010: many options with little comparative data. 
Clin Adv Hematol Oncol 2010;8:191‐200. 


Bacteriomic Profiling Associated with Vascular Endothelial Growth Factor Tyrosine Kinase Inhibitor‐Induced Diarrhea 
Page 23 of 35 
IRB Protocol No. 16088 
 
Version Date:  06/12/2020 
Version:  09 
2. 
Greaves  TS,  Olvera  M,  Florentine  BD,  et  al.  Follicular  lesions  of  thyroid:  a  5‐year  fine‐needle 
aspiration experience. Cancer 2000;90:335‐41. 
3. 
Jonasch E, Signorovitch JE, Lin PL, et al. Treatment patterns in metastatic renal cell carcinoma: a 
retrospective  review  of  medical  records  from  US  community  oncology  practices.  Current  Medical 
Research and Opinion 2014;30:2041‐50. 
4. 
Motzer  RJ,  Hutson  TE,  Tomczak  P,  et  al.  Overall  Survival  and  Updated  Results  for  Sunitinib 
Compared  With  Interferon  Alfa  in  Patients  With  Metastatic  Renal  Cell  Carcinoma.  J  Clin  Oncol 
2009;27:3584‐90. 
5. 
Rini BI, Halabi S, Rosenberg JE, et al. Phase III Trial of Bevacizumab Plus Interferon Alfa Versus 
Interferon Alfa Monotherapy in Patients With Metastatic Renal Cell Carcinoma: Final Results of CALGB 
90206. J Clin Oncol 2010;28:2137‐43. 
6. 
Escudier BJ, Bellmunt J, Negrier S, et al. Final results of the phase III, randomized, double‐blind 
AVOREN  trial  of  first‐line  bevacizumab  (BEV)  +  interferon‐{alpha}2a  (IFN)  in  metastatic  renal  cell 
carcinoma (mRCC). J Clin Oncol (Meeting Abstracts) 2009;27:5020‐. 
7. 
Rini BI, Escudier B, Tomczak P, et al. Comparative effectiveness of axitinib versus sorafenib in 
advanced renal cell carcinoma (AXIS): a randomised phase 3 trial. Lancet 2011;378:1931‐9. 
8. 
Nosov D, Bhargava P, Esteves WB, et al. Final analysis of the phase II randomized discontinuation 
trial (RDT) of tivozanib (AV‐951) versus placebo in patients with renal cell carcinoma (RCC). ASCO Meeting 
Abstracts 2011;29:4550. 
9. 
Xin H, Zhang C, Herrmann A, Du Y, Figlin R, Yu H. Sunitinib inhibition of Stat3 induces renal cell 
carcinoma tumor cell apoptosis and reduces immunosuppressive cells. Cancer Res 2009;69:2506‐13. 
10. 
Albiges L, Antoun S, Martin L, et al. Effect of everolimus therapy on skeletal muscle wasting in 
patients with metastatic renal cell carcinoma (mRCC): Results from a placebo‐controlled study. ASCO 
Meeting Abstracts 2011;29:319. 
11. 
NCT01265901:  A  Randomized,  Controlled  Phase  III  Study  Investigating  IMA901  Multipeptide 
Cancer Vaccine in Patients Receiving Sunitinib as First‐line Therapy for Advanced/Metastatic Renal Cell 
Carcinoma (Available at http://www.clinicaltrials.gov; last accessed Augusts 15, 2011.). 
12. 
Agata N, Ueno N, Houzawa H, et al. Interim safety results from the all cases post‐marketing study 
(PMS) of sunitinib in 1,027 Japanese patients with renal cell carcinoma (RCC) or gastrointestinal stromal 
tumor (GIST). ASCO Meeting Abstracts 2011;29:e15133. 
13. 
Angevin E, Grunwald V, Ravaud A, et al. A phase II study of dovitinib (TKI258), an FGFR‐ and VEGFR‐
inhibitor,  in  patients  with  advanced  or  metastatic  renal  cell  cancer  (mRCC).  ASCO  Meeting  Abstracts 
2011;29:4551. 
14. 
Liu CM, Kachur S, Dwan MG, Abraham AG, Aziz M, Hsueh PR, Huang YT, Busch JD, Lamit LJ, Gehring 
CA et al: FungiQuant: a broad‐coverage fungal quantitative real‐time PCR assay. BMC Microbiol 2012, 
12:255. 
15. 
Taylor DL, Walters WA, Lennon NJ, Bochicchio J, Krohn A, Caporaso JG, Pennanen T: Accurate 
Estimation of Fungal Diversity and Abundance through Improved Lineage‐Specific Primers Optimized for 
Illumina Amplicon Sequencing. Appl Environ Microbiol 2016, 82(24):7217‐7226. 
16. 
Kozich  JJ,  Westcott  SL,  Baxter  NT,  Highlander  SK,  Schloss  PD:  Development  of  a  dual‐index 
sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq Illumina 
sequencing platform. Appl Environ Microbiol 2013, 79(17):5112‐5120. 


Bacteriomic Profiling Associated with Vascular Endothelial Growth Factor Tyrosine Kinase Inhibitor‐Induced Diarrhea 
Page 24 of 35 
IRB Protocol No. 16088 
 
Version Date:  06/12/2020 
Version:  09 
17. 
Bolyen E, Rideout JR, Dillon MR, Bokulich NA, Abnet CC, Al‐Ghalith  GA, Alexander H, Alm  EJ, 
Arumugam M, Asnicar F et al: Reproducible, interactive, scalable and extensible microbiome data science 
using QIIME 2. Nat Biotechnol 2019, 37(8):852‐857. 
18. 
Wen C, Zheng Z, Shao T, Liu L, Xie Z, Le Chatelier E, He Z, Zhong W, Fan Y, Zhang L et al: Quantitative 
metagenomics reveals unique gut microbiome biomarkers in ankylosing spondylitis. Genome Biol 2017, 
18(1):142. 
19. 
Yu  J,  Feng  Q,  Wong  SH,  Zhang  D,  Liang  QY,  Qin  Y,  Tang  L,  Zhao  H,  Stenvang  J,  Li  Y  et  al: 
Metagenomic  analysis  of  faecal  microbiome  as  a  tool  towards  targeted  non‐invasive  biomarkers  for 
colorectal cancer. Gut 2017, 66(1):70‐78. 
20. 
Langmead B, Salzberg SL: Fast gapped‐read alignment with Bowtie 2. Nat Methods 2012, 9(4):357‐
359. 
21. 
Bolger  AM,  Lohse  M,  Usadel  B:  Trimmomatic:  a  flexible  trimmer  for  Illumina  sequence  data. 
Bioinformatics 2014, 30(15):2114‐2120. 
22. 
Segata  N,  Waldron  L,  Ballarini  A,  Narasimhan  V,  Jousson  O,  Huttenhower  C:  Metagenomic 
microbial community profiling using unique clade‐specific marker genes. Nat Methods 2012, 9(8):811‐
814. 
23. 
Truong DT, Franzosa EA, Tickle TL, Scholz M, Weingart G, Pasolli E, Tett A, Huttenhower C, Segata 
N: MetaPhlAn2 for enhanced metagenomic taxonomic profiling. Nat Methods 2015, 12(10):902‐903. 
24. 
Franzosa EA, McIver LJ, Rahnavard G, Thompson LR, Schirmer M, Weingart G, Lipson KS, Knight R, 
Caporaso JG, Segata N et al: Species‐level functional profiling of metagenomes and metatranscriptomes. 
Nat Methods 2018, 15(11):962‐968. 
25. 
Gibson MK, Forsberg KJ, Dantas G: Improved annotation of antibiotic resistance determinants 
reveals microbial resistomes cluster by ecology. ISME J 2015, 9(1):207‐216. 
 
 
APPENDIX A: STOOL COLLECTION PROCEDURE 
STOOL COLLECTION KIT GENERAL INSTRUCTIONS 
As a part of your participation in the current study, we have some specific instructions related to collection 
of stool.  Please abide by these instructions, as they are essential for the proper conduct of the study. 
Keep a “cold pack” in your freezer so that it is ready when it is needed.  (We suggest putting them in your 
freezer when you get home). 
Samples should be collected only if: 
 
It is a Monday, Tuesday, Wednesday or Thursday.   
 
They can be taken to the FedEx drop‐off location before the last pick‐up 
time. 
The last pick‐up time is different for different locations; it can be as early as 3:00PM. 


Bacteriomic Profiling Associated with Vascular Endothelial Growth Factor Tyrosine Kinase Inhibitor‐Induced Diarrhea 
Page 25 of 35 
IRB Protocol No. 16088 
 
Version Date:  06/12/2020 
Version:  09 
Ask a study team member if you need assistance to locate a FedEx drop‐off location or find the time of 
the last pick‐up.  
You are being asked to collect samples at the following times: 
 
Before you begin treatment with VEGF‐TKI :__________ 
 
The week after the week you started VEGF‐TKI:_________ 
 
Two weeks after you started VEGF‐TKI:___________ 
 
Three weeks after you started VEGF‐TKI: __________ 
 
The  thirteenth  week  after  you  started  treatment  with  VEGF‐
TKI:_______________ 
 
On the first day you have diarrhea and the sample can be collected and 
dropped off (see example below). 
 
Examples of when to collect the diarrhea samples: 
EXAMPLE 1: If diarrhea begins on a Saturday, wait until Monday to collect a sample and take 
it that day to the FedEx drop off.  You do not need to still have diarrhea on Monday. 
EXAMPLE 2: If diarrhea begins on Wednesday, but you cannot take the sample to the FedEx 
location that day on time, wait until Thursday (the day after start of diarrhea) to collect the 
sample and take it to the drop off location. 
 
 
If you have any questions about sample collection, please call this number: ______________________ 
 
 


Bacteriomic Profiling Associated with Vascular Endothelial Growth Factor Tyrosine Kinase Inhibitor‐Induced Diarrhea 
Page 26 of 35 
IRB Protocol No. 16088 
 
Version Date:  06/12/2020 
Version:  09 
USING THE STOOL COLLECTION KIT 
Before you begin, review the following: 
a. The ice pack is cold (has been in the freezer). 
b. It is a Monday, Tuesday, Wednesday or Thursday. 
c. You are able to deliver the sample to the FedEx location before the final pick‐up time. 
 
STEP ONE: Please place the collection hat around 
the  rim  of  your  toilet  seat  to  allow  for  stool 
collection.  
 
 
STEP TWO: Use the small wooden stick provided 
to place a small sample of stool (about the size 
of your thumb) in the provided plastic container.  
 
 
STEP  THREE:  Seal  the  plastic  container  tightly.  
Write today’s date on the label. 
 
STEP  FOUR:  Place  the  plastic  container  in  the 
bag, and seal the back using the adhesive tape 
already present on the bag.  
 
 


Bacteriomic Profiling Associated with Vascular Endothelial Growth Factor Tyrosine Kinase Inhibitor‐Induced Diarrhea 
Page 27 of 35 
IRB Protocol No. 16088 
 
Version Date:  06/12/2020 
Version:  09 
STEP FIVE: Wrap the bag in the “cold pack”.  You 
should have the cold pack stored in your freezer 
(ideally, you will do this as soon as you bring the 
kit home).  
 
 
STEP SIX: Place the bag, surrounded by the cold 
pack, in the Styrofoam box.  
 
 
STEP  SEVEN:  Place  the  Styrofoam  box  in  the 
cardboard box. This box should already have a 
mailing  label  affixed  to  it,  addressed  to  our 
research group at City of Hope. 
 
 
STEP  EIGHT:  Drop  the  box  off  at  the  nearest 
FedEx  location  this  same  day  before  the  final 
pick‐up time.   
THANK YOU FOR YOUR PARTICIPATION! 
 
 
 
 
 


Bacteriomic Profiling Associated with Vascular Endothelial Growth Factor Tyrosine Kinase Inhibitor‐Induced Diarrhea 
Page 28 of 35 
IRB Protocol No. 16088 
 
Version Date:  06/12/2020 
Version:  09 
APPENDIX B:    DIET AND STOOL FREQUENCY LOG  
DIET and STOOL FREQUENCY LOG ‐ GENERAL INSTRUCTIONS 
As a part of your participation in the current study, we are requesting that you complete a study log every day. 
General pointers: 
 
When you come to the clinic, bring your logs with you. 
 
Each page has room for seven days – one row should be completed for each day. 
 
If you are randomized to Group A, please consume one 4 oz serving of Activia vanilla yogurt in the morning and one 4 oz serving of Activia 
vanilla  yogurt  in  the  evening.  Please  do  not  take  any  more  yogurt  or  yogurt‐containing  foods  beyond  this.  Please  also  do  not  take 
alternative Activia products, such as Activia Greek yogurt, Activia drinks, etc., or other flavors of Activia yogurt (i.e., fruit‐containing yogurt   
 
If you are randomized Group B, please avoid any intake of yogurt or yogurt‐containing foods.  
Example of how the top part of the log will look: 
 
A study team member will complete the information in this box before you leave the clinic. 
 
Example of how the information you enter might look:   
 
You or someone close to can complete the log for you, so long as the information is correct.  
 
List all prescription and non‐prescription medications. 
 
The person who completes that day’s entry should write his or her initials in the last column. 
 
Example of the signature line: 
 
When you hand over the document to the study team, they will ask to sign and date at the bottom of each log if you agree that the 
information is complete and correct. 
 


Bacteriomic Profiling Associated with Vascular Endothelial Growth Factor Tyrosine Kinase Inhibitor‐Induced Diarrhea 
Page 29 of 35 
IRB Protocol No. 16088 
 
Version Date:  06/12/2020 
Version:  09 
COMPLETED BY STUDY TEAM                       Participant Initials:                                Participant Research Number:                           Group:           
 
Day 
and 
Date 
General description of food I ate: 
Did I eat 
yogurt or take 
probiotics? 
How was my stool frequency? 
Was a stool 
sample 
collected? 
Medications taken 
Initials of 
person filling 
information 
 
Eggs, toast, juice 
Ham sandwich, coke, potato chips 
Steak, m ashed potatoes, wine 
⃝ Yes 
⃝ No 
⃝Seems like baseline 
⃝1‐3 stools more than baseline 
⃝4‐6 stools more than normal 
⃝7 or more than baseline, or incontinence 
⃝ Yes 
⃝ No 
Vitamin C, 
lipitor 
 
JBC 
 
 
⃝ Yes 
⃝ No 
⃝ Seems like baseline 
⃝1‐3 stools more than baseline 
⃝4‐6 stools more than normal 
⃝7 or more than baseline, or incontinence 
⃝ Yes 
⃝ No 
 
 
 
 
⃝ Yes 
⃝ No 
⃝ Seems like baseline 
⃝1‐3 stools more than baseline 
⃝4‐6 stools more than normal 
⃝7 or more than baseline, or incontinence 
⃝ Yes 
⃝ No 
 
 
 
 
⃝ Yes 
⃝ No 
⃝ Seems like baseline 
⃝1‐3 stools more than baseline 
⃝4‐6 stools more than normal 
⃝7 or more than baseline, or incontinence 
⃝ Yes 
⃝ No 
 
 
 
 
⃝ Yes 
⃝ No 
⃝ Seems like baseline 
⃝1‐3 stools more than baseline 
⃝4‐6 stools more than normal 
⃝7 or more than baseline, or incontinence 
⃝ Yes 
⃝ No 
 
 
 
 
⃝ Yes 
⃝ No 
⃝ Seems like baseline 
⃝1‐3 stools more than baseline 
⃝4‐6 stools more than normal 
⃝7 or more than baseline, or incontinence 
⃝ Yes 
⃝ No 
 
 
X 
X 
X 


Bacteriomic Profiling Associated with Vascular Endothelial Growth Factor Tyrosine Kinase Inhibitor‐Induced Diarrhea 
Page 30 of 35 
IRB Protocol No. 16088 
 
Version Date:  06/12/2020 
Version:  09 
 
 
⃝ Yes 
⃝ No 
⃝ Seems like baseline 
⃝1‐3 stools more than baseline 
⃝4‐6 stools more than normal 
⃝7 or more than baseline, or incontinence 
⃝ Yes 
⃝ No 
 
 
  
At the time of handing over the document   ‐‐   Participant Signature: __________________________________________ Date _____________________________


Bacteriomic Profiling Associated with Vascular Endothelial Growth Factor Tyrosine Kinase Inhibitor‐Induced Diarrhea 
Page 31 of 35 
IRB Protocol No. 16088 
 
Version Date:  06/12/2020 
Version:  09 
APPENDIX C: AT HOME SAMPLE COLLECTION KIT CONTENTS 
 
Contents of each kit to be provided to participants for at home collection: 
Copy of Appendix A, Instructions for Stool Specimen Collection 
Stool collection hat 
Specimen container 
With label attached 
 
Label should have participant identifier added; the participant will be oriented to add the 
date himself/herself. 
Plastic seal bag 
Cold pack 
Styrofoam box 
Cardboard box (into which Styrofoam box fits) 
Prepaid FedEx shipping pouch  
 
Shipping label should already be attached with COH as the sender and the recipient 
 


Bacteriomic Profiling Associated with Vascular Endothelial Growth Factor Tyrosine Kinase Inhibitor‐Induced Diarrhea 
Page 32 of 35 
IRB Protocol No. 16088 
 
Version Date:  06/12/2020 
Version:  09 
APPENDIX D:    YOGURT‐INTAKE LOG  
YOGURT‐INTAKE LOG ‐ GENERAL INSTRUCTIONS 
As a part of your participation in the current study, we are requesting that you complete a yogurt‐intake log every day. 
General pointers: 
 
When you come to the clinic, bring your logs with you. 
 
Each page has room for seven days – one row should be completed for each day. 
 
You have been randomized to the probiotic‐supplemented group. Please consume one 4 oz serving of Activia vanilla yogurt in the morning and 
one 4 oz serving of Activia vanilla yogurt in the evening. Please do not take any more yogurt or yogurt‐containing foods beyond this. Please also 
do not take alternative Activia products, such as Activia Greek yogurt, Activia drinks, etc., or other flavors of Activia yogurt (i.e., fruit‐containing 
yogurt).   
 
Please log the serving size and time of each yogurt‐intake 
Example of how the top part of the log will look: 
 
A study team member will complete the information in this box before you leave the clinic. 
 
Example of how the information you enter might look:   
 
You or someone close to can complete the log for you, so long as the information is correct.  
 
The person who completes that day’s entry should write his or her initials in the last column. 
 
Example of the signature line: 
 
When you hand over the document to the study team, they will ask to sign and date at the bottom of each log if you agree that the information is 
complete and correct. 


Bacteriomic Profiling Associated with Vascular Endothelial Growth Factor Tyrosine Kinase Inhibitor‐Induced Diarrhea 
Page 33 of 35 
IRB Protocol No. 16088 
 
Version Date:  06/12/2020 
Version:  09 
COMPLETED BY STUDY TEAM                       Participant Initials:                                Participant Research Number:                           Group:           
 
Day and Date 
 
Serving Size 
Time of Yogurt‐Intake 
Initials of person 
filling information 
7/1/2016 
MORNING 
4 oz 
10:00 AM 
JBC 
EVENING 
4 oz 
7:00 PM 
 
MORNING 
 
 
JBC 
EVENING 
 
 
 
MORNING 
 
 
JBC 
EVENING 
 
 
 
MORNING 
 
 
JBC 
EVENING 
 
 
 
MORNING 
 
 
JBC 
EVENING 
 
 
 
MORNING 
 
 
JBC 
EVENING 
 
 
 
MORNING 
 
 
JBC 
EVENING 
 
 
  
At the time of handing over the document   ‐‐   Participant Signature: __________________________________________ Date __________________________ 
 


Bacteriomic Profiling Associated with Vascular Endothelial Growth Factor Tyrosine Kinase Inhibitor‐Induced Diarrhea 
Page 34 of 35 
IRB Protocol No. 16088 
 
Version Date:  06/12/2020 
Version:  09 
APPENDIX E: PHQ‐9  
Samples questionnaire is shown below. 
  
 


Bacteriomic Profiling Associated with Vascular Endothelial Growth Factor Tyrosine Kinase Inhibitor‐Induced Diarrhea 
Page 35 of 35 
IRB Protocol No. 16088 
 
Version Date:  06/12/2020 
Version:  09 
APPENDIX E: GAD‐7 
Sample questionnaire is shown below