Búsqueda de factores de transcripción que regulan la expresión tejidoespecífica de NaStEP en estigmas de nicotiana alata 
Autor: Berenice Cuevas Estrada
Año: 2021
Carrera: Química Farmaceútico Biológica

El sistema de autoincompatibilidad sexual (AI) en la familia Solanaceaeestá controlado por el locusmutialélicoS, el cual incluyedos genes fuertemente ligados que segregan como una unidad mendeliana, estableciendo un haplotipo Sespecífico. Uno de estos genes codifica la determinante femenina que es una SRNasa, expresada en el pistilo y el otro a la determinante masculina, SLF, con expresión específica en el polen. La interacción Sespecífica de las determinantes en el tubo polínico (TP) desencadena el rechazo del polen propio, mediante la inhibición del crecimiento del TP. El rechazo del polen ocurre si hay coincidencia del alelo Sdel polen con uno de los alelos Sdel pistilo de la planta receptora, siesta esheterociga. Por ejemplo, una planta S1S2rechazará el polen S1 y el S2, pero si llega al pistilo un polen S3 este germinará y el TP tendrá un crecimiento normal hasta el ovario dondefecundará a sus óvulos. Además de las determinantes de especificidad, existen otros genes no ligados al locus Sque complementan la vía genética del rechazo del polen. Uno de ellos es NaStEP(N. alataStigma Expressed Protein) y codifica un inhibidor de proteasas tipo Kunitz con actividad dual, ya quepor un lado inhibe de manera específica e irreversiblemente a una proteasa similar a la subtilisina y por otro lado funciona como un bloqueador de canales de voltaje. La expresión de NaStEPse restringe a las células estigmáticas del pistilo y su supresión en plantas transgénicas de Nicotiana dio evidencia de que es un gen esencial para la respuesta el rechazo del polen Sespecífico en Nicotiana. El patrón de expresión específico de NaStEPen el estigma de N. alatallevó al análisis de su región promotora, donde se identificaron cinco motivos de secuencia conservados también en distintos alelos del promotor de SLG, un gen estigmático involucrado en el mecanismo de AI en Brassica. Estudios de eliminación secuencial de estos motivos en el promotor de SLG, indicanqueel motivo IV parece actuar como un elemento represor de la expresión de SLGen el polen. En nuestro laboratorio se llevaron a cabo ensayos de expresión de la βglucoronidasa (GUS) bajo el control del promotor de NaStEP en plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana. La construcción con el promotor completo reveló actividad del reportero en el pistilo; sin embargo, cuando el motivo IV se eliminó del promotor de NaStEP, la expresión de GUSocurre además del pistilo, en las anteras y granos de polen. Estos datos confirman las observaciones con SLGqueindican que el motivo IV es un elemento barrera que evita la expresión en el polen en las plantas de tipo silvestre. El presente trabajo tuvo como objetivoidentificar proteínas que tuvieran la capacidad de unirse al motivo IV del promotor de NaStEP, como potenciales candidatos cruciales en la regulación de la expresión tejidoespecíficade este gen. Para cumplir elobjetivo se estableció un ensayo de monohíbrido en Saccharomyces cerevisiae, enfrentando el motivo IV a una biblioteca de cDNA de polen maduro de N. alata. De este ensayo se recuperaron varias clonas, sin embargo, la clona candidata a reproducir una interacción positiva entre el motivo IV y la proteína, resultó ser un falso positivo, la proteína de fusión no reconoce de manera específica a la secuencia de interés. El método experimental no demostró ser lo suficientemente poderoso para detectar a la proteína de unión al motivo IV, no obstante, los resultados no permiten concluir que la hipótesis con la que se planteó el proyecto es incorrecta. Se sugieren otras aproximaciones experimentales para lograr caracterizar al factor de transcripción que actúa como un represor del gen NaStEPen el polen