압타머

섬네일|425x170 px|왼쪽: 결합하지 않은 압타머. 오른쪽: 표적 단백질에 결합된 압타머. 단백질은 노란색이다. 표적에 결합할 때 모양이 변하는 압타머 부분은 파란색이고, 변하지 않는 부분은 주황색이다. 단백질과 접촉하는 압타머 부분은 빨간색으로 강조 표시되어 있다.

섬네일|450x330 px|유방암 세포를 암세포의 바이오마커에 선택적으로 결합하지만 건강한 세포에는 결합하지 않는 압타머와 함께 배양했다. 압타머는 Alexa Fluor 594에 연결되어 있는데, 이 분자는 UV 빛 아래에서 붉게 빛난다. 이 유형의 테스트를 통해 의사나 연구원은 환자의 조직 샘플에서 암세포를 식별할 수 있다.

압타머(aptamer) 또는 앱타머는 인공 ssDNA, RNA, Xeno 핵산 또는 펩타이드의 올리고머로서 특정 표적 분자 또는 표적 분자 계열에 결합한다. 이들은 pM에서 μM 범위의 다양한 친화도(KD)를 보이며, 다양한 수준의 탈표적 결합이 발생한다 이들은 때때로 화학 항체로 분류되기도 한다. 압타머와 항체는 많은 동일한 응용 분야에서 사용될 수 있지만, 대부분 올리고뉴클레오타이드인 압타머의 핵산 기반 구조는 단백질인 항체의 아미노산 기반 구조와 매우 다르다. 이러한 차이로 인해 압타머가 특정 목적에는 항체보다 더 나은 선택이 될 수 있다 (세부 사항은 항체 대체 참조).

압타머는 생물학 실험실 연구 및 의료 테스트에 사용된다. 여러 압타머를 단일 분석으로 결합하면 샘플에서 많은 수의 다른 단백질을 측정할 수 있다. 이들은 질병의 분자 마커를 식별하는 데 사용되거나, 약물, 약물 전달 시스템 및 조절 약물 방출 시스템으로 기능할 수 있다. 또한 다른 분자 공학 작업에도 활용된다.

대부분의 압타머는 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment)에서 유래한다. SELEX는 다양한 DNA 서열의 거대한 풀에서 유용한 압타머를 찾는 시험관 실험 계열이다. 이 과정은 자연선택, 방향성 진화 또는 인공선택과 매우 유사하다. SELEX에서 연구자는 약 1경 개의 다른 무작위로 생성된 DNA 또는 RNA 조각으로 구성된 초기 DNA 라이브러리에서 가장 좋은 압타머를 반복적으로 선택한다. SELEX 후 연구자는 압타머를 돌연변이시키거나 화학적 변형을 가하여 다른 선택을 수행하거나, 합리적 설계 과정을 사용하여 개선을 설계할 수 있다. 압타머를 발견하는 비-SELEX 방법도 존재한다.

연구자들은 다양한 유익한 특성을 얻기 위해 압타머를 최적화한다. 가장 중요한 특성은 선택된 표적에 대한 특이적이고 민감한 결합이다. 혈청 검사나 압타머 치료제처럼 압타머가 체액에 노출될 때, DNA 및 RNA 파괴 효소에 의한 소화에 저항하는 것이 종종 중요하다. 치료용 압타머는 체내에서 느리게 청소되도록 종종 변형되어야 한다. 표적에 결합할 때 극적으로 모양을 바꾸는 압타머는 센서를 켜고 끄는 분자 스위치로 유용하다. 일부 압타머는 바이오센서나 생물학적 샘플 테스트에 맞도록 설계된다. 어떤 경우에는 압타머가 미리 정의된 수준 또는 속도의 결합을 달성하는 것이 유용할 수 있다. 알려진 압타머를 생산하는 데 사용되는 합성의 수율이 서열이 길어질수록 급격히 감소하므로, 연구자들은 생산 비용을 줄이기 위해 압타머를 최소 결합 서열로 단축하는 경우가 많다.

어원

"압타머"라는 단어는 앤드루 D. 엘링턴과 잭 쇼스택이 이 주제에 대한 첫 출판물에서 만든 신조어이다. 그들은 정확한 정의를 제공하지 않고 "우리는 이 개별 RNA 서열을 '압타머'라고 불렀는데, 이는 라틴어 aptus에서 유래하며, '적합하다'는 뜻이다."라고 명시했다.

이 단어 자체는 그리스어 단어 ἅπτω (연결하다 또는 맞추다, 호메로스(기원전 8세기경) 사용)와 μέρος (더 큰 것의 구성 요소)에서 유래한다.

분류
전형적인 압타머는 DNA, RNA, XNA 또는 펩타이드의 조합 다양성을 활용하여 특정 표적 분자 또는 표적 분자 계열에 대해 강력하고 특이적인 결합을 달성하는 합성적으로 생성된 리간드이다. 압타머는 가끔 "화학 항체" 또는 "항체 모방체"로 분류된다. 그러나 대부분의 압타머는 분자량이 6-30 kDa로 작으며, 150 kDa 크기의 항체와는 대조적으로 두 개의 일치하는 항원 결합 부위 대신 하나의 결합 부위를 포함한다.

역사
섬네일|150 px|노벨상 수상자이자 SELEX 및 압타머 발명가 중 한 명인 잭 쇼스택.

1967년 처음 적용된 이후, 방향성 진화 방법론은 새로운 특성과 기능을 가진 생체분자를 개발하는 데 사용되었다. 초기 사례로는 박테리오파지 Q베타 복제 시스템의 변형과 변형된 결합 절단 활성을 가진 리보자임의 생성이 있다.

1990년, 두 팀이 독립적으로 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) 방법을 개발하고 발표하여 RNA 압타머를 생성했다. 래리 골드의 연구실은 T4 DNA 중합효소에 대한 RNA 리간드를 선택하는 과정에 SELEX라는 용어를 사용했고 잭 쇼스택의 연구실은 다양한 유기 염료에 대한 RNA 리간드를 선택했다. 2년 후, 쇼스택 연구실과 길리어드 사이언스는 서로 독립적으로 시험관내 선택 방식을 사용하여 유기 염료와 인간 트롬빈에 대한 DNA 압타머를 생성했다. 2001년, SELEX는 엘링턴 연구실의 J. Colin Cox에 의해 자동화되어, 몇 주 걸리던 선택 실험 기간을 단 3일로 단축시켰다.

2002년, 로널드 브레이커와 예브게니 누들러가 이끄는 두 연구팀은 이전에 존재가 의심되었던 핵산 기반의 유전자 조절 요소인 리보스위치에 대한 첫 번째 명확한 증거를 발표했다. 리보스위치는 압타머와 유사한 분자 인식 특성을 가지고 있다. 이 발견은 지구의 생명 기원에서 가정된 시간적 단계인 RNA 세계 가설에 대한 지지를 더했다.

속성

구조
섬네일|500x500 px|압타머의 복잡하고 다양한 2차 및 3차 구조는 이 압타머의 2차 구조 개략도에서 보듯이 표적에 강력하고 특이적으로 결합하도록 한다. 일부 G-C 및 A-T 염기를 연결하는 검은색 선에서 상보적 염기쌍 형성이 보인다. 이는 항체의 아미노산에는 없는 핵산의 특징이다. 이것은 압타머가 이러한 독특한 구조를 형성하는 데 도움이 된다. 이 염기쌍 형성에 의존하는 헤어핀 영역(빨간색)은 다른 온도에서 압타머의 안정성을 향상시킨다. 이 이미지는 또한 기본 압타머에 대한 화학적 변형의 예를 보여준다. 내구성을 향상시키는 두 개의 비천연 염기는 노란색이다. 바이오틴 분자는 스트렙타비딘에 극도로 강력하게 결합하여 압타머가 센서 및 분석법에서 다른 분자나 표면에 고정될 수 있게 한다.

대부분의 압타머는 20-100개의 뉴클레오타이드 염기와 3-20 kDa의 특정 올리고머 서열을 기반으로 한다. 일부는 기능 향상 또는 더 큰 공학적 분자 시스템과의 호환성을 위해 화학적 변형이 되어 있다. DNA, RNA, Xeno 핵산 및 펩타이드 압타머 화학은 각각 저장 안정성, 혈청 또는 생체 내 내구성, 특이성 및 민감도, 비용, 생성 용이성, 증폭 및 특성화, 사용자 친숙성 측면에서 뚜렷한 프로필을 제공할 수 있다. 일반적으로 DNA 및 RNA 기반 압타머는 낮은 면역원성을 나타내며, 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 통해 증폭 가능하며, 복잡한 2차 구조와 3차 구조를 가진다. DNA 및 XNA 기반 압타머는 우수한 저장 안정성을 나타낸다. XNA 기반 압타머는 결합 친화도를 높이거나 혈청 또는 생체 내에서 더 큰 내구성을 제공하기 위해 추가적인 화학적 다양성을 도입할 수 있다.

유전적으로 암호화된 22가지 및 자연적으로 발생하는 500가지 이상의 아미노산이 존재하므로, 펩타이드 압타머는 항체와 마찬가지로 DNA 또는 RNA의 4가지 핵산에 비해 단위 길이당 조합 다양성이 훨씬 더 크다. 핵산 염기 또는 골격의 화학적 변형은 표준 핵산 염기의 화학적 다양성을 증가시킨다.

분할 압타머는 분자 절단에 의해 둘로 나뉜 더 큰 모체 압타머의 조각인 두 개 이상의 DNA 가닥으로 구성된다. 각 구성 가닥의 표적 결합 능력은 절단 위치와 딸 가닥의 2차 구조에 따라 달라진다. 표적 분자의 존재는 DNA 단편의 결합을 촉진한다. 이는 바이오센서의 기초로 사용될 수 있다. 일단 조립되면 두 개의 분리된 DNA 가닥은 단일 가닥으로 연결될 수 있다.

변형되지 않은 압타머는 혈액에서 반감기가 몇 초에서 몇 시간으로 빠르게 제거된다. 이는 주로 압타머를 물리적으로 파괴하는 핵산 분해 효소 분해와 압타머의 낮은 분자량 및 크기로 인한 신장에 의한 제거 때문이다. 2'-플루오린 치환된 피리미딘 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 연결과 같은 여러 변형은 며칠에서 몇 주까지의 혈청 반감기를 허용한다. PEG화는 생체 내에서 신장에 의한 제거를 방지하기에 충분한 질량과 크기를 더할 수 있다. 변형되지 않은 압타머는 혈액응고 장애를 치료할 수 있다. 압타머를 눈에 적용할 경우, 핵산 분해 효소 농도가 낮고 제거 속도가 느리기 때문에 제거 및 핵산 분해 효소 소화 문제가 줄어든다. 혈청에서 빠른 제거는 진단 영상과 같은 일부 응용 분야에서도 유용할 수 있다.

에볼라 감염 관련 단백질에 결합하도록 설계된 압타머에 대한 연구에서 에볼라 바이러스 sGP 표적 단백질에 결합하는 능력에 따라 분리된 세 가지 압타머 간의 비교가 이루어졌다. 이 압타머들은 서열과 구조가 모두 다르지만, 에볼라 바이러스와 수단 바이러스의 sGP 및 에볼라 바이러스 GP1.2에 대해 놀랍도록 유사한 상대적 친화도를 보였다. 특히, 이 압타머들은 GP 유전자 산물에 대해 높은 특이도를 나타냈다. 특히 한 압타머는 전기화학 센서에서 인식 요소로 효과적이며, 용액 내 sGP 및 GP1.2뿐만 아니라 막 컨텍스트 내 GP1.2를 감지할 수 있었다. 이 연구 결과는 단백질 표면의 특정 영역이 압타머 친화적 특성을 가질 수 있다는 흥미로운 가능성을 시사한다. 이러한 부위의 핵심 특징을 식별하고, 압타머의 향상된 3D 구조 예측과 결합하면 단백질에 대한 압타머 상호작용 부위 예측의 정확성을 높일 수 있는 잠재력이 있다. 이는 결과적으로 높은 친화도로 단백질에 결합할 가능성이 높은 압타머를 식별하는 데 도움이 될 뿐만 아니라 압타머 결합에 큰 영향을 미 미칠 수 있는 단백질 돌연변이를 밝히는 데도 기여할 수 있다. 압타머와 단백질 간의 구조 기반 상호작용에 대한 포괄적인 이해는 압타머-단백질 결합의 계산적 예측 가능성을 정교하게 만드는 데 필수적이다. 또한, 궁극적으로 실험적 SELEX 프로토콜의 필요성을 없앨 잠재력도 가지고 있다.

표적
압타머의 표적은 작은 분자 및 중금속 이온과 같은 작은 리간드부터 단백질과 같은 더 큰 리간드, 심지어 전체 세포까지 포함할 수 있다. 이러한 표적에는 리소자임, 트롬빈, 인간 면역결핍 바이러스 전사 활성 반응 요소 (HIV TAR), 헤민, 인터페론 감마, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 전립선 특이 항원 (PSA), 도파민, 및 비고전적 암유전자인 열 충격 인자 1 (HSF1)이 포함된다.

압타머는 암세포, 프리온, 박테리아, 및 바이러스에 대항하여 생성되었다. 압타머의 바이러스 표적에는 인플루엔자 A 및 B 바이러스, 호흡기세포융합바이러스 (RSV), SARS 코로나바이러스 (SARS-CoV) 및 SARS-CoV-2가 포함된다.

압타머는 환경과학 단백체학에 특히 유용할 수 있다. 항체는 다른 단백질과 마찬가지로 핵산보다 서열을 분석하기가 더 어렵다. 또한 유지 및 생산 비용이 많이 들고, 세포 배양을 통해 생산되거나 동물 혈청에서 채취되기 때문에 오염 위험이 끊임없이 존재한다. 이러한 이유로, 잘 연구되지 않은 단백질과 종에 관심이 있는 연구자들은 회사들이 자신들이 관심 있는 표적에 대한 항체를 생산, 유지 또는 충분히 품질을 검증하지 않을 수 있다는 것을 알게 될 수 있다. 반면, 압타머는 서열 분석이 간단하고 유지 비용이 들지 않는데, 그 정확한 구조가 디지털로 저장되어 필요에 따라 합성될 수 있기 때문이다. 이는 자금이 부족한 생물학 연구 분야에서 연구 도구로서 경제적으로 더 실현 가능하게 만들 수 있다. 압타머는 차에서 발견되는 테오필린 및 아브시스산 (식물 면역 호르몬)과 같은 식물 화합물에도 존재한다. 치명적인 광대버섯속 중독을 일으키는 독소인 알파 아마니틴에 대한 압타머가 개발되었는데, 이는 버섯 표적에 대한 압타머의 한 예이다.

압타머 응용 분야는 크게 감지, 치료, 시약 생산 및 공학 범주로 분류될 수 있다. 감지 응용 분야는 압타머가 분석법, 이미징 방법, 진단 분석법 및 바이오센서에서 프로브로 작용하는 환경, 생물의학, 역학, 생물보안 및 기초 연구 응용 분야에서 중요하다. 치료 응용 분야 및 정밀 의학에서 압타머는 약물로 기능할 수 있고, 표적 약물 전달 운반체, 조절 방출 메커니즘, 그리고 작은 분자 및 단백질에 대한 고속대량 스크리닝을 통한 약물 발견을 위한 시약으로 기능할 수 있다. 압타머는 단백질 생산 모니터링, 품질 관리 및 정제에 적용된다. 이들은 단백질을 변형하는 방법으로 분자 공학 응용 분야에서 기능할 수 있는데, 예를 들어 PCR을 더욱 신뢰할 수 있게 만들기 위해 DNA 중합효소를 강화하는 것과 같다.

압타머의 친화도가 동적 범위와 검출 한계에도 영향을 미치므로, 표적 분자가 고농도일 때에는 친화도가 낮은 압타머가 더 바람직할 수 있다. 친화성 크로마토그래피 또한 압타머와 같은 친화성 시약이 표적에 결합하고 방출하는 능력에 의존하며, 낮은 친화도는 표적 분자의 방출을 돕는 데 도움이 될 수 있다. 따라서 특정 응용 분야에 따라 압타머 친화도의 유용한 범위가 결정된다.

항체 대체

압타머는 많은 생명공학기술 응용 분야에서 항체를 대체할 수 있다. 실험실 연구 및 임상 진단에서 압타머는 효소결합면역흡착검사 (ELISA), 웨스턴 블롯, 면역조직화학 (IHC), 및 유세포 분석을 포함한 압타머 기반 버전의 면역분석에 사용될 수 있다. 치료제로서 이들은 리간드의 작용제 또는 수용체 길항제로 기능할 수 있다. 항체는 잘 알려진 시장이 개발된 익숙한 기술이지만, 압타머는 대부분의 연구자에게 비교적 새로운 기술이며, 압타머는 중요한 연구 표적의 일부에 대해서만 생성되었다. 항체와 달리, 변형되지 않은 압타머는 혈청에서 핵산 분해 효소 소화에, 생체 내에서 신장 제거에 더 취약하다. 압타머는 항체보다 크기와 질량이 훨씬 작으며, 이는 주어진 응용 분야에 가장 적합한 것을 선택하는 데 중요한 요소가 될 수 있다. 특정 응용 분야에 압타머가 사용 가능할 때, 항체에 비해 압타머의 장점으로는 잠재적으로 낮은 면역원성, 더 큰 재현성 및 낮은 비용, 시험관내 선택 조건으로 인한 더 높은 제어 수준, 그리고 내구성, 특이성 및 민감도를 위해 효율적으로 설계될 수 있는 능력이 있다.

또한, 압타머는 연구 동물 사용 감소에 기여한다. 항체는 종종 초기 발견뿐만 아니라 다중클론 항체의 경우 생산에 동물을 의존하는 반면, 압타머의 선택과 생산은 일반적으로 동물 없이 이루어진다. 그러나 파지 디스플레이 방법은 시험관 내에서 항체를 선택한 다음 단일클론 세포주에서 생산하여 동물 사용을 완전히 피할 수 있게 한다.

치료제 조절 방출
압타머가 단백질과 같은 분자에 가역적으로 결합하는 능력은 성장 인자와 같은 치료용 생체분자의 조절 방출을 촉진하는 데 이를 사용하는 것에 대한 관심이 증가하게 했다. 이는 성장 인자를 수동적으로 방출하도록 결합 강도를 조절하거나, 상보적 올리고뉴클레오타이드와의 혼성화 또는 세포 견인력으로 인한 압타머의 펼쳐짐과 같은 메커니즘을 통한 능동적 방출을 통해 달성할 수 있다.

조직 공학 응용
특정 분자에 가역적으로 결합하는 능력으로 알려진 압타머는 3차원 바이오프린팅 조직에서 혈관신생을 촉진하기 위해 성장 인자를 정밀하게 전달하는 데 사용되었다. 이 조절된 전달은 성장 인자가 올바른 장소와 시간에 방출되도록 하여, 국소적이고 복잡한 혈관 네트워크 형성을 촉진한다. 또한, 이러한 네트워크의 특성은 시간 경과에 따른 성장 인자 방출 방식을 조절함으로써 미세 조정될 수 있어, 이 접근 방식은 혈관화된 공학 조직을 만드는 강력한 도구가 된다.

AptaBiD
AptaBiD (Aptamer-Facilitated Biomarker Discovery)는 바이오마커 발견을 위한 압타머 기반 방법이다.

펩타이드 압타머
대부분의 압타머는 DNA, RNA 또는 XNA를 기반으로 하지만, 펩타이드 압타머는 특정 표적 분자에 결합하도록 선택되거나 조작된 인공 단백질이다.

구조

펩타이드 압타머는 단백질 골격에 의해 발현되는 가변 서열의 하나 이상의 펩타이드 루프로 구성된다. 펩타이드 압타머의 "머리"가 고유한 서열의 이중 가닥 DNA "꼬리"에 공유결합으로 연결된 올챙이(tadpoles)라고 알려진 유도체는 DNA 꼬리의 PCR(예를 들어 정량 실시간 중합효소 연쇄 반응)을 사용하여 혼합물에서 희귀 표적 분자를 정량화할 수 있게 한다. 압타머 가변 영역을 형성하는 펩타이드는 골격과 동일한 폴리펩타이드 사슬의 일부로 합성되며, 골격에 대한 연결에 의해 N 및 C 말단에서 제한된다. 이러한 이중 구조적 제약은 가변 영역이 취할 수 있는 3D 구조의 다양성을 감소시키며, 이러한 구조적 다양성의 감소는 표적과의 상호작용으로 인해 가변 영역이 균일한 구조를 취할 때 분자 결합의 엔트로피 비용을 낮춘다.

선택

가장 일반적인 펩타이드 압타머 선택 시스템은 효모 투 하이브리드 시스템이다. 펩타이드 압타머는 파지 디스플레이 및 mRNA 디스플레이, 리보솜 디스플레이, 세균 디스플레이 및 효모 디스플레이와 같은 다른 표면 디스플레이 기술로 구성된 조합 펩타이드 라이브러리에서도 선택될 수 있다. 이러한 실험 절차는 바이오패닝이라고도 알려져 있다. 조합 펩타이드 라이브러리에서 패닝된 모든 펩타이드는 MimoDB 데이터베이스에 저장되어 있다.

응용

펩타이드 압타머 라이브러리는 "돌연변이원"으로 사용되었는데, 이는 연구자가 다양한 펩타이드 압타머를 발현하는 라이브러리를 세포 집단에 도입하고, 원하는 표현형을 선택하고, 해당 표현형을 유발하는 압타머를 식별하는 연구에서이다. 연구자는 그런 다음 해당 압타머를 미끼로 사용하여, 예를 들어 효모 투-하이브리드 스크리닝에서 해당 압타머의 표적이 되는 세포 단백질을 식별한다. 이러한 실험은 압타머에 결합하는 특정 단백질과 압타머가 방해하여 표현형을 유발하는 단백질 상호작용을 식별한다. 또한, 적절한 기능적 부분으로 유도체화된 펩타이드 압타머는 표적 단백질의 특정 번역 후 변형을 유발하거나 표적의 세포 내 국소화를 변경할 수 있다.

섬네일|520x212 px|이 분석법은 두 가지 다른 유형의 압타머(V 및 I)가 각각의 표적 단백질(VEGF 및 IFN-γ)을 감지하는 능력을 테스트한다. Apt1, Apt2, Apt3, Apt4는 결합 강도가 감소하는 순서이다(즉, Apt1이 가장 강한 압타머이다). DD, AD, DA, AA 문자는 비천연 염기쌍의 다른 조합을 가지고 있음을 의미한다. 이것이 결합 강도의 차이를 유발한다. "-" 열에는 단백질이 없고, "+" 열에는 단백질이 있다. 단백질이 있는 압타머(+)와 없는 압타머(-)는 겔의 웰에 로딩되어 컬럼 레인을 따라 이동한다. 표적이 존재하면, 압타머의 전하와 단백질의 질량 때문에 결합하고 더 느리게 이동한다. 그렇지 않으면, 결합하지 않은 압타머는 빠르게 레인 끝으로 이동한다. "+" 및 "-" 밴드 간의 위치 차이가 "이동성 변화"이다. 이를 통해 연구자는 단백질의 존재 또는 부재를 감지할 수 있다. 가장 왼쪽 V 및 I 레인의 더 어두운 밴드는 더 강한 압타머-표적 결합이 샘플 내 특정 표적 단백질 양에서 표적을 더 쉽게 감지할 수 있게 함을 보여준다. 하단 이미지는 약한 I 압타머에서 압타머-표적 결합을 방해하는 요소를 포함한 변성 겔을 포함하며, 이는 압타머-단백질 결합이 실제로 이동성 변화를 유발했음을 보여준다.

산업 및 연구 커뮤니티
압타머를 기반으로 하는 상업 제품 및 회사로는 마큐겐 (페갑타닙)과 의료 진단 회사인 SomaLogic이 있다. 압타머 연구 커뮤니티의 전문 학회인 국제 압타머 학회(INSOAP)는 이 주제에 전념하는 학술지인 Aptamers를 발행한다. Apta-index는 700개 이상의 압타머에 대한 주문 과정을 목록화하고 간소화하는 최신 데이터베이스이다.

 같이 보기 

 
 
 

 각주 

 참고 자료 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Cho EJ, Lee JW, Ellington, AD
 

분류:핵산
분류:생명공학
분류:펩타이드
분류:유전학 기술