KARAKTERISASI PLANLET JERUK SIAM PONTIANAK (Citrus nobilis Lour. var. microcarpa Hassk.) SETELAH DIINDUKSI LARUTAN ATONIK DALAM KONDISI CEKAMAN KEKERINGAN SECARA IN VITRO (Skripsi) Oleh Nadya Rosyalina Putri FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG BANDAR LAMPUNG 2018
KARAKTERISASI PLANLET JERUK SIAM PONTIANAK (Citrus nobilis Lour. var. microcarpa Hassk.) SETELAH DIINDUKSI LARUTAN ATONIK DALAM KONDISI CEKAMAN KEKERINGAN SECARA IN VITRO Oleh Nadya Rosyalina Putri ABSTRAK Jeruk siam pontianak (Citrus nobilis Lour. var. microcarpa Hassk.) salah satu komoditas buah-buahan penting di Indonesia. Jeruk mempunyai nilai ekonomis yang cukup tinggi baik dalam bentuk segar maupun olahan serta sebagai sumber vitamin dan mineral. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui konsentrasi larutan atonik yang optimum; konsentrasi Polyethylene Glycol (PEG) yang toleran terhadap cekaman kekeringan untuk seleksi planlet jeruk siam secara in vitro; mengetahui larutan atonik dengan PEG 6000 terhadap pertumbuhan planlet jeruk siam; mengetahui dan menganalisis karakter ekspresi spesifik pada planlet jeruk siam yang toleran terhadap cekaman kekeringan meliputi kandungan prolin, kandungan karbohidrat, dan indeks stomata. Penelitian ini telah dilaksanakan pada bulan November - Desember 2017 di Laboratorium Botani Ruang In Vitro Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Lampung. Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap Faktorial dengan 2 faktor, yaitu faktor A; atonik 0 mL/L, 1 mL/L, 2 mL/L, faktor B; PEG 0 %, 3 %, 5 %. Masing-masing konsentrasi dilakukan 4 kali pengulangan dan setiap ulangan terdiri dari 3 planlet jeruk siam dalam setiap botol kultur. Data dianalisis menggunakan analisis ragam (ANOVA), kemudian dilanjutkan dengan uji BNT pada taraf nyata 5 %. Hasil penelitian menunjukkan bahwa konsentrasi PEG 6000 toleran terhadap cekaman kekeringan pada konsentrasi 5%. Karakter ekspresi pengaruh larutan atonik dan PEG 6000 terhadap kandungan prolin pada planlet jeruk siam mengalami peningkatan secara nyata pada konsentrasi tertinggi. Kandungan karbohidrat terlarut total meningkat secara nyata pada konsentrasi larutan atonik 1 mL/L dan PEG 6000 3 %, namun, kandungan karbohidrat terlarut total menurun secara nyata pada konsentrasi larutan atonik dan PEG 6000 tertinggi. Konsentrasi PEG 6000 yang diberikan pada medium seleksi juga mampu mempengaruhi indeks stomata pada planlet jeruk siam, semakin tinggi konsentrasi PEG 6000, maka indeks stomata pada daun planlet jeruk siam semakin menurun. interaksi antara Kata Kunci : Citrus nobilis Lour. var. microcarpa Hassk., Atonik, Cekaman Kekeringan, PEG 6000, In Vitro
CHARACTERIZATION PLANLET ORANGE SIAM PONTIANAK (Citrus nobilis Lour. var. microcarpa Hassk.) AFTER INDUCED ATONIC SOLUTION IN DROUGHT STRESS CONDITION IN VITRO By Nadya Rosyalina Putri ABSTRACT Orange siam pontianak (Citrus nobilis Lour. Var. Microcarpa Hassk.) One of the important fruits commodities in Indonesia. Oranges have a high economic value both in the form of fresh and processed and as a source of vitamins and minerals. This study aims to determine the optimum concentration of atonic solutions; concentration of Polyethylene Glycol (PEG) tolerant to drought stress for selection of Siam plantlets in vitro; to know the interaction between an atonic solution with PEG 6000 growth of orange plantlets; knowing and analyzing specific expression characters of the conjoined orange planlet tolerant of drought stressed to include proline content, carbohydrate content, and stomata index. This research has been conducted in November - December 2017 at In Vitro Space Botanical Laboratory of Biology Department, Faculty of Mathematics and Natural Science, University of Lampung. This research uses Factorial Complete Random Design with 2 factors, namely factor A; atonic 0 mL / L, 1 mL / L, 2 mL / L, factor B; PEG 0%, 3%, 5%. Each concentration was performed 4 repetitions and each replication consisted of 3 orange's plantlets in each culture bottle. Data were analyzed using variance analysis (ANOVA), then continued with LSD test at 5% real level. The results showed that PEG 6000 concentration was tolerant of drought stress at 5% concentration. The expression character of the effect of atonic and PEG 6000 solutions on the proline content of the conjoined orange planlet has significantly increased at the highest concentration. Total soluble carbohydrate content was significantly increased from concentrations of 1 mL / L and PEG 6000 3% atonic, however, total soluble carbohydrate content decreased significantly to the highest concentration of atonic and PEG 6000 solutions. The concentration of PEG 6000 given to the selection medium is also able to influence the stomata index on the siam orange planlet, the higher the concentration of PEG 6000, the stomata index on Siam plantlet leaf are decreasing. Keyword : Citrus nobilis Lour. var. microcarpa Hassk., Atonic, Drought Stress, PEG 6000, In Vitro
KARAKTERISASI PLANLET JERUK SIAM PONTIANAK (Citrus nobilis Lour. var. microcarpa Hassk.) SETELAH DIINDUKSI LARUTAN ATONIK DALAM KONDISI CEKAMAN KEKERINGAN SECARA IN VITRO Oleh NADYA ROSYALINA PUTRI Skripsi Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar SARJANA SAINS Pada Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG BANDAR LAMPUNG 2018
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Tanjung Karang, Provinsi Lampung pada tanggan 11 Juli 1996, sebagai anak kedua dari tiga bersaudara, dari pasangan Bapak O. Zahroni dan Ibu Erlinawati, S.Sos. Penulis menempuh pendidikan pertamanya di Taman Kanak-Kanak Al-Azhar 3 Bandar Lampung pada tahun 2001. Pada tahun 2002 penulis melanjutkan pendidikannya di Sekolah Dasar Al- Azhar 1 Bandar Lampung. Kemudian penulis melanjutkan pendidikan Sekolah Menengah Pertama di SMP Negeri 21 Bandar Lampung pada tahun 2008, dan melanjutkan pendidikan Sekolah Menengah Atas di SMA Negeri 1 Bandar Lampung pada tahun 2011. Pada tahun 2014, penulis tercatat sebagai salah satu mahasiswa Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung melalui jalur Seleksi Nasional Masuk Perguruan Tinggi Negeri (SNMPTN). Selama menjadi mahasiswa di Jurusan Biologi FMIPA Unila, penulis pernah menjadi asisten praktikum mata kuliah Botani Ekonomi dan Etnobotani jurusan biologi, Embriologi Hewan jurusan biologi, Kultur Jaringan Tumbuhan jurusan biologi, dan Palinologi jurusan biologi. Penulis juga aktif di Organisasi Himpunan
Mahasiswa Biologi (HIMBIO) FMIPA Unila sebagai anggota bidang kaderisasi 2015-2016. Penulis melaksanakan Kuliah Kerja Nyata (KKN) di Desa Sri Purnomo, Kecamatan Kalirejo, Kabupaten Lampung Tengah dari Bulan Januari-Februari 2017. Pada Bulan Juli-Agustus 2017 penulis melaksanakan Kerja Praktik di Balai Penelitian Tanaman Jeruk dan Buah Subtropika (BALITJESTRO) Kota Batu, Jawa Timur dengan judul "Penanaman Meristem Stroberi (Fragaria X ananassa Dutch.) pada Medium Murashige dan Skoog di BALITJESTRO, Batu, Jawa Timur". Penulis melaksanakan penelitian di Laboratorium Botani ruang In-Vitro Jurusan Biologi pada Bulan September sampai Desember 2017.
MOTTO Hidup itu seperti sekotak cokelat, kamu tidak akan pernah tahu potongan seperti apa yang akan kamu dapat. (Tom Hanks) "Tidak ada kesuksesan melainkan dengan pertolongan Allah" (Q.S Huud: 88)
PERSEMBAHAN Segala puji hanya milik Allah SWT yang telah memberikanku kekuatan, kesabaran, kesehatan, rezeki serta karunia dan kemudahan. Shalawat serta salam terlimpah kepada Nabi Muhammad SAW sehingga skripsi ini dapat terselesaikan. Kupersembahkan karya ini kepada orang-orang terkasih dan kusayangi: Kepada Ayahanda dan Ibunda sebagai tanda hormat dan rasa terima kasih yang tiada terhingga atas segala dukungan, motivasi, kesabaran dalam mendidikku, cinta kasih dan semangat untuk menjadi pribadi yang kuat serta doa yang tiada hentinya. Para guru dan dosen yang telah mendidik dan mengajariku hingga hari ini dengan dedikasi dan keikhlasannya. Abang dan adik laki-lakiku yang terus memberi dukungan serta memotivasiku untuk terus berkarya. Sahabat-sahabat terbaik dan teman-teman seperjuanganku yang banyak memberikan pengalaman berharga, selalu ada untuk saling menguatkan dan mengingatkan. Dan untuk seseorang yang diam-diam mendoakanku disetiap sujudnya dan sudah disiapkan Allah SWT untuk mendampingi hidupku kelak. Almamaterku tercinta
SANWACANA Assalamualaikum Wr. Wb. Puji syukur atas rahmat Allah SWT. dengan segala karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan salah satu syarat dalam menempuh pendidikan strata satu atau sarjana dalam bidang sains yaitu skripsi yang berjudul "Karakterisasi Planlet Jeruk Siam Pontianak (Citrus nobilis Lour. var. microcarpa Hassk.) Setelah Diinduksi Larutan Atonik Dalam Kondisi Cekaman Kekeringan Secara In Vitro". Dengan terselesaikannya skripsi ini penulis mengucapkan terimakasih yang sebesar-besarnya kepada: 1. Kedua orang tuaku tercinta, Papa O. Zahroni, Mama Erlinawati, S.Sos., serta abang dan adikku tersayang Nico Aditya Pratama, S.T. dan Rio Fernando Putra dan keluarga besarku, terima kasih yang teramat dalam atas doa, dukungan, kasih sayang, kesabaran, dan motivasi sehingga penulis mampu menyelesaikan skripsi ini. 2. Ibu Dr. Endang Nurcahyani, M.Si., selaku pembimbing I yang selalu sabar membimbing saya, dan memberikan saran terbaiknya, serta memberikan kepercayaan kepada penulis.
3. Bapak Dr. Hardoko Insan Qudus, M.S., selaku pembimbing II yang selalu memberikan bimbingan, saran, dan motivasi yang membangun bagi penulis. 4. Bapak Ir. Zulkifli, M.Sc., selaku penguji skripsi yang selalu memberikan kritik, saran, dan masukan positif kepada penulis. Terimakasih atas ketersediaannya menjadi pembahas dalam penelitian ini sehingga skripsi ini terselesaikan dengan baik. 5. Ibu Dra. Eti Ernawiati, M.P., selaku dosen pembimbing akademik serta Kepala Laboratorium Botani, Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam yang telah memberi motivasi, masukan, dan semangat yang diberikan kepada penulis. 6. Bapak Prof. Dr. Ir. Hasriadi Mat Akin, M.P., selaku Rektor Universitas Lampung. 7. Bapak Prof. Warsito, S.Si., D.E.A., Ph.D., selaku Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. 8. Ibu Dr. Nuning Nurcahyani, M.Sc., selaku Ketua Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam dan atas semua fasilitas yang telah diberikan. 9. Bapak Drs. M. Kanedi, M.Si., selaku Sekretaris Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. 10. Bapak dan Ibu Dosen Jurusan Biologi atas ilmu dan bimbingan yang diberikan kepada penulis selama menempuh pendidikan di Jurusan Biologi. 11. Sahabat seperjuangan penelitian Bioteknologi Tumbuhan - Kultur Jaringan Anis, Nadia, Fesya, Tara, Nalindri, Essy, Genta dan Dwi Sindi terima kasih
untuk kerjasama, kebersamaan, semangat, kritik, saran, serta suka dan duka selama menjalani penelitian ini. 12. Sahabat seperjuangan Biologi angkatan 2014 yang tidak dapat disebutkan satu persatu, atas kebersamaan serta dukungannya kepada penulis. 13. Keluarga besar KKN Desa Sri Purnomo Ekawati, Deka, Ratu, Arnaldo, Shofyan, dan Hariska, atas pengalaman, kebersamaan serta pembelajaran yang sangat berarti bagi penulis. 14. Kakak tingkat Biologi angkatan 2011, 2012, 2013, dan adik tingkat angkatan 2015, serta keluarga besar Himpunan Mahasiswa Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Unila, atas pengalaman dan pembelajaran yang sangat berarti bagi penulis. 15. Almamater tercinta. Akhir kata, penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan di dalam penyusunan skripsi ini dan jauh dari kesempurnaan, akan tetapi sedikit harapan semoga skripsi yang sederhana ini dapat berguna dan bermanfaat bagi kita semua. Bandar Lampung, 17 April 2018 Penulis, Nadya Rosyalina Putri
DAFTAR ISI Halaman HALAMAN DEPAN ... i ABSTRAK ... ii HALAMAN JUDUL DALAM ... iii HALAMAN PERSETUJUAN ... iv HALAMAN PENGESAHAN ... v RIWAYAT HIDUP ... vi MOTTO ... viii HALAMAN PERSEMBAHAN ... ix SANWACANA ... x DAFTAR ISI ... xiii DAFTAR TABEL ... xv DAFTAR GAMBAR ... xvi I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang ... 1 B. Tujuan Penelitian ... 4 C. Manfaat Penelitian ... 5 D. Kerangka Pemikiran ... 5 E. Hipotesis ... 6 II. TINJAUAN PUSTAKA A. Klasifikasi dan Morfologi Tanaman Jeruk Siam Pontianak ... 8 1. Klasifikasi Tanaman Jeruk Siam Pontianak ... 8
2. Morfologi Tanaman Jeruk Siam Pontianak ... 8 B. Kultur Jaringan ... 13 C. Cekaman Kekeringan ... 14 D. Polyethylene Glycol (PEG) ... 15 E. Seleksi Cekaman Kekeringan Menggunakan PEG... 16 F. Atonik ... 18 G. Metabolisme Prolin ... 18 H. Karbohidrat ... 22 A. Waktu dan Tempat ... 23 B. Alat dan Bahan ... 23 C. Rancangan Percobaan ... 24 D. Bagan Alir Penelitian ... 26 E. Pelaksanaan Penelitian ... 28 1. Strerilisasi Alat ... 28 2. Persiapan Medium Tanam ... 28 3. Persiapan Medium Seleksi ... 29 4. Sterilisasi Biji ... 29 5. Penanaman ... 30 6. Induksi Planlet dengan Larutan Atonik ... 30 7. Pananaman Pada Medium Seleksi ... 30 8. Pengamatan ... 31 a. Persentase Jumlah Planlet yang Hidup ... 31 b. Visualisasi Planlet ... 31 c. Analisis KandunganProlin ... 32 d. Kandungan Karbohidrat ... 33 e. Indeks Stomata ... 34 9. Analisis Data ... 35 2. Morfologi Tanaman Jeruk Siam Pontianak ... 8 B. Kultur Jaringan ... 13 C. Cekaman Kekeringan ... 14 D. Polyethylene Glycol (PEG) ... 15 E. Seleksi Cekaman Kekeringan Menggunakan PEG... 16 F. Atonik ... 18 G. Metabolisme Prolin ... 18 H. Karbohidrat ... 22 A. Waktu dan Tempat ... 23 B. Alat dan Bahan ... 23 C. Rancangan Percobaan ... 24 D. Bagan Alir Penelitian ... 26 E. Pelaksanaan Penelitian ... 28 1. Strerilisasi Alat ... 28 2. Persiapan Medium Tanam ... 28 3. Persiapan Medium Seleksi ... 29 4. Sterilisasi Biji ... 29 5. Penanaman ... 30 6. Induksi Planlet dengan Larutan Atonik ... 30 7. Pananaman Pada Medium Seleksi ... 30 8. Pengamatan ... 31 a. Persentase Jumlah Planlet yang Hidup ... 31 b. Visualisasi Planlet ... 31 c. Analisis KandunganProlin ... 32 d. Kandungan Karbohidrat ... 33 e. Indeks Stomata ... 34 9. Analisis Data ... 35 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Seleksi Planlet Jeruk Siam Pontianak dengan Kombinasi Larutan Atonik dan PEG 6000 ... 36 a. Persentase Jumlah Planlet yang Hidup ... 38 b. Visualisasi Planlet ... 39 c. Analisis Kandungan Prolin ... 41 d. Analisis Kandungan Kabohidrat Terlarut Total ... 45 e. Indeks Stomata... 50 V. SIMPULAN DAN SARAN A. Simpulan ... 55 B. Saran ... 56 DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN
DAFTAR TABEL Tabel 1. Notasi FaktorTaraf Kombinasi Perlakuan ... 25 2. Tata Letak Satuan Percobaan U4 ... 26 3. Persentase Jumlah Planlet Jeruk Siam Pontianak yang Hidup Hasil Seleksi dengan Larutan Atonik dan PEG 6000 pada Beberapa Konsentrasi... 38 4. Visualisasi Planlet Jeruk Siam PontianakHasil Seleksi dengan Larutan Atonik dan PEG 6000 pada Beberapa Konsentrasi ... 40 5. Uji Kandungan Prolin Planlet Jeruk Siam Pontianak (Citrus nobilis Lour. var. microcarpa Hassk.) 3 Minggu Setelah Perlakuan Kombinasi Larutan Atonik dan PEG 6000... 42 6. Uji Kandungan Karbohidrat Terlarut Total Planlet Jeruk Siam Pontianak (Citrus nobilis Lour. var. microcarpa Hassk.) 3 Minggu Setelah Perlakuan Kombinasi Larutan Atonik dan PEG 6000... 47 7. Uji Indeks Stomata Planlet Jeruk Siam Pontianak (Citrus nobilis Lour. var. microcarpa Hassk.) 3 Minggu Setelah Perlakuan Kombinasi Larutan Atonik dan PEG 6000... 52 8. Komposisi Medium Murashige dan Skoog (MS) ... 64 9. Data Hasil Penelitian Anaslisis Kandungan Prolin ... 68 10. Data Hasil Penelitian Anaslisis Kandungan Karbohidrat Terlarut Total...68 11. Data Hasil Penelitian Anaslisis Indeks Stomata ... 68 12. Uji Levene Kandungan Prolin PlanletJeruk Siam Pontianak ... 69 13. Uji Levene Kandungan Karbohidrat Terlarut Total Planlet Jeruk Siam Pontianak ... 70 14. Uji Levene Indeks Stomata Jeruk Siam Pontianak ... 71 15. Analisis Ragam Two Factors KandunganProlin Planlet Jeruk Siam Pontianak ... 72 16. Analisis RagamTwo Factors Kandungan Karbohidrat Terlarut Total Planlet Jeruk Siam Pontianak ... 73 17. Analisis Ragam Two Factors Indeks Stomata Planlet Jeruk Siam Pontianak ... 74 . Halaman
DAFTAR GAMBAR GambarHalaman 1. Buah Jeruk Siam Pontianak... 11 2. Struktur Polyethylene Glycol(PEG) ... 16 3. Bagan Alir Penelitian ... 27 4. Planlet Jeruk Siam Pontianak yang ditanam pada Medium MS yang Ditambahkan PEG dengan Berbagai Konsentrasi pada Minggu ke Satu.. 37 5. Kurva Regresi Hubungan Kandungan Prolin Planlet Jeruk Siam Pontianak dengan Penambahan Larutan Atonik dan PEG 6000 Berbagai Konsentrasi ... 43 6. Permukaan Bawah Daun Planlet Jeruk Siam Pontianak ... 50 7. Kurva Regresi Hubungan Indeks Stomata pada Daun Planlet Jeruk Siam Pontianak dengan Penambahan Larutan Atonik dan PEG 6000 Berbagai Konsentrasi ... 53 8. Histogram Kandungan Prolin ... 75 9. Histogram Kandungan Karbohidrat Terlarut Total ... 75 10. Histogram Indeks Stomata ... 76 11. Buah Jeruk Siam Pontianak... 77 12. Planlet Jeruk Siam Pontianak... 77 13. Penanaman Planlet Jeruk Siam Pontianak kedalam Botol Medium Seleksi ... 78 14. Penataan Letak Planlet Jeruk Siam Pontianak di Lemari Inkubasi ... 78 15. Persiapan Uji Prolin dan Karbohidrat ... 78 16. Larutan Prolin Daun Planlet Jeruk Siam Pontianak ... 79 17. Pembuatan Ekstraksi Daun Planlet Jeruk Siam PontianakUntuk Analisis Prolindan Karbohidrat Terlarut Total... 79 18. Uji Karbohidrat ... 80 19. Persiapan Uji Indeks Stomata ... 80
I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang Jeruk salah satu komoditas buah-buahan penting di Indonesia. Selain sebagai sumber vitamin dan mineral, jeruk juga mempunyai nilai ekonomis yang cukup tinggi baik dalam bentuk segar maupun olahan. Oleh karena itu jeruk digemari oleh semua lapisan masyarakat sehingga kebutuhan akan jeruk terus meningkat (Hatimah, 2000). Jeruk siam merupakan bagian kecil dari sekian banyak spesies jeruk yang sudah dikenal dan dibudidayakan secara luas. Jeruk siam merupakan anggota dari kelompok jeruk keprok yang memiliki nama ilmiah Citrus nobilis. Memiliki nama jeruk siam karena jeruk ini berasal dari Siam (Thailand). Di Thailand, jeruk siam diberi nama Som Kin Wan. Sampai saat ini, belum ada data resmi mengenai kapan dan di mana jeruk siam pertama kali di datangkan di Indonesia. Akan tetapi, ada daerah yang mempunyai catatan yang cukup tentang kisah awal masuknya jeruk siam di wilayahnya, seperti di Kalimantan Barat. Jeruk siam di Indonesia mempunyai banyak jenis tergantung dari daerah asalnya seperti: jeruk siam pontianak, siam simadu, siam garut, siam palembang, siam jati barang dan lain-lain (Kartasapoetra, 1994). 1
Pada tahun 2004, impor buah jeruk segar mencapai 94.696 ton sedangkan ekspornya sebesar 1.261 ton, atau sejak tahun 1998 masing-masing meningkat sebesar 16,6 % dan 5,6 % per tahun (Deptan, 2010). Selama ini jeruk hanya dikenal sebagai sumber vitamin C, padahal buah bulat ini juga mengandung sederetan zat gizi esensial lainnya, yang meliputi karbohidrat (zat gula dan serat makanan), potassium, folat, kalsium, thiamin, niacin, vitamin B6, fosfor, magnesium, tembaga, riboflavin, asam pantotenat, dan senyawa fotokimia. Keunggulan lainnya, jeruk tidak mengandung sodium, lemak, dan kolesterol. Kandungan kalorinya pun rendah, sehingga tidak akan membangkitkan kekhawatiran bagi mereka yang berupaya menurunkan bobot badan. Sebuah jeruk segar berukuran sedang hanya mengandung 60-80 Kkal. Karbohidrat dalam jeruk merupakan karbohidrat sederhana yaitu fruktosa, glukosa, dan sukrosa. Karbohidrat kompleksnya berupa polisakarida non-pati yang baik untuk kesehatan (Rahardi et al., 1999). Di daerah tropika pada umumnya, termasuk Indonesia, memiliki tingkat curah hujan yang rendah sehingga pasokan air ke lahan pertanian menurun. Air merupakan salah satu faktor yang sangat penting untuk pertumbuhan tanaman jeruk manis, pembentukan buah, fotosintesis, dan lain-lain. Air juga sebagai komponen semua jaringan tanaman. Kandungan air pada daun dan tunas sekitar 50 sampai 75 %, pada buah lebih kurang 85 % dan pada akar kira-kira 60 sampa 85 %. Air melarutkan unsur hara dan membawanya 2
ke seluruh tubuh tanaman dan aktivitas kehidupan sel-sel dalam semua jaringan tanaman (Peter, 2012). Kekurangan air dapat mengganggu aktivitas fisiologis maupun morfologis, sehingga mengakibatkan terhentinya pertumbuhan. Difisiensi air yang terus menerus akan menyebabkan perubahan yang irreversible (tidak dapat balik) dan pada gilirannya tumbuh akan mati (Haryati, 2003). Salah satu cara alternatif yang efektif dan efisien untuk mengatasi cekaman kekeringan pada tanaman yaitu dengan menggunakan varietas yang tahan terhadap kekeringan. Cara untuk mendapatkan bibit yang baik dapat dengan menggunakan teknik in vitro. Seleksi cekaman kekeringan pada teknik in vitro dapat dilakukan dengan cara pemberian agen penyeleksi ke dalam medium tanam (Muliani et al., 2014). PEG yang larut sempurna dalam air mempunyai kemampuan menurunkan potensial air, sehingga dapat mengetahui respon jaringan yang ditanam terhadap cekaman kekeringan, serta mengisolasi varian sel atau jaringan yang mempunyai toleransi terhadap cekaman sehingga dapat digunakan untuk menstimulasi besarnya potensial air tanah (Badami et al., 2010). Upaya peningkatan produksi jeruk siam dapat dilakukan dengan pemberian Zat Perangsang Tumbuh (ZPT) (Septiatin, 2008). Atonik merupakan salah satu zat pengatur tumbuh golongan auksin pada tanaman. Pemakaian larutan atonik pada tanaman berfungsi untuk merangsang pertumbuhan akar 3
tanaman agar lebih banyak, mengaktifkan penyerapan unsur hara, meningkatnya keluarnya kuncup dan buah serta memperbaiki kualitas panen (Permadi et al.,1989). Sejauh ini belum ada penelitian tentang karakterisasi planlet jeruk siam pontianak (Citrus nobilis Lour. var. Microcarpa Hassk.) setelah diinduksi larutan atonik dalam kondisi cekaman kekeringan secara in vitro, oleh karena itu penelitian ini perlu dilakukan. B. Tujuan Penelitian 1. Mengetahui konsentrasi larutan atonik yang optimum terhadap cekaman kekeringan untuk seleksi planlet jeruk siam pontianak secara in vitro. 2. Mengetahui konsentrasi toleran PEG 6000 untuk seleksi planlet jeruk siam pontianak yang resisten terhadap cekaman kekeringan secara in vitro. 3. Mengetahui interaksi antara larutan atonik dengan PEG 6000 terhadap kandungan prolin, kandungan karbohidrat, dan indeks stomata planlet jeruk siam pontianak. 4. Mengetahui dan menganalisis karakter ekspresi spesifik pada planlet jeruk siam pontianak yang toleran terhadap cekaman kekeringan meliputi kandungan prolin, kandungan karbohidrat, dan indeks stomata. 4
C. Manfaat Penelitian Hasil dari penelitian ini diharapkan mampu memberikan informasi ilmiah mengenai penggunaan PEG 6000 untuk mendapatkan planlet jeruk siam pontianak (Citrus nobilis Lour. var. microcarpa Hassk.) yang toleran terhadap cekaman kekeringan secara in vitro. Secara ilmiah diharapkan dapat memberikan suatu kontribusi dalam ilmu pengetahuan terutama bidang pemuliaan tanaman dan bioteknologi dalam membudidayakan tanaman jeruk. D. Kerangka Pemikiran Tanaman jeruk merupakan tanaman yang paling banyak diminati dan bernilai ekonomi yang sangat menguntungkan. Penurunan produksi jeruk siam pontianak di Indonesia disebabkan oleh kurangnya pasokan air yang diterima di lahan perkebunan. Hal ini yang menjadi salah satu masalah petani jeruk di Indonesia. Kekeringan pada tanaman dapat terjadi hampir setiap tahun. Indonesia merupakan salah satu negara tropis yang memiliki dua musim yaitu musim hujan dan musim kemarau. Pada musim kemarau yang panjang ketersediaan air yang tidak memadai menjadi pembatas utama dalam pertumbuhan tanaman. Hal tersebut dapat menjadi tingkat kerugian bagi para petani. 5
Polyethylene Glycol (PEG) 6000 mampu mempengaruhi ketahanan tanaman terhadap kekeringan. Beberapa penelitian menyatakan penggunaan PEG 6000 pada medium sebagai agen seleksi dalam seleksi in vitro mempunyai tingkat resistensi terhadap kekeringan pada tingkat lapangan. Planlet yang dapat tumbuh dalam medium yang mengandung larutan atonik dan PEG 6000 dengan berbagai konsentrasi diduga dapat mendorong pertumbuhan akar dan mampu bertahan dalam kondisi alaminya di lingkungan yang dalam kondisi kekeringan. Perkecambahan jeruk siam yang ditanam pada medium in vitro dengan penambahan larutan atonik dan PEG 6000 dapat digunakan sebagai indikator kemampuan untuk menstimulasikan cekaman kekeringan dalam medium in vitro. E. Hipotesis 1. Terdapat kisaran konsentrasi larutan atonik yang optimum terhadap cekaman kekeringan untuk seleksi planlet jeruk siam pontianak secara in vitro. 2. Terdapat konsentrasi toleran PEG 6000 yang mampu menyeleksi planlet jeruk siam pontianak yang resisten terhadap cekaman kekeringan secara in vitro. 3. Terdapat interaksi antara larutan atonik dengan PEG 6000 terhadap kandungan prolin, kandungan karbohidrat terlarut total, dan indeks stomata planlet jeruk siam pontianak. 6
4. Adanya karakter ekspresi yang spesifik pada planlet jeruk siam pontianak toleran terhadap cekaman kekeringan meliputi: peningkatan kandungan prolin, kandungan karbohidrat terlarut total, dan indeks stomata. 7
II. TINJAUAN PUSTAKA A. Klasifikasi dan Morfologi Tanaman Jeruk Siam Pontianak 1. Klasifikasi Tanaman Jeruk Siam Pontianak Klasifikasi tanaman jeruk siam pontianak menurut (USDA, 2017) adalah sebagai berikut. Kerajaan : Plantae Divisi : Magnoliophyta Kelas : Magnoliopsida Bangsa : Sapindales Suku : Rutaceae Marga : Citrus Jenis : Citrus nobilis Lour. var. microcarpa Hassk. 2. Morfologi Tanaman Jeruk Siam Pontianak Tanaman jeruk mempunyai akar tunggang panjang dan akar serabut (bercabang pendek kecil) bila tanah subur dan gembur pertumbuhan akar dapat mencapai 4 meter. Akar cabang yang mendatar dapat mencapai 6-7 meter tergantung kepada banyaknya unsur hara didalam tanah (Deptan, 2012). 9
Daun tanaman jeruk siam memiliki daun warna yakni berwarna hijau tua pada bagian permukaan dau bagian atas dan hijau muda pada bagian permukaan bawah daun. Bentuk daun bulat memanjang, elips atau lanset dengan ujung runcing dan pangkal daun tumpul. Panjang daun 4-8 cm dan lebar 1,5-4 cm. Tangkai daunnya bersayap sangat sempit sehingga bisa dikatakan tidak bersayap (Sarwono, 1994). Bunga tanaman jeruk kebanyakan berbentuk majemuk dalam satu tangkai dan mempunyai aroma yang harum. Bunga-bunga tersebut muncul dari ketiak daun atau pucuk ranting yang masih muda. Setelah pucuk daun tumbuh, beberapa hari kemudian akan muncul bunga (Rismunandar, 1986). Bunga jeruk merupakan bunga lengkap yang terdiri atas ovarium (bakal buah), kepala putik, kepala sari, mahkota, dan tangkai putik (Sukarmin et al., 2008). Kelopak bunga berjumlah 4-5, ada yang menyatu ada yang tidak. Mahkota bunga kebanyakan berjumlah 4-5 dan berdaun lepas. Tonjolan dasar bunga beringgit atau berlekuk di dalam benang-sari (Sarwono, 1994). Buah jeruk berbentuk bulat dengan permukaan agak halus. Ujung buah bundar dan berpusar. Kulit buah berwarna kuning mengkilat dan sulit dikupas bila matang, ketebalan kulit sekitar 2 sampai 3,9 mm. Daging buah bertekstur lunak, mengandung banyak air, dan berwarna 10
kekuningan. Rasa daging buahnya sangat manis dan baunya harum, ukuran jeruk ini tergolong besar, dengan berat antara 150-250 gram/buah (Deptan, 2012). Adapun morfologi buah jeruk siam pontianak disajikan pada Gambar 1. Gambar 1. Buah Jeruk Siam Pontianak di BALITJESTRO (Rosyalina, 2017) Batang jeruk siam berbentuk bulat dan juga setengah bulat, batang tumbuh rendah dengan ketinggian 2-8 m. Batang jeruk siam memiliki percabangan yang banyak, pada umumnya tidak berduri dan tajuk pohon yang rindang. Ciri unik lainnya adalah dahannya kecil dan tidak bertulang (Deptan, 2012). Pada umumnya batang pohon jeruk siam yang dibudidayakan secara komersial mempunyai tinggi antara 2,5 sampai dengan 3,0 m. Pohon tersebut biasanya berasal dari perbanyakan vegetatif (cangkokan atau okulasi). Untuk pohon yang berasal dari okulasi, tingginya ditentukan oleh jenis batang bawah yang digunakan. Jeruk siam yang menggunakan batang bawah JC (Japanese citroen) biasanya memiliki 11
tinggi sekitar 272,5 cm, lingkaran batang 16,8 cm, dan lebar tajuk sekitar 197,5 cm. Sedangkan tanaman jeruk siam yang menggunakan RL (Rough lemon) biasanya memiliki tinggi sekitar 267,5 cm, lingkar batang 31,9 cm, dan lebar tajuk 217,5 cm. Kebanyakan varietas jeruk siam memiliki bentuk dan ukuran daun yang bisa di bedakan dari jenis jeruk lainnya. Bentuk daunnya oval dan berukuran sedikit lebih besar dari jeruk keprok garut. Ukuran daunnya sekitar 7,5 cm x 3,9 cm dan memiliki sayap daun kecil yang berukuran 0,8 x 0,2 cm. Ujung daunnya agak terbelah, sedangkan bagian pangkalnya meruncing. Urat daunnya menyebar sekitar 0,1 cm dari tepi daun. Antara batang dengan daun dihubungkan oleh tangkai daun dengan panjang sekitar 1,3 cm. Tanaman jeruk siam biasanya berbunga sekitar bulan September sampai dengan bulan Nopember. Bentuk dan warna bunganya cukup menarik. Ukuran bunga kecil dan mungil dengan warna putih segar. Bentuk buahnya bulat dengan ukuran idealnya sekitar 5,5 cm x 5.9 cm (Deptan, 2012). Jeruk siam memiliki ciri khas yang tidak dimiliki jeruk keprok lainnya karena mempunyai kulit yang tipis sekitar 2 mm, permukaannya halus dan licin, mengkilap serta kulit menempel lebih lekat dengan dagingnya. Dasar buahnya berleher pendek dengan puncak berlekuk. Tangkai buahnya pendek, dengan panjang sekitar 3 cm dan berdiameter 2,6 mm. Biji buahnya berbentuk ovoid, warnanya putih 12
kekuningan dengan ukuran sekitar 20 biji. Daging buahnya lunak dengan rasa manis dan harum. Produksi buah cukup berat dengan bobot berat perbuah sekitar 75,6 gram. Satu pohon rata-rata menghasilkan sekitar 7,3 kg buah. Panen biasanya dapat dilakukan pada bulan Mei - bulan Agustus (Deptan, 1994). B. Kultur Jaringan Teknik kultur jaringan dapat dijadikan alternatif untuk mengatasi beberapa kendala dalam pemuliaan konvensional. Kultur jaringan merupakan suatu proses menumbuhkan dan perbanyakan sel, jaringan, organ atau protoplas pada kondisi steril (Nasir, 2002). Menurut Zulkarnain (2009) keuntungan perbanyakan tanaman melalui kultur jaringan adalah memperoleh bibit secara massal dalam waktu yang relatif lebih singkat, tanaman bebas penyakit dan seragam. Teknik kultur jaringan dimulai dari teori totipotensi sel yang disampaikan oleh Schleiden dan Schawn pada tahun 1838. Sel dan jaringan tanaman tersebut dapat tumbuh menjadi kumpulan sel meristematik dalam jumlah tak terhingga yang disebut kalus. Kalus dapat dikembangkan menjadi tunas dan akar tanaman atau menjadi embrio somatik tergantung dari komposisi media dan lingkungan tumbuhnya (Nurhajati, 2011). Menurut Wetter et al., (1991) waktu yang dibutuhkan untuk mendapatkan kalus sangat bervariasi tergantung dengan jaringan eksplan dan komposisi 13
media kultur yang digunakan. Bagian jaringan tanaman yang digunakan sebagai bahan kultur jaringan disebut eksplan. Eksplan merupakan faktor penting dalam menentukan keberhasilan suatu regenerasi (Wattimena et al., 2011). Faktor penting lain yang berpengaruh terhadap keberhasilan kultur jaringan adalah media kultur jaringan, cahaya, suhu, oksigen, kelembaban dan pH (Hendaryono et al.,1994). Tahapan pada metode kultur jaringan dimulai dari pemilihan sumber tanaman sebagai bahan awal yang akan digunakan, penanaman pada medium yang sesuai untuk perbanyakan, pembentukan tunas dan akar hingga terbentuk planlet, proses adaptasi pada lingkungan di luar sistem in vitro (aklimatisasi) dan penanaman di lapang (Yuwono, 2008). C. Cekaman Kekeringan Cekaman kekeringan merupakan kondisi dimana minimumnya kadar air dalam tanah yang berhubungan dalam pertumbuhan dan produksi suatu tanaman. Cekaman kekeringan pada tanaman juga berdampak pada laju pelebaran daun, indeks luas daun, menutupnya stomata, pengurangan pengambilan karbon dioksida serta penuruan berat kering apabila cekaman kekeringan pada tanaman terlalu parah. Cekaman kekeringan pada tanaman menyebabkan menurunnya laju fotosintesis, penutupan stomata, penurunan pertumbuhan daun serta perubahan indeks luas daun (Purwanto et al., 2010). 14
D. Polyethylene Glycol (PEG) PEG termasuk kedalam golongan polimer sintetis. PEG mempunyai kelarutan yang baik dalam air dan kesamaan secara struktur kimia karena adanya gugus hidrosil primer pada ujung rantai polieter yang mengandung oksietilen (-CH2- CH2-O-). PEG mempunyai sifat stabil dan mudah larut dalam air hangat, tidak beracun, non-korosif, tidak berbau, tidak berwarna, memiliki titik lebur yang sangat tinggi (580 ), higoskopik (mudah menguap) dan juga dapat mengikat pigmen. PEG berbentuk putih seperti lilin yang menyerupai paraffin. Berupa bentuk padat dalam suhu kamar, dapat mencair pada suhu 104 °C dan memiliki berat molekul rata - rata 1000 (Mitchel, 1972). Polyethylene glycol (PEG) dapat di bedakan satu sama lain berdasarkan berat molekul (BM) atau Molecular Weight (MW). Penulisan atau penyebutan berat molekul PEG misalnya PEG MW 1650, PEG MW 3000, PEG MW 6000 yang semuanya merupakan polimer. Penggunaan PEG umumnya harus memperhatikan toksisitasnya, sifat PEG, kadar PEG optimal serta jenis PEG yang terbaik. Penggunaan PEG 6000 dalam 41 % keatas bagi tumbuh-tumbuhan umumnya bersifat toksik (Suryowinoto, 1996). 15
Polyethylene glycol (PEG) 6000 memiliki struktur bentuk padat, berwarna putih, suhu lebur 55-63 °C, berat molekul 6000-7000. PEG 6000 menunjukkan konduktivitas paling besar sebelum penambahan uap etanol 90 % hasil komposit polimer karbon (Gunawan et al., 2010). Struktur kimia Polyethylene Glycol (PEG) disajikan pada Gambar 2. Gambar 2. Struktur polyethylene glycol (PEG) (Anonymous, 2016). Polyethylene glycol (PEG) dapat digunakan sebagai simulasi kondisi cekaman kekeringan. Tanaman memiliki cara sendiri untuk menghadapi efek yang akan merusak pada dirinya yang ditimbulkan oleh cekaman. Setiap tanaman memiliki respon yang berbeda untuk menghadapi cekaman, tergantung pada jenis tanamannya. Apabila tanaman mampu bertahan hidup dalam kondisi cekaman maka tanaman itu dapat dikatakan sebagai tanaman yang memiliki tingkat resisten yang sangat tinggi terhadap cekaman (Mulyani, 2006). E. Seleksi Cekaman Kekeringan Menggunakan PEG Ketersediaan air merupakan faktor pembatas utama produksi tanaman karena sangat berpengaruh terhadap proses pertumbuhan. Kondisi cekaman kekeringan dapat disebabkan karena berkurangnya suplai air di 16
daerah perakaran dan permintaan air yang sangat banyak oleh daun, sehingga laju transpirasi melebihi laju absorpsi oleh akar (Levitt, 1980). Menurut (Kusvuran, 2012) respon tanaman terhadap cekaman kekeringan tergantung pada intensitas dan lama cekaman, spesies tanaman serta tahap pertumbuhan tanaman. Penggunaan metode seleksi in vitro pada perbaikan tanaman telah banyak digunakan untuk meningkatkan sifat ketahanan baik terhadap faktor biotik maupun abiotik (Tsago et al., 2013). Seleksi in vitro membutuhkan bahan selektif yang dapat mensimulasi kondisi ex vitro secara tepat. Salah satu metode untuk seleksi cekaman kekeringan adalah penggunaan senyawa osmotik Polyethylene glycol (PEG) (Maftuchah et al., 2014). PEG merupakan senyawa dengan bobot molekul antara 3.000 sampai 20.000 yang dapat larut sempurna di dalam air. Penggunaan PEG 6000 paling tepat digunakan untuk seleksi cekaman kekeringan karena tidak menyebabkan terserapnya PEG ke jaringan tanaman dan tidak bersifat racun bagi tanaman. Penurunan potensial air pada media PEG sesuai dengan penurunan potensial air di dalam tanah pada kondisi cekaman kekeringan. Besarnya penurunan potensial air tergantung pada bobot molekul dan konsentrasi PEG yang digunakan, semakin tinggi konsentrasi dan bobot molekul PEG yang digunakan, maka semakin besar penurunan potensial air (Michel et al., 1973). 17
F. Atonik Zat pengatur tumbuh Atonik merupakan salah satu zat pengatur tumbuh yang beredar di pasaran. Zat pengetur tumbuh ini dapat meningkatkan proses fotosintesis, meningkatkan sintesis protein dan juga meningkatkan daya serap unsur hara dari dalam tanah. Zat pengatur tumbuh Atonik mengandung bahan aktif triakontanol, yang umumnya berfungsi mendorong pertumbuhan, dimana dengan pemberian zat pengatur tumbuh terhadap tanaman dapat merangsang penyerapan hara oleh tanaman (Kusumo, 1984). Selanjutnya Lingga (1986) menyatakan, atonik dapat juga untuk meningkatkan hasil atau produksi, mutu, warna, kandungan vitamin dan menciptakan buah matang seragam serta menciptakan daya tahan terhadap serangan hama. G. Metabolisme Prolin Prolin merupakan senyawa penciri biokimia atau metabolit osmotik yang banyak disintesis dan diakumulasi pada berbagai jaringan tanaman terutama pada daun apabila tanaman menghadapi cekaman kekeringan. Tanaman yang mengakumulasi prolin pada kondisi tercekam pada umumnya memiliki kenampakan morfologi yang lebih baik serta memiliki ketahanan hidup yang lebih tinggi daripada tanaman yang tidak mengakumulasikannya (Hamim et al., 2008). 18
Mathius et al., (2004) menyatakan prolin merupakan senyawa osmotikum yang berperan dalam peningkatan daya tahan terhadap cekaman air dari lingkungannya sehingga banyak diakumulasikan pada kondisi ketersediaan air rendah. Fenomena tersebut dideskripsikan sebagai osmoregulasi dan penyesuaian osmosis. Osmoregulasi didefinisikan sebagai pengaturan potensial osmosis dalam sel dengan penambahan/pemindahan senyawa terlarut sehingga potensial osmosis intrasel sebanding dengan potensial osmosis medium sekeliling sel, sedangkan penyesuaian osmosis lebih mengarah pada penurunan potensial osmosis yang disebabkan akumulasi senyawa terlarut sehingga memungkinkan untuk mengambil air dari lingkungan. Tanaman yang mempunyai tingkat peningkatan osmotikum yang lebih tinggi diduga lebih toleran dibandingkan dengan tanaman yang tingkat peningkatan osmotikumnya lebih rendah. Respon tanaman dalam menghadapi kondisi cekaman kekeringan dapat terjadi pada tingkat morphologi, fisiologi dan biokimia (Tardieu, 1996). Salah satu mekanisme tanaman untuk bertahan terhadap terjadinya cekaman kekeringan dilakukan dengan cara mengatur potensial osmotik sel, terutama jika cekaman kekeringan yang terjadi meningkat secara gradual dari cekaman ringan menjadi berat (Levitt, 1980). Potensial osmotik sel dapat diatur dengan meningkatkan konsentrasi prolin. Senyawa prolin berfungsi untuk pengaturan derajat osmotik sel 19
(osmotic adjustment). Akumulasi prolin dapat menurunkan potensial osmotik sehingga menurunkan potensial air dalam sel tanpa membatasi fungsi enzim dan menjaga turgor sel (Hamim et al., 1996). Akumulasi prolin sebagai respon terhadap cekaman osmotik telah umum diketahui (Konstantinova et al., 2002). Telah banyak peneliti yang menemukan bahwa tanaman yang terkena cekaman kekeringan akan mengakumulasi asam amino prolin dalam jumlah tertentu dan bervariasi tergantung pada jenis tanaman, umur, dan varietas tanaman yang digunakan (Hamim, 2004). Menurut Bates (1973) kandungan prolin pada tanaman meningkat secara proporsional lebih cepat dibandingkan dengan asam amino lain pada kondisi cekaman kekeringan. Kriteria ini dapat dimanfaatkan sebagai suatu tolok ukur untuk mengevaluasi varietas-varietas yang tahan terhadap- kondisi kekeringan. Hubungan antara akumulasi prolin bebas dan cekaman kekeringan ini, telah benyak diteliti oleh para peneliti dan pakar fisiologi tanaman. Barnett et al. (1966) yang melakukan penelitian pada sulur rumput Bermuda melaporkan bahwa cekaman kekeringan menyebabkan akumulasi prolin bebas sebesar 10-100 kali dan asparagin bebas sebanyak 2-6 kali; keduanya merupakan karakter respon tanaman terhadap cekaman kekeringan. 20
Prolin disintesis dan diakumulasi dari asam glutamat serta diduga selama cekaman kekeringan air prolin berfungsi sebagai cadangan makanan. Hasil serupa juga dilaporkan oleh Rhodes et al. (1986) yang melakukan penelitian mengenai kultur sel tomat, bahwa peningkatan tekanan osmotik (dengan memberikan perlakuan beberapa taraf konsentrasi PEG) telah meningkatkan akumulasi prolin bebas. Maggio et al. (2002) mengemukakan bahwa akumulasi prolin merupakan konsekuensi dari peningkatan asam amino bebas dan tidak semata-mata karena pengaruh induksi dan ekspresi gen secara langsung. Ia menambahkan bahwa ketika tanaman berada pada lingkungan stress, seperti kekeringan, salinitas tinggi, dan temperatur yang rendah, tanaman aktif memproduksi berbagai macam metabolit dan sistem pertahanan untuk tetap bertahan hidup. Contohnya, osmoprotektan, seperti prolin (pro), glycine betaine, mannitol, dan gula untuk toleransi terhadap cekaman. Claussen, (2004) mengemukakan bahwa semakin stres cekaman yang di alami tanaman (tomat) maka semakin tinggi kadar prolinnya. Hasil tersebut tercermin dari konsentrasi prolin yang lebih tinggi pada daun tanaman yang ditanam selama akhir musim. Perbedaan waktu tanam menyebabkan perbedaan kandugan air pada tanah. Disimpulkan bahwa prolin merupakan indikator yang dapat diandalkan dari tekanan lingkungan yang dikenakan pada tanaman, sehingga memungkinkan untuk 21
membangun ambang stres bagi hasil buah dan produk kualitas tomat hidroponik yang tumbuh. H. Karbohidrat Karbohidrat adalah senyawa organik yang mengandung karbon, hidrogen dan oksigen baik dalam bentuk molekul sederhana maupun kompleks (Christian et al., 2003). Karbohidrat telah menjadi sumber energi utama untuk metabolisme pada manusia dan sarana untuk memelihara kesehatan saluran pencernaaan manusia. Karbohidrat adalah penyumbang utama dari komponen yang membentuk produk pangan baik sebagai komponen alami maupun bahan yang ditambahkan. Karbohidrat meliputi lebih dari 90 % dari berat kering tanaman. Karbohidrat banyak tersedia dan murah. Penggunaannya sangat luas dan jumlah penggunaannya cukup besar (Fennema, 1996) baik untuk pemanis, pengental, penstabil, gelling agents dan fat replacer (Christian et al., 2003). Karbohidrat dapat dimodifikasi baik secara kimia dan biokimia dan modifikasi itu digunakan untuk memperbaiki sifat dan memperluas penggunaannya. Perubahan karbohidrat menjadi bentuk tertentu sangat penting karena adanya hubungan secara langsung dengan proses fisiologis seperti fotosintesis, translokasi dan respirasi. Terdapat beberapa macam karbohidrat terlarut, yaitu diantaranya sukrosa, glukosa dan fruktan. 22
Kandungan karbohidrat terlarut total merupakan indikator yang sesuai untuk cekaman kekeringan atau cekaman salinitas. Efek dari tekanan osmotik dan cekaman salinitas pada kandungan karbohidrat terlarut dapat diamati dari bagian akar, daun dan batang. Bagian batang banyak digunakan karena organ tersebut banyak mengandung konsentrasi gula pada kondisi tercekam (Kerepesi, 2000). 23
III. METODE PENELITIAN A. Waktu dan Tempat Kegiatan penelitian ini telah dilaksanakan mulai bulan November sampai dengan Desember 2017 bertempat di Laboratorium Botani (Ruang In Vitro), Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Lampung. B. Alat dan Bahan Alat-alat yang di gunakan dalam kegiatan ini adalah autoklaf, botol kultur, cawan petri, tabung reaksi, gelas ukur, erlenmeyer, labu takar, beaker glass, pH meter, bunsen, pinset, mikropipet, gunting, batang pengaduk, kompor, panci, laminar air flow cabinet (LAFC) merk ESCO, timbangan analitik ohaus, magnetic stirrer, spektrofotometer UV, pisau skalpel, mata pisau scalpel (One Med), peralatan diseksi, hand sprayer, tisu, alat tulis, solasi, plastic wrap, alumunium foil, dan kertas label. Bahan-bahan yang digunakan dalam kegiatan ini adalah media dasar murashige dan skoog use ready, polyethylene glycol 6000 (PEG 6000), 22
atonik (ATONIK 6,5L) {komposisi: natrium orthophenol (0,2 %), natrium para nitrophenol (0,3 %), natrium 5-nitroguaiacolat (0,1 %), dan 2,4 dinitrophenolat (0,01 %), akuades, benzine amino purine (BAP), sukrosa, plant preservative mixture (PPM), spritus, α napthol, H2SO4, alkohol 70 %, 95 % dan 96 %, larutan pemutih (Bayclean) (bahan aktif: Natrium Hipoklorit), gula pasir, agar-agar, biji jeruk varietas pontianak, myoinositol, Kalium Hidroksida (KOH), dan Asam Klorida (HCl). Sedangkan bahan untuk analisa prolin yaitu asam sufosalisilat 3 % (MERCK), ninhydrin (MERCK), asam fosforat, asam asetat glasial, toluen, prolin (SIGMA-ALDRICH), daun tanaman jeruk siam pontianak, dan kertas saring Whatman No. 1. C. Rancangan Penelitian Rancangan penelitian ini disusun dengan pola dasar Rancangan Faktorial 3x3 dengan dua faktor yaitu faktor A: Atonik dengan tiga taraf konsentrasi yaitu 0 mL/L (A1), 1 mL/L (A2), 2 mL/L (A3) dan faktor B: PEG 6000 b/v dengan 3 taraf konsentrasi yaitu 0 % (Kontrol) (B1), 3 % (B2), 5 % (B3). Masing-masing konsentrasi dilakukan 4 kali pengulangan dan setiap ulangan terdiri dari 3 planlet jeruk siam pontianak dalam setiap botol kultur. Notasi faktor taraf kombinasi perlakuan disajikan pada Tabel 1. dan tata letak percobaan disajikan pada Tabel 2. 24
Tabel 1. Notasi faktor taraf kombinasi perlakuan Faktor B Taraf A1 B1 B2 B3 A1B1 A1B2 A1B 3 Keterangan : A1B1 : Larutan Atonik 0 mL/L, PEG 6000 0 % A1B2 : Larutan Atonik 1 mL/L, PEG 6000 3 % A1B3 : Larutan Atonik 2 mL/L, PEG 6000 5 % A2B1 : Larutan Atonik 0 mL/L, PEG 6000 0 % A2B2 : Larutan Atonik 1 mL/L, PEG 6000 3 % A2B3 : Larutan Atonik 2 mL/L, PEG 6000 5 % A3B1 : Larutan Atonik 0 mL/L, PEG 6000 0 % A3B2 : Larutan Atonik 1 mL/L, PEG 6000 3 % A3B3 : Larutan Atonik 2 mL/L, PEG 6000 5 % A A2 A2B1 A2B2 A2B3 A3 A3B1 A3B2 A3B3 25
26 Tabel 2. Tata letak satuan percobaan U4 A1B1 U2 A1B3 U2 A1B2 U1 A2B3 U1 A2B2 U2 A3B1 U4 A2B1 U1 A3B2 U4 A1B3 U1 A2B3 U3 A2B2 U4 A3B3 U3 A2B1 U3 A1B1 U1 A3B1 U1 A1B2 U2 A3B3 U4 A2B2 U1 A1B3 U3 A3B1 U2 A1B2 U4 A2B1 U4 A2B3 U2 A2B2 U3 A3B2 U3 A3B3 U2 A1B1 U4 A1B3 U4 A2B3 U4 A1B2 U3 A3B2 U3 A2B1 U2 A3B1 U1 A3B2 U2 A3B3 U1 A1B1 U3 Keterangan : A1 - A3 : Konsentrasi Atonik B1 - B3 : Konsentrasi PEG U1 - U3 : Ulangan 1 - Ulangan 4 D. Bagan Alir Penelitian Penelitian ini terdiri atas beberapa tahap, yaitu : (1.) Perendaman biji jeruk siam pontianak dengan larutan atonik sesuai konsentrasi sebelum penanaman dalam medium, (2.) Penanaman biji jeruk ke dalam medium MS yang sudah ditambahkan PEG sesuai konsentrasi, (3.) Analisis karakter ekspresi yang spesifik pada planlet biji jeruk siam pontianak resisten cekaman kekeringan meliputi analisis (1.) Presentase jumlah planlet yang hidup, (2.) Visualisasi planlet, ( 3.) Kandungan prolin, (4.) Karbohidrat, (5.) Indeks stomata. Pengamatan dilakukan setiap 3 hari
sekali selama 2 minggu. Tahap penelitian ini disajikan dalam bentuk diagram alir seperti tercantum pada Gambar 3. 27
E. Pelaksanaan Penelitian Pelaksanaan penelitian meliputi beberapa langkah sebagai berikut : 1. Sterilisasi Alat Alat-alat gelas dan dissecting set (skalpel, mata pisau skalpel, pinset) dicuci dengan detergen kemudian alat-alat tersebut dicuci dengan air mengalir dan diautoklaf. Alat dari bahan gelas ditutup plastik, sedangkan alat-alat dari bahan logam dan cawan petri dibungkus dengan kertas HVS. Semua alat tersebut disterilisasi dalam autoklaf pada temperatur 121 °C, selama 30 menit. 2. Persiapan Medium Tanam Medium yang digunakan dalam penelitian ini adalah Murashige dan Skoog (MS) padat. Pembuatan medium tanam MS sebanyak 1 liter adalah dengan cara menimbang media dasar Murashige dan Skoog use ready sebanyak 4,43 gram, kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 1 liter. Akuades ditambahkan sampai tanda 1 liter dan pH diatur sampai 5,5. Untuk mendapatkan pH 5,5 dilakukan penambahan KOH 1 N atau HCl 1 N. Larutan tersbut kemudian dipindahkan ke dalam wadah yang lebih besar lalu ditambahkan agar-agar sebanyak 7 gram/L, sukrosa 30 gram/L, dan PPM 0,5 mL/L. Larutan medium dipanaskan untuk melarutkan agar-agar (sambil diaduk) sampai mendidih. Penambahan (Zat Pengatur Tumbuh) ZPT dilakukan setelah larutan medium diangkat, kemudian dituangkan ke 28
dalam botol kultur sebanyak 20 ml/botol. Sterilisasi medium dengan menggunakan autoklaf dengan tekanan 17,5 psi, 121 °C selama 15 menit. 3. Persiapan Medium Seleksi Medium Murashige dan Skoog (MS) padat ditambah PEG 6000 dengan konsentrasi 0 % (kontrol), 3 %, dan 5 %. Sebelum digunakan, PEG 6000 yang telah dilarutkan dengan akuades pada konsentrasi tertentu disaring menggunakan syringe filter yang mempunyai diameter 0,45µm sebanyak 2 kali, dilanjutkan filter berdiameter 0,22 µm satu kali. Penyaringan dilakukan dalam ruang steril didalam LAFC. Selanjutnya PEG 6000 ditambahkan ke dalam medium MS. Sebelum digunakan, medium diinkubasikan selama 7 hari pada suhu kamar (25 °C) untuk memastikan bahwa PEG 6000 telah tersaring dengan baik. Apabila dalam waktu 7 hari tidak terjadi kontaminasi pada medium, maka medium dapat digunakan. 4. Sterilisasi Biji Biji dikupas dari kulitnya kemudian biji direndam dalam larutan bendix (fungisida) selama 30 menit, kemudian biji dibilas dengan akuades sebanyak 3 kali, lalu biji dikupas lapisan kulit arinya. Setelah itu biji direndam dengan bayclean 10 % selama 10 menit dilanjutkan dengan bayclean 5 % selama 15 menit. Setelah itu biji dibilas dengan akuades steril sebanyak 3 kali pengulangan. Semua kegiatan ini dilakukan dalam ruang steril di dalam Laminar Air Flow. (Gambar 11., Lampiran 7.). 29
5. Penanaman Biji yang telah steril kemudian dipindahkan ke dalam cawan petri, selanjutnya biji ditanam pada medium MS 0. Penanaman biji jeruk siam pontianak dilakukan di dalam LAFC. Setiap botol kultur ditanami 10 biji, sehingga total biji yang ditanam sebanyak 150 biji dalam 15 botol kultur. Biji jeruk siam pontianak tersebut ditumbuhkan hingga menjadi planlet. Inkubasi kultur dilakukan pada ruangan dengan penyinaran sekitar 1000 lux, 24 jam/hari dan suhu sekitar 20 °C. Penanaman biji pada medium tanam dilampirkan pada Gambar 12, Lampiran 7. 6. Induksi Planlet dengan Larutan Atonik Akar planlet yang akan ditanam mula-mula direndam dengan larutan atonik selama 10 menit. Larutan atonik terlebih dahulu dilarutkan dengan akuades pada 3 konsentrasi yaitu 0 mL/L (kontrol), 1 mL/L, 2 mL/L, kemudian disaring dengan menggunakan syringe filter dengan diameter 0,45 µm sebanyak 2 kali, dilanjutkan filter berdiameter 0,22 µm 1 kali. 7. Penanaman Pada Medium Seleksi Planlet yang telah direndam dengan larutan atonik dipindahkan ke dalam cawan petri, selanjutnya planlet ditanam pada medium Murashige dan Skoog yang telah diberi PEG 6000 dengan berbagai konsentrasi. Penanaman planlet jeruk siam pontianak dilakukan di dalam LAFC. Setiap botol kultur ditanami 3 planlet, sehingga total planlet yang ditanam 30
31 sebanyak 108 batang dalam 36 botol kultur. Penanaman planlet jeruk siam pontianak dilampirkan pada Gambar 13., Lampiran 7. Inkubasi kultur dilakukan pada ruangan dengan penyinaran sekitar 1000 lux, 24 jam/hari dan suhu sekitar 20 °C. Penataan letak planlet jeruk siam pontianak di lemari inkubasi dengan penyinaran sekitar 1000 lux, dan suhu sekitar 18- 20 °C dilampirkan pada Gambar 14., Lampiran 7. 8. Pengamatan Pengamatan dilakukan pada akhir minggu ke-2 dan dievaluasi untuk mengetahui konsentrasi PEG 6000 yang toleran untuk seleksi planlet jeruk siam pontianak secara in vitro. Setelah 2 minggu diinkubasi, planlet yang masih hidup dalam botol kultur kemudian dikarakterisasi dengan parameter sebagai berikut. a. Persentase Jumlah Planlet yang Hidup Rumus yang digunakan untuk menghitung persentase jumlah planlet jeruk siam pontianak yang hidup yaitu: 100 (Persamaan 1.) (Nurcahyani et al., 2014). b. Visualisasi Planlet Meliputi warna planlet setelah diseleksi PEG 6000 dengan klasifikasi sebagai berikut: hijau, hijau dengan bagian tertentu berwarna cokelat, dan cokelat (Nurcahyani et al., 2014).
c. Analisis Kandungan Prolin Analisis prolin dilakukan dengan metode yang telah dimodifikasi oleh Bates (1973) menggunakan spektrofotometer dengan prolin murni sebagai standar. Diawali dengan menyiapkan asam ninhydrin sebagai pereaksi, yaitu dengan melarutkan 1 gram ninhydrin dalam 30 ml asam asetat glasial dan 20 ml asam asetat. Larutan tersebut didinginkan dan disimpan selama 24 jam hingga pereaksi siap digunakan. Sementara itu daun planlet yang telah disiapkan lalu ditimbang sebanyak 0,1 gram, kemudian daun digerus (ekstraksi) dengan mortar dengan ditambahkan 10 ml asam sulfosalisik 3 % dan disentrifuse dengan kecepatan 6.000 rpm selama 5 menit dan diambil supernatannya. Persiapan uji kandungan prolin disajikan pada Gambar 15. Lampiran 7. Hasil supernatannya ditera sebanyak 10 ml, 2 ml cairan sampel diambil dan direaksikan dengan 2 ml asam ninhidrin dan 2 ml asam asetat glasial. Selanjutnya tabung dipanaskan selama 1 jam pada suhu 100 °C, kemudian dinginkan. Cairan tersebut selanjutnya diekstraksi kembali dengan 4 ml toulen kemudian dikocok selama 15-20 detik dengan testtube strirer kemudian larutan dipisahkan dari endapan yang terbentuk dan diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 490 nm dengan blangko larutan toluen. Larutan prolin daun planlet jeruk siam pontianak dilampirkan pada Gambar16. Lampiran 7. 32
Hasil absorbansi larutan standar dibuat persamaan regresi linier sehingga diperoleh persamaan: Y = ax + b. Nilai absorbansi sampel selanjutnya dimasukkan sebagai nilai Y sehingga didapatkan nilai x (µ/mol). ( ) (Persamaan 2.) (Bates, 1973). d. Kandungan Karbohidrat Terlarut Total Analisis kandungan karbohidrat terlarut total dilakukan dengan metode fenol-sulfur (Witham et al.,1993). Daun planlet jeruk siam pontianak diambil dan ditimbang sebanyak 0,1 gram. Daun ditumbuk dengan mortar lalu diberi 10 ml akuades, disaring dengan kertas saring Whatman no. 1 lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Pembuatan ekstraksi daun planlet jeruk siam pontianak dilampirkan pada Gambar 17. Lampiran 7. Selanjutnya filtrat diambil sebanyak 1 ml lalu ditambahkan 1 ml H2SO4 lalu ditambahkan fenol sebanyak 2 ml. Selanjutnya filtrat dimasukkan ke dalam kuvet dibaca pada panjang gelombang 490 nm. Larutan karbohidrat disajikan pada Gambar 18. Lampiran 5. 33
34 Kandungan karbohidrat terlarut total dihitung dengan cara membuat larutan standar glukosa yang terdiri dari beberapa konsentrasi lalu diukur pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 490 nm. e. Indeks Stomata Pembuatan preparat stomata dengan metode Ruzin (1999) sebagai berikut. Daun planlet Citrus nobilis dibuat potongan-potongan segiempat dengan sisi sekitar 5 mm dan dimasukkan ke dalam tabung berisi larutan kloralhidrat dalam air (5:1). Tabung dipanasi dalam waterbath selama sekitar 10 menit hingga potongan-potongan daun tersebut menjadi transparan. Potongan daun diletakkan dalam larutan khloralhidrat pada gelas benda. Permukaan yang ada stomatanya diletakkan disebelah atas, kemudian ditutup dengan gelas penutup. Preparat diamati pada 5 bagian daerah yang berlainan. Persiapan dan pengamatan indeks stomata dilampirkan pada Gambar 20. Lampiran 7. Tiap sel epidermis (E) ditandai dengan (x), tiap stoma (S) ditandai dengan (O). Indeks stomata besarnya dihitung dengan rumus: Indeks Stomata = { } 100 (Persamaan 4.) (Ruzin, 1999). Hasil akhir adalah rata-rata dari 5 buah pengamatan.
9. Analisis Data Data yang diperoleh dari pertumbuhan planlet jeruk selama seleksi dengan PEG 6000 berupa data kualitatif dan data kuantitatif. Data kualitatif disajikan dalam bentuk deskriptif komparatif dan didukung foto. Sedangkan untuk mengetahui pengaruh atonik dan PEG secara kuantitatif, maka homogenitas ragam diuji menggunakan uji Levene. Kemudian data yang diperoleh dianalisis menggunakan analisis ragam pada taraf nyata 5 %. Jika interaksi faktor A (Atonik) dan faktor B (PEG 6000) tidak nyata maka ditentukan main effect dengan uji BNT (Beda Nyata Terkecil) pada taraf nyata 5 %. Jika interaksi nyata maka ditentukan simple effect PEG (faktor B) pada setiap konsentrasi atonik (faktor A) dengan uji F pada taraf nyata 5 %. 35
V. SIMPULAN DAN SARAN A. Simpulan Berdasarkan hasil penelitian dan pembahasan, dapat disimpulkan bahwa: 1. Konsentrasi larutan atonik yang optimum untuk pertumbuhan planlet jeruk siam pontianak (Citrus nobilis Lour. var. microcarpa Hassk.) yang resisten terhadap cekaman kekeringan secara in-vitro adalah 2 mL/L. 2. Konsentrasi PEG 6000 yang toleran untuk pertumbuhan planlet jeruk siam pontianak (Citrus nobilis Lour. var. microcarpa Hassk.) yang resisten terhadap cekaman kekeringan secara in-vitro adalah 5 %. 3. Terdapat interaksi antara larutan atonik dan PEG 6000 pada karakter ekspresi jeruk siam pontianak (Citrus nobilis Lour. var. microcarpa Hassk.). 4. Karakter ekspresi yang spesifik pada planlet jeruk siam pontianak (Citrus nobilis Lour. var. microcarpa Hassk.) yang mengalami cekaman kekeringan meliputi: a. Kandungan prolin pada planlet jeruk siam pontianak dengan perlakuan kombinasi larutan atonik dan PEG 6000 dengan berbagai 55
b. konsentrasi mengalami peningkatan. Semakin tinggi konsentrasi PEG 6000 yang diberikan maka semakin tinggi kandungan prolin. c. Kandungan karbohidrat terlarut total pada planlet jeruk siam pontianak dengan perlakuan kombinasi larutan atonik dan PEG 6000 berbagai konsentrasi mengalami penurunan. Semakin tinggi konsentrasi PEG 6000 maka semakin rendah kandungan karbohidrat terlarut total. d. Indeks stomata pada planlet jeruk siam pontianak dengan perlakuan kombinasi larutan atonik dan PEG 6000 berbagai konsentrasi mengalami penurunan. Semakin tinggi konsentrasi PEG 6000 maka semakin rendah indeks stomata. B. Saran Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap planlet jeruk siam pontianak yang resisten terhadap cekaman kekeringan dengan penambahan konsentrasi Zat Pengatur Tumbuh (ZPT) dan analisis lanjut dengan menganalisis karakter yang lain seperti kandungan klorofil, gula pereduksi, dan juga analisis molekular. 56
DAFTAR PUSTAKA 57
Badami K dan A. Amzeri. 2010. Seleksi In Vitro untuk Toleransi Terhadap Kekeringan pada Jagung ( Zea mays L.) dengan Polyethylene Glycol (PEG). Agrovigor , 3 No. 1. Banyo, Y. E., N. S. Ai, P. Siahaan, dan A.M. Tangpao. 2013. Konsentrasi Klorofil Daun Padi Pada Saat Kekurangan Air yang Diinduksikan dengan Polyethylene Glycol. Jurnal Ilmiah Sains, 13 (1) : 1 - 8. Barnett NM, Naylor AW. 1966. Amino Acid and Protein Metabolism in Bermuda Grass during Water Stress. Plant Physiology. 41(7):1222 - 1230. Bates, L.S. 1973. Rapid Determination of Free Proline for Water-Stress Studies. Plant and Soil, 39: 205 - 207. Bray, E.A. 1997. Plant Responses to Water Deficit. Trend Plant Sci., 2(21) : 48 - 54. Christian, V.A., dan Vaclavik. 2003. Essential of Food Science Second Edition. Kluwer Academic. London. Clausen, G. 2004. Price Sensitivity for Electronic Entertainment. Boca Raton. Florida. Deptan. 2010. Modul Diklat Tugas dan Fungsi Penyuluhan Pertanian. Deptan. 2012. Kajian Umum Mengenai Tanaman Jeruk. diakses 13 September 2017 Pukul: 19.15 WIB. Farooq, M, S.M.A. Basra, Z.A. Wahid, M.A. Cheema, dan A. Khaliq. 2008. Physiological Role of Exogenously Applied Glycinebetaine in Improving Drought Tolerance of Fine Grain Aromatic Rice (Oryza sativa L.). Journal of Agronomy and Crop Science, 194 : 325 - 333. Fennema, O. R. 1996. Food Chemistry Third Edition.Marcel Dekker Inc. New York Gunawan, L. W. 1987. Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan. PAU Bioteknologi IPB. Bogor. Gunawan, B. dan C. D. Azhari.2010. Karakterisasi Spektofotometri dan Scaning Electron Microcopy (SEM) Sensor Gas dari Bahan Polimer Poly-Etilene Glycol (PEG). Jurnal ISSN :1979 - 6870 Hamim, D. Sopandie, M. Jusuf. 1996. Beberapa Karakteristik Morfologi dan Fisiologi Kedelai Toleran dan Peka Terhadap Cekaman Kekeringan. Hayati 1:30-34. 58
Hamim. 2004. Underlaying Drought Stress Effects on Plant: Inhibition of Photosynthesis. Hayati, 11 (4): 164 - 169. Hamim. 2008. Pengaruh Pupuk Hayati Terhadap Pola Serapan Hara, Ketahanan Penyakit, Produksi dan Kualitas Hasil Beberapa Komoditas Tanaman Pangan dan Sayuran Unggulan. Laporan Penelitian KK3PT. Institut Pertanian Bogor. Bogor. Haryati. 2003. Pengaruh Cekaman Kekeringan Air Terhadap Pertumbuhan dan Hasil Tanaman. Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara. Medan. Hassanein, A.M. 1999. Alterations in Protein and Esterase Patterns of Peanut in Response to Salinity Stress. Biologia Plantarum, 42 : 241 - 248. Hatimah, I. 2000. Strategi dan Metode Pembelajaran. Andira. Bandung. Hendaryono, D.P.S. dan A. Wijayani. 1994. Kultur Jaringan (Pengenalan dan Petunjuk Perbanyakan Tanaman Secara Vegetatif Media). Penerbit Kanisius. Yogyakarta. Jaleel, C.A., P. Manivannan, A. Wahid, M. Farooq, R. Somasundaram, dan R. Panneerselvam. 2009. Drought Stress in Plants: a Review on Morphological Characteristics and Pigments Composition. International Journal of Agricultural and Biology, 11 : 100 - 105. Konstantinova, T., D. Parvanova, A. Atanassov, dan D. Djilianov. 2002. Freezing Tolerant Tobacco, Transformed to Accumulate Osmoprotectants. Plant Science, 163: 157-164. Kartasapoetra, G. 1994. Teknologi Penyuluhan Pertanian. Bina Aksara. Jakarta. Keller, F. dan M.W. Ludlow. 1999. Carbohydrates Metabolism in Drought- Stressed Leaves of Pigeonpeas (Cajanus cajan). Journal of Exp. Botany, 44 : 1351 - 1359. Kerepesi, I. dan G. Galiba. 2000. Osmotic and Salt Stress-Induced Alteration in Soluble Carbohydrate Content in Wheat Seedlings. CropScience, 40 : 482 - 487. Kramer, A. 1977. Effect Of Storage On Nutritive Value Of Food. Journal of Food Quality,1 : 22 - 55. Kusumo. 1984. Zat Pengatur Tumbuh. CV Yasaguna. Jakarta. 59
Kusvuran, S. 2012. Effects of Drought and Salt Stresses on Growth, Stomatal Conductance, Leaf Water and Osmotic Potentials of Melon Genotypes (Cucumis Melo L.). African Journal of Agricultural Research, 7 (5) : 775 - 781. Levitt, J. 1980. Responses of plants to environmental stresses: Water, radiation, salt, and other stresses. . II. Academic Press. New York. Lingga. 1986. Petunjuk Penggunaan Pupuk. Penebar Swadaya. Jakarta. Mafakheri, A., A. Siosemardeh, B. Bahramnejad , P. C. Stuik, Y. Sohrabi. 2011. Effect of Drought Stress and Subsequent Recovery on Protein, Carbohydrate Content, Catalase, and Peroxidase Activities in Three Chickpea (Cicer arietinum) Cultivars. Australian Journal of Crop Science, 5 (10) : 1255 - 1260. Maftuchah, A. Winaya, dan A. Zainudin. 2014. Teknik Analisis Biologi Molekuler. Penerbit Deepublish. 50 - 52. Yogyakarta. Maggio, A., T. Matsumoto., P.M. Hasegawa, J.M. Pardo, dan R.A. Bressan. 2002. The Long and Winding Road to Halotolerance Genes. In: Lauchli, A., Luttge,U. (Eds.), Salinity: Environment-Plants-Molecules. Kluwer Academic Publisher, The Netherlands, 505 - 533. Mahajan, S dan N. Tuteja. 2005. Cold, Salinity and Drought Stress: An overview. Archives of Biochemistry and Biophysics, 444 : 139 - 158. Mathius, N. T., Liwang, T., Danuwikarsa, M. I., Suryatmana, G., Djajasukanta, H., Saodah, D. dan I. G. P. W. Astika. 2004. Respons Biokimia Beberapa Progeni Kelapa Sawit (Elaeis guineensis Jacq.) Terhadap Cekaman Kekeringan Pada Kondisi Lapang. Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia. Bogor. Michele, R. E dan M. R. Kaufman. 1973. Osmotic potential of polyethylene glikol 6000. Plant Physiology, 5 : 914 - 916. Mitchel, H.L. 1972. How PEG Helps the Hobbyist Who Works with Wood. Forest Service, U.S Department of Agriculture. Madison Muhammad, S., Hussain, I., Khan, I. A., Rab, A., Jan, I., Wahid, F., Shah, S. T. 2013. Influence of Organic Mulches on Growth and Yield Components of Pea's Cultivars. Greener Journal of Agricultural Sciences, 3 : 652 - 657. Mulyani, S. 2006. Anatomi Tumbuhan. Penerbit Kanisius. Yogyakarta. 140- 150. 60
Nasir, M. 2002. Bioteknologi: Potensi dan Keberhasilannya dalam Bidang Pertanian. Raja Grafindo Persada. Jakarta. Nurcahyani, E., B. Hadisutrisno, I. Sumardi, dan E. Suharyanto. 2014. Identifikasi Galur Planlet Vanili (Vanilla planifolia Andrews) Resisten Terhadap Infeksi Fusarium oxysforum f. Sp. Vanillae hasil seleksi in vitro dengan asam fusarat. Prosiding Seminar Nasional: "Pengendalian Penyakit pada Tanaman Pertanian Ramah Lingkungan", Perhimpunan Fitopatologi Indonesia Komda Joglosemar-Fakultas Pertanian UGM. ISBN 978-602- 71784-0-3./2014 : 272 - 279. Nurhajati, A.M. 2011. Membangun Usaha Tanaman Hias dan Bunga Potong dengan Mengaplikasikan Bioteknologi Khususnya Kultur Jaringan. Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian Institut Pertanian Bogor. Bogor. Nurul, A. 2013. Struktur Anatomi Daun Lengkeng (Dimocarpus longan Lour.) Kultivar Lokal, Pingpong Itoh, dan Diamond River. Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Jember. Jember. Pallardy, S.G. 2008. Transpiration and Plant Water Balance. Physiology of Woody Plants 3rd Edition. Elsevier - London, UK : 25 - 366. Permadi, A. H., A. Wasito, dan E. Sumiati. 1989. Morfologi dan Pertumbuhan Kentang. Balai Penelitian Hortikultura. Lembang. Peter, R. H., J. Tatuh, dan E. X. Johannes. 2012. Analisis Dampak Perubahan Iklim terhadap Produksi Beras Provinsi Sulawesi Utara Tahun 2013 - 2030. Eugenia, 18 : 3. Purwanto, dan T. Agustono. 2010. Kajian Fisiologi Tanaman Kedelai pada Cekaman Kekeringan dan Berbagai Kepadatan Gulma Teki. Agrobisnis, 12 (1) : 24 - 28. Rahardi,P., Y.H. Indriani dan Haryono. 1999. Agribisnis Tanaman Buah. Penebar Swadaya. Jakarta. Renan, S. 2014. Pengaruh Cekaman Kekeringan terhadap Respon Fisiologis Perkecambahan Benih Kacang Tanah (Arachis hypogaea L). Mediagro, 10 (2) : 32 - 44. Rhodes, D. S. Handa, dan R. A. Bressan. 1986. Metabolic change associated with adaptation of plant cell two water stress. Plant Physiology, 82 : 890 - 903. Rismunandar.1986. Bercocok Tanaman Jeruk. Sinar Baru. Bandung. 61
Ruzin, S.E. 1999. Plant Microtechnique and Microscopy. Oxford University Press. New York. 307. Sarwono. 1994. Budidaya Tanaman Jeruk. Bumi Aksara. Jakarta. Sebnem, K. 2012. Influence of Drought Stress on Growth, Ion Accumulation and Antioxidative Enzymes in Okra Genotype. International Journal Of Agriculture & Biology ISSN Print: 1560 - 8530. Septiatin, dan Eatin. 2008. Apotek Hidup dari Rempah-Rempah, Tanaman Hias, dan Tanaman Liar. CV. Yrama Widya. Bandung. Setiawan, Tohari, dan S. Dja'far. 2012. Pengaruh Cekaman Kekeringan Terhadap Akumulasi Prolin Tanaman Nilam (Pogostemon Cablin Benth.). Jurnal Ilmu Pertanian, 15 : 85 - 99. Sukarmin, dan F. Ihsan. 2008. Teknik persilangan jeruk (Citrus sp.) untuk perakitan varietas unggul baru. Buletin Teknik Pertanian, 13(1):12 - 15. Suryowinoto. 1996. Pemuliaan Tanaman Secara In vitro. Kanisius. Yogyakarta. Sutjahjo, S.H., A. W. Rustikawati, dan S.S. Gumabo. 2007. Kajian Genetik dan Seleksi Genotipe S5 Kacang Hijau (Vigna radiata) Menuju Kultivar Berdaya Hasil Tinggi Dan Serempak Panen. Agrin, 11(1):10-18. Tandisau, P. 2012. Lahan Untuk Usaha Tani Tanaman Jeruk. diakses pada tanggal 20 September 2017 Pukul 19.00 WIB. Tardieu, F. 1996. Drought Perception by Plants. Do Cells of Droughted Plants Experience Water Stress. Plant Growth Regulation, 20 : 93 - 104. Tsago, Y. A. Mebeaselassie, dan A. Takele. 2013. In Vitro Screening for Drougth Tolerance in Different Sorghum (Sorghum bicolar L.) Moench Varietie. Journal of Stress Physiology and Biochemistry, 9 : 72 - 83. Wattimena, G.A., A.M. Nurhajati, N.M.A. Purwito, D. Efendi, B.S. Purwoko, dan N. Khumaida. 2011. Biotechnology in Plant Breeding. IPB Press. Bogor. Wetter, L.R., dan F. Constabel. 1991. Metode Kultur Jaringan Tanaman (edisi Bahasa Indonesia). ITB. Bandung. Witham, Devlin dan M. Robert. 1993. Exercise in Plant Physiology. Second Edition. Prindle, Weber & Scimdt. Boston. Yoshida, S., T. Katsutomo, W. Kazuhiko, F. Morihiro, N. Chiharu. 1998. A Maize MnDR-Like Element Expressed in Rice Callus Subcultured with Proline. Journal of Plant Physiology, 129 : 95 - 99. 62
Yuwono, T. 2008. Bioteknologi Pertanian. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta. Zao, D., B. Glaz, dan J.C. Comntock. 2013. Sugarcane leaf photoshinthesis and growth characters during development of water deficit stress, Crop Science, 80:1066 - 1075. Zulkarnain. 2010. Dasar - Dasar Hortikultura. Bumi Aksana. Jakarta. 63