Vol. 4 No.2 Juni 2011 (154-161) Website: UJI AKTIVITAS ENZIM PENISLIN G ASILASE (PGA) SECARA KUALITATIF TERHADAP ISOLAT ESCHERICHIA COLI YANG BERASAL DARI AIR SUNGAI DI KOTA PADANG Ruth Rize Paas Megahati INFO ARTIKEL Abstrak Diterima: Direview: Disetujui: Kata Kunci: E.coli, penisilin asilase, uji aktivitas enzim Penicillin G acylase is catalysed hydrolisis enzym penicillin G to 6- amino penicilanad acid (6-APA). 6-APA is precursor to made semisinthetic penicillin. Semisynthetic penicillin derivated of natural penicillin that get it by change natural penicillin chemistry structure or sinthesis nuclear penicillin. Penicillin G acylase (PGA) produce of bacteria but bacteria produced number penicillin is limited so looking new bacteria penicillin produce is importen to do. Based it haved bacteria isolation in Padang town any rivers, include air batang Kandis, air batang Kurao, air batang Kuranji, air batang Arau dan air batang Aru di kota Padang. This research do in Kopertis wilayah X laboratory. Activity assay PGA used Meevootisom methode is metode easy to selection, rapid and spesifik to selection bacteria strain PGA produced. Meevootisoom metode used Serratia marsescens, is resisten to penicillin and sensitiv to 6-APA. Result of this research is every isolated from all rivers contain PGA. PENDAHULUAN A. Latar Belakang suatu substanti kimia yang dihasilkan oleh mikroorganisme yang dapat membunuh dan pertumbuhan mikroorganisme lain penyebab penyakit infeksi. Antibiotik pertama kali ditemukan oleh Fleming pada tahun 1929. Fleming menemukan adanya suatu yang dapat substanti menghambat bakteri Stapilococci yang berada di cawan agar Antibiotik merupakan menghambat antibakteri pertumbuhan yang telah dikontaminasi oleh jamur Penicillium, substanti ini selanjutnya disebut sebagai penisilin. Penggunaan secara global di dunia, dan penggunaan penisilin dengan dosis di luar kontrol atau dosis kurang tepat serta mulai timbulnya gen - gen resisten terhadap antibiotik, menyebabkan timbulnya gejala resistensi pada beberapa macam penisilin mikroorganisme alami. Contohnya, sebanyak 80% strain Staphylococcus aureus resisten terhadap penisilin terhadap ISSN: 2085-1057 E-ISSN: 2460-3740
Jurnal Pelangi penisilin dan pada beberapa macam seperti metisilin, antibiotik sefalosforin, eritromisin, streptomisin dan neomisin. Masalah resistensi ini dapat diatasi dengan cara membuat penisilin semisintetik yang merupakan turunan dari penisilin alami. lain, dapat dihasilkan dari bahan dasar asam 6- 6-APA aminopenisilanat merupakan hasil hidrolisis dari penisilin alami oleh aktivitas enzim penisilin G asilase (Kafshnochi et al., 2010). Bakteri penghasil penisilin G asilase di alam jumlahnya masih sangat terbatas, maka diperlukan pencarian strain - strain baru E.coli dari air sungai di Padang (Sumatera barat). Penisilin semisintetik (6-APA). B. Rumusan Masalah belakang Berdasarkan rumusan masalah, penelitian maka uji hasil adalah Bagaimanakah aktivitas enzim Penisilin G Asilase (PGA) secara kualitatif terhadap isolat Escherichia coli yang berasal dari air sungai di kota Padang. latar C. Tujuan Penelitian Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengisolasi bakteri E.coli penghasil enzim penisilin G asilase dari air sungai di kota Padang. D. Manfaat Penelitian Manfaat dari penelitian ini adalah : 1. Untuk mengatasi masalah resistensi terhadap penisilin 2. Pemanfaatan sumber daya alam setempat (air sungai kota Padang) TINJAUAN PUSTAKA A. Escherichia coli Escherichia coli adalah salah satu bakteri gram negatif yang dapat menghasilkan enzim penisilin G asilase. 155 E.coli bisa ditemukan pada dua habitat yang berbeda, yaitu habitat primer (host) dan (lingkungan sekunder eksternal). Habitat primer E.coli adalah pada usus vertebrata, sedangkan habitat sekunder E.coli adalah air, tanah. dan fases hewan vertebrata. Perbedaan habitat primer dan habitat sekunder, antara lain pada habitat primer suhu lingkungan konstan, anaerob, nutrient bervariasi, berkompetisi sedangkan pada habitat sekunder suhu bervariasi, bervariasi, aerob, kompetisi rendah. E.coli yang hidup di habitat primer mampu beradaptasi terhadap jika dibandingan dengan E.coli yang hidup pada habitat sekunder, sehingga populasi E.coli pada habitat primer dan habitat sekunder berbeda secara genetik (Gordon,D.M et al 2002). habitat nutrient tidak lingkungannya B. Penisilin Penisilin struktur dasar yang terdiri inti penisilin yaitu asam 6-aminopenisilanat (6-APA) dan rantai samping. Inti penisilin merupakan hasil kondensasi cincin thiazolidin dan cincin β-laktam (Gambar 1). mempunyai Gambar 1. Struktur kimia penisilin a. cincin β-laktam b. cincin thiazolidin R. rantai samping (Arroliga dan Pien, 2003) Variasi struktur rantai samping akan membedakan jenis penisilin satu dengan akan mempengaruhi spektrum antibakterinya. yang lainnya dan
156 C. Penisilin asilase Penisilin asilase adalah enzim yang mengkatalis proses hidrolisis penisilin G atau penisilin V menjadi 6- APA) dan asam organik. Asam organik yang dihasilkan akan beda - beda tergantung dari jenis penisilin yang dihidrolisis. Bila penisilin G yang dihidrolisis maka akan dihasilkan asam fenilasetat tetapi bila yang dihidrolisis penisilin V maka akan dihasilkan asam fenoksi metil asetat (Rajendhran et al., 2004) Penisilin asilase dapat mengkatalis reaksi bolak - balik dalam menghidrolisis penisilin G, sehingga bila ada campuran asam fenilasetat dan asam 6-APA serta penisilin asilase maka akan terjadi reaksi pembentukan penisilin G (Chandel.A.K et al.,2007). (PAA), Penisilin G asilase yang dihasilkan oleh E.coli ATCC 11105 terdiri dari subunit α dan subunit β yang terdapat pada ruang periplasmik (Flores.G et al., 2004). Peptida sinyal berperan dalam proses transfer prekursor enzim ke ruang periplasmik, subunit α berperan untuk menentukan substrat, endopeptida berperan dalam proses pelipatan prekursor enzim menjadi enzim penisilin asilase yang dewasa, dan subunit β berperan dalam menentukan aktivitas katalitik enzim (Lindsay & Pain 1990 ; Lindsay & Pain 1991). spesifitas D. Metode Meevootisom Metode Meevootisom merupakan metode seleksi yang mudah, cepat, dan spesifik untuk menseleksi strain bakteri yang dapat menghasilkan enzim PGA baik secara intraseluler Metode atau secara ekstraseluler. bakteri Meevootisom menggunakan Serratia marcescens yang berwarna merah dan resisten terhadap penisilin Ruth Rize Paas Megahati dan Adanya 6-APA di medium sebagai hasil hidrolisis penisilin G oleh bakteri yang mempunyai aktivitas PGA di dalam menghambat medium marcescens. pertumbuhan Terhambatnya aktivitas S.marcescens akan menghasilkan zona bening di yang mempunyai sekitar bakteri (Meevootisom & PGA aktivitas Saunders, 1987) sensitive terhadap 6-APA. akan S. METODE PENELITIAN A. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini telah dilakukan pada Bulan Juli s/d September tahun 2011 di Laboratorium Kopertis wilayah X. B. Alat dan Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian lain, aquades, penisilin G, alkohol 70%, medium NA, medium LB, medium Endo Agar, bakteri E.coli strain lokal dan bakteri Serratia marsescens. ini antara Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain, botol sampel, tabung reaksi, tabung durham, cawan petri, jarum ose, kapas, aluminum foil, autoklav, tangan, inkubator, shaker, vorteks, botol larutan, tissu, spatula, mikropipet, hot plate, timbangan gelas ukur, beaker glass, analitik, lemari pendingin dan laminair flow. bunsen, sarung C. Metode penelitian Jenis penelitian ini adalah survey deskriptif, sampel diambil dari air sungai di kota Padang. Pengambilan sampel dilakukan dengan menggungakan metode Simple Random Sampling.
Jurnal Pelangi D. Persiapan penelitian 1. Pembuatan medium a. Medium Natrium Agar (NA) b. Pembuatan Medium Endo c. Pembentukan Medium Laktosa Broth 2. Pembuatan kertas cakram 3. Sterilisasi alat menggunakan autoklav 4. Penyediaan Serratia marsescens bakteri 5. Penyediaan penisislin G E. Prosedur penelitian 1. Pengambilan sampel di lapangan 2. Kerja di laboratorium koloni bakteri E.coli dari air, dilakukan uji coliform, adapun langkah-langkah dalam melakukan uji coliform sebagai berikut: a. Uji dugaan b. Uji penguat Untuk mendapatkan 3. Uji aktivitas enzim secara kualitatif (Metode Meevootisom) a. Pengenceran Serratia marsescens. b. Pengenceran bakteri E.coli c. Pembuatan larutan penisilin G d. Pembuatan media tanam e. Peletakkan kertas cakram f. F. Teknik Analisis Data Data yang diperoleh dari penelitian ini berupa data kualitatif dan tidak diolah secara statistik. Data penelitian ini merupakan hasil pengamatan yang dilakukan pada medium dengan melihat ada tidaknya zona bening yang terbentuk di sekitar kertas cakram yang diletakkan di atas medium NA. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil Hasil penelitian yang telah dilakukan tentang isolasi dan uji aktivitas enzim penisilin G asilase secara kualitatif dari bakteri Escherichia coli pada air sungai kota Padang, dapat 157 dilihat pada Tabel 1, 2 dan Gambar 2 di bawah ini: Tabel 1. Hasil isolasi E.coli dari air sungai kota Padang Dari Tabel 1 di atas dapat dilihat bahwa isolasi E. coli yang telah dilakukan pada air batang Kuranji, air batang Kurao, air batang Kandis, air batang Arau dan air batang Aru di kota Padang menunjukkan hasil positif yang berarti bahwa pada kelima air sungai tersebut berhasil didapatkan isolat murni E. coli. Tabel 2. Hasil uji aktivitas enzim penisilin G asilase secara kualitatif pada E.coli yang diisolasi dari air sungai kota Padang. Hasil Uji Aktivitas Enzim Penisilin G Asilase dari Bakteri E. coli pada beberapa Air Sungai Kota Padang
158 A. Sumber isolat Air Batang Kandis dan Air Batang Kurao B. Sumber Isolat Air Batang Arau dan Air batang kuranji Ruth Rize Paas Megahati C. Sumber Isolat Air batang Aru Gambar 2 . Isolat - isolat yang menghasilkan penisilin G asilase Dari Tabel 2 dan Gambar 2 di atas dapat dilihat bahwa uji aktivitas enzim penisilin G asilase yang telah dilakukan pada setiap isolat E. coli menunjukkan hasil positif yang berarti bahwa E. coli menghasilkan enzim penisilin G asilase. B. Pembahasan 1. Isolasi E. coli Isolasi E.coli yang telah dilakukan pada air batang Kuranji, air batang Kurao, air batang Kandis, air batang Arau dan air batang Aru di kota Padang menunjukkan hasil positif yang berarti bahwa pada kelima air sungai tersebut berhasil ditemukan isolat murni E. coli. Ditemukannya isolat murni E. coli pada sampel air setelah melalui beberapa tahapan isolasi, mulai dari sampai sampel proses pengenceran penanaman pada medium sampel selektif. sungai Pada dasarnya ditemukannya E. coli pada air merupakan indikator air tersebut telah terkontaminasi oleh tinja manusia atau tinja hewan berdarah panas. Berdasarkan pengamatan penulis pada kelima sampel sungai tersebut banyak sekali terdapat aktivitas manusia.
Jurnal Pelangi Aktivitas manusia di sekitar badan sungai dapat menyebabkan terjadinya pencemaran dan anorganik sehingga memicu terjadinya pencemaran mikroorganisme pada sungai. Terdapatnya bakteri E. coli pada air sungai merupakan dampak dari pencemaran yang ditimbulkan oleh aktivitas manusia di pinggiran sungai tersebut. bahan organik bahan organik Penentuan ada tidaknya E.coli yang berhasil diisolasi dari sampel air sungai dapat dilihat dari warna koloni bakteri yang ditimbulkan pada medium endo agar. Endo agar merupakan medium selektif yang digunakan dalam penelitian ini untuk penanaman sampel. Penanaman sampel pada endo agar setelah melalui beberapa tahapan isolasi. Tahap pertama dimulai dari pengenceran sampel yang bertujuan mengurangi komposisi mikroba yang terkandung di dalam sampel air sungai. Selanjutnya dilakukan uji coliform yang melalui beberapa langkah, uji coliform dilakukan dengan tujuan untuk menseleksi bakteri coliform yang mana salah satunya adalah E. coli. Sampel yang positif coliform kemudian ditanam pada medium endo agar. Endo agar merupakan medium yang selektif terhadap bakteri gram positif tetapi sangat baik untuk pertumbuhan bakteri gram negatif. Masing-masing koloni bakteri dapat dikenali dari warna yang ditimbulkan pada medium endo akan menghasilkan warna merah atau logam Proteus, mengkilap, Salmonella, shigella, menghasilkan warna pink pudar dan Pseudomonas tidak menghasilkan warna (Anonimus, 2011). agar, seperti E.coli sedangkan Dari hasil penelitian yang telah dilakukan terlihat koloni yang tumbuh pada medium endo agar bewarna merah kilap logam. Penyebaran warna merah kilap logam hampir menutupi seluruh 159 permukaan medium endo agar. Warna koloni terlihat lebih jelas setelah diinkubasi selama 24 jam pada suhu 370C. Menurut Dunling dan Fiessel (2007), karakteristik pertumbuhan E. coli pada berbagai macam pertumbuhan, didapatkan koloni E.coli dengan warna yang berbeda-beda. Pada media CCA E.coli menghasilkan warna ungu terang, pada medium DCA E.coli menghasilkan warna ungu terang dengan pink dan pada medium endo agar didapatkan koloni E. coli dengan warna merah logam mengkilap. berdasarkan medium Penelitian yang dilakukan oleh Stoppe (2007), ia berhasil mengisolasi 49 strain E. coli dari sampel air minum di Brasil yang ditempatkan ke dalam phylogenetic groups A (15 strains), B1 (19 strains), B2 (2 strains) and D (13 strains). Dia menganalisis setiap sampel dengan menggunakan medium endo agar. Pada endo agar, koloni E. coli akan menimbulkan warna yang khas yaitu warna merah gelap dengan kilau metalik. Selanjutnya dia menyimpan isolat E coli yang menunjukkan warna yang khas (merah kilau metalik) di dalam larutan gliserol 25%. 2. Uji aktivitas enzim Uji aktivitas enzim penisilin G asilase yang dilakukan pada bakteri E. coli yang diisolasi dari air batang Kuranji, Kurao, Kandis, Arau dan air batang Aru positif menghasilkan enzim penisilin G asilase. Hal ini ditunjukkan dengan terbentuknya zona bening di sekitar kertas cakram pada medium. Zona bening terbentuk karena bakteri Serratia Marsescens sensitiv terhadap sehingga pertumbuhan dan 6-APA, terhambat. aktivitasnya Terhambatnya dan Serratia marsescens pertumbuhan ditandai dengan terbentuknya zona bening. akan aktivitas
160 Hal ini didukung oleh pernyataan Meevootisom (1987), yang sensitif Serratia marsescens terhadap resisisten tetapi 6-APA terhadap penisilin G digunakan sebagai pertumbuhan indikator. Kegagalan Serratia marsescens yang ditandai bening dengan bakteri, disekeliling tersebut menunjukkan bahwa koloni menghasilkan yang enzim menghidrolisis penisilin G menjadi 6- APA. adanya zona koloni PGA Produksi enzim penisilin G asilase pada E.coli sangat berkaitan dengan habitat dan faktor lingkungan. Habitat yang berbeda akan menyebabkan perbedaan E. coli secara genetic drift. Fenotip suatu organisme dihasilkan dari genotip dan pengaruh lingkungan organisme tersebut. Variasi fenotip suatu organisme disebabkan oleh perbedaan struktur gen atau urutan DNA. Penelitian yang dilakukan Arsyad (2006), E. coli yang diisolasi dari air, tanah, fases manusia dan beberapa fases hewan menghasilkan kuantitas enzim penisilin G asilase yang berbeda. vertebrata Penisilin G asilase adalah enzim yang terdapat di ruang periplasmik yang terdiri dari subunit α dan subunit β. Kedua subunit dihasilkan oleh suatu prekursor tunggal yang dibawa ke ruang periplasmik kemudian akan mengalami proses pemotongan proteolitik untuk menjadi enzim yang aktif. Peptida sinyal berperan dalam proses transfer prekursor enzim ke ruang periplasmik, subunit α berperan untuk menentukan spesifitas substrat, endopeptida berperan dalam enzim proses pelipatan menjadi enzim penisilin asilase yang dewasa, dan subunit β berperan dalam menentukan aktivitas katalik enzim (Lindsay dan Pain, 1991). prekursor Penisilin G asilase dikode oleh gen PGA yang terdapat di dalam genom E. Ruth Rize Paas Megahati coli dengan panjang 2,4 kb. Perbedaan habitat akan menyebabkan perbedaan struktur sehingga menyebabkan perbedaan dalam kualitas dan kuantitas PGA yang dihasilkan. Perubahan struktur gen PGA akan menyebabkan penu kerangka baca (roading frame) dari gen PGA. Perubahan a roading menyebabkan perubahan pada sintesa protein atau PGA (Dale, 1995). gen PGA frame KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan ini dapat disimpulkan bahwa setiap isolat bakteri Escherichia coli yang diisolasi dari air batang Kuranji, air batang Kandis, air batang Kurao, air batang Arau dan air batang Aru terbukti menghasilkan asilase karena enzim penisilin G terlihatnya zona bening di sekitar kertas cakram pada medium. Dari hasil penelitian B. Saran Dari hasil penelitian ini belum dapat ditentukan berapa jumlah enzim penislin G asilase yang dihasilkan oleh setiap isolat E. Coli. Oleh karena itu diperlukan penelitian lebih lanjut untuk melakukan uji aktivitas enzim penisilin G asilase secara kuantitatif dari bakteri E.coli pada air sungai kota Padang. DAFTAR PUSTAKA Arroliga M.E, Pien.L.P 2003. Penicillin allergy : Consider trying penicillin again. Cleveland Clinic Journal of Medicine. 70 : 313- 321 Chandel A.K, L. Venkateswar Rao, M. Lakshmi Narasu, Om V. Singh. The realm of penicillin G acylase in lactam antibiotics. Enzyme and Microbial Technology.2008. 42 : 199-207.
Jurnal Pelangi J. Production of a fully functional, permuted single- chain penicillin G acylase. Protein Sci 2004.13:1677- 83. Gordon.D.M., Flores G, Soberon X, Osuna Bauer.S.,dan Johnsons.R. 2002. The genetic structure of Escherichia coli populations in primary and secondary habitats. Microbiology 148: 1513-1522. Lindsay,C.D., dan Pain,R.H. 1990. The folding and solution conformation of penicillin G acylase. J. Biochem 192 : 133 - 144 --------.1991. refolding and assembly of penicillin acylase, an enzyme composed of two polypeptide chains that result from proteolitic activation. J. Biochem 30 : 9034 - 9040 Kafshnochi.M, Farajnia.S, Aboshof.R, Babaei.H and Aminolroayaee.M. 2010. Cloning of Penicillin G acylase in Escherichia coli BL21. African Journal of Biotechnology Vol. 9(18) : 2697- 2701. and over-expression Mevootisoom. P, V, 1983. Prachaktam.R, Flegel.T Simpel screening methods for isolation of penicillin acylase producing bacteria. Appl environ microbial 46 : 1227-1229 Somsuk. Rajendhran J, Gunasekaran P. Recent biotechnological interventions for developing improved penicillin G J Biosci Bioeng acylases. 2004;97:1-13 Bock,A. Sizmann,D., structure 1990. requirement for the maturation in vivo of penicillin acylase from E.coli ATCC 11105. J. Biochem 192 : 143 - 151. Kelmann,C., Primary 161