PENYEDIAKAN BENIH TEBU KLONAL MENGGUNAKAN TEKNIK KULTUR IN VITRO MENUNJANG PENCAPAIAN TARGET SWASEMBADA GULA Ragapadmi Purnamaningsih Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian Jl. Tentara Pelajar 3A, Bogor 16111, Indonesia PENDAHULUAN T ebu (Saccharum officinarum L.) merupakan tanaman penting yang bernilai ekonomi tinggi di berbagai negara, terutama di negara berkembang yang beriklim tropis seperti Indonesia. Tanaman tebu tergolong tanaman perdu dengan nama latin Saccharum officinarum. Tanaman tebu tumbuh di daerah tropika dan sub tropika sampai batas garis isoterm 20°C yaitu antara 19°LU-35°LS. Kondisi tanah yang baik bagi tanaman tebu adalah yang tidak terlalu kering dan tidak terlalu basah, selain itu akar tanaman tebu sangat sensitif terhadap kekurangan udara dalam tanah, sehingga pengairan dan drainase harus sangat diperhatikan. Tanaman tebu dapat tumbuh baik pada berbagai jenis tanah seperti tanah alluvial, grumosol, latosol dan regusol dengan ke- tinggian antara 0-1400 m di atas permukaan laut. Akan tetapi lahan yang paling sesuai adalah kurang dari 500 m di atas permukaan laut, sedangkan pada ketinggian 1200 m di atas permukaan laut Penyediakan Benih Tebu Klonal Menggunakan Teknik Kultur In Vitro ...... | 189
pertumbuhan tanaman relatif lambat. Batang tebu dimanfaatkan terutama sebagai bahan dasar utama dalam industri gula dan bahan baku industri lainnya seperti farmasi, kimia, pakan ternak, pupuk, jamur, dan lain-lain. Pengembangan industri gula saat ini tidak hanya berperan penting dalam pertumbuhan perekonomi- an negara, tetapi juga berkaitan langsung dengan pemenuhan kebutuhan masyarakat (Indrawanto et al. 2010). Tebu dapat diperbanyak secara vegetatif dan generatif. Per- banyakan tebu secara komersial dilakukan secara vegetatif me- lalui setek. Di beberapa negara tropis, 2-3 bagian buku (nodus) batang tebu digunakan sebagai bahan tanaman baru (Jalaja et al. 2008), dengan cara menanam dua atau tiga mata tunas (budset). Satu tunas akan menghasilkan empat hingga lima tunas dalam satu tahun (Khan et al. 2009 dalam Getnet 2017), sehingga 1 ha benih tebu hanya cukup untuk menanam 10 ha lahan komersial dalam 7-10 bulan (Biradar et al. 2009 dalam Getnet 2017). Pengembangan varietas yang baru dirilis akan membutuhkan benih dalam jumlah yang banyak, dengan metode perbanyakan benih secara konvensional diperlukan waktu 10 tahun untuk untuk mempro- duksi benih dalam jumlah yang cukup (Sughra et al. 2014 dalam Getnet 2017), bahkan apabila laju perbanyakan tanaman rendah diperlukan 10-12 tahun untuk pengembangan varietas baru (Lal et al. 2014). Metode perbanyakan tebu secara konvensional memiliki kekurangan antara lain waktu perbanyakan benih lama, membu- tuhkan tanaman induk dan tenaga yang banyak (Sukmadjaja & Mulyana 2011), meningkatnya serangan penyakit dan hama se- lama beberapa siklus produksi di lapangan (Getnet, 2017), dan ketergantungan musim tanam. Selain itu juga dapat terjadi degenerasi klonal yang dapat merugikan (Ekasugiyarta 2014). Pertumbuhan penduduk Indonesia yang sangat cepat menye- babkan kebutuhan gula konsumsi yang semakin meningkat pula, kondisi ini menyebabkan produksi gula Indonesia tidak dapat memenuhi kebutuhan konsumsi gula nasional. Defisit ini terus 190 | Pemanfaatan SDG dan Bioteknologi untuk Mendukung Pertanian Berkelanjutan
meningkat dan hanya bisa dipenuhi melalui impor gula. Dengan harga gula dunia yang tinggi dan defisit yang terus meningkat, mengakibatkan terjadinya pengurasan devisa negara. Pemerintah telah menetapkan swasembada gula konsumsi pada tahun 2019 dengan target produksi gula sebanyak 2,84 juta ton dan swasem- bada gula industri pada tahun 2029 sebanyak 2,86 juta ton (Kementan 2015). Salah satu upaya peningkatan produksi gula nasional adalah melalui pengembangan areal penanaman tebu, untuk itu dukungan pemenuhan bibit bermutu dalam jumlah besar sangat diperlukan (Minarsih et al. 2013). Perkembangbiakan tebu secara konvensional menghadapi kendala tingkat propagasi rendah, tenaga kerja mahal, waktu lama, serta dapat terjadi penularan patogen melalui benih tebu dari generasi ke generasi, oleh karena itu permintaan benih yang besar akan sulit dipenuhi dengan metode propagasi konven- sional. Faktor lain yang menyebabkan lambatnya pengembangan varietas baru adalah adanya tingkat penjenjangan pada produksi benih sebelum dapat digunakan sebagai tebu giling. Aplikasi bidang bioteknologi tanaman melalui teknik kultur jaringan merupakan metode yang potensial dalam untuk meng- atasi permasalahan produksi benih tanaman, termasuk tebu (Getnet 2017; Jalaja et al. 2008; Lal et al. 2014). Teknik kultur jaringan dapat digunakan pada perbanyakan tanaman tebu dalam menghasilkan benih dalam jumlah besar dengan waktu yang relatif singkat, pertumbuhan seragam, bebas patogen, dan produksi benih yang tidak tergantung musim (Jalaja et al. 2008, Tiwari et al. 2011). Teknik kultur jaringan terbukti merupakan metode yang lebih effien dalam produksi benih berbagai tanam- an dibanding dengan metode konvensional, benih yang dihasil- kan juga beba dari patogen sehingga kematian benih juga dapat diminimalkan (Lal et al. 2014). Penyediakan Benih Tebu Klonal Menggunakan Teknik Kultur In Vitro ...... | 191
TIPE KEMASAKAN TEBU Umur panen tebu daat dikelompokkan berdasarkan tipe ke- masakannya. Kategori kemasakan tebu terkait dengan lama tanaman tebu yang telah berumur fisiologi dewasa (lebih dari 9 bulan) mengalami kondisi lengas tanah rendah (kurang dari 50% kapasitas lapang) dan menunjukkan tingkat kecepatan masak- nya. Terdapat tebu (Indrawanto et al. 2010), yaitu: 1. Varietas Genjah (masak awal), mencapai masak optimal +8-10 tiga tipe kemaskan pada tanaman bulan. 2. Varietas Sedang (masak tengahan), mencapai masak optimal pada umur +10-12 bulan. 3. Varietas Dalam (masak lambat), mencapai masak optimal pada umur lebih dari 12 bulan. Produktivitas suatu pertanaman tebu merupakan sinergi dari kemampuan suatu varietas dan pengelolaan lingkungan tum- buhnya. Penggunaan varietas yang sesuai disertai pengelolaan lingkungan tumbuh yang tepat akan menghasilkan produktivitas tanaman yang tinggi. PENJENJANGAN BERTINGKAT PADA PRODUKSI BENIH TEBU Suatu varietas baru harus melalui beberapa tingkat penjen- jangan sebelum dapat digunakan untuk tebu giling. Tebu bibit dibudi dayakan melalui beberapa tingkat kebun bibit yaitu berturut-turut dari kebun bibit pokok (KBP), kebun bibit nenek (KBN), kebun bibit induk (KBI), dan kebun bibit datar (KBD), se- belum dapat digunakan sebagai sumber bibit bagi pertanaman atau Kebun Tebu Giling (KTG). Proses seleksi bertingkat dilaku- kan dari satu tingkat kebun bibit ketingkat berikutnya, sehingga diperoleh benih yang mempunyai kualitas baik dan dalam 192 | Pemanfaatan SDG dan Bioteknologi untuk Mendukung Pertanian Berkelanjutan
jumlah yang banyak (Indrawanto et al. 2010). Proses penjenjangan bibit yang panjang serta terbatasnya jumlah benih yang dihasil- kan merupakan salah satu kendala yang dihadapi dalam peng- adaan benih tebu. Pembibitan tebu secara konvensional diperkira- kan tidak akan cukup untuk memenuhi jumlah kebutuhan bibit tebu yang diperlukan (Sukmadjaja et al. 2014). Secara umum, tidak tersedianya kualitas yang baik untuk ba- han tanam varietas yang baru dirilis merupakan kendala utama dalam pengembangan varietas tersebut untuk penggunaan komersial, karena perbanyakan benih secara konvensional akan menghadapi kendala penyebaran penyakit yang terbawa oleh benih. Oleh karena itu, program pengembangan dan peningkatan produktivitas tanaman tebu, termasuk penyediaan bibit dalam skala besar, cepat, murah, dan bebas penyakit menjadi hal yang sangat perlu dilakukan (Sukmadjaja & Mulyana 2011; Lal et al. 2014). PERBANYAKAN TEBU MENGGUNAKAN METODE KULTUR IN VITRO Teknik kultur jaringan tanaman memberikan metode alter- natif untuk perbanyakan tebu. Perbanyakan benih tebu melalui kultur in vitro merupakan pilihan yang tepat untuk memproduksi benih secara cepat dan bebas penyakit, terutama untuk varietas tebu baru yang akan dikembangkan secara massal (Lal et al. 2014; Jalaja et al. 2008; Tiwari et al. 2011). Kultur jaringan terbukti dapat meningkatkan perbanyakan tunas secara cepat, yang disebut dengan laju multiplikasi. Kaur & Sandhu (2015) menunjukkan laju multiplikasi kultivar CoPb91 adalah 4 kali setiap 14 hari, sedangkan laju multipliaski kultivar CoJ 83 adalah 25 kali lipat/14 hari. Kelebihan benih tebu hasil kultur jaringan adalah mempu- nyai anakan, pertumbuhan yang baik, serta produktivitas yang Penyediakan Benih Tebu Klonal Menggunakan Teknik Kultur In Vitro ...... | 193
lebih baik dibandingkan benih tebu hasil perbanyakan konven- sional (Hamza et al. 2017). Teknik kultur jaringan dimulai dengan mengisolasi bagian- bagian tanaman (sel, jaringan, organ) yang disebut eksplan, ke- mudian menumbuhkannya secara aseptis pada suatu media tumbuh sehingga bagian-bagian tanaman tersebut dapat mem- perbanyak diri. Perkembangbiakan atau regenerasi dalam kultur in vitro dapat dilakukan melalui jalur organogenesis dan embrio- genesis somatik, baik secara langsung maupun tidak langsung malalui tahap kalus (Jalaja et al. 2008, Kaur & Sandhu 2015). Organogenesis merupakan proses pembentukan dan perkem- bangan tunas dari jaringan meristem. Organogenesis langsung dapat diinisiasi dari tunas pucuk, meristem apikal, atau tunas adventif yang diinisiasi dari berbagai organ, antara lain daun, batang, akar, sedangkan organogenesis tidak langsung adalah pembentukan tunas adventif secara tidak langsung melalui fase kalus. Embriogenesis somatik merupakan suatu proses di mana sel somatik (baik haploid maupun diploid) berkembang mem- bentuk tumbuhan baru melalui tahap perkembangan embrio yang spesifik tanpa melalui fusi gamet (Purnamaningsih 2002). Embrio somatik mempunyai struktur bipolar, yaitu mempunyai calon meristem akar dan meristem tunas. Secara spesifik tahap perkembangan tersebut dimulai dari fase globular, fase hati, fase torpedo, dan planlet. Berbagai metode yang dilakukan mempu- nyai tingkat kesamaan genetik yang berbeda-beda tergantung metode yang digunakan. Analisis ISSR menunjukkan bahwa tunas yang diregenerasi dari ujung tunas (Bhatia et al. 2009); nodus (Joshi & Dhawan 2007) dan tunas adventif (Liu et al. 2011; Yin et al. 2013) mempunyai kesamaan genetik 100% dengan induknya. 194 | Pemanfaatan SDG dan Bioteknologi untuk Mendukung Pertanian Berkelanjutan
KULTUR TUNAS PUCUK Tunas pucuk diisolasi dari pucuk batang tebu. Kultur tebu dengan menggunakan tunas pucuk mempunyai kelebihan yaitu benih yang dihasilkan serupa dengan induknya, keragaman genetik lebih rendah sehingga akan menjamin kualitas benih. Induksi tunas dan multiplikasi tebu dari tunas umumnya meng- gunakan BA 1-2 mg/l (Aamir et al. 2012), atau dikombinasikan dengan GA3 (Zamir et al. 2012). KULTUR MERISTEM APIKAL Meristem merupakan kumpulan sel-sel yang aktif membelah pada tempat tertentu pada tanaman dan berukuran sangat kecil. Sel-sel pada meristem dapat membelah dengan cepat dan akhir- nya akan membentuk organ-organ tanaman. Meristem apikal disebut juga sebagai meristem ujung karena keberadaan jaringan meristem yang letak pada bagian ujung akar, ujung batang utama dan ujung batang lateral. Meristem apikal memiliki empat fungsi, yaitu inisiasi pembentukan organ dan jaringan baru, komunikasi sinyal ke seluruh bagian tanaman, dan mempertahankan diri sebagai daerah formatif (Jalaja et al. 2008). Penggunaan kultur meristem sebagai bahan tanaman didasari hasil penelitian yang menunjukkan bahwa bagian meristem ta- naman tidak terinvasi oleh virus. Bibit bermutu harus memenuhi beberapa persyaratan, antara lain bersifat sama dengan induknya (true-to-type), seragam, tegar, dan bebas penyakit. Melalui kultur meristem atau apeks, kriteria tersebut dapat terpenuhi. Mikropropagasi tebu melalui metode kultur meristem atau apeks merupakan cara yang paling banyak diaplikasikan karena selain lebih menjamin stabilitas genetik dari tanaman yang di- hasilkan (true-to-type), jumlah bibit yang dihasilkan pun lebih Penyediakan Benih Tebu Klonal Menggunakan Teknik Kultur In Vitro ...... | 195
banyak, serta tanaman akan bebas penyakit, terutama virus (Sukmadjaja et al. 2014). Menurut Tiwari et al. (2011), virus dapat dieliminasi dari tanaman dengan menggunakan beberapa metode, antara lain termoterapi dan kultur apeks atau meristem, atau kombinasi keduanya. Perbanyakan benih secara massal menggunakan kultur me- ristem mempumyai tingkat kesulitan regenerasi eksplan yang lebih besar dibandingkan dengan menggunakan tunas pucuk se- bagai eksplan. Hasil penelitian Cheong et al. (2012) menunjuk- kan bahwa regenerasi apikal meristem dengan menggunakan tunas pucuk dan meristem apikal msing-masing 61-92% dan 77-100%. Hasil yang diperoleh juga menunjukkan bahwa ta- naman yang berasal dari meristem apikal bebas dari virus dengan keberhasilan 90-100%. Ali et al. (2008) berhasil mere- generasikan meristem tunas apikal tebu varietas CO77,400 dan BL-4 pada media dasar MS yang ditambahkan kombinasi BAP, kinetin, dan GA3, serta dilanjutkan dengan pembentukan planlet- nya pada media MS yang mengandung NAA dan IBA. Sumber: Djufry et al. (2017) Gambar 2.7. Tunas in vitro berasal dari kultur meristem apikal 196 | Pemanfaatan SDG dan Bioteknologi untuk Mendukung Pertanian Berkelanjutan
KULTUR KALUS Kalus adalah suatu kumpulan sel yang belum terdiferensiasi yang terjadi dari sel-sel jaringan yang membelah diri secara terus menerus. Sel-sel penyusun kalus berupa sel parenkim yang mem- punyai ikatan yang renggang dengan sel-sel lain. Kalus biasanya terbentuk pada eksplan ditempat irisan. Pembelahan sel-sel pada kalus dipacu oleh hormon endogen dan eksogen yang ditambah- kan pada media kultur. Beberapa kalus ada yang mengalami pembentukan lignifikasi sehingga kalus tersebut mempunyai tekstur yang keras dan kompak. Namun ada kalus yang tumbuh terpisah-pisah menjadi fragmen-fragmen yang kecil, kalus yang demikian dikenal dengan kalus remah (friable) (George & Sherrington 1984). Penambahan zat pengatur tumbuh untuk menginduksi pem- bentukan kalus dapat terdiri dari satu atau beberapa jenis, ter- gantung kepada jenis tanaman dan eksplan yang digunakan. Zat pengatur tumbuh dari golongan auksin berupa 2,4-D merupakan jenis auksin yang paling banyak digunakan untuk menginduksi kalus pada tanaman famili Gramineae (Lee et al. 2011) termasuk tanaman tebu. Senyawa 2.4-D berperan dalam memacu hiper- methilasi pada DNA, sehingga pembelahan sel selalu dalam fase mitosis, dengan demikian maka pembentukan kalus menjadi optimal (Meneses et al. 2005). Kemampuan pembentukan kalus dari jaringan tergantung dari beberapa faktor, yaitu: (1) umur fisiologi dari jaringan waktu diisolasi; (2) musim pada waktu bahan tanaman diisolasi; (3) bagian tanaman yang dipakai; dan (4) genotipe tanaman. Kalus dapat diinisiasi dari hampir semua bagian tanaman, tetapi organ yang berbeda menunjukkan kecepatan pembelahan sel yang berbeda pula. Daun muda diketahui merupakan eksplan yang lebih baik untuk inisiasi kalus karena mampu menghasilkan kalus morfogenik pada setiap level (Laksmanan et al. 2005). Abu Penyediakan Benih Tebu Klonal Menggunakan Teknik Kultur In Vitro ...... | 197
et al. (2014) menggunakan media dasar MS dan 2,4-D 2-3 mg/l untuk induksi kalus dari eksplan daun, dan MS + BA 1-2 mg/l untuk regenerasi kalus membentuk tunas. Hasil penelitian Khan & Khatri (2006) menunjukkan bahwa penggunaan 2,4-D 4 mg/l dapat menginduksi pembentukan kalus embriogenik dari daun muda. Hasil yang berbeda diperoleh dari penelitian Raza et al. (2012) bahwa penggunaan 2,4-D dan kinetin pada konsentrasi rendah mendukung perkembangan kalus embriogenik, sedangkan regenerasi kalus diperoleh mengguna- kan BA 0,2 mg/l. EMBRIOGENESIS SOMATIK Embriogenesis somatik merupakan suatu proses di mana sel somatik (baik haploid maupun diploid) berkembang membentuk tumbuhan baru melalui tahap perkembangan embrio yang spesifik tanpa melalui fusi gamet. Embrio somatik dapat diciri- kan dari strukturnya yang bipolar, yaitu mempunyai dua calon meristem, yaitu meristem akar dan meristem tunas. Dengan me- miliki struktur tersebut maka perbanyakan melalui embrio somatik lebih menguntungkan daripada pembentukan tunas adventif yang unipolar (Purnamaningsih 2002). Tahap perkembangan embrio somatik pada tanaman mono- kotil dimulai dari pembentukan globular, skutelar, dan koleopti- lar. Mekanisme penting selama proses embriogenesis somatik yaitu pembelahan sel secara asimetris dan elongasi sel. Auksin sintetis yang umumnya digunakan untuk menginduksi embrio- genesis somatik dari berbagai tanaman adalah 2,4-D. Embrioge- nesis somatik telah dilaporkan dari sejumlah besar klon tebu komersial dan dapat diperoleh secara langsung atau tidak langsung dari jaringan daun (Wekesa et al. 2014; Raza et al. 2012). Ho & Vasil (1983) berhasil meregenerasikan eksplan daun muda tebu melalui metode embriogenesis somatik. Formulasi media 198 | Pemanfaatan SDG dan Bioteknologi untuk Mendukung Pertanian Berkelanjutan
yang digunakan untuk induksi kalus embriogenik adalah media MS dengan penambahan 2,4-D 0.5-3 mg/l dan air kelapa 5%, se- dangkan pengurangan 2,-D menjadi 0.25-0.5 mg/l dapat meng- induksi pembentukan struktur embrioid. Khan & Khatri (2006) berhasil menginduksi pembentukan struktur embrioid tebu yang diinduksi dari daun muda dengan menggunakan media mengan- dung 2,4-D pada konsentrasi rendah, yaitu 0.5 mg/l, sedangkan regenerasinya membentuk planlet diperoleh dengan mengguna- kan media MS mengandung sukrosa 2%, kinetin, IAA, IBA masing-masing pada konsentrasi mg/l. Penguasaan metode embriogenesis pada tanaman tebu sangat diperlukan untuk merakit varietas tebu baru menggunakan rekayasa genetik (Lakshmanan 2006).mbryogenic Perbanyakan benih tebu melalui teknik kultur in vitro telah banyak dilaporkan oleh peneliti. Umumnya, hasil penelitian ter- sebut menyatakan bahwa keberhasilan regenerasi tanaman tebu tergantung pada genotipe tanaman, sumber eksplan yang di- gunakan, dan formulasi media untuk meregenerasikannya (Ali et al. 2008; Abu et al. 2014). Komposisi media dasar dan zat peng- atur tumbuh, baik sitokinin maupun auksin, merupakan kompo- nen yang paling banyak dipelajari dalam regenerasi tanaman tebu, selain itu bentuk fisik media dalam kultur in vitro (media dengan atau tanpa penambahan agar) merupakan faktor yang mempengaruhi regenerasi tanaman tebu. Media cair (media tanpa penambahan agar) seringkali lebih efektif digunakan untuk multiplikasi tunas tebu (Gambar 2.8 dan 2.9). Penggandaan tunas tebu menggunakan media cair dengan sistem RITA (Récipient à Immersion Temporaire Automatique) telah dilakukan oleh Snyman et al. (2011). Hasil penelitian me- nunjukkan bahwa penggunaan metode tersebut dapat meng- hasilkan 18.000 tunas/potongan daun. Hasil penelitian Djufry et al. (2017) menunjukkan bahwa empat varietas tebu yang diper- banyak dengan menggunakan eksplan daun muda, menghendaki Penyediakan Benih Tebu Klonal Menggunakan Teknik Kultur In Vitro ...... | 199
formulasi media yang berbeda-beda. Umumnya media ½ MS cair dengan penambahan BA 0.5 mg/l, IBA 0.1 mg/l ,PVP 100 mg/l dan sukrosa 2% merupakan media terbaik. Induksi kalus pada tanaman tebu umumnya menggunakan 2,4-D, picloram atau kom- binasi keduanya pada konsentrasi 1-3 mg/l tergantung kepada genotipe yang digunakan. Berbagai hasil penelitian untuk per- banyakan benih tebu melalui kultur jaringan disajikan pada Tabel 2.2. Sumber: Djufry et al. (2017) Gambar 2.8. Multiplikasi tunas tebu menggunakan media cair Sumber: Djufry et al. (2017) Gambar 2.9. Multiplikasi tunas tebu menggunakan media padat 200 | Pemanfaatan SDG dan Bioteknologi untuk Mendukung Pertanian Berkelanjutan
Tabel 2.2. Formulasi media yang digunakan pada berbagai tahapan perkembangan kultur in vitro tebu Tahapan kegiatan Formulasi media (mg/l) Publikasi Induksi kalus MS + 2,4-D 3 MS + 2,4-D 2-3 MS + 2,4-D 2,5 MS + 2,4-D 3 MS + 2,4-D 2,5 Suhesti et al. (2015) Abu et al. (2014) Behera & Sahoo (2009) Ali et al. (2008) Dinesh et al. (2015) Abu et al. (2014) Behera & Sahoo (2009) Ali et al. (2008); Biradar et al. (2009) Pertumbuhan tunas MS + BA 1-2 MS + BA 2 + NAA 0.5 MS + BA 1 MS + BA 0.25 + kinetin 0.25 Ali et al. (2008) MS + BA 2 + IBA 0.5 MS + NAA 3 MS + NAA 2 ½ MS + NAA 2,5 ½ MS + NAA 4 MS + IBA 1 Dinesh et al. (2015) Behera & Sahoo (2009) Ali et al. (2008); Biradar et al. (2009) Dinesh et al. (2015) Abu et al. (2014) Abu et al. (2014) Perakaran PERSIAPAN BAHAN TANAMAN Persiapan bahan tanaman yang akan digunakan dalam kultur in vitro merupakan tahap yang menentukan diperolehnya tunas in vitro yang steril dan sehat. Bahan tanaman yang dapat digunakan untuk perbanyakan tebu melalui kultur in vitro dapat berupa daun muda, tunas pucuk atau meristem apikal. Bahan tanaman yang sehat dipotong dari tanaman induk, kemudian di- cuci dengan menggunakan deterjen. Selanjutnya bahan tanaman disterilisasi menggunakan alkohol dan pemutih. Bahan tanaman yang sudah steril ditanam pada media kultur (Hamza et al. 2017). STERILISASI BAHAN TANAMAN Sterilisasi adalah suatu proses untuk mematikan mikroor- ganisme yang menempel pada bahan tanaman (eksplan), alat serta bahan yang digunakan dalam penanaman eksplan sehingga Penyediakan Benih Tebu Klonal Menggunakan Teknik Kultur In Vitro ...... | 201
jika ditumbuhkan di dalam suatu medium tidak ada mikro- organisme yang dapat berkembang biak. Teknik aseptik merupa- kan salah satu kunci keberhasilan dalam kutur jaringan. Pada tahap ini dilakukan berbagai perlakuan untuk membersihkan kotoran yang ada di permukaan bahan tanaman (disinfestasi). Pemberian bahan anti bakterial dan fungisidal (Agrept dan Dithane M-45), juga dapat dilakukan untuk memberikan tingkat sterilisasi yang baik bagi eksplan yang akan dikulturkan. Per- lakuan sterilisasi dapat berbeda untuk setiap jenis dan umur eksplan. Eksplan yang lebih tua menggunakan konsentrasi larut- an zat sterilisasinya lebih tinggi dibandingkan dengan eksplan yang lebih muda. Sterilisasi tebu dilakukan dengan cara mencuci eksplan meng- gunakan air mengalir, setelah itu eksplan direndam dalam detergen dan dibilas dengan air. Larutan dithane M 45 atau fungisida dan agrept (bakterisida) serta alkohol dan bayclin pemutih) digunakan untuk mematikan mikroorganisme yang menempel pada eksplan. Tingkat kontaminasi eksplan, tergan- tung dari: (1) jenis tanaman; (2) bagian tanaman yang dipergu- nakan; (3) morfologi permukaan (berbulu atau tidak); (4) ling- kungan tumbuhnya (rumah kaca atau lapangan); (5) musim waktu mengambil (musim hujan atau kemarau); (6) umur tanam- an (bibit atau tanaman dewasa); dan (7) kondisi tanaman induk (sehat atau sakit). Beberapa jenis bahan disienfektan yang dapat digunakan untuk sterilisasi bahan tanaman. INDUKSI KALUS ATAU INDUKSI TUNAS Pada tahap ini digunakan media dasar yang ditambahkan zat pengatur tumbuh auksin atau sitokinin. Media dasar yang di- gunakan untuk tanaman tebu umumnya adalah Murashige- Skoog (MS). Auksin diperlukan untuk menginduksi pembentuk- an kalus pada eksplan, sedangkan sitokinin diperlukan untuk 202 | Pemanfaatan SDG dan Bioteknologi untuk Mendukung Pertanian Berkelanjutan
menginduksi pembentukan tunas. Keseimbangan konsentrasi auksin dan sitokinin akan menginduksi pembentukan kalus (George & Sherrington 1984). MULTIPLIKASI Tujuan dari tahapan ini adalah untuk meningkatkan kece- patan pertumbuhan eksplan, baik berupa kalus, tunas, meristem, atau embriosomatik agar diperoleh jumlah yang diinginkan. For- mulasi media yang digunakan adalah formulasi media yang sesuai untuk tahap perkembangan eksplan. SUB KULTUR Subkultur merupakan proses pindah tanam eksplan ke media baru untuk mendapatkan benih yang banyak dalam periode waktu tertentu. Waktu untuk melakukan sub kultur tergantung pada eksplan yang diregenerasikan, selain itu media yang di- gunakan untuk subkultur tergantung kondisi eksplan Jumlah sub kultur yang diperlukan untuk masing-masing gentotipe tebu berbeda-beda. Pertambahan tunas genotipe PS 862 mencapai tingkat maksimal pada subkultur keenam dan menu- run pada subkultur ke sembilan. PSJK 922 menghasilkan pertam- bahan tunas per eksplan yang relatif tetap pada ke tiga taraf subkultur. Dalam kultur jaringan tebu, genotipe yang digunakan mempengaruhi regenerasi dan multiplikasi in vitro (Sukmadjaja et al. 2014; Abu et al. 2014). tunas INDUKSI PERAKARAN Pembentukan planlet tebu sebagai tahap akhir perbanyakan secara in vitro diperoleh setelah tunas hasil multiplikasi ditanam pada media untuk induksi perakaran. Zat pengatur tumbuh Penyediakan Benih Tebu Klonal Menggunakan Teknik Kultur In Vitro ...... | 203
perlu ditambahkan pada media tumbuh untuk menginduksi pembentukan dan pertumbuhan akar. Penggunaan media MS (1, ½) yang ditambahkan auksin (NAA atau IBA) pada konsentrasi rendah (0,1-1 mg/l), dapat menghasilkan planlet dengan perakar- an yang baik dan normal. Penggunaan jenis dan konsentrasi auksin dapat berpengaruh nyata terhadap jumlah biakan yang berakar (Tabel 2.2). AKLIMATISASI Aklimatisasi adalah tahap proses adaptasi planlet dari ling- kungan laboratorium yang terjaga kelembabannya untuk di- tumbuhkan ke kondisi lingkungan yang terbuka. Aklimatisasi planlet biasanya dilakukan di rumah kaca. Pemilihan tempat aklimatisasi yang tepat dapat meningkatkan keberhasilan aklima- tisasi planlet tebu hasil kultur in vitro. Faktor fisik berupa tingkat kelembaban dan ketersediaan air yang terjaga dalam wadah seperti polybag sangat mempengaruhi pertumbuhan planlet dapat meningkatkan keberhasilan aklimatisasi. Keuntungan lain peng- gunaan polybag adalah memudahkan pada saat pemindahan benih ke lapangan karena tidak merusak perakaran sehingga benih tidak mengalami stagnasi akibat kerusakan pada akar. KESIMPULAN Penyediaan benih tebu secara in vitro lebih efektif dalam mendukung kebutuhan benih tebu dibanding perbanyakan secara konvensional. Perbanyakan tebu secara in vitro dapat di- lakukan melalui pembentukan tunas aksilar menggunakan tunas pucuk atau meristem apikal, pembentukan tunas adventif secara langsung dan atau tidak langsung, serta embriogenesis somatik. Berbagai metode tersebut mempunyai kelebihan dan kekurangan masing-masing tergantung kepada tujuan yang ingin dicapai. 204 | Pemanfaatan SDG dan Bioteknologi untuk Mendukung Pertanian Berkelanjutan
Beberapa faktor yang mempengaruhi keberhasilan perbanyakan tebu melalui kultur jaringan adalah umur fisiologi eksplan, jenis eksplan, genotipe tanaman, fisik media, dan formulasi media yang digunakan. DAFTAR PUSTAKA Abu G, Mekbib F, Teklewold A. 2014. Effect of genotype on in vitro propagation of elite sugarcane (Saccharum officinarum L.) varieties of Ethiopian sugar estates. Int J Technol Enhanc Emerg Eng Res. 2:123-128. Ali A, Shagufta N, Siddiqui FA, Iqbal J. 2008. Rapid clonal multiplication of sugarcane (Saccharum officinarum) through callogenesis and organogenesis. Pak J Bot. 40:123-138. Azizi AAA, Roostika I, Efendi D. 2017. Multiplikasi tunas in vitro tebu 23:90-97. DOI: berdasarkan (Saccharum littri. jenis eksplan pada enam genotipe officinarum L.). J Littri. Behera KK, Sahoo S. 2009. Rapid in vitro micropropagation of sugarcane (Saccharum officinarum L. cv.Nayana) through callus culture. Nat Sci. 7:1-10. Bhatia R, Singh KP, Jhang T, Sharma TR. 2009. Assessment of clonal fidelity of micropropagated gerbera plants by ISSR markers. Sci Hortic. 119:208-211. Biradar S, Biradar DP, Patil VC, Patil S, Kambar N. 2009. In vitro plant regeneration using shoot tip culture in commercial cultivar of sugarcane. Karnataka J Agric Sci. 22:21-24. jto Dinesh P, Thirunavukkarasu P, Saraniya AR, Ramanathan T. 2015. In vitro studies of sugarcane variety co-91017 through micropopagation of shoot tip culture. Adv Plants Agric Res. : 263-268. Penyediakan Benih Tebu Klonal Menggunakan Teknik Kultur In Vitro ...... | 205
Djufry FR, Purnamaningsih, Mariska I, Sukmadjaja D, Rahayu S. 2017. Teknologi produksi benih galur-galur somaklon tebu. Laporan Akhir KP4S. Pusat Penelitian dan Pengembangan Perkebunan. Ekasugiyarta. 2014. Konsep penataan varietas pada sistem budi daya tanaman tebu. George EF, Sherington PD. (1984). Plant Propagation by Tissue of Commercial Culture. Handbook Laboratories. Edington (UK): Exegetics Ltd. 274 pp. and Directory Getnet B. 2017. Review on in vitro propagation of sugarcane to advance the value of tissue culture. Agric Res Technol: Open Access Journal. 5:1-5. Hamza TA, AL. Alebjo. 2017. Sugarcane (Saccharum officinarum L) Tissue Culture In Ethiopia: Opportunities For Ethiopia's Sugar Industries. Int J Sci Technol Res. 8:2277-8616. Ho JW, Vasil IK. 1983. Somatic embryogenesis in sugarcane (Saccharum officinarum L.) I. Morphology and physiology of callus formation and the ontogeny of somatic embryos. Protoplasma. 118:169-180. Indrawanto C, Purwono, Siswanto, Rumini W. 2010. Budi daya dan pasca panen tebu. Bogor (Indonesia): ESKA Media. Pusat Penelitian dan Pengembangan Perkebunan. Jalaja NC, Neelamathi D, 2008. Micropropagation for quality seed production in sugarcane in Asia and the Pacific. Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome; Asia-Pacific Consortium on Agricultural Biotechnology, New Delhi; AsiaPacific Association of Agricultural Research Institutions, Bangkok, p. i-x + 46. Sreenivasan TV. 206 | Pemanfaatan SDG dan Bioteknologi untuk Mendukung Pertanian Berkelanjutan
Joshi P, Dhawan V. 2007. Assessment of genetic fidelity of micropropagated Swertia chirayita plantlets by ISSR marker assay. Biol Plant. 51:22-26. Kaur A, Sandhu in vitro micropropagation of sugarcane (Saccharum officinarum L.) from spindle leaf roll segments: Cost analysis for agribusiness industry. Plant Cell Tiss Organ Culture. 120:339-350. JS. 2015. High throughput Kementan 2015. Peningkatan Produksi, Produktivitas dan Mutu Tanaman Semusim: Pedoman Teknis Pelaksanaan Pengem- bangan Tanaman Tebu. Jakarta (Indonesia): Kementerian Pertanian. 65 hlm. Khan A, Khatri A. 2006. Plant regeneration via organogenesis or somatic embryogenesis in sugarcane: histological studies. Pak J Bot. 38:631-636. Lakshmanan P, Geijskes RJ, Aitken KS, Grof CPL, GD.Bonnett, Smith GR. 2005.Sugarcane biotechnology: The challenges and opportunities. In Vitro Cell Dev Biol Plant. 41:345-363. Lal M, Tiwari AK, Gupta GN, Kavita. 2014. Commercial scale micropropagation of sugarcane: constraints and remedies. Sugar Tech. Springer. DOI 10.1007/s12355-014-0345-y. Liu F, Huang LL, Li YL, Reinhoud P, Jongsma MA, Wang CY. 2011. Shoot organogenesis in leaf explants of Hydrangea macrophylla 'Hyd1' and assessing genetic stability of regenerants using ISSR markers. Plant Cell Tiss Organ Cult. 104:111-117. Meneses A, Flores D, Munoz M, Arrieta G, Espinosa AM. 2005. Effect of 2.4-D, hydric stress and light on indica rice (Oryza sativa) somatic embryogenesis. Rev Biol Trop Int J. 53:361-368. Minarsih, Riyadi H, Sumaryono 013. Mikropropagasi tebu (Saccharum officinarum.L) menggunakan sistem perendaman sesaat. Menara Perkebun. 81:1-8. I, Budiani A. Penyediakan Benih Tebu Klonal Menggunakan Teknik Kultur In Vitro ...... | 207
Purnamaningsih R. 2002. Regenerasi tanaman melalui embrio- genesis somatik dan beberapa gen yang mengendalikannya. Bul AgroBio. 5:51-58. Raza S, Qamarunisa S, Hussain M, Jamil I, Anjum S, Azhar A, Qureshi JA. 2012. Regeneration in sugarcane via somatic embryogenesis and genomic instability in regenerated plants. J Crop Sci Biotech. 15:131-136. Snyman SJ, Nkwanyana PD, MP. Watt. 2011. Alleviation of hyperhydricity of sugarcane plantlets produced in RITA® vessels and genotypic and phenotypic characterization of acclimated plants. South Afr J Bot. 77:685-692. Suhesti S, Khumaida N, Wattimena GA, Syukur M, Husni A, Hadipoetyanti E, Hartati RRS. 2015. Induksi kalus dan regenerasi dua varietas tebu (Saccharum officinarum L.) secara in vitro. J Littri. 21:77-88. Sukmadjaja D, Ade M. 2011. Regenerasi dan pertumbuhan beberapa varietas tebu (Saccharum officinarum L.) secara in vitro. J AgroBiogen. 7:106-118. Sukmadjaja D, Supriati Y, Pardal SJ. 2014. Kultur apeks untuk penyediaan bibit unggul tebu varietas PS864 dan PS881'. AgroBiogen. 10:45-52. Tiwari AK, Tripathi S, Lal M, Sharma ML, Chiemsombat P. 2011. Elimination of sugarcane grassy shoot disease through apical meristem culture. Arch Phytopathol Plant Prot. 44:1942-1948. Wekesa R, Onguso JM, Nyende BA, Wamocho LS. 2015. Sugarcane in vitro culture technology: Opportunities for Kenya's sugar industry. Afr J Biotechnol. 14:3170-3178. Yin ZF, Zhao B, Bi WL, Chen L, Wang QC. 2013. Direct shoot leaf segments of Lilium and regeneration assessment of genetic stability in regenerants by ISSR and AFLP markers. In Vitro Cell Dev Biol Plant. 49:333-342. from basal 208 | Pemanfaatan SDG dan Bioteknologi untuk Mendukung Pertanian Berkelanjutan