Menara Perkebunan 2018 86(2), 116-125 p-ISSN: 0125-9318/ e-ISSN: 1858-3768 DOI: Accreditation Number: 21/E/KPT/2018 Isolasi dan karakterisasi gen dehydrin dari tebu (Saccharum officinarumL.) yang terlibat dalam respon toleransi cekaman kekeringan Isolation and characterization of dehydrin gene from sugarcane (Saccharum officinarum L.) involved in drought tolerance response Hayati MINARSIH1)*), Sony SUHANDONO2), FANIAR2), Tati KRISTIANTI2), Dian M AMANAH1) & SUSTIPRIJATNO3) 1)Pusat Penelitian Bioteknologi dan Bioindustri Indonesia, Jl. Taman Kencana No 1, Bogor 16128, Indonesia 2)Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati, Institut Teknologi Bandung, Jalan Ganeca No. 10 Bandung 40132, Indonesia 3)Balai Besar Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian, Jl. Tentara Pelajar No. 3A, Bogor 16111, Indonesia Diterima tanggal 14 Maret 2018/Disetujui tanggal 4 Oktober 2018 Abstract the development of molecular biology techniques has enabled to engineer drought tolerant sugarcane to accelerate the breeding program. Dehydrin (DHN) that belong to the group II late embryogenesis abundant (LEA) family is known to have an important role in plant response and adaptation to abiotic stresses (drought, high salinity, cold, heat, etc.). Literature study and bioinformatics analysis reported that DHN1 gene on sugarcane showed high homology sequences with sorghum DHN. The expression of DHN1 gene on sugarcane var. PSJT 941 treated with various period of drought stress had been conducted using semi-quantitative reverse transcriptase (RT)-PCR method. The results showed that the expression level of DHN1 gene increased along with the increased period of the treatment. The highest expression level of DHN1 gene was resulted from plants that had been subjected to drought for 25 days. Amplification of DHN1 gene from plants with the highest gene expression, resulted an amplicon with a size of 465 bp which represents a full length coding sequence (CDS) of DHN1. Identification using Blast analysis showed that DHN1 sequences from sugarcane var. PSJT 941 shared high homology with DHN gene on sugarcane and sorghum. The alignment results also revealed a conserved motif that characterized DHN genes. Nowadays, teknik rekayasa genetika untuk mempercepat program pemuliaan tanaman. Protein dehydrin (DHN) yang termasuk ke dalam kelompok II famili LEA (Late Embryogenesis Abundant) diketahui berperan penting dalam respon dan adaptasi tanaman terhadap cekaman abiotik (kekeringan, salinitas tinggi, suhu dingin, panas, dll). Studi literatur dan analisis bioinformatika menunjukkan bahwa gen DHN1 pada tanaman tebu memiliki homologi yang tinggi dengan gen DHN pada sorghum. Analisis ekspresi gen DHN1 pada tanaman tebu varietas PSJT 941 yang diberi cekaman kekeringan telah dilakukan menggunakan semi-kuantitatif reverse transcriptase (RT)-PCR dan terlihat bahwa ekspresi gen DHN1 meningkat secara nyata sejalan dengan semakin lamanya waktu pemberian cekaman. Tingkat ekspresi gen DHN1 paling tanaman yang mengalami cekaman kekeringan selama 25 hari. Amplifikasi gen DHN1 pada tanaman dengan tingkat ekspresi yang paling tinggi menunjukkan pita dengan ukuran 465 bp yang merepresentasikan full coding sequence (CDS) gen DHN1. Identifikasi menggunakan analisis Blast menunjukkan bahwa sekuen gen DHN1 dari tanaman tebu varietas PSJT 941 yang diperoleh memiliki homologi yang tinggi dengan gen DHN pada tanaman tebu dan sorghum. Hasil penjajaran sekuen protein juga menunjukkan adanya motif lestari yang mencirikan gen DHN. tinggi diperoleh dari [Kata kunci: cekaman kekeringan, dehydrin, gen [Key words: drought stress, dehydrin, DHN1 gene, DHN1, tebu] sugarcane] Pendahuluan Abstrak biologi molekuler saat ini, maka perakitan tanaman tebu yang toleran kekeringan lebih diarahkan melalui Dengan berkembangnya teknik Tebu (Saccharum officinarum L.) merupakan salah satu komoditas perkebunan utama di Indonesia, penghasil gula yang menjadi salah satu kebutuhan pangan dasar. Peningkatan produk- 116 ) Penulis korespondensi:
Isolasi dan karakterisasi gen dehydrin dari tebu (Saccharum... ... (Minarsih et al.) tivitas tebu saat ini dilakukan, salah satunya dengan ekstensifikasi ke lahan-lahan marjinal. Lahan marjinal didefinisikan sebagai lahan yang memiliki potensi ekonomi yang rendah bahkan sangat rendah untuk dimanfaatkan sebagai lahan pertanian. Lahan marjinal dapat dicirikan dengan lahan atau tanah yang miskin unsur hara, ketersediaan air yang sedikit, curah hujan terbatas, adanya kandungan logam berat dan atau salinitas tinggi (Kang et al., 2013). Untuk itu diperlukan varietas atau klon-klon tanaman yang mampu beradaptasi terhadap kondisi tersebut seperti terhadap tahan atau kekeringan, salinitas tinggi ataupun kandungan logam berat. toleran umumnya berada di sitoplasma dan berperan melindungi protein serta struktur membran dari degradasi dan pengaruh proteinase, memelihara status air dalam sel, serta berperan dalam proses protein folding pada sintesis protein (Ingram & Bartels, 1996;). Kondisi lingkungan yang tidak sesuai sering mengakibatkan timbulnya cekaman oksidatif dan terbentuknya reactive oxygen species (ROS) pada tanaman. Protein LEA dapat mereduksi hal tersebut dengan mengikat senyawa ROS. Selain itu, dilaporkan juga bahwa protein LEA berperan dalam ketahanan terhadap logam berat seperti Cadmium (Cd) dan nikel (Cu) (Gao et al., 2012; Reis et al, 2012). Menurut Andrade et al. (2014), kekeringan merupakan salah satu faktor pembatas utama yang sangat berpengaruh terhadap produktivitas tebu. Program pemuliaan tebu di hampir setiap negara saat ini diarahkan untuk menghasilkan varietas tebu yang toleran terhadap kondisi kekeringan. Salah satu cara dalam program pemuliaan adalah melalui rekayasa genetik yang terbukti manfaatnya dalam (Lakshmanan & tanaman memperbaiki Robinson, 2014). Dengan demikian studi gen yang berperan penting dalam meningkatkan toleransi tanaman terhadap cekaman kekeringan, perlu dilakukan. sifat Pada kondisi cekaman osmotik, tanaman dapat menunjukkan respon yang berbeda yang dimulai dengan pengenalan reseptor pada membran plasma, diikuti dengan penyebaran sinyal dari satu sel ke sel lainnya di seluruh bagian tanaman (Mahajan & Tuteja, 2005). Hal tersebut memicu ekspresi gen- gen yang berperan dalam cekaman osmotik dan dapat mempengaruhi metabolisme dan perkem- bangan tanaman (Osakabe et al., 2014). Secara molekuler, terhadap cekaman tanaman kekeringan atau cekaman osmotik bervariasi di antaranya senyawa adalah mengakumulasi osmoprotektan dan protein yang berasosiasi dengan toleransi kekeringan (Osakabe et al., 2014; Ferreira et al., 2017). Saat ini, sejumlah gen tanaman yang diketahui terinduksi oleh cekaman osmotik telah diidentifikasi dan dikarakterisasi. Fungsi gen-gen tersebut telah diuji dengan analisis ekspresi dan dengan manipulasi gen melalui tanaman transgenik untuk mempelajari perananannya dalam mekanisme toleransi terhadap cekaman (Ferreira et al., 2017). respon Famili gen yang mengkode protein dan berperan dalam respon terhadap cekaman osmotik meliputi gen-gen yang berperan dalam biosintesis poliamin, asam amino, gula dan poliols, protein chaperone dan regulator transkripsi (Ferreira et al., 2017). Protein chaperone seperti Hsp (heat shock protein), dehydrin dan kelompok LEA (late embryogenesis abundant) lainnya diketahui sangat terinduksi oleh adanya cekaman kekeringan (Ingram & Bartels, ini 1996; Hanin et al., 2011). Jenis protein Berdasarkan beberapa penelitian yang telah dilakukan terhadap respon kekeringan, gen dehydrin (DHN) teridentifikasi sebagai salah satu gen penting yang berhubungan dengan cekaman kekeringan dan terkait dalam pemeliharaan turgor sel (Andrade et al., 2014). Menurut Harb et al (2010), mekanisme toleransi tumbuhan terhadap kekeringan ditandai dengan kemampuan tumbuhan untuk mempertahan- kan turgor sel dan mengurangi penguapan air melalui akumulasi zat terlarut yang kompatibel. Dehydrin (DHN) termasuk dalam kelompok II protein LEA yang berperan penting dalam respon dan adaptasi tanaman terhadap cekaman abiotik (kekeringan, salinitas tinggi, suhu dingin, panas, dan lain-lain) (Gao & Lan, 2015). Pada saat jaringan tanaman mengalami cekaman kekeringan (dehidrasi), protein DHN dapat terakumulasi dalam jumlah yang tinggi diseluruh jaringan baik vegetatif maupun generatif (Hanin et al., 2011). Gen DHN telah banyak diteliti di beberapa tanaman seperti pada Arabidopsis thaliana, kedelai, gandum, sorghum dan anggur (Brini et al., 2007; Hanin et al., 2011, Savitri et al., 2013; Yang et al., 2012). Akan tetapi penelitian gen DHN pada level molekuler pada tanaman tebu belum banyak dilaporkan. Penelitian sebelumnya menunjukkan adanya peningkatan ekspresi gen DHN yang sangat tinggi pada jaringan batang tebu yang diberi cekaman kekeringan selama 15 hari (Iskandar et al., 2011). Hal ternyata eskpresi gen DHN di bawah cekaman kekeringan jauh lebih tinggi dibandingkan dengan beberapa gen yang terinduksi oleh stres (stress-inducible) lainnya seperti gen-gen yang berperan dalam biosintesis prolin. Overekspresi gen DHN pada A. thaliana dan tembakau transgenik telah terbukti meningkatkan toleransi terhadap cekaman osmotik dan salinitas tinggi (Hanin et al., 2011). Beberapa famili gen DHN ternyata juga berperan dalam meningkatkan toleransi terhadap cekaman biotik seperti DHN-5 yang mempengaruhi proses asam jasmonat (JA) dan dapat mengaktivasi protein PR (pathogenesis related) (Hanin et al., 2011). Tujuan tersebut menarik karena signaling 117
Menara Perkebunan 2018 86(2), 116-125 penelitian ini adalah untuk melakukan isolasi dan karakterisasi gen DHN1 dari tanaman tebu varietas PSJT 941 yang sangat berpotensi untuk dapat digunakan baik sebagai penanda molekuler maupun untuk perbaikan tanaman tebu toleran cekaman kekeringan. Bahan dan Metode Bahan tanam di Laboratorium Biokimia dan Biologi Molekuler, Pusat Penelitian Bioteknologi dan Bioindustri Indonesia Jl. Taman Kencana No. 1 Bogor dan di Laboratorium Genetika Molekuler SITH-ITB Bandung. Bahan yang digunakan untuk isolasi gen DHN1 adalah daun tebu varietas PSJT 941 hasil kultur jaringan berumur + 7 bulan yang merupakan varietas bina Pusat Penelitian Perkebunan Gula Indonesia (P3GI), Pasuruan. Penelitian dilaksanakan Perlakuan cekaman kekeringan Tanaman tebu diseleksi terlebih dahulu dengan kriteria tidak berbuku, tinggi seragam dan tunggal (tidak memiliki anakan). Selanjutnya, tanaman tebu terpilih ditanam dalam polybag berukuran 2 kg dengan media tanam berisi tanah, pasir, dan pupuk kandang dengan perbandingan 3:1:1 (v/v/v). Selama satu minggu, tanaman tebu diadaptasikan dalam rumah kaca dengan penyiraman setiap hari. Perlakuan cekaman kekeringan dilakukan dengan memberhentikan penyiraman selama 0, 4, 8, 12, 16, 20 dan 25 hari. Sementara itu untuk perlakuan kontrol, penyiraman dilakukan dengan interval dua hari. Pada hari ke- 0, 4, 8, 12, 16, 20 dan 25 sampel daun untuk dilakukan pengambilan pengukuran persentase relative water content (RWC). Perlakuan diulang sebanyak tiga kali, masing-masing ulangan terdiri dari tiga tanaman tebu. Perhitungan RWC dilakukan dengan mengacu pada metode (Barrs & Wheatherley, 1962). Sebanyak ±0,05 gram sampel daun segar (FM) tanpa tulang, direndam dalam cawan petri yang berisi air selama empat jam, kemudian ditimbang berat turgid daun (TM). Selanjutnya, daun dikeringkan dalam oven pada suhu 60°C selama tiga sampai lima hari dan ditimbang berat keringnya (DM). Persentase RWC dihitung dengan rumus sebagai berikut: relative turgidity % RWC = x 100 Data yang diperoleh dirata-ratakan untuk diolah dengan analisis keragaman (analysis of variance = ANOVA) menggunakan program DASTAAT. Apabila terdapat perbedaan faktor perlakuan yang nyata, maka perbedaan antar perlakuan diuji dengan uji jarak berganda Duncan's Multiple Range Test (DMRT) dengan tingkat kepercayaan α ≤ 0,05. Isolasi RNA total Isolasi RNA total dilakukan menggunakan Total RNA Isolation Kit (plant) (Geneaid, Taiwan). Sampel daun tebu dari perlakuan cekaman kekeringan digerus hingga halus. Sebanyak 200 mg sampel yang telah dihaluskan dimasukkan ke dalam microtube 1,5 mL ditambahkan buffer ekstraksi (RB buffer) dan β-merkaptoetanol sebanyak 5 µL, kemudian dipindahkan ke dalam filtration column dan disentrifuse dengan kecepatan 3000g selama lima menit. dihasilkan dipindahkan ke dalam binding column dan ditambahkan larutan binding buffer. Setelah disentrifuse dengan kecepatan 12000g selama satu menit, supernatan dibuang kemudian ditambahkan wash buffer (mengandung etanol) sebanyak 500 µL dan disentrifuse 12000g selama satu menit. Supernatan dibuang dan pellet RNA disentrifugasi kembali dengan kecepatan 12000g selama tiga menit. RNA total pada binding column kemudian dielusi dengan de-ion DEPC atau RNAse-free water. RNA diukur telah konsentrasinya menggunakan spektrofotometer. Supernatan yang total yang dihasilkan, Hasil isolasi RNA total dimurnikan dimurnikan dari kontaminan DNA dengan menambahkan DNAse. Sebanyak 1000 ng RNA total ditambahkan ke dalam larutan yang mengandung 10X buffer DNAse, 1 unit DNAse dan air bebas ion dan nuclease (de-ion nuclease free water) hingga volume total mencapai 10 µL. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit, kemudian ditambahkan EDTA sebanyak 1 µL dan diinkubasi kembali pada suhu 60oC selama 10 menit. Kuantitas RNA ditetapkan secara spektrofotometri pada panjang gelombang ditetapkan 260 berdasarkan rasio A260/280 dan rasio A260/230 serta dengan elektroforesis pada gel agarose. (λ) sedangkan nm, kualitasnya Studi bioinformatika dan seleksi pasangan primer untuk isolasi full length CDS DHN1 Studi bioinformatika dilakukan dalam proses pembuatan primer spesifik gen DHN1 dari tebu dan analisis hasil sekuensing. Disain primer dilakukan Primer3 program menggunakan gen reference adalah gen DHN dari Saccharum sp atau dari tanaman lain yang sekerabat dengan tebu misalnya sorgum yang didapatkan dari Genbank NCBI Analisis hasil sekuensing dilakukan dengan analisis BLAST dan dilakukan penjajaran dengan software Bioedit v7.0.5 dan ClustalW. dengan 118
Isolasi dan karakterisasi gen dehydrin dari tebu (Saccharum... ... (Minarsih et al.) fragmen CDS cDNA DHN1 dilakukan dengan RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) menggunakan RNA total yang diisolasi dari daun tebu yang mendapat berbagai perlakuan cekaman kekeringan sebagai tunggal dari cDNA disintesis cetakan. Utas menggunakan Superscript First Strand cDNA Synthesis kit (Invitrogen, USA) yang selanjutnya digunakan sebagai cetakan untuk mengamplifikasi gen DHN1 menggunakan primer yang spesifik untuk gen tersebut. Amplifikasi gen DHN1 dilakukan dengan menambahkan 1µl DNA template dengan konsentrasi 100 ng ke dalam reaksi PCR yang mengandung 10 µM primer, 12,5 µL buffer Kapa 2G fast Ready mix PCR kit (KapaBiosystems) dan H2O sampai total volume 25 µL. Kondisi RT- PCR dioptimasi meliputi suhu annealing, jumlah siklus dan konsentrasi ion Mg2+. Produk PCR agarose menggunakan dimurnikan dari gel QIAquick Gel Extraction kit (Qiagen). Amplifikasi Kloning dan sekuensing fragmen cDNA DHN1 hasil amplifikasi diligasi ke dalam vektor kloning pGEM-T Easy (Promega, USA) dan diklon ke dalam sel E. coli strain DH5α kompeten. Seleksi transforman dilakukan pada media Luria Bertani (LB) yang mengandung 50 mg/L kanamisin dan 40 mg/L X- Gal. Sel transforman yang ditandai dengan warna koloni putih dibuktikan dengan analisis PCR menggunakan primer spesifik untuk gen DHN1. Plasmid rekombinan terbukti membawa gen DHN1 selanjutnya diisolasi menggunakan QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN, Germany) kit diikuti dengan pemotongan menggunakan enzim restriksi EcoRI. Fragmen DNA kemudian diverifikasi pada gel agarose, dimurnikan dan selanjutnya disekuens. Fragmen cDNA DHN1 Hasil dan pembahasan Pengaruh pemberian cekaman kekeringan pada eksplan tebu Pemberian perlakuan cekaman kekeringan pada tanaman tebu varietas PSJT 941 di rumah kaca dilakukan untuk melihat pengaruh lama waktu cekaman terhadap eskpresi gen DHN pada tanaman tebu. Parameter yang digunakan untuk melihat apakah tanaman sudah dalam kondisi stress atau tercekam adalah status RWC nya. Hasil pengukuran RWC dari tebu yang diberi cekaman kekeringan selama 4, 8, 12, 16, 20 dan 25 hari serta kontrolnya ditampilkan pada Tabel 1 dan Gambar 1. Sementara itu penampilan tanaman yang mengalami cekaman kekeringan selama 4, 8, 12, 16, 20 dan 25 hari serta kontrolnya dapat dilihat pada Gambar 2. (RWC) merupakan parameter penting dalam menentukan resistensi kekeringan pada tanaman (Barrs, 1968). Rampino et al., (2006) juga menyebutkan bahwa nilai RWC digunakan untuk menilai status air daun sehingga dapat digunakan untuk mengetahui respon tanaman terhadap cekaman kekeringan yang diberikan. Dari Tabel 1 dapat dilihat bahwa nilai RWC pada tanaman yang mengalami cekaman kekeringan selama 4, 8, 12 dan 16 hari tidak berbeda nyata dibandingkan dengan kontrol perlakuan. Sementara itu nilai RWC pada tanaman yang mengalami kekeringan selama 20 dan 25 hari menunjukkan perbedaan yang nyata dibandingkan dengan kontrol lainnya perlakuan dan perlakukan kekeringan dengan nilai RWC sebesar 0,58 dan 0,34. Nilai RWC sebesar 0,58 dan 0,34 menunjukkan bahwa tanaman sudah dalam kondisi tercekam (stress) air. Relative water content Tabel 1. Pengaruh cekaman kekeringan terhadap perubahan Relative Water Content pada tanaman tebu varietas PSJT 941 Table 1. The effect of drought stress exposure on changes in Relative Water Content on sugarcane var. PSJT 941 Perlakuan/ Treatment Nilai rata-rata Relative Water Content (RWC)/ Average value of Relative Water Content (RWC) t0 t4 t8 t12 t16 t20 t25 0,92a 0,90a 0,89a 0,84a 0,78a 0,58b 0,34c Keterangan: Nilai rata-rata yang ditandai dengan huruf kecil yang sama pada kolom yang sama, dinyatakan tidak berbeda nyata menurut uji jarak berganda Duncan taraf 5%. t0 = hari ke-0; t4= hari ke-4;t8= hari ke-8;t12= hari ke-12;t16= hari ke- 16;t20= hari ke-20;t25= hari ke-25 Notes: Means in the same column followed by the same letters are not significantly different according to Duncan's multiple range test at P= 0.05. t0 = day-0; t4= day-4;t8= day-8;t12= day-12;t16= day-16;t20= day-20;t25= day-25 119
Menara Perkebunan 2018 86(2), 116-125 Gambar 1. Pengaruh cekaman kekeringan terhadap persentase perubahan Relative water content pada tanaman tebu varietas PSJT 941 selama perlakuan kekeringan dibandingkan dengan kontrol (tanpa perlakuan) Figure 1. The effect of drought stress exposure on percentage of changes in Relative water content on sugarcane var. PSJT 941 during drought treatments compared with the control (without drought treatment) Data persentase RWC ditampilkan pada Gambar 1. Persentase RWC tanaman tebu tanpa perlakuan dan dengan perlakuan cekaman kekeringan berada pada rentang 34,33 - 95,33%. Persentase RWC tertinggi terlihat pada tanaman kontrol hari ke-16, sedangkan persentase RWC terendah terlihat pada tanaman yang mengalami kekeringan selama 25 hari. Persentase RWC pada tanaman perlakuan terlihat jelas mengalami penurunan dari hari ke-0 hingga hari ke-25 , berbeda dengan tanaman kontrol yang memberikan hasil persentase RWC yang tergolong (Gambar 1). akibat Penurunan kekurangan air, berakibat pada menurunnya proses fisiologi diantaranya, penurunan jumlah stomata yang penurunan konsentrasi CO2, penurunan proses fotosintesis serta karbohidrat cadangan (Widianti et al., 2017; Sevanto et al., 2014). Respon fisiologi dari tanaman yang diberi cekaman kekeringan dan mengalami penurunan RWC berdampak pada fenotipe tanaman tebu di antaranya adalah daun menguning serta mengering dan akhirnya layu. Hal tersebut juga menunjukkan bahwa penurunan RWC dibawah 70% pada tebu (T20 dan T25) berdampak terhadap fenotipe tanaman. tinggi dan konsisten serta hilangnya turgiditas terbuka, Genbank (NCBI), diketahui bahwa sekuen gen DHN pada tebu (Acc no. KF184715) memiliki identitas yang tinggi sebesar 93% dengan gen DHN no.U11696). pada Berdasarkan data sekuens tersebut, selanjutnya telah untuk mengamplifikasi full length CDS dan full length CDS plus daerah 5' UTR dari gen DHN1 dari tanaman tebu varietas PSJT 941 dengan susunan basa yang dapat dilihat pada Tabel 2. Sorghum bicolor (Acc didesain 2 pasang primer Hasil amplifikasi PCR dari cDNA DHN1 ditampilkan pada Gambar 2. Terlihat bahwa pasangan primer DHN1 Forward dan DHN1 Reverse dapat mengamplifikasi gen DHN1 dari tanaman tebu varietas PSJT 941, terbukti dengan terbentuknya pita DNA pada ukuran 465 bp yang sesuai dengan ukuran full length CDS DHN1 pada tebu. Sedangkan pasangan primer DHN1+ Forward dan DHN1 Reverse tidak dapat mengamplifikasi full length CDS DHN1 plus 5' UTR region, sehingga pasangan primer ini tidak digunakan untuk studi selanjutnya. Untuk itu, pada studi ekspresi gen DHN, maka pasangan primer DHN1 Forward dan DHN1 Reverse yang akan digunakan. Studi ekspresi dan karakterisasi cDNA DHN 1 Studi bioinformatika dan seleksi pasangan primer untuk isolasi full length CDS DHN1 dari tanaman tebu Dalam upaya untuk isolasi dan kloning gen DHN1 dari tanaman tebu, analisis bioinformatika untuk mencari sekuen gen DHN pada tanaman tebu maupun yang berkerabat dekat dengan tebu telah dilakukan. Berdasarkan hasil search dari data Studi ekspresi cDNA DHN1 dilakukan dengan metode RT-PCR menggunakan primer spesifik untuk gen DHN1 yaitu DHN1 Forward dan DHN1 Reverse (Tabel 2). Isolasi RNA dilakukan pada sampel daun telah diberi cekaman kekeringan selama 0, 4, 8, 12, 16, 20, dan 25 hari. Untuk mengetahui kualitas RNA total hasil isolasi, elektroforesis telah dilakukan. Dari hasil tanaman tebu yang 120
Isolasi dan karakterisasi gen dehydrin dari tebu (Saccharum... ... (Minarsih et al.) Tabel 2. Daftar primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen DHN dari tanaman tebu varietas PSJT 941 Table 2. List of primers used to amplify DHN1 gene from sugarcane var.PSJT 941 Primer/ Primers Sekuen primer/ Primers sequence Keterangan/ Note DHN1 Forward DHN1 Reverse DHN1 +Forward ATGGAGTACGGTCAGCAGG TTAGTGCTGTCCGGGCAGCT GGCACGAGACCAAATTAAAGC Full length CDS Full length CDS + 5'UTR region 465 bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 Gambar 2. Elektroforegram hasil amplifikasi cDNA DHN1 tanaman tebu. Lajur M: Marker 1 kb Plus Ladder; lajur 1-3: menggunakan pasangan primer. DHN1 forward dan DHN1 Reverse dengan suhu annealing 55oC, 58oC, 60oC.; lajur 4-7: menggunakan pasangan primer DHN1 + Forward dan DHN1 Reverse dengan suhu annealing 52oC, 55oC, 58oC, 60oC lajur 8: kontrol negatif (H2O) Figure 2. Electrophoregram of a DHN1 cDNA amplification using DHN primer pairs. Lane M: Marker 1 kb Plus Ladder; lane 1 - 3= Primer DHN1-forward and DHN1-reverse with temperature of annealing as 55oC, 58oC, 60oC; lane 4 - 7: lane 4-7: primer DHN1+forward and DHN1+reverse with temperature of annealing as52oC, 55oC, 58oC, 60oC; lane 8: negative control (H2O) elektroforesis menunjukkan bahwa 250 ng RNA total dari daun tidak diberi perlakukan maupun yang diberi perlakuan cekaman kekeringan, memperlihatkan dua pita 'intake' yang menandakan RNA tidak terdegradasi (Gambar 3). Dari RNA total yang dihasilkan kemudian dilakukan sintesis cDNA menggunakan metode RT- PCR. Selanjutnya, cDNA yang dihasilkan dijadikan cetakan pada proses PCR untuk mengamplifikasi gen DHN1 menggunakan primer DHN1 Forward dan DHN1 reverse (Tabel 2). Amplifikasi gen DHN1 dilakukan dengan kondisi RT-PCR sebagai berikut: predenaturasi 95oC: 3 menit 1 siklus, 95oC: 15 detik, 66oC: 15 detik, 72oC: 15 detik selama 35 siklus, dan 72oC: 7 menit selama 1 siklus. Produk PCR dimurnikan dari gel agarose menggunakan QIAquick Gel Extraction kit (Qiagen). Hasil amplifikasi gen DHN1 dapat dilihat pada Gambar 5. Gambar 4 menunjukkan bahwa dengan menggunakan RT-PCR, keberadaan transkrip dari gen DHN1 dapat dilihat. Tingkat ekspresi gen DHN1 pada perlakuan dengan cekaman kekeringan memberikan hasil pita DNA yang semakin tebal tebu baik yang dengan bertambahnya waktu perlakuan. Hal ini menunjukkan bahwa eskpresi gen DHN1 pada daun terinduksi dan meningkat seiring dengan tebu bertambahnya waktu cekaman. Dengan demikian DHN1 diperkirakan merupakan osmotic/drought inducible gene dimana ekspresinya dipengaruhi oleh adanya cekaman osmotik atau kekeringan. Dari Gambar 5 terlihat pula bahwa, setelah 25 hari mengalami perlakuan cekaman kekeringan, tingkat eskpresi gen DHN1 terlihat paling tinggi. Namun demikian pernyataan ini harus dibuktikan dengan menggunakan real-time PCR. Seperti dari hasil penelitian yang dilakukan oleh Iskandar et al. (2011), dengan menggunakan real-time qPCR telah terbukti adanya peningkatan ekspresi gen DHN yang sangat tinggi pada jaringan batang tebu yang diberi cekaman kekeringan selama 15 hari. Hasil penelitian yang dilakukan oleh Iskandar et al. (2011), dapat digunakan untuk menduga bahwa ekspresi gen DHN1 pada daun tebu varietas PSJT lamanya 941 akan meningkat seiring dengan perlakuan cekaman kekeringan yang diberikan. 121
Menara Perkebunan 2018 86(2), 116-125 Gambar 3. Elektroforegram RNA total yang diisolasi dari daun tebu pada berbagai perlakuan cekaman kekeringan (T0, T4, T8, T12, T16, T20 dan T25) .Tanda panah menunjukkan subunit rRNA yaitu 25S dan 18S Figure 3. Electrophoregram of total RNA isolated from sugarcane leaf on varius drought treatments (T0, T4, T8, T12, T16, T20 dan T25) . Arrows are indicating two sub units of rRNA i.e. 25S and 18S 465 bp Gambar 4. Elektroforegram hasil amplifikasi cDNA DHN1 memperlihatkan akumulasi transkrip gen DHN1 pada tanaman tebu yang mengalami cekaman kekeringan selama 0,4,8,12,16,20 and 25 hari . M: marka DNA (100 bp ladder marker), T0-T25= sampel tanaman yang diberi cekaman kekeringan selama 0, 4, 8, 12, 16, 20 dan 25 hari; lajur K- : kontrol negatif (H2O) Figure 4. Electrophoregram of DHN1 cDNA amplification showing trancript accumulation of DHN1 gene at 0,4,8,12,16,20 and 25 days after drought stress exposure. Lane M: DNA marker (100 bp ladder marker); lane T0-T25= plants subjected to drought stress for 0, 4, 8, 12, 16, 20 and 25 days; lane K-: negative control (H2O) Kloning cDNA DHN1 hasil RT-PCR Dari hasil RT-PCR, tingkat ekspresi gen DHN1 tertinggi ditandai dengan intensitas fragmen DNA yang tinggi pula ditunjukkan pada sampel tanaman pada hari ke- 20 (T20) dan ke-25 (T25) setelah cekaman kekeringan. Fragmen DNA berukuran 465 bp dari cDNA DHN1 dengan tingkat ekspresi tertinggi tersebut diklon ke vektor kloning pJET 1.2, dan ditransformasi ke dalam kompeten sel E. Coli DH5α. Seleksi transforman dilakukan pada media LB yang mengandung antibiotik ampisilin. Positif transforman ditandai dengan tumbuhnya koloni putih dan telah dibuktikan melalui analisis PCR menggunakan primer spesifik untuk gen DHN1. Selanjutnya, plasmid rekombinan diisolasi, analisis PCR untuk mengamplifikasi gen DHN1 telah dilakukan, produk PCR dengan panjang 465 bp dimurnikan dari gel agarose diikuti pemotongan dengan enzim restriksi EcoRI dan fragmen yang didapatkan selanjutnya disekuens. Berdasarkan hasil analisis melalui BLASTx, gen DHN1 dari tanaman tebu varietas PSJT 941 hasil sekuensing menunjukkan homologinya dengan gen DHN dari berbagai spesies tanaman (Tabel 3). Analisis BLASTx juga menunjukkan bahwa gen DHN1 dari tanaman tebu memiliki homologi yang tinggi dengan gen DHN dari Sorghum bicolor yaitu sebesar 93%. Hasil penjajaran sekuen asam amino (Gambar 5) menunjukkan adanya pola conserved motif DHN. Menurut Graether & Boddington (2014), sekuen dehydrin (DHN) memiliki 3 conserved motif di antaranya yaitu Segmen Y, Segmen S dan Segmen K. Protein DHN dikenali dengan keberadaan sekuens motif Lys dalam jumlah yang banyak. Motif ini disebut juga sebagai segmen K, dengan urutan sekuens EKKGIMDKIKEKLPG (Hara, 2010; Graether & Boddington, 2014). Motif segmen K dalam protein DHN berperan dalam mekanisme biotin dengan membentuk struktur transmembran yang berinteraksi dengan membran sel bakteri untuk menghambat pertumbuhan bakteri. Motif conserved lainnya yaitu segmen Y, dikenal sebagai motif dengan keberadaan residu Tyr. Segmen Y memiliki sekuens motif berupa (V/T)D(E/Q)YGNP, dengan 122
Isolasi dan karakterisasi gen dehydrin dari tebu (Saccharum... ... (Minarsih et al.) Tabel 3. Hasil BLASTx sequence gen DHN1 dari tanaman tebu (S. officinarum) dan species tanaman lainnya Table 3. BLASTx result of DHN1 gene from sugarcane (S. officinarum) and other plant species Description Max score Total score Query cover E value Ident Accession Sorghum bicolor SPV 462 dehydrin protein (DHN) mRNA, complete cds Predicted Sorghum bicolor dehydrin (DHN1) (LOC8077913) mRNA 518 512 518 512 100% 100% 7e-143 3e-141 88% 88% HM243499.1 XM_002439642.2 Sorghum bicolor cultivar 512 512 100% 3e-141 88% KT438253.1 B35dehydrin 1 mRNA, complete cds bicolor Sorghum cultivarBtx (DHN1) 623dehydrinprotein mRNA, complete cds 1 512 512 100% 3e-141 88% KC893318.1 Vignamungo cultivar PBG 107 507 507 100% 1e-139 88% HQ317488.1 dehydrin (DHN) gene, complete cds Sorghum bicolor clone BAC IS 2103 like gene, induced RAB17 ABA partial sequence 497 497 100% 8e-137 88% AY177889.1 Sorghum bicolor dehydrin (DHN2) 431 431 70% 9e-117 92% U63831.1 mRNA, partial cds Panicummiliaceumdehydrin mRNA, 420 420 100% 2e-113 84% KT438253.1 complete cds Saccharum hybrid cultivar R570 clone BAC 051E13 complete sequence Zea mays mRNA for dehydrin (dhn1 399 398 777 543 100% 99% 2e-107 9e-107 99% 86% KF184715.1 X15290.1 gene) Gambar 5. Multiple Sequence Alignment (MSA) (penjajaran) protein DHNdari tebu dan sorgum(kotak biru: motif lestari DHN). ADM48799.1 dehydrin protein Sorghumbicolor, XP_002439687.1 dehydrin DHN1 Sorghumbicolor, AGT17093.1 dehydrin Saccharum hybrid cultivar R570, DHN1.clone ) Figure 5. Multiple sequence alignment of DHN1 proteinfrom sugarcane and sorghum (blue box: conserved region DHN). ADM48799.1 dehydrin protein Sorghumbicolor, XP_002439687.1 dehydrin DHN1 Sorghumbicolor, AGT17093.1 dehydrin Saccharum hybrid cultivar R570, DHN1.clone) residu ASP dan Gly-Asn-Pro merupakan residu yang paling conserved. Motif conserved segmen S tersusun atas 5-7 residu Ser. Saat segmen S dalam protein DHN terfosforilasi, dapat menyebabkan protein DHN berinteraksi dengan signal peptide yang diikuti translokasi ke dalam nukleus (Graether & Boddington, 2014). Berdasarkan hasil penjajaran pada Gambar 5, dapat dilihat bahwa pola struktur DHN dari Saccharum tergolong dalam susunan YnSKn yang tersebut menunjukkan pola YSK. mengindikasikan keberadaan gen DHN pada Saccharum diduga berada pada daerah sitoplasma atau nukleus. Hal ini disebabkan karena adanya segmen Y pada pola susunan DHN Saccharum yang tidak memiliki peranan dalam menjaga atau proteksi terhadap membrane (Graether & Boddington, 2014). Dari pola ini memiliki pengaruh terhadap jenis cekaman abiotik Selain itu, adanya pola struktur DHN 123
Menara Perkebunan 2018 86(2), 116-125 yang berperan dalam ekspresi gen DHN. Adanya respon dapat mempengaruhi sinyal dan kontrol transkripsi dalam sel sehingga menentukan pola ekspresi gen DHN dalam merespon cekaman lingkungan (Wang et al, 2014; Graether & Boddington, 2014). Untuk pola struktur YnSKn seperti pada DHN dari Saccharum, kekeringan dan tinggi merupakan jenis cekaman lingkungan yang paling dominan dalam meningkatkan ekspresi gen DHN. Dalam hal ini segmen Y memiliki peranan penting dalam menjaga sel terhadap kekeringan dan garam tinggi dibandingkan dengan cekaman lingkungan dingin (Graether & Boddington, 2014). terhadap cekaman stress tingkat garam yang Kesimpulan Semakin lama tanaman tebu PSJT 941 diberi cekaman kekeringan, semakin besar penurunan nilai RWC dan semakin tinggi tingkat ekspresi gen DHN1. Sekuen gen DHN1 yang diperoleh dari penelitian tinggi dengan gen DHN pada tebu dan sorghum serta memiliki motif lestari yang mencirikan gen DHN, dan dapat menentukan jenis cekaman abiotik yang mempengaruhi perubahan ekspresi gen DHN. Dengan demikian gen DHN merupakan stress- related gene yang sangat potensial digunakan baik sebagai penanda maupun untuk konstruk gen dalam rekayasa genetik tanaman tebu toleran kekeringan. ini memiliki homologi yang Ucapan Terima Kasih terlaksana dengan dana dari Kegiatan Kerja Sama Kemitraan Penelitian dan Pengembangan Pertanian Nasional (KKP3N) Badan Litbang Pertanian TA 2015-2016 atas kontrak kerjasama dengan Pusat Penelitian Bioteknologi dan Bioindustri Indonesia, PT Riset Perkebunan Nusantara. Penelitian ini Daftar Pustaka Andrade LM, TR Benatti, PM Nobile, HG Maria, F Antonio, LA Ana, SB Michael, S Jorge & C Silvana (2014). Characterization, isolation and cloning of sugarcane genes related to drought stress. BMC Proc 8 (4), 110-112. Barrs HD & PE Weatherley (1962). A re- examination of the relative turgidity technique for estimating water deficits in leaves. Aust J Biol Sci15, 413-428. Brini F, M Hanin, V Lumbreras, S Irar, M Pagès & K Masmoudi (2007). Functional characterization of DHN5,a dehydrin showing a differential phosphorylation patternin two Tunisian durum wheat (Triticum durum Desf.) varieties with marked differences in salt and drought tolerance. Plant Sci 172,20-8. Ferreira, THS, MS Tsunada, D Bassi ,P Araújo, L Mattiello, GV Guidelli, GL Righetto, VR Gonçalves, P Lakshmanan & M Menossi (2017). Sugarcane water tolerance mechanisms and its implications on developing biotechnology solutions. Frontiers in Plant Sci, 8(1077), 1-18. doi: 10.3389/fpls.2017.01077. stress Gao C, C Wang, L Zheng, L Wang & Y Wang regulates cadmium (2012). A LEA gene tolerance by mediating physiological responses. Int 5468-5481; doi:10.3390/ijms13055468. J Mol Sci13, Gao J & T Lan (2015). Functional characterization of the Late Embryogenesis Abudant (LEA) protein gene family from Pinus tabuliformis (Pinaceae) in Escherichia coli. Scientific Reports 6 (19467), 1- 10. Graether SP& KF Boddington (2014). Disorder and function: A review of the dehydrin protein family. Frontiers In Plant Science 5 (576), 1-12. Hanin M, F Brini, C Ebel, Y Toda, S Takeda & K Masmoudi (2011). Plant dehydrins and stress complex tolerance: Versatile protein mechanisms. and Behavior6(10), 1503-1509. for Plant Signaling Hara M (2010). The multifunctionality of dehydrins. An overview. Plant Signaling and Behaviour 5(5), 503-508. Harb A, A Krishnan, MR Madana, Ambavaram & and Andy physiological analysis of drought stress in Arabidopsis reveals early response leading to acclimation in plant growth. Plant Physiology 154 (3), 1254-1271. Pereira (2010). Molecular Ingram J & DBartels (1996). The molecular basis of dehydration tolerance in plants. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 47, 377-403. Iskandar HM, RE Casu, AT Fletcher, S Schmidt, J Xu, DJ Maclean, JM Manners & GD Bonnett (2011). Identification of drought-response genes and a study of their expression during sucrose accumulation and water deficit in sugarcane culms. BMC Plant Biology 11(12), 1-14). Kang S, Post, W, J Nichols, D Wang, T West, V Bandaru & Roberto I (2013). Marginal lands: 124
Isolasi dan karakterisasi gen dehydrin dari tebu (Saccharum... ... (Minarsih et al.) concept, assessment and management. Journal of Agricultural Science5(5), 129-139. Lakshmanan P& Robinson N (2014). Stress physiology: Abiotic stresses. In: PH Moore & (ed), Sugarcane: physiology, FC Botha biochemistry, and functional biology.Chichester, JohnWiley & Sons, Inc.p. 411-434. drought tolerance of gene LEA-D11 soybean (Glycine max L. Merr) based on PCR- sequencing. American JMol Biol 3, 32-37. Sevanto S, McDowell NG, Dickman LT, Pangle R & Pockman WT (2014). How do trees die? A failure and carbon test of starvation Cell Environ37,153-161. the hydraulic hypotheses. Plant Mahajan S & N Tuteja (2005). Cold, salinity and drought stresses, An overview. Arch Biochem Biophys 444(2), 139-158. Osakabe Y, K Osakabe K, K Shinozaki & Lam-Son P Tran (2014). Response of plants to water stress. Front Plant Sci 5 (86), 1-8. WangY, HXu , H Zhu ,Y Tao, G Zhang & L Zhang (2014). expression diversification of wheat dehydrin genes. PlantSci. 214, 113-120. doi: 10.1016/j.plantsci. 2013.10.005 Classification and Rampino P, Pataleo S, Gerardi C, Mita G & Perrotta C (2006). Drought stress response in wheat: physiological andmolecular analysis of resistant and sensitive genotypes. Plant, Cell and Environment 29, 2143-2152. Widianti Putri, Violita V & Moralita Chatri (2017). Luas dan indeks stomata daun tanaman padi (Oryza sativa L.) varietas cisokan dan batang piaman akibat cekaman kekeringan. Bioscience 1(2), 77-86. Reis SP, AM Lima & CR de Souza (2012). Recent molecular advances on downstream plant responses to abiotic stress. Rev Int J Mol Sci13, 8628-8647; doi:10.3390/ijms13078628. Savitri ES, N Basuki, N Aini & EL Arumingtyas Identification and characterization (2013). Yang Y, M He, Z Zhu, S Li, Y Xu, C Zhang, SD Singer & Y Wang (2012). Identification of the dehydrin gene family fromgrapevine species and analysis of theirresponsiveness to various forms of abiotic andbiotic stress. BMC Plant Biology 12,140, 1-17. 125