MODEL TIKUS DIABETES YANG DIINDUKSI STREPTOZOTOCIN- SUKROSA UNTUK PENDEKATAN PENELITIAN DIABETES MELITUS GESTASIONAL Streptozotocin, Sucrose- Induce Diabetic Male Rats Model for Research Approach of Gestational Diabetes Mellitus Firdaus1, Rimbawan2, Sri Anna Marliyati2, Katrin Roosita2. Program Studi Ilmu Gizi Masyarakat Sekolah Pascasarjana IPB ABSTRAK Diabetes melitus gestasional (DMG) merupakan intoleransi glukosa pada berbagai tingkatan yang terjadi selama kehamilan. DMG pada wanita meningkatkan risiko kematian sebelum kelahiran pada ibu dan bayinya, tingkat kesakitan pada ibu dan meningkatkan risiko berkembangnya DM tipe-2 setelah melahirkan. Penggunaan hewan coba alternatif dengan metode yang tepat dalam penelitian DMG dengan pendekatan DM tipe-2 telah ba- nyak dilakukan dan cukup mendesak. Tujuan penelitian ini untuk mengetahui apakah induksi Streptozotocin-sukro- sa dapat menghasilkan DM tipe-2 pada tikus yang dapat digunakan sebagai pendekatan dalam penelitian DMG. Peneltian ini bersifat eksperimental, tikus Sprague Dawley jantan berjumlah 45 ekor berusia 6 minggu dialokasikan pada 2 kelompok: kontrol (n=5) dan diabetes (n=40). Kelompok kontrol diinjeksi secara intraperitoneal dengan phosphat buffer saline (PBS) tanpa sukrosa dan kelompok diabetes diinjeksi secara intraperitonela dengan strepto- zotocin (STZ) dosis 40 mg/kg berat badan dan diberikan 30% sukrosa secara ad libitum, pengukuran glukosa darah puasa dan berat badan dilakukan tiap 3 hari. Setelah minggu ke-4 perlakuan, terdapat 24 tikus pada kelompok dia- betes dengan glukosa darah puasa diatas 126 mg/dL dan menunjukkan perbedaan signifikan glukosa darah (p<0.05) dan peningkatan berat badan (p<0.05) dibandingkan dengan kelompok kontrol. Induksi STZ-sukrosa dapat meng- hasilkan DM tipe-2 pada tikus Sprague dawley Jantan dan dapat digunakan sebagai pendekatan peneltian DMG. Kata kunci : Streptozotocin, sukrosa, Gestasional Diabetes Melitus (GDM) ABSTRACT Gestational Diabetes mellitus (GDM) is defined as glucose intolerance of various degreees that is first detected during pregnancy. Individuals with GDM have increased risk for perinatal mortality and morbidity and clearly are at increased risk for the later development of diabetes especially type-2 diabetes. This make the use of alternative experimental models for the disease is promted. The aim of this study was to investigate whether streptozotocin-sucrose-induced in rats results type-2 diabetes as the same as GDM. Type of study is experi- mental, on 6 month of age 45 male Sprague Dawley rats were assigned to two experimental groups: control (n=5), and diabetic (n=40). Control group was injected intraperitoneally with phosphat buffer saline (PBS) without sucrose and diabetic group injected intraperitoneally with streptozotocin (STZ) dosage of 40 mg/kg body weight with 30% sucrose ad libitum and each 3 days fasting blood glucose and body weigt was measured. After 4 weeks of treatment, 24 rats on diabetic groups with fasting blood glucose level above 126 mg/dL and showed significantly different in blood glucose (p<0.05) and weight gain (p<0.05) compare with control. STZ- sucrose-induced can results type-2 diabetic in Sprague dawley male rats that can be used to GDM research. Key words : Streptozotocin, Sucrose, Diabetes Mellitus Gestational (DMG) 29
PENDAHULUAN Dabetes melitus gestasional (DMG) didefi- nisikan sebagai suatu gangguan toleransi glukosa yang timbul atau pertama kali dideteksi pada saat kehamilan. Kondisi ini terjadi pada 3-7% perem- puan hamil.1 DMG merupakan salah satu faktor risiko terjadinya komplikasi pada janin dan ber- kaitan dengan timbulnya diabetes melitus tipe 2 di masa yang akan datang bagi perempuan yang pernah didiagnosis DMG,2 disamping faktor hi- pertensi, umur, gaya hidup, etnik, ras dan bu- daya.3,4 Diabetes melitus pada kehamilan memiliki dampak yang serius pada ibu dan anak yang dila- hirkannya jika tidak ditangani dengan baik.5 Prevalensi DMG dunia telah meningkat dalam kurun waktu 20 tahun terakhir, bervari- asi antar ras dan grup etnik,6 dan berbeda antar kelompok ras dan budaya yang berbeda di negara yang sama.7 Prevalensi DMG di Negara-negara Asia, juga terdapat peningkatan, di Tianjin, China DMG meningkat dari 2.4% (2002) menjadi 6.8% (2008), di Hong Kong dari 7.4% (1986) menjadi 10.4% (1998-2001), di Bangkok Thailand dari 2.0% (1987-1989) menjadi 3.0% (2001-2002), dan prevalensi di India bervariasi tergantung lo- kasi dan kriteria diagnosa DM dengan prevalensi tertinggi pada wilayah urban Chennai dari 17.7% (2001) dan 17.8% (2005-2007).8 Berdasarkan semakin meningkatnya preva- lensi dan dampaknya terhadap fisik dan keadaan psikologis penderita, saat ini diabetes mendapat- kan perhatian yang besar dalam dunia medis. Di- abetes kemudian berkembang menjadi tidak dapat diobati dan hanya dapat dikontrol dengan bantu- an obat. Selama bertahun-tahun, beberapa hewan coba telah dikembangkan untuk mempelajari di- abetes melitus atau untuk melakukan pengujian agen anti-diabetes baik obat baru ataupun kom- ponen aktif pada bahan tertentu yang memiliki potensi anti-diabetik. Model ini antara lain dengan melibatkan komponen kimia, pembedahan (pan- createctomy), dan manipulasi genetik pada bebe- rapa spesies hewan untuk menghasilkan diabetes melitus sesuai tujuan.9 Pemilihan model hewan yang paling sesuai untuk mempelajari pengaruh suatu komponen tertentu sebagai anti-diabetes dalam kaitannya untuk mengatasi penyakit terse- but kemungkinan menjadi sangat sulit terutama bagi peneliti muda. Penelitian ini bertujuan un- tuk mempelajari kombinasi induksi streptozoto- cin-sukrosa dalam menghasilkan DM tipe-2 pada tikus sebagai pendekatan untuk penelitian DMG. BAHAN DAN METODE Penelitian ini telah mendapatkan per- setujuan etik dari komisi etik penelitian keseha- tan Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia Nomor 505/UN2.F1/ETIK/2015. Jenis penelitian yang digunakan adalah eksperimental dengan 2 kelompok perlakuan kontrol dan diabetes. Pene- litian dilaksanakan dari bulan Desember 2014 - Januari 2015. Jumlah sampel 45 ekor tikus strain Sprague Dawley Jantan (veteriner stem cell LPPM IPB), umur 6 bulan dengan berat 120 - 140 gram ditempatkan secara kelompok dengan lingkungan dan perlakuan yang sama, suhu ruang diatur de- ngan kisaran 20-28 oC, kelembaban 50+10% dan siklus gelap-terang masing-masing 12 jam.10 Ti- kus yang digunakan dalam penelitian ini berjenis kelamin jantan, hal ini didasarkan karena kondisi kehamilan dan jenis kelamin pada tikus bukan- lah hal yang paling mendasar akan tetapi lebih pada kesamaan patogenesis dari DMG antara lain penurunan sensitifitas insulin dan berkurangnya respon insulin terhadap muatan glukosa baik oral maupun intravena yang berujung pada resistensi insulin.11 Kebersihan kandang dijaga setiap hari dan serbuk kayu sebagai media alas tikus (beed- ing) diganti 2 kali per minggu. Tikus diberi pakan berupa diet standar untuk tikus dewasa dengan kandungan zat gizi makro disesuaikan dengan pakan Teklad Global 14% Protein Rodent Main- tenance Diet 2014S dari HarlanTM Laboratories (2014) dan diberi minum secara ad libitum selama 10 hari sebelum masa percobaan. Setelah 10 hari adaptasi dilakukan alokasi secara purposive dengan kelompok kontrol ber- jumlah 5 ekor dan kelompok diabetes berjumlah 40 ekor. Tikus pada kelompok diabetes diinjek- si STZ dengan dosis 40 mg/kg berat badan serta diberi minum larutan sukrosa 30% secara ad libi- tum, sedangkan kelompok kontrol diinjeksi phos- phat buffer saline (PBS) dan diberi minum secara ad libitum tanpa sukrosa, selama masa percobaan, seluruh kelompok perlakuan mendapat pakan stan- dar. Pengukuran glukosa darah puasa tikus dilaku- kan dari pembuluh darah ekor (vena lateralis)12 dan penimbangan berat badan tikus masing-ma- 30
sing menggunakan glukometer glucoDR Bio- sensor dan timbangan digital, pengambilan data dilakukan tiap 3 hari setelah sebelumnya dipua- sakan selama + 10 jam. Banyaknya pakan dan minum yang dikonsumsi serta urin yag dihasilkan tikus dilakukan dengan pengamatan setiap hari. Tikus dinyatakan diabetes apabila glukosa darah puasa > 126 mg/dL.13,14 Hasil disajikan dalam ra- ta-rata dan standar deviasi, analisis data dengan menggunakan uji T berpasangan dan uji beda de- ngan menggunakan ANOVA. Perbedaan sig- nifikan pada p<0.05. Penyajian data dalam bentuk tabel dan gambar. HASIL Pada hari pertama pasca injeksi STZ, kemudian dilakukan pengukuran glukosa darah dan penimbangan berat badan tikus. Kelompok ti- kus diabetes yang diinduksi STZ dengan dosis 40 mg/kg berat badan memperlihatkan kadar glukosa darah puasa 124,36+8.78 mg/dL yang masih pada rentang hiperglikemia sedangkan kelompok kon- trol 103.25+11.35 mg/dL (Gambar 1). Hasil pe- nimbangan berat badan menunjukkan berat badan tikus kelompok diabetes pada hari pertama induksi 124.85+8.78 g, sedangkan pada kelompok kontrol 131.08+10.36 g (Gambar 2). Setelah 4 minggu perlakuan, diperoleh glu- kosa darah puasa sesuai dengan cut point yang digunakan pada penelitian. Terdapat 24 ekor pada kelompok diabetes dengan glukosa darah puasa diabetes stabil yakni 146.00+21.40 mg/dL, se- dangkan pada kelompok kontrol 111.75+7.72 mg/ dL. Peningkatan glukosa darah puasa pada kelom- pok diabetes berbeda signifikan jika dibandingkan dengan glukosa darah puasa kelompok diabetes pada awal percobaan (p<0.05) (Gambar 1). Pada minggu ke-4 percobaan terjadi pe- Gambar 1. Glukosa Darah Awal dan 4 Minggu Percobaan pada Kelompok diabetes dan kontrol, (**) signifikan pada p<0.05 Gambar 2. Berat Badan Awal dan 4 Minggu Percobaan pada Kelompok Diabetes dan Kontrol, (**) signifikan pada p<0.05 Gambar 3. Glukosa Darah Puasa Tikus Setelah 4 Minggu dan 3 Hari Kemudian, (*) tidak signifikan pada p<0.05 31
ningkatan berat badan pada kedua kelompok per- lakuan, pada kelompok diabetes berat badan ti- kus sebesar 192.85+26.78 g dan pada kelompok kontrol sebesar 190.50+43.84 g. Peningkatan be- rat badan pada minggu ke-4 percobaan berbeda signifikan dibandingkan dengan berat badan pada awal percobaan (Gambar 2). Setelah cut point tercapai pada minggu ke-4, untuk mengukur kestabilan glukosa darah, pemberian sukrosa 30% secara ad libitum pada kelompok diabetes kemudian dihentikan. Setelah itu dilakukan pengukuran kembali 3 hari setelah penghentian pemberian sukrosa. Hasil menunjuk- kan tidak terdapat perbedaan signifikan glukosa darah puasa pada akhir masa pemberian sukrosa dengan 3 hari setelahnya (Gambar 3), sehingga dapat dikatakan bahwa tikus telah mengalami dia- betes dengan kondisi glukosa darah diabetes stabil. Pengamatan terhadap konsumsi pakan, mi- num dan banyaknya urin yang dihasilkan sebagai indikator perkembangan diabetes melitus antara lain polipagia (peningkatan konsumsi pakan), po- lidipsia (peningkatan konsumsi air) dan poliuria (peningkatan produksi urin) menunjukkan ter- dapat peningkatan konsumsi pakan dan minum yang ditandai dengan tidak tersisanya pakan stan- dar yang diberi dan minum yang selalu habis di- mulai pada hari ke-4 perlakuan pada kelompok tikus diabetes, penggantian beeding sebagai alas pada kandang menjadi lebih sering karena serutan kayu pada media pemeliharaan menjadi lebih ba- sah dan aroma urin tercium lebih pekat. Berbeda dengan kelompok tikus kontrol yang tidak jauh berbeda konusmsi pakan, minum dan banyaknya urin pada saat awal dan akhir percobaan. glikosuria.15 Reaksi STZ terhadap sel-β pankreas disertai dengan perubahan karakteristik pada insu- lin darah dan konsentrasi glukosa yang meyebab- kan hiperglikemia dan menurunnya level insulin dalam darah.16 STZ mempengaruhi oksidasi glu- kosa dan menurunkan biosintesis dan sekresi in- sulin. STZ masuk ke sel-β pankreas melalui trans- porter glukosa GLUT2 menyebabkan menurunnya ekspresi dari GLUT2.16 Hal ini mengakibatkan penurunnya sensitifitas reseptor insulin perifer se- hingga berdampak pada meningkatnya resistensi insulin dan meningkatkan kadar glukosa darah. STZ mampu mempengaruhi glukosa da- rah melalui 3 mekanisme yakni antara lain : 1) Penumpulan atau hilangnya respon insulin tahap pertama, sehingga sekresi insulin terlambat dan gagal mengembalikan lonjakan gula darah prandi- al dalam waktu yang normal, 2) Penurunan sensi- tifitas insulin sebagai respon terhadap glukosa se- demikian hingga menyebabkan hiperglikemia, 3) Gagal memberikan stimulasi terhadap respon in- sulin yang wajar.17,18 Pemberian sukrosa memper- besar gejala diabetes yang dinduksi STZ dengan meningkatkan glukosa darah dan deposit lemak dan juga berat badan pada tikus.19 Pemberian larutan sukrosa dan lama- nya durasi merujuk pada19,20,21. Diet tinggi sukrosa selama 3-5 minggu telah dapat meningkatkan le- vel glukosa darah dan hyperinsulinemia dan juga menurunkan sensitifitas insulin pada tikus20 dan pada mencit.19 Diet tinggi sukrosa secara nyata merubah metabolisme glukosa yang dimediasi insulin yang dapat menghasilkan resistensi isulin pada tikus.22 PEMBAHASAN Induksi diabetes dengan STZ dosis 40 mg/kg berat badan disertai pemberian sukro- sa 30% mampu meningkatkan glukosa darah puasa dan berat badan tikus secara signifikan. Penggunaa dosis 40 mg/kg berat badan tikus didasarkan karena aplikasi dosis dibawah 40mg/kg berat badan pada tikus meski pada awalnya terjadi hiperglikemi akan tetapi se- cara spontan akan terjadi mekanisme per- baikan dalam waktu singkat dari kondisi dia- betes dengan kondisi volume urin normal dan sangat sedikitnya atau bahkan tidak terjadi Peningkatan berat badan pada kelompok diabetes dapat terjadi dikarenakan terdampak- nya regenerasi populasi sel-β dan terpengaruh- nya reseptor insulin pada sel-β akibat STZ.23 Me- kanisme DMG mirip dengan DM Tipe-2 yang ter- jadi karena gangguan aksi dan sekresi insulin pada reseptor insulin yang menyebabkan resistensi, bu- kan karena rusaknya sel-β pankreas seperti pada DM Tipe-1.14 Sehingga tingginya asupan kalori pada kelompok tikus diabetes menyebabkan pen- ingkatan perlemakan subkutan.24,25 KESIMPULAN DAN SARAN Induksi STZ dengan sukrosa 30% dapat 32
dapat menghasilkan DM tipe-2 pada tikus Sprague dawley jantan. Hal ini dapat sebagai alternatif he- wan coba yang digunakan sebagai pendekatan dalam penelitian DMG. Perlu dilakukan peneli- tian lanjutan dengan kombinasi sukrosa beberapa taraf atau dengan membandingkan dengan gluko- sa murni atau dengan kombinasi pemberian pakan tinggi lemak sehingga dapat dijadikan alternatif pembuatan diabetes tipe-2 pada tikus yang diin- duksi dengan agen diabetogenik. DAFTAR PUSTAKA 1. Zhang H, Zhang J, Pope CF, Crawford LA, Vasavada RC, Jagasia SM, Gannon M.. Ges- tational diabetes mellitus resulting from im- paired β-Cell compensation in the absence of FoxM1, a novel downstream effector of pla- cental lactogen. Diabetes 2010;59:143-152. 2. Adam JMF. Klasifikasi dan kriteria diagosis diabetes melitus yang baru. Cermin Dunia Ke- dokteran. 2000;127:37-40. Management of Laboratory and Others Re- search Animals. Wheathampstead (UK). Wi- ley-Blackwell; 2010 11. Hellerstrom C, Swenne I, Erikkson UJ. Is there an animal model for gestational diabe- tes?. Diabetes. 1985;34(2). 12. Rantam FA.. Metode Imunologi. Cet.1. Sura- baya (ID): Airlangga University Press; 2003. 13. Jung JY, Lim Y, Moon MS, Kim JY,Kwon O. Onion peel extracts ameliorate hyperglycemia and insulin resistance in high fat diet/ strep- tozotocin-induced diabetic rats. Nutrition and Metabolism. 2011;8(18). 14. American Diabetes Association. Standards of medical care in diabetes . Diabetes Care. 2015;38(1):S1-S94. 15. Junod A, Lambert AE, Stauffacher W, Re- nold AE. Diabetogenic Action of Streptozo- tocin: Relationship of Dose to Metabolic Re- sponse. The Journal of Clinical Investigation. 1969;48:2129-2139. 3. Lowdermilk DL, Perry SE, Bobak IM.. Ma- ternity nursing. Edisi ke-5. St. Louis : Mosby; 1999 16. Szkudelski T. The mechanism of alloxan and streptozotocin action in B cells of the rat pan- creas. Physiol. Res. 2001;50: 536-546. 4. Sutanegara D, Darmono, Budhiarta AAG. The epidemiology and management of diabetes mellitus in indonesia. Diabet Res Clin Prac. 2000;50(2):S9-S16. 5. Purnamasari D, Waspadji S, Adam JMF, Rudi- janto A, Tahapary D. Indonesian Clinical Practice Guidelines for Diabetes in Pregnancy. JAFES. 2013;28(1):9-13. 6. Ferrara A.. Increasing prevalence of gestation- al diabetes mellitus : A public health perspec- tive. Diabetes Care. 2007;30(2). 7. Bellamy L, Casas JP, Hingorani AD, Williams D.. Type 2 diabetes mellitus after gestational diabetes: a systematic review and meta-analy- sis. The Lancet. 2009;373(9677):1773 - 1779. 8. Hirst JE, Greenow CHR, Jeffery HE. A sys- tematic review of trends of gestational diabe- tes mellitus in Asia. Journal of Diabetology. 2012;3(4). 9. Etuk EU. Animals models for studying diabe- tes mellitus. Agric. Biol. J. N. Am. 2010; 1(2): 130-134. 10. Koolhaas JM.. The Laboratory Rat Chapter 22. Di dalam: Hubercht R, Kirkwood J, edi- tor. The UFAW Handbook on The Care and 17. Garvey WT. Glucose transport and NIDDM [ulasan]. Diabetes Care. 1992;15(3). 18. Mayfild JA, White RD. Insulin therapy for type 2 diabetes: rescue, augmentation, and replacement of beta-cell function. American Family Physycian. 2004;70(3). 19. Cao D, Lu H, Lewis TL, Li L. Intake of su- crose-sweetened water induces insulin resis- tance and exacerbates memory deficits and amyloidosis in a transgenic mouse model of Alzheimer disease. The Journal Of Biological Chemistry. 2007;282(50):36275-36282. 20. Chicco A, D'Alessandro ME, Karabatas L, Pastorale C, Basabe JC, Lombardo YB.. Mus- cle lipid metabolism and insulin secretion are altered in insulin-resistant rats fed a high su- crose diet. J Nutr. 2003;133: 127-133. 21. Daly M. Sugars, insulin sensitivity, and the postprandial state. Am J Clin Nutr: 2003;78:865S-72S. 22. Pagliassoti MJ, Gayles EC, Podolin DA, Wei Y, Morin CL. Developmental stage modifies diet-induced peripheral insulin resistance in rats. Am. J. Physiol. Regulatory Integrative Comp. Physiol. 2000;278: R66-R73. 33
23. Calcutt NA.. Modeling Diabetic Sensory Neu- ropathy in Rats. Di dalam: Luo ZD, editor. Pain Research: Methods and Protocols. New Jersey (US). Humana Press; 2004. 24. Archer ZA, Rayner DV, Rozman J, Klingespor M, Mercer JG.. Normal distribution of body weight gain in male sprague-dawley rats fed a high-energy diet. Obes Res. 2003;11:1376- 1383. 25. Russel-Jones D, Khan R.. Insulin-associat- ed weight gain in diabetes--causes, effects and coping strategies. Diabetes Obes Metab. 2007;9(6):799-812. 34