Majalah Ilmiah Biologi Biosfera : A Scientific Journal DOI: 10.20884/1.mib.2019.36.2.866 Vol 36, No 2 Mei 2019 : 79 - 84 Mikrosporogenesis Cabai Merah Besar (Capsicum annuum L.) Akibat Cekaman Kekeringan Utaminingsih1 , Suharyanto1, Issirep Sumardi1 1Fakultas Biologi, Universitas Gadjah Mada Email: utaminingsih@ugm.ac.id Abstract Chilli is one of high economic vegetable crops that had multi purpose. Some marginal areas in Indonesia have limited water rate. The aims of this research are to know microsporogenesis process and physiological responses of big red chilli in drought stress. The stage of this research were: 1) seed germination and acclimatization; 2) treatment of dryness grasp (was watered every 1, 3, 5, and 7 days); 3) sample collection (flower and leaves); 4) anatomical preparation of flower; 5) proline and chlorophyll analysis; 6) pollen viability test; 7) microsporogenesis observation; 8) data analyses. Parameters observed in this research were prolin contents, chlorophyll contents, microsporogenesis and pollen viability test. The result showed that drought stress treatment in this research did not affect chilli microsporogenesis process, but these process begin earlier. Plant responses to drought stress were decreased of proline content of root; decreased of chlorophyl content of leaf; and degradation of pollen viability. Key words : Capsicum annuum, chili, drought stress, microsporogenesis Abstrak Cabai merupakan salah satu tanaman sayuran bernilai ekonomi tinggi yang memiliki banyak manfaat. Beberapa wilayah marginal di Indonesia memiliki keterbatasan dalam ketersediaan air. Tujuan dari penelitian ini adalah mengetahui mikrosporogenesis dan respons fisiologis tanaman cabai merah besar akibat cekaman kekeringan. Tahapan penelitian meliputi : 1) perkecambahan biji dan aklimatisasi; 2) perlakuan cekaman kekeringan (penyiraman setiap 1,3,5,7,hari sekali); 3) pengambilan sampel (bunga dan daun); 4) pembuatan preparat anatomi bunga; 5) analisis prolin dan klorofil; 6) uji viabilitas polen; 7) pengamatan mikrosporogenesis; 8) analisis data. Parameter yang diamati meliputi kadar prolin, kadar klorofil, mikrosporogenesis, dan uji viabilitas polen. Hasil penelitian menunjukkan bahwa cekaman kekeringan tidak mempengaruhi tahapan mikrosporogenesis, tetapi mikrosporogenesis berlangsung lebih awal daripada tanaman kontrol. Respons tanaman cabai terhadap cekaman kekeringan meliputi penurunan kadar prolin akar, penuruanan kadar klorofil daun, dan penurunan viabilitas polen. Kata kunci : Capsicum annuum, cabai merah besar, cekaman kekeringan, mikrosporogenesis. Pendahuluan tanaman sayuran yang multiguna. Pada umumnya, cabai dimanfaatkan untuk bahan penyedap berbagai juga digunakan macam masakan, selain sebagai bahan baku jadi, penghasil minyak atsiri dan bahan ramuan obat tradisional, serta bahan baku kosmetik. Secara sistematik, cabai merupakan anggota suku Solanaceae yang memiliki banyak variasi baik pada tingkat jenis maupun varietas. Saat ini terdapat 12 jenis cabai yang dikenal. Namun yang paling banyak dibudidayakan oleh petani hanya beberapa jenis saja, yaitu cabai merah, cabai rawit, paprika, dan cabai hias. Pada pasar tradisional, cabai yang umum dijual untuk dikonsumsi adalah cabai merah besar (Capsicum annuum L. var. abreviata Eingerhuth), cabai merah keriting (Capsicum annuum L. var. longum Sendt) dan cabai rawit (Capsicum frutescens L.). Cabai merupakan salah satu itu industri makanan pada tahun 2010 mengalami penurunan menjadi tersebut 1.332.356 menyebabkan harga cabai melambung tinggi tahun 2010. Fluktuasi harga cabai pada diakibatkan adanya penyakit dan hama. Selain itu, adanya perubahan iklim yang tidak menentu mengakibatkan curah hujan tidak menentu. Tanaman cabai dapat tumbuh baik pada tanah dengan kadar air cukup. Beberapa wilayah di Indonesia, terutama daerah marginal memiliki keterbatasan yaitu kadar air rendah atau kering. Lahan pertanian yang kering akan mengakibatkan terganggu. fungsi dan pertumbuhan akar Akibatnya pertumbuhan ikut juga tanaman terganggu sehingga produksi bunga dan buah akan menurun. Lahan kering di Indonesia berupa tanah Ultisol 47,5 juta ha dan Oxisol 18 juta ha. Indonesia memiliki panjang garis pantai mencapai 106.000 km dengan potensi luas lahan 1.060.000 ha. Berjuta-juta hektar lahan marginal tersebar di untuk beberapa pengembangan pertanian, terutama cabai. ton (BPS, 2011). Hal tahun 2010 mengalami penurunan dibandingkan tahun-tahun sebelumnya. Pada tahun 2009, produksi cabai di Indonesia mencapai 1.378.727 ton, sedangkan Produktivitas cabai pada pulau, prospeknya baik Air merupakan komponen utama penyusun sel tumbuhan, mempunyai peranan penting dalam pertumbuhan dan perkembangan (Shao et al., 79
Mikrosporogenesis Cabai Merah Besar ... Utaminingsih, dkk. 2008). Pada tumbuhan herba, di dalam selnya terkandung 85-90% air yang merupaka n pelarut bagi banyak reaksi biokimia. Laju pertumbuhan sel tanaman dan efisiensi proses fisiologisnya mencapai tingkat tertinggi apabila sel berada yang maksimum. Cekaman pada kekeringan adalah keadaan dimana sel tanaman kehilangan air dan berada pada tekanan turgor yang lebih rendah daripada nilai maksimumnya. Pada keadaan tersebut menyebabkan gangguan metabolisme (Fitter & Hay, 1991). turgor Tujuan penelitian ini adalah mengetahui proses mikrosporogenesis dan respon fisiologi, biokimia, dan anatomi tanaman cabai merah besar dalam kondisi cekaman kekeringan sehingga dapat digunakan sebagai acuan untuk meningkatkan produktivitas tanaman cabai merah besar. Metode Penelitian Perubahan metabolisme yang terjadi akibat cekaman akan mempengaruhi perkembangan tanaman, terutama pada proses miksporogenesis dan perkembangan polen. Mikrosporogenesis pada cabai sebelumnya telah diteliti oleh Lengel dan Cochran (1960). Hasil penelitian tersebut menunjukkan bahwa spesies yang sama dengan varietas berbeda mempunyai perbedaan dalam perkembangan polen. Oleh karena ini dilakukan untuk mengetahui proses mikrosporogenesis dan perkembangan polen pada cabai merah besar (Capsicum annuum L.). kekeringan itu, penelitian dilaksanakan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan satu faktor, yaitu perlakuan cekaman kekeringan (interval penyiraman/ hari). Perlakuan cekaman kekeringan yang diberikan yaitu disiram setiap hari (kontrol); 3 hari sekali; 5 hari sekali; dan 7 hari sekali. Penyiraman menggunakan air sumur sebanyak 500 ml. Masing-masing perlakuan dilakukan dengan 10 kali ulangan. Penelitian Pengambilan sampel bunga menggunakan kriteria dari Erickson dan Markhart (2002) (Tabel 1.). Pembuatan Preparat Anatomi bunga menggunakan metode parafin dengan pewarnaan tunggal (Ruzin, 1999). Tabel 1. Fase perkembangan bunga cabai merah besar berhubungan dengan perkembangan mikrospora, ukuran kuncup, hari ke antesis pada suhu 25° C Fase I II III IV V Karakteristik Lobus daun kelopak menutup, mahkota tidak terlihat, kuncup berwarna hijau Lobus daun kelopak mulai memisah Pemisahan lebih lanjut dari daun kelopak, mahkota mulai terlihat Mahkota bunga menonjol Penonjolan mahkota bunga hampir dua kali panjang kelopak Panjang kuncup (mm) < 2,5 3,0-4,0 4,5-6,5 7,0-8,0 8,5-11,0 Hari ke- antesis 14-17 Sep-13 06-Agt 03-Mei 01-Feb Fase Mikrosporogenesis Premiosis Pembentukan tetrad dan pemisahan Mikrospora bebas, muda Pemasakan mikrospora, penebalan eksin Butir polen mengadakan pembelahan mitosis, eksin tebal dan gelap dengan pewarnaan 0,4% Trypan blue (Sigma, St Louis, MO, USA). Pada saat antesis, bunga dari masing- masing perlakuan dikoleksi secara acak. Polen ditaburkan pada gelas benda ditambahkan 70 μL Trypan diamati menggunakan mikroskop cahaya. Kriteria polen yang viabel adalah berbentuk triangular dan elips dengan dinding eksin yang tebal serta berwarna biru. Jumlah polen yang viabel dan jumlah total polen dalam satu bidang pandang dihitung, kemudian dihitung persentase jumlah polen yang viabel (Erickson & Markhat, 2002). Viabilitas polen diestimasi blue. Selanjutnya polen Pengukuran kadar prolin mengacu pada Bates (1973). Akar tanaman cabai di akhir pengamatan diambil kemudian dibersihkan dan ditimbang sebanyak 0,5 g. Akar ditumbuk dengan mortar di dalam larutan sulfosalisilat 3% sebanyak 10 ml kemudian disaring dengan kertas saring Whatman no. 1. Selanjutnya filtrat diambil sebanyak 2 ml, dimasukkan dalam tabung reaksi, dan ditambah 2 ml asam Ninhydrin. Asam Ninhydrin dibuat dengan cara memanaskan 1,25 g Ninhydrin dalam 30 ml asam asetat glasial dan 20 ml asam fosforat. Pemanasan dilakukan dalam waterbath pada suhu 100 °C hingga larut. Filtrat dan 2 ml asam Ninhydrin ditambah 2 ml asam asetat glasial kemudian dipanaskan pada suhu 100 °C selama 1 jam. Reaksi diakhiri dengan memasukkan tabung reaksi berisi filtrat ke dalam gelas piala berisi es. Campuran filtrat, Ninhydrin dan asam asetat glasial ditambahkan 80
Majalah Ilmiah Biologi Biosfera : A Scientific Journal DOI: 10.20884/1.mib.2019.36.2.866 Vol 36, No 2 Mei 2019 : 79 - 84 toluen 4 ml dan digojog dengan stirer 15-20 detik sehingga terbentuk dua lapisan cairan berwarna tidak sama. Toluen berwarna merah yang mengandung prolin diambil dengan pipet, dimasukkan kuvet, dan dibaca Optical Density (OD) pada panjang gelombang 520 nm. mikrosporogenesis dianalisis secara deskriptif (kualitatif). Hasil dan Pembahasan A. Kadar prolin Akar Kadar prolin dihitung dengan cara membuat larutan standar prolin terlebih dahulu, yaitu 2,5 μM larutan induk diencerkan dengan Pengenceran asam variasi dimaksudkan konsentrasi larutan direaksikan dengan asam Ninhydrin dan asam asetat glasial, kemudian larutan dimasukkan dalam kuvet dan dibaca Optical Density (OD) pada panjang gelombang 520 nm. Hasil absorbansi larutan standar dibuat persamaan regresi linier sehingga diperoleh persamaan : Y = ax + b. Nilai absorbansi sampel selanjutnya dimasukkan sebagai nilai Y sehingga didapatkan nilai x (μg/mol). sulfosalisilat 3%. untuk mendapatkan prolin. Selanjutnya Senyawa biokimia yang dihasilkan tanaman terhadap kekeringan dan sebagai berperan dalam penyesuaian osmotik bervariasi, antara lain gula, asam amino, dan senyawa terlarut yang kompatibel. Senyawa osmotik yang tanaman banyak dipelajari pada terhadap kekeringan antara lain prolin, asam absisat (ABA), protein dehidrin, total gula, pati, sorbitol, vitamin C, asam organik, aspargin, glisin- betain, serta superoksida dismutase dan K+ yang bertujuan untuk menurunkan potensial osmotik sel tanpa membatasi fungsi enzim. respons toleransi Tabel 2. Kadar prolin daun dan akar (μmol prolin/ g berat sampel) cabai merah besar dengan perlakuan interval penyiraman. = μmol prolin/ g berat segar sampel Pengukuran kadar klorofil : Daun ke-2 dan ke-3 tanaman cabai diambil pada bagian tengah tulang daun dihilangkan. Daun daun, ditimbang 0,1 g kemudian digerus dengan mortar dan dilarutkan dalam 10 ml aseton 80%. Ekstrak disaring dengan kertas saring Whatman no. 1. Larutan dimasukkan dalam tabung reaksi dan ditutup dengan alumunium foil. Selanjutnya larutan dimasukkan dalam kuvet dan Optical Density (OD) diukur pada panjang gelombang 646 dan 663 nm. Kadar klorofil dihitung dengan rumus : Klorofil a ibu = 12,21 (Abs 663) - 2,81 (Abs 646) mg/ liter Klorofil b = 20,13 (Abs 646) - 5,03 (Abs 663) mg/ liter Total klorofil = 17,3 (Abs 646) + 7,18 (Abs 663) mg/ liter Hasil perhitungan dari rumus tersebut kemudian dikonversi ke dalam satuan mg/ g dengan rumus : (1/ 100 x kadar total klorofil) / 0,1 mg/g. Kadar klorofil metode ditentukan spektrofotometri (Harborne, 1987). menurut Data kuantitatif dianalisis menggunakan analisis variansi CRD (Clompletelly Randomize Design). Kemudian dilanjutkan dengan uji DMRT (Duncan's Multiple Range Test) pada tingkat signifikansi 95% untuk menunjukkan pasangan Proses perlakuan yang berbeda nyata. Perlakuan (interval penyiraman) Kontrol (setiap hari) 3 hari sekali 5 hari sekali 7 hari sekali Kadar prolin daun 0.38a 0.40a 0.39a 0.40a Kadar prolin akar 0.36a 0.35a 0.36a 0.34a huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak ada beda nyata antar perlakuan Hasil pengukuran terhadap kadar prolin akar (Tabel 2.) menunjukkan bahwa semakin interval penyiraman, kadar prolin akar tinggi semakin menurun. Hal ini disebabkan prolin terakumulasi di daun, meskipun akar merupakan organ pertama yang mengalami cekaman kekeringan. Prolin berperan penting sebagai osmoregulator. Produk senyawa tersebut secara berlebihan dapat menghasilkan peningkatan toleransi terhadap cekaman kekeringan pada tanaman (Kishor et al. 1995; Marjorie et al. 2002 dalam Hapsoh et al., 2006). Metabolisme prolin pada tanaman cabai merah besar dalam kondisi cekaman kekeringan sebelumnya telah diteliti oleh Sayed (1992). Menurut Sayed (1992),terdapat dua enzim yang berperan penting dalam biosintesis prolin, yaitu prolin dehidrogenase dan prolin oksidase. Kedua enzim tersebut dihambat dalam kondisi cekaman; prolin oksidase lebih menghambat di akar daripada di daun. Hal ini berarti bahwa pada tanaman cabai, akumulasi prolin di akar lebih tinggi daripada di daun. 81
Mikrosporogenesis Cabai Merah Besar ... Utaminingsih, dkk. B. Kadar klorofil daun faktor yang mempengaruhi kadar klorofil suatu tanaman adalah ketersediaan air di sekitar sistem perakaran tanaman. Hasil pengamatan terhadap kadar klorofil menunjukkan bahwa secara keseluruhan kadar klorofil daun cabai merah besar semakin menurun seiring dengan kekeringan. Tanaman kontrol memiliki kadar klorofil tertinggi dibandingkan dengan tanaman yang diperlakukan dengan cekaman kekeringan. Salah satu peningkatan cekaman Menurut Fitter & Hay (1991), biosintesis protein dan klorofil sensitif terhadap cekaman kekeringan. Ketersediaan air di sekitar sistem tanaman mempengaruhi kelarutan perakaran unsur hara di tanah. Pada tanah yang kering, unsur hara cenderung dalam bentuk terikat sehingga sukar diserap oleh akar tanaman. Salah satu unsur yang diperlukan dalam pembentukan klorofil adalah Mg dan Fe. Kondisi tanah yang kering menyebabkan kedua unsur tersebut akan berada dalam bentuk terikat atau tidak tersedia bagi tanaman sehingga kadar klorofil rendah. Selain itu, dalam kondisi cekaman kekeringan, potensial air daun akan menurun, pembentukan klorofil daun akan terganggu dan struktur kloroplas akan mengalami disintegrasi. Kadar interval penyiraman klorofil pada berbagai disajikan pada Tabel 3. Tabel 3. Kadar klorofil a, klorofil b, dan klorofil total (mg/ g) daun cabai merah besar dengan perlakuan interval penyiraman. Perlakuan (interval penyiraman) Kontrol (setiap hari) 3 hari sekali 5 hari sekali 7 hari sekali Kadar klorofil a 1,43±0,024b 1,33±0,011a 1,34±0,035a 1,29±0,081a Kadar klorofil b 0,99±0,043a 0,86±0,018a 0,90±0,061a 0,79±0,078a Kadar klorofil total 2,42±0,066b 2,19±0,022a 2,24±0,095ab 2,08±0,16a C. Mikrosporogenesis Mikrosporogenesis merupakan proses pembentukan dan perkembangan mikrospora. Mikrosporogenesis diawali dengan pembentukan sel induk mikrospora yang berasal dari jaringan sporogen. Jaringan sporogen dapat berfungsi induk mikrospora atau langsung sebagai sel mengalami beberapa kali pembelahan mitosis sebelum mengalami meiosis. Sel induk mikrospora (sporosit) mengalami pembelahan meisosis, menghasilkan mikrospora yang bersifat haploid. Pada pembelahan meiosis ada dua tingkat pembelahan, yaitu meiosis I dan meiosis II (Bhojwani and Bhatnagar, 1974). Penampang melintang buah cabai yang berumur 7 HSA pada berbagai perlakuan disajikan pada Gambar terhadap mikrosporogenesis pada cabai merah besar (Gambar 2.) sesuai dengan yang dikemukaan oleh Lengel (1960) bahwa perkembangan polen induk cabai dimulai dari perkembangan sel mikrospora. Sel secara langsung merupakan diferensiasi dari sel sub hipodermal pada antera. Pada pembelahan meiosis pertama, tidak terbentuk dinding sel diantara anak inti, sedangkan pada pembelahan miosis kedua terbentuk 4 sel yang menghasilkan yang masing-masing tetrad mikrospora dipisahkan oleh eksin. Kemudian diikuti dengan pembesaran mikrospora, inti sel membelah dan menghasilkan dua inti yang tidak sama. 1. Hasil pengamatan induk mikrospora Gambar 1. Penampang melintang bunga cabai merah besar umur 7 HSA (Hari Sebelum Antesis) pada perlakuan interval penyiraman A. kontrol (setiap hari); B. 3 hari sekali; C. 5 hari sekali; D. 7 hari sekali. Keterangan gambar : an, antera; I,lobi. 82
Majalah Ilmiah Biologi Biosfera : A Scientific Journal DOI: 10.20884/1.mib.2019.36.2.866 Vol 36, No 2 Mei 2019 : 79 - 84 Gambar 3. Polen cabai merah besar. Keterangan : V. viabel, NV. Nonviabel. Gambar 2. Tahap-tahap mikrosporogensis cabai merah besar. A. sel induk mikrospora; B. meiosis sel induk mikrospora; C. tetrad mikrospora; D. mikrospora soliter; E. polen masak. Keterangan b. a. endotesium, c. lapisan tengah, d. tapetum, e. sel induk mikrospora, f. profase, g. metaphase, h. anaphase, i. telofase, j. tetrad mikrospora, k. mikrospora soliter, l. mikrospora masak dengan dinding tebal, inti polen, n. endotesium dengan m. penebalan dinding. : eksotesium, D. Viabilitas Polen Proses mikrosporogenesis diatur oleh banyak faktor yang meliputi faktor internal dan internal yang eksternal. Salah satu mempengaruhi adalah hormon tumbuhan yaitu auksin dan sitokinin. Adapun faktor eksternal yang mempengaruhi mikrosporogenesis yaitu temperatur, ketersediaan air, cahaya, dan unsur hara dalam tanah. Pengamatan terhadap viabilitas polen disajikan pada Tabel 4. dan Gambar 3. faktor mikrosporogenesis yang adalah mempengaruhi ketersediaan air. Ketersediaan air yang terbatas akan menyebabkan tanaman mengalami cekaman yang akan mempengaruhi pertumbuhan dan perkembangan. Nguyen (2008) telah meneliti perkembangan polen pada padi akibat cekaman kekeringan. Nguyen menyebutkan bahwa pada kondisi kekeringan, mikrospora akan mengalami aborsi yang diakibatkan oleh adanya programmed cell death (PCD). Cekaman kekeringan akan menginduksi terbentuknya hidrogen peroksida yang akan mempengaruhi DNA sel untuk mengaktifkan PCD. Selain itu, adanya oksidatif stress yang ditimbulkan oleh kondisi cekaman kekeringan menyebabkan kadar glukosa. Konsentrasi glukosa yang tinggi akan pada tapetum dan lokulus merupakan respon alami terhadap stress oksidatif dan meningkatkan tersebut Kondisi sel. tekanan menyebabkan tapetal swelling atau hipertrofi (abnormalitas tapetum/ membengkak). Kondisi tapetum yang abnormal berakibat pada sterilitas polen. Polen yang viabel terlihat berwarna biru dengan pewarna Tryphan blue. Pewarna ini akan bereaksi dengan kalosa. Kalosa merupakan karbohidrat yang menyusun dinding mikrospora (Stanley & Linskens, 1974). Salah satu faktor eksternal mikrosporogenesis tingginya turgor Tabel 4. Persentase viabilitas polen cabai merah besar dengan perlakuan interval penyiraman. Perlakuan (interval penyiraman) Kontrol (setiap hari) 3 hari sekali 5 hari sekali 7 hari sekali Viabilitas polen (%) 94,48±1,5a 84,65±1,8b 72,62±1,0c 53,71±1,9d Simpulan Tahap - tahap mikrosporogenesis pada tanaman yang mengalami cekaman kekeringan sama dengan tanaman yang tidak mengalami cekaman, lebih awal. Cekaman kekeringan menyebabkan terjadinya respons fisiologi berupa penurunan kadar prolin akar, penurunan kadar klorofil daun, serta penurunan viabilitas polen. tetapi waktunya berlangsung 83
Mikrosporogenesis Cabai Merah Besar ... Utaminingsih, dkk. Ucapan Terima Kasih Terima kasih disampaiakan kepada tim I- telah MHERE Fakultas Biologi UGM yang mendanai penelitian ini. Harborne, J. B., 1987. Metode Fitokimia : cara modern menganalisis penuntun tumbuhan. Diterjemahkan oleh : K. Padmawinata & I. Soediro. Cetakan ke-2. Penerbit ITB. Bandung, hal : 234 - 244. Daftar Referensi Badan Pusat Statistik, 2011. Luas Panen, Produksi dan Produktivitas Cabai 2009- 2010. Diterima 12 Januari 2012, dari : Bates, L.S., 1973. Rapid Determination of Free Proline for Water-Stress Studies. Plant and Soil 39: 205-207. Lengel, P. A., 1960. Development ot the Pollen and in Capsicum frutescens L. var. Japanese Variegated Ornamental. The Ohio Journal of Science, 60 : 8. the Embryo Sac Nguyen, G. N., 2008. Effect of Water Deficit on Pollen Development in Rice, Thesis for the degree of Doctor of Phylosophy. The University of Sydney. Bhojwani, S. S. & S. P. Bhatnagar, 1974. The Vikas Embryology Publishing House PVT LTD, New Delhi. 9- 27 pp. of Angiosperm. Erickson, A.N, & A. H. Markhart, 2002. Flower Developmental Stage and Organ Sensitivity of Bell Pepper (Capsicum annuum L.) to Elevated Temperature. Plant, cell and Environmen, 25 : 123-130. Fitter, A.H & R.K.M. Hay, 1991. Fisiologi Lingkungan Tanaman, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta. Ruzin, S. E., 1999. Plant Microtechnique and Microscopy. Oxford University Press, Inc. p: 61-65. Sayed, H. E. 1992. Proline Metabilosm During Water Stress in Sweet Pepper (Capsicum annuum L.) Plant. Phyton (Horn, Austria) Vol. 32 (2) : 255-261. Shao, H. B., Chu, L. Y., Jaleel, C. A., & Zhao, C. stress-induced X. 2008. Water-deficit anatomical changes in higher plants. Comptes rendus biologies, 331(3), 215- 225. Yahya, S., Oelim, T. M. H., & Purwoko, B. S. 2006. Respons fisiologi beberapa genotipe kedelai yang bersimbiosis dengan MVA cekaman terhadap kekeringan. of Biosciences, 13(2), 43-48. berbagai tingkat HAYATI Journal Stanley, R. G. & H. F. Linskens. 1974. Pollen: biology, biochemistry, and Management. Springer-Verlag Berlin Heidelberg. New York. p: 81. 84