ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রি

ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রি হলো ইমিউনোস্টেইনিং-এর একটি রূপ। এটি অ্যান্টিজেন শনাক্তকরণের একটি পদ্ধতি যেখানে অ্যান্টিবডি-এর নির্দিষ্ট অ্যান্টিজেন বন্ধন নীতির মাধ্যমে কোষ ও টিস্যুতে লক্ষ্য অণু চিহ্নিত করা হয়। অ্যালবার্ট হিউইট কুনস, আর্নেস্ট বার্লিনার, নরম্যান জোন্স ও হিউ জে ক্রিচ ১৯৪১ সালে সর্বপ্রথম ইমিউনোফ্লুরোসেন্স উন্নয়ন করেছিলেন। এটি পরবর্তীতে ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রির বিকাশে নেতৃত্ব দেয়।
ক্যান্সারাস টিউমারের মতো অস্বাভাবিক কোষ নির্ণয়ে ইমিউনোহিস্টোকেমিক্যাল স্টেইনিং ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়। কিছু ক্যান্সার কোষে নির্দিষ্ট টিউমার অ্যান্টিজেন প্রকাশিত হয় যা শনাক্ত করা সম্ভব করে। মৌলিক গবেষণাতেও এই পদ্ধতি ব্যবহৃত হয়, যেখানে জৈবিক টিস্যুর বিভিন্ন অংশে বায়োমার্কার ও প্রোটিনের বণ্টন বোঝা যায়।
ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রি প্যারাফিনে সংরক্ষিত বা ক্রায়োপ্রিজার্ভড (হিমায়িত) টিস্যুতে করা যায়। সংরক্ষণ পদ্ধতিভেদে প্রস্তুতির ধাপ ভিন্ন, তবে সাধারণ পদ্ধতিতে সঠিক ফিক্সেশন, অ্যান্টিজেন রিট্রিভাল, প্রাইমারি অ্যান্টিবডি ইনকিউবেশন ও সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি ইনকিউবেশন অন্তর্ভুক্ত।
টিস্যুর মরফোলজি রক্ষায় ফিক্সেশন অপরিহার্য। সাধারণত ১০% নিউট্রাল বাফার ফর্মালিন দ্রবণে ২৪ ঘণ্টা ফিক্স করা হয়। ফিক্সেটিভ ও টিস্যুর অনুপাত ১:১ থেকে ১:২০ পর্যন্ত হতে পারে। ফিক্সেশনের পর টিস্যু প্যারাফিন মোমে এমবেড করা হয়।
হিমায়িত সেকশনের ক্ষেত্রে সাধারণত সেকশন করার পর ফিক্সেশন করা হয়। এজন্য অ্যাসিটোন বা ফর্মালিন ব্যবহার করা যেতে পারে।
মাইক্রোটোম ব্যবহার করে টিস্যু সেকশন করা হয়। প্যারাফিন এমবেডেড টিস্যুর জন্য ৪ μm এবং হিমায়িত টিস্যুর জন্য ৪–৬ μm পুরুত্ব আদর্শ। সেকশনের পুরুত্ব গুরুত্বপূর্ণ; উদাহরণস্বরূপ, ৭ μm পুরুত্বের ব্রেইন টিস্যু সেকশনে ৪ μm সেকশনে অনুপস্থিত কাঠামো দেখা যেতে পারে। প্যারাফিন এমবেডেড টিস্যু ডিপ্যারাফিনাইজেশনের জন্য জাইলিন বা বিকল্প দ্রবণে চিকিত্সা করা হয়।
অ্যান্টিজেন রিট্রিভাল ফর্মালিন ফিক্সড টিস্যুতে অ্যান্টিজেনের প্রাপ্যতা বৃদ্ধি করে। ফিক্সেশনে তৈরি মিথাইলিন ব্রিজ বা অ্যামিনো গ্রুপের ক্রসলিঙ্কিং এপিটোপকে আড়াল করতে পারে। উচ্চ তাপমাত্রায় বাফার দ্রবণে স্লাইড গরম করে এই বাধা দূর করা যায়। মাইক্রোওয়েভ ওভেন, অটোক্লেভ বা ওয়াটার বাথ ব্যবহার করে এই প্রক্রিয়া করা হয়।
অনির্দিষ্ট অ্যান্টিবডি বন্ধন কমাতে নরম্যাল সেরাম বা ব্লকিং বাফার ব্যবহার করা হয়। হাইড্রোজেন পারঅক্সাইড দিয়ে টিস্যু চিকিত্সা করলে এন্ডোজেনাস এনজাইম কার্যকলাপ কমে।
নমুনা প্রস্তুত করার পর, ফ্লুরোসেন্ট যৌগ, ধাতু বা এনজাইম দ্বারা লেবেলকৃত অ্যান্টিবডি ব্যবহার করে টার্গেট ভিজ্যুয়ালাইজ করা যায়। লেবেলিংয়ের প্রত্যক্ষ ও পরোক্ষ পদ্ধতি বিদ্যমান।
শনাক্তকরণে পলিক্লোনাল বা মনোক্লোনাল অ্যান্টিবডি ব্যবহৃত হয়। পলিক্লোনাল অ্যান্টিবডি উৎপাদনের জন্য গিনিপিগ, খরগোশ, ইঁদুর বা ছাগলের মতো প্রাণীতে লক্ষ্য অ্যান্টিজেন ইনজেক্ট করে অনাক্রম্য প্রতিক্রিয়া সৃষ্টি করা হয়। প্রাণীর সিরাম থেকে অ্যান্টিবডি পৃথক করা যায়। এতে একাধিক এপিটোপ শনাক্তকারী অ্যান্টিবডির মিশ্রণ পাওয়া যায়। মনোক্লোনাল অ্যান্টিবডি উৎপাদনে প্রাণীর প্লীহা থেকে অ্যান্টিবডি উৎপাদনকারী বি কোষ পৃথক করে ক্যান্সার কোষ লাইনের সাথে ফিউজ করা হয়। ফলে একটি মাত্র এপিটোপের জন্য নির্দিষ্ট অ্যান্টিবডি তৈরি হয়।
প্রাইমারি অ্যান্টিবডি লক্ষ্য অ্যান্টিজেনের বিরুদ্ধে তৈরি করা হয় এবং সাধারণত আনকনজুগেটেড থাকে। সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি প্রাইমারি অ্যান্টিবডির ইমিউনোগ্লোবুলিনের বিরুদ্ধে তৈরি হয়। সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডিকে বায়োটিনের মতো লিংকার অণুর সাথে যুক্ত করা হয় বা সরাসরি রিপোর্টার অণু সংযুক্ত করা হয়।
প্রত্যক্ষ পদ্ধতিতে লেবেলযুক্ত একক অ্যান্টিবডি টিস্যুতে সরাসরি অ্যান্টিজেনের সাথে বিক্রিয়া করে। এই পদ্ধতি দ্রুত কিন্তু কম সংবেদনশীল।
পরোক্ষ পদ্ধতিতে প্রাইমারি অ্যান্টিবডি প্রথমে টার্গেটের সাথে বন্ধন তৈরি করে, তারপর সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি যোগ করা হয়। একাধিক সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি যুক্ত হওয়ায় সিগন্যাল অ্যামপ্লিফিকেশন ঘটে, ফলে সংবেদনশীলতা বৃদ্ধি পায়।
পরোক্ষ পদ্ধতির সুবিধা হলো কম সংখ্যক স্ট্যান্ডার্ড সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি প্রয়োজন। উদাহরণস্বরূপ, খরগোশ IgG-এর বিরুদ্ধে তৈরি সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি যেকোনো খরগোশ-উদ্ভূত প্রাইমারি অ্যান্টিবডির সাথে কাজ করবে। 
ক্রোমোজেনিক ও ফ্লুরোসেন্ট শনাক্তকরণে ভিন্ন রিপোর্টার অণু ব্যবহৃত হয়। ক্রোমোজেনিক পদ্ধতিতে হর্সরাডিশ পারঅক্সিডেজের মতো এনজাইম ব্যবহার করে ডায়ামিনোবেঞ্জিডিনের মাধ্যমে রঙ উৎপন্ন করা হয়। সাধারণ আলোক মাইক্রোস্কোপে এই রঙ বিশ্লেষণযোগ্য।
ইমিউনোফ্লুরোসেন্সে ফ্লুরোসেইন আইসোথায়োসায়ানেট বা সায়ানিন৫-এর মতো ফ্লুরোফোর ব্যবহার করা হয়। ফ্লুরোক্রোমগুলি ফ্লুরোসেন্স বা কনফোকাল মাইক্রোস্কোপে পর্যবেক্ষণ করা যায়।
প্রাথমিক স্টেইনিংয়ের পর টিস্যুর মরফোলজি স্পষ্ট করতে কাউন্টারস্টেইন প্রয়োগ করা হয়। হিমাটক্সিলিন সর্বাধিক ব্যবহৃত কাউন্টারস্টেইন।
ব্যাকগ্রাউন্ড স্টেইনিং, দুর্বল লক্ষ্য শনাক্তকরণ বা আর্টিফ্যাক্টের সমস্যা এড়াতে অ্যান্টিবডির গুণমান ও প্রোটোকল অপ্টিমাইজ করা প্রয়োজন। এন্ডোজেনাস বায়োটিন বা অ্যান্টিবডি ক্রস-রিঅ্যাক্টিভিটি সাধারণ কারণ। দুর্বল ফিক্সেশন বা নিম্ন অ্যান্টিজেন মাত্রাও সমস্যা সৃষ্টি করতে পারে।
সমাধানের জন্য অ্যান্টিব�ি ডাইলিউশন, ইনকিউবেশন সময় পরিবর্তন বা বিকল্প শনাক্তকরণ পদ্ধতি ব্যবহার করা যেতে পারে।
ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রি একটি উৎকৃষ্ট শনাক্তকরণ কৌশল যা টিস্যুতে নির্দিষ্ট প্রোটিনের সঠিক অবস্থান প্রদর্শন করতে সক্ষম। এটি টিস্যু পরীক্ষার একটি কার্যকর পদ্ধতি। স্নায়ুবিজ্ঞানে এই কৌশল ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়, বিশেষ করে মস্তিষ্কের নির্দিষ্ট কাঠামোতে প্রোটিন এক্সপ্রেশন অধ্যয়নের জন্য। তবে ইমিউনোব্লটিং পদ্ধতির মতো আণবিক ভর ল্যাডারের বিপরীতে স্টেইনিংয়ের সঙ্গতি প্রমাণ করা সম্ভব নয়। এজন্য প্রাইমারি অ্যান্টিবডিগুলোকে ওয়েস্টার্ন ব্লট বা সমতুল্য পদ্ধতিতে যাচাই করা আবশ্যক।
রোগনির্ণয়মূলক সার্জিক্যাল প্যাথলজিতে ইমিউনোহিস্টোকেমিক্যাল মার্কারের বৈচিত্র্য উল্লেখযোগ্য। তৃতীয় পর্যায়ের হাসপাতালের পরীক্ষাগারগুলোতে ২০০টিরও বেশি অ্যান্টিবডি ব্যবহৃত হয়। উল্লেখযোগ্য মার্কারগুলির উদাহরণ:
ক্যান্সারে বিভিন্ন আণবিক পথ পরিবর্তিত হয়, যার কিছুকে ক্যান্সার থেরাপিতে লক্ষ্যবস্তু করা যায়। আণবিক লক্ষ্যের উপস্থিতি বা মাত্রা শনাক্ত করে ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রির মাধ্যমে কোন টিউমার থেরাপিতে সাড়া দেবে তা মূল্যায়ন করা যায়।
টিউমার জীববিজ্ঞানে একাধিক অন্তঃকোষীয় লক্ষ্যবস্তু বিদ্যমান। অনেক টিউমার হরমোন-নির্ভর। হরমোন রিসেপ্টরের উপস্থিতি দ্বারা অ্যান্টিহরমোন থেরাপির প্রতি টিউমারের সংবেদনশীলতা নির্ধারণ করা যায়। স্তন ক্যান্সার চিকিৎসায় ব্যবহৃত অ্যান্টিএস্ট্রোজেন ট্যামোক্সিফেন ছিল প্রথম থেরাপিগুলির একটি।
ইমাটিনিব, একটি অন্তঃকোষীয় টাইরোসিন কিনেজ প্রতিবন্ধক, ক্রনিক মায়েলোজেনাস লিউকেমিয়া চিকিৎসার জন্য তৈরি করা হয়েছিল।
প্যাথলজিক্যাল অবস্থায় অতিসক্রিয় প্রোটিনগুলি মনোক্লোনাল অ্যান্টিবডি থেরাপির লক্ষ্যবস্তু হতে পারে। কোষ পৃষ্ঠের লক্ষ্যগুলির বিরুদ্ধে এই অ্যান্টিবডিগুলি ব্যবহৃত হয়। EGFR পরিবারের সদস্যরা ট্রান্সমেমব্রেন প্রোটিন হিসাবে অন্তঃকোষীয় টাইরোসিন কিনেজ নিয়ন্ত্রণ করে। HER2/neu (Erb-B2) স্তন ক্যান্সারে অতিসক্রিয় হয়। এফডিএ-অনুমোদিত "হারসেপ্টিন" এই লক্ষ্যে কাজ করে।
এপিডার্মাল গ্রোথ ফ্যাক্টর রিসেপ্টর (HER-1) মাথা-ঘাড় ও কোলন ক্যান্সারে অতিসক্রিয় হতে পারে। 
ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রি দ্বারা সাধারণ প্রোটিন প্রোফাইলিং সম্ভব, যদি ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রির জন্য বৈধ অ্যান্টিবডি উপলব্ধ থাকে। হিউম্যান প্রোটিন অ্যাটলাস স্বাস্থ্যকর মানব অঙ্গ ও টিস্যুতে প্রোটিনের অভিব্যক্তি প্রদর্শন করে। টিস্যু মাইক্রোঅ্যারে ও ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রির সমন্বয়ে বিভিন্ন টিস্যু প্রকারে প্রোটিন অভিব্যক্তির প্যাটার্ন নির্ণয় করা যায়। মানবদেহের সাধারণ ক্যান্সারগুলিতে প্রোটিন প্রোফাইলিংয়েও এই পদ্ধতি ব্যবহৃত হয়।