Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram atau pewarna Gram, juga dikenali sebagai kaedah Gram, merupakan satu kaedah pewarnaan yang digunakan untuk membezakan spesies bakteria kepada dua kumpulan terbesar (gram positif dan gram negatif). Nama kaedah ini berasal dari seorang pakar bakteriologi Denmark yang membangunkan teknik ini, iaitu Hans Christian Gram.

Pewarnaan gram membezakan bakteria melalui sifat kimia dan fizikal dinding sel bakteria melalui pengesanan peptidoglikan, yang wujud dalam dinding sel untuk bakteria bergram positif.  Bakteria gram positif mengekalkan pewarna kristal ungu, yang menyebabkan bakteria itu berwarna ungu lembayung, tetapi berlaku sebaliknya bagi bakteria gram negatif. Selepas dibasuhkan, pewarna balas ditambahkan (kebiasaannya safranin atau karbol fuksin) yang akan mewarnakan bakteria gram negatif menjadi merah jambu. Perlu diingatkan bahawa kedua-dua bakteria gram positif dan negatif meresap pewarna balas. Namun, pewarna balas tidak kelihatan pada bakteria gram positif kerana warna kristal ungu yang lebih gelap menutup warna merah jambu itu.

Pewarnaan Gram hampir setiap kali dijadikan sebagai langkah pertama untuk identifikasi awal bagi sesuatu bakteria. Walaupun pewarnaan Gram adalah alat diagnostik yang berharga di dalam persekitaran klinikal dan penyelidikan, tidak semua bakteria boleh diklasifikasikan menggunakan teknik ini secara muktamad.

Sejarah
Kaedah ini dinamakan sempena seorang ahli sains Denmark, Hans Christian Gram (1853–1938), yang menghasilkan teknik ini apabila bekerja dengan Carl Friedländer di rumah mayat sebuah hospital bandar di Berlin pada tahun 1884. Gram mencipta teknik beliau bukannya bertujuan untuk membezakan satu jenis bakteria dari yang lain, tetapi hanya untuk membuat bakteria lebih kelihatan dalam keratan tisu paru-paru yang berwarna. Beliau menerbitkan kaedah beliau pada tahun 1884, dan dimasukkan ke dalam laporan singkatnya dengan pemerhatian bahawa basilus tifus tidak berupaya mengekalkan pewarna.

Kegunaan
Pewarnaan Gram merupakan satu teknik makmal bakteriologi yang digunakan untuk membezakan spesies bakteria kepada dua kumpulan besar (gram positif dan gram negatif) berdasarkan ciri-ciri yang ditunjukkan oleh dinding sel. Pewarnaan gram tidak digunakan untuk mengklasifikasi arkea, dulu dikenali sebagai arkeabakteria, kerana organisma tersebut menghasilkan pelbagai respons yang jauh berbeza dan tidak mengikuti kumpulan-kumpulan filogenetiknya.

Pewarnaan Gram ini bukanlah alatan yang sempurna untuk diagnosis, pengecaman, mahupun penentuan filogenik, malahan ianya mempunyai penggunaan yang sangat terhad dalam mikrobiologi persekitaran Ia digunakan secara utamanya untuk membuat pengenalan awal morfologi atau untuk menentukan bahawa terdapatnya sebilangan besar bakteria di dalam spesimen klinikal. Ia tidak dapat mengenal pasti bakteria ke peringkat spesies, dan dalam kebanyakan situasi perubatan, ia tidak boleh digunakan sebagai kaedah tunggal untuk mengidentifikasi bakteria. Di makmal mikrobiologi klinikal, ia digunakan dalam kombinasi dengan teknik-teknik tradisional dan molekul yang lain untuk mengenal pasti bakteria. Sesetengah organisma adalah gram-ubah (bermakna mereka mungkin menyerap warna sama ada negatif atau positif); ada yang tidak berwarna dan tidak kelihatan dengan apa jua pewarna yang digunakan dalam teknik Gram. Dalam makmal mikrobiologi alam sekitar atau makmal molekul moden, kebanyakan identifikasi dilakukan dengan menggunakan turutan genetik dan teknik molekul lain, yang jauh lebih spesifik dan bermaklumat daripada pewarnaan pembezaan.

Pewarnaan Gram telah dicadangkan sebagai alat diagnostik yang efisen setanding dengan PCR dalam sebuah laporan kajian utama berhubungan uretritis gonokokal.

Mekanisme pewarnaan
Bakteria gram positif mempunyai dinding sel berbentuk jaringan halus yang tebal dan diperbuat daripada peptidoglikan (50–60% daripada lapisan yang membungkus sel), dan hasilnya dinding ini diwarnakan ungu oleh kristal ungu, manakala bakteria gram negatif mempunyai lapisan yang jauh lebih nipis (hanya sebanyak 10% daripada lapisan yang membungkus sel), maka tidak dapat mengekalkan warna ungu sebaliknya diwarnabalik dengan safranin. 
Terdapat empat langkah asas untuk pewarnaan Gram:
Mengenakan pewarna pertama (kristal ungu) pada lumuran atau apusan lekat haba bagi suatu kultur bakteria. Fiksasi haba membunuh sebahagian bakteria tapi kebanyakannya digunakan untuk melekatkan bakteria pada slaid supaya bakteria tidak dibasuh keluar sewaktu proses pewarnaan.
Penambahan iodida, yang mengikat pada kristal ungu dan mengurung kristal ungu dalam sel
Penyahwarnaan pantas dengan etanol or aseton
Mewarnabalas kembali dengan safranin. Karbol fuksin kadangkala digantikan dengan safranin kerana ia jauh lebih mudah untuk mewarnakan bakteria anaerob, tetapi jarang digunakan sebagai pewarna balas.

Kristal ungu (CV) berpisah dalam larutan akueus kepada ion-ion  dan klorida (). Ion-ion ini akan menembusi dinding sel dan membran sel bagi kedua-dua sel gram positif dan gram negatif. Ion  berinteraksi dengan komponen bercas negatif dalam sel bakteria lalu mewarnakan sel kepada ungu.

Ion iodida ( atau ) akan berinteraksi dengan  dan membentuk kompleks besar kristal ungu dan iodin (CV–I) dalam dan luar lapisan sel. Iodin seringkali merujuk kepada mordan, tetapi merupakan agen perangkap yang mengelakkan penyingkiran kompleks CV–I dan, oleh itu, mewarnakan sel.

Apabila penyahwarna seperti alkohol atau aseton ditambah, ia akan berinteraksi dengan lipid-lipid pada membran sel. Sel bergram negatif akan menghilangkan membran luaran lipopolisakarida, dan lapisan dalaman peptidoglikan didedahkan. Kebanyakan kompleks CV–I telah dibasuh keluar dari sel bergram negatif bersama-sama membran luarannya. Secara jelas perbezaannya, sel bergram negatif dinyahhidratkan selepas pembasuhan dengan etanol. Kompleks besar CV–I terperangkap dalam sel bergram positif disebabkan sifat semulajadi peptidoglikan yang berlapis-lapisan. Langkah penyahwarnaan adalah merupakan langkah yang sangat genting dan mesti dikira masanya dengan tepat; pewarna kristal ungu akan dibuang dari kedua-dua sel bergram positif dan negatif sekiranya agen penyahwarnaan dibiarkan terlampau lama (hanya dalam beberapa saat sahaja).

Selepas penyahwarnaan, sel bergram positif masih kekal warna ungunya manakala sel bergram negatif akan kehilangan warna ungunya. Pewarna balas, yang selalunya safranin atau fuksin asas yang bercas positif, akhir sekali akan dikenakan kepada apusan untuk memberikan bakteria bergram negatif warna merah atau merah jambu.

Lihat juga
Mikrobiologi
Bakteria

Rujukan

Pautan Luar

Video kaedah pewarnaan Gram

Bacteriologi
Pewarnaan
Kaedah mikroskopi