Isabel dari Asturias

Pada tahun yang sama dengan pernikahan keduanya, Isabel menjadi Putri Asturias dan pewaris kerajaan Takhta Kastila menyusul kematian mendadak satu-satunya saudara laki-lakinya, Juan, Pangeran Asturias, pada bulan September 1497, dan kelahiran mati putrinya. Segera Philipp, suami adinda Isabel, Juana dari Kastila, menuntut mahkota, walaupun Isabel, sebagai putri sulung pewaris mahkota. Monarki Katolik, untuk melawan pretensi dari menantu laki-laki mereka Philipp, mengadakan pengadilan di kota Toledo pada tahun 1498 beberapa bulan setelah kematian putra mereka João dan membuat Isabel dan suaminya Manuel bersumpah sebagai ahli waris yang sah dari Takhta Spanyol. Keluarga kerajaan kemudian pergi ke Zaragoza untuk menyelenggarakan istana-istana Aragon untuk tujuan yang sama. Meskipun suksesi perempuan diizinkan di Kastila, kerajaan Aragon dari Ferrando II ragu-ragu untuk menerima seorang wanita sebagai penguasa masa depan mereka. Jika dia melahirkan seorang anak laki-laki, maka anak itu bisa mewarisi segalanya, sesuatu yang lebih disukai daripada wanita.