Kromatografi lapisan tipis

Senyawa yang berbeda dalam campuran sampel bergerak dengan laju yang berbeda karena perbedaan gaya tariknya pada fasa diam serta perbedaan kelarutannya dalam eluen. Dengan mengganti pelarut, atau mungkin menggunakan suatu campuran, pemisahan komponen (diukur berdasarkan nilai Rf) dapat diatur. Selain itu, pemisahan yang diperoleh dengan pelat KLT dapat digunakan untuk memperkirakan pemisahan kromatografi kolom cepat ("flash chromatography").
Pemisahan senyawa terjadi berdasarkan kompetisi pengikatan solut dan solven pada fasa diam. Misalnya, jika digunakan silika gel fasa normal sebagai fasa diam, maka fasa diam bersifat polar. Jika dua senyawa yang berbeda kepolarannya melintas, maka senyawa yang lebih polar akan memiliki interaksi dengan silika gel lebih kuat daripada yang lainnya. Oleh karena itu, lebih mudah menghilangkan fasa gerak dari tempat terikatnya. Sebagai konsekuensi, senyawa yang kurang polar akan bergerak lebih tinggi pada pelat (menghasilkan nilai Rf yang lebih besar). Jika fasa gerak diganti dengan pelarut atau campuran pelarut yang lebih polar, maka lebih mudah untuk melepaskan solut dari ikatan silikanya, dan semua senyawa pada pelat KLT akan bergerak lebih tinggi pada pelat. Umum dikatakan bahwa pelarut (eluen) "kuat" mendorong analit lebih tinggi daripada eluan "lemah. Urutan kekuatan eluan bergantung pada lapisan tipis (fasa diam) pada pelat KLT. Untuk pelat KLT dengan lapisan silika gel, kekuatan eluen meningkat sesuai urutan berikut: perfluoroalkana (paling lemah), heksana, pentana, karbon tetraklorida, benzena/toluena, diklorometana, dietil eter, etil asetat, asetonitril, aseton, 2-propanol/n-butanol, air, metanol, trietilamina, asam asetat, asam format (paling kuat). Pelat lapisan tipis C adalah fasa terbalik. Artinya bahwa jika campuran etil asetat dan heksana digunakan sebagai fasa gerak, penambahan etil asetat menghasilkan nilai R"" yang lebih tinggi untuk semua senyawa pada pelat KLT. Mengubah polaritas fasa gerak tidak akan menghasilkan urutan kebalikan R"" senyawa pada pelat KLT. Seri eluotropik dapat digunakan sebagai pandauan pemilihan fasa gerak. Jika dilakukan sistem fasa terbalik pada senyawa yang diinginkan, harus digunakan fasa diam apolar seperti silika bergugus fungsi C.