Yapışkan uçların bağlanmasını gösteren bir çizim
**Bağlama** veya **ligasyon**, rekombinant DNA teknolojisinde klonlanacak geni taşıyan DNA parçaları ile vektörün bir enzim aracığılıyla birbirlerine bağlanması işlemine denir. Bu işlem için ligaz cinsi enzimler görev yapar. Örneğin, DNA Ligaz enzimi 1970'li yıllarda I. Robert Lehman ve ekibi tarafından saflaştırılmış ve karakterize edilmiştir.

DNA ligazları, tüm organizmalarda DNA’nın onarımı ve kopyalanması için önemlidir. Lehman ve ekibi tarafından yapılan çalışmalarda, DNA ligazlarının hücre içindeki birçok temel reaksiyonda kullanıldığı sonucuna varılmıştır. DNA ligazları; Okazaki fragmanlarının birleştirilmesinde, DNA'nın nükleotid ve baz eksizyon onarımı sırasında, DNA zincirlerinin ve DNA segmentlerinin birleştirilmesinde rol almaktır. Tüm organizmalarda bulunmalarına rağmen, DNA ligazları çok çeşitli amino asit dizileri, moleküler boyutlar ve özellikler gösterir. DNA ligazları, ligaz-adenilat oluşumu için gerekli substrata göre ATP'ye bağımlı ligazlar ve NAD+'ya bağımlı ligazlar olarak iki gruba ayrılmaktadır. Bilinen tüm ökaryotik hücresel DNA ligazları ATP'ye bağımlı olup, NAD+ gerekli DNA ligazları yalnızca prokaryotik organizmalarda bulunmuştur.

DNA Ligaz türleri
-----------------

### E.coli DNA ligazları

E. coli DNA ligazı, 671 amino asitten oluşan ve *ligA* tarafından kodlanan temel bir enzimdir. Çoğu prokaryotta olduğu gibi E. coli'deki DNA ligaz da, fosfodiester bağı oluşturmak için Nikotinamid Adenin Dinükleotit’in (NAD) parçalanmasından elde edilen enerjiyi kullanır. E. coli DNA ligazı, yapışkan uçlu DNA'daki iki bitişik DNA ipliğinin 5'-fosfat ve 3'-hidroksil arasında bir fosfodiester bağının oluşumunu katalize eder. Küt uçlu yüzeylerde çok fazla aktif değildir. E. coli DNA Ligaz, NAD'yi bir kofaktör olarak kullanır. E. coli DNA Ligazı, çeşitli sıcaklıklarda (4 °C – 37 °C) aktiftir ve böylece ısıyla aktivasyonu bloklanabilir.

### Bakteriofaj T4 DNA ligazları

Bakteriyofaj T4 DNA ligaz, moleküler biyoloji alanında rekombinant DNA moleküllerinin yapım sürecinde en yaygın olarak kullanılan ligaz türüdür. Genellikle bitişik nükleotitlerin 5'-fosfat ve 3'-hidroksil grupları arasında iki DNA sarmalının tamamlayıcı kohezif veya küt uçlara sahip DNA fragmanlarını birleştirebilir ve bir kofaktör olarak ATP’ye ihtiyaç duyar; NAD’a bağımlı değildir. In vivo, T4 DNA Ligaz, çift sarmallı DNA moleküllerindeki tek sarmallı çentiklerin sızdırmazlığını katalize eder. Enzim ayrıca, RNA'nın bir dubleks molekülde bir DNA veya RNA zincirine bağlanmasını da katalize eder ancak tek sarmallı nükleik asitleri bağlayamaz. T4 DNA ligaz inkübasyonu için en uygun sıcaklık ise 16 °C'dir.

### Termostabil DNA ligazları

Termostabil DNA Ligaz, çift sarmal DNA yapılarında bitişik 3'-hidroksil ve 5'-fosfat uçlarının NAD'ye bağlı ligasyonunu katalize eder. Termofilik bir bakteriden türetilen Ampligase DNA Ligaz, geleneksel DNA ligazlarından çok daha yüksek sıcaklıklarda stabil ve aktiftir.

### Memeli DNA Ligazları

Memeli DNA ligazları, mRNA kapatma enzimlerini ve RNA ligazlarını da içeren nükleotidil transferaz ailesinin üyeleridir. İnsan hücrelerinde DNA ligazları LIG1 , LIG3 ve LIG4 olmak üzere üç gen tarafından kodlanır. Bu ligazlar; DNA ligaz I, DNA ligaz III ve DNA ligaz IV şeklinde adlandırılmıştır. Memeli DNA ligazları ATP'yi kofaktör olarak kullanırlar. DNA ligaz-adenilat ara ürününün oluşumu sırasında açık bir oluşumda düzenlenirken, tek sarmal çentiklerde meydana gelebilecek bitişik 3' hidroksil ve 5' fosfat uçlarıyla birleştiklerinde bir C-kelepçe yapısını benimserler.

1. DNA ligazı I yalnızca çekirdekte işlev görür. Ligaz I, klasik bir nükleer lokalizasyon sinyaline sahiptir. Memeli DNA ligaz I, E. coli ve T4 DNA ligazları gibi belirgin asimetrik bir yapıya sahiptir.
2. DNA ligaz III hem çekirdekte hem de mitokondride işlev görür. DNA ligaz III, DNA'daki tek sarmal kırılmalarını verimli bir şekilde onarır, ancak küt uçlu birleştirme veya aşırı sarmal DNA'nın AMP'ye bağlı gevşemesini gerçekleştiremez.
3. DNA ligaz IV de tıpkı DNA ligaz I gibi yalnızca çekirdekte işlev görür. DNA ligaz IV, DNA çift sarmallı kırılmaları onarmak için gerekli olan, homolog olmayan uç birleştirme mekanizmasının bir parçasıdır.

* DNA ligaz II, DNA ligaz III'ün proteolitik bozunmasıyla ortaya çıkan bir saflaştırma ürünüdür. DNA ligaz II, hücre çekirdeği ile sıkı bir şekilde ilişkilidir ve sadece tuz içeren tamponlar tarafından çözünür forma getirilir. DNA ligaz II genellikle memeli hücrelerinde ve dokularında DNA ligaz I’e kıyasla daha düşük bir aktivitasyon gösterir.

Uçların bağlanma yöntemleri
---------------------------

Bazen, vektörün yabancı DNA'ya bağlanması yerine kendi uçlarının birleşip halka şeklini kazanır. Bu sebeple, bağlama için uygun uçların bulunması ya da oluşturulması gerekir. Bu işlem değişik yollarla  gerçekleştirilebilir:

### Yapışkan Uçların Bağlanması

DNA parçalarının aynı cins enzimle kesilmiş olanları ve vektör bir araya getirildiğinde, kökenleri farklı olsa bile birbirlerini tamamlayıcı özellikteki yapışkan uçlara sahip olduklarından uçlar arasındaki baz eşleşmeleri ile moleküller bağlanır. Ardından, ligaz enzimi nükleotidler arasında fosfodiester bağları oluşturarak açık uçları kapatır. Bu, rDNA elde etmek için kullanılan basit ve etkili bir yöntemdir.

### Bağlayıcı ya da Aracı Moleküller Kullanarak Bağlanma

Küt uçların bağlanmasında kullanılan bu yöntemde, aracı olarak yapay bağlayıcı moleküller kullanılmaktadır. Bu sentetik aracı moleküller 6-10 baz çiftinden oluşur ve bunlar oligonükleotidler. Oligonükleotidler, 5' uçları polinükleotid kinaz ile fosforlanma sonrası T4 DNA ligaz yardımıyla küt uçlara bağlanır ve bir  restriksiyon enzimi yardımıyla yapışkan uçlar oluşturulur. Bu şekilde oluşturulmuş diğer bir taşıyıcıya bağlanma ve aralıkların ligaz ile kapanmasıyla bağlanma işlemi tamamlanır.

### Homopolimerik Tek Zincirli Kuyruklar Kullanarak Bağlanma

Bu yöntemle de, bağlayıcı ya da aracı moleküller kullanarak bağlanmada olduğu gibi küt uçların bağlanması için kullanılır. Küt uçların 3' uçlarına terminal transferaz enzimi aracılığıyla homopolimerik tek zincirli kuyruklar eklenir. Bu yöntem, çoğunlukla ökaryotik genlerin replikasyonunda kullanılır.

Ligasyon (Bağlama) Reaksiyonu
-----------------------------

DNA ligasyonu, birçok moleküler biyoloji ve rekombinant DNA uygulamaları için kritik bir adımdır. DNA Ligasyonu, iki DNA molekülünün DNA ligaz yoluyla birleştirilmesidir. DNA ligaz, ATP'ye bağlı bir reaksiyonda bir nükleotidin 3' hidroksil grubu ile diğerinin 5' fosfat grubu arasında iki kovalent fosfodiester bağının oluşumunu katalize eder.

### 3' hidroksil ve 5' fosfatı arasında bir fosfodiester bağının oluşumu üç aşamada olur

1. İlk olarak ligaz, serbest ATP ile reaksiyona girerek kendi kendine adenillenir.
2. Daha sonra adenil grubu, "verici" sarmalın 5'-fosforile edilmiş ucuna aktarılır.
3. Son olarak, fosfodiester bağının oluşumu, adenillenmiş verici ucunun bitişik 3' hidroksil akseptörü ile reaksiyonundan ve AMP'nin salınmasından sonra ilerler.

Ligasyon reaksiyonunun kendisini kurmadan önce, ligasyon reaksiyonu için kullanılacak kesici uç ve vektör miktarını belirlemek önemlidir.

* "Yapışkan uçlar" olarak adlandırılan çıkıntılar, vektörün ve ekin birbirine bağlanmasına izin verir. Yapışkan uçta, molekülün her ipliği farklı pozisyonda kesilmiştir. Yapışkan uçlar uyumlu olduğu zaman iki DNA parçası birbirine bağlanabilir ve sonunda ligasyon reaksiyonu ile kaynaşır. Birbirleri ile H bağı yaparak enzim için uygun kararlı yapıyı oluşturmaları sebebiyle yapışkan uçların ligasyon verimi oldukça yüksektir.
* Küt uçta; molekülün her iki ipliği de aynı noktadan kesilmiş olup, uçları düz ve nükleotidlerin her biri eşlenmiştir. Küt uçların ise ligasyonu daha zorlayıcıdır. Çünkü DNA ligazın doğru molekülü yakalaması zor olur. Küt uçla ligasyon, yüksek DNA yoğunluğunda gerçekleştirilirse, doğru birleşme şansı arttırılır. İki küt ucun bir araya getirildiği laboratuvar deneyleri çok verimli değildir. Çünkü ligaz, yapıştırılacak olan molekülü tutamamaktadır. Bu nedenle küt uç ligasyonu, yüksek DNA yoğunluğunda gerçekleştirilmelidir.

Ligasyonu Etkileyen Faktörler
-----------------------------

### Sıcaklık

Bir ligasyon reaksiyonunun sıcaklığını ayarlarken  iki nokta dikkate alınmalıdır. Bunlardan biri DNA ligaz enziminin optimum aktivite sıcaklığı olan 37 °C, diğeri ise  DNA'nın erime sıcaklığı olan Tm’dir. Tm ligasyona son verir. DNA'nın baz bileşimi ve uzunluğu, erime sıcaklığını belirler. Baz bileşimi, hidrojen bağları nedeniyle Tm'yi arttırır. G-C baz çifti üç hidrojen bağı, A-T baz çiftleri ise iki hidrojen bağı içerir. Yapılan bağ sayısı arttıkça erime noktası yükselir. Bir ligasyon reaksiyonunun etkinliği, DNA sarmalının uçlarının kararlı bir şekilde birleşmesi için gerekir. Genel olarak ligasyon deneylerinde Tm, 37 °C'den çok daha düşüktür. Bununla birlikte, farklı restriksiyon enzimleri farklı uçlar üretir ve bu enzimler tarafından üretilen uçların baz bileşimi de farklı olabilir. Erime sıcaklığı ve dolayısıyla optimum sıcaklık, kullanılan restriksiyon enzimlerine bağlı olarak büyük ölçüde değişebilir ve ligasyon için optimum sıcaklık değişebilir.

### DNA Konsantrasyonu

Ligasyon karışımındaki genel DNA konsantrasyonu, reaksiyonun verimliliği üzerinde önemli bir etkiye sahiptir. Eğer bir ligasyon reaksiyonunda DNA konsantrasyonu yüksekse, bir DNA molekülünün bir ucunun başka bir DNA'nın ucuyla denk gelme ve böylece moleküller arası bir ligasyon oluşturma ihtimali daha yüksek olacaktır. Yani, konsantrasyon çok düşükse, ekleme fragmanı ile bir vektör fragmanı arasındaki ilk temasa daha az rastlanacaktır ve çok az bozulmamış plazmit ile sonuçlanacaktır. Konsantrasyon çok yüksekse, parçalar daha sık çarpışır ve birçok parçadan oluşan uzun moleküller oluşur. Genel bir kural olarak, toplam DNA konsantrasyonu 10 μg/ml'den az olmalıdır.

### Ligaz Konsantrasyonu

Ligaz konsantrasyonu, ligasyon hızı ile doğru orantılıdır. Küt uçlu ligasyonun etkinliği her zaman yapışkan uç ligasyonundan çok daha az verimli olduğundan küt uçlu ligasyonlar için daha yüksek bir ligaz konsantrasyonu kullanılmalıdır. Yüksek DNA ligaz konsantrasyonu, daha hızlı bir ligasyon için PEG ile birlikte kullanılabilir.

### Tampon Bileşimi

Tamponun iyonik gücü ligasyonu etkileyebilir. Mevcut katyonlar da ligasyon reaksiyonunu etkileyebilir. Örneğin Na+ miktarının fazla olması DNA'nın daha katı hale gelmesine neden olur. Bu, moleküller arası ligasyon olasılığını artırır. Yüksek tek değerlikli katyon konsantrasyonu (>200 mM) ligasyonu neredeyse tamamen engeller. Ligasyon için kullanılan standart tampon, iyonik etkileri en aza indirecek şekilde tasarlanacaktır.

Diğer Ligasyon Metotları
------------------------

Ticari amaç güden DNA klonlama kitleri, var olan DNA ligazlarının kullanımını gerektirmeyen diğer ligasyon yöntemlerini kullanır. Bu yöntemler, klonlamanın çok daha hızlı yapılmasına izin vermekle birlikte, klonlanmış DNA ekinin farklı vektörlere daha basit bir şekilde aktarılmasına olanak sağlar.

### Topoizomeraz Aracılı Ligasyon

TOPO klonlama, hem restriksiyon enzimi hem de ligaz olarak işlev gören DNA topoizomeraz I enzimi içerir. Biyolojik rolü, replikasyon sırasında DNA'yı hem parçalamak, hem de yeniden birleştirmektir. Vaccinia virüsü topoizomeraz I spesifik olarak 5'-(C/T)CCTT-3' pentamerik dizisini tanır ve 3' timidinine bağlı fosfat grubu ile kovalent bir bağ oluşturur. Bir DNA zincirini ayırarak DNA'nın gevşemesini sağlar. Enzim daha sonra bölünmüş sarmalın uçlarını taşır ve kendisini DNA'dan serbest bırakır. Topoizomerazın yeniden bağlanma aktivitesinden yararlanmak için TOPO vektörleri, her 3' fosfata kovalent olarak bağlı topoizomeraz I ile lineerleştirilmiş olarak sağlanır. Bu, vektörlerin DNA dizilerini uyumlu uçlarla kolayca bağlamasını sağlar. Ligasyon oda sıcaklığında sadece 5 dakikada tamamlanır.

### Homolog Rekombinasyon

Faj lambdanın iyi karakterize edilmiş sahaya özel rekombinasyon sistemine dayanan Gateway® teknolojisi, yönlendirmeyi ve okuma çerçevesini korurken DNA segmentlerinin yüksek verimli bir şekilde farklı ifade platformları arasında klonlanmasına, ilgilenilen parçanın veya parçaların birleştirilmesine ve aktarılmasına izin verir. Invitrogen Gateway rekombinasyon klonlaması; restriksiyon enzimleri, ligaz, alt klonlama adımları veya sayısız koloninin taranması olmaksızın bir saatlik tersinir rekombinasyon reaksiyonunu kullanır ve böylece zamandan, paradan ve emekten tasarruf etmeyi sağlar.

Ayrıca bakınız
--------------

* Rekombinant DNA teknolojisi
* Ligaz

Kaynakça
--------

1. ↑  "Insights into DNA Joining: I. Robert Lehman's Work on DNA Ligase". 5 Aralık 2022 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 5 Aralık 2022.
2. ↑  Shuman, Stewart (26 Haziran 2009). "DNA Ligases: Progress and Prospects \*". *Journal of Biological Chemistry* (İngilizce). **284** (26): 17365-17369. doi:10.1074/jbc.R900017200. ISSN 0021-9258. PMID 19329793.
3. ↑  Kresge, Nicole; Simoni, Robert D.; Hill, Robert L. (12 Ocak 2007). "Insights into DNA Joining: I. Robert Lehman's Work on DNA Ligase". *Journal of Biological Chemistry* (İngilizce). **282** (2): e1-e3. doi:10.1016/S0021-9258(20)73504-0. ISSN 0021-9258. 23 Ocak 2023 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 23 Ocak 2023.
4. ↑  Joanna A Ruszkiewicz, Alexander Bürkle, Aswin Mangerich (2022). "Fueling genome maintenance: On the versatile roles of NAD+ in preserving DNA integrity". doi: 10.1016/j.jbc.2022.102037. 23 Ocak 2023 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 23 Ocak 2023.
5. ↑  Bruand, Claude; Ehrlich, S. Dusko (2000). "UvrD-dependent replication of rolling-circle plasmids in Escherichia coli". *Molecular Microbiology* (İngilizce). **35** (1): 204-210. doi:10.1046/j.1365-2958.2000.01700.x. ISSN 0950-382X.
6. ↑  "E. coli DNA Ligase | NEB". *www.neb.com*. 25 Ocak 2023 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 25 Ocak 2023.
7. ↑  Black, Lindsay W.; Rao, Venigalla B. (2012). "Structure, assembly, and DNA packaging of the bacteriophage T4 head". *Advances in Virus Research*. **82**: 119-153. doi:10.1016/B978-0-12-394621-8.00018-2. ISSN 1557-8399. PMC 4365992 $2. PMID 22420853. 1 Kasım 2022 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 25 Ocak 2023.
8. ↑  Kuhn, Andreas; Thomas, Julie A. (28 Mart 2022). "The Beauty of Bacteriophage T4 Research: Lindsay W. Black and the T4 Head Assembly". *Viruses*. **14** (4): 700. doi:10.3390/v14040700. ISSN 1999-4915. PMC 9026906 $2. PMID 35458430. 25 Ocak 2023 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 25 Ocak 2023.
9. ↑  Benkovic, Stephen J.; Spiering, Michelle M. (10 Kasım 2017). "Understanding DNA replication by the bacteriophage T4 replisome". *The Journal of Biological Chemistry*. **292** (45): 18434-18442. doi:10.1074/jbc.R117.811208. ISSN 1083-351X. PMC 5682956 $2. PMID 28972188. 25 Ocak 2023 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 25 Ocak 2023.
10. ↑  Baldy, Marian W. (1 Ocak 1968). "Repair and Recombination in Phage T4 II. Genes Affecting UV Sensitivity". *Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology* (İngilizce). **33**: 333-338. doi:10.1101/SQB.1968.033.01.038. ISSN 0091-7451. PMID 4891973. 25 Ocak 2023 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 25 Ocak 2023.
11. ↑  "Thermostable DNA Ligase-Mediated PCR Production of Circular Plasmid (PPCP) and Its Application in Directed Evolution via In situ Error-Prone PCR". *academic.oup.com*. 25 Ocak 2023 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 25 Ocak 2023.
12. ↑  Lindahl, Tomas; Barnes, Deborah E. (1992). "MAMMALIAN DNA LIGASES". *Annual Review of Biochemistry*. **61** (1): 251-281. doi:10.1146/annurev.bi.61.070192.001343. ISSN 0066-4154.
13. ↑  Tomkinson, Alan E.; Sallmyr, Annahita (1 Aralık 2013). "Structure and function of the DNA ligases encoded by the mammalian LIG3 gene". *Gene* (İngilizce). **531** (2): 150-157. doi:10.1016/j.gene.2013.08.061. ISSN 0378-1119. 24 Mayıs 2019 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 25 Ocak 2023.
14. 1 2  Tomkinson, Alan E.; Naila, Tasmin; Khattri Bhandari, Seema (13 Şubat 2020). "Altered DNA ligase activity in human disease". *Mutagenesis*. **35** (1): 51-60. doi:10.1093/mutage/gez026. ISSN 1464-3804. PMC 7317150 $2. PMID 31630206. 25 Ocak 2023 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 25 Ocak 2023.
15. ↑  Howes, Timothy R. L.; Tomkinson, Alan E. (2012). "DNA ligase I, the replicative DNA ligase". *Sub-Cellular Biochemistry*. **62**: 327-341. doi:10.1007/978-94-007-4572-8\_17. ISSN 0306-0225. PMC 3881551 $2. PMID 22918593. 25 Ocak 2023 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 25 Ocak 2023.
16. ↑  Martin, Ina V.; MacNeill, Stuart A. (2002). "ATP-dependent DNA ligases". *Genome Biology*. **3** (4): REVIEWS3005. doi:10.1186/gb-2002-3-4-reviews3005. ISSN 1474-760X. PMID 11983065. 25 Ocak 2023 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 25 Ocak 2023.
17. ↑  Arakawa, Hiroshi; Iliakis, George (23 Haziran 2015). "Alternative Okazaki Fragment Ligation Pathway by DNA Ligase III". *Genes*. **6** (2): 385-398. doi:10.3390/genes6020385. ISSN 2073-4425. PMC 4488670 $2. PMID 26110316. 25 Ocak 2023 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 25 Ocak 2023.
18. ↑  Tomkinson, Alan E.; Sallmyr, Annahita (1 Aralık 2013). "Structure and function of the DNA ligases encoded by the mammalian LIG3 gene". *Gene*. **531** (2): 150-157. doi:10.1016/j.gene.2013.08.061. ISSN 1879-0038. PMC 3881560 $2. PMID 24013086. 25 Ocak 2023 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 25 Ocak 2023.
19. ↑  Altmann, Thomas; Gennery, Andrew R. (7 Ekim 2016). "DNA ligase IV syndrome; a review". *Orphanet Journal of Rare Diseases*. **11** (1): 137. doi:10.1186/s13023-016-0520-1. ISSN 1750-1172. PMC 5055698 $2. PMID 27717373. 25 Ocak 2023 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 25 Ocak 2023.
20. 1 2 3  Bae, Chilman; Butler, Peter J. (2006). "Automated single-cell electroporation". *BioTechniques*. **41** (4): 399-402. doi:10.2144/000112261. ISSN 0736-6205.
21. 1 2 3  "[PDF] MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER I - Free Download PDF". *silo.tips* (İngilizce). 26 Ocak 2023 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 26 Ocak 2023.
22. ↑  "Cloning Ligation | NEB". *www.neb.com*. 26 Ocak 2023 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 25 Ocak 2023.
23. ↑  "What Is DNA Ligation?". 26 Ocak 2023 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 26 Ocak 2023.
24. ↑  Biolabs, New England. "Cloning Ligation | NEB". *international.neb.com* (İngilizce). 26 Ocak 2023 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 25 Ocak 2023.
25. ↑  "Addgene: Protocol - How to Ligate Plasmid DNA". *www.addgene.org*. 26 Ocak 2023 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 25 Ocak 2023.
26. ↑  Berg, Jeremy M. (2007). *Biochemistry*. 6th ed. John L. Tymoczko, Lubert Stryer, Lubert Stryer. New York: W.H. Freeman. ISBN 0-7167-8724-5. OCLC 61500079. 17 Nisan 2009 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 26 Ocak 2023.
27. ↑  Old, R. W. (1994). *Principles of gene manipulation : an introduction to genetic engineering*. 5th ed. S. B. Primrose. Oxford: Blackwell Scientific. ISBN 0-632-03712-1. OCLC 29843632.
28. ↑  "Ligation". *MyBioSource Learning Center* (İngilizce). 26 Ocak 2023 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 26 Ocak 2023.
29. ↑  Sambrook, Joseph (2001). *Molecular cloning : a laboratory manual*. 3rd ed. David W. Russell. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 0-87969-577-3. OCLC 45015638. 23 Mayıs 2022 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 26 Ocak 2023.
30. ↑  IslandPubDev518 (16 Mayıs 2022). "DNA Ligation: 6 easy tips to improve your reactions". *bitesizebio.com* (İngilizce). 26 Ocak 2023 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 26 Ocak 2023.
31. ↑  Dykhuizen, Daniel (1993). "*Introduction to Molecular Cloning Techniques.*Gerard Lucotte , Francois Baneyx". *The Quarterly Review of Biology*. **69** (2): 265-266. doi:10.1086/418566. ISSN 0033-5770.
32. ↑  "The Technology Behind TOPO Cloning - US". *www.thermofisher.com* (İngilizce). 4 Ocak 2023 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 26 Ocak 2023.
33. ↑  Katzen, Federico (2007). "Gateway®recombinational cloning: a biological operating system". *Expert Opinion on Drug Discovery*. **2** (4): 571-589. doi:10.1517/17460441.2.4.571. ISSN 1746-0441.