Spektroskopia jadrovej (nukleárnej) magnetickej rezonancie je metóda využívajúca magnetické vlastnosti atómových jadier niektorých izotopov.

Dnes sú tradičné metódy NMR spektroskopie nepostrádateľnou pomôckou syntetického chemika pri sledovaní priebehu reakcií a overovaní štruktúry produktov. Špeciálne časovo náročnejšie techniky umožňujú riešiť štruktúry aj veľmi komplikovaných zlúčenín, napr. sekundárne a terciárne štruktúry biopolymérov, a študovať interakcie medzi nimi. Obrovskou výhodou NMR spektroskopie biomolekúl je, že môžeme zisťovať ich trojdimenzionálnu štruktúru za „fyziologických" podmienok (v roztoku s určitým pH, teplotou, iónovou silou) Pomocou MR tomografie sú dnes už bežne študované tkanivá a orgány v ľudskom tele. NMR spektroskopia našla tiež široké uplatnenie v materiálovej chémii, farmaceutickom priemysle a vo fyzike pevných látok.

História
--------

V roku 1945 boli prvýkrát pozorované signály jadier vodíka vo vode a v parafíne. V päťdesiatych rokoch 20. storočia sa objavujú prvé sériovo vyrábané NMR spektrometre. Merané boli síce väčšinou iba jadrá vodíka 1H, ale získané informácie sa ukázali byť nesmierne cennými pri určovaní štruktúry zlúčenín, predovšetkým organických. Prvá 13C NMR spektra bola popísaná v roku 1957. Širokopásmový dekapling vodíkov sa objavil v roku 1965. Od tej doby sa NMR spektroskopia veľmi rýchlo rozvíjala a stala sa nevyhnutnou súčasťou štruktúrnej analýzy. Zavedenie supravodivých magnetov a ich zdokonaľovanie umožnilo postupné zvyšovanie intenzity magnetického poľa a tým aj citlivosti a rozlíšenia metódy. Objav dvojdimenzionálnych techník v 70. rokoch dvadsiateho storočia viedol k technikám schopným podať kompletnú informáciu o skelete molekuly a priestorovom usporiadaní atómov. Metódy umožňujúce snímanie spektier alebo aspoň získavanie určitých informácií o jadrách atómov v malých priestorových elementoch vo vnútri objektov dali vzniknúť NMR zobrazovaniu (NMR imaging, MR tomografia, MRT).

### Nobelove ceny za NMR

O význame nukleárnej magnetickej rezonancie svedčí aj niekoľko Nobelových cien udelených v tejto oblasti. V roku 1943 získal Nobelovu cenu za fyziku Otto Stern za objav magnetického momentu protónu. V roku 1944 získal Nobelovu cenu za fyziku Isidor Isaac Rabi za jeho rezonančnú metódu na zistenie magnetických vlastností atómových jadier. V roku 1952 získali Nobelovu cenu za fyziku Felix Bloch a Edward Mills Purcell za rozvoj nových metód na presné meranie jadrového magnetizmu a prvú detekciu NMR signálu. V roku 1991 získal Nobelovu cenu za chémiu Richard R. Ernst za jeho príspevok k rozvoju nukleárnej magnetickej rezonancie s vysokým rozlíšením, zavedenie pulzných techník merania a použitia Fourierovej transformácie a zavedenie dvojdimenzionálnych NMR techník. V roku 2002 získal Nobelovu cenu za chémiu Kurt Wüthrich za vývoj NMR ako metódy umožňujúcej určenie trojrozmernej štruktúry biologických makromolekúl v roztoku. V roku 2003 získali Nobelovu cenu za fyziológiu a medicínu Paul C. Lauterbur a Peter Mansfield za vypracovanie metódy zobrazovania magnetickou rezonanciou.

Jadrový spin
------------

Z hľadiska NMR môžeme atómové jadrá jednotlivých izotopov rozdeliť na tri skupiny:

1. Jadrá, ktoré majú nulové spinové kvantové číslo **I = 0** (výraz spinové kvantové číslo sa často nahrádza výrazom spin alebo jadrový spin). Sú to jadrá s párnym počtom protónov i neutrónov, ako napr. 12C, 16O, 32S. Tieto jadrá nemajú jadrový magnetický moment a **nie sú v NMR spektroskopii pozorovateľné** ani nijako neovplyvňujú spektrá iných izotopov.

2. Jadrá so spinovým kvantovým číslom **I = 1/2**. Tieto jadrá majú jadrový magnetický moment a sú **ľahko merateľné**. Príkladom je protón, 1H, ktorý má vysoké prírodné zastúpenie, a je najbežnejšie meraným jadrom. Uhlík 13C predstavuje ďalšie často merané jadro. Má nižšiu citlivosť a zároveň nízke prírodné zastúpenie (1,11%), takže jeho signály sú zhruba 5700x slabšie ako signály 1H. Ďalšie jadrá so spinom 1/2 sú napríklad 15N, 19F, 31P.

3. Jadrá so spinovým kvantovým číslom **I > 1/2**. Tieto jadrá majú okrem jadrového magnetického momentu aj kvadrupolový moment a sú veľmi často **ťažko merateľné**. Jadrá s nepárnym nukleónovým číslom (súčet počtu protónov a neutrónov) majú poločíselné spinové kvantové čísla (1/2, 3/2, 5/2…). Jadrá s párnym nukleónovým číslom a nepárnym počtom protónov majú celočíselné spinové kvantové čísla (1, 2, 3…).

NMR spektrometer
----------------

### Magnet

U väčšiny súčasných NMR spektrometrov určených na meranie kvapalných vzoriek je magnetické pole vytvárané supravodivými cievkami tvorenými niekoľkými tisíckami závitov zo špeciálnych zliatin. V súčasnej dobe dostupné supravodivé materiály, ktoré sú schopné znášať vysoké magnetické polia, majú kritickú teplotu niekoľko málo stupňov od absolútnej nuly. Supravodivá cievka teda musí byť ponorená v kvapalnom héliu. Zásoby hélia na Zemi sú obmedzené a jeho cena je vysoká, preto je snahou čo najviac jeho spotrebu obmedziť. Zásadné úspory kvapalného hélia sa dosahuje tým, že časť NMR magnetu s kvapalným héliom a supravodivou cievkou je od okolitého prostredia s izbovou teplotou oddelená priestorom s kvapalným dusíkom, ktorý sa ľahko získava zo vzduchu a jeho cena je nízka. Kvapalný dusík sa musí pravidelne dopĺňať každé 1–2 týždne a kvapalné hélium sa dopĺňa cca raz za 6 mesiacov. Odparené hélium je možné tiež zachycovať a znovu skvapalniť. Niektoré novšie NMR magnety dokonca fungujú ako uzavretý systém, kedy sa odparené hélium rovno znovu skvapalňuje a vracia do magnetu.

Supravodivou cievkou tečie prúd okolo 100 A. Intenzita takto dosiahnutého magnetického poľa je 7–23 T. Pole musí byť vysoko stabilné, jeho kolísanie vedie k rozšíreniu línií v spektre. Rovnako tak vedie k rozšíreniu línií nízka homogenita magnetického poľa – pokiaľ sa vyskytujú inak identické jadrá z rôznych častí vzorky pri rôznom poli, rezonujú pri rôznych frekvenciách. Homogenita poľa sa upravuje špeciálnou sadou priestorovo rôzne orientovaných cievok, pri ktorých sa intenzita prúdu a tým aj dodatkového poľa upravujú tak, aby výsledné magnetické pole bolo čo najviac homogénne.

Súčasné NMR magnety sú väčšinou tzv. tienené. To znamená, že obsahujú ďalšiu cievku, ktorá vytvára opačné magnetické pole takým spôsobom, aby mimo NMR magnetu bolo magnetické pole čo najmenšie a neobmedzovalo tak napríklad prevádzku niektorých zariadení.

Pokiaľ by sa časť supravodivej cievky ocitla pri vyššej teplote, než ktorá umožňuje supravodivosť (napríklad pri neskorom alebo neodbornom doplňovaní kvapalného hélia), táto časť cievky prestane byť supravodivá, má nenulový odpor a prechádzajúci prúd cievku zahrieva. To vedie k zahriatiu ďalšej časti cievky a strate supravodivosti. Výsledkom tejto reťazovej reakcie je potom úplná strata supravodivých vlastností celej cievky, premena elektrickej energie na tepelnú (spojená s prudkým odparením všetkého hélia) a strata magnetického poľa. Tomuto nechcenému procesu sa podľa anglického termínu hovorí **quench NMR magnetu**.

### Sonda

Časť NMR spektrometra, kde sú umiestnené **prijímacie cievky,** **vysielacie cievky**, **korekčné cievky** pre dosiahnutie maximálnej homogenity poľa a zariadenia ovládajúce presné **nastavenie teploty vzorky** sa nazýva sonda. Sondy je možné v prípade potreby meniť. Niektoré sondy sú konštruované tak, že umožňujú merať určitý typ experimentu s väčšou citlivosťou (inverzné sondy). Pri súčasných spektrometroch je obvykle rovnaká cievka použitá na vyslanie pulzu aj na snímanie odozvy. Ďalšia cievka alebo cievky slúžia na vysielanie frekvencií iného jadra, vytváranie gradientov poľa a pod.

Najväčším slabinou NMR spektroskopie je **pomerne nízka citlivosť**. V každom experimente je potrebné dosiahnuť dostatočný pomer signálu k šumu, aby bolo možné výsledné spektrá interpretovať. Časť elektronického šumu, tzv. tepelný šum, vzniká v akomkoľvek elektronickom zariadení náhodným pohybom elektrónov. Znížením teploty daného elektronického zariadenia dochádza k potlačeniu tepelného šumu. Niektoré moderné NMR sondy (nazývané **kryosondy**) využívajú tento jav na zvýšenie citlivosti. Prijímacia cievka, vodiče, ktoré vedú NMR signál, a prvý zosilňovač signálu sú v týchto sondách chladené buď héliom s teplotou asi 20 K alebo dusíkom s teplotou asi 80 K. To vedie k dramatickému zlepšeniu pomeru signálu k šumu (pri héliom chladených kryosond asi päť ) a skrátenie doby NMR experimentu (päťkrát lepší pomer signálu k šumu umožňuje skrátiť experiment 25x).

### Konzola

Všetky elektronické zariadenia, ktoré sú potrebné na priebeh NMR experimentu, sú umiestnené v tzv. konzole. Konzola obsahuje syntetizátor frekvencií opatrený zosilňovačom (**vysielač**om) s výkonom obvykle 50-300 W, ktorý musí byť schopný produkovať krátke rádiofrekvenčné pulzy s presnou amplitúdou, frekvenciou a fázou. Vysielače bývajú obvykle dva alebo viac, pretože často je ožarované aj iné jadro ako merané. Okrem toho je ďalší nezávislý kanál využitý na udržanie stabilného poľa (lock), ten obvykle využíva jadier deutéria v použitom rozpúšťadle. Pri snímaní odozvy systému je cievka prepnutá na prijímač, kde je signál zosilnený a digitalizovaný. FID je uložený do pamäte riadiaceho počítača, kde sú FIDy z jednotlivých priechodov sčítané. V konzole býva tiež umiestnená teplotná jednotka, ktorá riadi teplotu vzorky počas experimentu. Medzi ďalšie potrebné súčasti NMR spektrometra, ktoré sú umiestnené v konzole, patrí napríklad jednotka, ktorá riadi použitie gradientových pulzov, alebo jednotka, ktorá má na starosti riadenie korekčných cievok na získanie maximálnej homogenity magnetického poľa.

NMR experiment
--------------

### **NMR kyvety**

Na meranie NMR spektier sa najčastejšie používajú sklené kyvety s vonkajším priemerom 5 mm a **objemom roztoku 500–600 μL**. Existujú však aj iné typy kyviet, napríklad na meranie málo citlivých jadier je možné použiť kyvety s vonkajším priemerom 10 mm, do ktorých sa zmestí väčšie množstvo vzorky. Tieto kyvety je možné ale použiť iba so zodpovedajúcou sondou. Naopak, pokiaľ je množstvo vzorky limitované, je možné použiť tzv. Shigemi kyvety, v ktorých je potrebné množstvo roztoku asi 150–200 μL a stĺpec vzorky je ohraničený materiálom s magnetickou susceptibilitou adjustovanou tak, aby bola totožná ako susceptibilita použitého rozpúšťadla. Ak by sa totiž použila bežná NMR kyveta s tak malým množstvom roztoku, homogenita magnetického poľa by bola narušená. Pre malé množstvá vzorky je tiež možné použiť NMR kyvety s vonkajším priemerom 3 mm (objem roztoku cca 150 μL) alebo 1,6 mm (objem roztoku 35 μL).

### Rozpúšťadlo

Vzorka je rozpustená v deuterovanom rozpúšťadle a umiestnená v kyvete, ktorá je presunutá do stredu magnetu na miesto obklopené cievkami. Deuterované rozpúšťadlá sa používajú, pretože rozpúšťadlo je oproti meranej látke väčšinou v obrovskom nadbytku a signál vodíka 1H rozpúšťadla by tak bol v 1H NMR spektre oveľa intenzívnejší a mohol by prekryť signály meranej látky. Deuterácia rozpúšťadiel nie je nikdy stopercentná a tak je v 1H NMR spektroch vidieť aj signál nedeuterovaného rozpúšťadla. V 13C spektroch potom môžeme pozorovať aj signály uhlíkov rozpúšťadla, ktoré bývajú spin-spinovou interakciou s deutériom rozštiepené na multiplety.

Deutérium z rozpúšťadiel sa počas NMR experimentov používa na takzvané uzamknutie magnetického poľa (lock). NMR spektrometer neustále sleduje rezonančnú frekvenciu deutériového signálu. Pokiaľ by stabilita magnetického poľa spektrometra nebola dostatočná, počas experimentu by došlo k zmene rezonančnej frekvencie. NMR spektrometer automaticky zapína korekčnú cievku, ktorá vytvára dodatočné magnetické pole takým spôsobom, aby rezonančná frekvencia deutéria bola konštantná, a týmto spôsobom teda zaisťuje dlhodobú stabilitu magnetického poľa. 

### Štandard

Začiatok stupnice chemických posunov sa z technických dôvodov stanovuje ťažko v absolútnej hodnote. Ujalo sa používanie vhodného štandardu, ktorý má v spektre jedinú líniu, ktorú možno ľahko nájsť medzi ostatnými líniami a pridáva sa buď priamo k meranej látke (**interný štandard**) alebo v zatavenej kapiláre do kyvety so vzorkou (**externý štandard**). Pre 1H NMR spektra to je najčastejšie tetramethylsilán (TMS), (CH3)4Si s dvanástimi ekvivalentnými vodíkovými atómami. V spektroch je to singlet, ktorý je obvykle najviac vpravo. Pre 13C NMR spektra sa pri roztokoch v CDCl3 najčastejšie používa prostredná línia jeho signálu s posunom δ = 77 ppm. Tetramethylsilán nie je rozpustný vo vode, preto sa pri meraní vo vodných roztokoch používajú iné štandardy; napríklad 1,4-dioxán s chemickým posunom 1H 3,75 ppm alebo sodná soľ kyseliny 4,4-dimetyl-4-silapentán-1-sulfónovej (DSS). Vodíkové spektrá merané vo vode nie je vhodné referencovať na zvyškový signál nedeuterované frakcie vody (HDO), pretože chemický posun vody závisí na teplote, pH a iónovej sile roztoku. Externý štandard sa používa v 31P NMR. Do kapilári sa zataví 85% vodný roztok kyseliny fosforečnej (koncentrovaná kyselina fosforečná).

#### NMR experimenty v nedeuterovaných rozpúšťadlách

Niekedy nie je možné alebo vhodné merať NMR spektra v deuterovaných rozpúšťadlách. Napríklad, ak sa vzorka na meranie odoberá priamo z reakčnej zmesi, v ktorej sa nepoužívajú deuterované rozpúšťadlá, alebo pokiaľ nie je dostupné deuterované rozpúšťadlo, v ktorom je potrebné vykonávať daný NMR experiment. Ďalším prípadom sú experimenty v protických rozpúšťadlách, kde sa pri použití deuterovaných rozpúšťadiel všetky vymeniteľné vodíky vymenia za deutérium a ich signály tak zmiznú z 1H NMR spektier a nie je ich teda možné využiť pri interpretácii daného experimentu. Typickým príkladom sú peptidy a proteíny rozpustné vo vode. Pri meraní v D2O nie sú pozorovateľné (okrem iného) amidické vodíky, ktoré sú ale mimoriadne dôležité pre určenie štruktúry týchto látok, pretože to sú jediné vodíky na peptidových väzbách, ktoré spájajú jednotlivé aminokyseliny. Riešením je v týchto prípadoch meranie NMR experimentov v nedeuterovaných rozpúšťadlách a potlačovanie intenzívneho signálu rozpúšťadla. K vzorkám sa ale väčšinou pridáva aspoň malá časť deuterovaného rozpúšťadla (~ 10%), aby bolo možné zaistiť stabilitu magnetického poľa pomocou locku.

Na potlačenie signálu rozpúšťadla bolo vyvinutých niekoľko rôznych metód. Najjednoduchšou metódou je takzvaná **presaturácia**, pri ktorej sa v priebehu relaxačného oneskorenia *d*1 ožaruje signál rozpúšťadla elektromagnetickým žiarením so slabým výkonom, ktoré spôsobí vyrovnanie populácií (saturácii) spinových stavov jadier 1H rozpúšťadla a teda potlačenie intenzity jeho signálu. Iné metódy využívajú NMR relaxáciu, napríklad pulznú sekvenciu **inversion recovery**, kde je oneskorenie medzi 180° a 90° pulzom nastavené tak, že magnetizácia rozpúšťadla je pred 90° pulzom práve nulová a signál rozpúšťadla je teda vo výslednom spektre potlačený. Moderné metódy potlačenia signálu rozpúšťadla využívajú kombináciu gradientových a selektívnych pulzov. Tieto metódy vychádzajú z pulznej sekvencie **WATERGATE**, ktorá bola navrhnutá na potlačenie signálu vody pri meraní biomolekúl. Zaujímavosťou je, že táto pulzná sekvencia bola navrhnutá významným českým spektroskopikom Vladimírom Sklenářom.

### Ladenie rezonančného obvodu

Aby bol rezonančný obvod NMR spektrometra schopný emitovať a prijímať signál, musí byť naladený na príslušnú rezonančnú frekvenciu. Proces ladenia je podobný tomu, ako sa predtým ladili rádiá na určitú frekvenciu (teda určitú stanicu) pomocou premenných kondenzátorov alebo potenciometrov, a v súčasnosti môže byť plne automatizovaný. Preladiť rezonančný obvod je nutné vždy, ak meníme izotop, ktorý chceme ožarovať alebo detekovať. Napríklad ak meriame jadrá 13C a potom jadrá 31P, rezonančný obvod musí byť medzi meraniami preladený. Na rezonančný obvod má vplyv aj magnetická susceptibilita rozpúšťadla v NMR kyvete, preto je vhodné rezonančný obvod doladiť, aj keď meriame ten istý experiment, ale máme vzorku rozpustenú v inom rozpúšťadle.

### Rotácia vzorky

Časť nehomogenít magnetického poľa v rovine xy je možné eliminovať rotáciou kyvety so vzorkou pozdĺž osi z, pretože každé jadro prechádza počas otočky rôznymi oblasťami magnetického poľa. Nehomogenity v rovine xy ale pri rotácii vzorky vedú k vzniku rotačných postranných pásov. Rotáciu vzorky nie je vhodné používať pri experimentoch s gradientmi magnetického poľa, pretože rotácia vzorky môže prispieť ku konvekcii, teda prúdeniu vzorky medzi jednotlivými časťami kyvety, a tým pádom k potlačeniu refokusácie signálu počas gradientového echa.

### Ladenie homogenity magnetického poľa (shim)

Magnetické pole, v ktorom prebieha NMR experiment, musí byť čo najviac homogénne. Pokiaľ je v rôznych častiach kyvety rôzna intenzita vonkajšieho magnetického poľa, identické jadrá v molekulách nachádzajúcich sa v rôznych častiach kyvety majú inú rezonančnú frekvenciu. To v praxi najčastejšie vedie k tomu, že sú všetky signály rozšírené a majú nepravidelný tvar. Integrálna intenzita (plocha signálu) ale zostáva rovnaká, takže široké signály sú nižšie a majú teda horší pomer signálu k šumu. Nedokonalá homogenita magnetického poľa teda vedie k strate rozlíšenia (široké signály sa budú skôr prekrývať) aj citlivosti.

Nehomogenity magnetického poľa sa odstraňujú pomocou sady niekoľkých desiatok korekčných cievok, ktoré vytvárajú dodatočné magnetické pole takým spôsobom, aby výsledné celkové magnetické pole bolo v celom objeme meranej vzorky čo najviac homogénne. Pri moderných spektrometroch je možné ladenie homogenity vykonávať automaticky bez zásahu užívateľa. Na ladenie homogenity magnetického poľa sa často v slovenčine používa prevzatý výraz šimovanie.

### **Teplota**

Okolo kyvety v NMR sonde neustále prúdi vzduch (prípadne dusík) s určitou teplotou a tým možno vzorku temperovať na vopred zvolenú teplotu. Niektoré sondy umožňujú meranie NMR spektier v širokom rozsahu teplôt, napríklad –150 – +150 °C. Napriek tomu, že teplota prúdiaceho vzduchu je snímaná senzorom v blízkosti vzorky, teplota vzorky v NMR kyvete sa môže od nameranej teploty trochu líšiť. Pokiaľ je potrebné poznať teplotu vzorky s veľkou presnosťou (napríklad pri meraní reakčnej kinetiky), musí sa táto teplota kalibrovať. Pre nízke teploty sa na túto kalibráciu používa vzorka metanolu, ktorá sa zmeria tesne pred alebo po experimente, pri ktorom potrebujeme poznať presnú teplotu vzorky. Metanol má v 1H spektre dva signály (OH a CH3 signál) a chemické posuny týchto signálov sa menia s teplotou (predovšetkým signály OH vodíkov, pretože pri vyššej teplote dochádza k rozvoľneniu medzimolekulových vodíkových väzieb). Z rozdielu chemických posunov týchto dvoch signálov je možné vypočítať presnú teplotu vzorky metanolu. Na kalibráciu vyšších teplôt sa používa vzorka etylénglykolu.

Zdroje
------

1. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12  DRAČÍNSKY, Martin. *NMR spektroskopie pro chemiky*. 1.. vyd. Praha : Univerzita Karlova. Přírodovědecká fakulta. Knihovna chemie, 2021. ISBN 978-80-7444-085-4.
2. ↑  ĐUD, Mateja; TICHOTOVÁ, Markéta; PROCHÁZKOVÁ, Eliška. Phosphate-Based Self-Immolative Linkers for the Delivery of Amine-Containing Drugs. *Molecules*, 2021-08-25, roč. 26, čís. 17, s. 5160. Dostupné online [cit. 2023-12-12]. ISSN 1420-3049. DOI: 10.3390/molecules26175160. (po anglicky)
3. ↑  CHARY, Kandala V. R.; GOVIL, Girjesh; CHARY, K. V. R.. *NMR in biological systems: from molecules to humans*. Dordrecht, [Heidelberg] : Springer, 2008. (Focus on structural biology.) ISBN 978-1-4020-6679-5.
4. ↑   *New techniques in solid-state NMR*. Berlin Heidelberg : Springer, 2005. (Topics in current chemistry.) ISBN 978-3-540-22168-5.
5. 1 2 3  VACÍK, Jiří. *Obecná chemie*. 2.. vyd. Praha : Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova, 2017. ISBN 978-80-7563-590-7.
6. ↑  DEVÍNSKY, Ferdinand. *Organická chémia*. 2. vyd. [s.l.] : Vydavateľstvo Osveta, 2013. ISBN 978-80-8063-388-2.