Genska terapija putem adenovirusa kao vektora. U nekim slučajevima, adenovirus će ubaciti novi gen u ćeliju. Ako je liječenje uspješno, novi gen će učiniti funkcionalnim protein za liječenje bolesti.
**Genska terapija** obuhvata niz *in vivo*, *ex vivo* i *in vitro* metoda i postupaka za prekomponiranje postojećih i unošenje funkcionalnih kopija gena, koji zamjenjuju ili nadopunjuju (ne)aktivnost alelnih varijanti koje su odgovorne za mnoge bolesti.

Već općepoznati termini kao što su: genetičko inženjerstvo, genska manipulacija, gensko kloniranje, tehnologija rekombinantne DNK, DNK kloniranje, genetička modifikacija, molekulsko kloniranje, gensko inženjerstvo, pa i "nova genetika", opisuju istoznačne pojmove u oblasti biotehnologije na bazi genetičkog inženjerstva. Svi se odnose na istovjetan proces: svrsishodni transfer ciljanih fragmenata i molekula DNK iz jednog organizma u samoreplicirajuće genetičke strukture drugog, tj. transgenozu. Takvi transgeni fragmenti DNK se kasnije mogu, u potrebnoj količini kopija, propagirati u "stranoj ćeliji domaćinu". Pored genetičkog inženjerstva na molekulskoj razini, već su odavno u primjeni i manipulacije većim kompleksima genetičkog materijala – hromosomima i kompletnim genomima (označene kao hromosomsko i genomsko inženjerstvo).

Molekulsko-genetički osnovi genske terapije
-------------------------------------------

Esencijalne komponente strategije molekulsko–genetičkog inženjerstva su:

* isijecanje, modificiranje i ugradnja DNK molekula *in vitro*,
* transfer i introdukcija isječenih segmenata donorske DNK (gena) u recipijenta – putem odgovarajućih vektora,
* propagacija rekombinovanih DNK molekula u domaćinu vektor sistema (koji omogućuje kloniranje rekombinantnih DNK molekula) i
* selekcija odgovarajućih DNK sekvenci.

Razvoj tehnologije rekombinatne DNK omogućuje neslućene oblike primjene novih terapijskih metoda, naročito u oblasti genske terapije i transplantacije. Tako, npr. u istraživačke svrhe već se primjenjuje terapeutsko embrionalno kloniranje, koje predstavlja proces produkcije genetički transformiranih humanih ćelija i tkiva. Polazni cilj razvoja ovog procesa nije kloniranje integralnih ljudskih organizama, nego "uzgajanje" stem (matičnih, neizdiferenciranih) ćelija koje se mogu koristiti za razvoj terapeutskih programa u novim pristupima tretiranju oboljenja. Stem ćelije su veoma bitne za biomedicinska istraživanja, jer mogu generirati gotovo sve naknadno specijalizirane ćelije u ljudskom organizmu. Izdvajaju se nakon pet dana od iniciranja diobe – u fazi blastocita. Proces ekstrakcije, međutim, razara embrio, što sve češće postaje tema pravnih, etičkih i drugih rasprava. 

Ovakva genska terapija je moguća u tretiranju određenih genetičkih kontroliranih poremećaja introdukcijom vektora koji "unose" korigovane kopije "pogrešnih" gena u ćelije domaćina. Tehnologija terapeutskog kloniranja se u budućnosti može koristiti i kao izvor cijelih organa iz ćelija ili za produkciju zdravih ćelija. One, primjerice, mogu zamijeniti defektne ćelije u nekim degerativnim poremećajima, liječenju srčanih oboljenja, kancera, Alzheimerove i drugih bolesti.

Vektori unosa gena u genskoj terapiji
-------------------------------------

Vektori u genskoj terapiji mogu biti virusnog i nevirusnog porijekla. Najčešći i najprikladniji virusni vektori su retrovirusi, adenovirusi, adeno–asocirani i herpes virusi, a od neviralnih – liposomi, lipopleksi i "gola" DNK. Liposomi su mikroskopski sitni mjehurići koji se formiraju spontano kada se lipoproteini rasprše u tečnosti. U lipidne micele se mogu inkapsulirati molekule DNK (gen), a lipopleksi su mnogo kompleksnije – virusolike stukture. Direktna upotreba "gole" DNK realizira se samo u nekim slučajevima, jer je nedostatno učinkovita.

Mikroinjektiranje, biolistika, elektroporacija i infuzija su novije tehnike genske terapije, koje komplementiraju ili substituiraju aplikaciju pomenutih nevirus vektora. Direktno injektiranje DNK u tkivo primaoca obavlja se putem specifičnih igala. Alternativni metod takve procedure je tehnika specifičnog bombardovanja mikroprojektilima (biolistika). Vrlo mali fragmenti (4 μm) načinjeni od zlata ili volframa se oblože (inkapsuliraju) molekulama DNK i, osobitim pištoljem (uz veliku početnu brzinu), "upucavaju" u ćelije ili tkiva. Metalne partikule (mikroprojektili) prodiru kroz ćelijski zid i membranu i ne oštećuju ih, a pri tome se formiraju pore koje su dovoljnih dimenzija za ulazak strane DNK u unutrašnjost ciljane ćelije. Ovim putem se uspješno transformiraju više biljke, alge, gljive i prokarioti, uključujući i transformaciju hloroplasta i mitohondrija. Ovaj metod intervencije in vivo obećava nove mogućnosti primjene i u genskoj terapiji.

Elektroporacija se uspješno koristi u transformaciji mikroorganizama i biljaka, a sastoji se u tome da se silama električnog polja otvaraju pore na ćelijskoj membrani, kroz koje strana DNK može ući u citosol. Zatim se transformisane stanice se podvrgavaju selekciji (na selektivnoj hranljivoj podlozi), gdje se dijele samo one koje su primile stranu DNK, dok ostale ugibaju. U aplikaciji ovog metoda najčešće se tretiraju protoplasti, kalus i zreli embrioni. Očekuje se da bi ova tehnika mogla biti uspješna i u specifičnim zahvatima genske terapije. Receptor–medijacijska endocitoza je relativno jednostavsn metod infuzijskog transfera, koji podrazumijeva da se DNK integrira sa ciljanom molekulom, koja se može vezati na površini specifičnog ćelijskog receptora. Taj kompleks, zatim, inducira endocitozu i unosi manipuliranu ćeliju.

* **Prednosti i nedostaci virusnih vektora u genskoj terapiji**

|  |  |  |
| --- | --- | --- |
| **Vektor** | **Prednosti** | **Nedostaci** |
| **Virusni** |
| Retrovirus | * Veoma su dobro proučeni i efikasni u procesu transfera DNK u ćelije
* Dugotrajna ekspresija

rekombinacija malo vjerovatna | * Mala veličina inserta (do 8 kb DNK)
* Transfekcija samo onih ćelija koje su u aktivnoj diobi
* Rizik od inzicijske mutageneze
 |
| Adenovirus | * Transfekcija replicirajućih i nereplicirajućih ćelija
* Visoka ekspresija insertiranih gena
* Idealni za plućno tkivo
* Mogućnost aerosolne aplikacije
* Rijetka intergracija u genom domaćina
 | * Mala veličina inserta (7–8 kb DNK)
* Značajan rizik od upalnog odgovora
* Kratkotrajna genska ekspresija
* Vektor se gubi tokom ćelijske diobe
* Rizik od rekombinacije u domaćinu
* Ekspresija drugih proteina
 |
| Adeno–
asociorani virus | * Dugotrajna ekspresija i njena visoka sigurnost
 | * Mala veličina inserta (7–8 +*kb* DNK)
* Neproduktivna infekcija bez virusa "pomagača" (helper virus)
 |
| Herpes virus | * Transfekcija replicirajućih i nereplicirajućih ćelija
* Specijalno dobar za nervno tkivo
* Rijetka intergracija u genom domaćina
* Insercija veličine do oko 30 *kb*
 | \*Rizik od rekombinacije u domaćinu 
* Kratkotrajna genska ekspresija
 |
| **Nevirusni** |
| Liposomi | * Ne nose virusne gene, pa ne izazivaju oboljenja
 | * Pri transferu gena, manja je efikasnost nego kod virusa
* Problemi sa veličinom vektora, što limitira količinu transferirane DNK
 |
| Lipopleksi | * Nemaju imunogensko djelovanje, pa su podobniji za transfer nego virusi
 | * Veličina limitira količinu transferirane DNK
 |
| "Gola" DNK | * Veoma korisna za konstrukciju vakcina
* Korisna u posebnim slučajevima
 | * Neefikasna u transferu gena
* U većini tkiva je nestabilna
 |
| Mikroinjektiranje | * Sigurnost, preciznost i jednostavnost transfera
 | * Moguća neregularna proliferacija u tkivima
* Potrebno ponovno injektiranje
 |
| Biolistika | * Sigurnost transfera
* Visoka uspješnost transfera genetičkog materijala u različita tkiva
 | \*Limitirana efikasnost genskog transfera 
* Nedostatna integracija injektovane DNK
 |
| Receptor–medijacijska endocitoza | * Laka infuzija putem jetre preko žučnog kanala, gdje ih preuzimaju hepatociti i transportuju u proliferirajuće ćelije hematopoetskog tkiva
 | \*Nije dizajniran za integraciju transferiranih gena 
* Protein–DNK kompleks nestabilan u serumu
 |
|

Strategija i modeli genske terapije
-----------------------------------

Svaka identifikacija i karakterizacija genetičkih defekata otvara logično pitanje mogućnosti tretmana pogođenih pacijenata. Ako se defektni gen može transgeno zamijeniti funkcionalnom kopijom koja ima korektnu ekspresiju, takva bolest se može uspješno prevenirati i liječiti. Taj pristup se označava kao genska terapija i jedan je od iznimno obećavajućih aspekata u primjeni genske tehnologije u medicini.

Genska terapija obuhvata sve oblike prevencije i liječenja u kojima se pacijentu inkorporiraju normalni geni koji korigiraju disfunkciju ili malfunkciju mutantnih gena – odgovornih za određene bolesti. Može se aplicirati raspoloživim in vivo ili ex vivo metodima. U toj oblasti postoje dva glavna moguća pristupa:

* introdukcija transformiranih gena u somatske ćelije aficiranog tkiva i
* unošenje takvih gena u reproduktivne (germinalne, germ) linije ćelija.

Pored ostalog, treba naglasiti da ovi pristupi imaju markantno diferencirane etičke implikacije. Većina naučnika i kliničara somatsku gensku terapiju smatra prihvatljivom u mjeri koja (u moralnom pogledu) nije problematičnija od aplikacije bilo kojeg klasičnog medikamenta. Međutim, kada je riječ o genskoj terapiji u liniji germinativnih ćelija, ona je neprihvatljiva za većinu eksperata i šire javnosti; između ostalog, i zbog rizika po narušavanje evolucijskog balansa u genskom fondu populacije i ljudske vrste uopće.

Uspješnost odabranog protokola genske terapije primarno ovisi o ostvarenju nekoliko esencijalnih preduvjeta.

* Genski defekt mora biti karakteriziran, a raspoloživi gen kloniran u formi koja je primjenjiva u namjenskim kliničkim programima.
* Neophodno je osigurati raspoloživ sistem apliciranja gena u ciljno tkivo pacijenta – unošenjem DNK sekvence (putem odgovarajućeg vektora) u "target" ćelije.
* Nezaobilazan je i pogodan mehanizam pristupa ciljnom tkivu ili organu, koji može uključiti i inhalaciju, injiciranje ili druge slične metode.
* Ako su prethodni uvjeti ispunjeni, tj. ekspresija nefunkcionalnog gena "korigirana", u ciljnoj ćeliji će se ispoljiti produkt insertiranog gena.

U idealnim okolnostima, defektni gen bi bilo moguće zamijeniti funkcionalnom kopijom. Takva gensko–zamjenska terapija je ekvivalentna rekombinaciji između malformirane i insertirane kopije. Alternativa joj je aplikacija gensko–adicijske terapije, kojoj nisu potrebni uvjeti recipročne zamjene genskih sekvenci, jer se funkcije insercijskog gena samo pridružuju efektima defektivnog. Ovakav pristup je djelotvoran samo pod uvjetom da defektni gen nije dominantan, jer u tom slučaju on kodira defektivni protein koji prekriva svaki efekat inkorporiranog recesivnog transgena. Ipak, terapija dominantnog gena se može izvesti upotrebom antisens iRNK (tako da reverzna kopija gena producira antisens konfiguraciju iRNK).

Komplikacije mogu nastati zbog ciljnih ćelija i tkiva. U nekim situacijama je moguće izdvojiti ćelije iz pacijenta i manipulirati njima van tijela, a zatim se defektne ćelije pacijenta zamijene funkcionalno restauriranim u *ex vivo* tretmanu. Ova metoda je pogodna za gensku terapiju bolesti krvnog sistema, ali ne i za liječenje solidnih tkiva, kao što su plućna, pankreasna, koštana i druga – koje se aplicira *in vivo*.

Genska terapija *in vivo* počiva na inkorporaciji terapeutskih gena u organizam pacijenta putem mogućih transfer–sistema: virusa, kultura ćelija ili drugih sintetičkih vektora introducirajućeg gena. Tako, npr. liposomi sa genima za kontrolu cistične fibroze se u ljudski organizam mogu unijeti sprej–tehnikom inhalacije (u nozdrve). Retrovirusi u koje su ugrađeni antikancerski geni su injicirani direktno u maligni tumor uz očekivanje kurativnih efekata. U tim pokušajima već su zabilježeni primjeri uspješnih intervencija. Također se očekuje da bi genska terapija in vivo mogla biti uspješna i u tretmanu hemofilije, dijabetesa, Parkinsonove bolesti ili AIDS–a. U slučaju hemofilije, u organizam pacijenta se unose regularne ćelije sa normalnim genom za produkciju koagulacijskih faktora. Takve ćelije se mugu inkorporirati i u organoide, tj. artificijelne organe koji se implantiraju u organizam pacijenta. Za liječenje Parkinsonove bolesti neophodne su dopamin–producirajuće ćelije koje se mogu direktno inputirati u mozak. U novije vrijeme istražuju se mogućnosti direktnog korigiranja defektne DNK sekvence pacijenta sa nasljednom bolešću. 

Izbor metoda genskog transfera ovisi o prirodi ciljanog tkiva i metoda aplikacije: posredstvom ćelija u kulturi (*ex vivo*) ili direktno u ćelije pacijenta (*in vivo*). U principu, nijedan od sistema genskog transfera nije idelan niti univerzalan, jer svaki od njih ima specifične mane i ograničenja.

Genska terapija *ex vivo* uključuje sve oblike genetičke transformacije molekula, ćelija ili organa u vantjelesnim uvjetima i inkorporiranja tako modificiranih produkata u organizam pacijenta. Još prije desetak godina (1993.) je potvrđena njena opravdanost i učinkovitost Široko i detaljno je opisivan primjer takvog liječenja kompleksne imunodeficijencije (SCID) kod jedne djevojčice (Cindy Cutshall). Ovakva genska terapija počiva na ideji da je moguće pacijenta snabdjeti nedostajućim genom ili zamjenom defektnog. Pacijentovim leukocitima je, u kulturi *ex vivo*, dodan gen za korekciju nedostajuće funkcije defektnog gena, a zatim su ponovo vraćeni u njegov organizam. Zabilježeno je da tako inkorporirani gen (ADA) još uvijek funkcionira.

Ovaj model genske terapije je apliciran i u tretmanu AIDS–a, kancera, cistične fibroze, hiperholesterolemije i drugih bolest. Iako u nekim slučajevima ćelije pacijenta nisu prihvatile adekvatan broj aktivnih manipuliranih gena, razvojem dostatne procedure, genska terapija *ex vivo* bi uskoro mogla spašavati živote miliona ljudi.

Ostali pristupi genske terapije *ex vivo* također se koriste imunološkim reakcijama za destrukciju tumora. Jedna podrazumijeva transfer antisens gen faktora rasta IGF–1. Nakon in vivo reimplantacije transformiranih tumorskih ćelija sa ovim genom dolazi do indukcije imunog odgovora, koji vodi destrukciji nemodificiranih tumora po još nedovoljno poznatoj etiologiji. Drugi pristup se bazira na inserciji stimulatora, tj. sekvenci koje su normalno zastupljene u genomu a koje su obligatne za punu aktivaciju T–limfocita.

Modeli i potencijali genske terapije kancera i imunodeficijencija
-----------------------------------------------------------------

Genska terapija kancera uključuje mnoštvo različitih pristupa. Za razliku od genske terapije nasljednih poremećaja, koja nije imala bogatija iskustva, ovaj terapijski pristup u tretmanu kancera se sve češće primjenjuje, ali još uvijek najčešće na nivou eksperimentalnog liječenja. Najčešći primjeri kancera koji se tretiraju genskom terapijom su tumori mozga, rak dojke, debelog crijeva, maligni melanomi, mijelogenska leukemija, neuroblastomi, mikrocelularni i nemikrocelularni rak pluća, rak jajnika te razni čvrsti tumori.

Činjenica je da je genska terapija frekventnija u tretmanu kancera, nego nekih drugih oboljenja istovremeno svjedoči o njihovoj letalnosti i ogromnim investicijama u ovo područje. Tome se pridružuje i relativno jednostaviji pristup u uništavanju ciljanih malignih stanica, vještački ili osposobljavanjem imunskog sistema za samoodbranu organizma. U nekoliko najpoznatijih slučajeva primjene genske terapije ciljani su pojedinačni geni, kao što su (npr.) *TP53* augmentacijska terapija i aktivacija antisens *KRAS* gena u nekim slučajevima mikrocelularnog kancera pluća. No, u najvećem broju slučajeva, pristupa se ciljanom uništavanju ćelija raka, bez prethodnog poznavanja njegove molekularne etiologije. 

Strategija genske terapije raka se, u principu, paralelno razvija u dva glavna pravca.

* **Strategija redukcije tumora** je motivirana činjenicom da brojni oblici genske, kao ni bilo koje druge terapije raka, ne rezultiraju potpunim uništenjem ciljanih tumorskih ćelija, diferencirajući ih od zdravog tkiva. Naprimjer, genska terapija direktnog genskog transfera u tumorske stanice ne osigurava potpunu (100%) uspješnost kao ni bilo koji drugi vid transformacije ćelija. Zbog toga je ovaj pristup, u suštini, rafiniranje klasičnog tretmana u liječenju raka (konvencionalne terapije i hirurškog uklanjanja), a ne novi, zasebni oblik liječenja.
* **Strategija eliminacije tumora** teži ka potpunom uništavanju ćelija raka. Ako se, na primjer, imuno–ćelije uspiju stimulirati na specifični imuni odgovor, onda je moguće govoriti o potpunom izliječenju. Bez obzira na primijenjenu terapiju, potpuna eliminacija ćelija raka je prava rijetkost, jer njegove ćelije rapidno proliferiraju, uz selektivno preživljavanje onih najotpornijih. One se kasnije dijele i postaju potpuno rezistentne na propisanu terapiju.

Genska imunoterapija infektivnih oboljenja ima nešto drugačiji pristup u odnosu na onu kod liječenja raka. Zajedničko im je to da provociraju specifični imuni odgovor koji, u slučaju infektivnih oboljenja, inhibira ćelijski ciklus infektivnog agensa, onemogućavajući tako širenje infekcije. Neki infektivni agensi su genetički stabilniji, dok drugi, pak, brzo evoluiraju u rezistentne sojeve i otežavaju opći pristup u liječenju. Jedan od najeklatantnijih primjera ovakvog infektivnog agensa je *HIV*–1, dobropoznati uzročnik AIDS–a koji ima visoku stopu mutacija i brzu evoluciju.

Genetička transformacija limfocita u *ex vivo* genskoj terapiji raka, u jednom od svojih ishodišnih protokola, bazira se na ciljanom uništavanju tumora stranim proteinom. Ovakva terapija se smatra vidom adaptivne imunoterapije, budući da se gen za citokin – faktor nekroze tumora α (*TNF*α) unosi u tumor–filtrirajuće limfocite (TILs) i pospješuje njihovu antitumorsku efikasnost. *TIL* limfociti su, ustvari, normalno prisutni T–limfociti koji imaju sposobnost da prepoznaju i filtriraju tumorske depozite kao što su, primjerice, metastaze melanoma. T–ćelije produciraju *TNF*α protein koji, injiciran u dovoljnim količinama u laboratorijskog miša, dovodi do eliminacije tumora. U čistom stanju, *TNF*α je toksična supstanca, pa nakon direktnog injiciranja u organizam čovjeka uzrokuje brojne negativne nus–pojave. Zato se alternativno pristupa direktnoj primjeni *TIL*–ova u tumor (kao svojevrsnih prenosilaca antitumorskog proteina). Cijela postavka bazira se na tome da nakon injiciranja transformiranih *TIL*–limfocita, koji nose gen za antitumorski protein, dolazi do lokalizirane aktivacije TIL–limfocita i produkcije antitumorskog proteina te, shodno tome, i regresije tumora. Ipak, ispostavilo se da je efikasnost ove terapije dosta niska, a da ograničavajući faktori jesu (ne)uspješnost transformacije *TIL*–limfocita i *down*–regulacija ekspresije introduciranog gena za antitumorski protein.

Adaptivna imunoterapija genetičkom modifikacijom tumorskih ćelija je zasnovana na rezultatima laboratorijskih istraživanja genetički modificiranih tumorskih ćelija eksperimentalnih životinja. Dokazano je da transformirane ćelije sa insertom kodirajućeg gena za različite tipove citokina (interleukine, *TNF*α, interferone itd.), reimplantirane u miša, otvaraju nove mogućnosti genske terapije. U svakom slučaju, genetički promijenjene ćelije tumora ili više ne rastu ili u početku rastu a zatim degradiraju. Pored toga, reimplantacija netransformiranih tumora dovodi do sistemskog imunskog odgovora miševa na nemodificirane tumore. Ovaj pristup je pokazao manju efikasnost kad se eksperimentiralo većim i već formiranim tumorima. Ipak, modifikacija tumora i njihovo korištenje kao svojevrsnih antitumorskih vakcina (indukcija vlastitog imunog odgovora na specifične tumorske produkte) i dalje je predmet intenzivnog istraživanja u liječenju raka. 

Uvođenje specifičnih gena retrovirusnom transformacijom tumora kao što su određeni HLA antigeni također je usmjereno ka indukciji imunog odgovora na tumor. Retrovirus–posredovanom inkorporacijom gena za *HLA*–57 antigen u tumor kod osoba koji ne posjeduju  *HLA*–57 antigen dovodi do indukcije imunog odgovora prema *HLA*–57 proteinu. Ciljani imuni odgovor konsekventno biva usmjeren na tumor koji producira strani antigen. Kasnije se stečeni imunitet može aktivirati u slučajevima kada se javlja isti tip tumora, čak i ako ne producira strani antigen (*HLA*–57).

Adaptivna imunoterapija genetičkom modifikacijom fibroblasta je razvijena na temelju iskustava da je otežana kultivacija tumorskih ćelija in vitro jedan od delikatnijih problema u *ex vivo* terapiji tumorskih oboljenja. U dugotrajnoj kulturi tumora opstaje manje od 50% ćelija. Kao zamjena za tumorske ćelije najčešće se koriste fibroblasti. Introdukcijom gena za citokine *IL*–2 i *IL*–4 u genom fibroblasta kože stvara se osnova za klinička istraživanja raka dojke, kolorektalnog kancera, melanoma i karcinoma renalnih ćelija. Transformirani fibroblasti (sa kapacitetom sinteze citokina) se injiciraju subkutano u smjesi sa ozračenim autolognim tumorskim ćelijama. Očekuje se da će lokalna produkcija citokina u transgenim inducirati imuni odgovor usmjeren i na okolne, ozračene tumorske ćelije, odnosno razviti sistemski antitumorski imunski odgovor.

Brojne su tehnike transformacije koje za cilj imaju modifikaciju tumorskih stanica in vivo. Najčešće je u upotrebi adaptivna imunoterapija kad se u čvrste tumore direktno apliciraju modificirane liposome koji sadrže gene za *HLA*–B7. Tumorske ćelije fagocitiraju liposome i eksprimiraju strane antigene. U nekim slučajevima primjenjuje se retroviralna transformacija tumora sa proterapeutikom, koji slabi tumorske ćelije i izlaže ih destrukciji nakon aplikacije glavnog terapeutika. Jedan od krunskih primjera uspješnosti genske terapije in vivo koji je uspio izbalansirati neophodne uslove preciznosti i specifičnosti djelovanja jeste direktna imunoterapija multiformnog glioblastoma putem ćelija fibroblasta, koje produciraju retroviralne faktore. Oni opet, ciljano djeluju samo na ćelije u fazi dijeljenja (tumorske), ali ne i na već diferencirane ćelije (okolne ćelije mozga).

Ksenotransplantacija transgenih organa i gensko farmerstvo
----------------------------------------------------------

Posebne nade u mogućnost transplantacije probudile su uspješne genetičko–inženjerske manipulacije organima nekoliko životinjskih vrsta.

Ksenotransplantacija , sljedstveno općoj definiciji, u medicinskoj primjeni podrazumijeva presađivanje animalnih (umjesto humanih) tkiva i organa u organizam ugroženih pacijenata. Tako je moguće transplantirati srce, pluća, jetru, bubrege, pankreas i druge organe, iz dva osnovna razloga.

* Prva solucija je razvijena za potrebe zaštite donorskih organa tokom nekoliko sati.
* Druga varijanta je u funkciji prevencije odbacivanja transplantata aplikacijom imunodepresivnih lijekova.

Sve su češće sugestije znanstvenika za razvoj protokola transplantacije organa animalnog porijekla. Obično se mislilo da bi ne–hominidni primati, a osobito šimpanze ili babuni, mogli biti imunološki najprikladniji kao izvor organa za ovakve zahvate. Međutim, majmuni se sporo razmnožavaju i teško mogu podmiriti potencijalne potrebe za traženim organima. Pored toga, postoje i izvjesne poteškoće u procesuiranju njihovog kloniranja. Nasuprot tome, kultivirano stočarstvo već tradicionalno uključuje svinje i ostale domesticirane životinje kao izvor mesne hrane, a neke od njih su veoma plodonosne. Tako, ženka svinje može godišnje imati po dva okota sa po (prosječno) desetak mladunaca. 

Jedan od mogućih oblika primjene ove tehnologije je i terapeutsko kloniranje organa i tkiva za transplantaciju. Taj proces se zasniva na ekstrakciji DNK individue kojoj je potrebna transplatacija. Izoliriana DNK se zatim ubacuje u denukleiranu jajnu ćeliju. Nakon što se dokaže da takva jajna ćelija sadrži pacijentovu DNK, inaktivira se mitoza, da bi se embrionalne stem ćelije mogle upotrijebiti za generiranje kompatibilnih tkiva i organa. Takve tranplantate je moguće prenijeti u pacijenta bez rizika od odbacivanja Podrazumijeva se da je primjena ovakvog postupka moguća tek nakon savladavanja mnogih imunoloških, metodološko–aplikacijskih, tehničkih i drugih prepreka. 

Transgene životinje se produciraju tako što se: 

* direktno u jajnu ćeliju ubaci manipulirani gen

ili se

* jajna ćelija recipijenta denukleira in vitro, a zatim se u nju implantira genetički transformirano donor–jedro (sa inkorporiranim genom za kodiranje poželjnog proteina).

Tako transformirana jajna ćelija (zigot) se unosi u uterus majke – primaoca (ili surogat – majke). Nakon normalnog razvoja transformiranog zigota rađaju se genetički modificirane jedinke. Primjenom opisane procedure oni se zatim mogu klonirati u praktično beskonačno mnogo kopija.

Razumljivo je da ljudski organizam violentno odbacuje implantirane nativne svinjske organe. Genetičko inženjerstvo, međutim, može omogućiti da takvi transplantati izgube izvornu antigenost. Tako su već producirani sojevi genetički modificiranih svinja čiji organi u ljudskom organizmu mogu opstati i po nekoliko mjeseci. Oni se mogu upotrijebiti za premoštavanje vremenske distance između odluke za transplantaciju i pribavljanja kompatibilnog humanog izvora organa – transplantata. Od svih uspješno kloniranih životinja, svinje imaju najveću "sličnost" sa tkivima i organima čovjeka. Da bi uopće postojala mogućnost tranplantacije svinjskih organa i tkiva u organizam čovjeka potrebno je izvršiti inaktivaciju gena (*knock–out*) koji kodiraju produkciju proteina koji izazivaju imunu reakciju čovjeka. Proces inaktivacije se vrši u jednoj individualnoj ćeliji koja se koristi za produkciju kompatiblnih organa. Dvostruka inaktivacija (double knock–out) gena svinje podrazumijeva genetičku manipulaciju u cilju ukidanja djelovanja obje homologne kopije gena odgovornih za odbacivanje transplatata. Tako je, između ostalog, i produkcija transgenih svinjskih organa koji su široko prihvatljivi pacijentima krvne grupe 0 (univerzalnim davaocima – bez glavnih antigena ABO sistema) jedan od urgentnih ciljeva u ovoj oblasti.

"Genske farme" , "gensko farmerstvo", "uzgoj gena" (i tome slično) su među novijim terminima u vokabularu biotehnologije na bazi genetičkog inženjerstva. Ovakve farme su već zasnovane u mnogim biotehnološkim kompanijama razvijenog svijeta. Geni koji kodiraju biosintezu dijagnostički i terapeutski zanimljivih proteina su inkorporirani u molekule animalne DNK, a poželjne – namjenske supstance se luče u životinjskom mlijeku. Proizvedene su i transgene biljke, koje sintetiziraju lijekove za tretman cistične fibroze, kancera, krvnih bolesti i drugih kompleksnih poremećaja. Antitrombin III (za prevenciju zgrušavanja krvi tokom hirurških operacija) se već dobija iz mlijeka genetički transformiranih koza, a klinička ispitivanja produkata te biotehnologije su u toku.
Suvremena istraživanja mogućnosti genetičke konstrukcije i kloniranja genetički modificiranih sisara primarno su usmjerena ka ugradnji onih gena čiji se produkti ne luče u mlijeku, nego u urinu (kod visokoreproducibilnih miševa, npr.). Motivi takvih ambicija su, prije svega, praktične naravi: ekskrecija urina je permanentna fiziološka funkcija svih životinja, a mlijeko luče samo ženke – periodično, u toku laktacije.

Počeci kloniranja životinja nisu novijeg datuma, jer su prvi takvi pokušaji zabilježeni još 1952. godine. Razvoj genskog farmerstva bio je snažno stimuliran pojavom prve (sada već bivše!) transgene ovce (famozne *Dolly*, 1997.) i kloniranih miševa (1998.). Ubrzo nakon toga, klonirana je i ovca (*Polly*) sa inkorporiranim humanim genom za kodiranje sinteze terapeutskog proteina, koji se luči u mlijeku. Do danas je kloniran veliki broj individua različitih vrsta životinja, uključujući ovce, goveda, koze, miševe, svinje, mačke, zečeve itd. Prvi transgeni nehominidni primat bio je rezus majmun (2001.), zvani ANDi (po inverziji skraćenice DNA), u kojeg je introduciran marker–gen meduze za fluorescentni protein (GFP). Taj uspjeh se smatra jednim od najuvjerljivijih dokaza mogućnosti široke primjene genske terapije u medicini.

Genska terapija nasljednih oboljenja
------------------------------------

Genska terapija je jedno od najprivlačnijih područja razvoja, kao novih biotehnologija, tako i načina liječenja pacijenata od mnogih opakih bolesti. Njen razvoj je imanentno potaknut u liječenju bolesti koje ne slabo ili nikako ne reagiraju na klasične lijekove i tretmane.

Okarakterizirano je preko 4.000 nasljednih oboljenja, a genskom terapijom su liječeni: SCID, cistična fibroza, Gausher oboljenje, familijarna hiperholesterolemija, hemofilija, nedostatak alfa 1 antitripsina, Fanconi anemija, Hunter sindrom, hronično granulomatozno oboljenje, reumatoidni artritis i periferno vaskularno oboljenje. Najveći broj njih je izazvan nedostatkom jednog genskog produkta ili se javlja usljed produkcije mutiranog gena koji nije u stanju da obavlja svoju originalnu funkciju. Pristup genske terapije u ovom slučaju je vrlo jednostavan. Pacijentu se može pomoći samo insercijom zdrave kopije gena. Međutim, taj jednostavni koncept ne implicira mogućnost da se ovakvi protokoli mogu uspješno primijeniti i na pacijenta.

Problemi u napretku takvih tehnologija se vežu za činjenicu da je broj genetičkih oboljenja za koja je identificiran odgovarajući gen odgovoran za bolest, u suštini, mali. Problem je i pojava da se niti jedan od vektorskih sistema za isporuku gena nije pokazao kompletno uspješnim. Neka nasljedna oboljenja se odlikuju kompleksnošću jer se efekti nedostatka gena manifestiraju u više organa, tj. tkiva. Zato je ciljani gen teško ubaciti u aficirane ćelije. Regulacija nivoa ekspresije se također pokazala problematičnom. I konačno, pitanje atraktivnosti obrade pacijenata na ovaj način je također diskutabilno zato što se farmaceutske kuće više bave tretmanom oboljenja poput kancera koja su moderna oboljenja današnjice, a broj pacijenata koji imaju genetička oboljenja, u poređenju sa ovim prvim, relativno je mali.

U inicijalnoj fazi ispitivanja ovih oboljenja, naučnici su se fokusirali na hemoglobinopatije. One su davno bile okarakterizirane na molekulskoj razini, kada je uočeno da se njihova detekcija svodi na analizu α– i β–lanaca hemoglobina. Ovom u prilog je išla i činjenica da se ciljane ćelije koštane srži mogu (relativno lako) ukloniti i zamijeniti. Kod hemoglobinopatija, međutim, sinteza odgovarajućih koncentracija funkcionalnog hemoglobina je ovisna o prisustvu α– i β–gena sa ispravnom sekvencom aminokiselina, ali također i sa detaljnom regulacijom genske ekspresije. Tako čvrsta regulacija ekspresije transferiranih gena je iznad kapaciteta tehnologije genske terapije. 

Drugo oboljenje koje se pokušalo tretirati genskom terapijom je bila SCID (ozbiljna kombinirana imunodeficijencija). Praćena je nedostatkom adenozin–dezaminaze (*ADA'*). To je rijetka genopatiju koja se ispoljava kao vrlo ozbiljna imuna deficitarnost kod djece. Enzim, inače, ima važnu ulogu u degradaciji purinskih nukleotida i katalizira izdvajanje amonijaka iz adenozina, pri čemu se stvara inozin koji se, obično, prevodi u mokraćnu kiselinu. Ovo vodi ka disfunkciji *T* i *B* limfocita. Kao što je već pomenuto, nedostatak efektivnog imunološkog sistema znači da oboljeli od *SCID*a moraju, uvjetno, biti u sterilnom ambijentu. Kada se ovaj tretman uporedi sa onim kod talasemija, regulacija ekspresije *ADA* je, izgleda, manje važna za terapeutski ishod. Kod najvećeg broja metaboličkih oboljenja izazvanih enzimskom deficitarnošću, čak je ekspresija i male frakcije enzima dovoljna za poboljšanje simptoma bolesti. Tako je 1990. godine funkcionalni *ADA*–gen bio ubačen u nukleusni materijal. Genski korigirani autologni *T*–limfociti su bili injicirani dvjema djevojkama koje pate od ovog oboljenja. Jedna pacijentica je primila 11 infuzija i od tada ta djevojčica živi, u biti, normalnim životom. I ona, kao i druga djevojčica, nastavile su primati polietilen glikola. U svojoj cirkulaciji obje imaju *T*–limfocite dobijene genetičkim injženjerstvom. Terapija se, u oba ova slučaja, pokazala uspješnom jer su se imune funkcije kod pacijenata poboljšale, ali je terapija tekla sa *PEG* (polietilen glikol) i *ADA* lijekom koji je također uspješan u terapiji.

Gen za cističnu fibrozu je identificiran 1989. godine. On kodira 170–*kD*–protein, tzv. transmembranski regulator provodljivosti cistične fibroze, koji u epitelnim ćelijama djeluje kao hloridni kanal. Nasljeđivanje mutantnog *cftr* gena od oba roditelja se ispoljava kao *CF* fenotip, pri čemu 5%–10% ciljane populacije mora ima ekspresiju *CFTR* gena. Za isporuku *CF* gena u epitel pacijenata koristi se nekoliko vektora. Najčešći sistemi su adenovirusi i katjonski liposomi. Transfer vektora u ciljane ćelije se može ostvariti i tehnologijom aerosola. Isporuka *CFTR*–a je demonstrirana sa oba vektorska tipa.

* **Prve bolesti koje su liječene genskom terapijom**

|  |
| --- |
|  **Kancer**\* |
| SCID\*\* |
| Cistična fibroza |
| Gaucherova bolest |
| Familijarna hiperholesterolemija |
| Hemofilija |
| Deficijencija purinnukleozid–fosforilaze |
| Alfa–1 antitripsin deficijencija |
| Fanconijeva anemija |
| Hunterov sindrom |
| Hronična granulomatozna bolest |
| Reumatoidni artritis |
| Periferna vaskularna bolest |
| AIDS |
|

- \* Melanom, neuroblastom, malignomi mozga, glave i vrata, pluća, jetre, bubrega, rak jajnika, rak dojke, kolona, prostate, mezoteliom, leukemija, limfom, multipli mijelom.  

- \*\* SCID = **S**evere **C**ombined **I**mmuno**d**eficiency – kombinirana imunodeficijencija.

Rizici kloniranja i genske terapije
-----------------------------------

Uz sve elaborirane prednosti kloniranja i genske terapije, postoje i brojni (stvarni ili hipotetski) rizici aplikacije navedenih biotehnologija. Reproduktivno kloniranje je skupo i relativno neefikasno. Tako, npr. više od 90% pokušaja kloniranja ne producira vijabilne potomke, a za realizaciju jednog viabilnog klona potrebno je više od 100 transnuklearnih operacija. Također je uočeno da su kod kloniranih životinja frekventne pojave potiskivanja imune funkcije, uz visoku stopu infekcija, kancera i drugih bolesti. Zabilježeno je da takve životinje umiru ranije nego što je prosječni vijek vrste kojoj pripadaju. Budući da se u procesu kloniranja multipliciraju obilježja samo jedne individue, takav genetički *imprinting* može dovesti i do razvoja abnormalnosti kloniranih embriona.

Mnogi eksperti upozoravaju i na mogućnost inkorporiranja ebola ili MSC virusa ("kravljeg ludila") u ljudski genom i pojave odgovarajućih i drugih pandemija. Istovremeno, u jednoj od prihvatljivijih hipoteza, naučnici vjeruju da je HIV u genom ljudske vrste inkorporiran konzumacijom majmunskog mesa. Argumentacija da je takva opasnost izbjegnuta u slučaju prehrane svinjskim mesom i njegovim prerađevinama traži se u činjenici da je ono u ljudski jelovnik uključeno još prije 10–12 milenija (u bliskoistočnoj i kineskoj regiji domestikacije), a bez registriranih masovnih i ozbiljnijih infekcija takve prirode.

Povezano
--------

* Genetičko testiranje
* Genetička konsultacija
* Genetička identifikacija
* Genetička analiza

Vanjski linkovi
---------------

* Gene Therapy: Molecular Bandage? Arhivirano 2014-03-05 na Wayback Machine-u University of Utah's Genetic Science Learning Center
* The American Society of Gene & Cell Therapy Arhivirano 2009-11-29 na Wayback Machine-u
* The European Society of Gene & Cell Therapy
* Research Group at Cambridge, UK working on overcoming current hurdles to successful gene therapy Arhivirano 2006-09-23 na Wayback Machine-u
* Council for Responsible Genetics
* Molecular Medicine and Gene Therapy at Lund University
* Gene Therapy Frees β-Thalassemia Patient From Transfusions
* Clinical Trial at Sloan Kettering
* Stem Cell Therapy Trial Offers Hope