Дијаграм што го илустрира процесот на развој на вакцината против птичји грип со техники на обратна генетика
**Обратна генетика** — метод во молекуларната генетика што се користи за да помогне во разбирањето на функцијата на генот преку анализа на фенотипските ефекти предизвикани од генетско инженерство и специфични секвенци на нуклеинска киселина во генот. Процесот продолжува во спротивна насока за да се проследат генетските екрани на класичната генетика. Додека напредната генетика се обидува да ја пронајде генетската основа на фенотипот или особина, обратната генетика бара да открие кои фенотипови се контролирани од одредени генетски секвенци.

Автоматското секвенцирање на ДНК релативно брзо генерира големи количини на податоци за геномската секвенца. Обратна генетика се обидува да поврзе дадена генетска секвенца со специфични ефекти врз организмот. Системите за обратна генетика, исто така, можат да овозможат закрепнување и генерирање на заразни или неисправни вируси со посакувани мутации. Ова овозможува можност за проучување на вирусот *ин витро* и *ин виво*.

Користени техники
-----------------

Со цел да го научат влијанието што една низа го има врз фенотипот или да ја откријат неговата биолошка функција, истражувачите можат да направат промена или да ја нарушат дезоксирибонуклеинската киселина. Откако ќе се направи оваа промена, истражувачот може да го бара ефектот од таквите промени во целиот организам. Постојат неколку различни методи на обратна генетика:

### Насочени бришења и точкасти мутации

Локусната насочена мутагенеза е софистицирана техника која може или да ги промени регулаторните региони во промоторот на генот или да направи суптилни промени на кодот во отворената рамка за читање за да се идентификуваат важните амино остатоци за протеинската функција.

Дивиот тип Physcomitrella патенти и мовови: Девијантни фенотипови индуцирани во трансформантите на библиотеката со нарушување на генот. Растенијата од див тип и трансформирани Physcomitrella биле одгледувани на минимална „Knop" средина за да поттикнат диференцијација и развој на гаметофори. За секоерастение, прикажан е преглед (горниот ред; лентата за скала одговара на 1 mm) и одблиску (долниот ред; лентата за скала е еднаква на 0,5 mm). О: Хаплоидно растение мов од див тип целосно покриено со лиснати гаметофори и крупен лист од див тип. B–E: Различни мутанти. [1].
Алтернативно, техниката може да се користи за создавање на нулти алели, така што генот не е функционален. На пример, бришење на ген со таргетирање на гените ( генски нокаут) може да се направи кај некои организми, како што се квасец, глувци и мов. Уникатен меѓу растенијата, кај Physcomitrella patens, генетскиот нокаут преку хомологна рекомбинација за создавање на нокаут мов (види слика) е речиси исто толку ефикасен како кај квасецот Во случајот на системот за модел на квасец, создадени се насочени бришења во секој несуштински ген во геномот на квасецот.. Во случајот со системот на растителен модел, создадени се огромни мутантни податоци врз основа на конструкции за нарушување на генот. Во генетскиот нок-ин, ендогениот егзон се заменува со изменета секвенца на интерес.

Во некои случаи условните алели може да се користат така што генот има нормална функција додека не се активира условниот алел. Ова може да доведе до „удирање" на местата на рекомбинација што ќе предизвика бришење на генот кој е од интерес кога ќе се индуцира специфична рекомбиназа (како CRE, FLP). Рекомбиназите Cre или Flp може да се индуцираат со хемиски третмани, третмани со топлински шок или да се ограничат на одредена подгрупа на ткива.

Друга техника што може да се користи е TILLING. Ова е метод кој комбинира стандардна и ефикасна техника на мутагенеза со хемиски мутаген како што е етил метансулфонат (EMS) со чувствителна техника за скрининг на ДНК која ги идентификува точкастите мутации во целниот ген. 

Во областа на вирологијата, техниките на обратна генетика може да се користат за обновување на инфективни вируси со целосна должина со посакувани мутации или вметнувања во вирусните геноми или во специфичните гени на вирусот. Технологиите кои ги дозволуваат овие манипулации вклучуваат кружна реакција на екстензија на полимераза (КРЕП) која првпат била искористена за генерирање на инфективна cDNA за вирусот Кунџин, близок роднина на Западнонилскиот вирус. КРЕП, исто така, успешно се користи за генерирање на низа РНК вируси со позитивна смисла, како што е SARS-CoV-2, предизвикувачкиот агенс на КОВИД-19.

### Замолчување на гените

Откритието на т.н. замолчување на гените со користење на двоверижна РНК, исто така познато како РНК интерференција (РНКи), и развојот на генски нокдаун со помош на Морфолино олигос, го направиле нарушувањето на генската експресија пристапна техника за многу повеќе истражувачи. Овој метод често се нарекува генски нокдаун бидејќи ефектите од овие реагенси се генерално привремени, за разлика од генските нокаути кои се трајни.

РНКи создава специфичен нокаут ефект без всушност да мутира на ДНК од интерес. Во C. elegans, РНКи се користи за систематско мешање со изразувањето на повеќето гени во геномот. РНКи делува така што ги насочува клеточните системи да ја деградираат целната гласничка РНК (mRNA). 

Интерференцијата на РНКи, конкретно замолчувањето на гените, станала корисна алатка за замолчување на изразувањето на гените и за идентификување и анализа на нивниот фенотип за губење на функцијата. Кога се случуваат мутации во алели, функцијата што ја претставува, исто така, е мутирана и изгубена; ова генерално се нарекува мутација со губење на функцијата. Способноста да се анализира фенотипот со губење на функцијата овозможува анализа на функцијата на генот кога нема пристап до мутантните алели.

Додека РНКи се потпира на клеточните компоненти за ефикасност, едноставна алтернатива за соборување на гените е Morpholino antisense oligos. Морфолиносите се врзуваат и го блокираат пристапот до целната mRNA без да бараат активност на клеточните протеини и без нужно да ја забрзаат деградацијата на mRNA. Морфолиносите се ефикасни во системи кои се движат по сложеност од превод без клетки во епрувета до ин виво студии кај големи животински модели.

### Пречки со помош на трансгени

Молекуларниот генетски пристап е создавање на трансгенски организми кои прекумерно изразуваат нормален ген од интерес. Резултирачкиот фенотип може да ја одразува нормалната функција на генот.

Алтернативно, можно е прекумерно да се изразат мутантни форми на ген кои се мешаат во функцијата на нормалниот (див тип) ген. На пример, прекумерното изразување на мутантен ген може да резултира со високи нивоа на нефункционален протеин кое може да резултира со доминантна негативна интеракција со протеинот од див тип. Во овој случај, мутантската верзија ќе се натпреварува за партнерите од дивиот тип протеини што ќе резултира со мутант фенотип.

Други мутантни форми може да резултираат со протеин кој е ненормално регулиран и конститутивно активен („вклучен" цело време). Ова може да се должи на отстранување на регулаторен домен или мутација на специфичен амино остаток што е реверзибилно модифициран (со фосфорилација, метилација или убиквитинација). Секоја промена е критична за модулирање на протеинската функција и често резултира со информативни фенотипови.

Синтеза на вакцини
------------------

Атенуираните вируси се создаваат со размножување на жив вирус под нови услови, како што е јајцето од пиле. Ова произведува вирусен сој кој е сè уште жив, но не е патоген за луѓето, бидејќи овие вируси се претвораат во дефекти со тоа што не можат да го реплицираат нивниот геном доволно за да се размножуваат и доволно да заразат домаќин. Сепак, вирусните гени сè уште се изразуваат во клетката на домаќинот преку еден циклус на репликација, што овозможува развој на имунитет. 

  

Вакцините создадени преку обратни генетски методи се познати како атенуирана вакцини, именувани затоа што содржат ослабени (атенуирани) живи вируси. Атенуираните вакцини се создаваат со комбинирање на гени од нов или актуелен вирус на вирус со претходно атенуирани вируси од истиот вид. Атенуираните вируси се создаваат со размножување на жив вирус во нови услови, како што е јајцето од пиле. Ова создава вирусен вид кој е сè уште жив, но не е патоген за луѓето, бидејќи овие вируси се претвораат во дефекти со тоа што не можат доволно да го реплицираат нивниот геном за да се размножуваат и доволно да заразат домаќин. Сепак, вирусните гени сè уште се изразуваат во клетката на домаќинот преку еден циклус на репликација, што овозможува развој на имунитет.

### Вакцина против грип

Вообичаен начин да се создаде вакцина користејќи обратни генетски техники е да се користат плазмиди за синтеза на атенуирани вируси. Оваа техника најчесто се користи во годишното производство на вакцини против грип, каде што осум плазмиден систем може брзо да произведе ефективна вакцина. Целиот геном на вирусот на инфлуенца А се состои од осум РНК сегменти, така што комбинацијата од шест атенуирани вирусни cDNA плазмиди со два плазмиди од див тип овозможуваат конструирање на атенуиран сој на вакцина. За развој на вакцини против грип, четвртиот и шестиот сегмент на РНК, коишто ги кодираат протеините на хемаглутинин и неураминидаза, соодветно, се земени од циркулирачкиот вирус, додека другите шест сегменти се добиени од претходно атенуиран главен сој. Протеините HA и NA покажуваат висока разновидност на антиген, и затоа се земени од тековниот сој за кој се произведува вакцината за да се создаде добро усогласена вакцина.

Плазмидот што се користи во овој систем со осум плазмиди содржи три главни компоненти кои овозможуваат развој на вакцина. Прво, плазмидот содржи рестриктивни места кои ќе овозможат инкорпорирање на гени на грип во плазмидот. Второ, плазмидот содржи ген за отпорност на антибиотици, што овозможува избор на само плазмиди кои го содржат точниот ген. И на крај, плазмидот содржи два промотори, човечки pol 1 и pol 2 промотор кои ги транскрибираат гените во спротивни насоки.

cDNA секвенците на вирусна РНК се синтетизираат од атенуирани мастер соеви со користење на RT-PCR. Оваа cDNA потоа може да се вметне помеѓу промотор на РНК полимераза I (Pol I) и терминаторска секвенца преку дигестија со рестриктивен ензим. Секвенцата на cDNA и pol I потоа, пак, е опкружена со промотер на РНК полимераза II (Pol II) и полиаденилација. Целата оваа низа потоа се вметнува во плазмид. Шест плазмиди добиени од атенуираниот главен вид cDNA се котрансфектираат во целна клетка, често пилешко јајце, заедно со два плазмида од тековно циркулирачкиот вид на грип од див тип. Внатре во целната клетка, двата „наредени" ензими Pol I и Pol II ја транскрибираат вирусната cDNA за да ги синтетизираат и вирусната РНК со негативна смисла и mRNA со позитивна смисла, ефикасно создавајќи атенуиран вирус. [1] Резултатот е дефектен сој на вакцина кој е сличен на сегашниот вид на вирус, што му овозможува на домаќинот да изгради имунитет. Овој синтетизиран сој на вакцина потоа може да се користи како вирус на семе за да се создадат дополнителни вакцини.

### Предности и недостатоци

Вакцините направени од обратна генетика имаат неколку предности во однос на традиционалните дизајни на вакцини. Најзабележителна е брзината на производство. Поради високата антигенска варијација во HA и NA гликопротеините, обратниот генетски пристап овозможува брзо формулирање на потребниот генотип (т.е. оној што содржи HA и NA протеини земени од тековно циркулирачките вирусни соеви). Дополнително, бидејќи финалниот производ на производството на вакцини ослабено со обратна генетика е жив вирус, се покажува повисока имуногеност отколку кај традиционалните инактивирани вакцини, кои мора да се уништат со употреба на хемиски процедури пред да се пренесат како вакцина. Сепак, поради живата природа на атенуираните вируси, може да настанат компликации кај пациенти со имунодефициенција. Исто така, постои можност дека мутацијата на вирусот би можела да доведе до тоа вакцината да се претвори во жив неослабен вирус.

Наводи
------

1. ↑  Chalfie M, Girard L (2007). *WormBook the online review of C. elegans biology*. Wormbook.org. OCLC 1067052025.
2. ↑  Kanai Y, Kobayashi T (September 2021). „FAST Proteins: Development and Use of Reverse Genetics Systems for *Reoviridae* Viruses". *Annual Review of Virology*. **8** (1): 515–536. doi:10.1146/annurev-virology-091919-070225. PMID 34586868 Проверете ја вредноста `|pmid=` (help).
3. ↑  Egener T, Granado J, Guitton MC, Hohe A, Holtorf H, Lucht JM, и др. (July 2002). „High frequency of phenotypic deviations in *Physcomitrella patens* plants transformed with a gene-disruption library". *BMC Plant Biology*. **2**: 6. doi:10.1186/1471-2229-2-6. PMC 117800. PMID 12123528.
4. ↑  Reski R (1998). „*Physcomitrella* and *Arabidopsis*: the David and Goliath of reverse genetics". *Trends Plant Sci*. **3** (6): 209–210. doi:10.1016/S1360-1385(98)01257-6.
5. ↑  Winzeler EA, Shoemaker DD, Astromoff A, Liang H, Anderson K, Andre B, и др. (August 1999). „Functional characterization of the *S. cerevisiae* genome by gene deletion and parallel analysis". *Science*. **285** (5429): 901–906. doi:10.1126/science.285.5429.901. PMID 10436161.
6. ↑  Schween G, Egener T, Fritzowsky D, Granado J, Guitton MC, Hartmann N, и др. (May 2005). „Large-scale analysis of 73 329 *Physcomitrella* plants transformed with different gene disruption libraries: production parameters and mutant phenotypes". *Plant Biology*. **7** (3): 228–237. doi:10.1055/s-2005-837692. PMID 15912442. S2CID 260251655 Проверете ја вредноста `|s2cid=` (help).
7. ↑  Manis JP (December 2007). „Knock out, knock in, knock down--genetically manipulated mice and the Nobel Prize". *The New England Journal of Medicine*. Massachusetts Medical Society. **357** (24): 2426–2429. doi:10.1056/NEJMp0707712. OCLC 34945333. PMID 18077807.
8. ↑  Edmonds J, van Grinsven E, Prow N, Bosco-Lauth A, Brault AC, Bowen RA, и др. (February 2013). „A novel bacterium-free method for generation of flavivirus infectious DNA by circular polymerase extension reaction allows accurate recapitulation of viral heterogeneity". *Journal of Virology*. **87** (4): 2367–2372. doi:10.1128/JVI.03162-12. PMC 3571472. PMID 23236063.
9. ↑  Amarilla AA, Sng JD, Parry R, Deerain JM, Potter JR, Setoh YX, и др. (June 2021). „A versatile reverse genetics platform for SARS-CoV-2 and other positive-strand RNA viruses". *Nature Communications*. **12** (1): 3431. Bibcode:2021NatCo..12.3431A. doi:10.1038/s41467-021-23779-5. PMC 8187723 Проверете ја вредноста `|pmc=` (help). PMID 34103499 Проверете ја вредноста `|pmid=` (help).
10. ↑  McClean P. „Types of Mutations". *Genes and Mutations*. North Dakota State University. Посетено на April 27, 2015.
11. ↑  Tierney MB, Lamour KH. „An Introduction to Reverse Genetic Tools for Investigating Gene Function". *APSnet*. The American Phytopathological Society. Архивирано од изворникот на 2018-11-23. Посетено на 2015-04-28.
12. 1 2 3  Hoffmann E, Krauss S, Perez D, Webby R, Webster RG (August 2002). „Eight-plasmid system for rapid generation of influenza virus vaccines" (PDF). *Vaccine*. **20** (25–26): 3165–3170. doi:10.1016/s0264-410x(02)00268-2. PMID 12163268. S2CID 17514938. Архивирано од изворникот (PDF) на 2017-04-02.
13. ↑  Badgett MR, Auer A, Carmichael LE, Parrish CR, Bull JJ (October 2002). „Evolutionary dynamics of viral attenuation". *Journal of Virology*. **76** (20): 10524–10529. doi:10.1128/JVI.76.20.10524-10529.2002. PMC 136581. PMID 12239331.
14. ↑  Lauring AS, Jones JO, Andino R (June 2010). „Rationalizing the development of live attenuated virus vaccines". *Nature Biotechnology*. **28** (6): 573–579. doi:10.1038/nbt.1635. PMC 2883798. PMID 20531338.
15. ↑  Hoffmann E, Neumann G, Kawaoka Y, Hobom G, Webster RG (May 2000). „A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids". *Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America*. **97** (11): 6108–6113. Bibcode:2000PNAS...97.6108H. doi:10.1073/pnas.100133697. PMC 18566. PMID 10801978.
16. ↑  Mostafa A, Kanrai P, Petersen H, Ibrahim S, Rautenschlein S, Pleschka S (2015-01-23). „Efficient generation of recombinant influenza A viruses employing a new approach to overcome the genetic instability of HA segments". *PLOS ONE*. **10** (1): e0116917. Bibcode:2015PLoSO..1016917M. doi:10.1371/journal.pone.0116917. PMC 4304806. PMID 25615576.
17. ↑  Stobart CC, Moore ML (June 2014). „RNA virus reverse genetics and vaccine design". *Viruses*. **6** (7): 2531–2550. doi:10.3390/v6072531. PMC 4113782. PMID 24967693.
18. ↑  Kroger AT, Atkinson WL, Sumaya CV, Pickering LK, и др. (Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP)) (28 January 2011). „General Recommendations on Immunization". *Morbidity and Mortality Weekly Report (MMWR)* (англиски). U.S. Centers for Disease Control and Prevention. 60(RR02);1-60. Посетено на 2017-04-01.
19. ↑  Shimizu H, Thorley B, Paladin FJ, Brussen KA, Stambos V, Yuen L, и др. (December 2004). „Circulation of type 1 vaccine-derived poliovirus in the Philippines in 2001". *Journal of Virology*. **78** (24): 13512–13521. doi:10.1128/JVI.78.24.13512-13521.2004. PMC 533948. PMID 15564462.

Понатамошно читање
------------------

* Neumann G, Hatta M, Kawaoka Y (2003). „Reverse genetics for the control of avian influenza". *Avian Diseases*. **47** (3 Suppl): 882–887. doi:10.1637/0005-2086-47.s3.882. PMID 14575081. S2CID 30492604.
* Neumann G, Fujii K, Kino Y, Kawaoka Y (November 2005). „An improved reverse genetics system for influenza A virus generation and its implications for vaccine production". *Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America*. **102** (46): 16825–16829. Bibcode:2005PNAS..10216825N. doi:10.1073/pnas.0505587102. PMC 1283806. PMID 16267134.
* Ozaki H, Govorkova EA, Li C, Xiong X, Webster RG, Webby RJ (February 2004). „Generation of high-yielding influenza A viruses in African green monkey kidney (Vero) cells by reverse genetics". *Journal of Virology*. **78** (4): 1851–1857. doi:10.1128/JVI.78.4.1851-1857.2004. PMC 369478. PMID 14747549.

Надворешни врски
----------------

|  |
| --- |
| Библиотечни извори за  **Обратна генетика** 

---

 |
| * Извори во вашата библиотека
* Извори во други библиотеки
 |

* Reassortment vs. Reverse Genetics Архивирано на 4 јули 2008 г.
* Reverse Genetics: Building Flu Vaccines Piece by Piece