Кај *Xenopus laevis*, спецификацијата на трите герминативни слоеви (ендодерм, мезодерм и ектодерм) се јавувала во фазата на бластула. Биле направени големи напори за да се утврделе факторите кои го специфицирале ендодермот и мезодермот. Од друга страна, само неколку примери на гени кои биле потребни за спецификација на ектодермот биле опишани во последната деценија. Првата молекула идентификувана дека била потребна за спецификација на ектодермот била убиквитин лигаза **Ектодермин** (Ecto, TIF1-γ, TRIM33); подоцна, било откриено дека деубиквитинирачкиот ензим, **FAM/USP9x**, можел да ги надмине ефектите на убиквитинација направени од Ектодермин во Smad4 (Дупонт и сор. 2009). Два фактори на транскрипција биле предложени за контрола на генската експресија на ектодермалните специфични гени: **POU91/Oct3/4** и **FoxIe1/Xema**. Нов фактор специфичен за ектодермот, **XFDL156**, се покажал како суштински за супресија на диференцијацијата на мезодермот од плурипотентните клетки.

 Протеини потребни за ектодермална спецификација.

Ектодермин и ФАМ
----------------

### Биолошка улога на Ектодермин и ФАМ

Протеинот Ектодермин, најпрво идентификуван во ембрионите *на Xenopus*, ја промовирал ектодермалната судбина и го потиснувал формирањето на мезодермот посредувано од сигнализирањето на трансформирачкиот фактор на раст β (TGFβ) и коскените морфогени протеини (BMP), членови на TGFβ-суперфамилијата. Кога TGFβ лигандите се врзувале за TGFβ рецепторите, тие предизвикувале активирање на сигналните трансдуктори R-Smads (Smad2, Smad3). Smad4 формирал комплекс со активирани R-Smads и ја активирал транскрипцијата на специфични гени како одговор на TGFβ сигналот. Патеката BMP ги пренела своите сигнали на сличен начин, но преку други видови R-Smads (Smad1, Smad5 и Smad8). Факторот на транскрипција Smad4 бил единствениот заеднички посредник споделен помеѓу двете патишта на TGFβ и BMP. За време на спецификацијата на ектодермот, функцијата на Smad4 била регулирана со убиквитинација и деубиквитинација направени од ектодермин и FAM, соодветно. Состојбата на убиквитинација на Smad4 ќе определела дали бил во состојба да одговори на сигналите добиени од TGFβ и BMP. Рамнотежата на активноста, локализацијата и времето на TGFβ и BMP трансдукторите, Smad4, FAM и Ectodermin требало да се постигне за да можело да се модулира генската експресија на гените потребни за формирање на герминативниот слој.

### Ектодермин и ФАМ функции

cDNA библиотека од фазата на бластула на ембрионот на жаба била клонирана во плазмиди за изразување на РНК за да генерирала синтетичка mRNA. Потоа, мРНК била инјектирана во неколку ембриони *Xenopus* во фаза на четири клетки и се испитувала во раните ембриони на бластула за проширување на регионот на ектодермалниот маркер Sox2 и намалување на експресијата на мезодермалниот маркер Xbra. Ектодермин бил еден од 50 клонови што го претставил овој фенотип кога се инјектирал во ембриони. Идентификацијата на FAM била направена преку siRNA екран за да се најделе деубиквитинази кои го регулирале одговорот на TGFβ.

### Идентификација на Ектодермин и ФАМ

Ектодермин mRNA бил мајчински депониран во животинскиот пол на јајцето. Во раниот стадиум на бластула на ембрионот, Ектодермин mRNA и протеинот формирале градиент што одел од животинскиот пол (највисока концентрација) до маргиналната зона (најниска концентрација) за да се спречеле TGFβ и нодалните сигнали кои индуцирале мезодерм што потекнувал од растителниот пол. Ектодерминската мРНК се збогатувала во грбната страна на ембрионот, а на крајот од оваа фаза изразот постепено исчезнувала. Smad4 бил убиквитиниран од Ектодермин во јадрото и се извезувал во цитоплазмата каде што можело да се деубиквитинира со FAM; на овој начин Smad4 можел да се рециклира и повторно да биде функционален. Иако не постоел изразен профил на FAM кај раните ембриони кај *Xenopus*, кај рибата зебра, FAM хомологот се изразувал сеприсутно во фаза на две клетки, но како што развојот продолжувал, тој единствено се изразувал во цефаличниот централен нервен систем.

### Ектодермин и ФАМ локализација

Ектодермин била убиквитин Е3 лигаза која ги инхибирала сигналните патишта на TGFβ и BMP преку инхибиција на Smad4 преку убиквитинација на Лизин 519 и, исто така, директно врзување за фосфо-Smad2. Инјектирањето на Ecto mRNA во маргиналната зона доведувало до проширување на раниот ектодермален маркер, Sox2, и намалување на мезодермалните маркери (Xbra, Eomes, Vent-1, Mix-1 и Mixer). Спротивното се случувало во експериментите со нокдаун на Ектодермин со користење на морфолино стратегија; ембрионите станувале почувствителни на одговорот на Активин, тие покажувале зголемување и проширување на експресијата на мезодермалните специфични гени и ја намалувале експресијата на нервната плоча и епидермисот маркер (сокс2 и цитокератин соодветно). Во согласност со активноста на убиквитин-лигаза зависна од прстенот на прстот на Ектодермин, мутантот на екто прстенест прст (C97A/C100A) бил неактивен во добивката на функцијата. Добивањето на функцијата на FAM ги зголемувало одговорите од BMP и TGFβ и неговото губење на функцијата со мутација во критичен остаток за неговата активност предизвикала инхибиција на одговорот на TGFβ.

### Зачувување на Ектодермин и ФАМ кај други видови

Молекуларната функција на човечкиот ектодермин да дејствува како негативен регулатор на Smad4 сугерирало дека оваа специфична функција била зачувана кај лозата на 'рбетниците. Идентитетот на секвенцата помеѓу FAM хомолозите бил повисок од 90% кога се споредувале хомолозите на *Xenopus*, зебра риба, глушец и човек, што сугерирало дека ова можело да биде зачувано и меѓу другите организми. Навистина, инактивацијата на нокаут генот кај ембриони на глувци покажала дека функцијата на ектодерминот како инхибитор на сигнализацијата на TGF-бета била зачувана. Ембрионите со недостаток на ектодермин покажувале неисправен развој на предниот висцерален ендодерм (AVE), кој бил првото ткиво кое било индуцирано од TGF-бета сигналите кај ембрионите на глувци; во согласност со загубата на инхибитор, ектодермин-/- ембрионите покажале зголемена AVE индукција. Бидејќи AVE бил природен извор на секретирани TGF-бета антагонисти, оваа примарна AVE експанзија предизвикала секундарно, во подоцнежните фази, инхибиција на екстрацелуларните TGF-бета лиганди, што резултирало со недостаток на развој на мезодерм на ембриони. Овој модел бил потврден со наодот дека ектодермин-/- ембрионите биле спасени во див тип (нормален AVE, нормален развој на мезодерм) со намалување на генетската доза на главниот TGF-бета лиганд на ембрионот, Нодал. Дополнителна поддршка на улогата како TGF-бета инхибитор, ткивно селективно бришење на ектодерминот од епибластот (од кој произлегувал мезодермот, но не и AVE) го оставил AVE недопрен, но овојпат предизвикал проширување на предните мезодермални судбини, што укажувало на зголемена одговор на TGF-бета сигналите. Колективно, овие податоци ја потврдиле со генетски алатки клеточно-автономната улога на ектодерминот како инхибитор на Smad4 одговорите претходно идентификувани во ембрионите на Xenopus и човечките клеточни линии.

FOXI1e
------

### Биолошка улога на FOXI1e

За време на раниот развој кај *Xenopus*, факторот на транскрипција FoxI1e/Xema ја активирал епидермалната диференцијација и ги потиснувал специфичните гени на ендодерм и мезодерм кај животинските капи (Suri et al. 2005). Се сугерирало дека FoxI1e бил активен пред ектодермот да се диференцирал во епидермисот и централниот нервен систем.

### Идентификација на FoxI1e

Мир и соработниците, 2005 година го идентификувале FoxI1e (Xema) со избирање гени кои биле намалено регулирани под сигналите што предизвикувале мезодерм во ектодермот во споредба со растителниот регион на ран бластула ембрион. Исто така, висока експресија на овој ген била забележана кај животински капи кај ембриони на кои им недостасувал VegT во споредба со дивиот тип.

### Локализација во клетката

FoxI1e mRNA се изразувала зиготски (стадиум 8.5) и достигнувала повисоко ниво на изразување во почетокот на гаструлацијата и го одржувала тоа ниво во неврула, опашка до раните фази на полноглавец. FoxI1e имал необичен мозаичен модел на изразување, тој се изразувал прво во дорзалниот ектодерм и додека гаструлата напредувала, изразот минувал низ вентралната страна и неговата експресија била надолу регулирана во дорзалната страна кога се формирала нервната плоча. FoxI1e бил зависен од BMP сигналите во фазата на неврула, ограничувајќи ја локализацијата на FoxI1e на вентралната страна на ектодермот.

### Функција и регулација на протеини

FoxI1e/Xema припаѓала на класата FoxI1 на фамилијата на фактори за транскрипција на глава на вилушка, позната по тоа што учествува во формирањето на мезодерм, развојот на очите и спецификацијата на вентралната глава. Било предложено дека Notch и/или NODAL, изразени во вегеталниот/мезодермскиот регион на раниот бластула ембрион, потенцијално би можеле да бидат инхибитори на FoxI1e.

### Загуба и добивка на функција

Инхибицијата на созревањето на мРНК на FoxI1e со морфолино што го блокирало спојувањето покажало малформации во развојот на епидермисот и пропустливиот систем и ги намалил специфичните гени на ектодермата, додека прекумерната експресија на FoxI1e го инхибирало формирањето на мезодерм и ендодерм. Растителните структури формирале доцни бластули маси кои вообичаено би довеле до ендодерм и мезодерм, кога се инјектирале со мРНК FoxI1e, тие биле способни да изразеле ектодермални специфични маркери (пан-ектодермален Е-кадерин, епителен цитокератин, маркер на нервниот гребен Slug и нервен маркер Sox- 2) додека ендодермалните маркери (ендодермин, Xsox17a) се намалиле во експресијата.

XFDL156
-------

### Биолошката улога на XFDL156

Протеинот p53 се врзувал за промоторите на раните мезодермални гени. p53 бил мајчински депониран транскрипт кој формирал комплекс на транскрипциски фактор со Smad2 и ја поттикнувал експресијата на гените вклучени во индукцијата на мезодермот и активирањето на целните гени на TGFβ. Нуклеарниот протеин на цинк (Zn)-прст XFDL159, изразен во животинската капа, делувал како ектодермски фактор кој го специфицирал ектодермот со инхибиција на p53 од активирање на гени за мезодерм диференцијација.

### Идентификација на XFDL156

Изградба на cDNA библиотека од животински капи во фаза од 11,5, клонирана во експресивен вектор и генерирана mRNA. Синтетичката РНК потоа била инјектирана во ембриони и животинските капачиња од овие собрани ембриони биле добиени и предадени на третман со активин. Xbra бил обновен со избирање на клонот што го потиснувал мезодермалниот маркер Xbra.

### Локализација на XFDL156

Бидејќи XFDL156 бил фактор кој комуницира со p53, локализацијата на овој протеин бил во јадрото (Sasai et al. 2008). mRNA на XFDL156 била мајчински депонирана и потоа изразена зиготски. Временската рамка на генската експресија покажала повисоко ниво на изразување при рана гаструла и половина намалување на експресијата во средината на гаструлата и до стадиумот 20 изразот избледувал.

### Протеинска функција на XFDL156

Прстот на цинкот XFDR се врзувал за регулаторниот регион на p53 лоциран на C-терминалниот домен и на неговото изразување не влијаело присуството на факторите на транскрипција на активин, FoxI1e или XLPOU91.

### Загуба и добивка на функција во XFDL156

Губење на функцијата од морфолино, предизвикало неправилна мезодермална диференцијација во ектоедермалните региони; ова било предизвикано од десупресија на мезодермалните маркери (Xbra, VegT и Mix.2). Добивањето на функции предизвикувало намалување на експресијата на мезодермалните маркери.

### Зачувување на XFDL хомолозите кај други видови

Човечките и глувците хомологи на XFDR156 биле способни да ја надополнеле функцијата на XFDR за интеракција со p53 и да го инхибирале да дејствувал како фактор на транскрипција.

---

* Ectoderm induction in early blastula in Xenopus embryo.Ектодерм индукција во рана бластула кај ембрионот*Ксенопус*.

---

Наводи
------

1. ↑  Heasman, J. Quarmby, J. and Wylie, C.C. (1984). The mitochondrial cloud of Xenopus oocytes: the source of germinal granule material. Dev Biol 105, 458-469.
2. ↑  Snir, M. Ofir, R. Elias, S. and Frank, D. (2006). Xenopus laevis POU91 protein, an Oct3/4 homologue, regulates competence transitions from mesoderm to neural cell fates. EMBO J 25, 3664-3674.
3. 1 2 3  Mir, A. Kofron, M. Zorn, A.M. Bajzer, M. Haque, M. Heasman, J. and Wylie, C.C. (2007). FoxI1e activates ectoderm formation and controls cell position in the Xenopus blastula. Development 134, 779-788.
4. 1 2 3  Suri, C. Haremaki, T. and Weinstein, D.C. (2005). Xema, a foxi-class gene expressed in the gastrula stage Xenopus ectoderm, is required for the suppression of mesendoderm. Development 132, 2733-2742.
5. 1 2 3 4 5 6  Sasai, N. Yakura, R. Kamiya, D. Nakazawa, Y. and Sasai, Y. (2008). Ectodermal factor restricts mesoderm differentiation by inhibiting p53. Cell 133, 878-890.
6. 1 2 3 4 5 6 7  Dupont, S. Zacchigna, L. Cordenonsi, M. Soligo, S. Adorno, M. Rugge, M. and Piccolo, S. (2005). Germ-layer specification and control of cell growth by Ectodermin, a Smad4 ubiquitin ligase. Cell 121, 87-99.
7. ↑  Siegel, P.M. and Massague, J. (2003). Cytostatic and apoptotic actions of TGFβeta in homeostasis and cancer. Nature Reviews – Cancer 3, 807-821.
8. 1 2  Dupont, S. Mamidi, A. Cordenonsi, M. Montagner, M. Zacchigna, L. Adorno, M. Martello, G. Stinchfield, M.J. Soligo, S. Morsut, L. et al. (2009). FAM/USP9x, a deubiquitinating enzyme essential for TGFβeta signaling, controls Smad4 monoubiquitination. Cell 136, 123-135.
9. 1 2  Khut, P.Y. Tucker, B. Lardelli, M. and Wood, S.A. (2007). Evolutionary and expression analysis of the zebrafish deubiquitylating enzyme, usp9. Zebrafish 4, 95-101.
10. ↑  „Negative control of Smad activity by ectodermin/Tif1gamma patterns the mammalian embryo". *Development*. **137** (15): 2571–8. 2010. doi:10.1242/dev.053801. PMID 20573697.
11. 1 2  Mir, A. Kofron, M. Heasman, J. Mogle, M. Lang, S. Birsoy, B. and Wylie, C. (2008). Long- and short-range signals control the dynamic expression of an animal hemisphere-specific gene in Xenopus. Dev Biol 315, 161-172.
12. ↑  Pohl, B.S. Rossner, A. and Knochel, W. (2005). The Fox gene family in Xenopus laevis:FoxI2, FoxM1 and FoxP1 in early development. Int J Dev Biol 49, 53-58.
13. ↑  Matsuo-Takasaki, M. Matsumura, M. and Sasai, Y. (2005). An essential role of Xenopus Foxi1a for ventral specification of the cephalic ectoderm during gastrulation. Development 132, 3885-3894.
14. ↑  Cordenonsi, M. Dupont, S. Maretto, S. Insinga, A. Imbriano, C. and Piccolo, S. (2003). Links between tumor suppressors: p53 is required for TGFβeta gene responses by cooperating with Smads. Cell 113, 301-314.
15. ↑  Takebayashi-Suzuki, K. Funami, J. Tokumori, D. Saito, A. Watabe, T. Miyazono, K. Kanda, A. and Suzuki, A. (2003). Interplay between the tumor suppressor p53 and TGF beta signaling shapes embryonic body axes in Xenopus. Development 130, 3929-3939.