Kallusi uz agarizētas barotnes
**Auga kalluss**  ir amorfi auga audi, kuri rodas, neorganizēti vairojoties augu šūnām. Kalluss tiek definēts arī kā nediferencēto (pamataudu) šūnu masa. Kalluss var veidoties ievainojuma vietā, kā arī *in vitro* kultūrā, dediferencējoties un daloties auga eksplanta šūnām. Kalluss labāk veidojas aktīvās augšanas periodā. Pēc morfoloģiskām īpašībām izšķir blīvus/kompaktus (*compact*) un irdenus (*friable*) kallusus.

Vēsture
-------

Henri-Louis Duhamel du Monceau savā slavenākajā darbā *"Éléments d’architecture navale"* (1758) pētīja ievainojumu sadzīšanu gobām, un bija pirmais, kas aprakstīja kallusa veidošanos dzīvajiem augiem.

1908. gadā E. F. Simon izaudzēja kallusu no *poplar stems*, no kura spēja attīstīties dzinumi un saknes.

Pirmās ziņas par kallusu iegūšanu in vitro apstākļos ir no 1939. gada. P. White ieguva kallusu no audzēju attīstošiem prokambija audiem no hibrīdauga *Nicotiana glauca*, kam nebija nepieciešams izmantot papildu hormonus.

No 1954.-1955. gadam F. Skoogs atklāja kinetīnu un citus citokinīnu grupas augšanas regulatorus (fitohormonus).

1962. gadā T. Murashige un F. Skoogs izveidoja universālo augu audu kultūras barotni "MS" medium jeb "Murashige & Skoog medium", kuru joprojām izmanto arī kallusu kultūru audzēšanā.

Kallusa veidošanās
------------------

Kallusi var veidoties gan no atsevišķām šūnām, gan ievainojumu vietās augā. Ievainojums stimulē sākotnējo šūnu dalīšanos, veicinot savienojumu veidošanos. Galvenais stimulējošais savienojums ir augšanas hormoni. Vienu no šiem hormoniem savos pētījumos atklāja G. Hāberlands un tas tiek uzskatīts par "nekrohormonu". Turpmākā kallusa audu veidošanās ir atkarīga no fitohormonu mijiedarbības, pārsvarā auksīnu un citokinīnu. Gan paša kallusa bioloģiskās īpašības, gan barotnes sastāvā iekļautie fitohormoni ietekmē kallusa šūnu spēju dalīties un diferencēties.

Kallusu kultūru iniciācija un uzturēšana
----------------------------------------

Kallusa veidošanās no eksplanta (Parastais apinis)
Viens no augu mikropavairošanas veidiem ir kallusu un to kultūru iegūšana un uzturēšana.

*In vitro* kallusu kultūras ir aseptiskas šūnu kultūras, kas rodas ķīmiski un fizikāli kontrolētos apstākļos. Lai nodrošinātu kontrolētus apstākļus un sekmīgu kultūru augšanu, tiek mainīti tādi parametri un vides apstākļi kā pH, gāzapmaiņa, temperatūra, barības vielu pievade un gaismas režīms.

#### Kallusu kultūru iniciācija

Kallusu kultūru aizsāk no auga, kuru sadala daļās. Šīs daļas (lapas, auga kātus, dzinumus, ziedkātus, pumpurus u.c.) sauc par eksplantiem. Tos izvēlas atkarībā no auga sugas vai pat šķirnes un to specifiskuma. *In vivo* apstākļos auguši augi ir kontaminēti ar kaitēkļiem un dažādiem mikroorganismiem. Tie pārsvarā atrodas uz auga virsmas vai audos (endofīti). Lai kultūras uzturētu aseptiskos apstākļos, augu materiāls pirms ievietošanas autoklāvētā barotnē ir jāsterilizē. Sterilizāciju veic secīgi eksplantu skalojot ar ūdeni, ieivetojot to sterilizējošā aģentā, kas satur nātrija hipohlorītu (NaOCl) un Tween 20, un atkārtoti skalojot eksplantu sterilā ūdenī aseptiskos apstākļos. Sterilizācijas metodes modificē atkarībā no auga bioloģiskajām īpašībām.

Kallusa veidošanos var ietekmēt tas, kurā sezonā ir ievākts augs un no tā iegūts eksplants. Ir novērotas atšķirīgas koncentrācijas mātes augā endogēnajiem augšanas regulatoriem, mainoties sezonām.

Augu kallusu kultūru attīstības posmi:

1. šūnu dalīšanās indukcija;
2. aktīvā šūnu dalīšanās fāze;
3. fāze, kuras laikā kallusa dalīšana palēninās vai pat apstājas.

### Fitohormonu ietekme

Sākotnējā kallusu attīstība ir atkarīga no augšanas regulatoriem, galvenokārt citokinīniem un auksīniem. Citokinīni veicina šūnu dalīšanos un bremzē to novecošanos, bet auksīni — šūnu attīstību. Augšanas regulatori iesaistās reakcijās kā mazmolekulāra organiska viela un pilda specifiskas regulējošas funkcijas. Tie var ietekmēt enzīmu darbību, gēnu ekspresiju un mainīt pat šūnu membrānu īpašības.
Giberelīna ietekme kallusa kultūrā var būt līdzīga auksīna ietekmei. Giberelīnu izmanto, lai iesāktu šūnu kultūru ar ļoti zemu sākotnējo šūnu blīvumu. Vienlaicīgi giberelīns var kavēt kallusa veidošanos, ja nav vēlama kallusa veidošanās eksplantiem. Parasti giberelīns kavē adventīvo orgānu un somatisko embriju veidošanos no kallusa, lai gan atsevišķām sugām giberelīna klātbūtne var palielināt adventīvo dzinumu skaitu. Audu kultūrās abscizskābe parasti inhibē kallusa augšanu un veicina morfoģenēzi. Daudzām kultūrām etilēns stimulē kallusa veidošanos un augšanu.

### Kallusu kultūru uzturēšana

Kallusu var kultivēt uz cietas barotnes (ar agaru vai citu želējošo vielu) vai šķidrā barotnē. Visbiežāk izmanto cietās *Murashige & Skoog* barotnes. Barotnes sastāvā jābūt visiem nepieciešamajiem mikroelementiem un makroelementiem, aminoskābēm, vitamīniem, augšanas regulatoriem un ogļhidrātiem. Īpaši nozīmīga ir augu šūnu nodrošināšana ar slāpekli (N), fosforu (P) un kāliju (K). Kallusu fragmentus ievietojot šķidrajā barotnē, var veidot šūnu suspensiju kultūras. Šķidrās barotnes komponentes ir līdzīgas, taču nesatur želējošo aģentu, un ir nepieciešams nodrošināt aerāciju un barotnes samaisīšanos. Lai gan kallusu veido nediferencētas šūnas, kalluss nav pilnībā neorganizēta masa — tajā var izšķirt šūnu slāņus ar dažāda izmēra šūnām, pēc noteikta laika var veidoties meristēmu aizmetņi. No tā var attīstīties dzinumi vai saknes, kā arī somatiskie embriji. Kallusu kultūras var tikt audzētas gan tumsā, gan gaismā (16h gaismas, 8h tumsas fotoperiods). Pārsvarā šīs kultūras aug 25 ± 2 °C temperatūrā. Ar laiku, audzējot kultūru gaismā, kallusa šūnās veidojas hloroplasti un sākas fotosintēze. Nodrošinot paaugstinātu CO2 saturu atmosfērā, ir iespējams iegūt pilnībā autotrofu kultūru. Līdzīgi, nodrošinot piemērotus kultivēšanas apstākļus, pēc noteikta laika kallusā var atjaunoties veselam augam raksturīgo sekundāro savienojumu sintēze. Kultivēšanas procesā kallusa šūnās var notikt ģenētiskās izmaiņas, piemēram, izveidojas aneiploīdas vai poliploīdas šūnas. Tādēļ, pavairojot šķirnes augus, lai saglabātu klonāli pavairoto augu ģenētisko viendabīgumu, ir jāizvairās no kallusa veidošanās un adventīvo orgānu attīstības (augus pavairo ar meristēmu kultūru un stimulējot sānpumpuru attīstību).

Kallusa līnija
--------------

Sadalot vienu kallusu, iegūst eksplantus un tiek veidotas kallusu līnijas. Tās sauc arī par pasāžām. Līnijai piemīt noteiktas kopīgas morfoloģiskās un fizioloģiskās īpašības. Kallusu līniju uzturēšanai ir nepieciešamas regulāras pasāžas — to biežums ir atkarīgs no sugas īpašībām. Jaunas pasāžas veido, jo barotnē uzkrājas toksiski savienojumi, tā izžūst vai veidojas barības vielu izsīkums. Piemēram, viendīgļlapju augu kallusiem ir raksturīga intensīva fenolu izdalīšanās barotnē, līdz ar to pasāžas ir jāveic bieži. No citu sugu augiem iegūtie kallusi var augt uz vienas barotnes daudz ilgāku laiku. Piemērotos apstākļos kallusu līniju var uzturēt neierobežotu laiku. Tomēr ilgākā laika periodā var novērot, ka arvien vairāk uzkrājas ģenētiski mainījušās šūnas.

Habituācija
-----------

Habituācija jeb pierašana ir augu audu iegūtā spēja attīstīties neatkarīgi no eksogēniem fitohormoniem. Šī īpašība var izpausties lielākā vai mazākā pakāpē un ir atgriezeniska. Parasti pierašana ir cieši saistīta ar diferencēšanos. Piemēram, tā ir raksturīga embriogēnajiem kallusiem. Pierašanu var veicināt vides ietekme, piemēram, citokinīna līmeni tabakas kallusa šūnās izraisīja paaugstināta temperatūra, savukārt, zema temperatūra izraisīja atgriešanos sākotnējā stāvoklī.

Embriogēnās kultūras iniciācija
-------------------------------

Embriogēnais kalluss satur kompetentās šūnas, kuras reaģē uz auksīnu un uzsāk embrionālās attīstības ciklu. Iespējams, šūnas kompetenci jeb spēju veidot augu embrijus nosaka tās jutīgums pret auksīnu vai specifiskie auksīna receptori. Ja fitohormonu specifiskajā ietekmē notiek asimetriska šūnu dalīšanās, veidojas somatiskie embriji, savukārt, simetriskās dalīšanās rezultātā veidojas kalluss.

Kallusu kultūru priekšrocības un mīnusi
---------------------------------------

#### Priekšrocības

Nepieciešama mazāka platība augu uzturēšanai. Ir iespējama mātes auga un hibrīdu pavairošana. No kallusu kultūrām var iegūt vīrusu un citu slimību brīvus augus. Ir iespējams iegūt un uzturēt kultūras grūti pavairojamiem, apdraudētiem un izmirstošiem augiem.

#### Mīnusi

Kallusu kultūrās ir iespējama ģenētiska nestabilitate un šķirnes īpašību zaudēšana. Kultūru iegūšana un uzturēšana ir relatīvi ilgs un dārgs process. Tam ir nepieciešams specifisks laboratorijas aprīkojums un reaģenti.

Izmantošana
-----------

No kallusu kultūrām var iegūt augu klonus, kā arī no slimībām brīvus augus. Dažādu augu sugu (arī apdraudētu savvaļas augu sugu) kallusi tiek glabāti *in vitro* taksonu bankās un ietilpst *ex situ* kolekciju veidošanā. Kallusu kultūras arvien vairāk izmanto ekstraktu iegūšanā, kuru sastāvā ir sekundārie metabolīti. To sintēzi kallusu kultūrās var stimulēt ar elicitoru pievienošanu barotnē. Sekundārie metabolīti tiek izmantoti tādās nozarēs kā farmācijā, kosmētikas, rekombinanto proteīnu un antivielu ražošanā. Kallusus plaši izmanto augu fizioloģiskajiem un ģenētiskajiem pētījumiem. Piemēram, pētījumā var izmantot pusi kallusa, pakļaujot to apstrādei eksperimentālajā grupā, bet otru pusi izmantot kontroles grupā, bez aktīvas ārstēšanas. Visa auga reģenerācija no vienas šūnas ļauj pētniekam izmantot kallusu transģenētiskiem pētījumiem, kuriem ir transgēnu „kopija" katrā šūnā. Visa auga reģenerācijā, kurā piedalās gan ģenētiski transformētas šūnas, gan ģenētiski netransformētas šūnas, veidojas himēra. Gēnus var ievadīt kallusa šūnās, izmantojot „biolistic" apšaudes metodi, kas pazīstama arī kā gēnu pistole, vai ar *Agrobacterium tumefaciens* metodi. Šūnas, kas saņēma nepieciešamo gēnu, tad var kļūt par veselu augu. Visi augi, kas tiek iegūti, var tikt izmantoti, lai eksperimentāli noteiktu gēnu funkcijas, vai, lai uzlabotu kultūraugu augu īpašības izmantošanai lauksaimniecībā.

Atsauces
--------

1. ↑  Springer Verlag, "Plant Propagation" by Tissue Culture. 2008.
2. ↑  «Каллус (callus)». *humbio.ru*.
3. ↑  Razdan, M. K. (2003). Introduction to plant tissue culture (2. ed.). ISBN 1-57808-237-4
4. ↑  Gautheret, Roger J. (1983) "Plant tissue culture: A history" doi:10.1007/BF02488184
5. ↑  P. R. White (1939). "Potentially unlimited growth of excised plant callus in an artificial nutrient" doi:10.2307/2436709
6. ↑  Amasino, Richard (2005-07). "1955: Kinetin Arrives. The 50th Anniversary of a New Plant Hormone" (en). *Plant Physiology* 138 (3): 1177–1184. doi:10.1104/pp.104.900160. ISSN 0032-0889. PMC PMC1176392. PMID 16009993.
7. 1 2  Murashige, Toshio; Skoog, Folke (1962-07). "A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures". *Physiologia Plantarum* 15 (3): 473–497. doi:10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x. ISSN 0031-9317.
8. ↑  Chawla, H.S. (2002). Introduction to plant biotechnology (2nd ed.). ISBN 1-57808-228-5.
9. ↑  Loyola-Vargas, Víctor M.; Vázquez-Flota, Felipe (2005-11-01). Plant Cell Culture Protocols. doi:10.1385/1592599591.
10. ↑  Altaf Hussain, Iqbal Ahmed, Hummera Nazir, Ikram Ullah. *Recent Advances in Plant in vitro Culture*. InTech, 2012-10-17. ISBN 978-953-51-0787-3.
11. 1 2 3 4 5 6  Edwin F. George, Michael A. Hall, Geert-Jan De Klerk. *Plant Propagation by Tissue Culture*. Dordrecht : Springer Netherlands. 1–28. lpp. ISBN 978-1-4020-5004-6.
12. ↑  Thakur, Rajesh; Sood, Anil (2006-03). "An efficient method for explant sterilization for reduced contamination" (en). *Plant Cell, Tissue and Organ Culture* 84 (3): 369–371. doi:10.1007/s11240-005-9034-6. ISSN 0167-6857.
13. 1 2  Ikeuchi, Momoko; Sugimoto, Keiko; Iwase, Akira (2013-09). "Plant Callus: Mechanisms of Induction and Repression" (en). *The Plant Cell* 25 (9): 3159–3173. doi:10.1105/tpc.113.116053. ISSN 1040-4651. PMC PMC3809525. PMID 24076977.
14. ↑  O'Dowd, Niamh A.; McCauley, Patrick G.; Richardson, David H. S.; Wilson, Graham. (1993) "Callus production, suspension culture and in vitro alkaloid yields of Ephedra" doi:10.1007/BF00036095
15. ↑  Beutelmann, P.; Bauer, L. (1977). "Purification and identification of a cytokinin from moss callus cells". doi:10.1007/BF00380679
16. 1 2  Finer, John J.; Kriebel, Howard B.; Becwar, Michael R. (1989). "Initiation of embryogenic callus and suspension cultures of eastern white pine (Pinus strobus L.)" doi:10.1007/BF00778532
17. ↑  Ģederts Ieviņš. *Augu fizioloģija. Funkcijas un mijiedarbība ar vidi*. Rīga : LU Akadēmiskais apgāds, 2016.
18. ↑  Wang, X.-D.; Nolan, K. E.; Irwanto, R. R.; Sheahan, M. B.; Rose, R. J.. "Ontogeny of embryogenic callus in Medicago truncatula: the fate of the pluripotent and totipotent stem cells". *Annals of Botany* 107 (4): 599–609.
19. 1 2  Батыгина Т.Б. Graminad-тип эмбриогенеза (1997) Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции. Т.2
20. 1 2  Efferth, Thomas (2019-02). "Biotechnology Applications of Plant Callus Cultures" (en). *Engineering* 5 (1): 50–59. doi:10.1016/j.eng.2018.11.006.
21. ↑  Van Lammeren A.M.(1986) Development morphology and cytology of the young maize embryo (Zea mays L.), doi: 10.1007/978-3-642-78643-3\_3
22. 1 2 3  «What is Plant Tissue Culture». *www.liverpool.ac.uk*.
23. ↑  Experiments in Plant Tissue Culture. 1995. Cambridge University Press
24. ↑  Neumann, Karl-Hermann (2009) Plant Cell and Tissue Culture — A Tool in Biotechnology — "Cell Suspension Cultures"
25. ↑  «Advantages and Disadvantages of Plant Tissue Culture». *Plant Cell Technology | Fight Contamination With PPM* (angļu). Skatīts: 2020-11-14.
26. ↑  P. J. Wang, C. Y. Hu. *Advances in Biomedical Engineering, Volume 18* 18. Berlin, Heidelberg : Springer Berlin Heidelberg, 1980. 61–99. lpp. ISBN 978-3-540-09936-9.
27. ↑  Sarasan, Viswambharan; Cripps, Ryan; Ramsay, Marcaret M.; Atherton, Caroline; McMichen, Monica; Prendergast, Grace; Rowntree, Jennifer K. (2006-05). "Conservation In vitro of threatened plants—Progress in the past decade" (en). *In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant* 42 (3): 206–214. doi:10.1079/IVP2006769. ISSN 1054-5476.
28. ↑  Калинин Ф.Л. Сарнацкая В.В.(1980) Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев