**TIL terapija** - viena iš adoptyviosios ląstelių terapijos atmainų, kuri remiasi iš paciento navikinio audinio išskirtų baltųjų kraujo ląstelių (limfocitų) manipuliacijomis *ex vivo*. Vykdoma autologinė ląstelių transplantacija: iš paciento naviko išskirti limfocitai pagausinami, aktyvuojami ir sugrąžinami sergančiajam - sukuriamas individualus preparatas kiekvienam pacientui. Tokios priešvėžinės terapijos tikslas yra sunaikinti vėžinį audinį ar naviką pasitelkiant paties paciento imuninę sistemą. 

TIL (angl. *Tumor infiltrating lymphocytes*) – vienbranduolės navikinį audinį infiltruojančios baltosios kraujo ląstelės, kurių didžiąją dalį sudaro pagalbiniai ir citotoksiniai T limfocitai. Tokie limfocitai dažniausiai randami solidinių (kietųjų, aiškias ribas turinčių) navikų mikroaplinkoje. Parodyta, kad didelis TIL kiekis naviko mikroaplinkoje yra siejamas su stipresniu paciento imuniniu atsaku į supiktybėjusias ląsteles, į paskirtą gydymą, o tam tikrais atvejais net ilgesne ligos remisija. Manoma, kad tokių ląstelių ir jų savybių, paviršiaus žymenų ištyrimas leidžia prognozuoti ligos eigą.

TIL terapija yra dažniausiai skiriama paskutinių stadijų metastazinės melanomos pacientams. Parodyta, kad TIL terapija pasirodo veiksminga daugiau nei 50 proc. metastazinės melanomos pacientų. Tačiau dėl šalutinių poveikių, klinikinių tyrimų stokos tokios imunoterapijos taikymas kitų vėžio formų gydymui nėra dažnas.

Priešvėžinė imunoterapija
-------------------------

Priešvėžinę imunoterapiją galima skirti į dvi šakas: aktyviąją ir pasyviąją. Aktyviosios priešvėžinės imunoterapijos veikimas remiasi paciento imuninio atsako stimuliavimu imunogenu prieš piktybines vėžines ląsteles. Tuo metu pasyviosios priešvėžinės imunoterapijos principas remiasi paciento imunizacija iš anksto paruoštais pakitusių ląstelių naikinimui antikūnais arba ląstelėmis.

Adoptyvioji ląstelių terapija
-----------------------------

Adoptyvioji ląstelių terapija (angl. *Adoptive cell transfer*) – viena iš pasyviosios imunoterapijos rūšių, kuomet pasitelkiamos priešnavikiniu aktyvumu pasižyminčios imuninės ląstelės. Jos gali būti išgaunamos iš kraujo, limfmazgių ar paties navikinio audinio. Po to ląstelėmis yra manipuliuojama *ex vivo*: jos padauginamos, įvairiais metodais sustiprinamos jų priešnavikinės savybės (vykdoma ląstelių aktyvacija) ir tokios pakeistos ląstelės yra grąžinamos naviką turinčiam pacientui. Taigi, vykdoma imuninių ląstelių autologinė transplantacija. Pirma tokia efektyvi ACT buvo pritaikyta kaulų čiulpų persodinimui onkohematologinėmis ligomis sergantiems pacientams. 

### Naudojamos ląstelės

Eksperimentiškai įvertinta, kad T limfocitai ir NK (angl. *Natural killer*) ląstelės yra tinkamiausios ACT.

NK ląstelės naudojamos ACT todėl, kad greitai reaguoja į virusais infekuotas, piktybiškai pakitusias ląsteles ir geba jas lizuoti. αβT – gausiausia ir geriausiai ištirta T kraujo ląstelių populiacija ACT taikymui. ACT pasitelkiami tiek efektoriniai (CD8+), tiek pagalbiniai (CD4+) T limfocitai. Ne tokios gausios limfocitų populiacijos, kaip NK, γδT ląstelės yra dauginamos ir pasitelkiamos pakitusių ląstelių naikinime.

### TIL

TIL terapijos vystymui kelią atvėrė ankstyvieji tyrimai su kitomis imuninėmis ląstelėmis, naudojamomis ACT. TIL – vienbranduolės navikinį audinį infiltruojančios baltosios kraujo ląstelės (T, B limfocitai, NK ląstelės). TIL yra skirstomi pagal lokalizaciją, jie gali būti aptinkami auglio jungiamajame audinyje (stromos TIL) arba pačiame navike (intraepiteliniai TIL). Paprastai TIL buvimas tarp navikinių ląstelių yra interpretuojamas kaip sergančiojo imuninės sistemos atsakas į besiformuojantį darinį, tad TIL koncentracija gali pasitarnauti prognozuojant ligos eigą bei gydymo efektyvumą. Aptinkamas didelis TIL kiekis yra siejamas su aktyviu, tačiau nepakankamu atsaku į navikines ląsteles. Pasitelkus pagrindinius ACT principus TIL terapijai ląstelės yra pagausinamos, aktyvuojamos ir pritaikomos priešvėžinėje terapijoje.

TIL terapijos istorija
----------------------

Nuo pirmųjų priešvėžinės TIL terapijos tyrimų praėjo daugiau nei 30 metų. Pirmą kartą TIL panaudojimas vėžio imunoterapijoje buvo pademonstruotas su eksperimentinėmis pelėmis. Parodyta, kad donoro TIL turėjo įtakos recipiento naviko regresijai. Aštuntajame 20 a. dešimtmetyje komerciškai pradėtas gaminti IL-2 (angl. *interleukin 2*), kuris leido pradėti dauginti TIL *in vitro*. Devintajame 20 a. dešimtmetyje Nacionaliniame vėžio institute, JAV (angl. *National cancer institute*) TIL pradėti naudoti kaip specifiškų vėžinėms ląstelėms limfocitų šaltinis, tuo pačiu jas pradėta dauginti *ex vivo*. Pirmą kartą TIL terapijos klinikiniai tyrimai su žmonėmis buvo atlikti 1988 m. Šie tyrimai buvo atlikti su 20 metastazine melanoma sergančių pacientų. Buvo parodyta, kad 55 proc. pacientų TIL terapija veikė (pagal RECIST (angl. *Response Evaluation Criteria in Solid Tumors*) kriterijų). Nors vėlesni tyrimai TIL terapijos efektyvumą įvertino 34 proc. pirmieji tyrimai padarė didžiulę įtaką šio metodo tobulinimui. Dabar TIL terapija yra dažniausiai gydomi pacientai su pažengusia III/IV stadijos mestastazine melanoma (MM). Nors parodyta, kad MM gydymo TIL efektyvumas siekia 50-70 proc. tačiau tokios terapijos taikymas prieš kitus vėžinius susirgimus tokiais aukštais rodikliais nepasižymi.

TIL terapijos metodo apžvalga
-----------------------------

Vaizdas:Til metodika.PNGPagrindiniai TIL terapijos etapai: ląstelių išskyrimas, padauginimas ex vivo, sugrąžinimas.  
TIL terapijos metu vykdomas ląstelių padauginimas ir aktyvavimas *ex vivo* leidžia apeiti natūralų imuninį atsaką, kuriam nėra būdingas greitas ir gausus vėžinių antigenų atpažinimą vykdančių T limfocitų pasidauginimas.  

### Ląstelių pagausinimas ir paruošimas

Ląstelių padauginimas vykdomas pagal REP (angl. *Rapid expansion protocol*) protokolą 2 etapais. Pirmajame etape (arba pre-REP fazėje) per 2-3 sav. gaunama 40-50 mln. ląstelių. Jų dalinimosi paskatinimui į kultūrą yra dedamas IL-2. Dalį pre-REP fazėje užaugintų ląstelių galima išsaugoti pasitelkiant krioprezervaciją – ilgalaikį užšaldymą, todėl esant būtinybei terapiją galima pakartoti. Prieš pereinant į sekantį TIL padauginimo etapą, galima įvertinti ląstelių specifiškumą ir aktyvumą – TIL inkubuojamos pernakt kartu su vėžinėmis ląstelėmis ir stebima IFN-γ sekrecija. Antrajame TIL padauginimo etape (REP fazėje) TIL 1-2 sav. auginami kartu su IL-2, monokloniniu anti-CD3 antikūnu ir sveiko donoro alogeninėmis PBMC (angl. *Peripheral blood mononuclear cells*) apšvitintamomis mitybinėmis ląstelėmis. Anti-CD3 monokloniniai antikūnai atpažįsta TIL CD3 diferenciacijos žymenį ir stimuliuoja T ląstelių aktyvaciją. REP ląstelių dauginimo etape ląstelių kiekis pagausinamas 1000-3000 kartų. Per 4-6 ląstelių auginimo savaites gaunami jauni terapiniai TIL. Taip pagaminamas individualus imunoterapijai skirtas polikloninių T ląstelių preparatas, sudarytas iš skirtingų subpopuliacijų navikui specifinių TIL.

Vaizdas:Til kultivavimas.PNGTradicinių ir jaunų TIL auginimas. 
### Chemoterapija

Savaitė prieš TIL ląstelių sugrąžinimą pacientui yra skiriamas intensyvus nemieloabliacinės chemoterapijos kursas (ciklofosfamidu ir fludarabinu). Chemoterapijos metu susilpninama paciento imuninė sistema taip sumažinant limfocitų kiekį organizme. Be to tokia chemoterapija atliekama ir dėl to, kad TIL negalėtų konkuruoti su natyviais organizmo limfocitais dėl citokinų ar IL-2. Taigi tokia chemoterapija yra skirta TIL terapijos poveikio sustiprinimui.

### Aktyvuotų TIL sugrąžinimas

Po ląstelių aktyvavimo ir pagausinimo ir chemoterapijos kurso seka TIL sugrąžinimas sergančiajam. TIL ląstelių aktyvacija, proliferacija ir citolitinio poveikio sustiprinimas organizme yra palaikomas IL-2 terapija. Terapija laikoma efektyvia, jeigu TIL numigruoja į metastazių židinius, atpažįsta didelę įvairovę audinių suderinamumo komplekso molekulių - MHC (angl. *Major histocompatibility complex*) pateikiamų vėžinių antigenų ir pradeda navikinių ląstelių naikinimą.

TIL kultivavimas bioreaktoriuose
--------------------------------

Vaizdas:Til bioreaktoriai.PNGTIL kultivavimo metodai.
Klinikiniams tyrimams ląstelės dažniausiai auginamos nemaišomose (státinėse) audinių kultūrų auginimui pritaikytose kolbose (nedideliam tūriui) arba maišuose (dideliems tūriams) periodiškai pamaitinant. Taip auginti ląsteles yra brangu ir neefektyvu – sunku gauti optimalų ląstelių kiekį net ir dideliame tūryje, sunku reguliuoti ir sekti auginimo sąlygas. TIL auginimo optimizavimui yra pradėti naudoti WAWE ir GRex (angl. *Gas-permeable Rapid Expansion Flask*) bioreaktoriai.

### WAWE bioreaktorius

WAWE – bañginio tipo bioreaktorius, kuris plačiai taikomas ir kitose terapijose naudojamų ląstelių padauginimui (pvz. antikūnų). Ląstelių auginimas vyksta steriliame maiše. Platformos judėjimas pagerina ląstelių aprūpinimą deguonimi. Taip pat nuolatos tiekiant šviežią mitybinę terpę ląstelės užauginamos iki didelio tankio. Parodyta, kad ląstelių auginimas WAWE bioreaktoriuje paspartėja iki 5000 kartų.Tokiame bioreaktoriuje pagausintos TIL buvo pripažintos kaip saugios ir tinkamos terapiniam panaudojimui.

### GRex bioreaktorius

GRex – kolbos tipo bioreaktorius, kuriame TIL ląstelės auginamos ant aeruojamos silikoninės membranos esančios kolbos apačioje. Dėl geros aeracijos, TIL gali užaugti iki didesnio tankio. Auginant TIL GRex bioreaktoriuje sunaudojama mažiau mitybinės terpės lyginant su ląstelių auginimu WAWE ar nemaišomame (státiniame) maiše.

TIL terapijai būdingi šalutiniai poveikiai ir trūkumai
------------------------------------------------------

TIL terapijos metu patiriami šalutiniai poveikiai yra siejami su IL-2 kursu po aktyvuotų ląstelių sugrąžinimo pacientui. Vienas iš dažniausiai pasireiškiančių šalutinių poveikių yra kapiliarų pralaidumo sindromas. Tokiu būdu gali atsirasti patinimų, nukristi kraujospūdis, padidėti kūno masė. Didelis kraujo plazmos praradimas gali sukelti sepsį. Nenutraukus IL-2 terapijos po pirmųjų kapiliarų pralaidumo sindromo simptomų, padidėja edemos plaučiuose atsiradimo rizika.

Parodyta, kad pati autologinė TIL transplancija nesukelia labai stiprių ar gyvybei pavojingų šalutinių poveikių. Tai buvo ištirta su 180 pacientų, kuriems buvo atliktas 381 TIL perkėlimas. Pastebėta, kad pacientams dažniausiai pasireiškė šleikštulys ir vėmimas. Buvo padaryta išvada, kad šie šalutiniai poveikiai atsirado dėl DMSO (angl. *Dimethyl sulfoxide*), kuris yra naudojamas kaip terpė apsauganti ląsteles nuo šalčio.
Prieš taikant pasyviąją imunoterapiją reikėtų atsižvelgti į tai, kad sukeltas priešnavikinis atsakas yra greitas, tačiau nėra ilgalaikis, vėžinės ląstelės linkusios mutuoti, įgyti atsparumą.

Literatūra
----------

1. ↑  Baxter, D. (2014). Active and passive immunization for cancer. Human Vaccines & Immunotherapeutics 10, 2123–2129.
2. ↑  Topalian, S.L. Weiner, G.J. and Pardoll, D.M. (2011). Cancer Immunotherapy Comes of Age.Journal of Clinical Oncology 29, 4828–4836.
3. ↑  Ruella, M. and Kalos, M. (2014). Adoptive immunotherapy for cancer. Immunological Reviews 257, 14–38.
4. ↑  Eberlein, T.J. Rosenstein, M. and Rosenberg, S.A. REGRESSION OF A DISSEMINATED SYNGENEIC SOLID TUMOR BY SYSTEMIC TRANSFER OF LYMPHOID CELLS EXPANDED IN INTERLEUKIN 2. 13.
5. ↑  Rosenberg, S. Spiess, P. and Lafreniere, R. (1986). A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor infiltrating lymphocytes. Science 233, 1318–1321
6. ↑  Mayor, P. Starbuck, K. and Zsiros, E. (2018). Adoptive cell transfer using autologous tumor infiltrating lymphocytes in gynecologic malignancies. Gynecologic Oncology 150, 361–369.
7. ↑  Santoiemma, P.P. and Powell, D.J. (2015). Tumor infiltrating lymphocytes in ovarian cancer. Cancer Biology & Therapy 16, 807–820.
8. ↑  Wang, X. and Rivière, I. (2015). Manufacture of tumor- and virus-specific T lymphocytes for adoptive cell therapies. Cancer Gene Therapy 22, 85–94.
9. ↑  Weber, J. Atkins, M. Hwu, P. Radvanyi, L. Sznol, M. Yee, C. and on behalf of the Immunotherapy Task Force of the NCI Investigational Drug Steering Committee (2011). White Paper on Adoptive Cell Therapy for Cancer with Tumor-Infiltrating Lymphocytes: A Report of the CTEP Subcommittee on Adoptive Cell Therapy. Clinical Cancer Research 17, 1664–1673
10. ↑  Dudley, M.E. Wunderlich, J.R. Yang, J.C. Sherry, R.M. Topalian, S.L. Restifo, N.P. Royal, R.E. Kammula, U. White, D.E. Mavroukakis, S.A. et al. (2005). Adoptive Cell Transfer Therapy Following Non-Myeloablative but Lymphodepleting Chemotherapy for the Treatment of Patients With Refractory Metastatic Melanoma. Journal of Clinical Oncology 23, 2346–2357.
11. ↑  Svane, I.M. and Verdegaal, E.M. (2014). Achievements and challenges of adoptive T cell therapy with tumor-infiltrating or blood-derived lymphocytes for metastatic melanoma: what is needed to achieve standard of care? Cancer Immunology, Immunotherapy 63, 1081–1091
12. ↑  Somerville, R.P.T. and Dudley, M.E. (2012b). Bioreactors get personal. OncoImmunology 1,1435–1437.
13. ↑  Jin, J. Sabatino, M. Somerville, R. Wilson, J.R. Dudley, M.E. Stroncek, D.F. and Rosenberg, S.A. (2012). Simplified Method of the Growth of Human Tumor Infiltrating Lymphocytes in Gaspermeable Flasks to Numbers Needed for Patient Treatment: Journal of Immunotherapy 35, 283–292.
14. ↑  Somerville, R.P.T. and Dudley, M.E. (2012b). Bioreactors get personal. OncoImmunology 1, 1435–1437.
15. ↑  Besser, M.J. Shapira-Frommer, R. and Schachter, J. (2015). Tumor-Infiltrating Lymphocytes: Clinical Experience. The Cancer Journal 21, 465–469
16. ↑  Cruz, C.R. Hanley, P.J. Liu, H. Torrano, V. Lin, Y.-F. Arce, J.A. Gottschalk, S. Savoldo, B. Dotti, G. Louis, C.U. et al. (2010). Adverse events following infusion of T cells for adoptive immunotherapy: a 10-year experience. Cytotherapy 12, 743–749.
17. ↑  Abbas, A.K. Lichtman, A.H. and Pillai, S. (2015). Cellular and molecular immunology (Philadelphia, PA: Elsevier Saunders).
18. ↑  Brody, J. Kohrt, H. Marabelle, A. and Levy, R. (2011). Active and Passive Immunotherapy for Lymphoma: Proving Principles and Improving Results. Journal of Clinical Oncology 29, 1864–1875.