Заманауи HPLC құрылғысы
HPLC-дің құрылымы.
(1) Еріткіштер сақталған ыдыстар, (2) Еріткіштерді газсыздандырушы, (3) Градиентті клапан, (4) Жылжымалы фазану жеткізуге арналған араластыру ыдысы, (5) жоғары қысымды сорғы, (6) "енгізу" қалпындағы инжектор клапаны, (6') "жүктеу" қалпындағы инжектор клапаны, (7) Үлгіні енізуге арналған луп, (8) Алғы баған (қорғаушы баған), (9) Аналитикалық баған, (10) детектор (*мысалы*, IR, UV), (11) Ақпарат жинаушы, (12) Қалдық не болмаса фракция жинағыш.
**Өнімділігі жоғары сұйық хроматография** (**HPLC**; ескіде **Қысымы жоғары сұйық хроматография** деп те аталды) — аналитикалық химияда қоспадағы компоненттерді бөліп, анықтап, мөлшерлеу үшін қолданылатын әдіс. Оның негізгі құрылымдық ерекшелігі - қатты адсорбент материалдан жасалған стационарлы фаза бойымен жылжымалы фазаны үлкен қысыммен сығатын сорғылар. Үлгідегі әр компонент адсорбент материалымен әртүрлі әрекеттеседі, сондықтан да олар баған бойымен әртүрлі жылдамдықпен қозғалады, соның әсерінен қоспа бөлінеді.

HPLC көптеген мақсаттарда қолданылады: өндірісте (мысалы, дәрілер мен тамақ өнімдерін зерттеу үшін), заң қызметінде (мысалы, допингтерді анықтау), зерттеулерде (мысалы, күрделі биологиялық материалдың компоненттерін бөлу), медицинада (мысалы, қан талдауын жүргізу).

Хроматография — масса ауысуымен жүретін адсорбция деуге болады. HPLC-дің негізгі бөлігі — қатты адсорбентпен толтырылған баған арқылы үлгі мен еріткіштің қоспасын сығатын сорғылар, бұл олардың әртүрлі жылдамдықпен қозғалып, бөлінуіне әкеледі. Бағанның белсенді құрамдас бөлігі, адсорбент, *стационарлы фаза* болып табылады, және көбінесе өлшемі 2-50 мкм болатын қатты, түйіршікті материал (мысалы, кремнеземнен не полимерлерден жасалған). Компоненттердің бөліну себебі — олардың адсорбент материалымен әртүрлі әрекеттесуі. Қысым астындағы сұйық көбіне еріткіштер қоспасы (мысалы, су, ацетонитрил, метанол, сұйылтылған минералды қышқылдардың сулы ерітінділері), үлгі мен еріткішті бірге *жылжымалы фаза* деп атайды. Жылжымалы фазаның құрамы мен температурасы бөлу процессінде өте үлкен рөл атқарады, себебі бұл компоненнтердің адсорбциялану процессіне ықпал етеді. Бұл әрекеттесулердің көбінің табиғаты физикалық, мысалы гидрофобты, диполь-дипольдық, ионды әрекеттесулер, немесе олардың үйлесімі.

HPLC-дың әдеттегі *қысымы төмен* сұйық хроматографиядан ерекшелігі ондағы қысымның өте жоғары болуы (50-350 атм-ға дейін), ал дәстүрлі бағанды сұйық хроматографиядағы негізгі қозғаушы күш - гравитация. HPLC арқылы үлгінің өте аз мөлшерлері талданғандықтан, оның бағанының өлшемдері де кіші болады (диаметрі 2.1-4.6 мкм, ұзындығы 30-250 мм). HPLC бағандарының адсорбент бөлшектері де өте ұсақ (2-50 мкм). Мұндай өлшемдер HPLC-дің қоспаларды бөлу қабілетін еселеп арттырады, соның арқасында ол қазіргі кезге дейін ең көп қолданыстағы әдіс болып табылады.

HPLC құрылғысы әдетте гассыздандырғыштан, сэмплерден, сорғылардан және детектордан тұрады. Сэмплер үлгіні жылжымалы фазаның ағынына енгізеді. Сорғылар жылжымалы фазаның құрамы мен жылдамдығын сақтайды. Ал детектор бағаннан шығып жатқан ағындағы бөлінген компоненттердің мөлшеріне пропорционал сигнал береді. Сандық микропроцессор арқылы құрылғы талдаудың нәтижелерін шығарады. Кей HPLC құрылғысының модельдерігндегі сорғылар жылжымалы фазаның құрамын уақыт бойынша өзгерте алады, мұндай ағындар құрамы градиентті ағын деп аталады. Көбінесе қолданылатын детекторларға УК-Көрінетін жарық спектрометрлері (UV-Vis), Фотодиод жиымды детекторлар (DAD), масс-спектрометрияға (MS) негізделген детекторлар жатады. Көптеген HPLC құрылғылары температураны өзгертуге де мүмкіндік береді.

Қолдану
-------

Бөлінетін қоспа үлгісі аз көлемде баған арқылы ағып жатқан жылжымалы фазаның ағынына енгізіледі. Үлгідегі компоненттер адсорбентпен (стационарлы фазамен) әртүрлі әрекеттеседі, сондықтан да баған бойымен әртүрлі жылдамдықпен қозғалады. Әр компоненттің жылдамдығы оның табиғатына, стационарлы фазаның табиғаты мен жылжымалы фазаның құрамына тәуелді. Аналиттің бағаннан элюциялануына (ағып шығуына) кеткен уақыты тежелу уақыты деп аталады. Бірдей аналит бірдей жағдайда өлшенсе, бірдей тежелу уақытын көрсетеді, сондықтан оны аналитті сапалық анықтау үшін қолдануға болады.

Қазіргі кезде адсорбентінің өлшемі мен беттік қасиеттері әртүрлі болатын көптеген баған түрлері қолжетімді. Толтырғыш материалдың бөлшектері кішірек болған сайын, оның бойымен жылжымалы фазаны өткізу үшін жоғарырақ қысым қажет, дегенмен бұл ажыратымдылықты арттырады. Адсорбенттер гидрофобты да, полярлы да болуы мүмкін.

 HPLC өнімдерін жинап жатқан айналмалы фракция жинағыш. Жүйе E.coli бактериаларының плазмалық мембранасының құрамынан Комплекс I-ді бөлу үшін қолданылған. Бұл мөлшердегі фракцияны алу үшін 50 литрге жуық бактерия қолданылды.
Көбіне жылжымалы фаза ретінде судың ацетонитрил, метанол сияқты суда ерігіш органикалық еріткіштердің қоспалары қолданылады. Кей HPLC әдістері сусыз жылжымалы фазаны қолданады (қалыпты фазалы сұйық хроматография (NPLC)). Жылжымалы фазаның сулы компонентінің құрамында қышқылдар (құмырсқа қышқылы, фосфор қышқылы, трифторсірке қышқылы, сірке қышқылы), тұздар болуы мүмкін. Ал жылжымалы фазаның құрамы талдау барысында тұрақты сақталуы мүмкін (изократты элюция) не өзгеруі мүмкін (градиентті элюция). Изократты элюция көбіне қасиеттері өте әртүрлі молекулаларды бөлу үшін қолданылады. Градиентті элюция кезінде көбіне элюциялау күші төмен құрамнан күші жоғары құрамға өзгертеді. Жылжымалы фазаның элюциялау күші дегеніміз оның аналиттерді қаншалықты тез жылжытатынын көрсететін шама (яғни, тежелу уақыты аз). Кері фазалы сұйық хроматографияда қолданылған градиентті элюцияға мысал 5%-дық судағы не сулы буфердегі ацетонитрил ерітіндісінен бастап 5-25 минуттың ішінде оны 95%-ға дейін көтеру. Кей градиентті элюциялау бағдарламаларында жылжымалы фазаның құрамы белгілі бір уақыт тұрақты болып сақталуы да мүмкін. Мысалы, 5%-дық ацетонитрил ерітіндісін 1-3 минут айдап, кейін 95%-дық ерітіндіге дейін сызықтық функциямен концентрацияны баяу көтеру.

Жылжымалы фазаның құрамы (элюент деп те аталады) аналиттер мен стационарлы фазаның әрекеттесу күшіне байланысты таңдалады, себебі аналиттердің бөлінуі олардың екі фазаға жақындығынан туатын таралуға негізделген. Бұл процесс сұйық-сұйықтық экстракцияға ұқсас, дегенмен хроматография кезінде бұл процесс үзіліссіз. Мысалдағы су/ацетонитрил градиентін қарастырсақ, онда гидрофобты аналиттер кейін элюцияланады (бағаннан ағып шығады), себебі бастапқыда жылжымалы фазадағы су мөлшері көп, кейін ондағы органикалық еріткіштің мөлшері артқан кезде, гидрофобты аналиттер жылжымалы фазада көбірек ери бастайды.

Бағананы толтырдғыш пен үлгідегі компоненттердің табиғатына қарай жылжымалы фазаға әртүрлі қоспалар қосылуы мүмкін (мысалы, қышқылдар, тұздар). Көбінесе ең жақсы бөлінуді беретін жағдайды анықтау үшін бірнеше экспериметтер жүргізеді. Бұл процессті *әдіс дамыту* деп аталады.

Тарихы және дамуы
-----------------

HPLC әдісі пайда болғанға дейін ғалымдар қарапайым сұйық хроматография әдістерін қолданды. Еріткіштердің жылдамдығы тек тартылыс күшіне тәуелді болғандықтан, мұндай жүйелердің ағыс жылдамдығы өте төмен болды. Кей бөлінулерді орындау үшін сағаттар, кейде күндер кететін. Ол кездерде газ хроматографиясы (GC) сұйық хроматографияға (LC) қарағанда қуатты әдіс болып саналды, дегенмен, өте полярлы, молекулалық массасы жоғары биополимерлерді газбен бөлу мүмкін емес болатын. Биохимиктер үшін GC өте тиімсіз болды, себебі көптеген аналиттер жоғары температураларға шыдамсыз. Нәтижесінде, жаңа әдістер ұсынылып, HPLC-дің дамуына әкелді. 

1941-жылғы Мартин мен Сингтің іргелі жұмысынан кейін, 1960-жылдары Кәл Гиддиңс, Жозеф Хубер және басқалары LC-дің өнімділігін бөлшектердің өлшемін кішірейту (ол кездегі бөлшектер 150 мкм-дей болатын) арқылы, ал ағын жылдамдығын жоғары қысым арқылы арттыруға болатындығын болжады. 1960-жылдардың ортасында басталған бұл болжамдардың негізіндегі кең эксперименттер 1970-жылдарға дейін созылды. Бастапқы зерттеулер LC бөлшектерін жақсартуға ұмтылды, соның нәтижесінде өте кеуекті Zipax материалы жасалды, бұл HPLC құрылғыларының дамуында үлкен рөл ойнады.

1970-жылдары көптеген аспаптар мен құрылғылардың дамуы жүрді. Зерттеушілер әртүрлі сорғылар мен инжекторларды қолданып, HPLC жүйелерінің бастапқы дизайндарын жасады. Бұл зерттеулерде көбіне газ күшейткішті сорғылар қолданылды, себебі олар тұрақты қысымды ұстап тұруға қабілетті, герметизацияны және кері клапандарды қажет етпейді. Аспаптық дамытуға Dupont IPD-дың өндірістік полимерлер бөлімі ең үлкен үлес қосты. Мысалы олар көлем тежелуі төмен градиентті құрылғыларды бірінші болып жасады, және септумдық инжекторларды луп инжекторлы клапандарға алмастырды.

Аспаптардың дамуы өте маңызды болғанмен, HPLC жүйелерінің дамуы көбіне бөлшек материалдарының дамуына тәуелді болды. Кеуекті қабатты бөлшектер пайда болғаннан кейін, зерттеулер көбіне өнімділікті арттыру үшін олардың өлшемдерін кішірейтуге бағытталды. Дегенмен, бөлшектерді кішірейту тағы да проблемаларға алып келді. Себебі өте ұсақ бөлшектермен толтырылған бағандар арқылы сұйық фазаны жылжыту үшін үлкен қысым қажет, ал мұндай бағандарды біркелкі толтыру да үлкен проблема болды. Сондықтан да бөлшек өлшемдері кішірейген сайын, ол арқылы жылжымалы фазаны өткізе алатын құрылғы ойлап табылу керек болды

Бұл проблемалар қазіргі кезде өнімділігі ультра жоғары сұйық хроматографияның (UHPLC) дамуына алып келді. Бұл әдістердегі бөлшектердің өлшемі 2 мкм-ден кіші, ал қысым 1200 атмосфераға дейін жетуі мүмкін.

Дереккөздер
-----------

1. ↑  Gerber, F.; Krummen, M.; Potgeter, H.; Roth, A.; Siffrin, C.; Spoendlin, C. (2004). "Practical aspects of fast reversed-phase high-performance liquid chromatography using 3μm particle packed columns and monolithic columns in pharmaceutical development and production working under current good manufacturing practice". *Journal of Chromatography A* **1036** (2): 127–133. doi:10.1016/j.chroma.2004.02.056. PMID 15146913.
2. ↑  Fraction collector (post on Flickr) (19 қараша 2003). Тексерілді, 28 қазан 2015.
3. 1 2  Karger, Barry L. (1997). "HPLC: Early and Recent Perspectives". *Journal of Chemical Education* **74** (1): 45. Bibcode 1997JChEd..74...45K. doi:10.1021/ed074p45.
4. 1 2 3 4 5 6  Henry, Richard A. (1 February 2009) "The Early Days of HPLC at Dupont" Мұрағатталған 1 тамыздың 2020 жылы.. Chromatography Online. Avanstar Communications Inc.
5. ↑  Iler, R.K. (1979) *The Chemistry of Silica*. John Wiley & Sons. New York.
6. ↑  Karger, B. L.; Berry, L. V. (1971). "Rapid liquid-chromatographic separation of steroids on columns heavily loaded with stationary phase". *Clin. Chem.* **17** (8): 757–64. PMID 4254537.
7. ↑  Giddings, J. Calvin (1965) *Dynamics of Chromatography, Part I. Principles and Theory*. Marcel Dekker, Inc. New York. p. 281.