**חלבוני אנטי קריספר** (**Anti-Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats**; בראשי תיבות **Acr**) הם חלבונים שמקודדים על ידי אלמנטים גנטיים ניידים (MGEs), כגון פלסמידים ובקטריופאג'ים (פאג'ים), המעכבים את תפקוד CRISPR-Cas, מערכת חיסונית של פרוקריוטיים. עד כה התגלו 45 משפחות חלבוני Acr עם מנגנונים ומבנים ברורים וללא דמיון רצפי משמעותי זה לזה. מלבד גודלם הקטן, שנע לרוב בין 50 ל-150 חומצות אמינו, אין מאפיינים נפוצים השמורים בין רצפי חלבונים שונים במשפחה זו. לעיתים קרובות ניתן למצוא גנים של Acr זה לצד זה, מה שמסייע לזיהוי ולמחקר שלהם. יכולתם של חלבוני Acr רבים להפריע ישירות לתפקודי מערכות CRISPR-Cas מספקת אפשרות לרגולציה לאחר תרגום לטכנולוגיות שנגזרות מ-CRISPR-Cas. במהלך השנים האחרונות נקבעו מנגנוני פעולה של שישה חלבוני אנטי קריספר על ידי שילוב של מחקרים גנטיים, ביוכימיים ומבניים,

חלבוני האנטי קריספר ככל הנראה נוצרו כתוצאה מלחץ אבולוציוני שהופעל על הפאג'ים על מנת למנוע את הרס הגנום שלהם לאחר החדרתו לתוך תא חיידקי, ולאפשר הדבקה יעילה. מנגנונים אחרים להתחמקות ממערכות ה-CRISPR-Cas, שהוכרו לפני האנטי קריספר הן מוטציות נקודתיות ואירועי שחלוף (recombination) ששימשו לחמוק מספייסרים של מערכות קריספר. מכיוון שיש צורך בהתאמה בין הרצף של הספייסר (מקטעים זהים עם רווחים בגנום המארח) לבין הרצף של הפאג' – שינויים כמו מוטציות נקודתיות ורקומבציה מונעים את ההתאמה ולכן גם את הפעילות של מערכת הקריספר באותו אתר. כיום, חלבוני האנטי קריספר הם הדרך היעילה ביותר המוכרת של פאג'ים לשרוד את תהליך הדבקת פרוקריוטיים בעלי מערכות הגנה של CRISPR.

תהליך גילוי
-----------

נשיאת גן anti-CRISPR (acr) מאפשרת לפאג'ים לשרוד כאשר בלעדיה הוא היה מזוהה ונחסם על ידי מערכת CRISPR-Cas במארח
מערכות CRISPR-Cas הן בעלות יכולת הסתגלות גבוהה ואזורי CRISPR נפוצים מאוד בגנומים של חיידקים וארכיאונים, דבר המעיד על כך שהמערכות האלו הן ככל הנראה היעילות ביותר להתמודדות עם חדירה של חומר גנטי זר לחיידק. לפני גילוי גני האנטי קריספר, הדרך היחידה שהייתה מוכרת למדע להתמודדות של הפאג'ים עם מערכות אלו הייתה מוטציות נקודתיות ואירועי רקומבינציה (שחלוף). מוטציות נקודתיות הן אירועים מיוחדים וחריגים שתדירותם נמוכה, אשר מתקבעים לאורך האבולוציה רק אם הם מקנים יתרון אבולוציוני, והן אפשרו לפאג'ים לבצע הדבקה מוצלחת למרות המצאות מערכות ה-CRISPR-Cas בחיידקים.
אנטי-קריספר התגלה לראשונה ב*פסאודומונס אארוגינוזה* (Pseudomonas aeruginosa) בעקבות מחקר של מערכת I-F CRISPR-Cas. בניסוי לקחו שלושה פאג'ים רגישים למערכות CRISPR ורצו לבדוק את יעילות יצירת רובד נגיפי (פלאק), המהווה מדד למוות של חיידקים, על ידי הפאג'ים. הניסוי הראה במפתיע כי אחד מזני הפאג'ים הליזוגניים של הפסאודומונס אארוגינוזה, PA14(JBD30), הצליח לגדול. החוקרים ניסו להבין מה איפשר לאותם פאג'ים לגדול למרות מערכת הקריספר והגיעו למסקנה כי גנים המקודדים על-ידי הפאג'ים גרמו להשבתת מערכת ה-CRISPR-Cas של החיידק.

בשלב הראשון נמצאו חמישה חלבונים שונים שמשביתים את מערכת CRISPR-Cas מסוג I-F והם: AcrF1, AcrF2, AcrF3, AcrF4 ו-AcrF5. שמות חלבוני האנטי קריספר נקבעים על פי המערכת אותה הם מעכבים ועל פי סדר הגילוי שלהם. מאחר שחמשת החלבונים מעכבים מערכת מסוג I-F הם קיבלו את התחילית AcrF והמספר של כל אחד מהם נקבע בהתאם לסדר גילויים. על ידי בדיקה של חמשת גני האנטי קריספר האלו שעברו אינטגרציה לתוך גנום ה-PA14 בעקבות התקפת פאג', הראו כי ביטוי גנים אלו לא גרם לשינוי ברמת הביטוי של מערכת ה-CRISPR. השערה זו חוזקה על ידי בדיקת PCR שבה נבדקה הימצאותם של גני cas3 ו-csy3. מניסויים אלו הסיקו כי גני האנטי קריספר פועלים רק לאחר הביטוי של רכיבי מערכת ה-CRISPR.

גני האנטי קריספר מהווים הסבר אפשרי להמשך פעילות הפאג'ים ותקיפת החיידקים על-אף קיום מערכות ה-CRISPR-Cas. יתר על כן, נראה כי בעקבות השוני הקיים בין גני אנטי קריספר נוצרו גם מגוון רחב של מערכות CRISPR-Cas לאורך האבולוציה, ולעיתים אף קיימות מספר מערכות שונות בחיידק אחד. כלומר, מדובר בתהליך של קו-אבולוציה המתבססת על מרוץ חימוש בין יצירת מגוון גני אנטי קריספר לבין יצירות מערכות ההגנה השונות של החיידקים.

לאחר מחקר נוסף, התגלו עוד ארבע משפחות שונות של חלבונים קטנים יותר, AcrE1, AcrE2, AcrE3 ו-AcrE4, והראו כי הם מעכבים מערכות CRISPR-Cas מסוג I-E של פסאודומונס אארוגינוזה. הגנים המקודדים את ארבעת חלבונים אלו נגד מערכות מסוג I-E סמוכים על הגנום הנגיפי לאלו המקודדים את החלבונים נגד מערכת מסוג I-F.

הצגת השיטה של זיהוי גני anti-CISPR חדשים בעקבות מיקום בסמוך לגני aca
תשעת הגנים שזוהו לא הכילו מוטיב רצפי שיכל היה להקל במציאת גני אנטי קריספר דומים או משפחות נוספות. חוקרים גילו כי פאג'ים שהכילו קידוד בגנום לגני אנטי קריספר הכילו בקר שעתוק שנקרא אנטי קריספר associated 1 (Aca1), בסמיכות לגנים של אנטי קריספר. על הקשר בין הגנים הללו העיד גם הממצא כי פאג'ים שלא הכילו כלל גני אנטי קריספר לא קודדו כלל ל-Aca1. שני החלקים האלו, גני אנטי קריספר ו-*aca1* מהווים אופרון, כאשר חלבון הבקרה Aca שולט בביטוי של אנטי קריספר ושל גני *aca* כדי להבטיח פעילות אופטימלית במהלך מעגל ההדבקה של הפאג'. מחקרים ביואינפורמטיים שהתמקדו בחקר גנים בשיטת "חיזוי על פי אסוציאציה" (guilt-by-association), זיהו עוד גני אנטי קריספר בהתבסס על מיקומם בגנום – בקרבה לגנים המקודדים לחלבון הרגולטורי Aca1 באלמנטים גנטיים ניידים. בעקבות כך זוהו גנים הומולוגיים שחשבו שהם אנטי קריספר שהיו ממוקמים בסמיכות לגנים אחרים שהיו שונים מאלו של Aca1 מה שהוביל לגילוי משפחת החלבונים Aca2. כך זוהו עוד חמש משפחות נוספות מתוך קבוצת המערכות מסוג I-F (AcrF6, AcrF7, AcrF8, AcrF9 ו-AcrF10).

שיטת הזיהוי עצמי לגילוי גנים חדשים כמועמדים לגני anti-CRISPR
מערכות ה-CRISPR-Cas9 נמצאות כיום בשימוש נרחב בתחומי הביוטכנולוגיה והרפואה עבור עריכה גנטית. על כן הייתה חשיבות גדולה במיוחד לגילויי חלבוני אנטי קריספר אלו, שכן הם יכולים לשמש לבקרה על החלבונים אשר מבצעים את העריכה הגנטית וכך לייעל ולבקר אותה. על-ידי שימוש נוסף בכלים ביואינפורמטיים ושיטת ה"חיזוי על פי אסוציאציה" זוהו המעכבים הראשונים של מערכות CRISPR-Cas מסוג II. נמצאו שלוש משפחות של חלבונים קטנים (AcrIIC1, AcrIIC2 ו-AcrIIC3) החוסמים את פעילות מערכת CRISPR-Cas9 מסוג II-C ב-*Neisseria meningitidis*. כמו כן, נעשה שימוש בגישה ביואינפורמטית חלופית לגילוי מעכבים של מערכות CRISPR-Cas9 מסוג II-A. במחקר זוהו זני חיידקים שמקודדים מערכות CRISPR-Cas9 מסוג II-A שלכאורה תוקפים את הגנום שלהם עצמם. צורת גילוי נוספת נראית שיטת הזיהוי עצמי (self-targeting) לגילוי גנים חדשים כמועמדים לגני anti-CRISPR. השיטה נשענת על ההנחה שמערכת CRISPR-Cas פעילה ו-CRISPR RNA (crRNA) שמכוונות לגנום המארח לא יכולות להתקיים במקביל מבלי לגרום לזיהוי עצמי ומוות תאים. זאת מאחר שחלבוני anti-CRISPR שמקודדים באלמנטים גנטיים ניידים ומבוטאים באותו התא יכולים למנוע מוות של תאים שנגרם על ידי זיהוי עצמי על ידי השבתת מערכת CRISPR מה שמאפשר התמודדות עם מקרים של זיהוי. על ידי שימוש בשיטה הזו התגלו עוד ארבע משפחות חדשות של חלבוני אנטי קריספר (AcrIIA1, AcrIIA2, AcrIIA3 ו-AcrIIA4) המעכבים את מערכת ה-CRISPR-Cas מסוג II-A של *Listeria monocytogenes*. שניים מחלבוני האנטי קריספר, crIIA2 ו-AcrIIA4, נמצאו כיעילים כנגד חלבון CRISPR-Cas9 מסוג II-A של *Streptococcus pyogenes*, חלבון זה הוא החלבון העיקרי המשמש לעריכה גנטית.

מבנה
----

מבנים של חלבוני anti-CRISPR שזוהו עד כה.
קיים מגוון רחב של חלבוני אנטי קריספר. חלק מהמבנים זוהו בפני עצמם ואילו חלק זוהו על בסיס הקישור לקומפלקס ה-CRISPR-Cas. עד כה לא זוהה הבדל משמעותי בין הצורה לפני קישור של חלבוני ה-Acr לצורה אחריה במקרים שבהם שתי התצורות נחקרו ופוענחו. רובם שונים זה מזה, דבר המעיד על מקור אבולוציוני ייחודי של כל אחת ממשפחות חלבוני ה-Acr. עם זאת, למרות השוני הנראה בין המבנים, קיים דמיון מבחינת תפקוד המנגנונים. דוגמה טובה לכך היא הקישור של חלבוני Acr לאזורי אינטראקציה ב-PAM או קרוב אליהם, תכונה אשר משותפת ל: AcrIF2, AcrIF10, AcrIIA2, AcrIIA4 ו-AcrVA1. זוהי דוגמה לאבולוציה מתכנסת.

מחקרים הראו כי גם אופן הפעולה של AcrIE1, אשר חוסם את המערכת מסוג I-E, דומה לזה של AcrIF3. חלבון AcrIE1 זה גם נקשר לנוקלאז (Cas3) וכנראה מונע את הגיוס של קומפלקס ה-DNA אשר קשור ל-I-E CRISPR-Cas. המבנה של Acr זה, אשר נקבע בעזרת קריסטלוגרפיה, מורכב מדימר שכל תת-יחידה שלו מורכבת משלושה סלילי α-helix ו-β-sheet בקצה ה-C-terminal. הדמיון בין AcrE1 ל-AcrIF3 בא לידי ביטוי רק במבנה ה-α-helix וסוברים שהם מונעים פעילות של Cas3 ו-Cas2-3 בהתאמה, בדרכים שונות.

מנגנון
------

לרוב, כאשר הבקטריופאג' מחדיר את הגנום שלו לחיידק, אם אין לחיידק מערכת הגנה, הפאג' יכול לנצל את משאבי התא לשכפול המידע הגנטי שלו. בחיידקים בהם קיימת מערכת ה-CRISPR, בעקבות תקיפות של פאג'ים יש אינטגרציה של מקטע מהגנום הפאג'י לתוך גנום החיידק, אלו רצפי ה-CRISPR. בהגנה מהדבקה של פאג'ים יש ביטוי של crRNA, המגויסים על-ידי חלבוני Cas ומובילים אותם לחיתוך של הגנום הפאג'י. כך, תהליך ההדבקה של הפאג', נעצר על ידי קווי ההגנה של החיידק עוד לפני שהחל. הזיהוי נעשה על בסיס חלקי DNA של הבקטריופאג'ים שנשמרו בגנום החיידק, חלקים אלו משועתקים בהמשך כחלק ממקטעים הנקראים CRISPR RNA (crRNA), אשר יכולים להתחבר ולזהות את הגנום הנגיפי שמוחדר לתאי החיידקים.

חלבוני אנטי קריספר מעכבים את תפקוד CRISPR-Cas במגוון דרכים, למשל על ידי אינטראקציה ישירה עם חלבון Cas החוסמת קשירת DNA לאתרי מטרה מוכרים בגנום הפאג' או מונעת את פעולת החיתוך של אתרי המטרה. כמו כן, הם יכולים לפגוע ב-crRNA, המכוון את חלבון ה-Cas למטרתו.

נראה כי באופן כללי חלבוני Acr יעילים בעיקר אם הם יכולים למנוע באופן ישיר את הפעילות של קומפלקס CRISPR-Cas שכבר נוצר, מה שקורה לרוב כאשר DNA זר נכנס לתא.

גני ה-anti-CRISPR מתורגמים לחלבונים בעלי כמה נקודות התערבות ומניעת פעולות מערכת ה-CRISPR. הם מתחלקים לשני סוגי פעילות עיקריים שהם עיכוב קשירת הגנום ועיכוב חיתוך של הגנום, אך ישנן גם דרכי פעולה נוספות.

שלבי הפעילות של מערכת ה-CRISPR Cas ומנגנוני הפעולה של חלבוני anti-CRISPR (Acr)
### מעכבי קשירה של DNA

זו הפונקציה הנפוצה ביותר בקרב חלבוני אנטי קריספר. החלבונים שעושים זאת הם: AcrIF1, AcrIF2, AcrIF10, AcrIIA2, AcrIIA4 ו-AcrVA4.

מחקרים אודות המבנה הראו כי יש קשירה של שני חלבוני AcrIF1 לחלבון Cas7, ובכך נוצרת הפרעה מרחבית ונמנע קישור ל-DNA. ה-AcrIF2 וה-AcrIF10 נקשרים שניהם ל-Cas8f: AcrIF2 נקשר, ככל הנראה, באזור של החיבור בין Cas7 ו-Cas8 וכך גורם לשינוי בקונפורמציה ומונע אפשרות לקישור עם ה-DNA, ולעומתו AcrIF10 גורם, ככל הנראה, לשינוי קונפורמציה של ה-Cas8 עקב חיקוי מבנה ה-DNA הגורם לו להתקרב ל-Cas7. על אף ש-AcrIF2 וה-AcrIF10 נקשרים ויוצרים אינטראקציה עם Cas7 ו-Cas8 הם נקשרים באזורים עם חפיפה קטנה וגורמים לשינוי קונפורמציה של Cas8 בכיוונים מנוגדים.

AcrIIA4 הוא החלבון הראשון מסוג II שאופיין בצורה מעמיקה. זהו חלבון מאוד חומצי אשר נקשר ל-Cas9 על ידי חיקוי אזור ה-PAM של ה-DNA הדו גדילי וכך מונע קישור ל-DNA המטרה. יעילות של AcrIIA4 כמעכב נובעת מהקישור החזק שלו לקומפלקס של Cas9, שעוצמתי הרבה יותר מהקשירה ל-DNA המטרה.

AcrIIA2 שמשתק גם הוא חלבוני Cas9 מאותה משפחה, שונה משמעותית במבנהו ובצורתו המרחבית מ-AcrIIA4. עם זאת, שני החלבונים נקשרים לאזורים סמוכים ב-Cas9, ולפיכך לא רק ששניהם מתחרים בקשירה של DNA ל-Cas9 אלא גם קיימת ביניהם תחרות. זו דוגמה מעולה נוספת למקרה של אבולוציה מתכנסת של שני חלבונים אשר נקשרים לאתר בצורה דומה. למרות הדמיון בפעולה שלהם, AcrIIA2 יכול להיקשר גם לדומיינים HNH ו-REC2 ב-Cas9 אשר אינם מהווים אזורי מטרה עבור AcrIIA4.

AcrVA4 החוסם את הפעילות של Cas12a גורם לדימריזציה של החלבון וכך מונע את יכולתו להיקשר ל-DNA. ראשית, ה-AcrVA4 נקשר לאזורים בדומיין ה-REC אשר מעורבים בקשירה ובעיבוד של crRNA. ה-AcrVA4 מחקה למעשה את ה-pre-crRNA, מבנה ראשוני ארוך אשר מתורגם מרצפים זיכרון של CRISPR במארח, שלאחר עיבוד הופך להיות crRNA. נקודת הקשירה של חלבון ה-Acr רחוקה מנקודת הקשירה של ה-DNA אך קשירתו גורמת להפרעה מרחבית המונעת את שינוי הקונפורמציה שנחוץ ל-Cas12a על מנת שיוכל להיקשר ל-DNA המטרה.

### מונעי חיתוך של ה-DNA

הפונקציה השנייה הנפוצה ביותר של חלבוני אנטי קריספר היא מניעת חיתוך של DNA. החלבונים להם יכולת זו הם: AcrIF3, AcrIE1 ו-AcrIIC1. מבנה של חלבוני Acr אלו פוענח על ידי קריסטלוגרפיה.

AcrIF3 הוא חלבון שכולו מורכב מסלילי הליקס ופועל כדימר של זוג חלבונים אשר מתחברים לCas2-3 תוך כיסוי אזור הקישור וקצוות החלבון, אינטראקציה המונעת ממנו לחתוך את גנום הפאג'. מחקרים הראו כי מבנה ה-AcrIF3 מחקה את מבנה הדומיין ב-Cas8f אשר אמור לגייס את ה-Cas2-3 לקומפלקס שאמור לקשור את ה-DNA. טרם התגלה המנגנון המלא של החלבונים האחרים אך נראה כי המנגנון של AcrIE1 דומה לזה של AcrIF3. מבחינת מבנה נראה כי מבניהם שונים זה מזה, דבר המרמז כי הם פועלים בדרכים אחרות לעיכוב מערכת ה-CRISPR-Cas. AcrIE1 קושר את הנוקלאז Cas3 וכנראה מונע גיוס לקומפלקס של I-E CISPR-Cas.

AcrIIC1 אשר פועל כנגד מערכות מסוג II-C נקשר לדומיין ה-HNH של Cas9, כאשר ה-AcrIIC1 קשור ל-Cas9 חלבון ה-Cas עדיין יכול להיקשר לגנום אך הוא לא מצליח לחתוך אותו.

### עיכוב על ידי יצירת דימר

AcrIIC3 מונע קישור ל-DNA של Cas9 וגורם לו לעבור דימריזציה, כלומר קישור של זוגות Cas9, זאת על ידי קשירת דומיין הנוקלאז HNH של Cas9. הוא נקשר ל-Cas9 לצד הנגדי של אתר ה-HNH בהשוואה ל-AcrIIC1. צורה זו גורמת לדומיין ה-HNH להיות במצב לא פעיל ורחוק מנקודת החיתוך המיועדת.

### עיכוב של קישור ל-Guide RNA

AcrIIC2 נקשר ל-Cas9 אשר מעורב בשלב האינטראקציה עם gRNA. בהתאם לאזור הקישור, הקומפלקס של Cas9 ו-AcrIIC2 מונע אינטראקציה עם gRNA. הצורה של AcrIIC2 היא דימר עם מטען שלילי גדול אשר נקשר לאתר הקישור החיובי ב-Cas9. בעקבות הקישור יש הפרעה מרחבית המונעת קישור של ה-Cas9 עם ה-gRNA.

### עיכוב קשירה ל-DNA בעזרת מנגנון אנזימטי

AcrVA1 נקשר לקומפלקס של Cas12a ו-crRNA ונמצא באינטראקציה בעיקר עם אזורים אשר קושרים PAM ובכך בעצם מחקה את ה-DNA. כמו כן, הוא יכול לחתוך את ה-crRNA וכך למנוע באופן מוחלט קישור ל-DNA. זהו חלבון ה-Acr הראשון שהתגלה אשר פועל במנגנון אנזימטי.

גם AcrVA5 מעכב פעילות קשריה ל-DNA של Cas12a. הוא מבצע אצטילציה לאזור ב-Cas12a ובכך מונע זיהוי של ה-PAM דבר המונע אינטראקציה עם גנום המטרה.

דרכי פעולה
----------

מטרת חלבוני האנטי קריספר היא לאפשר לפאג' לשרוד בתא החיידק על ידי פגיעה במערכת ה-CRISPR-Cas אשר מגינה על החיידק. ישנן שתי דרכי פעולה עיקריות בהן פועלים חלבוני האנטי קריספר, מניעת הריסת המידע הגנטי של הפאג' אשר הוחדר לתוך תא החיידק וכן רצף הדבקות, כאשר הפאג' הראשון מייצר פלטפורמה המאפשרת לפאג' הבא שיתקוף את אותו התא לשרוד.

### מניעת הריסת גנום הפאג'

תיאור הדבקה ראשונית מול משנית של פסאודומונס אארוגינוזה המתבצעת על ידי פאג'ים
אחד מהתפקידים העיקריים של חלבוני האנטי קריספר הוא להיות באינטראקציה ישירה עם מרכיבים של מערכת ה-CRISPR Cas, בין היתר הנוקלאזות, במטרה למנוע את פעולתן ולחסום את הרס הגנום של הפאג'.

תהליך התקיפה מתחיל בכך שהפאג' מחדיר את הגנום שלו לתוך חיידק. לרוב, החיידק מזהה את הרצף שהוחדר אליו על ידי הפאג', דבר המעורר את מערכת ה-CRISPR-Cas על מנת להרוס את הגנום הזר ולמנוע שכפול של הפאג'. למרות זאת, אם קיים בגנום שהוחדר רצף ראשוני המקודד לחלבוני אנטי קריספר ייתכן שהם ימנעו את הרס הגנום של הפאג'. הרצף הראשוני המדובר נמצא לפני מקטע המטרה אשר מזוהה על ידי מערכת ה-CRISPR-Cas ולכן נוצר לפני שרצף המטרה נקרא. כך פעילות מערכת החיסון של החיידק נחסמת לפני שהחלה את פעולתה.

### הדבקה משנית

חיידקים בעלי מערכות CRISPR-Cas חסינים באופן חלקי לפאג'ים המקודדים חלבוני אנטי קריספר מקודד (נקראים גם Acr-phages). לעיתים, לאחר הדבקה ראשונית של Acr-phages נוצרת הדבקה משנית על ידי פאג' אחר, כלומר בסיום התהליך יש הדבקה מוצלחת. הפאג' הראשון חוסם את מערכת החיסון של החיידק, CRISPR-Cas, כדי לאפשר שכפול של ה-Acr-phage הבא שיתקוף. רצף אירועים זה, פאג'-פאג', יכול להוביל לנקודות מפנה אפידמיולוגיות בהן הריכוז הראשוני של Acr-phage יכול להטות את המצב בתא המארח מהכחדת הפאגים למגפת הפאג'ים.

מחקרים הראו כי הריכוז התוך-תאי של חלבון אנטי קריספר אשר דרוש לצורך השבתה של מערכת ה-CRISPR-Cas תלוי ביחסים של המעכב (חלבוני אנטי קריספר) למול החסינות של מערכת ה-CRISPR-Cas. מכך נובע כי תא בודד יכול להיות מדוכא חיסונית על ידי חלבוני אנטי קריספר שנכנסו לתא מאירועי הדבקה בודדים. בהיעדר שכפול ויראלי, אירועי הדבקה כאלה יכולים להוביל להפסקת החסינות התאית, ובכך להגדיל את ההסתברות לאירועי הדבקה מוצלחים בעתיד.

מכך נובע כי אינטראקציות בין חלבוני אנטי קריספר המקודדים על ידי הפאג'ים לבין מערכות ה-CRISPR-Cas שבהם החלבונים מיועדים לפגוע, מעצבים את הדינמיקה של אוכלוסיית החיידקים.

שימושים
-------

המחשת שימושים בגנים של Acr בפרוקריוטיים
הספציפיות הגבוהה של הנוקלאזות מסוג CRISPR-Cas והיכולת ל"תכנת" אותן בקלות משמשות ליישומים מולקולריים, ביו-טכנולוגיים ורפואיים שונים, כולל עריכת גנים, ביצוע נוקאאוט גנטי וויסות גנים. עם זאת, חרף היתרונות המהפכניים שמציעות מערכות ה-CRISPR-Cas, עדיין יש כמה אתגרים ליעילותן ולבטיחותן של טכנולוגיות אלה. לדוגמה, פעילות נוקלאזית של Cas בתאים במהלך עריכת vivo in או ex vivo יכולה להוביל להשפעות מחוץ למטרה (off-target), להשפעות בלתי צפויות, להרעלה תאית, ולאימונוגניות. יש צורך לטפל ולהתייחס לבעיות אלו בכל הפיתוחים של יישומים לעריכה גנטית.

שימוש בחלבוני אנטי קריספר יכולה להגביל עריכה באזורים שאינם אתר המטרה של אנזים ה-Cas. לדוגמה, חלבון AcrIIA4 הוא אחד מהחלבונים האחראים על עיכוב מערכת CRISPR-Cas9, אשר משמש כיום עבור עריכה גנטית בתאים של יונקים. כאשר מכניסים AcrIIA4 לתאים אנושיים, הוא מונע את האינטראקציה של Cas9 עם מערכת CRISPR, ועל ידי כך מפחית את יכולת המערכת לחתוך DNA. עם זאת, מחקרים הגיעו למסקנה כי הוספתו של חלבון האנטי קריספר כמה שעות לאחר הכנסת ה-Cas9, מפחיתה את מספר החיתוכים מחוץ לאזור המטרה באתרים בהם מתבצעת אינטראקציה עם Cas9. זאת מכיוון שלאחר שמתבצעת עריכה באתרי המטרה, Cas9 מבצע גם עריכה באזורים אחרים. לכן שימוש בחלבון אנטי קריספר גורם לתהליך העריכה הגנטית להיות מדויק הרבה יותר.

דוגמאות לשימושים אפשריים נוספים בגנים של Acr בפרוקריוטיים:

1. חלבוני Acr יכולים לחסום עריכה על ידי מערכות CRISPR-Cas.
2. חלבוני Acr יכולים לסייע בהפחתת אירועי עריכה גנומיים לא רצויים העלולים לגרום לרעילות.
3. גנים של Acr יכולים לשמש כסמנים לבחירה בעריכה גנטית של פאג'ים.
4. חלבוני Acr יכולים להשבית את פעילות האנדונוקלאז, ובכך לשנות את פעילות המערכת להיות מערכת CRISPRi ולבצע השתקה של גנים.
5. מנגנון מערכות ה-CRISPR-Cas לעיתים תורמות להדבקה חיידקית (bacterial virulence), למשל, באמצעות קשירה ל-DNA גנומי של המארח. הכנסת חלבוני Acr עשוי למנוע פונקציות אלה של מערכות CRISPR-Cas, ובכך למנוע את התחזקות פעילותו הוירולנטית של החיידק.
6. הביטוי של חלבוני Acr יכול להרחיב את מגוון המארחים הפוטנציאליים עבור טיפול פאג'י (Phage therapy, טיפול בזיהום פתוגני על ידי שימוש בפאג'ים) מאחר שהוא יכול לבצע עיכוב של מערכות ה-CRISPR-Cas העלולות לפגוע בטיפול מסוג זה.

סוגים
-----

שמות חלבוני האנטי קריספר נקבעים על פי המערכת אותה הם מעכבים ועל פי סדר הגילוי שלהם. לדוגמה, חלבון AcrIIA4 הוא החלבון הרביעי שזוהה מתוך החלבונים אשר מעכבים את מערכת CRISPR-Cas מסוג II-A וכך נקבע שמו.

|  |  |  |  |  |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| **סוג** | **שלב מעוכב** | **תת סוג מעוכב** | **שם חלבון Acr** | **אורתולוג Cas** |
| I | קישור ל-DNA | I-F | AcrIF1 | **PaeCascade (I-F), PecCascade (I-F)** |
| AcrIF2 | **PaeCascade (I-F), PecCascade (I-F)** |
| AcrIF4 | **PaeCascade (I-F)** |
| AcrIF10 | **PaeCascade (I-F), PecCascade (I-F)** |
| I-D | AcrID1 | **SisCas10d (I-D)** |
| חיתוך ה-DNA | I-E | AcrIE1 | **PaeCas3 (I-E)** |
| I-F | AcrIF3 | **PaeCas3 (I-F)** |
| לא ידוע | I-C | AcrIC1 | **PaeCascade/Cas3 (I-C)** |
| I-E | AcrIE2−7 | **PaeCascade/Cas3 (I-E)** |
| I-F | AcrIF5−9

AcrIF11−14 | **PaeCascade/Cas3 (I-F)** |
| II | קישור ל-DNA | II-A | AcrIIA2 | **SpyCas9, LmoCas9** |
| AcrIIA4 | **SpyCas9, LmoCas9** |
| AcrIIA6 | **St1Cas9** |
| II-C | AcrIIC3 | **NmeCas9, Nme2Cas9, HpaCas9, SmuCas9** |
| AcrIIC4 | **NmeCas9, Nme2Cas9, HpaCas9, SmuCas9** |
| AcrIIC5 | **NmeCas9, HpaCas9, SmuCas9** |
| טעינת מקטעGuide | AcrIIC2 | **NmeCas9, SmuCas9, HpaCas9** |
| חיתוך ה-DNA | AcrIIC1 | **NmeCas9, Nme2Cas9, CjeCas9, GeoCas9, SmuCas9, HpaCas9** |
| II-A | AcrIIA11 | **SpyCas9, TdeCas9** |
| לא ידוע | II-A | AcrIIA1 | **LmoCas9, SpyCas9** |
| AcrIIA3 | **LmoCas9, SpyCas9** |
| AcrIIA5 | **St1Cas9, St3Cas9, SpyCas9** |
| AcrIIA7−10 | **SpyCas9** |
| III | הפרעה ל-Csx1 RNase | III-B | AcrIIIB1 | **SisCmr-α; SisCmr-γ** |
| V | קישור ל-DNA | V-A | AcrVA1 | **MbCas12a, AsCas12a, LbCas12a, FnCas12a** |
| AcrVA4 | **MbCas12a, LbCas12a** |
| AcrVA5 | **MbCas12a, LbCas12a** |
| לא ידוע | AcrVA2 | **MbCas12a** |
| AcrVA3.1 | **MbCas12a, PaeCascade/Cas3 (I-C)** |
| VI | לא ידוע | VI-B | Csx27 | **BzoCas13b, PbuCas13b** |

הטבלה מציגה סיכום של סוגי האנטי קריספר המוכרים, כולל סיווג עבור הדרך שבה החלבונים מבצעים עיכוב אם המנגנון זוהה. בין היתר זוהו כמה חלבוני Acr אשר מעכבים מערכות ממספר תתי סוגים.

קישורים חיצוניים
----------------

* מסמך Google Sheets שיצרה קהילת החוקרים העולמית של אנטי קריספר המתעדכן עם שמות כל חלבוני האנטי קריספר שהתגלו, כולל מידע נוסף על המשפחות, מידע על הפרסום ורצף חומצות האמינו שמרכיב אותם
* סרטון הסבר על שימוש שחלבוני Acr בתור מתג כיבוי לטכנולוגיות של שימושים ב-CRISPR-Cas

הערות שוליים
------------

1. 1 2 3 4 5 6  Nicole D. Marino, Rafael Pinilla-Redondo, Bálint Csörgő, Joseph Bondy-Denomy, Anti-CRISPR protein applications: natural brakes for CRISPR-Cas technologies, **Nature Methods** 17, 2020-05, עמ' 471–479 doi: 10.1038/s41592-020-0771-6
2. 1 2 3 4 5 6  April Pawluk, Alan R. Davidson, Karen L. Maxwell, Anti-CRISPR: discovery, mechanism and function, **Nature Reviews Microbiology** 16, 2018-01, עמ' 12–17 doi: 10.1038/nrmicro.2017.120
3. 1 2 3 4 5  Joe Bondy-Denomy, April Pawluk, Karen L. Maxwell, Alan R. Davidson, Bacteriophage genes that inactivate the CRISPR/Cas bacterial immune system, **Nature** 493, 2013-01, עמ' 429–432 doi: 10.1038/nature11723
4. ↑  April Pawluk, Joseph Bondy-Denomy, Vivian H. W. Cheung, Karen L. Maxwell, A new group of phage anti-CRISPR genes inhibits the type I-E CRISPR-Cas system of Pseudomonas aeruginosa, **mBio** 5, 2014-04-15, עמ' e00896 doi: 10.1128/mBio.00896-14
5. 1 2  April Pawluk, Raymond H. J. Staals, Corinda Taylor, Bridget N. J. Watson, Inactivation of CRISPR-Cas systems by anti-CRISPR proteins in diverse bacterial species, **Nature Microbiology** 1, 2016-06-13, עמ' 1–6 doi: 10.1038/nmicrobiol.2016.85
6. ↑  April Pawluk, Nadia Amrani, Yan Zhang, Bianca Garcia, Naturally Occurring Off-Switches for CRISPR-Cas9, **Cell** 167, 2016-12-15, עמ' 1829–1838.e9 doi: 10.1016/j.cell.2016.11.017
7. ↑  Benjamin J. Rauch, Melanie R. Silvis, Judd F. Hultquist, Christopher S. Waters, Inhibition of CRISPR-Cas9 with Bacteriophage Proteins, **Cell** 168, 2017-01-12, עמ' 150–158.e10 doi: 10.1016/j.cell.2016.12.009
8. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13  Alan R. Davidson, Wang-Ting Lu, Sabrina Y. Stanley, Jingrui Wang, Anti-CRISPRs: Protein Inhibitors of CRISPR-Cas Systems, **Annual Review of Biochemistry** 89, 2020-06-20, עמ' 309–332 doi: 10.1146/annurev-biochem-011420-111224
9. 1 2  Michiel van Gent, Michaela U. Gack, Viral Anti-CRISPR Tactics: No Success without Sacrifice, **Immunity** 49, 2018-09-18, עמ' 391–393 doi: 10.1016/j.immuni.2018.08.023
10. 1 2  Mariann Landsberger, Sylvain Gandon, Sean Meaden, Clare Rollie, Anti-CRISPR Phages Cooperate to Overcome CRISPR-Cas Immunity, **Cell** 174, 2018-08-09, עמ' 908–916.e12 doi: 10.1016/j.cell.2018.05.058
11. ↑  Adair L. Borges, Jenny Y. Zhang, MaryClare F. Rollins, Beatriz A. Osuna, Bacteriophage Cooperation Suppresses CRISPR-Cas3 and Cas9 Immunity, **Cell** 174, 2018-08-09, עמ' 917–925.e10 doi: 10.1016/j.cell.2018.06.013
12. ↑  Patrick D. Hsu, David A. Scott, Joshua A. Weinstein, F. Ann Ran, DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases, **Nature Biotechnology** 31, 2013-09, עמ' 827–832 doi: 10.1038/nbt.2647
13. ↑  Hyunji Lee, Jin-Soo Kim, Unexpected CRISPR on-target effects, **Nature Biotechnology** 36, 2018-09, עמ' 703–704 doi: 10.1038/nbt.4207
14. ↑  Robert J. Ihry, Kathleen A. Worringer, Max R. Salick, Elizabeth Frias, p53 inhibits CRISPR–Cas9 engineering in human pluripotent stem cells, **Nature Medicine** 24, 2018-06-11, עמ' 939–946 doi: 10.1038/s41591-018-0050-6
15. ↑  Kira S. Makarova, Yuri I. Wolf, Omer S. Alkhnbashi, Fabrizio Costa, An updated evolutionary classification of CRISPR–Cas systems, **Nature Reviews Microbiology** 13, 2015-11, עמ' 722–736 doi: 10.1038/nrmicro3569