As diferentes xeracións de nucleases usadas para a edición do xenoma e as vías de reparación do ADN usadas para modificar o ADN diana.
A **edición do xenoma** (*genome editing*), **edición de xenes** ou **enxeñaría xenómica** é un tipo de enxeñaría xenética na cal o ADN se insire, elimina, modifica ou substitúe no xenoma dun organismo vivo. A diferenza das primeiras técnicas de enxeñaría xenética nas que se insería aleatoriamente material xenético no xenoma do hóspede, a edición do xenoma dirixe as insercións a localizacións específicas de sitio. O mecanismo básico implicado nas manipulacións xenéticas realizadas por medio de nucleases programables é o recoñecemento de loci xenéticos diana e a unión de endonucleases de restrición (FokI e Cas) a roturas de dobre febra (DSBs) do ADN diana, e a reparción de roturas de dobre febra por recombinación dirixida por homoloxía (HDR) ou unión de extremos non homólogos (NHEJ).

Historia
--------

A edición do xenoma empezou na década de 1990, antes da aparición das actuais plataformas comúns de edición de xenes baseadas nas nucleases; porén, o seu uso estaba limitado pola baixa eficiencia da edición. A edición xenómica con nucleases preparadas por enxeñaría, é dicir, as tres grandes clases de encimas nucleases de dedo de cinc (ZFNs), nucleases efectoras similares a activadores da transcrición (TALENs) e meganucleases modificadas por enxeñaría, foi seleccionada pola revista Nature Methods como o Método do ano 2011. O sistema CRISPR-Cas foi seleccionado pola revista Science como Logro do ano 2015.

En 2015 utilizábanse catro familias de nucleases de enxeñaría: meganucleases, nucleases de dedo de cinc (ZFNs), nucleases efectoras similares a factores de transcrición (TALEN) e o sistema de repeticións palindrómicas curtas interespazadas regularmente agrupadas (CRISPR/Cas9). En 2017 dispoñíase de nove editores xenómicos.

En 2018 os métodos comúns para a edición utilizaban nucleases preparadas por enxeñaría ou "tesoiras moleculares". Estas nucleases crean roturas de dobre febra (DSBs) específicas de sitio nos lugares desexados do xenoma. As roturas de dobre febra inducidas son reparadas por unión de extremos non homólogos (NHEJ) ou recombinación homóloga (HR), o que orixina mutacións nos lugares diana ("edicións").

En maio de 2019 avogados da China informaron, á luz da suposta creación polo científico chinés He Jiankui dos primeiros xenes humanos editados, do borrador dunhas regulacións legais que estipulaban que calquera que manipulase o xenoma humano coas técnicas de edición de xenes, como CRISPR, sería responsable das consecuencias adversas que se puidesen producir. Recentemente abriuse unha discusión advertindo sobre os posibles puntos cegos e riscos do uso de CRISPR e biotecnoloxías relacionadas, enfocándose na natureza aleatoria dos procesos de control celular.

O Instituto Roslin da Universidade de Edimburgo preparou porcos modificados por enxeñaría resistentes a un virus que causa a síndrome respiratoria e reprodutiva porcina, que costa anualmente 2.600 millóns de dólares en perdas aos granxeiros de porcino europeos e norteamericanos.

En febreiro de 2020 un ensaio en EUA mostrou a seguridade do uso da edición de xenes con CRISPR en 3 pacientes de cancro. En 2020 a variedade de tomate Sicilian Rouge High GABA, que produce máis cantidade dun aminoácido que se di promove a relaxación, foi aprobada para a súa venda no Xapón.

En 2021 Inglaterra (pero non o resto do Reino Unido) planeou retirar as restricións á edición de xenes en plantas e animais, cambiando as anteriores regulacións concordantes coas da Unión Europea a regras máis parecidas ás dos Estados Unidos e outros países. Mesmo un informe da propia Comisión Europea de abril de 2021 atopou "fortes indicacións" de que o actual réxime regulatorio non era apropiado para a edición de xenes. Posteriormente en 2021, algúns investigadores anunciaron unha alternativa ao CRISPR consistente en usar proteínas etiquetadas de actividade guiada por elemento móbil (OMEGA), entre as cales estaban IscB, IsrB e TnpB, como endonucleases atopadas en transposóns, e guiadas por pequenos ARNω.

Introdución
-----------

A enxeñaría xenética leva utilizándose desde a década de 1970 como método de introdución de novos elementos xenéticos en organismos. Unha desvantaxe desta tecnoloxía foi a natureza aleatoria coa cal o ADN se insire no xenoma do hóspede, que pode afectar ou alterar outros xenes do organismo. Porén, descubríronse varios métodos que dirixen os xenes inseridos a sitios específicos do xenoma. Isto tamén permitía a edición de secuencias específicas dentro dun xenoma así como reducía os efectos fóra da diana. Isto podía utilizarse en investigacións para dirixir a produción de mutacións a xenes específicos, e en terapia xénica. Inserindo un xene funcional nun organismo e utilizándoo para substituír un xene defectuoso, sería posible curar certas enfermidades xenéticas.

### Gene targeting

#### Recombinación homóloga

Os métodos iniciais para dirixir xenes a certos puntos do xenoma dun organismo (chamados gene targeting) utilizaban a recombinación homóloga (HR). Ao crear construtos de ADN que conteñan un molde que se corresponda coa secuencia diana do xenoma é posible que os procesos de recombinación homóloga dentro da célula insiran o construto na localización desexada. O uso deste método en células nai embrionais levou ao desenvolvemento de ratos trasnxénicos nos que se aplicara knockout nos xenes diana. Tamén foi posible facer un knock-in de xenes ou alterar os padróns de expresión xénica. Mario Capecchi, Martin Evans e Oliver Smithies recibiron en 2007 o Premio Nobel de Medicina en recoñecemento polo seu descubrimento de como se pode usar a recombinación homóloga para introducir as modificacións xenéticas en ratos por medio de células nai embrionais.

#### Targeting condicional

Se un xene vital é sometido a knockout isto pode ser mortal para o organismo. Para estudar a función destes xenes utilizáronse recombinases específicas de sitio (SSR). Os dous tipos máis comúns son os sistemas Cre-LoxP e Flp-FRT. A recombinase Cre é un encima que elimina ADN por recombinación homóloga entre secuencias de unión coñecidas como sitios Lox-P. O sistema Flip-FRT funciona de xeito similar, co recoñecemento de secuencias FRT pola recombinase Flip. Cruzando un organismo que conteña os sitios de recombinase que flanquean o xene de interese cun organismo que expresa a recombinase específica de sitio baixo o control de promotores específicos de tecido, é posible causar un knockout ou interrupción en xenes de certas células. Estas técnicas tamén se utilizaron para eliminar marcadores de xenes de animais transxénicos. Outras modificacións destes sistemas permiten inducir a recombinación só baixo certas condicións, permitindo que os xenes sexan sometidos a knockout ou expresados en momentos desexados ou etapas do desenvolvemento.

Proceso
-------

### Reparación de roturas de dobre febra

Vías de reparación das roturas de dobre febra e edición do xenoma usando nucleases CRISPR-Cas.
Unha forma común de edición do xenoma depende do concepto da mecánica de reparación de roturas de dobre febra (DSB) no ADN. Hai dúas vías principais que reparan as roturas de dobre febra; a unión de extremos non homólogos (NHEJ) e a reparción dirixida por homoloxía (HDR). A unión de extremos non homólogos usa unha variedade de encimas para unirse directamente aos extremos do ADN, mentres que a máis exacta reparación dirixida por homoloxía usa unha secuencia homóloga como molde para a rexeneración de secuencias de ADN perdidas no punto de rotura. Isto pode ser aproveitado creando un vector cos elementos xenéticos desexados dentro dunha secuencia que é homóloga das secuencias flanqueantes dunha rotura de dobre febr. Isto resulta na inserción do cambio desexado no sitio da rotura de dobre febra. Mentres que a edición de xenes baseada na reparaciónn dirixida por homoloxí é similar á recombinación homóloga baseada no gene targeting, a taxa de recombinación increméntase en polo menos tres ordes de magnitude.

### Nucleases de enxeñaría

A clave da edición do xenoma é crear unha rotura de dobre febra nun punto específico do xenoma. Os encimas de restrición usados comunmente son efectivos para cortar o ADN, pero xeralmente recoñecen e cortan en múltiples sitios. Para superar este cambio e crear roturas de dobre febra específicas de sitio, descubríronse e preparáronse por bioenxeñaría ata agora tres clases de nucleases. Estas son as nucleases de dedo de cinc (ZFNs), as nucleases efectoras similares a activadores de transcrición (TALEN), as meganucleases e o sistema de repeticións palindrómicas curtas intespazadas regularmente agrupadas (CRISPR/Cas9).

#### Meganucleases

As meganucleases, descubertas a finais da década de 1980, son encimas da familia das endonucleases que se caracterizan pola súa capacidade de recoñecer e cortar grandes secuencias de ADN (de 14 a 40 pares de bases). As meganucleases mellor coñecidas e espalladas son as proteínas da familia LAGLIDADG, que deben o seu nome a unha secuencia de aminoácidos conservada.

As meganucleases encóntranse comunmente en todas as especies microbianas e teñen a propiedade exclusiva de ter secuencias de recoñecemento moi longas (>14bp) o que as fai naturalmente moi específicas. Porén, non hai virtualmente ningunha oportunidade de encontrar a meganuclease exacta necesaria para actuar sobre unhas secuencias de ADN específicas escollidas. Para superar este reto, utilizáronse os métodos da mutaxénese e o cribado de alto rendemento para crear variantes da meganuclease que recoñecen secuencias únicas. Outros conseguiron fusionar varias meganucleases e crearon encimas híbridos que recoñecen unha nova secuencia. Outros intentaron alterar os aminoácidos que interaccionan co ADN da meganuclease para deseñar meganucleases específicas de secuencia cun método que produce as chamadas meganucleases deseñadas racionalmente. Finalmente, outra estratexia é o uso de modelos computacionais para tratar de predicir tan exactamente como sexa posible a actividade de meganucleases modificadas e a especificidade da secuencia de ácido nucleico recoñecida.

Creouse un gran banco que contiña varias decenas de miles de unidades de proteínas. Estas unidades poden combinarse para obter meganucleases quiméricas que recoñecen o sitio diana, proporcionando así as ferramentas de investigación e desenvolvemento que serven para unha ampla variedade de necesidades (investigación fundamental, saúde, agricultura, industria, enerxía, etc.). Entre estas está a produción escala industrial de dúas meganucleases capaces de cortar o xene humano XPC; as mutacións neste xene orixinan xeroderma pigmentosum, un trastorno monoxénico grave que predispón aos pacientes ao cancro de pel e quiemaduras cando a súa pel se expón aos raios UV.

As meganucleases teñen a vantaxe de causar menos toxicidade nas células que métodos como a da nuclease de dedo de cinc (ZFN), probablemente debido ao recoñecemento máis estrito da secuencia de ADN; porén, a construción de encimas específicos de secuencia de todas as secuencias posibles é caro e leva moito tempo, e non se beneficia das posibilidades combinatorias de métodos como as que utilizan fusións baseadas en TALEN e ZFNs.

#### Nucleases de dedo de cinc

O concepto que está detrás das tecnoloxías ZFNs e TALEN, oposto ao das meganucleases, baséase nun dominio catalítico que corta o ADN non específico, que pode despois ligarse a péptidos que recoñecen unha secuencia específica de ADN, como os dedos de cinc e efectores similares a activadores de transcrición (TALEs). O primeiro paso para isto era atopar unha endonuclease cuxo sitio de recoñecemento do ADN e sitio de corte estivesen separados, unha situación que non é a máis común entre os encimas de restrición. Unha ve que se atopou este encima, a súa porción para o corte podía ser separada, o cal sería non moi específico, xa que non tería capacidade de recoñecemento. Esta porción podía despois ligarse a péptidos de recoñecemento de secuencia que poderían dar lugar a unha especificidade moi alta.

Os motivos de dedo de cinc aparecen en varios factores de transcrición. O ión cinc, atopado no 8% de todas as proteínas humanas, exerce un importante papel na organización da estrutura tridimensional. Nos factores de transcrición, adoita estar situado nos sitios de interacción proteína-ADN, onde estabiliza o motivo. A parte C-terminal de cada dedo é responsable do recoñecemento específico da secuencia de ADN.

As secuencias de recoñecemento son curtas, constituídas por uns tres pares de bases, pero combinando de 6 a 8 dedos de cinc dos cales se caracterizaron os sitios de recoñecemento. É posible obter proteínas específicas para secuencias duns 20 pares de bases. É, por tanto, posible controlar a expresión dun xene específico. Demostrouse que esta estratexia pode utilizarse para promover un proceso de anxioxénese en animais. É tamén posible fusionar unha proteína construída deste modo cun dominio catalítico dunha endonuclease para inducir unha rotura de ADN dirixida a un punto, e así usar estas proteínas como ferramentas de enxeñaría do xenoma.

O método que xeralmente se adopta para isto implica asociar dúas proteínas de unión ao ADN, cada unha das cales contén de 3 a 6 dedos de cinc elixidos especificamente, cun dominio catalítico da endonuclease FokI que necesita dimerizarse para cortar o ADN de dobre febra. As dúas proteínas recoñecen dúas secuencias ADN que están afastados uns poucos nucleótidos. A ligazón de dúas proteínas de dedo de cinc ás súas respectivas secuencias pon os dous dominios FokI fisicamente xuntos. A FokI necesita dimerización para ter actividade de nuclease e isto significa que a especificidade se incrementa drasticamente a medida que a nuclease asociada recoñece unha secuencia de ADN única. Para mellorar este efecto, preparáronse por enxeñaría xenética nucleases FokI para que só poidan funcionar como heterodímeros.

Utilízanse varias estatexias para deseñar nucleases de dedo de cinc específicas para as secuencias escollidas. As máis estendidas implican combinar as unidades de dedo de cinc con especificidades coñecidas (ensamblaxe modular). Desenvolvéronse varias técnicas de selección, usando bacterias, lévedos ou células de mamífero para identificar as combinacións que ofrecen a mellor especificidade e a mellor tolerancia celular. Aínda que non se informou da caracterización en todo o xenoma directa da actividade de nuclease de dedo de cinc, un ensaio que mide o número total de roturas de dobre febra do ADN en células atopou que só ocorrían unha ou dúas desas roturas por riba das de fondo en células tratadas con nucleases de dedo de cinc cun sitio de recoñecemento composto de 24 bp e dominios de nuclease FokI heterodímeros obrigados.

As nucleases que funcionan como heterodímeros evitarían a posibilidade de actividade homodímera non desexada e así incrementarían a especificidade das roturas de dobre febra. Aínda que as porcións de nuclease dos construtos ZFNs e TALEN teñen propiedades similares, a diferenza entre estas nucleases de enxeñaría está no seu péptido de recoñecemento do ADN. As ZFNs dependen de dedos de cinx Cys2-His2 e os construtos TALEN dependen dos TALEs. Ambos os dominios de péptidos de recoñecemento do ADN teñen a característica de que se encontran naturalmente en combinacións nas súas proteínas. Os dedos de cinc Cys2-His2 aparecen tipicamente en repeticións que están separadas 3 bp e atópanse en diversas combinacións nunha variedade de proteínas que interaccionan cos ácidos nucleicos como os factores de transcrición. Cada dominio de dedo de cinc é completamente independente e a capacidade de unión dun dedo está afectada polo seu veciño. Por outra parte, os TALEs atópanse en repeticións cunha razón de recoñecemento dun a un entre os aminoácidos e os pares de nucleótidos recoñecidos. Como os dedos de cinc e TALEs aparecen en padróns repetidos, as diferentes combinacións poden probarse para crear unha ampla variedade de especificidades de secuencias. Os dedos de cinc foron ben establecidos nestes termos e estratexias como a ensamblaxe modular, a OPEN e os cribados dun híbrido en bacterias de bibliotecas de dedos de cinc, entre outros métodos utilizados para facer nucleases específicas de sitio.

As nucleases de dedo de cinc son ferramentas de investigación e desenvolvemento que xa foron utilizadas para modificar diversos xenomas, en particular polos laboratorios do Consorcio do Dedo de Cinc. A compañía estadounidense Sangamo BioSciences usa a nucleases de dedo de cinc para levar a cabo investigacións en enxeñaría xenética de células nai e a modificación de células inmunes con propósitos terapéuticos. Os linfocitos T modificados están actualmente en ensaios clínicos en fase I para tratar un tipo de tumor cerebral (glioblastoma) e na loita conta a SIDA.

#### TALEN

Esquema xeral do proceso dos TALENs.
As nucleases efectoras similares a activadores de transcrición (TALENs, do inglés *Transcription Activator-Like Effector Nucleases*) son proteínas que se unen a ADN específico que presentan un conxunto de 33 ou 34 repeticións de aminoácidos. Os TALENs son encimas de restrición artificiais deseñados por fusión dun dominio de corte do ADN dunha nuclease con dominios TELE, os cales poden ser deseñados para recoñecer especificamente unha determinada secuencia de ADN. Estas proteínas de fusión serven como "tesoiras do ADN" facilmente dirixibles a un punto do ADN para aplicacións na edición de xenes, que permiten realizar modificacións xenómicas dirixidas a puntos específicos, como inversións de secuencias, delecións, reparación e substitución en células vivas. Os dominios de unión ao ADN, que se poden deseñar para unirse a calquera secuencia de ADN deseñada, proceden de efectores TAL, proteínas que se unen ao ADN excretadas pola planta patóxena *Xanthomanos spp.* Os efectores TAL constan de dominios repetidos, cada un dos cales contén unha secuencia altamente observada de 34 aminoácidos, e recoñece un só nucleótido do ADN dentro do sitio diana. A nuclease pode crear roturas de dobre febra no sitio diana que poden ser reparadas por unión de extremos non homólogos (NHEJ) tendente ao erro, o que ten como resultado alteracións de xenes pola introdución de pequenas insercións ou delecións. Cada repetición está conservada, coa excepción da chamada RVDs (do inglés *repeat variable di-residues*) nas posicións dos aminoácidos 12 e 13. A RVDs determina a secuencia de ADN á cal se unirá o TALE. Esta correspondencia simple un a un entre as repeticións TALE e a secuencia de ADN correspondente fai que sexa doado o proceso de ensamblar conxuntos de repeticións para recoñecer novas secuencias de ADN. Estes TALEs poden ser fusionados ao dominio catalítico da nuclease do ADN FokI, para xerar unha nuclease efectora similar a activadores de transcrición (TALEN). Os construtos TALEN resultantes combinan especificidade e actividade, xerando nucleases específicas de secuencia de enxeñaría que se unen e cortan secuencias de ADN só en sitios preseleccionados. O sistema de recoñecemento da diana das TALEN está baseado nun código doado de predicir. As nucleases TAL son específicas da súa diana debido en parte á lonxitude do seu sitio de unión de 30+ pares de bases. TALEN pode realizarse dentro dun rango de 6 pares de bases arredor de calquera nucleótido determinado de todo o xenoma.

Os construtos TALEN utilízanse de maneira similar ás nucleases de dedo de cinc deseñadas, e teñen tres vantaxes na mutaxénese dirixida: (1) a especificidade de unión ao ADN é maior, (2) os efectos fóra da diana son menores, e (3) a construción dos dominios de unión ao ADN é máis doada.

#### CRISPR

*Artigo principal**:* Edición de xenes CRISPR.
As CRISPRs (do inglés *Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats*, Repeticións Palindrómicas Curtas Interespazadas Regularmente Agrupadas) son elementos xenéticos que usan as bacterias como un tipo de inmunidade adquirida para protexerse dos virus. Consisten en secuencias curtas que se orixinaron a partir dos xenomas virais e foron incorporados ao xenoma da bacteria. As Cas (proteínas asociadas a CRISPR) procesan estas secuencias e cortan as secuencias virais que se corresponden. Ao introducir plásmidos que conteñen xenes Cas e CRISPRs construídos especificamente en células eucariotas, o xenoma eucariota pode cortarse nas posicións deseñadas.

### Edición por modificación de nucleobases (edición de bases)

Un dos primeiros métodos para editar eficazmente ácidos nucleicos emprega encimas que modifican as nucleobases dirixidos por secuencias guía de ácidos nucleicos describiuse na década de 1990 e o seu uso rexurdiu máis recentemente. Este método ten a vantaxe de que non require a rotura das febras do ADN xenómico e así evita as insercións e delecións aleatorias asociadas coa rotura de febras de ADN. Só é apropiado para unha edición precisa que requira cambios dun só nucleótido e demostrou ser moi eficiente para este tipo de edición.

### ARCUT

ARCUT significa cortador de ADN de restrición artificial, técnica desenvolvida por Komiyama. Este método usa ácidos nucleicos peptídicos pseudocomplementarios (ANPpc ou, en inglés, pcPNA) para identificar o sitio de corte no cromosoma. Unha vez que o ácido nucleico peptídico pseudocomplementario especifica o sitio, a excisión é levada a cabo polas tesoiras moleculares cerium (CE) e EDTA (mestura química), que realizan a función de empalme.

Precisión e eficiencia das nucleases de enxeñaría
-------------------------------------------------

O método das megsanucleases de edición de xenes é o menos eficiente de todos os mencionados. Debido á natureza do seu elemento de unión ao ADN e do elemento cortador (ou de clivaxe), está limitado a recoñecer unha posible diana cada mil nucleótidos. O método ZFN desenvolveuse para superar as limitacións das meganucleases. O número de posibles dianas que pode recoñecer co método ZFN increméntase a un por cada 140 nucleótidos. Porén, ambos os métodos son impredicibles debido a que os seus elementos de unión ao ADN aféctanse un a outro. Como resultado, cómpren altos graos de experiencia para utilizalos e procesos de validación longos e caros.

As nucleases TALE son o método máis preciso e específico, máis eficiente que os dous métodos anteriores. Consegue esa eficiencia porque o elemento de unión ao ADN consiste nun conxunto de subunidades TALE, que cada unha delas ten a capacidade de recoñecer unha cadea de nucleótidos de ADN específica independentemente das outras, o que fai que poidan recoñecer un maior número de sitios diana con alta precisión. En crear novas nucleases TALE tárdase unha semana, cun custo duns poucos centos de dólares, tendo experiencia específica en bioloxía molecular e enxeñaría de proteínas.

As nucleases CRISPR teñen unha precisión lixeiramente menor se as comparamos coas TALE. Isto débese á necesidade de ter un nucleótido específico a un extremo para producir o ARN guía que usa CRISPR para reparar a rotura de dobre febra que induciu. É o método máis rápido e barato, xa que custa só menos de douscentos dólares e realízase nuns poucos días. O método CRISPR tamén é o que require menos experiencia en bioloxía molecular, xa que o deseño está no ARN guía en vez de nas proteínas. Unha vantaxe importante que ten o método CRISPR sobre os métodos ZFN e TALEN é que pode ser dirixido a diferentes secuencias de ADN dianas usando os seus ARNs de guía única (sgRNAs) de CRISPR de ~80nt, mentres que tanto o método ZFN coma o TALEN necesitan a construción e testado de proteínas creadas para dirixirse a cada unha das secuencias de ADN.

Como a actividade fóra da diana dunha nuclease activa tería consecuencias potencialmente perigosas a nivel xenético e de organismo, a precisión das meganucleases, as ZFNs, a CRISPR e as fusións baseadas en TALEN foron unha área moi activa de investigación. Aínda que se informou de cifras variables, as ZFNs adoitan ter máis citotoxicidade que os métodos TALEN ou as nucleases guiadas por ARN, mentres que as estratexias que usan TALEN e guiado por ARN adoitan ter a maior eficacia e menores efectos fóra da diana. Baseándose na máxima distancia teórica entre a actividade de nuclease e a de unión ao ADN, a estratexia TALEN é a que ten maior precisión.

Enxeñaría xenómica automatizada múltiple (MAGE)
-----------------------------------------------

O ADN sintético é introducido repetidamente en múltiples áreas diana do cromosoma e/ou loci e despois é replicado producindo células con/sen mutacións.
Os métodos habituais, para os científicos que querían estudar a diversidade xenómica e todos os posibles fenotipos asociados, eran moi lentos, caros e ineficientes. Antes da nova revolución que supuxo a aparición da MAGE, os investigadores facían manipulacións dun só xene e modificaban o xenoma nunha soa pequena sección de cada vez, observaban o fenotipo e empezaban o proceso outra vez cunha nova manipulación diferente dun só xene. Por tanto, os investigadores do Instituto Wyss da Universidade de Harvard deseñaron a MAGE (do inglés *Multiplex Automated Genomic Engineering*, enxeñaría xenómica automatizada múltiple), unha poderosa tecnoloxía que mellora o proceso de edición do xenoma in vivo. Permite manipulacións rápidas e eficientes dun xenoma, que ocorren todas nunha máquina pequena que se podería poñer sobre unhsa mesa de cociña pequena. Estas mutacións combínanse coa variación que ocorre naturalmente durante a mitose da célula, creando miles de millóns de mutacións.

Un ADN monocatenario sintético e un conxunto de oligonucleótidos combinados quimicamente introdúcense nas áreas diana da célula creando así modificacións xenéticas. O proceso cíclico implica a transformación con ADN monocatenario (por electroporación) seguida dun período durante o cal proteínas de recombinación homólogas ás de bacteriófagos fan de mediadoras do *annealing* dos ADN monocatenarios coas súas dianas xenómicas. Nos experimentos que se dirixen a marcadores fenotípicos selectivos faise un cribado e identificación sementando as células en medios diferenciais. Cada ciclo tarda en procesarse 2,5 horas, máis un tempo adicional necesario para que crezan os cultivos isoxénicos e para caracterizar as mutacións. Ao introducir iterativamente bibliotecas de ADN monocatenario mutaxénico dirixido a múltiples sitios, o MAGE pode xerar diversidade xenética combinatoria nunha poboación celular. Pode haber ata 50 edicións xenómicas, desde un só par de bases nucleotídicas a un xenoma completo ou redes de xenes simultaneamente con resultados que se obteñen en cuestión de días.

Os experimentos con MAGE poden dividirse en tres clases, caracterizadas por varios graos de escala e complexidade, que son: (i) moitos sitios diana, mutacións xenéticas simples; (ii) un sitio diana, moitas mutacións xenéticas; e (iii) moitos sitios diana, moitas mutacións xenéticas. Un exemplo de clase tres realizouse en 2009, cando Church e colegas conseguiron programar *Escherichia coli* para producir cinco veces a cantidade normal de licopeno, un antioxidante atopado normalmente en sementes de tomate e ligado a propiedades anticanceríxenas. Aplicaron o MAGE para optimizar a vía metabólica do 1-desoxi-d-xilulosa-5-fosfato (DXP) en *Escherichia coli* para sobreproducir o isoprenoide licopeno. Tardaron 3 días e gstaron só uns mil dólares en materiais. A facilidade, velocidade e baixo custo co cal o MAGE pode alterar xenomas pode transformar as estratexias das industrias para crear e fabricar importantes compostos nos campos da bioenxeñaría, bioenerxía, enxeñaría biomédica, bioloxía sintética, farmacéutica, agrícola e química.

Aplicacións
-----------

En 2012 a edición xenómica eficiente desenvolveuse para un amplo rango de sistemas experimentais que van desde plantas a animais, a miúdo máis alá do interese clínico, e converteuse nunha estratexia experimental estándar en laboratorios de investigación. A xeración recente de mutantes creados con ZFN de ratas, peixe cebra, millo e tabaco e as melloras nas estratexias baseadas en TALEN testemuñan a importancia destes métodos, e a lista está ampliándose rapidamente. A edición do xenoma con nucleases de enxeñaría probablemente contribuirá positivamente en moitos eidos das ciencias da vida, desde estudar as funcións dos xenes en plantas e animais á terapia xénica en humanos. Por exemplo, o campo da bioloxía sintética, que trata de preparar células e organismos por enxeñaría para que realicen novas funcións, probablemente se beneficiará da capacidade das nucleases de enxeñaría de engadir ou eliminar elementos xenómicos e, por tanto, crear sistemas complexos. Ademais, as funcións dos xenes poden estudarse usando células nai con nucleases de enxeñaría.

Velaquí unha lista dalgunhas tarefas específicas que este método pode levar a cabo:

* Mutacións en xenes diana
* Terapia xénica
* Crear rearranxos cromosómicos
* Estudar a función de xenes con células nai
* Animais transxénicos
* Etiquetado de xens endóxenos
* Adición de transxenes dirixida a diana.

### Modificacións de xenes dirixidas a diana en animais

A combinación de descubrimentos recentes en enxeñaría xenética, especialmente a edición de xenes e os últimos avances nas tecnoloxías de reprodución bovina (por exemplo, o cultivo de embrións in vitro) permite facer unha edición xenómica directamente en ovocitos fecundados usando endonucleases altamente específicas sintéticas. As endonucleases guiadas por ARN CRISPR/Cas9 son unha nova ferramenta, que incrementa o número de métodos dispoñibles. En concreto, as endonulceases de enxeñaría CRISPR/Cas9 permiten o uso de múltiples ARNs guía para facer knockouts simultáneos nun só paso por inxección directa citoplasmática (CDI) en cigotos de mamíferos.

Ademais, a edición de xenes pode aplicarse a certos tipos de peixes en acuicultura como o salmón do Atlántico. A edición de xenes en peixes é actualmente experimental, pero as posibilidades inclúen o crecemento, resistencia a enfermidades, esterilidade, reprodución controlada e cor. Seleccionar estes caracteres pode permitir un ambiente máis sostible e un maior benestar dos peixes.

O salmón AquAdvantage é un salmón do Atlántico modificado xeneticamente desenvolvido por AquaBounty Technologies. O xene regulador da hormona do crecemento do salmón do Atlántico é substituído por ese mesmo xene do salmón do Pacífico *Oncorhynchus tshawytscha* e unha secuencia promotora do peixe zoárcido *Zoarces americanus*

Grazas ao desenvolvemento paralelo de transcriptómica dunha soa célula, a edición do xenoma e novos modelos de células nai estamos entrando agora nun período cientificametne excitante no que a xenética funcional xa non está restrinxida a modelos animais pero pode ser realizado directamente en mostras humanas. A análise de expresión de xenes nunha soa célula resolveu un mapa transcricional do desenvolvemento humano a partir do cal están identificándose xenes candidatos claves para estudos funcionais. Usando datos de transcriptómica global para guiar a experimentción, a ferramenta de edición do xenoma baseada en CRISPR fixo factible alterar ou eliminar xenes clave para dilucidar a función en humanos.

### Modificacións de xenes dirixidas a diana en plantas

A edición do xenoma usando meganucleases, ZFNs e TALEN proporciona unha nova estratexia para a manipulación xenética en plantas e é probable que axuden na obtención por enxeñaría de caracteres desexados de plantas modificando xenes endóxenos. Por exemplo, a adición de xenes específica de sitio nas principais especies agrícolas pode utilizarse para o "empillamento de xenes" (*"trait stacking"*), na que varios e ligan caracteres desexados fisicamente para asegurar a súa cosegregación durante o proceso de reprodución. Informouse de progresos en tales casos nas plantas *Arabidopsis thaliana* e *Zea mays*. En *Arabidopsis thaliana*, usando gene targeting asistido por ZFN, foron introducidos dous xenes resistentes a herbicidas (acetolactato sintase SuRA e SuRB do tabaco) no locus SuR cunha alta porcentaxe de ata o 2% de células tnasformadas con mutacións. En *Zea mays* a alteración do locus diana conseguiuse por roturas de dobre febra inducidas por ZFN e a unión de extremos non homólogos resultante. O ZFN foi utilizado para situar o casete de expresión de xenes (PAT) de tolerancia a hebicidas no locus diana endóxeno IPK1 neste caso. Tales modificacións xenómicas observadas en plantas rexeneradas é herdable e foi transmitida á seguinte xeración. Un exemplo potencialmente exitoso da aplicación de técnicas de edición do xenoma na mellora de plantas agrícolas pode encontrarse na banana, na cal se utilizou a edición CRISPR/Cas9 para inactivar o virus das manchas da banana endóxeno no xenoma B da banana (*Musa* spp.) para superar un importante reto na reprodución da banana.

Ademais, a enxeñaría do xenoma baseada en TALEN foi amplamente testada e optimizada para o seu uso en plantas. As fusións TALEN tamén foron utilizadas por unha compañía estadounidense de ingredientes alimentrios, Calyxt, para mellorar a calidade dos produtos do aceite de soia e para incrementar o potencial de almacenamento e procesamento das patacas.

Aínda haberá que facer varias optimizacións para mellorar a edición de xenomas de plantas usando o método do ZFN. Hai unha necesidade para o deseño fiable e o subseguinte test das nucleases, a ausencia de toxicidade das nucleases, a elección axeitada do tecido diana da planta, as rutas e indución da actividade encimática, a falta de mutaxénese fóra de diana, e unha detección fiable dos casos mutados.

Un método común de entrega para o CRISPR/Cas9 en plantas é a transformación baseada en *Agrobacterium*. O ADN-T introdúcese directamente no xenoma da planta por un mecanismo T4SS. O Cas9 e os casetes de expresión baseados en ARN guía son colocados en plásmidos Ti, que son transformados en *Agrobacterium* para aplicacións en plantas. Para mellorar a entrega de Cas9 en plantas vivas, están usando os virus máis efectivos para a transferencia de transxenes.

Investigación
-------------

### Terapia xénica

A práctica ideal da terapia xénica é substituír un xene defectuoso por un alelo normal na súa posición natural. Para isto a edición xenómica é vantaxosa sobre a entrega de xenes por medio de virus, xa que non hai necesidade de incluír as secuencias codificantes completas e as secuencias regulatorias cando en realidade na maior parte dos casos só se necesitaría alterar unha pequena porción do xene. A expresión dos xenes substituídos parcialmente é tamén máis consistente coa bioloxía celular normal que a de xenes completos portados por vectores virais.

O primeiro uso clínico de edición xenómica baseada en TALEN foi para o tratamento da leucemia linfoblástica aguda CD19+ nun neno de 11 meses en 2015. Preparáronse por enxeñaría células T dun doante modificadas para atacar as células da leucemia, para que fosen resistentes ao Alemtuzumab, e que se evadisen da detección polo sistema inmunitario do hóspede unha vez introducidas.

Realizáronse amplas investigacións en células e animais usando CRISPR-Cas9 para intentar corrixir mutacións xenéticas que causan enfermidades xenéticas como a síndrome de Down, espiña bífida, anencefalia e síndromes de Turner e Klinefelter.

En febreiro de 2019, científicos de Sangamo Therapeutics, en Richmond, California, anunciaron a primeira terapia de edición de xenes humanos "no corpo" para alterar permanentemente o ADN, realizada nun paciente de síndrome de Hunter. Os ensaios clínicos de Sangamo nos que se aplica a edición de xenes usando nucleases de dedo de cinc (ZFN) están en marcha.

### Erradicación de enfermidades

Utilizouse xenética dirixida con CRISPR-Cas9 para modificar xenes asociados coa esterilidade en *Anopheles gambiae*, o mosquito vector da malaria. Esta técnica pode utilizarse para erradicar outros vectores portadores de enfermidades, como os da febre amarela, dengue e Zika.

O sistema CRISPR-Cas9 pode programarse para modular a poboación de calquera especie bacteriana tomando como diana xenotipos clínicos ou illamentos epidemiolóxicos. Pode permitir favorecer selectivamente a especies bacterianas beneficiosas sobre as daniñas, eliminando o patóxeno, o cal é unha vantaxe comparado cos antibióticos de amplo espectro.

Están investigándose aplicacións antivirais en terapias para virus humanos como o VIH ou os virus do herpes e hepatite B. O CRISPR pode utilizarse tomando como diana o virus ou o hóspede para alterar xenes que codifican as proteínas receptoras da superficie celular para o virus. En novembro de 2018, na China, o científico He Jiankui anunciou que editara dous embrións humanos para intentar inutilizar o xene da CCR5, que codifica un receptor que usa o VIH para entrar nas células. Aplicou a terapia a dúas nenas xemelgas, Lulu e Nana, fillas de pai positivo para o VIH, para que estivesen protexidas contra o virus, pero o resultado foi que aínda portaban copias funcionais de CCR5 xunto co CCR5 inutilizado (un caso de mosaicismo) e eran aínda vulnerables ao VIH. Este traballo foi amplamente condenado por considerarse falto de ética, perigoso e prematuro.

En xaneiro de 2019 científicos chineses informaron da creación de cinco monos clónicos idénticos por edición de xenes, usando a mesma técnica de clonación utilizada anteriormente cos primeiros monos clonados Zhong Zhong e Hua Hua e coa ovella Dolly, e coa mesma técnica de edición de xenes de CRISPR-Cas9 empregada por He Jiankui coas xemelgas humanas Lulu e Nana. Cos monos clónicos pretendíase estudar varias enfermidades médicas.

Perspectivas e limitacións
--------------------------

No futuro un importante obectivo da investigación en edición do xenoma con nuclesses de enxeñaría debe ser a mellora da seguridade e especificidade de acción das nucleases. Por exemplo, mellorar a capacidade de detectar os eventos fóra de diana aumentará a nosa capacidade de aprender sobre as maneiras de previla. Ademais, os dedos de cinc usados nas ZFNs raramente son completamente específicos e algunhas veces poden causar unha reacción tóxica. Porén, a toxicidade redúcese por modificacións feitas no dominio de corte da ZFN.

Ademais, investigacións feitas por Dana Carroll sobre a modificación do xenoma con nucleases de enxeñaría indican a necesidade de comprender mellor a maquinaria básica de recombinación e reparación do ADN. No futuro un posible método para identificar dianas secundarias sería capturar extremos rotos de células que expresan as ZFNs e secuenciar o ADN que os flanquea usando secuenciación de alto rendemento.

Debido á facilidade de uso e boa relación custo-eficacia de CRISPR, estase a facer actualmente unha ampla investigación sobre ela. Hai agora máis publicacións sobre CRISPR que sobre ZFN e TALEN, malia o recente que é o descubrimento da CRISPR. Tanto CRISPR coma TALEN son as favoritas para ser as técnicas elixidas para aplicalas en producións a grande escala debido á súa precisión e eficiencia.

A edición do xenoma ocorre tamén como un proceso natural sen enxeñaría xenética artificial. Os axentes que son competentes para editar información xenética son virus ou axentes de ARN subvirais.

Aínda que o método GEEN ten maior eficacia que calquera outro método en xenética inversa, aínda non é moi eficiente; en moitos casos menos da metade das poboacións tratadas obteñen os cambios desexados. Por exemplo, cando se planea utilizar a unión de extremos non homólogos celular para crear unha mutación, os sistemas de recombinación dirixida por homoloxía da célula tamén se poñen a funcionar corrixindo as roturas de dobre febra con baixas taxas de mutación.

Tradicionalmente, os ratos son a especie elixida as máis das veces como hóspede para un modelo de enfermidades. O CRISPR pode axudar a superar a distancia entre estes modelos e os ensaios clínicos en humanos ao crear modelos de enfermidades transxénicos en animais máis grandes como porcos, cans e primates non humanos. Usando o sistema CRISPR-Cas9, a proteína Cas9 programada e o ARN de guía única (sgRNA) poden introducirse directamente en cigotos fecundados para conseguir as modificacións xénicas desexadas cando se crean modelos transxénicos en roedores. Isto permite sortear a habitual etapa de tomar como diana unha célula na xeración de liñas transxénicas e, como resultado, isto reduce o tempo de xeración nun 90%.

Unha potencialidade do CRISPR derivada da súa efectividade é a aplicación de xenotransplantes. En ensaios de investigación previos, CRISPR demostrou a capacidade de tomar como diana e eliminar retrovirus endóxenos, o cal reduce o risco de transmitir enfermidades e reduce as barreiras inmunitarias. Eliminar estes problemas mellora a función do órgano do doante, o que achega máis esta aplicación a unha utilidade real.

En plantas a edición do xenoma considérase unha solución viable para a conservación da biodiversidade. A xenética dirixida é unha ferramenta potencial para alterar a taxa reprodutiva de especies invasoras, aínda que leva asociados riscos significativos.

### Potenciamento humano

Moitos transhumanistas ven a edición do xenoma como unha ferramenta potencial para o potenciamento humano. O biólogo australiano e profesor de Xenética David Andrew Sinclair sinalou que "as novas tecnoloxías con edición do xenoma permitirán usala en individuos (...) para que teñan (...) fillos máis sans" (bebés deseñados). Segundo un informe de setembro de 2016 do Nuffield Council on Bioethics, no futuro poderían potenciarse as persoas con xenes doutros organismos ou xenes completamente sintéticos para, por exemplo, mellorar a visión nocturna e o sentido do olfacto. George Church compilou unha lista de posibles modificacións xenéticas de caracteres vantaxosos como unha menor necesidade de durmir, cambios relacionados coa cognición que protexen contra a enfermidade de Alzheimer, resistencia a enfermidades e capacidades de aprendizaxe melloradas xunto con algúns dos estudos asociados e efectos negativos potenciais.

A Academia Nacional de Ciencias e a Academia Nacional de Medicina estadounidenses sacaron un informe en febreiro de 2017 dando un apoio cualificado á edición xenómica en humanos. Recomendaron que os ensaios clínicos para a edición do xenoma poderían permitirse algún día unha vez que se atopen respostas aos problemas de seguridade e eficiencia "pero só para condicións graves baixo estrita supervisión".

Riscos
------

Na declaración da *Avaliación de Ameazas Mundiais da Comunidade de Intelixencia dos EUA* de 2016 o director da Intelixencia Nacional dos EUA James R. Clapper, denominou a edición do xenoma como unha potenciall arma de destrución masiva, afirmando que a edición do xenoma realizada por países con estándares regulaorios ou éticos "diferentes dos de países occidentais" probablemente incrementa o risco da creación de axentes ou produtos biolóxicos daniños. Segundo a declaración, a ampla distribución, baixo custo e ritmo acelerado de desenvolvemento desta tecnoloxía, o seu mal uso a mantenta ou sen intención podería levar a consecuencias económicas e de seguridade nacional de longo alcance. Por exemplo, tecnoloxias como CRISPR poderían utilizarse para producir "mosquitos asasinos" que causasen pragas que barrerían os cultivos básicos para a alimentación.

Segundo un informe de setembro de 2016 do Nuffield Council on Bioethics, a simplicidade e o baixo custo de ferramentas para editar a información xenética permitira a persoas amadoras ( ou "biohackers") realizar os seus propios experimentos, os cales supoñerían un risco potencial de liberación de insectos modificados xeneticamente. A revisión tamén atopou que os riscos e beneficios de modificar o xenoma dunha persoa (e que eses cambios se trasmitan a futuras xeracións) son tan complexos que demandan un escrutinio ético urxente. Tales modificacións poderían ter consecuencias non pretendidas que poderían danar non só aos nenos, senón tamén aos seus fillos futuros, xa que os xenes alterados estarían nos seus espermatozoides e óvulos. En 2001 os investigadores australianos Ronald Jackson e Ian Ramshaw foron criticados por publicar un artigo no Journal of Virology que explora a posibilidade de controlar as poboacións de ratos, unha gran praga en Australia, infectándoos cun virus alterado da variola dos ratos que causaria infertilidade, xa que proporcionaba información sensible que podería levar á fabricación de armas biolóxicas por posibles bioterroristas, que poderían usar ese coñecemento para crear cepas resistentes á vacina doutros virus similares como o do variola, que poderían afectar humanos. Ademais, hai preocupacións adicionais sobre os riscos ecolóxicos de liberar xenes nas poboacións silvestres.

Premio Nobel
------------

En 2007 o Premio Nobel de Medicina foille concedido a Mario Capecchi, Martin Evans e Oliver Smithies "polos seus descubrimentos dos principios para introducir modificacións a xenes específicos en ratos co uso de células nai embrionais."

En 2020 foron galardoados co Premio Nobel de Química Emmanuelle Charpentier e Jennifer Doudna polo "desenvolvemento dun método de edición do xenoma".

Notas
-----

1. ↑  Saurabh S (marzo de 2021). "Genome Editing: Revolutionizing the Crop Improvement". *Plant Molecular Biology Reporte* **39** (4): 752–772. doi:10.1007/s11105-021-01286-7.
2. ↑  Bak, Rasmus O.; Gomez-Ospina, Natalia; Porteus, Matthew H. (agosto de 2018). "Gene Editing on Center Stage". *Trends in Genetics* **34** (8): 600–611. ISSN 0168-9525. PMID 29908711. doi:10.1016/j.tig.2018.05.004.
3. 1 2 3  Woolf TM (abril de 1998). "Therapeutic repair of mutated nucleic acid sequences". *Nature Biotechnology* **16** (4): 341–4. PMID 9555723. doi:10.1038/nbt0498-341.
4. ↑  "Method of the Year 2011". *Nature Methods* **9** (1): 1. xaneiro de 2012. PMID 22312634. doi:10.1038/nmeth.1852.
5. ↑  Science News Staff (17 de decembro de 2015). "Breakthrough of the Year: CRISPR makes the cut".
6. ↑  Esvelt KM, Wang HH (2013). "Genome-scale engineering for systems and synthetic biology". *Molecular Systems Biology* **9** (1): 641. PMC 3564264. PMID 23340847. doi:10.1038/msb.2012.66.
7. ↑  Tan WS, Carlson DF, Walton MW, Fahrenkrug SC, Hackett PB (2012). "Precision editing of large animal genomes". *Advances in Genetics Volume 80*. *Advances in Genetics* **80**. pp. 37–97. ISBN 9780124047426. PMC 3683964. PMID 23084873. doi:10.1016/B978-0-12-404742-6.00002-8.
8. ↑  Puchta H, Fauser F (2013). "Gene targeting in plants: 25 years later". *The International Journal of Developmental Biology* **57** (6–8): 629–37. PMID 24166445. doi:10.1387/ijdb.130194hp.
9. 1 2 3 4 5 6  Boglioli E, Richard M. "Rewriting the book of life: a new era in precision genome editing" (PDF). Boston Consulting Group. Consultado o 30 de novembro de 2015.
10. ↑  Church G. "The future of genetic codes and BRAIN codes". *YouTube*. NIHvcast. Consultado o 10 de febreiro de 2017.
11. ↑  Cyranoski D (maio de 2019). "China set to introduce gene-editing regulation following CRISPR-baby furore". *Nature*. PMID 32424191. doi:10.1038/d41586-019-01580-1. Consultado o 20 de maio de 2019.
12. ↑  Cheong KH, Koh JM, Jones MC (xullo de 2019). "Black Swans of CRISPR: Stochasticity and Complexity of Genetic Regulation". *BioEssays* **41** (7): e1900032. PMID 31090950. doi:10.1002/bies.201900032.
13. 1 2 3  Stokstad, Erik (2021-05-26). "U.K. set to loosen rules for gene-edited crops and animals". *Science | AAAS* (en inglés). Consultado o 2021-05-27.
14. ↑  "US Trial Shows 3 Cancer Patients Had Their Genomes Altered Safely by CRISPR". *ScienceAlert* (en inglés). 7 de febreiro de 2020. Consultado o 2020-02-09.
15. ↑  Altae-Tran, Han; Kannan, Soumya; Demircioglu, F. Esra; Oshiro, Rachel; Nety, Suchita P.; McKay, Luke J.; Dlakić, Mensur; Inskeep, William P.; Makarova, Kira S.; Macrae, Rhiannon K.; Koonin, Eugene V. (2021-10-01). "The widespread IS200/IS605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases". *Science* **374** (6563): 57–65. Bibcode:2021Sci...374...57A. ISSN 0036-8075. PMC 8929163. PMID 34591643. doi:10.1126/science.abj6856.
16. ↑  "New programmable gene editing proteins found outside of CRISPR systems". *Broad Institute* (en inglés). 2021-09-09. Consultado o 2021-10-04.
17. ↑  Lodish H, Berk A, Zipursky SL, Matsudaira P, Baltimore D, Darnell J (2000). [*Edición xenómica* en Google Books. "Chapter 8.5: Gene Replacement and Transgenic Animals: DNA Is Transferred into Eukaryotic Cells in Various Ways"] `|chapter-url=` incorrecto (Axuda). *Molecular Cell Biology* (4th ed.). W. H. Freeman and Company. ISBN 978-0-7167-3136-8.
18. 1 2  Rocha-Martins M, Cavalheiro GR, Matos-Rodrigues GE, Martins RA (agosto de 2015). "From Gene Targeting to Genome Editing: Transgenic animals applications and beyond". *Anais da Academia Brasileira de Ciências* **87** (2 Suppl): 1323–48. PMID 26397828. doi:10.1590/0001-3765201520140710.
19. 1 2  "The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2007". The Nobel Foundation. Consultado o 15 de decembro de 2008.
20. ↑  Jasin M (xuño de 1996). "Genetic manipulation of genomes with rare-cutting endonucleases". *Trends in Genetics* **12** (6): 224–8. PMID 8928227. doi:10.1016/0168-9525(96)10019-6.
21. ↑  Stoddard BL (febreiro de 2005). "Homing endonuclease structure and function". *Quarterly Reviews of Biophysics* **38** (1): 49–95. PMID 16336743. doi:10.1017/s0033583505004063.
22. 1 2  de Souza N (xaneiro de 2012). "Primer: genome editing with engineered nucleases". *Nature Methods* **9** (1): 27. PMID 22312638. doi:10.1038/nmeth.1848.
23. 1 2 3  Smith J, Grizot S, Arnould S, Duclert A, Epinat JC, Chames P, et al. (2006). "A combinatorial approach to create artificial homing endonucleases cleaving chosen sequences". *Nucleic Acids Research* **34** (22): e149. PMC 1702487. PMID 17130168. doi:10.1093/nar/gkl720.
24. ↑  Seligman LM, Chisholm KM, Chevalier BS, Chadsey MS, Edwards ST, Savage JH, Veillet AL (setembro de 2002). "Mutations altering the cleavage specificity of a homing endonuclease". *Nucleic Acids Research* **30** (17): 3870–9. PMC 137417. PMID 12202772. doi:10.1093/nar/gkf495.
25. ↑  Chevalier BS, Kortemme T, Chadsey MS, Baker D, Monnat RJ, Stoddard BL (outubro de 2002). "Design, activity, and structure of a highly specific artificial endonuclease". *Molecular Cell* **10** (4): 895–905. PMID 12419232. doi:10.1016/S1097-2765(02)00690-1.
26. ↑  Arnould S, Chames P, Perez C, Lacroix E, Duclert A, Epinat JC, et al. (xaneiro de 2006). "Engineering of large numbers of highly specific homing endonucleases that induce recombination on novel DNA targets". *Journal of Molecular Biology* **355** (3): 443–58. PMID 16310802. doi:10.1016/j.jmb.2005.10.065.
27. ↑  *Rationally-designed meganucleases with altered sequence specificity and DNA-binding affinity*. 2006-10-18. Consultado o 2018-08-11.
28. ↑  Ashworth J, Taylor GK, Havranek JJ, Quadri SA, Stoddard BL, Baker D (setembro de 2010). "Computational reprogramming of homing endonuclease specificity at multiple adjacent base pairs". *Nucleic Acids Research* **38** (16): 5601–8. PMC 2938204. PMID 20435674. doi:10.1093/nar/gkq283.
29. ↑  Redondo P, Prieto J, Muñoz IG, Alibés A, Stricher F, Serrano L, et al. (novembro de 2008). "Molecular basis of xeroderma pigmentosum group C DNA recognition by engineered meganucleases". *Nature* **456** (7218): 107–11. Bibcode:2008Natur.456..107R. PMID 18987743. doi:10.1038/nature07343.
30. 1 2  Baker M (xaneiro de 2012). "Gene-editing nucleases". *Nature Methods* **9** (1): 23–6. PMID 22312637. doi:10.1038/nmeth.1807.
31. ↑  Rebar EJ, Huang Y, Hickey R, Nath AK, Meoli D, Nath S, et al. (decembro de 2002). "Induction of angiogenesis in a mouse model using engineered transcription factors". *Nature Medicine* **8** (12): 1427–32. PMID 12415262. doi:10.1038/nm1202-795.
32. ↑  Kim YG, Cha J, Chandrasegaran S (febreiro de 1996). "Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain". *Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America* **93** (3): 1156–60. Bibcode:1996PNAS...93.1156K. PMC 40048. PMID 8577732. doi:10.1073/pnas.93.3.1156.
33. 1 2 3 4  Urnov FD, Rebar EJ, Holmes MC, Zhang HS, Gregory PD (setembro 2010). "Genome editing with engineered zinc finger nucleases". *Nature Reviews. Genetics* **11** (9): 636–46. PMID 20717154. doi:10.1038/nrg2842.
34. ↑  Reik A, et al. (2008). "Zinc finger nucleases targeting the glucocorticoid receptor allow IL-13 zetakine transgenic CTLs to kill glioblastoma cells in vivo in the presence of immunosuppressing glucocorticoids". *Mol. Ther.* **16** (Supplement 1): S13–S14. doi:10.1016/S1525-0016(16)39437-0.
35. ↑  Holt N, Wang J, Kim K, Friedman G, Wang X, Taupin V, et al. (agosto de 2010). "Human hematopoietic stem/progenitor cells modified by zinc-finger nucleases targeted to CCR5 control HIV-1 in vivo". *Nature Biotechnology* **28** (8): 839–47. PMC 3080757. PMID 20601939. doi:10.1038/nbt.1663.
36. ↑  Gaj T, Gersbach CA, Barbas CF (xullo de 2013). "ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering". *Trends in Biotechnology* **31** (7): 397–405. PMC 3694601. PMID 23664777. doi:10.1016/j.tibtech.2013.04.004.
37. ↑  Pérez-Quintero AL, Rodriguez-R LM, Dereeper A, López C, Koebnik R, Szurek B, Cunnac S (2013-07-15). "An improved method for TAL effectors DNA-binding sites prediction reveals functional convergence in TAL repertoires of Xanthomonas oryzae strains". *PLOS ONE* **8** (7): e68464. Bibcode:2013PLoSO...868464P. PMC 3711819. PMID 23869221. doi:10.1371/journal.pone.0068464.
38. ↑  Young S (11 de febreiro de 2014). "Genome Surgery". *MIT Technology Review*.
39. ↑  Woolf TM, Chase JM, Stinchcomb DT (agosto de 1995). "Toward the therapeutic editing of mutated RNA sequences". *Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America* **92** (18): 8298–302. Bibcode:1995PNAS...92.8298W. PMC 41144. PMID 7545300. doi:10.1073/pnas.92.18.8298.
40. ↑  Woolf TM, Gurumurthy CB, Boyce F, Kmiec EB (abril de 2017). "To cleave or not to cleave: therapeutic gene editing with and without programmable nucleases". *Nature Reviews. Drug Discovery* **16** (4): 296. PMID 28303022. doi:10.1038/nrd.2017.42.
41. 1 2  Komor AC, Kim YB, Packer MS, Zuris JA, Liu DR (maio de 2016). "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage". *Nature* **533** (7603): 420–4. Bibcode:2016Natur.533..420K. PMC 4873371. PMID 27096365. doi:10.1038/nature17946. SharedIt
42. ↑  Cervantes-Gracia K, Gramalla-Schmitz A, Weischedel J, Chahwan R (2021). "APOBECs orchestrate genomic and epigenomic editing across health and disease". *Trends Genet.* **37** (11): 1028–1043. ISSN 0168-9525. PMID 34353635. doi:10.1016/j.tig.2021.07.003.
43. ↑  Khan, Sikandar Hayat (2019-06-07). "Genome-Editing Technologies: Concept, Pros, and Cons of Various Genome-Editing Techniques and Bioethical Concerns for Clinical Application". *Molecular Therapy. Nucleic Acids* (Elsevier BV) **16**: 326–334. ISSN 2162-2531. PMC 6454098. PMID 30965277. doi:10.1016/j.omtn.2019.02.027.
44. ↑  Komiyama M. Chemical modifications of artificial restriction DNA cutter (ARCUT) to promote its in vivo and in vitro applications. Artificial DNA PNA XNA. 15 de decembro de 2014; 5(3):e1112457. doi: 10.1080/1949095X.2015.1112457. PMID: 26744220; PMCID: PMC5329899.
45. 1 2 3 4  Barrangou R, Doudna JA (setembro de 2016). "Applications of CRISPR technologies in research and beyond". *Nature Biotechnology* **34** (9): 933–941. PMID 27606440. doi:10.1038/nbt.3659.
46. ↑  Kim H, Kim JS (maio de 2014). "A guide to genome engineering with programmable nucleases". *Nature Reviews. Genetics* **15** (5): 321–34. PMID 24690881. doi:10.1038/nrg3686.
47. 1 2 3 4  Gallagher RR, Li Z, Lewis AO, Isaacs FJ (outubro de 2014). "Rapid editing and evolution of bacterial genomes using libraries of synthetic DNA". *Nature Protocols* **9** (10): 2301–16. PMID 25188632. doi:10.1038/nprot.2014.082.
48. 1 2  McMahon MA, Rahdar M, Porteus M (decembro de 2011). "Gene editing: not just for translation anymore". *Nature Methods* **9** (1): 28–31. PMID 22205513. doi:10.1038/nmeth.1811.
49. ↑  Daigneault BW, Rajput S, Smith GW, Ross PJ (maio de 2018). "Embryonic POU5F1 is Required for Expanded Bovine Blastocyst Formation". *Scientific Reports* **8** (1): 7753. Bibcode:2018NatSR...8.7753D. PMC 5958112. PMID 29773834. doi:10.1038/s41598-018-25964-x.
50. ↑  Wargelius, Anna (2019). "Application of genome editing in aquatic farm animals". *Transgenic Research* **28** (Suppl 2): 101–105. PMID 31321691. doi:10.1007/s11248-019-00163-0. Consultado o 29 de abril de 2021.
51. ↑  Yaskowiak, Edward S.; Shears, Margaret A.; Agarwal-Mawal, Alka; Fletcher, Garth L. (2006). "Characterization and multi-generational stability of the growth hormone transgene (EO-1α) responsible for enhanced growth rates in Atlantic Salmon". *Transgenic Research* **15** (4): 465–480. PMID 16906447. doi:10.1007/s11248-006-0020-5.
52. ↑  Ortega NM, Winblad N, Plaza Reyes A, Lanner F (outubro de 2018). "Functional genetics of early human development". *Current Opinion in Genetics & Development* **52**: 1–6. PMID 29729430. doi:10.1016/j.gde.2018.04.005.
53. ↑  Arnould S, Delenda C, Grizot S, Desseaux C, Pâques F, Silva GH, Smith J (xaneiro de 2011). "The I-CreI meganuclease and its engineered derivatives: applications from cell modification to gene therapy". *Protein Engineering, Design & Selection* **24** (1–2): 27–31. PMID 21047873. doi:10.1093/protein/gzq083.
54. 1 2 3  Townsend JA, Wright DA, Winfrey RJ, Fu F, Maeder ML, Joung JK, Voytas DF (maio de 2009). "High-frequency modification of plant genes using engineered zinc-finger nucleases". *Nature* **459** (7245): 442–5. Bibcode:2009Natur.459..442T. PMC 2743854. PMID 19404258. doi:10.1038/nature07845.
55. ↑  Zhang F, Maeder ML, Unger-Wallace E, Hoshaw JP, Reyon D, Christian M, et al. (xuño de 2010). "High frequency targeted mutagenesis in Arabidopsis thaliana using zinc finger nucleases". *Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America* **107** (26): 12028–33. Bibcode:2010PNAS..10712028Z. PMC 2900673. PMID 20508152. doi:10.1073/pnas.0914991107.
56. ↑  Osakabe K, Osakabe Y, Toki S (xuño de 2010). "Site-directed mutagenesis in Arabidopsis using custom-designed zinc finger nucleases". *Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America* **107** (26): 12034–9. Bibcode:2010PNAS..10712034O. PMC 2900650. PMID 20508151. doi:10.1073/pnas.1000234107.
57. 1 2  Shukla VK, Doyon Y, Miller JC, DeKelver RC, Moehle EA, Worden SE, et al. (maio de 2009). "Precise genome modification in the crop species Zea mays using zinc-finger nucleases". *Nature* **459** (7245): 437–41. Bibcode:2009Natur.459..437S. PMID 19404259. doi:10.1038/nature07992.
58. ↑  Tripathi JN, Ntui VO, Ron M, Muiruri SK, Britt A, Tripathi L (2019-01-31). "CRISPR/Cas9 editing of endogenous *banana streak virus* in the B genome of *Musa* spp. overcomes a major challenge in banana breeding". *Communications Biology* **2** (1): 46. PMC 6355771. PMID 30729184. doi:10.1038/s42003-019-0288-7.
59. ↑  Townson J (2017-01-01). "Recent developments in genome editing for potential use in plants". *Bioscience Horizons* (en inglés) **10**. doi:10.1093/biohorizons/hzx016.
60. ↑  Regalado A (19 de decembro de 2017). "These Are Not Your Father's GMOs". MIT Technology Review. Consultado o 16 de abril de 2018.
61. ↑  Haun W, Coffman A, Clasen BM, Demorest ZL, Lowy A, Ray E, et al. (setembro de 2014). "Improved soybean oil quality by targeted mutagenesis of the fatty acid desaturase 2 gene family". *Plant Biotechnology Journal* **12** (7): 934–40. PMID 24851712. doi:10.1111/pbi.12201.
62. ↑  Clasen BM, Stoddard TJ, Luo S, Demorest ZL, Li J, Cedrone F, et al. (xaneiro de 2016). "Improving cold storage and processing traits in potato through targeted gene knockout". *Plant Biotechnology Journal* **14** (1): 169–76. PMID 25846201. doi:10.1111/pbi.12370.
63. 1 2  Puchta H, Hohn B (xuño de 2010). "Breaking news: plants mutate right on target". *Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America* **107** (26): 11657–8. Bibcode:2010PNAS..10711657P. PMC 2900667. PMID 20554917. doi:10.1073/pnas.1006364107.
64. 1 2 3  Paul JW, Qi Y (xullo de 2016). "CRISPR/Cas9 for plant genome editing: accomplishments, problems and prospects". *Plant Cell Reports* **35** (7): 1417–27. PMID 27114166. doi:10.1007/s00299-016-1985-z.
65. ↑  Monga, Isha; Qureshi, Abid; Thakur, Nishant; Gupta, Amit Kumar; Kumar, Manoj (setembro de 2017). "ASPsiRNA: A Resource of ASP-siRNAs Having Therapeutic Potential for Human Genetic Disorders and Algorithm for Prediction of Their Inhibitory Efficacy". *G3* **7** (9): 2931–2943. PMC 5592921. PMID 28696921. doi:10.1534/g3.117.044024.
66. 1 2 3  Carroll D (novembro de 2008). "Progress and prospects: zinc-finger nucleases as gene therapy agents". *Gene Therapy* **15** (22): 1463–8. PMC 2747807. PMID 18784746. doi:10.1038/gt.2008.145.
67. ↑  Pollack A (2015-11-05). "A Cell Therapy Untested in Humans Saves a Baby With Cancer". *The New York Times*. ISSN 0362-4331. Consultado o 2015-11-30.
68. ↑  Couzin-Frankel J (novembro de 2015). "CANCER IMMUNOTHERAPY. Baby's leukemia recedes after novel cell therapy". *Science* **350** (6262): 731. PMID 26564829. doi:10.1126/science.350.6262.731.
69. ↑  Mentis AF (decembro de 2016). "Epigenomic engineering for Down syndrome". *Neuroscience and Biobehavioral Reviews* **71**: 323–327. PMID 27646312. doi:10.1016/j.neubiorev.2016.09.012.
70. ↑  Marchione M (7 de febreiro de 2019). "Tests suggest scientists achieved 1st 'in body' gene editing". *AP News*. Consultado o 7 de febreiro de 2019.
71. ↑  Staff (2 de febreiro de 2019). "Ascending Dose Study of Genome Editing by the Zinc Finger Nuclease (ZFN) Therapeutic SB-913 in Subjects With MPS II". *ClinicalTrials.gov*. U.S. National Library of Medicine. Consultado o 7 de febreiro de 2019.
72. ↑  Hammond A, Galizi R, Kyrou K, Simoni A, Siniscalchi C, Katsanos D, et al. (xaneiro de 2016). "A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae". *Nature Biotechnology* **34** (1): 78–83. PMC 4913862. PMID 26641531. doi:10.1038/nbt.3439.
73. ↑  Fletcher M (2018-08-11). "Mutant mosquitoes: Can gene editing kill off malaria?". *The Telegraph* (en inglés). ISSN 0307-1235. Consultado o 2018-08-12.
74. ↑  Begley S (28 de novembro de 2018). "Amid uproar, Chinese scientist defends creating gene-edited babies - STAT". *STAT*.
75. ↑  Science China Press (23 de xaneiro de 2019). "Gene-edited disease monkeys cloned in China". *EurekAlert!*. Consultado o 24 de xaneiro de 2019.
76. ↑  Mandelbaum RF (23 de xaneiro de 2019). "China's Latest Cloned-Monkey Experiment Is an Ethical Mess". *Gizmodo*. Consultado o 24 de xaneiro de 2019.
77. ↑  Teboul L, Herault Y, Wells S, Qasim W, Pavlovic G (xuño de 2020). "Variability in Genome Editing Outcomes: Challenges for Research Reproducibility and Clinical Safety". *Molecular Therapy* (en English) **28** (6): 1422–1431. PMC 7264426. PMID 32243835. doi:10.1016/j.ymthe.2020.03.015.
78. ↑  Im W, Moon J, Kim M (setembro de 2016). "Applications of CRISPR/Cas9 for Gene Editing in Hereditary Movement Disorders". *Journal of Movement Disorders* **9** (3): 136–43. PMC 5035944. PMID 27667185. doi:10.14802/jmd.16029.
79. 1 2  Hsu PD, Lander ES, Zhang F (xuño de 2014). "Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering". *Cell* **157** (6): 1262–1278. PMC 4343198. PMID 24906146. doi:10.1016/j.cell.2014.05.010.
80. ↑  Johnson JA, Altwegg R, Evans DM, Ewen JG, Gordon IJ, Pettorelli N, Young JK (2016-04-01). "Is there a future for genome-editing technologies in conservation?". *Animal Conservation* (en inglés) **19** (2): 97–101. ISSN 1469-1795. doi:10.1111/acv.12273.
81. ↑  Pearlman A (2015-12-03). "Geneticists Are Concerned Transhumanists Will Use CRISPR on Themselves". Vice Motherboard. Consultado o 26 de decembro de 2016.
82. ↑  Jorgensen E. "How DIY bio-hackers are changing the conversation around genetic engineering". *The Washington Post*. Consultado o 26 de decembro de 2016.
83. ↑  "Human Enhancement". Pew Research Center. 2016-07-26. Consultado o 26 de decembro de 2016.
84. ↑  Regalado A. "Engineering the Perfect Baby". MIT Technology Review. Consultado o 26 de decembro de 2016.
85. 1 2  Sample I (30 de setembro de 2016). "Experts warn home 'gene editing' kits pose risk to society". *The Guardian*. Consultado o 26 de decembro de 2016.
86. 1 2 3 4  "Genome editing: an ethical review" (PDF). Nuffield Council on Bioethics. setembro de 2016. Consultado o 27 de decembro de 2016.
87. ↑  "George Church told us why he's listing "superhuman" gene hacks". *Futurism*. Consultado o 25 de xullo de 2021.
88. ↑  "Protective alleles". *arep.med.harvard.edu* (en inglés). Consultado o 25 de xullo de 2021.
89. ↑  Harmon A (2017-02-14). "Human Gene Editing Receives Science Panel's Support". *The New York Times*. ISSN 0362-4331. Consultado o 2017-02-17.
90. ↑  "Scientists OK genetically engineering babies". *New York Post*. Reuters. 2017-02-14. Consultado o 2017-02-17.
91. ↑  Worldwide Threat Assessment of the US Intelligence Community
92. ↑  Clapper JR (9 de febreiro de 2016). "Worldwide Threat Assessment of the US Intelligence Community" (PDF). Consultado o 26 de decembro de 2016.
93. ↑  Warmflash D (2016-09-06). "Genome editing: Is it a national security threat?". Consultado o 26 de decembro de 2016.
94. 1 2  Regalado A. "Top U.S. Intelligence Official Calls Gene Editing a WMD Threat". MIT Technology Review. Consultado o 26 de decembro de 2016.
95. ↑  Jackson R, Ramshaw I (xaneiro de 2010). "The mousepox experience. An interview with Ronald Jackson and Ian Ramshaw on dual-use research. Interview by Michael J. Selgelid and Lorna Weir". *EMBO Reports* **11** (1): 18–24. PMC 2816623. PMID 20010799. doi:10.1038/embor.2009.270.
96. ↑  Broad WJ (23 de aneiro de 2001). "Australians Create a Deadly Mouse Virus". *The New York Times*. Consultado o 27 de decembro de 2016.
97. ↑  Radford T (10 de xaneiro de 2001). "Lab creates killer virus by accident". *The Guardian*. Consultado o 27 de decembro de 2016.
98. ↑  "The Nobel Prize in Chemistry 2020". Nobel Foundation. Arquivado dende o orixinal o 7 de outubro de 2020. Consultado o 7 de outubro de 2020.

Véxase tamén
------------

### Outros artigos

* CRISPR/Cpf1
* Edición do ARN
* Edición do epixenoma
* Prime editing
* Os transposóns como ferramenta xenética
* Tecnoloxía de elección xerminal
* NgAgo, unha endonuclease Argonauta guiada por ADN bicatenario

### Bibliografía

* Saurabh S (marzo de 2021). "Genome Editing: Revolutionizing the Crop Improvement". *Plant Molecular Biology Reporte* **39** (4): 752–772. doi:10.1007/s11105-021-01286-7.
* "Special Issue on Human Germline Editing". *Bioethics* **34**. 2020.
* "Customized Human Genes: New Promises and Perils". *Scientific American* (en inglés). Consultado o 2019-02-21.
* Connor S (25 de abril de 2014). "Scientific split - the human genome breakthrough dividing former colleagues". *The Independent*. Consultado o 2016-02-11.
* "What is genome editing?". *yourgenome.org* (en inglés). Consultado o 2018-04-13.

|  |  |
| --- | --- |
| Control de autoridades | 
* Wd: Q5533489
* GND: 1116095971
* LCCN: sh2018000093
* MAG: 144501496
* SUDOC: 199619603

 |