Unión de extremos non homólogos (NHEJ) e recombinación homóloga (HR) en mamíferos durante unha rotura de dobre febra no ADN.
A **unión de extremos non homólogos** (abreviada xeralmente como **NHEJ**, do inglés *Non-homologous end joining*) é unha vía de reparación do ADN que arranxa as roturas de dobre febra que sofre o ADN. A NHEJ denomínase "non homóloga" porque as roturas dos extremos son ligadas directamente sen necesidade de que haxa un molde homólogo, en contraste coa reparación dirixida por homoloxía, que require unha secuencia homóloga que guíe a reparación. O termo "unión de extremos non homólogos" foi acuñado en 1996 por Moore e Haber.

A NHEJ utiliza tipicamente curtas secuencias de ADN homólogas chamadas microhomoloxías para que guíen a reparación. Estas microhomoloxías están xeralmente presentes nos tramos de febra simple que sobresaen nos extremos das roturas de dobre febra. Cando estes tramos que sobresaen son perfectamente compatibles, a NHEJ xeralmente repara a rotura de forma precisa. Tamén pode ocorrer unha reparación imprecisa que orixina a perda de nucleótidos, pero é moito máis común cando estes tramos que sobresaen non son compatibles. Unha NHEJ inapropiada pode orixinar translocacións e fusión de telómeros, que son marcas distintivas das células tumorais.

A NHEJ está conservada evolutivamente en todos os reinos da vida e é a vía de reparación de roturas de dobre febra predominante en células de mamíferos. Porén, no lévedo de xemación (*Saccharomyces cerevisiae*) a recombinación homóloga domina cando o organismo crece en condicións de laboratorio.

Cando se inactiva a vía NHEJ, poden repararse as roturas de dobre febra por unha vía máis tendente ao erro chamada unión de extremos mediada por microhomoloxía (MMEJ). Nesta vía, a resección dos extremos revela curtas microhomoloxías a cada lado da rotura, que son despois aliñadas para guiar a reparación. Isto contrasta coa NHEJ clásica, que usa as microhomoloxías que están xa expostas nos tramos que sobresaen de cadea simple nos extremos con roturas de dobre cadea. A reparación por MMEJ, por tanto, leva á deleción das secuencias de ADN entre as microhomoloxías.

En bacterias
------------

Moitas especies de bacterias, como *Escherichia coli*, carecen dunha vía de unión de extremos, polo que dependen totalmente da recombinación homóloga para reparar as roturas de dobre febra. Porén, identificáronse proteínas da NHEJ en diversas bacterias, incluíndo *Bacillus subtilis*, *Mycobacterium tuberculosis*, e *Mycobacterium smegmatis*. As bacterias utilizan unha versión moi compacta da NHEJ na cal todas as actividades necesarias están contidas en só dúas proteínas: o homodímero Ku e a ligase/polimerase/nuclease LigD multifuncional. En micobacterias, a NHEJ é moito máis tendente ao erro do que en lévedos, e a miúdo engádense bases ou son eliminadas nos extremos das roturas de dobre febra durante a reparación. Moitas das bacterias que posúen proteínas da NHEJ pasan unha porción significativa do seu ciclo de vida nunha fase haploide estacionaria, na cal non se dispón dun molde para a recombinación. A NHEJ puido ter evlucionado para axudar a estes organismos a sobrevivir ás roturas de dobre febra inducidas durante o desecamento. Os bacteriófagos relacionados Corndog e Omega de *Mycobacterium smegmatis*, tamén codifican os homólogos de Ku e aprovéitanse da vía NHEJ para recircularizar os seus xenomas durante a infección. A diferenza da recombinación homóloga, que foi estudada extensamente en bacterias, a NHEJ foi descuberta orixinalmente en eucariotas e só foi identificada en procariotas na pasada década.

En eucariotas
-------------

A diferenza das bacterias, a NHEJ en eucariotas utiliza varias proteínas, que participan nos seguintes pasos:

### Unión e fixación dos extremos

En lévedos, o complexo Mre11-Rad50-Xrs2 (MRX) é recrutado nas roturas de dobre febra moi cedo e pénsase que promociona unha ponte que une os dous extremos do ADN. O complexo correspondente en mamíferos Mre11-Rad50-Nbs1 (MRN) está tamén implicado na NHEJ, pero pode funcionar en moitos pasos da vía ademais de simplemente manter próximos os extremos. A DNA-PKcs tamén se pensa que participa na formación de pontes entre os extremos durante a NHEJ de mamíferos.

A proteína Ku eucariota é un heterodímero que consta de Ku70 e Ku80, e forma un complexo coa DNA-PKcs, que está presente en mamíferos pero ausente en lévedos. A Ku é unha molécula con forma de cesta que escorrega sobre o extremo do ADN e se move cara a adiante. A Ku pode funcionar como un sitio de atraque para outras proteínas da NHEJ, e interacciona co complexo da ADN ligase IV e a proteína XLF.

### Procesamento dos extremos

O procesamento dos extremos implica a eliminación dos nucleótidos danados ou con discordancias na complementariedade por nucleases e a resíntese por ADN polimerases. Este paso non é necesario se os extremos son xa compatibles e teñen os extremos 3' hidroxilo e 5' fosfato.

Sábese pouco sobre a función das nucleases na NHEJ. Unha é Artemis, que cómpre para a abertura das forquitas que se forman nos extremos do ADN durante a recombinación V(D)J, un tipo específico de NHEJ, e pode tamén participar no recortes dos extremos durante a NHEJ xeral. A Mre11 ten actividade de nuclease, pero parece estar implicada na recombinación homóloga, pero non na NHEJ.

As polimerases da familia X das ADN polimerases Pol λ e Pol μ (Pol4 en lévedos) enchen os ocos na febra do ADN durante a NHEJ. Os lévedos que carecen de Pol4 non poden unir os tramos 3' que sobresaen que se requiren para encher os ocos, pero seguen sendo eficientes para encher os ocos nos tramos 5' que sobresaen. Isto débese a que o cebador terminal usado para iniciar a síntese de ADN é menos estable nos tramos 3' que sobresaen, e necesita unha polimerase da NHEJ especializada.

### Ligazón

O clomplexo da ADN ligase IV, consta da subunidade catalítica ADN ligase IV e o seu cofactor XRCC4 (Dnl4 e Lif1 en lévedos), realiza o paso de ligazón da reparación. A proteína XLF, tamén coñecida como Cernunnos, é homóloga da Nej1 de lévedos e tamén é necesaria para a NHEJ. Aínda que se descoñece que o papel preciso da proteína XLF, sábese que interacciona co complexo XRCC4/ADN ligase IV e probablemente participa no paso de ligazón. Recentes evidencias suxiren que a XLF promociona a readenilación da ADN ligase IV despois da ligazón, recargando a ligase e permitíndolle que catalice unha segunda ligazón.

### Outros

En lévedos, a Sir2 foi identificada orixinalmente como unha proteína da NHEJ, pero agora sábese que é necesaria para a NHEJ só porque cómpre para a transcrición de Nej1.

Regulación
----------

A elección entre a NHEJ e a recombinación homóloga para a reparación de roturas de dobe febra está regulada no paso inicial de resección do extremo 5' na recombinación. Neste paso, a febra 5' da rotura é degradada polas nucleases para crear colas 3' de cadea simple longas. As roturas de dobre febra que non foron extirpadas poden volverse a unir por NHEJ, pero a eliminación de incluso só uns poucos nucleótidos inhibe fortemente a NHEJ e destina a rotura a unha reparación por recombinación. A NHEJ é activa durante todo o ciclo celular, pero é máis importante durante a fase G1 cando se dispón dun molde non homólogo para a recombinación. Esta regulación realízaa a quinase dependente de ciclina Cdk1 (Cdc28 en lévedos), que é "apagada" na fase G1 e expresada nas fases S e G2. A Cdk1 fosforila a nuclease Sae2, permitindo que se inicie a extirpación de nucleótidos.

Recombinación V(D)J
-------------------

A NHEJ desempeña un papel esencial na recombinación V(D)J, que é o proceso por medio do cal se xera a diversidade dos receptores da célula B e da T no sistema inmunitario dos vertebrados. Na recombinación V(D)J, créanse roturas de dobre febra que rematan en forquita pola nuclease RAG1/RAG2, a cal cliva o ADN nos puntos onde hai secuencias sinal de recombinción. Estas forquitas son despois abertas pola nuclease Artemis e unidas por medio de NHEJ. Unha ADN polimerase especializada chamada desoxinucleotidil transferase terminal (TdT), que só se expresa no tecido linfático, engade nucleótidos sen usar molde aos extremos antes de unir a rotura. Este proceso acopla as rexións "variable" (V), "de diversidade" (D), e "de unión" (J), as cales ao ensamblárense orixinan a rexión variable dos xenes dos receptores BCR (de células B) e TCR (de células T). A diferenza da NHEJ celular típica, na cal unha reparación exacta é o resultado máis favorable, a reparación tendente ao ero na recombinación V(D)J é beneficiosa porque maximiza a diversidade na secuencia codificante dos xenes. Os pacientes que preentan mutacións en xenes que interveñen na NHEJ non poden producir células B e T funcionais e sofren unha inmunodeficiencia combinada grave.

Nos telómeros
-------------

Os telómeros están normalmente protexidos por unha "caparuza" que lles impide ser recoñecidos como roturas de dobre febra. A perda das proteínas desta caparuza causa o acurtamento dos telómeros e unha unión incorrecta durante a NHEJ, producindo cromosomas dicéntricos (con dous centrómeros), que son separados durante a mitose. Paradoxalmente, algunhas proteínas da NHEJ están implicadas na formación das caparuzas dos telómeros. Por exemplo, a Ku localiza os telómeros e a súa deleción orixina un acurtamento dos telómeros. A Ku tamén é necesaria para o silenciamento subtelomérico, o proceso polo cal os son "apagados" os xenes localizados preto dos telómeros.

Consecuencias da disfunción
---------------------------

Varias síndromes humanas están asociadas cunha NEHJ disfuncional. As mutacións hipomórficas en LIG4 e XLF causan as síndromes LIG4 e XLF-SCID, respectivamente. Estas síndromes teñen moitas características comúns, como a radiosensibilidade celular, microcefalia e inmunodeficiencia combinada grave (SCID, *severe combined immunodeficiency*) debido a unha recombinación V(D)J defectuosa. As mutacións de perda de función en Artemis causan tamén SCID, pero estes pacientes non mostran os defectos neurolóxicos asociados coas mutacións de LIG4 ou XLF. A diferenza na gravidade pode explicarse polo papel exercido polas proteínas mutadas. Artemis é unha nuclease e crese que só é necesaria para reparar roturas de dobre cadea con extremos danados, mentres que a ADN ligase IV e XLF cómpren para todos os eventos da NHEJ.

Moitos xenes da NHEJ foron sometidos a knockout en ratos. A deleción de XRCC4 ou LIG4 causa letalidade embrionaria en ratos, o que indica que a NHEJ é esencial para a viabilidade dos mamíferos. A diferenza disto, os ratos que carecen de Ku ou de DNA-PKcs son viables, probablemente porque pode haber un baixo nivel de unión de extremos aínda en ausencia destes compoñentes. Todos os ratos mutantes para a NHEJ mostran o fenotipo SCID, sensibilidade á radiación inonizante e apoptose neuronal.

Envellecemento
--------------

Desenvolveuse un sistema para medir a eficiencia da NHEJ en ratos. A eficiencia da NHEJ pode compararse entre tecidos dun mesmo rato e entre ratos de distintas idades. A eficiencia é maior en fibroblastos de riles, pulmón e pel, e menor nos fibroblastos do corazón e astrocitos do cerebro. Ademais, a eficiencia da NHEJ diminúe coa idade. Esta diminución é de 1,8 veces a 3,8 veces, dependendo do tecido, no rato de 5 meses de idade comparado co de 24 meses. Unha capacidade reducida da NHEJ pode causar un incremento no número de roturas de dobre febra non reparadas ou defectuosamente reparadas, que poden despois contribuír ao envellecemento (teoría do envellecemento por danos no ADN). Unha análise do nivel da proteína Ku80 do NEHJ en humanos, vacas e ratos indicou que os niveis de Ku80 varían drasticamente entre especies, e que estes niveis están fortemente correlacionados coa lonxevidade das especies.

Lista de proteínas implicadas na NHEJ en células humanas
--------------------------------------------------------

* Ku70/80
* DNA-PKcs
* ADN ligase IV
* XRCC4
* XLF
* Artemis
* ADN polimerase mu
* ADN polimerase lambda
* PNKP
* Aprataxina
* APLF
* BRCA1
* BRCA2

Notas
-----

1. 1 2  Moore JK, Haber JE (May 1996). "Cell cycle and genetic requirements of two pathways of nonhomologous end-joining repair of double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae" **16** (5): 2164–73. PMC 231204. PMID 8628283.
2. ↑  Boulton SJ, Jackson SP (September 1996). "Saccharomyces cerevisiae Ku70 potentiates illegitimate DNA double-strand break repair and serves as a barrier to error-prone DNA repair pathways" **15** (18): 5093–103. PMC 452249. PMID 8890183.
3. 1 2  Wilson, T. E. and Lieber, M. R. Efficient processing of DNA ends during yeast nonhomologous end joining. Evidence for a DNA polymerase beta (Pol4)-dependent pathway. (1999) J" *Biol. Chem* 274, 23599–23609. doi 10.1074/jbc.274.33.23599 PMID 10438542
4. ↑  Budman J, Chu G. Processing of DNA for nonhomologous end-joining by cell-free extract. EMBO J. 2005 Feb 23;24(4) 849-60. doi 10.1038/sj.emboj.7600563 PMID 15692565
5. ↑  Espejel S, Franco S, Rodríguez-Perales S, Bouffler SD, Cigudosa JC, Blasco MA (May 2002). "Mammalian Ku86 mediates chromosomal fusions and apoptosis caused by critically short telomeres" **21** (9): 2207–19. PMC 125978. PMID 11980718. doi:10.1093/emboj/21.9.2207.
6. ↑  Guirouilh-Barbat J, Huck S, Bertrand P, et al. (June 2004). "Impact of the KU80 pathway on NHEJ-induced genome rearrangements in mammalian cells". *Mol. Cell* **14** (5): 611–23. PMID 15175156. doi:10.1016/j.molcel.2004.05.008.
7. ↑  McVey M, Lee SE (November 2008). "MMEJ repair of double-strand breaks (director's cut): deleted sequences and alternative endings". *Trends Genet.* **24** (11): 529–38. PMID 18809224. doi:10.1016/j.tig.2008.08.007.
8. 1 2  Weller GR, Kysela B, Roy R, et al. (September 2002). "Identification of a DNA nonhomologous end-joining complex in bacteria". *Science* **297** (5587): 1686–9. PMID 12215643. doi:10.1126/science.1074584.
9. 1 2  Gong C, Bongiorno P, Martins A, et al. (April 2005). "Mechanism of nonhomologous end-joining in mycobacteria: a low-fidelity repair system driven by Ku, ligase D and ligase C". *Nat. Struct. Mol. Biol.* **12** (4): 304–12. PMID 15778718. doi:10.1038/nsmb915.
10. ↑  Della M, Palmbos PL, Tseng HM, et al. (October 2004). "Mycobacterial Ku and ligase proteins constitute a two-component NHEJ repair machine". *Science* **306** (5696): 683–5. PMID 15499016. doi:10.1126/science.1099824.
11. ↑  Pitcher RS, Green AJ, Brzostek A, Korycka-Machala M, Dziadek J, Doherty AJ (September 2007). "NHEJ protects mycobacteria in stationary phase against the harmful effects of desiccation". *DNA Repair (Amst.)* **6** (9): 1271–6. PMID 17360246. doi:10.1016/j.dnarep.2007.02.009.
12. ↑  Pitcher RS, Tonkin LM, Daley JM, et al. (September 2006). "Mycobacteriophage exploit NHEJ to facilitate genome circularization". *Mol. Cell* **23** (5): 743–8. PMID 16949369. doi:10.1016/j.molcel.2006.07.009.
13. ↑  Chen, L. Trujillo, K. Ramos, W. Sung, P. and Tomkinson, A. E. Promotion of Dnl4-catalyzed DNA end-joining by the Rad50/Mre11/Xrs2 and Hdf1/Hdf2 complexes. (2001) Mol" *Cell* 8, 1105–1115. PMID 11741545
14. ↑  Zha S, Boboila C, Alt FW (August 2009). "Mre11: roles in DNA repair beyond homologous recombination". *Nat. Struct. Mol. Biol.* **16** (8): 798–800. PMID 19654615. doi:10.1038/nsmb0809-798.
15. ↑  DeFazio LG, Stansel RM, Griffith JD, Chu G (June 2002). "Synapsis of DNA ends by DNA-dependent protein kinase" **21** (12): 3192–200. PMC 126055. PMID 12065431. doi:10.1093/emboj/cdf299.
16. ↑  Palmbos PL, Wu D, Daley JM, Wilson TE (December 2008). "Recruitment of Saccharomyces cerevisiae Dnl4-Lif1 complex to a double-strand break requires interactions with Yku80 and the Xrs2 FHA domain". *Genetics* **180** (4): 1809–19. PMC 2600923. PMID 18832348. doi:10.1534/genetics.108.095539.
17. ↑  Yano K, Morotomi-Yano K, Wang SY, et al. (January 2008). "Ku recruits XLF to DNA double-strand breaks". *EMBO Rep.* **9** (1): 91–6. PMC 2246615. PMID 18064046. doi:10.1038/sj.embor.7401137.
18. 1 2  Ma, Y. Pannicke, U. Schwarz, K. and Lieber, M. R. Hairpin opening and overhang processing by an Artemis/DNA-dependent protein kinase complex in nonhomologous end joining and V(D)J recombination. (2002) Cell 108, 781–794. PMID 11955432
19. ↑  Nick McElhinny SA, Ramsden DA (August 2004). "Sibling rivalry: competition between Pol X family members in V(D)J recombination and general double strand break repair" **200**: 156–64. PMID 15242403. doi:10.1111/j.0105-2896.2004.00160.x.
20. 1 2  Daley JM, Laan RL, Suresh A, Wilson TE (August 2005). "DNA joint dependence of pol X family polymerase action in nonhomologous end joining" **280** (32): 29030–7. PMID 15964833. doi:10.1074/jbc.M505277200.
21. ↑  Daley JM, Laan RL, Suresh A, Wilson TE (August 2005). "DNA joint dependence of pol X family polymerase action in nonhomologous end joining". *J. Biol. Chem.* **280** (32): 29030–7. PMID 15964833. doi:10.1074/jbc.M505277200.
22. ↑  Wilson T. E.; Grawunder U.; Lieber M. R. (1997). "Yeast DNA ligase IV mediates non-homologous DNA end joining". *Nature* **388**: 495–498. PMID 9242411. doi:10.1038/41365.
23. ↑  Ahnesorg P, Smith P, Jackson SP (Jan 2006). "XLF interacts with the XRCC4-DNA ligase IV complex to promote DNA nonhomologous end-joining". *Cell* **124** (2): 301–13. PMID 16439205. doi:10.1016/j.cell.2005.12.031.
24. ↑  Buck D, Malivert L, de Chasseval R, Barraud A, Fondaneche MC, Sanal O, Plebani A, Stephan JL, Hufnagel M, et al. (Jan 2006). "Cernunnos, a novel nonhomologous end-joining factor, is mutated in human immunodeficiency with microcephaly". *Cell* **124** (2): 287–99. PMID 16439204. doi:10.1016/j.cell.2005.12.030.
25. ↑  Callebaut I, Malivert L, Fischer A, Mornon JP, Revy P, de Villartay JP. "Cernunnos Interacts with the XRCC4{middle dot}DNA-ligase IV Complex and Is Homologous to the Yeast Nonhomologous End-joining Factor Nej1. *J Biol Chem.* 2006 May 19;281(20) 13857-60. doi 10.1074/jbc.C500473200 PMID 16571728
26. ↑  Riballo E, Woodbine L, Stiff T, Walker SA, Goodarzi AA, Jeggo PA (February 2009). "XLF-Cernunnos promotes DNA ligase IV-XRCC4 re-adenylation following ligation". *Nucleic Acids Res.* **37** (2): 482–92. PMC 2632933. PMID 19056826. doi:10.1093/nar/gkn957.
27. ↑  Lee SE, Pâques F, Sylvan J, Haber JE (July 1999). "Role of yeast SIR genes and mating type in directing DNA double-strand breaks to homologous and non-homologous repair paths" **9** (14): 767–70. PMID 10421582.
28. ↑  Mimitou EP, Symington LS (September 2009). "DNA end resection: Many nucleases make light work". *DNA Repair (Amst.)* **8** (9): 983–95. PMC 2760233. PMID 19473888. doi:10.1016/j.dnarep.2009.04.017.
29. ↑  Jung D, Alt FW. Unraveling V(D)J recombination; insights into gene regulation. Cell. 2004 Jan 23;116(2) 299-311. Review. doi 10.1016/S0092-8674(04)00039-X PMID 14744439
30. ↑  Schatz DG, Baltimore D (April 1988). "Stable expression of immunoglobulin gene V(D)J recombinase activity by gene transfer into 3T3 fibroblasts" **53** (1): 107–15. PMID 3349523.
31. ↑  Gilfillan S, Dierich A, Lemeur M, Benoist C, Mathis D (August 1993). "Mice lacking TdT: mature animals with an immature lymphocyte repertoire" **261** (5125): 1175–8. PMID 8356452.
32. ↑  Komori T, Okada A, Stewart V, Alt FW (August 1993). "Lack of N regions in antigen receptor variable region genes of TdT-deficient lymphocytes" **261** (5125): 1171–5. PMID 8356451.
33. ↑  Boulton SJ, Jackson SP (1998). "Components of the Ku-dependent non-homologous endjoining pathway are involved in telomeric length maintenance and telomeric silencing". *EMBO J* **17**: 1819–28. PMC 1170529. PMID 9501103. doi:10.1093/emboj/17.6.1819.
34. ↑  Kerzendorfer C, O'Driscoll M (September 2009). "Human DNA damage response and repair deficiency syndromes: Linking genomic instability and cell cycle checkpoint proficiency". *DNA Repair (Amst.)* **8** (9): 1139–52. PMID 19473885. doi:10.1016/j.dnarep.2009.04.018.
35. ↑  Li H, Vogel H, Holcomb VB, Gu Y, Hasty P (December 2007). "Deletion of Ku70, Ku80, or both causes early aging without substantially increased cancer". *Mol. Cell. Biol.* **27** (23): 8205–14. PMC 2169178. PMID 17875923. doi:10.1128/MCB.00785-07.
36. ↑  Vaidya A, Mao Z, Tian X, Spencer B, Seluanov A, Gorbunova V (2014). "Knock-in reporter mice demonstrate that DNA repair by non-homologous end joining declines with age". *PLoS Genet.* **10** (7): e1004511. PMC 4102425. PMID 25033455. doi:10.1371/journal.pgen.1004511.
37. ↑  Bernstein H, Payne CM, Bernstein C, Garewal H, Dvorak K (2008). Cancer and aging as consequences of un-repaired DNA damage. In: New Research on DNA Damages (Editors: Honoka Kimura and Aoi Suzuki) Nova Science Publishers, Inc. New York, Chapter 1, pp. 1-47. open access, but read only  Arquivado 25 de outubro de 2014 en Wayback Machine. ISBN 978-1604565812
38. ↑  Lorenzini A, Johnson FB, Oliver A, Tresini M, Smith JS, Hdeib M, Sell C, Cristofalo VJ, Stamato TD (2009). "Significant correlation of species longevity with DNA double strand break recognition but not with telomere length". *Mech. Ageing Dev.* **130** (11-12): 784–92. PMC 2799038. PMID 19896964. doi:10.1016/j.mad.2009.10.004.

|  |  |
| --- | --- |
| Control de autoridades | 
* Wd: Q2065945
* MAG: 122917832

 |