Mutaxénese de saturación dunha soa posición nunha proteína teórica de 10 residuos. A versión de tipo salvaxe da proteína móstrase arriba, onde M representa o primeiro aminoácido, metionina, e \* representa a terminación da tradución. Debaixo móstranse todos os 19 mutantes na posición 5.
A **mutaxénese de saturación** ou **mutaxénese de saturación de sitios (SSM)** ou, simplemente, **sturación de sitios**, é unha técnica de mutaxénese aleatoria usada na enxeñaría de proteínas, na cal un só codón ou conxunto de codóns é substituído por todos os posibles aminoácidos nesa posición. Hai moitas variantes da técnica de saturación de sitio, desde a **saturación de sitios emparellados** (saturando dúas posicións en cada mutante da biblioteca) ata a **saturación de sitios escaneados** (realizando unha saturación de sitios en cada sitio da proteína, o que ten como resultado unha biblioteca de tamaño [20 x (número de residuos da proteína)] que contén cada posible mutante puntual da proteína).

Método
------

Representación dun modo común de clonar unha biblioteca de mutaxénese dirixida a sitio (é dicir, usando oligos dexenerados). O xene de interese é sometido a PCR con oligos que conteñen unha rexión que é perfectamente complementaria ao molde (en azul), e unha que difire do molde nun ou máis nucleótidos (en vermello). Moitos deses cebadores que conteñen dexeneracións na rexión non complementaria son xuntados na mesma PCR, o que ten como resultado moitos produtos de PCR distintos con diferentes mutacións nesa rexión (os mutantes individuais móstranse con diferentes cores debaixo).
A mutaxénese de saturación conséguese normalmente por PCR de mutaxénese dirixida a sitio cun codón aleatoriado nos cebadores (por exemplo na mutaxénese de saturación de secuencias ou SeSaM) ou por síntese de xenes artificiais, cunha mestura de nucleótidos de síntese usada nos codóns que van ser aleatorizados.

Poden utilizarse diferentes codóns dexenerados para codificar conxuntos de aminoácidos. Como algúns aminoácidos están codificados por máis codóns que outros, a proporción exacta de aminoácidos non pode ser igual. Ademais, é habitual usar codóns dexenerados que minimizan os codóns de stop (que xeralmente non se desexan). En consecuencia, o 'NNN' (ver abreviaturas na táboa) non completamente aleatorizado non é ideal, e como alternativa utilízanse codóns dexenerados máis restrinxidos. Os 'NNK' e 'NNS' teñen a vantaxe de codificar todos os 20 aminoácidos proteinoxénicos, pero seguen codificando codóns de stop nun 3% das veces. Codóns alternativos como 'NDT', 'DBK' evitan completamente os codóns de stop e codifican un mínimo conxunto de aminoácidos que comprenden todos os principais tipos biofísicos (aniónicos, catiónicos, alifáticos, hidrófobos, aromáticos hidrófobos, hidrófilos, pequenos). No caso de que non haxa restricións para usar soamente un codón dexenerado, é posible reducir o nesgo considerablemente. Desenvolvéronse varias ferramentas computacionais para permitir un alto nivel de control sobre os codóns dexenerados e os seus correspondentes aminoácidos.

| Codón dexenerado | Número de codóns | Número de aminoácidos | Número de stops | Aminoácidos codificados |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| NNN | 64 | 20 | 3 | Todos os 20 |
| NNK / NNS | 32 | 20 | 1 | Todos os 20 |
| NDT | 12 | 12 | 0 | RNDCGHILFSYV |
| DBK | 18 | 12 | 0 | ARCGILMFSTWV |
| NRT | 8 | 8 | 0 | RNDCGHSY |

(Significado dos símbolos de bases nos codóns dexenerados: N = calquera base ; K = cetona ; S = forte ; D = non citosina ; T = timina ; B = non adenina ; R = purina. Os símbolos dos aminoácidos da última columna son os símbolos dunha letra dos aminoácidos proteinoxénicos).

Aplicacións
-----------

A mutaxénese de saturación é utilizada xeralmente para xerar variantes para a evolución dirixida.

Notas
-----

1. 1 2 3  Reetz, M. T.; Carballeira J. D. (2007). "Iterative saturation mutagenesis (ISM) for rapid directed evolution of functional enzymes". *Nature Protocols* **2** (4): 891–903. PMID 17446890. doi:10.1038/nprot.2007.72.
2. ↑  Zheng, Lei; Baumann, Ulrich; Reymond, Jean-Louis (2004-07-15). "An efficient one-step site-directed and site-saturation mutagenesis protocol". *Nucleic Acids Research* (en inglés) **32** (14): e115. ISSN 0305-1048. PMC 514394. PMID 15304544. doi:10.1093/nar/gnh110.
3. ↑  Reetz, Manfred T.; Prasad, Shreenath; Carballeira, José D.; Gumulya, Yosephine; Bocola, Marco (2010-07-07). "Iterative Saturation Mutagenesis Accelerates Laboratory Evolution of Enzyme Stereoselectivity: Rigorous Comparison with Traditional Methods". *Journal of the American Chemical Society* **132** (26): 9144–9152. ISSN 0002-7863. PMID 20536132. doi:10.1021/ja1030479.
4. ↑  Kille, Sabrina; Acevedo-Rocha, Carlos G.; Parra, Loreto P.; Zhang, Zhi-Gang; Opperman, Diederik J.; Reetz, Manfred T.; Acevedo, Juan Pablo (2013-02-15). "Reducing Codon Redundancy and Screening Effort of Combinatorial Protein Libraries Created by Saturation Mutagenesis". *ACS Synthetic Biology* **2** (2): 83–92. PMID 23656371. doi:10.1021/sb300037w.
5. ↑  Tang, Lixia; Wang, Xiong; Ru, Beibei; Sun, Hengfei; Huang, Jian; Gao, Hui (xuño de 2014). "MDC-Analyzer: a novel degenerate primer design tool for the construction of intelligent mutagenesis libraries with contiguous sites". *BioTechniques* **56** (6): 301–302, 304, 306–308, passim. ISSN 1940-9818. PMID 24924390. doi:10.2144/000114177.
6. ↑  Halweg-Edwards, Andrea L.; Pines, Gur; Winkler, James D.; Pines, Assaf; Gill, Ryan T. (16 de setembro de 2016). "A Web Interface for Codon Compression". *ACS Synthetic Biology* **5** (9): 1021–1023. ISSN 2161-5063. PMID 27169595. doi:10.1021/acssynbio.6b00026.
7. ↑  Engqvist, Martin K. M.; Nielsen, Jens (2015-04-30). "ANT: Software for Generating and Evaluating Degenerate Codons for Natural and Expanded Genetic Codes". *ACS Synthetic Biology* **4** (8): 935–938. PMID 25901796. doi:10.1021/acssynbio.5b00018.
8. ↑  Kell, Douglas B.; Day, Philip J.; Breitling, Rainer; Green, Lucy; Currin, Andrew; Swainston, Neil (2017-07-10). "CodonGenie: optimised ambiguous codon design tools". *PeerJ Computer Science* **3**: e120. ISSN 2376-5992. doi:10.7717/peerj-cs.120.
9. ↑  Chica, Robert A.; et al. (2005). "Semi-rational approaches to engineering enzyme activity: combining the benefits of directed evolution and rational design". *Current Opinion in Biotechnology* **16** (4): 378–384. PMID 15994074. doi:10.1016/j.copbio.2005.06.004.
10. ↑  Shivange, Amol V; Marienhagen, Jan; Mundhada, Hemanshu; Schenk, Alexander; Schwaneberg, Ulrich (2009-02-01). "Advances in generating functional diversity for directed protein evolution". *Current Opinion in Chemical Biology*. Biocatalysis and Biotransformation/Bioinorganic Chemistry **13** (1): 19–25. PMID 19261539. doi:10.1016/j.cbpa.2009.01.019.

Véxase tamén
------------

### Outros artigos

* Mutaxénese de saturación de secuencias

|  |  |
| --- | --- |
| Control de autoridades | 
* Wd: Q7426583
* MAG: 109129352

 |