A **mutaxénese de saturación de secuencias** (**SeSaM**) é un método de mutaxénese aleatoria quimio-encimática aplicado á optimización de proteínas e encimas. É unha das técnicas máis comúns da mutaxénese de saturación. En catro pasos de reacción baseados en PCR, insírense nucleótidos fosforotioato na secuencia do xene, son cortados e os fragmentos resultantes alongados por nucleótidos universais ou dexenerados. Estes nucleótidos son despois substituídos por nucleótidos estándar, o que permite unha ampla distribución de mutacións no ácido nucleico espalladas pola secuencia do xene con preferencia de transversións e enfocadas a mutacións puntuais consecutivas, ambas as cales son difíciles de xerar por outras técnicas mutaxénicas. A técnica desenvolveuna o profesor Ulrich Schwaneberg na Universidade Jacobs de Bremen e na Universidade RWTH de Aachen.

Tecnoloxía, desenvolvemento e vantaxes
--------------------------------------

A SeSaM foi desenvolvida para superar varias das principais limitacións que se encontran cando se traballa con métodos de mutaxénese estándar baseados en simples técnicas de PCR proclive ao erro (epPCR). Estas técnicas de epPCR baséanse no uso de polimerases e así teñen limitacións que se orixinan principalmente polo feito de que só se realizan substitucións de nucleótidos únicos, pero raramente consecutivas, e que estas substitucións adoitan ocorrer soamente en posicións específicas favorecidas. Ademais, as transversións de nucleótidos son moito menos probables que as transicións e requiren o uso de polimerases deseñadas especificamente cun nesgo alterado. Estas características dos intercambios de nucleótidos catalizados por epPCR xunto co feito de que o código xenético é dexenerado diminúen a diversidade resultante a nivel de aminoácidos. As substitucións sinónimas orixinan que sexan moito máis frecuentes a conservación do aminoácido ou as mutacións conservadoras entre aminoácidos con propiedades físico-químicas similares como o seu tamaño e hidrofobicidade. Pola introdución non específica de bases universais en cada posición na secuencia do xene, a SeSaM supera o nesgo introducido pola polimerase favorecendo as substitucións por transición en posicións específicas, pero abre a secuencia xénica completa a toda unha diversidade de cambios de aminoácidos.

Comparación do padrón de substitucións de aminoácidos que se obtén usando métodos de epPCR estándar (substitucións dun só nucleótido con nesgo a favor das transicións) e o método da mutaxénese de saturación de secuencias (que introduce substitucións de nucleótidos consecutivas cun aumento da proporción de transversións).
Durante o desenvolvemento do método SeSaM, introducíronse varias modificacións que permitiron a introdución de varias mutacións simultaneamente. Outro avance do método conseguiuse coa introdución de bases dexeneradas no canto de inosina universal e o uso de ADN polimerases optimizadas, incrementando máis a proporción de transversións introducidas. Este método modificado da chamada SeSaM-TV+ ademais permite e favorece a introdución de dous cambios de nucleótidos consecutivos, ampliando moitísimo o espectro de aminoácidos que poden ser substituídos.

Por medio de varias optimizacións, incluíndo a aplicación dunha polimerase quimera mellorada no Paso 3 do método SeSaM-TV-II  e a adición dun nucleótido dexenerado alternativo para a substitución eficiente das bases timina e citosina e o incremento da frecuencia de mutación na SeSaM-P/R, as bibliotcas xeradas foron melloradas aínda máis con respecto ao número de transversións e o número de mutacións consecutivas elevouse a de 2 a 4 mutacións consecutivas cunha taxa de mutacións consecutivas de ata o 30%.

Procedemento
------------

O método SeSaM consta de catro pasos baseados na PCR que poden executarse en dous ou tres días. As partes principais son a incorporación de nucleótidos fosforotioato, a fragmentación química nesas posicións, a introdución de bases universais ou dexeneradas e a súa substitución por nucleótidos naturais inserindo mutacións puntuais.

Pasos experimentais para a xeración dunha biblioteca de mutaxénese aleatoria non nesgada usando o método de mutaxénese de saturación de secuencias.
Inicialmente, insírense as secuencias SeSaM universais por PCR con cebadores específicos de xene diante e detrás do xene de interese. O xene de interese coas súas rexións flanqueantes amplifícase para introducir estas secuencias SeSaM\_fwd (as dianteiras) ed SeSaM\_rev (as traseiras) e xerar molde para os seguintes pasos de PCR.

Estes así chamados moldes fwd e rev xerados son agora amplificados nunha reacción de PCR cunha mestura predefinida de fosforotioato e nucleótidos estándar para asegurar unha distribución uniforme de mutacións inseridas na totalidade da lonxitude do xene. Os produtos de PCR do Paso I son cortados especificacmente nos enlaces fosforotioato, xerando un conxunto de fragmentos monocaenarios de ADN de diferentes lonxitudes que comezan polo cebador universal.

No Paso 2 da SeSaM, as febras monocatenarias de ADN son alongadas por dunha a varias bases universais ou dexeneradas (dependendo da modificación de SeSaM aplicada) catalizadas pola desoxinucleotidil transferase terminal (TdT). Este paso é o paso clave para introducir as mutacións consecutivas características para mutar aleatoriamente codóns enteiros.

Seguidamente, no Paso 3 realízase unha PCR recombinando os fragmentos de ADN monocatenarios co correspondente molde reverso de lonxitude completa, xerando o xene bicatenario de lonxitude completa incluíndo na súa secuencia bases universais ou dexeneradas.

Substituíndo as bases universais/dexeneradas na secuencia do xene por nucleótidos estándar aleatorios no Paso 4 da SeSaM, xérase un diverso conxunto de secuencias xénicas de lonxitude completa con mutacións de substitución, incluíndo unha alta carga de transversións e mutacións de subtitución subsecuentes.

Aplicacións
-----------

A SeSaM utilizase para optimizar proteínas dirctamente a nivel de aminoácido, pero tamén para identificar preliminarmente posicións de aminoácidos para comprobar en mutaxénese de saturación o intercambio de aminoácido ideal. A SeSaM foi aplicada con éxito en numerosas campañas de evolución dirixida de diferentes clases de encimas para a súa mellora facendo que adquiran propiedades seleccionadas como a celulase con resistencia a líquidos iónicos, a protease cunha maior tolerancia a deterxentes, a glicosa oxidase para aplicacións analíticas, a fitase con maior termoestabilidade  e a monooxixenase cunha eficiencia catalítica aumentada usando doantes de electróns alternativos. A SeSaM está protexida por unha patente US770374 B2 nuns 13 países e é unha das plataformas tecnolóxicas de SeSaM-Biotech GmbH.

Notas
-----

1. ↑  Wong, T.S.; Zhurina, D.; Schwaneberg, U. (2006). "The diversity challenge in directed protein evolution". *Comb. Chem. High Throughput Screen.* **9** (4): 271–288. PMID 16724918. doi:10.2174/138620706776843192.
2. ↑  Füllen, G.; Youvan D.C. (1994). "Genetic algorithms and recursive ensemble mutagenesis in protein engineering". *Complex Int.* **1**.
3. ↑  Wong, T.S.; Roccatano, D.; Zacharias, M.; Schwaneberg, U. (2006). "A statistical analysis of random mutagenesis methods used for directed protein evolution". *J. Mol. Biol.* **355** (4): 858–871. PMID 16325201. doi:10.1016/j.jmb.2005.10.082.
4. ↑  Wong, T.S.; Tee, K.L.; Hauer, B.; Schwaneberg, U. (2004). "Sequence Saturation Mutagenesis (SeSaM): a novel method for directed protein evolution". *Nucleic Acids Res.* **32** (3): e26. PMC 373423. PMID 14872057. doi:10.1093/nar/gnh028.
5. ↑  Wong, T.S.; Tee, K.L.; Hauer, B.; Schwaneberg, U. (2005). "Sequence saturation mutagenesis with tunable mutation frequencies". *Anal. Biochem.* **341** (1): 187–189. PMID 15866543. doi:10.1016/j.ab.2005.03.023.
6. ↑  Wong, T.S.; Roccatano, D.; Loakes, D.; Tee, K.L.; Schenk, A.; Hauer, B.; Schwaneberg, U. (2008). "Transversion-enriched sequence saturation mutagenesis (SeSaM-Tv+): A random mutagenesis method with consecutive nucleotide exchanges that complements the bias of error-prone PCR". *Biotechnol. J.* **3** (1): 74–82. PMID 18022859. doi:10.1002/biot.200700193.
7. ↑  d'Abbadie, M.; Hofreiter, M.; Vaisman, A.; Loakes, D.; Gasparutto, D.; Cadet, J.; Woodgate, R.; Pääbo, S.; Holliger, P. (2007). "Molecular breeding of polymerases for amplification of ancient DNA". *Nat. Biotechnol.* **25** (8): 939–943. PMC 1978225. PMID 17632524. doi:10.1038/nbt1321.
8. ↑  Mundhada, H.; Marienhagen, J.; Scacioc, A.; Schenk, A.; Roccatano, D.; Schwaneberg, U. (2011). "SeSaM-Tv-II generates a protein sequence space that is unobtainable by epPCR". *ChemBioChem* **12** (10): 1595–1601. PMID 21671328. doi:10.1002/cbic.201100010.
9. ↑  Ruff, A.J.; Marienhagen, J.; Verma, R.; Roccatano, D.; Genieser, H.-G.; Niemann, R.; Shivange, A.V.; Schwaneberg, U. (2012). "dRTP and dPTP a complementary nucleotide couple for the Sequence Saturation Mutagenesis (SeSaM) method". *J Mol Catal B-Enzym.* **84**: 40–47. doi:10.1016/j.molcatb.2012.04.018.
10. ↑  Zhao, J.; Kardashliev, T.; Ruff, A.J.; Bocola, M.; Schwaneberg, M. (2014). "Lessons from diversity of directed evolution experiments by an analysis of 3000 mutations". *Biotechnol Bioeng* **111** (2): 2380–2389. PMID 24904008. doi:10.1002/bit.25302.
11. ↑  Pottkämper, J.; Barthen, P.; Ilmberger, N.; Schwaneberg, U.; Schenk, A.; Schulte, M.; Ignatiev, N.; Streit, W. (2009). "Applying metagenomics for the identification of bacterial cellulases that are stable in ionic liquids". *Green Chem.* **11** (7): 957–965. doi:10.1039/B820157A.
12. ↑  Li, Z.; Roccatano, D.; Lorenz, M.; Schwaneberg, U. (2012). "Directed evolution of subtilisin E into a highly active and guanidinium chloride- and sodium dodecylsulfate-tolerant protease". *ChemBioChem* **13** (5): 691–699. PMID 22408062. doi:10.1002/cbic.201100714.
13. ↑  Gutierrez, E.A.; Mundhada, H.; Meier, T.; Duefuel, H.; Bocola, M.; Schwaneberg, U. (2013). "Reengineered glucose oxidase for amperometric glucose determination in diabetes analytics". *Biosens. Bioelectron.* **50**: 84–90. PMID 23835222. doi:10.1016/j.bios.2013.06.029.
14. ↑  Shivange, A.V.; Roccatano, D.; Schwaneberg, U. (2016). "Iterative key-residues interrogation of a phytase with thermostability increasing substitutions identified in directed evolution". *Appl. Microbiol. Biot.* **100** (1): 227–242. PMID 26403922. doi:10.1007/s00253-015-6959-5.
15. ↑  Belsare, K.D.; Horn, T.; Ruff, A.J.; Martinez, R.; Magnusson, A.; Holtmann, D.; Schrader, J.; Schwaneberg, U. (2017). "Directed evolution of P450cin for mediated electron transfer". *Protein Engineering Design and Selection* **30** (2): 119–127. PMID 28007937. doi:10.1093/protein/gzw072.