No carreiro ou pista 1 do xel hai un control negativo, que contén só material xenético. O carreiro 2 contén proteína e tamén un fragmento de ADN que, baseándose na súa secuencia, non interacciona. O carreiro 3 contén a proteína e o fragmento de ADN que non reacciona; o complexo resultante é meirande, máis pesado, e móvese máis lentamente. O patrón mostrado no carreiro 3 é un dos que resultaría se todo o ADN estivese unido e non houbese disociación do complexo durante a electroforese. Cando non se dan estas condicións pode verse unha segunda banda no carreiro 3 que indica a presenza de ADN libre ou a disociación do complexo ADN-proteína.
Un **ensaio de retardo na mobilidade electroforética** ou **EMSA** (do inglés *electrophoretic mobility shift assay*), tamén chamado **electroforese de retardo de mobilidade**, **ensaio de retardo en xel**, **ensaio de retardo de mobilidade en xel**, **ensaio de retardo de banda**, ou **ensaio de retardo en xel**, é unha técnica común de electroforese de afinidade utilizada para estudar interaccións proteína-ADN e proteína-ARN. Este procedemento pode determinar se unha proteína ou mestura de proteínas pode unirse a unha secuencia dada de ADN ou ARN, e pode ás veces indicar se está implicada máis dunha molécula de proteína no complexo de unión. Os ensaios de retardo en xel realízanse a miúdo in vitro xunto cun perfil de DNase, unha extensión de cebador, e experimentos de promotor-sonda cando se estuda a iniciación da transcrición, replicación do ADN, reparación do ADN ou procesamento e maduración do ARN. Aínda que na literatura poden encontrarse métodos precursores desta técnica, a maioría dos ensaios actuais deste tipo están baseados nos métodos descritos por Garner e Revzin  e Fried e Crothers.

Principio
---------

Un ensaio de retardo de mobilidade é a separación electroforética dunha mestura de proteína–ADN ou proteína–ARN en xel de poliacrilamida ou agarosa durante un curto período (unhas 1,5-2 horas para un xel de 15 a 20 cm). A velocidade á cal diferentes moléculas (e combinacións delas) se moven a través do xel está determinada polo seu tamaño e carga, e en menor medida, pola súa forma (ver electroforese en xel). O carreiro de control (no que hai unha sonda de ADN sen proteína) contén unha soa banda correspondente ao fragmento de ADN ou ARN non unido. Porén, asumindo que a proteína pode unirse ao fragmento, o carreiro con proteína conterá outra banda que representa o complexo de maior tamaño e menor mobilidade da sonda de ácido nucleico unida á proteína, a cal queda retardada no xel (xa que se moveu máis lentamente).

Baixo as condicións experimentais correctas, a interacción entre o ADN (ou ARN) e a proteína é estabilizada e a proporción de ácido nucleico unido respecto ao non unido no xel reflicte a fracción de moléculas de sonda libres e unidas a medida que a reacción de unión entra no xel. Esta estabilidade é en parte debida a un "efecto gaiola", polo cal a proteína, rodeada pola matriz do xel, é incapaz de difundir lonxe da sonda antes de que se recombinen. Se se coñecen as concentracións iniciais de proteína e de sonda, e tamén a estequiometría do complexo, pode determinarse a afinidade aparente da proteína pola secuencia de ácido nucleico. A non ser que o complexo teña unha vida moi longa nas condicións do xel, ou sexa tomada en conta a disociación durante a electroforese, o número é unha Kd aparente. Se non se coñece a concentración de proteína pero si a estequiometría do complexo, pode determinarse a concentración da proteína ao incrementar a concentración da sonda de ADN ata que maiores incrementos non aumenten a fracción de proteína unida. Pode calcularse o número de moles de proteína facendo unha comparación cun conxunto de dilucións estándar de sonda libre *corrida* no mesmo xel.

Pode engadirse a esta mestura un anticorpo que recoñece a proteína para crear un complexo aínda maior cun maior retardo. Este método denomínase *ensaio de superretardo* (*supershift assay*), e utilízase para identificar sen ambigüidade unha proteína presente no complexo proteína–ácido nucleico.

A miúdo, *córrese* un carreiro extra cun oligonucleótido competidor para determinar a secuencia de unión máis favorable para a unión da proteína. O uso de diferentes oligonucleótidos de secuencias definidas permite a identificación do sitio de unión específico por competición (non mostrado na imaxe). Variantes do ensaio de competición son útiles para medir a especificidade de unión e para medir as cinéticas de asociación e disociación.

Unha vez que se determina a unión ADN-proteína *in vitro*, varios algoritmos *in silico* poden estreitar o campo de investigación para a identificación do factor de transcrición. Os oligonucleótidos da secuencia consenso para o factor de transcrición de interese poden competir pola unión, eliminando a banda retardada, e deben ser confirmados por superretardo (*supershift*). Se a secuencia consenso predita non pode competir pola unión, a identificación do factor de transcrición pode ser axudada polo *Competidor Multiplexado EMSA* (MC-EMSA), polo cal grandes conxuntos de secuencia consenso son multiplexados en cada reacción, e onde un conxunto compite por unirse, a secuencia consenso individual deste conxunto *córrese* noutra reacción.

Para propósitos de visualización, o fragmento de ácido nucleico márcase xeralmente cun isótopo radioactivo, un marcador fluorescente ou biotina. A tinguidura estándar con bromuro de etidio é menos sensible que estes métodos e pode carecer de sensiblidade para detectar o ácido nucleico se nestes experimentos se utilizan pequenas cantidades de ácidos nucleicos ou ácidos nucleicos monocatenarios. Cando se usa un etiquetado con biotina, utilízase para detectar o fragmento de ADN a estreptavidina conxugada a un encima como a peroxidase de ravo picante (*Armoracia rusticana*) (ver EMSA non radioactivo). Aínda que a etiquetaxe do ADN ten pouco ou ningún efecto sobre a afinidade de unión á proteína, o uso de etiquetas non isotópicas incluíndo os fluoróforos ou a biotina poden alterar a afinidade ou esteiquiometría da interacción coa proteína de interese. A competición entre a sonda unida a fluoróforo ou biotina e o ADN non etiquetado da mesma secuencia pode usarse para determinar se a etiqueta altera a afinidade de unión ou a estequiometría.

Notas
-----

1. ↑  Garner MM, Revzin A (July 1981). "A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system". *Nucleic Acids Res.* **9** (13): 3047–60. PMC 327330. PMID 6269071. doi:10.1093/nar/9.13.3047.
2. ↑  Fried M, Crothers DM (December 1981). "Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis". *Nucleic Acids Res.* **9** (23): 6505–25. PMC 327619. PMID 6275366. doi:10.1093/nar/9.23.6505.
3. 1 2  Ausubel, Frederick M. (1994). *Current Protocols in molecular biology*. Chichester: John Wiley & Sons. pp. 12.2.1–11. ISBN 0-471-50337-1.
4. ↑  Fried MG, Liu G. (1994). "Molecular sequestration stabilizes CAP- DNA complexes during polyacrylamide gel electrophoresis". *Nucleic Acids Research* 22(23): 5054-5059. doi: 10.1093/nar/22.23.5054. PMID 7800499.
5. ↑  Fried MG (1989) "Measurement of protein-DNA interaction parameters by electrophoresis mobility shift assay". *Electrophoresis* 10, 366-376. PMID 2670548.
6. ↑  Smith AJ, Humphries SE (January 2009). "Characterization of DNA-binding proteins using multiplexed competitor EMSA". *J. Mol. Biol.* **385** (3): 714–7. PMID 19059416. doi:10.1016/j.jmb.2008.11.035.

Véxase tamén
------------

### Ligazóns externas

Protocolos
* Dr. Mirmira EMSA Protocol
* Preparation of nuclear extract for EMSA
* Jonathan Flint Lab Protocol[*Ligazón morta*]
* EMSA for Transcription Factor Binding
* Chemiluminescent Gel Shift Protocol

| * v
* c
* e
Sondas moleculares |
| --- |
| Xeral | 
* Southern blot (ADN)
* Northern blot (ARN)
* Western blot (proteínas)
* Eastern blot (modificación postraducional)

 |
| Interaccións | 
* Southwestern blot (proteína:ADN)
* Ensaio de retardo na mobilidade electroforética (ADN:proteína)
* Far-western blot (proteína:proteína)
* Far-Eastern blot (lípido:modificación postraducional)
* Northwestern blot (proteína:ARN)

 |

|  |  |
| --- | --- |
| Control de autoridades | 
* Wd: Q903596
* MAG: 183978625

 |

|  |  |
| --- | --- |
| Identificadores | 
* MeSH: D024202

 |