Os **estudos in vitro** ocupan un lugar moi relevante no contexto dos métodos alternativos na investigación da toxicidade, xa que constitúen a alternativa máis salientable aos estudos in vivo, repolándoos nalgunhas ocasións.

Validación e aceptación dos métodos in vitro
--------------------------------------------

Actualmente admítese a utilidade dos resultados obtidos por procedementos in vitro na investigación básica dos mecanismos toxicolóxicos. Para que os datos subministrados por un método in vitro poidan ser usados para o rexistro dun novo composto químico requírese que o seu protocolo fora previamente validado cientificamente e aprobado polas autoridades reguladoras.

Compoñentes dos modelos experimentais de toxicidade in vitro
------------------------------------------------------------

Un método in vitro consta de dous compoñentes fundamentais: un substrato biolóxico e un (ou varios) indicador de toxicidade. O substrato biolóxico é o material, xeralmente orgánico, sobre o que se aplica in vitro o xenobiótico e cuxas reaccións ante o estímulo se pretende extrapolar ao ser humano. Estas alteracións mídense mediante os denominados indicadores de toxicidade, que son os parámetros que se valoran para cuantificar as modificacións producidas na estrutura ou fisioloxía dos compoñentes do substrato do ensaio. O valor predictivo do modelo experimental dependerá da boa conxunción entre o substrato biolóxico e os indicadores de toxicidade aplicados.

Principais substratos biolóxicos empregados in vitro
----------------------------------------------------

* Cultivo de embrións.

Empréganse principalmente embrións de roedores e de aves (ovos fecundados) para examinar as alteracións no desenvolvemento e a diferenciación. 

* Cultivo e baños de órganos.

Úsanse fígado, cerebro, hipófise, íleo etc. tanto íntegros como en toros. 

* Órganos perfundidos.

Determinados órganos como o fígado, ril e páncreas poden manterse en óptimas condicións mediante sistemas de perfusión continua o que facilita os estudos de captación e secreción de substancias.

* Explantes. Cultivos organotípicos.

Os explantes son pequenas pezas de tecido, tomadas de animais de calquera idade, cuxas células interaccionan entre si e crecen en cultivo durante semanas ou meses mantendo a estrutura do órgano.

* Cultivo de reagregados celulares.

Se as células procedentes de tecidos fetais se disocian e cultivan nun medio sometido a axitación constante, estas reagrúpanse formando microagregados nos que se restaura a arquitectura tridimensional orixinal. A diferenciación é máis completa que nun crecemento en monocapa e a reproducibilidade é mellor que nos explantes.

* Cultivo de células dispersadas.

As células cultívanse tras ser disociadas e o crecemento do cultivo prodúcese en monocapa. A reproducibilidade dos estudos é maior e pode realizarse sobre células individualizadas durante longo tempo.

* Cultivo de liñas celulares.

Empréganse células de orixe animal ou humano que se adaptaron a vivir en cultivo. Estas células teñen unha vida infinita (son capaces de multiplicarse in vitro durante períodos ilimitados) e converténdose nunha liña celular establecida. O seu mantemento é sinxelo e os resultados son moi reproducibles.

* Modelos libres de células.

A experimentación cunha fracción subcelular illada presenta a vantaxe de evitar interaccións tisulares, celulares e con outros orgánulos e enzimas, polo que resulta moi axeitada para comprobar efectos específicos sobre estruturas subcelulares.

Indicadores de toxicidade in vitro
----------------------------------

Para cuantificar o grao de toxicidade que un determinado substrato biolóxico sofre trala acción dun tóxico establécense unha serie de marcadores. Estes marcadores son variacións que se producen no funcionamento e na morfoloxía do substrato biolóxico empregado na análise. 
Tendo en conta que estas análises son in vitro os substratos biolóxicos dos que vai facer uso son os tecidos, as células, os compoñentes celulares e as biomoléculas, coma proteínas por exemplo.
Os principais indicadores son:

### 1. Modificacións na morfoloxía celular e tisular

Entre outros efectos tóxicos podemos atopar por exemplo: variacións no tamaño e na forma celular, nas unións e mecanismos de contacto entre células, no núcleo e nucléolos etc. Estas modificacións ponse de manifesto mediante unha serie de técnicas coma a microscopía óptica e electrónica, a resonancia magnética nuclear ou a citrometría de fluxo.

### 2. Morte celular

Este efecto tóxico pódese avaliar observando como actúan as células fronte a determinados colorantes. Así só as células vivas son capaces de expulsar o azul tripán, ou de absorber o vermello neutro. Avaliando a adhesión das células a superficie do cultivo tamén se poden distinguir células vivas de mortas xa que a adhesión é unha propiedade das células sas e vivas.

### 3. Incapacidade de división

A perda desta función vital para a célula pode ocorrer trala exposición a un tóxico. Para poder medir isto recórrese o reconto directo do número de células ou indirectamente avaliando o incremento do ADN total.

### 4. Variacións no metabolismo celular

Como resultado da interacción cun tóxico unha célula pode ver modificado o seu metabolismo. Podemos citar como exemplos a variación dos niveis de substancias vitais para o funcionamento celular (ATP, ións, glutatión, e outros.); a alteración das reaccións metabólicas que interveñen en funcións enerxéticas e a capacidade de síntese de macromoléculas coma os ácidos nucleicos e as proteínas.

Para a avaliación destes efectos hai que recorrer a:

* Técnicas fotométricas, fluorométricas, potenciométricas ou radioactivas.
* Análise do consumo de O2.
* Exame da captación de precursores marcados radioactivamente.
* Medida das actividades enzimáticas.
* Métodos de ADN recombinante como sondas de hibridación, para ARN-m de proteínas que se sintetizan tralo suceso tóxico.

### 5. Alteracións das membranas celulares

Tendo en conta que as membranas son un entramado bioquimicamente complexo, formado maioritariamente por lípidos e proteínas. A toxicidade sobre estas explícase atendendo a dous procesos: as alteracións na síntese de lípidos e proteínas e a un dano fisicoquímico directo sobre a membrana por parte dos radicais libres de osíxeno que provocarán a peroxidación lipídica desta, co correspondente dano estrutural. Atendendo a isto, a avaliación da toxicidade sobre a membrana recaerá na análise da súa fisioloxía e estrutura, da permeabilidade iónica, e dos sistemas de transporte, mediante procedementos coma a captación de colorantes.

### 6. Interferencias na comunicación intercelular

A comunicación celular, neste caso está referida ó intercambio de moléculas a través dos complexos de unión e pódese avaliar mediante técnicas coma o electroacoplamento e a inxección de colorantes.

### 7. Toxicidades específicas

Hai efectos tóxicos que son característicos de órganos concretos e por tanto requírense procedementos especiais para avaliar estas toxicidades. Son exemplos representativos:

* Técnicas electrofisiolóxicas para a avaliación da despolarización e repolarización a nivel neural.
* Control dos factores da coagulación para a avaliación da función hepática.
* Medida do aclaramento renal para a avaliación do estado fisiopatolóxico dos riles. ref name= cinco/>

Vantaxes dos ensaios in vitro fronte os ensaios in vivo
-------------------------------------------------------

* Son ética e moralmente máis aceptables.
* Nos casos en que se precisen, requírense un número menor de animais, xa que con fraccións dos órganos dun só animal poden realizarse centos de ensaios.
* Posibilitan o uso de material de orixe humano, o que facilita a extrapolación dos resultados.
* Facilitan determinados estudos especializados (electrofisiolóxicos e toxicocinéticos).
* Permiten estudar as accións dos compostos sobre unha determinada poboación celular, a que se presupoña a diana principal ou secundaria.
* Os resultados presentan maior reproducibilidade.
* Permiten o control da duración do período de contacto co produto avaliado, xa que o tóxico pode aplicarse e retirarse a vontade, e maior precisión no control da dosificación.
* Facilitan o estudo dos mecanismos da acción tóxica e o estudo cronolóxico desas accións.
* Supoñen un importante aforro de tempo.
* Precisan de menores cantidades dos produtos ensaiados.

Desvantaxes dos ensaios in vitro fronte os ensaios in vivo
----------------------------------------------------------

* Só serven para predicir a toxicidade dun determinado tipo de substancias ou dun aspecto concreto do proceso de toxicidade, polo que é necesario empregar unha batería de ensaios.
* Carecen das complexas interaccións existentes entre os distintos órganos.
* É difícil detectar toxicidades crónicas ou retardadas dada a limitada duración da actividade fisiolóxica, sobre todo das células especializadas.
* As substancias pouco solubles, volátiles, gasosas ou que se descompoñan rapidamente son difíciles de ensaiar.
* A complexidade da extrapolación, sobre todo cando non se dispón de información sobre as concentracións que producen efectos tóxicos in vivo.

Principais aplicacións dos ensaios in vitro
-------------------------------------------

As aplicacións deste tipo de test están en continuo desenvolvemento e inclúen test de irritación ocular, test de irritación/corrosión/sensibilización cutánea, carcinoxénese/mutaxénese (o test de Ames é o máis clásico), test de toxicidade reprodutiva e do desenvolvemento, hepatotoxicidade, neutoxicidade etc… Porén aínda faltan alternativas para a avaliación da toxicidade sistémica a longo prazo. Existe unha grande presión sobre os científicos para o desenvolvemento e validación destes métodos xa que existe lexislación que establece que a experimentación animal para a avaliación de produtos cosméticos estará prohibida a partir do ano 2013.

Notas
-----

1. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13  Repetto, M. Toxicología avanzada. Díaz de Santos. Madrid 1995. pp 43-49.
2. ↑  Castell J.V. Gomez-Lechón Mj "In vitro methods in pharmaceutical research" Academic Press 1997
3. ↑  Vinardell Martínez-Hidalgo, M.P. Alternativas a la experimentación animal en toxicología: situación actual. Acta Bioethica 2007; 13 (I): 41-52
4. 1 2 3  O’Hare, S. K.Atterwill C."IN VITRO TOXICITY TESTING PROTOCOLS" Methods in Molecular Biology Vol.43. Pags: 129-130
5. 1 2  M. Frazier J,"In vitro toxicity testing. Applications to safety evaluation" Marcel DEKKER, INC. 1992
6. ↑  Bourdeau P, Somers E, Mark Richardson G, Hickman JR. "Short-term toxicity test for non-genotoxic effects". Gildfor, J. Wiley and Sons, 1990, 353.
7. ↑  M. Bhanushali, V. Bagale, A. Shirode, Y. Joshi, V. Kadam. An in-vitro toxicity testing - a reliable alternative to toxicity testing by reduction, replacement and refinement of animals. International Journal of Advances in Pharmaceutical Sciences 1 (2010) 15-31.