O **northwestern blot**, tamén chamado **ensaio northwestern**, é unha técnica analítica de bioloxía molecular híbrida entre o western blot e o northern blot, que se utiliza para detectar as interaccións entre o ARN e as proteínas. A técnica relacionada do western blot utilízase para detectar proteínas de interese realizando unha transferencia a unha membrana de nitrocelulosa de ditas proteínas, que son separadas previamente por electroforese en xel. Os grupos de precipitados coloreados ao longo das bandas que quedan sobre a membrana conteñen unha determinada proteína diana. O northern blot é unha técnica similar que, en vez de detectar unha proteína de interese, úsase para estudar a expresión xénica pola detección de ARN (ou ARNm illado) sobre unha membrana similar á do western blot. Pola súa parte, o northwestern blot combina as dúas técnicas, e implica especificamente a identificación de ARN etiquetado que interacciona con proteínas que son inmobilizadas nunha membrana de nitrocelulosa similar. Serve para separar proteínas que interaccionan co ARN.

Historia
--------

O científico Edwin Southern foi o creador da primeira técnica de blotting ou transferencia, que se denominou co seu apelido Southern blot (transferencia de Southern), que era unha técnica analítica utilizada para detectar ADN. A técnica requiría usar electroforese en xel, un importante método analítico que implica a migración de ADN, ARN ou proteínas cargados a través dun campo eléctrico, que se separan baseándose no seu tamaño e carga. No Southern blot, os fragmentos de ADN separados son despois transferidos a unha membrana de filtración para a detección. Detéctanse como bandas que se fan visibles na membrana e correlaciónanse cunha determinada molécula de interese. Posteriormente, apareceron outras técnicas de blotting que se nomearon facendo un xogo de palabras co apelido Southern e os nomes dos puntos cardinais en inglés, que servían par detectar outras moléculas ou as interaccións entre moléculas. Entre elas están o western blot (para detección de proteínas), o northern blot (detección de ARN), o southwestern blot (detección da interacción ADN-proteína), o eastern blot (detección de modificacións postraducionais) e a northwestern blot (detección de interacción ARN-proteína). Estas técnicas escríbense con frecuencia con maiúscula, facendo unha analoxía co Southern blot.

Especificidades da técnica
--------------------------

Realizar un northwestern blot implica separar as proteínas que se unen ao ARN por medio de electroforese en xel, que as sepra bseándose no seu tamaño e carga. Cada mostra debe cargarse nos pozos dun xel de agarosa ou poliacrilamida (xeralmente para facer unha SDS-PAGE) para analizar múltiples mostras ao mesmo tempo. Unha vez que se completou a electroforese en xel, o xel e as proteínas que se unen ao ARN asociadas son transferidas a un papel ou lámina de nitrocelulosa.

Os blots acabados de transferir son despois mergullados nunha solución bloqueante; tampóns bloqueantes comúns son o leite desnatado e a seroalbumina bovina. Esta solución bloqueante axuda a impedir que se produzan unións non específicas cos anticorpos primarios ou secundarios da membrana de nitrocelulosa. Unha vez que se deixou que a solución bloqueante tivese un tempo adecuado de contacto co blot, aplícase un ARN competidor específico e déixase tempo para que incube á temperatura dunha habitación. Durante este tempo, o ARN competidor únese ás proteínas que se unen ao ARN nas mostras do blot. O tempo de incubación durante este proceso pode variar dependendo da concentración do ARN competidor aplicado, pero adoita ser dunha hora. Despois de completada a incubación, o blot adoita lavarse polo menos tres veces durante 5 minutos en cada lavado, para diluír e retirar o ARN da solución. Tampóns de lavado comúns son o salino tamponado con fosfato (PBS) ou unha solución ao 10% de Tween 20. Un lavado incorrecto afecta á claridade do revelado do blot. Unha vez rematado o lavado, o blot revélase despois con raios X ou métodos similares de autorradiografía.

Aplicacións
-----------

Despois de revelar o blot usando raios X ou autorradiografía, os resultados poden anlizarse e interpretarse para determinar o tamaño proximado e concentración das proteínas de interese que se unen o ARN para realizar un posterior estudo das mesmas. A localización e concentración das proteínas que se unen ao ARN no blot poden afectar os resultados, e por veces poden aparecer bandas despois do revelado. Estas bandas poden axudar aos investigadores a determinr o tamaño e a concentración das proteínas que se unen ao ARN de interese. Cando se coñece o tamaño aproximado da proteína, a mostra orixinal pode facerse pasar por unha máquina de cromatografía para separala por tamaño. Ademais, unha vez que se illa a proteína, pode dixerirse con tripsina, e pode utilizarse a espectrometría de masas para secuenciar os péptidos e determinar a identidade da proteína específica.

Vantaxes e desvantaxes
----------------------

Entre as vantaxes que teñen os northwestern blots están a detección rápida de proteínas específicas que se unen ao ARN e a estimación dos pesos moleculares aproximados de ditas proteínas. O northwestern blot permite a detección de proteínas identificadas de forma barata. O blot é normalmente o primeiro paso que se realiza nunha investigación, xa que permite a identificación dos pesos moleculares aproximados, e unha vez que se coñece o peso molecular permite posteriores investigacións ou purificacións usando outros métodos como a cromatografía. Outra vantaxe do northwestern blot é que axuda a construír bibliotecas de expresión de ligandos cognados.

Unha desvantaxe que se ten sinalado é que algunhas interaccións ARN-proteína con propiedades de unión ao ARN malas poden non ser detectables con esta técnica. Ademais, o procedemento do blotting pode tardar de 3 a 5 horas. Se o procedemento non se fai correctamente pode causar un significativo fondo que pode orixinar un blot pouco claro das proteínas identificadas. Adicionalmente, as proteínas necesitan renaturalizrse antes de ser separadas e transferidas á membrana de nitrocelulosa. Unha última desvantaxe é que as proteínas deben constar dun só polipéptido ou de dúas subunidades que comigran na matriz do xel.

Notas
-----

1. 1 2  
Southern, Edwin Mellor (5 November 1975). "Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis". *Journal of Molecular Biology* **98** (3): 503–517. ISSN 0022-2836. PMID 1195397. doi:10.1016/S0022-2836(75)80083-0.
2. 1 2  Nelson, Cox (2013). *Lehninger Principles of Biochemistry*. New York, NY: W.H. Freeman and Company. p. 179. ISBN 978-1-4641-0962-1.
3. ↑  Alberts, B. Johnson, A. Lewis, J. Raff, M. Roberts, K. Walter, P. 2008. Molecular Biology of the Cell, 5th ed. Garland Science, Taylor & Francis Group, NY, pp 538-539.
4. ↑  Kevil, C. G. Walsh, L. Laroux, F. S. Kalogeris, T. Grisham, M. B. Alexander, J. S. (1997) An Improved, Rapid Northern Protocol. Biochem. and Biophys. Research Comm. 238:277-279.
5. 1 2  Rapley, R (2000). *The Nucleic Acid Protocols Handbook*. Totowa, NJ: Humana Press Inc. p. 783. ISBN 0-89603-459-3.
6. ↑  Nicholas; Nelson (2013). "North, South, or East? Blotting Techniques". *Journal of Investigative Dermatology* **133** (e10): e10. doi:10.1038/jid.2013.216.
7. ↑  Verena, Bichsel; Alfred Walz; Matthias Bickel (1997). "Identification of proteins binding specifically to the 3'-untranslated region of granulocyte/macrophage-colony stimulating factro mRNA" (PDF). *Nucleic Acids Research* **25** (12): 2417–2423. PMC 146745. PMID 9171094. doi:10.1093/nar/25.12.2417. Consultado o 7 May 2014.
8. ↑  Liao, Huey-Jane; Ryuji Kobyashi and Michael B. Matthews; Mathews, M. B. (July 21, 1998). "Activities of adenovirus virus-associated RNAs: Purification and characterization of RNA binding proteins". *Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America* **95** (15): 8514. Bibcode:1998PNAS...95.8514L. PMC 21107. PMID 9671709. doi:10.1073/pnas.95.15.8514. Consultado o 23 April 2014.
9. ↑  C, Franke; Grafe D; Bartsch H; Bachmann M (2009). "Use of non-radioactive detection method for north- and southwestern blot". *Methods of Molecular Biology*. Methods in Molecular Biology **536**: 441–9. ISBN 978-1-934115-73-2. PMID 19378081. doi:10.1007/978-1-59745-542-8\_44.
10. ↑  Schumacher, Jill; Keesook Lee; Susanne Edelhoff; Robert Braun (May 1995). "Spnr, a Murine RNA-binding Protein That Is Localized to Cytoplasmic Microtubules" (PDF). *The Journal of Cell Biology* **129** (4): 1023–1032. PMC 2120489. PMID 7744952. doi:10.1083/jcb.129.4.1023. Consultado o 7 May 2014.
11. ↑  Stohlman, S A; R S Baric; G N Nelson; L H Soe; L M Welter; R J Deans (1988). "Specific interaction between coronavirus leader RNA and nucleocapsid protein". *Journal of Virology*. 11 **62** (11): 4288. Arquivado dende o orixinal (PDF) o 13 de setembro de 2019. Consultado o 25 March 2014.
12. ↑  Thangasamy, Saminathan. "Northwestern Blot of Protein-RNA Interaction from Young Rice Panicles". Consultado o 26 March 2014.
13. ↑  Perdew, Gary (Aug 17, 2008). *Regulation of Gene Expression: Molecular Mechanisms*. Springer. p. 129. ISBN 9781597452281.
14. ↑  Gary H. Perdew; Jack P. Vanden Heuvel; Jeffrey M. Peters (2008). *Regulation of Gene Expression: Molecular Mechanisms*. Springer. p. 129. ISBN 9781597452281.
15. 1 2  Smith, Christopher W.J. (1998). *RNA-Protein Interactions : A Practical Approach: A Practical Approach*. Oxford University Press. p. 187. ISBN 9780191591624.
16. ↑  Waldo, Cohen (Aug 16, 1991). *Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology*. Academic Press. p. 186. ISBN 9780080863290.
17. ↑  Nicholson, Allen W. (2001). *Ribonucleases, Part A: Functional Roles and Mechanisms of Action: Functional Roles and Mechanisms of Action*. Academic Press. p. 409. ISBN 9780080496917.

Véxase tamén
------------

### Outros artigos

* Southern blot
* Western blot
* Northern blot
* Southwestern blot
* Eastern blot
* Electroforese en xel
* SDS-PAGE
* Cromatografía

### Ligazóns externas

Protocolos
* Northwestern blot da interacción proteínas-ARN de panículas novas de arroz
* Illamento de ARN e análise por nortern blot
* Técnicas de blotting de proteínas Arquivado 13 de setembro de 2019 en Wayback Machine.

| * v
* c
* e
Sondas moleculares |
| --- |
| Xeral | 
* Southern blot (ADN)
* Northern blot (ARN)
* Western blot (proteínas)
* Eastern blot (modificación postraducional)

 |
| Interaccións | 
* Southwestern blot (proteína:ADN)
* Ensaio de retardo na mobilidade electroforética (ADN:proteína)
* Far-western blot (proteína:proteína)
* Far-Eastern blot (lípido:modificación postraducional)
* Northwestern blot (proteína:ARN)

 |

|  |  |
| --- | --- |
| Control de autoridades | 
* Wd: Q17072133
* MAG: 149793748

 |