Malli *Aspergillus niger*-homeen fytaasin rakenteesta
**Fytaasi** on entsyymi, joka katalysoi orgaanisten molekyylien sisältämien fosforihappoesteriryhmien hydrolyysiä. Alun perin fytaasilla tarkoitettiin vain entsyymiä, joka hajottaa fytiinihapon fosfaatti-ioniksi ja inositolin pentafosfaattijohdannaiseksi, mutta sittemmin fytaaseiksi on alettu kutsua entsyymejä, jotka hydrolysoivat myös muita yhdisteitä.

Historia
--------

Ensimmäinen fytaasi löytyi 1907 kasvista (riisin leseistä) ja 1908 eläimestä (vasikan verestä ja maksasta). 1962 alkoi ensimmäinen fytaasien kaupallistamiseen tähtäävä projekti. Yhdysvaltalainen *International Minerals & Chemicals* (IMC) yritys tutki tässä projektissa yli 2000 erilaista mikrobia ja pyrki löytämään niistä eläinten rehukäyttöön sopivimman fytaasien tuottajan. IMC myi tuolloin kaivoksista louhittua epäorgaanista fosforia rehuteollisuudelle, mutta osasyynä sille miksi IMC aloitti kyseisen projektin, oli huoli näistä uusiutumattomista lähteistä louhitun fosforin loppumisesta joskus tulevaisuudessa. *Aspergillus* (*ficuum*) *niger* NRRL 3135 homekanta (ATCC koodi 66876) tunnistettiin lupaavaksi tuottajaksi, sillä se pystyi valmistamaan suuria määriä solunulkoisia fytaaseita. Eliö ei kuitenkaan sopinut kaupalliseen käyttöön ja projekti päättyi 1968 epäonnistumiseen.

*A. niger* -homeen lupaavien ominaisuuksien tunnistusta seurasi kuitenkin 1984 uusi yritys *A. niger* mutanteilla, jotka oli tuotettu tuolloin hiljaittain kehitettyä yhdistelmä-DNA-tekniikkaa käyttäen. Yhdysvaltain maatalousministeriön rahoittaman projektin aloitti tohtori Rudy Wodzinski, joka oli aiemmin toiminut IMC:n projektissa. 1984 aloitetun projektin seurauksena onnistuttiin 1991 kloonaamaan osittain ensimmäinen fytaasin geenin *phyA* sekvenssi, joka oli lähtöisin kannasta *A. niger* NRRL 31235. 1993 kloonattiin koko sekvenssi ja sitä yliekspressoitiin *A. niger* -homeessa fytaasien ylituottamiseksi.

1991 *BASF* yritys alkoi myymään ensimmäistä kaupallista *A. niger* -homeessa tuotettua fytaasia kauppanimellä *Natuphos*, jota käytettiin eläinrehun ravintoarvojen parantamiseen.

1999 kolibakteerin fytaasien havaittiin olevan ominaisuuksiltaan parempia kuin *A. niger* -homefytaasit. Löydön ansiosta alettiin kehittää uudenlaisia bakteerifytaaseita, jotka olivat monilta ominaisuuksiltaan homefytaaseita ylivoimaisempia.

Toimintamekanismi ja rakenne
----------------------------

Fytaasientsyymit voidaan jakaa toimintamekanisminsa mukaan kahteen ryhmään, 3-fytaaseiksi (*myo*-inositoliheksakisfosfaatti-3-fosfohydrolaasit) ja 6-fytaaseiksi (*myo*-inositoliheksakisfosfaatti-6-fosfohydrolaasit) eli 4-fytaaseiksi. 3-Fytaasit hydrolysoivat ensiksi fosfaattiryhmän, joka on liittynyt yhdisteen hiiliketjun kolmosasemaan, kun 6-fytaasit hajottavat ensimmäiseksi esteriryhmän, joka on kuutosasemassa.

Fytaasientsyymit voidaan jakaa rakenteeltaan neljään ryhmään, jotka eroavat toisistaan aktiiviselta kohdaltaan. Suurin ryhmä on niin kutsutut histidiinihappofosfataasit.

Esiintyminen luonnossa
----------------------

### Sienet ja homeet

Sienien ja homeiden fytaasientsyymit luokitellaan 3-fytaaseiksi. Niille on tyypillistä useat eri substraatit. Fytaaseja on tyypillisesti *Aspergillus*-suvun lajeissa esimerkiksi *Aspergillus niger*- ja *Aspergillus fumigatus* -homeissa. Lisäksi entsyymin on todettu olevan aktiivinen myös muun muassa leivinhiivassa ja *Penicillium*-suvun lajeissa.

Sienien ja homeiden fytaasientsyymeille sopiva pH on useimmiten hapan tai hivenen emäksinen ja optimaalinen lämpötila 50–75 °C.

### Bakteerit

Bakteerien fytaasientsyymien toimintaa on tutkittu erityisesti kolibakteerilla ja entsyymejä on eristetty myös muun muassa *Bacillus*- ja *Pseudomonas*-suvun lajeista. Bakteerien fytaaseille on tyypillistä, että ne hajottavat erityisesti fytiinihappoa ja sen suoloja fytaatteja. Nämä entsyymit toimivat parhaiten happamissa olosuhteissa ja lämpötilan ollessa 40–70 °C. Erityisesti kolibakteerin fytaasientsyymi on osoittautunut käyttökelpoiseksi lisäksi sikojen ja siipikarjan ruokinnassa.

### Muut mikro-organismit

Bakteerien ja sienien lisäksi fytaaseja esiintyy myös alkueläimissä. Tällaisia ovat muun muassa *Paramecium tetraurelia* ja *Shewanella oneidensis*, jonka entsyymi on aktiivinen kylmemmässä kuin monien muiden lajien entsyymit

### Kasvit

Suurin osa kasvien fytaaseista on 6-fytaaseja. 3-fytaaseja esiintyy muun muassa lupiineissa. Entsyymiä on tavattu liljojen siitepölyssä, maississa, avokadossa, vehnän, rukiin ja speltin jyvissä, pavuissa ja öljykasveissa.

### Eläimet

Selkärankaisten verestä fytaaseja on löydetty kaloilta, matelijoilta ja linnuilta. Nisäkkäistä märehtijöiden suolistossa on fytaasia, joka on suoliston mikrobien tuottamaa. Muut nisäkkäät saavat fytaasia pääasiassa ravintonsa mukana.

Aktivaattorit ja inhibiittorit
------------------------------

Monet metalli-ionit toimivat pieninä annoksina fytaasien aktivaattoreina. Tällaisia ovat muun muassa kalsium, magnesium, mangaani ja rauta. Suurina pitoisuuksina ne voivat kuitenkin myös haitata entsyymin toimintaa. Metalli-ionien vaikutus fytaasientsyymiin riippuu suuresti entsyymin tyypistä. Fytaasin inhibiittoreita ovat raskasmetallit, kuten elohopea, kadmium, nikkeli ja koboltti. Lisäksi entsyymin toimintaa heikentää muun muassa EDTA.

Käyttö
------

Eläinten ruokinnassa käytettävissä viljoissa fosforista 60–80 prosenttia on fytiinihappona, jota eläimet, kuten siat, eivät pysty normaalisti hyödyntämään. Siksi eläinten rehuun voidaan lisätä fytaasia, joka parantaa fosforin hyödyntämistä. Fosforin parempi hyödyntäminen vähentää myös fosfaatin määrää eläinten lannassa ja sitä kautta myös maatalouden aiheuttamaa ympäristön fosfaattikuormitusta.

Teollisuudessa fytaasia on kokeiltu hyödyntää muun muassa alkoholijuomien valmistuksessa. Eräillä inositolin fosfaattijohdannaisilla voi olla myös terveyttä edistäviä vaikutuksia ja fytaaseja käyttämällä voidaan saada aikaiseksi edullinen menetelmä tuottaa näitä yhdisteitä. Laajempaa teollista käyttöä varten fytaasientsyymeistä pyritään kehittämään korkeampia lämpötiloja sietäviä ja niiden pH-profiilia pyritään parantamaan.

Lähteet
-------

* Julio Polaina,Andrew P. MacCabe: *Industrial enzymes: structure, function and applications*. Springer, 2007. ISBN 978-1402053764. Kirja Googlen teoshaussa. (englanniksi)
* K.G. Mukerji,C. Manoharachary: *Current Concepts in Botany*. I. K. International Pvt Ltd, 2006. ISBN 9788188237647. Kirja Googlen teoshaussa. (englanniksi)
* Benjamin L. Turner,Alan E. Richardson,Edward J. Mullaney: *Inositol phosphates: linking agriculture and the environment*. CABI, 2007. ISBN 9781845931520. Kirja Googlen teoshaussa. (englanniksi)

### Viitteet

1. 1 2  Mukerji & Manoharachary s. 379
2. ↑  Suzuki, U.; Yoshimura, K.; Takaishi, M.: Über ein enzym 'Phytase' das anhydro-oxy-methylen diphosphorsaure' spalter.  *Bulletin of the College of Agriculture, Tokyo Imperial University*, 1907, nro 7, s. 502–512. Artikkelin verkkoversio (pdf).  (englanniksi)
3. 1 2  Vikas Kumar, Amit K. Sinha, Harinder P.S. Makkar, Klaus Becker: Dietary roles of phytate and phytase in human nutrition: A review.  *Food Chemistry*, 2010-06, 120. vsk, nro 4, s. 945–959. doi:10.1016/j.foodchem.2009.11.052. ISSN 0308-8146. Artikkelin verkkoversio.  (englanniksi)
4. ↑  McCollum, E.V.; Hart, E.B.: On the occurrence of a phytin-splitting enzyme in animal tissues.  *Journal of Biological Chemistry*, 1908, nro 4, s. 497–500.
5. 1 2 3 4 5 6 7 8  Xin Gen Lei ym.: Phytase, a New Life for an "Old" Enzyme.  *Annual Review of Animal Biosciences*, 1.1.2013, nro 1, s. 283–309. PubMed:25387021. doi:10.1146/annurev-animal-031412-103717. ISSN 2165-8102. Artikkelin verkkoversio (pdf).  (englanniksi) (Arkistoitu – Internet Archive)
6. ↑  Ursula Konietzny, Ralf Greiner: Molecular and catalytic properties of phytate-degrading enzymes (phytases).  *International Journal of Food Science and Technology*, 2002-10, 37. vsk, nro 7, s. 791–812. doi:10.1046/j.1365-2621.2002.00617.x. ISSN 0950-5423. Artikkelin verkkoversio.  (englanniksi)
7. ↑  E. J. Mullaney ym.: Positive identification of a lambda gt11 clone containing a region of fungal phytase gene by immunoprobe and sequence verification.  *Applied Microbiology and Biotechnology*, 1.8.1991, 35. vsk, nro 5, s. 611–614. doi:10.1007/BF00169625. ISSN 0175-7598. Artikkelin verkkoversio (pdf).  (englanniksi) (Arkistoitu – Internet Archive)
8. ↑  W. van Hartingsveldt ym.: Cloning, characterization and overexpression of the phytase-encoding gene (phyA) of Aspergillus niger.  *Gene*, 15.5.1993, 127. vsk, nro 1, s. 87–94. PubMed:8387447. doi:10.1016/0378-1119(93)90620-I. ISSN 0378-1119. Artikkelin verkkoversio.  (englanniksi)
9. ↑  E. Rodriguez, Y. Han, X. G. Lei: Cloning, sequencing, and expression of an Escherichia coli acid phosphatase/phytase gene (appA2) isolated from pig colon.  *Biochemical and Biophysical Research Communications*, 2.4.1999, 257. vsk, nro 1, s. 117–123. PubMed:10092520. doi:10.1006/bbrc.1999.0361. ISSN 0006-291X. Artikkelin verkkoversio.  (englanniksi)
10. ↑  Eric Rodriguez ym.: Different Sensitivity of RecombinantAspergillus nigerPhytase (r-PhyA) and Escherichia colipH 2.5 Acid Phosphatase (r-AppA) to Trypsin and Pepsinin Vitro.  *Archives of Biochemistry and Biophysics*, May 1999, nro 2, s. 262–267. doi:10.1006/abbi.1999.1184. ISSN 0003-9861. Artikkelin verkkoversio.  (englanniksi)
11. ↑  Polaina & MacCabe s. 509
12. 1 2  Polaina & MacCabe s. 506
13. 1 2 3 4  Mukerji & Manoharachary s. 380
14. 1 2 3  Polaina & MacCabe s. 507
15. 1 2  Polaina & MacCabe s. 508
16. ↑  EC 3.1.3.26 - 4-phytase Brenda. Viitattu 12.8.2010. (englanniksi)
17. ↑  Turner, Richardson & Mullaney s. 133
18. ↑  Vähemmän fosfaatteja lihasioille ja lannan fosforipitoisuus alemmas fytaasin avulla Suomen rehu. Viitattu 12.8.2010.
19. ↑  Polaina & MacCabe s. 518
20. ↑  Turner, Richardson & Mullaney s. 138–140