**RESOLFT** یک کوته نوشت برای **REversible Saturable OpticaL Fluorescence Transitions** می‌باشد که به گروهی از تکنیک‌های میکروسکوپ فلورسانس نوری با وضوح بسیار بالا اشاره دارد. با استفاده از نور مرئی میدان دور استاندارد، می توان به وضوح بسیار کمتر از حد پراش تا مقیاس های مولکولی دست یافت.

  

با تکنیک‌های میکروسکوپی مرسوم، تشخیص ویژگی‌هایی که در فواصل کمتر از نیمی از طول موج مورد استفاده قرار دارند (یعنی حدود 200 نانومتر برای نور مرئی) ممکن نیست. این حد پراش بر اساس ماهیت موجی نور است. در میکروسکوپ‌های معمولی، حد توسط طول موج مورد استفاده و دیافراگم عددی سیستم نوری تعیین می‌شود. مفهوم RESOLFT با تغییر موقت مولکول ها به حالتی که در آن نمی توانند سیگنال (فلورسانس) را پس از روشنایی ارسال کنند، بر این محدودیت غلبه می کند. این مفهوم به عنوان مثال با میکروسکوپ الکترونی که در عوض طول موج استفاده شده بسیار کوچکتر است متفاوت است.

**اصول و قوائد عملکرد**

روشن و خاموش کردن فلورسانس در مناطق خاص منجر به فعال کردن فلورسانس در مناطق کوچکتر از حد پراش می شود. رستریزاسیون کل نمونه منجر به یک تصویر پیکسلی با وضوح بسیار بالا می شود.

  

  

میکروسکوپ RESOLFT یک میکروسکوپ نوری با وضوح بسیار بالا است که می‌تواند جزئیات نمونه‌هایی را که با میکروسکوپ معمولی یا کانفوکال قابل تصویربرداری نیستند، تصویر کند. در RESOLFT اصول میکروسکوپ STED و میکروسکوپ GSD تعمیم داده شده است. سازه هایی که معمولاً خیلی نزدیک به یکدیگر هستند و قابل تشخیص نیستند به ترتیب خوانده می شوند.

همه روش‌هایی که بر روی مولکول‌هایی کار می‌کنند که حداقل دو حالت قابل تشخیص دارند را می توان در این چارچوب شرح داد ، جایی که سوئیچ‌پذیری برگشت‌پذیر میان دو حالت امکان‌پذیر است، و نیز جایی که حداقل یکی از این انتقال‌ها می‌تواند به شکل نوری القا شود.

در بیشتر موارد از نشانگرهای فلورسنت استفاده می شود، جایی که یک حالت (A) ، بیانگر روشن است، یعنی سیگنال فلورسانس تولید می کند و حالت دیگر (B) بیانگر تاریک است و سیگنالی ایجاد نمی کند. یک انتقال میان آنها می تواندبه کمک نور القا شود (به عنوان مثال A→B، از روشن به تاریک).

نمونه به طور ناهمگن با شدت روشنایی در یک موقعیت بسیار کوچک (در حالت ایده آل نزدیک به صفر ) روشن می شود. فقط در این مکان، مولکول‌ها هرگز در حالت تاریک B نیستند (اگر A حالت قبل تر ایجاد شده باشد) و کاملاً در حالت روشن A باقی می‌مانند. ناحیه‌ای که مولکول‌ها عمدتاً در حالت روشن هستند، می‌تواند بسیار کوچک شود (کوچکتر از حد پراش معمولی) با افزایش شدت نور انتقالی (به زیر مراجعه کنید). بنابراین، هر سیگنال شناسایی شده تنها از مولکول‌های موجود در ناحیه کوچک اطراف حداقل شدت روشنایی ایجاد می‌شود. یک تصویر با وضوح بالا را می توان با اسکن کردن نمونه، به عنوان مثال، تغییر مشخصات روشنایی در سراسر سطح، ساخت.

انتقال از B به A می تواند خودکار یا توسط نور با طول موج متفاوتی انجام شود. مولکول ها باید چندین بار قابل تغییر باشند تا در زمان های مختلف در طول اسکن نمونه، در حالت A یا B باشند. همچنین، این روش اگر حالت روشن و تاریک معکوس شود، انجام پذیر است، که نتیجتا یک تصویر منفی به دست می آید.

اصل RESOLFT: نمونه به طور ناهمگن روشن می شود (خط قرمز). شدت در یک ناحیه قابل مقایسه با حد وضوح کلاسیک کاهش می یابد، اما (در حالت ایده آل) تنها در یک موقعیت صفر است. شدت آستانه (خط آبی) مورد نیاز برای تغییر مولکول ها به حالت تاریک تنها کسری از حداکثر شدت اعمال شده است، بنابراین فقط مولکول هایی که بسیار نزدیک به موقعیت حداقل شدت هستند می توانند در حالت روشن باشند. ناحیه سبز در کادر سمت راست، اندازه ناحیه ای را که مولکول ها قادر به تولید سیگنال هستند را نشان می دهد.
در RESOLFT ناحیه‌ای که در آن مولکول‌ها در حالت A (حالت روشن) قرار دارند، با وجود حد پراش، می تواند به میزان دلخواه کوچک ایجاد شود.

* نمونه باید به طور ناهمگن روشن شود تا یک نقطه شدت صفر جدا شده ایجاد شود. این را می توان به عنوان مثال با تداخل به دست آورد.
* در شدت های کم (پایین‌تر از خط آبی در تصویر) اکثر مولکول های نشانگر در حالت روشن هستند، اگر شدت بالاتر باشد، بیشتر نشانگرها در حالت تاریک هستند.

  

با روشنایی ضعیف، مشاهده می‌شود که همچنان، ناحیه‌ای که مولکول‌ها در حالت A باقی می مانند بسیار بزرگ است. زیرا روشنایی آنقدر کم است که اکثر مولکول‌ها در حالت A قرار دارند. شکل نمایه روشنایی، نیازی به تغییر ندارد. افزایش روشنایی در حال حاضر منجر به ایجاد یک ناحیه کوچکتر می شود که در آن، شدت کمتر از میزان مورد نیاز برای جابجایی کارآمد به حالت تاریک است. در نتیجه، ناحیه‌ای که مولکول‌ها می توانند در حالت A قرار گیرند نیز کاهش می‌یابد. سیگنال (فلورسانس) در طول بازخوانی بعدی از یک نقطه بسیار کوچک منشأ گرفته و می‌توان تصاویر بسیار واضحی به دست آورد.

  

در مفهوم RESOLFT، میزان وضوح را می توان به کمک رابطه {\displaystyle \Delta d\simeq {\frac {\lambda }{\pi n{\sqrt {\frac {I}{Isat}}}}}} به دست آورد که در آن، {\displaystyle I\_{sat}} مشخصه شدت مورد نیاز برای اشباع انتقال است (نیمی از مولکول ها در حالت A و نیمی در حالت B باقی می مانند)، و I به شدت وارده اشاره دارد. اگر مینیمم ها با متمرکز کردن اپتیک‌ها با دیافراگم عددی{\displaystyle {\mbox{NA}}=n\sin \alpha } تولید شوند، کمترین فاصله‌ای که دو شی متمایز می‌توانند تشخیص داده شوند برابر است با {\displaystyle \Delta d={\frac {\lambda }{2n\cdot \sin \alpha \cdot {\sqrt {1+{\frac {I}{Isat}}}}}}} که می‌توان آن را به عنوان رابطه‌ی آبه شناخت. ماهیت پراش نامحدود خانواده مفاهیم RESOLFT با این واقعیت منعکس شده است که حداقل فاصله قابل دست‌یابی {\displaystyle \Delta d} با افزایش {\displaystyle \varsigma ={\frac {I}{Isat}}} می‌تواند به طور پیوسته کاهش یابد.  

بنابراین، جستجو برای وضوح در ابعاد نانو به حداکثر کردن این کمیت ختم می‌شود. این کار با افزایش I یا با کاهش {\displaystyle I\_{sat}} امکان پذیر است. 

**انواع**

حین تغییر حالت‌های مولکولی از فرآیندهای مختلفی استفاده می شود. با این حال، وجه مشترک در همگی آن‌ها این است که حداقل از دو حالت متمایز بهره گرفته می‌شود. معمولاً خاصیت فلورسانس مورد استفاده، تمایز حالت‌ها را مشخص می‌کند، هرچند این امر ضروری نیست، چرا که از خواص جذب یا پراکندگی نیز می‌توان استفاده کرد. 

**میکروسکوپ STED**

در میکروسکوپ STED (میکروسکوپ کاهش انتشار STimulated Emission) یک مولکول فلورسنت رنگ، بین حالت پایه الکترونیکی و حالت برانگیخته آن در حالی که فوتون های فلورسانس را ارسال می کند، هدایت می شود. این حالت عملکرد استاندارد در میکروسکوپ فلورسانس است و حالت A را نشان می‌دهد. در حالت B، رنگ از طریق انتشار تحریک‌شده، به‌طور دائم در حالت پایه الکترونیکی خود نگهداری می‌شود. اگر رنگ بتواند در حالت A و نه در حالت B فلورسانس شود، مفهوم RESOLFT اعمال می شود.

**میکروسکوپ GSD**

میکروسکوپ GSD (میکروسکوپ کاهش حالت زمین) نیز از نشانگرهای فلورسنت استفاده می‌کند در حالت A، مولکول می‌تواند آزادانه بین زمین و اولین حالت برانگیخته هدایت شود و فلورسانس ساطع شود. در حالت تاریک B، که در آن حالت پایه مولکول خالی از جمعیت است، یک انتقال به حالت برانگیختگی طولانی مدت، صورت می‌گیرد که فلورسانس از آن ساطع نمی‌شود. تا وقتی که مولکول در حالت تاریک باشد، برای انجام چرخه بین حالت زمین و حالت برانگیخته در دسترس نیست، بنابراین فلورسانس غیرفعال می‌شود.

**SPEM و SSIM**

SPEM (میکروسکوپ تحریک الگوی اشباع شده)  و SSIM (میکروسکوپ روشنایی ساختار یافته اشباع شده)  از مفهوم RESOLFT با استفاده از تحریک اشباع برای تولید تصاویر "منفی" استفاده می‌کنند، به این معنی که فلورسانس از همه جا در اطراف به جز در یک منطقه بسیار کوچک رخ می‌دهد. همچنین، در نورپردازی میکروسکوپ از الگوهای غیر نقطه‌ای-مانند استفاده می‌شود. برای به دست آوردن دوباره تصاویر مثبت، بازسازی ریاضی تصویر، ضروری است.

**RESOLFT با پروتئین های قابل تعویض**

برخی از پروتئین های فلورسنت را می توان با نور با طول موج مناسب خاموش و روشن کرد. آنها را می‌توان در میکروسکوپ نوع RESOLFT استفاده کرد. در طول نورپردازی با نور، این پروتئین ها ساختار خود را تغییر می دهند. در این فرآیند آنها توانایی انتشار فلورسانس به دست می آورند یا از دست می دهند. وضعیت فلورسنت با حالت A مطابقت دارد، وضعیت غیر فلورسنت به حالت B و مفهوم RESOLFT دوباره اعمال می شود. انتقال برگشت پذیر (مثلاً از B به A) به طور خود به خود یا دوباره توسط نور انجام می شود. القای تغییرات ساختاری در پروتئین‌ها را می‌توان با شدت نور سدوضعیتی(سوییچینگ) بسیار پایین‌تر در مقایسه با انتشار تحریک‌شده یا کاهش حالت پایه (در حدود W/cm²) به دست آورد. در ترکیب با میکروسکوپ 4Pi، تصاویری با وضوح همسانگرد کمتر از 40 نانومتر از سلول‌های زنده در سطوح نور پایین به دست آمده است.

**RESOLFT با رنگ های آلی قابل تعویض**

درست مانند پروتئین‌ها، برخی از رنگ های آلی نیز می توانند ساختار خود را پس از روشن شدن تغییر دهند.   توانایی فلورسانس چنین رنگهای آلی را می توان از طریق نور مرئی فعال و غیر‌فعال کرد. در این‌جا نیز، شدت نور اعمال شده می‌تواند بسیار کم باشد (در حدود 100 W/cm²).

منابع
-----

1. ↑  Thomas A. Klar; Stefan W. Hell (1999). "Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy". *Optics Letters*. **24** (14): 954–956. Bibcode:1999OptL...24..954K. doi:10.1364/OL.24.000954. PMID 18073907.
2. ↑  Stefan W. Hell & Jan Wichmann (1994). "Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy". *Optics Letters*. **19** (11): 780–2. Bibcode:1994OptL...19..780H. doi:10.1364/OL.19.000780. PMID 19844443.
3. ↑  See also Confocal laser scanning microscopy.
4. ↑  Stefan W. Hell (2004). "Strategy for far-field optical imaging and writing without diffraction limit". *Physics Letters A*. **326** (1–2): 140–145. Bibcode:2004PhLA..326..140H. doi:10.1016/j.physleta.2004.03.082.
5. ↑  Rainer Heintzmann; Thomas M. Jovin; Christoph Cremer (2002). "Saturated patterned excitation microscopy a concept for optical resolution improvement". *Journal of the Optical Society of America A*. **19** (8): 1599–2109. Bibcode:2002JOSAA..19.1599H. doi:10.1364/JOSAA.19.001599. PMID 12152701. `{{cite journal}}`: `|hdl-access=` requires `|hdl=` (help)
6. ↑  Mats G. L. Gustafsson (2005). "Nonlinear structured-illumination microscopy: Wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution". *Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America*. **102** (37): 13081–6. Bibcode:2005PNAS..10213081G. doi:10.1073/pnas.0406877102. PMC 1201569. PMID 16141335.
7. ↑  Michael Hofmann; Christian Eggeling; Stefan Jakobs; Stefan W. Hell (2005). "Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy at low light intensities by using reversibly photoswitchable proteins". *Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America*. **102** (49): 17565–9. Bibcode:2005PNAS..10217565H. doi:10.1073/pnas.0506010102. PMC 1308899. PMID 16314572.
8. ↑  Ulrike Böhm; Stefan W. Hell; Roman Schmidt (2016). "4Pi-RESOLFT nanoscopy". *Nature Communications*. **7** (10504): 1–8. Bibcode:2016NatCo...710504B. doi:10.1038/ncomms10504. PMC 4740410. PMID 26833381.
9. ↑  Mariano Bossi; Jonas Fölling; Marcus Dyba; Volker Westphal; Stefan W. Hell (2006). "Breaking the diffraction resolution barrier in far-field microscopy by molecular optical bistability". *New Journal of Physics*. **8** (11): 275. Bibcode:2006NJPh....8..275B. doi:10.1088/1367-2630/8/11/275.
10. ↑  Jiwoong Kwon; Jihee Hwang; Jaewan Park; Gi Rim Han; Kyu Young Han; Seong Keun Kim (2015). "RESOLFT nanoscopy with photoswitchable organic fluorophores". *Scientific Reports*. **5**: 17804. Bibcode:2015NatSR...517804K. doi:10.1038/srep17804. PMC 4671063. PMID 26639557.