تصویر سه روش کشت سه‌بعدی سلول
**کشت سه‌بُعدی سلول** ایجاد محیطی مصنوعی است که در آن سلول‌ها بتوانند در هر سه بُعد رشد کنند و بر محیط اطرافشان تأثیر بگذارند. بر خلاف محیط دو بعدی (مثل پتری دیش)، یک محیط کشت سه‌بعدی به سلول‌ها این اجازه را می‌دهد که در فضای برون‌تنی در همهٔ جهت‌ها رشد کنند، درست مانند شرایطی که در محیط درون‌تنی وجود دارد. این محیط‌های کشت سه‌بعدی معمولاً در بیورآکتور‌ها رشد پیدا می‌کنند. بیورآکتورها، کپسول‌های کوچکی هستند که در آن‌ها سلول‌ها می‌توانند به‌صورت اسفروئید یا کلونی‌های سه‌بعدی رشد کنند. تقریباً ۳۰۰ اسفروئید در شرایط معمول در هر بیورآکتور کشت داده می‌شود.

پیشینه
------

مطالعات اولیه در دههٔ ۱۹۸۰ میلادی توسط مینا بیسل از آزمایشگاه ملی لارنس برکلی، اهمیت تکنیک‌های سه‌بعدی را برای ساخت مدل‌های کشت درون‌کشتگاهی صحیح، برجسته ساخت. این کار بر روی اهمیت ماتریکس خارج سلولی و توانایی کشت‌ها در ماتریکس‌های سه‌بعدی مصنوعی، در تولید ساختارهای چندسلولی مرتبط فیزیولوژیکی همانند ساختارهای آسینار در مدل‌های سالم و سرطانی بافت پستان، متمرکز بود. این تکنیک‌ها در مدل‌های درون‌کشتگاهی که برای ارزیابی پاسخ‌های سلولی به ترکیبات دارویی استفاده شده بودند، اعمال گردیدند.

اریک سیمون (در ۱۹۸۸ در یک گزارش گرنت NIH SBIR) نشان داد که می‌توان از الکتروریسی برای تولید حصیرهای فیبری پلی‌استیرنی و پلی‌کربناتی در ابعاد نانو و ساب‌میکرون استفاده کرد (امروزه به عنوان داربست شناخته می‌شود) که به‌طور ویژه می‌توان از آن‌ها به عنوان سوبستراهای سلولی درون‌کشتگاهی استفاده کرد. این استفادهٔ اولیه از توری‌ها و شبکه‌های فیبری الکتروریسی‌شده برای کشت سلول و مهندسی بافت نشان داد که انواع متفاوتی از سلول‌ها شامل سلول‌های HFF HEp\_2 و MLE به فیبرها متصل خواهند شد و تکثیر خواهند کرد. فهمیده شد که برخلاف مورفولوژی مسطحی که معمولاً در کشت‌های دوبُعدی می‌بینیم، سلول‌هایی که بر روی فیبرهای الکتروریسی‌شده رشد داده شده بودند، یک مورفولوژی بیشتر گِرد و سه‌بعدی که شبیه به بافت بود را نشان دادند که این حالت معمولاً در محیط‌های درون‌تنی مشاهده می‌شود.

ویژگی‌ها
--------

در بافت زنده، سلول در یک محیط زیستی سه‌بعدی با روابط پیچیده و در هم سلول-سلول و سلول-ماتریکس، و دینامیک حمل و نقل پیچیده‌ای برای مواد مغذی و سلول‌ها قرار دارد. محیط کشت دوبعدیِ استاندارد یا تک‌لایه‌ای برای ترسیم این محیط کافی نیست؛ این مسئله باعث شده‌است که این محیط‌ها معمولاً پیش‌بینی‌کننده‌های قابل اطمینانی برای بررسی عملکرد و سمیت داروها در شرایط درون‌تنی نباشند. اسفروئیدهای سه‌بعدی شباهت بیشتری با شرایط درون‌تنی از نظر ارتباطات سلولی و ایجاد ماتریکس خارج سلولی دارند. این ماتریکس‌ها کمک می‌کنند که سلول‌ها همان‌گونه که در بافت زنده حرکت می‌کنند در داخل اسفروئیدهایشان هم حرکت کنند. بدین ترتیب اسفروئیدها مدل‌های ارتقایافته‌ای برای مهاجرت سلولی، تمایز، بقا و رشد سلول‌ها هستند. به علاوه، کشت‌های سه‌بعدی سلول ترسیم دقیق‌تری را از قطبیت سلولی فراهم می‌کنند، حال آن‌که در محیط دوبعدی، سلول تنها می‌تواند به‌طور جزئی قطبیت پیدا کند. علاوه بر این، سلول‌های رشدیافته در محیط سه‌بعدی، بیان ژن متفاوتی را از آن‌هایی که در محیط دوبعدی کشت داده شده‌اند، نشان می‌دهند. سومین بعدِ رشد سلول، ارتباط فضایی بیشتری را برای ورودی‌های مکانیکی و چسبندگی سلولی فراهم می‌کند که این امر برای اتصال اینتگرین‌ها، انقباض سلولی و حتی پیام‌رسانی درون سلولی ضروری است. انتشار طبیعی حل‌شونده و اتصال آن به پروتئین‌های effector (مثل فاکتورهای رشد و آنزیم‌ها) نیز همچنین وابسته به ماتریکس سه‌بعدی سلول است، بنابراین بعد سوم برای ساخت شیب غلظت حل‌شونده در ابعاد بافتی نیز ضروری است. برای مقاصد غربالگری سم‌شناسی داروها، بررسی بیان ژن سلول‌هایی که در محیط برون‌تنی سه‌بعدی رشد یافته‌اند سودمندتر از سلول‌های رشدیافته در محیط دوبعدی است، چراکه بیان ژن در اسفروئیدهای سه‌بعدی بیشتر به بیان ژن در محیط درون‌تنی شبیه خواهد بود. محیط‌های کشت سه‌بعدی ثبات و طول عمر بهتری از محیط‌های کشت دوبعدی دارند. این به این معناست که آن‌ها برای مطالعات طولانی‌مدت و نشان دادن اثرات طولانی‌مدت داروها مناسب‌ترند. محیط‌های سه‌بعدی همین‌طور به سلول‌ها اجازه می‌دهند که بدون اختلال رشد کنند حال آن‌که در محیط‌های دوبعدی، سلول‌ها نیاز به اجرای منظم تریپسین‌سازی پروتئازها دارند تا مواد مغذی کافی و رشد سلولی طبیعی برایشان فراهم شود. اسفروئیدهای سه‌بعدی تا ۳۰۲ روز در یک آزمایشگاه، کشت داده شده‌اند؛ در حالی‌که هنوز سالم باقی ماندند و بدون سرطانی شدن، رشد داشتند.

روش‌ها
------

امروزه، تعداد زیادی ابزار کشت که ادعا می‌کنند مزیت‌های کشت سه‌بعدی را فراهم می‌کنند، به‌صورت تجاری در دسترس‌اند. به‌طور کلی، اساس این شیوه‌ها می‌تواند به دو نوع از روش‌های کشت سه‌بعدی وابسته به داربست و روش‌های مستقل از داربست، تقسیم شود.

### تکنیک‌های وابسته به داربست

تکنیک‌های وابسته به داربست شامل استفاده از داربست‌های جامد، هیدروژل‌ها و سایر مواد می‌شود.

#### هیدروژل‌ها

از آن‌جایی که ماتریکس خارج سلولی طبیعی برای بقا، تکثیر، تمایز و مهاجرت سلول‌ها مهم است، ماتریکس‌های مختلف هیدروژلی که ساختار ماتریکس خارج سلولی طبیعی را تقلید می‌کنند، به‌عنوان رویکردهای بالقوه‌ای در جهت کشت سلولی شبه‌درون‌جانداری (in vivo)، شناخته می‌شوند. هیدروژل‌ها از شبکهٔ به هم متصلی از حفرات تشکیل شده‌اند که با حفظ و احتباس بالای آب، انتقال مؤثر موادی مثل مواد مغذی و گازها را ممکن می‌سازند. انواع مختلفی از هیدروژل‌ها، از طبیعی گرفته تا سنتزشده، برای کشت‌های سه‌بعدی در دسترس است؛ به‌طور مثال مواردی شامل: هیدروژل‌های استخراج‌شده از ECM حیوانات، هیدروژل‌های پروتئینی، هیدروژل‌های پپتیدی، هیدروژل‌های پلیمری و هیدروژل نانوسلولوزی بر پایهٔ چوب.

داربست هیدروژلی نانوسلولوزی
### تکنیک‌های مستقل از داربست

تکنیک‌های مستقل از داربست، رویکرد دیگری را که غیروابسته به استفاده از داربست است، به کار می‌گیرند. تکنیک‌های مستقل از داربست به‌طور مثال شامل موارد زیر می‌شوند: پلیت‌های با چسبندگی کم، پلیت‌های هنگینگ دراپ، سطح‌های دارای ریزالگو، بیورآکتورهای چرخان، شناوری مغناطیسی و چاپ زیستی سه‌بعدی مغناطیسی.

تکنیک کشت سه‌بعدی یاخته با شناوری مغناطیسی
#### اسفروئیدها

تصویر میکروسکوپ الکترونی یک اسفروئید مزوتلیوما.
اسفروئیدها نوعی مدل‌سازی سلولی سه‌بعدی هستند که شرایط یک محیط سلولی زنده را در مقایسه با مدل سلولی دوبعدی، بهتر شبیه‌سازی می‌کنند، به‌خصوص در زمینهٔ برهمکنش‌های بین سلول‌ها و واکنش‌های بین سلول‌ها و ماتریکس. اسفروئیدها در زمینهٔ مطالعهٔ تغییرات فیزیولوژیکی ویژگی‌های سلول‌ها، کاربرد دارند. همچنین در مطالعهٔ تفاوت‌های ساختاری سلول‌های سالم و سلول‌های توموری و تغییراتی که سلول‌ها در هنگام توموری شدن ایجاد می‌کنند نیز کاربردی هستند. سختی، یکی از ویژگی‌هایی است که برای سنجش سلول‌های سرطانی به‌کار می‌رود. مطالعاتی که بر روی اسفروئیدها با استفاده از موچین‌های میکرومکانیکی صورت گرفته‌است نشان می‌دهد که اسفروئیدهای BT474 و T47T (سرطان پستان) ۳ تا ۶ برابر نرم‌تر از اسفروئیدهای MCF 10A (بافت پوششی طبیعی) هستند. از اسفروئیدهایی که در آن‌ها کشت همراه سلول‌های سرطانی و سالم بوده‌است برای شبیه‌سازی برهم‌کنش سلول‌های سرطانی با سلول‌های سالم استفاده شده‌است.

اسفروئیدها می‌توانند با استفاده از چند شیوهٔ مختلف، کشت داده شوند. یک روش متداول، استفاده از پلیت‌های با چسبندگی سلولی کم (معمولاً یک پلیت ۹۶ ول برای تولید انبوه کشت‌های اسفروئیدی، که تجمعات در کف گرد پلیت سلولی تشکیل می‌شوند) است. اسفروئیدها همچنین می‌توانند با استفاده از شیوهٔ هنگینگ‌دراپ (Hanging drop)، کشت داده شوند؛ این شیوه شامل تشکیل تجمعات سلولی در قطراتی است که از سطح پلیت سلولی آویزان‌اند. یکی دیگر از شیوه‌های در دست بررسی، شامل استفاده از بیورآکتورهای با ظرف دارای دیوارهٔ چرخان است که می‌چرخند و سلول‌ها را کشت می‌دهند و آن‌ها پیوسته در سقوط آزاد هستند و تجمعات را در چند لایه شکل می‌دهند.

ریزسیال‌ها
----------

ساختارهای مختلف سلولی در بدن انسان، نیاز دارند که حتماً رگ‌زایی داشته باشند تا بتوانند مواد مغذی را دریافت کنند و تبادلات گازی را که به بقایشان کمک می‌کند، انجام دهند. به همین شیوه، کشت‌های سه‌بعدی سلول در محیط‌های برون‌تنی نیز نیاز به سطوح مشخصی از گردش مایع دارند. نبود چنین گردشی در محیط‌های سه‌بعدی و متراکم که ممکن است همهٔ سلول‌ها به‌طور مناسبی در معرض مواد مغذی قرار نگیرند، می‌تواند مشکل‌ساز باشد. این مسئله خصوصاً در مورد کشت هپاتوسیت‌ها اهمیت دارد چرا که کبد اندامی است که سیستم عروقی وسیعی دارد. در یک مطالعه، سلول‌های هپاتوسیت و سلول‌های عروقی با هم در داربستی کلاژنی در بین کانال‌های میکروفلوئیدیک، کشت داده شدند و رشد سلول‌ها در محیط ایستا با محیط دارای جریان مقایسه شد؛ و نیاز به مدل‌هایی با بافت‌ها و ریزشبکه‌های عروقی نشان داده شد.

انتقادها
--------

هیچ‌یک از تکنیک‌های سه‌بعدی تا کنون نتوانسته‌است در مقیاسی وسیع، جایگزین تکنیک‌های دوبعدی شود؛ این مسئله فرایندهای اکتشاف دارو را نیز شامل می‌شود. تکنیک‌های سه‌بعدی حاضر، بدون محدودیت نیستند. این محدودیت‌ها شامل مواردی نظیر مقیاس‌پذیری (انجام فرایند در مقیاس‌های دلخواه)، تکرارپذیری، حساسیت و سازگاری با دستگاه‌های غربالگری با توان بالا (HTS) می‌شود. HTS مبتنی بر سلول، بر پایهٔ تعیین سریع پاسخ سلول به برهم‌کنش آن با دارو استوار است (مثل توان زیستن سلول در دوزهای مختلف، برهم‌کنش سلول-سلول و سلول-ماتریکس یا مهاجرت سلولی)، اما تست‌های در دسترس فعلی برای کشت سلولی سه‌بعدی، بهینه‌سازی نشده‌اند. چالش دیگری که پیش روی کشت سه‌بعدی است، تعداد کم داده‌ها و انتشاراتی است که در مورد مکانیسم‌های برهم‌کنش دارو، تمایز سلولی و پیام‌رسانی سلولی در محیط سه‌بعدی in vitro سخن می‌گویند و همبستگی نتایجشان را با پاسخ دارو در محیط in vivo می‌سنجند. اگر چه تعداد موضوعات منتشر شده در مورد کشت سه‌بعدی سلول به‌سرعت در حال افزایش است، اما تعیین مشخصات بیوشیمایی محدود فعلی برای بافت‌های سه‌بعدی، اعتماد لازم برای پذیرش شیوه‌های سه‌بعدی را به‌عنوان تکنیکی جدید، کاهش می‌دهد. به هر میزان که این چالش‌ها برآورده شوند، به همان سرعت هم کشت سه‌بعدی سلول به‌عنوان ابزاری متداول پذیرفته می‌شود.

در مورد استفاده از اسفروئیدها به‌عنوان مدل‌های سرطانی نیز مشکلاتی وجود دارد. با وجود مزیت‌های کشت بافت سه‌بعدی، از اسفروئیدهای سه‌بعدی به‌علت چالش‌برانگیز یا غیرممکن بودن کنترل دقیق گرادیان مولکول‌های حل‌شده در سازهٔ اسفروئیدی و تعیین دقیق ویژگی سلول‌ها در این گرادیان‌های پیچیده انتقاد می‌شود.

منابع
-----

1. 1 2 3  Fey, Stephen; Wrzesinski, Krzysztof (2013). "5". In Boucher, Alexis (ed.). *Valproic Acid* (PDF). Nova Science Publishers, Inc. pp. 141–165. ISBN 978-1-62417-952-5. Archived from the original (PDF) on 2 December 2013. Retrieved 19 January 2018.
2. ↑  MERIT Award Recipient: Mina J. Bissell, Ph.D. (n.d.). Retrieved June 16, 2016, from  بایگانی‌شده در ۱۷ سپتامبر ۲۰۲۰ توسط Wayback Machine
3. ↑  Simon, Eric M. (1988). "NIH PHASE I FINAL REPORT: FIBROUS SUBSTRATES FOR CELL CULTURE (R3RR03544A) (PDF Download Available)". *ResearchGate* (به انگلیسی). Retrieved 2017-05-22.
4. ↑  Marx, Vivien (11 April 2013). "A Better Brew" (PDF). *Nature*. Retrieved July 9, 2013.
5. ↑  Souza, Glauco (14 March 2010). "Three-dimensional tissue culture based on magnetic cell levitation". *Nature Nanotechnology*. **5** (4): 291–296. doi:10.1038/nnano.2010.23. Retrieved July 9, 2013.
6. 1 2 3 4  Pampaloni, Francesco (October 2007). "The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue". *Nature Reviews*. **8** (10): 839–845. doi:10.1038/nrm2236. Retrieved July 9, 2013.
7. ↑  Boudreau, Nancy (5 May 2006). "A pericellular collagenase directs the 3-dimensional development of white adipose tissue". *Cell*. **125** (3): 577–91. doi:10.1016/j.cell.2006.02.050. PMID 16678100.
8. ↑  Yamada, KM (24 August 2007). "Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D". *Cell*. **130** (4): 601–10. doi:10.1016/j.cell.2007.08.006. PMID 17719539.
9. ↑  Friedrich, Seidel (12 February 2009). "Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach". *Nature Protocols*. **4** (3): 309–324. doi:10.1038/nprot.2008.226. PMID 19214182. Retrieved July 9, 2013.
10. ↑  Prestwich, Glenn (15 August 2007). "Simplifying the extracellular matrix for 3-D cell culture and tissue engineering: a pragmatic approach". *Journal of Cellular Biochemistry*. **101** (6): 1370–83. doi:10.1002/jcb.21386. PMID 17492655.
11. 1 2  Griffith, Linda; Melody A. Swartz (March 2006). "Capturing complex 3D tissue physiology in vitro". *Nature Reviews*. **7** (3): 211–224. doi:10.1038/nrm1858. Retrieved July 9, 2013.
12. ↑  Lee, J; Cuddihy MJ; Kotov NA. (14 March 2008). "Three-dimensional cell culture matrices: state of the art". *Tissue Engineering Part B: Reviews*. **14** (1): 61–86. doi:10.1089/teb.2007.0150. PMID 18454635.
13. ↑  Haycock JW. (2011). "3D cell culture: a review of current approaches and techniques". *Methods Mol Biol*. **695**: 1–15. doi:10.1007/978-1-60761-984-0\_1.
14. ↑  Prestwich, G.D. (15 August 2007). "Simplifying the extracellular matrix for 3-D cell culture and tissue engineering: a pragmatic approach". *Journal of Cellular Biochemistry*. **101** (6): 1370–83. doi:10.1002/jcb.21386. PMID 17492655.
15. ↑  Suuronen, E. J.; Sheardown, H.; Newman, K.D.; McLaughlin, C.R. & Griffith, M. (2005). "Building in vitro Models of Organs". *Building in vitro Models of Organs*. **244**: 137–173. doi:10.1016/s0074-7696(05)44004-8.
16. ↑  Louekari, K (2004). "Status and prospects of in vitro tests and risk assessment". *Altern. Lab. Anim*. **32**: 431–435.
17. ↑  Knight, B.; et al. (2000). "Visualizing Muscle Cell Migration in situ". *Curr. Biol*. **10**: 576–585. doi:10.1016/s0960-9822(00)00486-3.
18. ↑  Roskelley, CD; Desprez PY; Bissell MJ (1994). "Extracellular matrix-dependent tissue-specific gene expression in mammary epithelial cells requires both physical and biochemical signal transduction". *Proc. Natl. Acad. Sci. USA*. **91**: 12378–12382. doi:10.1073/pnas.91.26.12378.
19. 1 2  Krzysztof Wrzesinski; et al. (2013). "HepG2/C3A spheroids exhibit stable physiological functionality for at least 24 days after recovering from trypsinisation". *Toxicol. Res*. **2**: 163–172. doi:10.1039/C3TX20086H.
20. ↑  "After trypsinisation, 3D spheroids of C3A hepatocytes need 18 days to re-establish similar levels of key physiological functions to those seen in the liver" (PDF). Archived from the original (PDF) on 2 April 2015. Retrieved 3 February 2018.
21. ↑  M.W. Tibbitt, K.S. Anseth Hydrogels as Extracellular Matrix Mimics for 3D Cell Culture Biotechnol Bioeng. 2009 Jul 1;103(4):655-63.
22. ↑  H. Geckil et al. Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics Nanomedicine (Lond). 2010 Apr; 5(3): 469–484.
23. ↑  Xiang X, Phung Y, Feng M, Nagashima K, Zhang J, Broaddus VC, et al. (January 2011). "The development and characterization of a human mesothelioma in vitro 3D model to investigate immunotoxin therapy". *PLOS ONE*. **6** (1): e14640. Bibcode:2011PLoSO...614640X. doi:10.1371/journal.pone.0014640. PMC 3031536. PMID 21305058.
24. ↑  Fennema, Eelco, et al. "Spheroid Culture as a Tool for Creating 3D Complex Tissues. "
Trends in Biotechnology, vol. 31, ser. 02, Feb. 2013. 02. doi: 10.1016/j.tibtech.2012.12.003 PMID 23336996
25. ↑  Jiang Y, Pjesivac-Grbovic J, Cantrell C, Freyer JP. A multiscale model for avascular tumor growth. Biophys J 2005;89(6):3884–3894. doi: 10.1529/biophysj.105.060640 pmid 16199495
26. ↑  Guttilla, I.K. , Phoenix, K.N. , Hong, X. et al. Breast Cancer Res Treat (2012) 132: 75. doi:10.1007/s10549-011-1534-y PMID 21553120
27. ↑  Jaiswal, Devina, Norah Cowley, Zichao Bian, Guoan Zheng, Kevin P. Claffey, and Kazunori Hoshino. 2017. "Stiffness Analysis of 3D Spheroids using Microtweezers." PLoS One 12 (11). doi:10.1371/journal.pone.0188346 PMID 29166651
28. ↑  Kunz-Schughart, Leoni A, et al. "A Heterologous 3-D Coculture Model of Breast Tumor Cells and Fibroblasts to Study Tumor-Associated Fibroblast Differentiation. "Experimental cell research, 2001 doi:10.1006/excr.2001.5210 PMID 11339826
29. ↑  Fennema, Eelco, et al. "Spheroid Culture as a Tool for Creating 3D Complex Tissues. "Trends in Biotechnology, vol. 31, ser. 02, Feb. 2013. 02. doi: 10.1016/j.tibtech.2012.12.003PMID 23336996
30. ↑  Xu, Xian, et al. "Three-Dimensional in Vitro Tumor Models for Cancer Research and Drug Evaluation. "Biotechnology Advances, 10 Aug. 2014. doi: 10.1016/j.biotechadv.2014.07.009 PMID 25116894
31. ↑  Chung, Seok; Kamm, Roger D.; Sudo, Ryo; et al. (July 2009). "Transport-Mediated Angiogenesis in 3D Epithelial Coculture". *The Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology (FASEB)*. **23** (7): 2155–2164. doi:10.1096/fj.08-122820. PMC 2718841. PMID 19246488.

* کتاب کشت سه‌بعدی سلول: اصول و روش‌ها. تألیف اسماعیل صدرالدینی و همکاران.
* کتاب کشت سه‌بعدی سلول: جان هایکوک، ترجمهٔ اسماعیل صدرالدینی و همکاران