Prozesu metaboliko baten ingeniaritzaren urrats batzuk.
**Ingeniaritza metabolikoa** zelulen barruko prozesu genetikoak eta erregulatzaileak optimizatzeko tekniken multzoa da, substantzia jakin baten zelulen ekoizpena handitzeko. Prozesu horiek erreakzio biokimikoek eta entzimek osatzen dituzten sare kimikoak dira. Hauek zelulei lehengaiak zelularen biziraupenerako beharrezkoak diren molekuletan bihurtzeko aukera ematen diete. Ingeniaritza metabolikoaren helburuak sare horiek matematikoki modelatzea, produktu erabilgarrien errendimendua kalkulatzea eta produktu horien ekoizpena mugatzen duten sareko zatiak adieraztea dira. Ingeniaritza genetikoko teknikak, beraz, sarea aldatzeko erabil daitezke muga horiek arintzeko helburuarekin. Beste behin, aldatutako sarea modelatu daiteke produktuaren errendimendu berria kalkulatzeko.

Ingeniaritza metabolikoaren azkeneko helburua organismo horiek industria-eskalan modu errentagarrian baliozko substantziak ekoizteko erabili ahal izatea da. Gaur egungo adibide batzuk garagardoaren, ardoaren, gaztaren, farmakoen eta beste produktu bioteknologiko batzuen ekoizpena dira. Ingeniaritza metabolikorako erabili ohi diren estrategietako batzuk hauek dira: (1) bidezidor biosintetikoaren abiadura mugatzen duen entzima kodetutako genearen gainadierazpena, (2) bide metaboliko lehiakideen blokeoa, (3) adierazpen genetiko heterologoa eta (4) ingeniaritza entzimatikoa.

Zelulek bidezidor metaboliko horiek erabiltzen dituztenez bizirauteko, aldaketek eragin drastikoak izan ditzakete zelulen bideragarritasunean. Hortaz, ingeniaritza metabolikoan intereseko substantziaren ekoizpenaren eta zelulen bideragarritasunaren arteko orekak bilatu behar dira. Horregatik, entzima metabolikoak kodetzen dituzten geneak zuzenean ezabatu edota gainadierazi beharrean, gaur egungo xedea zelulen sare erregulatzaileetan ardaztea da, metabolismoa eraginkortasunez diseinatzeko.

Historia eta aplikazioak
------------------------

Metabolismo zelularra optimizatua izan daiteke industria mailan erabiltzeko. 
Iraganean, intereseko metabolito baten produktibitatea handitzeko, mikroorganismo bat genetikoki aldatzen zen kimikoki induzitutako mutazio baten bidez. Ondoren, aukeratzen zen intereseko metabolitoa gainadierazten zuen andui mutantea. Hala ere, teknika horren arazo nagusietako bat zen ez zela metabolito hori ekoizteko bide metabolikoa aztertzen, eta, ondorioz, ez ziren ezagutzen ekoizpenaren mugak eta aldatu behar ziren bide metabolikoaren entzima garrantzitsuak.

1990eko hamarkadan ingeniaritza metabolikoa izeneko teknika berri bat sortu zen. Teknika honek mikroorganismo baten ibilbide metabolikoa aztertzen du eta ekoitzi nahi diren konposatuen produkzioan dituen mugak eta ondorioak zehazten ditu. Ostean, ingeniaritza genetikoa erabiltzen da muga horiek arintzeko. Ingeniaritza metabolikoaren arrakastaren adibide batzuk honako hauek dira; (i) *Corynebacterium glutamicum*-en lisina ekoizteko mugak identifikatzea eta gene berriak txertatzea muga horiek arintzeko eta ekoizpena hobetzeko, (ii) alderantzizko beta-oxidazioa deritzon gantz-azidoen biosintesirako bide berri baten diseinua, zeina bide natiboa baino eraginkorragoa den gantz-azidoen eta alkoholen ekoizpenean, geroago produktu kimiko eta erregaietan katalitikoki bihur daitezkeenak, (iii) *E. coli*-k sortutako DAHP metabolito aromatikoaren ekoizpena hobetzea, zeina aminoazido aromatikoak ekoizteko bitartekari bat den. Fluxu metabolikoaren analisiaren bitartez, DAHPren errendimendu maximo teorikoa erabilitako glukosa molekula bakoitzeko 3/7 zela zehaztu zen. Horren arrazoia da glukosaren karbonoaren zati bat karbono dioxido gisa galtzen dela, DAHP ekoizteko erabili beharrean. Gainera, DAHP ekoizteko erabiltzen den metabolitoetako bat (PEP edo fosfoenolpirubatoa) pirubatoan (PYR) bihurtzen ari zen glukosa zelularen barrura garraiatzeko, eta, beraz, ez zen erabilgarria DAHP ekoizteko. PEP-ren eskasia arintzeko eta errendimendua hobetzeko, Patnaik et al. *E. coli*-n ingeniaritza genetikoa erabili zuten PYR berriro PEP bihurtzen duen erreakzio bat sartzeko. Horrela, glukosa zelularen barrura garraiatzeko erabiltzen zen PEP birsortzen da eta DAHP fabrikatzeko erabil daiteke. Honen bitartez 6/7-ko errendimendu teoriko berri bat lortu zen, *E. coli* sistema natiboaren bikoitza. 

Industria mailan, ingeniaritza metabolikoa gero eta egokiagoa eta errentagarriagoa da. Bioteknologiaren Industriaren Erakundearen arabera, "eraikitzen ari dira 50 biofindegi instalazio baino gehiago Ipar Amerika osoan, ingeniaritza metabolikoa aplikatzeko biomasa berriztagarritik abiatuta bioerregaien eta produktu kimikoen ekoizpenari, berotegi-efektuko gasen emisioak murrizten lagun dezaketenak". Bioerregai potentzialek kate laburreko alkoholak eta alkanoak (gasolina ordezkatzeko), gantz-azidoen eta gantz-alkoholen ester metilikoak (gasolioa ordezkatzeko) eta gantz-azidoetan eta isoprenoideetan oinarritutako bioerregaiak (gasolioa ordezkatzeko) barne hartzen dituzte.

Ingeniaritza metabolikoak eboluzionatzen jarraitzen du eraginkortasunari eta prozesuei dagokienez, biologia sintetikoaren arloko aurrerapenen eta metabolitoek eragindako kalteak ulertzeko eta konpontzeko edo prebenitzeko aurrerapenen laguntzari esker. Ingeniaritza metabolikoko lehen esperimentuek frogatu zuten bitartekari erreaktiboen metaketak diseinatutako bideetan fluxua mugatu dezakeela eta zelula ostalarientzat kaltegarria izan daitekeela kalteak kontrolatzeko sistemak falta badira edo desegokiak badira. Biologia sintetikoaren ikertzaileek bide genetikoak optimizatzen dituzte, eta horiek eragina dute emaitza metaboliko zelularretan. DNA sintetizatuaren kostuaren azken aldiko jaitsierak eta zirkuitu genetikoen aurrerapenek ingeniaritza metabolikoaren bitartez lortu nahi diren emaitzak lortzeko duen gaitasunean laguntzen dute.

Fluxu metabolikoaren analisia
-----------------------------

### Bide metabolikoen sorrera analisirako

Prozesuaren lehen urratsa, organismo baten metabolismoa hobetuz edo aldatuz lortu nahi den helburua finkatzea da. Helburu hori lortzeko, erreakzio eta bide metabolikoak ikertu behar dira eta horretarako, erreferentzia-liburuak eta online datubaseak erabiltzen dira; izan ere, datubase horiek informazio genomiko eta kimiko ugari daukate, baita metabolismoaren eta beste prozesu zelular batzuen bideak ere. Aurretik egindako ikerketatik abiatuta, organismo bat aukeratuko da; organismoaren bide metabolikoa nahi den bidetik hurbil egotea, organismoa mantetzeko kostuak eta organismoaren bidea aldatzeko erraztasuna kontuan hartuz. Adibidez, *Esterichia coli* ingenieritza metabolikoan asko erabiltzen den bakterioa da, batik bat, mantentzeko eta aldatzeko duen erraztasunagatik. Aukeratutako organismoak nahi den emaitza lortzeko bide osoa ez badu, falta diren entzimak sortzen dituzten geneak sartu behar zaizkio organismoari.

### Bide metaboliko bat analizatzen

Produktuaren errendimendu teorikoa edo zelularen erreakzio-fluxuak aurkitzeko, ibilbide metaboliko osoa matematikoki molda daiteke. Fluxua, sarean erreakzio jakin batek jasaten duen abiadurari deritzo. Bide metabolikoen analisi errazak eskuz egin daitezke, baina gehienen kalkuluak egiteko informatika-programak beharrezkoak dira, programa horiek aljebra linealeko algoritmo konplexuak erabiltzen dituztelarik. Sare bat ebazteko, jarraian erakusten den sistema jakin batzuetarako ekuazioa erabiliko da. Ekuazioan, erreakzio garrantzitsuei eta horien fluxuei buruzko beharrezko informazioa sartzea ezinbestekoa da. Alde batetik, erreakzioari buruzko informazioa, hala nola, erreaktiboak eta estekiometria, Gx eta Gm matrizeetan dago. Bestetik, Vm eta Vx matrizeetan erreakzio garrantzitsuen fluxuak ageri dira, non ekuazioa ebaztean fluxu ezezagun guztien balioak ere egongo diren (Vx-en daudenak). 

{\displaystyle V\_{x}=({G\_{x}})^{-1}\*(G\_{m}\*V\_{m})}

### Manipulazio genetiko optimoen zehaztea

Sareko erreakzioen fluxuak ebatzi ondoren, nahi den produktuaren errendimendua maximizatzeko zer erreakzio alda daitezkeen zehaztu behar da. Zer manipulazio genetiko espezifiko egin behar den zehazteko, algoritmo konputazionalak erabiltzen dira, hala nola, OptGene edo OptFlux. Algoritmo horiek, geneak gainadierazi, ezabatu edo zelula batean sartu behar diren gomendatzen du, honen helburua, nahi den produktuaren ekoizpena handitzea izanik. Adibidez, erreakzio jakin baten fluxua baxua bada, produktuaren kantitatea mugatuz, software-ak erreakzio hori katalizatzen duen entzima zelulan gainadieraztea gomendatu dezake, erreakzioaren fluxua handitu nahian. Prozesu honetan egin beharreko manipulazio genetikoak biologia molekularreko teknika estandarren bidez egin daitezke. Geneak organismo batean gainadierazi edo ezaba daitezke, bidean duten eraginaren eta azken helburuaren arabera.

### Neurketa esperimentalak

Eredu ebazgarri bat sortzeko, sarritan beharrezkoa da dagoeneko ezagunak diren edo esperimentalki neurtuta dauden fluxu batzuk izatea. Gainera, manipulazio genetikoek sare metabolikoan duten eragina egiaztatzeko (ereduarekin lerrokatzen direla ziurtatzeko), sareko fluxuak esperimentalki neurtu behar dira. Erreakzio-fluxuak neurtzeko, karbono-13 markaketa isotopikoa duten karbono-fluxuen neurketak egiten dira. Organismoa, karbono-12 atomoen ordez, karbono-13 atomoak dituzten molekulez osatutako nahasketa baten bidez elikatzen da. Molekula horiek sarean erabili ondoren, ondorengo metabolitoak ere karbono-13 karbonoekin markatzen dira, hauek haien egituretan barneratzen dituztelarik. Metabolitoen markaketa patroi espezifikoa sareko erreakzio-fluxuek zehazten dute eta markaketa patroi horiek neurtzeko, hainbat teknika erabil daitezke, esaterako, gas kromatografia-masa espektrometria (GC-MS).

Erreferentziak
--------------

1. ↑   Yang, Yea-Tyng; Bennett, George N.; San, Ka-Yiu.  (1998). «Genetic and metabolic engineering» *Electronic Journal of Biotechnology* ISSN 0717-3458..
2. ↑   Milne, N.; Thomsen, P.; Mølgaard Knudsen, N.; Rubaszka, P.; Kristensen, M.; Borodina, I..  (2020-07). «Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for the de novo production of psilocybin and related tryptamine derivatives» *Metabolic Engineering* 60: 25–36. doi:10.1016/j.ymben.2019.12.007. ISSN 1096-7176..
3. ↑   Kulkarni, R.  (2016-03). «Metabolic engineering» *Resonance* 21 (3): 233–237. doi:10.1007/s12045-016-0318-4. ISSN 0971-8044..
4. ↑   Vemuri, Goutham N.; Aristidou, Aristos A..  (2005). «Metabolic Engineering in the -omics Era: Elucidating and Modulating Regulatory Networks» *Microbiology and Molecular Biology Reviews* 69 (2): 197–216. doi:10.1128/mmbr.69.2.197-216.2005. ISSN 1092-2172..
5. 1 2   Torres, Néstor V.; Voit, Eberhard O..  (2002-12-19). *Pathway Analysis and Optimization in Metabolic Engineering.*  Cambridge University Press ISBN 978-0-521-80038-9..
6. ↑   N. Stephanopoulos, G.. *Metabolic engineering : principles and methodologies.*  ISBN 0-12-666260-6. PMC 1012527921..
7. ↑   Dellomonaco, Clementina; Clomburg, James M.; Miller, Elliot N.; Gonzalez, Ramon.  (2011-08). «Engineered reversal of the β-oxidation cycle for the synthesis of fuels and chemicals» *Nature* 476 (7360): 355–359. doi:10.1038/nature10333. ISSN 0028-0836..
8. ↑   Patnaik, R; Liao, J C.  (1994-11). «Engineering of Escherichia coli central metabolism for aromatic metabolite production with near theoretical yield» *Applied and Environmental Microbiology* 60 (11): 3903–3908. doi:10.1128/aem.60.11.3903-3908.1994. ISSN 0099-2240..
9. ↑   Peralta-Yahya, Pamela P.; Keasling, Jay D..  (2010-01-18). «Advanced biofuel production in microbes» *Biotechnology Journal* 5 (2): 147–162. doi:10.1002/biot.200900220. ISSN 1860-6768..
10. ↑   Martin, Vincent J J; Pitera, Douglas J; Withers, Sydnor T; Newman, Jack D; Keasling, Jay D.  (2003-07-01). «Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids» *Nature Biotechnology* 21 (7): 796–802. doi:10.1038/nbt833. ISSN 1087-0156..
11. ↑   Withers, Sydnor T.; Gottlieb, Shayin S.; Lieu, Bonny; Newman, Jack D.; Keasling, Jay D..  (2007-10). «Identification of isopentenol biosynthetic genes from Bacillus subtilis by a screening method based on isoprenoid precursor toxicity» *Applied and Environmental Microbiology* 73 (19): 6277–6283. doi:10.1128/aem.00861-07. ISSN 0099-2240. PMID 17693564. PMC 2075014..
12. ↑   **(Ingelesez)** Stephanopoulos, Gregory.  (2012-11-16). «Synthetic Biology and Metabolic Engineering» *ACS Synthetic Biology* 1 (11): 514–525. doi:10.1021/sb300094q. ISSN 2161-5063. PMID 23656228..
13. ↑  University of California - Los Angeles (2008, December 18). "Genetic Modification Turns E. Coli Bacteria Into High Density Biofuel". *ScienceDaily.* Retrieved December 7, 2011, from
14. ↑  Schellenberger, J. Que, R. Fleming, R. et al. (2011). "Quantitative prediction of cellular metabolism with constraint-based models: the COBRA Toolbox v2.0". *Nature Protocols.* 6(9):1290-1307
15. ↑  Rocha, I. Maia, P. Evangelista, P. et al. (2010). "OptFlux: an open-source software platform for in silico metabolic engineering". BMC Sys Biol. 45(4)
16. ↑  Work, T.S. Hinton, R. Work, E. Dobrota, M. Chard, T. (1980). "Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology". v.8
17. ↑  Wiechert, W. and de Graaf, A.A. (2000). "Bidirectional Reaction Steps in Metabolic Networks: Modeling and Simulation of Carbon Isotope Labeling Experiments". *Biotechnol. Bioeng.* 55(1):101-117

Ikus, gainera
-------------

* Bakterioen transformazioa
* Bioerreaktorea
* Ingeniaritza genetikoa
* Zirkuitu biologiko sintetikoa
* Biologia sintetikoa

Kanpo estekak
-------------

* Biotechnology Industry Organization (BIO) -en weborria:

|  |  |
| --- | --- |
| Autoritate kontrola | 
* **Wikimedia proiektuak**
* Wd Datuak: Q6822347
* **Medikuntzako identifikadoreak**
* MeSH: D060847

 |

* Wd Datuak: Q6822347