Beckman DU640 UV/Vis-spektromeeter
**Ultravioletne-nähtav spektroskoopia** ehk **ultravioletne-nähtav spektrofotomeetria** (**UV/Vis** ehk **UV-Vis**) on absorptsiooni- või peegeldusspektroskoopia ultravioletses (190–400 nm) ja nähtavas (400–800 nm) spektrialas. See tähendab, et kasutatakse valgust nähtavas ja sellele lähedal asuvas (lähi-UV ja lähiinfrapuna (NIR)) vahemikus. Absorptsioon või peegeldus nähtavas alas on otseselt seotud analüüsitava kemikaali värviga. Selles elektromagnetilise spektri regioonis toimub molekulides elektronergastus. See meetod on komplementaarne fluorestsentsspektroskoopiaga. Fluorestsents toimub relaksatsioonil ergastatud olekust põhiolekusse. Absorptsioon tekib ergastusel põhiolekust ergastatud olekusse.

Rakendused
----------

UV/Vis-spektri näide
UV/Vis-spektroskoopiat kasutatakse tavapäraselt analüütilises keemias erinevate analüütide määramiseks. Sellisteks analüütideks on siirdemetallide ioonid, konjugeeritud orgaanilised ühendid ja bioloogilised makromolekulid. Analüüs tehakse tavaliselt lahuses.

* Siirdemetalli ioonide lahused võivad olla värvilised (absorbeerivad nähtavat valgust), sest metalli aatomites olevaid d-elektrone on võimalik ergastada ühelt elektronergastuse nivoolt teisele. Erinevad lisandid mõjutavad tugevalt metalliioone sisaldava lahuse värvust. Sellisteks lisanditeks on erinevad anioonid ja ligandid. Näiteks vasksulfaadi lahja lahus on helesinine. Sellele ammoniaaki lisades tumeneb lahuse värvus ja neeldumismaksimumi lainepikkus muutub (λmax).
* Orgaanilised ühendid, milles eelistatult esineb tugev konjugatsioon (nt DNA, RNA, valgud), neelavad valgust elektromagnetkiirguse spektri UV- või nähtavas alas. Kui tegu on vees lahustuva ainega, kasutatakse analüüsides lahustina vett. Orgaanilistes solventides lahustuvate ainete jaoks kasutatakse etanooli. (Orgaanilised lahustid võivad omada spektris iseloomulikku neelduvust UV-alas. Seetõttu ei ole kõik lahustid sobivad UV/Vis-spektroskoopia jaoks. Näiteks etanool neelab nõrgalt kõigi lainepikkuste juures.) Lahusti polaarsus ja pH võivad mõjutada orgaanilise ühendi neeldumisspektrit. Näiteks türosiini neeldumismaksimum ja molaarne neeldumiskoefitsient suurenevad, kui pH-d muuta 6-lt 13-le või lahusti polaarsust vähendada.
* Elektrondoonor-aktseptor komplekside värvused on tihti liiga intensiivsed kvantitatiivsete mõõtmiste jaoks.

Beeri-Lamberti seadus ütleb, et lahuse neelduvus on võrdeline absorbeeriva aine kontsentratsiooni ja lahusekihi paksusega. Fikseeritud lahusekihi paksuse korral on UV/Vis-spektroskoopiaga võimalik määrata neelava aine kontsentratsioon lahuses. Selleks on vaja teada, kui kiiresti neelduvus muutub kontsentratsiooni suurenemisel. Seda saab leida molaarsete neeldumiskoefitsientide tabelitest või määrata kalibreerimisgraafikult.

UV/Vis-spektromeetrit saab kasutada HPLC (kõrgefektiivne vedelikkromatograafia) detektorina. Analüüdi olemasolu annab signaali, mis on proportsionaalne kontsentratsiooniga. Täpsete tulemuste saavutamiseks on vaja analüüdi signaali tundmatus lahuses võrrelda referentsaine signaaliga. See lähenemine sarnaneb kalibreerimisgraafiku meetodiga.

Absorptsiooni piikide lainepikkus korreleeruvad molekulis olevate keemiliste sidemetega. See aitab määrata, milliseid funktsionaalrühmi molekul sisaldab. Woodwardi-Fieseri reeglid on kogum empiirilisi vaatlusi, mida kasutatakse λmax ennustamiseks. λmax on kõige intensiivsema neeldumise lainepikkus konjugeeritud orgaanilistes ühendites, nagu näiteks dieenides ja ketoonides. Ainult spektri järgi siiski ei saa mingi proovi kohta lõplikke järeldusi teha. Neeldumisspektrit võivad mõjutada solvendi iseloom, lahuse pH, temperatuur, kõrge elektrolüüdi kontsentratsioon ja segavate ainete olemasolu. Eksperimendi parameetrite (nt spektromeetri pilulaius) varieerimine muudab samuti uuritava aine spektrit.

Beeri-Lamberti seadus
---------------------

UV/Vis-spektroskoopias kasutatakse enamasti lahuses ultravioletset või nähtavat kiirgust neelava aine kontsentratsiooni määramiseks Beeri-Lamberti seadust:

A=log10 (*I0/I*) = *ε\*c\*L*

Selles valemis on *A* neelduvus, *I0* esialgne valguse intensiivsus antud lainepikkusel, *I* proovi läbinud valguse intensiivsus, *L* optiline teepikkus ja c neelava aine kontsentratsioon. Igale ainele ja lainepikkusele on omane konstant *ε*(kasutatakse ka tähistust a), mida kutsutakse molaarseks neeldumisteguriks või ekstinktsioonikoefitsiendiks. See konstant on molekulile omane fundamentaalne omadus antud solvendis kindlal temperatuuril ja rõhul. Ühikuteks on 1/*M\*cm* või *AU/M\*cm*.

Neelduvust ja ekstinktsioonikoefitsienti defineeritakse mõningatel juhtudel naturaallogaritmiga kümnendlogaritmi asemel.

Beeri-Lamberti seadus on kasulik paljude ühendite karakteriseerimisel, aga samas ei ole universaalselt rakendatav kõikide ainete jaoks. Palju keerulisem kontsentratsiooni ja neeldumisteguri vaheline sõltuvus võib esineda näiteks väga suurte, keeruliste orgaaniliste molekulide (ksülenooloranž, toluüleenpunane jt.) korral.

### Praktilised kaalutlused

Beeri-Lamberti seadusel on teatud nõuded, mis peavad olema eksperimentaalselt tagatud. Proovi keemiline koostis ja füüsikaline keskkond võivad muuta ekstinktsioonikoefitsienti. See tähendab, et proovi keemilised ja füüsikalised tingimused peavad ühtima referentsmõõtmiste omadega, et tagada tulemuste õigsus.

UV/Vis-spektromeeter
--------------------

Instrumenti, mida kasutatakse UV/Vis-spektroskoopias, kutsutakse UV/Vis-spektromeetriks (UV/Vis-spektrofotomeeter). Instrument mõõdab proovi läbiva valguse intensiivsust (*I*) ja võrdleb seda valguse intensiivsusega enne proovi läbimist (*I0*). *I/I0* suhet nimetatakse läbilaskvuseks ja seda väljendatakse tavaliselt protsentuaalselt (%T). 
Neelduvus (*A*) sõltub läbilaskvusest:

*A = −log (%T/100%)*

UV/Vis-spektromeetrit on võimalik seadistada peegelduse mõõtmiseks. Sel juhul mõõdab spektromeeter proovist peegeldunud valguse intensiivsust (*I*) ja võrdleb seda referentsmaterjalilt (nt valge plaat) peegeldunud valguse intensiivsusega (*I0*). *I / Io* suhet nimetatakse peegeldusteguriks ja seda väljendatakse protsentuaalselt (%R).

Spektromeetri põhilised osad on valgusallikas, proovikamber, monokromaator, et eraldada erineva lainepikkusega valgus ja detektor. Kiirgusallikaks on tihti volfram hõõgniit (300–2500 nm), deuteeriumlamp, mis annab pidevat kiirgust ultravioletses alas (190–400 nm), ksenoonlamp, mis on pidev lainepikkustel 160–2000 nm, ja viimasel ajal ka valgusdioodid (LED) nähtava valguse jaoks. Detektoriks on tavaliselt fotoelektronkordisti, fotodiood või fotodioodide rivi. Fotodioode ja fotoelektronkordistit kasutatakse skaneeriva monokromaatoritega, mis filtreerivad valgust nii, et ainult kindla lainepikkusega valgus jõuab detektorisse samal ajal. Skaneeriv monokromaator liigutab difraktsioonivõret läbi kõikide lainepikkuste nii, et intensiivsust on võimalik mõõta lainepikkuse funktsioonina. 

Lihtsa ühekiirelise spektromeetri skeem
Spektrofotomeeter võib olla kas ühe- või kahekiireline. Ühekiirelises instrumendis läbib prooviküvetti kogu pealelangev valgus. *Io* mõõdetakse proovi küvetikambrist eemaldades. See on kõige varajasem spektromeetri tüüp, mis sellegipoolest leiab laialdast kasutust õppe- ja tööstuslaborites.

Kahekiirelises instrumendis jagatakse valguskiir enne proovini jõudmist kaheks. Üht kiirt kasutatakse referentsiks ja teine läbib proovi. Referentskiire intensiivsus loetakse 100% läbitavuseks (neelduvus puudub) ja saadud mõõtetulemus on nende kahe kiire intensiivsuste suhe. Mõnel kahekiirelisel instrumendil on kaks detektorit (fotodioodi) ning referentskiire ja proovi läbiva kiire intensiivsus mõõdetakse samal ajal. Teist tüüpi instrumentides läbivad mõlemad kiired katkestit, mis laseb korraga läbi ainult ühe kiire. Detektor mõõdab kordamööda proovi läbiva kiire ja referentskiire intensiivsust. Katkesti tsüklis võib olla üks või mitu tumedat intervalli. Sel juhul on võimalik mõõdetud intensiivsusi korrigeerida eraldades nendest tumeda intervalli intensiivsuse.

UV/Vis-spektroskoopias on proovideks enamasti vedelikud, kuigi on võimalik mõõta gaaside ja isegi tahkiste neelduvust. Proov asetatakse tavaliselt läbipaistvasse rakku, mida kutsutakse küvetiks. Küvetid on enamasti ristkülikukujulised, sisemise küljepikkusega 1 cm. (Sellest pikkusest saab Beeri-Lamberti seaduses optiline teepikkus L.) Mõningates instrumentides on küvettide asemel võimalik kasutada katseklaase. Proovi sisaldav anum peab laskma läbi kiirgust vajalikus spektrialas. Kõige laialdasemalt kasutatavad küvetid on valmistatud kõrge kvaliteediga kvartsist, sest see on läbipaistev UV-, nähtavas ja lähiinfrapuna piirkonnas. Klaas- ja plastküvetid on samuti levinud, aga klaas ja enamik plaste neelab UV-kiirgust, mistõttu on nende kasutusala piiratud nähtava valguse lainepikkustega.

Valmistatud on ka spetsiifilisi instrumente. Nende hulka kuuluvad näiteks spektromeetrid, mis on ühendatud teleskoopidega, et mõõta astronoomilisi karakteristikuid. UV/Vis-nanospektromeetritega saab ilma küvettideta mõõta väga väikseid proovikoguseid (alates 0,3 µl). UV/Vis-mikrospektromeeter koosneb UV/Vis-mikroskoobiga ühendatud UV/Vis-spektromeetrist.

Viited
------

1. ↑  Skoog, et al. Principles of Instrumental Analysis. 6th ed. Thomson Brooks/Cole. 2007, 169–173.
2. ↑  "Ultraviolet Spectroscopy and UV Lasers", Prabhakar Misra and Mark Dubinskii, Editors, Marcel Dekker, New York, 2002 (ISBN 0-8247-0668-4).
3. ↑  Skoog, et al. Principles of Instrumental Analysis. 6th ed. Thomson Brooks/Cole. 2007, 349–351.
4. ↑  Skoog, et al. Principles of Instrumental Analysis. 6th ed. Thomson Brooks/Cole. 2007, 351.