**Fruktooligosahhariidide puhastamine** on protsess, mille käigus tuleb FOSi siirupist eemaldada suure glükeemilise indeksiga mono- ja disahhariidid (glükoos, fruktoos ja sahharoos). Kui FOSi siirupist eemaldatakse mono- ja disahhariidid, siis jääb alles puhas prebiootiline produkt. Fruktooligosahhariidid (FOS) on suure kasutuspotentsiaaliga prebiootilised ühendid. Need on tervisele kasulikud "mitteseeduvad" toidu koostisosad, mis võttes osa toidu seedimisest ja imendumisest, stimuleerivad näiteks immuunsüsteemi ja alandavad kolesterooli taset. See, kui tõhusaks prebiootiline produkt osutub, sõltub produkti puhtusest.

FOSi puhastamiseks on kasutatud mitut meetodit: puhastamine aktiivsöe ja tseoliidi abil, selektiivne fermenteerimine, nanofiltreerimine ja ioonvahetuspolümeerid.

Inuliini-tüüpi fruktooligosahhariid

Selektiivne fermenteerimine
---------------------------

*Saccharomyces cerevisiae* mikroskoobist vaadatuna
Fermenteerimine ehk kääritamine on protsess, mis võimaldab puhastada fruktooligosahhariide. Kääritamisel kasutatakse pärmirakke, kes metaboliseerivad FOSi siirupist valikuliselt mono- ja disahhariide (glükoos, fruktoos ja sahharoos), jättes oligosahhariidid puutumata. See, missugusel määral metaboliseeritakse erinevaid suhkruid, sõltub pärmide kasvutingimustest (aeroobne või anaeroobne).

Mõned pagaripärmi (*Saccharomyces cerevisiae*) tüved ei suuda anaeroobses keskkonnas sahharoosil kasvada. Selleks, et pagaripärm kasvaks hästi, vajab ta nii fosforit (bivesinikfosfaatioonina) kui ka väävlit (metioniinist, tsüsteiinist või sulfaatioonina). Olulist rolli mängivad ka mitmed metallid: magneesium (Mg), raud (Fe), kaltsium (Ca) ja tsink (Zv). Pärmirakkude kasutamise eeliseks on võimalus neid immobiliseerida. See tähendab, et samu rakke on võimalik kasutada korduvalt.

Lilu Lu jt viisid läbi katse, kus nad panid FOSi siirupisse (200 g/L) kasvama immobiliseeritud *W. anomala XS* rakud (suhe 1:3). Pärmirakud hakkasid metaboliseerima nii mono- kui ka disahhariide (glükoos, fruktoos ja sahharoos). Glükoos söödi ära peaaegu täielikult, kuid teatud määral jäi söömata sahharoosi ja fruktoosi. 12 tunni möödudes saavutati FOSi 80% puhtus. Seega optimeerides fermenteerimise tingimusi, on võimalik saavutada FOSi puhtus ka suuremal määral.

FOSi puhtust on võimalik analüüsida õhukese kihi kromatograafia ehk TLC abil. Puhastatud FOSi siirup asetatakse silikageeli kolonni ning elueeritakse etüülatsetaadi ja metüüleetriga. Kolonni läbinud puhastatud FOSi fraktsioonid kantakse TLC-le, kus mobiilse faasina kasutatakse butanool-etanool-vett. Tulemused visualiseeritakse 0,5% (w/v) 3,5-dihüdroksütolueeni pihustamisel väävelhappele (20%) ning seejärel kuumutatakse 5 minutit 120 kraadi juures. Kogutud frantsioonid tuvastatakse mass-spektromeetria abil ning kombineeritakse ja kontsentreeritakse struktuurseteks analüüsideks.

Puhastamine aktiivsöe ja tseoliidiga
------------------------------------

FOSi puhastamiseks saab kasutada nii aktiivsütt kui ka tseoliiti. Mõlema meetodi puhul seisneb põhimõte elueerimisel, kuid esineb ka väikseid erinevusi. Aktiivsütt kasutades on oluliseks teguriks adsorptsioon, mis tagatakse komponentide vahelise van der Waalsi jõududega. Tseoliidi puhul saab aga määravaks molekulmass ja poori suurus.

### Aktiivsöega puhastamine

Kromatograafiline täidiskolonn töös: näidatud on eluent, kolonni täidis (statsionaarne faas) ja väljuv eluaat. Aine proov viiakse täidise pealispinnale (vaata kolonnkromatograafia)
Aktiivsöega puhastamise põhimõte seisneb elueerimisel ja adsorptsioonil. Puhastamise käigus toimub mono- ja disahhariidide ning FOSi "väljaloputamine". Adsorptsioon sõltub üldiselt aktiivsöe pinna suurusest ja sisemiste pooride struktuurist, funktsionaalgruppidest ning adsorbantide laengutest. FOSi puhastamisel hakkavad olulist rolli mängima ka interaktsioonid nii eluendi (etanooli), adsorbeeritud aine (sahhariidid) kui ka adsorbendi (aktiivsüsi) vahel.

Aktiivsöel on hüdrofoobne iseloom. Kui võrrelda mono- ja disahhariide (glükoos, fruktoos ja sahharoos) ning FOSi, siis on aktiivsöel oluliselt suurem afiinsus FOSi suhtes. Suurem afiinsus on tingitud FOSi polümeersusest, mille tõttu sisaldab ta oluliselt rohkem CH gruppe kui mono- ja disahhariidid. FOSi polümeerne olemus suurendabki tema adsorptsiooni ehk pinna külge jäämist/kleepumist, mis teeb tema eraldamise raskemaks. Selleks, et eraldada FOS, tuleb vähendada FOSi ja aktiivsöe afiinsust. Afiinsust on võimalik vähendada etanooli kõrgema kontsentratsiooniga eluendis.

Mono- ja disahhariidide afiinsus on aga oluliselt väiksem ning seetõttu läbivad nad kolonni ja eralduvad sellest esimesena. Esimesena väljub kolonnist glükoos (suurel hulgal), sest võrreldes teiste mono- ja disahhariididega on glükoosi sisaldus (kontsentratsioon) FOSi siirupis oluliselt suurem. Glükoosi eraldumise põhjuseks on ka afiinsuse puudumine aktiivsöe ja glükoosi vahel. Afiinsuse puudumise tõttu ei seota glükoosi aktiivsöe pinna külge.

Puhastamisel tekib probleem sahharoosiga, mille eraldumise aeg kolonnist hakkab kattuma FOSi väljumisega.

Selleks, et FOSi eraldamine ja puhastamine oleks efektiivne, tuleb tingimusi optimeerida. Kuhn jt on oma artiklis välja toonud, et olulisteks parameetriteks on etanooli kontsentratsiooni gradient eluendis ja aktiivsöe kolonni kõrgus. Temperatuuri optimumiks on puhastamisel määratud 40 °C.

#### Etanooli astmeline kontsentratsioon

Mida väiksem on etanooli kontsentratsioon eluendis (3,5% (v/v)), seda väiksem on afiinsus aktiivsöe ning mono- ja disahhariidide (glükoos, fruktoos ja sahharoos) vahel. Väiksem etanooli kontsentratsioon põhjustab monosahhariidide desorptsiooni. Samas fruktooligosahhariide nende suure afiinsuse tõttu veel välja ei elueerita. Selleks, et eraldada kolonnist FOS, tuleb vähendada FOSi ja aktiivsöe afiinsust. Afiinsuse vähendamiseks tuleb etanooli kontsentratsiooni gradienti märgatavalt suurendada (15% (v/v)). Kui etanooli kontsentratsiooni gradient on saavutanud väärtuse 15% (v/v), hakkab kolonnist väljuma ka FOS. Ainult etanooli kontsentratsiooni gradiendi tõstmisest ei piisa, et saavutata FOSi täielik puhtus. FOSi "väljapesemise" ajal eraldub temaga samal ajal kolonnist ka sahharoos. Väljuma hakkab sahharoos, mis esimeses faasis, kui etanooli kontsentratsioon oli 3,5%, täielikult ei eraldunud.

#### Kolonni kõrgus

Et eemaldada ka sahharoos ja saavutada FOSi 94% puhtus, tuleb lisaks etanooli kontsentratsiooni gradiendile muuta ka aktiivsöe kolonni kõrgust. Pikendades kolonni kõrgust 35 cm (algne 15 cm ja lõplik 50 cm), on võimalik FOS ja sahharoos kolonnist eraldada erineval ajal. 50 cm kolonni kasutamisel väljub sahharoos fruktooligosahhariididest ~ 200 minutit varem. Monosahhariidid (glükoos ja fruktoos) on selleks ajaks kolonnist juba väljunud. Sellisel viisil, kui kolonni kõrgus on 50 cm ja etanooli kontsentratsioon 15% (v/v), on võimalik fruktooligosahhariide puhtal (94% puhtus) kujul eraldada.

#### FOSi eraldamise ja puhastamise optimaalsed tingimused

FOSi eraldamise ja puhastamise optimaalsed tingimused on järgmised: temperatuur 40 °C, 60 mL etanooli kontsentratsioonil 15% (v/v) ja aktiivsöe kolonni kõrgus 50 cm.

### Tseoliidiga puhastamine

Tseoliit Senckenbergi loodusmuuseumist
Tseoliiti on kasutatud mitmel otstarbel: valkude ja suhkrute puhastamiseks, toiduainetööstuses ning värvide ja plii eemaldamiseks. Kui kasutada FOSide eraldamiseks ja puhastamiseks tseoliiti, tuleb tähelepanu pöörata komponentide molekulmassile.

FOSi ja sahharoosi molekulmass on nii suur, et see ei võimalda molekulidel tungida tseoliidi pooridesse. Suure molekulmassi tõttu on vastavate komponentide sidumine tseoliidi pinnale minimaalne. Seega suur molekulmass põhjustab FOSi ja sahharoosi väljumist kolonnist. Glükoosi ja fruktoosi molekulmass on aga kordades väiksem. Väiksem molekulmass võimaldab neil tungida tseoliidi poorides. Üldjoontes sarnaneb tseoliidi kasutamine aktiivsöe puhastamisega.

FOSi puhastamise efektiivsus teistest sahhariidi molekulidest sõltub tingimuste optimeerimisest. Temperatuur ei mängi tseoliidiga eraldamisel väga suurt rolli. Energia kokkuhoiu mõttes võib protsessi läbi viia üsna madalal temperatuuril (35 °C). Selleks, et optimeerida FOSi eraldamist, peab eluendi etanooli kontsentratsioon olema suur. Mida suurem on etanooli kontsentratsioon (sisaldus) eluendis, seda efektiivsemalt toimub FOSi eraldumine glükoosist.

#### Sõltuvus eluendi etanooli kontsentratsioonist

FOSi eraldamise efektiivsuse (ES) sõltuvus eluendi etanooli kontsentratsioonist. Mida suurem on etanooli kontsentratsioon, seda efektiivsem on FOSi eraldamine.

* Puhas vesi – ES 0,14
* Vesi/etanool (90:40, v/v) – ES 0,60
* Vesi/etanool (80:20, v/v) – ES 1,08
* Vesi/etanool (60:40, v/v) – ES 2,74

#### Parameetrid puhastamise optimeerimiseks

Tseoliidiga puhastamisel on võimalik optimeerida ka kolonni sisestatu ja kolonni kogu mahu suhet. Mida väiksem on kolonni sisestatud ja kolonni kogu mahu suhe, seda tõhusamalt toimub glükoosi eraldumine ehk tungimine tseoliidi pooridesse. Parema tulemuse saavutamiseks on soovituslik kolonni sisestada väike kogus proovi.

Monosahhariidide (glükoos ja fruktoos) veelgi efektiivsemaks eraldamiseks peaks eluendi voolukiirus olema aeglane ja kolonn kõrge. Mida kõrgem on kolonn, seda pikem on vahemaa, mis tuleb komponentidel kolonnist väljumiseks läbida.

Need tegurid **(sisestatud proovi kogus, eluendi voolukiirus ja kolonni kõrgus)** annavad juurde lisaaega, et väikese molekulmassiga monosahhariidid (glükoos ja fruktoos) jõuaksid tungida tseoliidi pooridesse ning tugevamalt seonduda. Samal ajal monosahhariidide pooridesse tungimisega toimub FOSi desorptsioon.

#### Sahharoosi eraldamine

Sahharoosi eraldamine erineb glükoosi ja fruktoosi eraldamisest. Sahharoosi eraldamiseks tuleb kasutada väiksemat etanooli kontsentratsiooni ja kõrgemat temperatuuri. Põhjuseks võib olla sahharoosi liiga väike kontsentratsioon lahuses või suur molekulmass, mis takistab sahharoosi tungimist tseoliidi pooridesse.

Kogu FOSi puhastamise protsessi oleks seetõttu ideaalne läbi viia kahes kolonnis. 

* I kolonn glükoosi ja fruktoosi eemaldamiseks: madal temperatuur (umbes +35 °C) + eluendi suur etanooli kontsentratsioon (umbes 60%)
* II kolonn sahharoosi eemaldamiseks: kõrge temperatuur (umbes 50 °C) + eluendi väike etanooli kontsentratsioon (umbes 50%)

Kasutades FOSi puhastamiseks ainult ühte kolonni, peaks etanooli optimaalne kontsentratsioon eluendis olema >60% ja temperatuur >40 °C.

Viited
------

1. 1 2 3  Angela Avila-Fernandez, Nancy Galicia-Lagunas, Maria E.Rodriguesz-Alegria, Clarita Olvera, Augustin Lopez-Munguia. "Production of functional oligosaccharides through limited acid hydrolysis of agave fructans".`{{netiviide}}`: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link)
2. 1 2 3 4 5  Lili Lu, Jian Wu, Deyong Song, Han Zhao, Guofeng Gu, Yuchuan Guo, Jin Lan, Min Xiao. "Purification of fructooligosaccharides by immobilized yeast cells and identification of ethyl B-D.fructofuranoside as novel glycoside formed during the process".`{{netiviide}}`: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link)
3. 1 2 3  Raquel Cristine Kuhn, Marcio A.Mazutti, Lilian Buoro Albertini, Francisco Maugeri Filho. "Evaluation of fructooligosaccharides separation using a fixed-bed column packed with activated charcoal".`{{netiviide}}`: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link)
4. ↑  F.Sherman 'Getting Started with Yeast', *Methods Enzymol*.**350**, 3–41(2002)
5. 1 2  Raquel Cristine Kuhn, Marcio Antonio Mazutti, Francisco Maugeri Filho. "Separation and purification of fructooligosaccharides on a zeolite fixed-bed column".`{{netiviide}}`: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link)