**Bisubstraatsed inhibiitorid** on ained, mis koosnevad kahest konjugeeritud fragmendist, kus kumbki fragment on suunatud erinevale ensüümi substraati siduvale aktiivtsentrile. Sellise inhibiitori sidumisel proteiinkinaasile väheneb kinaasi võime katalüüsida valkude fosforüleerimist.

Ideaalne bisubstraatne inhibiitor
---------------------------------

Üldiselt peaks proteiinkinaasi bisubstraatsetel inihibiitoritel olema parimaks mõjuks mitmeid omadusi:

* Nad takistavad mõlema loodusliku substraadi seostumist ensüümiga.
* Nende väljatöötamine peab põhinema looduslike substraatide konfiguratsioonil ja nende paiknemisel kinaasi sidumispiirkondades.
* Need on spetsiifilised ainult ühe proteiinkinaasi suhtes (väga oluline aspekt, kuna paljudel kinaasidel on kattuvaid substraate).
* Nende kasutus on võimalik bioloogilistes süsteemides, vähemürgine.

Bisubstraatsete inhibiitorite väljatöötamine
--------------------------------------------

Bisubstraatsete inhibiitorite väljatöötamine eeldab ensüümreaktsiooni bisubstraatset mehhanismi, kus reaktsiooni käigus tekib kolmikkompleks. See eeldus on transferaaside (kuhu kuuluvad kinaasid) korral täidetud ja selline lähenemine on paljude transferaaside korral osutunud edukaks. Väljatöötamise strateegia on lähedalt seotud kahe ravimiarenduses levinud metoodikaga: vaheolekuga analoogse inhibiitori väljatöötamine ja fragmendipõhine ravimiarendus.

### Vaheolekuga analoogne inhibiitor

Vaheolekuga analoogse inhibiitori väljatöötamine põhineb eeldusel, et ensüümi katalüütiline võime pärineb vähemalt osaliselt tugevatest interaktsioonidest ensüümi ja tema substraatide vahel, mis vähendavad reaktsiooni aktivatsioonienergiat. Seega on sellistel inhibiitoritel, mis jäljendavad ensüümreaktsiooni vaheolekut, suurenenud afiinsus ja seda lähenemist kasutades on välja töötatud tugevalt seostuvaid inhibiitoreid. Selliseid bisubstraatseid inhibiitoreid on välja töötatud ka proteiinkinaaside jaoks, aga edukat vaheoleku jäljendamist pole veel täheldatud.

### Fragmendipõhine arendus

Fragmendipõhine arendus hõlmab väikese molekulmassiga fragmentide identifitseerimist ja konjugeerimist. Selle edukas rakendamine annab tulemuseks konjugaadid, mille fragmendid säilitavad oma individuaalsed interaktsioonid valgu sidumistaskutega. Moodustunud konjugaadi vabaenergia on fragmentide vabade energiate summa, millele lisandub veel ainult ühe molekuli sidumisest tulenev entroopia võit. See printsiip on analoogne kelaatefektile. Vaba energia lineaarsel kahanemisel väheneb dissotsiatsioonikonstant eksponentsiaalselt. Konjugatsioonist tulenev entroopiaefekt võib põhjustada dissotsiatsioonikonstandi vähenemist veel kolme suurusjärgu võrra. Nende arvestuste kohaselt võib kahe millimolaarse fragmendi ühendamine anda nanomolaarse afiinsusega inhibiitori.
See mudel on siiski idealistlik ja reaalselt läheb osa sidumisenergiast komponentide konjugeerimisel kaduma. Kahte fragmenti ühendav linker võib samas anda kinaasiga soodsaid interaktsioone.
Adenosiintrifosfaadi (ATP) ja valgu sidumisel esinevad ka sünergeetilised efektid. Need efektid võivad parandada bisubstraatsete inhibiitorite sidumisomadusi, aga seni pole kirjanduses selle efekti kohta kindlaid tõendeid.

Bisubstraatsete inhibiitorite tüübid
------------------------------------

Bisubstraatseid inhibiitoreid saab jaotada nende linkeriga ühendatud fragmentide struktuuri alusel.

### Nukleotiidide ja peptiidide konjugaadid

Ensüümreaktsiooni käigus moodustub kolmikkompleks, kui ATP ja peptiidi substraat seostuvad ensüümile. ATP ja peptiidi substraadi ühendamine võiks seega anda hea inhibiitori. Enamik selliseid inhibiitoreid on aga andnud halbade ja keskpäraste sidumisomadusetega ühendeid. Madala biokättesaadavuse ja peptiidi polaarsete osade madala stabiilsuse tõttu on küsitav nende ühendite farmakoloogiline potentsiaal. Lisaks on kahtluse all ka nende inhibiitorite stabiilsus proteiinkinaaside juuresolekul. Sellegipoolest on nende inhibiitorite struktuur-aktiivsus sõltuvuste ja kristallstruktuuride uurimine andnud väärtuslikku infot kinaaside toimemehhanismide ja substraatide sidumise kohta.

### Adenosiini derivaatide ja peptiidide konjugaadid

Teist bisubstraatse inhibiitorite gruppi esindavad ühendid, kus kaks substraati imiteerivat fragmenti on ühendatud mittefosfaatse linkeriga. Tavaliselt ühendatakse adenosiini ja peptiidi fragmendid omavahel estrirühma ja türosiini (seriini) jäägi kõrvalahela kaudu. Parimatel seda tüüpi inhibiitoritel on subnanomolaarne afiinsus proteiinkinaas A suhtes. Seda tüüpi inhibiitoreid on ka ravimiarenduses.

### Peptiidide konjugaadid ATP-konkurentsete inhibiitoritega

Kolmanda rühma inhibiitorite puhul on proteiinkinaasi ATP-konkurentne inhibiitor asendatud adenosiini fragmendiga. Sellel lähenemisel on eeliseid inhibiitorite arenduses, aga esineb võimalus, et ATP-konkurentne inhibiitor kaotab struktuuri muutmise käigus kõrge afiinsuse. Seetõttu tuleb inhibiitori struktuuris leida sobiv koht peptiidi konjugeerimiseks. Sellise koha leidmine võib osutuda aeganõudvaks ja kulukaks.

### ARC-tüüpi inhibiitorid

ARC-tüüpi inhibiitor ARC-1034
ARC-d (adenosiini analoogi ja oligoarginiini konjugaadid) on kõrgafiinsed bisubstraatsed proteiinkinaaside inhibiitorid. ARC-tüüpi inhibiitorid seonduvad põhiliselt AGC-rühma kuuluvatele proteiinkinaasidele. ARC-d koosnevad kahest fragmendist, adenosiini analoogist ja arginiinirikkast peptiidist, ning neid ühendavast linkerist. Kui ARC seondub kinaasile, siis nukleosiidne fragment seostub ATP-taskuga ja peptiidi fragment liitub valgu sidumistaskuga. Arginiinirikka fragmendi tõttu saab ARC läbida rakkude plasmamembraani, see võimaldab ARC-e kasutada kinaaside aktiivsuse ja funktsioonide uurimiseks elusates rakkudes. ARC-de afiinsust ja selektiivsust kinaaside suhtes saab reguleerida, kasutades erinevaid nukleosiidseid fragmente, linkereid ja peptiidi fragmente. Need omadused võimaldavad ARC-sid kasutada mitmesugustes katsesüsteemides.

### Biligandsed inhbiitorid

Välja on töötatud ka selliseid inhibiitoreid, millel on küll bisubstraatne toimemehhanism, aga millel pole võimalik fragmente selgelt eristada. Selliseid inhibiitoreid tuleks nimetada pigem biligandseteks (seostuvad proteiinkinaasi kahte sidumispiirkonda, aga need ei pruugi olla substraate siduvad taskud).

Bisubstraatsete inhibiitorite rakendused
----------------------------------------

### Proteiinkinaaside toimemehhanismi uurimine

Bisubstraatsetel inhibiitoritel on oluline rakendus röntgenkristallograafias, kus inhibiitori ja kinaasi kompleks kristalliseeritakse. Kompleksi kiiritatakse röntgenikiirgusega ja saadud andmete analüüsil saadakse kompleksi kolmemõõtmeline kristallstruktuur. See näitab ära interaktsioonid proteiinkinaasi ja inhibiitori vahel. Kristallstruktuurid annavad aimu ja kinnitavad oletusi mitmetest proteiinkinaaside toimimisega seotud protsessidest.
Kinaaside uurimisel on kasutusel ka tehnikad, kus bisubstraatne inhibiitor ja kinaas seotakse omavahel kovalentselt. Selle lähenemise puhul kiiritatakse tekkinud kompleksi ultraviolettkiirgusega ja analüüsitakse Western blotiga.

### ARC-tüüpi inhibiitorite rakendused

Biosensoritena on peamiselt kasutatud ARC-tüüpi inhibiitoreid. ARC-e kasutati varem pinnaplasmoni põhiste sensorite loomiseks. Nendel ainetel on suur keemiline ja bioloogiline stabiilsus ja seetõttu on neid võimalik kasutada sadades sidumiskatsetes.
Kui ARC-tüüpi inhibiitorile siduda kovalentselt külge fluorestsentsvärv, siis tulemuseks on ained, mida saab kasutada kinaaside ja kinaasiinhibiitorite uurimiseks fluorestsentsil põhinevate meetodite abil. Selliste biosensorite kasutamise eeliseks on see, et ei pea kasutama eraldi substraate, antikehi ja radioaktiivset kiirgust.

Hiljuti on hakatud arendama ka ARC-tüüpi inhibiitoreid, mille adenosiiniga analoogne fragment sisaldab selenofeeni või tiofeeni. Selliseid aineid nimetatakse ARC-Lum sondideks ja neid saab kasutada fosforestsentsil põhinevatel analüüsimeetoditel.

### Ravimid

Põhiliselt arendavad ravimifirmad inhibiitoreid, mis on suunatud ATP-d siduvale taskule. Kõige edukamaks näiteks on ilmselt Gleevec, mis on kasutusel leukeemia ravis.. Nüüd on hakatud arendama haiguste raviks ka bisubstraatseid inhibiitoreid. Üks sellise haiguse näiteid on tuberkuloos, mille tagajärjel sureb aastas üle ühe miljoni inimese. Tuberkuloosi põhjustab tuberkuloosibakter (*Mycobacterium tuberculosis*), mille elutegevust on võimalik pärssida bisubstraatse inhibiitoriga, millele on uurijad andnud nime Bio-AMS.

Viited
------

1. ↑  V. L. Schramm, Annu. Rev. Biochem. 1998, 67, 693–720.
2. ↑  L. R. Masterson, A. Mascioni, N. J. Traaseth, S. S. Taylor, G. Veglia, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2008, 105, 506–511. .
3. ↑  M. P. Patricelli, A. K. Szardenings, M. Liyanage, T. K. Nomanbhoy, M. Wu, H. Weissig, A. Aban, D. Chun, S. Tanner, J. W. Kozarich, Biochemistry 2007, 46, 350–358.
4. ↑  J. Phipps, R. Terreux, (PharmaGap Inc. Ottawa, Canada), WO2007016763, Pat. Appl. 2007.
5. ↑  M. Loog, A. Uri, G. Raidaru, J. Järv, P. Ek, Adenosine-5′-carboxylic acid peptidyl derivatives as inhibitors of protein kinases, Bioorg. Med. Chem. Lett. 9 (1999) 1447–1452.
6. ↑  D. Lavogina, M. Lust, I. Viil, N. König, G. Raidaru, J. Rogozina, E. Enkvist, A. Uri, D. Bossemeyer, Structural analysis of ARC-type inhibitor (ARC-1034) binding to protein kinase A catalytic subunit and rational design of bisubstrate analogue inhibitors of basophilic protein kinases, J. Med. Chem. 52 (2009) 308–321.
7. ↑  E. Enkvist, D. Lavogina, G. Raidaru, A. Vaasa, I. Viil, M. Lust, K. Viht, A. Uri, Conjugation of adenosine and hexa-(D-arginine) leads to a nanomolar bisubstrate- analog inhibitor of basophilic protein kinases, J. Med. Chem. 49 (2006) 7150–7159.
8. ↑  E. Enkvist, G. Raidaru, A. Vaasa, T. Pehk, D. Lavogina, A. Uri, Carbocyclic 3′- deoxyadenosine-based highly potent bisubstrate-analog inhibitor of basophilic protein kinases, Bioorg. Med. Chem. Lett. 17 (2007) 5336–5339.
9. ↑  J. H. Lee, S. Kumar, D. S. Lawrence, ChemBioChem 2008, 9, 507–509.
10. ↑  K. Parang, J. H. Till, A. J. Ablooglu, R. A. Kohanski, S. R. Hubbard, P. A. Cole, Nat. Struct. Biol. 2001, 8, 37–41.
11. ↑  X. Zhang, J. Gureasko, K. Shen, P. A. Cole, J. Kuriyan, Cell 2006, 125, 1137–1149.
12. ↑  K.-Y. Cheng, M. E. M. Noble, V. Skamnaki, N. R. Brown, E. D. Lowe, L. Kontogiannis, K. Shen, P. A. Cole, G. Siligardi, L. N. Johnson, J. Biol. Chem. 2006, 281, 23167–23179.
13. ↑  K. Parang, J. A. Kohn, S. A. Saldahna, P. A. Cole, FEBS Lett. 2002, 520, 156–160.
14. ↑  K. Viht, S. Schweinsberg, M. Lust, A. Vaasa, G. Raidaru, D. Lavogina, A. Uri, F. W. Herberg, Anal. Biochem. 2007, 362, 268–277.
15. ↑  A. Vaasa, I. Viil, E. Enkvist, K. Viht, G. Raidaru, D. Lavogina, A. Uri, Anal. Biochem. 2009, 385, 85–93.
16. ↑  E. Enkvist, A. Vaasa, M. Kasari, M. Kriisa, T. Ivan, K. Ligi, G. Raidaru, and A. Uri. Protein-Induced Long Lifetime Luminescence of Nonmetal Probes. ACS Chem. Biol. (2011), 6, 1052–1062.
17. ↑  "Arhiivikoopia". Originaali arhiivikoopia seisuga 3. november 2013. Vaadatud 1. novembril 2013.`{{netiviide}}`: CS1 hooldus: arhiivikoopia kasutusel pealkirjana (link)
18. ↑
19. ↑  Benjamin P. Duckworth, Todd W. Geders, Divya Tiwari, Helena I. Boshoff, Paul A. Sibbald, Clifton E. Barry, III, Dirk Schnappinger, Barry C. Finzel, and Courtney C. Aldrich1. Bisubstrate Adenylation Inhibitors of Biotin Protein Ligase from Mycobacterium tuberculosis. Chem Biol. 2011 November 23; 18(11): 1432–1441.