ARC-tüüpi inhibiitorid (lühendatult ARC-d) on sünteetilised ühendid, mis koosnevad nukleosiidi analoogist ja peptiidist või peptiidi analoogist. ARC-tüüpi inhibiitorite bioloogilisteks sihtmärkideks on ensüümid proteiinkinaasid. ARC-tüüpi inhibiitorid kuuluvad bisubstraatsete või biligandsete inhibiitorite hulka. ARC-tüüpi inhibiitorite arendus toimub dr Asko Uri labori eestvedamisel Tartu Ülikooli keemia instituudi meditsiinilise keemia uurimisrühmas.

ARC-tüüpi bisubstraatsete PK inhibiitorite üldine struktuur. Esitatud struktuuriosad on seotud kovalentsete sidemetega. Peptiidosa C-terminalis (tähistatud kuusnurgaga) võib paikneda fluorestsentsmärgis, ankur molekuli ühendamiseks pinnaga vms.
ARC-670 (sinine) ja PKA (roheline) kompleksi kristallstruktuur (PDB: 3AGM)

Struktuur
---------

ARC-tüüpi inhibiitori struktuurinäide: ARC-670.
ARC-tüüpi inhibiitorid on konjugaadid ehk koosnevad kahest fragmendist, mis on omavahel ühendatud teatud ahela (nn linkeri) kaudu. Üheks fragmendiks on tüüpiliselt nukleosiidi (nt adenosiini) analoog, mis seostub proteiinkinaasi ATP-sidumistaskusse (seondumissaiti). Selle fragmendi rollis võib esineda ka mõni teadaolev ATP-saiti seostuv inhibiitor (nt Fasudil või CX-4945). Teiseks fragmendiks on L- või D-aminohapetest koosnev peptiid või peptoid, mis seostub proteiinkinaasi valksubstraadi sidumistaskusse. Linkeriks on enamasti paindlik alifaatne ahel (nt 6-aminoheksaanhappe jääk). 
ARC-tüüpi inhibiitorite oluliseks omapäraks on võimalus viia ühendite struktuuri sünteetiliselt sisse täiendavad moodulid (nt fluorestsentsvärv, biotiin, PEG, fototundlik funktsionaalrühm vms). Need moodulid võimaldavad rakendada ARC-tüüpi inhibiitoreid mitmeteks spetsiifilisteks eesmärkideks (vt Rakendused uurimistöös). 
Enamik seni arendatud ARC-tüüpi inhibiitoritest kuulub pöörduvate inhibiitorite alla. See tähendab, et inhibiitori seostumisel proteiinkinaasiga moodustub mittekovaletne kompleks, mis võib teatud tõenäosusega laguneda taas proteiinkinaasiks ja inhibiitoriks.
Mainitud tõenäosus on seotud inhibiitori *K*D väärtusega antud proteiinkinaasi suhtes (vt Biokeemilised omadused).
Hiljuti arendatud ARC-tüüpi inhibiitorite seas leidub ka pöördumatuid inhibiitoreid. Sellised ühendid sisaldavad keemiliselt reaktiivset rühma, mis on võimeline proteiinkinaasiga reageerimisel moodustama kovalentse sideme. Keemiliselt reaktiivne rühm võib tekkida ka teatud fototundlike rühmade lagundamisel UV-kiirguse abil fotoreguleeritavates ARC-tüüpi inhibiitorites (vt Rakendused uurimistöös).
Igal unikaalse struktuuriga ARC-tüüpi inhibiitoril on oma ARC-kood (näiteks ARC-1063), mida antakse vastavalt labori andmebaasis määratletud järjekorrale ning kasutatakse läbivalt kõikides antud inhibiitorit kirjeldavates publikatsioonides.

Biokeemilised omadused
----------------------

### Afiinsus ja tasakaaluline dissotsiatsioonikonstant

Kui ARC-tüüpi inhibiitori mõlemal fragmendil on õnnestunud takistusteta seostuda sobiva sidumistaskuga proteiinkinaasi molekulis, siis moodustuvad ARC-tüüpi inhibiitori ja proteiinkinaasi molekuli vahel ulatuslikud vastastikmõjud. Näiteks tekivad inhibiitori funktsionaalrühmade ning kinaasi koosseisu kuuluvate aminohappejääkide vahel hüdrofoobsed vastastikmõjud, laeng-laeng vastastikmõjud ning vesiniksidemed. Mida rohkem vastastikmõjusid tekib ning mida tugevamad need on, seda suurem on inhibiitori afiinsus proteiinkinaasi suhtes – ehk seda energeetiliselt soodsam on inhibiitoril ja proteiinkinaasil viibida teineteise külge seotuna kompleksis.
Inhibiitori afiinsust proteiinkinaasi suhtes saab iseloomustada kompleksi tasakaalulise dissotsiatsioonikonstandi *K*D abil. Mida väiksem on *K*D väärtus, seda vähem kompleks dissotsieerub ehk seda stabiilsem on kompleks. Seega, mida väiksem on inhibiitori *K*D väärtus, seda suurem on inhibiitori afiinsus proteiinkinaasi suhtes. Parimate ARC-tüüpi inhibiitorite afiinsus sihtmärk-kinaaside suhtus on 10-12 suurusjärgus (ehk 1012 kompleksimolekulist on keskmiselt lagunenud vaid 1).

### Inhibeerimiskonstant

Inhibiitori efektiivsust saab iseloomustada ka selle järgi, kui hästi inhibiitor takistab selle sihtmärgiks oleva ensüümi poolt katalüüsitavat reaktsiooni. Proteiinkinaasid vastutavad elusorganismides fosforüülimisreaktsiooni katalüüsimise eest (vt Bioloogilised sihtmärgid). Fosforüülimisreaktsiooni puhul on lähteaineteks (substraatideks) fosforüülitav valk ning ATP. ARC-tüüpi inhibiitorid konkureerivad nii ATP kui valksubstraadiga proteiinkinaasi seondumispiirkondande pärast. Seepärast takistab ARC-tüüpi inhibiitor fosforüülimisreaktsiooni katalüüsimist proteiinkinaasi poolt – sel viisil avaldubki inhibiitori bioloogiline toime. Konkurentsete inhibiitorite efektiivsust iseloomustab inhibeerimiskonstant *K*i. ARC-tüüpi inhibiitorite puhul on näidatud, et nende *K*D ja *K*i väärtused on samas suurusjärgus ning omavahel võrdelises seoses.

### Kineetilised aspektid

Inhibiitori tasakaaluline dissotsiatsioonikonstant *K*D avaldub ka inhibiitori ja kinaasi kompleksi lagunemise (dissotsiatsiooni) ja tekke (assotsiatsiooni) kiiruskonstantide suhtena. Mida kiiremini kompleks tekib (ehk mida suurem on assotsiatsiooni kiiruskonstant *k*on) ning mida aeglasemalt kompleks laguneb (ehk mida väiksem on assotsiatsiooni kiiruskonstant *k*off), seda madalam on inhibiitori *K*D. Mõnede ARC-tüüpi inhibiitorite puhul on õnnestunud saavutada *k*off väärtusi suurusjärgus 10-4 … 10-5 s-1 .

### Selektiivsus

Proteiinkinaasi CK2 inhibiitori ARC-1502 selektiivsusprofiil. Inimese proteiinkinaaside fülogeneetilisel puul on ringidega tähistatud uuritud kinaasid, kus ringi suurus ja värv on vastavuses kinaasi katalüütilise aktiivsuse inhibeerimise ulatusega ARC-1502 toimel.
Inhibiitorite kasutamisel keerulistes bioloogilistes süsteemides (vt Rakendused uurimistöös) on oluliseks parameetriks ka selektiivsus ehk inhibiitori võime seostuda ainult kindlale bioloogilisele sihtmärgile. Olenevalt inhibiitori kasutamise eesmärgist, võib tekkida vajadus ka laiema selektiivsusprofiiliga ühendite järele (nt juhul, kui keskendutakse mitme sihtmärgi uurimisele). ARC-tüüpi inhibiitorite seas on nii ühendeid, mis on laia selektiivsusprofiiliga (ehk seostuvad mitme erineva proteiinkinaasiga, nt AGC-perekonna kinaasidega – vt Bioloogilised sihtmärgid), kui ka kõrge selektiivsusega ühendeid, mis seostuvad eelistatult ühele proteiinkinaasile (nt ROCK, CK2, Pim, Haspin– vt Bioloogilised sihtmärgid).

### Muud omadused

Fluorestsentsmärgistatud ARC-tüüpi inhibiitori lokalisatsioon rakus
Inhibiitorite säilitamisel ja kasutamisel on samuti oluline ühendi keemiline ja bioloogiline püsivus (stabiilsus). Mitmed ARC-tüüpi inhibiitorid sisaldavad D-aminohappejääke, mis suurendab ühendite bioloogilist stabiilsust. Selle põhjuseks on asjaolu, et valke lagundavad ensüümid proteaasid on enamasti kohastunud lagundama L-aminohappejääkidest koosnevaid peptiidjärjestusi.
ARC-tüüpi inhibiitorite molekulmass on enamasti üle 1000 Da. Samuti sisaldavad ARC-tüüpi inhibiitorid peptiidset fragmenti, mis võib füsioloogilise pH juures olla kas suure positiivse (nt oligo-Arg sisaldavate ühendite korral) või suure negatiivse (nt oligo-Asp sisaldavate ühendite korral) laenguga. Siiski on mitmed ARC-tüüpi inhibiitorid võimelised läbima elusrakkude plasmamembraani. Positiivselt laetud ARC-tüüpi inhibiitorid läbivad rakumembraani, kasutades oligo-arginiini kui transportpeptiidi (ingl. k. CPP, *cell-penetrating peptide*) omadusi. Negatiivselt laetud ARC-tüüpi inhibiitorite puhul võib kasutada laengute ajutist maskeerimist või lisamoodulite sisseviimist, mis abistavad ühendi rakku sisenemist (vt Rakendused uurimistöös).

Bioloogilised sihtmärgid
------------------------

ARC-tüüpi inhibiitorite bioloogilisteks sihtmärkideks on ensüümid proteiinkinaasid. Proteiinkinaasid katalüüsivad fosforüülimist ehk fosforüülrühma ülekannet doonorilt (ATP) aktseptorile (substraatvalk). Inimorganismi genoomis on leitud 538 erinevat proteiinkinaasi kodeerivat geeni, mida jaotatakse väiksemateks rühmadeks vastavalt struktuursetele ja funktsionaalsetele iseärasustele. ARC-tüüpi inhibiitorite põhilisteks sihtrühmadeks on olnud järgmised proteiinkinaasid: 

* AGC rühmast: PKAcα, PKAcβ, Akt/PKB (isovormid 1-3), PKG-I, ROCK-I, ROCK-II
* CAMK rühmast: Pim1, Pim2, Pim3
* CMGC rühmast: CK2α1, CK2α2
* Muud proteiinkinaasid: Aurora A, Haspin

Oligoarginiini sisaldava ARC-inhibiitori selektiivsusprofiil

Rakendused uurimistöös
----------------------

ARC-tüüpi inhibiitorite struktuuri on suhteliselt lihtne lisada orgaanilise sünteesi abil lisamooduleid, mis võimaldavad kasutada saadud ühendeid mitmetes rakendustes. Näiteks on võimalik kinnitada biotiiniga derivatiseeritud ARC-tüüpi inhibiitorid streptavidiin-pindadele, mis on seejärel kasutatavad sihtmärk-proteiinkinaasi „väljapüüdmiseks" bioloogilisest süsteemist (vt Pinnad afiinsuskromatograafia jaoks). Samuti on võimalik ühendada ARC-tüüpi inhibiitor fluorestsentsvärviga – sel juhul nimetatakse tekkinud ühendit ARC-tüüpi sondiks (vt ARC-tüüpi sondid fluorestsentsanisotroopia jaoks ja fotoluminestseeruvad ARC-tüüpi sondid ehk ARC-Lum sondid). ARC-tüüpe sonde saab kasutada sihtmärk-proteiinkinaasi hulga määramiseks keerulistes bioloogilistes süsteemides. Allpool on lühidalt kirjeldatud rida ARC-tüüpi inhibiitorite rakendusi.

### ARC-põhised afiinsuskromatograafia maatriksid

Mahukate rühmade (fluorestsentsmärgiste, polümeeriahelate) kinnitamine ARC peptiidosa külge ei vähenda oluliselt nende seondumisvõimet proteiinkinaasile. ARC-inhibiitori immobiliseerimisel tahkele kandjale tekib afiinsuskandja, mida saab kasutada proteiinkinaaside väljapüüdmiseks lahusest puhastamise või analüüsi eesmärgil. 2000. aastal ilmunud teaduspublikatsioonis näidati esmakordselt, et cAMP-sõltuva proteiinkinaasi katalüütilist alaühikut (PKAc) saab rakuhomogenaadist eraldada afiinsuskandjaga, mis valmistati adenosiini ja tetraarginiini konjugaadi sidumisel sefaroosiga. Hilisemas publikatsioonis uuriti ARC ja cAMP-sõltuva proteiinkinaasi katalüütilise alaühiku interaktsiooni kineetikat, kasutades pinnaplasmonresonants-meetodit. Näidati, et ARC immobiliseerimisel analüüsikiibile säilib selle võime siduda lahusefaasist cAMP-sõltuva proteiinkinaasi katalüütilist alaühikut.

### Polüetüleenglükooliga (PEG) konjugeeritud ARC-d

Kuna ARC-inhibiitorite struktuurid koosnevad väiksematest üksustest, mis on ühendatud amiidsidemetega, kasutatakse ARC sünteesimiseks polümeersel kandjal peptiidisünteesi jaoks arendatud meetodeid. Kui polümeerne kandja on reaktsioonisegus lahustumatu, on tegemist tahkefaassünteesi-meetodiga, mis on kõige levinum meetod peptiidide keemilises sünteesis. Tahkefaassünteesi alternatiivina on välja pakutud süntees lahustuval polümeersel kandjal. Lahustuva polümeerse kandjana on kasutatud peamiselt polüetüleenglükooli (PEG). Lisaks sünteetilise keemia rakendustele leiab PEG kasutamist biomolekulide aktiivsuse moduleerimisel. Biomolekulide konjugeerimist polüetüleenglükooli ahelatega (pegüleerimist) kasutatakse selleks, et vähendada nende immunogeensust ning suurendada nende eluiga vereringes. 2003. aastal näidati, et lahustuval polümeersel kandjal sünteesimeetodit saab kasutada pegüleeritud ARC-tüüpi inhibiitorite sünteesiks. Nagu immobiliseerimine tahkele kandjale, säilitas ka pegüleerimine ARC-de võime inhibeerida cAMP-sõltuva proteiinkinaasi katalüütilist alaühikut.

### ARC-tüüpi sondid fluorestsentsanisotroopia jaoks

Fluorestsentsanisotroopia mõõtmisel põhineva sidumiskatse põhimõtteskeem
ARC-sondi ja valgu kompleksi moodustumist on võimalik uurida fluorestsentsanisotroopia meetodil, mis põhineb sondi ergastamisel polariseeritud valgusega. Kinaasiga mitte seondunud ARC-sond jõuab oma ergastatud eluea jooksul lahuses mitu korda rohkem pöörelda ja seega kiirgab ta tagasi depolariseeritud valgust, mistõttu on lahuse anisotroopia väärtus madal. Kui ARC-sond on lahuses seondunud valguga (mis on sondist kümneid kordi suurem), siis tema pöörlemise kiirus lahuses aeglustub ning kiiratud valguse polarisatsioon jääb ergastava valguse polarisatsiooniga samaks ning sel juhul on lahuse aniotroopia väärtus kõrge. ARC-sondi konkurentne väljatõrjumine valgu kompleksist põhjustab lahuse anisotroopia väärtuse vähenemist ja võimaldab hinnata konkureeriva inhibiitori seondumise võimet valguga.

### Fotoluminestseeruvad ARC-tüüpi sondid ehk ARC-Lum sondid

ARC-Lum luminestsentsomadused
Aastal 2009 avastati, et tiofeeni fragmenti sisaldavad ARC-d omavad kinaasi kompleksis pika elueaga fotoluminestsentsi omadusi. Kuna vabalt lahuses olevatel ARC-del pika elueaga fotoluminestsents praktiliselt puudub, siis on tegemist valksõltuva signaaliga, mida saab kasutada proteiinkinaaside kontsentratsioonide määramiseks ja väljatõrjumisformaadis kinaasi inhibiitorite iseloomustamiseks. Valksõltuvat pika elueaga fotoluminestsentsi andvaid ARC-tüüpi inhibiitoreid nimetatakse ARC-Lum sondideks.
ARC-Lum sondid sisaldavad ATP-taolise fragmendi koosseisus teisi väävli ja seleeni heterotsükleid. Pika elueaga fotoluminestsentsi nähtus põhineb asjaolul, et proteiinkinaasi jäik ATP-tasku kaitseb tiofeeni/selenofeeni tripletset olekut kustutajate eest, milleks on lahustunud hapnik ja molekulaarsed liikumised. Tulemuseks on mõõdetav fosforestsentsi signaal, mille eluiga jääb 20 ja 1000 mikrosekundi vahele (sõltuvalt ühendist, kinaasist ning mõõtmistingimustest). Seleeni sisaldavate ARC-Lum sondide fotoluminestsents kinaasitaskus on 1-2 suurusjärku tugevam kui vastavatel väävlianaloogidel. 

Aastaks 2019 on publitseeritud neli erinevat baasstruktuuri, millel on ARC-Lum omadused.

ARC-Lum sondid Kui ARC-Lum sondi külge on kinnitatud fluorestsentsvärv, mille ergastusspekter kattub ARC-Lum sondi fosforestsentsspektriga, ilmneb 1-3 suurusjärgu võrra tugevam pika elueaga fotoluminestsents. Nähtust seletatakse efektiivse Försteri-tüüpi energiaülekandega (FRET) ARC-Lum sondi ergastatud tripletselt olekult fluorestsentsvärvile, mis seejärel kiirgab valgust. Kuna tripletselt olekult värvile energiaülekanne on oluliselt kiirem kui fosforestsents, siis ilmneb ka signaali võimendumine. 

Fluorestsentsvärviga ARC-Lum sonde nimetatakse mõnikord ka ARC-Lum(Fluo) sondideks. ARC-Lum(Fluo) sondide korral toimuv efektiivne energiaülekanne tripletselt olekult singletsele võib omada rakendust uut tüüpi OLED-värvide arenduses.

### ARC-tüüpi sondid kasutamiseks elusrakkudes

Tänu struktuursetele iseärasustele (vt Biokeemilised omadused) on mitmed ARC-tüüpi inhibiitorid ja sondid võimelised läbima rakkude plasmamembraani. ARC-tüüpi inhibiitorite toimet proteiinkinaaside signaaliradadele on näidatud mitmes füsioloogilises süsteemis. Konstrukti β-aktiin-GFP üle-ekspresseerivates HeLa rakkudes mõjutas ühend ARC-341 tsütoskeleti stabiilsust, tõenäoliselt proteiinkinaasi ROCK inhibeerimise kaudu. Ühend ARC-903 takistas roti ajust isoleeritud arterite laienemist, mida kutsuti algselt esile proteiinkinaasi PKG-I aktiveerimise kaudu (uuring teostatud koostöös Prof. Wolfgang R. Dostmann’i laboriga Vermont’i ülikoolis USA-s). Vereliistakutes takistas ühend ARC-775 ADP poolt käivitatud agregatsiooni, inhibeerides proteiinkinaasi CK2. ARC-tüüpe sonde on samuti võimalik kasutada elusrakkudes ja lüsaatides kombinatsioonis geneetiliselt modifitseeritud (*tagged*) proteiinkinaasidega. Näiteks juhul, kui proteiinkinaas on konjugeeritud sobiva fluorestseeruva valguga, saab ARC-tüüpi sondi ja proteiinkinaasi vahel toimuda Försteri-tüüpi energiaülekanne (FRET). Saadud fenomeni on võimalik kasutada proteiinkinaaside rakusiseste signaaliradade uurimiseks ning ka selliseid signaaliradu mõjutavate ainete iseloomustamiseks.

### Fotoreguleeritavad ARC-tüüpi ühendid

Aastal 2015 avaldati publikatsioon ARC-tüüpi sondide kohta, mis sisaldasid Aurora A-selektiivset ATP-d jäljendavat fragmenti ja aromaatset asiidi linkeri koosseisus. UV-kiirgusega kiiritamisel tekkis aromaatsest asiidist reaktiivne vaheühend, mille reaktsioonil proteiinkinaasiga Aurora A moodustus kovalentne fluorestseeruv kompleks. ARC-tüüpi inhibiitorite põhjal on valmistatud fotoreguleeritavaid inhibiitoreid, mille bioloogilist aktiivsust on võimalik valguse ja/või kiirguse toimel mõjutada. Fotoreguleeritavate ühendite sünteesis kasutatakse tavaliselt valgustundlike kaitserühmasid. Aastast 2019 esitleti inhibiitoreid ARC-2112 ja ARC-2113, mille seondumisvõime valk sihtmärgiga kasvas pärast minutilist kiiritamist (400 nm lainepikkuse juures) üle 300 000 korra potentsemaks, muutes bioloogiliselt suhteliselt labiilsed molekulid väga aktiivseteks inhibiitoriteks. ARC-2113 valgusega aktiveerimist on näidatud ka katsetes raku lüsaadiga.

Ajalugu
-------

Esimene publikatsioon ARC-tüüpi inhibiitorite kohta ilmus 1999. aastal ajakirjas Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, kus vaadeldi adenosiini analoogi ja oligo-L-arginiini konjugaatide inhibeerivat toimet proteiinkinaasidele PKA, PKC, CK1, CK2 ja CDPK-1. Publikatsioon järgmise põlvkonna ARC-tüüpi inhibiitorite kohta ilmus 2006. aastal ajakirjas Journal of Medicinal Chemistry, kus vaadeldi adenosiini analoogist või H9 jäägist ning oligo-D-arginiinist koosnevate konjugaatide inhibeerivat toimet proteiinkinaasile PKAc. Samas artiklis teostati esimene ARC-tüüpi inhibiitorite selektiivsuse uuring laia kinaasivalimiga. 2009. aastal ilmus ajakirjas Journal of Medicinal Chemistry artikkel, kus koostöös Dr Dirk Bossemeyeri laboriga (DKFZ, Heidelberg, Saksamaa) näidati esmakordselt ARC-tüüpi ühendite ratsionaalset disaini, kasutades valkkristallograafia meetodit. Antud lähenemise efektiivsust on tõestanud ka hilisemad koostööprojektid proteiinkinaaside PKA, Haspin ja CK2 inhibiitorite disainil koostöös Prof. Richard Engh’i (Tromsø ülikool, Norra), Prof. Stefan Knapp’i (Oxfordi ülikool, Suurbritannia) ja Prof. Karsten Niefind’i (Kölni ülikool, Saksamaa) laboritega. 2011. aastal ilmus ajakirjas ACS Chemical Biology publikatsioon ARC-tüüpi inhibiitorite kohta, milles nukleosiidi-laadseteks fragmentideks olid tiofeeni või selenofeeni tsüklit sisaldavad aromaatsed süsteemid. Need ühendid näitasid unikaalseid fotoluminestsentsomadusi kompleksis mitme AGC-rühma proteiinkinaasiga. Avastatud fenomeni on edaspidi kasutatud ARC-Lum- ja ARC-Lum(Fluo)-tüüpi sondide arendamiseks (vt Rakendused uurimistöös). 2012. aastal ilmus publikatsioon ajakirjas Organic and Biomolecular Chemistry, kus näidati ARC-tüüpi ühendite disaini põhimõtte üldist toimivust, vahetades positiivselt laetud peptiidset fragmenti negatiivselt laetud fragmendi vastu. Tetrabromobensimidasooli ja oligo-L-aspartaadi konjugeerimisel saadi efektiivsed inhibiitorid atsidofiilse proteiinkinaasi CK2 jaoks.
ARC-tüüpi inhibiitorite järjepidev arendus kestab ka tänapäeval. Dr Asko Uri labori hiljutised projektid keskenduvad ARC-tüüpi inhibiitorite ja sondide arvukate rakendusvõimaluste iseloomustamisele. Samuti püütakse laiendada ARC-tüüpi bisubstraatsete inhibiitorite bioloogiliste sihtmärkide ringi – nt selektiivsete inhibiitorite arenduse kaudu proteiinkinaaside perekondade Akt ja Pim esindajate suhtes.

Viited
------

1. 1 2 3  "Diversity of bisubstrate binding modes of adenosine analogue-oligoarginine conjugates in protein kinase a and implications for protein substrate interactions.", *J Mol Biol*, **403** (1): 66–77, oktoober 2010, DOI:10.1016/j.jmb.2010.08.028
2. 1 2  Lavogina, Darja; Enkvist, Erki; Uri, Asko (jaanuar 2010), "Bisubstrate inhibitors of protein kinases: from principle to practical applications", *ChemMedChem*, **5** (1): 23–34, DOI:10.1002/cmdc.200900252
3. 1 2  Sinijarv, Hedi; Wu, Shanshan; Ivan, Taavi; Laasfeld, Tõnis; Viht, Kaido; Uri, Asko (august 2017), "Binding assay for characterization of protein kinase inhibitors possessing sub-picomolar to sub-millimolar affinity", *Anal BioChem*, **15** (531): 67–77, DOI:10.1016/j.ab.2017.05.017
4. 1 2  "Fluorescent photoaffinity probes for mitotic protein kinase Aurora A", *Bioorg Med Chem Lett*, **25** (16): 3290–4, jaanuar 2015, DOI:10.1016/j.bmcl.2015.05.060
5. 1 2 3  "Structural analysis of ARC-type inhibitor (ARC-1034) binding to protein kinase A catalytic subunit and rational design of bisubstrate analogue inhibitors of basophilic protein kinases", *J Med Chem*, **52** (2): 308–21, jaanuar 2009, DOI:10.1021/jm800797n
6. 1 2  "Slowly on, Slowly off: Bisubstrate-Analogue Conjugates of 5-Iodotubercidin and Histone H3 Peptide Targeting Protein Kinase Haspin", *Chembiochem*, **18** (8): 790–798, aprill 2017, DOI:10.1002/cbic.201600697
7. ↑  "Long residence times revealed by Aurora A kinase-targeting fluorescent probes derived from inhibitors MLN8237 and VX-689", *Chembiochem*, **15** (3): 443–50, veebruar 2014, DOI:10.1002/cbic.201300613
8. 1 2 3 4  "A subnanomolar fluorescent probe for protein kinase CK2 interaction studies", *Org Biomol Chem*, **43**: 8645–8653, 2012, DOI:10.1039/C2OB26022K
9. 1 2 3  "Conjugation of adenosine and hexa-(D-arginine) leads to a nanomolar bisubstrate-analog inhibitor of basophilic protein kinases", *J Med Chem*, **49** (24): 7150–9, november 2006, DOI:10.1021/jm0605942
10. 1 2 3  "Protein-induced long lifetime luminescence of nonmetal probes", *ACS Chem Biol*, **6** (10): 1052–62, oktoober 2011, DOI:10.1021/cb200120v
11. ↑  "Conjugates of 5-isoquinolinesulfonylamides and oligo-D-arginine possess high affinity and selectivity towards Rho kinase (ROCK)", *Bioorg Med Chem Lett*, **22** (10): 3425–30, mai 2012, DOI:10.1016/j.bmcl.2012.03.101
12. ↑  "Selective bisubstrate inhibitors with sub-nanomolar affinity for protein kinase Pim-1", *ChemMedChem*, **8** (6): 909–13, juuni 2013, DOI:10.1002/cmdc.201300042
13. ↑  "Bisubstrate fluorescent probes and biosensors in binding assays for HTS of protein kinase inhibitors", *Biochimica et Biophysica Acta*, **1804**: 541–546, juuni 2013, DOI:10.1016/j.bbapap.2009.10.019
14. 1 2  "Small-molecule FRET probes for protein kinase activity monitoring in living cells", *Biochem Biophys Res Commun*, **397** (4): 750–5, juuli 2010, DOI:10.1016/j.bbrc.2010.06.026
15. ↑  "Inhibition of CREB phosphorylation by conjugates of adenosine analogues and arginine-rich peptides, inhibitors of PKA catalytic subunit", *Chembiochem*, **16** (2): 312–9, jaanuar 2015, DOI:10.1002/cbic.201402526
16. 1 2  "A Selective Biligand Inhibitor of CK2 Increases Caspase-3 Activity in Cancer Cells and Inhibits Platelet Aggregation", *ChemMedChem*, **12** (20): 1723–36, oktoober 2017, DOI:10.1002/cmdc.201700457
17. ↑  "Quantitative network mapping of the human kinome interactome reveals new clues for rational kinase inhibitor discovery and individualized cancer therapy", *Oncotarget*, **5** (11): 3696–3710, juuni 2014, DOI:10.18632/oncotarget.1984
18. ↑  "Bi-substrate analogue ligands for affinity chromatography of protein kinases", *FEBS Lett*, **480** (2–3): 244–8, september 2000, DOI:10.1016/s0014-5793(00)01948-7
19. ↑  "Surface-plasmon-resonance-based biosensor with immobilized bisubstrate analog inhibitor for the determination of affinities of ATP- and protein-competitive ligands of cAMP-dependent protein kinase", *Anal Biochem*, **362** (2): 268–77, märts 2007, DOI:10.1016/j.ab.2006.12.041
20. ↑  "Liquid-phase synthesis of a pegylated adenosine-oligoarginine conjugate, cell-permeable inhibitor of cAMP-dependent protein kinase", *Bioorg Med Chem Lett*, **13** (18): 3035–9, september 2003, DOI:10.1016/s0960-894x(03)00641-3PMC238298
21. ↑  "High-affinity bisubstrate probe for fluorescence anisotropy binding/displacement assays with protein kinases PKA and ROCK", *Anal Biochem*, **385** (1): 85–93, veebruar 2009, DOI:10.1016/j.ab.2008.10.030
22. ↑  "Adenosine-oligoarginine conjugate, a novel bisubstrate inhibitor, effectively dissociates the actin cytoskeleton", *FEBS J.*, **275** (14): 3608–24, juuli 2008, DOI:10.1111/j.1742-4658.2008.06506.x. `{{citation}}`: kontrolli parameetri `|doi=` väärtust (juhend)
23. ↑  "Adenosine analogue-oligo-arginine conjugates (ARCs) serve as high-affinity inhibitors and fluorescence probes of type I cGMP-dependent protein kinase (PKGIalpha)", *Biochim Biophys Acta*, **1804** (9): 1857–68, september 2010, DOI:10.1016/j.bbapap.2010.04.007
24. ↑  "FRET-based screening assay using small-molecule photoluminescent probes in lysate of cells overexpressing RFP-fused protein kinases", *Anal Biochem*, **481**: 10–7, juuli 2015, DOI:10.1016/j.ab.2015.04.009
25. ↑  "Efficient photocaging of a tight-binding bisubstrate inhibitor of cAMP-dependent protein kinase", *Chem Commun (Camb)*, **55** (74): 11147–11150, september 2019, DOI:10.1039/c9cc04978a
26. ↑  "Adenosine-5'-carboxylic acid peptidyl derivatives as inhibitors of protein kinases", *Bioorg Med Chem Lett*, **9** (10): 1447–52, mai 1999, DOI:10.1016/s0960-894x(99)00210-3
27. ↑  "Co-crystal structures of the protein kinase haspin with bisubstrate inhibitors", *Acta Crystallogr F Struct Biol Commun*, **72** (5): 339–45, mai 2016, DOI:10.1107/S2053230X16004611