CRISPR/Cas9
Diagram o fecaniaeth amddiffyn gwrth-firws CRISPR mewn organebau procaryotig.
Teulu o ddilyniannau DNA mewn bacteria yw **CRISPR** (ynganiad: [/]ˈkrɪsprynganiad: [/]). Mae'r dilyniannau yn cynnwys darnau DNA o firwsau sydd wedi ymosod ar y bacteria. Mae'r bacteria wedyn yn defnyddio'r darnau DNA yma i ddarganfod a dinistrio DNA mewn ymosodiadau eraill gan firwsau tebyg. Mae dilyniannau CRISPR yn rhan bwysig o system amddiffyn bacteria. Maen nhw hefyd yn cael eu defnyddio fel rhan o dechnoleg o'r enw **CRISPR/Cas9** sy'n gallu newid genynnau mewn organebau mewn ffordd effeithiol a manwl.

System imiwnedd mewn organebau procaryotig yw CRISPR/Cas. Mae'n system sy'n rhoi ymwrthedd rhag elfennau genetig dieithr, megis y rheiny sy'n bresennol mewn plasmidau o facteria eraill ac mewn firwsau bacterioffag. Maen nhw'n darparu math o imiwnedd caffaeledig i'r bacteria. Mae RNA sy'n dal y dilyniant o'r ymosodwyr blaenorol yn helpu proteinau Cas i ddarganfod a thorri DNA dieithr. Call proteinau Cas eraill, hefyd wedi eu harwain gan RNA, dorri RNA dieithr fel a geir yn lle DNA mewn rhai firwsau. Fe welir dilyniannau CRISPR mewn tua 40% o'r genomau bacteriaidd sydd wedi eu dilyniannu, ac mewn 90% o archaea sydd wedi eu dilyniannu.

Daw'r talfyriad CRISPR o'r enw Saesneg - ***C**lustered **R**egularly **I**nterspaced **S**hort **P**alindromic **R**epeats*. Bathwyd yr enw pan nad oedd gwyddonwyr yn gwybod am darddiad a defnydd is-ddilyniannau ysbeidiol. Ar y pryd, disgrifwyd CRISPR fel darnau o DNA procaryotig yn cynnwys dilyniannau byr, ailadroddol. Mewn dilyniannau ailadroddol palindromig, mae dilyniant y niwcleotidau yr un fath yn y ddau gyfeiriad. Dilynnir pob adran ailadroddol gan ddarnau byr o ddarnau DNA ysbeidiol o ymosodiadau blaenorol i DNA dieithr (ee firws neu blasmid). Ceir clystyrau bychain o enynnau *cas* (system yn gysylltiedig â CRISPR) o gwmpas dilyniannau CRISPR.

Mae fersiwn syml o system CRISPR/Cas, o'r enw CRISPR/Cas9, wedi ei addasu i olygu genomau. Wrth ddanfon yr ensym niwcleas Cas9 wedi ei gyfuno ag RNA arwain (gRNA) synthetig i mewn i gell, gellir torri genom y gell mewn man dewisiol, gan ganiatau dileu genynnau a/neu ychwaneug genynnau newydd. Mae'r cymhlygyn Cas9-gRNA yn cyfateb â'r cymhlygyn CAS III-crRNA yn y diagram uchod mewn bacteria.

Mae gan dechnegau golygu genom CRISPR/CAS lawer o ddefnyddiau posibl, yn cynnwys mewn meddygaeth ac mewn gwella cnydau. Cyhoeddwyd yn 2015 mai system olygu genom CRISPR/Cas9-gRNA oedd dewis cymdeithas y AAAS fel darganfyddiad gwyddonol y flwyddyn. Mae rhai pryderon ethegol wedi eu crybwyll ynglŷn â defnyddio CRISPR ar gyfer golygu'r llinach genhedlu.

Hanes
-----

Dechreuodd daranfyddiad darnau ailadroddol o DNA mewn tri rhan o'r byd.

### Dilyniannau ailadroddol

Daeth y disgrifiad cyntaf o beth sydd erbyn hyn yn cael ei alw'n CRISPR o ymchwilydd ym Mhrifysgol Osaka, Yoshizumi Ishino, yn 1987. Ar gamgymeriad, fe gloniodd ran o ddilyniant CRISPR ynghyd â genyn *iap*, y terged oedd Ishino â diddordeb ynddo. Roedd trefniant y dilyniannau ailadroddol yn anarferol - fel arfer, mae dilyniannau ailadroddol wedi eu trefnu yn olynol ar hyd dilyniannau DNA, heb ymyriadau rhyngddynt. Doedd gwyddonwyr ar y pryd ddim yn gwybod beth oedd swyddogaeth dilyniannau ailadroddol ysbeidiol mewn clystyrau.

Yn 1993, cyhoeddodd ymchwilwyr yn yr Iseldiroedd oedd yn gweithio ar *Mycobacterium tuberculosis* (y bacteria sy'n achosi twbercwlosis neu'r diciâu) ddwy erthygl am glwstwr o ddilyniannau ailadroddol uniongyrchol â darnau eraill o DNA rhyngddynt yn y bacteriwm. Fe welodd yr ymchwilwyr fod y darnau DNA ysbeidiol yma yn amrywio yn arw rhwng straenau gwahanol o *M. tuberculosis*. Fe ddefnyddion nhw'r nodwedd yma i ddatblygu dull o ddosbarthu'r straenau, ac mae'r dull yma - *spoligotyping* - yn cael ei ddefnyddio hyd heddiw.

Ar yr un pryd, gwelwyd dilyniannau ailadroddol yn y rhywogaethau archaea *Haloferax* a *Haloarcula.* Dechreuodd Francisco Mojica astudio swyddogaeth y dilyniannau ailadroddol yma ym Mhrifysgol Alicante yn Sbaen. Er fod ei ragdybiaeth wreiddiol yn anghywir, dyfalodd Mojica ar y pryd fod y clystyrau yma o ddilyniannau ailadroddol yn bwysig ar gyfer didoli DNA datblygedig i mewn i epigelloedd yn ystod cellraniad oherwydd nad all blasmidau a chromosomau â dilyniannau o'r un fath gydfodoli yn *Haloferax volcanii*. Gwelodd Mojica hefyd drawsgrifiad y dilyniannau ailadroddol bylchog am y tro cyntaf. Erbyn 2000, roedd grŵp ymchwil Mojica wedi dynodi dilyniannau ailadroddom bylchog mewn 20 rhywogaeth o ficrobau. Yn 2001, cynnigwyd y term CRISPR am y tro cyntaf gan Mojica a Ruud Jansen (roedd Jansen hefyd yn chwilio am ddilyniannau tebyg) er mwyn lleihau'r dryswch ynglŷn â'r talfyriadau gwahanol oedd yn cael eu defnyddio mewn erthyglau gwyddonol.

### Systemau Cas (*CRISPR-associated systems*)

Daeth gwelliant mawr yn nealltwriaeth gwyddonwyr o CRISPR pan sylweddolodd Jansen fod genynnau arbenning bob amser i'w gweld ynghyd â'r clystyrau a welodd o ddilyniannau ailadroddol. Rhoddwyd yr enw *CRISPR-associated systems*, neu *cas*, ar y genynnau yma. Gwelodd Jansen bedwar genyn *cas* yn gyntaf (*cas 1* i *4*. Roedd gan y proteinau Cas fotiffau helicas a niwcleas, gan awgrymu eu bod yn bwysig ar gyfer strwythur dynamig y locws CRISPR. Hwn oedd y cyhoeddiad lle bathwyd yr enw CRISPR fel enw cyffredinol y patrwm. Ond parhaodd swyddogaeth CRISPR i fod yn ddirgelwch.

Diagram syml o locws CRISPR. Dangosir y tair cydran a geir mewn locws CRISPR: genynnau *cas*, dilyniant arweiniol (leader), a rheng o ddilyniannau ailadroddol (blychau llwyd) a dilyniannau ysbeidiol (llinellau lliwgar). Dydy trefn y tair cydran ddim bob amser yr un fath. Hefyd, gellir cael nifer o locysau CRISPR tebyg mewn un genom, ond dim ond un all fod yn gysylltiedig â genynnau *cas*.
Yn 2005, dangosodd tri grwp ymchwil annibynnol fod rhai dilyniannau ysbeidiol CRISPR wedi dod o DNA bacterioffag a DNA o du allan i'r cromosom, megis plasmidau. I bob pwrpas, tameidiau o DNA sydd wedi ceisio ymosod ar y gell yn flaenorol yw'r dilyniannau ysbeidiol yma. Roedd y darganfyddiad hwn yn arwydd y gallai system CRISPR/*cas* chwarae rhan yn imiwnedd ymaddasol bacteria. Yn gyntaf, fe wrthododd y cylchgronau gwyddonol mwyaf enwog bob un o'r tri gwaith ymchwil, ond fe'u cyhoeddwyd yn ddiweddarach mewn cylchgronau eraill.

Cyhoeddwyd yr erthygl gyntaf i gynnig y gall CRISPR-Cas chwarae rhan mewn imiwnedd mewn microbau gan grŵp Mojica yn 2005. Rhagdybiodd Mojica y gallai trawsgrifiad RNA y dilyniannau ysbeidiol chwarae rhan gan alluogi'r system i adnabod targed y protein Cas. Byddai mecanwaith o'r fath yn cyfateb i system ymyriant RNA mewn celloedd ewcaryotig. Felly, yr un pryd ag y daeth Ian Wilmut yn enwog am glônio Dolly'r ddafad, estynodd Koonin a'i gydweithwyr (2005) y rhagdybiaeth ymyriad RNA gan gynnig dulliau gweithio ar gyfer yr is-fathau gwahanol o CRISPR-Cas yn ôl swyddogaeth rhagweliedig eu proteinau. Cynnigiodd eraill fod y dilyniannau CRISPR yn arwain ensymau Cas i ddiraddio DNA firysau.

Dangosodd gwaith ymchwil o lawer o grwpiau gwahanol y mecanweithiau sylfaenol wrth wraidd imiwnedd CRISPR-Cas. Yn 2007, cyhoeddwyd y dystiolaeth arbrofol gyntaf mai system imiwnedd ymaddasol oedd CRISPR. Caffaelodd locws CRISPR yn *Streptococcus thermophilus* ddilyniannau ysbeidiol o DNA firws oedd yn ymosod arno. Llwyddodd yr ymchwilwyr i newid ymwrthedd *S. thermophilus* i firws bacterioffag gan ychwanegu a dileu dilyniannau ysbeidiol wedi eu canfod mewn firysau gwahanol. Yn 2008, dynododd Brouns a chydweithwyr gymhlygyn protein Cas mewn *E. coli* oedd yn gallu torri'r RNA CRISPR o fewn i'r dilyniannau ailadroddol i mewn i foleciwlau RNA yn cynnwys dilyniannau ysbeidiol; fe welodd yr ymchwilwyr fod o moleciwlau yma yn aros ynghlwm i'r cymhlygyn protein. Yr un flwyddyn, dangosodd Marraffini a Sontheimer ddilyniant CRISPR yn *S. epidermidis* oedd yn targedu DNA yn hytrach nag RNA er mwyn atal cyfunedd. Doedd y darganfyddiad hwn ddim yn cydfynd â'r syniad fod mecanwaith imiwnedd CRISPR-Cas yn debyg i system ymyriad RNA, er y darganfyddwyd system CRISPR-Cas oedd yn targedu RNA dieithr yn ddiweddarach mewn *Pyrococcus furiosus*. Dangosodd gwaith yn 2010 fod CRISPR-Cas yn torri'r ddau edafedd o DNA firysau bacterioffag a phlasmidau yn *S. thermophilus*.

### Cas9

Dechreuodd ymchwilwyr astudio system CRISPR mwy syml o *Streptococcus pyogenes* sy'n defnyddio'r protein Cas9. Mae pedwar rhan i system endoniwcleas Cas9, sy'n cynnwys dau foleciwl RNA bychan o'r enw RNA CRISPR (crRNA) ac RNA CRISPR traws-ysgogi (tracrRNA). Llwyddodd Jennifer Doudna ac Emmanuelle Charpentier i ailadeiladu a symleiddio'r endoniwcleas Cas9 gan gyduno'r ddau foleciwl RNA i ffurfio un RNA arwain. Gall Cas9 wedyn, pan wedi ei gyfuno â'r RNA arwain, ddarganfod a thorri targed penodol mewn DNA wedi ei ddynodi gan yr RNA arwain. Gan newid dilyniant niwcleotid yr RNA arwain, gellid rhaglennu'r system Cas9 i dargedu unrhyw ddilyniant DNA er mwyn ei dorri. Dangosodd grŵp arall o gydweithwyr, yn cynnwys Šikšnys, Gasiūnas, Barrangou a Horvath y gallant hefyd ail-ragnlennu'r Cas9 o system CRISPR *S. thermophilus* er mwyn targedu man o'u dewis gan newid ei ddilyniant crRNA. Rhoddodd y datblygiadau hyn hwb i ymdrechion gwyddonwyr i olygu genomau gen ddefnyddio'r system CRISPR-Cas9.

Dangosodd dau grŵp ymchwil ar yr un pryd a'i gilydd y gellid defnyddio CRISPR/Cas9 er mwyn golygu'r genom dynol mewn celloedd meithrin. Ers hynny, mae'r system wedi ei defnyddio mewn ystod eang o organebau, gan gynnwys burum pobi (*Saccharomyces cerevisiae*), pysgod rhesog (*D. rerio*), pryfed ffrwythau (*Drosophila melanogaster*), nematodau (*C. elegans*), planhigion, llygod, mwncïod ac ebryonau dynol.

Mae CRISPR hefyd wedi ei addasu ar gyfer creu ffactorau trawsgrifiad y gellir eu rhaglennu. Gan ddefnyddio'r rhain, gall wyddonwyr dargedu a throi genynnau penodol ymlaen neu i ffwrdd.

Defnyddiau
----------

Erbyn diwedd 2014, roedd oddeutu 1000 o erthyglau ymchwil yn crybwyll CRISPR wedi eu cyhoeddi. Mae'r dechnoleg wedi ei defnyddio er mwyn diffodd genynnnau mewn celloedd a llinachau o gelloedd dynol, i astudio *Candida albicans*, i addasu'r burum sy'n cael ei ddefnyddio i greu biodanwydd, ac ar gyfer addasu genetig mewn cnydau. Gellir defnyddio CRISPR hefyd i newid mosgitos fel nad allant drosglwyddo afiechydon megis malaria.

### Peiriannu'r genom

Mae systemau golygu genom CRISPR/Cas9 yn defnyddio system CRISPR Math II. Pan gaiff ei defnyddio ar gyfer golygu genom, mae'r system yn cynnwys Cas9, crRNA, tracrRNA ac adran opsiynol o dempled atgyweirio DNA.

Trawsolwg o wneuthuriad plasmid a ddefnyddir ar gyfer golygu'r genom gyda CRISPR/Cas9.
#### Prif gydrannau

| Cydran | Swyddogaeth |
| --- | --- |
| crRNA | Yn cynnwys yr RNA arwain sy'n lleoli'r adran gywir o DNA y targed, ynghyd â safle sy'n clymu'r moleciwl i'r tracrRNA i ffurfio cymhlygyn gweithredol. |
| tracrRNA | Yn clymu i'r crRNA i ffurfio cymhlygyn gweithredol. |
| sgRNA | RNA arwain unigol. RNA cyfunedig sy'n cynnwys tracrRNA ac oleiaf un crRNA. |
| Cas9 | Yn ei ffurf weithredol, gall y protein hwn addasu DNA. Gall mathau gwahanol o Cas9 weithredu mewn ffyrdd gwahanol (hy rhicio un edafedd, torri'r ddau edafedd neu glymu at DNA). |
| Templed atgyweirio | DNA i arwain y broses atgyweirio DNA, gan alluogi ychwanegu dilyniant newydd i'r bwlch ar ôl i Cas9 dorri DNA y targed. |

Cyfeiriadau
-----------

1. ↑  "The roles of CRISPR-Cas systems in adaptive immunity and beyond". *Current Opinion in Immunology* **32**: 36–41. 2015. doi:10.1016/j.coi.2014.12.008. PMID 25574773.
2. ↑  "CRISPR/Cas9 for genome editing: progress, implications and challenges". *Human Molecular Genetics* **23** (R1): R40–6. 2014. doi:10.1093/hmg/ddu125. PMID 24651067.
3. ↑  "What is CRISPR/Cas9?". *Archives of Disease in Childhood. Education and Practice Edition* **101** (4): 213–5. Awst 2016. doi:10.1136/archdischild-2016-310459. PMC 4975809. PMID 27059283. .
4. ↑  "CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes". *Science* **315** (5819): 1709–12. Mawrth 2007. Bibcode 2007Sci...315.1709B. doi:10.1126/science.1138140. PMID 17379808. (registration required)
5. ↑  "CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA". *Science* **322** (5909): 1843–5. Rhagfyr 2008. Bibcode 2008Sci...322.1843M. doi:10.1126/science.1165771. PMC 2695655. PMID 19095942. .
6. ↑  "Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems". *Science* **353** (6299): aad5147. 2016. doi:10.1126/science.aad5147. PMID 27493190.
7. ↑  "The CRISPRdb database and tools to display CRISPRs and to generate dictionaries of spacers and repeats". *BMC Bioinformatics* **8**: 172. Mai 2007. doi:10.1186/1471-2105-8-172. PMC 1892036. PMID 17521438. .
8. ↑  Sawyer, Eric (9 Chwefror 2013). "Editing Genomes with the Bacterial Immune System". *Scitable*. Nature Publishing Group. Cyrchwyd 6 Ebrill 2015.
9. ↑  "CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea". *Nature Reviews Genetics* **11** (3): 181–90. Mawrth 2010. doi:10.1038/nrg2749. PMC 2928866. PMID 20125085. .
10. ↑  "Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells". *Nature Biotechnology* **33** (9): 985–9. Medi 2015. doi:10.1038/nbt.3290. PMC 4729442. PMID 26121415. .
11. ↑  "CRISPR: gene editing is just the beginning". *Nature* **531** (7593): 156–9. Mawrth 2016. doi:10.1038/531156a. PMID 26961639.
12. ↑  Maxmen, Amy (Awst 2015). "The Genesis Engine". *WIRED*. Cyrchwyd 2016-06-05.
13. ↑  "Breakthrough of the Year: CRISPR makes the cut". *Science Magazine*. American Association for the Advancement of Science. 17 Rhagfyr 2015.
14. ↑  "CRISPR, the disruptor". *Nature* **522** (7554): 20–4. Mehefin 2015. doi:10.1038/522020a. PMID 26040877.
15. ↑  "Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product". *Journal of Bacteriology* **169** (12): 5429–33. Rhagfyr 1987. PMC 213968. PMID 3316184. .
16. ↑  "Comparison of various repetitive DNA elements as genetic markers for strain differentiation and epidemiology of Mycobacterium tuberculosis". *Journal of Clinical Microbiology* **31** (8): 1987–95. Awst 1993. PMC 265684. PMID 7690367. .
17. ↑  "Nature of DNA polymorphism in the direct repeat cluster of Mycobacterium tuberculosis; application for strain differentiation by a novel typing method". *Molecular Microbiology* **10** (5): 1057–65. Rhagfyr 1993. doi:10.1111/j.1365-2958.1993.tb00976.x. PMID 7934856. .
18. ↑  "On the Origin of CRISPR-Cas Technology: From Prokaryotes to Mammals". *Trends in Microbiology* **24** (10): 811–20. 2016. doi:10.1016/j.tim.2016.06.005. PMID 27401123.
19. ↑  "The discovery of CRISPR in archaea and bacteria". *The FEBS Journal* **283** (17): 3162–9. 2016. doi:10.1111/febs.13766. PMID 27234458.
20. ↑  "Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria". *Molecular Microbiology* **36** (1): 244–6. Ebrill 2000. doi:10.1046/j.1365-2958.2000.01838.x. PMID 10760181.
21. ↑  Barrangou, Rodolphe; van der Oost, John (2013). *CRISPR-Cas Systems : RNA-mediated Adaptive Immunity in Bacteria and Archaea*. Heidelberg: Springer. t. 6. ISBN 978-3-642-34656-9.
22. ↑  "Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes". *Molecular Microbiology* **43** (6): 1565–75. Mawrth 2002. doi:10.1046/j.1365-2958.2002.02839.x. PMID 11952905.
23. ↑  "CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea". *Science* **327** (5962): 167–70. Ionawr 2010. Bibcode 2010Sci...327..167H. doi:10.1126/Science.1179555. PMID 20056882.
24. ↑  "CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies". *Microbiology* **151** (Pt 3): 653–63. Mawrth 2005. doi:10.1099/mic.0.27437-0. PMID 15758212.
25. ↑  "Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements". *Journal of Molecular Evolution* **60** (2): 174–82. Chwefror 2005. doi:10.1007/s00239-004-0046-3. PMID 15791728. .
26. ↑  "Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin". *Microbiology* **151** (Pt 8): 2551–61. Awst 2005. doi:10.1099/mic.0.28048-0. PMID 16079334.
27. ↑  "What history tells us XXXVII. CRISPR-Cas: The discovery of an immune system in prokaryotes". *Journal of Biosciences* **40** (2): 221–3. Mehefin 2015. doi:10.1007/s12038-015-9532-6. PMID 25963251.
28. ↑  "The Heroes of CRISPR". *Cell* **164** (1–2): 18–28. Ionawr 2016. doi:10.1016/j.cell.2015.12.041. PMID 26771483.
29. ↑  Ledford, Heidi (2017). "Five big mysteries about CRISPR's origins". *Nature* **541** (7637): 280–282. Bibcode 2017Natur.541..280L. doi:10.1038/541280a. PMID 28102279.
30. ↑  "for the prediction of CRISPR function". Archifwyd o'r gwreiddiol ar 2017-11-22. Cyrchwyd 2017-11-17.
31. ↑  "A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action". *Biology Direct* **1**: 7. Mawrth 2006. doi:10.1186/1745-6150-1-7. PMC 1462988. PMID 16545108. .
32. ↑  "The CRISPR craze". *Science* **341** (6148): 833–6. Awst 2013. doi:10.1126/science.341.6148.833. PMID 23970676.
33. ↑  "The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA". *Nature* **468** (7320): 67–71. Tachwedd 2010. doi:10.1038/nature09523. PMID 21048762.
34. ↑  "Diversity of CRISPR-Cas immune systems and molecular machines". *Genome Biology* **16**: 247. Tachwedd 2015. doi:10.1186/s13059-015-0816-9. PMC 4638107. PMID 26549499. .
35. ↑  "Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering". *Cell* **157** (6): 1262–78. Mehefin 2014. doi:10.1016/j.cell.2014.05.010. PMC 4343198. PMID 24906146. .
36. ↑  "Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems". *Science* **339** (6121): 819–23. Chwefror 2013. doi:10.1126/science.1231143. PMC 3795411. PMID 23287718. .
37. ↑  "RNA-guided human genome engineering via Cas9". *Science* **339** (6121): 823–6. Chwefror 2013. doi:10.1126/science.1232033. PMC 3712628. PMID 23287722. .
38. ↑  "Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems". *Nucleic Acids Research* **41** (7): 4336–43. Ebrill 2013. doi:10.1093/nar/gkt135. PMC 3627607. PMID 23460208. .
39. ↑  "Construction of a quadruple auxotrophic mutant of an industrial polyploid saccharomyces cerevisiae strain by using RNA-guided Cas9 nuclease". *Applied and Environmental Microbiology* **80** (24): 7694–701. Rhagfyr 2014. doi:10.1128/AEM.02310-14. PMC 4249234. PMID 25281382. .
40. ↑  "Metabolic Engineering of Probiotic Saccharomyces boulardii". *Applied and Environmental Microbiology* **82** (8): 2280–7. Ebrill 2016. doi:10.1128/AEM.00057-16. PMC 4959471. PMID 26850302. .
41. ↑  "Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system". *Nature Biotechnology* **31** (3): 227–9. Mawrth 2013. doi:10.1038/nbt.2501. PMC 3686313. PMID 23360964. .
42. ↑  "Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease". *Genetics* **194** (4): 1029–35. Awst 2013. doi:10.1534/genetics.113.152710. PMC 3730909. PMID 23709638. .
43. ↑  "Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system". *Nature Methods* **10** (8): 741–3. Awst 2013. doi:10.1038/nmeth.2532. PMC 3822328. PMID 23817069. .
44. ↑  "Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis, tobacco, sorghum and rice". *Nucleic Acids Research* **41** (20): e188. Tachwedd 2013. doi:10.1093/nar/gkt780. PMC 3814374. PMID 23999092. .
45. ↑  "One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering". *Cell* **153** (4): 910–8. Mai 2013. doi:10.1016/j.cell.2013.04.025. PMC 3969854. PMID 23643243. .
46. ↑  "Targeted genome editing in primate embryos". *Cell Research* **25** (7): 767–8. Gorffennaf 2015. doi:10.1038/cr.2015.64. PMC 4493275. PMID 26032266. .
47. ↑  "CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression". *Nature Protocols* **8** (11): 2180–96. Tachwedd 2013. doi:10.1038/nprot.2013.132. PMC 3922765. PMID 24136345. .
48. ↑  Doudna, J. A; Charpentier, E (2014). "The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9". *Science* **346** (6213): 1258096. doi:10.1126/science.1258096. PMID 25430774.
49. ↑  "CRISPR, the disruptor". *Nature* **522** (7554): 20–4. Mehefin 2015. Bibcode 2015Natur.522...20L. doi:10.1038/522020a. PMID 26040877.
50. ↑  "Can CRISPR-Cas9 gene drives curb malaria?". *Nature Biotechnology* **34** (2): 149–50. 2016. doi:10.1038/nbt.3473. PMID 26849518.
51. ↑  "CRISPR/Cas9 Plasmids". *www.systembio.com*. Archifwyd o'r gwreiddiol ar 2015-12-22. Cyrchwyd 2015-12-17.
52. ↑  "CRISPR Cas9 Genome Editing". *www.origene.com*. OriGene. Cyrchwyd 2015-12-17.