Fatti:
A. Con messaggio del 20 giugno 2005 il Municipio di Lugano ha chiesto al Consiglio comunale un credito di fr. 690'000.-- per la realizzazione di interventi a favore della viabilità ciclabile. Dopo l'approvazione del credito da parte del Consiglio comunale durante la seduta del 4 ottobre 2005, il Municipio ha pubblicato il 1° settembre 2006 le prescrizioni locali concernenti il traffico volte alla realizzazione di un percorso ciclabile tra Davesco/Soragno e Pian Scairolo. Il progetto prevede in particolare nel centro cittadino, segnatamente per via Nassa e via Canova, la sostituzione degli attuali segnali di zona pedonale e di divieto di accesso con segnali corrispondenti ma che consentono, quale eccezione, la circolazione delle biciclette.
Contro tali prescrizioni, A._ e B._SA si sono tra altri aggravati dinanzi al Consiglio di Stato del Cantone Ticino che, con risoluzione del 16 gennaio 2007, ha respinto i ricorsi. Il Governo ha contestualmente approvato la segnaletica stradale in particolare per quanto riguarda il centro città.
B. Con sentenza del 30 ottobre 2008 il Tribunale cantonale amministrativo ha respinto un ricorso presentato da A._ e da B._SA contro la risoluzione governativa. Ha negato che la parziale apertura del centro ai velocipedi fosse in contrasto con la zona pedonale prevista dal piano regolatore comunale ed ha ritenuto le nuove prescrizioni sorrette dall'interesse pubblico e rispettose del principio della proporzionalità.
C. A._ e B._SA impugnano questo giudizio con un ricorso in materia di diritto pubblico e un ricorso sussidiario in materia costituzionale al Tribunale federale, chiedendo di annullarlo e di rinviare gli atti all'autorità cantonale per una nuova decisione. I ricorrenti fanno valere la violazione del diritto federale e l'accertamento arbitrario dei fatti.
D. La Corte cantonale si riconferma nella sua sentenza. Il Consiglio di Stato si rimette al giudizio del Tribunale federale, mentre il Municipio di Lugano chiede di respingere il ricorso in materia di diritto pubblico e di dichiarare inammissibile quello sussidiario in materia costituzionale.

Diritto:
1. 1.1 Con la sentenza impugnata il Tribunale cantonale amministrativo ha sostanzialmente confermato le prescrizioni locali concernenti il traffico adottate dal Comune di Lugano a norma dell'art. 3 cpv. 4 della legge federale sulla circolazione stradale, del 19 dicembre 1958 (LCStr; RS 741.01). Il gravame è quindi diretto contro una decisione finale pronunciata in una causa di diritto pubblico da un'autorità cantonale di ultima istanza (art. 82 lett. a, art. 86 cpv. 1 lett. d, <ref-law>). Non essendo data alcuna eccezione ai sensi dell'<ref-law>, il ricorso in materia di diritto pubblico è di principio aperto. Il ricorso sussidiario in materia costituzionale (art. 113 segg. LTF) è di conseguenza inammissibile.
1. 1.1 Con la sentenza impugnata il Tribunale cantonale amministrativo ha sostanzialmente confermato le prescrizioni locali concernenti il traffico adottate dal Comune di Lugano a norma dell'art. 3 cpv. 4 della legge federale sulla circolazione stradale, del 19 dicembre 1958 (LCStr; RS 741.01). Il gravame è quindi diretto contro una decisione finale pronunciata in una causa di diritto pubblico da un'autorità cantonale di ultima istanza (art. 82 lett. a, art. 86 cpv. 1 lett. d, <ref-law>). Non essendo data alcuna eccezione ai sensi dell'<ref-law>, il ricorso in materia di diritto pubblico è di principio aperto. Il ricorso sussidiario in materia costituzionale (art. 113 segg. LTF) è di conseguenza inammissibile.
1.2 1.2.1 Secondo l'<ref-law> ha diritto di interporre ricorso in materia di diritto pubblico chi ha partecipato al procedimento dinanzi all'autorità inferiore (lett. a), è particolarmente toccato dalla decisione impugnata (lett. b) e ha un interesse degno di protezione all'annullamento o alla modifica della stessa (lett. c). Le condizioni dell'art. 89 cpv. 1 lett. b e lett. c sono strettamente dipendenti e si riallacciano alle esigenze poste per il ricorso di diritto amministrativo sotto l'egida del previgente art. 103 lett. a OG, mirando ad escludere l'azione popolare (cfr. sentenza 1C_405/2008 del 18 marzo 2009 consid. 2.2). Spetta ai ricorrenti allegare i fatti a sostegno della loro legittimazione quando gli stessi non risultino chiaramente dalla decisione impugnata o dagli atti di causa (<ref-ruling> consid. 1.1; sentenza 1C_503/2008 del 10 febbraio 2009 consid. 3.2).
1.2.2 È stato accertato nella decisione impugnata, e risulta dagli atti, che i ricorrenti sono proprietari di particelle o titolari di attività commerciali nel centro di Lugano, nei comparti interessati dal contestato percorso ciclabile. Soccombenti dinanzi alla precedente istanza, essi sono quindi toccati dalle nuove prescrizioni stradali ed hanno un interesse a contestarle distinto da quello degli altri abitanti del Comune. La loro legittimazione a ricorrere giusta l'<ref-law> è pertanto data (cfr. sentenza 1C_206/2008 del 9 ottobre 2008 consid. 1).
Gli ulteriori requisiti di ammissibilità del ricorso in materia di diritto pubblico non danno adito ad osservazioni.
1.3 Con il ricorso in materia di diritto pubblico si può in particolare fare valere la violazione del diritto federale (<ref-law>), in cui rientra l'<ref-law> di cui i ricorrenti censurano la lesione. Il Tribunale federale esamina d'ufficio l'applicazione di tale normativa (<ref-law>) e può quindi accogliere il ricorso sulla base di un motivo non invocato, rispettivamente respingerlo con una motivazione diversa da quella addotta dalla precedente istanza (<ref-ruling> consid. 1.4.1).
2. 2.1 I ricorrenti sostengono che consentendo il transito delle biciclette all'interno di una zona che il piano regolatore qualifica come esclusivamente pedonale, la segnaletica litigiosa modificherebbe in modo sostanziale la relativa destinazione stabilita a livello pianificatorio. Ritengono che l'inserimento di un percorso ciclabile attraverso la zona pedonale del centro cittadino sarebbe contraria alla funzione di detta zona prevista dal piano regolatore e disciplinata dall'ordinanza municipale del 25 agosto 1994. Secondo i ricorrenti, le prescrizioni litigiose non sarebbero giustificate da un interesse pubblico e disattenderebbero il principio della proporzionalità. In particolare, esse non si fonderebbero su una valutazione approfondita circa il numero di pedoni che percorrono attualmente il centro cittadino e quello di ciclisti che prevedibilmente vi transiterebbero dopo l'apertura alle biciclette, nonché circa possibili collegamenti alternativi configuranti minori rischi di collisione. I ricorrenti ritengono infine che le prescrizioni adottate non terrebbero conto delle esigenze stabilite dalla norma SN 640 060 dell'Unione dei professionisti svizzeri della strada e dalla pubblicazione "Percorso casa-scuola. Misure per una maggiore sicurezza sul percorso casa-scuola", edita dall'Ufficio di prevenzione degli infortuni.
2.2 Prescrizioni funzionali concernenti il traffico ai sensi dell'<ref-law> possono essere emanate in quanto lo esigano la protezione degli abitanti o di altri ugualmente toccati dall'inquinamento fonico o atmosferico, l'eliminazione di svantaggi per i disabili, la sicurezza, l'alleviamento o la disciplina del traffico, la protezione della strada o altre condizioni locali. Per tali motivi, soprattutto nei quartieri d'abitazione, può essere limitato il traffico e regolato specialmente il posteggio. I Cantoni possono adottare al riguardo tutti i provvedimenti a loro disposizione nell'ambito delle norme federali sulla circolazione stradale che risultino necessari e proporzionati al raggiungimento dello scopo prefisso (cfr. <ref-law>; sentenze 2A.194/2006 del 3 novembre 2006 consid. 3.1, in: ZBGR 89/2008 pag. 107 segg. e 2A.70/2007 del 9 novembre 2007 consid. 3.1).
2.3 Il Tribunale federale esamina di massima liberamente se una prescrizione adottata in base all'<ref-law> sia giustificata dall'interesse pubblico e rispetti il principio della proporzionalità. Si impone tuttavia un certo riserbo laddove, come in concreto, sono in discussione situazioni locali meglio conosciute e valutate dall'autorità cantonale (<ref-ruling> consid. 4.1). La responsabilità per l'adeguatezza e l'efficacia di una prescrizione concernente il traffico compete in primo luogo all'autorità che ha emanato la decisione, la quale dispone di un ampio margine di apprezzamento. Un intervento del giudice si giustifica quindi solo quand'essa si sia fondata su considerazioni oggettivamente insostenibili, abbia perseguito obiettivi in contrasto con il diritto federale, abbia stabilito il provvedimento eseguendo differenziazioni ingiustificate o tralasciato differenziazioni necessarie o, ancora, si sia lasciata condurre da una ponderazione degli interessi lesiva dei diritti fondamentali (cfr. sentenze 2A.70/2007 e 2A.194/2006 citate, consid. 3.2).
2.4 Per quanto concerne il comparto del centro cittadino oggetto della contestazione, in particolare il tratto di via Nassa, le prescrizioni adottate dal Municipio comportano la rimozione degli attuali segnali di "zona pedonale" (2.59.3) e di "divieto di accesso" (2.02), per posarvi segnali analoghi, ma dotati di tavole complementari che consentono il transito delle biciclette. Il provvedimento litigioso si inserisce nel contesto della realizzazione di un percorso ciclabile appositamente demarcato che collega Davesco/Soragno al Pian Scairolo e che si snoda attraverso sette quartieri della città, interessando quindi un ampio settore del territorio comunale. Il tracciato è pure indicato quale "percorso raccomandato per ciclisti" (4.50.1) mediante la segnaletica specifica (cfr. art. 54a dell'ordinanza sulla segnaletica stradale, del 5 settembre 1979 [OSStr; RS 741.21]).
Il comparto del centro cittadino interessato dalla segnaletica litigiosa è però qualificato dal piano regolatore comunale, segnatamente dal piano del traffico, come zona pedonale. È incontestato che, per la sua destinazione, tale zona è di principio riservata esclusivamente ai pedoni. Lo prevede del resto esplicitamente l'ordinanza municipale concernente la regolamentazione della zona pedonale, del 25 agosto 1994, che, tenendo conto della pianificazione locale, pur riservate eventuali deroghe, vieta esplicitamente la circolazione a tutti i veicoli (cfr. art. 2 lett. e, art. 3 cpv. 1 dell'ordinanza; cfr. inoltre l'art. 41 cpv. 1 delle norme di attuazione del piano regolatore, Sezione di Lugano e la sentenza 2P.236/1995 del 23 aprile 1996, in: RDAT I-1997 n. 61 pag. 199 segg.). Tale destinazione è di principio vincolante nell'ambito di un'applicazione concreta (cfr. sentenza 1P.51/2004 del 28 febbraio 2005 consid. 4.2, in: RtiD II-2005 n. 21 pag. 121 segg.). Le prescrizioni concernenti il traffico devono quindi di massima tenere conto della stessa e coordinarvisi (cfr. MARTIN LENDI, in: Kommentar zur Bundesverfassung vom 29. Mai 1874, n. 21 all'art. 37bis vCost.). In concreto, la segnaletica litigiosa mira alla realizzazione di un vero e proprio percorso ciclabile cittadino che, nella zona del centro storico, si sovrappone alla via pedonale ampliandone in sostanza la destinazione. Essa non è quindi né idonea né necessaria a garantire l'utilizzazione ammissibile conformemente alla pianificazione viaria vigente. Non essendo sorretta dall'interesse pubblico, come si vedrà ancora al considerando seguente, né rispettosa del principio della proporzionalità, viola pertanto l'<ref-law>. Confermando le prescrizioni adottate dal Comune omettendo di tenere convenientemente conto della portata dell'attuale destinazione esclusivamente pedonale del tracciato, la Corte cantonale ha quindi disatteso la normativa federale.
2.5 La Corte cantonale ha richiamato l'<ref-law>, secondo cui se, eccezionalmente, nelle "zone pedonali" (2.59.3) è ammesso un traffico limitato di veicoli, vi si può circolare solo a passo d'uomo; i pedoni e gli utenti di mezzi simili a veicoli hanno la precedenza. Come visto, in concreto, il provvedimento litigioso non ha tuttavia carattere eccezionale e consentirebbe il transito generalizzato dei velocipedi. Esso è infatti destinato a realizzare un nuovo percorso ciclabile che nel tratto del centro si sovrappone all'area pedonale, modificandone la funzione. Ciò implica però il riesame e, se del caso, la modifica dell'attuale destinazione viaria dopo avere eseguito un'accurata ponderazione di tutti gli interessi in discussione e la valutazione di eventuali alternative nel contesto di una procedura pianificatoria (cfr. art. 3 cpv. 3 lett. c LPT, art. 2 e 3 OPT, art. 28 cpv. 2 lett. p della legge cantonale di applicazione della LPT, del 23 maggio 1990). L'eventuale interesse pubblico a realizzare un percorso ciclabile attraverso le vie del centro deve quindi essere vagliato in tale procedura. A torto la Corte cantonale l'ha ammesso già in questa fase, disattendendo che in concreto tale interesse avrebbe dovuto essere vagliato solo con riferimento alla segnaletica in oggetto tenendo conto dell'utilizzazione ammissibile. Sempre nella sede pianificatoria dovrà inoltre essere esaminato il rispetto delle esigenze in materia di progettazione dei percorsi ciclabili, segnatamente per quanto riguarda la sicurezza.
3. 3.1 Ne segue che il ricorso in materia di diritto pubblico deve essere accolto e la decisione impugnata annullata. Gli atti sono rinviati alla precedente istanza per un nuovo giudizio nel senso dei considerandi. Il ricorso sussidiario in materia costituzionale deve per contro essere dichiarato inammissibile.
3.2 Non sono addossate spese giudiziarie al Comune di Lugano, che ha agito nell'esercizio delle sue attribuzioni ufficiali, senza avere un interesse pecuniario (<ref-law>). Soccombente, esso è nondimeno tenuto a versare ai ricorrenti un'indennità per ripetibili (<ref-law>).

Per questi motivi, il Tribunale federale pronuncia:
1. Il ricorso in materia di diritto pubblico è accolto e la decisione impugnata è annullata.
2. Il ricorso sussidiario in materia costituzionale è inammissibile.
3. Non si prelevano spese giudiziarie.
4. Il Municipio di Lugano rifonderà ai ricorrenti un'indennità complessiva di fr. 2'500.-- a titolo di ripetibili della sede federale.
5. Comunicazione al patrocinatore dei ricorrenti, al Municipio di Lugano, al Consiglio di Stato e al Tribunale amministrativo del Cantone Ticino.