Modyfikacja rusztowania kostnego chitosan/HA za pomocą β-1,3-glukanu znacząco poprawia jego biokompatybilność in vitro

Inżynieria tkankowa kości kładzie nacisk na produkcje trójwymiarowego, porowatego rusztowania, które posiadałoby zdolność stymulowania adhezji, proliferacji i różnicowania osteoblastów. Takie rusztowanie wspierałoby proces regeneracji i tworzenia funkcjonalnej tkanki kostnej [1-3]. Celem niniejszej pracy było udowodnienie za pomocą 2 linii osteoblastycznych, że dodatek β-1,3-glukanu do rusztowania na bazie chitosanu i hydroksyapatytu (chit/HA) skutkuje wytworzeniem nowego, trójskładnikowego kompozytu chitosan/β-1,3-glukan/hydroksyapatyt (chit/glu/HA), który posiada lepszą biokompatybilność w porównaniu do dwuskładnikowego materiału chit/HA. Trójskładnikowe rusztowanie wyprodukowano poprzez modyfikację kompozytu chit/HA za pomocą bakteryjnego β-1,3-glukanu jak to zostało opisane wcześniej [2,3]. Eksperymenty in vitro przeprowadzono z zastosowaniem linii komórkowej prawidłowych ludzkich płodowych osteoblastów (hFOB 1.19) oraz linii komórkowej mysich preosteoblastów (MC3T3-E1 Subclone 4). Cytotoksyczność materiałów oznaczono metodą kontaktu bezpośredniego za pomocą podwójnego barwienia fluorescencyjnego „żywe/martwe komórki”. Kalceina-AM barwi na zielono jedynie żywe komórki, natomiast jodek propidyny barwi kwasy nukleinowe martwych komórek emitując czerwoną fluorescencję jader komórkowych. Wybarwione komórki obserwowano w mikroskopie konfokalnym. Liczbę osteoblastów przyklejonych do powierzchni rusztowań kostnych określono ilościowo po lizie komórek za pomocą testu LDH total. Wzrost i proliferację komórek na powierzchni biokompozytów oceniono poprzez obserwację w mikroskopie konfokalnym stosując podwójne barwienie fluorescencyjne cytoszkieltu i jąder komórkowych. Komórki linii hFOB 1.19 i MC3T3-E1 hodowano bezpośrednio na powierzchni biomateriałów przez 9 dni. Co trzeci dzień komórki barwiono za pomocą barwników fluorescencyjnych AlexaFluor635phalloidin i Hoechst 33342 w celu oceny ich morfologii oraz wzrostu ich liczby w czasie. Barwnik AlexaFluor635phalloidin zapewnia czerwoną fluorescencję filamentów cytoszkieletu, natomiast Hoechst 33342 barwi jadra komórkowe na niebiesko. Barwienie „żywe/martwe komórki” wykazało zgrupowania żywych, emitujących zieloną fluorescencje komórek na powierzchni obydwu biokompozytów (chit/HA i chit/glu/HA). Jednakże, komórki hFOB 1.19 porastające powierzchnię rusztowania chit/HA były okrągłe i nie wykazywały typowego dla ich morfologii podłużnego kształtu, co sugeruje, że nie przykleiły się do powierzchni chit/HA (RYS.1). Ponadto, na powierzchni materiału chit/HA zaobserwowano dość dużą liczbę martwych, czerwonych komórek linii hFOB 1.19. Komórki hFOB 1.19 hodowane na powierzchni chit/glu/HA były rozpłaszczone i miały podłużny kształt, co świadczy o ich dobrej adhezji do powierzchni tego materiału. Komórki linii MC3T3-E1 porastające powierzchnię obydwu materiałów były rozpłaszczone i miały typowy dla nich gwiazdkowaty kształt. Jedynie pojedyncze martwe, czerwone komórki MC3T3-E1 zaobserwowano na powierzchni tych kompozytów. Jednakże w porównaniu do rusztowania chit/glu/HA, zdecydowanie mniej komórek MC3T3-E1 było na powierzchni kompozytu chit/HA. LDH total test wykazał znacząco lepszą adhezję komórek hFOB 1.19 i MC3T3-E1 do powierzchni materiału chit/glu/HA (RYS. 2). Trzy godziny od momentu inokulacji rusztowań, do powierzchni kompozytu chit/HA przykleiło się 30% (1.6 x 104) komórek linii hFOB 1.19, natomiast do materiału chit/glu/HA 50% (2.6x104) komórek. W przypadku komórek linii MC3T3-E1, do materiału chit/HA przykleiło się 20% (1.9x104) komórek, a do kompozytu chit/glu/HA aż 70% Obserwacja mikroskopowa wykazała dobry wzrost i proliferację osteoblastów linii hFOB 1.19 i MC3T3-E1 jedynie na rusztowaniu chit/glu/HA (RYS. 3). Liczba komórek porastających powierzchnię chit/glu/HA wzrastała wraz z wydłużającym się czasem hodowli in vitro. Osteoblasty miały typową dla danej linii komórkowej morfologię i dobrze rozbudowany cytoszkielet. Fluoryzujące na niebiesko jądra komórkowe były również bardzo dobrze widoczne. Po 9 dniach prowadzenia hodowli, powierzchnia rusztowania chit/glu/HA była pokryta wielowarstwą komórek linii Hiob 1.19 i MC3T3-E1, które posiadały dobrze rozwiniętą sieć filamentów cytoszkieletu i liczne wypustki cytoplazmatyczne. Osteoblasty hodowane na materiale chit/glu/HA były rozpłaszczone i posiadały dobrze rozbudowaną strukturę cytoszkieletu, co sugeruje, że ten materiał sprzyja adhezji i proliferacji komórek. Udowodniono, że materiał chit/HA całkowicie nie sprzyja adhezji, wzrostowi i proliferacji komórek hFOB 1.19. Przez cały czas trwania eksperymentu na powierzchni chit/HA zaobserwowano jedynie pojedyncze, okrągłe komórki hFOB 1.19. Co więcej, ich liczba nie wzrastała w czasie, a komórki były drobne i okrągłe, co może świadczyć o tym, że były martwe. W przypadku komórek linii MC3T3-E1, 3 dni po inokulacji materiału chit/HA zaobserwowano jedynie pojedyncze komórki na powierzchni próbki (RYS. 3). Ponadto, komórki MC3T3-E1 były okrągłe i nie miały typowego gwiazdkowego kształtu, co świadczy o ich słabej adhezji do powierzchni chit/HA. Jednakże, liczba komórek MC3T3-E1 wzrastała w czasie i po 9 dniach prowadzenia hodowli na powierzchni materiału chit/HA zaobserwowano obszary o małej gęstości komórek MC3T3-E1, które miały gwiazdkowaty kształt, widoczny cytoszkielet i wypustki cytoplazmatyczne. Przeprowadzone eksperymenty in vitro oraz uzyskane zdjęcia z mikroskopu konfokalnego wyraźnie udowadniają, że dodatek β-1,3-glukanu do rusztowania chit/HA stymuluje adhezję, wzrost i proliferację komórek linii hFOB 1.19 i MC3T3-E1. Oba testowane biomateriały były nietoksyczne i pozwalały na wstępną adhezję komórek. Jednakże na powierzchni rusztowania zawierającego β-1,3-glukan zaobserwowano znacząco lepsze rozpłaszczanie się komórek, ich szybszy wzrost i proliferację. Analizując uzyskane wyniki można wysnuć wniosek, że nowy trójskładnikowy kompozyt jest obiecującym materiałem do stosowania w inżynierii tkankowej kości jako rusztowanie komórek mające za zadanie przyspieszenie procesów regeneracyjnych oraz tworzenie nowej, funkcjonalnej tkanki kostnej. (7x104) komórek.

Czasopismo: Engineering of Biomaterials
Dziedziny: nauki inżynieryjno-techniczne
Dyscypliny: inżynieria materiałowa