การหาลำดับนิวคลีโอไทด์ด้วยวิธีอิลลูมินา

การหาลำดับนิวคลีโอไทด์ด้วยวิธีอิลลูมินา (Illumina dye sequencing) เป็นเทคนิคที่ใช้ในการตรวจหาลำดับเบสในดีเอ็นเอ หรือที่รู้จักกันในนาม การหาลำดับดีเอ็นเอ (DNA sequencing) แนวคิดนี้คิดค้นโดย Bruno Canard และ Simon Sarfati และพัฒนาโดย Shankar Balasubramanian และ David Klenerman ซึ่งต่อมาได้ก่อตั้ง Solexa โดยบริษัท Illumina ซึ่งวิธีการหาลำดับเบสนี้ขึ้นอยู่กับการเกิดสีที่ปลายนิวคลีโอไทด์ (dye-terminators) ซึ่งช่วยให้ระบุชนิดของเบส (single bases) ในขณะที่นำเข้าสู่สาย DNA นอกจากนี้ยังสามารถใช้หาลำดับจีโนมและ region sequencing การวิเคราะห์ทรานสคริปโตม (transcriptome) การศึกษากลุ่มของสารพันธุกรรมทั้งหมดของกลุ่มประชากรจุลินทรีย์ในสิ่งแวดล้อมที่จำเพาะ การค้นพบการเติมหมู่เมทิลในดีเอ็นเอ (DNA methylation profiling) และการวิเคราะห์ปฏิสัมพันธ์ของกรดนิวคลีอิก โปรตีน และจีโนม
==ภาพรวม==
อิลลูมินา เป็นเทคโนโลยีที่ใช้ในการหาลำดับ โดยมีการทำงานสามขั้นตอนคือ  การเพิ่มจำนวน การจัดลำดับ และการวิเคราะห์ เริ่มต้นกระบวนการด้วยการนำดีเอ็นเอที่บริสุทธิ์ มาตัดเป็นชิ้นเล็ก ๆ และต่อกับตัวรับหรือที่เรียกว่าอะแดปเตอร์ จากนั้นทำดัดแปลงโมเลกุลแล้วบรรจุลงในชิปเพื่อที่จะเพิ่มจำนวนและการจัดลำดับ ด้านล่างของชิปมีโอลิโกนิวคลีโอไทด์นับแสน (ดีเอ็นเอสายสั้นๆ) มันจะติดกับชิปและสามารถที่จะจับชิ้นส่วนดีเอ็นเอ เมื่อชิ้นส่วนของดีเอ็นเอเชื่อมต่อแล้วเฟสที่เรียกว่าการสร้างคลัสเตอร์จะเริ่มต้นขึ้น ขั้นตอนนี้ทำการคัดลอกชิ้นส่วนของดีเอ็นเอประมาณหนึ่งพันก๊อปปี้ ขั้นตอนถัดไป นำไพรเมอร์และนิวคลีโอไทด์ที่ถูกดัดแปลงจะเข้าสู่ชิป นิวคลีโอไทด์เหล่านี้มีตัวบล็อคที่ 3’ สามารถย้อนกลับได้ซึ่งบังคับให้โพลีเมอเรสมีการเพิ่มขึ้น ในนิวคลีโอไทด์เพียงหนึ่งครั้งเท่านั้นพร้อมกับติดแท็กสารเรืองแสง หลังจากการสังเคราะห์แต่ละรอบ กล้องจะถ่ายรูปชิปไว้และคอมพิวเตอร์จะตรวจสอบว่าเบสใดที่ถูกเพิ่มเข้ามาด้วยความยาวคลื่นของแท็กสารเรืองแสงและบันทึกทุกจุดบนชิป หลังจากแต่ละรอบ โมเลกุลที่ไม่มีการรวมกันจะถูกล้างออกไป จากนั้นจะใช้ขั้นตอนทางเคมีในการกำจัดปลาย 3’ และทำการย้อมสีย้อมในขั้นตอนเดียว กระบวนการนี้จะดำเนินต่อไปจนกระทั่งลำดับของดีเอ็นเอสมบรูณ์ ดังนั้นเทคโนโลยีนี้สามารถจัดลำดับดีเอ็นดีที่มีมากและขนาดใหญ่ได้พร้อมกัน
==ขั้นตอน==
การติดตัวติดตามบนดีเอ็นเอ ขั้นแรกหลังจากทำบริสุทธิ์ดีเอ็นเอแล้วนำดีเอ็นเอมาทำการหั่นให้ได้ดีเอ็นเอชิ้นเล็กๆแบบสุ่มโดยใช้เอ็นไซม์ทรานโพเอส  (Transposases)  จากนั้นจะนำอะแดปเตอร์ต่อเข้ากับปลายทั้งสองข้างของดีเอ็นเอที่ถูกตัด(กระบวนการไลเกชั่น) ส่วนสายที่ไม่ถูกต่อด้วยอะแดปเตอร์ จะถูกล้างออกไป
Reduced cycle amplification เป็นขั้นตอนที่เติม adapters ซึ่งประกอบด้วย Primer binding, indices และTerminal sequence ให้กับสายดีเอ็นเอแม่แบบโดยที่ indices ส่วนใหญ่มีความยาว 6 เบสใช้เพื่อแยกดีเอ็นเอตัวอย่างแต่ละชิ้นในระหว่างการหาลำดับนิวคลีโอไทด์ตัวอย่าง โดย indices ที่ใช้จะมีลำดับแต่แตกต่างกันถึง 96 แบบ ซึ่งเมื่อคอมพิวเตอร์ทำการวิเคราะห์จะทำการรวมกลุ่ม indices ที่เหมือนกันเข้าด้วยกันแล้ววิเคราะห์ Terminal sequence ใช้เพื่อให้ดีเอ็นเอยึดกับ flow cell ซึ่งใน flow cell มีลำดับนิวคลีโอไทด์สายสั้นๆเคลือบอยู่ส่วนฐานของ flow cell ซึ่งทำหน้าที่ยึดกับดีเอ็นเอไว้กับที่ในระหว่างที่ทำการหาลำดับนิวคลีโอไทด์ Terminal sequence สองแบบจะถูกเติมให้กับดีเอ็นเอ เมื่อดีเอ็นเอเข้าสู่ flow cell adapter แต่ละตัวก็จะจับกับนิวคลีโอไทด์ที่อยู่บนฐานของ flow cell
Bridge amplification หลังจากที่ดีเอ็นเอตัวอย่างลงจับกับนิวคลีโอไทด์บนฐานของ flow cell  cluster generation จะเกิดขึ้นเพื่อที่จะสร้างดีเอ็นเอที่มีหน้าตาเหมือนดีเอ็นเอตัวอย่างทุกประการจำนวนมากโดยดีเอ็นเอที่ได้จะมีทั้งสาย forward strands  และ reverse strands โดยที่เอ็นไซม์พอลีเมอเรสเคลื่อนที่ไปตามดีเอ็นเอตัวอย่างเพื่อสร้างดีเอ็นคู่สม จากนั้นจะทำการล้างดีเอ็นเอตัวอย่างทิ้งไปโดยจะเหลือเส้น reverse strands ที่ติดกับ flow cell เท่านั้นที่ส่วนบนสุดของสายดีเอ็นเอ reverse strands มี adapters ลำดับนิวคลีโอไทด์ที่สามารถจับกับนิวคลีโอไทด์บนฐานของ flow cell ได้จากนั้นเอ็นไซม์พอรีเมอเรสจับกับ reverse strands เพื่อสร้างสายดีเอ็นเอคู่สมซึ่งดีเอ็นเอคู่สมจะมีลำดับนิวคลีโอไทด์เหมือน forward strands  จากนั้นทำการแยกสายของดีเอ็นเอออกจากกันเพื่อให้ดีเอ็นเอจับกับนิวคลีโอไทด์ที่อยู่บนฐานของ flow cell แล้วเกิดการต่อสายดีเอ็นเอขึ้น ซึ่งกระบวนการนี้เป็นการต่อสายดีเอ็เอหลายพันกลุ่มได้ในครั้งเดียว
Clonal amplification ดีเอ็นเอจะเกิดการโค้งงอและยึดติดกับนิวคลีโอไทด์ที่อยู่บนฐานของ flow cell เรื่อยๆโดยเอ็นไซม์พอลีเมอเรสจะสังเคราะห์เพื่อสร้างสายดีเอ็นเอคู่สม(เกลียวคู่)จากนั้นจะถูกทำให้แยกสายเพื่อให้ดีเอ็นเอทั้งเส้น forward strands  และ reverse strands ยึดติดกับนิวคลีโอไทด์ที่อยู่บนฐานของ flow cell ที่ตำแหน่งข้างเคียง โดยในขั้น Clonal amplification มีความสำคัญในการควบคุมคุณภาพโดยสามารถตรวจสอบจากเส้น reverse strands ได้โดยที่เส้น forward strands  และ reverse strands สามารถใช้ตรวจเช็คเพื่อป้องกันข้อผิดพลาดได้ เนื่องจาก Illumina dye sequencing ใช้เอ็นไซม์ในปฏิกิริยาดังนั้นจึงอาจมีข้อผิดพลาดที่เกิดการแทนที่ได้ โดยเฉพาะที่ด้านปลาย 3’ โดยดีเอ็นเอทั้ง forward strands  และ reverse strands ควรมีลำดับนิวคลีโอไทด์ที่เป็นคู่สมกัน ดังนั้นถ้ามีลำดับนิวคลีโอไทด์ที่แตกต่างกันออกไปจะแสดงให้เห็นว่ามีข้อผิดพลาดเกิดขึ้น ซึ่งในห้องปฏิบัติการบางแห่งใช้เกณฑ์ยอมรับขั้นต่ำต้องเหมือนกันอย่างน้อย 97%
การหาลำดับนิวคลีโอไทด์ หลังจากสิ้นสุดขั้นตอน Clonal amplification สายดีเอ็นเอ reverse strands จะถูกตัดและล้างออกให้เหลือแต่ดีเอ็นเอ forward strands  Primers จะเกาะกับดีเอ็นเอ forward strands จากนั้น DNA Polymerase จะทำการต่อสายดีเอ็นเอโดยนำนิวคลีโอไทด์ที่ติดตามด้วย Fluorescent  โดยจะเกิดการเติมเบสเพียงหนึ่งเบสต่อรอบเท่านั้น ซึ่งในแต่ละนิวคลีโอไทด์จะมีการบล็อคปลาย 3’ (reversible terminator) เพื่อป้องกันการเติมเบสหลายเบสในหนึ่งรอบ โดยในเบสแต่ละแบบจะติดตามด้วย Fluorescent ที่มีสีและค่า emission ที่แตกต่างกันโดยเครื่องจะทำการอ่านสีในแต่ละรอบที่เติมเบส โดยเมื่ออ่านสายดีเอ็นเอแล้วดีเอ็นเอคู่สมที่ถูกสร้างมาจะถูกล้างออก จากนั้นให้ Index 1 primer เข้าจับกับ Index 1 ทำการต่อสาย Index จากนั้นทำการล้างสาย Index 1 ออก จากนั้นทำ Bridge amplification อีกครั้งโดยให้ปลาย3’ของสายดีเอ็นเอจับกับนิวคลีโอไทด์บนฐานของ flow cell เพื่อให้เกิดการต่อสายของดีเอ็นเอ reverse strands เมื่อได้สายดีเอ็นเอ reverse strands จะทำการตัดและล้างดีเอ็นเอ forward strands  ออกจากนั้นให้ทำการหาลำดับนิวคลีโอไทด์ซ้ำอีกรอบกับสายดีเอ็นเอ reverse strands
การวิเคราะห์ข้อมูล ลำดับนิวคลีโอไทด์ที่เกิดขึ้นมานับล้านนิวคลีโอไทด์ในครั้งเดียวจะถูกจัดกลุ่มตาม indices ซึ่งในแต่ละกลุ่มจะมีลำดับนิวคลีโอไทด์ที่เหมือนกันประมาณ 1000 ชุด โดยลำดับนิวคลีโอไทด์ที่ได้จากการวิเคราะห์ที่มีลำดับเหมือนกันจะถูกนำมาซ้อนทับกันซึ่งหากมีลำดับนิวคลีโอไทด์อ้างอิงสามารถนำข้อมูลมาเทียบกับลำดับอ้างอิงได้
==การเปรียบเทียบกับวิธีการหาลำดับนิวคลีโอไทด์วิธีอื่น==
เทคนิคการหาลำดับนิวคลีโอไทด์นี้มีข้อดีมากกว่าวิธีการหาลำดับนิวคลีโอไทด์แบบเดิม เช่น  Sanger sequencing เนื่องจาก เทคนิคการทำ Illumina sequencing สามารถที่จะหาลำดับนิวคลีโอไทด์ได้พร้อมกันหลายเส้น ซึ่งมีความถูกต้องแม่นยำที่สูงและรวดเร็ว นอกจากนี้ เทคนิคการทำ Illumina sequencing ใช้ DNA polymerase ที่มีราคาถูกกว่าที่ใช้ในเทคนิคอื่น
==ตัวอย่างการใช้==
เทคนิคการทำการหาลำดับนิวคลีโอไทด์ด้วยวิธี (Illumina dye sequencing) ถูกใช้เพื่องานวิจัย  การวิเคราะห์ทรานสคริปโตม (transcriptome) ในมันเทศ และการทำ  gymnosperm ในพืช จีนัส Taxus
==อ้างอิง==
การหาลำดับดีเอ็นเอ