Glutamato descarboxilase

A glutamato descarboxilase ou ácido glutámico descarboxilase (GAD) é un encima que cataliza a descarboxilación do glutamato a ácido gamma-aminobutírico (GABA) e dióxido de carbono (CO2). A GAD usa o fosfato de piridoxal (PLP) como cofactor. A reacción procede da seguinte maneira: HOOC−CH2−CH2−CH(NH2)−COOH → CO2 + HOOC−CH2−CH2−CH2NH2
En mamíferos a GAD existe en dúas isoformas con pesos moleculares de 67 e 65 kDa (GAD67 e GAD65), que están codificadas en dous xenes situados en distintos cromosomas; en concreto, en humanos o xene GAD1 está no cromosoma 2 e o GAD2 no cromosoma 10. A GAD67 e a GAD65 exprésanse no cerebro onde se utiliza o GABA como neurotransmisor, e tamén se expresan nas células β do páncreas produtoras de insulina, en diversas proporcións dependendo da especie. En conxunto, estes dous encimas manteñen a principal produción fisiolóxica de GABA nos mamíferos, aínda que pode tamén sintetizarse a partir da putrescina no sistema nervioso entérico, cerebro, e noutras partes do corpo pola acción da diamina oxidase e aldehido deshidroxenase 1a1.
Poden detectarse varios transcritos truncados e polipéptidos de GAD67 no cerebro en desenvolvemento, aínda que a súa función, se a teñen, é descoñecida. Estrutura e mecanismo
Ambas as isoformas da GAD son estruturas homodímeras que constan de tres dominios principais: o PLP, o C-terminal e o N-terminal. O dominio para a unión do PLP deste encima adopta un pregamento similar ao de transferase dependente de PLP tipo I. A reacción procede polo mecanismo canónico, no que está implicado un enlace de base de Schiff entre o PLP e a Lys405. O PLP mantense no seu sitio polo empillamento da base cun residuo de histidina adxacente, e o GABA colócase de modo que o seu grupo carboxilo forme unha ponte salina coa arxinina e un enlace de hidróxeno coa glutamina. A dimerización é esencial para manter a función do encima, xa que o sitio activo se encontra nesta interface, e as mutacións que interfiren coa asociación óptima entre as dúas cadeas foi ligada a patoloxías como a esquizofrenia. A interferencia na dimerización feita polos inhibidores da GAD como o ácido 2-ceto-4-pentenoico (KPA) e o etil cetopentenoato (EKP) tamén causa unha drástica redución da produción de GABA e da incidencia de convulsións.
A actividade catalítica depende dun curto bucle flexible na interface do dímero (residuos 432–442 en GAD67, e 423–433 en GAD65). En GAD67 este bucle permanece fixado, cubrindo o sitio activo e promovendo un ambiente catalítico para soster a produción de GABA; a súa mobilidade en GAD65 promove unha reacción lateral que resulta na liberación de PLP, orixinando a autoinactivación. A conformación deste bucle está intimamente ligada ao dominio C-terminal, o que tamén afecta a taxa de autoinactivación. Ademais, a GAD65 unida a GABA é intrinsecamente máis flexible e pode existir nun conxunto de estados, o que dá máis oportunidades para a autoantixenicidade, tal como se ve na diabetes tipo 1. A GAD derivada de Escherichia coli mostra complexidades estruturais adicionais, como un cambio conformacional dependente do pH. Ese comportamento defínese pola presenza dun feixe de hélice tripla formado polo N-terminal da proteína hexámera en ambientes ácidos. Regulación de GAD65 e GAD67
Malia a gran semellanza na secuencia entre os dous xenes, a GAD65 e a GAD67 exercen funcións moi diferentes no corpo humano. Ademais, as investigacións realizadas suxiren que a GAD65 e a GAD67 son reguladas por mecanismos celulares moi diferentes.
A GAD65 e a GAD67 sintetizan o GABA en diferentes partes da célula, en diferentes momentos do desenvolvemento e para propósitos funcionais distintos. A GAD67 espállase uniformemente pola célula, mentres que a GAD65 está localizada nas terminais nerviosas. A GAD67 sintetiza GABA para a actividade neuronal non relacionada coa neurotransmisión, como a sinaptoxénese e a protección de lesións neurais. Esta función require a presenza ubicua do GABA. Porén, a GAD65 sintetiza GABA para a neurotransmisión, e, polo tanto, só é necesaria nas terminais nerviosas e sinapses. Para axudar á neurotransmisión, a GAD65 forma un complexo con HSC70, a proteína de corda de cisteína (CSP) e o transportador de GABA vesicular (VGAT), o cal, como complexo, axuda ao empaquetamento do GABA en vesículas que serán liberadas durante a neurotransmisión. A GAD67 transcríbese durante as etapas iniciais do desenvolvemento, mentres que a GAD65 non se tanscribe ata etapas posteriores da vida. Esta diferenza no desenvolvemento entre a GAD67 e a GAD65 reflicte as propiedades funcionais de cada isoforma; a GAD67 é necesaria durante o desenvolvemento para o funcionamento celular normal, mentres que a GAD65 non é necesaria ata pouco despois no desenvolvemento cando a inhibición sináptica é máis prevalente. A GAD67 a a GAD65 son tamén reguladas de xeito diferente postraducionalmente. Tanto a GAD65 coma a GAD67 regúlanse por fosforilación dun bucle catalítico dinámico, mais a regulación destas isoformas difire; a GAD65 é activada por fosforilación mentres que a GAD67 é inhibida por fosforilación. a GAD67 atópase predominantemente activada (~92 %), mentres que a GAD65 se atopa predominantemente inactivada (~72 %). A GAD67 é fosforilada na treonina 91 pola proteína quinase A (PKA), mentres que a GAD65 é fosforilada e, polo tanto, regulada, pola proteína quinase C (PKC). Tanto a GAD67 coma a GAD65 son tamén reguladas postraducionalmente polo piridoxal 5’-fosfato (PLP); a GAD actívase cando se une ao PLP e inactívase cando non está unida ao PLP. A maioría da GAD67 está unida ao PLP nun momento dado, mentres que a GAD65 só se une ao PLP cando cómpre producir GABA para a neurotransmisión. Isto reflicte as propiedades funcionais das dúas isoformas; a GAD67 debe estar activa en todo momento para o funcionamento celular normal e, polo tanto, é constantemente activada polo PLP, mentres que a GAD65 só debe estar activada cando ocorre neurotransmisión por GABA e, polo tanto, é regulada de acordo co ambiente sináptico.
Estudos feitos en ratos tamén mostran diferenzas funcionais entre a Gad67 e a Gad65. Os ratos GAD67−/− nacen cun padal fendido e morren no primeiro día despois de nacer, mentres que os ratos GAD65−/− sobreviven cunha tendencia lixeiramente maior a ter convulsións. Ademais, os GAD65+/- teñen síntomas definidos como similares aos do trastorno por déficit de atención con hiperactividade (TDAH) en humanos. Función no sistema nervioso
Tanto a GAD67 coma a GAD65 están presentes en todos os tipos de sinapses do sistema nervioso humano. Isto inclúe as sinapses dendrodendríticas, axosomáticas e axodendríticas. Evidencias preliminares suxiren que a GAD65 é dominante nos sistemas visual e neuroendócrino, que sofren máis cambios fásicos. Tamén se cre que a GAD67 está presente en maior cantidade en neuronas tonicamente activas. Papel na patoloxía
Autismo
Tanto a GAD65 coma a GAD67 experimentan unha significativa regulación á baixa en casos de autismo. Nunha comparación de cerebros autistas con controis, a GAD65 e a GAD67 experimentaban unha regulación á baixa como media do 50 % nos córtex parietal e cerebelar de persoas autistas. Nas células de Purkinje cerebelares tamén se observa un 40 % de regulación á baixa, o que suxire que os núcleos cerebelares afectados poden distorsionar a saída de sinais a áreas motoras e cognitivas de orde superior do cerebro.
Diabetes
Tanto a GAD67 coma a GAD65 son dianas de autoanticorpos en persoas que posteriormente desenvolven diabetes mellitus tipo 1 ou diabetes autoinmune latente. Comprobouse que as inxeccións con GAD65 de maneira que induzan inmunotolerancia impiden a diabetes tipo 1 en modelos de roedores. En ensaios clínicos, a administración en inxeccións de GAD65 preserva algunha produción de insulina durante 30 meses en persoas con diabetes tipo 1. Unha revisión sistemática Cochrane tamén examinou un estudo que mostra a mellora dos niveis de péptido C en casos de diabetes autoinmune latente en adultos 5 anos despois do tratamento con GAD65. Porén, é importante salientar que os estudos dispoñibles que foron incluídos nesta revisión presentaban considerables defectos de calidade e deseño.
Síndrome da persoa ríxida
Documentáronse ben altas titulacións de autoanticorpos para a ácido glutámico descarboxilase (GAD) en asociación coa síndrome da persoa ríxida. A GAD é o encima limitante da velocidade na síntese de ácido γ-aminobutírico (GABA) e na alteración do funcionamento de neuronas GABAérxicas, e foi implicada na patoxénese da síndrome da persoa ríxida. Os autoanticorpos para a GAD poderían ser o axente causante ou un marcador da enfermidade.
Esquizofrenia e trastorno bipolar
Unha substancial desregulación da expresiónn do ARNm da GAD, acompañada da regulación á baixa da reelina, obsérvase na esquizofrenia e no trastorno bipolar. Unha regulación á baixa máis pronunciada da GAD67 atopouse na capa stratum oriens do hipocampo en ambos os trastornos e noutras capas e estruturas do hipocampo en varios graos.
A GAD67 é un encima clave implicado na síntese do neurotransmisor inhibitorio GABA e as persoas con esquizofrenia expresan menores cantidades de GAD67 no córtex prefrontal dorsolateral comparadas con suxeitos control sans. O mecanismo que subxace na diminución dos niveis de GAD67 en persoas con esquizofrenia segue sen estar claro. Algúns investigadores propuxeron que un xene temperán inmediato, o Zif268, cuxo produto normalmente se une á rexión promotora de GAD67 e incrementa a transcrición de GAD67, exprésase a menor nivel en pacientes esquizofrénicos, contribuíndo así á diminución dos niveis de GAD67. Como o córtex prefrontal dorsolateral está implicado na memoria de traballo, e a GAD67 e os niveis de ARNm de Zif268 son menores no córtex prefrontal dorsolateral de pacientes esquizofrénicos, esta alteración molecular pode explicar, polo menos en parte, as alteracións da memoria de traballo asociadas a esta doenza.
Enfermidade de Parkinson
A entrega bilateral de GAD por un vector viral adeno-asociado no núcleo subtalámico de pacientes entre os 30 e os 75 anos de idade con enfermidade de Parkinson que responde á levodopa progresiva avanzada resultou nunha mellora significativa sobre o valor basal durante o curso dun estudo de seis meses.
Trastornos cerebelares
A administración intracerebelar de autoanticorpos anti-GAD a animais incrementa a excitabilidade de motoneuronas e distorsiona a produción de óxido nítrico (NO), unha molécula implicada na aprendizaxe. O recoñecemento de epítopos contribúe á afectación cerebelar. A redución dos niveis de GABA incrementa os niveis de glutamato como consecuencia da menor inhibición de subtipos de receptores GABA. Os niveis de glutamato máis altos activan a microglía e a activación do antiportador cisteína/glutamato xc(−) incrementa a liberación de glutamato extracelular.
Dor neuropático
A lesión nerviosa periférica do nervio ciático (un modelo de dor neuropática) induce unha perda transitoria de terminais inmunorreactivos a GAD65 no corno dorsal da medula espiñal e suxire unha posible implicación destas alteracións no desenvolvemento e mellora do comportamento da dor. Outros trastornos neurolóxicos asociados a anti-GAD
Os anticorpos dirixidos contra a GAD encóntranse cada vez con máis frecuencia en pacientes con outros síntomas que indican unha disfunción do sistema nervioso central, como a ataxia, encefalomielite progresiva con rixidez e mioclono, encefalite límbica e epilepsia. O padrón de anticorpos anti-GAD na epilepsia difire do da diabetes tipo 1 e a síndrome da persoa ríxida. Papel da glutamato descarboxilase noutros organismos
Ademais da síntese do GABA, a GAD ten funcións adicionais e variacións estruturais que dependen da especie. En Saccharomyces cerevisiae, a GAD únese á proteína reguladora do Ca2+ calmodulina (CaM) e, dese xeito, está implicada na resposta ao estrés oxidativo. De maneira similar, a GAD en plantas tamén se une á calmodulina. Esta interacción ocorre no dominio de unión á calmodulina (CaMBD) no seu C-terminal e é necesaria para unha correcta regulación da produción de GABA. A diferenza dos vertebrados e invertebrados, o GABA producido pola GAD úsase en plantas para sinalar estreses abióticos ao controlar os niveis de Ca2+ intracelulares por medio da calmodulina. A unión á calmodulina abre as canles de Ca2+ e causa un incremento das concentracións de Ca2+ no citosol, o que permite que o Ca2+ actúe como un segundo mensaxeiro e active as vías de augas abaixo. Cando a GAD non está unida á calmodulina, o CaMBD actúa como un dominio autoinhibitorio, desactivando así a GAD en ausencia de estrés. Un dato interesante é que en dúas especies de plantas, o arroz e as maceiras, descubríronse isoformas da GAD independentes do Ca2+/calmodulina. O C-terminal destas isoformas contén substitucións en residuos clave que cómpren para interaccionar coa calmodulina no CaMBD, impedindo que a proteína se una á GAD. Mentres que o CaMBD da isoforma do arroz aínda funciona como dominio autoinhibitorio, o C-terminal da isoforma das maceiras non. Finalmente, a estrutura da GAD de plantas é un hexámero e ten unha actividade dependente do pH, cun pH óptimo de 5, 8 en moitas especies. pero tamén con actividade significativa a pH 7, 3 en presenza de calmodulina. Tamén se pensa que o control da GAD pode servir para mellorar a calidade das colleitas de cítricos despois da recollida. En cítricos, observouse que a glutamato descarboxilase xoga un papel clave no metabolismo do citrato. Co incremento da GAD por exposición directa, os niveis de citrato increméntanse significativamente nas plantas, e en combinación o mantemento da calidade poscolleita melloraba significativamente, á vez que a velocidade de aparición de podremia decrecía.
Igual que a GAD en plantas, a GAD en E. coli ten unha estrutura hexámera e é máis activa a pH ácido; o pH óptimo para a GAD de E. coli é 3, 8-4, 6. Porén, a diferenza das plantas e lévedos, a GAD de E. coli non require a unión á calmodulina para funcionar. Hai tamén dúas isoformas da GAD, chamadas GadA e GadB, codificada por xenes diferentes en E. coli, se ben ambas as isoformas son bioquimicamente idénticas. O encima xoga un papel principal para dar resistencia aos ácidos e permitir que a bacteria sobreviva temporalmente en ambientes moi ácidos (pH < 2, 5), como o estómago. Isto faise ao descarboxilar a GAD o glutamato orixinando GABA, para o cal cómpre que se capte H+ como reactivo e se eleve o pH dento da bacteria. O GABA pode despois exportarse fóra da célula de E. coli e contribúe ao incremento do pH dos ambientes extracelulares próximos.