Electroforese en xel

A electroforese en xel é un método bioquímico para a separación e análise de macromoléculas (ADN, ARN e proteínas) e os seus fragmentos, baseándose no seu tamaño e carga. Utilízase en química clínica para separar proteínas pola súa carga e/ou tamaño (o isoelectroenfoque en agarosa é esencialmente independente do tamaño) e en bioquímica e bioloxía molecular para separar unha poboación mixta de moléculas de fragmentos de ADN e ARN pola súa lonxitude, para estimar o tamaño de fragmentos de ADN e ARN ou para separar proteínas pola súa carga.
As moléculas de ácidos nucleicos son separadas aplicando un campo eléctrico para mover moléculas cargadas negativamente a través dunha matriz de agarosa ou outras substancias. As moléculas máis curtas móvense máis rápido e migran máis lonxe que as máis longas, porque as moléculas máis curtas migran máis facilmente a través dos poros do xel. Este fenómeno denomínase cribado.
As proteínas sepáranse pola súa carga en agarosa, porque os poros do xel son demasiado grandes para cribar as proteínas.
A electroforese en xel pode utilizarse tamén para a separación de nanopartículas.
A electroforese en xel utiliza un xel como medio anticonvectivo e/ou como medio de cribado durante a electroforese, a cal é o movemento dunha partícula cargada nun campo eléctrico. Os xeles suprimen a convección térmica causada pola aplicación do campo eléctrico, e poden tamén actuar como medio de cribado, retardando o paso das moléculas; os xeles poden tamén servir simplemente para manter a separación unha vez acabada a electroforese, para que se poida aplicar a tinguidura post-electroferese. A electroforese en xel de ADN realízase xeralmente con propósitos analíticos, a miúdo despois da amplificación do ADN por medio de PCR, pero pode utilizarse como unha técnica preparativa previa ao uso doutros métodos como a espectrometría de masas, RFLP, PCR, clonación, secuenciación do ADN, ou o Southern blot (e para outras moléculas noutras técnicas de blotting) para unha posterior caracterización. Base física
En poucas palabras, pode dicirse que a electroforese é un proceso que arrastra as moléculas debido á súa carga e permite separalas de acordo co seu tamaño. Créase un campo eléctrico no que se sitúan as moléculas (como por exemplo o ADN), e estas vanse mover a través do xel de ágar ou poliacrilamida. O campo eléctrico consiste nunha carga negativa aplicada nun lado do xel e outra positiva no outro extremo, que causan o arrastre das moléculas. As moléculas colócanse en pozos feitos no material do xel. O xel sitúase nunha cámara de electroforese, conectada a unha fonte eléctrica. Cando se aplica a corrente eléctrica, as moléculas máis grandes móvense lentamente a través do xel e as moléculas máis pequenas móvense máis rápido. As moléculas de diferentes tamaños quedan separadas formando distintas bandas no xel.
O termo "xel" neste caso refírese á matriz utilizada para conter e despois separar as moléculas diana. Na maioría dos casos, o xel é un polímero con enlaces cruzados (reticulado), cuxa composición e porosidade se elixe baseándose no peso específico e composición da diana que vai ser analizada. Cando se están a separar proteínas ou pequenos ácidos nucleicos (ADN, ARN, ou oligonucleótidos) o xel está xeralmente composto de diferentes concentracións de acrilamida e un reactivo que crea enlaces cruzados, producindo unha rede de diferentes calibres no xel, agora chamado de poliacrilamida. Cando se están a separar ácidos nucleicos máis grandes (maiores duns poucos centos de bases), a matriz preferida é a agarosa purificada. En ambos os casos, o xel forma unha matriz sólida pero porosa. A acrilamida, a diferenza da poliacrilamida, é unha neurotoxina e debe ser manipulada usando as precaucións de seguridade axeitadas para evitar envelenamentos. A agarosa está composta de cadeas non ramificadas longas de carbohidratos non cargados sen enlaces cruzados, que dan lugar a un xel con grandes poros, que permiten a separación de macromoléculas e complexos macromoleculares.
O termo "electroforese" fai referencia á forza electromotriz (FEM), que é utilizada para mover as moléculas a través da matriz do xel. Ao situar as moléculas en pozos no xel e aplicar un campo eléctrico, as moléculas móvense a través da matriz a diferentes velocidades, determinadas fundamentalmente pola súa masa cando a razón carga/masa (Z) de todas as especies é uniforme. Porén, cando as cargas non son todas uniformes entón, o campo eléctrico xerado polo procedemento de electroforese afectará ás especies que teñan diferentes cargas e, por tanto, atraerá as especies de acordo coas súas cargas opostas. As especies que están cargadas positivamente (catións) migrarán cara ao cátodo, que está cargado negativamente, xa que na electroforese os eléctrodos compórtanse igual que nunha cuba electrolítica. Se as especies están cargadas negativamente (anións) migrarán cara ao ánodo, que está cargado positivamente.
Se se cargan varias mostras en pozos adxacentes do xel, moveranse (correrán) paralelamente en pistas ou carreiros do xel individuais. Dependendo do número de moléculas diferentes, cada unha destas pistas mostra a separación dos compoñentes desde a mestura orixinal en forma dunha ou máis bandas, unha banda por compoñente. Cando a separación dos compoñentes é incompleta poden formarse bandas solapadas indistinguibles que representan moitos compoñentes non resoltos. As bandas situadas en diferentes pistas do xel que acaban á mesma distancia conteñen moléculas que atravesaron o xel á mesma velocidade, o que significa xeralmente que son aproximadamente do mesmo tamaño. Disponse de marcadores de tamaño de peso molecular que conteñen unha mestura de moléculas de tamaños coñecidos. Se tales marcadores corren nunha pista do xel en paralelo ás mostras de moléculas descoñecidas, as bandas que se observan poden compararse coas da mestura descoñecida para determinar o seu tamaño.
Hai límites ás técnicas electroforéticas. Como ao pasar a corrente eléctrica polo xel se orixina calor, os xeles poden fundirse durante a electroforese. A electroforese realízase en solucións tampón para reducir os cambios de pH debidos ao campo eléctrico, o cal é importante, porque a carga do ADN e ARN depende do pH. Pero correr as moléculas no xel durante longo tempo pode esgotar a capacidade de tamponamento da solución. Ademais, diferentes preparacións de material xenético pode que non migren da mesma maneira, por razóns morfolóxicas ou outras. Tipos de xel
Os tipos de xel usados normalmente son os de agarosa e poliacrilamida. Cada tipo de xel é o máis axeitado para diferentes tipos de tamaños e analitos. Os xeles de pliacrilamida utilízanse xeralmente para proteínas, e teñen un poder de resolución máis alto para pequenos fragmentos de ADN (5-500 pares de bases). Os xeles de agarosa, pola súa parte, teñen un menor poder de resolución para o ADN pero teñen un maior rango de separación, e úsanse, por tanto, para separar fragmentos de ADN de normalmente 50-20. 000 pares de bases de tamaño, pero tamén é posible unha resolución dunhas 6 Mb coa electroforese en xel de campo pulsado (PFGE). Os xeles de poliacrilamida córrense en configuración vertical, mentres que os de agarosa normalmente fano horizontalmente en modo submarino. Tamén difiren no seu modo de formación, xa que os de agarosa endurecen termicamente, mentres que os de poliacrilamida se forman por unha reacción de polimerización química.
Agarosa
Os xeles de agarosa están feitos de polímeros de polisacáridos naturais extraídos de algas. Os xeles de agarosa son facilmente moldeables e manipulables comparados con outras matrices, porque a formación do xel é un cambio físico en vez de químico. Ademais, as mostras poden recuperarse doadamente. Despois de que remata o experimento, o xel resultante pode almacenarse nunha bolsa de plástico nun refrixerador.
Os xeles de agarosa non teñen un tamaño de poro uniforme, pero son óptimos para a electroforese de proteínas maiores de 200 kDa. A electrofrese en xel de agarosa pode utilizarse tamén para a separación de fragmentos de ADN que van desde 50 pares de bases a varias megabases (millóns de bases), e para as máis grandes cómpre usar un aparello especializado. A distancia entre as bandas de ADN de diferentes lonxitudes está influenciada pola porcentaxe de agarosa no xel, e os de maior porcentaxe requiren un maior tempo de funcionamento do aparello, algunhas veces días. Os xeles de alto porcentaxe de agarosa deberían mellor usarse con electrofrese en xel de campo pulsado (PFE), ou electroforese de inversión de campo.
"A maioría dos xeles de agarosa fanse con agarosa entre o 0, 7% (para unha boa separación ou resolución de fragmentos grandes de ADN de 5–10kb) e o 2% (para unha boa resolución dos pequenos fragmentos de 0, 2–1kb) disoltos no tampón de agarosa. Pode usarse ata o 3% para separar fragmentos moi pequenos pero nese caso é máis apropiado un xel de poliacrilamida vertical. Os xeles de porcentaxes baixas son moi febles e poden romper cando se intenta levantalos. Os xeles de porcentaxes altas son a miúdo fráxiles e non se endurecen uniformemente. Os xeles ao 1% son comúns para moitas aplicacións. "
Poliacrilamida
A electroforese en xel de poliacrilamida (PAGE) utilízase para separar proteínas que están entre os 5 e os 2. 000 kDa debido ao tamaño uniforme de poro proporcionado polo xel de poliacrilamida. O tamaño do poro contrólase modulando as concentracións de acrilamida e po de bis-acrilamida usados para fabricar o xel. Debe terse coidado cando se prepara esta tipo de xel, xa que a acrilamida é unha potente neurotoxina nas súas formas líquida e en po.
As técnicas tradicionais de secuenciación do ADN, como os métodos de Maxam-Gilbert ou de Sanger, usaban xeles de poliacrilamida para separar fragmentos de ADN cuxas lonxitudes se diferenciaban nun só par de bases para que se puidese ler a secuencia. Métodos máis modernos de separación de ADN usan agora xeles de agarosa, agás para fragmentos de ADN especialmente pequenos. Actualmente utilízase máis comunmente no campo da inmunoloxía e análises de proteínas, a miúdo usados para separar diferentes proteínas ou isoformas da mesma proteína en bandas separadas. Estas poden ser transferidas a unha membrana de nitrocelulosa ou PVDF para ser sondadas con anticorpos e os correspondentes marcadores, como se fai nun western blot.
Os xeles de resolución típicos fanse ao 6%, 8%, 10%, 12% ou 15%. Adoitan utilizarse dous xeles un enriba do outro. O xel da parte superior ou de amontoamento (stacking gel, ao 5%) déitase enriba do xel inferior ou de resolución, e insírese un peite de xel (que forma os pozos e define as pistas polas que correrán as proteínas, e o tampón da mostra e escadas). A porcentaxe que se escolle depende do tamaño da proteína que se desexe identificar ou sondar na mostra. Canto máis pequeno sexa o peso molecular coñecido da proteína, maior será a porcentaxe que debería utilizarse. Os cambios no sistema tampón do xel poden axudar a obter unha maior resolución de proteínas de tamaños moi pequenos.
Amidón
O amidón parcialmente hidrolizado de pataca é outro medio non tóxico para facer electroforese de proteínas. Os xeles son lixeiramente máis opacos que os de acrilamida ou agarosa. As proteínas non desnaturalizadas poden separarse con este xel pola súa carga e tamaño. Visualízanse usando as tinguiduras Negro Amidón (Amido Black) ou Negro Naftal (Napthal Black). As concentracións típicas dos xeles de amidón están entre o 5 e o 10%. Condicións do xel
Desnaturalizantes
Os xeles desnaturalizantes córrense en condicións nas que se altera a estrutura natural do analito, causando que se a súa estrutura se despregue formando unha cadea lineal. Así, a mobilidade de cada macromolécula depende só da súa lonxitude lineal e da súa razón masa/carga. Así, quedan alterados os niveis da estrutura biomolecular secundario, terciario e cuaternario, de modo que só pode ser analizada a estrutura primaria.
Os ácidos nucleicos desnaturalízanse a miúdo incluíndo urea no tampón, mentres que as proteínas se desnaturalizan usando dodecilsulfato sódico, xeralmente como parte do proceso SDS-PAGE. Para unha desnaturalización completa das proteínas, tamén cómpre reducir as pontes disulfuro covalentes que estabilizan as súas estruturas terciaria e cuaternaria, un método chamado PAGE redutora. As condicións redutoras mantéñense xeralmente por adición de beta-mercaptoetanol ou ditiotreitol. Para unha análise xeral de mostras de proteínas, a PAGE redutora é a forma máis común de electroforese de proteínas.
As condicións de desnaturalización son necesarias para unha estimación adecuada do peso molecular do ARN. O ARN pode formar máis interaccións intramoleculares que o ADN, que poden orixinar cambios na súa mobilidade electroforética. A urea, DMSO e glioxal son os axentes desnaturalizantes que se usan máis a miúdo para alterar a estrutura do ARN. Orixinalmente, o composto moi tóxico hidróxido de metilmercurio era o que se usaba comunmente na electroforese de ARN desnaturalizado, pero aínda pode ser un método axeitado para algunhas mostras.
A electroforese en xel desnaturalizante utilízase nos métodos baseados nos patróns de bandas de ARN e ADN, como a DGGE (electroforese en xel en gradiente desnaturalizante) a TGGE (electroforese en xel de gradiente de temperatura), e a TTGE (electroforese en gradiente de temperatura temporal).
Nativas
Os xeles nativos corren en condicións non desnaturalizantes, de modo que se mantén a estrutura natural do analito. Isto permite que o tamaño físico do complexo ensamblado ou pregado afecte á mobilidade, o que permite a análise dos catro niveis estruturais da biomolécula. Para mostras biolóxicas, utilízanse deterxentes só na medida en que sexan necesarios para a lise das membranas lipídicas da célula. Os complexos permanecen na súa maior parte asociados e pregados tal como o estarían na célula. Porén, un problema é que os complexos pode que non se separen limpamente ou prediciblemente, xa que é difícil predicir como a forma e tamaño da molécula vai afectar á súa mobilidade.
A diferenza dos métodos de desnaturalización, a electroforese en xel nativa non usa un axente desnaturalizante. As moléculas que se van separar (xeralmente proteínas ou ácidos nucleicos), que difiren non só en masa molecular e carga intrínseca, senón tamén na área da sección transversal, experimentan diferentes forzas electroforéticas dependentes da forma ou do conxunto da estrutura. Como as proteínas permanecen en estado nativo poden ser visualizadas non só polos reactivos para a tinguidura de proteínas xerais, senón tamén por tinguiduras ligadas a encimas específicos.
A electroforese en xel en estado nativo utilízase tipicamente en proteómica e metalómica. Porén, a PAGE nativa utilízase tamén para escanear xenes (ADN) de mutacións descoñecidas como no polimorfismo de conformación de febra simple. Tampóns
Os tampóns na electroforese en xel utilízanse para proporcionar ións que transporten a corrente e manteñan o pH a un valor relativamente constante. Entre os varios tampóns que se utilizan en electroforese, os máis comúns son, para ácidos nucleicos, o Tris/Acetato/EDTA (TAE), e o Tris/Borato/EDTA (TBE). Propuxéronse moitos outros tampóns, por exemplo, o borato de litio (LB), que case nunca se usa, a histidina isoeléctrica, tampóns axustados ao pK etc. ; na maioría dos casos a razón que se pretende para o seu uso é que teñen mobilidades de ións axustadas ou que precisan menor corrente eléctrica (menos calor), o que fai que o tampón teña unha vida máis longa. O borato é problemático, porque pode polimerizar e interaccionar cos cis diois como os que se encontran no ARN. O TAE é o tampón coa capacidade de tamponización máis baixa, pero proporciona a mellor resolución para ADNs grandes. Isto significa unha menor voltaxe e máis tempo, pero un mellor produto. O LB é relativamente novo e non é efectivo para resolver fragmentos de lonxitudes maiores de 5 kbp; porén, con esta condutividade tan baixa, podería utilizarse unha voltaxe maior (ata 35 V/cm), o cal significa un tempo de análise máis reducido para electroforeses de rotina. Podería resolverse unha diferenza tan pequena como un só par de bases nun xel de agarosa ao 3% cunha condutividade do medio extremadamente baixa (1 mM de borato de litio).
A maioría das separacións de proteínas por SDS-PAGE realízanse usando un sistema tampón "descontinuo" (ou DISC), que potencia significativamente a nitidez das bandas no xel. Durante a electroforese nun sistema de xel descontinuo, fórmase un gradiente iónico no estadio inicial da electroforese, que causa que todas as proteínas se enfoquen nunha soa banda ben definida nun proceso chamado isotacoforese. A separación de proteínas por tamaño conséguese na rexión "de resolución" máis baixa do xel. O xel de resolución tipicamente ten un tamaño de poro moito menor, o cal orixina un efecto de cribado que agora determina a mobilidade electroforética das proteínas. Visualización
Unha vez que se completa a electroforese, as moléculas que foron separadas no xel poden ser tinguidas para facelas visibles. O ADN pode visualizarse usando bromuro de etidio, o cal, a intercalarse no ADN, xera fluorescencia cando se pon baixo luz ultravioleta, mentres que a as proteínas poden visualizarse utilizando tinguidura de prata ou o colorante Azul Brillante Coomassie. Hai outros métodos que se poden utilizar para visualizar as bandas do xel. Se as moléculas que hai que separar conteñen radioactividade, por exemplo na secuenciación do ADN, pode gravarse un autorradiograma do xel. Poden tomarse tamén fotografías do xel, xeralmente usando o sistema Gel Doc. Procesamento posterior
Despois da separación, pode utilizarse un método de separación adicional chamado isoelectroenfoque ou SDS-PAGE. O xel córtase fisicamente, e extráense os complexos de proteínas de cada porción separadamente. Cada extracto pode despois ser analizado, por exemplo por pegada peptídica ou secuenciación de péptido de novo despois dunha dixestión en xel. Isto pode proporcionar unha gran cantidade de información sobre as identidades das proteínas presentes no complexo. Aplicacións
Estimación do tamaño de moléculas de ADN despois de dixestión con encimas de restrición, por exemplo, en mapado de restrición de ADN clonado.
Análise de produtos de PCR, por exemplo, en diagnose xenética molecular ou pegada xenética
Separación de ADN xenómico restrinxido antes dunha transferencia de Southern, ou de ARN antes dunha transferencia northern.
A electroforese en xel utilízase en química forense, bioloxía molecular, xenética, microbioloxía e bioquímica. Os resultados poden analizarse cuantitativamente por visualización do xel con luz UV e un aparello de visualización do xel. A imaxe grávase cunha computadora operada por cámara, e a intensidade da banda ou punto de interese mídese e compárase cun estándar ou con marcadores cargados no mesmo xel. As medidas e análises fanse principalmente con software especializado.
Segundo o tipo de análise que se vaia facer, poden aplicarse outras técnicas xunto cos resultados da electroforese en xel, que teñen unha ampla gama de aplicacións específicas de diversos campos.
Ácidos nucleicos
No caso dos ácidos nucleicos, a dirección da migración, desde os eléctrodos negativos aos positivos, débese á carga negativa natural que ten o seu esqueleto azucre-fosfato.
Os fragmentos de ADN bicatenarios compórtanse naturalmente como longos bastóns, polo que a súa migración a través do xel está en relación co seu tamaño ou, para fragmentos cíclicos, co seu raio de xiro. Con todo, o ADN circular como o de plásmidos, pode presentar moitas bandas na electroforese, a súa velocidade de migración pode depender de se está relaxado ou superenrolado. Os ADNs monocatenarios e os ARNs tenden a pregarse formando moléculas con formas complexas e migran a través do xel de maneiras complicadas que dependen da súa estrutura terciaria. Por tanto, os axentes que alteran os enlaces de hidróxeno, como o hidróxido de sodio ou a formamida, utilízanse para desnaturalizar os ácidos nucleicos e facer que se comporten de novo como longos bastóns.
A electroforese en xel de grandes moléculas de ADN ou ARN faise xeralmente por medio dunha electroforese en xel de agarosa. No "método de terminación de cadea" utilízase un xel de secuenciación do ADN de poliacrilamida. A caracterización por medio da interacción cun ligando dos ácidos nucleicos ou fragmentos pode realizarse por electroforese de afinidade de corremento de mobilidade.
A electroforese de mostras de ARN pode utilizarse para comprobar a contaminación do ADN xenómico e tamén para a degradación do ARN. O ARN de organismos eucarióticos mostra diferentes bandas de ARNr 28S e 18S, a banda de 28S é aproximadamente dúas veces máis intensa que a de 18S. O ARN degradado ten menos bandas nitidamente definidas, ten unha aparencia máis esvaída, e a proporción da intensidade é de menos de 2: 1.
Proteínas
A diferenza dos ácidos nucleicos, as proteínas, poden ter cargas variadas e formas complexas, e, por tanto, non poden migrar nun xel de poliacrilamida a velocidades similares, ou non o fan en absoluto, cando aplicamos unha forza electromotriz (EMF) de negativa a positiva na mostra. En consecuencia, as proteínas xeralmente son desnaturalizadas en presenza dun deterxente como o docdecilsulfato sódico (SDS) que cobre as proteínas con cargas negativas. Xeralmente, a cantidade de SDS unido está en relación co tamaño das proteínas (xeralmente 1, 4 g de SDS por gramo de proteína), para que as proteínas desnaturalizadas resultantes teñan unha carga negativa global, e todas as proteínas teñen unha razón similar carga/masa. Como as proteínas desnaturalizadas actúan como longos bastóns en lugar de ter unha estrutura terciaria complexa, a velocidade coa que unha proteína cuberta con SDS migra no xel só está en relación ao seu tamaño e non á súa carga ou forma.
As proteínas son analizadas xeralmente por electroforese en xel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE), por electroforese en xel nativo, por electroforese en xel de poliacrilamida continuo nativo preparativo cuantitativo (QPNC-PAGE), ou por electroforese bidimensional.
A caracterización por medio da interacción cun ligando pode realizarse por electroblotting ou por electroforese de afinidade en agarosa ou por electroforese capilar e para a estimación das constantes de unión e a determinación de características estruturais como o contido en glicanos por medio da unión de lectinas. Historia
1930s – primeiros informes do uso de sacarosa para a electroforese en xel.
1955 – introdución de xeles de amidón cos que se obtiña unha mediocre separación. Mellora do método por Oliver Smithies.
1959 – introdución de xeles de acrilamida; electroforese en disco (Ornstein e Davis); control preciso dos parámetros como tamaño do poro e estabilidade (Raymond e Weintraub).
1966 – xeles de ágar.
1969 – introdución de axentes desnaturalizantes especialmente separación con SDS de subunidades proteícas (Weber e Osborn).
1970 – Laemmli separou 28 compoñentes do fago T4 usando un xel amontoado (stacking gel) e SDS.
1972 – xeles de agarosa con tinguidura de bromuro de etidio.
1975 – xeles bidimensionais (O’Farrell); isoelectroenfoque despois dunha electroforese en xel SDS.
1977 – xeles de secuenciación.
1983 – electroforese en xel de campo pulsado, que permite a separación de grandes moléculas de ADN.
1983 – introdución da electroforese capilar.
2004 – tempo estandarizado de polimerización de xeles PAGE, que permiten unha separación nítida e predicible de proteínas nativas.