MicroADN

O microADN ou microDNA é o subtipo máis abundante de ADN extracromosómico circular (ADNecc) en humanos, atopado no núcleo celular, caracterizado por ter tamaños que van desde 200 a 400 pares de bases, estar enriquecido en secuencias xenómicas non repetitivas e ter unha alta densidade de exóns. Ademais, o microADN orixínase a partir de rexións con illas CpG que se adoitan atopar nas rexións non traducidas (UTR) 5' e 3'. Como se orixina a partir de rexións en activa transcrición, hipotetízase que o microADN pode orixinarse como un subproduto da reparación de danos no ADN transcricionais. Tamén se pensa que o microADN pode orixinarse noutras vías de reparación do ADN, principalmente debido a que as secuencias parentais do microADN teñen repeticións directas de 2 a 15 bp nos extremos, resultantes da reparación do deslizamento (slippage) na reparación. Como o seu descubrimento é recente, o papel xogado polo microADN dentro e fóra da célula aínda non se comprende ben. Con todo, actualmente pénsase que o microADN afecta á homeostase celular por medio da unión de factores de transcrición e foi utilizado como biomarcador do cancro. Descubrimento
O microADN foi descuberto utilizando protocolos similares aos usados para a extracción de ADNecc en xeral. Concretamente, xeráronse clons de ADNecc por amplificación de múltiple desprazamento e secuenciáronse por secuenciación de Sanger, o que conduciu ao descubrimento do microADN. Agora que a secuenciación de alto rendemento é unha práctica mái común, pode obterse a secuencia xenómica completa do ADNecc de mamífero secuenciando os produtos de amplificación rodante de ADNecc. Despois utilízanse métodos computacionais para identificar as secuencias de unión no ADN. Descubriuse que os picos de produtos atopados con lonxitudes de 180 e 380 bp eran microADN e caracterizábanse polas súas illas CpG e estaban flanqueados por repeticións directas de 2 a 15 bp.
Desde o seu descubrimento, o microADN foi identificado en todos os tipos de tecidos e moitas mostras extraídas, incluíndo tecidos de rato e liñas celulares de cancro humanas. Porén, cada especie ten sitios xenómicos únicos que producen especificamente microADN. Como hai puntos xenómicos comúns que producen microADN en múltiples tipos de células e tecidos dunha determinada especie, hai probas de que podería producirse non soamente como un subproduto da síntese do ADN, senón tamén doutros xeitos. Porén, varios estudos revelaron un agrupamento separado dos microADN extraídos de liñas celulares de diferentes tecidos, o que suxire que a súa formación pode estar ligada á liñaxe celular de que se trate e atopáronse ambientes transcricionais exclusivos en diferentes tipos celulares. Bioxénese
Aínda que quedan moitas cousas por saber sobre o microADN, foi asociado coa actividade transcricional e múltiples vías de reparación do ADN. Como o microADN se produce en áreas de alta actividade de transcriciónn/densidade de exóns, podería formarse na reparación do ADN durante a transcrición. Un dato interesante é que os híbridos de ADN: ARN de febra tripla formados durante a transcrición, denominados bucles R, tenden a formar illas CpG dentro dos UTRs 5' e 3', similares ao microADN. Os bucles R están correlacionados con danos no ADN e inestabilidade xenética, o cal suxire que o microADN pode formarse a partir do bucle de ADN monocatenario durante a resposta a danos no ADN para os bucles R. Na replicación do ADN de repeticións directas curtas (como as que se encontran nas rexións dos flancos de fontes de xenes de microADN), é posible que se formen bucles de ADN, na febra parental ou produto, por deslizamento (slippage) na replicación. Para reparar isto, a vía de reparación de discordancias (MMR) pode eliminar o bucle e, despois da ligación dos extremos repetidos, pode producirse microADN monocatenario. O microADN monocatenaio é despois convertido en ADN bicatenario, pero este proceso é aínda descoñecido. É importante notar que se o bucle se forma na febra acabada de replicarse, non hai unha deleción significativa no xenoma, mentres que poden formarse microdelecións por excisións na febra molde. Para comprender o papel que a reparación de discordancias pode ter na bioxénese do microADN, realizouse unha análise da abundancia de microADN en células DT40 despois da eliminación de MSH3, unha proteína esencial na reparación de discordancias (MMR). O microDNA resultante da liña celular DT40 MSH3-/- tiñan un maior enriquecemento de illas CpG comparado co tipo silvestre, así como unha redución dun 80% de microADN bicatenario. Así, hipotetízae que a vía MMR é esencial para a produción de microADN de zonas sen illas de CpG do xenoma, mentres que o microADN enriquecido en CpG fórmase por unha vía de reparación diferente. De novo, debido á microhomoloxía no xenoma molde, se hai unha rotura no ADN ou unha pausa na replicación (atasco da forquita de replicación), o ADN de nova síntese pode circularizarse formando microADN monocatenario. Isto significa que cando se repara o molde de ADN despois da creación de microADN, non hai deleción. O microADN creado pola vía de reparación de discordancias (MMR) e o atasco da forquita de replicación é o resultado de erros na replicación do ADN; porén, hai evidencias de que o microDNA está presente tamén en células que non están en división. Isto significa que algúns microADN se producen por vías de reparación que tamén se dan en células quiescentes, como os extremos 5' dos elementos LINE1 que se sabe que se transpoñen. Para moverse polo xenoma, os transposón de ADN requiren unha transposase para eliminar o transposón do seu sitio orixinal e catalizar a súa inserción noutra parte do xenoma. Así, créase o transposón por roturas de dobre febra do ADN, creando tamén unha microdeleción no ADN. Este fragmento de ADN bicatenario pode ser circularizado por circularización mediada por microhomoloxía, creando un microADN bicatenario. Implicacións
Unión de factores de tanscrición
O microADN é de só 200-400 bp de longo, polo que é demasiado pequeno para codificar proteínas; porén, pode ser importante para o efecto de esponxa molecular. Os factores de transcrición adoitan unirse ao promotor ou secuencias regulatorias no extremo 5' do ADN para iniciar a transcrición. Estes factores de transcrición poden tamén unirse aos seus respectivos sitios de recoñecemento no microADN porque o microADN adoita orixinarse a partir do 5' UTR do seu xene parental, por tanto, actuando como unha esponxa para os factores de transcrición. Isto significa que o microADN pode controlar indirectamente a expresión xénica e a homeostase da transcrición.
Aplicacións no cancro
En xeral, as moléculas de ácidos nucleicos que se encontran na circulación sanguínea, denominados circulantes ou libres de células, son un biomarcador de enfermidade relativamente novo que se está a investigar, incluíndo para a diagnose e progresión do cancro. Estas moléculas, como o ADN libre de células, libéranse ao sangue despois da morte das células e, en casos de cancro, poden identificarse baseándose nas mutacións coñecidas en oncoxenes. En estudos recentes estendeuse o uso de ácidos nucleicos libres de células como biomarcadores do cancro ao microADN. O microADN libre de células (cfmicroDNA ou cell-free microDNA) obtívose do soro humano e de rato e debido ás súas semellanzas co microADN derivado de células, como se describiu máis arriba, concluíuse que o microDNA libre de células se produce na célula. De xeito similar, cando se compara o tecido pulmonar antes e despois da extirpación dun tumor, non se atopa diferenza nas características clave do microADN circulante que non sexa unha tendencia inesperada de haber secuencias de microADN circulante máis longas nos pacientes de cancro antes da extirpación do tumor. Atopouse que a lonxitude do microADN libre de células era máis curta despois da cirurxía. O ADN libre de células é rapidamente eliminado do sangue, o que fai difícil usalo como biomarcador do cancro. Porén, como o ADN circular non é susceptible de ser roto pola RNAse e exonuclease, é máis estable que o ADN lineal. En combinación co alongamento observado dos microADN libres de células no soro dos pacientes de cancro, isto fai que o microADN circulante sexa un bo biomarcador do cancro tanto para o diagnóstico coma para a progresión despois do tratamento.