Electroforese en xel bidimensional

A electroforese en xel bidimensional, abreviada como electroforese 2-D ou, en inglés 2-DE, é unha forma de electroforese en xel utilizada normalmente para analizar proteínas. As mesturas de proteínas son separadas aproveitando dúas das súas propiedades en xeles bidimensionais (2D). Esta técnica foi introducida independentemente por O'Farrell e Klose en 1975. Base para a separación
A electroforese 2-D empeza cunha electroforese na primeira dimensión e despois separa as moléculas perpendicularmente desde esa primeira para crear un electroferograma na segunda dimensión. Na electroforese na primeira dimensión as moléculas sepáranse linearmente segundo o seu punto isoeléctrico. Na segunda dimensión as moléculas son separadas nun ángulo de 90 graos desde o primeiro electroferograma segundo a súa masa molecular. Como é improbable que dúas moléculas sexan similares en dúas propiedades distintas, as moléculas son separadas con maior efectividade na electroforese 2-D que na 1-D.
As dúas dimensións nas que se separan as proteínas usando esta técnica poden ser o seu punto isoeléctrico, masa do complexo proteico en estado nativo, ou a masa da proteína.
A separación das proteínas por punto isoeléctrico denomínase isoelectroenfoque (IEF). Desta maneira, aplícase un gradiente de pH a un xel e un potencial eléctrico a través do xel, facendo un dos extremos máis positivo que o outro. A todos os valores de pH distintos dos seus puntos isoeléctricos, as proteínas estarán cargadas. Se están cargadas positivamente, serán puladas cara ao extremo máis negativo do xel e se están cargadas negativamente serán puladas cara ao extremo máis positivo. As proteínas aplicaads na primeira dimensión móvense ao longo do xel e acumúlanse nos seus puntos isoeléctricos; é dicir, o punto ao cal a carga global da proteína é 0 (carga neutra).
Para a análise do funcionamento das proteínas nunha célula, o coñecemento da cooperación entre elas é esencial. A maioría das proteínas actúan xuntas en complexos para seren completamente funcionais. A análise desta organización suborganular da célula require o uso de técnicas que conserven o estado nativo dos complexos proteicos. Na electroforese en xel de poliacrilamida nativa (PAGE nativa), as proteínas permanecen nos seus estados nativos e sepáranse no seu campo eléctrico segundo a súa masa e a masa dos seus complexos, respectivamente. Para obter unha separación por tamaño e non por carga neta, como na IEF, transfírese unha carga adicional ás proteínas utilizando Azul Brillante Coomassie ou dodecilsulfato de litio. Despois de completar a primeira dimensión, os complexos son destruídos ao aplicar unha SDS-PAGE desnaturalizante na segunda dimensión, onde as proteínas de ditos complexos son separadas pola súa masa.
Antes de separar as proteínas pola masa, son tratadas con dodecil sulfato de sodio (SDS) xunto con outros reactivos (SDS-PAGE en 1-D). Isto desnaturaliza as proteínas (é dicir, despréganse formando unha molécula longa e recta) e únense a certo número de moléculas de SDS de forma aproximadamente proporcional á lonxitude da proteína. Como a lonxitude dunha proteína (cando se despregou) é aproximadamente proporcional á súa masa, isto equivale a dicir que se une a un número de moléculas de SDS aproximadamente proporcional á masa da proteína. Como as moléculas de SDS están cargadas negativamente, o resultado disto é que as proteínas terán todas case a mesma razón masa-carga. Ademais, as proteínas non migran cando non teñen carga (un resultado do paso do electroenfoque), polo que a cobertura da proteína con SDS (cargado negativamente) permite a migración das proteínas na segunda dimensión (SDS-PAGE, non é compatible para o uso na primeira dimensión, xa que está cargado e hai que usar un deterxente non iónico ou zwitteriónico).
Na segunda dimensión, aplícase outra vez un potencial eléctrico, pero nun ángulo de 90 graos desde o primeiro campo. As proteínas serán atraídas ao lado máis positivo do xel (porque o SDS está cargado negativamente) proporcionalmente ás súas razóns masa-carga. Como xa se explicou, esta razón será case igual para todas as proteínas. O avance das proteínas é retardado por causa das forzas de fricción. O xel, por tanto, actúa como un baruto molecular cando se aplica a corrente, separando a proteína baseándose no seu peso molecular e as proteínas máis grandes serán retidas máis arriba no xel e as proteínas máis pequenas, que poden pasar a través do baruto, chegan a rexións máis baixas do xel. Detección de proteínas
O resultado disto é un xel con proteínas espalladas pola súa superficie. Estas proteínas poden detectarse por diversos medios, pero o que máis se usa é a tinguidura con prata ou Azul Brillante Coomassie. No primeiro caso, aplícase o xel un coloide de prata. A prata únese aos residuos cisteína da proteína. A prata escurécese ao expoñela a luz ultravioleta. A cantidade de prata pode relacionarse co escuro que se presente o xel e, por tanto, a cantidade de proteína que hai nunha determinada localización do xel. Esta medida pode dar só cantidades aproximadas, pero é adecuada para a maioría dos propósitos. A tinguidura de prata é 100 veces máis sensible que a de Azul Brillante Coomassie cun rango de linearidade 40 veces maior.
Outras moléculas distintas das proteínas poden tamén separarse por electroforese 2D. En ensaios de superenrolamento, o ADN enrolado é separado na primeira dimensión e desnaturalizado por medio dun intercalador do ADN (como o bromuro de etidio ou a menos carcinóxena cloroquina) na segunda dimensión. Isto é comparable á combinación de PAGE nativa/SDS-PAGE na separación de proteínas. Técnicas comúns
IPG-DALT
Unha técnica común é usar un gradiente de pH inmobilizado (IPG) na primeira dimensión. Esta técnica denomínase IPG-DALT. A mostra sepárase primeiro no xel de IPG (que se pode obter comercialmente) e despois o xel córtase en láminas para cada mostra, que é despois equilibrada en SDS-mercaptoetanol e aplicada a un xel de SDS-PAGE para a resolución na segunda dimensión. Tipicamente, a IPG-DALT non se usa para a cuantificación de proteínas debido á perda de compoñentes de baixo peso molecular durante a transferencia ao xel de SDS-PAGE.
IEF SDS-PAGE
Trátase duunha SDS-PAGE con isoelectroenfoque. Software para a análise de xeles 2D
En proteómica cuantitativa, estas ferramentas analizan primariamente biomarcadores para cuantificar proteínas individuais e mostran a separación entre unha ou máis "manchas " de proteínas nunha imaxe escaneada dun xel bidimensional. Adicionalmente, estas ferramentas establecen as correspondencias entre manchas de xeles de mostras similares para poñer en evidencia, por exemplo, as diferenzas proteómicas entre os estadios iniciais e avanzados dunha enfermidade. Entre os paquetes de software están Delta2D, ImageMaster, Melanie, PDQuest, SameSpots e REDFIN, entre outros. Aínda que esta tecnoloxía se utiliza amplamente, a súa intelixencia non foi perfeccionada. Por exemplo, aínda que PDQuest e SameSpots tenden a concordar na cuantificación e análise de manchas de proteínas ben definidas e ben separadas, dan lugar a diferentes resultados e tendencias de análise cando as manchas son menos definidas e menos separadas.
Os retos aos que se enfronta a análise baseada en software son a presenza de manchas incompletamente separadas (solapantes), é dicir, menos definidas ou separadas, as manchas débiles/ruído (por exemplo, as "manchas fantasma"), as diferenzas á hora de "correr" diferentes xeles (por exemplo, a proteína migra a diferentes posicións en diferentes xeles), as manchas sen correspondencia/indetectadas, que conducen a valores perdidos, as manchas sen correspondencia con outras, os erros na cuantificación (varias manchas distintas poden ser detectadas erradamente polo software como unha mancha única, ou ben partes dunha mancha poden ser excluídas da cuantificación), e as diferenzas en algoritmos de software e, por tanto, nas tendencias de análise.
Poden utilizarse listas de picking xeradas para a dixestión en xel automatizada de manchas de proteínas e a subseguinte identificación das proteínas por espectrometría de masas.
Para un resumo dos enfoques actuais da análise por software de imaxes de electroforese en xel bidimensional ver ou.