Ribonuclease H

As ribonucleases H (abreviadas como RNase H ou RNH) forman unha familia de encimas endonucleases non específicos de secuencia que catalizan a clivaxe de ARN nun substrato ARN/ADN por medio dun mecanismo hidrolítico. Os membros da familia da RNase H poden encontrarse en case todos os organismos, desde bacterias a arqueas e a eucariotas.
A familia está dividida en grupos relacionados evolutivamente con preferencias de substrato lixeiramente diferentes, designadas cos nomes xerais de ribonuclease H1 e H2. O xenoma humano codifica tanto a H1 coma a H2. A ribonuclease H2 humana é un complexo heterotrimérico composto de tres subunidades, e as mutacións en cada unha delas están entre as causas xenéticas da rara enfermidade chamada síndrome de Aicardi-Goutières. Un terceiro tipo, estreitamente relacionado con H2, soamente se encontra nuns poucos procariotas, mentres que as H1 e H2 aparecen en todos os dominios da vida. Adicionalmente, os dominios da ribonuclease H retroviral de tipo RNase H1 aparecen en proteínas transcriptase inversa multidominio, que codifican os retrovirus, como o VIH, e cómpren para a replicación viral.
En eucariotas, a ribonuclease H1 está implicada na replicación do ADN do xenoma mitocondrial. Tanto a H1 coma a H2 están implicadas en tarefas de mantemento do xenoma, como o procesamento de estruturas en bucle R. Clasificación e nomenclatura
A ribonuclease H é unha familia de encimas endonucleases que comparten unha especificidade de substrato polas febras de ARN de dobres hélices ARN-ADN. Por definición, as RNases H clivan o esqueleto de enlaces fosfodiéster do ARN deixando un extremo 3' hidroxilo e un grupo 5' fosfato. As RNases H foron propostas como membros dunha superfamilia relacionada evolutivamente que comprendería outras nucleases e encimas procesadores de ácidos nucleicos, como as integrases retroviraiss, ADN transposases, resolvases de unión de Holliday, proteínas Piwi e Argonauta, varias exonucleases e a proteína espliceosómica Prp8.
As RNases H poden, grosso modo, ser divididas en dous subtipos, H1 e H2, aos que por razóns históricas se lles dá numeración en números arábigos en eucariotas e numeración romana en procariotas. Así, a RNase HI de Escherichia coli é un homólogo da RNase H1 de Homo sapiens. En E. coli e en moitos outros procariotas, o xene rnhA codifica a HI e o rnhB a HII. Unha terceira clase relacionada, chamada HIII, aparece nunhas poucas bacterias e arqueas, e está estreitamente relacionada cos encimas HII procariotas. Estrutura
A estrutura da RNase H consiste comunmente nunha folla β de cinco febras rodeada por unha distribución de hélices α. Todas as RNases H teñen un sitio activo centrado nun motivo de secuencia conservado composto por residuos de aspartato e glutamato, a miúdo denominados motivo DEDD. Estes residuos interaccionan con ións magnesio cataliticamente necesarios.
As RNases H2 son de maior tamaño que as H1 e xeralmente teñen hélices adicionais. A organización de dominios dos encimas varía; algúns membros eucariotas e procariotas do grupo H1 teñen un pequeno dominio adicional no N-terminal coñecido como "dominio de unión a híbrido", que facilita a unión dos dúplex híbridos ARN: ADN e ás veces confire un incremento de procesividade. Aínda que todos os membros do grupo H1 e membros procariotas do grupo H2 funcionan como monómeros, os encimas H2 eucariotas son heterotrímeros obrigados. Os encimas HIII procariotas son membros do grupo H2 considerado nunn sentido máis amplo e comparten a maioría das características estruturais de H2, coa adición dun dominio de unión á caixa TATA N-terminal. Os dominios de RNase H retroviral que aparecen nas transcriptases inversas multidominio teñen estruturas que lembran estreitamente o grupo H1.
As RNases H1 foron estudadas intensamente para explorar as relacións entre a estrutura e a actividade encimática. Son tamén utilizadas, especialmente o homólogo de E. coli, como sistemas modelos para estudar o pregamento das proteínas. Dentro do grupo H1, identificouse unha relación entre unha maior afinidade de unión ao substrato e a presenza de elementos estruturais consistentes nunha hélice e bucle flexible, que proporcionan unha superficie de unión ao substrato maior e quimicamente máis básica. A hélice C ten unha distribución taxonómica dispersa; está presente nos homólogos de RNase H1 de E. coli e humanos e ausente no dominio RNase H de VIH, pero hai tamén exemplos de dominios retrovirais con hélices C. Función
Os encimas ribonuclease H clivan os enlaces fosfodiéster do ARN dun híbrido bicatenario ARN: ADN, deixando un extemo 3' hidroxilo e un grupo fosfato 5' en ambos os extremos do punto de corte. As RNases H1 e H2 teñen distintas preferencias polo substrato e funcións distintas pero solapadas na célula. En procariotas e eucariotas inferiores, ningún deses encimas é esencial, mentres que se cre que son esenciais nos eucariotas superiores. A actividade combinada dos encimas H1 e H2 está asociada co mantemento da estabilidade xenómica debido á degradación encimática do compoñente ARN de bucle R.
Ribonuclease H1
Os encimas ribonuclease H1 requiren un substrato de polo menos catro pares de bases con ribonucleótidos e non poden eliminar un só ribonucleótido dunha febra que está doutro modo composta de desoxirribonucleótidos. Por esta razón, considérase improbable que as RNases H1 estean implicadas no procesamento dos cebadores de ARN dos fragmentos de Okazaki durante a replicación do ADN. A RNase H1 non é esencial en organismos unicelulares nos que foi investigada; en E. coli, os knockouts para a RNase H1 confiren un fenotipo sensible á temperatura, e en Saccharomyces cerevisiae, producen defectos en resposta ao estrés.
En moitos eucariotas, incluíndo os mamíferos, os xenes da RNase H1 inclúen unha secuencia de destino mitocondrial (MTS, mitochondrial targeting sequence), que causa a expresión de isoformas con e sen secuencia de destino mitocondrial. Como resultado, a RNase H1 está localizada tanto na mitocondria coma no núcleo. Nos modelos de ratos knockout, os mutantes nulos de RNase H1 son letais durante a embrioxénese debido a defectos na replicación do ADN mitocondrial. Os defectos na replicación do ADN mitocondrial inducidos pola perda de RNase H1 débense probablemente a defectos no procesamento do bucle R.
Ribonuclease H2
En procariotas, a RNase H2 é encimaticamente activa como proteína monómera. En eucariotas, é un heterodímero obrigado composto dunha subunidade A catalítica e as subunidades B e C estruturais. Mentres que a subunidade A ten grande homoloxía coas RNAase H2 procariotas, e as subunidades B e C non teñen homólogos aparentes en procariotas e están pouco conservadas a nivel de secuencia mesmo entre eucariotas. A subunidade B funciona como mediadora das interaccións proteína-proteína entre o complexo H2 e o PCNA, o cal localiza H2 nos focos de replicación.
Tanto os encimas H2 procariotas coma eucariotas poden clivar un só nucleótido nunha febra. porén, teñen patróns de clivaxe e preferencias de substrato lixeiramente diferentes: os encimas procariotas teñen unha procesividade máis baxa e hidrolizan ribonucleótidos sucesivos máis eficazmente que os ribonucleótidos cun desoxirribonucleótido 5', mentres que os encimas eucariotas son máis procesivos e hidrolizan ambos os tipos de substrato con eficacia similar. A especificidade de substrato da RNase H2 dálle un papel na reparación por escisión de ribonucleótidos, eliminando os ribonucleótidos incorporados incorrectamente ao ADN, ademais do procesamento do bucle R. Aínda que no núcleo das células de mamíferos están presentes tanto a H1 coma a H2, a H2 é a fonte dominante de actividade de RNase H alí e é importante para manter a estabilidade xenómica.
Algúns procariotas posúen un xene de tipo H2 adicional denominado RNase HIII na nomenclatura de números romanos usada para os xenes procariotas. As proteinas HIII están máis estreitamente relacionadas co grupo H2 por identidade de secuencia e semellanza estrutural, pero teñen preferencias de substrato que lembran máis claramente a H1. A diferenza de HI e HII, que están ambos amplamente espallados entre os procariotas, HIII atópase só nuns poucos organismos cunha distribución taxonómica dispersa; é algo máis común en arqueas e case nunca se atopa no mesmo xenoma procariota que HI. Mecanismo
O sitio activo de case todas as RNases H contén catro residuos de aminoácidos cargados negativamente, coñecidos como os dominios de motivo DEDD; adoita estar presente a histidina.
Os residuos cargados únense a un ou dous ións metálicos que son necesarios para a catálise; baixo condicións fisiolóxicas estes son ións magnesio, pero o manganeso tamén mantén xeralmente a actividade encimática, mentres que o calcio pode inhibilo. Aínda que os mecanismos catalíticos de dous ións metálicos son moi comúns en encimas implicados na bioquímica do fosfato, debateuse na literatura se se usaban un ou dous ións na catálise da RNase H. En ambos os mecanismos propostos, participa polo menos unha molécula de auga na reacción.
A maioría das evidencias experimentais para o mecanismo da catálise da RNase H proceden de medidas realizadas en membros do grupo H1, xeralmente o homólogo de E. coli. Segundo as medidas desta proteína, un dos residuos de aspartato ten un elevado pKa, mentres que outros teñen un pka anormalmente baixo. Non está claro se algún dos residuos do sitio activo participa na reacción como base xeral. Ademais, é posible que un dos átomos de oxíxeno do substrato participe directamente na reacción como unha base. En bioloxía humana
O xenoma humano contén catro xenes que codifican a RNase H: RNASEH1, un exemplo do subtipo H1 (monomérico)
RNASEH2A, unha subunidade catalítica do complexo H2 trimérico
RNASEH2B, unha subunidade estrutural do complexo H2 trimérico
RNASEH2C, unha subunidade estrutural do complexo H2 trimérico
Ademais, no xenoma aparece frecuentemente material xenético de orixe retroviral, o que reflicte a integración de xenomas de retrovirus endóxeneos humanos. Ditos eventos de integración teñen como resultado a presenza de xenes codificados pola transcriptase inversa retroviral, o cal inclúe un dominio de RNase H. Un exemplo é ERVK6. Os retrotransposóns de repetición terminal longa son tamén comúns no xenoma humano e a miúdo inclúen os seus propios dominios RNase H, cunha complexa historia evolutiva.
Papel en enfermidades
En pequenos estudos, as mutacións na RNase H1 humana foron asociadas coa oftalmoplexia externa progresiva crónica, unha característica común de enfermidade mitocondrial.
As mutacións en calquera das tres subunidades da RNase H2 están ben establecidas como causas dunha rara doenza xenética denominada síndrome de Aicardi–Goutières, a cal se manifesta con síntomas neurolóxicos e dermatolóxicos nunha idade temperá. Os síntomas desta síndrome lembran moito a unha infección conxénita viral e están asociadas coa regulación á alza inapropiada do interferón de tipo I. A síndrome de Aicardi-Goutières pode ser causada igualmente por mutacións noutros xenes: TREX1, SAMHD1, ADAR e MDA5/IFIH1, todos os cales están implicados no procesamento de ácidos nucleicos. A caracterización da distribución mutacional na poboación de pacientes de síndrome de Aicardi-Goutières encontrou un 5% de todas as mutacións nestas síndromes na RNASEH2A, un 36% na 2B, e un 12% na 2C. As mutacións no 2B foron asociadas cun trastorno neurolóxico algo máis suave e cunha ausencia de regulación á alza do xene inducida por interferón, que pode ser detectada en pacientes con outros xenotipos asociados á síndrome de Aicardi-Goutières. En virus
Hai dous grupos de virus que usan a transcrición inversa como parte dos seus ciclos vitais: os retrovirus, que codifican os seus xenomas en ARN monocatenario e replícanse por medio dun intermediario de ADN bicatenario; e os virus de ADN bicatenario con transcrición inversa (dsDNA-RT), que replican os seus xenomas de ADN bicatenario por medio dun "prexenoma" intermediario de ARN. Exemplos patóxenos son o virus da inmunodeficiencia humana e o virus da hepatite B, respectivamente. Ambos os dous codifican grandes transcriptases inversas multifuncionais que conteñen dominios RNase H.
As transcriptases inversas retrovirais do VIH-1 e o virus da leucemia murina son os membros mellor estudados da familia. A transcriptase inversa retroviral é responsable de converter o xenoma de ARN monocatenario do virus en ADN bicatenario. Este proceso require tres pasos: en primeiro lugar, a actividade de ADN polimerase dependente do ARN produce ADN de febra menos (-) a partir do molde de ARN de febra máis (+), xerando un intermediario híbrido ARN: ADN; en segundo lugar, destrúese a febra de ARN; e en terceiro lugar, a actividade de ADN polimerase dependente de ADN sintetiza o ADN de febra máis, xerando ADN bicatenario como o produto final. O segundo paso deste proceso é levado a cabo por un dominio RNase H localizado no C-terminal da transcriptase inversa.
A RNase H realiza tres tipos de accións de clivaxe: a degradación non específica do xenoma de ARN de febra máis, a eliminación específica do cebador de ARNt de febra menos, e a eliminación do cebador do tracto de polipurina rico en purinas da febra máis (PPT). A RNase H intervén tamén no cebado da febra máis, pero non polo método convencional de sintetizar unha secuencia de cebador novo, senón que a RNase H crea un "cebador" a partir do PPT que é resistente á clivaxe da RNase H. Ao eliminar todas as bases agás o PPT, o PPT utilízase como marcador do final da rexión U3 da súa repetición terminal longa.
Como a actividade de RNase H é necesaria para a proliferación viral, este dominio foi considerado unha diana de fármacos para o desenvolvemento de fármacos antirretrovirais usados no tratamento do VIH/SIDA e outras condicións causadas polos retrovirus. Identificáronse os inhibidores da RNase H retroviral de varios quimiotipos diferentes, moitos dos cales teñen un mecanismo de acción baseado na quelación dos catións do sitio activo. Os inhibidores da transcriptase inversa que inhiben especificamente a función polimerase da transcriptase inversa teñen un estendido uso clínico, pero non os inhibidores da función de RNase H; esta é a única función encimática codificada polo VIH que aínda non é diana de fármacos en uso clínico. Evolución
As RNases H están amplamente distribuídas e aparecen en todos os dominios da vida. A familia pertence a unha superfamila máis grande de encimas nucleases e considérase que é evolutivamente antiga. En xenomas procarióticos están presentes múltiples xenes de RNase H, pero hai pouca correlación entre a presenza de xenes de HI, HII e HIII e as relacións filoxenéticas globais, o que suxire que a transferencia horizontal de xenes puido ter xogado un papel no establecemento da distribución destes encimas entre os seres vivos. As RNases HI e HIII case nunca aparecen no mesmo xenoma procariótico. Cando o xenoma dun organismo contén máis dun xene de RNase H, ás veces teñen diferenzas significativas no nivel de actividade. Suxeriuse que estas observacións reflicten un padrón evolutivo que minimiza a redundancia funcional entre os xenes de RNase H. A RNase HIII, que é única dos procariotas, ten unha distribución taxonómica moi espallada e encóntrase en bacterias e arqueas; crese que diverxeu a partir da HII bastante cedo na evolución.
Non está clara a traxectoria evolutiva da RNase H2 en eucariotas, especialmente o mecanismo polo cal os homólogos eucarióticos se converteron en heterotrímeros obrigados. As subunidades B e C non teñen homólogos aparentes en procariotas. Aplicacións
Como a RNase H degrada especificamente só o ARN de híbridos bicatenarios de ARN: ADN, é usada comunmente como un reactivo de laboratorio en bioloxía molecular. Disponse comercialmente de preparacións purificadas de RNase HI e HII de E. coli. A RNase HI é utilizada a miúdo para destruír o molde de ARN despois da síntese da primeira febra de ADN complementario (ADNc) por transcrición inversa. Pode tamén utilizarse para clivar secuencias de ARN específicas en presenza de segmentos curtos complementarios de ADN. Para a detección poden utilizarse técnicas de gran sensibilidade como a resonancia plasmónica de superficie. A RNase HII pode usarse para degradar o compoñente cebador de ARN dun fragmento de Okazaki ou para introducir amosegas dunha febra en posicións que conteñen un ribonucleótido. Tamén se usa na técnica da reacción en cadea da polimerase (PCR), xa que se describiu unha variante da hot start PCR, chamada PCR dependente de RNase H ou rhPCR, que usa unha RNase HII termoestable procedente da arquea hipertermófila Pyrococcus abyssi. Hai que salientar que a proteína inhibidora da ribonuclease usada habitualmente como reactivo non é efectiva para inhibir a actividade da HI ou da HII. Historia
As ribonucleases H foron descubertas primeiro no laboratorio de Peter Hausen cando os investigadores atoparon a actividade de endonuclease sobre o híbrido de ARN: ADN no timo de tenreira en 1969 e déuselle o nome de "ribonuclease H" para designar a súa especificidade híbrida (H). A actividade de RNase H foi despois descuberta en E. coli e nunha mostra de oncovirus con xenoma de ARN durante os estudos iniciais sobre a transcrición inversa viral. Posteriormente quedou claro que os extractos de timo de tenreira contiñan máis dunha proteína con actividade de RNase H e que E. coli contiña dous xenes de RNase H. Orixinalmente, o encima agora coñecido como a RNase H2 en eucariotas foi designado como H1 e viceversa, pero os nomes dos encimas eucariotas foron intercambiados para que se correspondesen cos de E. coli para facilitar as análises comparativas, orixinándose a nomenclatura moderna na cal os encimas procariotas se designan con números romanos e os eucariotas con números arábigos. A RNase HIII procariota, de cuxo descubrimento se informou en 1999, foi o último subtipo de RNase H en ser identificado.
A caracterización da RNase H2 eucariótica foi historicamente todo un reto, en parte pola súa escasa abundancia. Os esforzos coidadosos realizados para purificar o encima suxeriron que o encima eucariota, a diferenza da RNase H de E. coli, tiña moitas subunidades. O homólolgo de Saccharomyces cerevisiae da proteína de E. coli (que é, a subunidade H2A) foi doadamente identificable por bioinformática cando se secuenciou o xenoma do lévedo, pero comprobouse que a proteína correspondente non tiña actividade encimática illada. Finalmente, as subunidades B e C de lévedo foron illadas por copurificación e viuse que eran necesarias para a actividade encimática. Porén, as subunidades B e C de lévedos teñen unha identidade de secuencia moi baixa coas súas homólogas doutros organismos, e as proteínas humanas correspondentes foron definitivamente identficadas só despois de que se atoparon mutacións nas tres que causaban a síndrome de Aicardi-Goutières.