Cultivo celular

O cultivo celular é o complexo proceso polo cal se cultivan células en condicións controladas, xeralmente fóra do seu ambiente natural, in vitro. Tamén se lle chama cultivo celular ao conxunto de células resultantes dese proceso. Na práctica, o termo "cultivo celular" actualmente refírese ao cultivo de células derivadas de eucariotas pluricelulares, especialmente células animais. Porén, existen tamén cultivos de cultivos de tecidos de plantas, fungos e microbios, como bacterias, protistas e virus. O desenvolvemento histórico e os métodos do cultivo celular están estreitamente interrelacionados cos do cultivo de tecidos e o cultivo de órganos.
O cultivo de células animais converteuse nunha técnica de laboratorio común na década de 1950 pero o concepto de manter liñas de células vivas separadas do seu tecido orixinal xa se descubrira no século XIX. Historia
O fisiólogo inglés do século XIX Sydney Ringer desenvolveu solucións salinas que contiñan cloruros de sodio, potasio, calcio e magnesio axeitadas para manter o latexo dun corazón illado de animal fóra do corpo. Arquivado 17 de febreiro de 2010 en Wayback Machine. En 1885, Wilhelm Roux retirou unha porción da placa medular dun polo embrionado e mantívoa nunha solución salina quente durante varios días, establecendo os principios do cultivo de tecidos. Ross Granville Harrison, cando traballaba na Johns Hopkins Medical School e despois na Universidade Yale, publicou os resultados dos seus experimentos desde 1907 a 1910, establecendo a metodoloxía dos cultivos de tecidos.
As técnicas de cultivo celular avanzaron significativamente nas décadas de 1940 e 1950 para aplicalas á investigación en viroloxía. O cultivar virus en cultivos celulares permitiu a preparación de virus purificados para a produción de vacinas. A vacina da polio inxectable desenvolvida por Jonas Salk foi un dos primeiros preparados producidos en masa utilizando técnicas de cultivo celular. A produción desta vacina foi posible grazas á investigación en cultivos celulares levada a cabo por John Franklin Enders, Thomas Huckle Weller, e Frederick Chapman Robbins, que foron galardoados co Premio Nobel polos seus descubrimentos sobre métodos de cultivo de virus en cultivos de células de ril de mono. Conceptos usados no cultivo de células de mamífero
Illamento de células
As células poden illarse dos tecidos de diversos modos para facer cultivos ex vivo. As células poden purificarse doadamente do sangue, pero só os glóbulos brancos poden crecer en cultivo. As células mononucleares poden obterse de tecidos brandos por dixestión encimática con encimas como colaxenase, tripsina, ou pronase, que degradan a matriz extracelular. Alternativamente, cachos de tecido poden situarse en medio de cultivo, e as células que xorden poden utilizarse para o cultivo. Este método coñécese como cultivo de explantes.
As células que se cultivan directamente a partir das dun individuo denomínanse células primarias. Coa excepción dalgunhas derivadas de tumores, a maioría dos cultivos de células primarias teñen unha vida limitada. Despois de certo número de duplicacións da poboación celular (chamado límite de Hayflick), as células sofren o proceso de senescencia e deixan de se dividir, aínda que xeralmente reteñen a súa viabilidade.
Unha liña celular inmortalizada ou establecida é a que adquiriu a capacidade de proliferar indefinidamente quer por causa dunha mutación aleatoria quer por unha modificación deliberada, como a expresión artificial do xene da telomerase. Hai numerosas liñas celulares ben establecidas representativas de determinados tipos celulares.
Mantemento das células en cultivo
As células cultívanse e mantéñense a unha temperatura apropiada e nunha mestura de gases determinada (normalmente, 37 °C, 5% CO2 para as células de mamífero) nunha incubadora celular. As condicións de cultivo varían amplamente para cada tipo celular, e a variación das condicións para un determinado tipo celular poden orixinar diferentes fenotipos.
Ademais da temperatura e unha mestura de gases, o factor que máis comunmente se varía nos sistemas de cultivo é o medio de cultivo ou crecemento. As receitas para un medio de crecemento poden variar no pH, concentración de glicosa, factores de crecemento, e a presenza doutros nutrientes. Os factores de crecemento utilizados para suplementar os medios derivan con frecuencia do sangue de animais, como o soro de tenreira. Unha complicación destes ingredientes derivados do sangue é o seu potencial para contaminaren o cultivo con virus ou prións, especialmente en aplicacións de biotecnoloxía médica. A práctica actual é minimizar ou eliminar o uso destes ingredientes sempre que sexa posible e usar medios definidos quimicamente, mais isto non sempre se pode facer. Estratexias alternativas implican obter o sangue animal de países cun mínimo risco de encefalopatía esponxiforme bovina/encefalopatía esponxiforme transmisible, como Australia e Nova Zelandia, e utilizar concentrados de nutrientes purificados derivados de soro en lugar de utilizar o soro animal completo para os cultivos celulares. Ademais, o uso de alternativas completamente definidas universais e libres de produtos animais desenvolvidas recentemente como Serum-Free evita estas complicacións.
A densidade de placa (número de células por volume de medio de cultivo) xoga un papel fundamental para algúns tipos celulares. Por exemplo, unha densidade de placa baixa fai que as células da granulosa produzan estróxeno, e unha densidade de placa máis alta failles comportarse como células luteínicas da teca produtoras de proxesterona.
As células poden cultivarse en suspensión ou en cultivos adherentes. Algunhas células viven de forma natural en suspensión, sen estaren adheridas a ningunha superficie, como é o caso das células do sangue. Hai tamén liñas celulares que foron modificadas para poder sobrevivir en cultivos en suspensión e poden cultivarse en densidades maiores ca as permitidas en condicións adherentes. As células adherentes requiren unha superficie, como plástico para o cultivo celular ou microcarrier (matrices de soporte con microesferas), que pode estar cuberto con compoñentes da matriz extracelular para incrementar as propiedades de adhesión e proporcionar outros sinais necesarios para o crecemento e diferenciación. A maioría das células derivadas de tecidos sólidos son adherentes. Outro tipo de cultivo adherente é o cultivo organotípico, o cal implica o cultivo das células nun medio tridimensional en lugar de nas placas de cultivo bidimensionais. Estes sistemas de cultivo tridimensionais son bioquímica e fisioloxicamente máis similares aos tecidos in vivo, pero mantelos supón un reto técnico debido a moitos factores, como, por exemplo, a difusión.
Contaminación cruzada entre liñas celulares
A contaminación cruzada entre liñas celulares é un problema para os científicos que traballan con cultivos celulares. Varios estudos suxiren que do 15 ao 20% das veces as células utilizadas nos experimentos son incorrectamente identificadas ou están contaminadas con outras liñas celulares. Identificáronse problemas de contaminación entre liñas celulares nas liñas do panel NCI-60 (National Cancer Institute-60), que se utilizan rutineiramente para os estudos de fármacos. Os principais repositorios de liñas celulares, incluíndo a Colección de Cultivos Tipo Americana (ATCC) e a Colección de Cultivos Celulares e Microorganismos Alemá (DSMZ), recibiron dos investigadores entregas de liñas celulares que foran incorrectamente identificadas. Estas contaminacións supoñen un problema para a calidade da investigación realizada utilizando liñas de cultivo celular, e os principais repositorios están agora autenticando todas as entregas de liñas celulares. A ATCC utiliza análises de pegada dactilar do ADN de Repeticións en tándem curtas (Short tandem repeats, STR) para autenticar as liñas celulares.
Para enfrontarse a este problema, recoméndase aos investigadores que autentiquen as súas liñas celulares nunha pasaxe previa para establecer a identidade da liña celular. A autenticación debería repetirse antes de conxelar os stocks da liña celular, cada dous meses durante o seu cultivo activo e antes de calquera publicación de datos de investigacións realizadas utilizándoas. Úsanse moitos métodos para identificar liñas celulares, como as análises con isoencimas, determinación do antíxeno leucocitario humano (HLA), análise cromosómica, cariotipado, morfoloxía e análise de STR (Repeticións en tándem curtas do xenoma, Short Tandem Repeats).
Unha das liñas celulares humanas máis contaminantes é a liña celular inmortal HeLa.
Manipulación das células cultivadas
As células xeralmente continúan dividíndose en cultivo ata que enchen toda a área ou volume dispoñible. Isto pode xerar varios problemas: Diminución dos nutrientes no medio de crecemento.
Acumulación de células apoptóticas/necróticas (mortas).
O contacto entre as células pode estimular a detención do ciclo celular, causando que as células paren de dividirse, o que se coñece como inhibición por contacto.
O contacto entre as células pode estimular a diferenciación celular.
Entre as manipulacións comúns levadas a cabo nos cultivos celulares están os cambios de medio, as pasaxes de células, e a transfección de células. As manipulacións dos cultivos realízanse xeralmente utilizando métodos de cultivo celular que usan técnicas de esterilización. As técnicas de esterilización pretenden evitar a contaminación con bacterias, lévedos, ou outras liñas celulares. As manipulacións lévanse a cabo nunha campá de fluxo laminar para así evitar a contaminación por microorganismos. Tamén se engaden aos medios de crecemento antibióticos (como a penicilina e a estreptomicina) e antifúnxicos (como a anfotericina B).
Todas as células sofren procesos metabólicos que producen ácidos e diminúen o pH. Con frecuencia, engádese un indicador de pH ao medio para medir a diminución dos nutrientes.
Cambios de medio
Nos cultivos adherentes, o medio pode ser retirado directamente por aspiración, e despois é substituído por outro. Os cambios de medio nos cultivos non adherentes implican a centrifugación do cultivo, e despois a resuspensión das células en medio fresco.
Pasaxe de células
A pasaxe (tamén chamada subcultivo ou separación das células) é a transferencia dun pequeno número de células do cultivo a un novo recipiente con medio de crecemento para formar un novo cultivo. As células poden cultivarse durante un tempo máis longo se son separadas regularmente, o que evita a senescencia asociada a unha elevada densidade de células por tempo prolongado. Os cultivos en suspensión transfírense doadamente tomando unha pequena cantidade de cultivo que conteña unhas poucas células que son diluídas nun maior volume de medio fresco. Para os cultivos adherentes, as células primeiro necesitan ser despegadas; isto faise xeralmente cunha mestura de tripsina-EDTA; porén, disponse agora doutras mesturas de encimas para este propósito. Despois pode utilizarse unha pequena cantidade de células despegadas para sementar un novo cultivo.
Transfección e transdución
Outro método común de manipulación das células implica a introdución de ADN alleo por transfección. Isto realízase a miúdo para facer que as células expresen unha proteína de interese. Máis recentemente, realízase a transfección de produtos de interferencia de ARN como un mecanismo útil para a supresión da expresión dun determinado xene/proteína. O ADN pode tamén inserirse nas células utilizando virus, con métodos denominados transdución, infección ou transformación. Os virus, como axentes parasitos que son, son moi axeitados para a introdución de ADN nas células, xa que isto é parte do curso normal da súa reprodución.
Liñas celulares humanas establecidas
As liñas celulares de orixe humana teñen creado algunhas controversias bioéticas, xa que poden sobrevivir ao individuo do que proceden e despois utilizarse no descubrimento de tratamentos médicos lucrativos. Nunha famosa decisión xudicial da Corte Suprema de California estableceuse que os pacientes humanos non teñen dereitos de propiedade sobre as liñas celulares derivadas de órganos extraídos co seu consentimento.
Xeración de hibridomas
É posible fusionar células normais con células dunha liña celular inmortalizada. Este método utilízase para producir anticorpos monoclonais. Resumindo, os linfocitos illados do bazo (ou sangue) dun animal inmunizado combínanse con células B dunha liña celular de mieloma inmortal para producir un hibridoma, o cal ten a especificidade de anticorpos do linfocito primario e a inmortalidade característica do mieloma. Utilízase un medio de crecemento selectivo (HA ou HAT) para seleccionar en contra das células de mieloma non fusionadas; os linfocitos primarios morren rapidamente no cultivo e só sobreviven as células fusionadas. Estas son examinadas para a produción dos anticorpos requiridos, xeralmente en poboacións para empezar, e despois con clonacións dunha soa célula. Aplicacións dos cultivos celulares
Os cultivos en masa de liñas celulares animais son fundamentais para a produción de vacinas virais e outros produtos de biotecnoloxía.
Os produtos biolóxicos producidos pola tecnoloxía do ADN recombinante (ADNr) en cultivos de células animais inclúen encimas, hormonas sintéticas, produtos inmunobiolóxicos (anticorpos monoclonais, interleucinas, linfocinas), e axentes anticanceríxenos. Aínda que moitas das proteínas máis simples poden producirse utilizando ADNr en cultivos bacterianos, as proteínas máis complexas que están glicosiladas (modificadas con carbohidratos) actualmente deben producirse en células animais. Un exemplo importante desas proteínas complexas é a hormona eritropoetina. O custo de facer cultivos de células de mamífero é alto, polo que están en marcha investigacións para intentar producir proteínas complexas con células de insectos ou de plantas superiores, e utilizando células embrionarias.
Cultivos celulares bidimensionais
A investigación en enxeñaría de tecidos, células nai e bioloxía molecular implica principalmente cultivos de células en placas de plástico planas. Esta técnica coñécese como cultivo celular bidimensional, e foi desenvolvido inicialmente por Wilhelm Roux, quen, en 1885, extraeu unha porción da placa medular dun polo embrionado e mantívoa nunha solución salina quente durante varios días nunha placa de cristal plana. Co avance na tecnoloxía dos polímeros empezaron a usarse placas de plástico para o cultivo celular, que son o material estándar hoxe, coñecidas como placas de Petri. A súa invención atribúese ao bacteriólogo alemán Julius Richard Petri cando estaba traballando como axudante de Robert Koch.
Ademais das placas de Petri, as células cultiváronse en matrices de derivados biolóxicos como o coláxeno e a fibrina, e máis recentemente, en hidroxeles sintéticos como a poliacrilamida ou PEG. Utilízanse para obter fenotipos que non se expresan nos substratos ríxidos convencionais. Existe un crecente interese en controlar a "rixidez da matriz", un concepto que levou a descubrimentos en campos como: Autorrenovación das células nai Especificación de liñaxes Fenotipo de células cancerosas Fibrose
Función dos hepatocitos Mecanosensibilidade
Cultivos celulares tridimensionais
Os cultivos celulares tridimensionais foron considerados como unha "Nova Dimensión da Bioloxía", pero a práctica de cultivos celulares segue baseada abrumadoramente en substratos ríxidos bidimensionais. Porén, existe cada vez maior interese nos cultivos tridimensionais en áreas de investigación como o descubrimento de fármacos, bioloxía do cancro, medicina rexenerativa e investigación básica nas ciencias da vida. Utilízanse varias plataformas para facilitar o crecemento de estruturas celulares tridimensionais como a levitación magnética facilitada por nanopartículas, armazóns de matrices de xel, e placas de gota colgante.
Cultivo e enxeñaría de tecidos
O cultivo celular é un compoñente fundamental do cultivo e enxeñaría de tecidos, xa que establece os principios para cultivar e manter células in vitro. A principal aplicación de cultivos celulares humanos é na industria das células nai, na que poden cultivarse células nai mesenquimais e criopreservalas para futuras utilizacións.
Vacinas
As vacinas da polio, sarampelo, papeiras, rubéola, e varicela prodúcense actualmente en cultivos celulares. Debido á ameaza de pandemia polo virus da gripe H5N1, algúns gobernos, como o dos Estados Unidos, financiaron a investigación no uso de cultivos celulares para producir a vacina da gripe. Entre as novas ideas neste campo están as vacinas baseadas no ADN recombinante, como por exemplo unha que utiliza adenovirus humanos (un virus común do arrefriado) como vector, e novos adxuvantes.
Estudos que empregan cultivos celulares
Os estudos que empregan cultivos celulares abranguen gran número de disciplinas e aproximacións ao estudo do fenómeno celular. Son:
Actividade celular. Estuda os mecanismos envolvidos nos diferentes procesos intracelulares, como por exemplo: transcrición do ADN, síntese de proteínas, metabolismo enerxético. ..
Fluxo intracelular. Estuda os movementos intracelulares de substancias e sinais asociados aos diferentes procesos fisiolóxicos, como por exemplo: ensamblaxe e desensamblaxe dos diferentes compoñentes intracelulares, movementos do ARN: núcleo-citoplasma, movemento de proteínas.
Ecoloxía celular. Estudo das condicións ambientais responsables do mantemento da funcionalidade celular, da súa diferenciación etc. , como por exemplo o estudo das necesidades nutricionais, infeccións, estudo da transformación celular (inducida por virus ou axentes químicos), cinética da poboación celular. ..
Interaccións celulares. Estudan os procesos de indución embrionaria, cooperación metabólica, inhibición por contacto ou por adhesión, interaccións célula-célula.
Exemplo de áreas de investigación moi dependentes das técnicas de cultivo celular son:
- Viroloxía: establecemento de condicións de cultivo de virus animais e de plantas, produción de vacinas antivirais. ..
- Investigación do cancro
- Inmunoloxía
- Enxeñaría de proteínas. Para a produción de proteínas en liñas celulares: interferón, insulina, hormona do crecemento.
- Estudos de interacción e sinalización celular, na diferenciación e no desenvolvemento.
- Aplicacións diagnósticas. Por exemplo en medicina e farmacoloxía destacan a análise cromosómica de células cultivadas a partir de mostras de amniocentese, detección de infeccións virais, ensaios de toxicidade. ..
- Aplicacións médicas: mantemento e produción de tecido para transplantes.
- Aplicacións industriais e agronómicas: produción por reprodución "in vitro" de clons de plantas de interese comercial.
- Saúde ocupacional: Por medio de ensaios citoxenéticos que permiten detectar danos xenéticos a nivel celular, nos que os cultivos de linfocitos de sangue periférico son unha ferramenta para realizar ensaios como: Ensaio de Micronúcleos (MN), aberracións cromosómicas (AC), intercambio de cromátides irmás, a traballadores expostos a algún axente citotóxico. Vantaxes e desvantaxes dos cultivos celulares
Os cultivos celulares teñen unha serie de vantaxes innegables, pero ao mesmo tempo teñen desvantaxes que hai que ter en consideración.
Como vantaxes podemos citar: Permiten un control preciso e fino do medio ambiente. Nun cultivo pódense controlar todos os factores do medio: Físico-químicos (pH, temperatura, presión osmótica, niveis de O2, CO2, tensión superficial. .. ), e fisiolóxicos (hormonas, factores de crecemento, densidade celular. .. )
Caracterización e homoxeneidade da mostra. As células en cultivo dunha liña celular, ou dunha liña continua son homoxéneas, con morfoloxía e composición uniformes. Pódense obter con facilidade un número elevado de réplicas idénticas, co que se supera o grave problema de heteroxeneidade das mostras asociado ao uso de animais de experimentación.
Economía. Supoñen un aforro no uso de reactivos ou drogas a estudar porque ao realizárense os estudos en volumes reducidos e cun acceso directo das células á droga, as concentracións requiridas son moito máis baixas do que no animal completo.
En canto ás desvantaxes do cultivo celular salientaremos: Técnica sensible. O crecemento das células animais é moito máis lento ca o dos contaminantes máis habituais (fungos, lévedos, bacterias, micoplasmas. .. ) e ademais, dado que proceden de organismos pluricelulares, son incapaces de creceren en ausencia dunha complexa mestura de nutrientes que simula o plasma ou o fluído intersticial. Isto supón a necesidade de manter as condicións de asepsia en todo momento, o cal é limitante en canto ao instrumental requirido e ao persoal cualificado para a súa manipulación.
Cantidade e custo. O custo de produción dun gramo de tecido en cultivo é máis de 10 veces superior ao obtido no animal. Existe tamén unha limitación de produción, que é da orde de 10 g de células nun laboratorio normal, e que para ser superior a 100 g require instalacións de tipo industrial.
Inestabilidade. Moitas das liñas celulares continuas son inestables, como consecuencia da súa dotación cromosómica aneuploide. A poboación celular pode variar a súa composición se algunha das subpoboacións celulares pode crecer cunha taxa lixeiramente superior, é dicir, podemos encontrar diferenzas significativas na liña celular dunha xeración á seguinte. A única maneira de evitalo é empregar liñas estables que se resementan a partir dun stock conxelado cada determinado tempo, ou despois dun determinado número de xeracións.
A investigación biomédica supón o sacrificio cada ano de miles de animais de experimentación. O cultivo celular non pode substituír sempre aos ensaios "in vivo" pero é unha alternativa válida en moitos casos. Cultivo de células que non son de mamífero
Métodos de cultivo de células de plantas
Os cultivos de células de plantas fanse tipicamente en suspensión nun medio líquido ou como cultivos de calos en medio sólido. O cultivo de células de plantas indiferenciadas e de calos require que haxa un adecuado equilibrio entre a hormona de crecemento da planta auxina e a citoquinina.
Cultivos celulares de insectos
As células derivadas da mosca Drosophila melanogaster (principalmente as células Schneider 2) poden utilizarse para experimentos que poden ser difíciles de facer con moscas ou larvas vivas, como estudos bioquímicos ou nos que se usa ARN interferente pequeno. As liñas celulares derivadas da avelaíña Spodoptera frugiperda, como as liñas Sf9 e Sf21, e da avelaíña Trichoplusia ni, células High Five, utilízanse comunmente para a expresión de proteínas recombinantes utilizando baculovirus.
Métodos de cultivo de bacterias e lévedos
Para cultivar bacterias e lévedos utilízanse pequenas cantidades de células, que se fan crecer en soportes sólidos que conteñen os nutrientes, xeralmente un xel como o ágar-ágar, pero os cultivos a grande escala realízanse coas células en suspensión nun caldo de cultivo.
Métodos de cultivo de virus
O cultivo de virus require o cultivo de células de mamíferos, plantas, fungos ou bacterias, que funcionarán como hóspedes para o crecemento e replicación dos virus. Nas condicións axeitadas poden xerarse virus de tipo salvaxe completos, virus recombinantes ou produtos virais en tipos celulares distintos dos que son os seus hóspedes naturais. Dependendo da especie de virus, a infección e replicación viral poden dar lugar á lise da célula hóspede e a formación dunha placa viral. Liñas celulares comúns
Entre as numerosas liñas celulares utilizadas nos cultivos celulares, as máis comúns son: Liñas celulares humanas
HeLa
60 liñas de células canceríxenas do National Cancer Institute dos Estados Unidos
ESTDAB database Arquivado 06 de febreiro de 2011 en Wayback Machine.
DU145 (cancro de próstata)
Lncap (cancro de próstata)
MCF-7 (cancro de mama)
MDA-MB-438 (cancro de mama)
PC3 (cancro de próstata)
T47D (cancro de mama)
THP-1 (leucemia mieloide aguda)
U87 (glioblastoma)
SHSY5Y células de neuroblastoma humano, clonadas a partir dun mieloma
Células Saos-2 (cancro de óso)
Liñas celulares de primates (non humanos)
Vero (liña de células epiteliais de ril de mono verde africano Chlorocebus iniciada en 1962)
Liñas de células tumorais de rata
GH3 (tumor de pituitaria)
PC12 (feocromocitoma)
Liñas celulares de rato
MC3T3 (parte superior do cranio embrional)
Liñas celulares de plantas
Células BY-2 de tabaco (mantidas en cultivo en suspensión celular, que son un sistema modelo de célula vexetal)
Liñas celulares doutras especies
Células do peixe cebra ZF4 e AB9
Liña celular epitelial de ril canino Madin-Darby (MDCK)
Células epiteliais de ril A6 de Xenopus