Eastern blot

O eastern blot é unha técnica bioquímica de blotting utilizada para analizar modificacións postraducionais de proteínas como as que implican lípidos, residuos fosfóricos e glicoconxugados. Na maior parte dos casos utilízase para detectar epítopos de carbohidratos na proteína. Deste modo, o eastern blot pode considerarse unha ampliación da técnica bioquímica do western blot. Téñense descrito moitas técnicas usando o termo eastern blot ou eastern blotting, a maioría dos cales usan proteínas que se transfiren desde un xel de SDS-PAGE a unha membrana de PVDF ou nitrocelulosa. As proteínas transferidas son analizadas para detectar as súas modificacións postraducionais utilizando sondas que poden detectar lípidos, carbohidratos, fosforilacións ou calquera outra modificación da proteína. O termo eastern blot debería utilizarse para referirse aos métodos que detectan as súas dianas por medio de interaccións específicas entre a modificación postraducional e a sonda, para distinguila do far-western blot estándar. En principio, o eastern blot é similar ao blotting de lectina (é dicir, a detección de epítopos de carbohidratos sobre proteínas ou lípidos). De todos modos, non hai unha definición universalmente aceptada desta técnica na literatura, como se resume no seguinte capítulo. Historía e múltiples definicións
A definición precisa do termo eastern blot ou eastern blotting (moitas veces Eastern aparece con maiúscula) é algo confusa debido a que varios autores bautizaron novos métodos como Eastern blotting ou un derivado del. Todas as definicións refírense a métodos que derivan da técnica do western blotting desenvolvida por Towbin en 1979. As actuais definicións están resumidas a continuación ordenadas desde o primeiro uso do termo; porén, todas están baseadas nalgúns traballos iniciais. Nalgúns casos, a técnica estivera utilizándose xa antes da introdución do termo. (1982) O termo Eastern blotting foi rexeitado especificamente por dous grupos separados: Reinhart e Malamud refírense a un blot de proteínas dun xel nativo como native blot (blot nativo); Peferoen et al. , optaron por referirse ao seu método de arrastrar proteínas separadas en xel SDS a nitrocelulosa usando unha bomba de succión como vacuum blotting (~blotting de baleiro ou de aspiración).
(1984) Descríbese o termo Middle Eastern blotting como un blot de ARN poliA (resolvido en agarosa) que despois é inmobilizado. O ARN inmobilizado é despois sondado con ADN.
(1996) Bogdanov et al. son os que usan por primeira vez o termo Eastern-Western blot. O método implicaba a transferencia (blotting) de fosfolípidos a unha membrana de PVDF ou nitrocelulosa antes de transferir as proteínas á mesma membrana de nitrocelulosa por medio dun western blot convencional e sondar con anticorpos específicos de conformación. Este método está baseado nos traballos previos de Taki et al. de 1994, nos que eles denominaban orixinalmente a técnica como TLC blotting, e estaba baseado nun método similar introducido por Towbin en 1984.
(2001) Eastern blotting é descrita como unha técnica para detectar glicoconxugados xerados por transferencia de BSA en membranas de PVDF, seguida dun tratamento con periodato. A proteína oxidada é despois tratada cunha mestura complexa, xerando un novo conxugado na membrana. A membrana é despois sondada con anticorpos para buscar os epítopos de interese. Este método foi tamén discutido en traballos posteriores por este grupo. O método é esencialmente o Far-Eastern blotting.
(2002) Eastern blot tamén se utilizou para describir un inmunoblot realizado sobre proteínas transferidas a unha membrana de PVDF desde un xel PAGE corrido con polaridade oposta. Como este é esencialmente un western blot, a carga inversa que se utiliza serviu para bautizar a este método como eastern blot.
(2005) Eastern blot foi utilizado para describir un blot de proteínas sobre membranas de PVDF no que a sonda é un aptámero en vez dun anticorpo. Isto podería considerarse similar a un Southern blot, a pesar de que a interacción é entre unha molécula de ADN (o aptámero) e unha proteína, en vez de entre dúas moléculas de ADN. O método é similar ao south-western blotting.
(2006) Eastern blotting foi utilizado para referirse á detección de proteínas de fuisión por medio de complementación. O nome está baseado no uso dun activador de encimas como parte da detección.
(2009) Eastern blotting foi máis recentemente rebautizado por Thomas et al. como unha técnica que sonda proteínas transferidas a unha membrana de PVDF con lectinas, toxina colérica e tinguiduras químicas para detectar proteínas glicosiladas, lipoiladas ou fosforiladas. Estes autores distinguen o método do Far-Eastern blot nomeado por Taki et al. porque usa sondas de lectina e outros reactivos de tinguidura.
(2009) Eastern blot foi utilizado para describir un blot de proteínas sobre membrana de nitrocelulosa no que a sonda é un aptámero en vez dun anticorpo. O método ésimilar ao south-western blotting.
(2011) Un estudo recente utiliza o termo Eastern blotting para describir a detección de glicoproteínas con lectinas como a concanavalina A Como se ve, está claro que non hai unha soa definición aceptada do termo. Un recente artigo contén unha entrevista a Edwin Southern, creador do Southern blot, e trata sobre a rebautización de Eastern blotting a partir de Tanaka et al. O artigo equipara o Eastern blot ás "fadas, unicornios, e unha comida gratuíta" e afirma que os Eastern blots "non existen". O Eastern blot é mencionado nun libro de texto de inmunoloxía, que compara os métodos de blotting comúns (Southern, northern, e western), e afirma que "porén, o Eastern blot, existe só en preguntas de tests".
Os principios utilizados polo eastern blotting para detectar glicanos poden remontarse ao uso de lectinas para detectar a glicosilación de proteínas. Os exemplos máis temperáns deste modo de detección son uns traballos de Tanner e Anstee de 1976, nos que se usaban lectinas para detectar proteínas glicosiladas illadas de eritrocitos humanos. A detección específica da glicosilación por medio do blotting denomínase xeralmente blotting de lectinas (lectin blotting). Un resumo de melloras máis recentes do protocolo foi elaborado por H. Freeze. Aplicacións
Unha aplicación desta técnica inclúe a detección de modificacións de proteínas en dúas especies bacterianas do xénero Ehrlichia, E. muris ed IOE (Ixodes ovatus ehrlichia ou ehrlichia de Ixodes ovatus). Para detectar as modificacións de proeínas utilizáronse a subunidade B da toxina colérica (que se une a gangliósidos), a concanavalina A (que detecta glicanos que conteñen manosa) e o verde de nitrofosfo molibdato-metil (que detecta fosfoproteínas). A técnica mostra que as proteínas antixénicas de E. muris non virulentas son máis modificadas postraducionalmente que nas moi virulentas IOE. Importancia
A maioría das proteínas que son traducidas a partir dos ARNm sofren modificacións antes de ser finalmente funcionais nas células. Estas modificacións denomínase modificacións postraducionais (PTMs). As proteínas pregadas nacentes, que son estables en condicións fisiolóxicas, están despois suxeitas a unha batería de modificacións catalizadas por encimas específicas nas cadeas laterais ou na cadea central da proteína.
Entre as modificacións postraducionais das proteínas están as seguintes: acetilación, acilación (miristoilación, palmitoilación), alquilación, arxinilación, ADP-ribosilación, biotinilación, formilación, xeranilxeranilación, glutamilación, glicosilación, glicilación, hidroxilación, isoprenilación, lipoilación, metilación, nitroalquilación, fosfopanteteinilación, fosforilación, prenilación, selenación, S-nitrosilación, succinilación, sulfatación, transglutaminación e ubiquitinación (sumoilación, neddylación).
As modificacións postraducionais que ocorren no extremo N-terminal da cadea de aminoácidos xogan un importante papel na translocación a través das membranas biolóxicas. Entre as proteínas afectadas están proteínas secretoras de procariotas e eucariotas e tamén proteínas que se deben incorporar a varias membranas celulares e de orgánulos como as dos lisosomas, cloroplastos, mitocondrias e membrana plasmática. A expresión de proteínas con modificacións postraducionais é importante en varias doenzas.