Dot blot

Un dot blot ou (slot blot) é unha técnica de bioloxía molecular usada para detectar biomoléculas, como ADN ou proteínas. É unha simplificación dos métodos do northern blot, Southern blot, e western blot (estas técnicas denomínase en conxunto técnicas de blotting ou transferencia). Nun dot blot as biomoléculas que van ser detectadas non se separan primeiro por electroforese, senón que se aplica directamente unha mestura que contén a molécula que debe ser detectada como unha punto ou gota (dot) sobre unha membrana. Isto difire do western blot porque nesta última as mostras proteícas sepáranse primeiro electroforeticamente. Seguidamente faise unha detección por medio de sondas de nucleótidos (para dot blot, northern blot e Southern blot) ou por medio de anticorpos (para western blot).
A técnica ofrece un aforro de tempo significativo, xa que non se require cromatografía nin electroforese en xel, nin os complexos procedementos necesarios, pero non dá información sobre o tamaño da biomolécula diana. Ademais, se se detectan dúas moléculas de diferentes tamaños, aparecerán como un só punto. Por tanto, os dot blots só poden confirmar a presenza ou ausencia dunha biomolécula ou de biomoléculas que poden ser detectadas por sondas de ADN ou anticorpos.
A seguinte imaxe ilustra o resultado obtido ao realizar un protocolo de dot blot no que se fixaron mostras de ADN á membrana, e posteriormente se hibridaron con sondas marcadas radioactivamente específicas de certas rexións do ADN a estudar. Soamente se revelan as mostras portadoras da rexión de interese (puntos escuros). Canto maior é a cantidade do ADN de interese, maior é a intensidade da cor negra. Unha mostra radioactiva pode ser hibridada para permitir a detección da variación entre mostras. O ADN cuantifícase e bótanse en tubos cantidades alicuotas en exceso con respecto ao número das moléculas diana das mostras, como por exemplo 10 µg para un plásmido e 1 µg para un amplicón de PCR. Estas son desnaturalizadas (con NaOH a 95 °C) e engadidas aos pociños onde se aspira a auga ao baleiro (con NaOH e NH4OAc) desde debaixo da membrana (de nailon ou nitrocelulosa). Tipos de dot blot
ASO dot blot
Esta técnica, cuxas siglas ASO veñen do inglés Allele Specific Oligonucleotides (Oligonucleótidos Específicos de Alelos), é unha das metodoloxías que aplican a estratexia dot blot, é dicir, a deposición de mostras coas moléculas de interese sobre unha membrana para, posteriormente, revelar os resultados da presenza ou ausencia dos elementos de estudo mediante marcaxe con sondas dirixidas contra ditos elementos.
Nun caso de detección de alelos, este método consiste en amplificar o ADN de interese (por PCR xeralmente) e fixalo directamente á membrana de traballo (por exemplo con irradiación UV), para logo engadir oligonucleótidos duns 20 pb que son específicos do alelo que quere detectarse. Estes oligos son marcados previamente con radioactividade, fluoróforos ou calquera outro tipo de marcaxe. Trala hibridación, obtéñense os resultados detectando a marcaxe utilizada.
Unha aplicación directa deste protocolo é a detección de mutacións, de maneira que se fixa unha ringleira de mostras, cada unha correspondente a un individuo diferente, do cal se amplificou a rexión de ADN que pode conter ou non a mutación. Primeiramente hibrídanse as mostras cun oligo específico dun dos alelos (o silvestre, salvaxe ou normal, por exemplo) e revélase o resultado. Seguidamente, lávase a sonda e engádese unha nova, específica do outro alelo (o alelo mutado, por exemplo). Aqueles individuos que deran positivo para as dúas hibridacións serían heterocigotos para a mutación (posúen un alelo normal e o outro mutado), mentres que aqueles que soamente presentasen hibridación nun dos casos serían homocigotos para ese caso (para o alelo silvestre ou o mutado). Na imaxe ilústrase un exemplo di resultado obtido por este procedemento:
Neste exemplo o individuo 1 sería heterocigoto para dito xene (presenta os dous alelos, silvestre e mutante), o individuo 2 sería homocigoto para o alelo silvestre ou salvaxe, o 3 homocigoto para o mutante, e así sucesivamente cos restantes.
Esta técnica é sinxela, barata e rápida se o estudo se realiza sobre un xene que presenta poucas variantes alélicas relevantes (mutacións asociadas a unha doenza, por exemplo), pero nada recomendable se debe rehibridarse demasiadas veces.
Exemplo.
A doenza humana anemia falciforme está causada por unha mutación no codón que codifica o sexto aminoácido da beta-hemoglobina en sangue. A secuencia de ADN normal é G-A-G e codifica o aminoácido glutamato, mentres que a mutación ocasiona un cambio no codón de G-A-G a G-T-G, polo que o glutamato orixinal se substitúe por unha valina na proteína final, alterando a estrutura da proteína.
Para detectar a presenza da mutación nunha mostra de ADN pódese usar esta técnica ASO. Podemos deseñar unha sonda para que sexa complementaria á secuencia alterada, normalmente etiquetaríase como “S”. Mentres que como control se deseña outra sonda que hibride coa secuencia normal e neste caso adóitaselle chamar “A”.
Cada sonda é totalmente complementaria á súa secuencia diana e únese fortemente a ela, mais ten un desaxuste coa outra secuencia, a do alelo normal, entón isto provoca unha interacción máis feble con esta secuencia.
Desta forma, o que se fai é coller un segmento dos xenes que codifican a beta-hemoglobina presentes na mostra de ADN e amplifícase por PCR e o resultado aplícase a unha membrana, tamén hai que separar as febras da mostra de ADN. Unha vez feito isto engádese cada sonda a unha membrana do dot blot. Despois da hibridación pódese discriminar entre as sondas que están unidas completamente e as que presentan desaxuste na súa unión. As que presentan desaxustes son lavadas mentres que as que están unidas completamente permanecen na membrana.
Outros métodos que se poden usar na detección de mutacións son a secuenciación ou a RFLP. Este último ten o inconveniente de que a mutación ten que afectar o sitio de restrición dun encima. Esta última técnica foi rapidamente substituída pola ASO. A PCR foi tamén adaptada con grande éxito para a detección de polimorfismos pero, debido á simplicidade e versatilidade do método ASO, este séguese usando.
ASO dot blot inverso
Baséase no mesmo procedemento metodolóxico que o ASO dot blot, coa diferenza de que as moléculas fixadas á membrana son agora os alelos, mentres que o ADN do paciente ou individuo a estudar é o que actúa como sonda. Normalmente establécense dúas ringleiras de mostras, cada unha con distintas variantes alélicas normais ou mutantes (cada columna equivale a un alelo na súa versión normal ou mutada). E sobre ditas mostras aplícase o ADN marcado do individuo a estudo. Así, averíguase que alelos presenta en homocigose ou en heterocigose e se iso determinará o desenvolvemento de certa doenza.
A imaxe mostra un posible exemplo de aplicación da técnica:
O paciente do exemplo da imaxe presenta as dúas versións do alelo 1 (logo é heterocigoto para dito xene), soamente posúe a variante normal do alelo 2, de forma que é homocigoto para este caso (ou ben presenta unha deleción nun dos cromosomas de dita rexión de ADN), é homocigoto para o alelo 3 na súa variante mutada, homicigoto para a versión normal dos alelos 4 e 5 etc.
Esta variante da técnica ASO é utilizada cando non se require a análise de moitos pacientes. Usos da proba do dot blot
A proba de dot blot sensible pode utilizarse para detectar as infeccións pola bacteria Chlamydia trachomatis e outras doenzas de transmisión sexual. O dot blot utilízase para detectar anticorpos antidiaciltrehalosa en pacientes de tuberculose e febre tifoide. A proba do dot blot é especialmente útil en países subdesenvolvidos con sistemas sanitarios deficientes e en rexións que carecen de laboratorios.