Mutaxénese de saturación de secuencias

A mutaxénese de saturación de secuencias (SeSaM) é un método de mutaxénese aleatoria quimio-encimática aplicado á optimización de proteínas e encimas. É unha das técnicas máis comúns da mutaxénese de saturación. En catro pasos de reacción baseados en PCR, insírense nucleótidos fosforotioato na secuencia do xene, son cortados e os fragmentos resultantes alongados por nucleótidos universais ou dexenerados. Estes nucleótidos son despois substituídos por nucleótidos estándar, o que permite unha ampla distribución de mutacións no ácido nucleico espalladas pola secuencia do xene con preferencia de transversións e enfocadas a mutacións puntuais consecutivas, ambas as cales son difíciles de xerar por outras técnicas mutaxénicas. A técnica desenvolveuna o profesor Ulrich Schwaneberg na Universidade Jacobs de Bremen e na Universidade RWTH de Aachen. Tecnoloxía, desenvolvemento e vantaxes
A SeSaM foi desenvolvida para superar varias das principais limitacións que se encontran cando se traballa con métodos de mutaxénese estándar baseados en simples técnicas de PCR proclive ao erro (epPCR). Estas técnicas de epPCR baséanse no uso de polimerases e así teñen limitacións que se orixinan principalmente polo feito de que só se realizan substitucións de nucleótidos únicos, pero raramente consecutivas, e que estas substitucións adoitan ocorrer soamente en posicións específicas favorecidas. Ademais, as transversións de nucleótidos son moito menos probables que as transicións e requiren o uso de polimerases deseñadas especificamente cun nesgo alterado. Estas características dos intercambios de nucleótidos catalizados por epPCR xunto co feito de que o código xenético é dexenerado diminúen a diversidade resultante a nivel de aminoácidos. As substitucións sinónimas orixinan que sexan moito máis frecuentes a conservación do aminoácido ou as mutacións conservadoras entre aminoácidos con propiedades físico-químicas similares como o seu tamaño e hidrofobicidade. Pola introdución non específica de bases universais en cada posición na secuencia do xene, a SeSaM supera o nesgo introducido pola polimerase favorecendo as substitucións por transición en posicións específicas, pero abre a secuencia xénica completa a toda unha diversidade de cambios de aminoácidos. Durante o desenvolvemento do método SeSaM, introducíronse varias modificacións que permitiron a introdución de varias mutacións simultaneamente. Outro avance do método conseguiuse coa introdución de bases dexeneradas no canto de inosina universal e o uso de ADN polimerases optimizadas, incrementando máis a proporción de transversións introducidas. Este método modificado da chamada SeSaM-TV+ ademais permite e favorece a introdución de dous cambios de nucleótidos consecutivos, ampliando moitísimo o espectro de aminoácidos que poden ser substituídos.
Por medio de varias optimizacións, incluíndo a aplicación dunha polimerase quimera mellorada no Paso 3 do método SeSaM-TV-II e a adición dun nucleótido dexenerado alternativo para a substitución eficiente das bases timina e citosina e o incremento da frecuencia de mutación na SeSaM-P/R, as bibliotcas xeradas foron melloradas aínda máis con respecto ao número de transversións e o número de mutacións consecutivas elevouse a de 2 a 4 mutacións consecutivas cunha taxa de mutacións consecutivas de ata o 30%. Procedemento
O método SeSaM consta de catro pasos baseados na PCR que poden executarse en dous ou tres días. As partes principais son a incorporación de nucleótidos fosforotioato, a fragmentación química nesas posicións, a introdución de bases universais ou dexeneradas e a súa substitución por nucleótidos naturais inserindo mutacións puntuais. Inicialmente, insírense as secuencias SeSaM universais por PCR con cebadores específicos de xene diante e detrás do xene de interese. O xene de interese coas súas rexións flanqueantes amplifícase para introducir estas secuencias SeSaM_fwd (as dianteiras) ed SeSaM_rev (as traseiras) e xerar molde para os seguintes pasos de PCR.
Estes así chamados moldes fwd e rev xerados son agora amplificados nunha reacción de PCR cunha mestura predefinida de fosforotioato e nucleótidos estándar para asegurar unha distribución uniforme de mutacións inseridas na totalidade da lonxitude do xene. Os produtos de PCR do Paso I son cortados especificacmente nos enlaces fosforotioato, xerando un conxunto de fragmentos monocaenarios de ADN de diferentes lonxitudes que comezan polo cebador universal.
No Paso 2 da SeSaM, as febras monocatenarias de ADN son alongadas por dunha a varias bases universais ou dexeneradas (dependendo da modificación de SeSaM aplicada) catalizadas pola desoxinucleotidil transferase terminal (TdT). Este paso é o paso clave para introducir as mutacións consecutivas características para mutar aleatoriamente codóns enteiros.
Seguidamente, no Paso 3 realízase unha PCR recombinando os fragmentos de ADN monocatenarios co correspondente molde reverso de lonxitude completa, xerando o xene bicatenario de lonxitude completa incluíndo na súa secuencia bases universais ou dexeneradas.
Substituíndo as bases universais/dexeneradas na secuencia do xene por nucleótidos estándar aleatorios no Paso 4 da SeSaM, xérase un diverso conxunto de secuencias xénicas de lonxitude completa con mutacións de substitución, incluíndo unha alta carga de transversións e mutacións de subtitución subsecuentes. Aplicacións
A SeSaM utilizase para optimizar proteínas dirctamente a nivel de aminoácido, pero tamén para identificar preliminarmente posicións de aminoácidos para comprobar en mutaxénese de saturación o intercambio de aminoácido ideal. A SeSaM foi aplicada con éxito en numerosas campañas de evolución dirixida de diferentes clases de encimas para a súa mellora facendo que adquiran propiedades seleccionadas como a celulase con resistencia a líquidos iónicos, a protease cunha maior tolerancia a deterxentes, a glicosa oxidase para aplicacións analíticas, a fitase con maior termoestabilidade e a monooxixenase cunha eficiencia catalítica aumentada usando doantes de electróns alternativos. A SeSaM está protexida por unha patente US770374 B2 nuns 13 países e é unha das plataformas tecnolóxicas de SeSaM-Biotech GmbH.