Análises moleculares de ADN

O termo sistemática molecular é utilizado para referirse á sistemática macromolecular: o uso do ADN e do ARN para inferir relacións de parentesco entre os organismos (tamén chamados, para evitar confusións, análises moleculares de ADN, que implican análise de secuencias de ADN entre outros métodos). Aínda que tecnicamente, os métodos que implican o uso de isozimas e flavonoides tamén son moleculares, xeralmente son tratados en apartados diferentes.
A aplicación da información sobre os ácidos nucleicos á Bioloxía Sistemática tivo un desenvolvemento espectacular a partir da década dos 90. Os datos moleculares revolucionaron a forma en que a Sistemática establece relacións de parentesco, aínda que non polas razóns suxeridas nun primeiro momento. Introdución ao ADN
O ADN está presente en todas as células e é o responsable de codificar a información xenética do organismo, dunha forma similar a que nos libros está codificada a información que conteñen en forma de letras e palabras. A estrutura do ADN é dunha molécula lineal que se adoita representar con forma de escaleira de caracol, sendo os lados da escaleira cadeas lineais de nucleótidos (cada un deles contén unha base nucleotídica), cada nucleótido está unido a un nucleótido do outro lado da escaleira por pontes de hidróxeno, que adoitan ser representados polos banzos da escaleira.
Para "ler" a información contida no ADN adóitase tomar unha soa das febras da escaleira, e ler a súa secuencia de nucleótidos. Só hai 4 posibles nucleótidos, normalmente representados pola súa inicial en maiúscula: A (adenina), T (timina), C (citosina) e G (guanina). Para formar os "banzos da escaleira", a adenina só pode estar unida á timina, e viceversa, e a citosina só pode estar unida á guanina, e viceversa. Por iso cando se leu unha soa das febras do ADN, xa se ten tamén a información da complementaria.
A cantidade de ADN lido mídese en número de bases nucleotídicas, así se poden atopar unidades de medición como as "kilobases" (unha kilobase mil bases de ADN lidas).
As mutacións do ADN
As mutacións ás que está suxeito o ADN son: as mutacións que substitúen unha base por outra (por exemplo unha adenina por unha guanina debido ao efecto "túnel do protón" onde por acción da luz UV fórmase temporalmente unha terceira ligazón e se a duplicación do ADN ocorre antes que a súa reparación o cambio de base convértese en permanente), as mutacións en que desaparece un anaco de ADN ("delecións"), as mutacións en que un anaco de ADN escíndese e vólvese a unir ao resto noutro lugar diferente ("traslocacións"), as mutacións en que se duplica unha porción do ADN, entre outras. Tamén hai mutacións en que un anaco de ADN doutra especie é traído por vectores (polo xeral virus) e integrado ao ADN da especie estudada, as chamadas "transferencias horizontais de ADN".
Algunhas circunstancias fan que a taxa de mutacións sexa máis alta nalgúns organismos que noutros (por factores ambientais, por exemplo exposición a axentes mutáxenos; ou por factores xenéticos, por exemplo unha ineficiencia nos mecanismos de reparación do ADN).
Debido a que nunha mesma especie os organismos poden intercambiar información xenética en forma fluída (por exemplo mediante a reprodución sexual nos que a posúen), as mutacións que non inducen a morte do organismo adoitan ser transferidas ás xeracións seguintes, dispersándose na poboación. Isto coñécese como "acumulación de mutacións" dentro dunha poboación. Como o intercambio de información xenética entre organismos de especies diferentes é moi baixa ou nula, as mutacións ocorridas dentro dunha poboación (e a longo prazo, dentro dunha especie) mantéñense dentro desa poboación, e desa especie.
Diferenzas entre o ADN do núcleo, das mitocondrias, e dos cloroplastos
O núcleo das células das plantas e os animais contén xenoma de tipo eucariota: o ADN está ordenado en cromosomas, cada cromosoma é unha soa molécula de ADN lineal, empaquetada. En cambio, os dous orgánulos con ADN, que son as mitocondrias (e tamén os cloroplastos, en plantas) teñen xenoma de tipo bacteriano: posúen unha molécula de ADN circular por plastidio, do mesmo xeito que os seus devanceiros que eran bacterias. O tamaño do ADN é moito maior no núcleo que nos orgánulos: no núcleo é tan grande que se mide en "megabases", nas mitocondrias en cambio, é dunhas 200 a 2. 500 kilobases, nos cloroplastos é dunhas 130 a 160 *kbases (unha kbase é igual a mil bases, ou mil "banzos da escaleira").
A forma de herdar o ADN tamén difire no núcleo e os orgánulos: mentres que o ADN núcleo hérdase de forma biparental (como o ADN do núcleo dos animais), o ADN das mitocondrias e o dos cloroplastos das plantas hérdase por parte dun só dos pais, en xeral por parte da nai (do mesmo xeito que as mitocondrias dos animais). Isto é debido a que en xeral os orgánulos que serán transmitidos á xeración seguinte son os que están albergados no óvulo.
A orde en que se atopan os xenes nas mitocondrias é variable, e de feito o xenoma das mitocondrias reordénase espontaneamente con moita frecuencia (que se reordene" quere dicir que se corta en pedazos e vólvense a pegar dunha forma distinta da que estaban). Este reordenamento ocorre con tanta frecuencia que mesmo dentro dunha mesma planta atópanse xenomas diferentes en mitocondrias diferentes, e por tanto non son útiles para diferenciar especies ou grupos de especies, nin para establecer parentescos.
En contraste, o ADN dos cloroplastos é estable (non se reordena con tanta frecuencia), tan estable que se atopan os mesmos arranxos de ADN no xenoma dos cloroplastos de todos os descendentes dun devanceiro común. É por iso que o ADN dos cloroplastos é o máis utilizado nas análises moleculares de ADN, xa que neles, os reordenamentos son raros e por tanto por unha banda, é máis fácil rastrexar mutacións (que dan información de parentesco), e doutra banda, cando si ocorre un reordenamento, ao ser tan raros tamén dan información de parentesco.
O ADN das mitocondrias reordénase con moita frecuencia, pero as mutacións ocorren con moita menor frecuencia que nos cloroplastos. Por iso, a pesar de que é máis difícil de analizar que o xenoma dos cloroplastos debido aos reordenamentos, o xenoma das mitocondrias foi utilizado nas análises moleculares de ADN en que se buscaban parentescos entre parentes afastados (por exemplo nas anxiospermas basais, Qiu 1999).
O ADN do núcleo acumula moitas mutacións e posúe moitos polimorfismos, polo que é utilizado para establecer diferenzas entre especies próximas ou entre poboacións da mesma especie. É máis difícil de analizar que o xenoma dos orgánulos polo que só se fan as análises moleculares do ADN do núcleo nas especies que teñen importancia agrícola. Introdución á Bioloxía Sistemática
A Bioloxía Sistemática é a rama da Bioloxía que se ocupa de establecer as relacións de parentesco entre os taxons de organismos, tamén chamada filoxenia dos organismos. Para iso a Bioloxía Sistemática asume nun principio que todos os organismos do planeta temos un antecesor común, e que os organismos máis emparentados terán máis similitudes entre si que as que terán os organismos máis lonxanamente emparentados. Para saber canto similares son dous organismos entre si a Sistemática válese de caracteres: establécese un carácter que pode ter diferentes estados, e obsérvase nos diferentes organismos, que estados do carácter están presentes (por exemplo flores vermellas/flores brancas).
Para que un carácter sexa útil en Bioloxía Sistemática, é fundamental que exista variación dese carácter nos diferentes organismos estudados (dito doutra forma, que teña "diferentes estados do carácter"). Por iso o interese da Sistemática Molecular céntrase nas mutacións, que dan como resultado caracteres que son compartidos por algúns taxóns pero non por outros, e por tanto atopar un mesmo carácter en dous taxóns diferentes pode ser indicador de que nalgún momento eses taxóns pertencían á mesma especie.
En principio asúmese que os organismos que posúen o mesmo estado do carácter están máis emparentados entre si que os organismos que posúen un estado diferente do carácter, pero non sempre é así. A Bioloxía Sistemática ten que lidar con dúas pantasmas que escurecen a información filoxenética: as reversións e as converxencias. Nas reversións, un estado do carácter volve a un estado ancestral (por exemplo flores brancas -> flores vermellas -> flores brancas). Nas converxencias, dúas especies non emparentadas, por eventos de mutacións independentes, terminan por posuír o mesmo estado do carácter (por exemplo flores vermellas -> flores brancas nos dous casos). As secuencias de ADN utilizadas como caracteres na Bioloxía Sistemática
Os pioneiros en propor os datos moleculares como caracteres para o seu uso no campo da Bioloxía Sistemática, aseguraban que os datos moleculares son máis adecuados que os morfolóxicos para reflectir a verdadeira filoxenia dos organismos, debido a que os datos moleculares reflicten cambios a nivel do xenoma, que se pensaba que estaba menos suxeito a converxencia evolutiva e paralelismo do que o estaban os caracteres morfolóxicos.
Esta asunción temperá hoxe en día parece ser incorrecta. Os datos moleculares están en realidade suxeitos a moitos dos mesmos problemas que teñen os datos morfolóxicos. A maior diferenza é simple: hai moitos máis datos moleculares que datos morfolóxicos dispoñibles, co agregado de que a súa interpretación é máis fácil tamén: unha adenina será sempre unha adenina, pero por exemplo as follas compostas poden ter un aspecto moi diferente en plantas diferentes.
En moitos casos, a cantidade de información que forneceron os datos moleculares ha permitido a localización de taxóns que sempre foron problemáticos (por exemplo Hydrangeaceae foi tradicionalmente situada preto das saxifragáceas pero agora está claro que non están relacionadas, senón que Hydrangeaceae é parte da orde Cornales). Foi máis ben raro que os datos moleculares suxerisen algo completamente novo, aínda que houbo algún que outro caso dramático, como a monofilia do clado do glucosinolato e a localización de Limnanthaceae e a inclusión de Vochysiaceae nos Myrtales. Tipos de xeración de datos moleculares
Os taxónomos valéronse de diversas formas de analizar o ADN, aínda que hoxe en día predomina a análise directa das secuencias, tamén se utilizaron outros métodos como o mapeo de sitios de restrición.
Mapeo de sitios de restrición
Os primeiros estudos moleculares consistiron de mapeos de sitios de restrición. Para iso extraíase o ADN e logo mesturáballo con encimas de restrición, que o cortaban en secuencias específicas (por exemplo a encima BamHI corta o ADN en todos os sitios en que a secuencia sexa GGATCC). Logo utilízanse métodos para separar os pedaciños de ADN segundo o seu tamaño, e esa información dada por varias encimas de restrición utilizábase para reconstruír a secuencia de ADN por laboriosos métodos.
O mapeo de sitios de restrición segue sendo común para estudar a variación no xenoma do cloroplasto e o ARN ribosómico, particularmente entre especies conxenéricas e ás veces dentro de cada especie tamén.
Secuenciación de ADN
A secuenciación de xenes, partes de xenes, ou mesmo de rexións non codificantes é moi utilizada hoxe en día en sistemática. A secuenciación é a determinación da orde precisa en que se atopan os nucleótidos (Adenina, Timina, Citosina ou Guanina) nun anaco de ADN dado. A dificultade máis grande da secuenciación é a de obter unha cantidade suficiente de ADN para traballar. Primeiro utilizáronse librarías de xenes, onde as bacterias replicaban os fragmentos de ADN cortados con encimas de restrición, este laborioso método agora foi substituído polo uso da técnica da PCR. Unha desvantaxe da PCR é que ás veces introduce erros na secuencia, o que pode afectar a estimación da filoxenia, particularmente se as secuencias a comparar son moi similares. Unha forma de diminuír estes erros é secuenciar as dúas cadeas de ADN, e algunhas revistas científicas non aceptan traballos realizados sobre unha soa das cadeas.
A secuenciación directa por PCR pode non distinguir entre múltiples copias dun mesmo xene, ou entre diferentes alelos dun xene (o que si poden facer as librarías de ADN). Caracteres moleculares nas plantas
Por razóns históricas a maior cantidade de caracteres do ADN pertencen ao ADN do cloroplasto e ao ADN que codifica para o ARN ribosomal. Isto foi así porque estes anacos de ADN son abundantes na célula das plantas, facendo a súa detección por Southern blots fácil. Outro tipo de caracteres utilizado foron os reordenamentos de ADN. Sitios de restrición do ADN do cloroplasto tomado por métodos de mapeo de sitios de restrición. Foi moi utilizado nos '80 e segue sendo un bo método para especies que diverxiron recentemente. Para taxóns máis distantes o método faise máis difícil, xa que se acumulan moitas mutacións. A variación dos sitios de restrición é maior entre especies que dentro dunha mesma especie, pero dentro das especies xa hai variación, polo que tamén é útil para documentar historia das poboacións nunha especie.
Xene cloroplastídico rbcL. Moitos sistemáticos de plantas fixeron un esforzo comunitario para xerar unha gran base de datos de secuencias do xene do cloroplasto chamado rbcL. Este xene codifica para a subunidade grande da encima RuBisCO, que é o aceptor de carbono máis importante en todos os eucariotas fotosintéticos e nas cianobacterias. É coñecida a estrutura secundaria do xene, polo que cada aminoácido da subunidade pode ser asignado á súa correspondente secuencia de ADN do xene. O xene foi elixido porque é practicamente universal en todo o reino das plantas (exceptuando só as plantas parasitas), é o suficientemente longo (1428 pares de bases), non presenta problemas de aliñación, e como é parte do cloroplasto está presente en moitas copias en cada célula. O entusiasmo por secuenciar ao rbcL recibiu un pulo coa xenerosidade de Gerard Zurawski, que deseñou un set de primers de PCR que distribuíu gratuitamente a calquera que llo pedise. As árbores filoxenéticas feitas con estas secuencias de rbcL tiveron unha enorme influencia na nosa visión das relacións dentro das anxiospermas, e os sistemas de clasificación actuais como o APG, APG II e o APW fan referencia a eles continuamente. En particular faise moita referencia ao traballo de Chase et al. publicado en 1993 no Annals of the Missouri Botanical Garden, que xerou unha filoxenia para todas as plantas con semente usando 499 secuencias de rbcL. As árbores filoxenéticos publicados non eran os máis curtos posibles, algunhas secuencias terminaron sendo en realidade pseudoxenes, e familias enteiras foron representadas por unha soa secuencia, entre outros problemas. Análises subseguintes desta base de datos de 499 taxóns atopou numerosas árbores filoxenéticos distintos igualmente curtos, moitos deles moi diferentes dos presentados nesa publicación (Rice et al. 1997). Noutras palabras, os resultados deben ser interpretados con precaución, punto que os autores da publicación orixinal recoñeceron. Aínda así a árbore filoxenético de Chase et al. é moi citado e foi tomado como punto de partida por moitos proxectos de investigación.
Unha das limitacións do rbcL como marcador filoxenético é a súa taxa de mutacións baixa. A proteína que codifica é moi definida ao nivel dos aminoácidos que codifica, e as mutacións non adoitan sobrevivir. Por tanto o xene rbcL non é útil para inferir relacións filoxenéticas entre xéneros moi emparentados. Para iso utilizáronse outros xenes cloroplastídicos. ndhF. Ao ter unha taxa de mutacións máis alta que o rbcL, este xene cloroplastídico foi utilzado para inferir relacións entre xéneros moi emparentados. O xene codifica a pequena rexión de copia única da subunidade F da encima NADP deshidroxenase.
rpoA e rpoC2. Codifican respectivamente para a rexión longa de copia única da subunidade alfa e a beta dobre curmá da ARN polimerase II. Tamén son xenes cloroplastídicos con taxa de mutacións máis alta que o rbcL.
matK. Previamente coñecido como ORF (por "open reading frame"), é un xene dunha maturase que está no intrón que separa as rexións codificantes do trnK. Tamén é un xene cloroplastídico con taxa de mutacións máis alta que o rbcL.
Todos os xenes citados até agora son parte do mesmo xenoma non recombinante que o rbcL, polo que seguen o rastro da mesma historia familiar (polo xeral materna, ao ser xenes cloroplastídicos). atpB. É o xene que codifica para a subunidade beta do ATP sintase. Parece evolucionar máis ou menos á mesma velocidade que o rbcL polo que prové caracteres adicionais para a reconstrución da filoxenia. Os datos do atpB foron combinados cos do rbcL para refinar a árbore filoxenético das anxiospermas (Qiu et al. 1999, Soltis et al. 1999).
atp1, atpA. Son xenes mitocondriais, non cloroplastídicos, que codifican para subunidades da APT sintase. Foron utilizados por menos estudos e en xeral os xenes mitocondriais evolucionan máis lentamente que os cloroplastídicos, polo que dan luz sobre eventos máis ancestrais que os cloroplastídicos. Foron útiles para determinar relacións filoxenéticas nas orixes das anxiospermas (Qiu et al. 1999).
matR. Codifica para unha maturase, tamén é un xene mitocondrial que evuluciona máis lentamente que os cloroplastídicos e foi pouco utilizado en relación aos cloroplastídicos.
ADN que codifica para ARN ribosomal ou "ARNr". O ARN ribosomal primeiro foi secuenciado directamente, sen referencia aos xenes que o codificaban, debido ao alto número de copias presente en cada célula, o que facía fácil a súa extracción e secuenciación. Ao principio foron os únicos xenes do núcleo da célula cun número de copias o suficientemente alto como para extraelo e secuencialo. Estes xenes son moi variables aínda ao nivel da poboación. Foron útiles en estudos de estruturas das poboacións e patróns de hibridación.