Criomicroscopia electrónica de transmisión

A criomicroscopia electrónica de transmisión, abreviada como cryo-TEM e, de forma máis xeral, cryo-EM, é unha forma de microscopia electrónica crioxénica na que se utiliza o microsocpio electrónico de transmisión, na que se estuda unha mostra a temperaturas crioxénicas (xeralmente temperaturas de nitróxeno líquido). Esta técnica de microscopia utilízase cada vez máis en bioloxía estrutural.
A utilidade da criomicroscopia electrónica débese a que permite a observación de espécimes que non foron tinguidos ou fixados en absoluto, mostrándoos no seu ambiente nativo. Isto diferénciaa da cristalografía de raios X, na que cómpre cristalizar o espécime, o cal pode ser difícil, e situalo en ambientes non fisiolóxicos, o cal pode por veces orixinar cambios conformacionais non funcionais.
Os avances na tecnoloxía de detectores de electróns, especialmente nos DED (Detectores Electrónicos Directos), así como a aparición de algoritmos de imaxes de software máis potentes permitiron a determinación de estruturas moleculares a unha resolución case atómica. As macromoléculas e estruturas das que se obtiveron imaxes son virus, ribosomas, mitocondrias, canles iónicas e complexos encimáticos. Desde 2018 a criomicroscopia electrónica aplicouse a estruturas tan pequenas como a hemoglobina (64 kDa) e con resolucións de ata 1, 8 Å. En 2019 as estruturas cryo-EM representaban o 2, 5% das estruturas obtidas no Protein Data Bank, e este número continúa a crecer. Unha aplicación desta técnica é a crioelectrotomografía (cryo-ET), na cal se crea unha reconstrución tridimensional da mostra a partir de imaxes bidimensionais da mostra inclinada. Desenvolvemento
A razón orixinal para a cryo-TEM era poder dispoñer dun medio para loitar contra os danos por radiación que sufrían os espécimes biolóxicos estudados. A cantidade de radiación necesaria para obter unha imaxe dun espécime no microscopio electrónico é dabondo grande como para ser unha fonte potencial de danos nas estruturas delicadas do espécime. Ademais, o alto grao de baleiro requirido na columna dun microscopio electrónico fai que o ambiente no que está a mostra sexa bastante rigoroso.
O problema do baleiro resolveuse parcialmente coa introdución de tinguiduras negativas, pero incluso con estas tinguiduras as mostras biolóxicas teñen tendencia ao colapso estrutural por deshidratación do espécime. Incrustar a mostra en xeo a temperatura de sublimación era unha posibilidade que se considerou axiña, pero a auga tendía a formar redes cristalinas de baixa densidade ao conxelarse e isto podía destruír a estrutura de calquera cousa que estivese incrustada nela.
A inicios da década de 1980 varios grupos que estudaban a física do estado sólido estaban intentando producir xeo vítreo de diferentes xeitos, como a conxelación a alta presión ou a conxelación flash. Nun artigo pioneiro de 1984 o grupo liderado por Jacques Dubochet no Laboratorio Europeo de Bioloxía Molecular mostrou imaxes dun adenovirus incrustado nunha capa vitrificada de auga. Este artigo considérase xeralmente como o punto de orixe da cryo-EM, que foi desenvolvida ata converterse nunha técnica de rotina en numerosos laboratorios de todo o mundo.
A enerxía dos electróns usada para obter imaxes (80–300 kV) é suficientemente alta para romper enlaces covalentes. Cando se obteñen imaxes de espécimes, estes son vulnerables a donos por radiación, cómpre limitar a exposición aos electróns utilizada para conseguir a imaxe. Estas baixas exposicións requiren que imaxes de miles ou mesmo millóns de moléculas conxeladas idénticas se seleccionen, aliñen e se faga unha media para obter mapas de alta resolución, usando software especializado. Unha mellora significativa nas características estruturais conseguiuse en 2012 pola introdución de detectores de electróns directos e mellores algoritmos computacionais.
En 2015 Bridget Carragher e os seus colegas do Scripps National Resource for Automated Molecular Microscopy utilizaron técnicas que ela e Clint Potter desenvolveron para determinar a primeira estrutura cryo-EM cunha resolución mellor que 3 Å, o que situou a cryo-TEM como unha ferramenta comparable e potencialmente superior ás tradicionais técnicas de cristalografía de raios X que se viñan usando. Desde entón, acadáronse maiores resolucións, incluíndo unha estrutura a 2, 2 Å do encima bacteriano β-galactosidase en 2015 e unha estrutura a 1, 8 Å da glutamato deshidroxenase en 2016. A cryo-EM utilizouse tamén para determinar a estrutura de varios virus, incluíndo o virus Zika, e aplicouse a grandes complexos como o espliceosoma. En 2017 o premio Nobel de Química concedéuselles conxuntamente a Jacques Dubochet, Joachim Frank e Richard Henderson, "polo desenvolvemento da microscopia crioelectrónica para a determinación da estrutura a alta resolución de biomoléculas en solución". Espécimes biolóxicos
Película fina
O material biolóxico esténdese sobre unha grella de microscopio electrónico e consérvase en estado conxelado-hidratado por medio dunha conxelación rápida, normalmente en etano líquido preto da temperatura do nitróxeno líquido. Ao mantérense os espécimes a temperaturas de nitróxeno líquido ou máis frías, poden introducirse no alto baleiro da columna do microsocpio electrónico. A maioría dos espécimes biolóxicos son extremadamente radiosensibles, así deben de obterse imaxes deles con técnicas de baixa dose de radiación (aproveitando que a baixa temperatura da criomicroscopia electrónica de tranmisión proporciona un factor de protección adicional contra os danos por radiación).
En consecuencia, as imaxes conteñen unha cantidade extremadamente grande de "ruído". Para algúns sistemas biolóxicos é posible obter unha media das imaxes para incrementar a razón sinal-ruído e conseguir información de alta resolución sobre o espécime usando a técnica coñecida como análise de partícula única. Esta estratexia require en xeral que as cousas das que se vai facer a media sexan idénticas, aínda que agora pode estudarse certa heteroxeneidade conformacional limitada (por exemplo, en ribosomas). Resolvéronse reconstrucións tridimensionais das imaxes cryo-TEM de complexos de proteínas e virus a unha resolución subnanométrica ou case atómica, o que proporcionou unha nova visión da estrutura e bioloxía destas grandes ensamblaxes.
A análise de conxuntos ordenados de proteínas, como nos cristais bidimensionais de proteínas transmembrana ou conxuntos de proteínas helicoidais, tamén permitiu facer un tipo de media que pode proporcionar información de alta resolución sobre o espécime. Esta técnica denomínase cristalografía electrónica.
Seccións vítreas
O método de película fina está limitado a espécimes delgados (tipicamente < 500 nm) porque os electróns non poden cruzar mostras máis grosas sen episodios de dispersión múltiple. Os espécimes máis grosos poden ser vitrificados mergullándoos no conxelante (criofixación) etano (ata décimas de micron de grosor) ou máis comunmente por conxelación a alta presión (poden ter centos de microns). Poden despois cortarse en finas láminas ou seccións (de 40 a 200 nm de grosor) cun coitelo de diamante nun crio-ultramicrótomo a temperaturas menores de −135 °C (temperatura de desvitrificación). As láminas lévanse a unha grella de microscopio electrónico e obtéñense imaxes delas da mesma maneira que nun espécime vitrificado nunha película. Esta técnica chámase criomicroscopia electrónica de transmisión de seccións vítreas (CEMOVIS) ou criomicroscopia electrónica de tansmisión de seccións conxeladas-hidratadas. Espécimes materiais
Ademais de para mostras biolóxicas vitrificadas, a cryo-TEM pode utilizarse tamén para obter imaxes de espécimes que son demasiado volátiles no baleiro para poder utilizar a microscopia electrónica estándar a temperatura dunha habitación. Por exemplo, poden extraerse as seccións vitrificadas de interfaces líquido-sólido para a súa análise por cryo-TEM, e o xofre, que tende á sublimación no baleiro dos microscopios electróncos, pode ser estabilizado e obterse imaxes del con cryo-TEM. Procesamento de imaxes de cryo-TEM
Aínda que na maioría das técnicas de microsocpia electrónica se intenta obter imaxes dun material coa mellor resolución, non sempre é o caso na cryo-TEM. Ademais de todos os beneficios que teñen as imaxes de alta resolución, a razón sinal-ruído segue sendo o principal atranco que impide asignar unha orientación a cada partícula. Por exemplo, en complexos macromoleculares, hai varias estruturas diferentes que se proxectan de 3D a 2D durante a obtención de imaxes e se non se distinguen, o resultado do procesamento da imaxe pode ser borroso. Isto débese a que as estratexias probabilísticas fanse máis potentes neste tipo de investigacións. Hai dúas estratexias comúns que son moi usadas hoxe no procesamento de imaxes en cryo-EM: o método de máxima verosimilitude que se descubriu en 1998 e o relativamente recente método bayesiano adaptado.
O método de estimación de máxima verosimilitude chegou a este campo desde o da estatística. Aquí, todas as posibles orientacións das partículas súmanse para conseguir a distribución de probabilidades resultante. Pódese comparar isto cunha estimación do cadrado mínimo típica, na que as partículas teñen orientacións exactas por imaxe. Deste modo, as partículas na mostra teñen orientacións "borrosas" despois dos cálculos, ponderadas polas correspondentes probabilidades. O proceso completo é iterativo e con cada seguinte iteración o modelo faise mellor. As boas condicións para facer o modelo que represente o mellor posible a estrutura real danse cando os datos non teñen demasiado ruído e as partículas non teñen ningunha dirección preferencial. O principal inconveniente do método de máxima verosimilitude é que o resultado depende da suposición inicial e a optimización do modelo pode ás veces quedar trabada no mínimo local.
O método bayesiano que está usándose agora en cryo-TEM é empírico por natureza. Isto significa que a distribución de partículas está baseada no conxunto de datos orixinal. De xeito similar, no método bayesiano usual hai unha probablidade a priori fixada que se cambia despois de que se observan os datos. A principal diferenza da estimación de máxima verosimilitude está no termo reconstrución especial que axuda a suavizar os mapas resultantes á vez que diminúe o ruído durante a reconstrución. A suavización dos mapas ocorre ao asumir que a probabilidade a priori é unha distribución de Gauss e analiza os datos no espazo de Fourier. Como a conexión entre o coñecemento a priori e o conxunto de datos está estabilizada, hai menos posibilidades de erros causados polo factor humano, o cal podería incrementar a obxectividade da reconstrución da imaxe.
Coa aparición de novos métodos de ober imaxes por cryo-TEM e de reconstrución de imaxes, as novas solucións de software parece que axudan a automatizar o proceso. Desde que se empezou a aplicar a estratexia bayesiana empírica no programa de computador de fonte aberta RELION (REgularized LIkelihood OptimizatioN) para reconstrucións 3D, o uso do programa espallouse en todo o eido da cryo-TEM. Ofrece un rango de correccións que mellora a resolución das imaxes reconstruídas, permite aplicar scripts versátiles usando a linguaxe de programación python e executa as tarefas habituais dos modelos de clasificacións 2D/3D ou crear modelos de novo. Técnicas
Diversas técnicas utilizan a cryo-TEM. Entre as máis utilizadas están: Cristalografía electrónica
Análise de cristais bidimensionais
Análise de filamentos helicoidais ou tubos
Difracción de electróns en microcristais (MicroED)
Análise de partícula única (SPA, Single Particle Analysis)
Cryo-TEM resolto no tempo
Criotomografía electrónica (cryoET).