Cromosoma artificial de lévedo

Un cromosoma artificial de lévedo (CAL, xeralmente abreviado YAC, do inglés Yeast artificial chromosome) é un cromosoma preparado por enxeñaría xenética derivado de ADN do lévedo Saccharomyces cerevisiae, que é despois ligado a un plásmido bacteriano. Inserindo grandes fragmentos de ADN, de 100 a 1000 kb, estas poden ser clonadas e mapadas fisicamente usando un proceso chamado chromosome walking. Este foi o proceso que se usou inicialmente para o Proxecto Xenoma Humano; porén, debido a consideracións sobre a estabilidade, os YACs foron abandonados polo uso no seu lugar de cromosomas artificiais bacterianos (BAC). Nas investigacións iniciais de Rankin et al. , Strul et al. e Hsaio et al. , o cromosoma, inherentemente fráxil, foi estabilizado ao descubrirse a necesaria secuencia que se replica autonomamente (ARS, autonomously replicating sequence); en 1983 Murray et al. describiron un YAC refinado utilizando estes datos. Os compoñentes primarios do YAC son o ARS, o centrómero e os telómeros de S. cerevisiae. Ademais, utilízanse xenes marcadores seleccionables, como os que dan resistencia a antibióticos e un marcador visible, para seleccionar as células transformadas de lévedos. Sen estas secuencias, o cromosoma non sería estable durante a replicación extracelular e as colonias que o levan non serían distinguibles das colonias sen o vector. Construción
Un YAC constrúese usando un ADN circular de plásmido inicial, que tipicamene se corta orixinando unha molécula de ADN lineal utilizando encimas de restrición; despois utilízase a ADN ligase para ligar unha secuencia de ADN ou xene de interese no ADN linearizado, formando un fragmento circular longo de ADN. A xeración básica dos cromosomas artificiais de lévedo lineares pode ser dividida en 6 grandes pasos:
1. Ligación do marcador seleccionable nun vector plásmido: isto permite a selección diferencial de colonias con ou sen o xene marcador. Un xene de resistencia a antibióticos permite que o vector YAC sexa ser amplificado e seleccionado en E. coli ao recuperar capacidade do E. coli mutante de sintetizar leucina en presenza dos compoñentes necesarios no medio de crecemento. Outros marcadores seleccionables son os xenes TRP1 e URA3. O sitio de clonación do vector YAC para o ADN alleo está localizado dentro do xene SUP4. Este xene compensa a mutación na célula hóspede de lévedo que causa a acumulación de pigmento vermello. As células hóspede son normalmente vermellas, e aquelas que foron transformadas só con YAC, formarán colonias incoloras. A clonación dun fragmento de ADN alleo no YAC causa a inactivaión insercional do xene, restaurando a cor vermella. Por tanto, as colonias que conteñen o fragmento de ADN alleo son vermellas.
2. Ligación de secuencias centroméricas necesarias para a estabilidade mitótica.
3. Ligación de secuencias que se replican autonomamente (ARS), que proporcionan unha orixe de replicación para realizar unha replicación mitótica. Isto permite que o plásmido se replique extracromosomicamente, pero fai que o plásmido sexa moi inestable mitoticamente, e facilmente se perda sen as secuencias centroméricas.
4. Ligación de secuencias teloméricas artificiais para converter un plásmido circular nun fragmento linear de ADN.
5. Inserción das secuencias de ADN que van ser amplificadas (de ata 1000 kb).
6. Transformación da colonia de lévedos. Cromosoma III completo
En 2014, Jef Boeke do Langone Medical Centre da Universidade de Nova York, publicou que o seu equipo sintetizara un dos 16 cromosomas do lévedo Saccharomyces cerevisiae, o cromosoma III, que nomeou como synIII. O procedemento implicado substituía os xenes do cromosoma orixinal por versións sintéticas e o cromosoma sintetizado final era despois integrado nunha célula de lévedo. Foi necesario o deseño e a creación de 273871 pares de bases de ADN, o que é unha cantidde menor que os 316667 pares que tiña o cromosoma orixinal. Usos en biotecnoloxía
Os vectores de expresión de lévedos, como os YACs, YIps (plásmidos integradores de lévedo), e YEps (plásmidos episómicos de lévedo), teñen unha vantaxe sobre os cromosomas artificiais bacterianos (BAC) porque poden utilizarse para expresar proteínas eucariotas que requiren modificacións postraducionais. Ao poderse integrar neles grandes fragmentos de ADN, os YAC poden utilizarse para clonar e ensamblar o xenoma completo dun organismo. Coa inserción dun YAC nas células de lévedo, poden propagarse como cromosomas artificiais lineares, clonando as rexións inseridas do ADN neste proceso. Unha vez completado isto, poden usarse dous procesos para obter un xenoma secuenciado ou rexión de interese. que son:
1. Mapado físico.
2. Chromosome walking.
Isto é significativo porque permite o mapado detallado de rexións específicas do xenoma. Examináronse coromosomas humanos completos, como o cromosoma X, xerando a localización de marcadores xenéticos para numerosos trastornos e caracteres xenéticos. O Proxecto Xenoma Humano
Os YAC son significativamente menos estables que os BAC, producindo "efectos quiméricos": artefactos nos que as secuencias do ADN clonado non se corresponden realmente cunha soa rexión xenómica senón con múltiples rexións. O quimerismo pode deberse á coligación de múltiples segmentos xenómicos nun só YAC, ou á recombinación de dous ou máis YAC transformados na mesma célula de lévedo hóspede. A incidencia do quimerismo pode ser de ata o 50%. Outros artefactos son a deleción de segmentos dunha rexión clonada e o rearranxo de segmentos xenómicos (como a inversión). En todos estes casos, a secuencia determinada a partir do clon de YAC é diferente da secuencia orixinal natural, o que orixina resultados inconsistentes e erros ao interpretar se a información do clon é confiable ou non. Debido a estes problemas, o Proxecto Xenoma Humano abandonou finalmente o uso de YAC en favor do uso de cromosomas artificiais bacterianos, nos que a incidencia destes artefactos é moi baixa. Ademais de pola estabilidade, especificamente pola aparición relativamente frecuente de eventos quiméricos, os YACs probaron ser ineficaces á hora de xeraren o mínimo "camiño de baldosas" (tiling path, os fragmentos de ADN con extremos coincidentes que se empalman) para cubrir o xenoma humano completo. Crear a biblioteca de clons consome moito tempo. Ademais, debido á natureza da confianza nos sitios etiquetados por secuencia (STS, sequence-tagged sites) como punto de referencia cando se seleccionan os clons apropiados, hai grandes ocos que necesitan unha xeración adicional de bibliotecas para solucionalos. Foi este inconveniente adicional o que levou a que o proxecto pasase a utilizar BACs. Isto débese a dous factores:
1) Os BACs xéranse moito máis rapidamente e cando se xeran bibliotecas redundantes de clons isto é esencial.
2) Os BACs permiten unha cobertura máis densa con STSs, o que ten como resultado uns "camiños de baldosas" mínimos máis eficientes e completos xerados en computador.
Porén, é posible utilizar ambas as estratexias, como se demostrou no xenoma do nematodo Caenorhabditis elegans. A maioría deste xenoma quedou cuberto con BACs e os ocos foron enchidos con YACs.