ELISPOT

O ensaio ELISPOT ou ás veces ELISpot, do inglés Enzyme-Linked ImmunoSpot ou Inmunopunto ligado a encima (referido a un ensaio de inmunoabsorbencia ligada a encima no que se orixinan precipitados que forman puntos coloreados), é un método analítico amplamente usado para monitorizar as respostas inmunitarias en humanos e outros animais, e ten aplicacións clínicas no diagnótico da tuberculose e a monitorización da tolerancia ou rexeitamento de enxertos en pacientes transplantados. A técnica ELISPOT é un dos medios máis útiles de que se dispón para monitorizar a inmunidade mediada por células, debido a que fai unha detección precisa e moi sensible de escasas células T (ou B) específicas de antíxeno e a súa capacidade de visualizar unha soa célula positiva entre toda unha poboación de células mononucleares do sangue periférico.
O método ELISPOT foi desenvolvido polo grupo de Cecil Czerkinsky en Gotemburgo, Suecia en 1983, co propósito de detectar células que segregan anticorpos específicos de antíxenos (ASC) no ensaio ELISPOT de células B, que era unha modificación dun inmunoensaio ELISA en sándwich tradicional. Desde entón o ensaio ELISPOT foi principalmente adoptado como método para a identificación e contaxe de células produtoras de citocinas coa resolución dunha soa célula, pero aínda se segue usando para a detección de anticorpos específicos de antíxenos.
En resumo, nas condicións apropiadas o ensaio ELISPOT permite a visualización de produtos segregados de células activadas ou que están orixinando respostas individuais. Cada punto (spot) que se orixina durante o ensaio representa unha soa célula reactiva. Así, o ensaio ELISPOT proporciona información tanto cualitativa (sobre citocinas específicas ou outras moléculas inmunes segregadas) coma cuantitativa (a frecuencia das células que desenvolven unha resposta dentro da poboación examinada).
Dedido á gran sensibilidade do ELISPOT, as análises das frecuencias de escasas células específicas de antíxeno nunha poboación a examinar, que eran imposibles de realizar antes deste desenvolvemento, son agora relativamente simples. Esta sensibilidade excepcional deriva da mecánica do propio métido de ensaio.
Nun ensaio ELISPOT, as superficies da membrana nunha placa microtitradora de membrana de PVDF de 96 pozos están cubertas cun anticorpo de captura que se une a un epítopo específico da citocina que está sendo comprobada. Durante o paso de incubación e estimulación da célula, seméntanse os PBMC nos pociños da placa xunto co antíxeno, e forman unha monocapa sobre a superficie da membrana do pozo. A medida que as células específicas de antíxeno están activadas, liberan a citocina, que é capturada directamente sobre a superficie da membrana polo anticorpo inmobilizado. Deste xeito, a citocina é “capturada” na área que rodea directamente a célula secretora, antes de que teña a posibilidade de difundir no medio de cultivo ou ser degradada polas proteases e se una a receptores doutras células das proximidades. Os seguintes pasos de detección visualizan as citocinas inmobilizadas como un inmunopunto, que indica esencialmente a pegada secretora das células activadas (véxase máis abaixo).
Este mecanismo de captura das citocinas segregadas fai que o método ELISPOT sexa moito máis sensible que os ensaios que miden as citocinas liberadas en cultivos sobrenadantes, polas razóns mencionadas antes. Os Cytokine Bead Arrays (CBA) e os ensaios de ELISA convencionais poden proporcionar información extremadamente útil en certos contextos, pero carecen da sensibilidade e exactitude do ELISPOT para a detección e enumeración de células escasas específicas e antíxenos.
Os límites prácticos de detección do ELISPOT dependen xeralmente do número de células sementadas nun pozo de ensaio. Normalmente nun ensaio utilízanse de 200000 a 400000 PBMC por pozo, pero utilízanse ata un millón de células para a detección de eventos raros. O ELISPOT pode detectar unha soa célula positiva para un antíxeno dentro desa poboación celular, o que supón un límite de detección teórico dunha célula entre un millón. Procedemento
Os ensaios ELISPOT empregan unha técnica moi similar á da técnica ELISA sándwich. Utilízase un anticorpo de captura, que pode ser un anticorpo monoclonal (o preferido pola súa grande especificidade) ou policlonal para cubrir asepticamente unha microplaca cuberta de PVDF. Estes anticorpos elíxense pola súa especificidade para o analito en cuestión. A placa é bloqueada, xeralmente cunha proteína sérica que non é reactiva con ningún dos anticorpos do ensaio. Despois diso, as células de interese son situadas na placa en varias densidades, xunto co antíxeno ou mitóxeno, e despois colocadas nunha incubadora de CO2 a 37 °C humidificado durante un período de tempo especificado. Algúns antíxenos, como as proteínas, antes de seren cargados poden ter que ser previamente procesados por células presentadoras de antíxenos.
As citocinas (ou outros produtos celulares de interese) segregados polas células activadas son capturados localmente polo anticorpo cuberto na grande área superficial da membrana de PVDF. Unha vez lavados os pozos para eliminar as células, os residuos e os compoñentes do medio, engádese aos pociños un anticorpo biotinilado específico para o analito escollido. Este anticorpo é reactivo con distintos epítopos dunha citocina diana, polo que pode ser empregado para detectar a citocina capturada. Despois de facer un lavado e retirar todo o anticorpo biotinilado que non se uniu, a citocina detectada visualízase despois usando estreptavidina conxugada cun encima (a peroxidase do ravo picante, HRP, ou a fosfatase alcalina, AP) e un substrato que precipita (por exemplo, AEC, BCIP/NBT). O produto final coloreado, que se ve como un punto normalmente de cor vermella (como no caso de usar peroxidase do ravo picante) ou azul anegrado (se usamos fosfatase alcalina), representa unha célula produtora de citocina individual. Os puntos visualizados danlle nome á técnica (ImmunoSpot, Inmunopunto) e poden contarse manualmente, por exemplo cun microscopio de disección, ou usando un lector automatizado para capturar as imaxes dos micropozos e analizar o número e tamaño dos puntos. Ensaio FluoroSpot
O ensaio FluoroSpot é unha modificación do ELISPOT e está baseado no uso de múltiples anticorpos anticitocinas marcados fluorescentemente, o que fai posible medir dúas citocinas no mesmo ensaio. Aplicación
En 2011, dispoñíase comercialmente de probas in vitro baseadas na detección de inmunidade mediada por células para o diagnóstico da tuberculose. Estas probas usan os péptidos antixénicos específicos de Mycobacterium tuberculosis (MTB) chamados ESAT-6 (Early Secretory Antigenic Target-6) e CFP-10 (Culture Filtrate Protein 10) para estimular células T sensibilizadas por M. tuberculosis para a produción de IFN-γ. Os antíxenos ESAT-6 e CFP-10 son específicos para M. tuberculosis e prodúcense nunha área xenómica do microbio chamada Rexión de Diferenza 1 (RD1). Por tanto, a detección baseada en ELISPOT de CME pode proporcionar valiosa información sobre o diagnóstico da tuberculose. Ademais, esta proba non parece presentar reactividade cruzada coa lepra a pesar de que o antíxeno de M. leprae L-ESAT é moi homólogo do antíxeno T-ESAT-6 usado nesta proba. Por tanto, esta proba pode utilizarse mesmo en países onde a lepra é aínda endémica.
Desenvolvéronse probas de ELISPOT para a detección de infeccións ocultas de enfermidade de Lyme.