Micromatriz de ADN

Unha micromatriz de ADN (DNA microarray), tamén chamada chip de ADN ou biochip de ADN ou microarranxo de ADN, é unha superficie sólida á que se unen un conxunto de "puntos" (sitios, manchas) microscópicos (spots ou features na literatura inglesa) que levan fragmentos de ADN. Os científicos usan estas micromatrices para medir os niveis de expresión dun gran número de xenes simultaneamente ou para xenotipificar múltiples rexións dun xenoma. Cada unha destas "manchas" con ADN contén picomoles (10−12 moles) dunha secuencia de ADN específica, chamada sonda (probe ou reporteiros ou oligos). Estas secuencias poden ser un curto fragmento dun xene ou outro elemento de ADN que se utiliza para hibridalo a unha mostra "diana" (target) de ADNc ou ARNc (tamén chamado ARN antisentido). A hibridación entre a sonda e a diana xeralmente detéctase e cuantifícase porque a diana detectada está etiquetada cun fluoróforo ou con prata ou con quimioluminescencia, o que serve para determinar a abundancia relativa da secuencia do ácido nucleico na diana.
Unha das súas principais aplicacións é identificar xenes cunha expresión diferencial en condicións distintas. Por exemplo, para detectar xenes que producen certas doenzas comparando os niveis de expresión entre células sas e células que están desenvolvendo certos tipos de doenzas. A micromatriz básica
Como unha matriz (array) pode conter decenas de miles de sondas, un experimento cunha micromatriz (microarray) pode realizar moitas probas xenéticas en paralelo. Por tanto, o uso destas matrices acelerou drasticamente moitos tipos de investigacións. Nas micromatrices estándar as sondas son sintetizadas e despois unidas por medio de enxeñaría de superficie a unha superficie sólida por enlace covalente a unha matriz química (por medio de epoxi-silano, amino-silano, lisina, poliacrilamida ou outros). A superficie sólida pode ser vidro ou un chip de silicio, e nese caso denomínanse coloquialmente chip Affy se se utiliza un chip Affymetrix. Outras plataformas de micromatrices, como Illumina, utilizan boliñas, en vez de soportes sólidos grandes. Alternativamente, poden construírse micromatrices por síntese directa de sondas de oligonucleótidos en superficies sólidas. As matrices de ADN diferéncianse doutros tipos de micromatrices só en que ou ben miden o ADN ou usan o ADN como parte do seu sistema de detección.
As micromatrices de ADN poden utilizarse para medir cambios nos niveis de expresión para detectar polimorfismos dun só nucleótido (SNPs), ou para xenotipificar ou resecuenciar unha molécula diana. As micromatrices tamén se diferencian na súa fabricación, funcionamento, exactitude, eficiencia, e custo. Outros factores adicionais nos experimentos con micromatrices son o deseño experimental e os métodos de análise dos datos. Principio
O principio fundamental das micromatrices é a hibridación entre dúas febras de ADN, grazas á propiedade que teñen as secuencias de ADN complementarias de aparearse especificamente unha con outra formando enlaces de hidróxeno entre pares de bases nucleotídicas complementarias. Se hai un elevado núumero de pares de bases complementarias nunha secuencia nucleotídica, vaise producir un enlazamento non covalente máis forte entre as dúas febras. Despois de facer un lavado que arrastre as secuencias que non teñan especificidade de enlace, só quedarán hibridadas as febras fortemente apareadas. As secuencias diana etiquetadas flourescentemente que se unen a unha secuencia de sonda xeran un sinal que depende das condicións de hibridación (como a temperatura), e o lavado despois da hibridación. A forza total do sinal xerado desde un dos "puntos" ou "sitios" da micromatriz (spot, feature), depende da cantidade de mostra diana que se una ás sondas presentes nese "punto". As micromatrices usan unha cuantización relativa na cal se compara a intensidade dun destes "puntos" (feature) coa intensidade do mesmo "punto" en diferentes condicións (ver tamén os experimentos de dous canais máis abaixo) e a identidade do "punto" coñécese pola súa posición. Tipos
Existen moitos tipos de matrices e a maior distinción que se pode facer entre elas é se están dispostas espacialmente sobre unha superficie ampla ou en boliñas codificadas: A matriz de fase sólida tradicional é unha colección de "puntos" ordenados microscopicamente, chamados features, cada unha con miles de sondas específicas idénticas unidas a unha superficie sólida, como un vidro, plástico ou biochip de silicio (xeralmente coñecido por chip xenómico, chip de ADN ou matriz de xenes). Poden situarse miles destas en localizacións coñecidas nunha soa micromatriz de ADN.
A matriz de boliñas alternativa é unha colección de boliñas de polistireno microscópicas, cada unha das cales leva unha sonda específica e dúas ou máis marcaxes, que non interfiren coa marcaxe fluorescente usada na secuencia diana.
As principais técnicas de micromatrices de ADN son:
Micromatrices de dous canais (ou dúas cores)
Neste tipo de chips de ADN (en inglés spotted microarrays), as sondas son oligonucleótidos, ADN complementario (ADNc) ou pequenos fragmentos de reacción en cadea da polimerase, que corresponden a ARN mensaxeiros. Neste tipo de chip de ADN utilízanse preparacións de ADNc obtido a partir de dúas mostras biolóxicas distintas; por exemplo, de células cultivadas en dúas condicións distintas. O ADNc de cada mostra márcase cun fluoróforo diferente, e as dúas preparacións de ADNc marcadas mestúranse e hibridan sobre o mesmo chip de ADN. Unha vez realizado este primeiro paso, procédese ao escaneo do resultado e á visualización do mesmo. Desta forma pódense detectar xenes que se activan ou se reprimen en distintas condicións. A contrapartida destes experimentos é que non se poden observar niveis absolutos na expresión e requiren PCR cuantitativa (qPCR) para unha análise cuantitativa absoluta.
Chips de oligonucleótidos de ADN
Nos chips de oligonucleótidos de ADN ou micromatrices de canal único, as sondas deséñanse a partir dunha secuencia coñecida ou dun ARNm predito. Estes chips de ADN dan estimacións do nivel de expresión, mais nunha mesma matriz non se poden observar distintas condicións, polo que hai que utilizar un chip para cada condición.
A idea principal desta técnica é que as sondas se sintetizan in situ (no chip).
Non están baseados na hibridación competitiva, é dicir, un chip, unha mostra.
As secuencias constrúense na superficie do chip mediante o alongamento secuencial dunha cadea en crecemento cun só nucleótido utilizando fotolitografía.
GeneChips de Affymetrix
Affymetrix é a compañía líder neste tipo de chips.
Denomínanse xenericamente "GeneChips".
Cada xene é representado por un conxunto de secuencias curtas que o caracterizan.
Algúns chips teñen xenomas completos con máis de 50. 000 grupos de sondas.
Chips de ADN para xenotipificación
Os chips de ADN poden utilizarse para "ler" as secuencias dun xenoma en determinadas posicións. As matrices de SNP (SNP arrays) son un tipo particular de matrices que se utilizan para identificar variacións individuais e nas poboacións. Os oligonucleótidos pequenos poden identificar polimorfismos dun só nucleótido (SNPs, single nucleotide polymorphisms) que poderían ser os responsables das variacións xenéticas dentro dunha poboación, e a fonte de susceptibilidade a distintas enfermidades xenéticas e mesmo a certos tipos de cancro. En xeral, a aplicación destas técnicas de xenotipificación ou xenotipado é o uso forense e o médico, xa que son rápidas para descubrir ou medir a predisposición a doenzas ou mesmo permitir o uso de certos medicamentos para tratar determinadas doenzas segundo sexa o ADN do doente ou doante. Os chips de ADN de SNPs tamén se utilizan para a identificación de mutacións somáticas en cancros, sobre todo a perda de heterocigose, a amplificación ou a deleción de rexións de ADN no xenoma individual de pacientes afectados, é dicir, a detección de aberracións cromosómicas. Aplicacións
As micromatrices de ADN poden utilizarse para detectar ADN (como na hbridación xenómica comparativa), ou detectar ARN (xeralmente en forma de ADNc despois de facer unha transcrición inversa), o cal pode ser ARN que é traducido a proteínas ou non. O proceso de medir a expresión xénica por medio de ADNc denomínase análise de expresión ou perfil de expresión.
As principais aplicacións son: Fabricación
As micromatrices poden fabricarse de diferentes xeitos, dependendo do número de sondas a examinar, custos, requirimentos de personalización, e o tipo de cuestión científica que se vai examinar. As matrices poden ser de só 10 sondas ou de ata 2, 1 millóns de sondas a escala micrométrica vendidas comercialmente. É normal o uso de robots que se encargan da maior parte do proceso de manipulación dos chips (sintetizar o ADN molde que se une ao chip, unilo, engadir os reactivos necesarios etcétera).
O chip é unha placa pequena de arredor de 6 cm x 3 cm sobre a cal se fixan as febras monocatenarias (en lugar das bicatenarias habituais) de ADN, cada un correspondente a unha febra complementaria de ARN mensaxeiro. Poden fixarse sobre un chip varias decenas de miles de fragmentos de ADN.
As sondas deposítanse sobre a lámina de maneira similar á dunha impresora de inxección de tinta. Desta maneira, un brazo robótico con múltiples agullas mergúllase primeiro en pociños que conteñen as sondas (preparadas previamente) e despois deposita ringleiras de diminutas pinguiñas dunha solución de ADN en posicións específicas do chip. Deste conxunto de ringleiras vén o nome de microarray ou micromatriz. O ADN é despois secado e tratado de maneira que quede fixado ao chip. Esta "grella" ou retícula bidimensional de ringleiras e columnas ou micromatriz de sondas do tipo spotted microarray xa está preparada para recibir as dianas derivadas das mostras que se queren analizar.
As micromatrices de oligonucleótidos fabrícanse xeralmente doutra maneira, xa que as sondas se sintetizan nucleótido a nucleótido na superficie da propia matriz (en vez de depositar sondas previamente formadas). Micromatrices e bioinformática
A chegada da tecnoloxía dos experimentos de micromatrices baratos orixinou varios retos bioinformáticos: Os múltiples niveis de replicación no deseño experimental (deseño experimental).
O número de plataformas e grupos independentes e formatos de datos (estandarización).
O tratamento dos datos (análise estatística).
A exactitude e precisión (relación entre a sonda e o xene)
O enorme volume de datos e a capacidade de compartilos (almacenamento de datos). Tecnoloxías alternativas
Os avances na secuenciación en paralelo masiva levaron ao desenvolvemento da tecnoloxía RNA-Seq, que permite utilizar unha estratexia de escopeta de transcriptoma completo para caracterizar e cuantificar a expresión xénica. A diferenza das micromatrices, que necesitan dispoñer dun xenoma e transcriptoma de referencia antes de facer o experimento de micromatrices propiamente dito, a tecnoloxía RNA-Seq pode usarse tamén para novos organismos modelo cuxos xenomas aínda non foron secuenciados. Historia
A tecnoloxía de micromatrices evolucionou desde a técnica do Southern blot, na que o ADN fragmentado está unido a un substrato e despois é sondado cunha secuencia de ADN coñecida. O primeiro informe do uso deste enfoque técnico foi a análise de 378 colonias bacterianas lisadas en matriz, cada unha das cales levaba unha diferente secuencia, a cal era probada en múltiples réplicas para a expresión de xenes en tecido tumoral e normal múltiple. Isto foi ampliado despois a unha análise de máis de 4000 secuencias humanas con computador con escaneo e procesamento de imaxes para a análise cuantitativa das secuencias en tumores de colon humanos e tecidos normais, e despois para comparar tecidos de colon con diferentes riscos xenéticos. O uso dunha colección de diferentes ADNs en matrices para obter un perfil de expresión foi tamén descrito en 1987, e os ADNs en matriz foron utilizados para identificar xenes cuxa expresión está modulada polo interferón. Estas matrices de xenes iniciais fixéranse colocando "puntos" con ADNc en papel de filtro cun aparato. Os primeiros informes sobre o uso de micromatrices miniaturizadas para obter perfís de expresión xénica fixéronse en 1995, e en 1997 publicouse o exame en micromatrices dun xenoma eucariota completo (de Saccharomyces cerevisiae).