Mutaxénese de transposón

A mutaxénese de transposón ou mutaxénese de transposición é un proceso biolóxico que permite a transferencia de xenes a un cromosoma dun organismo hóspede, utilizando un transposón que interrompe ou modifica a función dun xene existente no cromosoma causando unha mutación. A mutaxénese de transposón é moito máis efectiva que a mutaxénese química, ten unha maior frecuencia de mutación e unha menor probabilidade de matar o organismo. Outras vantaxes son poder inducir mutacións dun só golpe, poder incorporar marcadores seleccionables na construción dunha cepa e poder recuperar os xenes despois da mutaxénese. Entre as súas desvantaxes están a baixa frecuencia de trransposición en sistemas vivos e a inexactitude da maioría dos sistemas de transposición. Historia
A mutaxénese de transposón foi estudada primeiramente por Barbara McClintock na metade do século XX durante os seus traballos na planta do millo cos que gañou o Premio Nobel. En 1927 McClintock obtivo a súa licenciatura en botánica e empezou inmediatemente a investigar os cromosomas do millo. Na década de 1940 McClintock estaba estudando a descendencia de plants de millo autopolinizadas resultado de cruzamentos, que tiñan un cromosoma 9 roto. Estas plantas perderan os seus telómeros. Esta investigación supuxo o descubrimento dos elementos transpoñibles, e desde entón a mutaxénese de transposóns foi aproveitada como ferramenta biolóxica. Dinámica
No caso de bacterias, a mutaxénese de trasnposón realízase xeralmente por medio dun plásmido do cal se extrae un transposón que é inserido no cromosoma hóspede. Isto normalmente require un conxunto de encimas, incluíndo unha transposase, para que poida ser taducido. A transposase pode ser expresada nun plásmido separado ou no mesmo plásmido que contiña o xene que vai ser integrado. Alternativamente, unha inxección de ARNm de transposase na célula hóspede pode inducir a tradución e a expresión. Os primeiros experimentos de mutaxénese de transposón utilizaban bacteriófagos e plásmidos bacterianos conxugantes para a inserción de secuencias. Estes non eran moi específicos e facían difícil incorporar xenes específicos. Unha técnica máis nova chamada mutaxénese de lanzadeira usa xenes clonados específicos da especie hóspede para incorporar elementos xenéticos. Outra estratexia efectiva é entregar os transposóns por medio de cápsides virais. Isto facilita a integración no cromosoma e a expresión de transxenes a longo prazo.
Sistema do transposón Tn5
O sistema do transposón Tn5 é un sistema modelo para o estudo da transposición e para a aplicación da mutaxénese de transposón. O sistema Tn5 orixinal contiña xenes de resistencia a antibióticos. O Tn5 é un transposón composto bacteriano cuxos xenes están flanqueados por dúas secuencias de inserción case idénticas, chamadas IS50R e IS50L correspondentes aos lados dereito e esquerdo do transposón, respectivamente. A secuencia IS50R codifica dúas proteínas: Tnp e Inh. Estas dúas proteínas son idénticas en secuencia, excepto porque Inh carece dos 55 aminoácidos N-terminais. A Tnp codifica a transposase para todo o sistema e a Inh codifica un inhibidor da transposase. O dominio de unión ao ADN de Tnp está situado no tramo de 55 aminoácidos N-terminais e, por tanto, estes residuos son esenciais para a súa función. As secuencias IS50R e IS50L están ambas flanqueadas por elmentos de 19 pares de bases nos extremos interno e externo do trasnposón, denominados IE e OE, respectivamente. A mutación destas rexións ten como resultado a incapacidade dos xenes da transposase de unirse ás secuencias. As interaccións de unión entre a transposase e estas secuencias é moi complicada e está afectada pola metilación do ADN e outras marcas epixenéticas. Ademais, outras proteínas poden unirse e afectar a transposición dos elementos IS50, como a DnaA.
A vía máis probable da trasnposición Tn5 é a vía común para todos os sistemas de trasnposón. Empeza coa unión do Tnp e as secuencias OE e IE de cada secuencia IS50. Os dous extremos xúntanse e por medio de oligomerización do ADN, a secuencia é cortada e separada do cromosoma. Despois de introducir extremos 5' de 9 pares de bases no ADN diana, o transposón e os seus xenes incorporados son inseridos no ADN diana, duplicando as rexións en cada un dos extremos do transposón. Os xenes de interese poden ser modificados por enxeñaría xenética no sistema transposón entre as secuencias IS50. Situando o transposón baixo o control dun promotor do hóspede, os xenes poderán expresarse. Os xenes incorporados adoitan incluír, ademais do xene de interese, un marcador seleccionable para identificar os transformantes, un promotor/terminador eucariota (se se expresan nun eucariota) e secuencias 3'-UTR para separar os xenes nun tramo de secuencia policistrónica.
Sistema do transposón Sleeping Beauty
O sistema do transposón Sleeping Beauty ("Bela Durmente", SBTS) é o primeiro vector non viral eficaz para a incorporación dunha casete de xenes nun xenoma vertebrado. Ata o desenvolvemento deste sistema, os maiores problemas coa terapia xénica non viral foron a degradación intracelular do transxene debido a ser recoñecido como procariota e a entrega pouco eficaz do transxene nos sistemas orgánicos. O SBTS revolucionou estes aspectos ao combinar as vantaxes dos virus e o ADN espido. Consta dun transposón que contén a casete de xenes que se deben expresar, así como o seu propio encima transposase. Ao transpoñer a casete directamente no xenoma do organismo desde o plásmido, pode conseguirse a expresión sostida do transxene. Isto pode ser refinado aínda máis mellorando as secuencias do transposón e os encimas transposase utilizados. O SB100X é unha transposase de mamífero hiperactiva que é aproximadamente 100 veces máis eficaz que a transposase típica de primeira xeración. A incorporación deste encima na casete orixina unha expresión do transxene incluso máis sostida (de aproximadamente un ano). Ademais, as frecuencias de transxénese poden ser de ata o 45% cando se usa unha inxección pronuclear nos cigotos de rato. O mecanismo do SBTS é similar ao do sistema do transposón Tn5, pero o encima e secuencias xénicas son eucariotas en vez de procariotas. A transposase do sistema pode actuar en trans ou en cis, permitindo unha colección diversa de estruturas de transposón. O propio transposón está flanqueado por secuencias repetidas invertidas, que están ambas repetidas dúas veces de maneira directa, designadas secuencias IR/DR. A rexión interna consta do xene ou secuencia que se vai transpoñer e podería tamén conter o xene da transposase. Alternativamente, a transposase pode estar codificada nun plásmido separado ou inxectada na súa forma proteica. Outra estratexia é incorporar tanto o transposón coma os xenes da transposase nun vector viral, o cal pode ter como diana unha célula ou tecido que se elixa. A proteína transposase é extemadamente específica das secuencias ás que se une e pode discernir as súas secuencias IR/DR dunha secuencia similar por unha diferenza de só tres pares de bases. Unha vez que o encima se une a ambos os extremos do transposón, as secuencias IR/DR son xuntadas e sostidas pola transposase nunha Formación do Complexo Sináptico (SCF). A formación da SCF é un punto de control que asegura un correcto corte. A HMGB1 é unha proteína non histona do hóspede que está asociada coa cromatina eucariota. Mellora a unión preferente da transposase ás secuencias IR/DR e probablemente é esencial para a formación e estabilidade do complexo SCF. A transposase corta o ADN nos sitios diana, xerando extremos colgantes 3' que sobresaen ("adherentes"). O encima entón toma como sitios dianas para a integración os dinucleótidos TA do xenoma do hóspede. O mesmo sitio catalítico encimático que clivou o ADN é responsable de integrar o ADN no xenoma, duplicando a rexión do xenoma neste proceso. Aínda que a transposase é específica para os dinucleótidos TA, a alta frecuencia destes pares no xenoma indica que o transposón sofre unha integración bastante aleatoria. Aplicacións prácticas
Como resultado da capacidade da mutaxénese de tansposón de incorporar xenes na maioría das áreas dun determinado cromosoma, hai varias funcións asociadas que se poden estudar con este proceso. Os xenes de virulencia en virus e bacterias poden descubrirse alterando xenes e observando se hai cambios no fenotipo. Isto ten importancia na produción de antibióticos e no control de enfermidades.
Poden descubrirse xenes non esenciais inducindo mutaxénese de trasnposón nun organismo. Os xenes tnasformados poden despois identificarse realizando unha PCR no xenoma recuperado do organismo usando un cebador específico de ORF e un cebador específico de transposón. Como os trasnposóns poden incorporarse por eles mesmos a rexións non codificantes do ADN, o cebador específico de ORF asegura que o transposón interompeu un xeen. Como o organismo sobreviviu despois da integración homóloga, o xene integrado era claramente non esencial.
Os xenes causantes de cancro poden identificarse por mutaxénese de xenoma completo e o cribado de mutantes que conteñen tumores. Baseándose no mecanismo e resultados da mutación, os xenes causantes de cancro poden identificarse como oncoxenes ou xenes supresores de tumores. Exemplos específicos
Identificación da agrupación de xenes de virulencia de Mycobacterium tuberculosis
En 1999, identificáronse os xenes de virulencia asociados con Mycobacterium tuberculosis (axente da tuberculose) por knockout de xenes mediado por mutaxénese de transposón. Preparouse por enxeñaría un plásmido chamado pCG113 que contiña xenes de resistencia á kanamicina e a secuencia de inserción IS1096 para que contivese etiquetas de 80 pares de bases variables. Esta técnica chámase STM. Os plásmidos foron despois utilizados para a transformación en células de M. tuberculosis por electroporación. As colonias foron situadas en placas con kanamicina para seleccionar as células resistentes. As colonias que sufriron eventos de transposición aleatoria identificáronse por medio de dixestión con BamHI e sometidas a Southern blot usando unha sonda de ADN interna IS1096. As colonias foron cribadas para buscar multiplicación atenuada para identificar colonias con mutacións en xenes de virulencia candidatos. As mutacións que orixinaban un fenotipo atenuado foron mapados por amplificación das rexións adxacentes ás secuencias IS1096 e comparados co xenoma publicado de M. tuberculosis. Neste exemplo dun tipo de mutaxénese de transposón identificáronse 13 loci patoxénicos no xenoma de M. tuberculosis que non foran previamente asociados coa enfermidade. Isto é unha información esencial para a comprensión do ciclo de infección da bacteria.
Mutaxénese de trasnposón PiggyBac (PB) para o descubrimento de xenes do cancro
O transposón PiggyBac (PB) da eiruga do repolo Trichoplusia ni foi preparada por enxeñaría para ser moi activa en células de mamífero e pode realizar unha mutaxénese en todo o xenoma. Os transposóns conteñen tanto repeticións inversas PB coma Sleeping Beauty, para ser recoñecidas por ambas as transposases e incrementar a frecuencia de transposición. Ademais, o transposón contiña elementos promotores e amplificadores, doantes e receptores de empalme para permitir mutacións de ganancia ou perda de función dependendo da orientación do transposón e sinais de poliadenilación bidireccional. Os transposóns foron utilizados para a transformación en células de rato in vitro e foron analizados os mutantes que contiñan tumores. O mecanismo da mutación que causaba a formación do tumor determinaba se o xene era clasificado como unn oncoxene ou un xene supresor de tumores. Os oncoxenes adoitaban ser caracterizados por insercións en rexións que orixinan a sobreexpresión dun xene, mentres que os xenes supresores de tumores eran clasificados como tales baseándose en mutacións de perda de función. Como o rato é un organismo modelo para o estudo da fisioloxía e doenzas humanas, esta investigación axudará a comprender mellor os xenes que causan cancro e as posibles dianas terapéuticas.