Aptámero

Os aptámeros ou aptómeros (do latín aptus, ligado, xunto, axeitado, e do grego meros, parte) son moléculas de oligonucleótidos ou péptidos que se unen a unha molécula diana específica. Os aptámeros créanse xeralmente seleccionándoos entre un gran conxunto de secuencias aleatorias, pero tamén existen aptámeros naturais nos riboswitches. Os aptámeros poden utilizarse tanto na investigación básica coma para propósitos clínicos como fármacos macromoleculares. Os aptámeros poden combinarse con ribozimas para a autoclivaxe en presenza da súa molécula diana. Estas moléculas compostas teñen aplicacións adicionais en investigación, na industria e clínicas.
Máis especificamente, os aptámeros poden clasificarse en: Aptámeros de ADN ou ARN ou XNA. Constan de febras (normalmente curtas) de oligonucleótidos.
Aptámeros péptidos. Constan dun curto dominio peptídico variable, unido por ambos os extremos a unha proteína armazón. Aptámeros de ácidos nucleicos
Os aptámeros de ácidos nucleicos son especies de ácidos nucleicos que foron obtidas por enxeñaría por medio de repetidas roldas de selección in vitro ou, equivalentemente, por SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment, evolución sistemática de ligandos por enriquecemento exponencial) para que poidan unirse a varias dianas moleculares como poden ser pequenas moléculas, proteínas, ácidos nucleicos, e mesmo a células, tecidos e organismos. Os aptámeros son útiles en aplicacións biotecnolóxicas e terapéuticas, xa que presentan propiedades de recoñecemento molecular que rivalizan coas doutras moléculas comunmente usadas para ese propósito, como os anticorpos. Ademais do seu recoñecemento discriminado de moléculas, os aptámeros teñen vantaxes con respecto aos anticorpos, xa que poden ser producidos completamente por enxeñaría nun tubo de ensaio, créanse facilmente por síntese química, posúen propiedades de almacenamento interesantes, e orixinan pouca ou ningunha inmunoxenicidade nas aplicacións terapeuticas.
En 1990, dous laboratorios desenvolveron independentemente a técnica da selección: o laboratorio de Gold, utilizou o termo SELEX para este proceso de seleccionar ligandos de ARN contra a ADN polimerase de T4; e o laboratorio de Szostak, acuñou o termo selección in vitro para a selección de ligandos de ARN contra varias tinguiduras orgánicas. O laboratorio Szostak tamén foi o que acuñou o termo aptámero para estes ligandos baseados en ácidos nucleicos. Dous anos despois, o laboratorio de Szostak e Gilead Sciences, usaron independentemente esquemas de selección in vitro para facer evolucionar ligandos de ADN monocatenario para tinguiduras orgánicas e o coagulante humano, trombina (aptámeros antitrombina), respectivamente. Non parece haber ningunha diferenza sistemática entre os aptámeros de ARN e ADN, agás a maior estabilidade química intrínseca do ADN.
En realidade, a noción de selección in vitro foi precedida uns 20 anos antes por un experimento de Sol Spiegelman no que usou un sistema de replicación do Bacteriófago Qβ como un modo de facer evolucionar unha molécula autorreplicante. Ademais, un ano antes da publicación da selección in vitro e SELEX, Gerald Joyce usou un sistema que denominou "evolución dirixida" para alterar a actividade de clivaxe dun ribozima.
Desde o descubrimento dos aptámeros, moitos investigadores usaron a selección de aptámeros como medio para aplicacións e descubrimentos. En 2001, automatizouse o proceso de selección in vitro grazas aos traballos de J. Colin Cox no laboratorio de Ellington da Universidade de Texas en Austin, o que reducía a duración dun experimento de selección de seis semanas a tres días.
Aínda que o proceso de obter artificialmente por enxeñaría de ligandos de ácidos nucleicos é moi interesante para a bioloxía e biotecnoloxía, a existencia de aptámeros no mundo natural non foi descuberta ata 2002, cando dous grupos liderados por Ronald Breaker e Evgeny Nudler descubriron un elemento regulador xenético baseado nos ácidos nucleicos (que se denominou riboswitch) que posuía propiedades de recoñecemento molecular similares ás dos aptámeros producidos artificialmente. Ademais do descubrimento dun novo modo de regulación xenética, isto supuxo un apoio á noción da primitiva existencia dun "mundo de ARN", que é un estadio que se postula que se deu nas orixes da vida na Terra.
Tanto os aptámeros de ADN coma os de ARN mostran fortes afinidades de unión para varias dianas. Os aptámeros de ADN e ARN foran seleccionados para a mesma diana. Estas dianas eran a lisozima, a trombina, o elemento de resposta que actúa en trans do virus da inmunodeficiencia humana (HIV TAR), a hemina, o interferón γ, o factor de crecemento endotelial vascular (VEGF), o antíxeno prostático específico (PSA), a dopamina, e o oncoxene non clásico factor de shock térmico 1 (HSF1). Nos casos da lisozima, HIV TAR, VEGF e dopamina, o aptámero de ADN é o análogo do aptámero de ARN, coa diferenza de que a timina substitúe ao uracilo. Os aptameros de ADN e ARN da hemina, a trombina, e o interferón γ foron seleccionados por medio de seleccións independentes e teñen secuencias únicas. Porén, considerando que non todos os análogos de ADN dos aptámeros de ARN mostran funcionalmente unha correlación entre as secuencias do ARN e ADN e as súas estruturas e funcións, cómpre facer máis investigación sobre este asunto.
Ultimamente, introducíronse os conceptos de aptámeros intelixentes (smart aptamers) e ligandos intelixentes (smart ligands) en xeral. Describen os aptámeros que son seleccionados cun equilibrio ( K d {\displaystyle K_{d}} ), constantes de velocidade ( k o f f {\displaystyle k_{off}}, k o n {\displaystyle k_{on}} ) e parámetros termodinámicos (ΔH, ΔS) predefinidos da interacción aptámero-diana. A tecnoloxía usada para a selección dos aptámeros intelixentes é a electroforese cinética capilar. Con ela obtéñense aptámeros en poucas roldas de selección.
Desenvolvementos recentes en terapéuticas baseados en aptámeros conseguiron a aprobación pola FDA norteamericana do primeiro fármaco baseado en aptámeros para o tratamento da dexeneración macular relacionada coa idade (AMD), chamado Macugen de OSI Pharmaceuticals. Ademais, a compañía NeoVentures Biotechnology Inc. (http: //www. neoventures. ca Arquivado 07 de febreiro de 2016 en Wayback Machine. ) comercializou con éxito a primeira plataforma de diagnóstico baseada en aptámeros para a análise de micotoxinas no gran. Moitas compañías desenvolven aptámeros e aptacorpos para substituír os anticorpos na investigación, plataformas de diagnóstico, descubrimento de fármacos, e terapéutica.
Os aptámeros non modificados son eliminados rapidamente da circulación sanguínea, xa que teñen unha vida media de minutos ou horas, principalmente debido á degradación por nucleases e a filtración renal, como resultado do baixo peso molecular que caracteriza aos aptámeros. As aplicacións dos aptámeros non modificados céntranse actualmente no tratamento de condicións transitorias como a coagulación do sangue, ou o tratamento de órganos como o ollo onde a aplicación local do fármaco é posible. Esta rápida eliminación ou aclaramento do aptámero do corpo pode ser unha desvantaxe en aplicacións como a obtención de imaxes de diagnóstico in vivo. Un exemplo é un aptámero que se une á tenascina que está a ser desenvolvido por Schering AG para obter imaxes en casos de cancro. Están a disposición dos científicos varias modificacións, como as pirimidinas 2'-fluorina-substituídas, ligamento a polietilenglicol (PEG) etc. (ambas as dúas usadas no aptámero Macugen aprobado pola FDA) coas cales se incrementa a vida media no soro sanguíneo dos aptámeros facilmente a días ou mesmo semanas.
Outra aproximación para incrementar a resistencia á nuclease dos aptámeros é desenvolver Spiegelmers (nome comercial que vén do alemán Spiegel, espello), que están compostos totalmente dun esqueleto de ácido L-ribonucleico non natural. Un Spiegelmer da mesma secuencia ten as mesmas propiedades de unión do seu correspondente aptámero de ARN, coa excepción de que se une á imaxe especular da súa molécula diana.
Ademais do desenvolvemento de terapéuticas baseadas en aptameros, moitos investigadores como os do laboratorio de Ellington desenvolveron técnicas de diagnóstico para aptámeros baseadas no perfil de proteínas plasmáticas chamado proteómica do plasma de aptámeros. Esta tecnoloxía permitirá medicións de futuras proteínas multi-biomarcadoras que poden axudar na distinción diagnóstica entre estados de enfermidade e saúde.
Ademais, o laboratorio Hirao aplicou unha expansión do alfabeto xenético usando un par de bases non natural para SELEX e conseguiu a xeración de aptámeros de ADN de alta afinidade. Soamente unhas poucas bases hidrofóbicas non naturais como quinta base aumentan significativamene a afinidade do aptámero por proteínas diana.
Como recurso para todos os experimentos de selección in vitro e SELEX, o laboratorio de Ellington desenvolveu a Aptamer Database, na que se catalogan os experimentos publicados. Aptámeros péptidos
Os aptámeros péptidos son proteínas que se designan para interferir con outras interaccións entre proteìnas dentro das células. Consisten nun bucle peptídico variable unido polos seus dous extremos a un armazón proteico. Esta restrición estrutural dobre incrementa grandemente a afinidade de unión do aptámero péptido ata niveis comparables ao dun anticorpo (rango nanomolar).
A lonxitude do bucle variable é normalmente de 10 a 20 aminoácidos, e o armazón á que está unido pode ser calquera proteína que teña unhas boas propiedades de solubilidade e sexa compacta. Actualmente, a proteína bacteriana tiorredoxina-A é a proteína armazón máis utilizada, o bucle variable está inserido no sitio activo redutor, que é un bucle -Cys-Gly-Pro-Cys- da proteína natural, no cal as cadeas laterais das dúas cisteínas (Cys) poden formar unha ponte disulfuro.
A selección dun aptámero péptido pode facerse usando sistemas diferentes, pro o máis utilizado actualmente é o sistema de dobre híbrido de lévedo.
Demostrouse a selección de Aptámeros Péptidos Regulados por Ligando (LiRPAs, do inglés Ligand Regulated Peptide Aptamers). Ao despregar péptidos de 7 aminoácidos dunha nova proteína armazón baseada na estrutura da proteína trimérica FKBP-rapamicina-FRB, a interacción entre o péptido aleatorizado e a molécula diana pode ser controlada pola pequena molécula rapamicina ou por análogos non inmunosupresores.
O aptámero péptido pode tamén seleccionarse de bibliotecas de péptidos combinatorios construídos pola técnica do phage display e outras tecnoloxías similares de mostra en superficie como o mRNA display, ribosome display, bacterial display e yeast display. Estes procedementos experimentais tamén se chaman biopannings (~biocribados). Entre os péptidos obtidos por biopannings, os mimótopos poden ser considerados como un tipo de aptámeros péptidos. Todos os péptidos cribados a partir de bibliotecas de péptidos combinatorias foron almacenados nunha base de datos especial chamada MimoDB, á que se pode acceder libremente en https: //web. archive. org/web/20121116054757/http: //immunet. cn/mimodb/. Affimer
O Affimer (~afímero) é unha evolución dos aptámeros péptidos. Trátase dunha pequena proteína moi estable obtida por enxeñaría que presenta bucles peptídicos que lle proporcionan unha superficie de unión de alta afinidade (de onde vén o seu nome comercial) para unirse a proteínas diana específicas. É unha proteína de baixo peso molecular, de 12–14 kDa, derivada das cistatinas da familia do inhibidor da cisteína protease.
O armazon Affimer é unha proteína estable basedada no pregamento da proteína cistatina. Contén dous bucles peptídicos e unha secuencia N-terminal que pode ser aleatorizada para unirse a diferentes proteínas diana cunha alta afinidade e especificidade similar á dos anticorpos. A estabilización do péptido no armazón da proteína restrinxe as posibles conformacións que pode adoptar o péptido, o que incrementa a afinidade de unión e a especificidade comparada coa de bibliotecas de péptidos libres.
A tecnoloxía de Affimers desenvolveuse inicialmente na MRC Cancer Cell Unit de Cambridge e despois en dous laboratorios da Universidade de Leeds. Esta tecnoloxía foi comercializada e desenolvida por Avacta Life Sciences, que os está desenvolvendo como reactivos para a investigación e aplicacións terapéuticas. AptaBiD
A tecnoloxía AptaBiD ou Aptamer-Facilitated Biomarker Discovery (Descubrimento de Biomarcadores Facilitado por Aptámeros) é unha tecnoloxía para descubrir biomarcadores. AptaBiD está baseada na xeración en multi-roldas dun aptámero ou un conxunto de aptámeros para dianas moleculares diferenciais sobre as células, que facilita a detección expoñencial de biomarcadores. Implica tres estadios principais: (i) selección multi-roldas diferencial de aptámeros para biomarcadores de células diana; (ii) illamento baseado en aptámeros de biomarcadores das células diana; e (iii) identificación de biomarcadores por espectrometría de masas. A característica máis importante da tecnoloxía AptaBiD é que produce sondas de afinidade sintéticas (aptámeros) á vez que descobre biomarcadores. Na AptaBiD, os aptámeros desenvólvense para biomarcadores da superficie celular no seu estado e conformación nativos. Ademais de para facilitar a identificación de biomarcadores, ditos aptámeros poden usarse directamente para o illamento de células, visualización de células, e rastrear células in vivo. Poden tamén utilizarse para modular actividades de receptores celulares e a entrega no interior das células de diferentes axentes (por exemplo, ARN interferente pequeno e fármacos).