Mutaxénese insercional

En bioloxía molecular, a mutaxénese insercional ou mutaxénese de inserción é a creación de mutacións no ADN pola adición dun ou máis pares de bases. Tales mutacións insercionais poden ocorrer de forma natural por causa de virus ou transposóns ou ser producidas artificialmente en experimentos de laboratorio realizados con propósitos científicos. Mutaxénese etiquetada con sinatura
A técnica da mutaxénese etiquetada con sinatura (signature-tagged mutagenesis) utilízase para estudar a función dos xenes. Consiste en facer que un transposón, como o elemento P de Drosophila melanogaster, se integre en localizacións aleatorias do xenoma do organismo que vai ser estudado. Os mutantes xerados por este método son despois cribados buscando calquera fenotipo non usual. Se se atopa un fenotipo así, entón pode asumirse que a inserción causou que o xene relacionado co fenotipo usual quedase inactivado. Como se coñece a secuencia do transposón, o xene pode ser identificado ou ben por secuenciación de xenoma completo e busca da secuencia ou ben por medio da reacción en cadea da polimerase para amplificar especificamente ese xene. Mutaxénese insercional viral
Como moitos virus integran os seus xenomas nos xenomas das súas células hóspede para poder replicarse, a mutaxénese causada por infeccións virais é algo bastante común. Non obstante, non todos os virus que se integran no xenoma poden causar mutaxénese insercional.
Algunhas insercións no ADN non causan mutacións apreciables. En ensaios recentes de terapia xénica os vectores lentivirais utilizados para inserir ADN terapéutico non mostraron unha tendencia a alterar a función do xene ou promover un desenvolvemento oncoxénico. Debido a estes avances, agora considérase seguro usar eses vectores que se integran para a terapia xénica. Unha vantaxe é que os vectores lentivirais integran o ADN permanentemente, mentres que o efecto doutros virus que non se integran é transitorio. Para virus como os gammarretrovirus que tenden a integrar o seu ADN en localizacións xeneticamente desfavorables, a gravidade de calquera mutación producida depende enteiramente do lugar dentro do xenoma do hóspede onde se inseriu o ADN viral. Se o ADN se insire no medio dun xene esencial, os efectos sobre a célula serán drásticos. Adicionalmente, a inserción na rexión promotora dun xene pode ter igualmente efectos drásticos. Do mesmo xeito, se o ADN viral se insire nun represor, o xene correspondente ao promotor pode ser sobreexpresado, o que causa unha sobreabundancia do seu produto e unha alteración da actividade celular. Se o ADN se insire na rexión amplificadora (enhancer) do xene, o xene pode ser subexpresado, o que causa unha relativa escaseza do seu produto, o cal pode interromper a actividade da célula.
A alteración de diferentes xenes terá variados efectos sobre a célula. Non todas as mutacións afectarán significativamente a proliferación da célula. Porén, se a inserción ocorre nun xene esencial ou nun xene que intervén na división celular ou na morte celular programada, a inserción pode comprometer a viabilidade da célula ou mesmo causar que a célula se replique interminablemente, o que leva á formación dun tumor, que pode ser canceroso.
A mutaxénese insercional é posible se o virus é dos tipos autoinactivantes usados comunmente en terapia xénica ou competente para replicarse. O virus insire un xene (coñecido como oncoxene viral) normalmente preto do xene celular myc (c-myc). O xene c-myc está normalmente desactivado na célula; porén cando está activado pode pular a célula cara á fase G1 do ciclo celular e causar que a célula empece a súa replicación, causando unha proliferación non controlada mentres permite que o xene viral se replique. Despois de moitas replicacións nas que o xene viral está latente, os tumores empezan a crecer. Estes tumores derivan normalmente dunha célula mutada/transformada (orixe clonal). O virus da leucose aviaria é un exemplo de virus que causa unha doenza por mutaxénese insercional. Os polos que acaban de facer eclosión infectados co virus da leucose aviaria empezan a fomar tumores que empezan a aparecer na súa bolsa de Fabricio (de función similar á do timo humano). Esta inserción de xenes virais tamén se coñece como inserción promotora, xa que conduce á expresión do xene c-myc. Existe un exemplo de evento de mutaxénese insercional causado por un retrotransposón no xenoma humano, que causa a distrofia muscular de tipo Fukuyama. Inactivación insercional
A inactivación insercional é unha técnica usada na enxeñaría do ADN recombinante na que se utiliza un plásmido (como o pBR322) para desactivar a expresión dun xene.
É a inactivación dun xene pola inserción dun fragmento de ADN no medio da súa secuencia codificante. Calquera produto futuro procedente do xene inactivado non funcionará debido aos códigos extra que se lle engadiron. Un exemplo é o uso do plásmido pBR322, que ten xenes que respectivamente codifican polipéptidos que dan resistencia aos antibióticos ampicilina e tetraciclina. Por tanto, cando unha rexión xenética se interompe por integración do pBR322, a función xénica pérdese pero gáñase unha nova función xénica (resistencia a antibióticos específicos).
Unha estratexia alternativa para a mutaxénese insercional foi utilizada en animais vertebrados para atopar xenes que causan cancro. Neste caso un transposón, por exemplo Sleeping Beauty (Bella Dormente), úsase para interromper un xene de tal maneira que cause o máximo caos xenético. Concretamente, o transposón contén sinais para truncar a expresión dun xene interrompido no sitio da inserción e despois recomezar a expresión dun segundo xene truncado. Este método utilizouse para identificar oncoxenes.