Produción de proteínas

Este artigo trata sobre o proceso biotecnolóxico. Para a produción natural de proteínas nas células véxase: Expresión xénica, Biosíntese de proteínas e Tradución (proteínas) A produción de proteínas é o proceso biotecnolóxico de xerar proteínas específicas. Realízase normalmente manipulando a expresión xénica nun organismo de maneira que este exprese en grandes cantidades un xene recombinante. Isto inclúe a transcrición do ADN recombinante a un ARN mensaxeiro, a tradución do ARNm a cadeas de polipéptidos, que son finalmente pregadas en proteínas funcionais e poden ser destinadas a localizacións específicas subcelulares ou extracelulares.
Os sistemas de produción de proteínas (denominados nos laboratorios 'sistemas de expresión') utilízanse en bioloxía, biotecnoloxía e medicina. A investigación en bioloxía molecular usa numerosas proteínas e encimas, moitas das cales proceden de sistemas de expresión; especialmente a ADN polimerase para a PCR, transcriptase inversa para a análise de ARN, endonucleases de restrición para a clonación e para fabricar proteínas que son cribadas nos estudos de descubrimento de fármacos como dianas biolóxicas ou como fármacos potenciais en si mesmos. Existen tamén aplicacións significativas para sistemas de expresión na fermentación industrial, notablemente a produción de produtos biofarmacéuticos como a insulina humana para tratar a diabetes e para producir encimas. Sistemas de produción de proteínas
Entre os sistemas de produción de proteínas habitualmente usados están os derivados de bacterias, lévedos, baculovirus/insectos, células de mamíferos, e máis recentemente de fungos filamentosos como Myceliophthora thermophila. Cando se producen produtos biofarmacéuticos cun destes sistemas, as impurezas relacionadas co proceso, chamadas proteínas da célula hóspede tamén están entre os produtos finais en cantidades traza.
Sistemas baseados en células
Os sistemas de expresión máis antigos e máis utilizados son os baseados en células e poden ser definidos como a "combinación dun vector de expresión, o seu ADN clonado e o hóspede para o vector que proporciona un contexto que permite funcionar o xene alleo na célula hóspede, é dicir, producir proteínas a alto nivel". A sobreexpresión é unexpresión xénica a un alto nivel excesivo e anormal, que produce un pronunciado fenotipo relacionado co xene.
Hai moitos xeitos de introducir ADN alleo nunha célula para a súa expresión, e poden utilizarse moitos tipos de células hóspede; cada sistema de expresión ten diferentes vantaxes e inconvenientes. Os sistemas de expresión denomínanse normalmente pola súa célula hóspede e a fonte de ADN ou o mecanismo de entrega do material xenético. Por exemplo, son hóspedes comúns as bacterias (como Escherichia coli, Bacillus subtilis), lévedos (como Saccharomyces cerevisiae) ou liñas celulares eucariotas. Fontes de ADN comúns e mecanismos de entrega son os virus (como os baculovirus, retrovirus, adenovirus), plásmidos, ceomosomas artificiais e bacteriófagos (como o lambda). O mellor sistema de expresión para cada caso depende do xene implicado; por exemplo Saccharomyces cerevisiae é normalmente o preferido para proteínas que requiren unha modificación postraducional significativa. As liñas celulares de mamíferos ou insectos utilízanse cando cómpre facer un empalme de ARNm similar ao humano. Non obstante, a expresión bacteriana ten a vantaxe de que produce doadamente grandes cantidades de proteína, que se requiren para experimentos de cristalografía de raios X ou resonancia magnética nuclear para a determinación das súas estruturas.
Como as bacterias son procariotas, non están equipadas coa maquinaria encimática completa necesaria para realizar as modificacións postraducionais requiridas ou o pregamento molecular. Por tanto, as proteínas multidominio eucariotas expresadas en bacterias con frecuencia non son funcionais. Ademais, moitas proteínas fanse insolubles e forman corpos de inclusión que son difíciles de recuperar sen utilizar fortes desnaturalizantes que causarían un problemático re-pregamento da proteína.
Para afrontar estes problemas, desenvolvéronse sistemas de expresión que usan moitas células eucariotas para aplicacións nas que cómpre que as proteínas teñan unha conformación como a que teñen nas células eucariotas ou moi similar: as células de plantas (como o tabaco), de insectos ou mamíferos (como os bovinos) transféctanse cos xenes e cultívanse en suspensión e incluso como tecidos ou en organismos completos, para producir proteínas completamente pregadas. Os sistemas de expresión de mamíferos in vivo teñen, porén, un baixo rendemento e outras limitacións (necesitan moito tempo para funcionar, toxicidade para a célula hóspede. .. ). Para combinar un alto rendemento/produtividade e características das proteínas escalables como as de bacterias e lévedos, e as avanzadas características epixenéticas dos sistemas de plantas, insectos e mamíferos, desenvolvéronse outros sistemas de produción de proteínas que usan eucariotas unicelulares (células de 'Leishmania' non patóxena).
Sistemas bacterianos
Escherichia coli
E. coli é un dos hóspedes máis utilizados, no que se pode introducir ADN normalmente nun vector de expresión plásmido. As técnicas para a sobreexpresión en E. coli están ben desenvolvidas e funcionan incrementando a cantidade de copias do xene ou incrementando a forza de unión da rexión promotora, o que axuda á transcrición.
Por exemplo, unha secuencia de ADN para unha proteína de interese pode ser clonada ou subclonada nun alto número de copias do plásmido que contén o promotor lac, que é despois transformada na bacteria E. coli. A adición de IPTG (un análogo da lactosa) activa o promotor lac e causa que a bacteria exprese a proteína de interese.
Corynebacterium
Especies non patóxenas da bacteria grampositiva Corynebacterium utilízanse para a produción comercial de varios aminoácidos. A especie C. glutamicum é amplamente utilizada para producir glutamato e lisina, compoñentes dos alimentos de humanos e animais e produtos farmacéuticos.
A expresión do factor de crecemento epidérmico humano funcionalmente activo realizouse en C. glutamicum, demostrando así un potencial para a produción a escala industrial de proteínas humanas. As proteínas expresadas poden ser dirixidas á secreción sexa pola vía secretora xeral (Sec) ou sexa pola vía de translocación de arxininas xemelgas (Tat).
A diferenza das bacterias gramnegativas, as Corynebacterium grampositivas carecen de lipopolisacáridos que funcionen como endotoxinas antixénicas en humanos.
Pseudomonas fluorescens
As bacterias gramnegativas non patóxenas Pseudomonas fluorescens utilízanse para a produción a alto nivel de proteínas recombinantes; normalmene para o desenvolvemento de produtos bioterapéuticos e vacinas. P. fluorescens é un organismo metabolicamente versátil, permitindo cribados de alto rendemento e o desenvolvemento rápido de proteínas complexas. P. fluorescens é principalmente coñecida pola súa capacidade de producir de forma rápida e exitosa altas titulacións de proteínas solubles activas.
Sistemas eucariotas
Lévedos
Os sistemas de expresión usan S. cerevisiae ou Pichia pastoris e permiten unha produción estable e duradeira de proteínas que son procesadas de forma similar ao das células de mamíferos, a alto rendemento, en medios definidos quimicamente de proteínas.
Fungos filamentosos
En fungos filamentosos, especialmente Aspergillus e Trichoderma, e máis recentemente C1 de Myceliophthora thermophila C1 desenvolvéronse plataformas de expresión para o cribado e a produción de diversos encimas industriais. O sistema de expresión C1 mostra unha baixa morfoloxía de viscosidade en cultivos mergullados, permitindo o uso de complexos medios de crecemento e produción.
Células infectadas por baculovirus
As células de insectos infectadas (Sf9, Sf21, cepas Hi-5) ou células de mamíferos (HeLa, HEK 293) permiten a produción de proteínas de membrana ou glicosiladas que non pode ser producidas usando sistemas bacterianos e fúnxicos. É útil para a produción de proteínas en alta cantidade. Os xenes non son expresados continuamente porque as células hóspede infectadas finalmente se lisan e morren durante cada ciclo de infección.
Expresión en célula de insecto non lítica
A expresión en célula de insecto non lítica é unha alternativa ao sistema de expresión en baculovirus lítico. Na expresión non lítica, os vectores son transfectados de forma transitoria ou estable no ADN cromosómico das células de insecto para a subseguinte expresión xénica. Despois a selección e cribado de clons recombinantes. Os sistemas non líticos utilizáronse para proporcionar un rendemento de proteínas máis alto e unha expresión máis rápida dos xenes recombinantes comparados cos expresión en células infectadas por baculovirus. Entre as liñas celulares usadas por este sistema están: Sf9, Sf21 de Spodoptera frugiperda, Hi-5 da avelaíña Trichoplusia ni, e células Schneider 2 e Schneider 3 de Drosophila melanogaster. Con este sistema, as células non se lisan e poden utilizarse varios modos de cultivo. Adicionalmente, as producións de proteínas son reproducibles. Este sistema orixina un produto homoxéneo. Un inconveniente deste sistema é o requiremento dun paso de cribado adicional para seleccionar clons viables.
Excavata
Os sistemas de expresión no organismo do grupo dos Excavata Leishmania tarentolae (que non pode infectar mamíferos) permiten unha produción de proteínas estable e duradeira a alto rendemento en medios definidos quimicamente. As proteínas producidas mostran modificacións postraducionais eucariotas completas, incluíndo a glicosilación e a formación de pontes disulfuro.
Sistemas de mamíferos
Os sistemas de expresión en mamíferos máis común son as células de ovario de hámster chinés (CHO) e células de ril embrionario humano (HEK). Unha lista máis completa é: Células de ovario de hámstrer chinés.
Células linfoblastoides de mieloma de rato.
Células completamente humanas:
Células de ril embrionario humano (HEK-293).
Células retinais embrionarias humanas (Crucell's Per. C6).
Células amniocíticas humanas (Glycotope e CEVEC).
Sistemas libres de células
A produción de proteínas en sistemas libres de células realízase in vitro usando ARN polimerase purificada, ribosomas, ARNt e ribonucleótidos. Estes reactivos poden obterse por extracción das células ou de sistemas de expresión baseados en células. Debido aos baixos niveis de expresión e ao alto custo de sistemas libres de células, os sistemas baseados en células son máis amplamente usados.