Proteína fluorescente verde

A proteína fluorescente verde (GFP, do inglés Green Fluorescent Protein) é unha proteína que presenta unha brillante fluorescencia verde cando se expón á luz no espectro que vai do azul ao ultravioleta. A proteína fluorescente verde tradicional é a que primeiro se illou procedente da medusa Aequorea victoria, á que lle dá bioluminescencia, aínda que se encontran proteínas fluorescentes verdes en moitos outros organismos mariños.
En bioloxía celular e molecular, o xene GFP utilízase frecuentemente como un reporteiro da expresión xénica (a súa fluorescencia é indicativa da expresión do xene considerado). Na súa forma modificada foi utilizado para preparar biosensores, e creáronse moitos animais que expresaban a GFP como unha proba experimental de que un xene introducido pode expresarse nun organismo dado. O xene GFP pode introducirse nun organismo e manterse no seu xenoma por medio de cruzamentos, inxección por un vector viral, ou transformación celular. Ata agora, o xene GFP foi introducido e expresado en moitas bacterias, lévedos e outros fungos, peixes (como o peixe cebra), plantas, moscas, e células de mamíferos, incluídas as humanas.
A GFP de Aequorea victoria está composta por 238 residuos de aminoácidos (de 26, 9 kDa), e ten o seu maior pico de excitación á lonxitude de onda de 395 nm e outro menor a 475 nm. O seu pico de emisión é a 509 nm, o cal corresponde á porción verde baixa do espectro visible. O rendemento cuántico (QY) de fluorescencia da GFP é de 0, 79. A GFP do antozoo Renilla reniformis presenta un só pico maior de excitación a 498 nm.
O Premio Nobel de Química de 2008 outorgóuselles a Martin Chalfie, Osamu Shimomura, e Roger Y. Tsien polo seu descubrimento e desenvolvemento desta proteína fluorescente verde. Historia
GFP de tipo salvaxe (wtGFP)
Nas décadas de 1960 e 1970, Osamu Shimomura purificou a GFP e mais outra proteína luminescente distinta, a aequorina, da medusa Aequorea victoria, e estudou as súas propiedades. En A. victoria, a fluorescencia da GFP ten lugar cando a aequorina interacciona con ións Ca2+, inducindo un resplandor azul. Parte desta enerxía luminescente transfírese á GFP, e a cor cambia ao verde. A utilidade desta proteína como ferramenta de bioloxía molecular non empezou a coñecerse ata 1992 cando Douglas Prasher informou da clonación e secuencia de nucleótidos da wtGFP na revista Gene. Cando se esgotaron os orzamentos para ese proxecto de investigación, Prasher enviou mostras de ADNc a varios laboratorios. No laboratorio de Martin Chalfie fixeron que se expresase a secuencia codificante da wtGFP da que se eliminaran algúns dos aminoácidos iniciais, en células heterólogas da bactria E. coli e do nematodo C. elegans, e publicaron os resultados en Science en 1994. Independentemente, no laboratorio de Frederick Tsuji conseguiron a expresión da proteína recombinante un mes despois. A molécula da GFP pregábase e presentaba fluorescencia a temperatura moderada, sen necesidade de cofactores exóxenos específicos da medusa. Aínda que esta proteína case igual á wtGFP era fluorescente, tiña varios inconvenientes, como o espectro de excitación con dous picos, sensibilidade ao pH e ao cloruro, pobre rendemento cuántico de fluorescencia, escasa fotoestabilidade e mal pregamento a 37 °C.
A primeira estrutura cristalina obtida dunha GFP foi a do mutante S65T, traballo feito polo grupo de Remington publicado en Science en 1996. Un mes despois, independentemente, o grupo de Phillips informou da estrutura do tipo salvaxe da GFP en Nature Biotech. Estas estruturas cristalinas proporcionaron información vital sobre a formación dos cromóforos e as interaccións entre os residuos veciños. Os investigadores modificaron estes residuos por mutaxénese dirixida e aleatoria para producir a ampla variedade de derivados da GFP que se usan hoxe. Martin Chalfie, Osamu Shimomura e Roger Y. Tsien compartiron o Premio Nobel de Química de 2008 polo seu descubrimento e desenvolvemento da proteína fluorescente verde.
Derivados da GFP
Debido ao grande potencial da expansión do uso desta proteína e das necesidades cambiantes dos investigadores, houbo que producir por enxeñaría moitos mutantes distintos da GFP. O primeiro avance importante foi unha mutación nun só punto (a S65T) obtida en 1995 por Roger Tsien. Esta mutación mellorou drasticamente as características espectrais da GFP, o que deu lugar a un incremento da súa fluorescencia, fotoestabilidade, e un cambio do maior pico de excitación a 488 nm, mentres que o pico de emisión se mantivo en 509 nm. Isto correspondíase coas características espectrais dos filtros de FITC normalmente dispoñibles, o que incrementaba a utilidade práctica do uso polos investigadores. En 1995 descubriuse nos laboratorios de Thatsrup e Falkow un mutante con eficiencia de pregamento a 37 °C (F64L) para este armazón que orixina unha GFP potenciada (EGFP, enhanced GFP). A EGFP permitiu o uso práctico das GFPs en células de mamífero. A EGFP ten un coeficiente de extinción (designado ε) de 55. 000 M−1cm−1. O rendemento cuántico de fluorescencia (QY) da EGFP é de 0, 60. O brillo relativo, expresado como ε•QY, é de 33. 000 M−1cm−1.
En 2006 obtívose unha GFP con superpregamento (superfolder), cunha serie de mutacións que permiten que a GFP sufra un rápido pregamento e maduración mesmo cando se fusiona con péptidos que se pregan mal.
Realizáronse outras moitas mutacións, incluíndo mutantes da cor; en especial, os derivados proteína fluorescente azul (EBFP, EBFP2, Azurite, mKalama1), proteína fluorescente ciano (ECFP, Cerulean, CyPet), e proteína fluorescente amarela (YFP, Citrine, Venus, YPet). Os derivados BFP (excepto mKalama1) conteñen a substitución Y66H. A mutación fundamental nos derivados ciano é a substitución Y66W, que causa que o cromóforo se forme cun compoñente indol en vez de cun fenol. Requírense varias mutacións compensatorias adicionais na estrutura de baril que envolve a proteína para restaurar o brillo deste cromóforo modificado debido ao incremento de tamaño do grupo indol. A lonxitude de onda está corrida ao vermello nos derivados YFP debido á mutación T203Y, e está orixinada por interaccións de apilamento dos electróns π entre o residuo de tirosina substituído e o cromóforo. Estas dúas clases de variantes espectrais empréganse a miúdo en experimentos de transferencia de enerxía de resonancia de Förster (FRET). Os reporteiros da FRET codificados xeneticamente sensibles a moléculas de sinalización celular, como o calcio ou o glutamato, o estado de fosforilación da proteína, a complementación da proteína, a dimerización de receptor, e outros procesos proporcionan lecturas ópticas moi específicas da actividade celular en tempo real.
A mutaxénese semirracional de varios residuos orixinou mutantes sensibles ao pH chamados pHluorinas, e máis tarde pHluorinas supereclípticas. Para visualizar a actividade sináptica das neuronas aproveitando o rápido cambio de pH na fusión de vesículas sinápticas, utilizáronse as pHluorinas etiquetadas a sinaptobrevina.
As versións sensibles aos cambios redox da GFP (roGFP) obtivéronse ao introducir cisteínas na estrutura de barril beta da proteína. O estado redox das cisteínas determina as propiedades de fluorescencia da roGFP.
A nomenclatura das GFPs modificadas é con frecuencia confusa debido ao mapado solapante de varias versións da GFP cun mesmo nome. Por exemplo, mGFP pode referirse a unha GFP cunha palmitoilación N-terminal que fai que a GFP se una ás membranas celulares. Porén, o mesmo termo tamén se usa para referirse a unha GFP monomérica, que se pode obter pola mutación A206K de rotura da interface do dímero. A GFP de tipo salvaxe ten unha feble tendencia á dimerización a concentracións por riba de 5 mg/mL. A mGFP tamén significa "GFP modificada", a cal foi optimizada por intercambio de aminoácidos para a súa expresión estable en células de plantas. A GFP na natureza
O propósito da bioluminescencia e da fluorescencia da GFP nas medusas é descoñecido. A GFP coexprésase coa aequorina en pequenos gránulos arredor da beira da campá da medusa. O pico de excitación secundaria (a 480 nm) da GFP absorbe parte da emisión azul da aequorina, o que lle dá á bioluminescencia un ton máis verde. O residuo de serina 65 do cromóforo da GFP é responsable do espectro de excitación con dous picos da GFP de tipo salvaxe. Está conservado nas tres isoformas clonadas orixinalmente por Prasher. Case todas as mutacións deste residuo consolidan o espectro de excitación nun só pico a 395 nm ou a 480 nm. O mecanismo preciso desta sensibilidade é complexo, pero, parece que implica a doazón dun hidróxeno da serina 65 ao glutamato 222, o cal inflúe na ionización do cromóforo. Como unha soa mutación pode aumentar drasticamente o pico de excitación de 480 nm, facendo que a GFP sexa un compañeiro moito máis eficiente da aequorina, A Aquorea victoria parece que preferiu evolutivamente o menos eficiente espectro de excitación de dous picos. Roger Tsien especulou que a variación da presión hidrostática coa profundidade pode afectar á capacidade da serina 65 de doar un hidróxeno ao cromóforo e cambiar a proporción dos dous picos de excitación. Así, a medusa pode cambiar a cor da súa bioluminescencia coa profundidade. Desgrazadamente, un colapso na poboación de medusas en Friday Harbor, onde a GFP foi descuberta, dificultou un maior estudo do papel da GFP no ambiente natural da medusa. Outras proteínas fluorescentes
A causa da gran variedade de derivados da GFP obtidos por enxeñaría, as proteínas fluorescentes que pertencen a outras familias, como a proteína fluorescente inducible pola bilirrubina UnaG, dsRed, eqFP611, Dronpa, TagRFPs, KFP, EosFP, Dendra, IrisFP e moitas outras, denomínanse ás veces erradamente derivados da GFP. Varias destas proteínas presentan propiedades peculiares como unha emisión corrida ao vermello a 600 nm ou a fotoconversión dun estado que emite en verde a outro que emite en vermello. Estas propiedades son ata agor únicas das proteínas fluorescentes que non son derivados da GFP. Estrutura
A GFP ten unha estrutura típica en barril beta, que consta de once follas β e 6 hélices alfa que conteñen o cromóforo unido covalentemente 4-(p-hidroxibencilideno)imidazolidin-5-ona (HBI) no centro. O HBI non é fluorescente en ausencia do armazón da GFP axeitadamente pregada e está principalmente na forma fenol non ionizada na wtGFP. As cadeas laterais dirixidas cara a dentro do barril inducen reaccións de ciclación específicas no tripéptido Ser65–Tyr66–Gly67 que inducen a ionización do HBI á forma fenolato e a formación do cromóforo. Este proceso de modificación postraducional denomínase maduración. A rede de enlaces de hidróxeno e as interaccións de apilamento de electróns nestas cadeas laterais inflúen na cor, intensidade e fotoestabilidade da GFP e os seus numerosos derivados. A natureza moi empaquetada do barril exclúe as moléculas do solvente (auga), protexendo así a fluorescencia do cromóforo. Aplicacións
Microscopía de fluorescencia
A dispoñibilidade da GFP e os seus derivados redefiniu por completo a microscopía de fluorescencia e o modo en que se usa en bioloxía celular e outras disciplinas biolóxicas. Aínda que as pequenas moléculas fluorescentes como a FITC (fluoresceína isotiocianato) son moi fototóxicas cando se usan nas células vivas, as proteínas fluorescentes como a GFP son xeralmente moito menos nocivas cando iluminan ás células vivas. Isto motivou o deenvolvemento de sistemas de microscpía de fluorescencia en células vivas moi automatizados, que poden utilizarse para observar células ao longo do tempo que expresan unha ou máis proteínas etiquetadas con proteínas fluorescentes. Por exemplo, a GFP foi amplamente usada no etiquetdo de espermatozoides de varios organismos para a súa identificación, como en Drosophila melanogaster, na que a expresión da GFP pode utilizarse como marcador para unha característica particular. O GFP pode tamén expresarse en diferentes estruturas, o que permite facer unha distinción morfolóxica. En tales casos, o xene para a produción de GFP é empalmado no xenoma do organismo na rexión do ADN que codifica as proteínas diana e que está controlada pola mesma secuencia regulatoria; é dicir, a secuencia regulatoria do xene agora controla a produción de GFP, ademais da das proteínas diana. Nas células nas que se expresa o xene, e se producen as proteínas etiquetadas, prodúcese ao mesmo tempo a GFP. Así, só mostrarán fluorescencia ao seren observadas cun microscopio de fluorescencia as células nas cales se expresa o xene etiquetado ou se producen as proteínas diana. A posibilidade de analizar películas durante ese lapso de tempo redefiniu a comprensión de moitos procesos biolóxicos como o pregamento de proteínas, transporte de proteínas, e a dinámica do ARN, que no pasado foran estudadas utilizando material fixado e, por tanto, morto. Os datos obtidos úsanse tamén para calibrar modelos matemáticos de sistemas intracelulares e estimar o grao de expresión xénica.
O microscopio Vertico SMI, que usa a tecnoloxía SPDM Phymod utiliza o denominado efecto de "fotoblanqueado reversible" das tinguiduras fluorescentes como a GFP e os seus derivados para localizalos como moléculas individuais cunha resolución óptica de 10 nm. Isto pode tamén realizarse como unha colocalización de dous derivados da GFP (2CLM).
Outro potente uso da GFP é expresar a proteína en pequenos conxuntos de células específicos. Isto permite aos investigadores detectar opticamente tipos específicos de células in vitro ou mesmo in vivo. Un truco útil para a análise da circuitería cerebral (brainbow) é combinar xeneticamente varias variantes espectrais da GFP. Outros usos interesantes das proteínas fluorescentes que aparecen na literatura son o seu uso como sensores do potencial de membrana de neuronas, rastreo de receptores AMPA nas membranas celulares, da entrada de virus e infección de virus da influenza e lentivirus, etc.
Tamén se encontrou que as novas liñas de ratos GFP transxénicos poden ser relevantes para o estudo da terapia xénica e medicina rexenerativa. Usando unha GFP "de alta expresión", os ratos transxénicos mostran unha alta expresión na maioría dos tecidos, e moitas células que non foron caracterizadas ou foron mal caracterizadas en ratos transxénicos GFP previos. Grazas á súa capacidade de formar cromóforos internos sen necesidade de cofactores accesorios, nin encimas ou substratos distintos do oxíxeno molecular, a GFP constitúe unha excelente ferramenta en bioloxía.
A GFP é útil en criobioloxía como un ensaio de viabilidade. A correlación da viabilidade medida con ensaios de azul tripán foi 0, 97.
Un novo posible uso da GFP é usala como un monitor sensible dos procesos intracelulares por medio dun sistema eGFP láser creado a partir dunha liña celular de ril embrionario humano. O primeiro láser vivo obtido por enxeñaría está feito de células que expresan eGFP situadas dentro dunha cavidade óptica reflectiva que é golpeada con pulsos de luz azul. A un certo limair de pulsos, o sinal óptico de saída da eGFP faise máis brillante e completamente uniforme en cor, que é verde puro cunha lonxitude de onda de 516 nm. Antes de ser emitida como luz láser, a luz rebota adiante e atrás dentro da cavidade resonante e atravesa a célula numerosas veces. Estudando os cambios na actividade óptica, os investigadores poden comprender mellor os procesos celulares.
Mascotas transxénicas
Os coellos Alba son uns coellos fluorescentes creados por un laboratorio francés utilizando a GFP cun obxectivo artístico e de comentario social. A compañía estadounidense Yorktown Technologies comercializa o peixe cebra fluorescente GloFish para acuarios, que foron desenvolvidos inicialmente para detectar a polución en vías navegables. A compañía estadounidense NeonPets comercializou un rato fluorescente como mascota co nome NeonMice. Os porcos fluorescentes verdes, chamados Noels, foron obtidos na Universidade Nacional de Taiwán. Un equipo nipón-norteamericano creou os gatos fluorescentes verdes para probalos como potenciais organismos modelo para o estudo de enfermidades, especialmente o VIH/SIDA.