Electroforese capilar

A electroforese capilar (EC ou, en inglés, CE) é unha familia de métodos de separación electrocinéticos que se realizan en capilares submilimétricos e en canais micro e nanofluídicos. Moi a miúdo a electroforese capilar refírese á electroforese en zona capilar (EZC ou CZE), pero outras técnicas electroforéticas pertencen tamén a esta clase de métodos, como son a electroforese en xel capilar (EXC ou CGE), o isoelectroenfoque capilar (IEEC ou CIEF), a isotacoforese capilar e a cromatografía electrocinética micelar (CECM ou MEKC). Nos diversos métodos de electroforese capilar, os analitos migran a través de solucións de electrólitos baixo a influencia dun campo eléctrico. Os analitos poden ser separados segundo a súa mobilidade iónica, e adicionalmente poden ser concentrados por medio de gradientes de condutividade e pH. Instrumentación
A instrumentación necesaria para levar a cabo unha electroforese capilar é relativamente simple. Un sistema básico esquemático de electroforese capilar é o que se mostra na figura 1. Os principais compoñentes do sistema son un vial de mostras, outros viais que funcionan como viais fonte e viais de destino, capilares, eléctrodos, unha fonte eléctrica de alta voltaxe, un detector, e un dispositivo para manexar os datos obtidos. O vial fonte, o de destino e o capilar énchense cun electrólito como é unha solución tampón acuosa. Para introducir a mostra, o extremo de entrada do capilar sitúase nun vial que contén a mostra. A mostra introdúcese no capilar por acción capilar, presión, extracción con sifón, ou electrocineticamente, e o capilar devóvlese despois ao vial fonte. A migración dos analitos iníciase ao aplicar un campo eléctrico entre os viais fonte e de destino que chega aos eléctrodos desde o cable de alta voltaxe. No modo máis común de electroforese capilar todos os ións, positivos ou negativos, son pulados a través do capilar na mesma dirección por fluxo electrosmótico, como se explicará máis adiante. Os analitos sepáranse a medida que migran debido á súa mobilidade electroforética e son detectados preto do extremo de saída do capilar. A saída de datos do detector envíase a un aparello que manexa os datos, como un integrador ou un computador. Os datos móstranse despois nun electroferograma, que informa da resposta do detector en función do tempo. Os compostos químicos que se separaron na electroforese aparecen no electroferograma como picos con diferentes tempos de retención nun electroferograma. Richard D. Smith e colaboradores foron os primeiros que combinaron a electroforese capilar coa espectrometría de masas, o que proporciona unha sensibilidade extremadamente grande para a análise de tamaños de mostra moi pequenas. Malia o pequeno tamaño das mostras (xeralmente só se introducen no capilar uns poucos nanolitros de líquido), conséguese unha alta sensibilidade e picos nítidos, en parte debido ás estratexias de inxección que dan lugar a unha concentración de analitos nunha zona estreita preto do extremo de entrada do capilar. Isto pode conseguirse nas inxeccións a presión ou nas electrocinéticas simplemente ao suspender a mostra nun tampón de condutividade menor (por exemplo, con concentracións salinas baixas) que a do tampón que se corre. Un proceso chamado amontoamento de mostra amplificada de campo (field-amplified sample stacking, que é unha forma de isotacoforese) orixina unha concentración do analito nunha zona estreita na fronteira entre a mostra de baixa condutividade e o tampón que se corre de maior condutividade. Para conseguir un maior rendemento da mostra, úsanse instrumentos con matrices (arrays) de capilares cos que se analizan moitas mostras simultaneamente. Estes instrumentos de electroforese con matrices de capilares (CAE) con de 16 a 96 capilares utilízanse para a secuenciación de ADN capilar de alto ou medio rendemento, e os extremos de entrada dos capilartes dispóñense espacialmente para recibiren as mostras directamente desde unha placas de 96 pozos de dimensións SBS estándar. Certos aspectos da instrumentación (como a detección) son necesariamente máis complexos que no sistema dun só capilar, mais os principios fundamentais do deseño e funcionamento son similares aos que se mostraron na figura 1. Detección
A separación por electroforese capilar pode detectarse por medio de diversos dispositivos. A maioría dos sistemas comerciais usan absorbancia UV ou UV-Vis como modo principal de detección. Nestes sistemas, utilízase unha sección do propio capilar como célula de detección. O uso dunha detección no propio tubo permite a detección de analitos separados sen perda de resolución. En xeral, os capilares usados na electroforese capilar están cubertos cun polímero (frecuentemente poliimida ou Teflon) para incrementar a flexibilidade. porén, a porción do capilar utilizado para a detección de luz UV debe ser opticamente transparente. Nos capilares cubertos de poliimida, un segmento do recubrimento é xeralmente quiemado ou retirado por raspado para proporcionar unha fiestra libre de cobertura de varios milímetros de longo. Esta sección espida do capilar pode romper facilmente, e existen capilares con recubrimentos transparentes que incrementan a estabilidade da fiestra da célula. A lonxitude do camiño percorrido (path length) da célula de detección na electroforese capilar (~ 50 micrómetros) é moito menor que na célula UV tradicional (~ 1 cm). Esta "lonxitude do camiño" (path enght) defínese como a distancia á que a luz (UV/VIS) viaxa ao atravesar unha mostra nunha célula analítica. Segundo a lei de Beer-Lambert, a sensibilidade do detector é proporcional á lonxitude do camiño óptico da célula. Para mellorar a sensibilidade, pode incrementarse esta lonxitude, aínda que isto ten como resultado unha perda de resolución. O propio tubo do capilar pode expandirse no punto de detección, creando unha "célula burbulla" cunha maior lonxitude do camiño ou poden engadirse tramos de tubo adicionais no punto de detección como se mostra na figura 2. Con todo, ambos os métodos fan decrecer a resolución da separación. Tamén se describiu unha detección post-columna que utiliza unha configuración de fluxo laminar. A detección por fluorescencia pode usarse tamén na electroforese capilar para mostras que fluorescen de forma natural ou son modificadas quimicamente para conter etiquetas fluorescentes. Este modo de detección ofrece unha alta sensibilidade e mellora a selectividade para estas mostras, pero non pode utilizarse para mostras que non presenten fluorescencia. Úsanse numerosas estratexias de etiquetado para crear derivados fluorescentes ou conxugados de moléculas non fluorescentes, incluíndo proteínas e ADN. A configuración para a detección por fluorescencia pode ser complicada nun sistema de electroforese capilar. O método require que o raio de luz estea enfocado no capilar, o cal pode ser difícil de facer con moitas fontes de luz. Utilizouse a fluorescencia inducida por láser en sistemas de electroforese capilar con límites de detección moi baixos de 10−18 a 10−21 mol. A sensibilidade da técnica atribúese á alta intensidade da luz incidente e á capacidade de enfocar axeitadamente a luz no capilar. A detección por fluorescencia multicolor pode conseguirse ao incluír espellos dicroicos múltiples e filtros de paso de banda para separar a emisión de fluorescencia entre múltiples detectores (por exemplo, tubos fotomultiplicadores), ou utilizando un prisma ou retícula para proxectar a emisión de fluorescencia resolta espectralmente sobre un detector sensible á posición, como unha matriz CCD. Os sistemas de electroforese capilar con sistemas de detección LIF de 4 ou 5 cores son os que se usan normalmente para a secuenciación do ADN capilar e as aplicacións de xenotipado ("perfil de ADN").
Para obter a identidade dos compoñentes dunha mostra, a electroforese capilar pode acoplarse directamente con espectrofotómetros de masas ou Espectroscopia Raman Amplificada na Superficie (SERS, Surface Enhanced Raman Spectroscopy). Na maioría dos sistemas, o extremo de saída do capilar introdúcese nunha fonte de ións que utiliza ionización de electrospray (ESI). Os ións resultantes son despois analizados polo espectrómetro de masas. Esta configuración require solucións tampón volátiles, que afectarán ao rango dos modos de separación que se poden empregar e ao grao de resolución que se pode conseguir.
A medida e a análise fanse principalmente cun software de análise en xel especializado.
Para a electroforese capilar SERS, os eluentes poden depositarse nun substrato activo para SERS. Os tempos de retención do analito poden ser traducidos en distancias espaciais movendo o substrato activo para SERS a unha velocidade constante durante a electroforese capilar. Isto permite que a subseguinte técnica espectroscópica se aplique a eluentes específicos para a identificación con alta sensibilidade. Poden escollerse substratos activos para SERS que non interfiran co espectro dos analitos. Modos de separación
A separación de compostos por electroforese capilar depende da migración diferencial dos analitos no campo eléctrico aplicado. A velocidade de migración electroforética ( u p {\displaystyle u_{p}} ) dun analito cara ao eléctrodo de carga oposta é: u p
μ p E {\displaystyle u_{p}
\mu _{p}E\, } A mobilidade electroforética pode determinarse experimentalmente a partir do tempo de migración e da forza do campo: μ p
( L t r ) ( L t V ) {\displaystyle \mu _{p}
\left({\frac {L}{t_{r}}}\right)\left({\frac {L_{t}}{V}}\right)} onde L {\displaystyle L} é a distancia desde o extremo de entrada do capilar ao punto de detección, t r {\displaystyle t_{r}} é o tempo requirido polo analito para chegar ao punto de detección (tempo de migración), V {\displaystyle V} é a voltaxe aplicada (forza do campo), e L t {\displaystyle L_{t}} é a lonxitude total do capilar. Como só as partículas cargadas (ións) son afectadas polo campo eléctrico, os analitos neutros sepáranse mal na electrrofrese capilar.
A velocidade de migración dun analito na electroforese capilar depende tamén da velocidade do fluxo electroosmótico (FEO ou EOF) da solución tampón. Nun sistema típico, o fluxo electroosmótico é dirixido cara ao cátodo (cargado negativamente), para que o tampón flúa a través do capilar desde o vial fonte ao vial de destino. Os analitos, ao írense separando polas súas diferentes mobilidades electroforéticas, migran cara ao eléctrodo de carga oposta. Como resultado, os analitos cargados negativamente son atraídos ao ánodo cargado positivamente, en contra do fluxo electroosmótico, mentres que os analitos cargados positivamente son atraídos ao cátodo, de acordo co fluxo electroosmótico que se mostra na figura 3. A velocidade do fluxo electroosmótico, u o {\displaystyle u_{o}} pode expresarse como: u o
μ o E {\displaystyle u_{o}
\mu _{o}E} onde μ o {\displaystyle \mu _{o}} é a mobilidade electroosmótica, a cal se define como: μ o
ϵ ζ η {\displaystyle \mu _{o}
{\frac {\epsilon \zeta }{\eta }}} onde ζ {\displaystyle \zeta } é o potencial zeta da parede capilar, e ϵ {\displaystyle \epsilon } é a permitividade relativa da solución tampón. Experimentalmente, a mobilidade electrosmótica pde determinarse medindo o tempo de retención dun analito neutro. A velocidade ( u {\displaystyle u} ) dun analito situado nun campo eléctrico pode ser definida así: u p + u o
( μ p + μ o ) E {\displaystyle u_{p}+u_{o}
(\mu _{p}+\mu _{o})E} Dado que o fluxo electroosmótico da solución tampón é xeralmente máis grande que o da mobilidade electroforética dos analitos, todos os analitos son transportados xunto coa solución tampón cara ao cátodo. Mesmo os anións con carga tripla pequenos poden ser redirixidos ao cátodo polo relativamente poderoso fluxo electroosmótico da solución tampón. Os analitos cargados negativamente son retidos durante máis tempo no capilar debido ás súas mobilidade electroforéticas en conflito. A orde de migración observada polo detector móstrase na figura 3: os catións de carga múltiple pequenos migran rapidamente e os anións con carga múltiple pequenos son retidos máis fortemente.
O fluxo electroosmótico obsérvase cando se aplica un campo eléctrico a unha solución nun capilar que ten cargas fixadas na súa parede interior. A carga acumúlase na superficie interior dun capilar cando se sitúa unha solución tampón dentro do capilar. Nun capilar de sílice fundida, os grupos silanol (Si-OH) unidos á parede interna do capilar están ionizados formando grupos cargados negativamente silanoato (Si-O−) a valores de pH maiores de 3. A ionización da parede capilar pode ser mellorada facendo primeiro correr unha primeira solución básica, como de NaOH ou KOH a través do capilar antes de introducir a solución tampón. Os catións da solución tampón, ao seren atraídos polos grupos silanoatos cargados negativamente, formarán dúas capas internas de catións (chamadas capa dobre difusa ou capa dobre eléctrica) sobre a parede capilar como se mostra na figura 4. A primeira capa denomínase capa fixada porque está firmemente unida aos grupo silanoato. A outra capa, chamada capa móbil, está máis lonxe dos grupos silanoato. Cando se aplica o campo eléctrico a capa de catións móbil é pulada en dirección ao cátodo cargado negativamente. Como estes catións están solvatados, a masa de solución tampón migra coa capa móbil, causando o fluxo electroosmótico da solución tampón. Outros capilares como poden ser os capilares de Teflon tamén presentan fluxo electroosmótico. O fluxo electroosmótico destes capilares é probablemente o resultado da adsorción de ións do tampón nas paredes do capilar. A velocidade de fluxo electroosmótico é dependente da forza do campo e da densidade de carga da parede do capilar. A densidade de carga da parede é proporcional ao pH da solución tampón. O fluxo electroosmótico increméntase co pH ata que todos os grupos silanol dispoñibles que tapizan a parede do capilar están completamente ionizados. En certas situacións nas que non é desexable un fluxo electroosmótico forte cara ao cátodo, a superficie interna do capilar pode recubrirse con polímeros, surfactantes, ou pequenas moléculas para reducir a electroosmose a niveis moi baixos, recuperando a dirección normal de migración (anións cara ao ánodo, e catións cara ao cátodo). A instrumentación para a electroforese capilar xeralmente inclúe fontes de electricidade con polaridade reversible, que permiten que un mesmo instrumento se use en modo "normal" (con fluxo electroosmótico e detección preto do extremo catódico do capilar) e en modo "inverso" (co fluxo electroosmótico suprimido ou invertido, e detección preto do extremo anódico do capilar). Unha das aproximacións máis comúns para suprimir o fluxo electroosmótico, como publicou Stellan Hjertén en 1985, é crear unha capa unida covalentemente de poliacrilamida linear. A superficie da sílice do capilar é modificada primeiro cun reactivo silano que leva un grupo vinilo polimerizable (por exemplo, o 3-metacriloxipropiltrimetoxisilano), seguido da introdución dun monómero de acrilamida e un iniciador radical libre. A acrilamida polimerízase in situ, formando cadeas lineares longas, algunhas das cales están unidas covalentemente ao reactivo silano unido á parede. Hai outras varias estratexias para a modificación covalente das superficies do capilar. Son tamén comúns os recubrimentos adsorbidos ou dinámicos, que poden incluír polímeros ou pequenas moléculas. Por exemplo, na secuenciación do ADN capilar, o polímero de criba (tipicamente polidimetilacrilamida) suprime o fluxo electrosmótico a niveis moi baixos. Disponse comercialmente de varios axentes de recubrimento de capilares dinámicos para modificar, suprimir, ou inverter a dirección do fluxo electroosmótico. Ademais de modular o fluxo electroosmótico, os recubrimentos da parede capilar poden tamén servir para reducir as interaccións entre os analitos "pegañentos" (como as proteínas) e a parede do capilar. Estas interaccións parede-analito, se son importantes, maniféstanse como unha redución no pico de eficiencia, picos asimétricos, ou mesmo a perda total do analito na parede do capilar. Eficiencia e resolución
o número de placas teóricas, ou eficiencia de separación, na electroforese capilar vén dado por: N
μ V 2 D m {\displaystyle N
{\frac {\mu V}{2D_{m}}}} onde N {\displaystyle N} é o número de (bandas) placas teóricas, μ {\displaystyle \mu } é a mobilidade aparente no medio de separación e D m {\displaystyle D_{m}} é o coeficiente de difusión do analito. De acodo con esta ecuación, a eficiencia de separación está só limitada pola difusión e é proporcional á forza do campo eléctrico, aínda que as consideracións prácticas limitan a forza do campo eléctrico a uns poucs centos de voltios por centímetro. A aplicación de potenciais moi altos (>20-30 kV) pode causar o arqueo ou rotura do capilar. Ademais, a aplicación de campos eléctricos fortes causa un quentamento por resistencia (quentamento de Joule) do tampón no capilar. En campos con forza o suficientemente alta, este quentamento é forte dabondo como para que se poidan desenvolver dentro do capilar gradientes de temperatura radiais. Como a mobilidade electroforética dos ións é xeralmente dependente da temperatura (debido tanto á ionización dependente de temperatura coma para os efectos de viscosidade do solvente), un perfil de temperatura non uniforme orixina unha variación da mobilidade electroforética a través do capilar, e unha perda de resolución. O inicio dun quentamento de Joule significativo pode determinarse construíndo un "gráfico da lei de Ohm", no cal se mide a corrente que atravesa o capilar en función do potencial aplicado. En campos baixos, a corrente é proporcional ao potencial aplicado (lei de Ohm), mentres que en campos máis altos a corrente desvíase da liña recta a medida que o quentamento orixina un decrecemento da resistencia do tampón. A mellor resulción obtense normalmente coa forza de campo máxima, na cal o quentamento de Joule é insignificante (é dicir, preto do límite entre os réximes linear e non liner do gráfico da lei de Ohm). Xeralmente, os capilares de diámetro interno máis pequeno soportan o uso de forzas de campo maiores, debido a unha mellora da disipación da calor e gradientes térmicos menores, en comparación cos capilares máis grandes, pero cos inconvenientes de ter unha menor sensibilidade na detección da absorbancia debido á menor lonxitude de camiño (path length), e unha maior dificultade para introducir o tampón e a mostra no capilar (os capilares pequenos requiren unha maior presión e/ou tempos máis longos para forzar o movemento dos fluídos a través do capilar).
A eficiencia das separacións por electroforese capilar é xeralmente moito maior que a que presentan outras técnicas de separación como a HPLC. A diferenza da HPLC, na electroforese capilar non hai transferencia de materia entre fases. Ademais, o perfil de fluxo en sistemas impulsados pola forza electroosmótica é plano, en vez do perfil de fluxo laminar arredondado característico dos fluxos impulsados por presión en columnas de cromatografía como se mostra na figura 5. Como resultado, a forza electroosmótica non contribúe significativamente a ampliar a banda como na cromatografía impulsada por presión. As separacións de electroforese capilar poden ter varios centos de miles de placas teóricas. A resolución ( R s {\displaystyle R_{s}} ) das separacións de electroforese capilar pode escribirse así: R s
14 ( △ μ p N μ p + μ o ) {\displaystyle R_{s}
{\frac {1}{4}}\left({\frac {\triangle \mu _{p}{\sqrt {N}}}{\mu _{p}+\mu _{o}}}\right)} Segundo esta ecuación, atínxese o máximo de resolución cando as mobilidades electroosmótica e electroforética son similares en magnitude e opostas en signo. Ademais, pode verse que a alta resolución require unha baixa velocidade e, en correspondencia, un aumento do tempo de análise.
Ademais da difusión e do quentamento de Joule (discutidos antes), outros factores que poden facer diminuír a resolución na electroforese capilar a partir dos límites teóricos na ecuación anterior son, entre outros, as larguras finitas da toma de inxección e a fiestra de detección; as interaccións entre o analito e a parede capilar; condicións non ideais do instrumental como unha lixeira diferenza en altura dos depósitos de fluído que orixinan un efecto sifón; irregularidades no campo eléctrico debidos a, por exemplo, cortes imperfectos dos extemos do capilar; depleción da capacidade de tamponamento nos depósitos; e electrodispersión (cando un analito ten unha maior condutividade que o electrólito de fondo). A identificación e minimización de numerosas fontes de ampliación de bandas é esencial para a realización con éxito dunha electroforese capilar, co obxectivo de aproximarse o máximo posible á resolución limitada pola difusión ideal.