Polimorfismo de lonxitude de fragmento de restrición

En bioloxía molecular, o polimorfismo de lonxitude de fragmento de restrición ou RFLP (Restriction fragment length polymorphism) é unha técnica de análise de ADN baseada nas variacións nas secuencias de ADNs homólogos. Na análise de RFLP as mostras de ADN son cortadas en segmentos (dixeridas) por encimas de restrición, que orixinan fragmentos de restrición, os cales son separados segundo a súa lonxitude por electroforese en xel. O termo RFPL pode referirse ás propias diferenzas (polimorfismos) entre mostras de moléculas de ADN homólogo debidas ás diferentes localizacións dos sitios de restrición (onde cortan os encimas de restrición), ou pode referirse á técnica de laboratorio que detecta os distintos segmentos de ADN orixinados por dito corte. Aínda que actualmente quedou un pouco obsoleta debido á aparición de tecnoloxías de secuenciación do ADN baratas, a análise de RFLP foi a primeira técnica usada para obter o perfil de ADN o suficientemente barata como para ter unha aplicación moi estendida. Ademais de para a pegada xenética, a RFLP foi unha importante ferramenta no mapado do xenoma, localización de xenes implicados en trastornos xenéticos, determinación do risco xenético de ter unha doenza, e en probas de paternidade. Técnica de análise
A técnica básica para detectar RFLPs implica fragmentar a mostra de ADN con encimas de restrición, os cales recoñecen unha secuencia curta específica no ADN (sitio de restrición) e cortan en todos os puntos do xenoma onde se encontre esa secuencia, orixinando moitos fragmentos de ADN. Os fragmentos de ADN resultantes son despois separados segundo a súa lonxitude por medio de electroforese en xel de agarosa, e transferidos a unha membrana polo procedemento Southern blot. A hibridación do ADN da membrana cunha sonda de ADN determina despois a lonxitude dos fragmentos que son complementarios coa sonda. Aparece un RFLP cando a lonxitude dun fragmento detectado varía entre individuos. Cada lonxitude dun fragmento é considerada un alelo, e pode utilizarse en análises xenéticas.
A análise de RFLP pode subdividirse en análises con sondas dun só locus (SLP, single-locus probe) e de multi-locus (MLP, multi-locus probe). Ademais, poden obterse datos mesmo con ADNs degradados (por exemplo, cando a mostra se toma de restos óseos).
Exemplos
Hai dous mecanismos comúns polos cales pode variar o tamaño dun fragmento de restrición determinado. No primeiro esquema, un pequeno segmento do xenoma é detectado por unha sonda (liña máis grosa). No alelo "A", o xenoma é clivado por un encima de restrición en tres sitios próximos (os triángulos do esquema), pero só o fragmento máis á dereita será detectado pola sonda. No alelo "a", perdeuse o sitio de restrición 2 por causa dunha mutación, polo que a sonda agora detecta o fragmento fusionado máis grande que vai dos sitios 1 ao 3.
O segundo diagrama mostra como se vería esta variación do tamaño do fragmento nunha Southern blot, e como podería herdarse cada alelo (dous por cada individuo) en distintos membros dunha familia.
No terceiro esquema, elíxense unha sonda e un encima de restrición para detectar unha rexión do xenoma que inclúe un segmento variable VNTR (caixas). No alelo "c" hai cinco repeticións na VNTR, e a sonda detecta un fragmento maior entre os dous sitios de restrición. No alelo "d" hai só dúas repeticións na VNTR, así que a sonda detecta un fragmento máis curto entre os mesmos dous sitios de restrición. Outros procesos xenéticos, como as insercións, delecións, translocacións, e inversións, poden tamén orixinar RFLPs. Aplicacións
A análise da variación de RFLP nos xenomas foi unha ferramenta fundamental no mapado do xenoma e na análise de doenzas xenéticas. Cando os investigadores querían determinar inicialmente a localización cromosómica dunha enfermidade xenética particular, analizan o ADN de membros dunha familia afectados pola doenza, e procuran alelos RFLP que mostren un patron de herdanza similar ao da doenza (ver ligamento xenético). Unha vez que foi localizado o xene dunha doenza, a análise RFLP doutras familias podería revelar quen está en risco de ter a doenza, ou quen é un probable portador dos xenes mutantes.
A análise de RFLP foi tamén a base dos primeiros métodos de análise da pegada xenética, útil na identificación de mostras recollidas en escenas de crimes, na determinación da paternidade, e na caracterización da diversidade xenética ou patróns de cruzamento en poboacións animais. Alternativas
A técnica de análise de RFLP é lenta e incómoda. Require unha gran cantidade de mostra de ADN (máis que para a análise de STR), e o proceso combinado de etiquetado de sondas, fragmentación de ADN, electroforese, blotting, hibridación, lavado e autorradiografía pode levar un mes enteiro. En 1985 apareceu unha versión limitada do método do RFLP que usaba sondas de oligonucleótidos. Afortunadamente, os resultados do Proxecto Xenoma Humano substituíron en grande medida a necesidade do mapado por RFLP, e a identificación de moitos polimorfismos dun só nucleótido (SNPs) nese proxecto (xunto coa identificación directa de moitos xenes e mutacións de doenzas) evitaron a necesidade da análise de ligamento de doenzas de RFLP (ver xenotipificación SNP). A análise de alelos VNTR continúa facéndose, pero hoxe faise xeralmente con métodos baseados na reacción en cadea da polimerase (PCR).
A RFLP é aínda unha técnica utilizada en selección asistida por marcador. O polimorfismo de lonxitude de fragmento de restrición terminal (TRFLP ou T-RFLP) é unha técnica de bioloxía molecular desenvolvida inicialmente para caracterizar comunidades bacerianas en mostras de especies mesturadas. A técnica tamén se aplicou a outros grupos como aos fungos do solo.
A TRFLP funciona por medio de amplificación por PCR do ADN utilizando pares de cebadores que foron marcados con etiquetas fluorescentes. Os produtos da PCR son despois dixeridos usando encimas de RFLP e os patróns resultandes son visualizados utilizando un secuenciador de ADN. Os resultados son analizados por contaxe simple e comparando bandas ou picos nos perfís de TRFLP, ou polas bandas que presentan correspondencia entre unha ou máis execucións de TRFLP e unha base de datos de especies coñecidas. A técnica é similar nalgúns aspectos á electroforese en xel en gradiente desnaturalizante ou de temperatura (DGGE ou TGGE).
Os cambios de secuencia directamente implicados nunha RFLP poden tamén analizarse máis rapidamente por PCR. A amplificación pode ser dirixida a través do sitio de restrición alterado, e os produtos dixeridos con encimas de restrición. Este método denomínase Secuencia polimórfica amplificada clivada (CAPS). Alternativamente, o segmento amplificado pode analizarse por sondas de oligonucleótido específico de alelo (ASO), un proceso que xeralmente pode facerse por un simple Dot blot.