Perfil ribosómico

O perfil ribosómico (ou perfilado ribosómico, ribosome profiling), tamén chamado Ribo-Seq ou pegada ribosómica (ribosome footprinting), é unha adaptación dunha técnica desenvolvida por Joan Steitz e Marilyn Kozak hai case 50 anos, que Nicholas Ingolia e Jonathan Weissman adaptaron para traballar cos métodos de secuenciación da seguinte xeración, que usa a secuenciación de ARNms especializados para determinar cales ARNms están sendo activamente traducidos. Unha técnica relacionada que tamén se pode usar para determinar qué ARNms están sendo activamente traducidos é a metodoloxía TRAP (Translating Ribosome Affinity Purification, Purificación de Afinidade de Ribosomas en Tradución), que desenvolveu Nathaniel Heintz na Universidade Rockefeller (en colaboración con Paul Greengard e Myriam Heiman). A TRAP non supón facer unha pegada ribosómica, mais proporciona información específica de tipo celular. Descrición
Produce unha “instantánea global” de todos os ribosomas que están traducindo proteínas activamente nunha célula nun momento dado, coñecida como tradutoma. En consecuencia, isto permite identificar a localización de sitios de comezo da tradución, o complemento de marcos de lectura abertos (ORFs) traducidos nunha célula ou tecido, a distribución de ribosomas nun ARN mensaxeiro, e a velocidade de tradución nos ribosomas. O perfil ribosómico ten como dianas soamente as secuencias de ARNm protexidas polo ribosoma durante o proceso de decodificación da tradución, a diferenza da RNA-Seq, a cal secuencia todos os ARNm dunha secuencia dada presente nunha mostra. Esta técnica é algo diferente do perfil de polisomas. Historia
O perfil ribosómico está baseado no descubrimento de que o ARNm unido a un ribosoma pode illarse usando nucleases que degradan as rexións non protexidas do ARNm. Esta técnica analiza as rexións do ARNm que están sendo traducidas a proteínas, así como os niveis de tradución de cada rexión para proporcionar unha visión da expresión xénica global. Antes do seu desenvolvemento, os esforzos para medir a tradución in vivo incluído a análise de micromatrices (microarrays) no ARN illado de polisomas, así como un perfil traducional pola purificación de afinidade de ribosomas etiquetados por epítopo. Estes son métodos útiles e complementarios, pero ningún permite a sensibilidade e información posicional proporciondas polo perfil ribosómico. Usos
Hai tres usos principais do perfil ribosómico: identificar rexións traducidas de ARNms, observar como se produce o pregamento dos péptidos nacentes e medir a cantidade de proteínas específicas que se sintetizan.
Identificación de rexións de ARNms traducidas
Usando compostos químicos específicos, o perfil ribosómico pode identificar rexións do ARNm, rexións alongadas e áreas nas que a tradución está detida. As rexións de inicio da tradución poden detectarse engadindo harringtonina ou lactidomicina para impedir calquera iniciación adicional. Isto permite analizar o codón de iniciación dos ARNms no lisado celular, que foi utilizado para determinar secuencias non-AUG que inician a tradución. As outras rexións en elongación poden detectarse engadindo antibióticos como a cicloheximida, que inhiben a translocación, o cloranfenicol, que inhibe a transferencia de péptidos dentro do ribosoma, ou métodos que non utilizan compostos químicos como a conxelación térmica. Estes métodos de conxelación da elongación permiten analizar a cinética da tradución. Como múltiples ribosomas poden traducir unha soa molécula de ARNm para así acelerar o proceso de tradución, a Ribo-Seq demostra as rexións codificantes de proteínas dentro do ARNm e a rapidez con que se fai isto dependendo do ARNm que está sendo secuenciado. Isto tamén posibilita que o perfil ribosómico mostre sitios de pausa dentro do transcritoma en codóns específicos. Estes sitios de tradución lenta ou pausada demóstranse por un incremento na densidade ribosómica e estas pausas poden servir para ligar proteínas específicas coas súas funcións na célula.
Pregamento de péptidos
O acoplamento do perfil ribosómico coa inmunoprecipitación da cromatina (ChIP) pode dilucidar como e cando se pregan as proteínas de nova síntese. Usando as pegadas proporcionadas pola Ribo-Seq, poden purificarse ribosomas específicos asociados con factores, como chaperonas. Pausando o ribosoma en momentos temporais específicos, permitíndolle traducir un polipétido conforme pasa o tempo, e expoñendo os diferentes puntos a unha chaperona e facéndoos precipitar usando ChIP, purifícanse estas mostras e pode mostrarse en que momento o péptido está pregándose.
Medida da síntese poteica
A Ribo-Seq pode tamén utilizarse para estimar a eficiencia da tradución, que indica a síntese de proteínas. Para esta aplicación, xéranse o perfil ribosómico e os datos de secuenciaión de ARN correspondente. As análises de datos iniciais poden obterse con marcos computacionais específicos para iso (por exemplo, ). A eficiencia da tradución pode despois computarse como a ocupación do ribosoma en cada xene mentres controla a súa expresión de ARN. Esta estratexia pode acoplarse coa perturbación dirixida das proteínas que se unen ao ARN e usar o perfil ribosómico para medir a diferenza na tradución. Estes ARNms perturbados poden asociarse con proteínas, cuxos sitios de unión foron xa mapados no ARN, para indicar regulación. Procedemento
Lise das células ou tecidos e illamento de moléculas de ARNm unidas a ribosomas.
Inmobilización de complexos. Isto realízase normalmente con cicloheximida, pero pódense empregar outros compostos. Tamén é posible prescindir de inhibidores da tradución con condicións de lise incompatibles coa tradución.
Uso de ribonucleases para dixerir o ARN non protexido polos ribosomas.
Illamento dos complexos ARNm-ribosoma usando centrifugación en gradiente de densidade de sacarosa ou columnas de cromatografía especializadas.
Purificación con fenol/cloroformo da mestura para eliminar proteínas.
Selección por tamaños de fragmentos de ARNm previamente protexidos.
Ligación dun adaptador 3' aos fragmentos.
Retirada de contaminantes do ARNr coñecidos (opcional).
Transcrición inversa do ARN a ADNc usando transcritase inversa.
Amplificar de modo específico de febra.
Lecturas de secuencia.
O aliñamento de secuencias ten como resultado unha secuencia xenómica para determinar o perfil traducional.
Analizar os datos resultantes usando estratexias computacionais deseñadas especificamente para o perfil ribosómico. Materiais
Complexos ARN-ribosoma
Cicloheximida
Nucleases
Fenol/cloroformo
Transcritase inversa
dNTPs
Método de secuenciación de biblioteca de ADNc.