Peixe cebra

O peixe cebra (Danio rerio) é unha especie de peixe tropical de auga doce pertencente á familia dos ciprínidos. É nativo da rexión do Himalaia, e un peixe de acuario moi común (vendido ás veces co nome comercial de danio cebra ou zebra danio, entre outros), e tamén un importante organismo modelo vertebrado usado para investigacións científicas. É especialmente notable polas súas capacidades rexenerativas, e foi modificado polos investigadores para producir varias cepas transxénicas. Taxonomía
O peixe cebra é membro do xénero Danio da familia Cyprinidae. Ten unha relación de grupo irmán coa especie Danio kyathit. O peixe cebra está tamén estreitamente relacionado co xénero Devario, como demostran as árbores filoxenéticas. Durante moitos anos na literatura científica, o peixe cebra era denominado Brachydanio rerio, ata que foi reasignado ao xénero Danio. Distribución
O peixe cebra é nativo das correntes fluviais do sueste da rexión do Himalaia, e atópase en partes da India, Paquistán, Bangladesh, Nepal, e Birmania. A especie orixinouse na rexión do río Ganxes no leste da India, e vive normalmente en ríos, canais, regos, lagoas e corpos de augas lentas ou encoradas, como nos campos de arroz. Descrición
O peixe cebra recibe o seu nome polas bandas horizontais uniformes pigmentadas de azul que presenta na parte lateral do seu corpo, que lembran ás raias das cebras, e que se estenden ata o final da aleta caudal. É fusiforme e comprimido lateralmente, coa boca dirixida cara a adiante. O macho ten forma de torpedo, con bandas douradas entre as bandas azuis; a femia ten unha barriga abrancazada maior e bandas prateadas en troques das douradas. As femias adultas mostran unha pequena papila xenital diante da orixe da aleta anal. O peixe cebra pode medrar ata os 6, 4 cm de lonxitude, aínda que en raras ocasións pode crecer máis, ata os 4 cm en catividade. A duración da súa vida en catividade é de arredor de dous ou tres anos, aínda que en condicións ideais, pode chegar aos cinco anos. Reprodución
O tempo de xeración aproximado de Danio rerio é de tres a catro meses. Para que se produza a ovulación e o desove debe estar presente un macho. As femias poden desovar a intervalos de dous ou tres días, poñendo centos de ovos en cada posta. Unha vez que se liberan os ovos, empeza o desenvolvemento embrionario; se non hai esperma, o crecemento detense despois dunhas poucas divisións celulares. Pero os ovos fertilizados fanse case inmediatamente transparentes, unha característica que fai de D. rerio unha especie modelo para a investigación moi conveniente. O embrión do peixe cebra desenvólvese rapidamente, e os precursores de todos os órganos principais aparecen en só 36 horas despois da fertilización, e a eclosión ten lugar de 12 a 36 horas despois, dependendo das condicións internas do embrión e da temperatura externa, que a ideal é de 28, 5 °C. O comportamento de natación e alimentación empeza unhas 36 horas despois. O sexo dos individuos xuvenís non se pode distinguir excepto por disección, e os determinantes do sexo non se comprenden claramente.
Para favorecer o desove, algúns investigadores utilizan un tanque cun fondo corredizo, o cal reduce a profundidade e simula as beiras dun río. O desove do peixe cebra prodúcese mellor pola mañá debido aos seus ritmos circadianos. Pódense recoller 10. 000 embrións en 10 minutos utilizando este método. O peixe cebra macho responde ás femias con marcas máis pronunciadas na pel, é dicir, ás "bandas boas", pero nun grupo, os machos aparéanse con calquera femia que atopen. Non se sabe que é o que atrae ás femias. A presenza de plantas, mesmo de plantas de plástico de acuario, tamén favorece o desove. Alimentación
Os peixes cebra son omnívoros, e comen principalmente zooplancto, fitoplancto, insectos e larvas de insectos, aínda que poden comer tamén outros alimentos, como vermes e pequenos crustáceos, se non atopan as súas fontes preferidas de alimento. A maioría dos peixes cebra aceptan comida para peixes de acuario común e vermes tubifex nos acuarios. Coidados en acuarios
Os peixes cebra son resistentes e considéranse bos para acuaristas principiantes. A súa gran popularidade débese á súa disposición ao xogo, á súa rápida reprodución, estética, prezo barato e grande dispoñibilidade. Tamén se desenvolve ben en bancos ou cardumes de seis ou máis, e interacciona ben con outras especies de peixes nos acuarios. Porén, son susceptibles ao dinoflaxelado Oodinium, ao microsporidio Pseudoloma neurophilia, e a especies de Mycobacterium. Se teñen a oportunidade os adultos comen as crías, as cales poden ser protexidas separándoas en dous grupos por unha rede, unha caixa de cría ou nun tanque separado. Cepas
En 2003, comercializouse nos Estados Unidos un peixe cebra transxénico que expresaba as proteínas fluorescentes verde, vermella e amarela. As cepas fluorescentes vendéronse co nome comercial de GloFish. Outras variedades cultivadas son a "golden", "sandy", "longfin" e "leopard".
O danio leopardo, previamente chamado Danio frankei, é un morfo de manchas redondas do peixe cebra, que se orixinou debido a unha mutación na pigmentación. As formas con xantocromismo cos patróns cebra e leopardo, xunto coas subespecies de aletas longas, obtivéronse con programas de cruzamento selectivo para a súa venda para acuarios.
No Centro de Recursos do Peixe Cebra da China (China Zebrafish Resource Center, CZRC) almacénanse varias cepas mutantes e transxénicas do peixe cebra. , que é unha organización sen ánimo de lucro, financiada polo Ministerio da Ciencia e Tecnoloxía da China e a Academia Chinesa das Ciencias.
Cepas de tipo salvaxe
A Zebrafish Information Network (ZFIN) proporciona información actualizada sobre as cepas de tipo salvaxe ou silvestre coñecidas de D. rerio, algunhas das cales son as da seguinte lista:
Híbridos
Os híbridos entre distintas especies do xénero Danio poden ser fértiles: por exemplo, entre D. rerio e D. nigrofasciatus. En investigación científica
D. rerio é un organismo modelo común e moi útil para estudos de desenvolvemento de vertebrados e función xénica. Os pioneiros no seu uso como animal de laboratorio foron George Streisinger e os seus colegas da Universidade de Oregón. A súa importancia foi consolidada polos existosos cribados xenéticos a grande escala (xeralmente chamados Tübingen/Boston screens). Este peixe ten unha base de datos en liña con información de desenvolvemento, xenómica e xenética, chamada Zebrafish Information Network (ZFIN). D. rerio é tamén unha das poucas especies de peixes que foron enviados ao espazo para a experimentación.
As investigacións realizadas con D. rerio proporcionaron avances importantes nos eidos da bioloxía do desenvolvemento, oncoloxía, toxicoloxía, estudos reprodutivos, teratoloxía, xenética, neurobioloxía, ciencias medioambientais, investigación en células nai e medicina rexenerativa, e teoría da evolución.
Características modelo
Como modelo de sistemas biolóxicos, o peixe cebra posúe numerosas vantaxes para os investigadores. O seu xenoma foi completamente secuenciado, e ten comportamentos de desenvolvemento ben comprendidos e doadamente observables e comprobables. O seu desenvolvemento embrionario é moi rápido, e os seus embrións son relativamente grandes, robustos, e transparentes, e poden desenvolverse fóra da súa nai. Ademais, hai cepas mutantes ben caracterizadas das que se pode dispoñer facilmente.
Outras vantaxes son o tamaño case constante da especie durante o seu desenvolvemento inicial, o que permite o uso de técnicas de tinguidura simples, e o feito de que se pode fusionar o seu embrión de dúas células para formar unha soa célula e crear un embrión homocigoto. O peixe cebra é tamén demostrablemente similar aos modelos de mamífero e humanos en probas de toxicidade, e mostra un ciclo de sono diúrno con semellanzas co comportamento durante o sono dos mamíferos. Con todo, hai tamén algunhas desvantaxes no uso do peixe cebra, como a ausencia dunha dieta estándar, e a presenza de pequenas pero importantes diferenzas entre o peixe cebra e os mamíferos na función que teñen algúns xenes relacionados con trastornos humanos, todo o cal é importante consideralo para determinar se o peixe cebra é un modelo apropiado para un determinado estudo.
Rexeneración
O peixe cebra ten a capacidade de rexenerar as súas aletas, pel, corazón e, nos estados larvais, o cerebro. Na rexeneración do músculo cardíaco do peixe cebra non interveñen células nai, senón que as células musculares cardíacas maduras volven a un estado similar ao de célula nai e rediferéncianse. Inténtase aplicar estas propiedades aos humanos.
O peixe cebra pode rexenerar tamén as células fotorreceptoras e neuronas da retina se estas sofren danos, o que está mediado pola desdiferenciación e proliferación de células da glía de Müller. Os investigadores adoitan amputar as aletas da cola dorsal e ventral e analizar o seu recrecemento para probar mutacións. Atopouse que no sitio da amputación ocorre unha desmetilación de histonas, que fai que as células do peixe cebra cambien de estar no estado "activo", a un estado rexenerativo similar a células nai. En 2012, un estudo revelou que o peixe cebra utiliza unha proteína especializada, chamada factor de crecemento de fibroblastos, para facilitar a curación da súa medula espiñal lesionada sen orixinar cicatrices gliais.
En trastornos do sistema nervioso, como doenzas neurodexenerativas, trastornos do movemento, trastornos psiquiátricos e xordeira, os investigadores están utilizando o peixe cebra para comprender como os defectos xenéticos que subxacen nesas condicións causan anormalidades funcionais no cerebro humano, medula espiñal e órganos sensoriais. Tamén se estudou o peixe cebra para saber máis sobre as complexidades das doenzas musculoesqueléticas humanas, como a distrofia muscular. Outro foco de investigación co peixe cebra está centrado en comprender como un xene chamado Hedgehog, que é un sinal biolóxico que está implicado en varios tipos de cancro humanos, controla o crecemento celular.
Xenética
Expresión xénica
Debido aos seus curtos ciclos vitais e ao tamaño relativamente grande das súas postas de ovos, os peixes cebra son un modelo moi útil para estudos xenéticos. Unha técnica común de xenética inversa é reducir a expresión de xenes (knockdown de xenes) ou modificar o splicing utilizando a tecnoloxía Morpholino antisentido. Os oligonucleótidos Morpholino (MO) son macromoléculas sintéticas estables que conteñen as mesmas bases que o ADN ou ARN. Ao unir estas moléculas con secuencias complementarias de ARN, redúcese a expresión xénica de xenes específicos. Os oligonucleótidos Morpholino poden inxectarse nunha célula dun embrión despois de que este chega ao estadio de 32 células, reducindo así a expresión xénica soamente nas células que descenden da célula tratada. Porén, as células de todo o embrión en etapas máis iniciais (menos de 32 células) son interpermeables a grandes moléculas, o que permite a difusión destas entre elas e impide o uso da técnica nesa etapa.
Un problema que ten o knockdown de xenes é que, debido a que o xenoma sufriu na evolución unha duplicación despois da diverxencia entre os peixes actinopterixios (de aletas con espiñas radiais) e os sarcopterixios (de aletas lobuladas), non sempre é doado silenciar a actividade con fiabilidade dun dos xenes parálogos porque se produce complementación polo outro parálogo. Malia estas complicacións que ten o xenoma do peixe cebra, existen unha serie de plataformas globais dispoñibles comercialmente para a análise da expresión xénica por micromatrices (microarrays) e por regulación do promotor utilizando a técnica ChIP-on-chip.
Secuenciación do xenoma
O Wellcome Trust Sanger Institute comezou o proxecto de secuenciación do xenoma do peixe cebra en 2001, e a secuencia xenómica completa da cepa de referencia Tuebingen está dispoñible publicamente na páxina do National Center for Biotechnology Information (NCBI) Xenoma do Peixe Cebra. A secuencia do xenoma de referencia do peixe cebra está anotada como parte do proxecto de Ensembl, e é mantida polo Genome Reference Consortium.
En 2009, os investigadores do Institute of Genomics and Integrative Biology (IGIB) de Delhi, India, anunciaron a secuenciación do xenoma dunha cepa salvaxe do peixe cebra, que contiña 1, 7 miles de millóns de letras. As análises comparativas co xenoma de referencia do peixe cebra revelaron unhas 5 millóns de variacións dun só nucleótido e unhas 1, 6 millóns de variacións de inserción deleción. A secuencia do xenoma de referencia do peixe cebra foi publicada por Kerstin Howe et al. en 2013.
ADN mitocondrial
En 2001, os investigadores da Universidade de Oklahoma publicaron a secuencia completa do ADN mitocondrial de D. rerio. Tiña unha lonxitude de 16. 596 pares de bases. Ten unha diferenza de só uns 100 pares de bases coa doutras especies de peixes relacionadas, e tan só ten unha diferenza de 18 pares de bases máis co do peixe Carassius auratus e de 21 pares máis co da carpa (Cyprinus carpio). A súa orde de xenes e contido son idénticos ao da forma común en vertebrados do ADN mitocondrial. Contén 13 xenes codificantes de proteínas e unha rexión non codificante que contén a orixe de replicación para a cadea pesada. Situada entre un grupo de cinco xenes de ARNt, atópase unha secuencia que lembra a orixe de replicación da cadea lixeira de vertebrados. É difícil extraer conclusións evolutivas destes datos porque non é doado determinar se os cambios nos pares de bases teñen importancia adaptativa ao facer comparacións con outras secuencias de nucleótidos de vertebrados.
Xenes da pigmentación
En 1999, identificouse a mutación nacre (nácar) no ortólogo do peixe cebra do factor de transcrición de mamífero MITF. As mutacións no MITF humano orixinan defectos nos ollos e perda de pigmentos, o que é un tipo de síndrome de Waardenburg. En 2005, nun estudo da cepa golden identificouse o xene responsable desta pigmentación infrecuente, que era o SLC24A5, un transportador de solutos que parecía ser necesario para a produción de melanina, e confirmouse a súa función cun knockdown con Morpholino. O xene ortólogo foi despois caracterizado en humanos e atopouse unha diferenza nun só par de bases que segregaba claramente os humanos europeos de pel clara dos africanos de pel escura.
Transxénese
A transxénese é un enfoque común de moitos estudos sobre o funcionamento dos xenes no peixe cebra. A preparación dun peixe cebra transxénico é relativamente fácil polo método que usa un sistema transposón Tol2.
Corpos adultos transparentes
En 2008, os investigadores do Hospital Infantil de Boston desenvolveron unha nova cepa de peixe cebra, que denominaron Casper, que ten a característica de que os corpos dos adultos son de pel transparente. Isto permite unha visualización detallada da actividade celular, circulación, metástase e moitos outros fenómenos. Como peixes e humanos comparten moitas funcións xénicas, pénsase que a cepa Casper servirá para estudar enfermidades humanas como a leucemia e outros cancros. En 2013, científicos xaponeses modificaron xeneticamente un espécime de peixe cebra transparente para producir un resplandor visible durante os períodos de intensa actividade cerebral do animal, o que permitiu rexistrar os "pensamentos" do peixe en rexións específicas do seu cerebro que se iluminaban en resposta a estímulos externos.
Uso na monitorización medioambiental
En 2007, os investigadores chineses da Universidade Fudan modificaron xeneticamente o peixe cebra para poder detectar a polución por estróxenos en lagos e ríos, o cal está ligado á infertilidade dos machos. Clonaron xenes senibles aos estróxenos e inxectáronos en ovos fértiles de peixe cebra. Os peixes modificados que se orixinaron volvíanse verdes se estaban situados en augas polucionadas con estróxenos. En investigación médica
Cancro
O peixe cebra foi utilizado como modelo transxénico para varios tipos de cancro, como o melanoma, leucemia, cancro pancreático e carcinoma hepatocelular. O peixe cebra que expresa formas mutadas dos oncoxenes BRAF ou NRAS desenvolve o melanoma cando se sitúa nunha contorna deficiente en p53. Histoloxicamente, estes tumores lembran fortemente á enfermidade humana, son completamente transplantables, e mostran alteracións xenómicas a grande escala. O modelo do melanoma BRAF foi utilizado como plataforma para dous cribados publicados en 2011 na revista Nature. Nun dos estudos, o modelo utilizouse como ferramenta para comprender a importancia funcional de xenes que se sabe que son amplificados e sobreexpresados nos melanomas humanos. Un xene chamado SETDB1, aceleraba marcadamente a formación do tumor no sistema do peixe cebra, o que demostraba a súa importancia como novo oncoxene de melanoma. Isto era especialmente significativo porque o SETDB1 está implicado na regulación epixenética á que cada vez se lle dá máis importancia como un feito central na bioloxía dos tumores.
Noutro estudo, fíxose un esforzo para tomar como diana terapéutica o programa xenético presente na célula da crista neural orixe do tumor utilizando un cribado químico. Isto revelou que a inhibición da proteína DHODH (feita por unha pequena molécula chamada leflunomida) impedía o desenvolvemento das células nai da crista neural, as cales finalmente dan lugar ao melanoma por medio de interferencia co proceso de elongación transcricional. Como esta estratexia está pensada para tomar como diana a "identidade" da célula de melanoma en vez dunha soa mutación xenética, a leflunomida pode ser útil no tratamento do melanoma humano.
Doenzas cardiovasculares
Na investigación cardiovascular, o peixe cebra foi utilizado para servir como modelo para a coagulación do sangue, desenvolvemento de vasos sanguíneos, insuficiencia cardíaca, e defectos conxénitos do corazón e doenzas renais.
Sistema inmunitario
En programas de investigación da inflamación aguda, que é un importante proceso fundamento de moitas doenzas, os investigadores estableceron un modelo do peixe cebra da inflamación e a súa resolución. Esta aproximación permite un estudo detallado dos controis xenéticos da inflamación e a posibilidade de identificar novos fármacos potenciais.
Doenzas infecciosas
Como o sistema inmunitario está relativamente conservado entre o peixe cebra e os humanos, moitas doenzas infecciosas humanas poden ser modelizadas co peixe cebra. As primeiras etapas da vida transparentes do peixe cebra son moi axeitadas para a disección xenética e toma de imaxes in vivo das interaccións hóspede-patóxeno. Establecéronse modelos de peixe cebra para un amplo rango de patóxenos parasitos, virais e bacterianos; por exemplo, o modelo do peixe cebra para a tuberculose dá a oportunidade de estudar os mecanismos da patoxénese das micobacterias. Ademais, desenvolveuse unha tecnoloxía robótica para os cribados de fármacos antimicrobianos de alta resolución utilizando os modelos de infección do peixe cebra.
Reparación de danos na retina
Outra característica notable do peixe cebra é que posúe catro tipos de células cono, con células sensibles ao ultravioleta que suplementan os subtipos de conos para o vermello, verde e azul que se encontran en humanos. O peixe cebra pode así observar un amplo espectro de cores. A especie tamén se estuda para comprender mellor o desenvolvemento da retina; en especial, como os conos da retina se dispoñen formando o chamado "mosaico de conos". O peixe cebra, xunto con outros peixes teleósteos, ten unha grande precisión na súa disposicións dos conos na retina.
Este estudo das características da retina do peixe cebra foi extrapolado tamén á investigación médica. En 2007, investigadores da University College de Londres obtiveron un tipo de células nai adultas de peixe cebra que se encontran nos ollos de peixes e mamíferos que se desenvolven en neuronas na retina. Estas células de mamífero podían ser inxectadas nos ollos para tratar doenzas que danan as neuronas da retina e aplicadas en moitas enfermidades oculares, como a dexeneración macular, glaucoma, e cegueira relacionada coa diabetes. Os investigadores estudaron as células gliais de Múller dos ollos humanos a idades desde os 18 meses aos 91 anos, e puideron facer que se desenvolveran en todos os tipos de neuronas retinianas. Foron tamén quen de cultivalas facilmente no laboratorio. As células nai migraban con éxito ás retinas lesionadas de ratas de laboratorio, e adquirían as características das neuronas que as rodeaban. O equipo está traballando no desenvolvemento do mesmo procedemento con humanos.
Descubrimento de fármacos
Como se demostrou en programas de investigación que seguen en marcha, o modelo do peixe cebra permite aos investigadores non só identificar os xenes que poderían estar detrás de certas doenzas humanas, senón tamén desenvolver novos axentes terapéuticos nos programas de descubrimento de fármacos. Os embrións de peixe cebra demostraron ser un modelo de ensaio teratolóxico rápido, eficiente en custo, e fiable.