Xenopus

Xenopus (do grego ξενος, xenos, 'estraño', πους, pous, 'pé') é un xénero de ras de vida moi acuática nativas da África subsahariana. Describíronse polo momento 20 especies dentro deste xénero. As dúas especies mellor coñecidas son Xenopus laevis e Xenopus tropicalis, que son frecuentemente estudados como organismos modelo para a bioloxía do desenvolvemento, bioloxía celular, toxicoloxía, neurociencia e como modelo de doenzas humanas e defectos conxénitos.
O xénero é tamén coñecido pola súa poliploidía, e algunhas especies teñen 12 xogos de cromosomas. Características
Descrición
Todas as especies de Xenopus teñen corpos aplanados, algo ovoides e hidrodinámicos, cunha pel moi escorregadiza debido ao seu recubrimento de moco protector. A pel desta ra é lisa, pero cunha liña lateral sensorial que ten unha aparencia de liña. Estas ras son todas excelentes nadadoras e teñen as dedas dos pés completamente palmadas e potentes, aínda que os dedos das mans carecen de membrana interdixital. Tres das dedas de cada pé teñen unhas garras ben visibles.
Os ollos destas ras están na parte superior da cabeza, mirando cara a adiante. As pupilas son circulares. Non teñen pálpebras móbiles, nin lingua móbil (a lingua está completamente pegada ao solo da boca), nin membrana timpánica (igual que ocorre en Pipa pipa).
A diferenza da maioría dos anfibios, carecen de haptoglobina no seu sangue.
Comportamento
As especies de Xenopus son totalmente acuáticas, aínda que se observou que migran a terra para chegar a corpos de auga próximos durante os tempos de seca ou con chuvia forte. Atópanse xeralmente en lagos, ríos, pantanos, pozas de regatos, e encoros feitos polo home.
As ras adultas son predadoras e preeiras, e como non poden sacar a lingua, utilizan os seus pequenos brazos para axudarse durante a alimentación. Como tamén carecen de saco vocal, emiten clics (breves pulsos de son) baixo a auga (de novo igual que Pipa pipa). Os machos establecen unha xerarquía de dominancia social na cal hai un macho que é o que ten principalmente o dereito de facer chamadas de advertencia. As femias de moitas especies producen unha chamada de liberación, e as femias de Xenopus laevis producen unha chamada adicional cando son sexualmente receptivas e están preparadas para poñer ovos. As especies de Xenopus son tamén activas durante as horas de lusco-fusco.
Durante a estación de apareamento, os machos desenvolven almofadiñas nupciais con forma de crista e cor negra nos dedos para facilitar o agarre da femia. O abrazo de apareamento (amplexo) é inguinal, xa que agarran a femia pola cintura. Especies
X. amieti
X. andrei
X. borealis
X. boumbaensis
X. clivii
X. fraseri
X. gilli
X. itombwensis
X. laevis X. largeni
X. lenduensis
X. longipes
X. muelleri
X. petersii
X. pygmaeus X. ruwenzoriensis
X. tropicalis
X. vestitus
X. victorianus
X. wittei Organismo modelo para a investigación médica
Como moitos outros anuros, utilízanse a miúdo no laboratorio como suxeitos de investigación.
Os embrións de Xenopus e os seus ovos son un sistema modelo popular para unha ampla variedade de estudos biolóxicos. Este animal utilízase debido á súa poderosa combinación da facilidade do seu uso experimental e as súas máis estreitas relacións evolutivas cos humanos, polo menos comparado con outros moitos organismos modelo.
Xenopus leva sendo unha importante ferramenta para estudos in vivo en bioloxía molecular, celular e do desenvolvemento de animais vertebrados. Porén, a ampla duración do uso de Xenopus en investigación nace do feito adicional de que os extractos libres de célula feitos a partir de Xenopus son un excelente sistema in vitro para estudos de aspectos fundamentais de bioloxía celular e molecular. Así, Xenopus é o único sistema modelo de vertebrado que permite un alto rendemento de análises in vivo da función xénica e bioquímica de alto rendemento. Ademais, os ovocitos de Xenopus son un sistema líder para estudos da fisioloxía das canles de transporte iónico. Xenopus é tamén un sistema único para análises de evolución de xenomas e a duplicación xenómica completa en vertebrados, xa que as diferentes especies de Xenopus forman unha serie de ploidía formada por hibridación interespecífica.
Xenbase é o base de datos de organismo modelo tanto para Xenopus laevis coma para Xenopus tropicalis. Investigación de xenes humanos de enfermidades
Todos os modos de investigación de Xenopus (embrións, extractos libres de células e ovocitos) son utilizados comunmente en estudos directos de xenes de doenzas humanas e para estudar a ciencia básica que subxace no inicio e progresión do cancro. Os embrións de Xenopus para estudos in vivo da función de xenes de enfermidades humanas: os embrións de Xenopus son grandes e doados de manipular, e ademais, poden obterse miles de embrións nun só día. De feito, Xenopus foi o primeiro animal vertebrado para o cal se desenvolveron métodos que permitían unha rápida análise da función xénica usando a alteración da expresión (por inxección de ARNm ). A inxección de ARNm de Xenopus levou á clonación do interferón. Ademais, o uso de oligonucleótidos morfolino antisentido para realizar knockdowns de xenes en embrións de vertebrados, que é agora amplamente usado, foi desenvolvido primeiro por Janet Heasman usando Xenopus.
Nos últimos anos estes enfoques foron moi importantes en estudos de xenes de doenzas humanas. O mecanismo de acción de varios xenes mutados nos trastornos de ril quístico humano (por exemplo a nefronoftise) foron amplamente estudados en embrións de Xenopus, o que serviu para aclarar a ligazón entre estes trastornos, a cilioxénese e a sinalización Wnt. Os embrións de Xenopus proporcionaron tamén unha rápida forma de probar e validar novos xenes de enfermidades que se foron descubrindo. Por exemplo, os estudos en Xenopus confirmaron e diluciaron o papel de PYCR1 na cute laxa con características proxeroides.
Xenopus transxénico para o estudo da regulación transcricional de xenes de enfermidades humanas: Os embrións de Xenopus desenvólvense rapidamente, así a transxénese en Xenopus é un método rápido e efectivo para analizar secuencias xenómicas reguladoras. Nun estudo recente, revelouse que as mutacións no locus SMAD7 estaban asociadas co cancro colorrectal humano. Un dato interesante é que as mutacións se encontran en secuencias conservadas pero non codificantes, o que suxire que estas mutacións exercen un impacto sobre os padróns de transcrición de SMAD7. Para comprobar estas hipóteses, os autores usaron a tranxénese de Xenopus, e revelaron que esta rexión xenómica orixinaba a expresión da GFP no intestino posterior. Ademais, os transxénicos feitos coa versión mutante desta rexión mostraban unha expresión substancialmente menor no intestino posterior.
Extractos libres de células de Xenopus para estudos bioquímicos de proteínas codificados por xenes humanos de enfermidades: unha vantaxe única do sistema de Xenopus é que os extractos citosólicos conteñen tanto proteínas solubles citoplásmicas coma nucleares (incluíndo proteínas cromatínicas). Isto está en contraste cos extractos celulares preparados a partir de células somáticas con compartimentos celulares xa diferenciados. Os extractos de ovos de Xenopus proporcionaron moita información sobre a bioloxía básica das células, especialmente sobre a división celular e as transaccións de ADN asociadas con ela (véxase máis abaixo).
Os estudos feitos en extractos de ovos de Xenopus tamén serviron para dilucidar os mecanismos de acción de xenes de enfermidades humanas asociadas con inestabilidade xenética e elevado risco de cancro, como a ataxia telanxiectasia, cancro de ovario e de mama de BRCA1 herdado, síndrome de rotura de Nijmegen Nbs1, síndrome de Rothmund-Thomson RecQL4, oncoxene c-Myc e proteínas FANC (de anemia de Fanconi).
Ovocitos de Xenopus para estudos de expresión xénica e actividade de canles iónicas relacionadas cos doenzas humanas: Outra vantaxe de Xenopus é a capacidade de ensaiar de forma rápida e doada a actividade de canles e proteínas de transporte usando a expresión en ovocitos. Esta aplicación foi moi útil para a comprensión de enfermidades humanas, como os estudos relacionados coa transmisión do tripanosoma, epilepsia con ataxia e xordeira neurosensorial, arritmia cardíaca catastrófica (síndrome da QT longa), e leucoencefalopatía megaloencefálica.
A edición de xenes polo sistema CRISPR/CAS foi demostrada recentemente en Xenopus tropicalis e Xenopus laevis. Esta técnica está utilizándose para facer cribados dos efectos de xenes de enfermidades humanas en Xenopus e o sistema é suficientemente eficiente para estudar os efectos nos mesmos embrións que foron manipulados. Investigación de procesos biolóxicos fundamentais
Transdución de sinais: Os embrións e extractos libres de células de Xenopus son amplamente usados para a investigación básica en transdución de sinais. Nos últimos anos, os embrións de Xenopus proporcionaron información sobre os mecanismos do TGF-beta e a transdución de sinais Wnt. Por exemplo, os embrións de Xenopus foron utilizados para identificar os encimas que controlan a ubiquitinación de Smad4, e para demostrar as ligazóns directas entre as vías de sinalización da superfamilia do TGF-beta e outras redes importantes, como a vía da quinase MAP e a vía Wnt. Ademais, os novos métodos que usaban extractos de ovos revelaron novas e importantes dianas do complexo de destrución Wnt/GSK3.
División celular: Os extractos de ovos de Xenopus permitiron o estudo de moitos eventos celulares complicados in vitro. Como o citosol dos ovos pode soportar ciclos sucesivos entre a mitose e a interfase in vitro, foi esencial para diversos estudos da división celular. Por exemplo, encontrouse primeiro que a pequena GTPase Ran regulaba o transporte nuclear na interfase, pero os extractos de ovos de Xenopus revelaron un papel fundamental exercido pola GTPase Ran na mitose independentemente do seu papel no transporte nuclear na interfase. De xeito similar, os extractos libres de células utilizáronse como modelo de ensamblaxe da envoltura nuclear a partir da cromatina, o que revelou a función da GTPase Ran na regulación da reensamblaxe da envoltura nuclear despois da mitose. Máis recentemente, usando extractos de ovos de Xenopus, era posible demostrar a función específica da mitose da lamina B nuclear na regulación da morfoxénese do fuso e para identificar novas proteínas que median a unión do cinetocoro aos microtúbulos.
Desenvolvemento embrionario: Os embrións de Xenopus foron amplamente usados na bioloxía do desenvolvemento. Un sumario dos recentes avances feitos por medio de investigacións en Xenopus en anos recentes inclúe: Epixenética da especificación do destino que vai ter a célula e mapas de referencia epixenómicos
microARN nos padróns da capa xerminal e desenvolvemeno do ollo
Ligazón entre a sinalización Wnt e a telomerase
Desenvolvemento da vasculatura
Morfoxénese do tracto gastrointestinal
Inhibición de contacto e migración das células da crista neural e a xeración da crista neural a partir de células da blástula pluripotentes
Replicación do ADN: os extractos libres de células de Xenopus tamén soportan estudos da ensamblaxe sincronizada e a activación das orixes da replicación do ADN. Foron instrumentais para caracterizar a función bioquímica do complexo prerreplicativo, incluíndo as proteinas MCM.
Resposta aos danos no ADN: os extractos libres de células foron esenciais para desvelar as vías de sinalización que se activan en resposta a roturas de dobre febra no ADN (ATM), detención da forcada de replicación (ATR) ou ligazóns cruzadas entre febras do ADN (proteínas FA e ATR). Especialmente, varios mecanismos e compoñentes destas vías de transdución de sinais foron identificados primeiramente en Xenopus.
Apoptose: os ovocitos de Xenopus proporcionan un modelo axeitado para estudos bioquímicos da apoptose. Recentemente, os ovocitos foron utilizados para estudar os mecanismos bioquímicos da activación da caspase-2; un dato importante é que este mecanismo está conservado nos mamíferos.
Medicina rexenerativa: en anos recentes, o tremendo interese na bioloxía do desenvolvemento acrecentouse pola promesa de aplicala á medicina rexenerativa. Xenopus xogou tamén un papel aquí. Por exemplo, a expresión de sete factores de transcrición en células pluripotentes de Xenopus fixeron que estas células puidesen desenvolverse en ollos funcionais cando se implantaban en embrións de Xenopus, proporcionando información sobre a reparación da dexeneración ou dano retinal. Nun estudo completamente diferente, os embrións de Xenopus foron utilizados para estudar os efectos da tensión dos tecidos na morfoxénese, un aspecto que é esencial para a enxeñaría de tecidos in vitro.
Fisioloxía: o batido direccional dos cilios de células multiciliadas é esencial para o desenvolvemento e homeostase no sistema nervioso central, as vías aéreas e o oviduto. As células multiciliadas da epiderme de Xenopus desenvolvéronse recentemente como o primeiro banco de probas in vivo para estudos con células vivas de ditos tecidos ciliados, e estes estudos proporcionaron moitos datos sobre o control molecular e biomecánico do batido direccional. Cribados de pequenas moléculas para desenvolver novas terapias
Debido á enorme cantidade de material que se obtén doadamente, todas as modalidades de investigación en Xenopus están agora sendo utilizadas para cribados baseados en pequenas moléculas.
A xenética química de crecemento vascular en cágados de Xenopus: Dada a importancia da neovascularización na progresión do cancro, os embrións de Xenopus foron utilizados recentemente para identificar novas pequenas moléculas inhibidoras do crecemento dos vasos sanguíneos. Os compostos identificados en Xenopus foron efectivos en ratos. Os embrións de ras foron moi importantes nun estudo que utilizou principios evolutivos para identificar un novo axente perturbador vascular que pode ter un potencial quimioterapéutico.
Probas in vivo de potenciais perturbadores endócrinos en embrións transxénicos de Xenopus: un ensaio de alto rendemento para a perturbación tiroide foi desenvolvido recentemente usando embrións transxénicos de Xenopus.
Cribados de pequenas moléculas en extractos de ovos de Xenopus: os extractos de ovos proporcionan rápidas análises de procesos de bioloxía molecular e poden ser cribados rapidamente. Este enfoque foi utilizado para identificar novos inhibidores de degradación de proteínas mediados polo proteasoma e encimas de reparación do ADN. Estudos xenéticos
Aínda que Xenopus laevis é a especie máis comunmente utilizada en estudos de bioloxía do desenvolvemento, os estudos xenéticos, especialmente os estudos xenéticos avanzados, poden ser complicados polo seu xenoma pseudotetraploide. Xenopus tropicalis proporciona un modelo máis simple para estudos xenéticos, ao ter un xenoma diploide. Técnicas de knockdown da expresión xenética
A expresión dos xenes pode ser reducida por diversos medios, por exemplo usando oligonucleótidos antisentido dirixidos a moléculas de ARNm específicas. Os oligonucleótidos de ADN complementarios de moléculas de ARNm específicas adoitan ser modificados quimicamente para mellorar a súa estabilidade in vivo. As modificacións químicas usadas para este propósito inclúen o uso de fosforotioato, 2'-O-metil, morfolino, MEA fosforamidato e DEED fosforamidato.
Oligonucleótidos morfolino
Os oligos morfolino (ou Morpholino) utilízanse tanto en X. laevis coma en X. tropicalis para probar a función dunha proteína observando os resultados de eliminar a actividade da proteína. Por exemplo, cribouse desta forma un conxunto de xenes de X. tropicalis.
Os oligos morfolino (MOs) son oligos curtos antisentido feitos de nucleótidos modificados. Os MOs poden realizar un knockdown da expresión xénica ao inhibiren a tradución do ARNm, bloqueando o empalme de ARN, ou inhibindo a actividade e maduración dos miARN. Os MOs demostraron ser efectivos como ferramentas para o knockdown en experimentos de bioloxía do desenvolvemento e reactivos que bloquean o ARN para o cultivo de células. Os MOs non degradan os seus ARN diana, pero en vez diso actúan vía un mecanismo de bloqueo estérico de maneira independente de RNAseH. Permanecen estables en células e non inducen respostas inmunes. A microinxección de MOs en embrións temperáns de Xenopus poden suprimir a expresión xénica de maneira dirixida.
Como en todas as estratexias antisentido, diferentes MOs poden ter diferente eficacia, e poden causar efectos non específicos fóra da diana. A miúdo, varios MOs necesitan ser probados para encontrar unha secuencia diana efectiva. Utilízanse controis rigorosos para demostrar a especificidade, como os seguintes: Fenocopia de mutación xenética.
Verificación de proteínas reducidas por western blot ou inmunotinguidura.
Rescate de ARNm engadindo de novo un ARNm inmune ao oligo morfolino.
Uso de dous oligos morfolino diferentes (bloqueo da tradución e do empalme).
Inxección de oligos morfolino de control.
Xenbase proprociona un catálogo no que se poden buscar uns 2000 MOs que foron usados especificamente en investigación con Xenopus. Pódese buscar nos datos por secuencia, símbolo do xene e varios sinónimos (como se utilizan en diferentes publicacións). Xenbase mapea os MOs dos últimos xenomas de Xenopus obtidos en GBrowse, predín os impactos 'fóra de diana', e teñen unha listaxe de toda a literatura de Xenopus na cal se publicou o morfolino.