Hemateína ácida de Baker

A hemateína ácida de Baker é unha técnica histolóxica para evidenciar a presenza de fosfolípidos. O método foi creado por J. R. Baker en 1946, e baséase na reacción da hemateína co radical fosfato, aínda que non está totalmente demostrado. Resulta útil no estudo histolóxico do cerebro, así como en estudos hematolóxicos. Fundamento
Os tecidos, para obter resultados óptimos, deben fixarse en solución formol-calcio de Baker para prever a disolución dos fosfolípidos. Os tecidos son entón cromados, co cal os fosfolípidos e outras substancias ácidas non lipídicas forman complexos de quelato.
A especificidade tintorial para fosfolípidos foi cuestionada. Se as técnicas de hemateína ácida se empregan en tecido cerebral, pódese apreciar unha diferenza entre a materia gris e a materia branca, aínda que as análises químicas de ambas as dúas amosan unha pequena diferenza na cantidade de fosfolípidos e lípidos non saturados entre a materia gris e branca. Algúns estudos indican que o compoñente de fosfolípidos non é tan importante coma a cantidade real de lípidos. A mielina presente en grandes cantidades na materia branca é unha estrutura multilaminar, e crese que esta configuración pode agarrar aos ións cromo nunha estrutura estable e tridimensional, que é resistente ao paso da tinción.
Os eritrocitos tamén se tinguen con métodos de hemateína ácida, e foi formalmente asumido que este tinguido se atribuía ao contido fosfolípido do eritrocito. O feito de que a coloración de eritrocitos estivese presente mesmo despois de procesos de extracción de lípidos, significa que o fosfolípido presente estaba fortemente suxeito ao tecido da proteína. Análises bioquímicas revelaron que menos do 1% do peso seco é fosfolípido, e traballos posteriores demostraron que a hemoglobina presente é o compoñente responsable para a coloración positiva con métodos de hemateína ácida. Isto, abofé, indica que as probas tales como a hemateína ácida de Baker non son nin sensibles nin específicas para fosfolípidos. Tecido control e diana
O tecido que se debe empregar para esta técnica é o tecido adiposo que é o que ten maior concentración de fosfolípidos. Fixador óptimo
O fixador ideal para este tipo de técnica é unha solución de formol-calcio.
Débese aclarar que a formalina neutra estabilizada tende a remover os fosfolípidos dos tecidos. Porén, o formol-calcio, cando é usado despois da formalina neutra, pode preservar os fosfolípidos. Ás veces, os fosfolípidos poden ser demostrados en seccións de parafina fixadas en formalina neutra.
Para a súa preparación mesturamos (para 100cc): 10cc de formaldehido ao 40%
10cc cloruro anhídrido de calcio ao 10%
80cc de auga destilada Grosor do tecido
O material que se utilice deberá ter un grosor de 6 a 12 microns e realizaranse os cortes sobre tecido conxelado. Reactivos
Dicromato de Potasio ó 5%
5gr. Dicromato potásico
1gr. Cloruro de calcio
100cc auga destilada
Hemateína ácida:
0, 05gr. Hematoxilina
1cc Ioduro de Sodio ó 1%
1cc Ácido acético glacial
48cc auga destilada
Preparación: Conservar a hematoxilina e o ioduro de sodio nun matraz; engadir a auga, quentar ata ebulición; arrefriar; engadir ácido acético. Usar unha única vez, xa que a solución non é estable. Solución diferenciadora (é estable, pero debe gardarse na escuridade):
Borax 0. 25gr.
Ferrocianuro potásico 0. 25gr.
100cc auga destilada H2OD100ml Procedemento
Preparación da mostra
A mostra require preparación previa: Fixar as pequenas pezas de tecido en formol-calcio durante 6 horas. Este tempo pode prolongarse.
Introducir na solución de dicromato e cloruro de calcio durante 18h. a temperatura ambiente.
Introducir os bloques na solución de dicromato fresca, durante 24h. a 60º.
Lavar o tecido en auga durante 6 horas.
Obter seccións por conxelación de 6 a 12 microns.
Método de tinguidura
A técnica de tinguidura é como segue: Colocar as seccións na solución de dicromato e cloruro de calcio durante 1 hora a 60 °C.
Lavar en auga corrente durante 5 minutos, enxaugar con auga destilada.
Colorar as seccións coa hematina ácida durante 5 horas a 37 °C.
Enxaugar as seccións con auga destilada, 2 cambios e distinguir coa solución de ferrocianuro de bórax 18 horas a 37 °C.
Lavar en auga corrente durante 10 minutos; enxaugar con auga destilada.
Montar en xelatina de glicerol.
Resultados
Fosfolípidos: azul-negro
Fondo: marrón-amarillo
Nucleoproteínas: azul-negro