HindIII

HindIII ("Hin de tres") é un encima de restrición de tipo II específico de sitio que foi illado da bacteria Haemophilus influenzae, que corta a secuencia de ADN palindrómica AAGCTT en presenza do cofactor Mg2+ por hidrólise.
A clivaxe (corte) desta secuencia entre as AA orixina extremos 5' monocatenarios que sobresaen ou colgan a cada lado no ADN bicatenario chamados extremos cohesivos, pegañentos ou adherentes, que teñen secuencias complementarias:
5'-A |A G C T T-3'
3'-T T C G A| A-5'
As endonucleases de restrición utilízanse como mecanismos de defensa dos organismos procarióticos no seu sistema de restrición-modificación. A súa función principal é protexer o hóspede contra a invasión do ADN alleo, fundamentalmente o ADN dos bacteriófagos. Estrutura do encima
A estrutura de HindIII é a dun homodímero bastante complexo. Igual que outras endonucleases de restrición de tipo II, crese que contén un núcleo estrutural común que consta de catro follas β e unha soa hélice α. Cada subunidade contén 300 aminoácidos e a masa molecular predita é de 34. 950 Da. Malia a importancia deste encima en bioloxía molecular e na tecnoloxía do ADN, disponse de pouca información sobre o mecanismo de recoñecemento do ADN e clivaxe dos enlaces fosfodiéster do ADN. Porén, crese que HindIII utiliza un mecanismo común de recoñecemento e catálise do ADN que tamén se encontra noutros encimas de tipo II como EcoRI, BamHI, e BglII. Estes encimas conteñen o motivo de secuencia de aminoácidos PD-(D/E)XK que coordina o Mg2+, un catión requirido para clivar o ADN na maior parte das enconucleases de restrición de tipo II. O cofactor Mg2+ crese que se une a moléculas de auga e lévaas aos centros catalíticos do encima. A diferenza das endonucleases de restrición de tipo II máis documentadas, a HindIII é peculiar en que ten pouca ou ningunha actividade catalítica cando o Mg2+ se substitúe por outros factores, como Mn2+. Mutaxénese dirixida a sitio
Aínda que temos pouca certeza sobre as relacións entre estrutura e catálise nas endonucleases de tipo II, a mutaxénese dirixida a sitio de recoñecemento da HindIII proporcionou moita información sobre cales eran os aminoácidos chave implicados. En particular, as substitucións de Asn por Lys nos residuos 125 e Leu por Asp no residuo 108 fan decrecer significativamente a capacidade de unión ao ADN e a función catalítica de HindIII. Noutro estudo de mutaxénese atopouse que unha mutación no residuo 123 que cambiaba Asp por Asn reducía a actividade encimática. A pesar de que este residuo é con máis probabilidade o responsable do desenrolamento do ADN e da cordinación de moléculas de auga máis que da interacción directa co nucleófilo que produce o ataque, a súa función específica é descoñecida. Mecanismo proposto
Aínda que os encimas de restrición clivan en secuencias específicas do ADN, primeiramente teñen que unirse ao ADN de forma non específica antes de que poidan localizar o seu sitio de restrición. Como media, o encima de restrición forma uns 15-20 enlaces de hidróxeno coas bases da secuecncia de recoñecemento. Coa axuda de interaccións de van der Waals, estes enlaces facilitan cambios conformacionais no complexo ADN-encima, que orixinan a activación dos centros catalíticos.
Non hai evidencias suficientes para saber cal é o mecanismo exacto de clivaxe do ADN por HindIII, pero as análises de mutaxénese de sitio combinadas con estudos máis detallados de catálise medada por ións metálicos en EcoRV levaron a propoñer o seguinte mecanismo catalítico. Proponse que durante a hidrólise do ADN por EcoRV o residuo catalítico Lys-92 estabiliza e orienta a molécula de auga nucleófila atacante, mentres que o carboxilato do Asp-90 estabiliza o anión hidróxido saínte por coordinación co Mg2+. Ademais, a función encimática depende da correcta posición do Asp-74, o que suxire que ten un papel en incementar a nucleofilidade da molécula de auga que realiza o ataque.
Como resultado dos experimentos de mutaxénese de sitio xa mencionados, propúxose que a Lys-125, Asp-123, e Asp-108 de HindIII funcionan de xeito similar á Lys-92, Asp-90, e Asp-74 de EcoRV, respectivamente. A Lys-125 posiciona a molécula de auga atacante, mentres que o Asp-108 aumenta a súa nucleofilidade. O Asp-123 coordina o Mg2+, o cal á súa vez estabiliza o ión hidróxido saínte.
a Usos en investigación
A HindIII e outros tipos de endonucleases de restrición de tipo II son moi útiles na investigación moderna, especialmente no mapado e secuenciación do ADN. A diferenza dos encimas de restrición de tipo I, os de tipo II realizan clivaxes do ADN moi específicas. As de tipo I recoñecen secuencias específicas pero clivan ao ADN en puntos aleatorios distintos do seu sitio de recoñecemento, mentres que os de tipo II clivan só en puntos determinados no seu sitio específico de recoñecemento ou preto. Desde o seu descubrimento a inicios da década de 1970, os encimas de restrición de tipo II revolucionaron a maneira en que os científicos traballan co ADN, principalmente en enxeñaría xenética e bioloxía molecular.
Os principais usos dos encimas de restrición de tipo II como HindIII son a análise e clonación de xenes. Demostraron ser sistemas ideais para o estudo das interaccións proteínas-ácidos nucleicos, relacións estrutura-función, e o mecanismo de evolución. Serven para facer bos ensaios para o estudo de mutacións xenéticas pola súa capacidade de clivar especificamente o ADN, o cal permite eliminar ou inserir ADN. Con eles pode modificarse, inserir ou quitar xenes específicos.