Cromatografía en columna

A cromatografía en columna en química é un método de cromatografía usado para illar un só composto químico dunha mestura. A cromatografía pode separar substancias baseándose na adsorción diferencial de compostos ao adsorbente; os compostos móvense a través da columna a diferentes velocidades, o que permite separalas en fraccións. A técnica ten moitas aplicacións, xa que se poden utilizar moitos adsorbentes diferentes (fase normal, fase inversa ou doutros modos) cunha ampla variedade de solventes. A técnica pode usarse a escalas desde microgramos a quilogramos. A principal vantaxe da columna cromatográfica é o custo relativamente baixo e a facilidade para desbotar a fase estacionaria usada no proceso. Isto último impide a contaminación cruzada e a degradación da fase estacionaria debido á reciclaxe. Para mover o solvente na columna cromatográfica pode usarse a gravidade ou comprirse cun gas para que este empurre o solvente a través da columna.
Un cromatógrafo en capa fina pode mostrar como se comporta unha mestura de compostos cando se purifican nunha columna de cromatografía. A separación é optimizada primeiramente usando cromatografía en capa fina antes de realizar unha cromatografía en columna. Preparación da columna
Unha columna prepárase empaquetando un absorbente sólido nun cristal cilíndrico ou tubo de plástico. O seu tamaño dependerá da cantidade de composto que se debe illar. A base do tubo contén un filtro, que pode ser de algodón ou un tapón de la de vidro ou frita de vidro (moi porosa) para manter a fase sólida no seu sitio. Pode colocarse un depósito de solvente na parte superior da columna.
Xeralmente utilízanse dous métodos para preparar a columna: o método seco e o húmido. No método seco a columna énchese primeiro cun po seco da fase estacionaria, seguido da adición da fase móbil, que flúe a través da columna ata que está completamente húmida, e desde este momento nunca se permite que quede seca. No método húmido, prepárase unha solución do eluente co po da fase estacionaria e despois vértese coidadosamente na columna. A parte superior do sílice debería ser plano e pode protexerse por unha capa de area. O eluente pasa lentamente a través da columna para que avance o material orgánico.
Os distintos compoñentes quedan retidos pola fase estacionaria de maneira diferente e sepáranse uns doutros a medida que discorren a distintas velocidades a través da columna xunto co eluente. Ao final da columna elúen cada un en distinto momento. Durante o proceso completo da cromatografía, o eluente recóllese nunha serie de fraccións. As fraccións poden recollerse automaticamente por medio de colectores de fraccións. A produtividade da cromatografía pode incrementarse poñendo a funcionar varias columnas á vez. Nese caso utilizanse colectores de multifluxos. A composición do fluxo eluente pode monitorizarse e cada fracción é analizada para detectar os compostos disoltos, por exemplo, por cromatografía analítica, espectroscopia ultravioleta-visible ou espectroscopia fluorescente. Os compostos coloreados (ou que son fluorescentes co uso dunha lámpada UV) poden verse a través da parede de cristal como bandas en movemento. Fase estacionaria
A fase estacionaria ou adsorbente na cromatografía en columna é un sólido. A fase estacionaria máis común para a cromatografía en columna é o xel de sílice, o segundo máis común é a alúmina. O po de celulosa era utilizado a miúdo no pasado. Disponse dunha gran variedade de fases estacionarias para realizar a cromatografía de intercambio iónico, a cromatografía de fase inversa, a cromatografía de afinidade ou a adsorción en cama expandida. As fases estacionarias son xeralmente pos finamente moídos ou xeles e/ou son microporosos para que aumente a súa superficie, aínda que na adsorción en cama expandida utilízase unha cama fluída. Hai unha importante desproporción entre o peso da fase estacionaria e o peso seco da mestura do analito que pode aplicarse á columna. Para a cromatografía en columna de sílice, a proporción entre eles vai desde 20: 1 a 100: 1, dependendo do próximos entre si que estean eluíndose os compoñentes do analito. Fase móbil (eluente)
A fase móbil ou eluente é un solvente ou unha mestura de solventes utilizados para mover os compostos a través da columna. É elixido de modo que o valor do factor de retención do composto de interese estea aproximadamente arredor de 0, 2 - 0, 3 para minimizar o tempo e a cantidade de eluente necesario para realizar a cromatografía. O eluente debe escollerse axeitadamente tamén para que os diferentes compostos se poida separar con efectividade. O eluente optimízase en tests previos a pequena escala, xeralmente usando cromatografía en capa fina coa mesma fase estacionaria.
Hai unha velocidade de fluxo óptima para cada separación concreta. Unha velocidade de fluxo máis rápida do eluente minimiza o tempo necesario para que estea en funcionamento a columna e minimiza a difusión, o que ten como resultado unha mellor separación. Porén, a velocidade de fluxo máxima está limitada porque cómpre un tempo finito para que o analito se equilibre entre a fase estacionaria e a fase móbil (ver a ecuación de Van Deemter). Unha columna de laboratorio simple funciona por fluxo de gravidade. A velocidade de fluxo desas columnas pode incrementarse alongando a columna chea de eluente fresco que está sobre a parte superior da fase estacionaria ou pode diminuírse polos controis das chaves reguladoras. Poden conseguirse velocidades de fluxo máis rápidas usando unha bomba ou con gas comprimido (por exemplo, aire, nitróxeno ou argon) para impulsar o solvente ao longo da columna (cromatografía en columnan flash). O tamaño da partícula da fase estacionaria é xeralmente máis fina na cromatografía en columna flash que na cromatografía en columna de gravidade. Por exemplo, un dos graos de xel de sílice máis amplamente utilizados na primeira técnica ten unha malla de 230 – 400 (40 – 63 µm), mentres que na última técnica normalmente cómpren xeles de sílice de mallas de 70 – 230 (63 – 200 µm).
Desenvolveuse unha folla de cálculo que axuda ao desenvolvemento exitoso de columnas flash. A folla de cálculo estima o volume de retención e volume de banda dos analitos, o número de fraccións que se espera que conteñan cada analito e a resolución entre picos adxacentes. Esta información permite aos usuarios seleccionar parámetros óptimos para as separacións a escala preparativa antes de que se realice a propia columna flash. Sistemas automatizados
A cromatografía en columna é unha técnica que consome moito tempo en calquera laboratorio e pode rapidamente converterse nun colo de botella en calquera proceso de laboratorio. Moitos fabricantes como Biotage, Buchi, Interchim e Teledyne Isco desenvolveron sistemas de cromatografía flash automatizados (normalmente denominados LPLC, é dicir, cromatografía líquida a baixa presión polas súas siglas en inglés, duns 350 a 525 kPa (50. 8-76, 1 psi) que minimizan a implicación humana no proceso de purificación. Os sistemas automatizados utilizan compoñentes que normalmente se encontran en sistemas máis caros como a cromatografía líquida de alto rendemento (HPLC) como unha bomba de gradiente, portos de inxección da mostra, un detector de UV e un colector de fraccións para recoller o eluente. Tipicamente estes sistemas automatizados poden separar mostras desde uns poucos miligramos ata unha escala industrial de moitos quilogramos e ofrece unha solución moito máis barata e rápida para facer inxeccións múltiples nos sistemas prep-HPLC.
A resolución (ou capacidade de separar unha mestura) nun sistema LPLC será sempre menor comparado co HPLC, xa que o material de empaquetado nunha columna de HPLC pode ser moito máis pequeno, normalmente de só 5 micrómetros incrementando así a área superficial da fase estacionaria, aumentando as interaccións de superficie e conseguindo unha mellor separación. Porén, o uso deste pequeno medio de empaquetdo causa a alta presión traseira e por iso se denomina cromatografia líquida de alta presión. As columnas de LPLC están normalmente empaquetadas con sílice duns 50 micrómetros, reducindo así a presión traseira e a resolución, pero tamén evita a necesidade de bombas de alta presión de alto prezo. Os fabricantes están agora empezando a cambiar a sistemas de cromatografía flash a maior presión e denomínanse sistemas de cromatografía líquida a media presión (MPLC), que funcionan a aproximadamente 1 MPa (150 psi). Cálculo da resolución do cromatograma en columna
Tipicamente, a cromatografía en columna instálase con bombas peristálticas, facendo fluír tampóns e a mostra en solución desde a parte superior da columna. As solucións e tampón pasan a través da columna, onde un colector de fraccións ao final da columna recolle as mostras eluídas. Antes da recollida das fraccións, as mostras que son eluídas pola columna pasan por un detector como un espectrofotómetro ou espectrómetro de masas para que se poida determinar a concentración das mostras separadas na mestura da solución da mostra.
Por exemplo, se o que se quere é separar dúas proteínas diferentes con distintas capacidades de unión á columna dunha mostra en solución, un bo tipo de detector sería un espectrómetro que use unha lonxitude de onda de 280 nm. Canto maior é a concentración de proteínas que pasan pola solución eluída pola columna, maior é a absorbancia da lonxitude de onda.
Como a cromatografía en columna ten un fluxo constante de solución eluída que pasa a través do detector a concentracións que varían, o detector debe facer unha gráfica da concentrción da mostra eluída durante un período de tempo. Esta gráfica da concentración de mostra fronte ao tempo denomínase cromatograma.
O obxectivo último da cromatografía é separar diferentes compoñentes dunha mestura en solución. A resolución expresa o grao de separación entre os compoñentes da mestura. Canta maior é a resolución do cromatograma, maior é o grao de separación das mostras que proporciona a columna. Estes datos son unha boa maneira de determinar as propiedades de separación da columna desa determinada mostra. A resolución pode calcularse a partir do cromatograma.
As curvas separadas do diagrama representan perfís de concentración de elución de mostra diferentes sobre o tempo baseándose na súa afinidade coa resina da columna. Para calcular a resolución son necesarios o tempo de retención e a anchura da curva.
O tempo de retención é o tempo desde o inicio do sinal de detección polo detector á altura do pico do perfil de concentración de elución de cada unha das mostras.
A anchura da curva é a anchura do perfil da curva de concentración das diferentes mostras do cromatograma en unidades de tempo.
Un método simplificado de calcular a resolución do cromatograma é usar un modelo de pratos. O modelo de pratos asume que a columna se pode dividir nun certo número de seccións ou pratos e o equilibrio de masas pode calcularse a partir de cada un dos pratos. Esta estratexia aproxima unha curva de cromatograma típica a unha curva de distribución de Gauss. Ao facer isto, a anchura da curva estímase como 4 veces a desviación estándar da curva, 4σ. O tempo de retención é o tempo desde o comezo da detección do sinal ao tempo da altura do pico da curva de Gauss.
A partir das variables da figura de arriba a resolución, número de pratos e altura de pratos do modelo de pratos da columna poden calcularse usando as seguintes ecuacións:
Resolución (Rs) Rs 2(tRB – tRA)/(wB + wA)
onde tRB
tempo de retención do soluto B tRA
tempo de retención do soluto A wB
anchura da curva de Gauss do soluto B wA
anchura da curva de Gauss do soluto A
Número de pratos (N): N (tR)2/(w/4)2
Altura de pratos (H): H L/N
onde L é a lonxitude da columna. Equilibrio de adsorción da columna
Para unha columna de adsorción a resina da columna (a fase estacionaria) está composta de microesferas. Incluso partículas máis pequenas como proteínas, carbohidratos, ións metálicos ou outros compostos químicos poden ser conxugados sobre as microesferas. Cada partícula ligadora que se adhira ás microesferas pode considerarse que se une nunha proporción de 1: 1 coa mostra de soluto que se fai pasar pola columna que necesita ser purificada e separada.
A unión entre a molécula diana que debe ser separada e a molécula ligadora situada sobre as esferiñas da columna pode ser modelada usando unha simple reacción de equilibrio Keq [CS]/([C][S]), onde Keq é a constante de equilibrio, [C] e [S] son as concentracións da molécula diana e a molécula ligadora situada sobre a resina da columna, respectivamente. [CS] é a concentración do complexo da molécula diana unida á resina da columna.
Usando isto como unha base, poden utilizarse tres isotermas para describir a dinámica de unión dunha columna de cromatografía: linear, Langmuir e Freundlich.
A isoterma linear ocorre cando a concentración de soluto necesaria para ser purificada é moi pequena en relación coa molécula ligadora. Así, o equilibrio pode definirse como:
[CS] Keq[C].
Para usos a escala industrial, as moléculas ligadoras totais sobre as esferas da resina da columna deben ser tidas en conta porque os sitios desocupados deben considerarse. A isoterma de Langmuir e a de Freundlich son útiles para describir este equilibrio.
Isoterma de Langmuir:
[CS] (KeqStot[C])/(1 + Keq[C]), onde Stot é o total de moléculas ligadoras situadas sobre as esferas.
Isoterma de Freundlich:
[CS] Keq[C]1/n
A isoterma de Freundlich é utilizada cando a columna pode unirse a moitas mostras diferentes da solución que deben ser purificadas. Como as diferentes mostras teñen constantes de unión ás esferas diferentes, hai moitas Keq distintas. Por tanto, a isoterma de Langmuir non é un bo modelo para a unión neste caso.