Microsatélite (ADN)

Para os satélites espaciais pequenos ver satélite artificial.
En bioloxía molecular e xenética os microsatélites do ADN, tamén chamados repeticións de secuencia simple (SSR, simple sequence repeats) ou repeticións en tándem curtas (STR, short tandem repeats), son secuencias repetidas de entre 2 e 6 pares de bases de lonxitude que se encontran no ADN. É un tipo de repeticións en tándem de número variable (VNTR), as cales poden ter distintos tamaños; neste caso son as de tamaño curto.
Os microsatélites non presentan dominancia. Utilízanse como marcadores moleculares na análise de STR, que se usa para estudos forenses, de parentesco ou de poboación. Tamén se poden utilizar para estudos de duplicación xénica ou delecións, selección asistida por marcador, e pegada xenética. Introdución
Un exemplo común de microsatélite é unha repetición (CA)n, na cal n varía nos distintos alelos. Estes marcadores adoitan presentar altos niveis de polimorfismo intra e interespecífico, especialmente cando o número de repeticións é de 10 ou máis. A secuencia repetida é normalmente simple, e consta xeralmente de dous, tres ou catro nucleótidos (repeticións de di-, tri-, e tetranucleótido, respectivamente), e a secuencia pode estar repetida de 3 a 100 veces, e os loci máis grandes teñen xeralmente máis alelos debido ao maior potencial de esvaramento ou slippage (véxase máis abaixo). As repetición do dinucleótido CA son moi frecuentes no xenoma humano e no doutros organismos, e están presentes cada poucos miles de pares de bases. Como adoita haber moitos alelos para un locus microsatélite, os xenotipos dunha árbore xenealóxica son xeralmente moi informativos, e normalmente pode identificarse o proxenitor dun alelo particular. Deste modo, os microsatélites son ideais para determinar a paternidade, estudos de xenética de poboacións e mapado de recombinación. É tamén o único marcador molecular que dá pistas sobre que alelos están máis estreitamente relacionados. Os microsatélites son tamén preditores da densidade de SNP, xa que as rexións de miles de nucleótidos de lonxitude que flanquean os microsatélites teñen unha densidade incrementada ou diminuída de SNPs dependendo da secuencia do microsatélite.
A variabilidade de microsatélites débese a unha maior taxa de mutación comparada coa doutras rexións neutras do ADN. Estas altas taxas de mutación poden explicarse na maior parte dos casos por apareamento incorrecto por esvaramento de febra (slippage) durante a replicación do ADN nunha soa febra do ADN. A mutación pode tamén ocorrer durante a recombinación xenética meiótica, aínda que as distribucións xenómicas de microsatélites están asociadas con sitios de recombinación máis probablemente como resultado da implicación de secuencias repetitivas na recombinación e non como consecuencia dela. Algúns erros de slippage son rectificados polos mecanismos de corrección de probas no núcleo celular, pero algunhas mutacións poden escapar á reparación. O tamaño da unidade de repetición, o número de repeticións e a presenza de repeticións variantes son factores importantes, xunto coa frecuencia de transcrición na área da repetición do ADN. A interrución dos microsatélites, quizais debido a mutación, pode orixinar un polimorfismo reducido. Porén, este mesmo mecanismo pode levar ocasionalmente a unha amplificación incorrecta de microsatélites; se o slippage ocorre ao inicio ou durante a PCR, poden amplificarse microsatélites de lonxitudes incorrectas. Análise de microsatélites
Amplificación
Os microsatélites poden ser amplificados para a súa identificación pola reacción en cadea da polimerase (PCR), utilizando as secuencias únicas das rexións flanqueantes como cebadores. O ADN é desnaturalizado repetidamente a altas temperaturas para separar as febras da dobre hélice do ADN, despois arrefríase para permitir o annealing dos cebadores e a extensión de secuencias de nucleótidos a través do microsatélite. Este proceso dá lugar á produción de suficiente ADN como para que sexa visible en electroforese en xel de agarosa ou de poliacrilamida; para facer a amplificación só cómpren pequenas cantidades iniciais de ADN porque deste modo o termociclado produce un incremento expoñencial do segmento replicado. Co desenvolvemento da tecnoloxía da PCR, os cebadores que flanquean os loci microsatélites son rápidos e simples de usar, pero o desenvolvemento de cebadores que funcionen correctamente é a miúdo un proceso custoso e tedioso.
Creación de cebadores de microsatélites
Cando se está a procurar marcadores microsatélites situados en rexións específicas do xenoma, por exemplo dentro dun determinado exón dun xene, os cebadores poden ser designados manualmente. Isto implica examinar a secuencia do ADN xenómico na procura de repeticións microsatélite, o cal pode facerse tamén con ferramentas automatizadas como repeat masker. Unha vez que se determinaron os microsatélites potencialmente útiles (eliminando os que non son útiles como os que teñen insercións aleatorias dentro da rexión repetida), as secuencias flanqueantes poden utilizarse para deseñar cebadores oligonucleótidos que servirán para amplificar a repetición microsatélite específica nunha reacción de PCR.
Os cebadores microsatélites aleatorios poden desenvolverse clonando segmentos de ADN aleatorios a partir da especie focal. Estes segmentos aleatorios son inseridos nun vector de clonación de tipo plásmido ou bacteriófago, o cal á súa vez é implantado na bacteria Escherichia coli. Cultívanse as colonias, e son examinadas con secuencias de oligonucleótidos etiquetadas fluorescentemente que se hibridarán a unha repetición microsatélite, se está presente no segmento de ADN. Se se obteñen clons positivos, secuénciase o ADN e elíxense os cebadores de PCR a partir das secuencias que flanquean ditas rexións para determinar un locus específico. Este proceso implica un significativo ensaio e erro por parte dos investigadores, xa que deben predicirse as secuencias repetidas microsatélite, e os cebadores que foron illados aleatoriamente poden non presentar un polimorfismo significativo. Os loci microsatélite están amplamente distribuídos polo xenoma e poden illarse a partir do ADN semidegradado de espécimes máis vellos, xa que todo o que se precisa é un substrato axeitado para a amplificación por medio da PCR.
Outras técnicas máis recentes implican o uso de secuencias de oligonucleótidos que constan de repeticións que son complementarias das repeticións no microsatélite para "enriquecer" o ADN extraído (enriquecemento de microsatélite). A sonda oligonucleotídica hibrida coa repetición do microsatélite, e despois o complexo sonda/microsatélite é sacado da solución. O ADN enriquecido é despois clonado como é normal, pero a proporción de éxito será agora moito maior, reducindo drasticamente o tempo requirido para desenvolver as rexións para o seu uso. Porén, decidir as sondas que se usarán pode ser un proceso de ensaio e erro.
ISSR-PCR
ISSR ou inter-repeticións de secuencias simples (inter-simple sequence repeats) é un termo que se utiliza para referirse a unha rexión do xenoma situada entre loci microsatélites. As secuencias complementarias de dous microsatelites veciños utilízanse como cebadores de PCR; amplifícase a rexión variable entre eles. A duración limitada dos ciclos de amplificación durante a PCR impide unha excesiva replicación de secuencias excesivamente próximas de ADN, polo que o resultado será unha mestura dunha variedade de febras de ADN amplificadas, as cales son xeralmente curtas, pero poden variar moito en lonxitude.
As secuencias amplificadas por ISSR-PCR poden utilizarse para obter a pegada xenética. Como unha ISSR pode ser unha rexión conservada ou non conservada, esta técnica non é útil para distinguir individuos, senón principalmente para análises filoxeográficas ou de delimitación de especies; a diversidade de secuencia é menor que na SSR-PCR, pero é maior que en secuencias xénicas reais. Ademais, a secuenciación de microsatélites e a secuenciación ISSR axúdanse mutuamente, xa que unha produce os cebadores para a outra.
Contido Microsatélite Global con micromatrices
Usando unha matriz (array) de estilo CGH fabricada por Nimblgen/Roche pode medirse rapidamente o contido completo de microsatélites dun xenoma, de forma barata e en masa. É importante salientar que este enfoque non avalía o xenotipo dun locus calquera determinado, senón que suma as contribucións para un motivo repetido dado de moitas posicións nas que está presente ese motivo en todo o xenoma. Esta matriz avalía todas as repeticións de 1 a 6 mer (e as súas permutacións cíclicas e complementos). Este enfoque foi utilizado para situar calquera especie, secuenciada ou non, nunha árbore taxonómica. Esa árbore correspóndese de forma precisa coas relacións filoxeneticas actualmente aceptadas. Con esta nova plataforma tecnolóxica é posible estudar as variacións xenómicas nun individuo naquelas características xenómicas que son máis variables, os microsatélites.
Os estudos que utilizan matrices de contido microsatélite global indican que hai importantes novos mecanismos de desestabilización xenómicos que modifican globalmente os microsatélites, alterando así potencialmente un número moi grande de xenes. Estas variacións a escala global en mostras de pacientes tumorais e da liña xerminal poden exercer importantes papeis no proceso do cancro, potencialmente valiosos na diagnose, prognose e terapia. Limitacións
Os microsatélites son marcadores moleculares versátiles, particularmente para análise de poboacións, pero teñen tamén limitacións. Os microsatélites desenvolvidos para especies particulares poden a miúdo aplicarse a especies moi relacionadas, pero a porcentaxe de loci que amplifican con éxito pode decrecer cando se incrementa a distancia xenética. As mutacións puntuais no sitio de annealing do cebador en ditas especies poden facer que aparezan "alelos nulos" nos puntos onde os microsatélites non se poden amplificar nos ensaios de PCR. Os alelos nulos poden atribuírse a varios fenómenos. A diverxencia de secuencia en rexións flanqueantes pode orixinar un alimneamento do cebador deficiente, especialmente na sección 3', onde comeza a extensión; a amplificación preferencial de alelos de determinados tamaños debido á natureza competitiva da PCR que pode facer que individuos heterocigotos sexan contabilizados como homocigotos (nulo parcial). Os fallos na PCR poden producirse cando falla a amplificación de loci particulares, mentres que outros se amplifcan máis eficientemente e poden parecer homocigotos nun ensaio en xel, cando en realidade son heterocigotos no xenoma. Os alelos nulos complican a interpretación das frecuencias de alelos microsatélites e provocan que se fagan estimacións erradas do parentesco. Ademais, os efectos estocásticos da mostraxe que se producen durante o apareamento poden cambiar as frecuencias alélicas dun modo que é moi similar ao efecto dos alelos nulos: unha frecuencia excesiva de homocigotos que causa desviacións do equilibrio de Hardy-Weinberg esperado. Como os alelos nulos son un problema técnico e os efectos de mostraxe que ocorren durante o apareamento son unha propiedade biolóxica real dunha poboación, é con frecuencia moi importante distinguir entre eles se se observa un exceso de homocigotos.
Cando se usan microsatélites para comparar especies, os loci homólogos poden ser doadamente amplificados en especies relacionadas, pero o número de loci que se amplifican con éxito durante a PCR pode diminuír ao aumentar a distancia xenética entre as especies en cuestión. A mutación nos alelos microsatélites está nesgada no sentido de que os alelos satélites máis longos conteñen máis bases, e é, por tanto, probable que sexan copiados incorrectamente na replicación do ADN. Os alelos máis pequenos tamén tenden a aumentar de tamaño, mentres que os alelos máis grandes tenden a reducir o seu tamaño, xa que poden estar suxeitos a un límite no seu tamaño superior; esta restrición está determinada pero os posibles valores non foron aínda especificados. Se hai unha diferenza grande de tamaños entre alelos individuais, entón podería haber un aumento da inestabilidade durante a recombinación e a meiose. En células tumorais, onde os controis na replicación poden estar danados, os microsatélites poden aumentar ou perderse a unha frecuencia especialmente alta durante cada rolda de mitose. Xa que logo, unha liña celular tumoral podería mostrar unha pegada xenética diferente á do tecido hóspede.
Mecanismos do cambio
A causa máis común dos cambios de lonxitude en repeticións de secuencias curtas é o esvaramento (slippage) na replicación, causado por correspondencias incorrectas entre febras de ADN mentres se replican durante a meiose. Tipicamente, o slippage en cada microsatélite ocorre unha vez cada 1. 000 xeracións. Os cambios por slippage no ADN repetitivo son varias ordes de magnitude máis comúns que as mutacións puntuais noutras partes do xenoma. A maioría do slippage dá lugar a un cambio nunha soa unidade repetida, e as taxas de slippage varían para diferentes tamaños das unidades repetidas, e en diferentes especies.
As repeticións de secuencias curtas están distribuídas por todo o xenoma. Presumiblemente, os seus medios de expresión máis probables variarán dependendo da súa localización.
En proteínas
En mamíferos, do 20% ao 40% das proteínas conteñen secuencias repetidas de aminoácidos causadas por curtas secuencias repetidas. A maioría das secuencias curtas repetidas nas porcións do xenoma que codifican proteínas teñen unha unidade repetida de tres nucleótidos, xa que esa lonxitude non causará mutacións de cambio de pauta. Cada secuencia trinucleotídica repetida é transcrita nunha serie repetida que codifica o mesmo aminoácido. Nos lévedos, os aminoácidos que máis comunmente se repiten son a glutamina, ácido glutámico, asparaxina, ácido aspártico e serina. Estes segmentos repetidos poden afectar ás propiedades físicas e químicas das proteínas, coa posibilidade de producir cambios graduais e preditibles na acción da proteína.
Por exemplo, os cambios de lonxitude en rexións repetidas en tándem no xene Runx2 producen diferenzas na lonxitude da face dos cans domésticos (Canis familiaris), cunha asociación entre lonxitudes de secuencias maiores e caras maiores. Esta asociación tamén se aplica a unha ampla variedade de especies da orde Carnivora. Os cambios de lonxitude en tractos polialanina no xene HoxA13 están ligados á síndrome de Mans-Pés-Xenitais, un trastorno do desenvolvemento en humanos. Os cambios de lonxitude noutros tripletes repetidos están ligados a máis de 40 doenzas neurolóxicas humanas.
Os cambios evolutivos debidos a slippage na replicación ocorren tamén en organismos máis simples. Por exemplo, os cambios na lonxitude dos microsatélites son comíns en proteínas da membrana superficial en lévedos, o que dá lugar a unha rápida evolución nas propiedades da célula. Especificamente, os cambios de lonxitude no xene FLO1 controlan o nivel de adhesión aos substratos. As repeticións de secuencias curtas tamén proporcionan un cambio evolutivo rápido das proteínas superficiais en bacterias; isto pode permitirlles afrontar os cambios inmunolóxicos que teñen lugar nos seus hóspedes. Isto coñécese como hipótese da Raína Vermella. Os cambios de lonxitude en repeticións de secuencias curtas no fungo Neurospora crassa controlan a duración dos ciclos do seu reloxo circadiano. .
Regulación xénica
Os cambios de lonxitude dos microsatélites nos promotores e outras rexións cis-regulatorias poden tamén cambiar a expresión xénica rapidamente entre xeracións. O xenoma humano contén moitas (>16. 000) repeticións de secuencias curtas en rexións regulatorias, que proporcionan "nodos de afinación" na expresión de moitos xenes.
Os cambios de lonxitude en SSRs bacterianos poden afectar á formación de fimbrias en Haemophilus influenzae, ao alteraren o espazado do promotor. Os minisatélites están tamén ligados a variacións abundantes en rexións de control cis-regulatorias no xenoma humano. E os microsatélites da rexión de control do xene do receptor da vasopresina 1a en ratiños de campo inflúe no seu comportamento social, e nivel de monogamia.
Nos intróns
Os microsatélites situados nos intróns tamén inflúen no fenotipo por mecanismos que non se coñecen. Por exemplo, a expansión do triplete GAA no primeiro intrón do xene X25 parece interferir coa transcrición, e causa a ataxia de Friedreich. As repeticións en tándem no primeiro intrón do xene da asparaxina sintetase están ligadas á leucemia linfoblástica. Un polimorfismo repetido no cuarto intrón do xene NOS3 está ligado á hipertensión na poboación tunisiana. A redución da lonxitude de rexións con repeticións no xene EGFR están ligadas co osteosarcoma.
En transposóns
Os microsatélites están distribuídos por todo o xenoma e os diversos tipos de elementos transpoñibles (transposóns) do xenoma humano supoñen case o 50% do xenoma, e moitos deles conteñen ADN repetitivo. É probable que as repeticións de secuencias curtas nestas localizacións estean tamén implicadas na regulación da expresión xénica. Análise forense
A análise de microsatélites ou análise de STR é unha tecnoloxía relativamente nova no campo forense, que se xeneralizou na última metade da década de 1990. Utilízase para obter a pegada xenética de individuos. Os microsatélites que se usan hoxe en análise forense son todos repeticións de tetra ou pentanucleótidos, xa que estes producen un alto grao de datos libres de erros á vez que son robustos dabondo como para sobrevivir á degradación en condicións non ideais. As secuencias repetidas máis curtas tenden a orixinar artefactos como o "tatexo" de PCR (stutter) e amplificación preferencial, e ademais varias doenzas xenéticas están asociadas con repeticións de trinucleótidos como a enfermidade de Huntington. As secuencias repetidas máis longas sofren unha maior degradación ambiental e non se amplifican pola PCR como as secuencias máis curtas.
A análise realízase extraendo o ADN nuclear das células dunha mostra forense, e despois amplificando rexións polimórficas específicas do ADN extraído por medio da PCR. Unha vez amplificadas estas secuencias, resólvense ou ben por electroforese en xel ou por electroforese capilar, o cal permitirá ao analista determinar cantas repeticións hai da secuencia microsatélite en cuestión. Se o ADN se resolveu por electroforese en xel, o ADN pode visualizarse por tinguidura de prata (que ten baixa sensibilidade, é segura e barata), ou por unha tinguidura intercalada, por exemplo con bromuro de etidio (que é bastante sensible, con riscos moderados para a saúde, e barata), ou nos laboratorios forenses máis modernos por tinguidura fluorescente (que é moi sensible e segura, pero cara). Os instrumentos construídos para resolver os fragmentos microsatélites por electroforese capilar tamén usan tinguiduras fluorescentes con grande efectividade. Tamén se utiliza para o seguimento de pacientes de transplante de medula ósea.
Os perfís de ADN almacénase en bases de datos nacionais. En España leva funcionando desde 2007 unha base de datos que en 2011 tiña 183. 000 fichas e está conectada con outras da Unión Europea, pero a máis ampla do mundo é a base CODIS (Combined DNA Index System) dos Estados Unidos con 5 millóns de perfís en 2007. Outra das máis grandes é a base de datos británica NDNAD (UK National DNA Database). O sistema británico examina nas mostras 10 loci STR e mais a proba de sexo (sistema SGM+), mentres que o norteamericano examina 13.
Nas probas xenealóxicas de ADN utilízanse con frecuencia os Y-STRs (microsatélites no cromosoma Y).