ADN recombinante

O ADN recombinante é unha molécula de ADN formada por medio de métodos de laboratorio de recombinación xenética (como a clonación molecular) na que se xuntan materiais xenéticos de dúas ou máis fontes, creando secuencias de ADN que doutro modo non formarían parte do xenoma. Xeralmente abréviase como ADNr ou rDNA (pero estas siglas tamén se usan para o ADN dos xenes que codifican o ARN ribosómico). Formar un ADN recombinante é posible porque as moléculas de ADN de todos os organismos comparten a mesma estrutura química global e só difiren na secuencia de nucleótidos. As moléculas de ADN recombinante denomínanse ás veces ADN quimérico, porque poden facerse con material de dúas especies, como as míticas quimeras. A tecnoloxía do ADN recombinante usa secuencias palindrómicas e produce extremos coherentes ou romos no ADN para crear o ADN recombinante.
As secuencias de ADN usadas na construción de moléculas de ADN recombinante poden proceder de calquera especie. Por exemplo, ADN dunha planta pode unirse con ADN bacteriano, ou ADN humano con ADN de fungo. Ademais, poden crearse secuencias de ADN que non aparecen en ningunha parte na natureza por síntese química de ADN e despois poden incorporarse ás moléculas recombinantes. Co uso da tecnoloxía do ADN recombinante e do ADN sintético, literalmente pode crearse calquera secuencia de ADN e introducila nunha ampla variedade de organismos vivos.
As proteínas que poden orixinarse da expresión dun ADN recombinante nas células vivas denomínanse proteínas recombinantes. Cando o ADN recombinante que codifica proteínas se introduce nun organismo hóspede, non necesariamente se vai producir a proteína recombinante. A expresión de proteínas alleas require o uso de vectores de expresión especializados e adoita necesitar unha significativa reestruturación por secuencias codificantes alleas.
A creación de ADN recombinante é distinta do creación de ADN por recombinación xenética natural, porque a primeira se orixina por medios artificiais no tubo de ensaio, mentres que a última é un proceso biolóxico normal no que se remesturan secuencias de ADN xa existentes dentro dun organismo. Creación
A clonación molecular é o método de laboratorio usado para crear ADN recombinante. É un dos dous métodos máis amplamente usados, xunto coa reacción en cadea da polimerase (PCR), utilizada para dirixir a replicación de calquera secuencia específica de ADN desexada. Hai dúas diferenzas fundamentais entre os dous métodos. Unha é que a clonación molecular implica a replicación do ADN dentro dunha célula viva, mentres que a PCR replica o ADN nun tubo de ensaio, sen células vivas. Outra diferenza é que a clonación implica cortar e pegar secuencias de ADN, mentres que a PCR amplifica unha secuencia existente copiándoa.
A formación do ADN recombinante require un vector de clonación, unha molécula de ADN que leve o ADN ao interior da célula viva. Os vectores xeralmente derivan de plásmidos ou virus e son segmentos relativamente pequenos de ADN que conteñen os sinais xenéticos necesarios para a replicación, así como elementos adicionais convenientes no ADN alleo inserido, que identifican as células que conteñen o ADN recombinante e, cando é apropiado, expresan o ADN alleo. A elección do vector para unha clonación molecular depende do organismo hóspede utilizado, o tamaño do ADN que vai ser clonado e de se o ADN alleo vai ser expresado e como. Os segmentos de ADN poden combinarse usando unha variedade de métodos, como a clonación con encimas de restrición/ligases ou a ensamblaxe de Gibson.
Nos protocolos de clonación estándar, a clonación dun fragmento de ADN implica esencialmente sete pasos: (1) Elección do organismo hóspede e do vector de clonación, (2) Preparación do ADN vector, (3) Preparación do ADN que vai ser clonado, (4) Creación do ADN recombinante, (5) Introdución do ADN recombinante no organismo hóspede, (6) Selección dos organismos que conteñen o ADN recombinante e (7) Cribado buscando os clons co ADN desexado inserido e as súas propiedades biolóxicas. (Para máis detalle ver clonación molecular). Expresión
Despois de transplantalo ao organismo hóspede, o ADN alleo contido no construto do ADN recombinante pode ser expresado ou non. É dicir, o ADN pode simplemente replicarse sen expresarse ou pode ser transcrito e traducido e acaba orixinando unha proteína recombinante. Xeralmente, a expresión dun xene alleo require a reestruturación do xene para que inclúa secuencias que son necesarias para a produción da molécula de ARNm que servirá para a tradución (por exemplo, un promotor, un sinal de iniciación da tradución e un terminador da transcrición). Poden facerse cambios espacíficos no organismo hóspede para mellorar a expresión do xene ectópico. Ademais, os cambios poden ser necesarios nas secuencias codificantes tamén, para optimizar a tradución, facer que a proteína sexa soluble, dirixir a proteína recombinante a unha localización celular ou extracelular axeitada e estabilizar a proteína ante a súa posible degradación. Propiedades dos organismos que conteñen ADN recombinante
Na maioría dos casos, os organismos que conteñen ADN recombinante teñen aparentemente fenotipos normais. É dicir, a súa aparencia, comportamento e metabolismo non quedan normalmente cambiados e o único modo de demostrar a presenza de secuencias recombianntes é examinar o propio ADN, normalmente usando un test de PCR. Hai tamén excepcións significativas, que se discuten máis abaixo.
Se as secuencias de ADN recombinante codifican un xene que se expresa, entón pode detectarse a presenza de ARN e/ou produtos proteicos do xene recombinante, xeralmente usando as técnicas da RT-PCR ou do western blot. Os cambios fenotípicos grandes non son o normal, a non ser que o xene recombinante fose elixido e modificado para xerar unha actividade biolóxica no organismo hóspede. Os fenotipos adicionais que se poden encontrar son toxicidades no organismo hóspede inducidas polo produto recombinante, especialmente se este é sobreexpresado ou expresado en células ou tecidos inapropiados.
Nalgúns casos, o ADN recombinante pode ter efectos prexudiciais incluso se non é expresado. Un mecanismo polo cal pode ocorrer isto é a inactivación inseccional, na cal o ADN recombinante queda inserido nun xene da célula hóspede. Nalgúns casos, pode utilizarse este fenómeno para facer un knockout de xenes para determinar a súa función biolóxica e importancia. Outro mecanismo polo cal a inserción do ADN recombinante no ADN cromosómico pode afectar á expresión xénica é pola activación inapropiada de xenes da célula hóspede que previamente non se expresaban. Isto pode acontecer, por exemplo, cando un fragmento de ADN recombinante que contén un promotor activo queda localizado preto dun xene da célula hóspede previamente silencioso ou cando un xene da célula hóspede que funciona restrinxindo a expresión xénica sofre unha inactivación insercional polo ADN recombinante. Usos
O ADN recombinante utilízase moito en biotecnoloxía, medicina e investigación. Hoxe, as proteínas recombinantes e outros produtos orixinados por medio da tecnoloxía do ADN encóntranse practicamente en todas as farmacias, consultas médicas ou veterinarias, laboratorios de probas médicas e de investigación biolóxica. Ademais, os organismos que foron manipulados usando a tecnoloxía do ADN recombinante ou os produtos derivados de ditos organismos atoparon un lugar nas granxas, supermercados, caixas de urxencia caseiras e mesmo en tendas de animais de compañía, como os peixes de acuario GloFish e outros animais modificados xeneticamente.
A aplicación máis común do ADN recombinante é na investigación básica, na cal a tecnoloxía é importante para os traballos máis actuais en ciencias biolóxicas e médicas. O ADN recombinante utilízase para identificar, mapar e secuenciar xenes e para determinar as súas funcións. As sondas de ADN recombinante empréganse para analizar a expresión xénica en células concretas e en todos os tecidos do organismo completo. As proteínas recombinnates son amplamente utilizadas como reactivos en experimentos de laboratorio e para xerar sondas de anticorpos para examinar a síntese de proteínas dentro das células e organismos.
Outras moitas aplicacións prácticas do ADN recombinante poden encontrarse na industria, produción de alimentos, medicina humana e veterinaria, agricultura e bioenxeñaría. Algúns exemplos indícanse a continuación. Quimosina recombinante
É un encima atopado no callo dos ruminantes necesario para a fabricación de queixo. Foi o primeiro aditivo alimentario producido por enxeñaría xenética que foi usado comercialmente. Tradicionalmente, obtíñase a quimosina do callo, unha preparación derivada do cuarto estómago das tenreiras en lactación. Os científicos transformaron por enxeñaría unha cepa non patóxena (K-12) da bacteria Escherichia coli para a produción a grande escala no laboratorio do encima. Ese encima recombinante producido microbioloxicamente, totalmente idéntico ao encima extraído das tenreiras, costa menos e pode producirse en grandes cantidades. Por exemplo, nos Estados Unidos un 60% do queixo duro faise con quimosina obtida por enxeñaria xenética. En 1990, a FDA deulle o status de "recoñecida xeralmente como segura" baseándose nos datos que se teñen sobre a seguridade do encima.
Insulina humana recombinante
Esta insulina substituíu case completamente a insulina que se obtiña de fontes animais (por exemplo de porco e vaca) para o tratamento da diabetes insulinodependente. Utilízanse amplamente diversas preparacións de insulina recombinante. A insulina recombinante é sintetizada inserindo o xene da insulina humana na bacteria E. coli ou no lévedo (Saccharomyces cerevisiae) que despois produce insulina para o uso humano. Esta insulina é igual á humana, xa que se orixina a partir do xene humano, mentres que a que se usaba antes, por exemplo de porco, era parecida e funcional, pero non idéntica.
Hormona do crecemento (HGH, somatotropina) humana recombinante
Administrada a pacientes cuxas glándulas pituitarias xeran cantidades insuficientes para soster un crecemento e desenvolvemento normais. Antes de que se dispuxese desta HGH recombinante, a HGH para uso terapéutico extraíase de glándulas pituitarias de cadáveres. Esta práctica un tanto insegura causou que algúns pacientes desenvolvesen a enfermidade de Creutzfeldt–Jakob. A HGH recombinante eliminou este problema e é a que agora se utiliza terapeuticamente. Tamén foi utilizada indebidamente por atletas e outros para mellorar o seu rendemento.
Factor VIII de coagulación sanguínea recombinante
É unha proteína que intervén na coagulación do sangue que se aministra a pacientes con certos trastornos hemorráxicos hemofílicos, que non poden producir o factor VIII en cantidades suficientes como para ter unha boa coagulación sanguínea. Antes do desenvolvemento do factor VIII recombinante, esta proteína obtíñase procesando grandes cantidades de sangue humano de múltiples doantes, o cal supoñía un alto risco de transmisión de infeccións transmitidas polo sangue, por exemplo o VIH-SIDA e a hepatite B.
Vacina da hepatite B recombinante
A hepatite B conrólase coa vacina da hepatite B recombinante, que contén unha forma do antíxeno de superficie do virus da hepatite B cuxa produción se realiza en células de lévedos. O desenvolvemento da vacina de subunidades recombinante foi un importante e necesario desenvolvemento porque o virus da hepatite B, a diferenza dos virus comúns como o virus da polio, non pode cultivarse in vitro.
Diagnóstico da infección por VIH
Todos os tres grandes métodos para diagnosticar a infección por VIH desenvolvéronse utilizando ADN recombinante. A proba de anticorpos (ELISA ou western blot) usa unha proteína do VIH recombinante para comprobar a presenza no corpo de anticorpos contra o virus. O test de ADN é outra proba na que se busca a presenza de material xenético do VIH usando a RT-PCR (reacción en cadea da polimerase con transcriptase inversa). O desenvolvemento da proba de RT-PCR fíxose posible pola clonación molecular e a análise de secuencias de xenomas de VIH.
Arroz dourado (Golden rice)
É unha variedade recombinante de arroz que foi preparada por enxeñaría para que expresase os encimas responsables da biosíntese do β-caroteno. Esta variedade de arroz é prometedor para reducir a incidencia da deficiencia de vitamina A na poboación mundial. O arroz dourado non se produce actualmente porque está pendente da resolución da súa propiedade intelectual e regulatoria. issues.
Cultivos resistentes a herbicidas
Desenvolvéronse variedades comerciais de importantes plantas de cultivo agrícola (como soia, millo, sorgo, colza, alfalfa e algodón) para que incorporasen un xene recombinante que lles dá resistencia ao herbicida glifosato (comercializado como Roundup), e simplifica o control de malas herbas aplicando o glifosato nos campos, que matará as malas herbas pero non a planta cultivada. Estas variedades de plantas están xa en uso comercial en varios países.
Plantas resistentes aos insectos
Bacillus thuringeiensis é unha bacteria que produce de forma natural unha proteína chamada toxina Bt, que ten propiedades insecticidas. Tratamentos coa bacteria e os seus produtos estiveron aplicándose á agricultura e xardinaría como loita contra as pragas de insectos desde hai moitos anos, pero recentemente creáronse plantas que expresan directamente unha forma recombinante da proteína da bacteria, que pode controlar efectivamente algúns predadores de insectos. Algúns problemas ambientais asociados co uso destas plantas transxénicas aínda non se resolveron totalmente. Historia
A idea do ADN recombinante foi proposta primeiramenre por Peter Lobban, un estudante graduado do Prof. Dale Kaiser no Departamento de Bioquímica da Escola de Medicina da Universidade de Stanford. A primeira publicación que describía a produción con éxito e a replicación intracelular de ADN recombinante apareceu en 1972 e 1973, na Universidade de Stanford e na UCSF. En 1980 Paul Berg, un profesor do Departamento de Bioquímica en Stanford e autor dun dos primeiros artigos foi galardoado co Premio Nobel de Química polo seu traballo sobre ácidos nucleicos "con especial consideración ao ADN recombinante". Werner Arber, Hamilton Smith e Daniel Nathans compartiron en 1978 o Premio Nobel de Medicina polo descubrimento das endonucleases de restrición, que melloraron as técnicas da tecnoloxía do ADN recombinante.
A Universidade de Stanford solicitou unha patente nos Estados Unidos sobre o ADN recombinante en 1974, mencionando como inventores a Herbert W. Boyer (profesor da University de California, San Francisco) e a Stanley N. Cohen (profesor en Stanford); esta patente foi concedida en 1980. O primeiro fármaco que recibiu licenza xerado usando a tecnoloxía do ADN recombinante foi a insulina humana, desenvolvida por Genentech e con licenza de Eli Lilly and Company. Polémica
Os científicos asociados co desenvolvemento inicial dos métodos do ADN recombinante recoñeceron que existía a posibilidade de que os organismos que contiñan ADN recombinante adquirisen propiedades non desexadas. En 1975 na Conferencia de Asilomar sobre ADN recombinante discutíronse estas cuestións e iniciouse unha moratoria voluntaria nas investigacións sobre ADN recombinante para aqueles experimentos que eran considerados especialmente perigosos. Esta moratoria foi amplamente obsevada ata que o Institutos Nacionais da Saúde (EUA) desenvolveron e sacaron unha serie de directrices formais para traballar co ADN recombinante. Hoxe, as moléculas de ADN recombinante e as proetínas recombinantes xeralmente non se consideran perigosas. Porén, segue habendo certa preocupación sobre os organismos que expresan ADN recombinante, especialmente cando son sacados do laboratorio e introducidos no medio ambiente ou na cadea alimentaria. Ademais, preocupan os subprodutos da produción biofarmacéutica, nos que o ADN recombinante orixina proteínas específicas. O principal subproduto, denominado proteína da célula hóspede, procde dun sistema de expresión do hóspede e supón unha ameaza para a saúde do paciente e o medio ambiente global.