Diapédese

A diapédese, tamén chamada extravasación dos leucocitos ou cadoiro de adhesión dos leucocitos, é o movemento de saída dos leucocitos (glóbulos brancos) fóra do sistema circulatorio, atravesando a parede dos vasos sanguíneos máis finos para dirixirse a un sitio nos tecidos onde hai un dano ou infección. Este proceso forma parte da resposta inmunitaria innata e implica o recrutamento de leucocitos non específicos. Os monocitos, un tipo de glóbulo branco, tamén usan este proceso en ausencia de infección ou dano nos tecidos durante a súa conversión en macrófagos. Introdución
A extravasación dos leucocitos ocorre principalmente en vénulas post-capilares, onde as forzas de cizalla hemodinámicas están minimizadas. Este proceso comprende varias etapas: Quimioatracción
Adhesión por rodadura
Adhesión firme
Transmigración (endotelial)
Demostrouse que o recrutamento de leucocitos queda detido se calquera destes pasos se suprime.
Os leucocitos realizan a maior parte das súas funcións nos tecidos. Entre as súas funcións están a fagocitose de partículas estrañas, a produción de anticorpos, a secreción de causantes da resposta inflamatoria (histamina e heparina), e a neutralización da histamina. En xeral, os leucocitos interveñen na defensa do organismo e protéxeno das doenzas ao inhibiren ou promoveren as respostas inflamatorias. Os leucocitos utilizan o sangue como medio de transporte par chegar a un determinado tecido do corpo. Velaquí un breve resumo de cada un dos catro pasos que se pensa seguen normalmente os leucocitos durante a súa extravasación:
Quimioatracción
Despois do recoñecemento e activación de patóxenos, os macrófagos residentes no tecido afectado liberan citocinas como a IL-1, o TNFα e quimiocinas. A IL-1, o TNFα e C5a causan que as células endoteliais dos vasos sanguíneos que están preto do sitio de infección expresen moléculas de adhesión celular, como as selectinas. Os leucocitos circulantes son atraídos cara ao sitio de lesión ou infección debido á presenza de quimiocinas.
Adhesión por rodadura
Como un velcro, os ligandos carbohidratos dos leucocitos circulantes únense a moléculas de selectina na parede interna do vaso, con afinidade marxinal. Isto causa que os leucocitos se movan máis lentamente e empecen a rodar pola superficie interna da parede do vaso. Durante este movemento rodante fórmanse e rompen enlaces transitorios entre as selectinas e os seus ligandos.
Por exemplo, o ligando carbohidrato para a P-selectina chamado PSGL-1 é expresado en diferentes tipos de leucocitos. A unión do PSGL-1 do leucocito á P-selectina da célula endotelial permite que o leucocito rode ao longo da superficie endotelial. Esta interacción pode ser afinada polo padrón de glicosilación de PSGL-1, dado que certas glicovariantes do PSGL-1 teñen afinidades específicas para diferentes selectinas, o que permite en certos casos que as células migren a sitios específicos do corpo (por exemplo a pel).
Adhesión firme
Ao mesmo tempo, as quimiocinas liberadas polos macrófagos activan os leucocitos rodantes e causan que as moléculas integrinas da superficie cambien do estado de baixa afinidade no que están por defecto ao estado de alta afinidade. Isto é axudado pola activación xustácrina de integrinas por quimiocinas e factores solubles liberados polas células endoteliais. No estado activado, as integrinas únense firmemente aos receptores complementarios expresados nas células endoteliais con alta afinidade. Isto causa a inmobilización dos leucocitos, que varía en vasos que conteñan diferentes forzas de cizalla do fluxo sanguíneo entrante.
Transmigración
O citoesqueleto dos leuocitos organízase de tal xeito que estes se estenden sobre as células endoteliais. Desta forma, os leucocitos estenden pseudópodos e pasan a través dos ocos entre as células endoteliais. Este paso das células polo vaso intacto denomínase diapédese. Estes ocos entre as células poden formarse polas interaccións dos leucocitos co endotelio, pero tamén autonomamente debido á mecánica endotelial. A transmigración do leucocito ocorre a medida que as proteínas PECAM, que se encontran na superficie do leucocito e da célula endotelial, interaccionan e empurran a célula a través do endotelio. Unha vez que atravesa o endotelio, o leucocito debe penetrar na membrana basal. O mecanismo para a penetración é discutido, mais pode implicar a dixestión proteolítica da membrana, unha forza mecánica ou ambas as cousas. A diapédese é o proceso completo do escape do vaso sanguíneo. Unha vez que están no fluído intersticial, os leucocitos migran ao longo dun gradiente quimiotáctico cara ao sitio de lesión ou infección. Bioloxía molecular
As fases da extravasación dos leucocitos mostradas no esquema da dereita son: aproximación, captura, rodadura, activación, unión, reforzamento da unión e extensión, reptación intravascular, migración paracelular ou migración transcelular.
Selectinas
As selectinas exprésanse pouco despois da activación polas citocinas das células endoteliais realizada polos macrófagos dos tecidos. As células endoteliais activadas expresan inicialmente moléculas de P-selectina, pero dúas horas despois da activación está favorecida a expresión de E-selectina. As selectinas endoteliais únense a carbohidratos das glicoproteínas tansmembrana do leucocito, incluíndo o carbohidrato sialil-LewisX. P-selectinas: A P-selectina exprésase en células endoteliais activadas e plaquetas. A síntese de P-selectina pode ser inducida pola trombina, o leucotrieno B4, o fragmento do complemento C5a, a histamina, o TNFα ou o LPS. Estas citocinas inducen a externalización de corpos de Weibel-Palade nas células endoteliais, presentando as P-selectinas preformadas sobre a superficie das células endoteliais. As P-selectinas únense ao ligando PSGL-1.
E-selectinas: A E-selectina exprésase en células endoteliais activadas. A síntese de E-selectina empeza pouco despois da síntese de P-selectina, inducida por citocinas como IL-1 e TNFα. As E-selectinas únense a PSGL-1 e ESL-1.
L-selectinas: As L-selectinas expéresanse constitutivamente nalgúns leucocitos e sábese que se unen a ligandos como GlyCAM-1, MadCAM-1 e CD34.
A supresión da expresión dalgunhas selectinas ten como resultado unha resposta inmunitaria máis lenta. Se non se produce a L-selectina, a resposta inmune pode ser dez veces máis lenta, xa que as P-selectinas (que tamén as poden producir os leucocitos) se unen unhas a outras. As P-selectinas poden unirse unhas a outras con grande afinidade, pero ocorre menos frecuentemente porque a densidade do sitio do receptor é menor que coas moléculas de E-selectinas, que son máis pequenas. Isto incrementa a velocidade inicial de rodadura dos leucocitos, prolongando a fase de rodadura lenta.
Integrinas
As integrinas implicadas na adhesión celular exprésanse principalmente nos leucocitos. As integrinas β2 dos leucocitos rodantes únense a moléculas de adhesión celular endoteliais, parando o movemento celular. LFA-1 encóntrase nos leucocitos circulantes e únese a ICAM-1 e ICAM-2 nas células endoteliais.
Mac-1 encóntrase en leucocitos circulantes e únese a ICAM-1 nas células endoteliais.
VLA-4 encóntrase nos leucocitos e células endoteliais e facilita a quimiotaxe; tamén se une a VCAM-1.
A activación celular por medio de quimiocinas extracelulares causa que as integrinas β2 preformadas se liberen dos seus almacéns celulares. As moléculas integrinas migran á superficie celular e congréganse en áreas de alta avidez. Os dominios de integrina intracelulares asócianse co citoesqueleto do leucocito coa mediación de factores citosólicos como a talina, a α-actinina e a vinculina. Esta asociación causa un cambio conformacional na estrutura terciaria da integrina, permitindo que o ligando acceda ao sitio de unión. Os catións divalentes (por exemplo o Mg2+) tamén cómpren para a unión integrina-ligando.
Os ligandos de integrina ICAM-1 e VCAM-1 son activados por citocinas inflamatorias, aínda que ICAM-2 exprésase constitutivamente nalgunhas células endoteliais pero son reguladas á baixa por citocinas inflamatorias. A ICAM-1 e ICAM-2 comparten dous dominios homólogos N-terminais; ambos os dous poden unirse a LFA-1.
Durante a quimiotaxe, o movemento celular é facilitado pola unión de integrinas β1 a compoñentes da súa matriz extracelular: VLA-3, VLA-4 e VLA-5 únense á fibronectina e VLA-2 e VLA-3 ao coláxeno e outros compoñentes da matriz extracelular.
Citocinas
A extravasación está regulada polo fondo ambiental de citocinas producido pola resposta inflamatoria, e é independente de antíxenos celulares específicos. A liberación de citocinas na resposta inmune inicial induce vasodilatación e unha menor carga eléctrica na superficie co vaso. O fluxo sanguíneo faise máis lento, facilitando as unións intermoleculares. IL-1 activa os linfocitos residentes e as células endoteliais.
TNFα incrementa a permeabilidade vascular e activa o endotelio vascular.
CXCL8 (IL-8) forma un gradiente quimiotáctico que dirixe os leucocitos cara ao sitio de lesión ou infección do tecido (CCL2 ten unha función similar á de CXCL8, inducindo a extravasación do monocito e o seu desenvolvemento en macrófago); tamén activa as integrinas do leucocito.
Avances recentes
En 1976, imaxes de microscopio electrónico de varrido mostraron que había receptores nos extremos parecidos a microvilosidades dos leucocitos que permitirían aos glóbulos brancos saír do vaso sanguíneo e chegar aos tecidos. Desde a década de 1990 estudouse intensamente a identidade dos ligandos implicados na extravasación dos leucocitos. Este asunto puido estudarse a fondo baixo condicións fisiolóxicas de estrés de cizallamento usando unha cámara de fluxo típica. Desde os primeiros experimentos detectouse un estraño fenómeno. Observouse que as interaccións de unión entre o glóbulo branco e as paredes do vaso sanguíneo se fan máis fortes baixo forzas maiores. As selectinas (E-selectina, L-selectina e P-selectina) están implicadas neste fenómeno. O limiar de cizalla requirido parece contraintuitivo porque ao incrementarse a cizalla elévase a forza aplicada nas ligazóns adhesivas das células pero parecería que isto debería incrementar a capacidade de desprenderse. Non obstante, as células rodan máis lentamente e máis regularmente ata que se chega un nivel de cizalla óptimo no que a velocidade de rodadura é mínima. Este fenómeno paradoxal non se explicou satisfactoriamente polo meomento malia o seu grande interese.
Unha hipótese que fora inicialmente desbotada pero que despois foi espertando maior interese é a hipótese do enlace de agarre (catch bond), no que o incremento da forza sobre a célula fai máis lentas as taxas de desprendemento (off-rates) e alonga a duración do enlace e estabiliza a fase de rodadura da extravasación de leucocitos. A adhesión da célula potenciada polo fluxo aínda é un fenómeno inexplicado que podería ser o resultado dun incremento dependente do transporte na taxa de adhesión (on-rate) ou un decrecemento dependente da forza na velocidade de desprendemento das ligazóns adhesivas. A L-selectina require un determinado mínimo de cizalla para soster a rodadura do leucocito sobre o ligando PSGL-1 e outros ligandos vasculares. Formulouse a hipótese de que as forzas de fluxo diminúen as taxas de desprendemento de L-selectina–PSGL-1 (enlaces de agarre ou catch bonds), mentres que forzas maiores incrementan as taxas de desprendemento (enlaces de deslizamento ou slip bonds). Nalgúns experimentos atopouse que un decrecemento dependente da forza nas taxas de desprendemento determinaba a rodadura potenciada polo fluxo de microesferas que levan L-selectina ou de neutrófilos sobre o PSGL-1. Os enlaces de agarre permiten incrementar a forza para converter duracións da ligazón curtas noutras máis longas, o cal diminúe as velocidades de rodadura e incrementa a regularidade das fases de rodadura a medida que aumenta a cizalla desde o limiar ata un valor óptimo. A medida que aumenta a cizalla, as transicións cara a enlaces de deslizamento fan máis curta a duración do enlace e incrementan as velocidades de rodadura e diminúen a regularidade da rodadura. Hipotetizouse que as alteracións dependentes da forza da duración dos enlaces gobernan a adhesión celular dependente de L-selectina por debaixo e por riba do óptimo de cizalla. Estes descubrimentos establecen unha función biolóxica dos enlaces de agarre como un mecanismo para a adhesión celular potenciada polo fluxo. Aínda que os leucocitos parecen presentar un comportamento de enlace de agarre co increemnto do fluxo, que leva aos pasos de fixación e rodadura na extravasación dos leucocitos, a adhesión firme conséguese por medio doutro mecanismo, a activación de integrinas.
Outros exemplos biolóxicos do mecanismo de enlaces de agarre obsérvase en bacterias que se agarran firmemente ás paredes do tracto urinario en resposta ás velocidades de fluído altas e grandes forzas de cizalla exercidas sobre as células e as bacterias con extremos adhesivos nas fimbrias. Un mecanismo esquemático de como se propón que o incremento da forza de cizalla causa interaccións de unión máis fortes entre bacterias e células diana mostran que o enlace de agarre actúa de forma moi similar a unha trampa chinesa de dedos. Para un enlace de agarre, a forza sobre a célula empurra o extremo adhesivo dunha fimbria que así se pecha máis firmemente sobre a célula diana. A medida que a intensidade das forzas aumenta, máis forte se fai o enlace entre a fimbria e o receptor da célula da superficie da célula diana. Para un enlace críptico, a forza causa que a fimbria xire cara á célula diana e teña máis sitios de unión aos que poder adherirse nos ligandos da célula diana, principalmente moléculas de azucres. Isto crea unha interacción de unión máis forte entre as bacterias e a célula diana.
Aplicación de aparellos microfluídicos
As cámaras de fluxo de placa paralela son unhas das cámaras de fluxo máis utilizadas para estudar a interacción leucocito-endotelial in vitro. Levan utilizándose en investigación desde finais da década de 1980. Aínda que as cámaras de fluxo foron unha importante ferramenta no estudo do rodamento de leucocitos, presentan varias limitacións para estudar as condicións fisiolóxicas in vivo, xa que non teñen unha correspondencia coa xeometría in vivo, incluíndo a razón escala/aspecto (a microvasculatura fronte a modelos de vasos grandes), condicións de fluxo (por exemplo, fluxos converxentes fronte a diverxentes nas bifurcacións) e require grandes volumes de reactivos (~ mL) debido ao seu gran tamaño (altura > 250 µm e largura > 1mm). Coa aparición dos aparellos baseados nos microfluídos, estas limitacións foron finalmente superadas. A CFD Research Corporation (CFDRC) ideou un novo modelo in vitro chamado rede microvascular sintética SynVivo (SynVvo-SMN), que se desenvolveu usando o proceso de litografía branda baseado no polidimetilsiloxano (PDMS). A rede microvascular sintética (SMN) pode recrear a complexa vasculatura presente in vivo, incluíndo características xeométricas, condicións de fluxo e volumes de reactivo, proprocionando así un ambiente bioloxicamente realista para estudar o comportamento da extravasación celular, pero tamén para a entrega e descubrimento de fármacos. Deficiencia da adhesión do leucocito
A deficiencia da adhesión do leucocito é unha doenza xenética asociada cun defecto no proceso de extravasación do leucocito, causado por un defecto na cadea de integrina β2 (encontrada en LFA-1 e Mac-1). Isto impide a capacidade dos leucocitos de parar e realizar a diapédese. As persoas con esta doenza sofren infeccións bacterianas recorrentes e unha defectuosa curación das feridas. Unha marca característica desta doenza é a neutrofilia. Disfunción dos neutrófilos
En enfermidades estendidas polo corpo como a sepse, a extravasación dos leucocitos entra nun estado incontrolado no que os glóbulos brancos neutrófilos empezan a destruír os tecidos do hóspede a velocidades moi superiores ao normal, o que, por exemplo só nos Estados Unidos de América, causa a morte dunhas 200. 000 persoas ao ano. A disfunción dos neutrófilos adoita ir precedida por algún tipo de infección, a cal desencadea a aparición de padróns moleculares asociados a patóxeno (PAMP). A medida que a extravasación de leucocitos se intensifica, os neutrófilos danan máis tecidos, o cal libera radicais do oxíxeno e proteases.
Estudos recentes cunha rede microvascular sintética SynVivo (SynVivo-SMN) fixeron posible estudar terapias antiinflamatorias para tratar patoloxías causadas pola disfunción dos neutrófilos. A SMN permite a análise completa de cada etapa da extravasación de leucocitos, o que proporciona unha metodoloxía para cuantificar o efecto do fármaco á hora de impedir a extravasación leucocitaria. Algúns descubrimentos recentes demostran o efecto da hidrodinámica en interaccións neutrófilo-endoteliais. Noutras palabras, a adhesión de neutrófilos está moi afectada polas forzas de cizalla do fluxo sanguíneo e por interaccións moleculares. Ademais, a medida que a taxa de cizalla diminúe (por exemplo nas vénulas post-capilares), a inmobilización dos leucocitos faise máis doada e, por tanto, máis frecuente. O contrario tamén é certo: os vasos nos que as forzas de cizalla son altas a inmobilización dos leucocitos é máis difícil. Isto ten importantes implicacións en varias doenzas nas que a alteración do fluxo sanguíneo impacta gravemente sobre a resposta do sistema inmunitario ao impedir ou facilitar a inmobilización dos leucocitos. Ter estes coñecementos axuda a mellorar os estudos sobre o efecto de fármacos sobre a extravasación leucocitaria.