MRNA display

A mRNA display (que se pode traducir por exhibición ou exposición en ARNm) é unha técnica de display utilizada para realizar a evollución de proteínas e péptidos in vitro para crear moléculas que poidan unirse a unha diana desexada. O proceso ten como resultado péptidos ou proteínas traducidas que están asociadas co seu ARNm proxenitor por medio dunha ligazón de puromicina. O complexo únese despois a unha diana inmobilizada nun paso de selección (cromatografía de afinidade). As fusións ARNm-proteína que se unen ben á diana son despois reversotranscritas a ADNc e as súas secuencias amplificadas por medio da reacción en cadea da polimerase. O resultado é unha secuencia de nucleótidos que codifica un péptido con alta afinidade pola molécula de interese.
A puromicina é un análogo do extremo 3' do tirosil-ARNt cunha parte da súa estrutura que imita unha molécula de adenosina, e outra parte que imita unha molécula de tirosina. Comparada co enlace éster clivable do tirosil-ARNt, a puromicina ten un enlace amida non hidrolizable. Como resultado, a puromicina interfire coa tradución, e causa a liberación prematura dos produtos de tradución.
Todos os moldes de ARNm usados na tecnoloxía da mRNA display teñen puromicina no seu extremo 3’. A medida que avanza a tradución, o ribosoma móvese ao longo do ARNm molde, e unha vez que chega ao extremo 3’ do molde, a puromicina fusionada entra no sitio A do ribosoma e é incorporada no péptido nacente. A fusión ARNm-polipéptido libérase despois do ribosoma.
Para sintetizar unha fusión ARNm-polipéptido, a puromicina fusionada non é a única modificación ao ARNm molde. Os oligonucleótidos e outros espazadores necesitan ser recrutados xunto coa puromicina para proporcionar flexibilidade e a lonxitude axeitada para que a puromicina entre no sitio A. Idealmente, o espazador situado entre o extremo 3’ dun ARNm e a puromicina ten que ser flexible e longo dabondo para permitir que a puromicina entre no sitio A despois da tradución do último codón. Isto permite a produción eficiente da fusión ARNm-polipéptido de lonxitude completa e alta calidade. Rihe Liu et al. optimizaron o espazador 3’-puromicina oligonucleótido. Informaron que dA25 en combinación co Spacer 9 (Glen Research), e dAdCdCP no 5’ terminal son os que mellor funcionan para a reacción de fusión. Encontraron que os enlazadores (linkers) de lonxitude maior de 40 nucleótidos e máis curtos de 16 nucleótidos mostraban unha eficiencia moi reducida na formación da fusión. Ademais, cando a secuencia rUrUP estaba presente adxacente á puromicina, a fusión non se formaba eficientemente.
Ademais de proporcionar flexibilidade e lonxitude, a porción poli dA do enlazador (linker) tamén permite unha ulterior purificación da fusión ARNm-polipéptido debido á súa alta afinidade para a resina dT celulosa. As fusión ARNm-polipéptido poden ser seleccionadas sobre dianas de selección inmobilizadas durante varias roldas cun incremento do rigor. Despois de cada rolda de selección, os membros da biblioteca que permanecen unidos á diana inmobilizda son amplificados por PCR e os que non se unen son arrastrados por lavado. Método
A síntese da biblioteca da mRNA display empeza a partir da síntese da biblioteca de ADN. Unha biblioteca de ADN para calquera proteína ou pequeno péptido de interese pode ser producida pola síntese de fase sólida seguida de amplificación por PCR. Usualmente, todos os membros desta biblioteca de ADN teñen un sitio de transcrición da ARN polimerase de T7 e un sitio de unión ao ribosoma no extremo 5’. A rexión promotora de T7 permite unha transcrición de T7 in vitro a grande escala para transcribir a biblioteca de ADN nunha biblioteca de ARNm, o cal proporciona moldes para a reacción de tradución in vitro posterior. O sitio de unión ao ribosoma na rexión non traducida 5' (5’ UTR) deséñase segundo o sistema de tradución in vitro que se vai usar. Hai dous sistemas de tradución in vitro dispoñibles comercialmente moi utilizados. Un deles é o "E. Coli S30 Extract System" (Promega) que require unha secuencia Shine-Dalgarno no 5’ UTR como sitio de unión ao ribosoma; o outro é o "Red Nova Lysate" (Novagen), que necesita un sitio de unión ao ribosoma ΔTMV.
Unha vez que se xera a biblioteca de ARNm, será purificada por Urea-PAGE e ligada usando a ADN ligase de T4 ao enlazador espazador de ADN que contén puromicina no extremo 3’. Neste paso de ligazón, un fragmento de ARNm é ligado a un ADN monocatenario coa axuda da ADN ligase da T4. Esta non é unha reacción de ligazón estándar de ADN ligase de T4, na que dous fragmentos de ADN bicatenario quedan ligados. Para incrementar o rendemento desta ligazón especial, pode usarse unha "férula" de ADN monocatenario para axudar na reacción de ligazón. O extremo 5’ da férula deséñase para ser complementario ao extremo 3’ e do ARNm, e o 3’ terminal da férula deséñase para que sexa complementario do extremo 5’ do ADN enlazador espazador, que usualmente consta de nucleótidos poli dA.
A biblioteca de ARNm-ADM-puromicina ligada é traducida nos sistemas Red Nova Lysate (Novagen) ou E. Coli S30 Extract System (Promega), orixinando polipéptidos enlazados covalentemente en cis co ARNm codificante. A tradución in vitro pode tamén facerse nun sistema PURE (síntese de proteínas usando elementos recombinantes). O sistema PURE é un sistema de tradución libre de células deE. coli no cal só están presentes os compoñentes da tradución esenciais. Neste sistema algúns compoñentes, como aminoácidos e aminoacil-ARNt sintases (AARSs) poden ser omitidos. En vez diso, poden engadirse ao sistema PURE ARNts acilados quimicamente. Demostrouse que algúns aminoácidos non naturais, como os de ARNt acilado con N-metil-aminoácido poden ser incorporados aos péptidos ou fusións ARNm-polipéptido nun sistema PURE.
Despois da tradución, as porcións de ARNm monocatenario das fusións serán convertidos en heterodúplex de ARN/ADN por unha reversotranscriptase para eliminar calquera estrutura secundaria de ARN non desexada, e facer máis estable a porción do ácdo nucleico da fusión. Este paso é unha reacción de transcrición inversa. Por exemplo, pode facerse usando Superscript II (GIBCO-BRL) seguindo o protocolo do fabricante.
As fusións ARNm/ADN-polipéptido poden ser seleccionadas sobre dianas de selección inmobilizadas durante varias roldas. Podería haber un fondo relativamente alto nas primeiras roldas de selección, e isto pode ser minimizado incrementando o rigor da selección, como axustar a concentración de sales, cantidade de deterxente, e a temperatura durante o período de unión diana/fusión. Despois da selección de unión, estes membros da biblioteca que permanecen unidos á diana inmobiliada son amplificados por PCR. O paso de amplificación por PCR enriquece a poboación da biblioteca de mRNA display que ten maior afinidadde pola diana inmobilizada. Pode facerse tamén unha PCR tendente ao erro entre cada rolda de selección para incrementar máis a diversidade dunha biblioteca de mRNA display e reducir o fondo na selección.
Publicouse recentemente un protocolo máis rápido de realizar para a mRNA display. Vantaxes
Aínda que hai moitas outras tecnoloxías de disply molecular, como a phage display, a bacterial display, a yeast display e a ribosome display, a tecnoloxía da mRNA display ten moitas vantaxes sobre as demais. As tres primeiras bibliotecas de display biolóxica listadas teñen polipéptidos ou proteínas expresadas na superficie do microorganismo respectivo e a información codificante que a acompaña para cada polipéptido ou proteína é recuperable do xenoma do microorganismo. Porén, o tamaño da biblioteca para estes tres sistemas de display in vivo está limitado pola eficacia da transformación de cada organismo. Por exemplo, o tamaño da biblioteca para as phage e bacterial displays está limitada a de 1-10 × 109 membros diferentes. O tamaño da biblioteca para a yeast display é aínda máis pequeno. Ademais, estes sistemas de display baseados en células só permiten o exame e enriquecemento de péptidos/proteínas que conteñan aminoácidos naturais. En contraste, a mRNA display e a ribosome display son métodos de selección in vitro. Permiten usar unha biblioteca con ata 1015 membros diferentes. O gran tamaño da biblioteca incrementa a probabilidade de seleccionar secuencias moi raras, e tamén mellora a diversidade das secuencias seleccionadas. Ademais, os métodos de selección in vitro eliminan a presión de selección non desexada, como unha escasa expresión proteica e unha rápida degradación de proteínas, que pode reducir a diversidade das secuencias seleccionadas. Finalmente, os métodos de selección in vitro permiten a aplicación da mutaxénese in vitro e técnicas de recombinación a través do proceso de selección.
Aínda que tanto a ribosome display coma a mRNA display son métodos de selección in vitro, a mRNA display ten algunhas vantaxes sobre a tecnoloxía da ribosome display. A mRNA display utiliza complexos mRNA-polipéptidos covalentes ligados por medio de puromicina; mentres que, a ribosome display utiliza complexos ribosoma-ARNm-polipéptidos non covalentes atascados. Para a ribosome display, o rigor de selección está limitado para manter o ribosoma-ARNm-polipéptido formando un complexo debido a que os complexos ribosoma-ARNm-polipéptido son non covalentes. Isto pode causar dificultades á hora de reducir as unións de fondo que se producen durante o ciclo de selección. Ademais, os polipéptidos baixo selección nun sistema de ribosome display están unidos a un enorme complexo ARNr-proteína, un ribosoma, que ten un peso molecular de máis de 2000000 Da. Podería haber certas interaccións impredicibles entre a diana de selección e o ribosoma, e isto pode levar a unha perda de potenciais moléculas que se unen durante o ciclo de selección. En contraste, a enlazador espazador de ADN de puromicina usado na tecnoloxía da mRNA display é moito máis pequeno en comparación cun ribosoma. Este enlazador adoita ter menos posibilidade de interaccionar coa diana de selección inmobilizada. Así, coa tecnoloxía da mRNA display é máis probable que se dean resultados menos nesgados. Aplicación
En 1997, Roberts e Szostak mostraron que as fusións entre un ARNm sintético e o seu epítopo myc codificado poderían ser enriquecidas a partir dun conxunto de secuencias aleatorias de fusións ARNm-polipéptidos por inmunoprecipitación.
Nove anos máis tarde, Fukuda e colegas elixiron o método da mRNA display para a evolución in vitro de fragmentos de anticorpos Fv de cadea simple (scFv). Seleccionaron seis mutantes diferentes scFv con cinco mutacións de consenso. Porén, a análise cinética destes mutantes mostrou que as súas especificidades de antíxeno permanecían similares ás de tipo silvestre. Porén, demostraron que dous das cinco mutacións de consenso estaban dentro das rexións determinantes de complementariedade (CDR), e concluíron que a mRNA display tiña o potencial de servir para unha evolución artificial rápida de anticorpos de alta afinidade terapéuticos e de diagnóstico optimizando os seus CDR.
Roberts e colaboradores demostraron que oligómeros peptídicos non naturais que constaban de aminoácidos N-substituídos poden ser sintetizados como fusións ARNm-polipéptidos. Os péptidos que conteñen aminoácidos N-substituídos foron asociados cunha boa estabilidade proteolítica e propiedades farmacocinéticas moderadas. Este traballo indica que a tecnoloxía da mRNA display podería servir para seleccionar péptidos con efecto de fármaco para o uso terapéutico resistentes á proteólise.