Hoechst (colorante)

Os colorantes Hoechst son un tipo de tinguiduras fluorescentes utilizadas para tinguir o ADN, que quimicamente son bisbencimidas. Levan ese nome porque foron desenvolvidas orixinariamente pola compañía alemá Hoechst AG (pronunciado /ˈhøːçst/ en alemán), que numerou todos os seus compostos pola orde en que foron obtidos (por exemplo Hoechst 33342). Hai tres colorantes Hoechst relacionados, que son: Hoechst 33258, Hoechst 33342, e Hoechst 34580. Os máis usados son o Hoechst 33258 e o Hoechst 33342, que teñen un espectro de emisión/excitación similar. Características moleculares
Os Hoechst 33258 e 33342 son ambos excitados por luz ultravioleta duns 350 nm, e ambos emiten fluorescencia azul/ciano cun un máximo de emisión arredor de 461 nm. O colorante non unido (ao ADN) ten o seu máximo de emisión de fluorescencia entre 510–540 nm. Os colorantes Hoechst poden excitarse cunha lámpada de arco de mercurio ou de xenon ou cun láser ultravioleta. Hai un considerable desprazamento de Stokes entre os espectros de excitación e emisión que fai que os colorantes Hoechst sexan útiles en experimentos nos cales se usan moitos fluoróforos. A intensidade da fluorescencia destes coloranrtes increméntase co pH do solvente.
Os colorantes Hoechst son solubles en auga e en solventes orgánicos como a dimetil formamida ou o dimetil sulfóxido. Poden obterse concentracións de ata 10 mg/mL. As solución acuosas son estables a 2–6 °C durante polo menos seis meses se son protexidas da luz. Para un almacenamento durante máis longo tempo hai que conxelar as solucións a ≤-20 °C. O colorante únese ao suco menor da dobre hélice do ADN e ten preferencia por secuencias ricas en adenina e timina. Aínda que os colorantes poden unirse a todos os ácidos nucleicos, os ADN bicatenarios ricos en AT potencian a fluorescencia obtida considerablemente. Os colorantes Hoechst poden permear a membrana da célula e poden unirse ao ADN en células fixadas ou vivas. Por tanto, estas tinguiduras denomínanse supravitais, o que significa que as células sobreviven ao tratamento con eles. As células que expresan as proteínas transportador de casete de unión ao ATP específicas poden tamén transportar activamente estes colorantes cara a fóra do seu citoplasma. Aplicacións
Normalmente, úsase unha concentración de 0, 1-12 µg/mL para tinguir o ADN en bacterias ou células eucariotas. As células tínguense durante de 1 a 30 minutos a 37 °C (ou temperaturas moderadas) e despois lavadas para eliminar o colorante que non se uniu á súa diana. Pode observarse unha fluorescencia verde producida polo colorante Hoechst non unido en mostras que foron tinguidas con demasiado colorante ou que non foron debidamente lavadas.
Os colorantes Hoechst úsanse frecuentemente como substitutos doutros colorantes de ácidos nucleicos chamados DAPI. As diferenzas principais entre os colorantes Hoechst e os DAPI son: Os colorantes Hoechst son menos tóxicos que os DAPI, o cal asegura unha maior viabilidade para as células tinguidas.
O grupo etilo adicional que teñen os colorantes Hoechst fai que penetren máis facilmente nas células.
A fluorescencia dos Hoechst 33342 e 33258 é temperada (quenched) pola bromodesoxiuridina (BrdU), o que se usa comunmente para detectar as células que están en división. O Hoechst 33342 mostra unha permeabilidade na célula 10 veces maior que o Hoechst 33258. As células poden integrar a BrdU no ADN de nova síntese en substitución da timidina. Cando BrdU está integrado no ADN, suponse que o bromo deforma o suco menor de modo que os colorantes Hoechst non poden alcanzar o seu sitio de unión óptimo. En realidade, a unión dos colorantes Hoechst é aínda máis forte no ADN substituído con BrdU, pero ao non estar unido de forma normal non orixina fluorescencia. Os colorantes Hoechst poden usarse xunto coa BrdU para monitorizar a progresión do ciclo celular.
Os colorantes Hoechst úsanse comunmente para tingur o ADN xenómico nas seguintes aplicacións: Microscopia de fluorescencia e inmunohistoquímica, xeralmente xunto con outros fluoróforos.
Citometría de fluxo para contar ou seleccionar células. Un exemplo é o seu uso para analizar cantas células dunha poboación están en determinada fase do ciclo celular.
Detección do ADN en presenza de ARN en xeles de agarosa.
Determinación de ADN automatizada.
Selección de cromosomas. Toxicidade e seguridade
Como os colorantes Hoechst se unen ao ADN, interfiren coa replicación do ADN durante o ciclo celular. Consecuentemente, son potencialmente mutáxénicos e carcinóxenos, polo que debe terse coidado coa súa manipulación e eliminación. Os colorantes Hoechst utilízanse para a selección do esperma para fecundacións artificiais en gando e en humanos. A súa seguridade foi debatida.