Operón lac

O operón lac é un operón (sistema xenético regulatorio) necesario para a regulación do transporte e metabolismo da lactosa na bacteria Escherichia coli e algunhas outras bacterias entéricas. O operón consta dun promotor e rexións regulatorias no ADN e ten tres xenes estruturais adxacentes aos que controla, chamados lacZ, lacY, e lacA, os cales codifican os encimas β-galactosidase, lactosa permease, e tiogalactósido transacetilase (ou galactósido O-acetiltransferase), respectivamente.
Na natureza o operón lac permite a utilización da lactosa pola bacteria (que vai ser utilizada como fonte de enerxía). A lactosa permease, que se encontra na membrana plasmática, transporta lactosa á célula. A β-galactosidase, que é un encima citoplasmático, cliva posteriormente o azucre lactosa orixinando o glicosa e galactosa. Como é un gasto inútil de enerxía producir os encimas cando non hai lactosa dispoñible ou cando hai unha fonte de enerxía máis fácil de utilizar, como a glicosa, nesas situacións eses xenes están inactivados pola regulación feita polo operón. A regulación xénica do operón lac foi o primeiro mecanismo xenético regulatorio que se chegou a comprender claramente e é un dos principais exemplos de regulación xénica en procariotas. O operón lac é un dos modos máis báxicos de explicar como un represor encimático funciona sobre o ADN da célula, e por esa razón o exemplo exponse en moitos libros e programas introdutorios de bioloxía celular e molecular. O operón lac operon utiliza un mecanismo de control que consta de dúas partes para asegurar que a célula gasta enerxía en producir os encimas codificados polo operón lac só cando é necesario. Está controlado principalmente polo represor lac, que detén a produción de encimas en ausencia de lactosa, e polo EIIAGlc, que corta a produción de lactosa permease cando se está a transportar glicosa á célula. Este mecanismo de control dual causa a utilización secuencial da glicosa e a lactosa en dúas fases distintas do crecemento da bacteria, o que se coñece como diauxia. Estrutura do operón lac
O operón lac consta de tres xenes estruturais, un promotor, un terminador, un regulador, e un operador. Os tres xenes estruturais son: lacZ, lacY, e lacA. lacZ codifica o encima β-galactosidase (ou LacZ), que é un encima intracelular que cliva o disacárido lactosa nos seus dous compoñentes os monosacáridos glicosa e galactosa.
lacY codifica o encima β-galactósido permease (LacY), un transportador de membran de tipo simportador que bombea lactosa ao interior da célula utilizando un grandiente de protóns.
lacA codifica o encima β-galactósido transacetilase (LacA), un encima que transfire un grupo acetilo desde o acetil-CoA a β-galactósidos.
Só os xenes lacZ e lacY parecen ser estritamente necesarios para o catabolismo da lactosa.
Nomenclatura xenética
Utilízanse abreviacións de tres letras empezando con maiúscula e con letra normal para describir os fenotipos de bacterias como E. coli.
Son exemplos: Lac (capacidade de utilizar lactosa). Neste caso, as células de tipo salvaxe son Lac+ e poden utilizar a lactosa como fonte de carbonos e enerxía, mentres que o mutante Lac- non a pode usar.
His (capacidade de sintetizar o aminoácido histidina).
Mot (motilidade natatoria).
SmR (resistencia ao antibiótico estreptomicina).
As mesmas tres letras utilízanse normalmente para designar os xenes implicados nun determinado xenotipo, pero esta vez escritas con minúscula e en cursiva. Cada xene diferente distínguese cunha letra adicional; por exemplo os xenes lac que codifican os tres encimas do operón lac denomínanse lacZ, lacY, e lacA. Hai un cuarto xene lac que é lacI, que codifica o represor da lactosa, no que "I" significa inducibilidade.
O uso actual designa as proteínas codificadas por un xene coas mesmas letras en maiúscula e normais (non cursivas). Así, LacZ é o produto proteico (a β-galactosidase) do xene lacZ.
Varias secuencias curtas que non son xenes pero tamén afectan á expresión xénica son o promotor lac ou lac p, e o operador lac ou lac o. Aínda que non é estritamente un uso estándar, as mutacións que afectan a lac o denomínanse lac oc, por razóns históricas. Regulación
O control específico dos xenes lac depende da dispoñibilidade do substrato lactosa para a bacteria. A bacteria non produce estas proteínas cando a lactosa non está dispoñible como fonte de carbono.
Os xenes lac están organizados nun operón; é dicir, están orientados na mesma dirección uns detrás dos outros no cromosoma e son cotranscritos nunha soa molécula de ARNm policistrónico. A transcrición de todos os xenes empeza coa unión do encima ARN polimerase (RNAP), que é unha proteína que se une ao ADN nun sitio de unión específico do ADN, que é o promotor, situado inmediatamente augas arriba do xene. Na unión da ARN polimerase ao promotor colabora a proteína activadora por catabolito (CAP) unida á adenosina monofosfato cíclica ou AMPc (a CAP tamén se chama proteína receptora do AMPc). Desde esta posición a ARN polimerase avanza para transcribir os tres xenes (lacZYA) nun ARNm. As secuencias de ADN do operón lac de E. coli, do ARNm lacZYA, e dos xenes lacI están dispoñibles en GenBank (ver).
Resposta á lactosa. Este primeiro mecanismo de control é a resposta regulatoria á lactosa, que utiliza unha proteína reguladora intracelular chamada represor da lactosa para dificultar a produción de β-galactosidase en ausencia de lactosa. O xene lacI que codifica o represor sitúase preto do operón lac e exprésase sempre (constitutivamente). Se desaparece a lactosa do medio de crecemento, o represor únese moi fortemente a unha curta secuencia de ADN situada augas abaixo do promotor preto do inicio de lacZ chamada operador lac. A unión do represor ao operador interfire coa unión da ARN polimerase ao promotor, e deste modo a transcrición do ARNm que codifica LacZ e LacY apenas pode realizarse a moi baixos niveis. polo contrario, cando as célula crecen en presenza de lactosa, fórmase un metabolito da lactosa chamado alolactosa, que se une ao represor, causando un cambio na súa forma. Este cambio de conformación altera o represor de tal xeito que é incapaz de unirse ao operador, o que permite que a ARN polimerase poida transcribir os xenes lac e facendo que aumentten os niveis das proteínas codificadas nos xenes.
Resposta á glicosa. O segundo mecanismo de control é unha resposta á glicosa, que é transportada dentro da célula bacteriana polo sistema da fosfotransferase dependente de PEP. O grupo fosfato do fosfoenolpiruvato (PEP) transfírese por medio dunha fervenza de fosforilación que consta das proteínas do sistema PTS (sistema da fosfotransferase) xerais HPr e EIA e as proteínas PTS específicas da glicosa EIIAGlc e EIIBGlc, que é o dominio citoplasmático do transportador de glicosa EII. O transporte de glicosa é acompañado pola súa fosforilación por EIIBGlc, tomando o grupo fosfato das outras proteínas PTS, como EIIAGlc. A forma desfosforilada de EIIAGlc únese á permease lac e impide que esta transporte máis lactosa ao interior da célula. Por tanto, se están presentes tanto a glicosa coma a lactosa, o transporte de glicosa bloquea o transporte do indutor do operón lac. Este proceso denomínase exclusión do indutor.
Resumo. En consecuencia as situacións que se poden dar son: Hai glicosa: operón inactivo. A célula usa a glicosa tanto se hai lactosa como se non. A lactosa non a usa.
Non hai glicosa nin lactosa: operón inactivo.
Non hai glicosa pero si lactosa: operón activo. A célula usa a lactosa.
Natureza multimérica do represor
O represor lac é unha proteína tetrámera de subunidades idénticas. Cada subunidade contén un motivo hélice-xiro-hélice (HTH) que pode unirse ao ADN. O sitio operador onde se une o represor é unha secuencia de ADN con simetría repetida invertida. Os dous medios sitios no ADN do operador xuntos únense a dúas das subunidades do represor tetramérico. As outras dúas subunidades do represor non teñen función neste modelo, pero esta propiedade non se comprendeu durante moitos anos.
Finalmente, descubriuse que están implicados dous operadores adicionais na regulación lac. Un (chamado O3) sitúase ao final do xene lacI e o outro (O2) está situado a 400 pares de bases augas abaixo na parte inicial do lacZ. Estes dous sitios non foron atopados nas primeiras investigacións porque teñen funcións redundantes e as mutacións individuais non afectan moito á represión. Unha soa mutación en O2 ou O3 ten só efectos na desrepresión nun factor de 2 ou 3. Con todo, a súa importancia demóstrase polo feito de que un mutante dobre defectivo tanto en O2 coma en O3 é drasticamente desreprimido (nun factor de 70).
No modelo actual, o represor está unido simultaneamente tanto ao principal operador O1 coma a O2 ou a O3. O ADN intercalado forma un bucle desde o complexo. A natureza redundante dos dous operadores menores suxire que non é importante a formación dun complexo en bucle específico. Unha idea é que o sistema funciona por medio de ligaduras (tethering). Se o represor unido se libera de O1 momentaneamente, a unión a un operador menor manteno na súa veciñanza, para que poida volverse a unir rapidamente. Isto incrementaría a afinidade do represor por O1.
Mecanismo de indución
O represor é unha proteína alostérica, é dicir, pode adoptar dúas formas algo distintas, que están en equilibrio entre si. Nunha das súas formas o represor únese ao operador do ADN co cal ten alta especificidade, e na outra forma perde esa especificidade. Segundo o modelo clásico de indución, a unión do indutor, sexa a alolactosa ou o IPTG, ao represor afecta á distribución das dúas formas do represor. Así, o represor unido a un indutor está estabilizado na conformación que non se une ao ADN. Con todo, este modelo simple non pode explicar todo o fenómeno, porque o represor está unido bastante establemente ao ADN, pero libérase rapidamente coa adición do indutor, polo que quedan cousas por coñecer sobre este mecanismo de unión.
Análogos da lactosa
Describíronse varios derivados ou análogos da lactosa que son útiles para traballar co operón lac. Estes compostos son principalmente galactósidos substituídos, nos que en vez do residuo glicosa da lactosa teñen outro grupo químico. Son os seguintes: Isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG). Utilízase frecuentemente como indutor do operón lac en traballos fisiolóxicos. O IPTG únese ao represor e inactívao, pero non é un substrato da β-galactosidase. Unha vantaxe do IPTG nos estudos in vivo é que como non pode ser metabolizado por E. coli a súa concentración permanece constante e o grao de expresión dos xenes controlados polo lac p/o, non é unha variable no experimento. A captación de IPTG é dependente da acción da lactosa permease en Pseudomonas fluorescens, pero non en E. coli.
Fenil-β-D-galactosa (fenil-Gal). É un substrato da β-galactosidase, pero non inactiva o represor e, por tanto, non é un indutor. Como as células de tipo salvaxe producen moi pouca β-galactosidase, non poden crecer con fenil-Gal como fonte de carbono e enerxía. Os mutantes que carecen de represor son capaces de crecer con fenil-Gal. Así, medios mínimos que conteñan só fenil-Gal como fonte de carbono e enerxía son selectivos para mutantes do represor e mutantes do operador. Se sementamos 108 células dunha cepa de tipo salvaxe nunha placa de ágar que contén fenil-Gal, as escasas colonias que crecen son principalmente mutantes espontáneos para o represor. A distribución relativa de mutantes do represor e o operador está afectada polo tamaño da diana. Como o xene lacI que codifica o represor é 50 veces máis grande que o operador, os mutantes do represor predominan na selección.
Outros compostos que serven de indicadores coloreados da actividade da β-galactosidase son:
Orto-nitrofenil-β-galactósido (ONPG). Este composto é clivado para producir o composto intensamente amarelo ortonitrofenol, e utilízase comunmente como un substrato para ensaios de β-galactosidase in vitro.
X-gal. As colonias que producen β-galactosidase vólvense azuis co X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactósido).
Alolactosa. É un isómero da lactosa producido naturalmente na célula e é o indutor do operón lac. A lactosa é o disacárido galactosa-(β1→4)-glicosa, mentres que a alolactosa é galactosa-(β1→6)-glicosa. A lactosa convértese en alolactosa pola β-galactosidase nunha rección alternativa á hidrolítica. Un experimento fisiolóxico que demostra o papel de LacZ na produción do "verdadeiro" indutor en células de E. coli é a observación de que un mutante nulo de lacZ pode aínda producir permease LacY cando crece con IPTG pero non cando crece con lactosa. A explicación é que o procesamento da lactosa a alolactosa (catalizado pola β-galactosidase) é necesario para producir o indutor dentro da célula. Desenvolvemento do modelo clásico
Os descubridores deste operón, François Jacob e Jacques Monod utilizaron nos seus experimentos a bacteria, E. coli, pero moitos dos conceptos básicos sobre regulación que descubriron son fundamentais para a regulación celular de todos os organismos. A idea básica é que as proteínas non se sintetizan cando non se necesitan. E. coli conserva os seus recursos celulares e enerxía ao non producir as tres proteínas do operón lac cando no hai necesidade de metabolizar a lactosa, como cando hai outros azucres máis facilmente metabolizables como a glicosa. Na seguinte sección discútese como E. coli controla certos xenes en resposta ás necesidades metabólicas.
Durante a segunda guerra mundial, Monod estaba probando os efectos de combinacións de azucres como fontes de nutrientes para E. coli e Bacillus subtilis. Monod seguía estudos similares que levaran a cabo outros científicos con bacterias e lévedos. Atopou que as bacterias que crecían con dous diferentes azucres a miúdo mostraban dúas fases de crecemento. Por exemplo, se dispoñían de glicosa e lactosa, metabolizábase primeiro a glicosa (fase I de crecemento, ver figura 2) e despois a lactosa (fase II de crecemento). A lactosa non era metabolizada durante a primeira parte dunha curva de crecemento diáuxico porque non se produce β-galactosidase cando están presentes no medio á vez a glicosa e a lactosa. Monod denominou a este fenómeno diauxia. Monod enfocou entón a súa atención na indución da formación de β-galactosidase que ocorría cando o único azucre no medio de cultivo era a lactosa.
Clasificación dos mutantes regulatorios
Un grande avance conceptual de Jacob e Monod foi recoñecer a distinción entre substancias regulatorias e sitios onde actúan para cambiar a expresión xénica. Jacob, que foi un antigo soldado, utilizou a analoxía dun bombardeiro que libera o seu cargamento letal segundo a recepción dun sinal especial dun radiotransmisor. Un sistema que funcione require tanto un transmisor en terra coma un receptor no avión. Agora, supoñamos que o transmisor está avariado. O sistema pode poñerse a funcionar se introducimos un segundo transmisor funcional. Pero, dixo, se consideramos que o bombardeiro ten un receptor defectuoso, o comportamento "deste" bombardeiro non poderá cambiarse pola introdución dun segundo avión funcional.
Para analizar os mutantes reguladores do operón lac, Jacob desenvolveu un sistema polo cal podía introducirse unha segunda copia dos xenes lac (lacI co seu promotor, e lacZYA co seu promotor e operador) nunha soa célula. Un cultivo de tales bacterias, que son diploides só para os xenes lac pero polo demais son normais, pode comprobarse para o fenotipo regulatorio. En concreto, determínase se se producen LacZ e LacY mesmo en ausencia de IPTG (debido a que o represor da lactosa producido polo xene mutante non é funcional). Este experimento, no cal os xenes ou agrupacións de xenes son probados por pares, chámase proba de complementación. Esta proba ilústrase na figura (lacA foi omitido para maior simplicidade). Primeiro, móstranse certos estados haploides (é dicir, a célula leva unha soa copia dos xenes lac). No panel, (a) mostra a represión, (b) mostra a indución por IPTG, e (c) e (d) mostran o efecto dunha mutación no xene lacI ou no operador, respectivamente. No panel, (e) mostra a proba de complementación para o represor. Se unha copia dos xenes lac leva unha mutación en lacI, pero a segunda copia é de tipo salvaxe para lacI, o fenotipo resultante é normal, pero lacZ exprésase cando se expón ao indutor IPTG. As mutacións que afectan ao represor dise que son recesivas para o tipo salvaxe (e que o tipo salvaxe é dominante), e isto explícase porque o represor é unha pequena proteína que pode difundir na célula. A copia do operón lac adxacente ao xene lacI defectivo é efectivamente desactivada pola proteína producida pola segunda copia do lacI.
Se o mesmo experimento se leva a cabo utilizando unha mutación no operador, obtense un resultado diferente (panel (f)). O fenotipo dunha célula que leve un mutante e un sitio operador de tipo salvaxe é que se producen LacZ e LacY mesmo en ausencia do indutor IPTG; porque o sitio operador danado non permite a unión do represor para inhibir a transcrición dos xenes estruturais. A mutación do operador é dominante. Cando está danado pola mutación o sitio operador onde debe unirse o represor, a presenza dun segundo sitio funcional na mesma célula non produce ningunha diferenza na expresión dos xenes controlados polo sitio mutante.
Unha versión máis sofisticada deste experimento usa operóns marcados para distinguir entre as dúas copias dos xenes lac e mostrar que o xene ou xenes estruturais non regulados son os que están despois do operador mutante (panel (g). Por exemplo, supoñamos que se marca unha copia por medio dunha mutación que inactiva lacZ para que só poida producir a proteína LacY, mentres que a segunda copia leva unha mutación que afecta a lacY e só pode producir LacZ. Nesta versión, só a copia do operón lac que está adxacente ao operador mutante poderá expresarse sen IPTG. Dise que a mutación do operador é cis-dominante, é dicir, é dominante para o tipo salvaxe pero afecta só á copia do operón que está inmediatamente adxacente a el.
Esta explicación é un pouco enganosa nun importante sentido: procede dunha descrición do experimento e despois explica os resultados segundo un modelo. De feito, a miúdo é certo que o que se fai primeiro é o modelo, e despois o experimento deséñase especificamente para comprobar ese modelo. Monod primeiro imaxinou que debería haber un sitio no ADN coas propiedades do operador, e despois deseñou a súa proba de complementación para demostrar iso.
A dominancia dos mutantes no operador tamén suxire un procedemento para seleccionalos especificamente. Se selecionamos nun cultivo do tipo salvaxe os mutantes reguladores utilizando fenil-Gal, como se describiu máis arriba, as mutacións no operador son raras comparadas cos mutantes no represor porque o tamaño da diana é pequeno. Pero se en vez de facelo así, empezamos cunha cepa que leva dúas copias da rexión lac completa (que é diploide para lac), non se obteñen aparentemente mutacións no represor (que aínda ocorren), porque a complementación polo segundo xene lacI salvaxe fai que teña un fenotipo salvaxe. Polo contrario, a mutacióm dunha copia no operador fai que apareza un fenotipo mutante, porque é dominante sobre o segunda copia de tipo salvaxe. Uso en bioloxía molecular
O xene lac e os seus derivados son moi axeitados para ser usados como xenes reporteiros en varias técnicas de selección baseadas en cultivos bacterianos, como a análise de dous híbridos, na cal debe determinarse a unión exitosa dun activador transcricional a unha secuencia promotora específica. En placas LB que conteñen o produto X-gal, o cambio de cor de colonias brancas a escuras ou azuis corresponde coa presenza no cultivo de 20-100 unidades de β-galactosidase, mentres que en medios de tetrazolio lactosa e MacConkey lactosa o rango é de 100-1000 unidades, e son máis sensibles nas partes alta e baixa dese rango, respectivamente. Como os medios MacConkey lactosa e tetrazolio lactosa dependen dos produtos da degradación da lactosa, requiren a presenza á vez dos xenes lacZ e lacY. Hai moitas técnicas de fusión lac que inclúen só o xene lacZ, que son axeitadas para as placas X-gal ou caldos líquidos ONPG.