Knockout de xenes

A técnica do knockout de xenes (ou tamén knock-out de xenes) é unha técnica xenética que consiste en suprimir a expresión dun xene específico nun organismo (un rato, unha planta, un lévedo. .. ), substituíndo o xene orixinal no seu locus por unha versión modificada do mesmo, á que se lle extraeu un ou varios exóns para xerar unha versión non funcional, que non pode producir a proteína que codificaba o xene orixinal. Desta forma, obtéñense organismos que non expresan o xene diana nun tecido específico ou no organismo completo, e que se denominan organismos knockout ou knockouts, como é o caso dos ratos knockout. Os organismos knockout son os modelos preferidos á hora de estudar a función dun xene.
En 2007, Mario Capecchi, Martin Evans, e Oliver Smithies obtiveron o Premio Nobel de Fisioloxía ou Medicina polo desenvolvemento de técnicas de modificación xenética específicas e tecnoloxía de células nai embrionarias de rato (células ES) que, combinadas, permitiron a xeración dos ratos knockout. A análise destes animais mutantes revolucionou a elucidación da función dos xenes, e estes ratos demostraron ser un valioso modelo para o estudo de numerosas doenzas humanas. Técnicas aplicadas na modificación da expresión xénica
Existen diferentes técnicas de bioloxía molecular por medio das cales se pode interferir coa expresión dun xene. Estas técnicas varían nos mecanismos utilizados, no tempo que se precisa para atinguir un resultado positivo e na especificidade do mesmo. Dentro destas técnicas están: Knockout de xenes. É unha técnica na que o xene endóxeno se extrae: intercámbiase por recombinación homóloga por unha versión mutada (que se introduce). Esta versión mutada pode eliminar practicamente toda a secuencia do xene ou ben deixar a expresión dos primeiros exóns, mais é preferible non deixar case nada; esta técnica é a que se describe no apartado "Metododoloxía". Adoita requirirse varios meses para obter individuos modificados (sobre todo no caso dos ratos), aínda que presentan a vantaxe de ser moi específicos: a estes organismos só lles falta o xene diana.
Outras técnicas distintas do knockout:
Transxénese. Nesta técnica introdúcense secuencias dentro do xene orixinal que o alteran, para producir modificacións que xeren proteínas non funcionais. Neste caso, os organismos obtidos denomínanse "organismos transxénicos". Xeralmente é unha técnica máis rápida, co inconveniente de que o xene endóxeno aínda está presente, e pode producir unha proteína que, aínda que mutada, pode interferir con outras moléculas da vía á que pertence. Ademais, pode producirse por casualidade unha nova mutación que reverta a modificación introducida, xerando de novo a proteína orixinal, que é algo que ocorre con certa frecuencia.
Mutantes con codóns "STOP". Poden obterse mutantes utilizando un produto mutaxénico (como o etil metanosulfanato ou EMS), que producen mutacións ao chou, e seleccionar logo organismos que leven codóns "STOP" na secuencia de interese. É un método rápido de obter mutantes, aínda que non é específico para a secuencia diana.
Uso do ARN interferente. Poden introducirse no xenoma dun organismo secuencias de ADN que expresen moléculas de ARN interferente. Estas moléculas interfiren de forma específica coa expresión do xene diana, producindo xeralmente unha diminución da expresión (que se denomina "knockdown" por este motivo). Esta técnica é máis rápida que a obtención dun organismo "knockout", pero non produce unha eliminación completa da expresión e ademais a secuencia introducida que codifica o ARN interferente pode tamén sufrir mutacións, inactivando o efecto desexado. Metodoloxía da técnica knockout
O xene modificado (que carece da maior parte da secuencia do xene orixinal) introdúcese nun plásmido, para xerar un vector direccionador (targeting vector). En dito vector, o xene modificado está controlado por un promotor que permite a expresión do xene de forma constitutiva (continua durante todo o desenvolvemento do animal), ou de forma condicional (dependendo da presenza ou non dunha substancia concreta que actúa como activador ou inhibidor, como a tetraciclina; isto permite expresar o xene unicamente nunha fase do desenvolvemento ou nun tecido concreto). Ademais, no vector direccionador o xene modificado está flanqueado por fragmentos dos brazos cromosómicos lindantes co locus do xene de interese (en posición 5' e en posición 3'). Tanto o xene de interese coma os brazos cromosómicos obtéñense a partir dun fragmento do xenoma da zona correspondente, por exemplo a partir dun cromosoma artificial bacteriano (BAC); o xene de interese modifícase por medio de técnicas de bioloxía molecular, e os tres compoñentes (o xene modificado e os brazos) introdúcense (subclónanse) no plásmido. Ademais, o plásmido debe incluír un marcador (que normalmente é a resistencia a un antibiótico) que permita seleccionar as células que incorporaron o xene modificado. Hai diferentes variantes de plásmidos dispoñibles, en función da técnica concreta que se queira utilizar para crear o vector direccionador.
Unha vez construído o vector direccionador (un proceso complexo que pode supoñer varios meses de traballo), este engádese a un cultivo de células nai embrionarias (ES, stem cells, células nai ou troncais), e incorpórase ás células por medio da transfección. O vector direccionador pode recoñecer (por apareamento de bases) a zona do locus de interese, de maneira que por medio do mecanismo de recombinación homóloga, pode producirse un intercambio entre o vector direccionador (que recibe o xene endóxeno) e o locus xenómico (que recibe o xene modificado non funcional). Por este motivo, canto máis longas sexan as secuencias dos brazos de homoloxía que flanquean ao xene modificado, maior será a probabilidade de que se produza recombinación homóloga (e, por tanto, aparezan células co xene modificado), aínda que iso aumenta a dificultade de construción do vector direccionador.
As células nai embrionarias transfectadas sométense entón a selección, utilizando o antibiótico correspondente, de maneira que só sobreviven as que incorporaran no seu xenoma o xene modificado (se o vector non se recombinou, dilúese tras un certo número de divisións celulares). As células que sobreviven ao proceso de selección verifícanse utilizando o método Southern blot, unha técnica de bioloxía molecular que permite comprobar a presenza dunha molécula de ADN concreta nunha mostra de ADN, combinando a separación de fragmentos de ADN por electroforese en xel de agarosa con métodos para transferir os fragmentos de ADN separados por tamaño a unha membrana, que se hibrida cunha sonda específica para detectar a presenza da molécula de interese.
Unha vez comprobado que as células nai embrionarias (ES) substituíron efectivamente o xene endóxeno (que foi extraído, de aí o termo knockout do inglés, entendendo que un conseguiu derribar ou noquear ou interceptar ao outro) polo xene modificado non funcional, algunhas destas células nai embrionarias inocúlanse a blastocitos, que son transplantados a femias pseudopreñadas (no caso de ratos). Os organismos knockout utilízanse para estudar o papel funcional dun determinado xene por defecto, estudando as diferenzas entre o organismo knockout e individuos normais da mesma cepa. Organismos knock-in e knockdown
Un organismo knock-in ou knockin é igual aos anteriores pero en lugar de eliminar un xene determinado este é substituído por unha versión modificada do mesmo, que produce unha variación na súa función (pero non a elimina).
Os organismos knockdown diferéncianse dos knockout e knock-in en que o xene en cuestión segue existindo (non foi eliminado nin substituído), pero a súa expresión é parcialmente bloqueada pola aplicación de diversas técnicas, como a utilización de moléculas que se unen ao xene ou aos seus transcritos. Neste caso a expresión do xene vese moi reducida, pero non completamente eliminada.