Electroforese en xel de campo pulsado

A electroforese en xel de campo pulsado, xeralmente abreviada PFGE, do inglés pulsed-field gel electrophoresis, é unha técnica electroforética de laboratorio utilizada para a separación de moléculas grandes de ADN ao aplicarlle a unha matriz de xel un campo eléctrico que periodicamente cambia de dirección. Historia
As técnicas estándar de electroforese en xel para a separación de moléculas de ADN proporcionou grandes vantaxes na investigación en bioloxía molecular. Porén, non servían para separar con efectividade as moléculas de ADN moi grandes. As moléculas de ADN maiores de 15–20 kb que migran a través dun xel moveranse esencialmente xuntas independentemente do seu tamaño. Na Universidade de Columbia en 1984, David C. Schwartz e Charles Cantor desenvolveron unha variante sobre o protocolo estándar ao introduciren un gradiente de voltaxe alternante para mellorar a resolución desas moléculas máis grandes.
Esta técnica acabou coñecéndose como electroforese en xel de campo pulsado ou en campo pulsado (PFGE). O desenvolvemento da PFGE ampliou o rango de resolución de fragmentos de ADN en dúas ordes de magnitude. Procedemento
O procedemento desta técnica é relativamenre similar ao usado ao realizar unha electroforese en xel estándar excepto que en vez de aplicar constantemente a voltaxe nunha soa dirección, esta é cambiada periodicamente entre tres direccións; unha que se aplica polo eixe central do xel e dúas que se aplican nun ángulo de 60 graos a ambos os lados. Os tempos dos pulsos eléctricos son iguais en cada dirección, o que ten como resultado a migración neta cara a adiante do ADN. Para moléculas extremadamente grandes (de ata unhas 2 Mb), poden utilizarse incrementos no intervalo de cambio que aumenten os tempos dos pulsos en cada dirección durante o lapso de varias horas, por exemplo, incrementando o pulso linearmente desde 10 segundos a 0 horas a 60 segundos a 18 horas.
Este procedemento leva máis tempo que a electroforese en xel normal debido ao tamaño dos fragmentos que se van resolver e a que o ADN non se move en liña recta a través do xel. Teoría
Aínda que en xeral os fragmentos pequenos de ADN poden abrirse paso a través da matriz do xel máis doadamente que os fragmentos grandes, existe un limiar de lonxitudes por riba dos 30–50 kb, nos que os fragmentos grandes se moverán todos á mesma velocidade e aparecen nun xel como unha soa banda grande difusa.
Porén, co cambio periódico da dirección do campo, as diversas lonxitudes do ADN reaccionan ao cambio a diferentes velocidades. É dicir, os fragmentos máis grandes serán máis lentos á hora de realiñar a súa carga cando se cambia a dirección do campo, mentres que os máis pequenos serán máis rápidos. Co paso do tempo con este consistente cambio de direccións, cada banda empezará a separarse máis e máis mesmo cando son de lonxitudes moi grandes. Así, faise posible a separación de cachos de ADN moi grandes usando PFGE. Aplicacións
A PFGE pode utilizarse para a xenotipificación ou a pegada xenética. Considérase xeralmente como o procedemento estándar en estudos de epidemioloxía de organismos patóxenos. Por exemplo, a subtipificación fíxose máis doada para discriminar entre cepas de Listeria monocytogenes e así ligar os illamentos ambientais ou alimentarios coas infeccións clínicas.