PCR con transcriptase inversa

A reacción en cadea da polimerase con transcriptase inversa (ou PCR tras transcriptase inversa), abreviada como RT-PCR (do inglés reverse transcriptase PCR) é unha das moitas variantes da reacción en cadea da polimerase (PCR) na que previamente se realiza unha reversotranscrición. Esta técnica úsase comunmente en bioloxía molecular para detectar a expresión do ARN. A PCR con transcriptase inversa (RT-PCR) confúndese a miúdo coa PCR en tempo real ou cuantitativa (qPCR), que ás veces tamén se ve abreviada como RT-PCR (real time). Porén, son técnicas distintas. A PCR con reversotranscriptase (RT-PCR) utilízase para detectar cualitativamente a expresión xénica por medio da creación dun ADN complementario (ADNc) reversotranscrito a partir dun ARN, mentres que, ao contrario, a qPCR úsase para medir cuantitativamente a amplificación dun ADN usando sondas fluorescentes en tempo real.
Tamén hai que distinguir entre a RT-PCR e a PCR tradicional. Aínda que a PCR con transcriptase inversa (RT-PCR) e a PCR tradicional producen ambas moitas copias dun ADN particular illado por amplificación, as aplicacións das dúas técnicas son moi distintas. A PCR tradicional utilízase para amplificar exponencialmente secuencias de ADN dianas. A RT-PCR utilízase para clonar xenes expresados por reversotranscrición do ARN de interese a un ADN complementario por medio do uso do encima transcriptase inversa. Seguidamente, o que se fai é que ese ADNc sintetizado novamente é amplificado usando a PCR tradicional.
Tamén é posible combinar a RT-PCR coa qPCR. Ademais do estudo cualitativo da expresión xénica, tamén se pode, facendo uso neste caso da PCR cuantitativa (qPCR), cuantificar o ARN, tanto en termos absolutos coma relativos, técnica que se utilizaría conxuntamente coa RT-PCR. A técnica combinada (RT-PCR + qPCR) denomínase "RT-PCR cuantitativa" ou "RT-PCR en tempo real"), que a miúdo se abrevia como qRT-PCR, ou RT-qPCR, ou RRT-PCR. Comparado con outros métodos de cuantificación do ARN, como o northern blot, a qRT-PCR considérase que é a proba cuantitativa máis potente e sensible para a detección dos niveis do ARN. Utilízase frecuentemente na análise de expresión dun ou moitos xenes, e os patróns de expresión para a identificación de infeccións e doenzas.
Para evitar calquera tipo de confusión, na seguinte táboa figuran as abreviacións que se utilizarán neste artigo de agora en adiante e a técnica á que se refiren: Historia
Desde a súa introdución en 1977, o northern blot utilizouse amplamente para a cuantificación do ARN malia as súas limitacións: (a) é unha técnica lenta que necesita moito tempo, (b) require unha gran cantidade de ARN para a detección, e (c) é cuantitativamente inexacta cando o cantido de ARN é pouco abundante. Porén, o descubrimento da transcriptase inversa durante o estudo da replicación do material xenético de certos virus levou ao desenvolvemento da RT-PCR, que desde entón desprazou á northern blot como método de elección para a detección e cuantificación de ARN.
A RT-PCR creceu en importancia ata converterse na tecnoloxía estándar para a detección ou comparación de niveis de ARN por varias razóns: (a) non require un procesamento post-PCR, (b) pode medirse un amplo rango en canto á abundancia de ARN (>107 veces máis), e (c) proporciona datos cuantitativos e cualitativos. Debido á súa simplicidade, especificidade e sensibilidade, a RT-PCR utilízase en moi variadas aplicacións desde experimentos tan simples como a cuantificación de células de lévedos no viño a usos máis complexos como ferramenta de diagnóstico para detectar axentes infecciosos como o virus da gripe aviaria. Principios
Na RT-PCR, o molde de ARN é convertido primeiro en ADN complementario (ADNc) usando unha transcriptase inversa. O ADNc utilízase despois como molde para a amplificación exponencial usando PCR. A RT-PCR é actualmente o método máis sensible para a detección de ARN de que se dispón. O uso da RT-PCR para a detección de transcritos de ARN revolucionou o estudo da expresión xénica nos seguintes importantes modos: Fixo teoricamente posible detectar os transcritos de practicamente calquera xene
Permitiu a amplificación de mostras e eliminou a necesidade de ter un material inicial abondoso como ocorre se se usa unha análise por northern blot.
Proporcionou tolerancia á degradación do ARN con tal de que estea intacto o ARN que abrangue o cebador.
RT-PCR dun paso fronte a RT-PCR de dous pasos
A cuantificación do ARNm usando a RT-PCR pode conseguirse cunha reacción dun paso (ou etapa) ou de dous pasos. A diferenza entre estes dous enfoques está no número de tubos utilizados cando se realiza o procedemento. No enfoque dun paso, toda a reacción desde a síntese do ADNc á amplificación do PCR ocorre nun só tubo. Por outra parte, a reacción en dous pasos require que a reacción da transcriptase inversa e a amplificación da PCR se realicen en tubos separados. O enfoque nun paso pénsase que minimiza a variación experimental ao conter todas as reaccións encimáticas nun só ambiente. Porén, neste método dun paso os moldes de ARN iniciais son propensos á degradación, e o uso desta modalidade non se recomenda cando cómpre facer ensaios repetidos a partir da mesma mostra. Adicionalmente, o enfoque nun paso é menos exacto en comparación co método en dous pasos. Tamén é o método preferido de análise cando se usan tinguiduras que se unen ao ADN como o SYBR Green (verde SYBR), xa que pode conseguirse a eliminación de dímeros de cebadores por medio dun simple cambio na temperatura de fusión. A desvantaxe da metodoloxía en dous pasos é a súa susceptibilidade á contaminación debido a un manexo das mostras máis frecuente.
RT-PCR de punto final fronte a RT-PCR en tempo real
A cuantificación dos produtos de RT-PCR pode dividirse grosso modo en dúas categorías: de punto final e en tempo real. O uso da RT-PCR de punto final é preferible para medir os cambios na expresión xénica nun pequeno número de mostras, pero a RT-PCR en tempo real converteuse no método estándar para validar os resultados obtidos en análises de matrices (arrays) ou os cambios na expresión xénica a escala global.
RT-PCR de punto final
O método de medida con RT-PCR de punto final require a detección dos niveis de expresión xénica usando tinguiduras fluorescentes como o bromuro de etidio, a etiquetaxe con P32 de produtos de PCR, ou a contaxe de escintileos. A RT-PCR de punto final realízase comunmente usando tres posibles métodos: relativo, competitivo e comparativo. RT-PCR relativa: A cuantificación relativa de RT-PCR implica a coamplificación dun control interno simultaneamente co xene de interese. O control interno utilízase para normalizar as mostras. Unha vez normalizadas, pode facerse unha comparación directa das abundancias de transcritos relativas en múltiples mostras de ARNm. Debe terse a precaución de elixir un control interno que non se vexa afectado polo tratamento experimental. O nivel de expresión debería ser constante en todas as mostras e co ARNm de interese para que os resultados sexan precisos e significativos. Como a cuantificación dos resultados se analiza comparando o rango lineal da diana e a amplificación control, é crucial ter en conta a concentración das moéculas diana iniciais e a súa taxa de amplificación antes de empezar a análise. Os resultados da análise exprésanse como as taxas de sinal do xene con respecto ao sinal control, e os valores poden usarse despois para a comparación entre as mostras na estimación da expresión do ARN diana relativa. RT-PCR competitiva: A técnica da RT-PCR competitiva úsase para a cuantificación absoluta. Supón usar un ARN “competitor” sintético que pode distinguirse do ARN diana por unha pequena diferenza de tamaño ou secuencia. É importante no deseño do ARN sintético que sexa idéntico en secuencia pero lixeiramente máis curto que o ARN diana para que os resultados sexan exactos. Unha vez deseñado e sintetizado, engádese unha cantidade coñecida do ARN competidor ás mostras experimentais e é coamplificado coa diana usando RT-PCR. Despois, faise unha curva de concentración do ARN competidor e utilízase para comparar os sinais de RT-PCR producidos a partir dos transcritos endóxenos para determinar a cantidade de diana presente na mostra. RT-PCR comparativa: A RT-PCR comparativa é similar á RT-PCR competitiva en que o ARN diana compite polos reactivos de amplificación nunha soa reacción cun estándar interno de secuencia non relacionada. Unha vez que a reacción é completa, os resultados compáranse cunha curva estándar externa para determinar a concentración de ARN diana. En comparación aos métodos de cuantificación competitivo e relativo, a RT-PCR comparativa considérase que é o método máis conveniente, xa que non se necesita que o investigador realice un experimento piloto; na RT-PCR relativa, o rango de amplificación exponencial do ARNm debe ser predeterminado e na RT-PCR competitiva, debe sintetizarse un ARN competidor sintético.
RT-PCR en tempo real
A aparición de novas técnicas de etiquetaxe fluorescente do ADN nos últimos anos permitiu a análise e detección de produtos de PCR en tempo real e en consecuencia levou a unha ampla adopción da RT-PCR en tempo real para a análise da expresión xénica. Agora a RT-PCR en tempo real non só é o método de elección para a cuantificación da expresión xénica, senón que tamén é o método preferido para obter resultados das análises de matrices (array) e expresións xénicas a escala global. Actualmente, disponse de catro sondas fluorescentes de ADN distintas para a detección por RT-PCR en tempo real de produtos de PCR, que son: SYBR Green, TaqMan, Molecular Beacons, e Scorpions. Todas estas sondas permiten a detección de produtos de PCR xerando un sinal fluorescente. Aínda que a tinguidura SYBR Green emite o seu sinal fluorescente simplemente ao unirse ao ADN bicatenario en solución, a xeración de fluorescencia das sondas TaqMan, Molecular Beacons e Scorpions dependen do acoplamento por transferencia de enerxía de resonancia de Förster (FRET) da molécula da tinguidura e un residuo amortecedor da fluorescencia (quencher) nos substratos oligonucleotídicos. SYBR Green: Cando se une o SYBR Green aos ADNs bicatenarios produtos de PCR, emite luz cando é excitado. A intensidade da fluorescencia increméntase a medida que se acumulan os produtos de PCR. Esta técnica é fácil de usar xa que non é necesario deseñar sondas dada a falta de especificidade da súa unión. Porén, como a tinguidura non discrimina entre o ADN bicatenario correspondente aos produtos de PCR e aquel outro que corresponde aos dímeros de cebadores, preséntase o problema frecuente de que se produce unha sobreestimación da concentración da diana. Cando é absolutamente necesario facer unha cuantificación con precisión, deben realizarse máis ensaios para a validación dos resultados. Con todo, entre os métodos de detección de produtos de RT-PCR en tempo real, o SYBR Green é o máis económico e doado de usar. Sondas TaqMan: As sondas TaqMan son oligonucleótidos que teñen unha sonda de fluorescencia unida no seu extremo 5' e un amortecedor da fluorescencia (quencher) no 3'. Durante a amplificación da PCR, estas sondas hibrídanse ás secuencias diana localizadas no amplicón, e a medida que a polimerase replica o molde coa TaqMan unida, tamén clivan a sonda fluorescente debido á actividade de polimerase 5'- nuclease. Como a estreita proximidade entre a molécula quencher e a sonda fluorescente impide normalmente que se detecte a fluorescencia por medio de FRET, os resultados de desacoplamento teñen como resultado un incremento da intensidade da fluorescencia proporcional ao número de ciclos de clivaxe de sondas. Aínda que as sondas TaqMan ben deseñadas producen resultados de RT-PCR en tempo real exactos, sintetizalas é caro e require moito tempo cando hai que facer sondas separadas para cada diana de ARNm analizada.
Sondas Molecular Beacon: As sondas Molecular Beacon son similares ás TaqMan, e tamén se usa con elas a detección FRET con sondas fluorescentes unidas ao extremo 5' e un quencher unido ao extremo 3' dun substrato oligonuceotídico. Porén, mentres que as sondas TaqMan fluorescentes se clivan durante a amplificación, as sondas Molecular Beacon permanecen intactas e poden volver a unirse a unha nova diana durante cada ciclo de reacción. Cando están libres en disolución, a estreita proximidade da sonda fluorescente e da molécula do quencher impide a fluorescencia por medio de FRET. Porén, cando as sondas Molecular Beacon se hibridan coa diana, a tinguidura fluorescente e o quencher están separados orixinando unha emisión de luz despois da excitación. Como ocorre coas sondas TaqMan, as Molecular Beacons son caras de sintetizar e cómpren sondas separadas para cada ARN diana. Sondas Scorpion: As sondas Scorpion, igual que as Molecular Beacon, non son activas fluorescentemente nun estado non hibridado, de novo debido a que a sonda fluorescente do extremo 5' é amortecida (quenched) polo residuo do extremo 3' do oligonucleótido. Porén, nas sondas Scorpions o extremo 5' tamén contén unha secuencia que é complementaria do produto de extensión do cebador no extremo 5'. Cando a extensión Scorpion se une ao seu complemento no amplicón, abre a estrutura Scorpion, impide o FRET, e permite medir o sinal fluorescente. Sondas múltiplex: As sondas TaqMan, Molecular Beacons e Scorpions permiten que se fagan medidas simultáneas de produtos de PCR nun só tubo. Isto é posible porque cada unha das distintas tinguiduras fluorescentes pode ser asociada cun espectro de emisión específico. O uso de sondas múltiplex non só aforra tempo e esforzos sen comprometer a utilidade das probas, senón que a súa aplicación en moitos campos de investigación como a análise de delecións de xenes, análises de mutacións e polimorfismo, análise cuantitativa, e detección de ARN, fan que sexa unha valiosa técnica nos laboratorios de moitas disciplinas científicas.
Empréganse xeralmente dúas estratexias para cuantificar os resultados obtidos coa RT-PCR en tempo real; o método da curva estándar e o método do limiar comparativo. Aplicacións
A amplificación exponencial por medio de PCR con transcriptase inversa é unha técnica moi sensible coa cal poden detectarse un número moi baixo de copias de moléculas de ARN. A RT-PCR úsase moito na diagnose de doenzas xenéticas e, semicuantitativamente, na determinación da abundancia de moléculas de ARN diferentes específicas contidas nunha célula ou tecido como medida da expresión xénica.
Métodos de investigación
A RT-PCR utilízase comunmente en métodos de investigación para medir a expresión xénica. Por exemplo, Lin et al. usaron qRT-PCR para medir a expresión dos xenes Gal en células de lévedos. Primeiro, Lin et al. produciron por enxeñaría unha mutación dunha proteína sospeitosa de participar na regulación dos xenes Gal. Hipotetizouse que esta mutación impedía selectivamente a expresión de Gal. Para confirmar isto, os niveis de expresión xénica das células de lévedos que conteñen esta mutación foron analizados usando qRT-PCR. Os investigadores puideron determinar selectivamente que a mutación desta proteína reguladora reducía a expresión de Gal. As análises de northern blot utilízanse para estudar máis a fondo a expresión xénica do ARN.
Inserción xénica
A RT-PCR pode tamén ser moi útil na inserción de xenes eucariotas en organismos procariotas. Como a maioría dos xenes eucariotas conteñen intróns, que están presentes no xenoma pero non no ARNm maduro, o ADNc que se xera coa reacción da RT-PCR é a secuencia de ADN exacta (se non temos en conta a natureza tendente ao erro das transcriptases inversas) que sería traducida directamente a proteínas despois da transcrición. Cando estes xenes se expresan en células procariotas co fin de producir ou purificar proteínas, o ARN producido directamente da transcrición non necesita sufrir splicing xa que o transcrito contén só exóns. (Os procariotas, como E. coli, carecen do mecanismo de splicing eucariótico).
A RT-PCR úsase frecuentemente para estudar os xenomas de virus, cuxos xenomas están compostos de ARN, como o influenzavirus A e retrovirus como o VIH.
Diagnóstico de doenzas xenéticas
A RT-PCR pode usarse para diagnosticar doenzas xenéticas como a síndrome de Lesch–Nyhan. Esta doenza xenética é causada por un mal funcionamento do xene HPRT1, que clinicamente orixina cálculos urinarios de ácido úrico e síntomas similares á gota. Se se analizan os niveis de expresión de ARNm de HPRT1 dunha nai preñada e o feto pode descubrirse se a nai é portadora e se o feto ten probabilidades de desenvolver a síndrome de Lesch–Nyhan.
Tamén pode usarse como unha proba para a gripe aviaria H7N9.
Detección do cancro
Os científicos están a traballar en dúas vías para usar a RT-PCR na detección do cancro para axudar a mellorar a prognose, e monitorizar a resposta á terapia. As células tumorais circulantes producen transcritos de ARNm exclusivos dependendo do tipo de cancro. A meta procurada é determinar que transcritos de ARNm serven como mellores biomarcadores para un tipo de célula de cancro particular e despois analizar os seus niveis de expresión con RT-PCR. Inconvenientes
Malia as súas grandes vantaxes, a RT-PCR ten tamén inconvenientes. O crecemento exponencial do ADN complementario reversotranscrito durante os múltiples ciclos de PCR produce unha cuantificación de punto final inexacta debido á dificultade de manter a lineariedade. Para proporcionar unha axeitada detección e cuantificación do contido de ARN nunha mostra, desenvolveuse a qRT-PCR usando modificacións baseadas en fluorescencia para monitorizar os produtos de amplificación durante cada ciclo de PCR. A extrema sensibilidade da técnica pode ser unha espada de dobre gume, xa que mesmo a máis lixeira contaminación do ADN pode levar a resultados non desexados. Un método simple para a eliminación de resultados de falsos positivos é incluír áncoras, ou tags, na rexión 5' dun cebador específico dun xene. Ademais, os estudos de planeamento e cuantificación poden ser un reto técnico debido á existencia de numerosas fontes de variación como a concentración de moldes e a eficiencia de amplificación. Protocolo
A RT-PCR pode realizarse polo protocolo da RT-PCR nun paso ou polo da RT-PCR en dous pasos.
RT-PCR nun paso
A RT-PCR nun paso toma dianas de ARNm (de ata 6 kb) e sométeas a unha transcrición inversa e despois a amplificación por PCR nun só tubo de ensaio. Úsase só ARN intacto de alta calidade para obter os mellores resultados. Hai que asegurarse de usar un cebador específico de secuencia. Selecciónase un kit de RT-PCR nun paso, que debería incluír unha mestura coa transcriptase inversa e o sistema PCR como a Taq polimerase e unha polimerase con corrección de probas.
Obtéñense todos os materiais necesarios, equipamento e instrumentos (os kits deberían incluír unha lista detallada das cousas necesarias).
Prepárase unha mestura de reacción, que inclúe dNTPs, cebadores, ARN molde, encimas necesarios e unha solución tampón.
Engádese a mestura a un tubo de PCR para cada reacción. Despois engádese o ARN molde.
Sitúanse os tubos de PCR no termociclador para empezar os ciclos. O primeiro ciclo é a síntese por transcrición inversa do ADNc. O segundo ciclo é a [[desnaturalización inicial. Durante este ciclo inactívase a transcriptase inversa. Os seguintes 40 a 50 ciclos constitúen o programa de amplificación, que consta de tres pasos: (1) desnaturatlización, (2) aliñamento (annealing), (3) elongación.
Os produtos de RT-PCR poden despois ser analizados por medio dunha electroforese en xel.
(Manual de Aplicacións de PCR e Bioferramentas)
RT-PCR en dous pasos
A RT-PCR en dous pasos, como indica o seu nome, realízase en dúas etapas. Primeiro a transcrición inversa e despois a PCR. Este método é máis sensible que o método nun paso. Os kits son tamén útiles para a RT-PCR en dous pasos. Igual que no método nun paso, usan só ARN de alta calidade intacto para obter os mellores resultados. Os cebadores para o método en dous pasos non teñen que ser específicos de secuencia.
Paso un
Combínase a mestura do ARN molde, o cebador, e os dNTP, e auga libre de nuclease nun tubo de PCR.
Engádese un inhibidor da RNase e a transcriptase inversa ao tubo de PCR.
Sitúase o tubo de PCR no termociclador para un ciclo que inclúe o aliñamento (annealing), extensión e despois inactivación da transcriptase inversa.
Procédese directamente á PCR ou almacénase en xeo ata que se poida realizar a PCR.
Paso dous
Engádese a cada tubo de PCR unha mestura mestra que conteña tampón, dNTPs, MgCl2, Taq polimerase e auga libre de nuclease.
Engádese un cebador axeitado.
Sitúanse os tubos de PCR no termociclador para realizar un programa de amplificación ded 30 ciclos, que inclúe tres pasos: (1) desnaturalización, (2) aliñamento (annealing), e (3) elongación.
Os produtos de RT-PCR poden ser analizados despois por electroforese en xel. Directrices para a publicación
Os ensaios de RT-PCR cuantitativa considéranse hoxe o procedemento estándar para medir o número de copias de dianas de ADNc específicas nunha mostra, pero, a pesar diso, están moi pouco estandarizados. Como resultado, aínda que hai moitos artigos nas publicacións nos que se indica que se utilizou esta técnica, moitos deles proporcionan detalles experimentais e usan análises de datos inadecuados para tirar conclusións inapropiadas. Debido á variabilidade inherente na calidade de calquera dato de PCR cuantitativa, os revisores dos artigos non só teñen dificultades para avalialos, senón que ás veces algúns estudos son case imposibles de replicar. Recoñecendo que existe unha necesidade de estandarización dos informes sobre as condicións experimentais, un consorcio internacional de científicos académicos publicou as directrices do chamado Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments (MIQE). As directrices MIQE describen a información mínima necesaria para avaliar os experimentos de PCR cuantitativa que se deberían requirir para a súa publicación para así favorecer unha mellor práctica expermental e asegurar a relevancia, exactitude, interpretación correcta, e repetibilidade dos experimentos con datos de PCR cuantitativa.
Ademais destas directrices á hora de informar dos experimentos, o MIQE fai fincapé na necesidade de estandarizar a nomenclatura asociada coa PCR cuantitativa para evitar confusión; por exemplo, a abreviatura qPCR debería usarse para a PCR en tempo real cuantitativa, mentres que RT-qPCR debería utilizarse para a técnica combinada de reverso transcrición-qPCR, e os xenes utilizados para a normalización deberían denominarse xenes de referencia en lugar de xenes de mantemento (housekeeping). Tamén propón que os termos derivados de nomes comerciais como sondas TaqMan® non deberían utilizarse e no seu lugar debería falarse de sondas de hidrólise. Adicionalmente, proponse que se use a denominación ciclo de cuantificación (Cq) para describir o ciclo de PCR usado para a cuantificación en troques dos termos ciclo limiar (Ct, threshold cycle), punto de cruzamento (Cp, crossing point), e punto de arranque (TOP, takeoff point), que son tres termos utilizados para referirse ao mesmo valor acuñados por diferentes fabricantes de instrumentos para PCR en tempo real.
As directrices constan dos seguintes elementos: 1) deseño experimental, 2) mostra, 3) extracción do ácido nucleico, 4) transcrición inversa, 5) información sobre a diana da qPCR, 6) oligonucleótidos, 7) protocolo, 8) validación, e 9) análise de datos. Diversos asuntos dentro de cada elemento foron etiquetados coas letras E (esencial) ou D (desexable). Os que se etiquetan con E considéranse fundamentais e indispensables, mentres que os que se etiquetan con D considéranse periféricos aínda que importantes para unha mellor práctica.