ADN extracromosómico

O ADN extracromosómico ou DNA extracromosómico (abreviado ADNec ou, en inglés, ecDNA) é o ADN que se encontra fóra dos cromosomas, xa sexa dentro ou fóra do núcleo dunha célula. A maior parte do ADN nun xenoma individual atópase formando parte dos cromosomas que nos eucariotas están contidos no núcleo. Existen múltiples formas de ADN extracromosómico e aínda que adoitan ter importantes funcións biolóxicas, tamén poden exercer un papel en enfermidades como o cancro.
En procariotas o ADN extracromosómico non viral atópase fundamentalmente en plásmidos, mentres que en eucariotas atópase esencialmente dentro de orgánulos. O ADN mitocondrial é a principal fonte deste tipo de ADN en eucariotas. O feito que este orgánulo conteña o seu propio ADN e que sexa circular apoia a hipótese de que as mitocondrias se orixinaron como células bacterianas fagocitadas e incorporadas (simbioxénese) ás células eucariotas ancestrais. O ADN extracromosómico utilízase a miúdo en investigacións sobre a replicación do ADN porque é doado de identificar e de illar. Non todos os plásmidos son circulares; algúns son lineais.
Aínda que o ADN extracromosómico circular (ADNecc ou, en inglés, eccDNA) se encontra de forma normal nas células eucariotas, o termo ADN extracromosómico (ADNec) tamén se usa para designar unha variante específica que comprende ADNs que foron identificados no núcleo das células cancerosas e portan moitas copias de posibles oncoxenes. Este ADNec considérase que é a maneira primaria de orixinar unha amplificación xénica, que dá lugar a múltiples copias de posibles oncoxenes e cancros moi agresivos. Nas células cancerosas, o ADNec íllase fundamentalmente no núcleo (ver).
O ADN extracromosómico que se encontra no citoplasma é estruturalmente diferente do ADN nuclear. O ADN citoplasmático está menos metilado que o nuclear. As secuencias do ADN citoplasmático son diferentes das nucleares nun mesmo organismo, polo que este ADN non pode ser simplemente un fragmento do ADN nuclear e debe ter outra orixe. En bacterias atopáronse segmentos de ADN extracromosómicos monocatenarios non circulares que están unidos a un ARN e codifican unha reversotranscritase (ver retron), chamados ADN monocatenario multicopia.
Ademais do ADN que se atopou fóra do núcleo das células eucariotas, a infección por xenomas virais tamén dá lugar a outro exemplo de ADN extracromosómico. Plásmidos procariotas
Aínda que os organismos procariotas non posúen un núcleo rodeado de membrana coma o dos eucariotas, conteñen unha rexión central chamada nucleoide na cal se encontra o seu gran cromosoma circular e superenrolado. Fóra desta rexión os procariotas poden ter pequenas moléculas de ADN circulares ou lineais chamadas plásmidos. Os plásmidos bacterianos son normalmente secuencias curtas, que constan dun cento a uns poucos centos de quilobases (kb), e conteñen unha orixe de replicación que lles permite replicarse independentemente do cromosoma bacteriano. Pode haber varios plásmidos diferentes nunha célula. Ademais, o número total de copias dun determinado plásmido nunha célula pode ser desde só dúas copias ata varios centos de copias por célula. Os plásmidos bacterianos circulares clasifícanse de acordo coas súas funcións especiais proporcionadas polos xenes que conteñen. Os plásmidos de fertilidade ou plásmidos f, permiten a conxugación bacteriana, mentres que os plásmidos de resistencia ou plásmidos r, conteñen xenes que lles dan resistencia a diversos antibióticos, como a ampicilina e a tetraciclina. Os plásmidos de virulencia conteñen os elementos xenéticos necesarios para que a bacteria sexa patóxena. Os plásmidos degradativos conteñen xenes grazas aos cales a bacteria pode degradar varias substancias como compostos aromáticos e xenobióticos. Os plásmidos bacterianos poden tamén funcionar na produción de pigmentos, a fixación do nitróxeno e a resistencia a metais pesados.
Os plásmidos circulares naturais poden modificarse para que conteñan múltiples xenes de resistencia e varios sitios de restrición únicos, o que os converte en ferramentas moi valiosas como vectores de clonación en biotecnoloxía. Os plásmidos bacterianos circulares son tamén a base da produción de vacinas de ADN. As vacinas de ADN de plásmido son preparadas por enxeñaría xenética para que conteñan un xene que codifica un antíxeno ou unha proteína producida por un virus patóxeno, unha bacteria ou outro parasito. Unha vez entregada a vacina no corpo do hóspede, os produtos dos xenes do plásmido estimularán a resposta inmunitaria innata e a resposta inmunitaria adaptativa do hóspede. Os plásmidos adoitan cubrirse con algún tipo de adxuvante antes da súa entrega para potenciar a resposta inmunitaria do hóspede.
Identificáronse plámidos bacterianos lineais en varias especies de bacterias espiroquetas, como nas do xénero Borrelia (ao que pertence a especie que causa a enfermidade de Lyme), varias especies de bacterias do solo grampositivas do xénero Streptomyces, e especies gramnegativas como Thiobacillus versutus, unha bacteria que oxida o xofre. Os plásmidos lineais dos procariotas poden conter un bucle en forquita ou unha proteína unida covalentemente ao extremo telomérico da molécula de ADN. Os bucles en forquita ricos en adenina-timina de Borrelia teñen un tamaño desde os 5 quilopares de bases (kb) a uns 200 kb e conteñen os xenes responsables da produción dun grupo de proteínas de superficie ou antíxenos da bacteria, que permiten a esta evadirse da resposta inmune do hóspede ao que infectou. Os plásmidos lineais que conteñen unha proteína unida covalentemente ao extremo 5’ das febras de ADN denomínase invertróns e poden ter un tamaño desde 9 kb a unhas 600, e constan de repeticións terminais invertidas. Os plásmidos lineais cunha proteína unida covalentemente poden axudar á conxugación bacteriana e á integración dos plásmidos no xenoma. Estes tipos de plásmidos lineais representan a clase máis grande de ADN extracromosómico, xa que non só están presentes en certas células bacterianas, senón que todas as moléculas de ADN extracromosómico atopadas en células eucariotas tamén adoptan esta estrutura de invertrón cunha proteína unida ao extremo 5’.
Algúns autores utilizan o termo episoma en procariotas para referirse a plásmidos que poden integrarse no cromosoma bacteriano. Pero este termo tamén se usa en eucariotas para significar unha molécula de ADN circular pechado extracromosómico non integrado que pode replicarse no núcleo.
Os "borgs" longos e lineais que aparecen xunto con especies de arqueas (que poden albergalos e compartir moitos dos seus xenes) poderían ser unha forma descoñecida de estruturas de ADN extracromosómico. Eucariotas
Mitocondrial
As mitocondrias presentes nas células eucariotas conteñen moitas copias de ADN mitocondrial (ADNmt) na matriz mitocondrial. En animais pluricelulares, incluíndo os humanos, o cromosoma circular do ADNmt contén 13 xenes que codifican proteínas que forman parte da cadea de transporte de electróns e 24 xenes para ARNs mitocondriais; 2 de ARNr e 22 de ARNt. O tamaño do ADNmt animal é dunhas 16, 6 kb e, aínda que contén xenes para os ARNt e a síntese de ARNm, tamén son necesarias proteínas codificadas nos xenes nucleares para que o ADNmt se poida replicar ou para que se traduzan as proteínas mitocondriais. Só hai unha rexión do cromosoma mitocondrial humano que non contén unha secuencia codificante, a rexión dun 1 kb coñecida como bucle D, ao que se unen proteínas regulatorias nucleares. O número de moléculas de ADNmt por mitocondria varía de especie a especie, así como entre células con diferentes demandas enerxéticas. Por exemplo, as células musculares e hepáticas conteñen máis copias de ADNmt por mitocondria que os leucocitos do sangue ou as células da pel. Debido á súa proximidade á cadea de transporte electrónico mitocondrial da membrana mitocondrial interna e á produción de especies reactivas do oxíxeno (ROS), e debido a que a molécula de ADNmt non está asociada e protexida por histonas, o ADNmt é máis susceptible de sufrir danos que o ADN nuclear. En casos nos que ocorren danos no ADNmt, o ADN pode repararse polas vías da reparación por escisión de bases, ou é destruído (sen causar danos á mitocondria, xa que hai múltiples copias de ADNmt por mitocondria).
O código xenético estándar que se utiliza para traducir os xenes nucleares é practicamente universal, o que significa que cada secuencia de 3 bases do ADN ou codóns (e da súa copia complementaria de ARN) codifica o mesmo aminoácido en todas as especies (cunhas poucas excepcións nalgúns codóns nalgunhas especies). Porén, este código é lixeiramente diferente no ADN mitocondrial de fungos, animais, protistas e plantas. Aínda que a maioría dos codóns do ADNmt destes organismos tamén codifica o mesmo aminoácido que o do código xenético nuclear, nalgúns é diferente. As diferenzas de codificación pénsase que son o resultado de modificacións químicas no ARN transferente que interacciona co ARN mensaxeiro producido como resultado da transcrición das secuencias de ADNmt.
Cloroplástico
Os cloroplastos eucariotas, e outros tipos de plastidios, tamén conteñen moléculas de ADN extracromosómico. A maioría dos cloroplastos albergan todo o seu material xenético nun só cromosoma con forma de anel, pero nalgunhas especies hai evidencias de múltiples aneis máis pequenos ou plásmidos. Unha teoría recente que cuestiona o modelo estándar corrente de ADN cloroplástico con forma de anel (ADNcp), suxire que o ADNcp pode adoptar máis comunmente forma lineal. Unha soa molécula de ADNcp pode conter de 100 a 200 xenes e varía en tamaño entre especies. O tamaño do ADNcp en plantas superiores é de arredor de 120–160 kb. Os xenes atopados no ADNcp codifican os ARNm que son responsables de producir os compoñentes necesarios da vía fotosintética, así como os ARNt, ARNr, subunidades da ARN polimerase e das proteínas ribosómicas. Igual que o ADNmt, o ADNcp non é completamente autónomo e depende de produtos dos xenes nucleares para a replicación e a produción de proteínas dos cloroplastos. Os cloroplastos conteñen múltiples copias de ADNcp e o número pode variar non só entre especies ou tipos de célula, senón tamén nunha soa célula dependendo da idade e do estadio de desenvolvemento da célula. Por exemplo, o contido de ADNcp nos cloroplastos de células xoves, durante as primeiras etapas de desenvolvemento onde os cloroplastos están en forma de proplastidios indistintos, son moito maiores que os presentes cando esa célula madura e se agranda e contén plastidios completamente maduros.
ADN extracromosómico circular (ADNecc)
O ADN extracromosómico circular (ADNecc ou, en inglés eccDNA) é un tipo de ADN bicatenario circular que se encontra no núcleo de células de animais (tamén humanas) e de plantas e probablemente de todos os eucariotas. Non ten que ver con outros ADNs circulares (mitocondrial, cloroplástico, plasmidial), senón que deriva do ADN xenómico nuclear e podería ser un subproduto de recombinacións. Pode ter un tamaño desde 50 pares de bases a varios millóns de pares de bases e pode codificar xenes e elementos regulatorios. En plantas o ADNecc contén secuencias repetidas similares ás que se encontran nas rexións centroméricas dos cromosomas e no ADN satélite repetitivo e mide de 2. 000 a 20. 000 pares de bases. En animais as moléculas de ADNecc conteñen secuencias repetitivas observadas no ADN satélite, ADN ribosómico de 5S e no telómero. Certos organismos, como os lévedos, dependen da replicación do ADN cromosómico para poder producir ADNecc, mentres que a súa formación noutros organismos, como os mamíferos, pode producirse independentemente do proceso de replicación. A función do ADNecc non foi suficientemente estudada, pero propúxose que a produción de elementos de ADNecc a partir de secuencias de ADN engade plasticidade ao xenoma eucariota e pode influír na estabilidade do xenoma, envellecemento celular e evolución dos cromosomas. Pode atoparse en células normais e tumorais. Algunhas veces estas moléculas aparecen en pares e denomínanse diminutos dobres, pero non sempre.
Un tipo especial de ADN extracromosómico circular é o ADNec que se encontra en células humanas cancerosas. Este ADN das células cancerosas contén un ou máis xenes que lle confiren unha vantaxe selectiva e é moito máis grande que os ADNecc máis típicos e mesmo é visible co microscopio óptico, con tamaños de 1-3 MB ou máis. Nas células cancerosas humanas viuse que este ADN leva moitas copias de posibles oncoxenes, que son transcritos nas células tumorais. Crese que contribúe ao crecemento do cancro.
Ferramentas especializadas para identificar o ADNec son: Software desenvolvido por Paul Mischel e Vineet Bafna, que permite identificar o ADNec en imaxes microscópicas.
"Circle-Seq, un método para illar fisicamente o ADNec das células, eliminando calquera resto de ADN lineal con encimas, e secuenciando o ADN circular que permanece, desenvolvido por Birgitte Regenberg e o seu equipo na Universidade de Copenhague.
Outros tipos de ADN extracromosómico circular son o ADN circular polidisperso pequeno (spcDNA), os círculos teloméricos e o microADN. Viral
Os ADN virais son outros exemplos de ADN extracromosómico que se poden atopar nas células. Comprender os xenomas virais é moi importante para entender a evolución e mutacións dos virus. Algúns virus, como o VIH e os virus oncoxénicos (retrovirus), incorporan o seu propio ADN no xenoma da célula hóspede. Os xenomas virais de ADN poden ser monocatenarios ou bicatenarios e poden ser lineais ou circulares.
Un exemplo de infección dun virus que orixina un ADN extracromosómico é o papilomavirus humano (HPV). O ADN do HPV pasa por tres estadios de replicación: establecemento, mantemento e amplificación. O HPV infecta células epiteliais no tracto anoxenital e cavidade oral. Normalmente, o HPV é detectado e eliminado polo sistema inmunitario. O recoñecemento do ADN viral é unha parte importante das respostas inmunitarias. Para que este virus persista, o seu xenoma circular debe replicarse e herdarse durante a división celular.
Recoñecemento pola célula hóspede
As células poden recoñecer o ADN citoplasmático alleo. Comprender as vías de recoñecemento é importante para a prevención e tratamento de doenzas. As células teñen sensores que poden recoñecer especificamente o ADN viral, como a vía dos receptores similares a Toll (TLR).
A vía Toll foi atopada inicialmente en insectos, como unha vía que permitía a certos tipos celulares actuar como sensores capaces de detectar unha variedade de xenomas bacterianos ou virais e PAMPS (padróns moleculares asociados a patóxenos). OS PAMPs son potentes activadores da sinalización inmunitaria innata. Existen aproximadamente 10 receptores similares a Toll (TLRs) humanos. Os diferentes TLRs humanos detectan diferentes PAMPS: lipopolisacáridos polo TLR4, ARN bicatenario viral polo TLR3, ARN monocatenario polos TLR7/TLR8, ADN non metilado viral ou bacteriano polo TLR9. O TLR9 evolucionou para detectar ADN con CpG que se adoita atopar en bacterias e virus e para iniciar a produción de IFN (interferóns de tipo I) e outras citocinas. Herdanza
A herdanza do ADN extracromosómico diferénciase da herdanza do ADN nuclear dos cromosomas. A diferenza dos cromosomas, o ADNec non contén centrómeros e, polo tanto, segue un padrón de herdanza non mendeliana que dá lugar a poboacións heteroxéneas. En humanos, virtualmente todo o citoplasma se herda da célula ovo da nai. Por isto, o ADN dos orgánulos, incluíndo o ADNmt, hérdase da nai. As mutacións no ADNmt ou outro ADN citoplásmico será herdado da nai. Esta herdanza uniparental é un exemplo de herdanza non mendeliana. As plantas tamén mostran herdanza uniparental do ADNmt e do cloroplástico. A maioría das plantas herdan por vía materna o ADNmt coa excepción de Sequoia sempervirens, que o herda por vía paterna (do pole).
Hai dúas teorías para explicar por que o ADNmt paterno raramente se transmite á descendencia. Unha é simplemente que o ADNmt paterno está nunha concentración máis baixa que o materno e así non é detectable na descendencia. Unha segunda teoría, máis complexa supón a dixestión do ADNmt para impedir a súa transmisión. Teorízase que a herdanza uniparental do ADNmt, que ten unha alta taxa de mutación, podería ser un mecanismo para manter a homoplasmia do ADN citoplasmático. Importancia clínica
Os ás veces chamados elementos extracroosómicos (EEs) foron asociados coa inestabilidade xenómica en eucariotas. Os ADNs circulares polidispersos pequenos (spcDNAs), que son un tipo de ADN extracronosómico circular, atónpase comunmente en conxunción coa inestabilidade xenómica. Os ADNs circulares polidispersos pequenos derivan de secuencias repetitivas como o ADN satélite, elementos de ADN similares a retrovirus e elementos transpoñibles no xenoma. Pénsase que son produtos do rearranxo dos xenes.
O ADN extracromosómico atopado en casos de cancro foi historicamente denominado cromosomas diminutos dobres, que se presentan como corpos de cromatina pares vistos co microscopio óptico. Os cromosomas diminutos dobres representan ~30% do espectro de ADNec contidos no cancro, incluíndo os corpos simples, e demostrouse conteñen xenes idénticos que os corpos non pares. A notación dos ADNec comprende todas as formas de ADN extracromosómico grande, que contén oncoxenes atopado nas células cancerosas. Este tipo de ADNec obsérvase en diversas histoloxías de células cancerosas, pero practicamente nunca en células normais. O ADNec pénsase que se produce por causa das rotras de dobre febra nos cromosomas ou da sobrerreplicación do ADN nun organismo. Os estudos mostran que en casos de cancro e outras inestabilidades xenómicas, obsérvanse maiores niveis de elementos extracromosómicos.
O ADN mitocondrial pode xogar un papel no comezo de enfermidades de diversos modos. As mutacións puntuais ou os arranxos xénicos alternativos do ADNmt foron ligados a varias doenzas que afectan o corazón, sistema nervioso central, sistema endócrino, tracto gastrointestinal, ollo e riles. A perda de parte da cantidade de ADNmt presente na mitocondrias pode levar a un completo conxunto de enfermidades coñecidas como síndromes de depleción mitocondrial, que afectan ao fígado, sistema nervioso central e periférico, músculo liso e oído en humanos. Os resultados obtidos en estudos que intentan ligar o número de copias de ADNmt co risco de desenvolver certos cancros foron mixtos e ás veces conflitivos. Realizáronse estudos para ver que asociación había entre o incremento ou a diminución do niveis de ADNmt e o aumento de risco de desenvolver cancro de mama. Observouse unha asociación positiva entre o aumento dos niveis de ADNmt e o aumento do risco de desenvolver tumores renais, pero non parece haber unha ligazón entre os niveis de ADNmt e o desenvolvemento de cancro de estómago.
O ADN extracromosómico encóntrase nos protozoos Apicomplexa. O parasito da malaria (Plasmodium), así como os patóxenos relacionados coa SIDA, como Taxoplasma e Cryptosporidium, son membros dos Apicomplexa. O ADNmt estudouse con detalle no parasito da malaria. Atopáronse dúas formas de ADN extracromosómico nos parasitos da malaria. Un destes é un ADN lineal de 6 kb e o segundo é un ADN circular de 35 kb. Estas moléculas de ADN foron investigadas como posibles dianas nucleotídicas para antibióticos. Papel do ADNec no cancro
A amplificación de xenes é un dos mecanismos máis comúns de activación de oncoxenes. As amplificacións xénicas no cancro adoitan ser elementos extracromosómicos circulares. Unha das funcións primarias do ADNec no cancro é permitir que o tumor acade rapidamente un alto número de copias, mentres promove tamén unha rápida masiva heteroxeneidade xenética entre células. Os oncoxenes máis habitualmente amplificados no cancro atópanse no ADNec e son moi dinámicos, reintégranse en cromosomas non nativos como rexións de tinguidura homoxénea (HSR, do inglés homogeneous staining regions) e altérase o número de copias e a composición en resposta a varios tratamentos con fármacos.
O ADNec é o responsable dun gran número dos cancros máis graves e avanzados, así como da resistencia aos fármacos anticancro.
A forma circular do ADNec difire da estrutura lineal do ADN cromosómico de maneiras significativas que inflúen na patoxénese do cancro. Os oncoxenes codificados no ADNec teñen un rendemento transcricional masivo, situándose no 1% superior dos xenes de todo o transcriptoma. A diferenza dos plásmidos bacterianos ou do ADN mitocondrial, o ADNec está cromatinizado e contén altos niveis de marcas de histonas activas, pero unha escaseza de marcas de hitonas represivas. A arquitectura cromatínica do ADNec carece da alta compactación que se encontra no ADN cromosómico e está entre os ADNs máis accesibles de todo o xenoma do cancro.
Os ADNec poderían agruparse dentro do núcleo, o cal se pode denominar focos ou centros (hubs) de ADNec. Espacialmente, os focos de ADNec poderían causar interaccións amplificador-xene intermoleculares para promover a sobreexpresión de oncoxenes.