Bacteriófago

Un bacteriófago, abreviado informalmente como fago, é un virus que infecta e se replica dentro de bacterias e arqueas. O termo deriva de "bacteria" e do grego φαγεῖν (fagein), 'devorar'. Os bacteriófagos están compostos de proteínas que encapsulan o seu xenoma de ADN ou ARN, e poden ter estruturas simples ou moi elaboradas. Os seus xenomas poden codificar desde só catro xenes (caso do bacteriófago MS2) ata centos. Miden de 20 a 200 nm aproximadamente. Os fagos replícanse dentro da célula procariota despois de inxectar o seu xenoma no seu citoplasma.
Os bacteriófagos están entre as entidades máis comúns e diversas da biosfera. Son un tipo de virus que se encontra en todas os sitios en que existan bacterias. Estímase que hai máis de 1031 bacteriófagos no planeta, máis que calquera outro organismo da Terra, incluídas todas as bacterias combinadas. Unha das fontes naturais máis densas de fagos e outros virus é a auga do mar, onde se atoparon ata 9·108 virións por mililitro en tapetes microbianos na superficie, e ata un 70% das bacterias mariñas poden ser infectadas por fagos.
Os fagos infectan só bacterias específicas. Algúns fagos son virulentos e destrúen inmediatamente a bacteria na que se reproducen, pero outros, chamados fagos temperados poden integrar o seu material xenético no ADN da bacteria e ser inocuos ou establecerse dentro da célula como se fosen plásmidos. Estes fagos endóxenos denomínanse profagos e replícanse xunto con todo o ADN cando a célula divide, polo que cada bacteria filla os leva. En certos momentos os fagos endóxenos actívanse e replícanse como virus virulentos destruíndo a célula. Nalgúns casos, os profagos poden ser mesmo beneficiosos para o hospedador, dándalle novas funcionalidades ao xenoma da bacteria, o que se chama conversión lisoxénica. Un exemplo é a bacteria Vibrio cholerae, que contén un fago, que codifica a toxina do cólera.
Os fagos foron utilizados desde finais do século XX como alternativa aos antibióticos na antiga Unión Soviética e en Europa Central e tamén en Francia. Considéranse unha posible terapia contra as cepas resistentes a multifármacos de moitas bacterias (terapia de fagos). Por outra parte, os fagos do grupos dos Inoviridae observouse que complican as biopelículas implicadas na pneumonía e fibrose quística e protexen as bacterias dos fármacos que se usan para erradicar esas doenzas, promovendo así infeccións persistentes.
Utilízanse tamén en investigación biolóxica en técnicas como o phage display, vectores de clonación e outras, e teñen aplicacións na industria alimentaria, farmacolóxica, diagnósticos clínicos e asepsia. Clasificación
Os bacteriófagos son abundantes na biosfera, teñen diferentes xenomas, morfoloxías e estilos de vida. Os fagos clasifícanse polo Comité Internacional de Taxonomía de Virus (ICTV) segundo a súa morfoloxía e ácido nucleico. Suxeriuse que os membros de Picobirnaviridae infectan bacterias, pero non mamíferos.
Outra familia proposta é a "Autolykiviridae" (de ADN bicatenario). Historia
En 1896, Ernest Hanbury Hankin informou que algo que estaba presente nas augas dos ríos Ganxes e Yamuna da India tiña unha marcada acción antibacteriana contra o axente do cólera e podía atravesar filtros de porcelana moi finos. En 1915, o bacteriólogo británico Frederick Twort, superintendente da Brown Institution de Londres, descubriu un pequeno axente que infectaba e mataba bacterias. El pensaba que o axente debía ser algunha das seguintes cousas: Un estadio do ciclo biolóxico das bacterias.
Un encima producido polas propias bacterias.
Un virus que crecía nas bacterias e as destruía.
As investigacións de Twort foron interompidas polo comezo da Primeira guerra mundial, e por unha escaseza de fondos e o descubrimento dos antibióticos. Independentemente, o microbiólogo franco-canadense Félix d'Hérelle, que traballaba no Instituto Pasteur de París, anunciou o 3 de setembro de 1917, que descubrira "un microbio invisible antagonista do bacilo da disentería". Para d’Hérelle, non había dúbida sobre a natureza do descubrimento: "Nun instante o comprendera: o que causaba os meus puntos claros [nos cultivos bacterianos] era de feito un microbio invisible … un virus parasito das bacterias. " D'Hérelle chamou ao virus bacteriófago, un "comedor de bacterias" (do grego phagein, 'devorar'). Tamén informou do caso dun home que padecía disentería e que recuperou a saúde grazas aos bacteriófagos. D'Herelle foi quen realizou boa parte das investigacións sobre bactgeriófagos daquela época e introduciu o concepto de terapia de fagos.
Máis de medio século despois, en 1969, Max Delbrück, Alfred Hershey e Salvador Luria foron galardoados co Premio Nobel de Medicina polos seus descubrimentos da replicación de virus e a súa estrutura xenética. Evolución
Estuos filoxenéticos indican que a maioría dos bacteriófagos que infectan actualmente os procariotas orixináronse antes que o último antepasado común universal (LUCA) e, por tanto, infectaron o último antepasado común universal e os protobiontes, (estruturas lipidícas compostas por material xenético que precederon ás células). A orixe dos bacteriófagos como primeiros virus é insegura, e suxeriuse que pudideron orixinarse no mundo de ARN ou a partir dalgún deses protobiontes ou por unha combinación de ambos. No momento da orixe dos eucariotas os bacteriófagos precederían a varios virus que actualmente infectan os eucariotas. Por exemplo, os bacteriófagos con cola (Caudovirales) serían os devanceiros dos Herpesvirales, entre os que están os virus do herpes e a varicela. Usos
Terapia de fagos
Como se descubrira que os fagos eran axentes antibacterianos, foron usados na antiga República Soviética de Xeorxia durante as décadas de 1920 e 1930 para tratar infeccións bacterianas. O pioneiro alí foi Giorgi Eliava coa axuda do codescubridor dos bacteriófagos Félix d'Herelle. Tiveron un amplo uso, incluíndo o tratamento de soldados do Exécito Vermello. Porén, foron despois abandonados para o seu uso xeral en Occidente por varias razóns: Descubríronse os antibióticos, que foron moi comercializados, eran máis fáciles de obter, almacenar e prescribir.
Realízáronse ensaios médicos con fagos, pero a falta dunha comprensión básica suscitaba cuestións sobre a validez destes ensaios.
A publicación de investigacións na Unión Soviética facíase principalmente en lingua rusa ou xeorxiana e durante moitos anos non foi seguida internacionalmente.
O uso de fagos continuou desde o final da guerra fría en Rusia, Xeorxia e noutros lugares de Europa central e do leste. O primeiro ensaio clínico regulado, aleatorizado de dobre cego publicouse no Journal of Wound Care en xuño de 2009, onde se avaliaba a seguridade e eficacia dun cóctel de bacteriófagos para tratar as úlceras venosas infectadas de pernas de pacientes humanos. A FDA aprobou o estudo como un ensaio clínico en fase I. Os resultados do estudo demostraron a seguridade da aplicación terapéutica dos bacteriófagos, pero non mostraron ser eficaces. Os autores explicaron que o uso de certos compostos químicos que forman parte do coidado das feridas (por exemplo, a lactoferrina ou prata) puido interferir coa viabilidade dos bacteriófagos. Pouco despois, publicouse outro ensaio controlado en Europa occidental (tratamento de infeccións de oído causadas por Pseudomonas aeruginosa) na revista Clinical Otolaryngology en agosto de 2009. O estudo concluíu que as preparacións de bacteriófagos eran seguras e efectivas para o tratamento de infeccións crónicas de oído en humanos. Ademais, houbo ensaios clínicos en animais e doutro tipo que avaliaron a eficacia dos bacteriófagos contra varias doenzas, como as queimaduras infectadas e feridas, e a fibrose quística asociada con infeccións de pulmón, entre outras.
Mentres tanto, os investigadores no eido dos bacteriófagos desenvolveran virus transformados por enxeñaría para superar a resistencia a antibióticos, e prepararon por enxeñería xenes de fagos que codificaban encimas que degradaban a matriz das biopelículas, as proteínas estruturais de fagos e os encimas responsables da lise da parede celular bacteriana. Algúns resultados mostraron que os fagos T4 que son de pequeno tamaño e cola curta, poden ser unha boa axuda para detectar a bacteria Escherichia coli no corpo humano.
Avaliouse a eficacia terapéutica dun cóctel de fagos nun modelo de ratos coa infección nasal pola bacteria resistente a multidrogas Acinetobacter baumannii. Os ratos tratados co cóctel de fagos mostraron unha taxa de supervivencia 2, 3 veces maior que os non tratados aos sete días despois da infección. En 2017 un paciente co páncreas afectado por A. baumannii resistente a multidrogas recibiu tratamento con varios antibióticos; malia iso a saúde do paciente continuou deteriorándose durante un período de catro meses. Xa sen administración de antibióticos o paciente foi sometido a terapia de fagos usando un cóctel de nove fagos que demostraran ser efctivos ante A. baumannii resistente a multidrogas, e o paciente mellorou ata recuperar a saúde.
D'Herelle "aprendeu rapidamente que os bacteriófagos se encontran onde queira que prosperen as bacterias: en cloacas, en ríos que reciben escorreduras residuais de tubaxes e nas feces dos pacientes convalecentes. " Isto inclúe ríos que tradicionalmente se cría que tiñan poderes curativos, como o río Ganxes da India (pero que hoxe en día está moi contaminado).
Outros
Industria alimentaria. – Desde 2006, a Administración de Medicinas e Alimentos (FDA) e o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA) aprobaron varios produtos bacteriófagos. O LMP-102 (Intralytix) aprobouse para tratar produtos de aves e outros produtos cárnicos "listos para comer". Ese mesmo ano a FDA aprobou LISTEX (desenvolvido e producido por Micreos) para usar bacteriófagos co quiexo para matar a bacteria Listeria monocytogenes e deulle a consideración de produto xeralmene recoñecido como seguro. En xullo de 2007, o mesmo bacteriófago foi aprobado para o seu uso en todos os produtos alimenticios. En 2011 o USDA confirmou que LISTEX é unha axuda ao procesamento de etiqueta limpa e está incluído na lista da USDA. Os investigadores no campo da seguridade alimentaria seguen examinando se os fagos líticos son unha opción viable para controlar outros patóxenos que se poden encontrar nos alimentos.
Industria láctea. – Os bacteriófagos presentes no ambiente poden causar fallos na fermentación dos cultivos iniciadores na produción de queixo. Para evitalo, poden usarse cultivos iniciadores de cepas mesturadas e réximes de rotación destes cultivos.
Diagnósticos. – En 2011, a FDA autorizou o primeiro produto baseado en bacteriófagos para o uso en diagnósticos in vitro. O KeyPath MRSA/MSSA Blood Culture Test utiliza un cóctel de bacteriófagos para detectar Staphylococcus aureus en cultivos sanguíneos positivos e determinar a súa resistencia ou susceptibilidade á meticilina. O test dá os resultados nunhas cinco horas, comparadas cos dous ou tres días dos métodos dos test estándar de identificación e susceptibilidade microbiana. Foi o primeiro test de susceptibilidade a antibióticos acelerado aprobado pola FDA.
Contrarrestación de armas biolóxicas e toxinas. – As axencias gobernamentais de países occidentais estiveron durante varios anos pedindo axuda a Xeorxia e á antiga Unión Soviética para aproveitar os fagos para contrarrestar as armas biolóxicas e toxinas, como o ántrax e o botulismo. Continúan facéndose desenvolvementos en grupos de investigación nos EUA. Outros usos inclúen a aplicación en spray en horticultura para protexer as plantas e produtos vexetais da podremia e do espallamento de enfermidades bacterianas. Outras aplicacións para os bacteriófagos son os biocidas para superficies de cdertos ambientes, por exemplo en hospitais, e como tratamento preventivo para catéteres e aparellos médicos antes do seu uso en instalacións médicas. Existe actualmetne unha tecnoloxía dos fagos que pode ser aplicada a superficies secas, por exemplo, uniformes, cortinas ou mesmo suturas cirúrxicas. Os ensaios clínicos publicados en Clinical Otolaryngology indican un éxito no tratamento veterinario de cans con otite.
SEPTIC. - O método de detección e identificación bacteriana SEPTIC (Sensing of phage-triggered ion cascades, Detección de fervenzas iónicas desencadeadas por fagos) usa a emisión de ións e as súas dinámicas durante a infección de fagos e ofrece unha alta especificidade para a detección.
Phage display. - Na técnica do phage display faise un uso diferente dos fagos en investigación, que implica a creación dunha biblioteca de fagos cun péptido variable unido a unha proteína superficial. Cada xenoma dos fagos codifica a variante da proteína exposta na súa superficie, proporcionando un vínculo entre a variante do péptido e o xene que o codifica. As variantes dos fagos na biblioteca poden ser seleccionadas pola súa afinidade de unión a unha molécula inmobilizada (por exemplo, a toxina botúlica) para neutralizala. Os fagos seleccionados unidos poden multiplicarse reinfectando unha cepa bacteriana susceptible, o que permite recuperar os péptidos codificados neles para posteriores estudos.
Descubrimento de fármacos antimicrobianos – As proteínas dos fagos adoitan ter actividade antimicrobiana e poden servir para a peptidomimética, é dicir, fármacos que imitan os péptidos. A tecnoloxía fago-ligando utiliza as proteínas dos fagos en varias aplicacións, como unirse a bacterias ou compoñentes bacterianos (por exemplo a endotoxinas) e a lise das bacterias.
Vectores de clonación. - Os fagos teñen un importante papel na bioloxía molecular como vectores de clonación para inserir ADN en bacterias. Combinando material xenético de fagos con plásmidos orixínanse un tipo de plásmidos artificiais denominados faxémidos (ou fásmidos), usados como vectores.
Investigación básica. – Os bacteriófagos son organismos modelo importantes para estudar os principios da evolución e a ecoloxía. Replicación
Os bacteriófagos poden ter un ciclo lítico ou un ciclo lisoxénico. Con fagos líticos como o fago T4, as células bacterianas son rotas e destruídas (lisadas) despois da replicación dovirión no seu interior, que dese modo libera a proxenie, que busca novos hóspedes que infectar. Os fagos líticos son máis axeitados para a terapia de fagos. Algúns fagos líticos experimentan un fenómeno chamado inhibición da lise, na que a proxenie do fago xa completada non lisa inmediatemente a célula se as concentracións extracelular de fagos son altas. Este mecanismo non é igual que o dos fagos temperados, que permanecen dormentes integrados no ADN da célula, e xeralmente é temporal.
A diferenza do anterior, o ciclo lisoxénico non orixina unha lise inmediata da célula hóspede. Os fagos que poden realizar a lisoxenia denomínanse fagos temperados. O seu xenoma viral intégrase no ADN do hóspede e replícase xunto con el, de maneira relativamente inofensiva para a célula, ou pode establecerse como un plásmido intracelular. Deste modo as bacterias fillas levan todas o virus. O virus permanece doemente ata que as condicións do hóspede se deterioran, quizais por unha escaseza de nutrientes, e entón, os fagos endoxenos (chamados profagos) fanse activos. Nese momento inician un ciclo reprodutivo, que ten como resultado a lise da célula hóspede. Como o ciclo lisoxénico permite á célula hóspede continuar sobrevivindo e reproducíndose, o virus replícase en todas as células fillas da célula hóspede orixinal. Un exemplo de bacteriófago que segue un ciclo lisoxénico e un ciclo lítico é o fago lambda de Escherichia coli.
Ás veces os profagos poden ser beneficiosos para a bacteria hóspede porque están dormentes e á vez proporcionan novas funcións ao xenoma bacteriano, fenómeno denominado conversión lisoxénica. Exemplos son a conversión de cepas inofensivas de Corynebacterium diphtheriae ou Vibrio cholerae por acción dos bacteriófagos, noutras altamente virulentas que causan a difteria ou o cólera, respectivamente. Propuxéronse estratexias para combater certas infeccións bacterianas tomando como diana os profagos que codifican toxinas.
Adhesión e penetración
As células bacterianas están protexidas por unha parede celular de polisacáridos, que son importantes factores de virulencia que protexen as células bacterianas contra as defensas inmunitarias do hóspede e algúns antibióticos. Para entraren na célula hóspede, os bacteriófagos únense a receptores específicos situados na superficie da bacteria, como os lipopolisacáridos, ácidos teicoicos, proteínas ou mesmo flaxelos. Esta especificidade significa que un bacteriófago só pode infectar certas bacterias que leven os receptores axeitados aos cales se pode unir, o cal á súa vez determina o rango de hóspedes do fago. Os encimas que degradan os polisacáridos, como as endolisinas, son proteínas asociadas a virións que degradan encimaticamente a capa externa capsular do hóspede, na etapa inicial do proceso estritamente programado de infección do fago.
As condicións de crecemento do hóspede tamén inflúen na capacidade do fago de adherirse a el e invadilo. Como os virións de fagos non se moven independentemente, dependen de encontros casuais cos receptores correctos cando están en solución, como no sangue, linfa, augas de rego, auga do solo, mar etc.
Os bacteriófagos miovirus usan un mecanismo de tipo xiringa hipodérmica para inxectar o seu material xenético dentro da célula. Unha vez que contactan co receptor apropiado, as fibras da cola flexiónanse achegando a placa basal moi preto da superficie da célula, o cal se denomina unión reversible. Unha vez que se adheriu completamente, iníciase a unión irreversible e a cola contráese, posiblemente coa axuda da enerxía do ATP, presente na cola, inxectando o material xenético a través da membrana bacteriana. A inxección realízase por medio dunha especie de movemento de dobramento no talo da cola, indo primeiro cara a un lado, contraéndose achegándose máis á célula e empuxando para arriba. Os podovirus carecen dunha vaíña da cola alongada como a dos miovirus, polo que no canto de faceren iso, usan as fibras da súa pequena cola con forma de dente para que degraden encimaticamente unha porción da membrana celular antes de inseriren o seu material xenético.
Síntese de proteínas e ácidos nucleicos
En cuestión de minutos, os ribosomas bacterianos empezan a traducir o ARNm viral a proteínas. Nos fagos de ARN, sintetízase temperanmente durante o proceso unha ARN replicase. As proteínas modifican a ARN polimerase bacteriana para que transcriba preferencialmente o ARNm viral. A síntese de proteínas normal do hóspede e a de ácidos nucleicos queda alterada, e a célula é forzada a fabricar os produtos virais. Estes produtos acabarán converténdose en partes dos novos virións que se forman dentro da célula, en proteínas axudantes que contribúen á ensamblaxe dos novos virións ou en proteínas implicadas na lise da célula. En 1972, Walter Fiers (Universidade de Gante, Bélxica) foi o primeiro en establecer a secuencia nucleotídica completa dun xene de fago e, en 1976, do xenoma viral completo do bacteriófago MS2. Algúns bacteriófagos de ADN bicatenario codifican proteínas ribosómicas, que se pensan que modulan a tradución de proteínas durante a infección do fago.
Ensamblaxe do virión
No caso do fago T4, a construción de novas partículas víricas implica a asistencia de proteínas axudantes. As placas basais son as que primeiro se ensamblan, e as colas constrúense despois sobre elas. As cápsides das cabezas, que se constrúen por separado, ensámblanse despois espontaneamente coas colas. O ADN empaquétase eficientemente dentro das cabezas. O proceso completo tarda uns 15 minutos.
Liberación de virións
Os fagos poden liberarse pola lise da célula, pero tamén por extrusión e, nuns poucos casos, por evaxinación. A lise dos fagos con cola realízase pola acción do encima endolisina, que ataca e destrúe a parede celular de peptidoglicano. Un tipo de fago completamente diferente, o fago filamentoso, fai que a célula hóspede segregue continuamente novas partículas víricas. Os virións liberados descríbense como libres e, a non ser que sexan defectuosos, con capacidade de infectar novas bacterias. A evaxinación está asociada con certos fagos de Mycoplasma (unha bacteria que, excepcionalmente, non ten parede). A diferenza da liberación dos virións, os fagos que presentan un ciclo lisoxénico non matan a célla hóspede, senón que se converten en residentes a longo prazo en forma de profagos.
Comunicación
Investigacións feitas en 2017 revelaron que o bacteriófago Φ3T fabrica unha proteína viral curta que sinaliza a outros bacteriófagos que queden durmentes en vez de mataren a bacteria hóspede. A esta proteína déuselle onome de arbitrium. Estrutura xenómica
Hai millóns de fagos no medio ambiente e os seus xenomas poden ter diversas formas e tamaños. Os fagos de ARN, como o MS2 teñen os xenomas máis pequenos, de só unhas poucas quilobases. Porén, algúns fagos de ADN como o fago T4 poden ter xenomas grandes, con centros de xenes; o tamaño e forma da cápside varía en consonancia co xenoma. Os xenomas de bacteriófagos máis grandes chegan a tamaños de 735 kb.
Os xenomas de bacteriofagos poden ter un elevado mosaicismo, é dicir, o xenoma de moitas especies de fagos parece estar composto por numerosos módulos individuais. Estes módulos poden encontrarse noutras especies de fagos en diferentes arranxos. Os micobacteriófagos, que son bacteriófagos con hóspedes micobacterianos, proporcionaron excelentes exemplos deste mosaicismo. Nestes micobacteriófagos, a segregación xenética pode ser o resultado de repetidos casos de recombinación específica de sitio e recombinación ilexítima (o resultado da adquisición polo fago de secuencias xenéticas do hóspede bacteriano). Os mecanismos evolutivos que deron forma aos xenomas dos virus bacterianos varían entre diferentes familias e dependen do tipo de ácido nucleico, características da estrutura do virión, así como do tipo de ciclo vital do virión. Bioloxía de sistemas
Os fagos adoitan ter drásticos efectos sobre os seus hóspedes. Como consecuencia, o padrón de transcrición da bacteria infectada pode cambiar considerablemente. Por exemplo, a infección que sofre Pseudomonas aeruginosa polo fago temperado PaP3 cambia a expresión do 38% (2160/5633) dos xenes do hóspede. Moitos destes efectos son probablemente indirectos, polo que é un reto identificar as interaccións indirectas entre a bacteria e o fago.
Fixéronse varios intentos de mapar as interaccións proteína-proteína entre os fagos e o seu hóspede. Por exemplo, o bacteriófago lambda sabíase que interaccionaba co seu hóspede, E. coli, por medio de 31 interaccións. Porén, un estudo a grande escala revelou 62 interaccións, a maioría das cales eran novas. De novo, a impotancia de moitas destas interaccións segue sendo pouco clara, pero estes estudos suxiren que hai moi probablemente varias interaccións clave e moitas interaccións indirectas cuxo papel permanece sen determinar. No medio ambiente
A metaxenómica permitiu a detección na auga de bacteriófagos, o que non era posible previamente.
Ademais, os bacteriófagos foron utilizados en rastreos hidrolóxicos e modelización de sistemas fluviais, especialmente onde hai interaccións entre as augas superficiais e as subterráneas. Prefírese o uso de fagos ao dun marcador de tinguidura máis convencional porque son absorbidos menos significativamente cando pasan a través de augas subterráneas e son doadamente detectados a concentracións moi baixas. As augas non polucionadas poden conter aproximadamente 2·108 bacteriófagos por mL.
Pénsase que os bacteriófagos contribúen amplamente á transferencia horizontal de xenes en ambientes naturais, principalmente por transdución, pero tamén por transformación. Os estudos baseados na metaxenmica tamén revelaron que os viromas dunha variedade de ambientes albergan xenes de resistencia a antibióticos, incluíndo os que poden dar resistencia a multifármacos.
No mar os bacteriófagos son as entidades biolóxicas máis abundante e parasitan as bacterias mariñas, principalmente cianobacterias, chegando a niveis de 250 millóns de bacteriófagos por mililitro de auga de mar. As bacterias deféndense producindo encimas (endonucleases de restrición) que destrúen o ADN dos bacteriófagos ou por unha interferencia de ARN que utiliza o sistema CRISPR, o cal lles dá certa inmunidade adquirida á infección. As bacterias mariñas son fundamentais nos ciclos da materia nos ecosistemas da Terra, e os bacteriófagos mariños modulan estes ciclos no mar ao afectaren á poboación de bacterias. Por exemplo, inflúen no ciclo do carbono ao controlaren as poboacións de cianobacterias como Prochlorococcus, que é un importante produtor primario. Ademais, os fagos mariños inflúen no metabolismo e evolución dos seus hóspedes, contribuíndo o intercambio e incorporación de xenes. Bacteriófagos modelo
Os seguintes bacteriófagos foron amplamente estudados: