Antíxeno leucocitario humano

Sistema do antíxeno leucocitario humano (HLA) (siglas do inglés Human Leukocyte Antigen) é o nome que se lle dá ao complexo maior de histocompatibilidade (MHC) en humanos. Este superlocus contén un gran número de xenes relacionados co funcionamento do sistema inmunitario humano. Este grupo de xenes está situada no cromosoma 6, e codifica as proteínas presentadoras de antíxenos da superficie celular e ten moitas outras funcións. Os xenes HLA son a versión humana dos xenes do MHC que se encontran en moitos vertebrados (e son os máis estudados entre eles). As proteínas codificadas por certos xenes tamén se coñecen como antíxenos, como resultado da historia do seu descubrimento como factores que eran importantes no transplante de órganos. Os antíxenos HLA maiores son elementos esenciais para a función inmune. Hainos de diferentes clases con diferentes funcións, que son: Os HLAs correspondentes ao MHC de clase I (A, B, e C) fan a presentación de péptidos do interior da célula (incluíndo péptidos virais). Estes péptidos orixínanse a partir de proteínas que foron degradadas nos proteasomas. En xeral, os péptidos son pequenos, de aproximadamente 9 aminoácidos de lonxitude. Os antíxenos alleos atraen as células T citotóxicas (ou T CD8+) que destrúen as células.
Os HLAs correspondentes ao MHC de clase II (DP, DM, DO, DQ, e DR) presentan antíxenos do exterior da célula aos linfocitos T. Estes antíxenos estimulan a multiplicación de células T axudantes, que á súa vez estimulan ás células B para que produzan anticorpos específicos contra o antíxeno.
Os HLAs correspondentes ao MHC de clase III codifican os compoñentes do sistema do complemento.
Os HLAs teñen outros papeis. Son importantes na defensa contra enfermidades. Son a principal causa do rexeitamento dos transplantes de órganos. Poden protexer contra o cancro ou fallar nesa protección se están regulados á baixa por causa dunha infección. As mutacións no HLA poden estar ligadas a enfermidades autoinmunes (exemplos: diabetes tipo I, enfermidade celíaca). O HLA pode tamén estar relacionado coa percepción do olor das outras persoas, e poden estar implicados na selección de parella.
No complexo HLA, á parte dos xenes que codifican as 6 principais proteínas presentadoras de antíxenos, están localizados tamén un gran número doutros xenes, moitos implicados na función inmune. A diversidade dos HLAs na poboación humana é un aspecto da defensa contra as enfermidades, e, como resultado desta diversidade, a probabilidade de que dous individuos teñan idénticas moléculas HLA en todos os loci é moi baixa. Os xenes HLA foron identificados historicamente polo rexeitamento de transplantes entre individuos con distinto HLA. Funcións
As proteínas codificadas polos HLAs encóntranse na superficie das células do corpo, e son únicas para cada persoa. O sistema inmunitario utiliza as HLAs para diferenciar as células propias das non propias. Todas as células mostran o tipo de HLA de cada persoa, indicando que non son unha célula invasora.
En doenzas infecciosas
Cando un patóxeno externo entra no corpo, unhas células específicas chamadas células presentadoras de antíxenos fagocitan o patóxeno. As proteínas do patóxeno son dixeridas en pequenos fragmentos (péptidos) e cargadas nos antíxenos HLA (especificamente nos MHC de clase II). Así unidos son mostrados na superficie celular das células presentadoras aos linfocitos T, que despois producen diversos efectos para eliminar o patóxeno.
Por medio dun proceso similar, as proteínas propias e algunhas alleas (como as víricas) producidas dentro das células son exhibidas unidas ao HLA (especificamente nos MHC de clase I) na superficie das células. As células infectadas por virus poden ser así recoñecidas e destruídas polas células T CD8+.
A figura anterior mostra un fragmento dunha proteína bacteriana velenosa (o péptido SEI) unido no suco de unión da molécula HLA-DR1. Na ilustración de máis abaixo, que é unha vista diferente, pode verse un HLA-DQ completo cun péptido unido nun suco de unión similar. Os péptidos que están relacionados con enfermidades encaixan nestes sucos como unha man nunha luva. Cando se unen, os péptidos son presentados ás células T. As células T requiren que lles presenten os antíxenos unidos a moléculas MHC para o seu recoñecemento, o que se denomina restrición MHC. Estas células teñen receptores que son similares aos receptores das células B, e cada célula recoñece só unhas poucas combinacións de péptido-MHC II. Unha vez que unha célula T recoñece un péptido unido a unha molécula do MHC de clase II, pode estimular ás células B que tamén recoñecerán á mesma molécula nos seus receptores BCR de superficie. Deste modo, as células T axudan ás B a activarse para producir anticorpos contra ese mesmo antíxeno alleo. Cada HLA pode unirse a moitos péptidos, e cada persoa ten 3 tipos de HLA e pode ter 4 isoformas de DP (ou HLA-DP), 4 isoformas de DQ e 4 isoformas de DR (2 de DRB1, e 2 de DRB3, DRB4, ou DRB5) o que fan un total de 12 isoformas. Con ese nivel de heterocigose é difícil que as proteínas relacionadas con enfermidades escapen á detección.
No rexeitamento de enxertos
As células que mostren un tipo de HLA "non propio" e sexan vistas como invasoras polo sistema inmunitario do corpo, orixinarán o rexeitamento do tecido que as conteña. Isto é particularmente importante no caso dos tecidos transplantados, porque pode causar o rexeitamento do transplante. Debido á importancia do HLA nos transplantes, os loci HLA están entre os máis frecuentemente tipificados (tipados) por seroloxía e PCR.
En autoinmunidade
Os tipos de HLA hérdanse, e algúns deles están asociados a trastornos inmunes e outras enfermidades. As persoas que posúen certos antíxenos HLA é máis probable que desenvolvan certas enfermidades autoinmunes, como a diabetes tipo I, espondilite anquilosante, enfermidade celíaca, lupus eritematoso sistémico, miastenia gravis, miosite de corpo de inclusión, e síndrome de Sjögren. A realización da tipificación (tipado) do HLA levou a mellorar algo e acelerar a diagnose da enfermidade celíaca e a diabetes tipo 1; porén, para que sexa útil a tipificación DQ2, requírese unha tipificación de alta resolución B1* (resolución: *02: 01-*02: 02), tipificación DQA1*, ou serotipificación DR. A serotipificación (serotipado) actual pode resolver, nun só paso, o DQ8. A tipificación de HLA en autoinmunidade está usándose cada vez máis como ferramenta de diagnose. Na enfermidade celíaca é o único medio efectivo para discriminar entre familiares de primeiro grao que están en risco dos que non o están, antes de que aparezan os síntomas, ás veces irreversibles, como as alerxias e enfermidades autoinmunes secundarias.
No cancro
Algunhas enfermidades mediadas por HLA están directamente implicadas na promoción do cancro. A enteropatía sensible ao glute está asociada a un incremento da prevalencia de linfoma de células T asociado a enteropatía, e os homocigotos DR3-DQ2 están entre o grupo de maior risco, e neles danse o 80% dos casos desta doenza. Porén, o máis frecuente é que as moléculas HLA teñan un papel protector, ao recoñeceren o incremento de antíxenos que non son tolerados debido aos baixos niveis que teñen no estado normal. As células anormais poderían ser marcadas para a apoptose, o cal se pensa que media moitos cancros antes da diagnose. Clasificación
As proteínas MHC de clase I forman un receptor funcional na maioría das células nucleadas do corpo.
Hai 3 xenes maiores e 3 menores do MHC de clase I no HLA: HLA-A
HLA-B
HLA-C
e os menores son: HLA-E, HLA-F e HLA-G
A β2-microglobulina únese coas subunidades do xene maior e menor para producir un heterodímero.
Hai 3 xenes maiores e 2 menores das proteínas do MHC de clase II codificadas polo HLA.
Os xenes da clase II combínanse para formar receptores proteicos heterodímeros (αβ) que se expresan na superficie das células presentadoras de antíxenos.
MHC de clase II maiores: HLA-DP
cadea α codificada polo locus HLA-DPA1
cadea β codificada polo locus HLA-DPB1
HLA-DQ
cadea α codificada polo locus HLA-DQA1
cadea β codificada polo locus HLA-DQB1
HLA-DR
cadea α codificada polo locus HLA-DRA
4 cadeas β (só son posibles 3 por persoa), codificadas polos loci HLA-DRB1, DRB3, DRB4 e DRB5.
As outras proteínas do MHC de clase II, DM e DO, utilízanse no procesamento interno de antíxenos, cargando os péptidos antixénicos xerados a partir de moléculas dos patóxenos nas moléculas HLA das células presentadoras de antíxenos.
Nomenclatura
Os alelos HLA modernos denótanse xeralmente con varios niveis de detalle. A maioría das designacións empezan con HLA- e o nome do locus, despois o signo * e algúns díxitos que especifican o alelo. Os primeiros dous díxitos especifican un grupo de alelos. Os métodos antigos de tipificación a miúdo non podían distinguir completamente os alelos e acababan a este nivel. Os díxitos terceiro e cuarto especifican un alelo sinónimo. Os díxitos quinto e sexto denotan calquera das mutacións sinónimas dentro do marco codificante do xene. O sétimo e oitavo números distinguen as mutacións situadas fóra da rexión codificante. A designación dos alelos pode ir seguida de letras como L, N, Q, ou S para especificar un nivel de expresión ou outros datos non xenómicos coñecidos. Así, un alelo completamente descrito pode ter ata nove números, sen incluír o prefixo HLA e a notación do locus.
Variabilidade
Os loci MHC son uns dos máis variables xeneticamente nos mamíferos, e os loci HLA humanos non son unha excepción. A pesar de que a poboación humana sufriu unha forte restrición ("pescozo de botella") hai algo máis de 150. 000 anos na que puideron quedar fixados moitos loci, os loci HLA parecen que superaron esa época de constrición mantendo unha gran cantidade de variabilidade. Dos 9 loci mencionados anteriormente, a maioría retiveron unha ducia ou máis de grupos alélicos en cada locus, o que é unha variación preservada moito maior que para a gran maioría dos loci humanos. Isto é consistente cun coeficiente de selección balanceada ou heterocigótico para estes loci. Ademais, algúns loci HLA están entre as rexións codificantes cunha evolución máis rápida no xenoma humano. Detectouse un mecanismo de diversificación no estudo das tribos amazónicas de América do Sur, as cales parece que sufriron unha intensa conversión xénica entre alelos variables e loci dentro de cada clase xénica HLA. Detectáronse menos frecuentemente recombinacións produtivas de maior rango entre os xenes HLA que produciron xenes quiméricos.
Seis loci teñen uns 100 alelos detectados na poboación humana. Destes, os máis variables son o HLA B e o HLA DRB1. En 2012, o número de alelos que foran determinados son os indicados na táboa de máis abaixo. Para interpretar esta táboa, é necesario considerar que un alelo é unha variante da secuencia de nucleótidos do ADN nun locus, de modo que cada alelo difire de todos os outros alelos en polo menos unha posición (polimorfismo dun só nucleótido, SNP). A maioría destes cambios orixinan un cambio nas secuencias de aminoácidos, o que dá lugar a diferenzas funcionais lixeiras ou grandes nas proteínas.
Hai factores que limitan esta variación. Certos alelos como DQA1*05: 01 e DQA1*05: 05 codifican proteínas con produtos procesados idénticos. Outros alelos como DQB1*0201 e DQB1*0202 producen proteínas que son funcionalmente similares. Para a clase II (DR, DP e DQ), as variantes de aminoácidos dentro do suco de unión ao péptido do receptor tenden a producir moléculas con diferentes capacidades de unión.
Táboas de variantes de alelos
Número de variantes de alelos nos loci da clase I (en xuño de 2012) segundo a base de datos IMGT-HLA: Número de variantes de alelos nos loci da clase II loci (DM, DO, DP, DQ e DR):
Tipos Variantes de Característica de Secuencia (SFVT)
A gran variabilidade que presentan os xenes HLA supón un grande reto á hora de investigar o papel exercido polas distintas variacións xenéticas do HLA nas enfermidades. Os estudos de asociación en enfermidades xeralmente tratan cada alelo HLA como unha única unidade completa, o cal non aclara que partes da molécula están asociadas coa enfermidade. Karp D. R. et al. describiron un novo enfoque baseado no Tipo Variante de Característica de Secuencia (Sequence Feature Variant Type, SFVT) para a análise xenética do HLA que categoriza as proteínas HLA en características de secuencia (sequence features, SFs) máis pequenas bioloxicamente relevantes, e os seus tipos variantes (VTs). As características de secuencia son combinacións de sitios de aminoácidos definidos baseándose en información estrutural (por exemplo, a presenza de folla-beta 1), información funcional (por exemplo, a unión do antíxeno péptido), e o polimorfismo. Estas características de secuencia poden superpoñerse e ser continuas ou descontinuas na secuencia lineal. Os tipos variantes de cada característica de secuencia defínense baseándose en todos os polimorfismos coñecidos no locus HLA que se describa. A categorización SFVT do HLA aplícase en análises de asociación xenética para que se poidan identificar os efectos e papeis dos epitopos compartidos por varios alelos HLA. As características de secuencia e os seus tipos variantes foron descritos para todas as proteínas HLA clásicas; o repositorio internacional de SFVTs do HLA está na base de datos IMGT/HLA. Existe unha ferramenta que converte os alelos HLA nos seus compoñentes SFVTs, que se pode encontrar na páxina web do Immunology Database and Analysis Portal (ImmPort).
Exame dos tipos de HLA
Serotipos e nomes de alelos
Hai dous sistemas paralelos de nomenclatura que se aplican ao HLA. O primeiro e máis antigo deses sistemas está baseado no recoñecemento serolóxico (baseado en anticorpos). Neste sistema, aos antíxenos se lles asignaron letras e números (por exemplo, HLA-B27 ou, abreviadamente, B27). Desenvolveuse despois un sistema paralelo que permite unha definición máis refinada dos alelos. Neste novo sistema para designar un alelo específico nun determinado locus HLA úsase "HLA" xunto cunha letra, o signo * e catro ou máis números (por exemplo, HLA-B*08: 01, A*68: 01, A*24: 02: 01N N Null). Os loci HLA poden ser clasificados ademais como MHC de clase I e MHC de clase II (ou máis raramente, locus D). Cada dous anos, proponse unha nomenclatura para axudar aos investigadores a interpretar os serotipos e alelos.
Serotipificación
Para crear un reactivo de tipificación, debe extraerse sangue de animais e humanos, sepáranse as células sanguíneas do soro, e o soro dilúese ata atinxir a súa sensibilidade óptima e úsase para tipar células doutros individuos ou animais. Así, a serotipificación (serotipado) converteuse nun modo de identificar de forma basta os receptores HLA e as isoformas dos receptores. Co paso dos anos, os anticorpos de serotipificación fixéronse máis refinados a medida que melloraban as técnicas para incrementar a sensibilidade e continúan aparecendo novos anticorpos de serotipificación. Un dos obxectivos da análise de serotipos é encher os ocos que sempre aparecen na análise. É posible facer predicións baseándose no método da "raíz cadrada"-"máxima verosimilitude", ou na análise de haplotipos familiares para representar adecuadamente os alelos tipificados. Estes estudos que usan técnicas de serotipificación revelan con frecuencia, especialmente para poboacións non europeas ou do norte de Asia oriental unha gran cantidade de serotipos cero (null) ou en branco. Isto era particularmente problemático para o locus Cw ata tempos recentes, e case a metade dos serotipos Cw quedaron sen tipar no exame de 1991 da poboación humana.
Hai varios tipos de serotipos. O serotipo dun antíxeno amplo é unha medida basta da identidade das células. Por exemplo, o serotipo HLA A9 recoñece tamén as células dos individuos que levan o A23 e A24. Pode tamén recoñecer células que perderon o A23 e A24 debido a pequenas variacións. A23 e A24 son antíxenos divididos, pero os anticorpos específicos para ambos os dous utilízanse normalmente con máis frecuencia que os anticorpos para os antíxenos amplos.
Tipificación celular
Un ensaio celular representativo é o cultivo de linfocitos mixto (MLC) que se usa para determinar os tipos de HLA de clase II. O ensaio celular é máis sensible detectando as diferenzas HLA ca a serotipificación. Isto é así porque as diferenzas menores non recoñecidas polos aloantisoros poden estimular as células T. Esta tipificación desígnase como tipos Dw. O DR1 serotipificado foi definido celularmente como Dw1 ou como Dw20 e igual para os outros DRs serotipificados. A táboa mostra especificidades celulares asociadas para os alelos DR. Porén, a tipificación (tipado) celular ten inconsistencias na reacción entre individuos segundo o tipo celular, que ás veces dan resultados diferentes do agardado. Isto xunto coas dificultades que ten o ensaio celular para xerar e manter os reactivos de tipificación celular, fan que os ensaios celulares estean sendo substituídos por métodos de tipificación baseados no ADN.
Secuenciación de xenes
Para os produtos xénicos dos alelos dun grupo serotípico poden observarse reaccións menores a subrexións que mostran semellanza con outros tipos. A secuencia de antíxenos determina as reactividades dos anticorpos, e así se teñen unha boa capacidade de secuenciación (ou tipificación baseado na secuencia) isto obvia a necesidade de facer probas serolóxicas. Por tanto, cando hai diferentes reaccións serotípicas isto pode indicar a necesidade de secuenciar o HLA dunha persoa para determinar unha nova secuencia xénica.
Os tipos antixénicos amplos seguen a ser útiles para tipar poboacións moi diversas con moitos alelos HLA non identificados (África, Arabia, sueste de Irán e Paquistán, India). Zonas como África, Irán meridional, e Arabia son exemplos da dificultade de tipar áreas que se estableceron antes. A diversidade alélica fai necesaria facer unha tipificación de antíxeno amplo seguido da secuenciación de xenes porque hai un maior risco de facer identificacións incorrectas utilizando as técnicas de serotipificación.
Finalmente un obradoiro, baseado na secuencia, serve para decidir que alelo novo se asigna a cada serotipo ou ben por secuencia ou ben por reactividade. Unha vez que se verifica a secuencia, asígnaselle un número. Por exemplo, un novo alelo de B44 pode ter un serotipo B*44: 65, xa que foi o 65º alelo B44 descuberto. O libro de nomenclatura para os factores do sistema HLA de Marsh et al. (2005) pode considerarse un libro de código para os serotipos e xenotipos HLA, e hai un novo libro bianual con actualizacións mensuais en Tissue Antigens.
Fenotipificación
A tipificación de xenes é distinto da secuenciación de xenes e a serotipificación.
Nesta estratexia utilízanse cebadores de PCR específicos dunha rexión variante do ADN (chamados SSP-PCR). Se se atopa un produto do tamaño adecuado, asúmese que se identificou o alelo HLA. As novas secuencias xénicas a miúdo orixinan un aumento da aparencia de ambigüidade. Como a tipificación de xenes está baseado no SSP-PCR, é posible que pasen desapercibidas novas variantes, especialmente nos loci da clase I e DRB1.
Por exemplo, o SSP-PCR úsase a miúdo nunha situación clínica para identificar os fenotipos HLA. Un exemplo dun fenotipo estendido dunha persoa pode ser:
A*01: 01/*03: 01, C*07: 01/*07: 02, B*07: 02/*08: 01, DRB1*03: 01/*15: 01,
DQA1*05: 01/*01: 02, DQB1*02: 01/*06: 02
En xeral, isto é idéntico para o serotipo estendido:
A1, A3, B7, B8, DR3, DR15(2), DQ2, DQ6(1)
Para moitas poboacións, como a xaponesa e as europeas, fíxose xa a tipificación de tantos pacientes que atopar alelos novos son relativamente raros, e así o SSP-PCR é moi axeitado para a resolución de alelos. Os haplotipos poden obterse facendo a tipificación dos membros dunha familia en zonas do mundo onde o SSP-PCR non serviría para recoñecer alelos e a tipificación require facer a secuenciación de alelos novos. Entre as zonas do mundo onde o SSP-PCR ou a serotipificación pode ser un método pouco axeitado están: África Central, África oriental, partes do sur de África, Arabia, sur de Irán, Paquistán e a India.
Haplotipos
Un haplotipo HLA é unha serie de "xenes" HLA (loci-alelos) por cromosoma, un transmitido pola nai e outro polo pai.
O fenotipo exemplificado arriba é un dos máis comúns en Irlanda e é o resultado de dous haplotipos xenéticos comúns, que son:
A*01: 01; C*07: 01; B*08: 01; DRB1*03: 01; DQA1*05: 01; DQB1*02: 01
(por serotipificación A1-Cw7-B8-DR3-DQ2)
que se chama "super B8" ou "haplotipo ancestral" e
A*03: 01; C*07: 02; B*07: 02; DRB1*15: 01; DQA1*01: 02; DQB1*06: 02
(por serotipificación A3-Cw7-B7-DR15-DQ6 ou a versión máis vella "A3-B7-DR2-DQ1")
Estes haplotipos poden usarse para trazar as migracións das poboacións humanas porque a miúdo son como a pegada dactilar dun evento que ocorreu na evolución. O haplotipo Super-B8 está enriquecido en Irlanda Occidental e declina gradualmente desde esa rexión, e encóntrase só en áreas do mundo onde migraron os europeos occidentais. O "A3-B7-DR2-DQ1" está estendido máis amplamente, desde Asia oriental a Iberia. O haplotipo Super-B8 está asociado cun número de enfermidades autoinmunes asociadas á dieta. Hai máis de 100. 000 haplotipos estendidos, pero só uns poucos mostran un carácter visible e nodal na poboación humana. Papel da variación alélica
Os estudos que se fixeron en humanos e outros animais implican un mecanismo de selección de heterocigotos que opera nestes loci como explicación desta excepcional variabilidade. Un mecanismo crible é a selección sexual na cal as femias poden detectar machos con HLA de tipo diferente con respecto ao delas. Aínda que os loci que codifican DQ e DP teñen menos alelos, as combinacións de A1: B1 poden producir teoricamente 7. 755 heterodímeros αβ DQ e outros 5. 270 DP. Aínda que non existe na poboación humana nada que se achegue a eses números, cada individuo pode levar 4 isoformas variables DQ e DP, incrementando o número potencial de antíxenos que estes receptores poden presentar ao sistema inmunitario no sistema inmunitario dun individuo. Estudos das posicións variables de DP, DR, e DQ revelan que os residuos de contacto do antíxeno peptídico nas moléculas da clase II son os que con máis frecuencia son o sitio de variación na estrutura primaria das proteínas. Por tanto, por medio da combinación de variacións alélicas intensas e/ou emparellamento de subunidades, os receptores "péptidos" da clase II son capaces de unirse a case unha infinita variación de péptidos de 9 aminoácidos ou maiores, protexendo ás subpoboacións mestizas das enfermidades epidémicas que aparezan. Os individuos dunha poboación frecuentemente teñen diferentes haplotipos, e isto dá lugar a moitas combinacións, mesmo dentro de pequenos grupos. Esta diversidade mellora a supervivencia deses grupos, e frustra a evolución de epitopos nos patóxenos, os cales doutro modo poderían blindarse ante o sistema inmunitario. Anticorpos
Os anticorpos HLA normalmente non se encontran de forma natural, xa que con poucas excepcións se forman como resultado de activacións inmunolóxicas por material alleo que contiña HLAs non propios, que foi adquirido por medio dunha transfusión de sangue, embarazo (antíxenos herdados do pai), ou órganos ou tecidos transplantados.
Os anticorpos contra haplotipos HLA asociados con enfermidades propuxéronse como un posible tratamento das enfermidades autoinmunes graves.
Os anticorpos HLA específicos de doante foron asociados con rexeitamentos de transplantes de riles, corazón, pulmón e fígado. Coincidencia de HLA entre irmáns
Nalgunhas doenzas nas que se require un transplante de células nai hematopoéticas, pode usarse a diagnose xenética preimplantación (de embrións a implantar creados con ese obxectivo) para atopar un irmán con HLA coincidente, que sirva como doante, aínda que hai que ter en conta certas consideracións éticas.