Guanosín pentafosfato

O guanosín pentafosfato (pppGpp), chamado guanosín tetrafosfato (ppGpp) cando ten un fosfato menos, e abreviado como (p)ppGpp, é unha alarmona que está implicada na chamada resposta estrita (stringent response) observada en bacterias, que causa a inhibición da síntese de ARN cando hai unha escaseza de aminoácidos. Isto orixina que diminúa a tradución de proteínas e que os aminoácidos presentes se conserven. Ademais, o ppGpp causa a regulación á alza de moitos outros xenes implicados na resposta ao estrés, como os xenes para a captación (desde o medio que rodea a célula) e a biosíntese de aminoácidos. Descubrimento
O ppGpp e o pppGpp foron primeiramente identificados por Michael Cashel na década de 1960. Viuse que estes nucleótidos (ou nucleósidos polifosfato) se acumulaban rapidamente en células da bacteria Escherichia coli que non dispoñían de suficientes aminoácidos, e inhibían a síntese de ARN ribosómico e transferente. Sábese que o (p)ppGpp tamén se produce en resposta a outros estresantes, como a privación de carbono e fosfato. Ausencia de (p)ppGpp
Unha ausencia completa de (p)ppGpp causa que na bactreria haxa múltiples necesidades de aminoácidos, mala supervivencia dos cultivos vellos, divisións celulares e morfoloxía anormais e inmobilidade, así como as fai permanecer no modo de crecemento durante todo o período de carencias. Síntese e degradación de (p)ppGpp
A síntese e degradación de (p)ppGpp foi amplamente caracterizada no sistema modelo de E. coli. O (p)ppGpp orixínase por medio do encima pppGpp sintase, tamén chamada RelA, e é transformado de pppGpp a ppGpp pola pppGpp fosfohidrolase. A RelA está asociada con practicamente todos os centos de ribosomas da célula e queda activado cando unha molécula de ARN transferente (ARNt) non cargada entra no sitio A do ribosoma, debido á escaseza dos aminoácidos que o ARNt debe transportar. Se unha bacteria mutante é relA− dise que está relaxada e non se observa ningunha regulación da produción de ARN debida á ausencia de aminoácidos.
E. coli produce unha segunda proteína responsable da degradación do (p)ppGpp, denominada SpoT. Cando se recupera o balance de aminoácidos na célula, o (p)ppGpp é hidrolizado por SpoT. Esta proteína tamén ten a capacidade de sintetizar (p)ppGpp e parece ser o encima sintase primario baixo certas condicións de estrés. A maioría das demais bacterias codifican unha soa proteína que é a responsable de facer tanto a síntese coma a degradación de (p)ppGpp, xeralmente homóloga de SpoT. Dianas do (p)ppGpp
Entre as dianas do (p)ppGpp están os operóns dos ARNr, dos cales hai sete en Escherichia coli (unha bacteria frecuentemente usada como organismo modelo), e todos eles teñen dous promotores. Cando o (p)ppGpp se asocia co promotor afecta á capacidade dos encimas ARN polimerase (RNAP) de unirse ao ADN e iniciar a transcrición. Pénsase que o (p)ppGpp pode afectar á estabilidade do complexo aberto formado pola ARN polimerase sobre o ADN e, por tanto, afecta ao acceso ao promotor. A súa presenza tamén leva a un incremento na pausa durante a fase de elongación da transcrición e compite con substratos nucleósido trifosfato.
Agora hai consenso de que o (p)ppGpp é máis determinante para o control da velocidade de crecemento que as concentracións dos substratos nucleósido trifosfato (NTP). Impacto do (p)ppGpp sobre a fisioloxía bacteriana
Inhibición do crecemento por inhibición da síntese de proteínas
O ppGpp inhibe a formación do dipéptido de iniciación fMet-Phe mediado por IF2, probablemente ao interferir coas interaccións entre as subunidades 30S e 50S do ribosoma. E. coli acumula máis cantidade de ppGpp que de pppGpp durante a privación de aminoácidos, e o ppGpp ten unha eficacia aproximadamente 8 veces maior que o pppGpp. Ao contrario, Bacillus subtilis acumula máis pppGpp que ppGpp.
Inhibición da replicación do ADN
En E. coli a privación de aminoácidos inhibe a replicación do ADN na etapa de iniciación en oriC, debido probablemente á falta da proteína de iniciación da replicación DnaA. En B. subtilis, a detención da replicación debida á acumulación de (p)ppGpp é causada pola unión dunha proteína Rtp en sitios específicos situados a uns 100-200 kb de distancia de oriC en ambas as direccións. A ADN primase (DnaG) é inhibida directamente polo (p)ppGpp. A diferenza de E. coli, B. subtilis acumula máis pppGpp que ppGpp; o nucleótido máis abundante é un inhibidor máis potente da DnaG. O ppGpp pode unirse á proteína Obg, que pertence á familia proteica moi conservada das GTPases pequenas. A proteína Obg interacciona con varios freguladores (RsbT, RsbW, RsbX) que cómpren para a activación de estrés de sigma B.
Impacto sobre a replicación e desenvolvemento de fagos
Os niveis de (p)ppGpp do hóspede parecen actuar como un sensor para o desenvolvemento do fago lambda, e afectan principalmente á transcrición. Uns niveis moderados de ppGpp inhiben os promotores de pR e activan os de pE, pI e paQ in vivo e teñen efectos in vitro que parecen favorecer a lisoxenia. En contraste, a ausencia ou as altas concentracións de (p)ppGpp favorecen a lise. Os niveis moderados de ppGpp favorecen a lisoxenia porque orixinan unha baixada de HflB (FtsH). Cando o ppGpp está ausente ou está moi alto, os niveis da protease HflB son altos; isto conduce a unha diminución de CII (unha proteína do fago promotora da lisoxenia) e favorece a lise.
Impacto sobre a transcrición
Características dos promotores afectados
Un dos elementos clave dos promotores inhibidos polo (p)ppGpp é a presenza de discriminadores ricos en GC, definidos como unha rexión situada entre a caixa TATA (-10 box) e +1 nt (onde +1 é o sitio de inicio da transcrición). Os promotores regulados negativamente polo ppGpp teñen un linker de 16 pares de bases (bp), en contraste co de consenso de 17 pares de bases. Os promotores activados polo ppGpp parecen ter un discriminador rico en AT e maiores linkers (por exemplo, o linker do promotor his é de 18 pares de bases).
A RNAP é a diana
As probas xenéticas que indican que a ARN polimerase (RNAP) era a diana do ppGpp proceden do descubrimento de que os mutantes M+ (tamén chamados mutantes de RNAP estrita ou stringent RNAP) mostran in vitro e in vivo un mimetismo fisiolóxico e de regulación da transcrición conferido polo (p)ppGpp, incluso na súa ausencia. Os detalles estruturais dunha asociación entre o ppGpp e a RNAP proceden da análise de cocristais que sitúan o ppGpp na canle secundaria da RNAP preto do centro catalítico.
A DksA aumenta a regulación
A DksA é unha proteína de 17 kDa con estrutura similar á de GreA e GreB, que son factores da elongación transcricional ben caracterizados. GreA e GreB únense directamente á RNAP en vez de ao ADN e actúan inserindo o seu dominio dedo superenrolado N-terminal a través da canle secundaria da RNAP. Son necesarios dous residuos ácidos conservados no extremo do dominio dedo para inducir a capacidade intrínseca da RNAP de clivar o ARN retrocedido. A DksA tamén posúe dous residuos ácidos no extremo do seu dedo, pero isto non induce a actividade de clivaxe nucleotídica. En vez diso, propúxose que eses residuos estabilizan a unión do ppGpp á RNAP por medio da coordinación mutua dun ión Mg2+ que é esencial para a polimerización.
Inhibición e activación da transcrición
O ppGpp inhibe directamente a transcrición nos promotores ribosómicos. Un modelo é que o ppGpp e a DksA xuntos e independentemente fan diminuír a estabilidade dos complexos abertos formados sobre o ADN pola RNAP. Outro modelo é o mecanismos de atrapamento. Neste modelo, a RNAP é atrapada polo ppGpp en complexos pechados e non pode iniciar a transcrición. Así, o ppGpp parece actuar a moitos niveis, e o mecanismo da súa acción é un o complexo resultado da acción de varios factores, entre os cales as propiedades intrínsecas do promotor son importantes. A activación da transcrición polo ppGpp pode ser directa ou indirecta. A activación directa ocorre cando a RNAP interacciona con efctores, como o ppGpp, DksA ou ambos, para incrementar a transcrición nun determinado promotor. A activación indirecta por estes efectores dun promotor depende da inhibición doutros (potentes) promotores, o que conduce a un incremento da dispoñibilidade da RNAP que indirectamente activa a iniciación da transcrición. Entre os promotores que son activados directamente polo ppGpp están PargI, PthrABC, PlivJ e PhisG. Entre os promotores da activación indirecta están os dependentes de factores sigma como S, H, N, E. Cando se inhiben promotores potentes como rrn, hai máis cantidade de RNAP dispoñible para estes factores sigma alternativos.
Patoxénese e (p)ppGpp
Cando está ausente o (p)ppGpp, a patoxenicidade do microbio queda comprometida por varias razóns que varían segundo o organismo estudado. A deleción dos xenes relA e spoT, pero non a de relA só, dá lugar a un estado (p)ppGpp0 que ten como resultado unha forte atenuación en ratos e unha non invasividade in vitro. As probas de vacinas revelan que 30 días despois dunha soa inmunización coa cepa (p)ppGpp0, os ratos quedaban protexidos da infección pola cepa de tipo salvaxe de Salmonella a unha dose 106 veces superior do LD50 establecido.
Acumulación de polifosfatos
Propúxose que o incremento da síntese de (p)ppGpp causaría a acumulación de polifosfatos en E. coli. A alarmona podería interaccionar coa exopolifosfatase PPX, que inhibiría a hidrólise de polifosfatos, causando así a súa acumulación nas bacterias. Aínda que se observou recentemente que en realidade é DksA e non o (p)ppGpp quen causa esta acumulación. En Pseudomonas aeruginosa o mutante phoU (phoU pertence ao regulón Pho) sintetiza máis (p)ppGpp e esta sería unha das razóns polas que se acumulan máis polifosfatos.