Polimorfismo de lonxitude de fragmento amplificado

O polimorfismo de lonxitude de fragmento amplificado (Amplified fragment length polymorphism), abreviado como AFLP ou AFLP-PCR, é unha técnica baseada na reacción en cadea da polimerase (PCR) utilizada en investigación xenética, pegada xenética, e en enxeñaría xenética. A técnica foi desenvolvida a inicios da década de 1990 por Keygene, e utiliza encimas de restrición para dixerir o ADN xenómico, seguido dunha ligación de adaptadores aos extremos cohesivos dos fragmentos de restrición. Despois, selecciónase un conxunto dos fragmentos de restrición obtidos, que é amplificado. Esta selección realízase utilizando primers (cebadores) complementarios da secuencia adaptadora, a secuencia do sitio de restrición e uns poucos nucleótidos dentro dos fragmentos do sitio de restrición. Os fragmentos amplificados son separados e visualizados en xeles de poliacrilamida desnaturalizantes por métodos de autorradiografía ou de fluorescencia, ou por instrumentos de secuenciación capilar automatizada.
Unha variante do AFLP é o cDNA-AFLP, que se usa para cuantificar diferenzas nos niveis de expresión xénica.
Outra variante do AFLP é a TE Display, usada para detectar a mobilidade de elementos transpoñibles. Base xenética
Cómpre sinalar que, aínda que o AFLP se denomine comunmente "polimorfismo de lonxitude de fragmento amplificado", os datos resultantes non se contabilizan como polimorfismos de lonxitude, senón como polimorfismos de presenza ou ausencia de fragmentos amplificados. A base xenética deste polimorfismo que se observa nos ensaios AFLP, é dicir, a ausencia ou presenza de fragmentos amplificados dun tamaño dado, está determinada por mutacións puntuais, inversións, insercións e delecións que levan á perda ou ganancia dun sitio de restrición ou á alteración da secuencia recoñecida ou amplificada polos cebadores ou primers. Igual que nos RAPDs, non é posible distinguir individuos heterocigotos polo que se trata dun marcador dominante. Unha banda AFLP adoita interpretarse como un locus, definido polos dous encimas de restrición, unha combinación de cebadores que inclúen as bases selectivas (por exemplo, EcoRI-ATC/MseI-AAG) e un peso molecular. Procedemento
A técnica AFLP-PCR é un método moi sensible para detectar polimorfismos no ADN. A técnica foi descrita orixinalmente por Vos e Zabeau en 1993. O procedemento en detalle desta técnica consiste no seguinte:
Consta esencialmente de catro etapas. Na primeira delas o ADN xenómico total córtase ou dixírese con dous encimas de restrición. Xeralmente un deles corta en poucos sitios (por exemplo, EcoRI, que recoñece de 6 a 8 pares de bases) e outro corta en moitos sitios (por exemplo, MseI, que recoñece 4 pares de bases).
Nunha segunda etapa, uns fragmentos de ADN de dobre cadea de 20 a 30 pares de bases chamados adaptadores líganse de forma específica aos extremos dos fragmentos obtidos no paso anterior, xerando así o molde para a amplificación posterior do ADN.
Nunha terceira etapa amplifícanse selectivamente os fragmentos por PCR. Nesta etapa, utilízanse cebadores ou primers de aproximadamente 20 nucleótidos que conteñen unha secuencia específica complementaria á secuencia dos adaptadores e ademais, dun a tres nucleótidos selectivos adicionais de secuencia arbitraria no seu extremo 3´. Dado que só se amplifica unha subpoboación dos fragmentos orixinais, obtense un patrón de bandas que permite un rexistro adecuado. A amplificación descrita na terceira etapa realízase en dous pasos: unha primeira amplificación selectiva empregando un nucleótido arbitrario (amplificación +1 ou preamplificación) e logo, este produto de amplificación obtido emprégase como molde nunha nova amplificación usando cebadores que posúen dous nucleótidos selectivos adicionais (amplificación +3 ou amplificación final).
A cuarta e última etapa do ensaio AFLP envolve a análise dos fragmentos amplificados, a cal se realiza por medio de electroforese en xel de poliacrilamida desnaturalizantes. Se un dos cebadores empregados está marcado radioactivamente, visualizarase por autorradiografía, e se un dos cebadores está marcado cun composto fluorescente, pode ser resolto empregando un secuenciador automático. Alternativamente, pode visualizarse por tinguidura con nitrato de prata. Aplicacións
A tecnoloxía AFLP ten a capacidade de detectar varios polimorfismos en diferentes rexións xenómicas simultaneamente. É tamén moi sensible e reproducible. Como resultado, o AFLP é moi utilizado para a identificación de vriacións xenéticas en cepas ou especies moi emparentadas de plantas, fungos, animais, e bacterias. A tecnoloxía do AFLP foi utilizada en probas de patermidade e de investigación criminal, e tamén para determinar pequenas diferenzas en poboacións, e en estudos de ligamento para crear mapas de análises QTL (de locus de trazo cuantitativo).
O AFLP presenta moitas vantaxes en comparación con outras tecnoloxías marcadoras como o ADN polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD), o polimorfismo de lonxitude de fragmento de restrición (RFLP), e os microsatélites. O AFLP non só ten unha maior reproducibilidade, resolución e sensibilidade a nivel de todo o xenoma comparado con outras técnicas, senón que tamén ten a capacidade de amplificar de 50 a 100 fragmentos á vez. Ademais, non se necesita información de secuencia previa para a amplificación (Meudt & Clarke 2007). En consecuencia, o AFLP foi moi beneficioso no estudo de taxons de bacterias, fungos e plantas, entre os que se descoñece moito aínda sobre a composición xenómica de moitas especies.
A tecnoloxía AFLP está suxeita a patentes e as aplicacións patentadas de Keygene N. V. AFLP son unha marca rexistrada de Keygene N. V.