Ribosome display

A ribosome display (que se pode traducir por exhibición ou exposición en ribosomas) é unha técnica usada para realizar evolucións de proteínas in vitro para crear proteínas que poidan unirse a un ligando desexado. O proceso ten como resultado proteínas traducidas que están asociadas co seu ARNm proxenitor, que se utilizan, en forma de complexo, para unirse a un ligando inmobilizado nun paso de selección. Na ribosome display a proteína traducida permanece conectada ao ribosoma e ao seu ARNm codificante; o complexo ternario resultante utilízase para a selección de moléculas, como péptidos, anticorpos, encimas e armazóns de enxeñaría de proteínas. Os híbridos ARNm-proteína que se unen ben son despois reversotranscritos a un ADNc e as súas secuencias son amplificadas por medio de PCR. O resultado final é unha secuencia de nucleótidos que pode utilizarse para crear proteínas que se unen firmemente. Proceso da ribosome display
A ribosome display empeza cunha biblioteca nativa de secuencias de ADN que codifican polipéptidos. Cada secuencia é transcrita, e despois traducida in vitro a polipéptidos. Porén, a biblioteca de ADN que codifica unha biblioteca particular de proteínas que se unen está xeneticamente fusionada a unha secuencia espazadora que carece dun codón de stop antes do seu extremo. A falta de codón de stop impide que os factores de liberación se unan e desencadeen a desensamblaxe do complexo tradicional. Así, esta secuencia espazadora permenece unida ao peptidil ARNt e ocupa o túnel ribosómico, o que permite que a proteína de interese sobresaia do ribosoma e se pregue. O resultado é un complexo de ARNm, ribosoma e proteína que pode unirse ao ligando unido á superficie. Este complexo é estabilizado co descenso da temperatura e a adición de catións como o Mg2+.
Durante a unión subsecuente ou etapas de cribado, o complexo é enfrontado a ligandos unidos a superficie. Isto pode ser realizado de diversas maneiras, por exemplo usando unha columna de cromatografía de afinidade cunha cama de resina que contén o ligando, unha placa de 96 pozos co ligando inmobilizado á superficie, ou boliñas magnéticas que foron cubertas co ligando. Os complexos que se unen ben son inmobilizados. As seguintes elucións con medio de altas concentracións salinas das moléculas que se unen, axentes quelantes ou ligandos móbiles que forman complexos co motivo de unión da proteína, permiten a disociacion do ARNm. O ARNm pode despois ser reversotranscrito a un ADNc, sufrir mutaxénese, e ser introducido repetidamente no proceso con maior presión selectiva para illar moléculas que se unan incluso mellor. Vantaxes da ribosome display
Ao ter a proteína proxenitora unida ao complexo, os procesos de ribosome display sáltanse a separación de secuencias de múltiples pozos/micromatriz/boliñas de péptido que é común en ensaios que implican a hibridación e proporciona un modo fácil de amplificar as proteínas que se unen sen descriptar a secuencia ata que é necesario. Ao mesmo tempo, este método depende de xerar grandes grupos concentrados de diversidade de secuencia sen ocos e de evitar que estas secuencias se degraden, hibriden e reaccionen entre elas de maneira que se puidesen orixinar ocos no espazo da secuencia.
Ten un récord existoso na enxeñaría de anticorpos e terapéutica de proteínas e aínda se usa amplamente nesas áreas.
Outros métodos en competencia para a evolución de proteínas in vitro son a phage display, yeast display, bacterial display e mRNA display. A ribosome display, como se realiza enteiramente in vitro, ten dúas principais vantaxes sobre outras tecnoloxías de selección. Primeiro, a diversidade da biblioteca non está limitada pola eficiencia de transformación de células bacterianas, senón só polo número de ribosomas e diferentes moléculas de ARNm presentes no tubo de ensaio. Segundo, as mutacións aleatorias poden ser introducidas doadamente despois de cada rolda de seleción, xa que ningunha biblioteca debe ser transformada despois de cada paso de diversificación. Isto permite a fácil evolución dirixida de proteínas que se unen en varias xeracións.
Un requisito previo para a selección de proteínas a partir de bibliotecas é o acoplamento de xenotipo (ARN, ADN) e fenotipo (proteína). Na ribosome display, esta ligazón realízase durante a tradución in vitro ao estabilizar o complexo que consta de ribosoma, ARNm e polipéptido nacente correctamente pregado. Déixase que os complexos ribosómicos se unan ás dianas inmobilizadas na superficie. Aínda que os complexos non unidos son eliminados por lavado, o ARNm dos complexos que exhiben un polipéptido que se uniu pode ser recuberto, e así, a información xenética dos polipétidos que se unen queda dispoñible para a análise.