Bioconxugación

A bioconxugación é o establecemento de enlaces covalentes estables entre dúas moléculas, das cales polo menos unha é unha biomolécula. Os métodos para conxugar biomoléculas aplícanse en varios eidos da medicina, diagnóstico, biocatálise e ciencias de materiais. As biomoléculas modificadas sinteticamente poden ter diversas funcionalidades, como rastrear eventos celulares, revelar a función de encimas, determinar a biodistribución de proteínas, crear biomarcadores específicos para obter imaxes, e entregar fármacos a células diana. A bioconxugación é unha estratexia fundamental que serve para enlazar estas biomoléculas modificadas con diferentes substratos. Ademais das aplicacións en investigación biomédica, a importancia da bioconxugación aumentou recentemente tamén en nanotecnoloxía, como nos puntos cuánticos bioconxugados.
Os tipos máis comúns de bioconxugación son acoplar unha pequena molécula (como a biotina ou unha tinguidura fluorescente) a unha proteína. Os conxugados anticorpo-fármaco como o Brentuximab vedotina e Gemtuzumab ozogamicina son exemplos que entran dentro desta categoría. Outras moléculas menos comúns usadas en bioconxugación son os oligosacáridos, ácidos nucleicos, polímeros sintéticos como o polietilenglicol, e nanotubos de carbono. As conxugacións proteína-proteína, como o acoplamento dun anticorpo a un encima, ou a ligazón de complexos proteicos, é tamén facilitado por bioconxugacións. Reaccións de bioconxugación comúns
A síntese de bioconxugados supón diversos retos, que van desde o uso simple e non específico dun marcador fluorescente a un deseño complexo de conxugados anticorpo-fármaco. Desenvolvéronse varias reaccións de bioconxugación para modificar quimicamente proteínas. Os tipos comúns de reaccións de bioconxugación de proteínas son o acoplamento a residuos de aminoácidos lisina, cisteína e tirosina, así como a modificación de residuos de triptófano e dos extremos N- e C-terminal.
Porén, estas reaccións a miúdo carecen de quimioselectividade e eficiencia, porque dependen da presenza de aminoácidos nativos, que por estaren presentes en grandes cantidades, dificultan a selectividade. Hai unha crecente necesidade de estratexias químicas que sirvan para unir moléculas sintéticas a sitios específicos de proteínas. Unha estratexia é instalar primeiro un grupo funcional particular nunha proteína, e despois utilízase unha reacción bioortogonal para acoplar unha biomolécula con ese grupo funcional particular. As reaccións bioortogonais que teñen como diana os grupos funcionais non nativos utilízanse amplamente en química de bioconxugación. Algunhas importantes reaccións son modificacións de cetonas e aldehidos, a ligazón de Staudinger con azidas orgánicas, a cicloadición de Huisgen de azidas catalizadas por cobre, e a cicloadición de Huisgen de azidas promovida pola tensión.
En aminoácidos naturais
Reaccións das lisinas
O residuo de lisina nucleófila é comunmente o sitio diana na bioconxugación de proteínas, por medio de ésteres N-hidroxisuccinimidil (NHS) reactivos a aminas. Para obter un número óptimo de residuos de lisina desprotonados, o pH da solución acuosa debe estar por debaixo do pKa do grupo amonio da lisina, que é de aproximadamente 10, 5, así que o pH típico da reacción é de arredor de 8 e 9. O reactivo común para a reacción de acoplamento é un éster de NHS (mostrado na primeira reacción de abaixo na Figura 1), que reacciona coa lisina nucleófila por un mecanismo de acilación da lisina. Outros reactivos similares son os isocianatos e isotiocianatos que usan un mecanismo similar (mostrado na segunda e terceira reaccións na Figura 1 de abaixo). Como alternativa aos reactivos específicos da lisina usados clasicamente, propuxéronse recentemente os fluoruros de benzoílo (mostrado na última reacción de abaixo da Figura 1), o que permite a modificación da lisina de proteínas en condicións suaves (baixa temperatua, pH fisiolóxico).
Reaccións de cisteínas
Como as cisteínas libres raramente aparecen na superficie dunha proteína, son unha elección excelente para a modificación quimioselectiva. En condicións básicas, os residuos de cisteína serán desprotonados para xerar un nucleófilo tiolato, que reacciona con electrófilos suaves, como as maleimidas e as iodoacetamidas (mostradas nas dúas primeiras reaccións na Figura 2 de abaixo). Como resultado, fórmase un enlace carbono-xofre. Outra modificación de residuos de cisteína supón a formación dun enlace disulfuro (mostrada na terceira reacción da Figura 2). Os residuos de cisteína reducidos reaccionan con disulfuros exóxenos, xerando un enlace disulfuro novo na proteína. A miúdo úsase un exceso de disulfuros para impulsar a reacción, como a 2-tiopiridona e 3-carboxi-4-nitrotiofenol. Demostrouse que os alquinos deficientes en electróns reaccionan selectivamente con residuos de cisteína de proteínas en presenza doutros residuos de aminoácidos nucleófilos. Dependendo da substitución dos alquinos, estas reaccións poden producir bioconxugados clivables (cando se usan derivados de alquinonas), ou ben estables hidroliticamente (cando se usan 3-arilpropiolonitrilos; a última reacción da abaixo na Figura 2).
Reaccións de tirosinas
Os residuos de tirosina son relativamente non reactivos; polo tanto, non foron dianas moi utilizadas para a bioconxugación. Desenvolvementos recentes mostaron que a tirosina pode modificarse por medio de reaccións de substitución aromática electrófila, e é selectiva para o carbono aromático adxacente ao grupo hidroxilo fenólico. Isto é especialmente útil no caso de residuos de cisteína que non poden ser atacados. Concretamente, o diazonio acóplase con residuos de tirosina (o sal de diazonio móstrase como reactivo na primeira reacción na Figura 3 de abaixo), e un substituínte de retirada electrónica na posición 4 do sal de diazonio pode incrementar a eficiencia da reacción. Sinaláronse os derivados cíclicos diazodicarboxiamida como o 4-fenil-1, 2, 4-triazol-3, 5-diona (PTAD) para a bioconxugación selectiva en residuos de tirosina (a segunda reacción na Figura 3 de abaixo). Unha reacción tipo Mannich de tres compoñentes con aldehidos e anilinas (a última reacción na Figura 3) tamén foi descrita como relativamente selectiva para a tirosina baixo unhas condicións de reacción suaves optimizadas.
Reaccións dos N- e C-terminais
Como os residuos de aminoácidos naturais están habitualmente presentes en grandes cantidades, a miúdo é difícil modificar un só sitio. Desenvolvéronse estratexias que atacan os extremos (terminais) das proteínas, porque melloran moito a selectividade do sitio de modificación da proteína. Unha das modificacións N-terminais consiste na funcionalización do aminoácido terminal. A oxidación dos residuos N-terminais de serina e treonina pode xerar aldehidos N-terminais, os cales poden sufrir reaccións biortogonais (mostrada na primeira reacción na Figura 4). Outro tipo de modificación implica a condensación da cisteína N-terminal con aldehidos, xerando tiazolidina, que é estable a pH alto (segunda reacción da Figura 4). Usando o piridoxal fosfato (PLP), varios aminoácidos N-terminais pode sufrir unha transaminación para render un aldehido N-terminal, como a glicina e o ácido aspártico (terceira reacción da Figura 4). Un exemplo de modificación C-terminal é a ligazón química negativa, que é o acoplamento entre o tioéster C-terminal e a cisteína N-terminal (Figura 5).
Reaccións biortogonais: sobre grupos funcionais particulares
Modificación de cetonas e aldehidos
Pode facerse que unha cetona ou aldehido se una a unha proteína por medio da oxidación de residuos de serina N-terminais ou transaminación con PLP. Adicionalmente, poden introducirse incorporando aminoácidos non naturais polo método de Tirrell ou o de Schultz. Despois condénsanse selectivamente cunha alcoxiamina e unha hidrazina, producindo derivados de hidrazona e oximas (mostrados na primeira e segunda reaccións, respectivamente, da Figura 6). Esta reacción é moi quimioselectiva en canto á bioconxugación da proteína, mais a velocidade de reacción é lenta. Os estudos mecanísticos mostran que o paso limitante da velocidade é a deshidratación dun intermediario tetraédrico, así que se adoita empregar unha solución debilmente ácida para acelerar o paso de deshidratación. A introdución de catalizadores nucleófilos pode aumentar significativamente a velocidade da reacción (mostrada na Figura 7). Por exemplo, usando a anilina como catalizador nucleófilo, un carbonilo protonado menos poboado convértese nunha base de Schiff protonada moi poboada. Noutras palabras, xérase unha alta concentración de electrófilo reactivo. A ligazón de oximas pode entón ocorrer doadamente, e informouse que a velocidade aumenta multiplicándose ata por 400 en condicións ácidas suaves. A clave deste catalizador é que pode xerar un electrófilo reactivo sen competir co produto desexado. Desenvolvementos recentes que aproveitan os grupos funcionais proximais permitiron facer condensacións de hidrazonas para operar a 20 M−1s−1 a pH neutro mentres que as condensacións de oximas proceden a 500-10000 M−1s−1 a pH neutro sen engadir catalizador.
Ligazón de Staudinger con azidas
A ligazón de Staudinger de azidas e fosfina utilizouse amplamente no campo da química biolóxica. Dado pode formar un enlace amida estable nas células vivas, aplicouse á modificación da membrana plasmática, así como na obtención de imaxes in vivo e noutros estudos de bioconxugación. A diferenza da reacción de Staudinger clásica, a ligaxón de Staudinger é unha reacción de segunda orde na cal o paso limitante da velocidade é a formación de fosfazida (mecanismo de reacción específico mostrado na Figura 9). Primeiro, a trifenilfosfina reacciona coa azida para render un azailuro por medio dun estado de transición dun anel de catro membros, e despois unha reacción intramolecular orixina un intermediario iminofosforano, que despois dará a ligazón amida por hidrólise.
Ciclación de Huisgen de azidas
Ciclación de Huisen de azidas catalizada polo cobre
As azidas convertéronse nunha diana común na modificación quimioselectiva de proteínas, porque son de tamaño pequeno e teñen un potencial de reacción termodinámica favorable. Unha desas reaccións de azidas é a reacción de cicloadición [3+2] con alquinos, pero para que se produza a reacción cómpren altas temperaturas e a miúdo orixina mesturas de rexioisómeros. Unha reacción mellorada desenvolvida polo químico Karl Barry Sharpless utiliza como catalizador o cobre(I), que acopla as azidas con alquinos terminais, que só dá lugar a 1, 2, 3 triazois 1, 4 substituídos con rendementos altos (mostrada máis abaixo na Figura 11). O estudo do mecanimso suxire unha reacción en varios pasos. O Cu(I) acóplase primeiro con acetilenos, e despois reacciona coa azida para xerar un intermediario de seis membros. O proceso é tan robusto que ocorre a pHs que van de 4 a 12, e adoita utilizarse o sulfato de cobre(II) como catalizador en presenza dun axente redutor.
Ciclación de Huisgen de azidas promovida pola tensión
Aínda que a ligazón de Staudinger é unha bioconxugación axeitada en células vivas que non produce gran toxicidade, a sensibilidade da fosfina á oxidación polo aire e a súa mala solubilidade en auga dificultan significativamene a súa eficiencia. O acoplamento azida-alquino catalizado por cobre(I) ten unha velocidade de reacción e eficiencia razoables baixo condicións fisiolóxicas, pero o cobre presenta unha significativa toxicidade e por veces interfire co funcionamento da proteína nas célula vivas. En 2004, o laboratorio do químico Carolyn R. Bertozzi desenvolveu unha cicloadición [3+2] sen metais usando a ciclooctina tensionada e azida. A ciclooctina, que é o cicloalquino estable máis pequeno, pode acoplarse coa azida por medio da cicloadición [3+2], o que orixina dous triazois rexioisómeros (Figura 12). A reacción ocorre doadamente a temperatura dunha habitación e por tanto poden usarse para modificar células vivas sen efectos negativos. Tamén se informou que a instalación de substituíntes de flúor nun alquino cíclico pode acelerar moito a velocidade de reacción. Reaccións de bioconxugación mediadas por metal de transición
A bioconxugación baseada en metais de transición foi todo un reto debido á natureza das condicións biolóxicas –solución acuosa, temperatura dunha habitación, pH suave, e concentracións baixas de substratos– que son xeralmente unha dificultade para as reaccións organometálicas. Con todo, recentemente, ademais da reacción de cicloadición [3 + 2] de azida alquino catalizada por cobre, aplicáronse cada vez máis transformacións químicas mediadas por diversos metais de transición para as reaccións de bioconxugación, introducindo a metátese de olefinas, a alquilación, a arilación C–H, e as reaccións de acoplamento cruzado C–C, C–S e C–N.
Alquilación
Alquilación de aminoácidos naturais
Alquilación de Trp e Cys catalizada por rodio
Usando un RhII-carbenoide xerado in situ por activación de composto diazoicos substituídos por vinilo con Rh2(OAc)4, os triptófanos e cisteínas son alquilados selectivamente en medios acuosos.
Porén, este método está limitado a triptófanos e cisteínas da superficie da molécula debido a restricións estéricas. Alquilación (redutiva) de Lys e N-terminal catalizada por iridio
As iminas formadas pola condensación de aldehidos con lisinas ou o N-terminal poden ser reducidas eficientemente por un complexo estable en auga [Cp*Ir(bipy)(H2O)]SO4 en presenza de ións formato (servindo como fonte de hidruros). A reacción ocorre facilmente en condicións fisioloxicamene relevantes e resulta nunha alta conversión de varios aldehidos aromáticos. O-alquilación de Tyr catalizada por paladio
Usando un reactivo electrófilo preformado π-alilpaladio(II) derivado do acetato alílico ou de precursores carbamatos, pode conseguirse a alquilación alílica selectiva de tirosinas en solución acuosa a temperatura dunha habitación e en presenza de cisteínas. Alquilación de Cys catalizada por ouro
Os péptidos que conteñen cisteína poden experimentar a adición 1, 2 de alenos en presenza de sales de ouro(I) e/ou prata(I), producindo tioéteres de vinilo substituídos por hidroxilo. A reacción con péptidos procede con alto rendemento e é selectiva para cisteínas sobre calquera outro residuo nucleófilo.
Porén, a reactividade con proteínas diminúe moito, posiblemente debido á coordinación do ouro co esqueleto molecular da proteína.
Arilación
Arilación de aminoácidos naturais
Arilación de Trp
Hai moitos métodos para conseguir realizar a arilación C-H do triptófano, onde se utilizan diversos electrófilos como os haluros de arilo e ácidos aril borónicos (móstrase un exemplo máis abaixo) para transferir os grupos arilo.
Porén, as codicións da reacción de arilación C-H de triptófano actuais seguen sendo bastante esixentes, requirindo solventes orgánicos, pH baixo e altas temperaturas. Arilación de Cys
Os tiois libres consideráronse desfavorables para as reaccións mediadas por Pd debido á descomposición do catalizador de Pd. Porén, os complexos de adición oxidativa de PdII apoiados por ligandos de dialquilbiaril fosfina funcionan eficientemente na S-arilación de cisteína.
O primeiro exemplo é o uso de complexos de adición oxidativa de PdII (Pd OAC polas súas siglas en inglés) con RuPhos: O complexo de PdII que resulta da adición oxidativa de haluros de arilo ou trifluorometanoesulfonatos e usando o RuPhos como ligando podía modificar quimioselectivamente cisteínas en varios tampóns cun 5 % de cosolvente orgánico a pH neutro. Este método que modifica péptidos e proteínas, consegue a macrociclación de péptidos (usando o reactivo bis-paladio e péptidos con dúas cisteínas non protexidas) e sintetizando conxugados anticorpo-fármaco. Cambiar o ligando a sSPhos axuda ao complexo de PdII a ser suficientemente hidrosoluble para conseguir a S-arilación da cisteína en condicións acuosas sen cosolvente. Hai outras aplicacións deste método nas que os complexos de PdII se xeraron como complexos de adición oxidativa de PdII-péptido ao introducir 4-halofenilalanina en péptidos durante a síntese de péptidos en fase sólida para conseguir a ligazón péptido-péptido ou péptido-proteína. Como alternativa á adición oxidativa directa do péptido, os complexos de adición oxidativa podían tamén transferirse á proteína por medio da reacción de acilación amino-selectiva por medio do éster NHS. Este último foi aplicado para etiquetar selectivamente residuos de lisina da superficie dunha proteína (formando complexos de adición oxidativa de PdII-proteína) e oligonucleótidos (formando complexos de adición oxidativa de PdII-oligonucleótido), que poderían despois ligarse a péptidos e proteínas que conteñen cisteína. Outros exemplos de acoplamento cruzado proteína-proteína conséguense convertendo os residuos de cisteína nun complexo de adición oxidativa S-aril–Pd–X electrófilo utilizando unha estratexia de adición oxidativa intramolecular. Arilación de Lys
Similar ao que se fai coa cisteína, pode realizarse a N-arilación da lisina por medio de complexos de adición oxidativa de Pd con diferentes ligandos de dialquilbiaril fosfina. Debido a unha nucleofilicidade máis débil e unha velocidade de eliminación redutiva máis lenta comparada coa da cisteína, a selección de ligandos de soporte é esencial. Utilizáronse os voluminosos ligandos BrettPhos e t-BuBrettPhos xunto con fenóxido de sodio lixeiramente básico como estratexia para funcionalizar lisinas en substratos de péptido. A reacción ocorre en condicións suaves e é selectivo sobre a maioría dos outros residuos de aminoácidos nucleófilos.
Arilación de aminoácidos non naturais
Aplicáronse amplamente as reaccións de acoplamento cruzado mediadas por Pd de Sonogashira, Heck e Suzuki-Miyaura para modificar péptidos e proteínas, nas cales se desenvolveron diversos reactivos de Pd para a súa aplicación en solucións acuosas. Estas reaccións neesitan un substrato proteína ou péptido que porte grupos funcionais non naturais como os alquinos, haluros de arilo, e ácidos aril borónicos, o que pode conseguirse por expansión do código xenético ou modificación postraducional. Exemplos de técnicas de bioconxugación aplicadas
Factores de crecemento
Unha aplicación é a bioconxugaión do TGF-β a nanopartículas de óxido de ferro e a súa activación por hipertermia magnética in vitro. Isto fíxose usando 1-(3-dimetilaminopropil)etilcarbodiimida combinada con N-hidroxisuccinimida para formar enlaces amida primarios con aminas primarias libres no factor de crcemento. Os nanotubos de carbono foron usados con éxito xunto coa bioconxugación para ligarse a TGF-β seguido dunha activación coa luz infravermella próxima. Estas reaccións usan un enlazador curzado, pero algúns destes engaden un espazo molecular entre o composto de interese e o material base e á súa vez causan maiores graos de unión non específica e reactividade non desexada.