Mutaxénese (técnica de bioloxía molecular)

En bioloxía molecular, a mutaxénese é unha importante técnica de laboratorio na que se producen por enxeñaría xenética deliberadamente mutacións para producir bibliotecas de xenes mutantes, proteínas, cepas de bacterias ou outros organismos modificados xeneticamente. Os diversos constituíntes dun xene, así como os seus elementos regulatorios e os seus produtos xénicos, poden ser mutados para que o funcionamento dun locus xénico, proceso ou produto poida ser examinado en detalle. A mutación pode producir proteínas mutantes con interesantes propiedades ou con mellores ou novas funcións que poden ter uso comercial. As cepas mutantes tamén se poden producir para que teñan aplicacións prácticas ou permitan as bases moleculares dunha determinada función celular que se quere investigar.
Hoxe en día existen moitos métodos de mutaxénese. Inicialmente, o tipo de mutacións inducidas artificialmente en laboratorio eran completamente aleatorias usando para iso mecanismos como a irradiación UV. Esta mutaxénese ao chou non pode dirixirse a rexións ou secuencias específicas do xenoma; porén, co desenvolvemento da mutaxénese dirixida a sitio, poden facerse cambios máis específicos. Desde 2013, o desenvolvemento da tecnoloxía CRISPR/Cas9, baseada nun sistema de defensa contra virus dos procariotas, permitiu a "edición" (modificación) ou mutaxénese dun xenoma in vivo. A mutaxénese dirixida a sitio probou a súa utilidade en situacións nas que a mutaxénese ao chou non o é. Outras técnicas de mutaxénese son a mutaxénese combinatoria e a insercional. A mutaxénese que non é aleatoria pode utilizarse para clonar ADN, investigar os efectos de mutáxenos, e proteínas modificadas por enxeñaría. Tamén ten aplicacións médicas como axudar a pacientes inmunocomprometidos, investigar o tratamento de doenzas incluíndo a infección por VIH e os cancros, e a curación de doenzas como a beta-talasemia. Mutaxénese aleatoria
As primeiras aproximacións á mutaxénese confiaban en métodos que producían mutacións completamente aleatorias, ao chou. En tales métodos as células ou organismos expóñense a mutáxenos como a radiación UV ou compostos químicos mutaxénicos e os mutantes coas características desexadas selecciónanse despois. Hermann Muller descubriu en 1927 que os raios X poden causar mutacións xenéticas en moscas do vinagre, e continuou usando os mutantes que creara nos seus estudos de xenética. No caso de Escherichia coli, os mutantes poden seleccionarse primeiro expoñéndoos a radiación UV, despois cultivándoos en placas de ágar. As colonias formadas son despois replicadas en placas de réplica, unha nun medio rico, outra nun medio mínimo e os mutantes que teñen necesidades nutricionais especiais poden entón identificarse pola súa incapacidade de crecer no medio mínimo. Procedementos similares poden repetirse con outros tipos de células e con diferentes medios para a selección.
Máis tarde desenvolvéronse varios métodos para xerar mutacións ao chou en proteínas específicas para cribar buscando os mutantes con propiedades interesantes ou melloradas. Estes métodos poden implicar o uso de nucleótidos dopados na síntese de oligonucleótidos, ou realizar unha PCR en condicións que favorecen a incorporación incorrecta de nucleótidos (PCR tendente ao erro), por exemplo ao reducir a fidelidade de replicación ou usar análogos de nucleótidos. Unha variación deste método para integrar mutacións non nesgadas nun xene é a mutaxénese de saturación de secuencias. Os produtos de PCR que conteñen mutación(s) son despois clonados nun vector de expresión e as proteínas mutantes producidas poden entón caracterizarse.
En estudos en animais de laboratorio, utilizáronse axentes alquilantes como a N-etil-N-nitrosourea (ENU) para xerar ratos mutantes. Tamén se usa a miúdo o metanosulfonato de etilo (EMS) para xerar mutantes de animais, plantas e virus.
Nunha lei da Unión Europea (directriz 2001/18), este tipo de mutaxénese pode utilizarse para producir organismos modificados xeneticamente, pero os produtos están exentos de regulación: non levan etiqueta nin avaliación. Mutaxénese dirixida a sitio
Antes do desenvolvemento das técnicas da mutaxénese dirixida a sitio, todas as mutacións eran aleatorias e os científicos tiñan que usar a selección para o fenotipo desexado e atopar a mutación buscada. As técnicas de mutaxénese aleatoria teñen a vantaxe do modo en que se poden producir moitas mutacións; porén, aínda que a mutaxénese aleatoria pode producir un cambio nun só nucleótido, non ofrece moito control sobre cal é o nucleótido que é cambiado. Moitos investigadores, por tanto, buscaban introducir cambios seleccionados no ADN de forma precisa e específica de sitio. Os intentos iniciais usaron análogos de nucleótidos e outros compostos químicos para xerar mutacións puntuais localizadas. Entre tales compostos químicos estaba a aminopurina, que induce unha transición de AT a GC, mentres que a nitrosoguanidina, o bisulfito, e a N4-hidroxicitidina pode inducir unha transición de GC a AT. Estas técnicas permiten que se preparen por enxeñaría mutacións específicas nunha proteína; porén, non son flexibles con respecto aos tipos de mutantes xerados, nin son tan específicas coma os últimos métodos de mutaxénese dirixida a sitio e, por tanto, teñen certo grao de aleatoriedade. Outras tecnoloxías como o corte do ADN en sitios específicos do cromosoma, a adición de novos nucleótidos e o intercambio de pares de bases fixeron posible decidir onde poden estar as mutacións. As técnicas actuais da mutación dirixida a sitio orixínáronse a partir da técnica de extensión de cebador (primer) desenvolvida en 1978. Tales técnicas normalmente implican o uso de oligonucleótidos mutaxénicos prefabricados nunha reacción de extensión de cebador con ADN polimerase. Estes métodos permiten mutacións puntuais ou delecións ou insercións de pequenos tramos de ADN en sitios específicos. Os avances en metodoloxía converteron agora esta mutaxénese nun proceso relativamente simple e eficiente.
Métodos novos e máis eficientes de mutaxénese dirixida a sitio están en constante desenvolvemento. Por exemplo, unha técnica chamada SLiCE (do inglés "Seamless ligation cloning extract") permite a clonación de certas secuencias de ADN dentro do xenoma e pode inserirse máis dun fragmento de ADN no xenoma á vez.
A mutaxénese dirixida a sitio permite investigar o efecto de mutacións específicas. Ten numerosos usos; por exemplo, foi utilizado para determinar o susceptibles que eran certas especies a compostos químicos que se utilizan decote nos laboratorios. O experimento utilizado usou a mutaxénese dirixida a sitio para imitar as mutacións esperadas do composto químico específico. A mutación tiña como resultado un cambio en aminoácidos específicos e analizáronse os efectos desta mutación. A estratexia dirixida a sitio pode facerse sistematicamente en técnicas como a mutaxénese de varrido de alanina, onde os residuos son mutados sistematicamente a alanina para identificar residuos importantes da estrutura ou función dunha proteína. Outra estratexia completa é a mutaxénese de saturación de sitios, onde un codón ou un conxunto de codóns pode ser substituído por todos os posibles aminoácidos nas posicións específicas. Mutaxénese combinatoria
A mutaxénese combinatoria é unha técnica de enxeñaría de proteínas dirixida a sitio na que múltiples mutantes dunha proteína poden ser sometidas a enxeñaría simultaneamente baseándose na análise dos efectos de mutacións individuais aditivas. Proporciona un método útil para avaliar os efectos combinatorios dun gran número de mutacións sobre a función das proteínas. Grandes cantidades de mutantes poden ser cribados buscando unha característica particular por análise combinatoria. Nesta técnica poden modificarse exhaustivamente múltiples posicións ou curtas secuencias ao longo dunha febra de ADN para obter unha biblioteca completa de proteínas mutantes. A taxa de incidencia de variantes beneficiosas pode ser mellorada por diferentes métodos para construír bibliotecas de mutaxénese. Unha estratexia desta técnica é extraer e substituír unha porción da secuencia de ADN por biblioteca de secuencias que conteñen todas as posibles combinacións no sitio de mutación desexado. O contido do segmento inserido pode incluír secuencias de importancia estrutural, propiedades inmunoxénicas ou funcións enerxéticas. Un segmento tamén pode ser inserido aleatoriamente nun xene para avaliar a importancia estrutural ou funcional dunha determinada parte dunha proteína. Mutaxénese insercional
A inserción dun ou máis pares de bases, que orixina mutacións no ADN, tamén se coñece como mutaxénese insercional. As mutacións introducidas por enxeñaría como estas poden proporcionar información importante na investigación do cancro, esencialmente sobre a mecánica do desenvolvemento desta doenza. Os retrovirus e transposóns son as ferramentas instrumentais básicas na mutaxénese insercional. Os retrovirus, como o virus do tumor mamario do rato e o virus da leucemia murina, poden utilizarse para identificar xenes implicados na carcinoxénese e comprender as vías biolóxicas de cancros específicos. Os transposóns, segmentos de ADN que poden sufrir transposición, poden deseñarse e aplicarse á mutaxénese insercional como instrumento para o descubrimento de xenes do cancro. Estes segmentos permiten que a mutaxénese insercional se poida aplicar a virtualmente calquera tecido e permite unha secuenciación do ADN mellor, máis completa e sen nesgos.
Os investigadores atoparon catro mecanismos de mutaxénese insercional que poden utilizarse en humanos. O primeiro mecanismo chámase inserción de amplificador (enhancer insertion). Os amplificadores ou enhancers promoven a transcrición dun determinado xene ao interaccionaren cun promotor dese xene. Este mecanismo particular foi utilizado primeiramente para axudar a pacientes gravemente inmunocomprometidos que necesitaban medula ósea. Os gammarretrovirus portan amplificadores que foron despois inseridos en pacientes. O segundo mecanismo denomínase inserción de promotor. Os promotores proporcionan ás células as secuencias específicas necesarias para empezar a tradución. A inserción de promotor axudou os investigadores a aprender máis sobre o virus VIH. O terceiro mecanismo é a inactivación de xenes. Un exemplo de inactivación de xenes é usar a mutaxénese insercional para inserir un retrovirus que altere o xenoma das células T en pacientes de leucemia e dálles un antíxeno específico chamado CAR que permite que as células T tomen como diana as células cancerosas. Os mecanismos finais denomínanse substitución de extremo 3' do ARNm. Os nosos xenes ocasionalmente sofren mutacións puntuais causando beta-talasemia, que interrompe a función dos glóbulos vermellos. Para arranxar este problema é introducida a secuencia xénica correcta para os glóbulos vermellos e faise unha substitución. Recombinación homóloga
A recombinación homóloga pode utilizarse para producir mutacións específicas nun organismo. Introdúcese na célula un vector que contén unha secuencia de ADN similar á do xene que vai ser modificado e por un proceso de recombinación substitúe o xene diana no cromosoma. Este método pode utilizarse para introducir unha mutación ou facer o knockout dun xene, por exemplo como o usado na produción dun rato knockout. CRISPR
Desde 2013 o desenvolvemento da tecnoloxía CRISPR-Cas9 permitiu a introdución eficiente de diferentes tipos de mutacións no xenoma dunha ampla variedade de organismos. O método non require un sitio de inserción de transposón, non deixa marcador e a súa eficiencia e simplicidade fíxoo o método preferido de "edición" do xenoma. Síntese de xenes
A medida que o custo da síntese de oligonucleótidos de ADN foi baixando, a síntese artificial dun xene completo converteuse finalmente nun método viable para introducir mutacións nun xene. Este método permite introducir mutacións en moitos sitios, incluíndo o redeseño completo do uso de codóns por un xene para optimizalo para un determinado organismo.