Enxeñaría de proteínas

A enxeñaría de proteínas é a disciplina técnica utilizada para desenvolver proteínas útiles e valiosas por medio do deseño e a produción de polipéptidos non naturais, a miúdo alterando secuencias de aminoácidos atopadas na natureza. É unha disciplina nova, na que se están a facer moitas investigacións para comprender o pregamento de proteínas e o recoñecemento dos principios para o deseño de proteínas. Foi utilizada para mellorar a función de moitos encimas para a catálise industrial. É tamén un mercado de servizos e produtos, cun valor estimado de 168. 000 millóns de dólares en 2017.
Hai dúas estratexias xerais para realizar a enxeñaría de proteínas: deseño de proteínas racional e evolución dirixida. Estes métodos non son mutuamente excluíntes, xa que a miúdo se aplican ambos. No futuro, un coñecemento máis detallado da estrutura das proteínas e da súa función, e os avances en cribado de alto rendemento, poden expandir grandemente as capacidades da enxeñaría de proteínas. Finalmente, poderán incluírse mesmo aminoácidos non naturais por medio de métodos máis modernos, como o código xenético expandido, que permiten codificar novos aminoácidos no código xenético. Estratexias
Deseño racional
No deseño de proteínas racional utilízase o coñecemento detallado da estrutura e función dunha proteína para facerlle os cambios desexados. En xeral, isto ten a vantaxe de ser barato e tecnicamente doado de realizar, xa que os métodos de mutaxénese dirixida ao sitio están ben desenvolvidos. Porén, o seu maior inconveniente é que o coñecemento estrutural detallado dunha proteína adoita non estar dispoñible, e, incluso cando está dispoñible, pode ser moi difícil de predicir os efectos de varias mutacións porque as máis das veces a información estrutural proporciona unha imaxe estática da estrutura dunha proteína. Con todo, programas como Folding@home e Foldit utilizaron técnicas de crowdsourcing para aprender máis sobre os motivos presentes no pregamento das proteínas.
Os algoritmos para o deseño de proteínas computacional tratan de identificar novas secuencias de aminoácidos que son de baixa enerxía cando se pregan nunha estrutura diana preespecificada. Mentres que o espazo secuencia-conformación que se debe investigar é grande, a necesidade máis complicada de satisfacer no deseño de proteínas computacional é unha función de enerxía rápida pero exacta que poida distinguir as secuencias óptimas doutras similares subóptimas.
Aliñamento de secuencias múltiples
Sen información estrutural sobre unha proteína, a análise de secuencias adoita ser útil para dilucidar información sobre a proteína. Estas técnicas implican o aliñamento de secuencias diana da proteína con outras secuencias de proteínas relacionadas. Este aliñamento pode mostrar os aminoácidos que están conservados entre especies e son importantes para a función da proteína. Estas análises poden axudar a identificar os aminoácidos clave que poden servir como sitios diana para realizar mutacións. O aliñamento de secuencias múltiples utiliza bases de datos como PREFAB, SABMARK, OXBENCH, IRMBASE e BALIBASE para establecer referencias cruzadas de secuencias diana de proteínas sen secuencias coñecidas. As técnicas de aliñamento de secuencias múltiples lístanse máis abaixo.
Este método empeza realizando un aliñamento de secuencias por pares usando os métodos k-tuple ou Needleman–Wunsch. Estes métodos calculan unha matriz que representa a semellanza por pares entre os pares de secuencia. Os valores de similitude son despois transformados en valores de distancias que se utilizan para producir unha árbore guía usando o método de unión de veciños. esta árbore guía emprégase despois para render aliñamentos de secuencias múltiples.
Clustal omega
Este método pode aliñar ata 190. 000 secuencias utilizando o método k-tuple. As secuencias seguintes son agrupadas usando os métodos mBed e k-means. Constrúese unha árbore guía usando o método UPGMA que é o empregado polo paquete de aliñamento HH. Esta árbore guía utilízase para xerar aliñamentos de secuencias múltiples.
MAFFT
Estes métodos utilizan a transformada de Fourier rápida (FFT) que converte secuencias de aminoácidos en secuencias compostas de valores de volume e polaridade para cada residuo de aminoácido. Esta nova secuencia úsase para atopar rexións homólogas.
K-Align
Este método utiliza o algoritmo de correspondencias de cadeas aproximadas de Wu-Manber para xerar aliñamentos de secuencias múltiples.
Comparación de secuencias múltiples por expectación de logaritmos (MUSCLE)
Este método utiliza distancias Kmer e Kimura para xerar aliñamentos de secuencias múltiples.
T-Coffee
Este método utiliza funcións obxectivas de consistencia baseadas en árbores para a evolución dos aliñamentos. Este método é un 5–10% máis exacto que Clustal W.
Análise coevolutiva
A análise coevolutiva tamén se coñece como mutación correlacionada, covariación ou cosubstitución. Este tipo de deseño racional implica cambios evolutivos recíprocos en loci que interaccionan evolutivamente. Xeralmente este método empeza coa xeración de aliñamentos de secuencias múltiples curados para a secuencia diana. Este aliñamento sométese despois a un refinamento manual que supón a eliminación de secuencias con moitos ocos, así como secuencias con baixa identidade de secuencia. Este paso incrementa a calidade do aliñamento. Seguidamente, utilízase o aliñamento procesado manualmente para medidas coevolutivas adicionais usando algoritmos de mutacións correlacionadas distintas. Estes algoritmos teñen como resultado matrices de valores de coevolución. Estas matrices fíltranse aplicando varios tests de significatividade para extaer valores de coevolución significativos e eliminar o ruído de fondo. Despois vólvense avaliar as medidas coevolutivas para asegurar o seu comportamento e rigor. Finalmente, valídanse experimentalmente os resultados desta análise coevolutiva.
Predición estrutural
A síntese de novo de proteínas benefíciase do coñecemento de estruturas proteicas existentes. Este coñecemento de estruturas proteicas existentes axuda á predición de novas estruturas proteicas. Os métodos de predición de estruturas das proteínas poden ser de catro clases posibles: ab initio, métodos baseados en fragmentos, modelaxe de homoloxía e enfiado de proteínas (protein threading).
Ab initio
Estes métodos implican a modelaxe libre sen usar ningunha información estrutural sobre o molde. Os métodos ab initio tratan de predicir as estruturas nativas das proteínas correspondentes no mínimo global da súa enerxía libre. Algúns exemplos de métodos ab initio son AMBER, GROMOS, GROMACS, CHARMM, OPLS e ENCEPP12. Os pasos xerais a seguir nos métodos ab initio comezan coa representación xeométrica da proteína de interese. Despois, desenvólvese un modelo de función de enerxía potencial para a proteína. Este modelo pode crearse usando potenciais de mecánica molecular ou funcións potenciais derivadas da estrutura da proteína. Despois do desenvolvemento dun modelo potencial, aplícanse á proteína técnicas de busca de enerxía, como as simulacións de dinámica molecular, simulacións Monte Carlo e algoritmos xenéticos.
Baseados en fragmentos
Estes métodos usan información de bases de datos sobre estruturas para atopar correspondencias con estruturas homólogas para crear secuencias de proteínas. Estas estruturas homólogas ensámblanse para dar estruturas compactas usando procedementos de cuantificación e optimización, co obxectico de conseguir o valor de enerxía potencial máis baixo. Servidores web para a información de fragmentos son: I-TASSER, ROSETTA, ROSETTA @ home, FRAGFOLD, CABS fold, PROFESY, CREF, QUARK, UNDERTAKER, HMM, e ANGLOR.
Modelaxe de homoloxía
Estes métodos están baseados na homoloxía de proteínas. Estes métodos tamén se coñecen como modelaxe comparativa. O primeiro paso na modelaxe de homoloxía é xeralmente a identificación de secuencias molde de estrutura coñecida que son homólogas da secuencia buscada. Unha vez que a secuencia buscada é aliñada á secuencia molde. Seguindo o aliñamento, as rexións conservadas estruturalmente son modeladas usando a estrutura molde. Despois disto, faise a modelaxe das cadeas laterais e bucles que son distintas das do molde. Finalmente, a estrutura modelada é sometida a un refinamento e avaliación da calidade. Os servidores dos que se dispón para datos de modelaxe de homoloxía son os seguintes: SWISS MODEL, MODELLER, ReformAlign, PyMOD, TIP-STRUCTFAST, COMPASS, 3d-PSSM, SAMT02, SAMT99, HHPRED, FAGUE, 3D-JIGSAW, META-PP, ROSETTA e I-TASSER.
Enfiado de proteínas (protein threading)
O enfiado de proteínas (protein threading) pode utilizarse cando non se pode atopar un homólogo fiable para a secuencia buscada. Este método empeza por obter unha secuencia buscada e unha biblioteca de estruturas molde. Seguidamente, a secuencia buscada é "enfiada" sobre as estruturas molde coñecidas. Estes modelos candidatos son valorados usando funcións de cuantificación, baseándose en modelos de enerxía potencial tanto da secuencia buscada coma da secuencia molde. Despois selecciónase a correspondencia co modelo de enerxía potencial máis baixa. Os métodos e servidores para recuperar datos de enfiado e realizar cálculos son os seguintes: GenTHREADER, pGenTHREADER, pDomTHREADER, ORFEUS, PROSPECT, BioShell-Threading, FFASO3, RaptorX, HHPred, LOOPP server, Sparks-X, SEGMER, THREADER2, ESYPRED3D, LIBRA, TOPITS, RAPTOR, COTH e MUSTER.
Para máis información sobre o deseño racional ver mutaxénese dirixida ao sitio.
Unión multivalente
A unión multivalente pode utilizarse para incrementar a especificidade de unión e afinidade a través de efectos de avidez. Ter múltiples dominios de unión nunha soa biomolécula ou complexo incrementa a probabilidade de que ocoran outras interaccións por medio de eventos de unión individuais. A avidez e a afinidade efectiva poden ser moito maiores que a suma das afinidades individuais, o que proporciona unha ferramenta efectiva en custo e tempo para a unión dirixida a diana.
Proteínas multivalentes
As proteinas multivlentes son relativamente fáciles de producir por informacións postraducionais ou multiplicando a secuencia de ADN que codifica a proteína. A principal desvantaxe das proteínas multivalentes e multiespecíficas é que poden incrementar a afinidade efectiva para unha diana dunha proteína coñecida. No caso dunha diana inhomoxénea usar unha combinación de proteínas que resulta na unión multiespecífica pode incrementar a especificidade, o cal ten unha grande aplicabilidade en terapéuticas de proteínas.
O exemplo máis común de unión multivalente son os anticorpos, e hai unha extensa investigación sobre anticorpos biespecíficos. As aplicacións de anticorpos biespecíficos cobren un amplo espectro que inclúe a diagnose, formación de imaxes, profilaxe e terapia.
Evolución dirixida
Na evolución dirixida aplícase a unha proteína a mutaxénese aleatoria, por exemplo por PCR tendente ao erro ou mutaxénese de saturación de secuencias, e úsase un réxime de selección para escoller as variantes que teñen as características desexadas. Aplícanse despois máis roldas de mutación e selección. Este método imita a evolución natural e, en xeral, produce resultados superiores ao deseño racional. Un proceso engadido denominado barallado de ADN (DNA shuffling) mestura e une as pezas de variantes con éxito para producir mellores resultados. Tales procesos imitan a recombinación que ocorre de forma natural durante a reprodución sexual. Vantaxes da evolución dirixida son que non necesita o coñecemento estrutural previo dunha proteína, nin é necesaria para predicir o efecto que terá unha determinada mutación. De feito, os resultados dos experimentos de evolución dirixida son a miúdo sorprendentes porque os cambios desexados adoitan ser causados por mutacións que non se esperaba que tivesen ningún efecto. O inconveniente é que cómpre facer un cribado de alto rendemento, o cal non é factible para todas as proteínas. Deben facerse mutr grandes cantidades de ADN recombinante e os produtos cribados para as características desexadas. O gran número de variantes adoita requirir un equipo robótico caro para automatizar o proceso. Ademais, non todas as actividades desexadas poden cribarse doadamente.
A evolución darwinista natural pode imitarse no laboratorio modelando a medida as propiedades das proteínas para diversas aplicacións, incluíndo a catálise. existen moitas tecnoloxías experimentais para producir grandes e diversas bibliotecas de proteínas e para o cribado ou selección de variantes funcionais pregadas. As proteínas pregadas orixínanse de forma frecuentemente sorprendente no espazo de secuencias aleatorio, algo aproveitable para facer evolucionar ligantes selectivos e catalizadores. Aínda que é máis conservadora que a selección dirixida do espazo de secuencias profundo, o redeseño de proteínas existentes por mutaxénese aleatoria e selección/cribado é un método especialmente robusto para optimizar ou alterar as propiedades existentes. Tamén representa un excelente punto de partida para conseguir obxectivos de enxeñaría ambiciosos. Combinar a evolución experimental con modernos métodos computacionais é probablemente a estratexia máis ampla e frutífera para xerar macromoléculas funcionais descoñecidas na natureza.
Os principais retos para deseñar bibliotecas mutantes de alta calidade solucionáronse significativamente no pasado recente. Este progreso debeuse a que se fixeron mellores descricións dos efectos das cargas mutacionais sobre as características da proteína. Tamén as estratexias computacionais experimentaron grandes avances no enormemente grande espazo de secuencias para tamaños de cribado máis manexables, creando así boas bibliotecas de mutantes. O tamaño de biblioteca tamén se reduciu a tamaños máis cribables pola identificación de residuos clave beneficiosos usando algoritmos para a recombinación sistemática. Finalmente, un avance significativo para unha reenxeñerización eficiente de encimas fíxose co desenvolvemento de modelos estatísticos máis axeitados e de algoritmos que cuantifican e predín efectos mutacionais acoplados sobre as funcións das proteínas.
Xeralmente, a evolución dirixida pode resumirse como un proceso iterativo en dous pasos no que se xeran bibliotecas de proteínas mutantes, e procesos de cribado de alto rendemento para seleccionar variantes con características melloradas. Para aplicar esta técnica non cómpre ter un coñecemento previo da estrutura das proteínas e as relacions coas funcións. A evolución dirixida utiliza a mutaxénese aleatoria ou focalizada para xerar bibliotecas de proteínas mutantes. As mutacións aleatorias poden introducirse usando a PCR tendente ao erro ou a mutaxénese de saturación de sitio. Os mutantes poden tamén xerarse usando a recombinación de xenes homólogos múltiples. Na natureza evolucionaron un número limitado de secuencias beneficiosas. A evolución dirixida fixo posible identificar secuencias proteicas non descubertas que teñen novas funcións. Esta capacidade é continxente coa capacidade das proteínas de ser tolerantes a substitucións de residuos de aminoácidos sen que isto comprometa o seu pregamento ou estabilidade.
Os métodos de evolución dirixida poden categorizarse grosso modo en dúas estratexias: métodos asexuais e sexuais.
Métodos asexuais
Os métodos asexuais non xeran ningún enlace cruzado entre xenes parentais. Utilízanse xenes únicos para crear bibliotecas de mutantes usando varias técnicas mutaxénicas. Estes métodos asexuais poden producir tanto mutaxénese aleatoria coma focalizada.
Mutaxénese aleatoria
Os métodos de mutaxénese aleatoria producen mutacións ao chou no xene de interese. A mutaxénese aleatoria pode introducir os seguintes tipos de mutacións: transicións, transversións, insercións, delecións, inversións, de cambio de sentido e sen sentido. Exemplos de métodos que producen mutaxénese aleatoria son os seguintes:
PCR tendente ao erro
A PCR tendente ao erro utiliza o feito de que a ADN polimerase Taq carece de actividade de exonuclease 3'-5'. Isto orixina unha taxa de erro de 0, 001–0, 002% por nucleótido por replicación. Este método empeza escollendo o xene ou a área dentro dun xene onde se desexa crear mutacións. Despois, o alcance do erro requirido calcúlase baseándose no tipo e amplitude da actividade que se quere xerar. Este alcance do erro determina a estratexia de PCR tendente ao erro que se debe empregar. Despois da PCR, os xenes clónanse nun plásmido e introdúcense en sistemas celulares competentes. Estas células son despois cribadas para os trazos desexados. Os plásmidos son despois illados en colonias que mostran os trazos mellorados, e despois utilízanse como moldes na seguinte rolda de mutaxénese. A PCR tendente ao erro presenta nesgos para certas mutacións respecto das demais, como sobre transicións fronte a transversións.
As taxas de erro na PCR poden incrementarse das seguintes maneiras: Aumentar a concentración de cloruro de magnesio, o cal estabiliza un apareamento de bases non complementario.
Engadir cloruro de magnesio para reducir a especificidade dos pares de bases.
Adición incrementada e desequilibrada de dNTPs.
Adición de análogos de bases como dITP, 8 oxo-dGTP e dPTP.
Incremento da concentración da polimerase Taq.
Aumentar o tempo de extensión.
Aumentar o tempo do ciclo.
Usar unha polimerase Taq menos exacta.
Ver tamén reacción en cadea da polimerase para máis información.
PCR tendente ao erro de círculo rodante
Este método de PCR está baseado na amplificación de círculo rodante, que se modela a partir do método que usan as bacterias para amplificar o seu ADN circular. Este método ten como resultado a formación de dúplex de ADN liñais. Estes fragmentos conteñen repeticións en tándem de ADN circular chamadas concatámeros, que se poden transformar dentro de cepas bacterianas. Introdúcense as mutacións clonando primeiro a secuencia diana nun plásmido axeitado. Despois, empeza o proceso de amplificación usando cebadores hexámeros aleatorios e ADN polimerase Φ29 en condicións de amplificación de círculo rodante tendente ao erro. Condicións adicionais para producir a amplificación de cícuclo rodante tendente ao erro son 1, 5 pM de ADN molde, 1, 5 mM de MnCl2 e un tempo de reacción de 24 horas. O MnCl2 engádese á mestura de reacción para promover mutacións puntuais aleatorias nas febras de ADN. As taxas de mutación poden incrementarse ao aumentar a concentración de MnCl2 ou ao diminuír a concentración do ADN molde. A amplificación de círculo rodante tendente ao erro é vantaxosa en relación á PCR tendente ao erro debido ao seu uso de cebadores hexámeros aleatorios universais no canto de usar cebadores específicos. Ademais, os produtos de reacción desta amplificación non necesitan tratarse con ligases ou endonucleases. Esta reacción é isoterma.
Mutaxénese química
A mutaxénese química supón o uso de axentes químicos para intoducir mutacións nas secuencias xenéticas. Exemplos de mutaxénese química son os seguintes: O bisulfato de sodio é efectivo para mutar secuencias xenómicas ricas en G/C. Isto débese a que o bisulfato de sodio cataliza a desaminación da citosina non metilada a uracilo.
Residuos de guanina alquilados con metanosulfonato de etilo (EMS). Esta alteración causa erros durante a replicación do ADN.
O ácido nitroso causa a transversión por desaminación da adenina e citosina.
A estratexia dobre da mutaxénese química aleatoria é un proceso iterativo en dous pasos. Primeiro, hai unha mutaxénese química in vivo do xene de interese por EMS. Despois, o xene tratado íllase e clónase nun vector de expresión non tratado para impedir mutacións no esqueleto molecular do plásmido. Esta técnica preserva as propiedades xenéticas do plásmido.
TaGTEAM
O método TaGTEAM (do inglés Targeting Glycosylases To Embedded Arrays for Mutagenesis) foi utilizado para crear mutaxénese dirixida a diana in vivo en lévedos. Este método implica a fusión dunha 3-metiladenina ADN glicosilase cun dominio de unión ao ADN tetR. Isto incrementa as taxas de mutación multiplicándoas por 800 en rexións do xenoma que conteñen sitios tetO.
Mutaxénese por inserción aleatoria e deleción
Este método implica a alteración da lonxitude da secuencia pola deleción e inserción simultáneas de tramos de bases de lonxitude arbitraria. Este método produce proteínas con novas funcionalidades por introdución de novos sitios de restrición, codóns específicos e codóns de catro bases para aminoácidos non naturais.
Mutaxénese aleatoria baseada en transposón
Recentemente informouse de moitos métodos de mutaxénese aleatoria baseada en transposón. Entre estes métodos están, entre outros, os seguintes: permutación circular aleatoria PERMUTE, truncamento de proteínas aleatorio, substitución de tripletes de nucleótidos aleatoria, inserción de aminoácidos de dominio/etiqueta/múltiple aleatoria, mutaxénese de escaneo de codón, e mutaxénese de escaneo multicodón. Nas técnicas antes mencionadas cómpre o deseño de transposóns mini-Mu. A compañía Thermo Scientific fabrica kits para o deseño destes trasposóns.
Métodos de mutaxénese aleatoria que alteran a lonxitude do ADN diana
Estes métodos alteran a lonxitude do xene por mutacións de inserción e deleción. Un exemplo é o método de inserción de repeticións en tándem (TRINS). Esta técnica orixina repeticións en tándem de fragmentos aleatorios do xene diana por amplificación de círculo rodante e a incorporación simultánea destas repeticións ao xene diana.
Cepas mutadoras
As cepas mutadoras son liñas celulares bacterianas deficientes nun ou máis mecanismos de reparación do ADN. Un exemplo de cepa mutadora é Escherichia coli XL1-RED. Esta cepa subordinada de E. coli é deficiente nas vías de reparación do ADN MutS, MutD e MutT. O uso de cepas mutadoras é útil para introducir moitos tipos de mutacións; porén, estas cepas mostran unha progresiva deterioración do cultivo debido á acumulación de mutacións no propio xenoma das cepas.
Mutaxénese focalizada
Os métodos mutaxénicos focalizados producen mutacións en residuos de aminoácidos predeterminados. Estas técnicas requiren comprender as relacións secuencia-función da proteína de interese, xa que isto permite a identificación de residuos que son importantes para a estabilidade, estereoselectividade e eficiencia catalítica. Exemplos de métodos que producen este tipo de mutaxénese indícanse máis abaixo.
Mutaxénese de saturación de sitio
A mutaxénese de saturación de sitio é un método baseado en PCR usado para afectar a aminoácidos con papeis significativos na función da proteína. As dúas técnicas máis comúns para realizar isto son a PCR única de plásmido completo e a PCR de extensión de solapamento.
A PCR única de plásmido completo (whole plasmid single PCR) tamén se denomina mutaxénese dirixida a sitio (SDM, do inglés site directed mutagenesis). Os produtos da mutaxénese dirixida a sitio son sometidos a dixestión por endonuclease Dpn. Esta dixestión ten como resultado o corte de só a febra parental, porque a febra parental contén un GmATC que está metilado no N6 da adenina. A mutaxénese dirixida a sitio non funciona ben con plásmidos grandes de máis de 10 quilobases. Ademais, este método só pode substituír dous nucleótidos á vez.
A PCR de exensión de solapamento (overlap extension PCR) usa dous pares de cebadores. Un cebador de cada conxunto contén unha mutación. Realízase unha primeira rolda de PCR usando estes conxuntos de cebadores e fórmanse dous dúplex de ADN bicatenario. Realízase unha segunda rolda de PCR na cal estes dúplex son desnaturalizados e anelados cos conxuntos de cebadores novamente para producir heterodúplex, nos cales cada febra ten unha mutación. Calquera oco que poida haber nestes heterodúplex neoformados énchese con ADN polimerases e sofre máis amplificacións.
Mutaxénese de saturación de secuencia (SeSaM)
A mutaxénese de saturación de secuencia ten como resultado a aleatorización da secuencia diana en cada posición nucleotídica. Este método empeza coa xeración de fragmentos de ADN de lonxitude variable cunha cola de bases universais polo uso de transferases de molde no extremo 3'. Despois, estes fragmentos exténdense ata a súa lonxitude completa usando un molde monocatenario. As bases universais son substituídas cunha base estándar aleatoria, causando mutacións. Deste método hai varias versións modificadas como SeSAM-Tv-II, SeSAM-Tv+ e SeSAM-III.
Reaccións dun único cebador en paralelo (SPRINP)
Este método de mutaxénese de saturaión de sitio comprende dúas reaccións de PCR separadas. A primeira delas usa só cebadores cara a adiante, mentres que a segunda reacción usa só cebadores inversos. Isto evita a formación de dímeros de cebadores.
Mutaxénese focalizada libre de ligase e con megacebadores
Esta técnica de mutaxénese de saturación de sitio empeza cun oligonucleótido mutaxénico e un cebador flanqueante universal. Estes dous reactivos utilízanse para un ciclo de PCR inicial. Os produtos deste primeiro ciclo de PCR utilízanse como megacebadores para a seguinte PCR.
Ω-PCR
Este método de mutaxénese de saturación de sitio está baseado na PCR de extensión de solapamento. Utilízase para introducir mutacións en calquera sitio dun plásmido circular.
PFunkel-ominchange-OSCARR
Este método utiliza mjutaxénese dirixida ao sitio definida polo usuario nun ou en múltiples sitios simultaneamente. OSCARR é un acrónimo de metodoloxía simple nun recipiente para aleatorización de casete e recombinación, que en inglés é one pot simple methodology for cassette randomization and recombination. Esta aleatorización e recombinación ten como resultado fragmentos desexados dunha proteína. Omnichange é unha mutaxénese de saturación multisitio independente de secuencia que pode saturar ata cinco codóns independentes dun xene.
Mutaxénese de trímero-dímero
Este método elimina codóns redundantes e codóns de stop.
Mutaxénese de casete
Este é un método baseado en PCR. A mutaxénese de casete empeza cunha síntese dun casete de ADN que contén o xene de interese, que está flanqueado a cada lado por sitios de restrición. A endonuclease que corta estes sitios de restrición tamén corta sitios no plásmido diana. A casete de ADN e o plásmido diana son ambos tratados con endonucleases para cortar estes sitios de restrición e crear extremos pegañosos. Seguidamente, os produtos deste corte quedan ligados, o que ten como resultado a inserción do xene no plásmido diana. Unha forma alternativa de mutaxénese de casete chamada mutaxénese de casete combinatoria utilízase para identificar as funcións de residuos de aminoácidos individuais na proteína de interese. Despois utilízase a mutaxénese de conxunto repetitiva a partir da mutaxénese de casete combinatoria previa. A mutaxénese de casete de codón permite inserir ou substituír un só codón nun sitio particular nun ADN bicatenario.
Métodos sexuais
Os métodos sexuais da evolución dirixida implican a recombinación in vitro que imita a recombinación natural in vivo. Xeralmente estas técnicas requiren unha alta homoloxía de secuencias entre as secuencias parentais. Estas técnicas utilízanse a miúdo para recombinar dous xenes parentais, e estes métodos crean sobrecruzamentos entre eses xenes.
Recombinación homóloga in vitro
A recombinación homóloga pode dividirse en in vivo ou in vitro. A recombinación homóloga in vitro imita a recombinación natural in vivo. Estes métodos de recombinación in vitro requiren unha alta homoloxía de secuencia entre as secuencias parentais. Estas técnicas aproveitan a diversidade natural en xenes parentais ao recombinalos para orixinar xenes quiméricos. A quimera resultante mostra unha mestura de características parentais.
Barallado de ADN
O barallado de ADN (DNA shuffling) é unha técnica in vitro que foi unha das primeiras técnicas na era da recombinación. Empeza coa dixestión de xenes parentais homólogos en pequenos fragmentos por DNase1. Estes pequenos fragmentos son despois purificados a partir de xenes parentais non dixeridos. Os fragmentos purificados son despois reensamblados usando PCR sen cebador. Nesta PCR fragmentos homólogos de diferentes xenes parentais cébanse uns a outros, o que orixina un ADN quimérico. O ADN quimérico de tamaño parental é despois amplificado usando cebadores terminais na PCR habitual.
Recombinación in vitro de cebado aleatorio (RPR)
Este método de recombinación homóloga in vitro comeza coa síntese de moitos fragmentos xénicos curtos que presentan mutacións usando cebadores de secuencia aleatoria. Estes fragmentos son reensamblados ata ter xenes parentais de lonxitude completa usando PCR sen cebador. Estas secuencias reensambladas son despois amplificadas usando PCR e sometidas a ulteriores procesos de selección. Este método é máis vantaxoso que o barallado de ADN porque non utiliza DNase1, e dese xeito non hai nesgo de recombinación xunto a un nucleótido pirimidínico. Este método é tamén vantaxoso debido ao seu uso de cebadores aleatorios sintéticos que son de lonxitude uniforme e á falta de nesgos. Finalmente este método é independente da lonxitude da secuencia do ADN molde e require unha cantidade pequena de ADN parental.
PCR específica de xene metaxenómico truncado
Este método xera xenes quiméricos directamente de mostras metaxenómicas. Empeza co illamento do xene desexado polo cribado funcional de mostras de ADN metaxenómico. Seguidamente, deséñanse cebadores específicos e utilízanse para amplificar os xenes homólogos de diferentes mostras ambientais. Finalmente, xéranse bibliotecas quiméricas para recuperar os clones funcionais desexados ao barallar estes xenes homólogos amplificados.
Proceso de extensión cambaleante (StEP)
O proceso de extensión cambaleante (StEP, do inglés Staggered extension process) é un método in vitro que utiliza PCR baseado no cambio de molde para xerar xenes quiméricos. Este método empeza cunha desnaturalización inicial do molde, seguindo do anelado de cebadores e un tempo de extensión breve. Todos os ciclos seguintes xeran o anelado entre os fragmentos curtos xerados en ciclos previos e diferentes partes do molde. Estes fragmentos curtos e o molde anélanse xuntos segundo a complementariedade de secuencia. Este proceso no que os fragmentos se anelan ao ADN molde denomínase cambio de molde (template switching). Estes fragmentos anelados servirán despois como cebadores para unha maior extensión. Este método lévase a cabo ata que se obtén a secuencia do xene quimérico de lonxitude parental. Para comezar a execución deste método só cómpren cebadores flanqueantes. Tampouco se necesita o encima Dnase1.
Quimeraxénese aleatoria en moldes transitorios (RACHITT)
O método RACHITT (do inglés Random chimeragenesis on transient templates) xera bibliotecas de xenes quiméricos cunha media de 14 sobrecruzamentos por xene quimérico. Empeza aliñando fragmentos desde unha febra superior parental a unha febra inferior dun molde que contén uracilo a partir dun xene homólogo. Córtanse os tramos que sobresaen 5' e 3' e os ocos énchense polas actividades de exonuclease e endonuclease das ADN polimerases Pfu e Taq. O molde que contén uracilo é despois retirado do heterodúplex por tratamento cunha uracilo ADN glicosilase, seguido dunha maior amplificación usando PCR. Ese método é vantxoso porque xera quimeras cunha frecuencia de sobrecruzamento relativamente alta. Porén, é algo limitado debido á complexidade e á necesidade da xeración de ADN monocatenario e dun ADN molde monocatenario que conteña uracilo.
Barallado sintético
O barallado de oligonucleótidos dexenerados sintéticos contribúe á flexibilidade dos métodos de barallado (shuffling), porque se poden incluír oligonucleótidos que conteñen codóns óptimos e mutacións beneficiosas.
Recombinación homóloga in vivo
A clonación realizada en lévedos utiliza a reensamblaxe dependente de PCR de vectores de expresión fragmentados. Estes vectores reensamblados son despois introducidos e clonados en lévedos. Usar lévedos para clonar o vector evita a toxicidade e a contra-selección que se introduciría por ligación e propagación en E. coli.
Proceso de recombinación organizada mutaxénica por agrupamento in vivo homólogo (MORPHING)
O MORPHING (do inglés Mutagenic organized recombination process by homologous in vivo grouping) introduce mutacións en rexións xénicas específicas mentres que deixa intactas outras partes ao utilizar a alta frecuencia de recombinación homóloga en lévedos.
Evolución continua asistida por fagos (PACE)
O PACE (do inglés Phage-assisted continuous evolution) utiliza un bacteriófago cun ciclo vital modificado para transferir xenes en evolución dun hóspede a outro. O ciclo vital do fago deséñase de tal xeito que a transferencia está correlacionada coa actividade de interese do encima. Este método é vantaxoso porque require unha intervención humana mínima para a evolución continua do xene.
Métodos de recombinación non homóloga in vitro
Estes métodos están baseados no feito de que as proteínas poden presentar unha identidade estrutural similar pero careceren de homoloxía de secuencias.
Barallado de exóns
O barallado de exóns (exon shuffling) é a combinación de exóns de diferentes proteínas por eventos de recombinación que ocorren nos intróns. O barallado de exóns ortólogos consiste na combinación de exóns de xenes ortólogos de diferentes especies. O barallado de dominios ortólogos supón o barallado de dominios proteicos enteiros de xenes ortólogos de distintas especies. O barallado de exóns parálogos é o barallado de exons de diferentes xenes da mesma especie. O barallado de dominios parálogos é o barallado de dominios proteicos enteiros de proteínas parálogas da mesma especie. O barallado homólogo funcional implica o barallado de dominios non homólogos que están relacionados funcionalmente. Todos estes procesos fanse con amplificación dos exóns desexados de diferentes xenes usando oligonucleótidos sintéticos quiméricos. Estes produtos de amplificación son despois reensamblados en xenes de lonxitude completa usando PCR sen cebador. Durante estes ciclos de PCR os fragmentos actúan como moldes e cebadores. Isto ten como resultado xenes de lonxitude completa quiméricos, que son despois sometidos a cribado.
Truncamento incremental para a creación de encimas híbridos (ITCHY)
Créanse fagmentos de xenes parentais usando a dixestión controlada por exonuclease III. Estes fragmentos fanse romos usando unha endonuclease e líganse para producir un xene híbrido. THIOITCHY é unha técnica de ITCHY modificado que utiliza análogos de nucleósidos trifosfato como os dNTPs α-fosfotioato. A incorporación destes nucleósidos bloquea a disxestión pola exonuclease III. Esta inhibición da dixestión pola exonuclease III denomínase spiking, o cal pode realizarse truncando primeiro os xenes con exonuclease para crear fragmentos con curtos tramos monocatenarios que sobresaen. Estes fragmentos serven despois como moldes para a amplificación pola ADN polimerase en presenza de pequenas cantidades de dNTPs fosfotioato. despois, estes fragmentos resultantes líganse para formar xenes de lonxitude completa. Alternativamente, os xenes parentais intactos poden amplificarse por PCR en presenza de dNTPs normais e dNTPs fosfotioato. Estes produtos de amplificación de lonxitude completa son sometidos despois a dixestión por unha exonuclease. A dixestión continúa ata que a exonuclease encontra un α-pdNTP, o que ten como resultado fragmentos de diferentes lonxitudes. Seguidamente, estes fragmentos son ligados para xerar xenes quiméricos.
SCRATCHY
Este método xera bibliotecas de xenes híbridos inhibindo múltiples sobrecruzamentos ao combinar o barallado de ADN e o ITCHY. Empeza coa construción de dúas bibliotecas de ITCHY independentes. A primeira ten o xene A no N-terminal, e a outra ten o xene B. Estes fragmentos de xenes híbridos sepáranse usando a dixestión por encimas de restrición ou PCR con cebadores terminais por electroforese en xel de agarosa. Estes fragmentos illados son despois mesturados e dixeridos usando DNase1. Os fragmentos dixeridos son entón reensamblados por PCR sen cebador con cambio de molde.
Extensión recombinada en moldes truncados (RETT)
O método RETT (do inglés recombined extension on truncated templates) xera bibliotecas de xenes híbridos por cambio de molde de polinucleótidos que crecen unidireccionalmente en presenza de fragmentos de ADN monocatenarios como moldes para quimeras. Este método comeza coa preparación de fragmentos de ADN monocatenarios por transcrición inversa a partir do ARNm diana. Entón, anélanse cebadores específicos do xene ao ADN monocatenario. Estes xenes son despois estendidos durante un ciclo de PCR. A este ciclo séguelle o cambio de molde e o anelado dos fragmentos curtos obtidos da anterior extensión de cebador a outros fragmentos de ADN monocatenaio. Este proceso repítese ata que se obtén o ADN monocatenario de lonxitude completa.
Recombinación de proteínas independente da homoloxía de secuencias (SHIPREC)
O método SHIPREC (do inglés sequence homology-independent protein recombination) xera unha recombinación entre xenes con pouca ou ningunha homoloxía de secuencias. Estas quimeras fusiónanse por medio dunha secuencia ligadora que contén varios sitios de restrición. Este construto dixírese a continuación usando DNase1. Os fragmentos fanse de extremos romos usando a nuclease S1. Estes fragmentos romos xúntanse por ligazón formando unha secuencia circular. Este construto circular linearízase usando encimas de restrición para os cales os sitios de restrición se encontran na rexión ligadora. Disto resulta unha biblioteca de xenes quiméricos na cal a contribución dos xenes aos extremos 5' e 3' será invertida comparada co construto de partida.
Quimeraxénese dirixida a sitio independente de secuencia (SISDC)
A SISDC (do inglés sequence independent site directed chimeragenesis) orixina unha biblioteca de xenes con múltiples sobrecruzamentos de varios xenes parentais. Este método non necesita que haxa unha identidade de secuencias entre os xenes parentais. Non require un ou dous aminoácidos conservados en cada posición de sobrecruzamento. Empeza co aliñamento de secuencias parentais e a identificación de rexións consenso que serven como sitios de sobrecruzamento. A isto séguelle a incorporación de etiquetas específicas que conteñen sitios de restrición e posteriormente elimínanse as etiquetas por dixestión con Bac1, resultando na formación de xenes con extremos cohesivos. Estes frgmentos de xenes son mesturados e ligados nunha orde axeitada para formar bibliotecas quiméricas.
Recombinación homo-dúplex dexenerada (DHR)
Este método empeza co aliñamento de xenes homólogos, seguido da identificación de rexións de polimorfismo. Despois, a febra superior do xene divídese en pequenos oligonucleótidos dexenerados. A febra inferior tamén se dixire en oligonucleótidos para que sirvan de armazón. Estes fragmentos combínanse en solución e son oligonucleótidos da febra superior ensamblados con oligonucleótidos da febra inferior. Os ocos entre estes fragmentos énchense con polimerase e líganse.
PCR multirrecombinante aleatoria (RM-PCR)
Este método implica o barallado de fragmentos de ADN plurais sen homoloxía nunha soa PCR. Isto ten como resultado a reconstrución de proteínas completas por ensamblaxe de módulos que codifican diferentes unidades estruturais.
Recombinación do ADN fácil de usar (USERec)
A USERec (do inglés user friendly DNA recombination) empeza coa amplificación de fragmentos de xenes que deben ser recombinados usando dNTPs de uracilo. Esta solución de amplificación tamén contén cebadores, PfuTurbo, e ADN polimerase Cx Hotstart. Os produtos amplificados son despois incubados co encima USER. Este encima cataliza a eliminación de residuos de uracilo do ADN creando ocos dunha soa base. Os fragmentos tratados co encima USER mestúranse e líganse utilizando ADN ligase de T4 e son sometidos a dixestión por Dpn1 para eliminar o molde de ADN. Estes fragmentos de febras son sometidos a amplificación usando PCR, e son transformados en E. coli.
Recombinación de barallado Golden Gate (GGS)
Este método permite recombinar polo menos 9 fragmentos diferentes nun vector aceptor usando un encima de restrición de tipo 2, que corta fóra do sitio de restrición. Iníciase coa subclonación de fragmentos en vectores separados para crear secuencias flanqueantes Bsa1 a ambos os lados. Estes vectores son despois cortados usando o encima de restrición de tipo II Bsa1, que xera tramos sobresaíntes monocatenarios de catro nucleótidos. Os fragmentos con tramos sobresaíntes complementarios hibrídanse e líganse usando ADN ligase de T4. Finalmente, estes construtos son despois transformados en células de E. coli, que son cribados para os niveis de expresión.
Método de recombinación do ADN baseado no fosforotioato (PRTec)
Este método pode utilizarse para recombinar elementos estruturais ou dominios proteicos enteiros. Está baseado na quimica do fosforotioato que permite o corte específico de enlaces fosforotiodiéster. O primeiro paso do proceso empeza coa amplificación de fragmentos que necesitan ser recombinados xunto co esqueleto molecular do vector. Esta amplificación realizada usando cebadores con nucleótidos fosforotiolados nos extremos 5'. Os produtos de PCR amplificados córtanse nunha solución de etanol-ioduro a altas temperaturas. A continuación, estes fragmentos hibrídanse a temperatura dunha habitación e son transformados en E. coli, o cal repara as amosegas.
Integrón
Este sistema está baseado no sistema de recombinación específico de sitio natural de E. coli. Este sistema chámse sistema integrón e produce un barallado de xenes naturais. Este método foi utilizado para construír e optimizar un operón biosintético de triptófano funcional en E. coli' deficiente en triptófano ao entregar casetes de recombinación individuais ou xenes trpA-E xunto con elementos regulatorios co sistema integrón.
Barallado baseado na ligación Y (YLBS)
Este método xera febras de ADN monocatenario, que comprenden un só bloque de secuencia no extremo 5' ou no 3', secuencias complementarias nunha rexión de talo-bucle e unha rexión de rama D que serve como o primeiro sitio de unión para a PCR. Mestúranse cantidades equivalentes de medias febras dos extremos 5' e 3' e fórmase un híbrido debido á complementariedade na rexión do talo. Os híbridos con extremos 5' fosforilados libres de medias febras 3' son despois ligados con extremos 3' libres de medias febras 5' usando ADN ligase de T4 en presenza de 0, 1 mM de ATP. Os produtos ligados son despois amplificados por dous tipos de PCR para xerar medios produtos de PCR pre 5' e pre 3'. Estes produtos de PCR convértense en febras monocatenarias pola unión de avidina-biotina ao extremo 5' dos cebadores que coneñen secuencias talo que estaban etiquetadas con biotina. Despois, as medias febras 5' biotiniladas e as medias febras 3' non biotiniladas utilízanse como medias febras 5' e 3' para o seguinte ciclo de ligación Y (ligación de bloques cun talo e dúas ramas, con forma de Y). Deseño semirracional
O deseño semirracional usa información sobre a secuencia, estrutura e función dunha proteína, en tándem con algoritmos preditivos. Todo isto úsase para identificar residuos de aminoácidos diana que é máis probable que inflúan na función da proteína. As mutacións destes residuos de aminoácidos clave crea bibliotecas de proteínas mutantes que é máis probable que teñan propiedades melloradas.
Os avances en enxeñaría de encimas semirracional e o deseño de encimas de novo posibilita novas estratexias poderosas e efectivas para manipular biocatalizadores. As estratexias baseadas na integración da secuencia e estrutura no deseño de bibliotecas demostrou ser unha gran guía para o redeseño de encimas. Xeralmente, os métodos actuais computacionais de novo e de redeseño non son comparables coas variantes resultado da evolución en prestacións catalíticas. Aínda que a optimización experimental pode producirse usando evolución dirixida, conséguense maiores aumentos na exactitude da predición da estrutura e maiores capacidades catalíticas con melloras no deseño de algoritmos. Poden incluírse máis melloras funcionais no futuro integrando a dinámica de proteínas.
Os estudos bioquímicos e biofísicos, xunto co afinamento dos marcos preditivos serán útiles para avaliar experimentalmente a importancia funcional de características de deseño habituais. Unha mellor comprensión destas contribucións funcionais facilitará a mellora dos deseños futuros.
A evolución dirixida probablemente non será substituída como método de elección para a enxeñaría de proteínas, aínda que o deseño de proteínas computacional cambiou fundamentalmente a maneira en que a enxeñaría de proteínas pode manipular as biomacromoléculas. Poden xerarse bibliotecas máis pequenas, máis centradas no seu obxectivo e ricas funcionalmente usando métodos que incorporan marcos preditivos para a enxeñaría de proteínas derivada de hipóteses. Novos deseños e estratexias e avances técnicos empezan a afastarse dos protocolos tradicionais, como a evolución dirixida, o cal representa a estratexia máis efectiva para identificar os candidatos con mellores prestacións en bibliotecas focalizadas. A síntese de bibliotecas de xenes completos está substituíndo os protocolos de barallado e mutaxénese para a preparación de bibliotecas. Ademais, aplícanse cada vez máis ensaios de cribado de baixo rendemento altamente específicos en lugar de cribados monumentais e esforzos de selección de millóns de candidatos. En conxunto, estes desenvolvementos están preparados para levar a enxeñaría de proteínas alén da evolución dirixida e cara a estratexias prácticas e máis eficientes para crear biocatalizadores á medida. Técnicas de cribado e selección
Unha vez que unha proteína foi sometida a evolución dirixida, deseño racional ou semirracional, as bibliotecas de proteínas mutantes deben ser cribadas para determinar que mutantes mostran propiedades melloradas. Os métodos de phage display son unha opción para o cribado de proteínas. Este método fusiona xenes que codifican os polipéptidos variantes con xenes de proteínas da cuberta de fagos. As variantes proteicas expresadas sobre a superficie do fago son seleccionadas uníndoas con dianas inmobilizadas in vitro. Os fagos con variantes de proteínas seleccionadas son despois amplificados en bacterias, e seguidamenrte identifícanse os clons positivos pola técnica ELISA. Estes fagos seleccionados son despois sometidos a secuenciación do ADN.
Os sistemas de display na superficie de células poden tamén utilizarse para cribar bibliotecas de polipéptidos mutantes. Os xenes mutantes da biblioteca incorpóranse a vectores de expresión, que son despois transformados nas células hóspede máis axeitadas. Estas células hóspede son sometidas a métodos de cribado de alto rendemento para identificar as células cos fenotipos desexados.
Os sistemas de display libres de células desenvolvéronse para aproveitar a tradución de proteínas in vitro ou a tradución libre de células. Entre estes métodos está o mRNA display, o ribosome display, o DNA display covalente ou non covalente, e a compartimentalización in vitro.
Enxeñaría de encimas
A enxeñaría de encimas é a aplicación da modificación da estrutura dun encima (e, desa maneira, da súa función) ou a modificación da actividade catalítica de encimas illados para producir novos metabolitos, para permitir que ocorran novas rutas (catalizadas) de reaccións, ou para converter certos compostos noutros (biotransformación). Estes produtos son útiles como compostos químicos, produtos farmacéuticos, combustibles, alimentos ou aditivos agrícolas.
Un reactor de encimas consiste nun recipiente que contén un medio de reacción que se utiliza para realizar unha conversión desexada por medios encimáticos. Os encimas utilizados neste proceso están libres en solución. Ademais, os microorganismos son unha das orixes importantes de encimas xenuínos. Exemplos de proteínas de enxeñaría
Utilizáronse métodos computacionais para deseñar unha proteína cun pregamento novo chamada Top7, e sensores para moléculas non naturais. A enxeñaría de proteínas de fusión rendeu o fármaco rilonacept, que ten a aprobación da FDA norteamericana para o tratamento da síndrome periódica asociada á criopirina.
Outro método computacional, IPRO, serviu para preparar por enxeñaría o cambio da especificidade de cofactor da xilose redutase de Candida boidinii. O Redeseño e Optimización Iterativos de Proteínas (Iterative Protein Redesign and Optimization, IPRO) redeseña proteínas para incrementar ou dar especificidade a substratos nativos e novos e cofactores. Isto faise perturbando aleatoriamente de forma repetida a estrutura da proteína arredor de posicións de deseño especificado, identificando a combinación de menor enerxía de rotámeros, e determinando se o novo deseño ten unha enerxía de unión máis baixa que os previos.
O deseño asistido por computador tamén se utilizou para obter por enxeñaría propiedades complexas dunha ensamblaxe nanoproteica altamente ordenada. Unha gaiola proteíca, a da bacterioferritina de E. coli (EcBfr), que mostra de forma natural inestabilidade estrutural e un comportamento de autoensamblaxe incompleta en dous estados de oligomerización, é a proteína modelo deste estudo. Por análise computacional e comparación cos seus homólogos, atopouse que esta proteína ten unha interface dímera máis pequena que a media no seu eixe de simetria binario debido principalmente á existencia dun peto de auga interfacial centrado en dous residuos de asparaxina ligados con ponte de auga. Para investigar a posibilidade de preparar por enxeñaría a EcBfr para a estabilidade estrutural modificada, utilízase un método computacional semiempírico para explorar virtualmente as diferenzas de enerxía de 480 mutantes posibles na interface dimérica en relación coa EcBfr de tipo silvestre. Este estudo computacional tamén converxe nas asparaxinas ligadas con ponte de auga. Substituír estas dúas asparaxinas con aminoácidos hidrófobos ten como resultado a formación de proteínas que se pregan en monómeros de hélice alfa e se ensamblan en gaiolas, como se evidencia por dicroísmo circular e microscopia electrónica de transmisión. Tanto a desnaturalización térmica coma química confirman que todas as proteínas redeseñadas, de acordo cos cálculos, presentan unha maior estabilidade. Unha das tres mutacións cambia a poboación en favor do estado de oligomerización de orde máis alta en solución, como mostran a cromatografía de exclusión por tamaños e a electroforese en xel nativa.
Un método in silico chamado PoreDesigner foi desenvolvido con éxito para redeseñar a proteína de canle bacteriana (OmpF) para reducir o seu tamaño de poro de 1 nm a calquera dimensión subnanométrica desexada. Os experimentos de transporte polos poros deseñados máis estreitos revelaron un completo rexeitamenteo de sales cando se ensamblaban en matrices de polímeros en bloques biomiméticos.