Southern blot

O Southern blot (literalmente "mancha (ou secado de tinta) de Southern" ou transferencia de Southern) é un método utilizado en bioloxía molecular para a detección dunha secuencia de ADN específica en mostras de ADN. Debe o seu nome ao apelido do seu inventor, o biólogo británico Edwin Southern. O Southern blot combina a transferencia de fragmentos de ADN separados por electroforese a unha membrana filtro coa posterior detección dos fragmentos por hibridación de sondas.
Outros métodos de blotting ou transferencia, como o western blot, northern blot, eastern blot e southwestern blot, empregan principios similares, pero úsanse para ARN ou proteínas, e foron posteriormente nomeados facendo unha analoxía co nome do Southern blot, aínda que neste caso non se refiren a apelidos. Os nomes dos outros métodos non hai razón para escribilos con maiúsculas, pero moitas veces tamén se fai por analoxía. Método
Dixestión con encima de restrición. Utilízanse endonucleases de restrición para cortar febras de ADN de alto peso molecular en fragmentos máis pequenos.
Electroforese dos fragmentos. Os fragmentos de ADN son despois sometidos a electroforese en xel de agarosa para separalos por tamaño.
Tratamento do xel previo á transferencia (con ácido). Se algúns dos fragmentos de ADN son maiores de 15 kb, entón, antes de iniciar o Southern blot, o xel pode tratarse cun ácido, como HCl diluído. Este despurina os fragmentos de ADN, rompéndoo en fragmentos máis pequenos, o que facilita unha transferencia máis eficiente desde o xel á membrana.
Tratamento do xel previo á transferencia (alcalino). Se se utilizan métodos de transferencia alcalina, o xel de ADN colócase na solución alcalina (que xeralmente contén hidróxido de sodio) para que se desnaturalice (separe) a dobre hélice do ADN. A desnaturalización nun ambiente alcalino pode mellorar a unión dos residuos de timina cargados negativamente do ADN a grupos amino cargados positivamente da membrana, separándoo en febras monocatenarias de ADN para posteriormente hibridalo á sonda (véxase máis abaixo), á vez que destrúe calquera ARN residual que puidese estar aínda presente no ADN. Tamén se poden elixir métodos de transferencia neutra en vez da alcalina. Transferencia á membrana. Sitúase unha lámina de membrana de nitrocelulosa (ou, alternativamente de nailon) na parte superior do xel (ou debaixo dependendo da dirección da transferencia). Aplícase uniformemente presión ao xel (usando succión ou situando unha morea de toallas de papel cun peso encima da membrana e o xel), para asegurar un contacto bo e uniforme entre o xel e a membrana. Se se fai a transferencia por succión, úsase o tampón 20X SSC para asegurar o selado e impedir o secado do xel. Despois úsase o tampón para transferir por capilaridade desde a rexión de alto potencial hídrico á rexión de baixo potencial hídrico (xeralmente tecidos de papel e papel de filtro) para transferir o ADN desde o xel á membrana. O ADN únese á membrana por interaccións de intercambio iónico debido á carga negativa do ADN e a positiva da membrna.
Quentamento da membrana. A membrana é entón quentada ao baleiro nun forno de baleiro ou normal a 80 °C durante 2 horas (en condicións estándar, con nitrocelulosa ou membrana de nailon) ou é exposta a radiación ultravioleta (con membrana de nailon) para que o ADN transferido quede unido permanentemente á membrana.
Hibridación coa sonda. A membrana é despois exposta a unha sonda de hibridación, que é un fragmento de ADN monocatenario cunha secuencia específica cuxa presenza no ADN diana debe determinarse. A sonda de ADN está etiquetada para que poida detectarse, xeralmente incorporándolle marcaxe radioactiva ou fluorescente ou unha tinguidura cromoxénica. Nalgúns casos, a sonda de hibridación pode ser de ARN en vez de ADN. Para segurar a especificidade da unión da sonda ao ADN da mostra, os métodos de hibridación máis comúns usan ADN de esperma de salmón ou de arenque para bloquear a superficie da membrana e o ADN diana, formamida desionizada, e deterxentes como o SDS para reducir a unión non específica da sonda.
Lavado e detección por autorradiografía. Despois da hibridación, lávase o exceso de sonda da membrana (normalmente usando tampón SSC), e o patrón de hibridación visualízase por autorradiografía de raios X no caso de sondas radioactivas ou fluorescentes, ou pola aparición de cor na membrana en caso de utilizar o método cromoxénico. Resultados
A hibridación da sonda a un fragmento de ADN específico na membrana filtro indica que este fragmento contén unha secuencia de ADN que é complementaria da sonda.
O paso de transferencia do ADN desde o xel de electroforese a unha membrana permite unir doadamente a sonda de hibridación etiquetada ao ADN fraccionado por tamaños. Tamén permite a fixación dos híbridos diana-sonda, necesarios para a análise por autorradiografía ou outros métodos de detección.
Os Southern blots realizados con ADN xenómico dixerido con encimas de restrición poden usarse para determinar o número de secuencias (por exemplo, copias de xenes) nun xenoma. Unha sonda que se hibrida só a un só segmento de ADN que non foi cortado polo encima de restrición producirá unha soa banda no Southern blot, mentres que probablemente se observarán múltiples bandas cando a sonda se hibrida con varias secuencias altamente similares (por exemplo, as que se poden orixinar por duplicacións de secuencias). Pode utilizarse a modificación das condicións de hibridación (por exemplo, incrementando a temperatura de hibridación ou a diminución da concentración de sal) para aumentar a especificidade e diminuír a hibridación da sonda a secuencias que son similares en menos do 100%. Aplicacións
A transferencia de Southern pode utilizarse para a clonación baseada na homoloxía da secuencia de aminoácidos do produto proteico do xene diana. Os oligonucleótidos están deseñados de modo que sexan similares á secuencia diana. Os oligonucleótidos son sintetizados quimicamente, radioetiquetados, e usados para examinar unha libraría de ADN, ou outras coleccións de fragmentos de ADN clonados. As secuencias que se hibridan coa sonda de hibridación son analizadas, por exemplo, para obter a secuencia completa do xene diana.
O Southern blot pode tamén usarse para identificar os sitios metilados en xenes determiandos. Son especialmente útiles as nucleases de restrición MspI e HpaII, que ambas as dúas recoñecen e clivan (cortan) dentro da mesma secuencia. Porén, HpaII require que a C dentro dese sitio estea metilada, mentres que a MspI cliva só ADN non metilado nese sitio. Por tanto, calquera sitio metilado dentro desa secuencia analizada cunha sonda particular será clivada polo primeiro encima, pero non polo último.