Micromatriz de anticorpos

Unha micromatriz de anticorpos (antibody microarray), tamén chamada matriz de anticorpos ou microarranxo de anticorpos, é unha forma específica de micromatriz de proteínas. Nesta tecnoloxía un conxunto de anticorpos capturados son situados e fixados nunha superficie solida, como un cristal, plástico, membrana ou chip de silicio, para detectar a interacción entre o anticorpo e o seu antíxeno diana. As micromatrices de anticorpos adoitan usarse para detectar a expresión de proteínas de varios biofluídos, como o soro e plasma sanguíneos ou lisados de células ou tecidos. As micromatrices de anticorpos poden usarse tanto para investigación básica coma para aplicacións médicas e diagnósticas. Fundamento
O concepto e a metodoloxía das micromatrices de anticorpos foron presentadas por Tse Wen Chang en 1983 nunha publicación científica e unha serie de patentes, cando traballaba en Centocor en Malvern, Pensilvania. Chang acuñou o termo “matriz de anticorpos” e discutiu o arranxo de "matrices" (arrays) de diminutos sitios ou manchas (spots) de anticorpos sobre unha superficie de cristal ou plástico. Demostrou que unha grella de 10×10 (100 en total) e 20×20 (400 en total) sitios para colocar os anticorpos podía situarse nunha superficie de 1×1 cm. Tamén estimou que se un anticorpo está cuberto a unha concentración de 10 μg/mL, a cal é óptima para a maioría dos anticorpos, 1 mg de anticorpo pode servir para facer 2. 000. 000 de puntos de 0, 25 mm de diámetro. A invención de Chang baseábase no emprego de micromatrices de anticorpos para a detección e cuantificación de células que portan certos antíxenos de superficie, como antíxenos CD e antíxenos alotípicos HLA, antíxenos particulados, como virus e bacterias, e antíxenos solubles. O principio de "aplicación dunha mostra, múltiples determinacións", a coniguración do ensaio, e a mecánica para situar puntos absorbentes descritos no artigo e patentes deberían ser aplicables de forma xeral a diferentes tipos de micromatrices. Cando Tse Wen Chang e Nancy T. Chang crearon Tanox, Inc. en Houston, Texas en 1986, compraron os dereitos das patentes das matrices de anticorpos a Centocor como parte da tecnoloxía básica para construír a súa nova empresa emerxente. O seu primeiro produto en desenvolvemento foi un ensaio denominado “citometría inmunosorbente”, que podía empregarse para monitorizar o estado inmune, é dicir, as concentracións e proporcións de células T CD3+, CD4+ e CD8+ no sangue de individuos infectados polo VIH.
O fundamento teórico dos ensaios de unión de ligandos baseados nas micromatrices de proteínas foi desenvolvido ulteriormente por Roger Ekins e colegas a finais da década de 1980. De acordo co modelo, as micromatices de anticorpos non só permitirían o cribado simultáneo dun panel de analitos, senón que tamén serían máis sensibles e rápidos que os métodos de cribado convencionais. O interese polo cribado de conxuntos de proteínas grandes só se orixinou como resultado dos adiantos en xenómica grazas ás micromatrices de ADN e ao Proxecto Xenoma Humano.
A primeira estratexia coas matrices foi intentar miniaturizar os ensaios bioquímicos e inmunobiolóxicos normalmente realizados en placas de microtitulación de 96 pozos. Mentres que as matrices de anticorpos baseadas en placas de 96 pozos teñen unha capacidade de alto rendemento, a pequena área superficial en cada pozo limita o número de sitios para colocar os anticorpos e así o número de analitos detectados. Seguidamente, utilizáronse outros soportes sólidos, como placas de cristal e membranas de nitrocelulosa para desenvolver matrices que poderían acomodar paneis de anticorpos máis grandes. As matrices baseadas na membrana de nitrocelulosa son flexibles, doados de manexar e incrementaron a súa capacidade de unión de proteínas, pero son menos axeitados para o procesamento de alto rendemento ou automatizado. As placas de cristal derivadas quimicamente permiten a impresión de sitios de anticorpos de tamaño de sub-microlitro, reducindo a área superficial da matriz sen sacrificar a densidade de sitios. Isto á súa vez reduce o volume de mostra consumida. As matrices baseadas en placas de cristal, debido á súa estrutura lisa e ríxida, poden tamén ser axustadas doadamente aos sistemas que manexan líquidos de alto rendemento.
A maioría de sistemas de matrices de anticorpos empregan algún dos dous métodos non competitivos de inmunodetección: a detección dun só anticorpo (baseada en etiquetaxe) ou de dous anticorpos (baseada en sándwich). Este último método, no cal a detección do analito require a unión de dous anticorpos distintos (un anticorpo de captura e un anticorpo reporteiro, cada un dos cales se une a un epítopo único), confire unha maior especificidade e un sinal de fondo menor comparado coa inmunodetección baseada en etiquetas (onde só se usa un anticorpo de captura e a detección conséguese etiquetando quimicamente todas as proteínas na mostra de inicio). As matrices baseadas en sándwich normalmente atinxen a maior especificidade e sensibilidade (a niveis de nanogramo-picogramo) de calquera formato de matriz; a súa reproducibilidade tamén permite que se realice a análise cuantitativa. Debido á dificultade de desenvolver pares de anticorpos que se correspondan que sexan compatibles con todos os outros anticorpos do panel, as pequenas matrices a miúdo fan uso dunha estratexia de sándwich. Inversamente, as matices de alta densidade son máis fáciles de desenvolver a un custo menor usando a estratexia baseada en etiquetas dun só anticorpo. Nesta metodoloxía, úsase un conxunto de anticorpos específicos e todas as proteínas dunha mostra son etiquetadas directamente por marcaxe fluorescente ou haptenos.
Os usos iniciais dos sistemas de matrices baseados en anticorpos incluían a detección de IgGs e subclases específicas, análise de antíxenos, cribado de anticorpos recombinantes, estudo de proteína quinases de lévedo, análise de anticorpos autoinmunes, e exame de interaccións proteína-proteína. A primeira estratexia para detectar simultaneamente citocinas múltiples de mostras fisiolóxicas usando a tecnoloxía das matrices de anticorpos ideárona Ruo-Pan Huang e colegas en 2001. A súa estratexia usaba membranas ECL Hybond para detectar un pequeno panel de 24 citocinas dun medio acondicionado de cultivo celular e soros do paciente e conseguía facer o perfil de expresión de citocinas a niveis fisiolóxicos. Huang tomou esta tecnoloxía e creou unha nova empresa, RayBiotech, Inc. , a primeira en comercializar con éxito unha matriz de anticorpos plana.
Nos últimos dez anos mellorouse a sensibilidade do método ao optimizar a química superficial así como os protocolos específicos para o seu etiquetado químico. Actualmente, a sensibilidade das matrices de anticorpos é comparable á da técnica ELISA e as matrices de anticorpos utilízanse habitualmente para os experimentos nos que se fan perfís de mostras de tecidos, plasma ou soro e moitos outros tipos de mostras. Un obxectivo principal nos estudos de perfís baseados en matrices de anticorpos é o descubrimento de biomarcadores, especificamente para o cancro. En 2010 informouse que para a investigación relacionada co cancro, se fixo o desenvolvemento e aplicación dunha matriz de anticorpos que comprendía 810 anticorpos diferentes relacionados co cancro. Tamén en 2010, se usou unha matriz de anticorpos que comprendía 507 citocinas, quimiocinas, adipocinas, factores de crecemento, factores anxioxénicos, proteases, receptores solubles, moléculas de adhesión solubles e outras proteínas para cribar o soro de pacientes de cancro de ovario e individuos sans e atopouse unha diferenza significativa na expresión de proteínas entre as mostras normal e cancerosa. Máis recentemente, as matices de anticorpos axudaron a determinar as proteínas séricas relacionadas con alerxias específicas cuxos niveis están asociados co glioma e poden reducir o risco anos antes do diagnóstico. Os perfís de proteínas feitos con matrices de anticorpos tamén probaron ser efectivos en áreas non relacionadas coa investigación do cancro, como en enfermidades neurolóxicas como o alzhéimer. Varios estudos intentaron identificar paneis de biomarcadores que poden distinguir aos pacientes de alzhéimer, e moitos deles utilizaron neste proceso matrices de anticorpos. Jaeger e colegas mediron case 600 proteínas circulatorias para descubrir as vías e redes biolóxicas que están afectadas no alzhéimer e exploraron as relacións negativas e positivas dos niveis destas proteínas individuais e redes co rendemento cognitivo dos pacientes de alzhéimer. Actualmente, a matriz de anticorpos máis grande dispoñible comercialmente baseada en sándwich detecta 1000 proteínas diferentes. Ademais, dispóñense de servizos de perfil de proteínas baseadas en micromatrices de anticorpos que analizan a abundancia de proteínas e o estado de fosforilación de proteínas ou de ubiquitinilación de 1030 proteínas en paralelo.
As matrices de anticorpos adoitan utilizarse para detectar a expresión de proteinas de moitos tipos de mostras, pero tamén naquelas con varias preparacións. Jiang e colegas ilustraron moi ben a correlación entre a expresión de proteínas en dúas preparaciósn de sangue distintas: manchas (spots) de soro e sangue seco. Estas preparacións de mostras de sangue diferentes analizáronse usando tres plataformas de matrices de anticorpos: baseada en sándwich, cuantitativa e baseada en etiquetas, e atopouse unha forte correlación na expresión de proteínas, o que suxire que as manchas de sangue seco, que son un medio máis conveniente, seguro e barato de obter sangue especialmente en centros de saúde públicos non hospitalarios, poden usarse con efectividade con análises de matrices de anticorpos para o descubrimento de biomarcadores, facer un perfil de proteínas, o cribado de enfermidades, diagnose e o tratamento. Aplicacións
O uso de micromatrices de anticorpos en diferentes áreas do diagnóstico médico atraeu a atención dos investigadores. O bioensaio dixital é un exemplo dese tipo de campos de investigación. Nesta tecnoloxía seméntase unha matriz de micropozos nun chip de polímero/cristal con boliñas magnéticas (cubertas de anticorpos etiquetados fluorescentemnte), son sometidos aos antíxenos diana e despois caracterizados con microscopio contando os pozos fluorescentes. Recentemente, demostrouse unha plataforma de fabricación rendible economicamente (usando polímeros OSTE) para ditas matrices de micropozos e o sistema modelo de bioensaio foi caracterizado con éxito. Ademais, os inmunoensaios en armazóns de micropiares de "papel sintético" de tiol-eno mostraron xerar un sinal de fluorescencia superior.