Encima de restrición

Un encima de restrición (tamén enzima de restrición) ou endonuclease de restrición é un encima que corta o ADN en puntos onde se encontran determinadas secuencias nucleotídicas específicas ou moi preto delas chamadas sitios de restrición. Os encimas de restrición son endonucleases que se clasifican xeralmente en tres tipos principais, os cales se diferencian na súa estrutura e na súa forma de cortar o ADN no seu sitio de recoñecemento ou restrición, ou na separación ou non entre os sitios de recoñecemento e clivaxe. Para cortar o ADN, todos os encimas de restrición fan dúas incisións, unha en cada cadea azucre-fosfato da dobre hélice do ADN.
Estes encimas encóntranse en bacterias e arqueas e para elas son un mecanismo de defensa contra os virus invasores. Dentro dunha célula procariota, os encimas de restrición cortan selectivamente o ADN alleo nun proceso chamado restrición; mentres que o ADN do hóspede está protexido por un encima modificador (unha metilase) que modifica o ADN procariótico e bloquea así a súa clivaxe (corte). En conxunto, estes dous procesos constitúen o sistema de restrición-modificación das bacterias.
Estudáronse en detalle uns 3. 000 encimas de restrición, e pode dispoñerse comercialmente de máis de 600. Estes encimas utilízanse de forma rutineira para a modificación do ADN nos laboratorios, e son unha ferramenta fundamental na clonación molecular. Historia
O termo encima de restrición orixinouse nos estudos sobre o fago λ e o fenómeno da restrición e modificación controlado polo hóspede de virus bacterianos. O fenómeno foi descuberto nos laboratorios de Salvador Luria e Giuseppe Bertani a principios da década de 1950. Atoparon que un bacteriófago λ que pode crecer ben nunha cepa de Escherichia coli, por exemplo E. coli C, non crecía tan ben noutra cepa, por exemplo E. coli K, na cal o seu rendemento caía significativamente de 3 a 5 ordes de magnitude. A célula hóspede E. coli K, chamada hóspede restritor, parecía ter a capacidade de reducir a actividade biolóxica do fago λ. Se un fago se estabilizaba nunha cepa, a capacidade dese fago de crecer tamén se restrinxía noutras cepas. Na década de 1960, nos laboratorios de Werner Arber e Matthew Meselson atoparon que a restrición era causada por unha clivaxe encimática do ADN do fago, e o encima implicado denominouse en consecuencia encima de restrición.
Os encimas de restrición estudados por Arber e Meselson eran de tipo I, os cales clivan o ADN aleatoriamente fóra do sitio de restrición. En 1970, Hamilton O. Smith, Thomas J. Kelly e Kent Welcox illaron e caracterizaron o primeiro encima de restrición de tipo II, o HindII, da bacteria Haemophilus influenzae. Este tipo de encimas de restrición é máis útil para o seu uso nos laboratorios, xa que corta o ADN no sitio onde está a súa secuencia de recoñecemento. Máis tarde, Daniel Nathans e Kathleen Danna demostraron que a clivaxe do ADN do virus simio 40 (SV40) por encimas de restrición orixinaba fragmentos específicos que podían separarse usando electroforese en xel de poliacrilamida, o que indicaba que os encimas de restrición podían utilizarse para o mapado do ADN. O Premio Nobel de Medicina e Fisioloxía de 1978 concedéuselle a Werner Arber, Daniel Nathans, e Hamilton O. Smith polo seu traballo no descubrimento e caracterización de encimas de restrición. O seu descubrimento levou ao desenvolvemento da tecnoloxía do ADN recombinante que permitiu, por exemplo, a produción a grande escala de insulina humana para tratar a diabetes utilizando a bacteria Escherichia coli. Orixe na evolución
Os encimas de restrición e todo o sistema de restrición-modificación, probablemente evolucionaron a partir dun antepasado común que tiña un encima con actividade de endonuclease e outro de metilase, e despois espalláronse por transferencia horizontal de xenes. Ademais, hai cada vez máis evidencias de que as endonucleases de restrición evolucionaron como un elemento xenético egoísta. Sitio de recoñecemento
Os encimas de restrición recoñecen unha secuencia de nucleótidos específica e produce un corte de dobre cadea no ADN, seccionándoo por completo. As secuencias de recoñecemento varían xeralmente en lonxitude entre 4 e 8 nucleótidos, e moitas delas son palindrómicas, o que significa que a secuencia de bases lese igual cara a adiante que cara a atrás. En teoría, hai dous tipos de secuencias palindrómicas posibles no ADN. O palíndromo de tipo espello é similar aos que se poden encontrar en textos escritos ordinarios, no cal unha secuencia se le igual cara a adiante que cara a atrás nunha soa febra do ADN, como en GTAATG. O palíndromo de tipo repetición invertida é tamén unha secuencia que se le igual cara a adiante que cara a atrás, pero as secuencias cara a adiante e cara a atrás están en febras de ADN complementarias nun ADN bicatenario, como en GTATAC (onde GTATAC é complementaria de CATATG). Os palíndromos de repetición invertida son máis comúns e teñen unha maior importancia biolóxica que os de tipo espello.
A dixestión polo encima de restrición EcoRI produce extremos que sobresaen e son complementarios entre si, e que se denominan extremos "pegañosos", "adherentes" ou "cohesivos", mentres que a clivaxe polo encima de restrición SmaI produce extremos "romos": As secuencias de recoñecemento no ADN difiren en cada encima de restrición, producindo diferenzas na lonxitude, secuencia e orientación da febra (o extremo 5' ou o extremo 3') dun extremo de ADN cohesivo que "sobresae" ou "colga" (é máis longa que a outra cadea).
Os distintos encimas (diferentes en procedencia, secuencia e estrutura) que recoñecen e clivan no mesmo punto denomínanse isoesquizómeros. Os diferentes encimas de restrición que recoñecen a mesma secuencia pero clivan en distintos puntos denomínanse neoesquizómeros. Tipos
As endonucleases de restrición que se encontran na natureza clasifícanse en catro grupos, denominados tipos I, II, III e IV, baseándose na súa composición e nos cofactores encimáticos que precisan, a natureza da súa secuencia diana, e a posición do seu sitio de clivaxe no ADN en relación coa secuencia diana. Todos estes tipos de encimas recoñecen secuencias de ADN curtas específicas e realizan a clivaxe endonucleolítica do ADN producindo fragmentos específicos con 5'-fosfatos terminais. Difiren na súa secuencia de recoñecemento, composición de subunidades, posición de clivaxe, e requirimentos de cofactores, tal como se resume seguidamente: Encimas de tipo I (EC 3. 1. 21. 3), que clivan en sitios afastados do seu sitio de recoñecemento e requiren ATP e S-adenosil-L-metionina para funcionar. Son proteínas multifuncionais que teñen tanto actividade de metilase (EC 2. 1. 1. 72) coma de restrición.
Encimas de tipo II (EC 3. 1. 21. 4) clivan no sitio de recoñecemento ou a unha curta distancia específica del; a maioría requiren magnesio. Só teñen unha actividade, a restrición, e son independentes de metilase.
Encimas de tipo III (EC 3. 1. 21. 5), que clivan en sitios que están a curta distancia do sitio de recoñecemento, e requiren ATP (pero non o hidrolizan); a S-adenosil-L-metionina estimula a reacción pero non é un requirimento. Forman parte dun complexo coa metilase de modificación (EC 2. 1. 1. 72).
Encimas de tipo IV recoñecen o ADN diana modificado, por exemplo ADN metilado, hidroximetilado e glicosil-hidroximetilado.
Ademais hai un tipo V que recoñece secuencias palindrómicas e utiliza ARNs guías.
Tipo I
Os encimas de restrición de tipo I foron os primeiros que se identificaron e atopáronse primeiramente en dúas cepas de E. coli, a K-12 e a B. Estes encimas cortan nun sitio diferente do sitio de recoñecemento e que está a unha distancia variable del, a polo menos 1000 pares de bases de distancia. A clivaxe nestes sitios aleatorios segue un proceso de translocación do ADN, que indica que estes encimas son tamén motores moleculares. O sitio de recoñecemento é asimétrico e está composto de dúas porcións específicas, unha que contén 3–4 nucleótidos, e outra que contén 4–5 nucleótidos, separadas por un espazador non específico duns 6–8 nucleótidos. Estes encimas son multifuncionais e son capaces de realizar actividades de restrición e modificación, dependendo do status de metilación do ADN diana. Para a súa actividade plena necesitan os cofactores S-adenosil metionina (AdoMet), ATP (hidrolizado), e ións magnesio (Mg2+). Os encimas de restrición de tipo I posúen tres subunidades chamadas HsdR, HsdM, e HsdS; a subunidade HsdR requírese para a restrición; a HsdM é necesaria para engadir grupos metilo ao ADN do hóspede (actividade metiltransferase) e a HsdS é importante para a especificidade do sitio de recoñecemento (de unión ao ADN) ademais de para as actividades de restrición (clivaxe do ADN) e modificación (ADN metiltransferase).
Tipo II
Os encimas de restrición de tipo II típicos difiren dos de tipo I en varios aspectos. Son un homodímero, teñen os sitios de recoñecemento xeralmente non divididos e son palindrómicos e de 4–8 nucleótidos de lonxitude. Recoñecen e clivan o ADN no mesmo sitio, e non utilizan ATP ou AdoMet para a súa actividade, xeralmente requiren só Mg2+ como cofactor. Estes son os encimas de restrición dos que se dispón máis habitualmente. Na década de 1990 e a inicios da do 2000 descubríronse novos encimas desta familia que non seguían todos os criterios clásicos típicos desta clase de encimas, polo que se creou unha nova nomenclatura de subfamilias para dividir esta ampla familia en subcategorías baseándose nas desviacións das características típicas dos encimas de tipo II. Estes subgrupos defínense usando un sufixo de letras.
Os encimas de restrición de tipo IIB (por exemplo, BcgI e BplI) son multímeros, que conteñen máis dunha subunidade. Clivan o ADN a ambos os lados do seu sitio de recoñecemento cortando e separando todo o sitio de recoñecemento. Requiren AdoMet e Mg2+ como cofactores. As enconucleases de restrición de tipo IIE (por exemplo, NaeI) clivan o ADN despois de interaccionaren con dúas copias da súa secuencia de recoñecemento. Un dos sitios de recoñecemento actúa como diana para a clivaxe, e o outro actúa como un efector alostérico que acelera ou mellora a eficiencia da clivaxe realizada polo encima. Igual que os encimas de tipo IIE, as endonucleases de restrición de tipo IIF (por exemplo, NgoMIV) interaccionan con dúas copias da súa secuencia de recoñecemento pero clivan ambas as secuencias ao mesmo tempo. As endonucleases de restrición de tipo IIG (Eco57I) teñen unha soa subunidade, como os encimas de restrición de tipo II clásicos, pero necesitan o cofactor AdoMet para estar activos. As endonucleases de restrición de tipo IIM, como DpnI, poden recoñecer e cortar ADN metilado. As endonucleases de restrición de tipo IIS (por exemplo, FokI) cliva o ADN a unha distancia definida dos seus sitios de recoñecemento asimétricos non palindrómicos. Estes encimas poden funcionar como dímeros. De xeito similar, os encimas de restrición de tipo IIT (por exemplo, Bpu10I e BslI) están compostos por dúas subunidades diferentes. Algúns recoñecen secuencias palindrómicas, mais outros teñen sitios de recoñecemento asimétricos.
Tipo III
Os encimas de restrición de tipo III (por exemplo, EcoP15) recoñecen dúas secuencias non palindrómicas separadas que están orientadas inversamente. Cortan o ADN a unhas 20-30 pares de bases despois do sitio de recoñecemento. Estes encimas conteñen máis dunha subunidade e requiren os cofactores AdoMet e ATP para as súas actividades de metilación do ADN e restrición, respectivamente. Son compoñentes dos mecanismos de restrición-modificación do ADN procarióticos, que protexen a eses organismos contra o ADN alleo invasor. Os encimas de tipo III son proteínas heterooligoméricas, multifuncionais compostas por dúas subunidades, chamadas Res e Mod. A subunidade Mod recoñece a secuencia de ADN específica para o sistema e é unha metiltransferase de modificación, que é funcionalmente equivalente ás subunidades M e S das endonucleases de restrición de tipo I. A subunidade Res requírese para a restrición, aínda que non ten actividade encimática de seu. Os encimas de tipo III recoñecen secuencias de ADN de 5-6 pares de bases asimétricas e clivan a 25-27 pares de bases augas abaixo e deixan no ADN protrusións 5' curtas monocatenarias (esa parte sobresae máis que a outra cadea). Necesitan dous sitios de recoñecemento non metilados orientados inversamente para que poida ter lugar a restrición. Estes encimas metilan só unha febra do ADN, na posición N-6 dos residuos adenosil, de modo que o ADN replicado novo ten só unha das febras metiladas, o cal é dabondo para protexelo contra a restrición. Os encimas de tipo III pertencen á subfamilia beta de N6 adenina metiltransferases, que conteñen os nove motivos que caracterizan esta familia, incluíndo o motivo I, o peto de unión para a AdoMet (FXGXG), e o motivo IV, a rexión catalítica (S/D/N (PP) Y/F).
Tipo IV
Os encimas de tipo IV recoñecen ADN modificado, xeralmente por metilación, e están exemplificados polos sistemas de E. coli McrBC e Mrr.
Tipo V
Os encimas de restrición de tipo V (por exemplo, o complexo cas9-gRNA de CRISPRs) utilizan ARNs guías para unirse especificamente a secuencias palindrómicas específicas que se encontran en organismos invasores. Poden cortar ADN de lonxitudes variables con tal de que dispoñan dun ARN guía adecuado. A flexibilidade e facilidade de uso destes encimas fan deles unha ferramenta moi prometedora para aplicacións en enxeñaría xenética futura.
Encimas de restrición artificiais
Os encimas de restrición artificiais poden xerarse fusionando un dominio de unión ao ADN natural ou producido por enxeñaría a un dominio nuclease (xeralmente úsase o dominio de clivaxe dos encimas de restrición de tipo IIS FokI). Estes encimas de restrición naturais poden unirse a sitios de ADN grandes (de ata 36 pares de bases) e poden prepararse por enxeñaría para unirse ás secuencias desexadas de ADN. As nucleases de dedo de cinc son os encimas de restrición artificiais utilizados máis comunmente especialmente en aplicacións de enxeñaría xenética, pero poden tamén utilizarse para aplicacións máis estándar de clonación de xenes. Outros encimas de restrición artificiais están baseados no dominio de unión ao ADN dos efectores TAL. Nomenclatura
Desde o seu descubrimento na década de 1970 foron identificados centos de encimas de restrición diferentes en distintas bacterias. Cada encima noméase polo nome da bacteria da cal foi illado utilizando un sistema de nomenclatura baseado no xénero, especie e cepa bacteriana. Por exemplo, o nome do encima de restrición EcoRI deriva do que se indica na táboa. Actualmente non se escriben partes do nome en cursiva nin debe haber un espazo antes do número romano final. Aplicacións
Os encimas de restrición illados utilízanse para manipular o ADN para distintas aplicacións científicas.
Utilízanse para axudar á inserción de xenes en vectores plásmidos durante a clonación de xenes e os experimentos de expresión de proteínas. Para un uso óptimo, os plásmidos que se utilizan comunmente no clonado de xenes son modificados para incluír unha curta secuencia polylinker ou de poliunión (chamada sitio de clonación múltiple, ou MCS) rica en secuencias de recoñecemento de encimas de restrición. Isto permite unha flexibilidade cando se insiren fragmentos xénicos no vector plásmido; os sitios de restrición contidos de forma natural nos xenes inflúen na elección da endonuclease para dixerir o ADN, xa que cómpre evitar a restrición do ADN desexado á vez que se corta intencionadamente os extremos do ADN. Para clonar un fragmento xénico nun vector, tanto os plásmidos de ADN coma as insercións xénicas córtanse tipicamente cos mesmos encimas de restrición, e despois péganse coa axuda do encima ADN ligase.
Os encimas de restrición poden usarse tamén para distinguir alelos de xenes recoñecendo especificamente cambios dunha soa base no ADN coñecidos como polimorfismos dun só nucleótido (SNPs). Isto só é posible se un SNP altera o sitio de restrición presente no alelo. Neste método, o encima de restrición pode utilizarse para a xenotipificación dunha mostra de ADN sen a necesidade de realizar unha custosa secuenciación xénica. A mostra dixírese primeiro co encima de restrición para xerar fragmentos de ADN, e despois os fragmentos de diferentes tamaños sepáranse por electroforese en xel. En xeral, os alelos cos sitios de restrición correctos xerarán dúas bandas visibles de ADN no xel, e os que teñen sitios de restrición alterados non se cortarán e xerarán só unha soa banda.
De xeito similar, os encimas de restrición utilízanse para dixerir o ADN xenómico para a análise de xenes pola técnica do Southern blot. Esta técnica permite identificar cantas copias (ou parálogos) dun xene están presentes no xenoma dun individuo, ou cantas mutacións xénicas (polimorfismos) tiveron lugar nunha poboación. O último exemplo chámase polimorfismo de lonxitude de fragmento de restrición (RFLP). Exemplos
Exemplos de encimas de restrición son: Chave:
* extremos romos
N C ou G ou T ou A
W A ou T