Electroforese en xel en gradiente de temperatura

A electroforese en xel en gradiente de temperatura (TGGE, do inglés temperature gradient gel electrophoresis) e a electroforese en xel en gradiente desnaturalizante (DGGE, do inglés denaturing gradient gel electrophoresis) son tipos de electroforese que usan un grandiente de temperatura ou un gradiente químico para desnaturalizar a mostra estudada a medida que esta se move a través dun xel de acrilamida. A TGGE e a DGGE poden aplicarse a ácidos nucleicos como o ADN e o ARN e (menos habitualmente) a proteínas. A TGGE baséase nos cambios dependentes da temperatura que se producen na estrutura das moléculas da mostra para separar ácidos nucleicos. A DGGE separa xenes do mesmo tamaño baseándose n a súa diferente capacidade de desnaturalización, a cal está determinada pola súa secuencia de pares de bases. A DGGE foi a técnica orixinal e a TGGE foi un refinamento posterior dela. Historia
A DGGE foi inventada por Leonard Lerman cando era profesor en SUNY Albany.
O mesmo equipo de electroforese foi utilizado para análises de proteínas por Thomas E. Creighton do MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, Inglaterra. Os ácidos nucleicos e as proteínas producen un padrón similar con esta técnica, pero os principios fundamentais son bastante diferentes.
A TGGE foi descrita por primeira vez por Thatcher e Hodson e por Roger Wartell de Georgia Tech. O grupo de Riesner en Alemaña fixo tamén moitos traballos sobre o desenvolvemento desta técnica. Os equipos comerciais para realizar DGGE fabrícanos Bio-Rad, INGENY e CBS Scientific; un sistema para TGGE fabrícao Biometra. Electroforese en xel en gradiente de temperatura
O ADN ten unha carga negativa nos seus fosfatos, polo que pode moverse cara ao eléctrodo positivo nun campo eléctrico. Un xel é un enguedello molecular, con buratos do mesmo tamaño que o diámetro dunha febra de ADN. Cando se aplica un campo eléctrico, o ADN empeza a moverse polo xel a unha velocidade que é aproximadamente inversamente proporcional á lonxitude da molécula de ADN (as máis curtas viaxan máis rápido); este é o fundamento da separación dependente do tamaño na electroforese estándar.
Na TGGE hai ademais un gradiente de temperatura ao longo do xel. A temperatura moderada dunha habitación, o ADN está estable en forma de dobre hélice (bicatenario). A medida que se incrementa a temperatura, as febras empezan a separarse ("fundirse"), e a velocidade á que se moven a través do xel diminúe drasticamente. A temperatura á cal ocorre esta fusión depende da secuencia, porque os pares GC son máis estables que os pares AT, polo que a TGGE proporciona un "método independente do tamaño e dependente da secuencia" para separar moléculas de ADN. A TGGE separa moléculas e dá información adicional sobre o comportamento de fusión e estabilidade. Electroforese en xel en gradiente desnaturalizante
A electroforese en xel en gradiente desnaturalizante (DGGE) funciona aplicando unha pequena mostra de ADN (ou ARN) nun xel de electroforese que contén un axente desnaturalizante. Certos xenes desnaturalizantes poden inducir a "fusión" do ADN en varias etapas. Como resultado desta fusión, o ADN esténdese polo xel e poden analizarse as distintas febras, mesmo aquelas que teñen só 200-700 pares de bases.
O que ten de especial esta técnica da DGGE é que a medida que o ADN está suxeito a condicións de desnaturalización extremas, os fragmentos de febras están fundidas completamente en febras monocatenarias. O proceso de desnaturalización nun xel desnaturalizante é moi brusco: En vez de estar parcialmente fundidas en maneira de cremalleira continua, a maioría dos fragmentos fusiónanse nun proceso gradual. Porcións discretas ou dominios do fragmento de súpeto pasan a ser monocatenarios nun rango moi estreito de condicións desnaturalizantes. Isto fai posible discernir as diferenzas nas secuencias de ADN ou mutacións de varios xenes: as diferenzas en secuencia en fragmentos do mesmo tamaño adoitan causar a fusión parcial en diferentes posicións do gradiente e, por tanto, "paran" en diferentes posicións do xel. Comparando o comportamento de fusión de fragmentos de ADN polimórficos un ao lado do outro en xeles de gradiente desnaturalizante é posible detectar que teñen mutacións no primeiro dominio de fusión. Situando dúas mostras unha ao lado da outra no xel e deixándolles que se desnaturalicen, pódense ver doadamente incluso as máis pequenas diferenzas en dúas mostras ou fragmentos de ADN.
Esta técnica ten varias desvantaxes: Os "gradientes químicos como os utilizados na DGGE non son reproducibles, son difíciles de establecer e a miúdo non resolven completamente os heterodúplex". Estes problemas poden solucionarse coa TGGE, que usa un gradiente de temperatura en vez de químico para desnaturalizar a mostra. Método
Para separar ácidos nucleicos por TGGE deben seguirse os seguintes pasos: preparar e verter os xeles, electroforese, tinguidura e elución do ADN. Como se debe elixir un sistema tampón, é importante que o sistema permaneza estable durante o incremento de temperatura. Así, utilízase normalmente a urea para a preparación do xel; porén, cómpre ser conscientes de que a cantidade de urea utilizada afectará a temperatura global necesaria para separar o ADN. Cárgase o xel, a mostra é situada no xel segundo o tipo de xel que se está utilizando (é dicir, paralelo ou perpendicular) axústase a voltaxe e xa se pode deixar que a mostra se mova polo xel. Dependendo do tipo de TGGE que se aplique, perpendicular ou paralela, haberá que preparar e cargar diferentes cantidades de mostra. Utilízase maior cantidade de mostra co modo perpendicular, mentres que se usa menos nas TGGE paralelas. Unha vez que o xel foi posto en funcionamento, ao final debe ser tinguido para visualizar os resultados. Aínda que hai diversas tinguiduras que se poden utilizar para isto, a tinguidura de prata demostrou ser a ferramenta máis efectiva. O ADN pode eluírse da tinguidura de prata para facer ulteriores análises por amplificación por medio de PCR. Aplicacións
A TGGE e a DGGE son moi útiles en investigación biomédica e ecolóxica; máis abaixo descríbense algunhas aplicacións seleccionadas.
Mutacións no ADNmt
De acordo cunha investigación recente de Wong, Liang, Kwon, Bai, Alper e Gropman, a TGGE pode utilizarse para examinar o ADN mitocondrial (ADNmt) dun individuo. Segundo estes autores, a TGGE foi utilizada para determinar dúas novas mutacións no xenoma mitocondrial: "Unha muller de 21 anos que se sospeitaba tiña citopatía mitocondrial, pero era negativa para as mutacións puntuais e delecións comúns no ADN mitocondrial (ADNmt), foi cribada para buscar mutacións descoñecidas en todo o seu xenoma mitocondrial por electroforese en xel en gradiente de temperatura".
Mutación en p53 en secrcións pancreáticas
Lohr e colaboradores (2001) informaron que nun estudo comprensivo de secrecións pancreáticas de individuos con cancro de páncreas, podían encontrarse mutacións en p53 nos zumes pancreáticos dunha pequena porcentaxe dos participantes. Como as mutacións de p53 se encontran frecuentemente en carcinomas pancreáticos, os investigadores intentaron determinar se a propia mutación podía estar ligada ao desenvolvemento do cancro de páncreas. Aínda que Lohr e colaboradores conseguiron atopar mutacións en p53 por medio de TGGE nuns poucos suxeitos, ningún deles desenvolveu posteriormente carcinoma pancreático. Deste modo, os investigadores concluíron sinalando que a mutación en p53 non pode ser o único indicador da oncoxénese do carcinoma pancreático.
Ecoloxía microbiana
A DGGE dos xenes dos ARNr da subunidade ribosómica menor foi realizada primeiramente por Gerard Muyzer, cando traballaba na Universidade de Leiden e converteuse nunha técnica moi utilizada en ecoloxía microbiana.
A amplificación por PCR do ADN extraído de comunidades microbianas mixtas con cebadores para PCR específicos para o fragmentos do xene do ARNr de 16S de bacterias e arqueas, e de fragmentos dos xenes de ARNr de 18S de eucariotas deu como resultado unha mestura de produtos de PCR. Como estes amplicóns tiñan todos a mesma lonxitude, non podían ser separados uns doutros por electroforese en xel de agarosa. Porén, as variacións na secuencia (é dicir, diferenzas no contido GC e distribución) entre diferentes ARNr microbianos dan lugar a diferentes propiedades de desnaturalización destas moléculas de ADN.
Por tanto, os padróns de bandas da DGGE poden utilizarse para visualizar variacións na diversidade xenética microbiana e proporcionar unha estimación aproximada da riqueza e abundancia dos membros predominantes na comunidade microbiana. Este método adoita denominarse perfil de ADN de comunidade (community fingerprinting). Recentemente, varios estudos mostraron que a DGGE de xenes funcionais (por exemplo, xenes ique interveñen na redución do xofre, fixación do nitróxeno e oxidación do amonio) poden proporcionar información sobre a función e filoxenia microbiana simultaneamente. Por exemplo, Tabatabaei et al. (2009) aplicaron DGGE e conseguiron revelar o padrón microbiano durante a fermentación anaeróbica de efluentes en muíños de aceite de palma por primeira vez.