Gene targeting

A técnica do gene targeting (tamén chamada estratexia de substitución baseada na recombinación homóloga) é unha técnica xenética que utiliza a recombinación homóloga para cambiar un xene endóxeno. O método pode utilizarse para eliminar un xene (deleción dun xene), eliminar exóns, engadir un xene, e introducir mutacións puntuais. Este termo utilízase maioritariamente na literatura así tal como se di en inglés e significa modificacións xenéticas dirixidas a un xene determinado (targeting é seleccionar ou apuntar a un obxectivo).
O gene targeting pode ser permanente ou condicional. As condicións poden ser específicas dun determinada momento do desenvolvemento ou vida do organismo ou limitadas a un tecido específico do corpo, por exemplo. A técnica require a creación dun vector específico para cada xene que interese, pero pode ser utilizada para calquera xene, sen importar a súa actividade transcricional ou tamaño.
Mario R. Capecchi, Martin J. Evans e Oliver Smithies foron galardoados co Premio Nobel de Medicina de 2007 polos seus traballos sobre os "principios para introducir modificacións en xenes específicos en ratos utilizando células nai embrionais", ou gene targeting. Métodos
Os métodos desta técnica foron establecidos para varios organismos modelo e poden variar dependendo da especie utilizada. En xeral, xérase en bacterias un construto de targeting feito de ADN, que contén xeralmente parte do xene ao que vai ir dirixido, xunto cun xene reporteiro, e un marcador seleccionable (dominante).
Para aplicar o gene targeting a xenes do rato, este construto insírese despois en células nai embrionarias de rato en cultivo. Despois, selecciónanse as células que teñen a inserción correcta, que poden ser utilizadas para contribuír a formar un tecido do rato por medio dunha inxección no embrión. Finalmente, selecciónanse os ratos quimera nos que as células modificadas orixinaron os órganos reprodutores por medio de cruzamentos entre os animais. Unha vez conseguido iso, todo o corpo do rato está baseado no xenoma das células nai embrionarias previamente seleccionadas.
Para aplicar o gene targeting a xenes do musgo Physcomitrella patens, este construto incúbase xunto con protoplastos acabados de illar e
con polietilenglicol. Todos os gametófitos de musgos son organismos haploides, e a formación dos filamentos da planta chamados protonemas pode ser estudada directamente por medio do gene targeting, aplicando un tratamento con antibióticos ou por PCR. Esta é a única planta en que se aplicou este procedemento de xenética inversa, que é tan eficiente coma en lévedos.
Utilizando modificacións destes procedementos, o gene targeting foi tamén aplicado con éxito en vacas, ovellas, porcos e moitos fungos.
A frecuencia do gene targeting pode ser aumentada significativamente utilizando endonucleases obtidas por enxeñaría como nucleases dedos de cinc, endonucleases homing, e nucleases baseadas en efectores TAL obtidos por enxeñaría. Ata agora, este método con nucleases foi aplicado a varias especies, como a mosca Drosophila melanogaster, o tabaco, millo, células humanas, ratos, e ratas. Comparación co gene trapping
O gene trapping está baseado na inserción aleatoria dun casete xénico mentres que o gene targeting está dirixido a un xene específico. Os casetes do gene trapping constan dun xene reporteiro sen prromotor e/ou un marcador xenético seleccionable flanqueado por un sitio de empalme 3' augas arriba (aceptor de empalme ou splice acceptor, SA) e unha secuencia de terminación transcricional augas abaixo (secuencia de poliadenilación). Estes casetes poden utilizarse para moitas cousas en bioloxía molecular, mentres que as rexións homólogas flanqueantes dos casetes do gene targeting necesitan ser adaptados para cada xene. Isto fai que o gene trapping sexa máis axeitado para proxectos a grande escala que o gene targeting. Por outra parte, o gene targeting pode utilizarse para xenes con baixo nivel de transcrición que non serían detectados aplicando o gene trapping. Ademais, a probabilidade do trapping increméntase co tamaño dos intróns. Para o gene targeting estes xenes compactos poden ser alterados con similar facilidade. Aplicacións
O gene targeting foi moi utilizado para o estudo de enfermidades xenéticas humanas ao eliminar ("knocking out"), ou engadir ("knocking in"), mutacións específicas de interese a diversos modelos. Previamente fora utilizado para modelos de células de rato en enxeñaría xenética, pero os avances nas tecnoloxías do gene targeting están permitindo actualmente a creación dunha nova onda de modelos de enfermidades humanas isoxénicos. Estes son os modelos máis exactos in vitro dos que dispoñen os investigadores actualmente, e están facilitando o desenvolvemento de novas drogas personalizadas e de métodos diagnósticos, especialmente no campo do cancro.