Radioinmunoensaio

Un radioinmunoensaio ou radioinmunoanálise (ou abreviado RIA, do inglés radioimmunoassay) é un tipo de inmunoensaio ou método radioinmunométrico que se basea na formación específica dos complexos antíxeno-anticorpo (Ax-Ac) o que o dota dunha grande especificidade, ademais da gran sensibilidade dos métodos radiolóxicos (isótopos radioactivos). A técnica foi moi utilizada, pero hoxe en día foi practicamente substituída polo método ELISA, o cal mide a unión Ax-Ac por medio de colorimetrías en lugar de radiometrías e evita ter que usar produtos radioactivos.
Case todas as moléculas poden ser antixénicas e isto úsase para que os anticorpos poidan unirse a esa molécula e marcala radioactivamente. Unha boa maneira de provocar que unha molécula sexa antixénica é utilizar un hapteno combinado cun coadxuvante da resposta inmune. Un coadxuvante moi usado é a seroalbumina bovina ou BSA, polo que ao conxugar un hapteno con BSA e introducilo noutra especie aparecerán anticorpos contra o hapteno.
É unha técnica que naceu nas décadas de 1960-70 e supuxo en grande avance en endocrinoloxía. É unha técnica moi sensible, que só necesita pequenas cantidades de sangue. Historia
Este método foi desenvolvido por Rosalyn Sussman Yalow, Roger Guillemin e Andrew Schally no Veterans Administration Hospital do Bronx, Nova York. A doutora Yalow gañou o Premio Nobel de Medicina de 1977 por este desenvolvemento. Radioinmunoensaios (RIA)
Clasicamente, para realizar un radioinmunoensaio, hai que converter un antíxeno en radioactivo, frecuentemente etiquetándoo con isótopos do iodo que emiten radiación gamma, como o 125-I, unido unha tirosina. Este antíxeno mestúrase cunha cantidade coñecida de anticorpo para ese antíxeno e como resultado únense un a outro especificamente. Despois, engádese a mostra de soro dun paciente que contén unha cantidade descoñecida dese mesmo antíxeno. Isto causa que o antixeno non etiquetado (denominado "frío") do soro compita co antíxeno radioetiquetado (denominado "quente") polos sitios de unión do anticorpo. A medida que se incrementa a concentración do antíxeno "frío", máis cantidade del se une ao anticorpo, desprazando a variante radioetiquetada e reducindo a proporción de antixeno radioetiquetado unido ao anticorpo respecto ao antíxeno libre radioetiquetado. Os antíxenos unidos son despois separados e mídese a radioactividade do antíxeno libre(non unido) que queda no sobrenadante usando un contador gamma. Este é o procedemento clásico, pero os radioinmunoensaios poden clasificarse d seguinte maneira:
RIA directo
O RIA baséase na competencia que se produce entre o anticorpo (Ac), un antíxeno non marcado (Ax) e unha cantidade coñecida do antíxeno marcado (Ax*) para formar os complexos AxAc ou Ax*Ac. Con estes tres compoñentes (Ax, Ax* e Ac) pode realizarse o ensaio no que, mantendo constante a cantidade de Ax* e Ac, obsérvase que a maior cantidade de Ax queda unido menos Ax* á cantidade fixa de Ac (e, por tanto, menos radioactividade), o que permitirá relacionar a radioactividade coa concentración de Ax. Hai que seguir estes pasos: Obtéñense primeiro anticorpos específicos, para o cal se inxectan nun animal pequenas cantidades en varias doses do antíxeno moi purificado. O animal xerará anticorpos que poderán ser recollidos do plasma sanguíneo.
Márcase o antíxeno radioactivamente. O antíxeno marcado debe seguir sendo recoñecible polo anticorpo.
Engádense Ac a unha placa de titulación e quedan unidos ao soporte sólido, tras o que se agrega o Ax* en cantidade coñecida e o Ax da mostra problema.
Elimínase o antíxeno non unido por decantación e lavado, e determínase a cantidade de marcaxe unida.
Incorpórase o valor obtido na recta de calibración que debe realizarse con anterioridade. Para a realización do calibrado disponse de varios tubos nos que se engade unha cantidade fixa de Ac e de Ax* e unha cantidade variable de Ax á que se engade soro normal para que quede ao mesmo volume. Así obteriamos unha táboa como a mostrada.
No tubo 1 o Ac non se une o Ax. No tubo 2 a maioría únese ao Ax*, a competencia vaise desprazando pouco a pouco ao Ax, polo que a radioactividade da mostra vai diminuíndo (diminúen os complexos Ac-Ax*). Créase unha recta R fronte a [Ax].
RIA de inhibición
Usado cando non se pode marcar o antíxeno. Inmobilizase unha cantidade constante de antíxeno nun soporte sólido. Adoita saturarse con BSA, leite en po ou caseína para que non se una nada máis ao soporte.
Engádese unha cantidade constante de anticorpo marcado e o antíxeno frío que se vai medir (ou de calibrado). Neste paso establécese unha competencia na que o Ac se une ao Ax fixo ao soporte ou ao problema.
Elimínanse o anticorpo non inmobilizado e o antíxeno soluble e determínase a cantidade de anticorpo marcado que se inmobilizou.
Constrúese unha curva de calibrado representando a cantidade de anticorpo marcado inmobilizado fronte á concentración de antíxeno soluble engadida ou ben interpólase a radioactividade medida nesta curva de calibrado.
RIA de sándwich (IRMA)
Tamén chamado ensaio inmunorradiométrico (IRMA, do inglés immunoradiometric assay). Inmobilízase unha concentración fixa do Ac1 (non marcado) nun soporte sólido. Despois, satúrase o soporte.
Engádese a mostra problema (ou de calibrado) de Ax.
Engádese un Ac*2 (marcado) que se una a outro epítopo do Ax.
Eliminación do Ac*2 non unido.
Determínase a cantidade de anticorpo marcado unido.
A partir dunha recta padrón interpólase o valor obtido para saber a concentración de Ax presente ou ben realízase a recta de calibrado. Unión non específica
Normalmente adoitan obterse valores de radioactividade por encima de 0 cando [Ax] 0, isto débese á unión non específica. Adoitan usarse algúns pozos do dispositivo para calcular a unión non específica que existe (facendo un branco de calibrado). Para iso engádese a un dos pozos 1mL de soro+1mL de Ax*+XmL de Ax+(1-X)mL de soro e ao non engadir Ac realízase o mesmo proceso e ao lavar mídese a unión non específica.