Vector de expresión

Un vector de expresión ou construto de expresión é xeralmente un plásmido ou un virus deseñado para a expresión xénica en células. O vector é utilizado para introducir un xene específico nunha célla diana, e pode recrutar o mecanismo da célula para a síntese de proteínas para producir a proteína codificada polo xene. Os vectores de expresión son as ferramentas básicas en biotecnoloxía para a produción de proteínas.
O vector é preparado por enxeñaría para que conteña secuencias regulatorias que actúan como rexións amplificadoras e promotoras e causen unha transcrición eficiente do xene que porta o vector de expresión. O obxectivo dun vector de expresión ben deseñado é a produción eficiente dunha proteína, e isto pode conseguirse pola produción de cantidades significativas de ARN mensaxeiro estable, que pode despois ser traducido a proteínas. A expresión dunha proteína pode estar estreitamente controlada, de tal xeito que a proteína só se produza en cantidades significativas cando é necesario polo uso dun indutor; porén, nalgúns sistemas a proteína pode expresarse constitutivamente. Escherichia coli é o organismo utilizado comunmente como hóspede para a produción de proteínas, mais poden utilizarse tamén outros tipos celulares. Un exemplo do uso dun vector de expresión é a produción de insulina, que se utiliza como tratamento médico da diabetes. Elementos dos vectores de expresión
Un vector de expresión ten as características que todo vector pode ter, como unha orixe de replicación, un marcador seleccionable e un sitio axeitado o para a inserción dun xene, como o sitio de clonación múltiple. O xene clonado pode ser transferido desde un vector de clonación especializado a un vector de expresión, aínda que é posible clonar directamente nun vector de expresión. O proceso de clonación realízase normalmente en Escherichia coli, e os vectores usados para a produción de proteínas en organismos distintos de E. coli poden ter, ademais dunha orixe de replicación axeitada para a súa propagación en E. coli, elementos que lles permiten ser mantidos noutro organismo e estes vectores denomínanse vectores lanzadeira.
Elementos para a expresión
Un vector de expresión debe ter os elementos necesarios para a expresión xénica. Estes poden incluír un promotor, a correcta secuencia de iniciación da tradución como un sitio de unión ao ribosoma e o codón de iniciación, un codón de terminación e unha secuencia de terminación da transcrición. Entre procariotas e eucariotas existen diferenzas en canto á maquinaria para a síntese proteica, polo que os vectores de expresión deben ter os elementos para a expresión que sexan apropiados para o hóspede elixido. Por exemplo, os vectores de expresión en procariotas terán unha secuencia Shine-Dalgarno no seu sitio de iniciación da tradución para a unión dos ribosomas, mentres que os vectores de expresión de eucariotas conterán a secuencia consenso Kozak.
O promotor inicia a transcrición e é, por tanto, o punto de control para a expresión do xene clonado. Os promotores usados no vector de expresión son normalmente inducibles, o que significa que a síntese proteica só se inicia cando é requirida pola introdución dun indutor como o IPTG. Porén, nalgúns vectores de expresión a expresión xénica pode tamén ser constitutiva (é dicir, a proteína exprésase constitutivamente, de forma constante). Pode ocorrer unha síntese de proteínas constitutiva a baixo nivel mesmo en vectores de expresión con promotores estreitamente controlados.
Etiquetas proteicas
Despois da expresión do produto do xene, adoita ser necesario para purificar a proteína expresada; porén, separar a proteína de interese da gran maioría das proteínas da célula hóspede pode ser un proceso moi longo. Para facer que este proceso de purificación sexa máis doado, pode engadirse unha etiqueta de purificación ao xene clonado. Esta etiqueta pode ser unha etiqueta de histidina (His), outros péptidos marcadores, ou un compañeiro de fusión como a glutatión S-transferase ou a proteína de unión á maltosa. Algúns destes compañeiros de fusión poden tamén axudar a incrementar a solubilidade dalgunhas proteínas expresadas. Outras proteínas de fusión como a proteína fluorescente verde pode actuar como un xene reporteiro para a identificación de xenes clonados exitosamente.
Outros
O vector de expresión é transformado ou transfectado na célula hóspede para a síntese de proteínas. Algúns vectores de expresión poden ter elementos para a transformación ou a inserción do ADN no cromosoma hóspede, por exemplo os xenes vir para a transformación de plantas e os sitios de integrase para a integración cromosómica.
Algúns vectores poden incluír unha secuencia de destino que pode destinar a proteína expresada a unha localización específica no espazo periplásmico da bacteria. Sistemas de expresión/produción
Diferentes organismos poden utilizarse para expresar a proteína diana dun xene, e o vector de expresión utilizado terá, por tanto, elementos específicos para o uso nun determinado organismo. O organismo máis utilizado comunmente para a podución de proteínas é a bacteria Escherichia coli. Porén, non todas as proteínas poden ser expresadas debidamente en E. coli, ou ser expresadas coa forma correcta de modificacións postraducionais, como as glicosilacións, polo que poden utilizarse outros sistemas.
Bacterias
A elección do hóspede de expresión para a expresión de moitas proteínas é Escherichia coli, xa que a produción de proteínas heterólogas en E. coli é relativamente simple e conveniente, e tamén é rápida e barata. Disponse de moitos plásmidos de expresión de E. coli para unha ampla variedade de necesidades. Outra bacteria usada para a produción de proteínas é Bacillus subtilis.
A maioría das proteínas heterólogas exprésanse no citoplasma de E. coli. Porén, non todas as proteínas formadas poden solubilizarse no citoplasma e as proteínas pregadas incorrectamente formadas no citoplasma poden formar agregados insolubles chamados corpos de inclusión. Tales proteínas insolubles deberán volver a pregarse, o cal pode ser un proceso complicado e pode que non necesariamente produza un alto rendemento. As proteínas que teñen enlaces disulfuro non adoitan ter a capacidade de pregarse correctamente debido ao ambiente redutor que reina no citoplasma, que impide a formación de tales enlaces, e unha posible solución é destinar a proteína ao espazo periplásmico utilizando unha secuencia sinal N-terminal. Outra posibilidade é manipular o ambiente redox do citoplasma. Tamén se están desenvolvendo outros sistemas máis sofisticados; ditos sistemas poden permitir a expresión de proteínas que previamente se pensaba que era imposible en E. coli, como a das proteínas glicosiladas.
Os promotores usados para estes vectores están baseados usualmente no promotor do operón lac ou o promotor do fago T7, e están normalmente regulados polo operador lac. Estes promotores poden tamén ser híbridos de diferentes promotores, por exemplo, o promotor tac é un híbrido dos promotores trp e lac. Nótese que a maioría dos promotores lac ou derivados de lac comunmente usados están baseados no mutante lacUV5, que é insensible a represión por catabolito. Este mutante permite a exspresión da proteína baixo o control do promotor lac cando o medio de crecemento contén glicosa, xa que a glicosa inhibiría a expresión xénica se se usa o tipo silvestre do promotor lac. A presenza de glicosa, non obstante, pode utilizarse para reducir a expresión de fondo por inhibición residual nalgúns sistemas.
Exemplos de vectores de expresión de E. coli son a serie de vectores pGEX, nos que se utiliza a glutatión S-transferase como compañeiro de fusión e a expresión xénica está baixo o control do promotor tac, e a serie de vectores pET, que usa un promotor T7.
É posible expresar simultaneamente dúas ou máis proteínas diferentes en E. coli usando distintos plásmidos. Porén, cando se usan dous ou máis plásmidos, cada plásmido necesita usar un antibiótico de seleción diferente e tamén unha orixe de replicación distinta, xa que doutro modo os plásmidos non se poderían manter establemente na célula. Moitos plásmidos utilizados habitualmente están baseados no replicón de ColE1 e son, por tanto, incompatibles entre si. Para que un plásmido baseado en ColE1 coexista con outro na mesma célula, o outro terá que ser dun replicón diferente, por exemplo un plásmido baseado no replicón p15A como os plásmidos da serie pACYC. Outro posible enfoque sería usar un só vector de dous cistróns ou deseñar secuencias codificantes en tándem como un construto bi- ou policistrónico.
Lévedos
Un lévedo usado frecuentemente para a produción de proteínas é Pichia pastoris. Exemplos de vector de expresión en Pichia son os vectores da serie pPIC, e estes vectores usan o promotor AOX1, que é inducible con metanol. Os plásmidos poden conter elementos para a inserción de ADN alleo no xenoma do lévedo e a secuencia sinal para a secreción da proteína expresada. En E. coli poden producirse eficientemente as proteínas con enlaces disulfuro e glicosilación. Outro lévedo usado para a produción de proteínas é Kluyveromyces lactis e o xene é expresado baixo a dirección do forte promotor dunha variante da lactase LAC4.
Saccharomyces cerevisiae é moi utilizado en estudos de expresión xénica en lévedos, como por exemplo nun sistema de dous híbridos de lévedos para o estudo das interaccións proteína-proteína. Os vectores usados no sistema de dous híbridos de lévedos conteñen compañeiros de fusión para dous xenes clonados que permiten a transcrición dun xene reporteiro cando hai unha interacción entre as dúas proteínas expresadas a partir dos xenes clonados.
Baculovirus
Os baculovirus son virus con forma de bastón que infectan células de insectos, que se utilizan como vectores de expresión nese sistema. Utilízanse como hóspede liñas de células de insectos derivadas de lepidópteros (avelaíñas e bolboretas), como Spodoptera frugiperda. Unha liña celular derivada da avelaíña Trichoplusia ni é de especial interese, xa que se desenvolveu para crecer rápido e sen o caro soro que normalmente se necesita para impulsar o crecemento celular. O vector lanzadeira denomínase bácmido, e a expresión xénica está baixo o control do forte promotor pPolh. Os baculovirus foron tamén utilizados con liñas celulares de mamíferos no sistema BacMam.
Os baculovirus utilízanse normalmente para a produción de glicoproteínas, aínda que as glicosilacións poden ser diferentes das que se encontran en vertebrados. En xeral, é máis seguro usalos que usar virus de mamíferos, xa que teñen un rango de hóspedes limitado e non infectan vertebrados sen modificacións.
Plantas
Moitos vectores de expresión en plantas están baseados no plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens. Nestes vectores de expresión, O ADN que vai ser inserido na planta é clonado no ADN-T, un tramo de ADN flanqueado por unha secuencia repetida directa de 25 pares de bases en ambos os extremos, e que pode integrarse no xenoma da planta. O ADN-T tamén contén o marcador seleccionable. Os Agrobacterium proporcionan un mecanismo para a transformación, a integración no xenoma da planta, e poden tamén utilizarse os promotores dos seus xenes vir para os xenes clonados. Porén, a preocupación polas posibles consecuencias da transferencia de material xenético bacteriano ou viral á planta levaron ao desenvolvemento de vectores chamados vectores intraxénicos, nos que se usan os equivalentes funcionais de xenoma de plantas para que non haxa transferencia de material xenético desde unha especie allea a unha planta.
Poden utilizarse tamén virus de plantas como vectores porque o método de Agrobacterium non funciona con todas as plantas. Exemplos de virus de plantas usados son o virus do mosaico do tabaco (TMV), o virus X da patata, e o virus do mosaico do feixón de ollo negro (Vigna unguiculata). A proteína pode expresarse como unha fusión coa proteína da cuberta do virus e exponse na superficie das partículas virais ensambladas ou como unha proteína non fusionada que se acumula dentro da planta. A expresión en plantas usando vectores de plantas é a miúdo constitutiva, e un promotor constitutivo de uso moi común en vectores de expresión en plantas é o promotor 355 do virus do mosaico da coliflor (CaMV).
Mamíferos
Os vectores de expresión de mamíferos ofrecen considerables vantaxes para a expresión de proteínas de mamíferos sobre os sistemas de expresión bacteriana, como son: correcto pregamento, modificacións postraducionais e actividade encimática relevante. Pode tamén ser máis desexable que outros sistemas eucarióticos non mamalianos nos que as proteínas expresadas pode que non teñan as glicosilacións correctas. Utilízase especialmente para a produción de proteínas asociadas á membrana que requiren chaperonas para o correcto pregamento e estabilidade e que conteñan numerosas modificacións postraducionais. A outra cara da moeda é o seu baixo rendemento de produto en comparación cos vectores procariotas así como o custo elevado das técnicas utilizadas. A súa complicada tecnoloxía e a potencial contaminación con virus animais tamén sitúan unha restrición no seu uso na produción industrial a grande escala.
As liñas de células de mamífero cultivadas, como a de ovario de hámster chinés (CHO), COS, incluíndo as liñas celulares humanas como a HEK e HeLa poden utilizarse para producir proteínas. Os vectores son transfectados nas células e o ADN pode ser integrado no xenoma por recombinación homóloga no caso de transfección estable, ou as células poden ser transfectadas transitoriamente. Exemplos de vectores de expresión en mamíferos inclúen os vectores adenovirais, a serie de vectores plásmidos pCMV e pSV, vaccinia e vectores retrovirais, así como os baculovirus. Os promotores para citomegalovirus (CMV) e SV40 utilízanse frecuentemente en vectores de expresión de mamíferos para impulsar a expresión xénica. Tamén existen os promotores non virais, como o promotor do factor de elongación (EF)-1.
Sistemas libres de células
Neste método de produción de proteínas in vitro utilízase un lisado celular de E. coli que contén os compoñentes celulares necesarios para a transcrición e tradución. A vantaxe de tales sistemas é que as proteínas se poden producir moito máis rápido que as producidas in vivo, xa que non se require tempo para cultivar as células, pero é tamén máis caro. Os vectores usados para a expresión en E. coli poden utilizarse neste sistema, aínda que existen tamén vectores especificamente deseñados para este sistema. Os extractos de células eucariotas poden tamén utilizarse noutros sistemas libres de células, por exemplo, os sitemas de expresión libres de células de xerme de trigo. Tamén se produciron sistemas libres de células de mamíferos. Aplicacións
Uso en laboratorio
Os vectores de expresión nun hóspede de expresión son agora o método usual utilizado en laboratorios para producir proteínas para a investigación. A maioría das proteínas son producidas en E. coli, pero para as proteínas glicosiladas e as que teñen enlaces disulfuro, poden usarse sistemas de lévedos, baculovirus e de mamíferos.
Produción de péptidos e proteínas farmacéuticas
A maioría das proteínas farmacéuticas son producidas hoxe en día utilizando a tecnoloxía do ADN recombinante usando vectores de expresión. Estes péptidos e proteínas farmacéuticas poden ser hormonas, vacinas, antibióticos, e encimas. A primeira proteína recombinante humana usada para o tratamento de enfermidades foi a insulina, que foi introducida en 1982. A biotecnoloxía permite que estes péptidos e proteínas farmacéuticas, algunhas das cales eran previamente raras ou difíciles de obter, sexan producidas en grandes cantidades. Tamén se reducen os riscos de contaminantes como os virus de hóspedes, toxinas e prións. Exemplos ocorridos no pasado son a contaminación con prións na extracción de hormona de crecemento da glándula pituitaria recollida de cadáveres humanos, que causou a enfermidade de Creutzfeldt-Jakob en pacientes que recibiron un tratamento para o ananismo, e os contaminantes virais presentes nalgúns casos no factor VIII de coagulación illado de sangue humano, que tivo como resultado a transmisión de enfermidades virais como as hepatite e a SIDA. Dito risco pode ser reducido ou eliminado completamente cando as proteínas se producen en células hóspede non humanas.
Animais e plantas transxénicas
Nos anos recentes, utilizáronse os vectrores de expresión para introducir xenes específicos en plantas e animais para producir organismos transxénicos, por exemplo en agricultura utilízanse para producir plantas transxénicas. Os vectores de expresión foron utilizados para introducir un precursor da vitamina A, o beta-caroteno, nas plantas do arroz. O produto obtido denomínase arroz dourado. Este proceso foi tamén utilizado para introducir un xene en plantas que producen un insecticida, chamado xene da toxina de Bacillus thuringiensis ou toxina Bt, que reduce a necesidade de que os agricultores apliquen insecticidas, xa que é producida por un organismo modificado. Ademais, os vectores de expresión son utilizados para aumentar o período en que maduran os tomates ao alteraren a planta para que produza menos cantidade do composto químico que causa que os tomates apodrezan. Ten habido polémicas sobre o uso de vectores de expresión para modificar plantas de cultivo debido a que podería haber riscos para a saúde descoñecidos, a posibilidade de que as empresas patenten certas variedades de plantas agrícolas xeneticamente modificados, e aspectos éticos. Non obstante, esta técnica está aínda sendo usada e moi investigada.
Tamén se produciron animais transxénicos para estudar os procesos bioquímicos animais e doenzas humanas, ou usados para producir fármacos e outras proteínas. Poden tamén ser preparadas por enxeñaría para que teñan algunha característica vantaxosa ou útil. A proteína verde fluorescente utilízase ás veces como etiqueta, o que ten como resultado que un animal sexa fluorescente, e isto foi explotado comercialmente para producir os peixes de acuario fluorescentes GloFish.
Terapia xénica
A terapia xénica é un tratamento prometedor para varias doenzas nas que o xene "normal" portado polo vector é inserido no xenoma para substituír un xene "anormal" ou suplementar a expresión dun xene particular. Os vectores virais son os utilizados xeralmente, pero desenvolvéronse tamén outros métodos non virais de entrega do xene. O tratamento é aínda unha opción arriscada debido ao vector viral usado, que pode causar efectos prexudiciais; por exemplo orixinar unha mutación insercional que pode causar un cancro. Porén, houbo algúns resultados prometedores.