Cribado de alto rendemento

O cribado de alto rendemento (ás veces abreviado HTS, do inglés high-throughput screening) é un método de investigación científica especialmente usado no descubrimento de fármacos e importante nos eidos da bioloxía, ciencia dos materiais e química. O cribado de alto rendemento, usando a robótica, software de procesamento/control de datos, aparellos para manexar líquidos e detectores sensibles, permite realizar rapidamente millóns de tests químicos, xenéticos e farmacolóxicos. Por medio deste proceso pódense recoñecer rapidamente compostos activos, anticorpos ou xenes que modulan unha determinada vía biomolecular. Os resultados destes experimentos proporcionan un punto de inicio para o deseño de fármacos e para comprender a non-interacción ou o papel dunha particular localización. Preparación das placas de ensaio
A peza clave ou recipiente de ensaio do HTS é a placa microtituladora, que é un pequeno contedor, xeralmente desbotable e feito de plástico, que ten o aspecto dunha grella con pequenos buratos abertos chamados pozos. En xeral, as microplacas para HTS poden ter 96, 192, 384, 1536, 3456 ou 6144 pozos. Todos son múltiplos de 96, porue a microplaca orixinal tiña 96 pozos cunha distribución dos pozos de 8 x 12 cun espazado de 9 mm. A maioría dos pozos conteñen produtos para testar, dependendo da natureza do experimento. Estes poden ser diferentes compostos químicos disoltos por exemplo nunha solución acuosa de dimetil sulfóxido (DMSO). Os pozos poden tamén conter células ou encimas dalgún tipo. (Os outros pozos poden estar baleiros ou conter solvente puro ou mostras non tratadas, que se pretenden usar como controis experimentais. )
Unha instalación de cribado normalmente garda unha biblioteca de placas de almacenamento (ou stock), cuxos contidos se catalogan coidadosamente, e cada unha das cales puido crearse no laboratorio ou obterse dun provedor comercial. Estas placas de almacenamento non se usan directamente nos experimentos, senón que cando é necesario se crean placas de ensaio separadas. Unha placa de ensaio é simplemente unha copia dunha placa de almacenamento, creada pipeteando unha pequena cantidade de líquido (a miúdo só uns nanolitros) dos pozos de almacenamento e pasándoa aos pozos correspondentes dunha placa completamente baleira. Observación das reaccións
Para preparar un ensaio, o investigador enche cada pozo da placa con algunha entidade biolóxica sobre a que desexa realizar o experimento, como unha proteína, células ou embrións de animais. Despois dun tempo de incubación para deixar que se absorba o material biolóxico, se una ou dalgunha maneira reaccione (ou non consiga reaccionar) cos compostos dos pozos, fanse medicións en todos os pozos da placa, quer manualmente quer por unha máquina. As medicións manuais adoitan ser necesarias cando o investigador usa a microscopia para (por exemplo) buscar os cambios ou defectos no desenvolvemento embrionario causado polos compostos dos pozos, buscando efectos que o computador non pode determinar facilmente por si só. Noutros casos, unha máquina de análise automatizada especializada pode realizar varios experimentos nos pozos (como iluminalos con luz polarizada e medir a reflectividade, que pode ser unha indicación da unión de proteínas). Neste caso, a máquina dá o resultado de cada experimento como unha grella de valores numéricos, e cada número mapea o valor obtido dun só pozo. Unha máquina de análise de alta capacidade pode medir ducias de placas en poucos minutos, xerando miles de puntos de datos experimentais moi rapidamente.
Dependendo dos resultados deste primeiro ensaio, o investigador pode realizar outros ensaios dentro do mesmo cribado seleccionando por conveniencia líquido dos pozos fonte que deron resultados interesantes (coñecidos como "éxitos" ou "hits") e pasándoo a novas placas de ensaio, e despois reiniciando o experimento para recoller máis datos deste novo conxunto máis restrinxido, confirmando e redifinindo así as observacións. Sistemas de automatización
A automatización é un elemento esencial na utilidade do HTS. Normalmente, un sistema robótico integrado que consiste nun ou máis robots transporta microplacas de ensaio de estación en estación para a adición de mostras e reactivos, para mesturalos, incubalos e finalmente para a lectura ou detección. Un sistema de HTS pode xeralmente preparar, incubar e analizar moitas placas simultaneamente, acelarando máis o proceso de recollida de datos. Actualmente, xa existen robots de HTS que poden testar ata 100. 000 compostos ao día. Recolectores de colonias automáticos recollen miles de colonias microbianas para o cribado xenético de alto rendemento. O termo cribado de ultraalto rendemento (uHTS, do inglés ultra-high-throughput screening) fai referencia a un cribado superior aos 100. 000 compostos diarios (en 2008, xa que as máquinas melloran co paso dos anos). Deseño experimental e análise de datos
Coa capacidade de facer cribados rápidos de diversos compostos (como peuenas moléculas ou ARNs interferentes pequenos) para identificar compostos activos, o HTS levou a unha explosión na velocidade de xeración de datos nos anos recentes. En consecuencia, un dos retos máis fundamentais nos experimentos de HTS é descubrir a importancia bioquímica de moreas de datos, o cal depende do desenvolvemento e adopción de deseños experimentais axeitados e de métodos analíticos para o control de calidade e selección dos "éxitos" (hits).
A investigación con HTS é un dos campos que se fixo tan importante que John Blume, xefe da oficina científica de Applied Proteomics, Inc. , dixo: "Pronto, se un científico non comprende algunhas estatísticas ou tecnoloxías de manexo de datos rudimentarias, non pode considerarse un verdadeiro biólogo molecular e, así, será simplemente "un dinosauro. "
Control de calidade
Os ensaios de HTS de alta calidade son fundamentais nos experimentos de HTS. Para o desenvolvemento de ensaios de HTS de alta calidade cómpre a integración de estratexias experimentais e computacionais para o control de calidade. Tres importantes medios de control de calidade son: (i) un bo deseño das placas, (ii) a selección de controis químicos/biolóxicos positivos e negativos efectivos, e (iii) o desenvolvemento de métricas de control de calidade efectivas para medir o grao de diferenciación para que se poidan identificar os ensaios con inferior calidade dos datos. Un bo deseño das placas axuda a identificar erros sistemáticos (especialmente os ligados coa posición dos pozos) e a determinar que normalización se debería usar para eliminar/reducir o efecto dos erros sistemáticos no control de calidade e na selección de "éxitos" (hits).
Os métodos de control de calidade efectivos serven como un gardián para os ensaios de excelente calidade. Nun experimento de HTS típico, unha clara distinción entre un control positivo e unha referencia negativa como un control negativo é un índice de boa calidade. Propuxéronse moitas medidas de avaliación da calidade para medir o grao de diferenciación entre un control positivo e unha referencia negativa. Para avaliar a calidade dos datos adoptáronse a razón sinal-fondo, a razón sinal-ruído, a ventá de sinal, a razón de variabilidade de ensaio e o factor Z. Propúxose recentemente a diferenza de medias estritamente estandarizadas (SSMD) para avaliar a calidade de datos dos ensaios de HTS.
Selección de éxitos (hits)
Un composto cun tamaño de efectos deseado nun HTS chámase "éxito", "acerto" ou "albo" (hit). O proceso de seleccionar estes éxitos chámase selección de éxitos. Os métodos analíticos para a selección de éxitos en cribados sen replicados (usualmente en cribados primarios) difire dos que se usan con replicados (usualmente en cribados confirmatorios). Por exemplo, o método do estatístico z (z-score ou variable estandarizada) é axeitado para cribados sen replicados, mentres que o estatístico t é apropiado para cribados con replicados. O cálculo da SSMD para cribados sen replicados tamén é distinto que para cribados con replicados.
Para a selección de éxitos en cribados primarios sen replicados, os facilmente interpretables son cambio medio, diferenza media, inhibición porcentual, e actividade porcentual. Porén, non capta de forma efectiva a variablilidade dos datos. O método do estatístico z ou a SSMD, que poden captar a variabilidade dos datos baseándose na suposición de que cada composto ten a mesma variabilidade que unha referencia negativa nos cribados. Porén, os valores atípicos son comúns nos experimentos de HTS, e os métodos como o estatístico z son sensibles a valores atípicos e poden ser problemáticos. Como consecuencia, propuxéronse e adoptáronse para a selección de éxitos métodos robustos como o método do estatístico z* e a SSMD*, o método do estatístico B (B-score) e o método baseado en cuantís.
Nun cribado con replicados, pódese estimar directamente a variabilidade para cada composto; en consecuencia, debería usrse a SSMD ou o estatístico t que non dependen da forte suposición da que dependen o estatístico z e o estatístico z*. Un problema co uso do estatístico t e valores p asociados é que están afectados tanto polo tamaño das mostras coma polo tamaño efectivo. Proceden de facer test para ningunha diferenza media, e, por tanto, non están deseñados para medir o tamaño dos efectos compostos. Para a selección de éxitos, o interese maior é o tamaño do efecto nun composto testado. A SSMD avalía directamente o tamaño dos efectos. A SSMD tamén demostrou ser mellor que outros tamaños de efecto comunmente usados. O valor de poboación da SSMD é comparable entre experimentos e, así, pode usarse o mesmo límite para o valor de poboación da SSMD para medir o tamaño dos efectos compostos. Técnicas para incrementar o rendemento e eficiencia
Poden utilizarse distribucións únicas de compostos nunha ou moitas placas para incrementar o número de ensaios por placa ou para reducir a varianza de resultados dos ensaios ou ambas as cousas. A suposición simplificada que se fai nesta estratexia é que os compostos N que houbese no mesmo pozo non interaccionarán normalmente entre si, nin coa diana ensaida, nunha maneira que cambia fundamentalmente a capacidade do ensaio de detectar os éxitos (hits) verdadeiros.
Por exemplo, imaxinemos unha placa na cal o composto A está nos pozos 1–2–3, o composto B nos pozos 2–3–4, e o C nos 3–4–5. Nun ensaio desta placa fronte a unha diana dada, un "éxito" nos pozos 2, 3 e 4 indicaría que o composo B é o axente máis probable, mentres que tamén proporciona tres medidas da eficacia do composto B contra a diana especificada. As aplicacións comerciais desta estratexia implican combinacións nas cales nunca hai dous compostos compartindo máis dun pozo, para reducir a posibilidaade (de segunda orde) de interferencia entre pares de compostos que están sendo cribados.
Avances recentes
Os científicos do Céntro Xenómico Químico (NCGC) dos NIH utilizaron a automatización e os formatos de ensaio de volume baixo para desenvolver a HTS cuantitativa (qHTS), un paradigma para as biblotecas químicas grandes de perfil farmacolóxico por medio da xeración de relacións resposta-concentración completa para cada composto. Acompañándoos con axustes de curvas e software de quimioinformática os datos de qHTS renden a concentración efectiva media (EC50), a resposta máxima, o coeficiente de Hill (nH) para a biblioteca enteira permitindo a avaliación das relacións de actividade da estrutura (SAR) nacentes.
En marzo de 2010, publicouse unha investigación que demostraba un proceso de HTS que podía facer un cribado mil veces máis rápido (reaccións de 100 millóns en 10 horas) a unha millonésima parte do custo (usando 10−7 veces de volume de reacción) das técnicas convencionais, que usaba microfluídica baseada en pingas. Aquí, pingas de fluído separadas por aceite substitúen os pozos das microplacas e permiten a análise e a selección de éxitos (hits) mentres que os reactivos están fluíndo polas canles.
En 2010, desenvolveuse unha lámina de silicio de lentes que se pode situar sobre matrices microfluídas que permite a medida da fluorescencia de 64 canles de saída simultaneamente cunha soa cámara. Este proceso pode analizar 200. 000 pingas por segundo.
En 2013, presentouse unha estratexia con pequenas moléculas de plantas. En xeral, é esencial proporcionar validacións de alta calidade de proba de concepto o máis axiña posible no proceso de descubrimento de fármacos. Aquí as tecnoloxías que permiten a identificación de sondas químicas potentes, selectivas e biodispoñibles son de crucial interese, mesmo se os compostos resultantes necesitan unha optimización para o desenvolvemento no produto farmacéutico. O receptor nuclear RORα, unha proteína que se utilizou por máis dunha década para identificar agonistas potentes e biodispoñibles, utilizouse como exemplo dunha diana de fármaco moi complicada. Os éxitos ou hits confírmanse no paso de cribado debido á curva de campá. Este método é moi similar para o método de HTS cuantitativo (o cribado e a confirmación de éxitos ao mesmo tempo), excepto que usando esta estratexia diminúe moito o número de puntos de datos e poden cribarse doadamente máis de 100. 000 compostos biolóxicos relevantes.
Segundo informa Merck, cambiar dun axitador orbital, que require funcionar durante 24 horas e polo menos 10 mg de fármaco, a un mesturador ResonantAcoustic, reducía o tempo de procesamento a menos de dúas horas e con só 1-2 mg de fármaco por pozo. Merck tamén sinalou que o uso do mesturador acústico permite preparacións de formulacións de nanosuspension de alta dose que non se poderían obter usando o equipamento convencional.
Cando o descubrimento de fármacos por HTS tradicional usa proteínas purificadas ou células intactas, o desenvolvemento recente da tecnoloxía está asociado co uso de organismos vivos intactos, como o nematodo Caenorhabditis elegans e o peixe cebra (Danio rerio).
En 2016-2018 na fabricación de placas empezou a producirse química especializada para permitir a produción en masa de superficies repelentes de células ultraadherentes que facilitaron o rápido desenvolvemento de ensaios de HTS que se puidesen dirixir ao descubrimento de fármacos anticanceríxenos en tecidos en 3D como os organoides e os esferoides; un formato relevante máis fisiolóxico. Aumento do uso do cribado de alto rendemento na academia para a investigación biomédica
O HTS é unha innovación relativamente recente, que se fixo posible grazas aos modernos avances en robótica e tecnoloxía computacional de alta velocidade. Aínda se precisa dun laboratorio de cribado caro e moi especializado para facer funcionar o cribado, así que en moitos casos unha institución de investigación de tamaño pequeno ou mediano usa os servizos dunha instalacións de HTS xa existente en lugar de montar unha instalación propia.
Hai unha tendencia na academia a que as universidades teñan a súa proia empresa dedicada ao descubrimento de fármacos. Estas instalacións, que normalmente se atopan só na industria, atópanse agora cada vez máis tamén nas universidades. UCLA, por exemplo, ten un laboratorio de HTS de acceso aberto de Recursos Compartidos de Cribado Molecular (ou Molecular Screening Shared Resources, MSSR), que pode cribar máis de 100. 000 compostos ao día. A política de acceso aberto garante que os investigadores de todo o mundo poidan aproveitar as vantaxes desta instalación sen longas negociacións da propiedade intelectual. Cunha biblioteca de compostos dunhas 200. 000 pequenas moléculas, o MSSR ten unha das mesas de compostos maior de todas as universidades da costa oeste. Ademais, o MSSR ten capacidades xenómicas funcioanis plenas (ARN interferente pequeno, ARN en forquita curto, ADN complementario e CRISPR de xenoma completo) que son complementarias dos traballos con moléculas pequenas: a xenómica funcional aprovéitase das capacidades do HTS para executar cribados de todo o xenoma que examinan o funcionamento de cada xene no contexto que interese por medio de facer un knockout de cada xene ou sobreexpresándoo. O acceso paralelo a cribados de alto rendemento de pequenas moléculas e os cribados de xenoma completo permite aos investigadores realizar identificación de dianas e validación para unha determinada doenza ou a determinación do modo de acción cunha pequena molécula. Poden obterse os resultados máis exactos usando bibliotecas xenómicas funcionais "matriciadas", é dicir, cada biblioteca contén un só construto como un só ARN interferente pequeno ou ADN complementario. A xenómica funcional é normalmente emparellada co cribado de alto contido usando, por exemplo, microscopia epifluorescente ou citometría de varrido láser.
A Universidade de Illinois ten unha instalación de HTS, como tamén a de Minnesota. O Instituto de Ciencias da Vida da Universidade de Míchigan alberga a instalación de HTS no Centro de Química Xenómica. A Universidade de Columbia ten unha instalación de recursos compartidos de HTS con ~300. 000 pequenas moléculas distintas e ~10. 000 compostos bioactivos coñecidos dispoñibles para o cribado bioquímico, baseado en células e baseado en secuenciación da seguinte xeración (NGS). A Universidade Rockefeller ten un centro de recursos de HTS de acceso aberto (HTSRC) que ofrece unha biblioteca duns 380. 000 compostos. O Laboratorio de Análise de Alto Rendemento da Universidade do Noroeste permite a identificación de dianas, a validación, ensaios de desenvolvemento e cribado de compostos. A institución sen ánimo de lucro Instituto de Descubrimento Médico Sanford Burnham Prebys tamén ten unha instalación de HTS desde hai moito tempo no Centro Conrad Prebys para a Xenómica Química que formaba parte do MLPCN. O Centro de Cribado Molecular de Scripps Research (SRMSC) sen ánimo de lucro continúa servindo á academia por medio dos institutos da era post-MLPCN. A instalación de uHTS do SRMSC ten unha das coleccións de bibliotecas máis grande na academia, actualemtne con máis de 665. 000 entidades de pequenas moléculas, e criba rutinariamente a colección completa de subbibliotecas de iniciativas de bolsas de investigación multi-PI (Multi Principal Investigators).
Nos Estados Unidos, os Institutos Nacionais da Saúde (NIH) crearon un consorcio nacional de centros de cribado de pequenas moléculas para producir ferramentas químicas innovadoras para o seu uso na investigación biolóxica. A Rede de Centros de Producidón de Sondas de Bibliotecas Moleculares (MLPCN), realiza HTS en ensaios proporcionados pola comunidade de investigadores, sobre unha gran biblioteca de pequenas moléculas mantidas nun repositorio de moléculas central. Ademais, os NIH crearon o Centro Nacional para o Avance das Ciencias Traducionais (NCATS), con sede en Shady Grove Maryland, que leva a cabo cribados de pequenas moléculas e de interferencia de ARN en colaboración con laboratorios académicos. Hai que salientar que o cribado de pequenas moléculas usa 1536 placas de pozos, unha capacidade raramente vista en laboatorios de cribado académicos que permite realizar HTS cuantitativo, no cal cada composto se testa en concentracións de catro a cinco ordes de magnitude.