Vector viral

Os vectores virais son ferramentas comunmente usadas en bioloxía molecular para entregar material xenético en células. Este proceso pode realizarse dentro dun organismo vivo (in vivo) ou nun cultivo celular (in vitro). Nos virus evolucionaron mecanismos moleculares especializados para transportar eficientemente os seus xenomas ao interior das células que infectan. A entrega de xenes ou outro material xenético por un vector denomínase transdución e as células infectadas dise que están transducidas. Estas ferramentas empezaron a utilizarse en bioloxía molecular na década de 1970s. Paul Berg utilizou un virus SV40 modificado que contiña ADN procedente do bacteriófago λ para infectar células de ril de mono en cultivo.
Ademais do seu uso en investigacións de bioloxía molecular, os vectores virais utilízanse na terapia xénica e no desenvolvemento de vacinas. Propiedades clave dun vector viral
Os vectores virais son confeccionados para as súas aplicacións específicas, mais xeralmente comparten unhas poucas características esenciais, que son: Seguridade. Aínda que os vectores virais se crean ocasionalmente a partir de virus patóxenos, normalmente son modificados de tal maneira que se minimiza o risco de manipulalos. Isto xeralmente supón a eliminación ou deleción dunha parte do xenoma viral que intervén na replicación viral. Un virus así preparado pode infectar eficazmente as células pero, unha vez que a infección tivo lugar, necesitaría un virus axudante que lle proporcionase as proteínas que lle faltan para a produción de novos virións.
Baixa toxicidade. O vector viral debería ter un efecto mínimo sobre a fisioloxía da célula que infecta.
Estabilidade. Algúns virus son xeneticamente inestables e poden rearranxar rapidamente os seus xenomas. Isto é prexudicial para a predicibilidade e reproducibilidade dos traballos de investigación realizados usando un vector viral e procura evitarse no seu deseño.
Especificidade para un tipo celular. A maioría dos vectores virais son preparados por enxeñaría para infectar o rango máis amplo de tipos celulares que sexa posible. Porén, ás veces prefírese ao contrario. O receptor viral pode ser modificado para que o virus afecte só a un tipo específico de célula. Os virus modificados desta maneira dise que están pseudotipados.
Identificación. Aos vectores virais engádenselles a miúdo certos xenes que axudan a identificar as células que captaron os xenes virais. Estes xenes denomínanse marcadores. Un marcador común é a resistencia a certos antibióticos. As células poden despois illarse doadamente, xa que aquelas que non captaronos xenes do vector viral non teñen resistencia ao antibiótico, e non poden crecer nun cultivo no que está presente ese antibiótico. Aplicacións
Investigación básica
Os vectores virais foron desenvolvidos orixinalmente como unha alternativa á transfección de ADN espido para experimentos de xenética molecular. Comparado cos métodos tradicionais como a precipitación con fosfato de calcio, a transdución pode asegurar que case o 100% das células son infectadas sen que isto afecte gravemente á viabilidade celular. Ademais, algúns virus intégranse no xenoma celular facilitando unha expresión estable.
Os xenes codificantes de proteínas poden expresarse utilizando vectores virais, normalmente para estudar a función dunha proteína determinada. Os vectores virais, especialmente os retrovirus, expresan establemente xenes marcadores como o da GFP e utilízanse amplamente para etiquetar de forma permanente as células para así rastrealas a elas e á súa proxenie; por exemplo en experimentos de xenotransplantes, onde as células infectadas in vitro son implantadas nun animal hóspede.
A inserción de xenes é máis barata que o knockout de xenes. Pero como o silenciamento é ás veces non específico e ten efectos fóra de diana sobre outros xenes, proporciona resultados menos fiables. Os vectores de hóspede animal xogan tamén un importante papel.
Terapia xénica
A terapia xénica é unha técnica para corrixir xenes defectivos responsables do desenvolvemento dunha enfermidade. No futuro a terapia xénica podería proporcionar un modo de curar os trastornos xenéticos, como a inmunodeficiencia combinada grave, a fibrose quística ou mesmo a haemofilia A. Como estas doenzas se orixinan por mutacións na secuencia de ADN de xenes específicos, nos ensaios de terapia xénica utilizáronse virus para entregar copias non mutadas destes xenes a células do corpo do paciente. Houbo moitos éxitos no laboratorio coa terapia xénica, pero deberán superarse varios problemas que ten a terapia xénica viral antes de que esta teña un uso xeneralizado. A resposta inmune a virus non só impide a entrega de xenes a células diana senón que pode causar graves complicacións para o paciente. Nun dos ensaios iniciais realizados de terapia xénica en 1999 isto orixinou a morte dun paciente que fora tratado usando un vector adenoviral.
Algúns vectores virais, por exemplo os gamma-retrovirus, insiren os seus xenomas nunha localización aparentemente aleatoria nun dos cromosomas do hóspede, o cal pode distorsionar o funcionamento de xenes celulares e conducir ao cancro. Nun ensaio de terapia xénica con retrovirus de inmunodeficiencia combinada grave realizado en 2002, catro dos pacientes desenvolveron leucemia como consecuencia do tratamento; tres dos pacientes recuperáronse despois da quimioterapia. Os vectores virais baseados en virus adenoasociados son moito máis seguros a ese respecto, xa que sempre integran os xenes no mesmo sitio do xenoma humano, e teñen aplicacións en varios trastornos, como a enfermidade de Alzheimer.
Vacinas
Os virus que expresan proteínas patóxenas están actualmente sendo desenvolvidos como vacinas contra eses patóxenos, baseándose nas mesmas razóns que as vacinas de ADN. Os linfocitos T recoñecen as células infectadas con parasitos intracelulares detectando as proteínas alleas producidas dentro da célula. A inmunidade de células T é crucial para a protección contra as infeccións virais e contra doenzas como a malaria. Unha vacina viral induce a expresión de proteínas patóxenas dentro das células hóspede de maneira similar á vacina da polio de Sabin e outras vacinas atenuadas. Porén, como as vacinas virais conteñen só unha pequena fracción de xenes patóxenos, son moito máis seguras e a infección esporádica polo patóxeno é imposible. Os adenovirus están sendo activamente desenvolvidos como vacinas. Tipos
Retrovirus
Os retrovirus son unha das columnas principais nas que se apoian as actuais estratexias de terapia xénica. O retrovirus recombinantes como o virus da leucemia murina Moloney teñen a capacidade de integrarse no xenoma do hóspede de maneira estable. Conteñen unha transcriptase inversa para facer copias en ADN do seu xenoma de ARN, e unha integrase, que permite a integración no xenoma do hóspede. Foron utilizados en varios ensaios clínicos como o ensaio SCID-X1.
Os vectores retrovirais poden ser competentes ou defectivos para a súa replicación. Os vectores defectivos para a súa replicación son a elección máis común nos estudos porque a estes virus se lles substituíron por outros xenes as rexións codificantes para os xenes necesarios para realizar roldas adicionais de replicación e empaquetamento dos virións, ou ben fóronlles eliminadas. Estes virus poden infectar as súas células diana e entregar o seu cargamento, pero despois non poen continuar o seu típico ciclo lítico, que causaría a lise e morte da célula.
Inversamente, os vectores virais competentes para a súa replicación conteñen todos os xenes necesarios para a síntese dos virións, e continúan propagándose por si mesmos unha vez que a infección empeza. Como o xenoma viral destes vectores é moito máis longo, a lonxitude do xene de interese que levan inserido está limitada comparada coa posible lonxitude do inserto en vectores defectivos para a súa replicación. Dependendo do vector viral, a lonxitude máxima típica do inserto de ADN permitido nun vector viral defectivo para a replicación é xeralmente de 8–10 kb. Aínda que isto limita a introdución de moitas secuencias xenómicas, a maioría das secuencias de ADN complementario poden, de todos modos, ser acomodadas no vector.
O principal inconveniente para o uso de retrovirus como o retrovirus Moloney é a necesidade de que as células se dividan activamente para a transdución. Como resultado, células como as neuronas son moi resistentes á infección e transdución por retrovirus.
Unha importante preocupación nestas técnicas é a mutaxénese insercional debida á integración no xenoma hóspede, que podería orixinar un cancro ou leucemia. Esta preocupación era só teórica ata que a terapia xénica realizada en dez pacientes do ensaio SCID-X1 usando o virus da leucemia murina Maloney tivo como resultado dous casos de leucemia causados pola activación do oncoxene LMO2, debido á integración do vector nun lugar próximo a ese xene.
Lentivirus
Os Lentivirus son unha subclase de retrovirus. Utilízanse ás veces como vectores para terapia xénica pola súa capacidade de integrarse no xenoma de células que non están en división, que é unha característica única dos lentivirus, xa que outros retrovirus poden infectar só células en división. O xenoma viral en forma de ARN é reversotranscrito cando o virus entra na célula para producir unha copia en ADN, o cal é despois inserido no xenoma nunha posición aleatoria (descubrimentos recentes indican, non obstante, que esta inserción non é aleatoria senón dirixida a xenes activos específicos e relacionados coa organización do xenoma) polo encima integrase viral. O ADN do vector integrado, agora chamado provirus, permanece no xenoma e transmítese á proxenie da célula cando esta se divide. O sitio de integración non é predicible, o cal pode supoler un problema. O provirus pode distorsionar a función dos xenes celulares e levar á activación de oncoxenes que promoven a carcinoxénese, o cal fai que sexa preocupante a posible aplicación dos lentivirus en terapia xénica. Porén, algúns estudos mostraron que os vectores lentivirus teñen unha menor tendencia a integrarse en lugares que potencialmente poderían causar cancro que a que mostran os vectores gamma-retrovirais. Máis especificamente, un dos estudos atopou que os vectores lentivirais non causaban un incremento na incidencia de tumores ou un comezo temperán de tumores nunha cepa de ratos que tiña unha moita maior incidencia de tumores. Por razóns de seguridade os vectores lentivirais nunca trasnportan os xenes necesarios para a súa replicación. Para producir un lentivirus, transféctanse varios plásmidos ás denominadas liñas celulares de empaquetado, normalmente HEK 293. Un ou máis plásmidos, xeralmente denominados plásmidos de empaquetado, codifican proteínas do virión, como as da cápside e a transcriptase inversa. Outro plásmido contén o material xenético que vai ser entregado ao vector. É transcrito para producir o xenoma viral de ARN monocatenario e é marcado pola presenza da secuenca ψ (psi). Esta secuencia utilízase para empaquetar o xenoma dentro do virión.
Adenovirus
Ao revés que nos lentivirus, o ADN de adenovirus non se integra no xenoma e non é replicado durante a división celular. Isto limita o seu uso en investigación básica, aínda que os vectores adenovirais seguen utilizándose en experimentos in vitro e in vivo. As súas aplicacións principais son en terapia xénica e vacinación. Como os humanos están frecuentemente en contacto con adenovirus, os cales causan infeccións respiratorias, gastrointestinais e oculares, a maioría dos pacientes xa desenvolveron anticorpos neutralizantes que poden inactivar o virus antes de que este poida chegar á célula diana. Para superar este problema estanse a investigar actualmente adenovirus que infectan outras especies para os cales os humanos non teñen inmunidade.
Virus adenoasociados
Os virus adenoasociados (AAV) son pequenos virus que infectan humanos e algunhas outras especies de primates. Polo que se sabe ata agora, os virus adenoasociados non causan enfermidades e orixinan unha resposta inmune moi suave. Poden infectar tanto a células en división coma non e poden incorporar o seu xenoma ao da célula hóspede. Ademais, fano permanecendo principalmente como episomas (replicándose sen incorporarse ao cromosoma); dando lugar a unha expresión longa e estable. Estas características fan dos virus adenoasociados uns candidatos moi atractivos para crear vectores virais para a terapia xénica. Porén, só poden entregar 5kb, o cal é un tamaño considerablemente pequeno comparado coa capacidade orixinal total do virus adenoasociado.
Ademais, debido ao seu potencial uso como vectores de terapia xénica, os investigadores crearon un virus adenoasociado alterado chamado virus adenoasociado autocomplementario (scAAV). Mentres que un virus adenoasociado empaqueta un ADN monocatenario e require o proceso da síntese da segunda cadea do ADN, o scAAV empaqueta as dúas cadeas que se emparellan para formar o ADN bicatenario. Ao evitaren a síntese da segunda cadea, os scAAV permiten unha rápida expresión na célula. Polo demais, o scAAV presenta moitas características dos virus adenoasociados (AAV).
Híbridos
Os vectores híbridos son virus vectores que son preparados por enxeñaría xenética para que teñan cualidades de máis dun vector. Os virus son alterados para evitar os defectos dos típicos vectores virais, os cales poden ter unha limitada capacidade de carga, inmunoxenicidade, xenotoxicidade e fallan ao manter unha expresión transxénica axeitada a longo prazo. Por medio da substitución de elementos indesexables polas capacidades desexadas, os vectores híbridos poden no futuro superar en resultados os vectores de transfección estándares en cato a seguridade e eficiencia terapéutica. Dificultades na súa aplicación
A elección dun vector viral para entregar material xenético a células presenta algúns problemas loxísticos. Hai un número limitado de vectores virais dispoñibles para uso terapéutico. Todos estes poucos vectores virais poden causar que o corpo desenvolva unha resposta inmune se o vector é considerado como un intruso invasor. Unha vez utilizado, o vector viral non pode ser usado de forma efectiva por segunda vez no paciente porque será recoñecidopolo sistema inmunitario do corpo. Se a vacina ou a terapia xénica fracasa nos ensaios clínicos, o virus non se pode utilizar outra vez no paciente para administrar outra vacina diferente ou para terapia xénica no futuro. O paciente podería ter unha inmunidade preexistente contra o vector viral, facendo a terapia ineficaz para el. É posible contrarrestar a inmunidade preexistente cando se usa un vecor viral para a vacinación cebando o sistema inmunitario cunha vacina de ADN non viral, mais este método supón un gasto adicional e un atranco no proceso de distribución de vacinas. A inmunidade preexistente pode tamén ser sorteada incrementando a dose da vacina ou cambiando a ruta de vacinación. Algúns inconvenientes dos vectores virais (como a xenotoxicidade e a baixa expresión transxénica) pode ser superado polo uso de vectores híbridos.