Pegada de masas peptídicas

A pegada de masas peptídicas (PMF, do inglés peptide mass fingerprinting), tamén chamado pegada peptídica ou pegada dactilar peptídica, é unha técnica analítica para a identificación de proteínas na cal a proteína descoñcida de interese se corta primeiro en pequenos péptidos, cuxas masas absolutas se miden con precisión cun espectrómetro de masas como o MALDI-TOF ou o ESI-TOF. O método desenvolvérono en 1993 varios grupos independentemente. As masas dos péptidos compáranse cunha base de datos de secuencias de proteínas coñecidas ou incluso co xenoma. Isto conséguese usando programas de computador que traducen o xenoma coñecido do organismo a proteínas, despois cortan teoricamente as proteínas en péptidos e calculan as masas absolutas dos péptidos de cada proteína. Despois comparan as masas dos péptidos das proteínas descoñecidas coas masas de péptidos teóricos de cada proteína codificada no xenoma. Os resultados analízanse estatisticamente para atopar a mellor correspondencia.
A vantaxe deste método é que só cómpre coñecer as masas dos péptidos. Unha desvantxe é que a secuencia de proteínas debe estar presente na base de datos de interese. Ademais, a maioría dos algoritmos para pegada de masas peptídicas asumen que os péptidos proceden dunha soa proteína. A presenza dunha mestura pode complicar significativamente a análise e comprometer os resultados. Un requirimento típico para a identificación de proteínas baseada en pegada de masas peptídicas é ter unha proteína illada. As mesturas que exceden un número de 2–3 proteínas normalmente necesitan o uso adicional da identificación de proteínas baseada en MS/MS para conseguir especificidade suficiente para a identificación. Por tanto, as mostras típicas para pegada de masas peptídicas son proteínas illadas por medio de electroforese en xel bidimensional (xeles 2D) ou bandas illadas por SDS-PAGE. As análises adicionais por MS/MS poden ser ou ben directas, por exemplo análises de MALDI-TOF/TOF, ou ben análises nanoLC-ESI-MS/MS de augas abaixo de eluatos de manchas de xel. Orixes
A pegada de masas peptídicas desenvolveuse debido ao longo e tedioso que era o proceso de analizar proteínas. A degradación de Edman usada na análise de proteínas tardaba case unha hora en analizar un residuo de aminoácido. A SDS-PAGE utilizouse tamén para separar proteínas en mesturas moi complexas, o cal tamén empregaba métodos de electroblotting e tinguidura. Despois, extráense as bandas do xel e son secuenciadas automaticamente. Un problema recorrente no proceso era que as proteínas que interferían tamén eran purificadas xunto coa proteína de interese. As secuencias destas proteínas que interferían eran compiladas no que se acabou por coñecer como a base de datos de Dayhoff. Finalmente, o feito de ter as secuencias destas proteínas contaminantes coñecidas nas bases de datos diminuíu o tempo instrumental e os custos económicos da análise de proteínas. Preparación da mostra
As mostras proteícas poden obterse dunha SDS-PAGE ou HPLC de fase inversa, e son despois sometidas a algunhas modificacións químicas. As pontes disulfuro das proteínas son reducidas e os aminoácidos cisteína son carbamidometilatdos quimicamente ou acrilamidados durante a electroforese en xel.
Despois, as proteínas córtanse en varios fragmentos usando encimas proteolíticos (proteases) como a tripsina, quimotripsina ou Glu-C. Unha razón típica mostra: protease é 50: 1. A proteólise normalmente realízase pola noite e os péptidos resultantes extráense con acetonitrilo e sécanse no baleiro. Despois, disólvense os péptidos nunha pequena cantidade de auga destilada ou son concentrados máis e purificados e están xa listos para a análise por espectrometría de masas. Análise de espectrometría de masas
A proteína dixerida pode analizarse con diferentes tipos de espectrómetros de masas como o ESI-TOF ou o MALDI-TOF. O MALDI-TOF adoita ser o instrumento preferido porque permite un alto rendemento da mostra e poden analizarse varias proteínas nun só experimento, se se complementa cunh análise MS/MS. O LC/ESI-MS e o CE/ESI-MS son tamén magníficas técnicas para a pegada de masas peptídicas.
Unha pequena fracción do péptido (usualmente 1 microlitro ou menos) é pipeteado nunha diana de MALDI e adiciónase un composto químico chamado matriz á mestura de péptidos. Matrices comúns son o ácido sinapínico, o ácido alfa-ciano-4-hidroxicinámico e o ácido 2, 3-dihidroxibenzoico. As moléculas matriz son necesarias para a desorción das moléculas peptídicas. As moléculas de matriz e as peptídicas cocristalizan sobre a diana do MALDI e están prontas para ser analizadas. Hai unha técnica de preparación da mostra predominante para MALDI-MS chamada técnica de pinga seca. A diana insírese na cámara de baleiro do espectrómetro de masas e iníciase a desorción e ionización dos fragmentos peptídicos por medio dun raio láser pulsado que transfire grandes cantidades de enerxía ás moléculas matriz. A transferencia de enerxía é dabondo grande como para promover a ionización e a transición de moléculas matriz e péptidos desde a fase sólida á fase de gas. Os ións son acelerados no campo eléctrico do espectrómetro de masas e voan cara a un detector de ións onde se detecta a súa chegada en forma dun sinal eléctrico. A razón masa-carga é proporcional ao seu tempo de voo (TOF, do inglés time-of-flight) no tubo de deriva e poden calcularse e consecuencia.
Acoplando ESI con LC capilar poden separarse os péptidos das proteínas dixeridas, mentres que se obtén ao mesmo tempo as súas masas moleculares. Outra técnica é a electroforese capilar acoplada con ESI-MS; porén, funciona mellor cando se analizan pequenas cantidades de proteínas. Análise computacional
A análise espectrométrica de masas produce unha lista de pesos moleculares que se adoita chamar lista de picos. As masas dos péptidos compáranse con bases de datos de proteínas como Swissprot, que conteñen información de secuencias de proteínas. O software realiza in silico simulacións virtuais de dixestións de proteínas da base de datos co mesmo encima (por exemplo, tripsina) usado na reacción de clivaxe química real. A masa destes péptidos calcúlase despois e compárase coa lista de picos das masas medidas. Os resultados son analizados estatisticamente e as posibles concordancias devólvense nunha táboa de resultados.