Transfección

A transfección é o proceso de introducir de forma deliberada ácidos nucleicos espidos ou purificados en células eucariotas. Tamén se pode referir a outros métodos e tipos celulares, aínda que adoitan preferirse neses casos outros termos, como transformación ou transdución. "Transformación" é o termo usado para descrbir a transferencia de ADN non viral en bacterias e células eucariotas non animais, incluíndo as células de plantas. En células animais transfección é o termo preferido, xa que transformación tamén se usa para referirse á progresión a un estado canceroso (carcinoxénese) nestas células. O termo transdución adoita utilizarse para describir a transferencia de xenes mediada por virus en células.
A palabra transfección é unha palabra composta formada a partir de trans- e infección. Poden ser transfectados o material xenético (como o ADN de plásmido superenrolado ou construtos de ARN interferente pequeno) ou mesmo proteínas como os anticorpos.
A transfección de células animais implica tipicamente a abertura de poros transitorios ou "buratos" na membrana plasmática polos que se pode realizar a captación do material. A transfección pode levarse a cabo usando fosfato de calcio (concretamente, fosfato tricálcico), por electroporación, por deformación da célula para que pase a presión por un estreito burato (cell squeezing) ou pola mestura dun lípido catiónico co material para producir liposomas que se fusionan coa membrana celular e depositan o seu cargamento no interior.
A transfección pode orixinar morfoloxías inesperadas e anormalidades nas células diana. Terminoloxía
O significado do termo foi evolucionando. O significado orixinal de transfección era "infección por transformación", é dicir, introdución nas células de material xenético, ADN ou ARN, dun virus que infecta a un procariota ou bacteriófago, rcomo resultado dunha infección. Como o termo transformación tiña outro senso en bioloxía das células animais (un cambio xenético que permite a propagación a longo prazo en cultivo ou a adquisición de propiedades típcias das células cancerosas), o termo transfección adquiriu, para células animais, o seu significado actual de cambio nas propiedades causado pola introdución dun ADN. Métodos
Hai varios métodos para introducir ADN alleo nunha célula eucariota. Algúns dependen dun tratamento físico (electroporación, introducir células a presión (cell squeezing), nanopartículas, magnetofección); outros dependen de materiais químicos ou partículas biolóxicas (virus) que se utilizan como transportadores. A entrega de xenes é, por exemplo, un dos pasos necesarios para realizar unha terapia xénica e a modificación xenética de plantas de cultivo agrícola. Desenvolvéronse varios métodos de entrega de xenes para varios tipos de células e tecidos, desde bacterias a mamíferos. Xeralmente, os métodos poden dividirse en dúas categorías: non viral e viral.
Os métodos non virais inclúen métodos físicos como a electroporación, microinxección, escopeta de xenes, empalafección (impalefection), presión hidrostática, fusión continua e sonicación, e métodos químicos como a lipofección, que é un proceso de transfección de ADN mediada por lípidos no que se utilizan vectores liposomas. Pode tamén incluír o uso de transportadores de xenes poliméricos (poliplexos).
A entrega de xenes mediada por virus utiliza a capacidade que teñen certos virus de inxectar o seu ADN na célula hóspede. Un xene que se quere entregar á célula empaquétase nunha partícula viral que é deficiente para a súa replicación. Os virus usados ata agora foron retrovirus, lentivirus, adenovirus, virus adenoasociados e virus herpes simplex. Porén, existen inconvenientes para o uso de virus para entregar xenes nas células: os virus poden entregar só fragmentos moi pequenos de ADN ás células, o proceso require moito traballo e hai un risco por sitios de inserción aleatoria, efectos citopáticos e mutaxénese.
Métodos non virais
Transfección baseada en compostos químicos
A transfección baseada en compostos químicos pode ser dividida en varios tipos: ciclodextrina, polímeros, liposomas ou nanopartículas (con ou sen funcionalización viral ou química. Véxase máis adiante). Un dos métodos máis baratos usa o fosfato de calcio, e foi descuberto orixinalmente por F. L. Graham e A. J. van der Eb en 1973 (ver tamén). Unha solución salina tamponada con HEPES (HeBS) que contén ións fosfato combínase cunha solución de cloruro de calcio que contén o ADN que vai ser transfectado. Cando se combinan os dous, fórmase un fino precipitado do calcio cargado positivamente e o fosfato cargado negativamente, que une sobre a súa superficie o ADN que vai ser transfectado. Despois, a suspensión do precipitado engádese ás células que van ser transfectadas (xeralmente un cultivo celular en monocapa). Por un proceso que non se comprende enteiramente, as células captan parte do precipitado, e con el, o ADN. Este proceso foi un método preferido para identificar moitos oncoxenes.
Outros métodos usan compostos orgánicos altamente ramificados, denominados dendrímeros, para unirse ao ADN e entrar na célula.
Outro método é o uso de polímeros catiónicos como o DEAE-dextrano ou polietilenimina (PEI). O ADN cargado negativamente únese ao policatión e o complexo é captado pola célula por endocitose.
A lipofección (ou transfección por liposomas) é unha técnica usada para inxectar material xenético nunha célula por medio de liposomas, que son vesículas que poden doadamente fusionarse coa membrana plasmática, xa que ambos están feitos dunha bicapa fosfolipídica. A lipofección usa xeralmente un lípido cargado positivamente (liposomas catiónicos ou mesturas) para formar un agregado co material xenético cargado negativamente. Esta tecnoloxía de transfección realiza as mesmas tarefas que outros procedementos bioquímicos que utilizan polímeros, DEAE-dextrano, fosfato de calcio e a electroporación. A eficiencia da lipofección pode ser mellorada tratando as células transfectadas cun suave shock térmico.
Un fuxene é unha serie de reactivos de transcrición non liposómicos comerciais amplamente usados con capacidade de transfectar directamente unha ampla variedade de células con alta eficiencia e baixa toxicidade.
Métodos non químicos
Electroporación (electrotransferencia de xenes) é un método popular, no que o incremento transitorio da permeabilidade da membrana plasmática conséguese expoñendo as células a pulsos curtos dun campo eléctrico intenso.
O CellSqueeze usa un método inventado en 2012 por Armon Sharei, Robert Langer e Klavs Jensen no MIT. Permite a entrega de moléculas ás células por medio da deformación da membrana plasmática. É unha plataforma microfluídica libre de vectores de alto rendemento para a entrega intracelular. Reduce a posibilidade de toxicidade ou efectos fóra da diana, xa que non depende de materiais exóxenos nin de campos eléctricos.
A sonoporación usa un ultrasón de alta intensidade para inducir a formación de poros na membrana plasmática. Esta formación de poros é atribuída principalmente á cavitación de burbullas de gas que interaccionan coas membranas celulares próximas, xa que é potenciada pola adición dun axente de contraste de ultrasóns, unha fonte de núcleos de cavitación.
A transfección óptica é un método no que se xera transitoriamente un diminuto burato (de ~1 µm de diámetro) na membrana plasmática dunha célula usando un láser moi enfocado. Esta técnica foi descrita primeiro en 1984 por Tsukakoshi et al. , que usou unha frecuencia Nd: YAG triplicada para xerar transfeccións estables e transitorias en células de ril de ratas normais. Nesta técnica trátase unha soa célula de cada vez, o que a fai particularmente útil para análises dunha soa célula.
A fusión de protoplastos é unha técnica na cal as células transfectadas transformadas son tratadas con lisozima para eliminar a parede celular. Despois, utilízanse axentes fusoxénicos (por exemplo, o virus Sendai, PEG, electroporación) para fusionar o protoplasto que transporta o xene de interese coa célula receptora diana. Unha importante desvantaxe deste método é que os compoñentes bacterianos non son introducidos especificamtente na célula diana.
A empalafección (impalefection) é un método consistente en introducir ADN unido á superficie dunha nanofibra que é inserida na célula (que queda "empalada"). Esta estratexia pode tamén realizarse con matrices de nanofibras que se introducen en gran cantidade de células e tecidos intactos.
A entrega hidrodinámica é un método usado en ratos e ratas, pero en menor extensión tamén en animais meirandes, na cal o ADN normalmente en plásmidos (incluíndo os transposóns) pode ser entregado no fígado usando unha inxección hidrodinámica que implica a infusión dun volume relativamente grande de sangue en menos de 10 segundos. Por este procedemento case todo o DNA se expresa no fígado.
Métodos baseados en partículas
Entre eles están os seguintes (algúns xa mencionados antes): Unha estratexia directa para a transfección é a escopeta de xenes (gene gun), na que o ADN está acoplado a unha nanopartícula dun sólido inerte (normalmente ouro), que é despois "disparado" directamente contra o núcleo da célula diana.
A magnetofección ou transfección axudada con imán, é un método de transfección que usa a forza magnética para entregar ADN nas células diana. Os ácidos nucleicos son primeiro asociados con nanopartíclas magnéticas. Despois, a aplicación de forza magnética impulsa os complexos de partículas de ácidos nucleicos cara a e ao interior das células diana, nas que se libera o cargamento.
A empalafección é levada a cabo por células empaladas por nanoestruturas alongadas e matrices de tales nanoestruturas como as nanofibras de carbono ou nanocables de silicio que foron funcionalizadas con ADN de plásmidos.
Outro método de transfección baseado en partículas coñécese como bombardeo de partículas. O ácido nucleico é entregado por penetración nas membranas a unha alta velocidade, xeralmente conectado a microproxectís.
Outros métodos e métodos híbridos
Outros métodos de transfección son a nucleofección, que demostrou ser moi eficiente na transfección da liña celular THP-1, creando unha liña celular viable que que podía ser diferenciada en macrófagos maduros, e o shock térmico.
Métodos virais
O ADN pode tamén ser introducido nas células usando virus como transportadores. En tales casos, a técnica denomínase transdución viral, e as células dise que son transducidas. Os vectores adenovirais poden ser útiles para os métodos de transfección viral porque poden transferir xenes nunha ampla variedade de células humanas e teñen altas taxas de transferencia. Os vectores lentivirais son tamén útiles debido á súa capacidade de transducir células que non están nese momento experimentando mitose. Transfeccións estables e transitorias
A transfección estable e transitoria diferéncianse nos seus efectos a longo prazo sobre a célula. Unha célula transfectada establemente expresa de forma continua o ADN transfectado e transmíteo ás células fillas durantre a división celular, mentres que unha célula transfectada transitoriamente expresa o ADN transfectado durante un curto período de tempo e non o transmite ás súas células fillas.
Para algunhas aplicacións da transfección abonda con que o material xenético transfectado se exprese só de forma transitoria. Como o ADN introducido no proceso de transfección xeralmente non está integrado no xenoma nuclear, o ADN alleo será diluído durante a mitose ou degradado. As liñas celulares que expresan o antíxeno 1 do virus de Epstein–Barr (EBNA1) ou o antíxeno T grande de SV40, permiten a amplificación episómica de plásmidos que contiñan as orixes de replicación virais do virus de Epstein-Barr (293E) ou de SV40 (293T), reducindo grandemente a taxa de dilución.
Se se desexa que o xene transfectado permaneza realmente no xenoma da célula e as súas células fillas, debe producirse unha transfección estable. Para realizar isto, cotransféctase un xene marcador, que lle dá á célula algunhas vantaxes selectivas, como a resistencia a certas toxinas. Algunhas (moi poucas) das células transfectadas terán integrado, por casualidade, o material xenético alleo nos seus xenomas. Se a toxina é despois engadida ao cultivo cellar, só unhas poucas células que tiñan o xene marcador integrado nos seus xenomas poderán proliferar, mentres que as outras células morrerán. Despois de aplicar este estrés selectivo (presión de selección) durante certo tempo, soamente as células cunha transfección estable permanecerán e poderán seguir sendo cultivadas.
Axentes comúns para seleccionar unha transfección estable son: Xeneticina, ou G418, neutralizada polo produto do xene de resistencia á neomicina.
Puromicina.
Zeocina.
Higromicina B.
Blasticidina S. Transfección de ARN
O ARN pode ser tamén transfectado ao interior de células para que se exprese transitoriamente a proteína que codifica, ou para estudar a cinética da degradación do ARN. A transfección de ARN é a miúdo usada nas células primarias que non se dividen.
Os ARN interferentes pequenos poden tamén ser transfectados para conseguir o silenciamento de ARN (é dicir, a perda do ARN e as proteínas do xene obxectivo). Esta converteuse nunha aplicación principal en investigación para conseguir o "knock-down" de proteínas de interese (por exemplo, a endotelina-1) con aplicacións potenciais en terapia xénica. As limitacións da estratexia de silenciamento son a toxicidade da transfección para as células e os posibles efectos "fóra de diana" sobre a expresión doutros xenes/proteínas.