ADN ligase

En bioloxía molecular, a ADN ligase (ou DNA ligase) é un tipo específico de encima ligase (EC 6. 5. 1. 1) que facilita a unión dos extremos de dúas febras de ADN ao catalizar a formación dun enlace fosfodiéster. Xoga un importante papel na replicación do ADN e na reparación de roturas de febra simple no ADN dúplex nos organismos vivos, pero algunhas formas (como a ADN ligase IV) poden reparar especificamente roturas de dobre febra (é dicir, que afectan a ambas as febras do ADN). Cando son reparadas as roturas de febra simple, a ADN ligase xera o enlace fosfodiéster final para rematar coa reparación.
A ADN ligase utilízase de forma natural polas células para a reparación e a replicación do ADN. Ademais, ten amplas aplicacións nos laboratorios de bioloxía molecular para os experimentos de ADN recombinante. A ADN ligase purificada utilízase na clonación de xenes para unir moléculas de ADN e formar ADN recombinante. Mecanismo da ligase
O mecanismo utilizado pola ADN ligase é formar dous enlaces fosfodiéster covalentes entre o extremo 3' hidroxilo dun nucleótido, ("aceptor") co extremo 5' fosfato doutro ("doante"). Con moitas das ADN ligases requírese ATP para esta reacción, que se realiza en tres etapas: adenilación (adición de AMP) dun residuo de lisina no centro activo do encima, con liberación de pirofosfato;
transferencia dun AMP ao fosfato 5' do denominado doante e formación dun enlace fosfodiéster;
formación dun enlace fosfodiéster entre o fosfato 5' do doante e o hidroxilo 3' do aceptor. A ligase pode funcionar en ADN con extremos coherentes e tamén con extremos romos, aínda que neste último caso se requiren altas concentracións de encima e diferentes condicións de reacción. Tipos de ligases
ADN ligase de E. coli
A ADN ligase de E. coli é codificada polo xene lig. A ADN ligase de Escherichia coli, igual ca as de moitos procariotas, usa a enerxía obtida clivando o dinucleótido de nicotinamida e adenina (NAD) para crear o enlace fosfodiéster. Non liga ADN con extremos romos a non ser en condicións de ateigamento molecular con polietilenglicol, e non pode unir eficazmente ARN a ADN.
ADN ligase de T4
A ADN ligase do bacteriófago T4 é a ligase máis usada comercialmente en investigación de laboratorio. Pode ligar extremos cohesivos ou "pegañosos" de ADN, oligonucleótidos, e híbridos de ARN ou de ARN-ADN, pero non ácidos nucleicos monocatenarios. Pode tamén ligar ADNs con extremos romos con moita maior eficacia ca a ADN ligase de Escherichia coli. A diferenza da ADN ligase de E. coli, a de T4 non pode utilizar o NAD, e ten unha necesidade absoluta do ATP como cofactor. Fixéronse algunhas modificacións de enxeñaría para mellorar a actividade in vitro da ADN ligase de T4; un enfoque que tivo éxito foi a fusión da ADN ligase de T4 a varias proteínas de unión ao ADN alternativas, na que se atopou que o construto coa proteína p50 ou con NF-κB como compañeiros de fusión era un 160% máis activo na ligazón de extremos romos para propósitos de clonación ca a ADN ligase de T4 de tipo natural (salvaxe).
Ligases de mamífero
En mamíferos, hai catro tipos específicos de ligases, que son: ADN ligase I: liga o ADN nacente da fibra retardada despois de que a ribonuclease H eliminou o cebador de ARN do fragmento de Okazaki.
A ADN ligase III: forma complexos coa proteína de reparación do ADN XRCC1 para axudar a unir o ADN durante o proceso de reparación de excisión de nucleótido e fragmentos recombinantes. De todas as ADN ligases de mamíferos coñecidas, a Lig III é a única que está presente nas mitocondrias.
ADN ligase IV: forma complexos con XRCC4. Cataliza o paso final na vía de reparación de roturas de dobre febra de ADN de unión de extremos non homólogos. Tamén cómpre a súa intervención na recombinación V(D)J, o proceso que xera diversidade nos loci das inmunoglobulinas e no receptor de células T (TCR) durante o desenvolvementodo sistema inmunitario.
As ADN ligases de eucariotas e a dalgúns microbios usan o ATP en vez do NAD.
Ligases termoestables
Clonáronse e secuenciáronse as ligases de varias bacterias termófilas, e están dispoñibles comercialmente para o seu uso en reaccións de amplificación de ligase debido ás súas propiedades termoestables. Medida da actividade de ligase
Hai polo menos tres unidades que se poden utilizar para medir a actividade da ADN ligase: Unidade Weiss: cantidade de ligase que cataliza o intercambio de 1 nmol de 32P desde o pirofosfato inorgánico ao ATP en 20 minutos a 37 °C. Este é un dos máis comunmente usados.
Unidade Modrich-Lehman: úsase pouco, e defínese como a cantidade de encima necesario para converter 100 nmoles de d(A-T)n a unha forma resistente á exonuclease-III en 30 minutos en condicións estándar.
Moitos fornecedores comerciais de ligases usan unha unidade arbitraria baseada na capacidade da ligase de ligar extremos cohesivos. Estas unidades son ás veces máis subxectivas que cuantitativas e carecen de precisión. Aplicacións en investigacións de bioloxía molecular
As ADN ligases convertéronse en ferramentas indispensables en investigación na moderna bioloxía molecular para xerar secuencias de ADN recombinantes. Por exemplo, as ADN ligases utilízanse con encimas de restrición para inserir fragmentos de ADN, xeralmente xenes, en plásmidos.
Para realizar eficazmente experimentos de recombinación que impliquen a ligazón de fragmentos con extremos cohesivos é fundamental controlar que haxa unha temperatura óptima. A maioría dos experimentos usan a ADN ligase de T4 (illada do bacteriófago T4), que ten a máxima actividade a 37 °C. Porén, para unha óptima eficacia na ligazón con fragmentos de extremos cohesivos ("pegañosos"), a temperatura óptima do encima debe equilibrarse coa temperatura de fusión (Tm) dos extremos cohesivos que van ser unidos, porque o apareamento homólogo dos extremos cohesivos non será estable se a temperatura altera as pontes de hidróxeno. Unha reacción de ligazón é máis eficaz cando os extremos cohesivos están xa aliñados (annealed, formando dobre cadea) establemente, e a distorsión deste anelamento causaría unha baixa eficacia na ligazón. Canto máis curto sexa a parte que sobresae da febra de ADN no extremo, menor será a Tm.
Como os fragmentos de ADN de extremos romos non teñen extremos cohesivos que aliñar (anneal), a temperatura de fusión non é un factor a considerar dentro do rango normal de temperaturas da reacción de ligazón. Porén, canto maior sexa a temperatura, menores son as posibilidades de que os extremos que van ser unidos se alineen para permitir a ligazón (as moléculas móvense máis dentro da solución canto maior é a temperatura). O factor limitante na ligazón de extremos romos non é a actividade de ligase senón o número de alineamentos que ocorran entre os extremos dos fragmentos de ADN. A temperatura de ligazón máis eficaz para ADN de extremos romos será, por tanto, a temperatura á cal se produza o maior número de alineamentos. A maioría de ligazóns de extremos romos lévanse a cabo a 14-25 °C durante toda unha noite. A ausencia de extremos anelados de forma estable tamén significa que a eficacia da ligazón estará diminuída, e será necesario usar unha maior concentración de ligase. Historia
A primeira ADN ligase foi purificada e caracterizada en 1967. As ADN ligases habitualmente dispoñibles comercialmente descubríronse orixinalmente no bacteriófago T4, en E. coli e outras bacterias.