Lipidómica

A lipidómica é o estudo a grande escala das vías e redes nas que interveñen os lípidos nos sistemas biolóxicos O termo "lipidoma" utilízase para describir o perfil lipídico completo dunha célula, tecido, organismo ou ecosistema e é unha parte do "metaboloma", o cal tamén inclúe as outras tres grandes clases de moléculas biolóxicas: proteínas/aminoácidos, azucres e ácidos nucleicos. A lipidómica é un campo de investigación relativamente recente que foi impulsado polos rápidos avances en tecnoloxías como a espectrometría de masas, espectroscopia de resonancia magnética nuclear, espectroscopia de fluorescencia, interferometría de polarización dual e métodos computacionais, acoplados co recoñecemento do papel dos lípidos en moitas doenzas metabólicas como a obesidade, aterosclerose, accidente cerebrovascular, hipertensión e diabetes. Este campo en rápida expansión complementa o enorme progreso feito en xenómica e proteómica, todos os cales constitúen a familia da bioloxía de sistemas.
A investigación lipidómica implica a identificación e cuantificación de miles de especies moleculares de lípidos celulares e as súas interaccións con outros lípidos, proteínas, e outros metabolitos. Os investigadores en lipidómica examinan as estruturas, funcións, interaccións, e dinámica dos lípidos celulares e os cambios que ocorren durante a perturbación do sistema.
Han e Gross foron os primeiros en definir o campo da lipidómica ao integraren as propiedades químicas específicas inherentes de especies moleculares de lípidos cun enfoque baseado nunha espectrometría de masas completa. Aínda que a lipidómica está baixo a éxida do campo máis xeral da "metabolómica", a lipidómica é unha disciplina propia debido ao carácter único e especificidade funcional dos lípidos en relación con outros metabolitos.
Na investigación lipidómica, unha vasta cantidade de información que describe cuantitativamente as alteracións espaciais e temporais no contido e composición de diferentes especies moleculares de lípidos obtense despois de perturbar unha célula por medio de cambios no seu estado fisiolóxico ou patolóxico. A información obtida nestes estudos facilita o estudo dos mecanismos polos que se producen os cambios no funcionamento celular. Por tanto, os estudos lipidómicos xogan un papel esencial na definición dos mecanismos bioquímicos dos procesos de doenzas relacionadas con lípidos por medio da identificación de alteracións no metabolismo lipídico celular, tráfico de substancias e homeostase. O crecente interese na investigación en lipidómica pode verse en iniciativas como LIPID Metabolites And Pathways Strategy (LIPID MAPS Consortium) e The European Lipidomics Initiative (ELIfe). Diversidade estrutural dos lípidos
Os lípidos son un grupo diverso e omnipresente de compostos que desempeñan moitas funcións biolóxicas clave, como actuar como compoñentes estruturais das membranas celulares, servindo como fontes de enerxía almacenable e participando en vías de sinalización. Os lípidos poden ser, grosso modo, definidos como pequenas moléculas hidrófobas ou anfipáticas que orixinan enteiramente ou en parte a partir de dous tipos de subunidades bioquímicas ou "bloques de construción", que son os grupos cetoacilo e isopreno. A enorme diversidade estrutural que se encontra nos lípidos débese ás variadas combinacións que se forman con estes bloques de construción nas biosínteses. Por exemplo, os glicerofosfolípidos están compostos por un esqueleto de glicerol ligado a un dos aproximadamente 10 grupos de cabeza polar posibles e tamén a 2 cadeas de acilo graxo/alquilo graxo, as cales á súa vez poden ter 30 ou máis estruturas moleculares diferentes. Na práctica, non se detectaron experimentalmente todas as posibles permutacións, debido ás preferencias por determinadas cadeas dependendo do tipo celular e tamén dos límites de detección; con todo, detectáronse varios centos de especies moleculares de glicerofosfolípidos en células de mamíferos.
Porén, as membranas dos tilacoides dos cloroplastos das plantas, teñen unha composición lipídica singular, xa que son deficientes en fosfolípidos. Ademais, os seus principais constituíntes, o monogalactosil diglicérido ou MGDG, non forma bicapas acuosas. Non obstante, os estudos dinámicos revelan unha organización normal de bicapa lipídica nas membranas dos tilacoides. Técnicas experimentais
Extracción de lípidos
A maioría dos métodos de extracción e illamento de lípidos de mostras biolóxicas aproveitan a alta solubilidade das cadeas hidrocarbonadas en solventes orgánicos. Dada a gran diversidade de clases de lípidos, non é posible utilizar con todas as clases un método de extracción común. O procedemento de Bligh/Dyer tradicional usa protocolos baseados no cloroformo/metanol que inclúen a partición de fases na capa orgánica. Estes protocolos funcionan relativamente ben para a unha ampla variedade de lípidos fisioloxicamente relevantes, pero teñen que ser adaptados para químicas lipídicas complexas e metabolitos lipídicos pouco abundantes e lábiles.
Cando se utilizaba solo orgánico, o tampón citrato na mestura de extracción rendía maiores cantidades de fosfato de lípidos que o tampón acetato, o Tris, a H2O ou o tampón fosfato.
Separación de lípidos
O método máis simple de separación de lípidos é a cromatografía en capa fina. Aínda que non é tan sensible coma outros métodos de detección de lípidos, ofrece unha ferramenta rápida e completa de cribado antes de usar técnicas máis sofisticadas e sensibles.
A cromatografía de extracción en fase sólida é útil para unha separación rápida preparativa de mesturas de lípidos crúas en diferentes clases de lípidos. Isto implica o uso de columnas preempaquetadas que conteñen sílice ou outras fases estacionarias para separar glicerofosfolípidos, ácidos graxos, ésteres do colesterol, glicerolípidos, e esterois a partir de mesturas de lípidos crúas.
Está moi estendido o uso da cromatografía líquida de alto rendemento (HPLC ou LC, do inglés High performance liquid chromatography ou Liquid chromatography) en análises lipidómicos para separar lípidos antes da análise de masas. A separación pode alcanzarse tanto por cromatografía líquida de alto rendemento en fase normal (NP-HPLC, do inglés Normal phase-HPLC) coma en fase inversa (RP-HPLC, do inglés Reverse phase-HPLC). Por exemplo, a NP-HPLC separa con grande efectividade glicerofosfolípidos baseándose na polaridade dos seus grupos da cabeza, mentres que a RP-HPLC é efectiva separando ácidos graxos como os eicosanoides baseándose na lonxitude da súa cadea, grao de insaturación e substitución. Para estudos lipidómicos globais non dirixidos a moléculas concretas é común usar tanto RP-HPLC coma NP-HPLC ou columnas de cromatografía líquida de interacción hidrofílica (HILC, do inglés Hydrophilic interaction liquid chromatrography) para aumentar a cobertura do lipidoma analizado. Isto pode ser mellorado con columnas de alto rendemento (UPLC, do inglés Ultra-performance liquid chromatography con tamaño de partículas de 2, 1 mm ID & sub-2 µm) ou columnas baseadas na tecnoloxía de núcleo sólido (con tamaños de partículas de 2, 1 mm ID & 2, 6 µm). As columnas de UHPLC permiten unha separación de alta resolución de lípidos complexos cunha capacidade pico e sensibilidade incrementadas, mentres que as columnas de núcleo sólido conseguen o mesmo en tempos máis breves sobre bombas HPLC normais. A separación cromatográfica (HPLC/UHPLC) de lípidos pode realizarse offline ou online mentres que o eluato é integrado coa fonte de ionización dun espectrómetro de masas.
Detección de lípidos
O progreso da moderna lipidómica foi moi acelerado polo desenvolvemento de métodos espectrofotométricos en técnicas de ionización suaves e xerais para espectrometría de masas como a ionización de electrospray (ESI), a ionización de electrospray de desorción (DESI) e a desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI) en particular. A ionización "suave" non causa unha ampla fragmentación, así que a detección completa dun rango completo de lípidos nunha mestura complexa pode correlacionarse coas condicións experimentais ou estados de enfermidades. Ademais, a técnica da ionización química a presión atmosférica (APCI) está sendo cada vez máis usada para a análise de lípidos non polares.
ESI MS
A ESI-MS (do inglés Electrospray ionization-Mass spectrometry ou espectroscopía de masas de ionización de electrospray) foi desenvolvida inicialmente por Fenn e colegas para a análise de biomoléculas. Depende da formación de ións gasosos a partir de moléculas polares termicamente lábiles e principalmente non volátiles, polo que é completamente adecuado para diversos lípidos. É un método de ionización suave que raramente distorsiona a natureza química do analito antes dunha análise de masas. Desenvolvéronse varios métodos de ESI-MS para a análise de distintas clases, subclases e especies lipídicas individuais de extractos biolóxicos. Publicouse recentemente unha revisión completa dos métodos e da súa aplicación. As principais vantaxes da ESI-MS son a súa alta precisión, sensibilidde, reproducibilidade e a aplicabilidade da técnica para solucións complexas sen previa derivación. Han e colegas desenvolveron un método chamado "escopeta lipidómica", que implica a infusión directa dun extracto lipídico cru nunha fonte de ESI optimizada para a separación intrafonte de lípidos baseada nas súas propiedades eléctricas intrínsecas.
DESI MS
A espectroscopia de masas de ionización de electrospray de desorción (DESI-MS, do inglés Desorption electrospray ionization-Mass spectroscopy) é unha técnica de ionización ambiental desenvolvida polo profesor Zoltan Takáts, et al. , no grupo do profesor Graham Cooks da Universidade Purdue. Combina as técnicas da ESI e a ionización de desorción, dirixindo unha néboa cargada electricamente á superficie da mostra que está a só uns poucos milímetros de distancia. A técnica foi plicada exitosamente á lipidómica como ferramenta de obtención de imaxes para mapar as distribucións lipídicas en espécimes de tecidos. Unha das vantaxes da DESI MS é que non necesita unha matriz para a preparación do tecido, o que permite facer moitas medicións consecutivas no mesmo espécime de tecido.
MALDI MS
A espectroscopia de masas de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-MS, do inglés Matrix-assisted laser desorption/ionization-Mass spectroscopy) é un método de ionización suave baseado no láser que adoita usarse para a análise de proteínas grandes, pero que foi tamén usado con éxito para lípidos. O lípido mestúrase cunha matriz, como o ácido 2, 5-dihidroxibenzoico, e aplícase nun recipiente de mostras como un pequeno punto. Dispárase un láser sobre o punto, e a matriz absorbe a enerxía, que é despois transferida ao analito, e prodúcese como resultado a ionización da molécula. A espectroscopia de masas con MALDI-Time-of-flight (MALDI-TOF MS) converteuse nun método moi prometedor para os estudos lipidómicos, especialmente para a obtención de imaxes dos lípidos de preparacións de tecidos.
APCI MS
A fonte para a ionización química a presión atmosférica ou APCI (do inglés Atmospheric pressure chemical ionization) é similar á ESI excepto en que os ións se forman pola interacción do solvente do analito quentado cunha agulla de descarga coroa a un alto potencial eléctrico. Os ións primarios fórmanse inmediatamente arredor da agulla, e estes interaccionan co solvente para formar ións secundarios que finalmente ionizan a mostra. A APCI é especialmente útil para a análise de lípidos non polares como os triacilglicerois, esterois, e ésteres de ácidos graxos. Técnicas de obtención de imaxes
A alta sensibilidade da DESI no rango dos lípidos convértea nunha poderosa técnica de detección e mapado das abundancias de lípidos en espécimes de tecidos. Desenvolvementos recentes nos métodos de MALDI permiten a deteción directa de lípidos in situ. Prodúcense abundantes ións relacionados con lípidos pola análise directa de preparacións de tecidos delgadas cando se obteñen os espectros secuenciais a través da superficie dun tecido que foron cubertas cunha matriz de MALDI. A activación colisional dos ións moleculares pode utilizarse para determinar a familia lipídica da molécula e a miúdo definir estruturalmente a especie molecular. Estas técnicas permiten a detección de fosfolípidos, espfngolípidos e glicerolípidos en tecidos como o corazón, riles e cerebro. Ademais, a distribución de moitas especies moleculares de lípidos diferentes adoitan definir rexións anatómicas dentro deses tecidos. Perfil lipidómico
O perfil lipidómico é unha plataforma metabolómica dirixida a diana que proporciona unha análise completa de especies lipídicas dentro dunha célula ou tecido. Os perfís baseados en espectroscopia de masas en tándem de ionización de electrospray (ESI-MS/MS, do inglés electrospray ionization tandem mass spectrometry) pode proporcionar datos cuantitativos e é adaptable a análises de alto rendemento. O poderoso enfoque dos transxénicos, concretamente a deleción e/ou sobreexpresión dun produto xénico acoplado coa lipidómica, pode dar importantes informacións sobre o papel das vías bioquímicas. As técnicas de perfil lipídico tamén foron aplicadas a plantas e microorganismos como o lévedo. Unha combinación de datos lipidómicos cuantitativos en conxunción cos datos transcricionais correspondentes (usando métodos de gene-array) e datos proteómicos (usando espectroscopia de masas en tándem) permite un enfoque de bioloxía de sistemas para unha comprensión máis profunda das vías de sinalización ou metabólicas de interese. Informática
Un dos principais retos da lipidómica, en particular para as estratexias baseadas en espectroscopia de masas, ten que ver coas demandas bioinformátic as e cumputacionais de manexar a gran cantidade de datos que se orixinan en varias etapas ao longo da cadea de adquisicón de información e do seu procesamento. A recollida de datos de espectroscopia de masas e cromatográficos require esforzos substanciais no aliñamento espectral e a avaliación estatística de flutuacións nas intensidades dos sinais. Tales variacións teñen múltiples orixes, incluíndo as variacións biolóxicas, a manipulación das mostras e a exactitude analítica. Como consecuencia cómpre facer normalmente varias replicacións dos traballos para a determinación fiable dos niveis de lípidos en mesturas complexas. Nos últimos anos, varias compañías desenvolveron diversos paquetes de software e grupos de investigación para analizar datos xerados polo perfil de espectroscopia de masas de metabolitos, incluíndo lípidos. O procesamento de datos para un perfil diferencial xeralmente faise en varias etapas, incluíndo a manipulación de arquivos de input, filtrado espectral, detección de picos, aliñamento cromatográfico, normalización, visualización, e exportación de datos. Un exemplo de software de perfís metabólicos é a aplicación Mzmine baseada en Java gratuíta. Algúns paquetes de software como Markerview inclúen análises estatísticas multivariadas (por exemplo, análises de compoñente principal) e estes serán útiles para a identificación de correlacións en metabolitos lipídicos que están asociados cun fenotipo fisiolóxico, en particular para o desenvolvemento de biomarcadores baseados en lípidos. Outros obxectivos da área da tecnoloxía de información da lipidómica implica a construción de mapas metabólicos a partir dos datos en estruturas de lípidos e proteínas relacionadas con lípidos e xenes. Algúns destas vías lipídicas son extremadamente complexas, por exemplo a vía glicoesfingolipídica dos mamíferos. O establecemento de bases de datos interactivas e nas que se poden facer buscas de lípidos e xenes/proteínas relacionadas con lípidos é tamén un recurso extremadamente importante como unha referencia para a comunidade lipidómica. A integración destas bases de datos con espectroscopia de masas e outros datos experimentais, así como con redes metabólicas ofrece unha oportunidade para idear estratexias terapéuticas para previr ou inverter estes estados patolóxicos que implican disfunción de procesos relacionados con lípidos.