DAPI

O DAPI ou 4′, 6-diamidino-2-fenilindol é unha tinguidura fluorescente que se une fortemente a rexións ricas en adenina–timina no ADN. É amplamente utilizado en microscopía de fluorescencia. Como o DAPI pode atravesar unha membrana celular intacta, pode utilizarse tanto con células vivas coma fixadas, aínda que pasa con máis dificultade polas membranas de células vivas, orixinando unha tinguidura menos efectiva. Historia
O DAPI foi sintetizado por primeira vez en 1971 no laboratorio de Otto Dann como parte dunha investigación sobre fármacos para tratar a tripanosomíase. Aínda que probou ser insatisfactorio como fármaco, posteriores investigacións indicaron que se unía fortemente ao ADN e facíase máis fluorescente cando está unido. Isto fixo que se utilizase para identificar o ADN mitocondrial en ultracentrifugación en 1975, o primeiro uso rexistrado do DAPI como unha tingidura de ADN fluorescente.
A forte fluorescencia que mostra cando se une ao ADN levou á súa rápida adopción para a tinguidura fluorescente do ADN por microscopía de fluorescencia. O seu uso para detectar o ADN en células de plantas, metazoos e bacterias e partículas de virus foi demostrado a finais da década de 1970, e a tinguidura cuantitativa do ADN no interior das células demostrouse en 1977. O uso do DAPI como tinguidura do ADN para citometría de fluxo foi tamén demostrada nesa época. Propiedades fluorescentes
Cando se une a un ADN bicatenario o DAPI ten un máximo de absorción a unha lonxitude de onda de 358 nm (ultravioleta) e o seu máximo de emisión é a 461 nm (azul). Por tanto, para a microscopía de fluorescencia o DAPI é excitado con luz ultravioleta e é detectado por medio dun filtro azul/ciano. O pico de emisión é bastante ancho. O DAPI tamén se une ao ARN, pero non é tan fortemente fluorescente. A súa emisión cambia a uns 500 nm cando se une ao ARN. A emisión azul do DAPI é conveniente para os microscopistas que desexan utilizar múltiples tinguiduras fluorescentes nunha soa mostra. Hai algún solapamento de fluorescencia entre o DAPI e moléculas verdes fluorescentes como a fluoresceína e a proteína fluorescente verde (GFP), pero o efecto disto é pequeno. O uso de desmestura espectral (spectral unmixing) pode explicar este efecto se cómpre facer análises de imaxes precisas.
Fóra da microscopía de luz fluorescente analítica, o DAPI é tamén moi usado para etiquetaxe en cultivos celulares para detectar o ADN de virus ou micoplasmas contaminantes. O micoplasma ou virus etiquetado no medio de crecemento fluoresce unha vez que foi tinguido co DAPI facendo que sexa doado de detectar. Modelaxe das propiedades de absorción e fluorescencia
Esta sonda de ADN fluorescente foi recentemente modelada usando a teoría do funcional de densidade dependente do tempo, acoplada coa versión IEF do modelo do continuo polarizable. Este modelo de mecánica cuántica racionalizou o comportamento de absorción e fluorescencia dado pola unión ao suco menor e a intercalación no peto de ADN, en canto á flexibilidade estrutural reducida e a polarización. Células vivas e toxicidade
O DAPI pode utilizarse para a tinguidura de células fixadas. A concentración de DAPI necesaria para a tinguidura de células vivas é xeralmente moi alta e raramente se usa para células vivas. Está etiquetado como non tóxico na súa folla de datos de seguridade e aínda que non mostrou ter mutaxenicidade en E. coli, está sinalado como un mutáxeno coñecido nas etiquetas de información dos fabricantes. Como é un composto que se une ao ADN, é probable que teña polo menos un baixo nivel de propiedades mutaxénicas e debe terse coidado cando se manexa ou se tira. Alternativas
As tinguiduras Hoechst son similares ao DAPI porque son ambas tinguiduras para o ADN azuis fluorescentes compatibles para aplicacións con células vivas ou fixadas, así como son visibles usando o mesmo equipamento de filtro.