Transformación xenética

En bioloxía molecular denomínase transformación á alteración xenética dunha célula como resultado da captación a través da membrana celular, incorporación e expresión de material xenético exóxeno (ADN exóxeno) do medio que a rodea. A transformación ten lugar de forma natural nalgunhas especies de bacterias (transformación bacteriana), pero pode tamén efectuarse por medios artificiais noutras células. Para que se produza a transformación, as bacterias deben estar nun estado chamado competente ou de competencia, que pode acontecer como unha resposta por tempo limitado ás condicións ambientais como escaseza de nutrientes e densidade celular. A transformación é un dos tres procesos polos cales o material xenético exóxeno pode introducirse nunha célula bacteriana; os outros dous son a conxugación bacteriana (na que as células transfiren ADN por contacto directo) e a transdución (na que un virus transporta xenes dunha bacteria a outra). O termo "transformación" pode utilizarse tamén para describir a inserción de novo material xenético en células non bacterianas, como fungos, plantas e animais, pero especialmente para os animais prefírese usar o termo transfección para non confundila coa "transformación" celular que ten lugar durante o cáncer. A introdución de ADN alleo en células eucariotas denomínase "transfección". Historia
A transformación foi descuberta en 1928 polo bacteriólogo británico Frederick Griffith. Griffith estaba traballando co Streptococcus pneumoniae, bacteria que ten dúas cepas, unha virulenta ou S e outra non virulenta ou R. Griffith descubriu que a cepa non virulenta de Streptococcus pneumoniae podía ser transformada en virulenta se a mesturábamos con bacterias da cepa virulenta mortas por calor. Griffith supuxo que algún "principio transformante" pasaba das células mortas virulentas ás células vivas non virulentas, que dese modo se transformaban en virulentas, pero non puido identificar que substancia era o principio transformador. En 1944 Oswald Avery, Colin MacLeod, e Maclyn McCarty identificaron o principio transformador como o ADN, o que serviu para demostrar que o ADN é a molécula que contén a información xenética nas células (o que ata entón se poñía en dúbida). Parte do ADN dos Streptococcus S pasaba ás células R, provocando a transformación.
Pensábase inicialmente que Escherichia coli, unha bacteria utilizada correntemente como organismo de laboratorio, non podía experimentar transformación. Porén, en 1970, Morton Mandel e Akiko Higa demostraron que E. coli pode ser inducida a captar ADN do bacteriófago λ sen ter que utilizar fagos axudantes despois de ser tratada con solucións de cloruro de calcio. Dous anos despois en 1972, Stanley Cohen, Annie Chang e Leslie Hsu demostraron que o tratamento con CaCl2 é tamén efectivo para a transformación de ADN de plásmidos. O método de transformación de Mandel e Higa foi despois mellorado por Douglas Hanahan. O descubrimento da existencia de competencia inducida artificialmente en E. coli proporcionou un eficiente e útil procedemento para provocar a transformación de bacterias, que permitiu simplificar os métodos de clonaxe molecular en biotecnoloxía e investigación, e que se converteu nun procedemento de rutina nos laboratorios.
A transformación utilizando electroporación desenvolveuse a finais da década de 1980, e incrementou a eficiencia da transformación in vitro e o número de cepas bacterianas que se podían transformar. A transformación de células animais e vexetais investigouse no primeiro rato transxénico que se creou, inxectando un xene dunha hormona de crecemento da rata nun embrión de rato en 1982. En 1907 descubriuse que a bacteria Agrobacterium tumefaciens causaba tumores nas plantas, e a principios da década de 1970 descubriuse que o axente indutor de tumores era un plásmido chamado plásmido Ti. Eliminando os xenes do plásmido que causaban o tumor e engadindo novos xenes os investigadores estiveron en condicións de poder infectar plantas con A. tumefaciens para que a bacteria inserise o ADN seleccionado nos xenoma das plantas. Non todas as plantas son susceptibles ás infección por A. tumefaciens polo que se desenvolveron métodos alternativos como a electroporación e a microinxección. O bombardeo de partículas fíxose posible coa invención da "pistola (canón, escopeta) de xenes" ou biolística por John Sanford en 1990. Mecanismos
Bacterias
A transformación bacteriana pode definirse como o cambio xenético estable producido pola captación de ADN espido (ADN sen células asociadas ou proteínas), e a competencia como o estado no que a bacteria pode captar o ADN exóxeno do medio que a rodea. Hai dúas formas de competencia: natural e artificial.
Competencia natural
Aproximadamente o 1% das especies bacterianas poden captar de forma natural ADN nas condicións de laboratorio, e máis especies poden captalo nos seus ambientes naturais. O ADN pode transferirse entre diferentes cepas de bacterias, nun proceso que se denomina transferencia horizontal de xenes. Algunhas especies cando a célula morre liberan o seu ADN que pode ser captado por outras células, pero a transformación funciona mellor con ADN de especies moi emparentadas. Estas bacterias competentes de forma natural teñen conxuntos de xenes que proporcionan a maquinaria proteica necesaria para transportar o ADN a través das membranas celulares. O transporte de ADN exóxeno nas células pode requirir proteínas que están implicadas na ensamblaxe de pili de tipo IV e sistemas de secreción de tipo II (T2SS), xunto cun complexo ADN translocase na membrana plasmática. Debido ás diferenzas de estrutura das envolturas celulares das bacterias grampositivas e gramnegativas, hai tamén algunhas diferenzas nos mecanismos da captación do ADN entre estas células, pero a maioría delas comparten características comúns que implican a proteínas relacionadas. O ADN únese primeiro á superficie de células competentes nun receptor do ADN, e pasa a través da membrana plasmática utilizando unha ADN translocase. Só pode atravesar o ADN monocatenario, polo que unha nuclease degrada a outra cadea durante o proceso, e o ADN monocatenario translocado pode despois integrarse no cromosoma bacteriano por medio dun proceso dependente de RecA. Nas células gramnegativas, debido á presenza dunha membrana extra, o ADN require a presenza de canais formados por secretinas na membrana externa da súa parede. Poden requirirse pilinas para que exista competencia, pero non está claro. A captación do ADN xeralmente non é específico de secuencia, aínda que nalgunhas especies a presenza de secuencias de captación de ADN específicas pode facilitar a captación eficiente do ADN.
Competencia artificial
A competencia artificial pode inducirse por procedementos de laboratorio nos que primeiro hai que facer a célula pasivamente permeable ao ADN ao expoñela a condicións que normalmente non se darían na natureza. Normalmente o que se fai é incubar as células nunha solución que contén catións divalentes, xeralmente unha solución de cloruro de calcio a temperatura baixa, e despois expoñela a un shock por un pulso de calor. Porén, o mecanismo de captación de ADN por medio da competencia inducida quimicamente por este método de transformación por cloruro de calcio non está claro. A superficie de bacterias como E. coli está cargada negativamente debido aos fosfolípidos e lipopolisacáridos da súa superficie, e o ADN está tamén cargado negativamente (deberían repelerse). Unha das funcións do catión divalente sería apantallar as cargas por coordinación dos fosfatos e outras cargas negativas, o que permitiría que a molécula de ADN se adherise á superficie. Suxeriuse que a exposición das células a catións divalentes en condicións frías pode tamén cambiar ou debilitar a estrutura da superficie celular facéndoa máis permeable ao ADN. O pulso térmico pénsase que crea un desequilibrio térmico entre os dous lados da membrana, que forza ao ADN a entrar na célula por poros celulares ou por zonas danadas da parede celular.
A electroporación é outro método de facer a unha célula competente. Neste método as células son sometidas durante breve tempo a un campo eléctrico de 10-20 kV/cm que se pensa crea buratos na membrana celular a través dos cales poden entrar os plásmidos. Despois do shock eléctrico os buratos volven a pecharse rapidamente polos mecanismos de reparación da membrana celulares.
Lévedos
A maioría das especies de lévedos, incluíndo Saccharomyces cerevisiae, poden ser transformados por ADN exóxeno presente no medio natural ou en condicións de laboratorio. Ao expoñer lévedos intactos a catións alcalinos como os de cesio ou litio as células poden captar plásmidos de ADN. Os últimos protocolos adaptan este método de transformación utilizando acetato de litio, polietilenglicol, e ADN monocatenario. Nestes protocolos, o ADN monocatenario únese preferentemente á parede celular do lévedo, impedindo que o ADN do plásmido faga o mesmo e deixándoo dispoñible para a transformación.
A dixestión encimática, a electroporación, ou a axitación con partículas de cristal pode utilizarse tamén para a transformación de células de lévedos.
Plantas
Existen varios métodos para transferir ADN a células de plantas: A transformación mediada pola bacteria Agrobacterium é o método máis doado e simple de transformación. O tecido da planta (xeralmente follas) córtase en pequenos cachos, por exemplo, de 10x10mm, e mergúllanse durante 10 minutos nun fluído que contén en suspensión células de Agrobacterium. Ao longo da zona do corte algunhas células serán transformadas polas bacterias, as cales inserirán o seu ADN na célula. Situada nun medio seleccionado de crecemento e enraizamento, a planta volverá medrar. Algunhas especies de plantas poden ser transformadas simplemente metendo as súas flores na suspensión de Agrobacterium e despois plantando as sementes nun medio selectivo. Pero por desgraza moitas plantas non son transformables por este método.
Bombardeo con partículas. Prepáranse partículas de ouro ou volframio cubertas de ADN e dispáranse cun aparato en células dunha planta nova ou dun embrión de planta. Parte do material xenético permanecerá dentro das células e causará a súa transformación. Este método tamén permite a transformación dos plastidios das plantas. A eficiencia da transformación é menor ca no método da Agrobacterium, pero a maioría das plantas poden ser transformadas deste modo.
Electroporación. Provócase a formación de pequenos buracos transitorios na membrana celular aplicando rápidos shocks eléctricos; isto permitirá que entre o ADN e transforme a planta.
Transformación viral (transdución). O material xenético desexado empaquétase dentro dun virus de planta axeitado e inféctase a planta con el. Se o material xenético é ADN, pode recombinarse cun cromosoma e producir células transformantes. Porén, os xenomas da maioría dos virus de plantas son de ARN monocatenario, que se replica no citoplasma da célula infectada. En tales xenomas este método é unha forma de transfección e non unha verdadeira transformación, xa que os xenes inseridos nunca chegan ao núcleo celular e non se integran no xenoma do hóspede. A proxenie das plantas infectadas está libre de virus e tamén libre do xene inserido.
Animais
A introdución de ADN en células animais denomínase xeralmente transfección.