Pseudoxene

Os pseudoxenes son secuencias nucleotídicas similares a xenes pero consideradas non funcionais, que perderon a súa capacidade de codificar proteínas ou dalgún outro modo xa non se expresan na célula. Aínda que algúns carecen de intróns ou promotores (como ocorre nos pseudoxenes procesados, que foron copiados dun ARNm e incorporados ao cromosoma), a maioría teñen algunhas características típicas dos xenes, como promotores, illas CpG, e sitios de empalme, pero son considerados non funcionais debido a que non teñen capacidade de codificar proteínas como resultado de varias discapacidades xenéticas, como codóns de stop prematuros, corremento da pauta de lectura, ou falta de transcrición, ou a súa incapacidade de codificar ARN (como no caso dos pseudoxenes de ARNr). Así, o termo acuñado en 1977 por Jacq, et al. , significa "falso xene".
Como en xeral se cre que os pseudoxenes son o último paso ao que chega o material xenético que vai ser eliminado do xenoma, frecuentemente se consideran como ADN lixo, aínda que os indicios de certa funcionalidade atopada nuns poucos pseudoxenes nos últimos anos podería matizar esta idea. Estes últimos descubrimentos fixeron que haxa unha certa división entre os xenetistas sobre a definición precisa de pseudoxene e a natureza do seu produto final (debe ser unha proteína? pode ser ARN? poden ser pseudoxenes de ARNt ou ARNr? ). Unha definición operacional de pseudoxene pode ser a seguinte: fragmento de secuencia nucleotídica que lembra a secuencia de dominios proteicos coñecidos pero con codóns de stop ou cambios de pautas de lectura en medio do dominio.
Malia a súa non funcionalidade, os pseudoxenes conteñen historias biolóxicas e evolutivas fascinantes nas súas secuencias. Isto débese a que un pseudoxene comparte un antepasado cun xene funcional: igual que as especies evolucionan a partir doutras especies anteriores e as especies emparentadas teñen un devanceiro común, un pseudoxene e o seu xene funcional asociado tamén comparten un xene antepasado común e diverxiron como entidades xenéticas separadas hai millóns de anos. Propiedades dos pseudoxenes
Os pseudoxenes están caracterizados pola combinación de dúas propiedades: homoloxía cun xene coñecido e non funcionalidade. Por tanto, aínda que teñen secuencias similares a algún xene non poden orixinar un produto final funcional. Os pseudoxenes son bastante difíciles de identificar e caracterizar nos xenomas, porque os dous requirimentos de homoloxía e non funcionalidade usados na súa identificación detéctanse con cálculos de secuencias e aliñamentos máis ca con probas biolóxicas. A homoloxía está determinada pola identidade de secuencia entre as secuencias de ADN do pseudoxene e o seu xene orixinario. Despois de facer un aliñamento das dúas secuencias, pode computarse o seu grao de identidade. Unha identidade de secuencia alta (normalmente entre o 40% e o 100%) significa que é moi probable que estas dúas secuencias diverxiron dunha secuencia ancestral común (son homólogas), e moi improbable que estas dúas secuencias foran orixinadas independentemente (ver evolución converxente).
A non funcionalidade pode manifestarse de moitas maneiras. Normalmente, un xene debe seguir varios pasos para que a partir da súa secuencia xenética no ADN se orixine unha proteína completamente funcional, que son: (1) transcrición, (2) procesamento do pre-ARNm, (3) tradución, e (4) pregamento da proteína. Se calquera destes pasos falla, a secuencia debe considerarse non funcional. Na identificación de alto rendemento de pseudoxenes, os defectos máis comunmente identificados son codóns de stop e mutacións de cambio de pauta de lectura, que case universalmente impiden a tradución dun produto proteico funcional.
Os pseudoxenes de xenes de ARN son xeralmente máis doados de descubrir. Moitos xenes de ARN aparecen no xenoma como múltiples copias de xenes, e os pseudoxenes son identificados pola súa identidade de secuencia e localización na rexión. Tipos e orixe dos pseudoxenes
Existen tres tipos principais de pseudoxenes, todos con distintas orixes e características, que son os seguintes: Pseudoxenes procesados (ou retrotransposados). Nos eucariotas superiores, particularmente os mamíferos, a retrotransposición é un proceso moi común que tivo un grande impacto na composición do xenoma. Por exemplo, aproximadamente entre o 30% e o 44% do xenoma humano consiste en elementos repetitivos como os SINEs e os LINEs (véxase retrotransposóns). No proceso de retrotransposición, unha porción do ARNm transcrito dun xene sofre espontaneamente unha reversotranscrición a ADN e volve a inserirse no ADN cromosómico. Aínda que os retrotransposóns xeralmente crean copias de si mesmos, nun sistema in vitro poden tamén crear copias por retrotransposición de xenes de forma aleatoria. Unha vez que estes pseudoxenes foron inseridos de novo no xenoma, xeralmente conteñen unha cola poli-A, e xeralmente carecen de intróns (que foron previamente eliminados por splicing); e estas son dúas características distintivas dos cDNAs. Porén, como derivan dun ARNm maduro, os pseudoxenes procesados tamén carecen do promotor que teñen os xenes normais; polo que xa son non funcionais desde o momento que se realiza a retrotransposición. Porén, ocasionalmente estas insercións contribúen con exóns a outros xenes xa existentes e normalmente por medio de transcritos que sofren splicing alternativo. Outra característica dos pseudoxenes procesados é que teñen truncado o extremo 5' en relación á secuencia orixinal, o cal é o resultado do mecanismo de retransposición que crea os pseudoxenes procesados.
Pseudoxenes non procesados (ou duplicados). A duplicación de xenes é outro proceso común importante na evolución de xenomas. Unha copia dun xene funcional pode orixinarse como resultado dun evento de duplicación xénica e posteriormente sofre unha mutación que causa que se volva non funcional. Os pseudoxenes duplicados xeralmente teñen todos as mesmas características dos xenes normais, incluíndo unha estrutura exóns-intróns intacta e secuencias promotoras. A perda da funcionalidade dun xene duplicado xeralmente ten pouco efecto sobre a eficacia biolóxica dun organismo, xa que aínda existe unha copia funcional intacta. De acordo con algúns modelos evolutivos, a presenza de pseudoxenes duplicados compartidos entre os humanos e outros primates indica o seu parentesco evolutivo. Se a formación de pseudoxenes se debe á duplicación de xenes, adoita ocorrer uns poucos millóns de anos despois da duplicación xénica con tal que o xene non estea sometido a presión de selección. A redundancia funcional xérase por duplicación xénica e maioritariamente non é vantaxoso ter dous xenes idénticos, e como as mutacións que interrompan a estrutura ou a función dun dos dous xenes non son deletéreas, os xenes non serán eliminados por un proceso selectivo. Como resultado, o xene que mutou convértese gradualmente en pseudoxene e acaba sendo un xene que non se expresa ou non funcional. Este tipo de destino evolutivo é predito polos modelos de xenética de poboacións e tamén pola análise xenómica. Estes pseudoxenes segundo o contexto evolutivo serán eliminados ou faranse tan distintos dos xenes orixinais que xa non serán identificables. Os pseudoxenes relativamente recentes poden ser recoñecibles debido á súa semellanza de secuencia.
Xenes incapacitados (disabled), ou pseudoxenes unitarios. Varias mutacións poden impedir que un xene sexa trascrito ou traducido con éxito, e un xene pode facerse non funcional ou desactivado se tal mutación queda fixada na poboación. Este é o mesmo mecanismo polo cal os xenes non procesados quedan desactivados, pero a diferenza neste caso é que o xene non foi duplicado antes de quedar incapacitado. Normalmente, esta desactivación de xenes é improbable que se fixe na poboación, pero varios efectos de poboación, como a deriva xenética, os pescozos de botella de poboación, ou nalgúns casos, a selección natural, poden levar a que o xene se fixe. O clásico exemplo dun pseudoxene unitario é o xene que presumiblemente codifica o encima L-gulono-γ-lactona oxidase (GULO) en primates. En todos os mamíferos estudados ademais dos primates (excepto a cobaia), GULO inervén na biosíntese de ácido ascórbico (vitamina C), pero existe como un xene incapacitado (GULOP) nos humanos e outros primates. Outro exemplo interesante e máis recente de xene incapacitado é o xene da caspase 12, que vincula a desactivación deste xene (por medio dunha mutación sen sentido) a unha selección positiva en humanos.
Os pseudoxenes poden complicar os estudos de xenética molecular. Por exemplo, un investigador que quere amplificar un xene pola técnica da PCR pode amplificar simultaneamente un pseudoxene que comparte unha secuencia similar. De xeito similar, os pseudoxenes son ás veces contabilizados como xenes nas secuencias do xenoma.
Os pseudoxenes procesados a miúdo son un problema para os programas de predición de xenes, e con fecuencia son identificados erradamente como verdadeiros xenes ou exóns. Propúxose que a identificación de pseudoxenes procesados pode axudar a mellorar a precisión dos métodos de predición de xenes.
Tamén se observou que as secuencias orixinais que deron lugar a pseudoxenes procesados perden o seu potencial de codificación máis rápido cós que dan lugar a pseudoxenes non procesados. Posibles pseudoxenes funcionais
Por definición, os pseudoxenes carecen de función. Porén, a identificación e clasificación dos pseudoxenes xeralmente baséase na análise computacional de secuencias xenómicas usando complexos algoritmos. Isto leva ás veces a unha identificación incorrecta dos pseudoxenes. Por exemplo o xene funcional quimérico jingwei de Drosophila pensábase antes que era un pseudoxene procesado, cando en realidade era un xene funcional.
Porén, está establecido que uns poucos pseudoxenes poden realizar o proceso de transcrición, ou ben porque usan o seu propio promotor, que nestes casos está aínda intacto, ou ben porque noutros casos utilizan o promotor dun xene próximo. Esta expresión transcricional de pseudoxenes parece ser específica de tecido. En 2003, Hirotsune et al. identificaron un pseudoxene retrotransposado cuxo transcrito supostamente desempeñaba unha función trans-regulatoria na expresión do seu xene homólogo, Makorin1 (MKRN1) (véxase tamén dominio dedo RING e ubiquitina ligases), e suxeriu que isto era un modelo xeral por medio do cal os pseudoxenes podían xogar un importante papel biolóxico. Posteriormente, outros investigadores hipotetizaron funcións similares para outros pseudoxenes. Unha análise bioinformática mostrou que os pseudoxenes procesados poden ser inseridos en intróns de xenes "anotados" e ser incorporados en transcritos que experimentaron splicing alternativo. Os traballos de Hirotsune motivaron que dous biólogos moleculares revisasen coidadosamente a literatura científica sobre os pseudoxenes, e para sorpresa de moitos, atoparon algúns exemplos nos cales os pseudoxenes xogaban un papel na regulación e expresión xénica, o que significaba que o grupo de Hirotsune non fora o primeiro en identificar unha función para un pseudoxene. Ademais, recentemente, os descubrimentos orixinais de Hirotsune et al. sobre o xene Makorin1 foron firmemente contraditos; de modo que a posibilidade de que algúns pseudoxenes puidesen ter unha importante función biolóxica foi discutida.
Ademais, científicos da Universidade de Chicago e da de Cincinnati informaron en que un xene considerado pseudoxene procesado chamado fosfoglicerato mutase 3 (xene PGAM3P) realmente produce unha proteína funcional, e pode ser un exemplo de xene activo orixinado a partir dun pseudoxene durante a evolución dos primates, que conserva intacto o marco aberto de lectura do xene a pesar de ter moitas delecións na rexión 3' UTR.
Dúas publicacións de 2008 na revista Nature comentan que algúns siRNAs endóxenos derivan de pseudoxenes, e deste modo algúns pseudoxenes desempeñarían un papel na regulación de transcritos que codifican proteínas.
En xuño de 2010, Nature publicou un artigo que indicaba que os niveis de ARNm do supresor de tumores PTEN e do oncoxénico KRAS son afectados polos seus pseudoxenes PTENP1 e KRAS1P, respectivamente. O traballo demostraba no caso do PTEN que os transcritos do pseudoxene (PTENP1) secuestran secuencias dos micro ARNs (os cales reducen a expresión deste xene), aumentando por tanto os niveis de PTEN, o que á vez identificaba os transcritos do pseudoxene como unidades bioloxicamente activas na bioloxía dos tumores; isto atribuía un novo papel biolóxico a pseudoxenes que se expresan, consistente na regulación da expresión de xenes codificantes, e revela unha función non codificante dos ARNm na progresión da enfermidade (regular competindo por unirse aos micro ARN). Resurreción de pseudoxenes
O ADN pseudoxénico duplicado pode ser "resucitado" e orixinar unha proteína funcional en certos casos como un raro caso de fenómeno evolutivo ocasional. Os pseudoxenes ou partes dos pseudoxenes poden ser reutilizados despois de que durante un certo período da evolución estiveron derivando xeneticamente ao chou sen estaren sometidos a presión de selección. Koch postulou por primeira vez a idea dos “intermediatos intraducibles” na evolución dunha proteína. A reparación de danos nos xenes pode acadarse por medio da reinserción dun segmento que fora eliminado, ou pola eliminación (no marco) dun segmento que fora inserido, ou por outros eventos máis improbables como a conversión xénica.
Hai varios exemplos que poden utilizarse para apoiar a posibilidade de dita resurrección. A ribonuclease seminal bovina, que leva en estado dormente desde hai 20 millóns de anos en forma de pseudoxene, parece ter resucitrado como xene funcional. Crese que un fenómeono chamado conversión xénica pode ser a causa desta resurrección. O gran grupo de pseudoxenes dos receptores olfactorios (ORs) nos metazoos (nos humanos o 60% dos ORs son pseudoxénicos) son resucitables quizais debido a fenómenos de conversión xénica. Unha agrupación de ORs que contén 16 xenes OR e 6 pseudoxenes OR situado no cromosoma 17 parece que estivo suxeita a un gran número (20) de episodios de conversión xénica no decurso da evolución dos primates. Estes episodios de conversión xénica nas agrupacións de xenes OR poden contribuír a aumentar a diversidade na capacidade de ligarse ao sitio de unión da molécula olorosa. Finalmente, a resurrección dun pseudoxene leva tamén á diversidade dos segmentos xénicos da rexión variable das cadeas pesadas das inmunoglobulinas nos polos e parece que se orixinou por un evento de conversión xénica dun só xene funcional con máis de 80 segmentos xénicos pseudoxénicos.
Atopáronse tamén lixeiras diferenzas no complemento de pseudoxenes entre distintos individuos. Por exemplo, na maioría da xente os pseudoxenes dos receptores olfactorios están mortos pero nunhas poucas persoas son xenes intactos e funcionais. Algúns estudos suxiren que certos pseudoxenes de proteínas da superficie celular resucitan debido ao estrés producido no organismo por novas condicións ambientais. Os dous pseudoxenes procesados chamados RC9 do citocromo c de rata e o pseudoxene rpL32-4A da proteína ribosómica L 32 de rato poden ser potencialmente funcionais. En recentes experimentos encontrouse que nun xenoma bacteriano un considerable segmento das rexións interxénicas son transcritas activamente. No proxecto ENCODE atopouse que o arredor do 20% das rexións activas transcricionalmente (TARs) eran producidas a partir de "xenes non nacidos potenciais" que non foran previamente detectados, o que indica que hai pseudoxenes funcionais dentro desas rexións. Para estar seguros de que os pseudoxenes se transcriben a ARN e comprobar a súa funcionalidade son moi útiles os estudos en ovocitos de rato nos que os ARN interferentes pequenos (siRNAs) derivados de pseudoxenes son funcionais na regulación da expresión xenética. Algúns pseudoxenes están mortos aínda que con algunhas funcións, o que reforza o feito de que non son "ADN lixo".
A era da paleontoloxía molecular é excitante e está comezando. Agora podemos empezar a identificar e estudar moitos máis pseudoxenes. Os pseudoxenes moi antigos e deteriorados escapan con frecuencia á detección, aínda que os pseudoxenes xerados máis recentemente son identificados doadamente polas técnicas actuais baseadas na comparación con secuencias de xenes ben caracterizados. A caracterización dos pseudoxenes mellorará cando se refine e poña ao día a secuencia e anotación do xenoma humano (incluír información sobre posición xenómica, límites intrón-exón, secuencias regulatorias, repeticións, nomes de xenes e produtos proteicos). Os indicios recentes de que non todos os pseudoxenes están mortos e das posibilidades da resurrección dos pseudoxenes (que se fan activos orixinando unha proteína funcional) poderán ser comprobados.