Estrutura terciaria dos ácidos nucleicos

A estrutura terciaria dos ácidos nucleicos é a forma tridimensional dun polímero de ácido nucleico. As moléculas de ARN e ADN son capaces de realizar diversas funcións desde o recoñecemento molecular á catálise. Tales funcións requiren unha estrutura tridimensional moi precisa. Aínda que ditas estruturas son diversas e aparentemente complexas, están compostas de motivos estruturais terciarios doadamente recoñecibles que serven como bloques de construción moleculares. Algúns dos motivos máis comúns da estrutura terciaria do ARN e ADN descríbense neste artigo, pero esta información está baseada no limitado número de estruturas resoltas. A medida que se vaian caracterizando estruturalmente novas moléculas de ARN e ADN, iranse revelando moitos máis motivos de estrutura terciaria. Estruturas helicoidais
Dobre hélice
A dobre hélice é a estrutura terciaria dominante do ADN biolóxcio e tamén é unha estrutura posible para o ARN. Na natureza crese que existen tres estruturas do ADN chamadas ADN A, ADN B e ADN Z. A forma "B", descrita por James D. Watson e Francis Crick, é a que predomina nas células. Watson e Crick describiron esta estrutura como unha dobre hélice cun radio de 10 Å e unha volta de hélice de 34 Å (uns dez pares de bases). A dobre hélice en solución dá unha volta completa sobre o seu eixe cada 10, 4–10, 5 pares de bases. Esta frecuencia de xiro depende en gran medida das forzas de empillamento (stacking) que cada base exerce sobre as súas veciñas na cadea. O ARN en dobre hélice adopta unha conformación similar á da estrutura da forma A do ADN.
Son posibles outras conformacións; de feito, só quedan dispoñibles agora as letras F, Q, U, V e Y para describir calquera nova estrutura de ADN que se descubra no futuro. Porén, a maioría destas formas foron creadas sinteticamente e non foron observadas en sistemas biolóxicos naturais.
Tríplex de ARN dos sucos maior e menor
O tríplex do suco menor é un motivo estrutural do ARN. Como as interaccións co suco menor do ADN están a miúdo medidadas polo grupo 2'-OH do azucre ribosa, este motivo do ARN parece moi diferente do seu equivalente no ADN. O exemplo máis común dun tríplex do suco menor é o motivo A-menor ou a inserción de bases adenosina no suco menor (véxase máis arriba). Porén, este motivo non está restrinxido a adenosinas, xa que tamén se observaron outras nucleobases que interaccionan co suco menor do ARN.
O suco menor presenta un complemento case perfecto para unha base inserida. Isto permite contactos de van der Waals, unha ampla formación de enlaces de hidróxeno e o enterramento da superficie hidrófoba, ademais de crear unha interacción moi favorable enerxeticamente. Como os tríplex de suco menor poden empaquetar establemente un bucle libre ou unha hélice, son elementos clave na estrutura de grandes ribonucleótidos, incluíndo o intrón do grupo I, o intrón do grupo II, e o ribosoma. Aínda que o suco maior do ARN da forma A estándar é bastante estreito e, por tanto, está menos dispoñible para a interacción tríplex que o suco menor, poden observarse interaccións tríplex do suco maior en varias estruturas do ARN. Estas estruturas constan de varias combinacións de pares de bases e interaccións Hoogsteen. Por exemplo, o tríplex GGC (GGC amino(N-2)-N-7, imino-carbonil, carbonil-amino(N-4); Watson e Crick) observadas na subunidade do ribosoma de 50S, compostas por un par G-C de tipo Watson e Crick e unha G entrante que forma unha rede pseudo-Hoogsteen de interaccións de enlaces de hidróxeno entre ambas as bases implicadas no apareamento canónico. Outros exemplos notables de tríplex do suco maior son (i) o núcleo catalítico do intrón do grupo II mostrado na figura da esquerda (ii) unha tripla hélice cataliticamente esencial observada no ARN da telomerase (iii) o riboswitch SAM-II e (iv) o elemento para a expresión nuclear (ENE), que actúa como un elemento de estabilización do ARN por medio da formación dunha tripla hélice coa cola poli(A).
Tamén é posible un ADN tricatenario (con tres febras) a partir de enlaces de hidróxeno de Hoogsteen ou Hoogsteen inverso no suco maior da forma B do ADN.
Cuádruplex
Ademais das dobres hélices e os antes mencionados tríplex, o ARN e o ADN poden tamén formar hélices cuádruplas. Hai diversas estruturas de cuádruplex de bases de ARN. Catro residuos consecutivos de guanina poden formar un cuádruplex no ARN por enlaces de hidróxeno de Hoogsteen para formar un “anel de Hoogsteen” (ver figura). Os pares G-C e A-U poden tamén formar cuádruplex de bases cunha combinación de apareamento de Watson e Crick e apareamento non canónico no suco menor do ADN.
O núcleo do aptámero Malaquita Verde é tamén un tipo de cuádruplex de bases cun padrón de enlaces de hidróxeno diferente (ver figura). O cuádruplex pode repetirse varias veces consecutivamente, producindo unha estrutura enormemente estable.
A estrutura única das rexións cuádruplex do ARN pode exercer diferentes funcións nun sistema biolóxico. Dúas importantes funcións son o potencial de unirse a ligandos ou proteínas e a súa capacidade de estabilizar a estrutura terciaria completa do ADN ou ARN. A forte estrutura pode inhibir ou modular a transcrición e a replicación do ADN, como nos telómeros dos cromosomas e na UTR do ARNm. A identidade de bases é importante para a unión de ligandos. O cuarteto G únese tipicamente a catións monovalentes como o ión potasio, mentres que outras bases poden unirse a outros numerosos ligandos como a hipoxantina nun cuádruplex U-U-C-U.
Xunto con estas funcións, o cuádruplex G do ARNm arredor das rexións de unión ao ribosoma podería servir como un regulador da expresión xénica en bacterias. Pode haber máis estruturas e funcións interesantes que están aínda por descubrir in vivo. Empillamento coaxial
O empillamento coaxial (coaxial stacking), tamén coñecido como empillamento helicoidal, é factor determinante da estrutura terciaria do ARN de maior orde. O empillamento coaxial ocorre cando dous dúplex de ARN forman unha hélice contigua, que se estabiliza por empillamento de bases na interface das dúas hélices. O empillamento coaxial detectouse na estrutura cristalina do ARNtPhe. Máis recentemente, o empillamento coaxial foi observado en estruturas de orde máis alto de moitos ribocimas, incluíndo moitas formas dos intróns de autoempalme do grupo I e grupo II. Entre os motivos de empillamento coaxial comúns están a interacción do bucle bicante (kissing loop) e o pseudonó. A estabilidade destas interaccións pode predicirse por unha adaptación das “regras de Turner”.
En 1994, Walter e Turner determinaron as contribucións de enerxía libre de interaccións de empillamento co veciño máis próximo dentro da interface hélice-hélice usando un sistema modelo que creou unha interface hélice-hélice entre un oligómero curto e un tramo colgante de catro nucleótidos ao final dun talo forquita. Os seus experimentos confirmaron que a contribución termodinámica de empillamento de bases entre dúas estruturas secundarias helicoidais imitan estreitamente a termodinámica da formación do dúplex estándar (as interaccións co veciño máis próximo predín a estabilidade termodinámica da hélice resultante). A estabilidade relativa das interaccións co veciño máis próximo poden utilizarse para predicir o empillamento coaxial favorable baseado na estrutura secundaria coñecida. Walter e Turner atoparon que, como media, a predición da estrutura do ARN melloraba en exactitude do 67% ao 74% cando se incluían as contribucións do empillamento coaxial.
A maioría das estruturas terciarias do ARN ben estudadas conteñen exemplos de empillamento coaxial. Algúns exemplos prominentes son o ARNtPhe, os intróns do grupo I, os intróns do grupo II e os ARNs ribosómicos. As estruturas cristalinas do ARNt revelaron a presenza de dúas hélices estendidas que se orixinan por empillamento coaxial do talo aceptor de aminoácidos co brazo T, e o empillamento dos brazos D e anticodón. Estas interaccións no ARNt orientan o talo anticodón perpendicularmente ao talo aminoácido, orixinando a estrutura terciaria con forma de L funcional. Nos intróns do grupo I, demostrouse que as hélices P4 e P6 teñen empillamento coaxial usando unha combinación de métodos bioquímicos e cristalográficos. A estrutura cristalina de P456 proporcionou unha visión detallada de como o empillamento coaxial estabiliza o empaquetamento de hélices de ARN en estruturas terciarias. No intrón do grupo II de autoempalme de Oceanobacillus iheyensis, os talos IA e IB empíllanse coaxialmente e contribúen á orientación relativa das hélices que constitúen unha unión de cinco vías. Esta orientación facilita o pregamento correcto do sitio activo dun ribocima funcional. O ribosoma contén numerosos exemplos de empillamento coaxial, incluíndo segmentos empillados de ata 70 bp. Dous motivos comúns con empillamento coaxial son os bucles bicantes e os pseudonós. Nas interaccións de bucle bicante, as rexións de bucle monocatenario de dúas forquitas interaccionan por apareamento de bases, formando unha hélice empillada coaxialmente composta. Hai que salientar que esta estrutura permite que todos os nucleótidos de cada bucle participen no apareamento de bases e nas interaccións de empillamento. Este motivo foi visualizado e estudado usando análise de resonancia magnética nuclear por Lee e Crothers. O motivo do pseudonó parece cando as bases dunha rexión monocatenaria dun bucle forquita se aparean cunha secuencia de augas arriba ou augas abaixo na secuencia dentro dunha mesma febra de ARN. As dúas rexións dúplex resultantes a miúdo empílanse entre si, formando unha hélice empillada coaxialmente composta. Un exemplo dun motivo pseudonó é o moi estable ribocima do virus da hepatite delta, no cal o seu esqueleto molecular mostra unha topoloxía de pseudonó dobre global.
Un efecto similar ao empillamento coaxial observouse en estruturas de ADN deseñado racionalmente. As estruturas do ADN origami conteñen un gran número de dobres hélices con extremos romos expostos. Observouse que estas estruturas se adhiren polos bordos que conteñen estes extremos romos expostos, debido a interaccións de empillamento hidrófobas. Outros motivos
Interaccións tetrabucle-receptor
As interaccións tetrabucle-receptor combinan o apareamento de bases e as interaccións de empillamento entre os nucleótidos do bucle dun motivo tetrabucle e un motivo receptor localizado dentro dun dúplex de ARN, creando un contacto terciario que estabiliza o pregamento terciario global dunha molécula de ARN. Os tetrabucles son tamén estruturas posibles nos dúplex de ADN.
Os talos-bucles poden variar moito en tamaño e secuencia, pero os tetrabucles de catro nucleótidos son moi comúns e xeralmente pertencen a algunha das tres clases que hai baseadas na secuencia. Estas tres familias son as dos tetrabucles CUYG, UNCG e GNRA (ver figura). En cada unha destas familias de tetrabucles o segundo e terceiro nucleótidos forman un xiro na febra de ARN e un apareamento de bases entre o primeiro e cuarto nucleótidos estabiliza a estrutura de talo-bucle. En xeral, determinouse que a estabilidade do tetrabucle depende da composición de bases dentro do bucle e da composición deste "par de bases de peche". A familia GNRA de tetrabucles é a que máis comunmente se observa nas interaccións tetrabucle-receptor. Adicionalmente, os tetrbucles UMAC son versións alternativas dos bucles GNRA, compartindo ambos estruturas do esqueleto molecular similares; malia estas semellanzas, son diferentes nas interaccións a longo rango que poden realizar. Os “motivos receptores tetrabucle” son interaccións terciarias de longo rango consistentes en enlaces de hidróxeno entre as bases do tetrabucle con secuencias do talo-bucle en seccións distais da estrutura secundaria do ARN. Ademais dos enlaces de hidróxeno, as interaccións de empillamento son un compoñente importante destas interaccións terciarias. Por exemplo, nas interaccións do tetrabucle GNRA, o segundo nucleótido do tetrabucle empíllase directamente cun motivo plataforma A (véxase máis arriba) dentro do receptor. A secuencia do tetrabucle e o seu receptor a miúdo covaría para que se poida facer o mesmo tipo de contacto terciario con diferentes isoformas do tetrabucle e do seu receptor correspondente.
Por exemplo, o intrón do grupo I de autoempalme depende de motivos de receptor de tetrabucle para a súa estrutura e funcionamento. Especificamente, os tres residuos de adenina do motivo GAAA canónico empíllanse na parte superior da hélice receptora e forman enlaces de hidróxeno estabilizantes múltiples co receptor. A primeira adenina da secuencia GAAA forma un apareamento de bases triplo coas bases AU do receptor. A segunda adenina está estabilizada por enlaces de hidróxeno coa mesma uridina, así como por medio do seu grupo 2'-OH co receptor e por interaccións coa guanina do tetrabucle GAAA. A terceira adenina forma un par de bases triplo.
O motivo A-menor
O motivo A-menor é un motivo de estrutura terciaria moi común no ARN. Fórmase pola inserción de nucleósidos non apareados no suco menor dun dúplex de ARN. É un exemplo de tríplex do suco menor. Aínda que a guanosina, citosina e uridina poden tamén formar interaccións triplas no suco menor, as interaccións no suco menor con adenina son moi comúns. No caso da adenina, o bordo N1-C2-N3 da base que se insire forma enlaces de hidróxeno cun ou con ambos os grupos 2’-OH do dúplex, así como as bases do dúplex (ver figura: Interaccións A-menor). O dúplex hóspede adoita ser un apareamento G-C.
Os motivos A-menor divídense en catro clases, denominadas tipos 0, I, II e III, baseándose na posiciión da base inserida en relación cos dous 2’-OH do par de bases de Watson e Crick. Nos tipos I e II de motivos A-menor, o N3 da adenina está inserido profundamente no suco menor do dúplex (ver figura: interaccións A-menor de tipo II), e hai unha boa complementariedade na forma co par de bases. A diferenza dos tipos 0 e III, as interacciós dos tipos I e II son específicas para a adenina debido ás interaccións de formación de enlaces de hidróxeno. Na interacción de tipo III tanto o O2' coma o N3 da base que se insire están asociados menos de preto co suco menor do dúplex. Os motivos de tipos 0 e III son máis débiles e non específicos porque están mediados por interaccións cun só grupo 2’-OH (ver figura: Interaccións A-menor de tipos 0 e III).
O motivo A-menor é un dos motivos estruturais máis comúns do ARN no ribosoma, onde contribúe á unión do ARNt á subunidade de 23S. Xeralmente estabilizan as interaccións do dúplex de ARN en bucles e hélices, como na parte central dos intróns do grupo II.
Un exemplo interesante de función do motivo A-menor é o seu papel no recoñecemento do anticodón. O ribosoma debe discriminar entre os pares correctos ou incorrectos codón-anticodón. Faino en parte por medio da inserción de bases adenina no suco menor. Os pares codón-anticodón incorrectos presentarán unha xeometría helicoidal distorsionada, que lles impedirá a interacción con A-menor ao estabilizar a unión, e incrementará a taxa de disociación do ARNt incorrecto.
Unha análise de motivos A-menor no ARNr 23S revelou unha rede xerárquica de dependencias estruturais, que se suxeriu está relacionada coa evolución do ribosoma e coa orde dos eventos que levaron ao desenvolvemento da subunidade maior bacteriana moderna.
O motivo A-menor e a súa nova subclase, chamada interacción A-menor WC/H, fortalecen outras estruturas terciarias como as hélices triplas do suco maior identificadas en elementos de estabilización do ARN.
Cremalleira de ribosa
A cremalleira de ribosa é un elemento estrutural terciario do ARN no cal dúas cadeas de ARN se manteñen xuntas por interaccións de enlaces de hidróxeno entre os grupos 2’-OH do azucre ribosa de diferentes febras. O 2'-OH pode comportarse como doante ou como receptor de enlaces de hidróxeno, o cal permite a formación de enlaces de hidróxeno bifurcados con outro 2’OH.
Informouse de numerosas formas de cremalleira de ribosa, pero un tipo común implica catro enlaces de hidróxeno entre grupos 2'-OH de azucres adxacentes. As cremalleiras de ribosa aparecen frecuentemente en disposicións que estabilizan interaccións entre febras de ARN separadas. As cremalleiras de ribosa obsérvanse a miúdo como interaccións talo-bucle cunha especificidade de secuencia moi baixa. Porén, nas subunidades ribosómicas menor e maior, existe unha propensión polas cremalleiras de ribosa de secuencia CC/AA, con dúas citosinas na primeira cadea apareadas con dúas adeninas na segunda cadea. Papel dos ións metálicos
Os ARNs funcionais adoitan ser moléculas pregadas estables con formas tridimensionais en lugar de febras lineares flexibles. Os catións son esenciais para a estabilización termodinámica das estruturas terciarias do ARN. Os catións metálicos que se unen ao ARN poden ser monovalentes, divalentes ou trivalentes. O ión potasio (K+) é un ión monovalente común que se une ao ARN. Un ión divalente frecuente que tamén se une ao ARN é o magnesio (Mg2+). Outros ións que se atoparon unidos ao ARN in vivo e in vitro son o sodio (Na+), calcio (Ca2+) e manganeso (Mn2+). Catións orgánicos multivalentes como a espermidina ou a espermina tamén se encontran nas células e fan importantes contribucións ao pregamento do ARN. Os ións trivalentes como a hexamina de cobalto ou os ións de lantánidos como o terbio (Tb3+) son útiles ferramentas experimentais para estudar a unión de metais ao ARN.
Un metal iónico pode interaccionar cun ARN de múltiples maneiras. Un ión pode asociarse difusamente co esqueleto molecular do ARN, apantallando as que doutro modo serían interaccións electrostáticas desfavorables. Esta protección da carga adoitan realizalo ións monovalentes. Os ións unidos ao sitio estabilizan elementos específicos da estrutura terciaria do ARN. As interaccións de unión ao sitio poden subdividirse en dúas categorías dependendo de se a auga funciona como mediadora na unión do metal. As ineraccións da “esfera externa” son mediadas por moléculas de auga que rodean o ión metálico. Por exemplo, o hexahidrato de magnesio interacciona con e estabiliza motivos de estrutura terciaria do ARN específicos por medio de interaccións con guanosina no suco maior. Inversamente, as interaccións da “esfera interna” están mediadas directamente por ións metálicos. O ARN a miúdo experimenta o seu pregamento en múltiples etapas e estas poden ser estabilizadas por diferentes tipos de catións. Nas etapas iniciais, o ARN forma estruturas secundarias estabilizadas pola unión de catións monovalentes ou divalentes e aminas polianiónicas para neutralizar o esqueleto molecular polianiónico. As etapas finais deste proceso implican a formación dunha estrutura terciaria do ARN, que se estabiliza maiormente pola unión de ións divalentes como o magnesio con posibles contribucións da unión de potasio.
Os sitios de unión de metais están a miúdo localizados no suco maior estreito e profundo do dúplex de ARN, coordinando os bordos de Hoogsteen das purinas. En concreto, catións metálicos estabilizan sitios onde o esqueleto da molécula xira, nos que o empaquetamento moi estreito dos fosfatos orixina unha rexión con gran densidade de cargas negativas. Nos dúplex de ARN hai varios motivos estruturais para a unión de metais que foron identificados nas súas estruturas cristalinas. Por exemplo, no dominio P4-P6 do intrón do grupo I de Tetrahymena thermophila varios sitios de unión de metais constan dun tándem de pares cambaleantes G-U e un tándem de apareamentos incorrectos G-A, nos cales os catións divalentes interaccionan cos bordos de Hoogsteen da guanosina polos átomos O6 e N7. Outro motivo de unión a ións nos intróns do grupo I de Tetrahymena é o motivo plataforma A-A, no cal adenosinas consecutivas nunha mesma febra do ARN forman un pseudopar de bases non canónico. A diferenza do motivo en tándem G-U, o motivo plataforma A-A únense preferentemente a catións monovalentes. En moitos destes motivos, a ausencia de catións monovalentes ou divalentes ten como resultado unha maior flexibilidade ou a perda da estrutura terciaria.
Os ións metálicos divalentes, especialmente o magnesio, son importantes para a estrutura das unións (junctions) do ADN como a unión de Holliday que intervén na recombinación xenética. O ión magnesio apantalla os grupos fosfato cargados negativamene na unión e permítelles posicionarse máis próximos, facilitando unha conformación empillada en vez de non empillada. O magnesio é vital para estabilizar este tipo de unións nas estruturas deseñadas artificialmente usadas na nanotecnoloxía do ADN, como o motivo de sobrecruzamento dobre. Historia
Os primeiros traballos sobre bioloxía estrutural do ARN coincidiron, máis ou menos, cos realizados sobre o ADN a inicios da década de 1950. Na súa publicación pioneira de 1953, Watson e Crick suxeriron que o ateigamento de van der Waals polos grupos 2'OH das ribosas impedirían que o ARN adoptase unha estrutura de dobre hélice idéntica á do modelo proposto para o ADN, hoxe chamado forma B do ADN. Isto suscitou cuestións sobre a estrutura tridimensional do ARN: podía esta molécula formar algún tipo de estrutura helicoidal, e se podía, cal era?
Na metade da década de 1960 o papel do ARNt na síntese proteica estaba sendo intensamente estudado. En 1965, Holley et al. purificaron a primeira secuencia dunha molécula de ARNt, e propuxeron inicialmente que adoptaba unha estrutura de folla de trevo, baseándose principalmente na capacidade de certas rexións da molécula de formar estruturas de talo-bucle. O illamento do ARNt foi o primeiro gran froito das investigacións sobre a bioloxía estrutural do ARN. En 1971, Kim et al. conseguiron outro grande avance, producindo cristais de ARNtPhe de lévedo que difractaron con resolucións de 2-3 ángstroms usando espermina, unha poliamina natural, que se unía e estabilizaba o ARNt.
Despois de conseguírense as primeiras estruturas do ARNt pasou un tempo considerable no que non se conseguiron grandes avances no campo da estrutura do ARN. A capacidade de estudar unha estrutura de ARN dependía do potencial de illar o ARN diana. Isto foi unha limitación neste campo durante moitos anos, en parte porque outras dianas coñecidas, é dicir, o ribosoma, eran significativamene máis difíciles de illar e cristalizar. Así, durante uns vinte anos despois da publicación orixinal da estrutura do ARNtPhe, só se resolveran as estruturas dunha manchea doutras dianas de ARN, e case todos eles pertencían á familia dos ARN transferentes.
Esta desafortunada falta de éxitos sería finalmente superada principalmente debido a dous grandes avances na investigación dos ácidos nucleicos: a identificación dos ribocimas, e a capacidade de producilos por transcrición in vitro. Despois da publicación de Tom Cech que mostraba que o intrón do grupo I de Tetrahymena funcionaba como un ribocima autocatalítico, e do informe de Sidney Altman sobre a catálise feita polo ARN ribonuclease P, identificáronse varios outros ARNs cataliticos a finais da década de 1980, incluíndo o ribocima cabeza de martelo. En 1994, McKay et al. publicaron a estrutura dun 'complexo ribocima ARN-ADN cabeza de martelo-inhibidor' a unha resolución de 2, 6 Å, no cal a actividade autocatalítica do ribocima era alterada pola unión ao substrato ADN. Ademais dos avances feitos na determinación da estrutura global por cristalografía, o inicio da década de 1990 tamén viu a aplicación da resonancia magnética nuclear (RMN) como unha técnica poderosa na bioloxía estrutrural do ARN. Investigacións como estas permitiron unha caracterización máis precisa do apareamento de bases e as interaccións de empillamento que estabilizaban o pregamento global de moléculas de ARN grandes.
O rexurdimento da bioloxía estrutural do ARN a metade da década de 1990 causou unha verdadeira explosión no eido da investigación estrutural dos ácidos nucleicos. Desde a publicación das estruturas do ribocima cabeza de martelo e do P4-6, fixéronse numerosas contribucións máis a este campo. Algúns dos exemplos máis salientables son as estruturas dos intróns do grupo I e do grupo II, e o ribosoma. As primeiras tres estruturas producíronse usando transcrición in vitro, e a RMN exerceu un papel importante na investigación de compoñentes parciais de todas as estruturas, proba do indispensables que son estas técnicas na investigación estrutural do ARN. O Premio Nobel de Química de 2009 concedéuselles a Ada Yonath, Venkatraman Ramakrishnan e Thomas A. Steitz polos seus traballos sobre o ribosoma, o que demostra o papel prominente adquirido pola bioloxía estrutural do ARN en bioloxía molecular.