Транспозонска мутагенеза

Транспозонска мутагенеза, или транспозициска мутагенеза, ― биолошка постапка кој овозможува гените да бидат пренесени во хромозомот на организмот-домаќин, прекинувајќи ја или изменувајќи ја функцијата на постоечки ген на хромозомот и предизвикувајќи мутација. Транспозонската мутагенеза е многу поефикасна од хемиската мутагенеза, со поголема честота на мутација и помала шанса за убивање на организмот. Други предности вклучуваат можност да бидат индуцирани мутации со еден удар, можност за вклучување на маркери кои можат да бидат избрани во конструкцијата на соеви и можност за враќање на гените по мутагенезата. Недостатоците ја вклучуваат ниската честота на транспозиција во живите системи и неточноста на повеќето системи за транспозиција.
1 Историја
Транспозонската мутагенеза првпат била проучувана од Барбара Маклинток во средината на 20 век за време на нејзината Нобелова награда за работењето со пченка. Маклинток ја добила својата диплома во 1923 година на Колеџот за земјоделство Корнел. До 1927 година таа докторирала по ботаника и веднаш почнала да работи на темата за хромозомите на пченката. Во раните 1940-ти, Меклинток го проучувал потомството на растенијата на самоопрашувана пченка, кои произлегуваат од вкрстувањата со скршен 9-ти хромозом. На овие растенија им недостасуваа теломерите. Ова истражување го поттикнало првото откритие на транспозонот, и оттаму мутагенезата на транспозоните е искористена како биолошка алатка.
2 Динамика
Во случај на бактерии, транспозициската мутагенеза обично е постигнувана преку плазмид од кој е екстрахиран транспосон и е вметнуван во хромозомот домаќин. Ова обично бара збир на ензими, вклучувајќи транспозаза, да бидат преведени. Транспозазата може да биде изразена или на посебен плазмид или на плазмидот што го содржи генот што треба да биде интегриран. Алтернативно, вбризгување на транспозазна информациска РНК во клетката домаќин може да предизвика превод и изразување. Опитите за рана транспозонска мутагенеза се потпираа на бактериофаги и конјугативни бактериски плазмиди за вметнување на низи. Овие биле многу неспецифични и го отежнувале вклучувањето на специфични гени. Поновата техника наречена шатл-мутагенеза користи специфични клонирани гени од видот домаќин за да ги вклучи генетските елементи. Друг ефикасен пристап е да бидат доставувани транспозони преку вирусни капсиди. Ова го олеснило вклучувањето во хромозомот и долгорочното трансгенско изразување.
2.1 Транспозонски систем Tn5
Транспозонскиот систем Tn5 е модел систем за проучување на транспозицијата и за примена на мутагенезата на транспозоните. Tn5 е бактериски композитен транспозон во кој гените (првобитниот систем кој содржи гени за отпорност кон антибиотици) се опкружени со две речиси идентични вметнувачки низи, именувани IS50R и IS50L кои одговараат на десната и левата страна на транспозонот соодветно. Низата IS50R шифрира две белковини, Tnp и Inh. Овие две белковини се идентични по низа, освен фактот дека на Inh му недостасуваат 55 N-терминални аминокиселини. Tnp шифрира за транспозаза за целиот систем, а Inh кодира инхибитор на транспозаза. Доменот за врзување на ДНК на Tnp се наоѓа во 55 N-терминални аминокиселини, и затоа овие остатоци се од суштинско значење за функцијата. Низите IS50R и IS50L се опкружени со елементи од 19-базни парови на внатрешниот и надворешниот крај на транспозонот, означени соодветно IE и OE. Мутацијата на овие региони резултира со неспособност на транспозазните гени да се врзат за низите. Врзувачките заемодејства помеѓу транспозазата и овие низи се многу сложени и се под влијание на метилацијата на ДНК и другите епигенетски знаци. Дополнително, се чини дека другите белковини се способни да се врзат и да влијаат на транспонирањето на елементите IS50, како што е DnaA.
Најверојатната патека на транспозиција на Tn 5 е заедничка патека за сите транспозонски системи. Започнува со Tnp врзување на низите OE и IE на секоја низа IS50. Двата краја се споени, и преку олигомеризација на ДНК, низата е отсечена од хромозомот. По воведувањето на 9-базни парови 5' краеви во целната ДНК, транспозонот и неговите вклучени гени се вметнувани во целната ДНК, удвојувајќи ги регионите на двата краја на транспозонот. Гените од интерес може генетски да бидат конструирани во транспозонскиот систем помеѓу низите IS50. Со ставање на транспозонот под контрола на промотор на домаќинот, гените ќе се изразат. Вклучените гени обично вклучуваат, покрај генот од интерес, маркер што може да биде избран за да бидат идентификувани трансформантите, еукариотски промотор/терминатор (ако е изразуван во еукариот) и 3' низи на непреведен регион за да бидат одделени гените во полицистронична истегната низа.
2.2 Транспосонскиот систем „заспана убавица“
Транспосонскиот систем „заспана убавица“ е првиот успешен невирусен вектор за вклучување на генска касета во геномот на 'рбетниците. До развојот на овој систем, главните проблеми со невирусна генска терапија биле интрацелуларното разградување на трансгенот поради што тој бил препознаен како прокариотски и неефикасното доставување на трансгенот во органските системи. Системот ги револуционизира овие прашања со комбинирање на предностите на вирусите и голата ДНК. Се состои од транспозон кој ја содржи касетата на гени што треба да бидат изразени, како и свој ензим на транспозаза. Со транспонирање на касетата директно во геномот на организмот од плазмидот, може да биде постигнато одржливо изразување на трансгенот. Ова може дополнително да биде рафинирано со подобрување на транспозонските низи и употребените ензими на транспоза. SB100X е хиперактивна транспозаза од цицачи која е приближно 100 пати поефикасна од вообичаената транспозаза од првата генерација. Вградувањето на овој ензим во касетата резултира со уште поодржлива трансгенско изразување (над една година). Дополнително, честотите на трансгенезата може да бидат високи до 45% кога е користено пројадрено вбризгување во зиготи на глувци.
Механизмот на Системот е сличен на системот на транспозонот Tn5, но сепак ензимските и генските низи се еукариотски по природа за разлика од прокариотските. Транспозазата на системот може да дејствува во „trans“, како и во „cis“, овозможувајќи разновидна збирка на транспозонски структури. Самиот транспозон е опкружен со превртени повторувачки низи, кои се повторуваат двапати на директен начин, назначени индиректно повторливи/директно повторливи низи. Внатрешниот регион се состои од генот или низи што треба да биде транспониран, а може да го содржи и генот на транспозаза. Алтернативно, транспозазата може да биде шифриран на посебен плазмид или да биде вбризган во неговиот белковински облик. Уште еден пристап е да бидат вклучени и транспозонот, и гените со транспозаза, во вирусен вектор, кој може да цели кон клетка или ткиво по избор. Белковината со транспозаза е крајно специфична во низите со кои се врзува и може да ги препознае неговите индиректно повторливи/директно повторливи низи од слична низа по три базни парови. Откако ензимот ќе се врзе за двата краја на транспозонот, индиректно повторливите/директно повторливите низи се спојуваат и се задржуваат од транспозазата во образбата на синаптички комплекс. Создавањето на образбата на синаптички комплекс е контролен пункт кој обезбедува правилно расцепување. HMGB1 е нехистонска белковина од домаќинот која е поврзан со еукариотски хроматин. Го подобрува преференцијалното врзување на транспозазата со индиректно повторливите/директно повторливите низи и веројатно е суштинско за создавање/одржување на образбата на синаптичкиот комплекс. Транспозазата ја расцепува ДНК на целните места, генерирајќи 3' висници. Ензимот потоа цели кон ТА динуклеотидите во геномот на домаќинот како целни места за вклучување. Истото ензимско каталитичко место кое ја расцепило ДНК, е одговорно за интегрирање на ДНК во геномот, дуплирање на регионот на геномот во постапката. Иако транспозазата е специфична за ТА динуклеотидите, високата честота на овие парови во геномот покажува дека транспозонот е подложуван на прилично случајно вклучување.
3 Практични примени
Како резултат на капацитетот на транспозонската мутагенеза да вклучува гени во повеќето области на целните хромозоми, постојат голем број функции поврзани со постапката.
* Вирулентните гени во вирусите и бактериите може да се откријат со нарушување на гените и набљудување за промена на фенотипот. Ова има важност во производството на антибиотици и контролата на болеста.* Несуштинските гени може да бидат откриени со индуцирање транспозонска мутагенеза во организмот. Преобразените гени потоа може да бидат идентификувани со извршување на полимеразна верижна реакција на обновениот геном на организмот со користење на зачетник со специфична отворена рамка на читање и транспозонски специфичен зачетник. Бидејќи транспозоните можат да се вклучат себеси во некодирачките региони на ДНК, зачетникот со специфична отворена рамка на читање гарантира дека транспозонот прекинал ген. Бидејќи организмот преживеал по хомологното вклучување, прекинатиот ген очигледно не бил суштински.
* Гените кои предизвикуваат рак може да бидат идентификувани со мутагенеза на целиот геном и преглед на мутанти кои содржат тумори. Врз основа на механизмот и резултатите на мутацијата, гените кои предизвикуваат рак може да бидат идентификувани како онкогени или туморско сузбивачки гени.
4 Конкретни примери
4.1 Идентификација на кластерот на вирулентен ген на Mycobacterium tuberculosis
Во 1999 година, вирулентните гени поврзани со ''Mycobacterium tuberculosis'' биле идентификувани преку генско соборување посредуван од транспозонската мутагенеза. Плазмидот со име pCG113 кој содржи гени за отпорност кон канамицин и низата за вметнување IS1096 е конструиран да содржи ознаки со променливи парови од 80 бази. Плазмидите потоа биле преобразени во клетки ''на M. tuberculosis'' со електропорација. Колониите биле обложени на канамицин за да бидат избрани отпорни клетки. Колониите кои биле подложени на случајни настани на транспозиција, биле идентификувани со варењето со ''Bam'' HI и Саутерновиот метод користејќи внатрешна сонда за ДНК во IS1096. Колониите биле прегледувани за атенуирано размножување за да бидат идентификувани колониите со мутации во кандидатските вирулентни гени. Мутациите кои водат до ослабен фенотип биле картирани со засилување на соседните региони до низите IS1096 и споредени со објавениот геном ''на M. tuberculosis'' . Во овој пример, транспозонската мутагенеза идентификувала 13 патогени локуси во геномот на ''M. tuberculosis'' кои претходно не биле поврзани со болеста. Ова е суштинска информација за разбирање на инфективниот циклус на бактеријата.
4.2 Транспозонска мутагенеза „PiggyBac“ за откривање ген на рак
Транспозонот „PiggyBac“ од зелковиот молец (''Trichoplusia ni''), бил дизајниран да биде високо активен во клетките на цицачите и е способен за мутагенеза низ целиот геном. Транспозоните содржеа и ''„PiggyBac“'' и превртените повторувања на „заспаната убавица“, со цел да бидат препознаени од двете транспозази и да биде зголемена честотата на транспозиција. Дополнително, транспозонот содржел елементи на промотор и засилувач, дарител на спојување и примачи за да бидат овозможени мутации на добивка или губење на функцијата во зависност од ориентацијата на транспозонот и двонасочните сигнали за полиаденилација. Транспозоните биле ин витро преобразувани во клетки од глушец и биле анализирани мутанти кои содржат тумори. Механизмот на мутација што води до создавање тумор одредува дали генот е класифициран како онкоген или туморско сузбивачки ген. Онкогените имаат тежнеење да бидат карактеризирани со вметнувања во региони што доведуваат до прекумерно изразување на ген, додека туморско сузбивачките гени биле класифицирани како такви врз основа на мутации со губење на функцијата. Бидејќи глушецот е моделен организам за проучување на човечката физиологија и болести, ова истражување ќе помогне да биде сторено зголемено разбирање на гените кои предизвикуваат рак и потенцијалните терапевтски цели.
5 Поврзано
* Транспозоните како генетско средство
* Транспозон
* Транспозаза
* Барбара Маклинток