Геномска библиотека

Геномска библиотека ― збирка од преклопени фрагменти на ДНК кои заедно ја сочинуваат вкупната геномска ДНК на еден организам. ДНК е складирана во состав од идентични вектори, од кои секој содржи различен додаток на ДНК. Со цел да биде изградена геномска библиотека, ДНК на организмот е извлекуван од клетките и потоа е варен со рестрикционен ензим за да биде исечена ДНК-та во фрагменти со одредена големина. Фрагментите потоа се вметнувани во векторот користејќи ДНК-лигаза. Следно, векторската ДНК може да биде преземена од организам-домаќин - најчесто население на ''Escherichia coli'' или квасец - при што секоја клетка содржи само една векторска молекула. Користењето на клетка-домаќин за носење на векторот овозможува лесно засилување и пронаоѓање на специфични клонови од библиотеката за анализа.
Достапни се неколку видови вектори со различни капацитети на вметнување. Општо земено, библиотеките направени од организми со поголеми геноми бараат вектори со поголеми внесови, а со тоа се потребни помалку векторски молекули за да биде направена библиотеката. Истражувачите можат да изберат вектор, исто така, земајќи ја предвид идеалната големина на внесот за да го најдат саканиот број на клонови неопходни за целосна покриеност на геномот.
Геномските библиотеки најчесто се користени за секвенционирачки примени. Тие одиграле важна улога во целокупното секвенционирање на геномот на неколку организми, вклучувајќи го и човечкиот геном и неколку моделни организми.
1 Историја
Првиот геном заснован на ДНК некогаш целосно секвенциониран бил постигнат од двократниот добитник на Нобеловата награда, Фредерик Сенгер, во 1977 година. Сенгер и неговата група научници создале библиотека на бактериофагот, phi X 174, за употреба во секвенционирањето на ДНК. Важноста на овој успех придонесе за постојано зголемување на побарувачката за секвенционирање на геномите за истражување на генската терапија. Научниците сега можат да ги каталогизираат полиморфизмите во геномите и да ги истражат оние кандидатски гени кои придонесуваат за болести како Паркинсонова болест, Алцхајмерова болест, мултипла склероза, ревматоиден артритис и дијабетес тип 1. Овие се должат на напредокот на општогеномските студии за поврзување од способноста да бидат создавани и секвенционирани геномски библиотеки. Претходните студии за поврзување и кандидатски гени биле некои од единствените пристапи.
2 Изградба на геномска библиотека
Изградбата на геномска библиотека вклучува создавање на многу рекомбинантни молекули на ДНК. Геномската ДНК на организмот е екстрахирана и потоа е варена со рестрикционен ензим. За организми со многу мали геноми (~10 kb), сварените фрагменти може да бидат одвоени со гелна електрофореза. Одделените фрагменти потоа може да бидат исечени и клонирани во векторот посебно. Меѓутоа, кога голем геном е варен со рестрикционен ензим, има премногу фрагменти за поединечно акцизирање. Целиот сет на фрагменти мора да биде клониран заедно со векторот, а потоа може да дојде до раздвојување на клоновите. Во секој случај, фрагментите се врзувани во вектор кој е варен со истиот рестрикционен ензим. Векторот што ги содржи вметнати фрагменти од геномската ДНК потоа може да биде внесен во организмот-домаќин.
Подолу се чекорите за создавање геномска библиотека од голем геном:
# Екстрактирање и прочистување на ДНК.
# Варење на ДНК со рестрикционен ензим. Ова создава фрагменти кои се слични по големина, а секој содржи еден или повеќе гени.
# Вметнете ги фрагментите од ДНК во вектори кои се исечени со истиот рестрикционен ензим. Користење на ензимот за ДНК-лигаза за да ги запечати фрагментите на ДНК во векторот. Ова создава голем фонд на рекомбинантни молекули.
# Овие рекомбинантни молекули ги презема бактеријата домаќин со преобразба, создавајќи библиотека на ДНК.
Подолу е дијаграм на горенаведените чекори.
2.1 Одредување на титарот на библиотеката
Откако ќе биде изградена геномска библиотека со вирусен вектор, како што е ламбда фагот, може да биде одреден титарот на библиотеката. Пресметувањето на титарот им овозможува на истражувачите приближно да утврдат колку заразни вирусни честички биле успешно создадени во библиотеката. За да биде сторено ова, разредувањата на библиотеката се користени за преобразба на културата ''E. coli'' со познати концентрации. Културите потоа се ставани на агарни плочи и се инкубирани преку ноќ. Бројот на вирусни плочи е броен и може да биде користен за пресметување на вкупниот број на заразни вирусни честички во библиотеката. Повеќето вирусни вектори исто така носат маркер кој овозможува клоновите што содржат внес да се разликуваат од оние што немаат внес. Ова им овозможува на истражувачите да го одредат и процентот на заразни вирусни честички кои всушност носат фрагмент од библиотеката.
Сличен метод може да биде користен за титрирање на геномски библиотеки направени со невирусни вектори, како што се плазмиди и бактерискиот вештачки хромозом. Пробнаталигација на библиотеката може да биде користена за да ја преобрази ''E. coli''. Преобразбата потоа се шири на агарни плочи и се инкубира преку ноќ. Титарот на преобразбата е одредуван со броење на бројот на колонии присутни на плочите. Овие вектори претежно имаат изборен маркер што овозможува диференцијација на клоновите што содржат вметнување од оние што не содржат. Со правење на овој тест, истражувачите исто така можат да ја одредат ефикасноста на лигацијата и да направат прилагодувања по потреба за да бидат осигурани дека ќе го добијат саканиот број на клонови за библиотеката.
2.2 Библиотека за прегледување
За да бидат изолирани клоновите што содржат региони од интерес од библиотеката, библиотеката мора прво да биде проверена. Еден метод на преглед е хибридизација. Секоја преобразена клетка-домаќин на библиотеката ќе содржи само еден вектор со еден внес на ДНК. Целата библиотека може да биде поставена на филтер преку медиум. Филтерот и колониите се подготвувани за хибридизација и потоа се означувани со сонда. Целниот внес на ДНК од интерес, може да биде идентификуван со откривање како што е авторадиографија поради хибридизацијата со сондата како што е прикажано подолу.
Друг метод на преглед е со полимеразна верижна реакција. Некои библиотеки се чувани како фондови на клонови и прегледот со полимеразна верижна реакција е ефикасен начин да бидат идентификувани фондови кои содржат специфични клонови.
3 Видови вектори
Големината на геномот варира кај различни организми и векторот за клонирање мора да биде избран соодветно. За голем геном, треба да биде избере вектор со голем капацитет така што релативно мал број клонови се доволни за покривање на целиот геном. Сепак, често е потешко да биде карактеризиран внесот содржан во вектор со поголем капацитет.
Подолу е табела со неколку видови вектори кои вообичаено се користени за геномски библиотеки и големината на внесот што претежно ја поседува секој.
Векторски вид, Големина на внес (илјада основи)
Плазмиди, до 10
Фаг ламбда (λ), до 25
Космиди, до 45
Бактериофаг P1, 70 до 100
P1 вештачки хромозоми, 130 до 150
Бактериски вештачки хромозоми, 120 до 300
Квасни вештачки хромозоми, 250 до 2000
3.1 Плазмиди
Плазмидот е двоверижна кружна молекула на ДНК која најчесто е користена за молекуларно клонирање. Плазмидите обично се со должина од 2 до 4 килобазни парови (kb) и се способни да носат внесови до 15 kb. Плазмидите содржат потекло на репликација што им овозможува да се реплицираат внатре во бактеријата независно од хромозомот-домаќин. Плазмидите најчесто носат ген за отпорност на антибиотици што овозможува избор на бактериски клетки кои го содржат плазмидот. Многу плазмиди исто така носат известувачки ген кој им овозможува на истражувачите да ги разликуваат клоновите што содржат вметнување од оние што не содржат.
3.2 Фаг ламбда (λ)
Фагот λ е двоверижен вирус на ДНК кој ја заразува ''E. coli''. Хромозомот на ламбдата е долг 48,5 kb и може да носи внесови до 25 kb. Овие внесови ги заменуваат несуштинските вирусни низи во хромозомот на ламбдата, додека гените потребни за создавање вирусни честички и инфекција остануваат недопрени. Вметната ДНК се реплицира со вирусната ДНК; така, заедно се пакуваат во вирусни честички. Овие честички се многу ефикасни при инфекција и размножување што доведува до поголемо производство на рекомбинантните хромозоми на ламбда. Сепак, поради помалата големина на внесот, библиотеките направени со ламбда фаг може да бараат многу клонови за целосна покриеност на геномот.
3.3 Космиди
Космидните вектори се плазмиди кои содржат мал регион на ДНК на бактериофагот ламбда наречена cos-низа. Оваа низа овозможува космидот да биде пакуван во честички на ламбда бактериофагот. Овие честички - кои содржат линеаризиран космид - се внесувани во клетката-домаќин со трансдукција. Откако ќе влезат во домаќинот, космидите кружат со помош на ДНК-лигазата на домаќинот и потоа функционираат како плазмиди. Космидите се способни да носат внесови со големина до 40 kb.
3.4 Вектори на бактериофаг P1
Векторите на бактериофагот P1 можат да носат внесови со големина од 70 – 100 kb. Тие започнуваат како линеарни молекули на ДНК спакувани во честички од бактериофагот P1. Овие честички се вбризгувани во сој на ''E. coli'' што изразува кре рекомбиназа. Линеарниот P1 вектор станува кружен со рекомбинација помеѓу две loxP места во векторот. P1 векторите претежно содржат ген за отпорност на антибиотици и позитивен маркер за одбирање за да бидат разликувани клоновите што содржат внес од оние што не содржат. Векторите P1, исто така, содржат плазмиден репликон P1, кој гарантира дека само една копија од векторот е присутна во клетката. Сепак, постои втор P1 репликон - наречен P1 литички репликон - кој е контролиран од индуциран промотор. Овој промотор овозможува засилување на повеќе од една копија на векторот по клетка пред екстракција на ДНК.
3.5 P1 вештачки хромозоми
P1 вештачките хромозоми имаат особина и на P1 вектори и на бактериските вештачки хромозоми. Слично на векторите P1, тие содржат плазмид и литички репликон како што е опишано погоре. За разлика од векторите P1, тие не треба да бидат пакуваани во бактериофаготни честички за трансдукција. Наместо тоа, тие се внесувани во ''E. coli'' како кружни молекули на ДНК преку електропорација исто како што се бактериските вештачки хромозоми. Исто така слични на бактериските вештачки хромозоми, тие се релативно потешко да бидат подготвени поради едно единствено потекло на репликација.
3.6 Бактериски вештачки хромозоми
Бактериските вештачки хромозоми се кружни молекули на ДНК, обично со должина од околу 7 kb, кои се способни да држат внесови со големина до 300 kb. Векторите на бактериските вештачки хромозоми содржат репликон изведен од факторот F на ''E. coli'', кој гарантира дека тие се одржувани на една копија по клетка. Штом внесот ќе биде поврзан во бактериски вештачки хромозом, бактерискиот вештачки хромозом е внесуван во соеви со недостаток на рекомбинација на ''E. coli'' со електропорација. Повеќето вектори на бактериски вештачки хромозом содржат ген за отпорност на антибиотици и исто така позитивен маркер за одбирање. Сликата десно прикажува вектор на бактериски вештачки хромозом, кој е сечен со рестрикционен ензим, проследено со вметнување на туѓа ДНК која повторно е анелирано со лигаза. Претежно, ова е многу стабилен вектор, но можеби е тешко да бидат подготвени поради едно единствено потекло на репликација исто како и P1 вештачките хромозоми.
3.7 Квасни вештачки хромозоми
Квасните вештачки хромозоми се линеарни молекули на ДНК кои ги содржат потребните особини на автентичниот хромозом на квасец, вклучувајќи теломери, центромер и потекло на репликација. Големите внесови на ДНК може да бидат врзани во средината на квасните вештачки хромозоми, така што има „рака“ на квасниот вештачки хромозом на двете страни на внесот. Рекомбинантниот квасен вештачки хромозом се внесуван во квасец преку преобразба; избираните маркери присутни во квасниот вештачки хромозом овозможуваат идентификација на успешни трансформанти. Квасните вештачки хромозоми може да чуваат внесови до 2000 kb, но повеќето библиотеки на квасен вештачки хромозом содржат внесови со големина од 250–400 kb. Теоретски не постои горна граница за големината на внесот што може да ја носи квасниот вештачки хромозом. Квалитетот во подготовката на ДНК што е користен за внесови е тој што ја одредува границата на големината. Најпредизвикувачкиот аспект на користењето квасен вештачки хромозом е фактот дека тие се склони кон преуредување.
4 Како да биде избран вектор
Одбирањето вектори бара еден за да осигура дека направената библиотека е претставителна за целиот геном. Секој додаток на геномот добиен од рестрикционен ензим треба да има еднакви шанси да биде во библиотеката во споредба со кој било друг внес. Понатаму, рекомбинантните молекули треба да содржат доволно големи внесови за да биде осигурано дека големината на библиотеката може лесно да биде ракувано. Ова е особено определено од бројот на клонови што треба да се имаат во библиотеката. Бројот на клонови за да биде добиен примерок од сите гени е одредуван според големината на геномот на организмот, како и просечната големина на внесот. Ова е претставено со формулата (исто така позната како Карбон-Кларкова формула):<math>N=\frac{ln (1-P)}{ln (1-f)}</math>
каде,
<math>N</math> е потребниот број на рекомбинанти<math>P</math> е посакуваната веројатност дека кој било фрагмент во геномот ќе се појави барем еднаш во создадената библиотека
<math>f</math> е фракциониот дел од геномот во една рекомбинантна
<math>f</math> понатаму може да се покаже дека е:
<math>f=\frac{i}{g}</math>
каде,
<math>i</math> е големината на внесот
<math>g</math> е големината на геномот
Така, зголемувањето на големината на внесот (по избор на вектор) ќе овозможи помалку клонови потребни за претставување на геномот. Пропорцијата на големината на внесот наспроти големината на геномот го претставува делот на соодветниот геном во еден клон. Еве ја равенката со сите разгледани делови:
<math>N=\frac{ln (1-P)}{ln (1-\frac{i}{g})}</math>
4.1 Пример за избор на вектор
Горенаведената формула може да биде користена за да биде одредено нивото на доверба од 99% дека сите низи во геномот се претставени со користење на вектор со големина на вметнување од дваесет илјади базни парови (како што е векторот на фагот ламбда). Големината на геномот на организмот е три милијарди базни парови во овој пример.
<math>N=\frac{ln (1-0.99)}{ln [1-\frac{2.0\times10^4 basepairs}{3.0\times10^9 basepairs}]}</math><math>N=\frac{-4.61}{-6.7\times10^{-6</math><math>N=688,060</math> клонови
Така, потребни се приближно 688.060 клонови за да биде обезбедена 99% веројатност дека дадена низа на ДНК од овој геном од три милијарди базни парови ќе биде присутна во библиотека со помош на вектор со големина на вметнување од дваесет илјади базни парови.
5 Примени
Откако ќе биде создадена библиотека, геномот на еден организам може да биде секвенциониран за да биде разјаснето како гените влијаат на организмот или да се споредат слични организми на ниво на геном. Гореспоменатите општогеномски студии за поврзување можат да идентификуваат кандидатски гени кои произлегуваат од многу функционални особини. Гените може да бидат изолирани преку геномски библиотеки и да бидат користени на човечки клеточни линии или животински модели за понатамошно истражување. Понатаму, создавањето клонови со висока верност со точна претстава на геномот и без проблеми со стабилноста, добро ќе придонесе како посредници за секвенционирањето со „сачмарка“ или проучување на целосни гени во функционалната анализа.
5.1 Хиерархиско секвенционирање
Една главна употреба на геномските библиотеки е хиерархиското секвенционирање со „сачмарка“, кое исто така е нарекувано секвенционирање „од горе-надолу“, „засновано на карта“ или „клон-по-клон“. Оваа стратегија била развиена во 1980-тите за секвенционирање на цели геноми пред да бидат достапни техники за секвенционирање со висока пропусна моќ. Поединечните клонови од геномските библиотеки може да бидат исечени на помали фрагменти, обично од 500bp до 1000bp, кои се попогодни за секвенционирање. Откако ќе биде секвенциониран клон од геномска библиотека, низата може да биде користи за прегледување на библиотеката за други клонови кои содржат внесови кои се преклопуваат со секвенционираниот клон. Сите нови клонови кои се преклопуваат потоа може да бидат секвенционирани и да образуваат контиг. Оваа техника, наречена хромозомско одење, може да биде искористена за да бидат секвенционирани цели хромозоми.
Секвенционирањето со „сачмарка“ на целиот геном е уште еден метод за секвенционирање на геномот кој не бара библиотека на вектори со висок капацитет. Наместо тоа, тој користи сметачки алгоритми за да собере кратки низи за читање за да го покрие целиот геном. Поради оваа причина, геномските библиотеки често се користени во комбинација со секвенционирање со „сачмарка“ на целиот геном. Може да биде создадена карта со висока резолуција со секвенционирање на двата краја на внесовите од неколку клонови во геномска библиотека. Оваа карта обезбедува низи на познати растојанија една од друга, што може да биде користена за да помогне во составувањето на читањата на низите добиени преку секвенционирање со „сачмарка“. Низата на човечкиот геном, која била прогласена за целосна во 2003 година, била составена со помош на библиотека на бактериски вештачки хромозом и секвенционирање со „сачмарка“.
5.2 Општогеномски студии за поврзување
Општогеномските студии за поврзување се општи примени за пронаоѓање специфични цели на гени и полиморфизми во човечката раса. Всушност, проектот „International HapMap“ бил создаден преку партнерство на научници и агенции од неколку земји за да ги каталогизираат и искористат овие податоци. Целта на овој проект е да бидат споредени генетските низи на различни поединци за да бидат разјаснети сличностите и разликите во хромозомските региони. Научниците од сите земји-учеснички ги каталогизираат овие атрибути со податоци од население од африканско, азиско и европско потекло. Ваквите општогеномски проценки може да доведат до понатамошни дијагностички и терапии со лекови, истовремено помагајќи им на идните работни групи да се насочуваат и да имаат на ум, создавање на терапевтски препарати со генетски особини. Овие концепти веќе се користени во генетското инженерство. На пример, истражувачка група всушност конструирала двофункционален вектор на P1 вештачки хромозом кој создава библиотека што претставува двократна покриеност на човечкиот геном. Ова би можело да послужи како неверојатен ресурс за да бидат идентификувани гени, или збирки гени, кои предизвикуваат болест. Згора на тоа, овие студии можат да послужат како моќен начин за истражување на транскрипциската регулација, како што е забележано во студијата за бакуловирусите. Претежно, напредокот во изградбата на библиотеката на геномот и секвенционирањето на ДНК овозможи ефикасно откривање на различни молекуларни цели. Претопувањето на овие особини преку такви ефикасни методи може да го забрза измислувањето нови кандидати за лекови.