Нуклеаза

Нуклеаза (порано позната како нуклеодеполимераза или полинуклеотидаза) е ензим кој врши сечење на фосфодиестерската врска помеѓу нуклеотидите на нуклеинските киселини. Нуклеазите може да создадат едноверижни или двоверижни пресеци во целните молекули на нуклеинските киселини. Во живите организми, тие се од суштинско значење во многу аспекти на поправката на ДНК молекулите. Дефектите во структурите на одредени нуклеази може да предизвика генетска нестабилност или имунодефициенција. Нуклеазите исто така често се користени во молекуларното клонирање.
Постојат две основни класификации на нуклеазите врз основа на центарот на активност. Егзонуклеазите ги разградуваат краевите на молекулите на нуклеинските киселини. Ендонуклеазите вршат сечење во средината на целните молекули на нуклеинските киселини. Тие дополнително можат да се поделат на деоксирибонуклеази (делуваат на ДНК) и рибонуклеази (делуваат на РНК).
1 Бројче систем на класифицирање
Повеќето нуклеази се класифицирани од страна на Бројот на ензимската комисија на „Комитетот за номенклатура на Интернационалната унија за биохемија и молекуларна биологија“ како хидролази (ЕЗ-број 3). Тие припаѓаат на естеразите, кои се подгрупа во рамките на хидролазите (ЕЗ-број 3.1). Естеразите во кои припаѓаат нуклеазите се класифицирани со ЕС-броеви 3.1.11 - ЕС-број 3.1.31.
2 Препознавање на врзувачкото место
Нуклеазата мора да се врзе за нуклеинската киселина пред да може да ја пресече молекулата. Ова значи дека ензимот треба да биде способен да го препознае своето место на врзување. Постојат неспецифични и специфични начини на врзување на нуклеазите за нуклеинските киселини. И двата начина играат значајни улоги во живите организми, особено во поправката на ДНК.
Неспецифичните ендонуклеази вклучени во поправката на ДНК може да ја скенираат ДНК молекулата за целни низи или оштетувања во нејзината структура. Овие нуклеази дифундираат по должината на ДНК додека не дојдат до целното место, по што следи интеракција помеѓу аминокиселинските остатоци од активното место на ензимот со хемиските групи на ДНК. Во случајот на ендонуклеазите како што се EcoRV, BamHI и PvuII, ова неспецифично врзување вклучува електростатички интеракции помеѓу минимална површина на белковината и ДНК молекулата.
Специфичните нуклеази градат појаки врски со ДНК молекулата, така што таа навлегува длабоко во жлебот на ДНК-врзувачкиот домен на ензимот. Ова резултира со значителна деформација на третичната структура на ДНК и се остварува со површини богати со базни (позитивно наелектризирани) аминокиселински остатоци. Електростатичката интеракција помеѓу ДНК и активното место на ензимот е екстензивна.
Некои нуклеази кои се вклучени во процесот на поправка на ДНК покажуваат делумна специфичност кон одредени низи. Сепак, повеќето нуклеази кои се вклучени во процесот на поправка на ДНК се неспецифични, и се способни само за препознавање на структурни абнормалности во ’рбетот на ДНК, предизвикани од погрешно спарување на азотните бази.
2.1 Нуклеази специфични за одредена низа
Ензим, Извор, Низа која ја препознава, Сече
''Hind''II, ''Haemophilus influenzae''
или G; или Т
Постојат повеќе од 900 рестрикциони ензими, некои се специфични за одредени низи, а некои не се. Тие биле изолирани од над 230 видови на бактерии од првото откритие на ''Hind''II. Имињата на овие ензими го одразуваат нивното потекло&mdash;првата буква од името доаѓа од родот на бактеријата, а втората и третата буква од видот на кој таа припаѓа. На пример, ''Eco''RI доаѓа од видот ''Escherichia coli'' RY13, додека ''Hind''II доаѓа од ''Haemophilus influenzae'' Rd. Броевите кои следат по името го означуваат редоследот по кој ензимите биле изолирани од дадениот сој на бактерии: ''Eco''RI, ''Eco''RII.
3 Ендонуклеази
Рестрикционата ендонуклеаза функционира така што ја „скенира“ должината на ДНК молекулата. По пронаоѓање на своето специфично место на врзување (односно специфична низа), ендонуклеазата се врзува за ДНК молекулата и прави еден засек во пентозо-фосфатниот ’рбет на двете вериги. Позициите на овие две засеци, и во однос на едниот кон другиот, и во однос на низата која ензимот ја препознава, се одредени од идентитетот на самата рестрикциона ендонуклеаза. Различни ендонуклеази прават различни засеци, но една одредена ендонуклеаза секогаш сече точно одредена низа на истиот начин, без разлика на која ДНК молекула делува. Резултатот на сечењето е фрагментирана ДНК молекула.
3.1 Назабени засеци
Не сите рестрикциони ендонуклеази прават симетрични засеци, како погоре опишаната ''Hind''II. Многу ендонуклеази го сечат ’рбетот на ДНК во позиции кои не се директно спротивни една на друга. На пример, нуклеазата ''Eco''RI има низа на препознавање <code>5'—GAATTC—3'</code>.
Ензим, Извор, Низа која ја препознава, Сече
''Hind''III, ''Haemophilus influenzae''''Eco''RI, ''Escherichia coli'', 5'–GAATTC-3'3'–CTTAAG–5', 5'–#9DF G #DDD AATTC-3'3'–#DDD CTTAA #9DF G-5'
''Bam''HI, ''Bacillus amyloliquefaciens'', 5'–GGATCC–3'3'–CCTAGG–5', 5'–#9DF G #DDD GATCC-3'3'–#DDD CCTAG #9DF G-5'
Кога ензимот ја препознава оваа низа, тој секоја од веригите ја сече помеѓу G и најблиската А. Откако засеците се направени, резултирачките фрагменти се држат заедно со релативно слаби водородни врски помеѓу комплементарните бази. Слабоста на овие врски овозможува ДНК фрагментите да се одделат еден од друг. Секој од двата фрагменти има протрудирачки 5' крај составен од неспарени бази. Други ензими создаваат пресеци во ДНК кои резултираат со протрудирачки 3' краеви. Ваквите протрудирачки краеви понекогаш се нарекуваат „лепливи краеви“, бидејќи тие имаат тенденција да се поврзат со комплементарни низи на бази. Со други зборови, ако неспарената низа <code>5'—AATT—3'</code> се сретне со друга неспарена низа <code>3'—TTAA—5'</code> тие ќе се поврзат една со друга&mdash;тие се „лепливи“ една за друга. Ензимот лигаза може да се искористи потоа за поврзување на пресеците во фосфатниот ’рбет. Ова својство на „лепливост“ овозможува создавање на рекомбинантни ДНК молекули, односно молекули кои се изградени од ДНК вериги кои потекнуваат од различни извори, што е основата на генетското инженерство.
4 Улога во природата
4.1 Поправка на ДНК
Многу нуклеази учествуваат во поправка на ДНК со препознавање на оштетените места и нивно отсекување. Овие ензими можат да функционираат самостојно или во комплекси. Повеќето нуклеази кои учествуваат во поправката на ДНК не се специфични за одредени низи. Тие ги препознаваат оштетените места на ДНК преку деформацијата на структурата на двојната верига.
4.1.1 Коректура на репликацијата
За време на репликацијата на ДНК, ДНК-полимеразите вршат елонгација на новите ДНК вериги имајќи ги како образец старите комплементарни вериги. Повеќето ДНК-полимерази имаат два различни ензимски домени: едниот домен има полимеразна активност, а другиот е егзонуклеаза која врши коректура. Полимеразата ја елонгира новата верига во насока 5' → 3'. Егзонуклеазата ги отстранува погрешно врзаните нуклеотиди од истата верига во насока 3' → 5'. Делециите кои ја деактивираат егзонуклеазата ја зголемуваат стапката на појава на мутации и со тоа стапката на морталитет кај афектираните организми.
4.1.2 Стопирана репликациона виљушка
Многу форми на оштетување на ДНК молекулата ја стопираат прогресијата на репликационата виљушка, поради што ДНК-полимеразите и асоцираните белковини ја напуштаат виљушката.
4.1.3 Обработка на Оказакиевите фрагменти
Отстранувањето на РНК прајмерите на Оказакиевите фрагменти е значаен чекор во репликацијата на ДНК. Повеќето вакви прајмери ги отстрануваат ендонуклеази од фамилијата RNase H.
4.1.4 Поправка на несовпаѓање во базните парови
Поправката на неусогласени базни парови ја вршат група на посебни ендонуклеази. Кај прокариотите, оваа улога најчесто ја вршат MutSLH системот и VSP системот.
4.1.5 Поправка со ексцизија на бази
АП местата (апурински/апиримидински места) се честа појава кај ДНК. Тие се резултат на спонтана хидролиза на нуклеотидите или на активноста на ДНК гликозилазите во процесот на поправка со екцизија на бази. Овие АП места биваат отстранети од страна на АП ендонуклеазите.
4.1.6 Поправка со ексцизија на нуклеотиди
Поправката со ексцизија на нуклеотиди вклучува отстранување и замена на оштетените нуклеотиди. Кратки низи на едноверижна ДНК кои содржат оштетени нуклеотиди биваат отстранети со помош на посебни ендонуклеази кои сечат возводно и низводно од оштетеното место.
4.1.7 Поправка на пресеци во двојната верига
Пресеците на двојната верига, без разлика дали се намерни или случајни, редовно се случуваат во клетките. Случајните пресеци најчесто се генерирани од страна на јонизирачко зрачење, разни егзогени или ендогени хемиски агенси и стопирани репликациони виљушки. Намерните пресеци се создаваат како интермедиери во процесот на мејоза и V(D)J рекомбинација, кои најчесто се поправаат преку хомологна рекомбинација и нехомологно поврзување на краевите. И во двата случаи потребно е краевите на пресеците на двојната верига да бидат обработени од нуклеази пред да започне процесот на поправка. Една таква нуклеаза е Mre11 комплексирана со Rad50.