Белковина за поправка на ДНК XRCC4

Белковина за поправка на ДНК XRCC4, познат и како белковина 4 за поправка на Х-зраци или XRCC4 е белковина кодирана кај луѓето од генот XRCC4. Покрај луѓето, белковината XRCC4 е изразенa и во многу други животни, габи и во растенијата. Вкрстено-комплементирачката белковина 4 за поправка на Х-зраци е еден од основните белковини вклучен во нехомологниот пат на поврзување на краевите (NHEJ) за поправка на прекините на ДНК двојни жици (DSBs).
NHEJ бара две главни компоненти за да се постигне успешно завршување. Првата компонента е кооперативното врзување и фосфорилација на артемисот од страна на каталитичката подединица на белковинската киназа зависна од ДНК (ДНК-PKcs). Артемида ги расцепува краевите на оштетената ДНК за подготвување за лигатура. Втората компонента вклучува премостување на ДНК со ДНК лигаза IV (LigIV), од XRCC4, со помош на Cernunnos-XLF. ДНК-PKcs и XRCC4 се закотвени на хетеродимерот Ku70/Ku80, кои се врзани за краевите на ДНК.
Бидејќи XRCC4 е клучната белковина која овозможува интеракција на LigIV со оштетената ДНК, а со тоа и врзување на краевите, било откриено дека мутациите во генот XRCC4 предизвикуваат ембрионска смртност кај глувците и развојна инхибиција и имунодефициенција кај луѓето.
1 Прекин во двојната низа
 DSB се предизвикани од слободните радикали генерирани од јонизирачко зрачење во околината и од нуспроизводи кои се ослободуваат постојано за време на клеточниот метаболизам. DSB кои не се ефикасно поправени може да резултираат со губење на важни гени за кодирање на белковини и регулаторни секвенци потребни за генска експресија неопходна за животот на клетката. DSB кои не можат да се потпрат на ново копираниот сестрински хромозом генериран со репликација на ДНК за да ја пополнат празнината ќе одат во патеката NHEJ. Овој метод на поправка е од големо значење бидејќи е последно средство за спречување на губењето на долги протегања на хромозомот. NHEJ исто така се користи за поправка на DSB генерирани за време на V(D)J рекомбинација кога генските региони се менуваат за да се создадат места за врзување на антиген на антитела и Т-клеточни рецептори.
1.1 Извори на оштетување на ДНК
Оштетувањето на ДНК се случува многу често и се создава од изложеност на различни егзогени и ендогени генотоксични извори. Едно од нив вклучува јонизирачко зрачење, како што се γ зрачење и Х-зраци, кои ги јонизираат деоксирибозните групи во столбот на ДНК и можат да индуцираат DSB. Реактивни видови кислород, ROS, како што е супероксид (О <sub>2</sub><sup>-</sup>), водород пероксид (H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>), хидроксилни радикали (HO<sup>•</sup>) и единечен кислород (<sup>1</sup>O<sub>2</sub>), исто така, можат да произведат DSB како резултат на јонизирачко зрачење, како и клеточни метаболички процеси кои природно се случуваат. DSB, исто така, може да бидат предизвикани од дејството на ДНК-полимеразата додека се обидуваат да реплицираат ДНК преку засек што бил воведен како резултат на оштетување на ДНК.
1.2 Последици од DSB
Постојат многу видови на оштетување на ДНК, но DSB, особено, се најштетни бидејќи и двете нишки се целосно одвоени од остатокот од хромозомот. Ако не постои ефикасен механизам за поправка, краевите на ДНК на крајот може да се деградираат, што ќе доведе до трајно губење на низата. Двоверижна празнина во ДНК, исто така, ќе го спречи продолжувањето на репликацијата, што ќе резултира со нецелосна копија на тој специфичен хромозом, насочена кон клетката за апоптоза. Како и со сите оштетувања на ДНК, DSB може да воведат нови мутации кои на крајот може да доведат до рак.
1.3 Методи за поправка на DSB
Постојат два методи за поправка на DSB во зависност од тоа кога се случува оштетувањето за време на митозата. Ако DSB се појави откако репликацијата на ДНК ќе ја заврши постапката S фаза од клеточниот циклус, патеката за поправка на DSB ќе користи хомологна рекомбинација со спарување со новосинтетизираната ќерка-влакна за да го поправи прекинот. Меѓутоа, ако DSB се генерира пред синтезата на сестринскиот хромозом, тогаш потребната секвенца на шаблоните ќе ја нема. За оваа околност, патеката NHEJ обезбедува решение за поправка на прекинот и е главниот систем што се користи за поправка на DSB кај луѓето и повеќеклеточните еукариоти. За време на NHEJ, многу кратки делови на комплементарна ДНК, 1 bp или повеќе во исто време, се хибридизираат заедно, а настрешниците се отстранети. Како резултат на тоа, овој специфичен регион од геномот е трајно изгубен и бришењето може да доведе до рак и предвремено стареење.
2 Својства
2.1 Гени и белковини
Човечкиот XRCC4 ген се наоѓа на хромозомот 5, поточно на 5q14.2. Овој ген содржи осум егзони и три варијанти на транскрипт, кои кодираат две различни белковински изоформи. Транскриптната варијанта 1, mRNA, RefSeq NM_003401.3, е долга 1688 bp и е најкратката од трите варијанти. Му недостига кратка низа во 3' кодирачки регион во споредба со варијантата 2. Изоформата 1 содржи 334 аминокиселини. Транскриптната варијанта 2, mRNA, RefSeq NM_022406, е долга 1694 bp и ја кодира најдолгата изоформа 2, која содржи 336 аминокиселини. Транскриптската варијанта 3, RefSeq NM_022550.2, е 1735 bp и е најдолга, но ја кодира и истата изоформа 1 како и варијантата 1. Содржи дополнителна секвенца во 5'UTR на транскриптот на mRNA и нема кратка секвенца во 3' кодирачки регион во споредба со варијантата 2.
2.2 Структура
Белковината XRCC4 е тетрамер кој наликува на форма на гира која содржи два глобуларни краја разделени со долго, тенко стебленце. Тетрамерот е составен од два димери, а секој димер од две слични подединици. Првата подединица (L) содржи остатоци од аминокиселини 1 – 203 и има подолго стебленце од втората (S) која содржи остатоци 1 – 178.
Глобуларните N-терминални домени на секоја подединица се идентични. Тие се составени од два, антипаралелни бета-плочи кои се свртени еден кон друг во структура слична на бета сендвич (т.е. „срамнета“ бета-цилиндар) и се одделени со два алфа завојници од едната страна. N-крајот започнува со еден бета лист составен од нишки 1, 2, 3 и 4, проследен со мотив на завојница-свијок-завојница на двете алфа спирали, αA и αB, кој продолжува во нишките 5, 6, 7, а завршува со едно алфа-спирално стебленце на C-крајот. αA и αB се нормални еден на друг, и поради тоа што едниот крај на αB е делумно вметнат помеѓу двата бета-плочи, предизвикува тие да се разгорат еден од друг. Структурата на сендвич бета се одржува заедно преку три водородни врски помеѓу антипаралелните нишки 4 и 7 и една водородна врска помеѓу жиците 1 и 5.
Двете спирални стебленца помеѓу подединиците L и S се испреплетуваат со единечен вкрстување на левата страна во намотана намотка на врвот, во близина на топчестите области формирајќи конфигурација на палма. Овој регион е во интеракција со двата алфа-спирали на вториот димер во спротивна ориентација за да формира завоен сноп и тетрамер во форма рачен тег.
2.3 Пост-преведувачки модификации
Со цел XRCC4 да се одвои од цитоплазмата до јадрото за да се поправи DSB за време на NHEJ или да се заврши V(D)J рекомбинација, пост-транслациска модификација на лизин 210 со мал модификатор поврзан со убиквитин (SUMO) или сумојлација, потребно е. СУМО модификацијата на различни типови на белковини за поправка на ДНК може да се најде во топоизомеразите, базната ексцизиска гликозилаза TDG, Ku70/80 и BLM хеликазата. Конзервиран мотив обично е цел на SUMO модификација, ΨKXE (каде Ψ е гломазна, хидрофобна аминокиселина). Во случајот на белковината XRCC4, консензусната секвенца која го опкружува лизинот 210 е IKQE. Клетките на јајниците од кинески хрчак, CHO, кои ја изразуваат мутираната форма на XRCC4 на K210 не можат да се модифицираат со SUMO, не успеваат да се регрутираат во јадрото и наместо тоа се акумулираат во цитоплазмата. Понатаму, овие клетки не ја завршуваат успешно V(D)J рекомбинацијата и се чувствителни на зрачење.
2.4 Интеракции
По создавањето на DSB, Ku белковините ќе се движат низ цитоплазмата додека не го најдат местото на прекин и не се врзат за него. Ку регрутира XRCC4 и Cer-XLF и двата од овие белковини преку специфични остатоци комуницираат меѓусебно за да формираат комплекс на нуклеобелковински пори кој се обвива околу ДНК. Cer-XLF е хомодимер кој е многу сличен на XRCC4 во структурата и големината на неговите N-терминални и C-терминални домени. Остатоците аргинин 64, леуцин 65 и леуцин 115 во Cer-XLF комуницираат со лизините 65 и 99 во XRCC4 во нивните N-терминални домени. Тие заедно формираат сноп со влакно што се обвива околу ДНК во наизменичен модел. Хиперфосфорилацијата на C-терминалните алфа спирални домени на XRCC4 од DNA-PKcs ја олеснува оваа интеракција. Димерот XRCC4 се врзува за втор димер на соседната ДНК влакно за да создаде тетрамер за премостување на ДНК рано во NHEJ. Пред лигатурата, Lig IV се врзува за C-терминалното стебленце на XRCC4 на местото на прекин и го поместува вториот XRCC4 димер.
3 Механизам
3.1 NHEJ
Процесот на NHEJ вклучува XRCC4 и голем број цврсто поврзани белковини кои дејствуваат заедно за да го поправат DSB. Системот започнува со врзување на еден хетеродимерна белковина наречена Ku70/80 на секој крај на DSB за да се одржуваат блиску еден до друг како подготовка за ковалентна врска и да се спречи нивното разградување. Ku70/80 потоа секвестрира една каталитичка подединица на белковинска киназа зависна од ДНК (DNA-PKcs) на краевите на ДНК за да овозможи врзување на белковината Artemis со едниот крај од секоја ДНК-PKcs. Едниот крај на DNA-PKcs се спојува за да се стабилизира близината на DSB и да се овозможи хибридирање на многу кратки региони на комплементарност на ДНК. ДНК-PKcs потоа ја фосфорилира Артемида во серин/треонин за да ја активира нејзината егзонуклеазна активност и да ги расцепи нуклеотидите на опашките од едната нишка кои не се хибридизирани во насока од 5' до 3'. Два XRCC4 белковини се пост-транслација модифицирани за препознавање и локализација на Ku70/80 (5). Двата XRCC4 белковини се димеризираат заедно и се врзуваат за Ku70/80 на краевите на нишките на ДНК за да промовираат лигатура. Потоа, XRCC4 формира силен комплекс со ДНК лигаза IV, LigIV, кој е зајакнат со факторот сличен на Cernunnos XRCC4, Cer-XLF. Cer-XLF се врзува само за XRCC4 без директна интеракција со LigIV. Потоа, LigIV ги спојува краевите на ДНК со катализирање на ковалентна фосфодиестерска врска.
3.2 V(D)J рекомбинација
Рекомбинацијата V(D)J е преуредување на повеќекратни, различни генски сегменти во ДНК од герминативна линија за да се произведат уникатните белковински домени на бели крвни зрнца, Б-клетките и Т-лимфоцит, кои конкретно ќе препознаваат странски антигени како што се вируси, бактерии и патогени еукариоти. Б-клетките произведуваат антитела кои се лачат во крвотокот, а Т-клетките произведуваат рецептори кои штом ќе се преведат се транспортираат до надворешниот липиден двослој на клетката. Антителата се составени од два лесни и два тешки синџири. Местото за врзување на антигенот се состои од два променливи региони, VL и VH. Остатокот од структурата на антителата се состои од константни региони, CL, CH, CH2 и CH3. Локусот Капа кај глувчето шифрира лесен ланец на антитела и содржи приближно 300 генски сегменти за променливиот регион, V, четири J сегменти отколку што кодираат краток белковински регион и една константна, C, сегмент. За да се произведе лесен синџир со еден единствен тип на VL, кога Б-клетките се диференцираат, ДНК се преуредува за да инкорпорира уникатна комбинација на V и J сегментите. Спојувањето на РНК го спојува рекомбинираниот регион со сегментот C. Генот на тежок ланец, исто така, содржи бројни сегменти на разновидност, D и повеќе константни сегменти, Cμ, Cδ, Cγ, Cε, Ca. Рекомбинацијата се јавува во специфичен регион на генот кој се наоѓа помеѓу два мотива на конзервирана секвенца наречени сигнални секвенци на рекомбинација. Секој мотив е опкружен со секвенца од 7 bp и 9 bp што е одвоена со разделник од 12 bp, означен како класа 1, или разделник од 23 bp, означен како класа 2. Рекомбиназа составена од RAG1 и RAG2 подединици секогаш се расцепува помеѓу овие две места. Резултатите од расцепувањето се две структури на фиба за V и J сегментите, соодветно, а некодирачкиот регион сега се одвоени од V и J сегментите со DSB. Регионот за кодирање на фиба поминува низ процесот на NHEJ каде затворениот крај се расцепува и поправа. Некодирачкиот регион е кружен и деградиран. Така, NHEJ е исто така важен во развојот на имунолошкиот систем преку неговата улога во V(D)J рекомбинацијата.
4 Патологија
Неодамнешните студии покажале поврзаност помеѓу XRCC4 и потенцијалната подложност на различни патологии. Најчесто забележаната поврзаност е помеѓу XRCC4 мутациите и подложноста на канцери како што се ракот на мочниот меур, ракот на дојката и лимфомите. Студиите исто така укажале на потенцијална поврзаност помеѓу XRCC4 мутацијата и ендометриозата. Во овој поглед се проучува и автоимунитетот. Поврзаноста помеѓу XRCC4 мутациите и одредени патологии може да обезбеди основа за дијагностички биомаркери и, евентуално, потенцијален развој на нови терапевтски средства.
4.1 Подложност на рак
Полиморфизмите на XRCC4 се поврзани со ризик од чувствителност на рак како што се рак на мочниот меур, рак на дојка, рак на простата, хепатоцелуларен карцином, лимфоми и мултипен миелом. Во однос на ракот на мочниот меур, на пример, врската помеѓу XRCC4 и ризикот од подложност на рак се заснова на хистолошки студии за контрола на случаи во болница на варијанти на ген и на XRCC4 и XRCC3 и нивната можна поврзаност со ризикот за рак на уротелијален мочен меур. Поврзаноста со ризикот за чувствителност на рак на уротелијалниот мочен меур била прикажана за XRCC4, но не и за XRCC3. Што се однесува до ракот на дојка, поврзаноста со „зголемен ризик од рак на дојка“ била заснована на испитување на функционалните полиморфизми на генот XRCC4 што се носи во врска со мета-анализа на пет студии за контрола на случај. Исто така, постои барем една хистолошка студија за контрола на случаи во болница која покажува дека полиморфизмите во XRCC4 може да имаат „влијание“ врз подложноста на рак на простата. Условното (CD21-cre-посредувано) бришење на генот XRCC4 NHEJ во периферните Б-клетки на глувчето со дефицит на p53 резултирало со површински Иг-негативни Б-клеточни лимфоми, и овие лимфоми често имале „реципрочна хромозомска транслокација“ спојувајќи го IgH во Myc (и исто така имаше „големи хромозомски бришења или транслокации“ кои вклучуваат IgK или IgL, со IgL „соединување“ со онкогени или со IgH). XRCC4- и p53-дефицитарните про-Б лимфоми „рутински го активираат c-myc со генско засилување“; и дополнително, периферните Б-клеточни лимфоми со дефицит на XRCC4- и p53 „рутински ектопично активираат“ една копија од c-myc. Навистина, со оглед на набљудувањето на некои дека „ензимите за поправка на ДНК се корективни за оштетувањето на ДНК предизвикано од канцерогени и антиканцерогени лекови“, не треба да чуди што „SNP во гените за поправка на ДНК може да играат важна улога“ во подложност на рак. Покрај ракот идентификуван погоре, полиморфизмите XRCC4 се идентификувани како потенцијална врска со разни дополнителни видови на рак како што се рак на усна празнина, рак на белите дробови, рак на желудникот и глиоми.
4.2 Стареење
Намалувањето на способноста за поправка на прекините на ДНК со двојни жици со NHEJ може да биде значаен фактор во процесот на стареење. Ли и сор. открил дека, кај луѓето, ефикасноста на поправката на NHEJ опаѓа од возраст од 16 на 75 години. Нивната студија покажала дека намалената експресија на XRCC4 и другите NHEJ белковини предизвикува пад на ефикасноста и верноста на NHEJ поврзан со возраста. Тие сугерирале дека намалувањето на изразувањето на XRCC4 поврзано со возраста може да придонесе за стареење на клетките.
4.3 Автоимунитет
Врз основа на наодите дека (1) неколку полипептиди во патеката NHEJ се „потенцијални цели на автоантитела“ и (2) „еден од автоимуните епитопи во XRCC4 се совпаѓа со секвенца што е врска за регулаторни настани предизвикани од зрачење“, било предложено дека изложеноста на агенси кои воведуваат прекин на двојна жичка на ДНК „може да биде еден од факторите“ кои посредуваат во автоимуните одговори.
4.4 Склоност кон ендометриоза
Имало шпекулации дека „XRCC4 кодон 247*А и XRCC4 промотер -1394*T поврзани генотипови и алели, може да бидат поврзани со поголема чувствителност и патогенеза на ендометриоза“.
4.5 Потенцијална употреба како биомаркер за рак
Со оглед на можните асоцијации на XRCC4 полиморфизмите со ризикот од чувствителност на рак (види дискусија погоре), XRCC4 може да се користи како биомаркер за скрининг на рак, особено во однос на ракот на простата, ракот на дојката и ракот на мочниот меур. Всушност, полиморфизмите на XRCC4 биле конкретно идентификувани дека имаат потенцијал да бидат нови корисни обележувачи за „примарна превенција и антиканцерогена интервенција“ во случај на уротелијален карцином на мочниот меур.
4.6 Радиосензибилизација на клетките на туморот
Со оглед на улогата на XRCC4 во поправка на прекин на двојна жичка на ДНК, испитана е врската помеѓу нарушената функција на XRCC4 и радиосензибилизацијата на клетките на туморот. На пример, објавено е дека „таргетирањето со посредство на RNAi на некодирачките и кодирани секвенци во пораките на гените за поправка на ДНК ефикасно ги радиосензибилизира човечките туморски клетки“.
4.7 Потенцијална улога во терапевтиката
Имало дискусија во литературата за потенцијалната улога на XRCC4 во развојот на нови терапевти. На пример, Ву ''и сор.'' сугерирале дека со оглед на тоа што генот XRCC4 е „критичен во NHEJ“ и е „позитивно поврзан со подложноста на рак“, некои XRCC4 SNP, како што е G-1394T (rs6869366) „може да послужат како вообичаен SNP за откривање и предвидување на различни видови на рак. (досега за рак на дојка, желудник и простата...)“; и, иако е потребна дополнителна истрага, „тие може да послужат како кандидатски цели за персонализирани антиканцерогени лекови“. Можноста за откривање на ендометриоза на оваа основа, исто така, била спомната, а тоа исто така може да доведе до евентуален развој на третмани. Во оценувањето на понатамошните можности за антиканцерогени третмани, Ву ''и сор''. исто така ја коментирал важноста на „заедничките третмани на агенси и зрачење што ја оштетуваат ДНК“. Поточно, Ву ''и сор''. истакна дека „рамнотежата помеѓу оштетувањето на ДНК и капацитетот на механизмите за поправка на ДНК го одредува конечниот терапевтски исход“ и „капацитетот на клетките на ракот да ги комплетираат механизмите за поправка на ДНК е важен за терапевтската резистенција и има негативно влијание врз терапевтската ефикасност“, и на тој начин се теоретизира дека „[p]фармаколошката инхибиција на неодамна откриените цели за поправка на ДНК со неколку соединенија со мали молекули... има потенцијал да ја подобри цитотоксичноста на антиканцерогените агенси“.
4.8 Микроцефалично исконски џуџест раст
Кај луѓето, мутациите во генот XRCC4 предизвикуваат микроцефаличен примордијален џуџест раст, фенотип што се карактеризира со изразена микроцефалија, фацијален дисморфизам, доцнење во развојот и низок раст. Иако имуноглобулинската спојна разновидност е нарушена, овие лица не покажуваат препознатлив имунолошки фенотип. За разлика од индивидуите со LIG4 мутација, панцитопенија што резултира со инсуфициенција на коскената срцевина не е забележана кај индивидуи со дефицит на XRCC4. На клеточно ниво, нарушувањето на XRCC4 индуцира хиперсензитивност на агенси кои индуцираат прекини на двојни жици, неисправна поправка на прекин на двојната жица и зголемена апоптоза по индукција на оштетување на ДНК.
5 Анти-XRCC4 антитела
Развиени се анти-XRCC4 антитела вклучувајќи фосфоспецифични антитела кон pS260 и pS318 во XRCC4. Антителата на XRCC4 можат да имаат различни намени, вклучително и употреба во имуноанализи за спроведување на истражувања во области како што се оштетување и поправка на ДНК, нехомологно поврзување на крајот, фактори на транскрипција, епигенетика и јадрена сигнализација.
6 Историја
Истражувањето спроведено во 1980-тите открило дека клеточниот мутант на јајниците од кинески хрчак (CHO) наречен XR-1 бил „исклучително чувствителен“ во однос на тоа да биде убиен од гама зраци за време на G1 делот од клеточниот циклус, но, во истите истражувачки студии, покажало „речиси нормална отпорност“ на оштетување на гама-зраците за време на доцната S фаза; и во текот на ова истражување, чувствителноста на клеточниот циклус на XR-1 било во корелација со неговата неспособност да ги поправи прекините на ДНК со двојни жици произведени од јонизирачко зрачење и рестриктивните ензими. Конкретно, во една студија која користи соматски клеточни хибриди на XR-1 клетки и човечки фибробласти, Giaccia ''et al.'' (1989) покажала дека мутацијата XR-1 е рецесивна мутација; и во продолжение на оваа работа, Giaccia ''et al.'' (1990) спровел дополнителни студии кои ја испитувале мутацијата XR-1 (повторно користејќи соматски клеточни хибриди формирани помеѓу XR-1 и човечки фибробласти) и биле во можност да го мапираат човечкиот ген за дополнување на хромозомот 5 користејќи анализа на сегрегација на хромозомите. Giaccia ''и сор.'', привремено му го доделил на овој човечки ген името „XRCC4“ (кратенка од „ген 4 за кинески хрчак што го надополнува рендгенот“) и утврдиле дека (а) новоименуваниот ген XRCC4 биохемиски го вратил дефектот на хрчакот на нормални нивоа на отпорноста на гама-зрачење и блеомицин и (б) генот XRCC4. Врз основа на овие наоди, Giaccia ''et al.'' предложил дека XRCC4 - како единствен ген - е одговорен за фенотипот XR-1.