Микросателит

Микросателит ― тракт на повторувачка ДНК во која одредени мотиви на ДНК (во должина од еден до шест или повеќе базни парови) се повторуваат, обично 5-50 пати. Микросателитите се појавуваат на илјадници места во геномот на организмот. Тие имаат повисока стапка на мутација од другите области на ДНК што доведува до висока генетска разновидност. Микросателитите често се нарекувани кратки тандемски повторувања од страна на форензичарите и во генетската генеалогија, или како едноставни повторувања на низи од страна на растителните генетичари.
Микросателитите и нивните подолги роднини, минисателитите, заедно се класифицирани како променлив број на тандемски повторувања на ДНК. Името „сателитска“ ДНК се однесува на раното набљудување дека центрифугирањето на геномската ДНК во епрувета одвојува истакнат слој на волуменска ДНК од придружните „сателитски“ слоеви на повторувачка ДНК.
Тие се широко користени за профилирање на ДНК во дијагноза на рак, во анализа на сродство (особено тестирање за татковство) и во форензичка идентификација. Тие се користени и во анализата на генетската поврзаност за наоѓање на ген или мутација одговорна за дадена особина или болест. Микросателитите се користени и во популационата генетика за мерење на нивоата на поврзаност помеѓу подвидовите, групите и поединците.
1 Историја
Иако првиот микросателит бил окарактеризиран во 1984 година на Универзитетот во Лестер од страна на Велер, Џефрис и неговите колеги како полиморфно GGAT повторување во генот на човечкиот миоглобин, поимот „микросателит“ бил воведен подоцна, во 1989 година, од Лит и Лути. Името „сателитска“ ДНК се однесува на раното набљудување дека центрифугирањето на геномската ДНК во епрувета која одвојува истакнат слој на волуменска ДНК од придружните „сателитски“ слоеви на повторувачка ДНК. Зголемената достапност на засилување на ДНК со полимеразна верижна реакција на почетокот на 1990-тите поттикнала голем број студии со користење на засилување на микросателити како генетски маркери за судска медицина, за тестирање на татковството и за положбено клонирање за да биде најде генот што лежи во основата на особина или болест. Истакнати рани примени се идентификации со микросателитско генотипирање на осумгодишните скелетни остатоци на британска жртва на убиство (Хагелберг и колегитем, 1991 година), и на лекарот од концентрациониот логор Аушвиц, Јозеф Менгеле, кој побегнал во Јужна Америка по Втората светска војна (Џефрис и колегите, 1992).
2 Структури, местоположби и функции
Микросателитот е тракт од тандемско повторувани (т.е. соседни) мотиви на ДНК кои се движат во должина од еден до шест или до десет нуклеотиди (точната дефиниција и разграничување на подолгите минисателити варира од автор до автор), и обично се повторуваат 5-50 пати. На пример, низата TATATATATA е динуклеотиден микросателит, а GTCGTCGTCGTCGTC е тринуклеотиден микросателит (со A се аденин, G гванин, C цитозин и T тимин). Повторливите единици од четири и пет нуклеотиди се нарекувани тетра- и пентануклеотидни мотиви, соодветно. Повеќето еукариоти имаат микросателити, со забележителен исклучок на некои видови квасец. Микросателитите се распределени низ геномот. Човечкиот геном на пример содржи 50.000-100.000 динуклеотидни микросателити и помал број на три-, тетра- и пентануклеотидни микросателити. Многу од нив се сместени во некодирачки делови на човечкиот геном и затоа не произведуваат белковини, но тие исто така можат да бидат сместени во регулаторни региони и региони за кодирање.
Микросателитите во некодирачките региони можеби немаат некоја посебна функција и затоа не може да бидат избрани против; ова им овозможува да собираат мутации непречено во текот на генерациите и доведува до променливост што може да биде користена за отпечатоци од ДНК и цели за идентификација. Другите микросателити се наоѓаат во регулаторните странични или интронични региони на гените, или директно во кодоните на гените – микросателитски мутации во такви случаи може да доведат до фенотипски промени и болести, особено кај болести со тројна ширење како што се кревкиот Х синдром и Хантингтоновата болест.
Теломерите се линеарни низа на ДНК кои седат на самите краеви на хромозомите и го штитат интегритетот на геномскиот материјал за време на последователни кругови на клеточна делба поради „проблемот со репликација на крајот“. Во белите крвни зрнца, било покажано дека постепеното скратување на теломерната ДНК е во обратна корелација со стареењето во неколку видови примероци. Теломерите се состојат од повторувачка ДНК, со хексануклеотидниот повторен мотив TTAGGG кај 'рбетниците. Затоа тие се класифицирани како минисателити. Слично на тоа, инсектите имаат пократки повторливи мотиви во нивните теломери кои би можеле да бидат сметани за микросателити.
3 Механизми на мутации и стапки на мутации
За разлика од точкестите мутации, кои влијаат само на еден нуклеотид, микросателитните мутации доведуваат до зголемување или губење на цела повторлива единица, а понекогаш и две или повеќе повторувања истовремено. Така, стапката на мутација на микросателитски локуси е очекувана да се разликува од другите стапки на мутација, како што се стапките на базна замена. Стапката на мутација кај микросателитски локуси зависи од низата на повторувачки мотиви, бројот на повторени мотивски единици и чистотата на канонската повторена низа. Разгледани се различни механизми за мутација на микросателитски локуси, и нивната добиена полиморфна природа е квантифицирана. Дебатирано е за вистинската причина за мутации кај микросателитите.
Една предложена причина за таквите промени во должината е лизгањето на репликацијата, предизвикано од неусогласеноста помеѓу нишките на ДНК додека се реплицираат за време на мејозата. ДНК-полимеразата, ензимот одговорен за читање на ДНК за време на репликацијата, може да се лизне додека се движи по шаблонот и да продолжи на погрешен нуклеотид. Лизгањето на ДНК полимеразата е поверојатно да се случи кога е реплицирана повторувачка низа (како што е CGCGCG). Бидејќи микросателитите се состојат од такви повторувачки низи, ДНК-полимеразата може да прави грешки со поголема стапка во овие региони на низа. Неколку студии пронашле докази дека лизгањето е причина за микросателитски мутации. Вообичаено, лизгањето во секој микросателит се случува околу еднаш на 1.000 генерации. Така, промените на лизгање во повторливите ДНК се за три реда на големина почести од точкестите мутации во другите делови на геномот. Повеќето лизгања резултираат со промена на само една единица за повторување, а стапките на лизгање се разликуваат за различни должини на алели и големини на повторени единици, и во различни видови. Ако постои голема разлика во големината помеѓу поединечните алели, тогаш може да има зголемена нестабилност за време на рекомбинација при мејоза.
Друга можна причина за микросателитски мутации се точкестите мутации, каде што само еден нуклеотид е погрешно копиран за време на репликацијата. Студијата која ги споредува геномите на луѓето и приматите покажа дека повеќето промени во бројот на повторувања кај кратките микросателити се појавуваат поради точкести мутации, а не поради лизгање.
3.1 Стапки на мутација на микросателити
Директни проценки на стапките на мутации на микросателитите се направени кај бројни организми, од инсекти до луѓе. Во пустинскиот скакулец ''Schistocerca gregaria'', стапката на мутација на микросателитот била проценета на 2,1 × 10<sup>−4</sup> по генерација по локус. Стапката на микросателитски мутации кај човечките машки зародишни клетки е пет до шест пати повисока отколку кај женските зародишни клетки и се движи од 0 до 7 × 10<sup>−3</sup> по локус по гамета по генерација. Во нематодата ''Pristionchus pacificus'', проценетата стапка на мутација на микросателитот се движи од 8,9 × 10<sup>−5</sup> до 7,5 × 10<sup>−4</sup> по локус по генерација.
Стапките на мутации на микросателитот варираат во зависност од положбата на базата во однос на микросателитот, видот на повторување и идентитетот на базата. Стапката на мутација се зголемува конкретно со бројот на повторувања, достигнувајќи го својот врв околу шест до осум повторувања, а потоа повторно е намалува. Зголемената хетерозиготност кај населението, исто така, ќе ги зголеми стапките на микросателитски мутации, особено кога има голема разлика во должина помеѓу алелите. Ова најверојатно се должи на хомологните хромозоми со краци со нееднаква должина што предизвикуваат нестабилност за време на мејозата.
4 Биолошки ефекти на микросателитски мутации
Многу микросателити се наоѓаат во некодирачка ДНК и се биолошки тивки. Други се сместени во регулаторна или дури и кодирана ДНК – микросателитски мутации во такви случаи може да доведат до фенотипски промени и болести. Општо геномска студија проценува дека варијациите на микросателитите придонесуваат со 10-15% од варијациите на наследното генско изразување кај луѓето.
4.1 Ефекти врз белковините
Кај цицачите, 20-40% од белковините содржат повторувачки низи на аминокиселини кодирани со повторувања на кратки низи. Повеќето од кратките низи кои се повторуваат во деловите на геномот кои кодираат белковини имаат повторлива единица од три нуклеотиди, бидејќи таа должина нема да предизвика поместување на рамката кога мутира. Секоја тринуклеотидна низа која се повторува се транскрибира во повторувачка серија од истата аминокиселина. Кај квасецот, најчестите повторени аминокиселини се глутаминот, глутаминската киселина, аспарагинот, аспарагинската киселина и серинот.
Мутациите во овие сегменти кои се повторуваат може да влијаат на физичките и хемиските својства на белковините, со потенцијал за производство на постепени и предвидливи промени во дејството на белковините. На пример, промените на должината во регионите кои се повторуваат во тандем во генот Runx2 доведуваат до разлики во должината на лицето кај припитомените кучиња (''Canis familiaris''), со поврзаност помеѓу подолги должини на низата и подолги лица. Ова поврзување се однесува и на поширок опсег на видови кои припаѓаат во редот ѕверови. Промените во должината на полиаланински трактати во рамките на генот HOXA13 се поврзани со синдромот „рака-стапало-гениталија“, развојно нарушување кај луѓето. Промените во должината на другите повторувања на тројката се поврзани со повеќе од 40 невролошки заболувања кај луѓето, особено тринуклеотидните пореметувања како што се кревкиот Х синдром и Хантингтоновата болест. Еволутивните промени од лизгањето на репликацијата се случуваат и кај поедноставните организми. На пример, промените во должината на микросателитот се вообичаени во површинските мембрански белковини во квасецот, обезбедувајќи брза еволуција во својствата на клетките. Поточно, промените во должината во генот FLO1 го контролираат нивото на адхезија на супстратите. Повторувањата на кратки низи, исто така, обезбедуваат брза еволутивна промена на површинските белковини кај патеногените бактерии; ова може да им овозможи да бидат во тек со имунолошките промени кај нивните домаќини. Промените на должината во кратка низа повторувања кај габата (''Neurospora crassa'') го контролираат времетраењето на нејзините циклуси на деноноќниот часовник.
4.2 Ефекти врз регулацијата на гените
Промените во должината на микросателитите во рамките на промоторите и другите цис-регулаторни региони може брзо да го променат генското изразување, меѓу генерациите. Човечкиот геном содржи многу (>16.000) кратки низи кои се повторуваат во регулаторните региони, кои обезбедуваат „копчиња за нагодување“ на изразување на многу гени.
Промените во должината на бактериските едноставни низни повторувања може да влијаат на создавањето на фимбриите кај ''Haemophilus influenzae'', со менување на растојанието помеѓу промоторите. Динуклеотидните микросателити се поврзани со изобилни варијации во цис-регулаторните контролни региони во човечкиот геном. Микросателитите во контролните региони на генот на рецепторот на вазопресин 1а во булките влијаат на нивното општествени однесување и нивото на моногамија.
Кај Јуинговиот сарком (вид болен рак на коските кај младите луѓе), точкеста мутација создава проширен GGAA микросателит кој го врзува факторот на транскрипција, кој пак го активира генот EGR2 кој го движи ракот. Дополнително, други GGAA микросателити може да влијаат на изразувањето на гените кои придонесуваат за клиничкиот исход на пациентите со Јуингов сарком.
4.3 Ефекти во рамките на интроните
Микросателитите во интроните исто така влијаат на фенотипот, преку средства кои моментално не се разбрани. На пример, тројното ширење на GAA во првиот интрон на генот X25 се чини дека се меша со транскрипцијата и предизвикува Фридрајхова атаксија. Тандемските повторувања во првиот интрон на генот аспарагинска синтетаза се поврзани со акутна лимфобластична леукемија. Повторениот полиморфизам во четвртиот интрон на генот NOS3 е поврзан со хипертензија кај туниското население. Намалените должини на повторувања во генот EGFR се поврзани со остеосаркомите.
Познато е дека архаичниот облик на спојување зачувана во зебрестата риба користи микросателитски низи во интроничната информациска РНК за отстранување на интроните во отсуство на U2AF2 и други начини за спојување. Теоретизирано е дека овие низи образуваат високо стабилни конфигурации на листовите на детелина кои ги доведуваат местата на спојување на интроните 3' и 5' во непосредна близина, ефикасно заменувајќи го сплајцеозомот. Овој метод на спојување на РНК се верува дека се оддалечил од човечката еволуција при создавањето на четириношците и дека претставува артефакт на светот на РНК.
4.4 Ефекти во транспозоните
Речиси 50% од човечкиот геном е содржан во различни видови транспозони (исто така наречени „скокачки гени“), а многу од нив содржат повторувачка ДНК. Веројатно е дека повторувањата на кратки низи на тие места исто така се вклучени во регулирањето на генското изразување.
5 Примени
Микросателитите се користат за проценка на бришењата на хромозомската ДНК при дијагноза на рак. Микросателитите се широко користени за анализа на ДНК, познато и како „генетски отпечаток“, на злосторнички дамки (во форензиката) и на ткива (кај пресадувани пациенти). Тие исто така се широко користени во анализата на сродството (најчесто во тестирањето за татковство). Исто така, микросателитите се користени за картирање на места во геномот, конкретно во анализа на генетско поврзување за наоѓање ген или мутација одговорна за дадена особина или болест. Како посебен случај на картирање, тие може да бидат користени за студии за удвојување или бришење на гените. Истражувачите користат микросателити во генетиката на населението и во проектите за зачувување на видовите. Растителните генетичари предложиле употреба на микросателити за маркерски потпомогнат избор на посакуваните особини во одгледувањето растенија.
5.1 Дијагноза на рак
Во клетките на туморот, чии контроли за репликација се оштетени, микросателитите може да бидат добиени или изгубени на особено висока честота за време на секој круг на митоза. Оттука, туморската клеточна линија може да покаже различен генетски отпечаток од оној на ткивото домаќин и, особено кај ракот на дебелото црево, може да се манифестира со губење на хетерозиготноста. Микросателитите анализирани во првичното ткиво затоа рутински се користени во дијагнозата на ракот за да биде проценет напредокот на туморот. Општо геномските поврзани студии биле користени за да бидат идентификувани микросателитски биомаркери како извор на генетска предиспозиција кај различни видови рак.
5.2 Судско-медицинско наоѓање отпечатоци
Микросателитската анализа станала популарна во областа на форензиката во 1990-тите. Користена е за генетско земање отпечатоци на поединци каде што дозволува форензичка идентификација (обично одговарање на злосторничка дамка со жртва или сторител). Исто така е користена за следење на пациенти со пресадување на коскена срцевина.
Микросателитите кои се користени денес за форензичка анализа се сите тетра- или пента-нуклеотидни повторувања, бидејќи тие даваат висок степен на податоци без грешки, додека се доволно кратки за да преживеат разградување во неидеални услови. Дури и пократките повторувачки низи ќе имаат тежнеење да страдаат од артефакти како што се треперење со полимеразната верижна реакција и преференцијално засилување, додека подолгите повторувачки низи ќе страдаат повеќе од разградација во животната средина и би се засилувале помалку добро со полимеразната верижна реакција. Друго форензичко размислување е дека мора да биде почитувано е медицинската приватност на личноста, така што се избирани форензички кратки тандемски повторувања кои не се кодираат, не влијаат на генската регулација и обично не се тринуклеотидни кратки тандемски повторувања кои би можеле да бидат вклучени во болести со тројно ширење, како што е Хантингтоновата болест. Форензичките профили со кратки тандемски повторувања се чувани во бази на податоци за ДНК како што е Националната база на податоци за ДНК на Обединетото Кралство, Индексниот систем на комбинирана ДНК од Соединетите Држави, или австралиската Национална база на податоци за ДНК за злосторнички истраги.
5.3 Анализа на сродство (тестирање за татковство)
Автосомните микросателити се широко користени за анализа на ДНК во анализата на сродството (најчесто во тестирањето за татковство). Наследените Y-STR (микросателити на Y хромозомот) често се користени во генеалошкото тестирање на ДНК.
5.4 Анализа на генетска поврзаност
Во текот на 1990-тите и првите неколку години од овој милениум, микросателитите биле клучните генетски маркери за скенирања на целиот геном за наоѓање на кој било ген одговорен за даден фенотип или болест, користејќи набљудувања на сегрегација низ генерации на примерок од педигре. Иако порастот на поголема пропусност и економични платформи за еднонуклеотиден полиморфизам довел до времето на еднонуклеотиден полиморфизам за скенирања на геномот, микросателитите остануваат високо информативни мерки за геномската варијација за студии за поврзување. Нивната постојана предност лежи во нивната поголема алелна разновидност од двоалелните еднонуклеотидни полиморфизми, така што микросателитите можат да ги разликуваат алелите во рамките на интересен блок за нерамнотежа на поврзување дефиниран од еднонуклеотиден полиморфизам. Така, микросателитите успешно довеле до откритија на дијабетес тип 2 (TCF7L2) и гени за рак на простата (регионот 8q21).
5.5 Генетика на населението
Микросателитите биле популаризирани во популационата генетика во текот на 1990-тите, бидејќи како што полимеразната верижна реакција стана сеприсутна во лабораториите, истражувачите биле во можност да дизајнираат зачетници и да ги засилуваат групите на микросателити по ниска цена. Нивната употреба е широка. Микросателитот со неутрална еволутивна историја го прави применлив за мерење или заклучување на тесните грла, месното приспособување, индексот на алелна фиксација (F<sub>ST</sub>), големината на населението, и протокот на гените. Како што масивното напоредно секвенционирање станува подостапно, употребата на микросателити е намалена, но сепак тие остануваат клучна алатка во оваа област.
5.6 Одгледување растенија
Одбирањето со помош на маркер е индиректна постапка на одбирање каде интересна особина е избирана врз основа на маркер (морфолошка, биохемиска или варијација на ДНК/РНК) поврзан со особина од интерес (на пр. продуктивност, отпорност на болести, толеранција кон стрес и квалитет), наместо на самата особина. Микросателитите се предложени да бидат користени како такви маркери за да помогнат при одгледувањето на растенијата.
6 Анализа
Повторливата ДНК не е анализирана лесно со методите за масивното напоредно секвенционирање на ДНК, бидејќи некои технологии се борат со хомополимерните патишта. Создадени се разновидни софтверски пристапи за анализа или за читање на секвенционирање на ДНК од необработено следното потекло за да биде одреден генотипот и варијантите на повторливи локуси. Микросателитите може да бидат анализирани и проверени со воспоставено засилување со полимеразна верижна реакција и одредување на големината на ампликонот, понекогаш проследено со Сенгеровото секвенционирање на ДНК.
Во форензиката, анализата е вршена со екстракција на јадрена ДНК од клетките на примерок од интерес, а потоа засилување на специфични полиморфни региони на извлечената ДНК со помош на полимеразна верижна реакција. Откако овие низи ќе бидат засилени, тие се решавани или преку гелна електрофореза или капиларна електрофореза, што ќе му овозможи на аналитичарот да одреди колку повторувања на микросателитната низа за која станува збор има. Ако ДНК е разрешена со гелна електрофореза, ДНК може да биде видена или со боење со сребро (ниска чувствителност, безбедно, евтино) или со интеркалирана боја како што е етидиум бромид (прилично чувствителна, умерени здравствени ризици, евтино) или како најсовремени форензички лаборатории користат, флуоресцентни бои (високо чувствителни, безбедни, скапи). Инструментите изградени за разрешување на микросателитски фрагменти со капиларна електрофореза исто така користат флуоресцентни бои. Форензичките профили се чувани во главните бази на податоци. Британската база на податоци за идентификација на микросателитски локуси првично била заснована на британскиот систем наречен Второгенерациски мултиплекс плус. користејќи 10 маркери за локуси и маркер за пол. Во Соединетите Држави, бил зголемен овој број на 13 маркери за локуси. Австралиската Национална база на податоци за ДНК за злосторнички истраги од 2013 година користи 18 основни маркери за анализа на ДНК.
6.1 Засилување
Микросателитите може да бидат засилени за идентификација со постапката полимеразна верижна реакција, користејќи ги уникатните низи на странични региони како зачетници. ДНК постојано е денатурирана на висока температура за да биде одвои двојното влакно, а потоа е ладена за да биде овозможено жарење на зачетници и проширување на нуклеотидните низи низ микросателитот. Оваа постапка резултира со производство на доволно ДНК за да биде видлива на агарозни или полиакриламидни гелови; само мали количества на ДНК се потребни за засилување бидејќи на овој начин термоциклирањето создава експоненцијално зголемување на реплицираниот сегмент. Со изобилството на технологија на полимеразна верижна реакција, зачетниците што ги наоѓаат страничните микросателитски места се едноставни и брзи за употреба, но развојот на правилно функционални зачетници често е мачна и скапа постапка.
6.2 Дизајн на микросателитските зачетници
Ако се барани микросателитски маркери во одредени региони на геномот, на пример во одреден интрон, зачетниците може да бидат дизајнирани рачно. Ова вклучува пребарување на низата на геномската ДНК за повторувања на микросателити, што може да биде направена со обично гледање или со користење на автоматизирани алатки како што е . Откако ќе бидат утврдени потенцијално корисните микросателити, страничните низи може да бидат користени за дизајнирање на олигонуклеотидни зачетници кои ќе го засилат специфичното повторување на микросателитот во полимеразна верижна реакција.
Случајните микросателитски зачетници може да бидат развиени со клонирање на случајни сегменти на ДНК од фокалните видови. Овие случајни сегменти се вметнуваат во плазмиден или бактериофазен вектор, кој пак е засаден во бактеријата ''Escherichia coli''. Потоа се развиваат колонии и се прикажуваат со флуоресцентно обележани олигонуклеотидни низи кои ќе бидат хибридирани со повторување на микросателитот, доколку се присутни на ДНК сегментот. Ако може да бидат добиени позитивни клонови од оваа постапка, ДНК е секвенционирана и зачетниците со полимеразна верижна реакција се избирани од низите кои граничат со таквите региони за да биде одреден специфичен локус. Ова постапка вклучува значителни обиди и грешки од страна на истражувачите, бидејќи низите на повторување на микросателитот мора да бидат предвидени, а зачетниците кои се случајно изолирани може да не покажуваат значителен полиморфизам. Микросателитски локуси се широко распространети низ геномот и може да бидат изолирани од полуразградена ДНК на постари примероци, бидејќи сè што е потребно е соодветен супстрат за засилување преку полимеразна верижна реакција.
Поновите техники вклучуваат користење на олигонуклеотидни низи кои се состојат од повторувања комплементарни на повторувањата во микросателитот за да биде „збогатена“ извлечената ДНК (микросателитно збогатување). Олигонуклеотидната сонда е хибридизирана со повторувањето во микросателитот, а комплексот на сонда/микросателит потоа е извлекуван од растворот. Збогатената ДНК потоа е клонирана како нормална, но процентот на успеси сега ќе биде многу поголем, драстично намалувајќи го времето потребно за развој на регионите за употреба. Сепак, кои сонди да бидат користени може да биде постапка на обиди и грешки сама по себе.
6.3 Меѓуедноставно низно повторување-полимеразна верижна реакција
Меѓуедноставното низно повторување е општ поим за геномски регион помеѓу микросателитски локуси. Комплементарните низи на два соседни микросателити се користени како зачетници на полимеразна верижна реакција; променливата област меѓу нив се засилува. Ограничената должина на циклусите на засилување за време на полимеразната верижна реакција спречува прекумерна репликација на премногу долги соседни низи на ДНК, така што резултатот ќе биде мешавина од разновидни засилени нишки на ДНК кои се претежно кратки, но многу се разликуваат по должина.
Низите засилени со меѓуедноставното низно повторување-полимеразна верижна реакција може да бидат користени за отпечатоци од ДНК. Бидејќи меѓуедноставното низно повторување може да е зачуван или незачуван регион, оваа техника не е корисна за разликување на поединци, туку за филогеографски анализи или можеби за разграничување на видовите; разновидноста на низите е помала отколку кај едноставното низно повторување-полимеразна верижна реакција, но сепак повисока отколку во вистинските генски низи. Дополнително, секвенционирањето на микросателитите и секвенционирањето на меѓуедноставното низно повторување меѓусебно си помагаат, бидејќи едниот произведува зачетници за другиот.
6.4 Ограничувања
Повторливата ДНК не е анализирана лесно со методите за масовното напоредно секвенционирање на ДНК, кои се борат со хомополимерните патишта. Затоа, микросателитите вообичаено се анализирани со конвенционално засилување со полимеразна верижна реакција и одредување на големината на ампликонот. Употребата на полимеразна верижна реакција значи дека анализата на должината на микросателитот е склона кон ограничувања на полимеразната верижна реакција како и секој друг локус на ДНК засилена со полимеразна верижна реакција. Посебна загриженост е појавата на „нулти алели“:
* Повремено, во примерок од поединци како што е случајот за тестирање на татковство, мутација на ДНК што го граничи микросателитот може да го спречи зачетникот на полимеразната верижна реакција да биде врзан и да произведе ампликон (создавајќи „нулти алел“ во анализата на гел), на тој начин само еден алел се засилува (од немутираниот сестрински хромозом), а поединецот тогаш може лажно да изгледа дека е хомозиготен. Ова може да предизвика збунетост во случајот за татковството. Тогаш може да биде неопходно да биде засилен микросателитот со користење на различен сет на зачетници. Нултите алели се предизвикани особено од мутации во 3' делот, каде што започнува екстензијата.
* Во анализата на видовите или населението, на пример во работата за зачувување, зачетниците на полимеразната верижна реакција, кои ги засилуваат микросателитите кај еден поединец или вид можат да работат во други видови. Сепак, ризикот од примена на зачетник на полимеразната верижна реакција кај различни видови е дека нултите алели стануваат веројатни, секогаш кога дивергенцијата во низата е преголема за зачетниците да бидат врзани. Видот тогаш вештачки може да изгледа дека има намалена разновидност. Нултите алели во овој случај понекогаш може да бидат означени со прекумерна честота на хомозиготи кои предизвикуваат отстапувања од Харди-Вајнбершките очекувања за рамнотежа.
7 Дополнителна литература
***********