ДНК анализа

ДНК анализа (исто така наречена ДНК тест или генетски профил) — процес на одредување на карактеристиките на деоксирибонуклеинската киселина (ДНК) на поединецот. ДНК анализата наменета за идентификување на вид, наместо поединец, се нарекува ДНК баркодирање.
ДНК анализата е форензичка техника во криминалните истраги, споредувајќи ги профилите на осомничените за криминал со ДНК докази за да се процени веројатноста за нивна вмешаност во кривичното дело. Исто така се користи при тестирањето за татковство, за да се утврди подобноста за имиграција, и во генеалошките и медицинските истражувања. ДНК анализата, исто така, се користи во проучувањето на животинските и растителните популации во областа на зоологијата, ботаниката и земјоделството.
1 Заднина
Почнувајќи од 1980-тите, научниот напредок дозволил употреба на ДНК како материјал за идентификација на поединецот. Прв патент кој ја покрил директната употреба на варијации на ДНК за форензика ( ) бил поднесен од Џефри Гласберг во 1983 година, врз основа на работата што ја направил додека бил на Универзитетот Рокфелер во САД во 1981 година.
Британскиот генетичар сер Алек Џефрис самостојно развил процес за ДНК анализата во 1985 година додека работел на Катедрата за генетика на Универзитетот во Лестер. Џеферис открил дека испитувачот на ДНК може да утврди модели во непозната ДНК. Овие обрасци биле дел од наследни особини што може да се користат за унапредување на полето на анализа на односите. Овие откритија довеле до првата употреба на ДНК анализата во кривично дело.
Процесот, развиен од Џефрис во врска со Питер Гил и Дејв Верет од Форензичката научна служба (ФНС), првпат бил форензички користен во решавањето на убиството на двајца тинејџери кои биле силувани и убиени во Нарборо, Лестершир во 1983 и 1986 година. Во истрагата за убиството, предводена од детективот Дејвид Бејкер, ДНК содржана во примероците на крв, добиени доброволно од околу 5.000 локални мажи кои доброволно и помагале на полицијата на Лестершир во истрагата, резултирала со ослободување на Ричард Бакланд, кој бил првично осомничен и истрагата довела до последователното осудување на Колин Пичфорк на 2 јануари 1988 година. Пичфорк, вработен во локална пекара, го присилил својот колега Ијан Кели да даде примерок од неговата крв - Кели потоа користел фалсификуван пасош за да се претставува како Пичфорк. Друг колега ја пријавил измамата во полиција. Пичфорк бил уапсен, а неговата крв била испратена во лабораторијата на Џефрис за обработка и развој на профилот. Анализата на Пичфорк се совпаѓа со онаа на ДНК оставена од убиецот што го потврдило присуството на Пичфорк на двете места на злосторството; тој се изјаснил за виновен за двете убиства. По неколку години, хемиска компанија по име Imperial Chemical Industries (ICI) го претставила првиот комерцијално достапен комплет во светот. И покрај тоа што е релативно неодамнешно поле, имала значително глобално влијание и врз системот на кривичната правда и врз општеството.
Иако 99,9% од секвенците на човечката ДНК се исти кај секој човек, доволно ДНК е различна што е можно да се разликува една единка од друга, освен доколку не се монозиготни (идентични) близнаци. ДНК анализа користи повторувачки секвенци кои се многу променливи, наречени тандемски повторувања со променливи броеви (ТППБ), особено кратки тандемски повторувања (КТП), исто така познати како микросателити и минисателити. Локусите на ТППБ се слични помеѓу тесно поврзани индивидуи, но се толку променливи што неповрзаните поединци веројатно нема да ги имаат истите ТППБ.
Пред ТППБ и КТП, луѓето како Џеферис користеле процес наречен ограничувачки фрагмент на полиморфистичка должина (ОФПД). Овој процес редовно користел големи делови од ДНК за да ги анализира разликите помеѓу два примероци на ДНК. ОФПД бил меѓу првите технологии користени во ДНК анализа. Меѓутоа, како што технологијата еволуирала, новите технологии, како што е КТП, се појавиле и го зазеле местото на постарата технологија како ОФПД.
Допуштеноста на доказите за ДНК во судовите била оспорувана во САД во 1980-тите и 1990-тите, но оттогаш станала универзално прифатена поради подобрените техники.
2 Процеси на анализа
2.1 Екстракција на ДНК
Кога ќе се добие примерок од крв или плунка, ДНК е само мал дел од она што е присутно во примерокот. Пред да може да се анализира ДНК, таа мора да се извади од клетките и да се прочисти. Постојат многу начини на кои тоа може да се постигне, но сите методи ја следат истата основна процедура. Клетката и јадрените мембрани треба да се разбијат за да се овозможи ДНК да биде ослободена во раствор. Откако ДНК ќе стане слободна, таа може да се одвои од сите други клеточни компоненти. Откако ДНК ќе се одвои во растворот, преостанатиот клеточен отпад потоа може да се отстрани од растворот и да се фрли, оставајќи ја само ДНК. Најчестите методи за екстракција на ДНК вклучуваат органска екстракција (исто така наречена екстракција на фенол хлороформ), екстракција на хелекс и цврстофазна екстракција. Диференцијалната екстракција е модифицирана верзија на екстракција во која ДНК од два различни типа на клетки може да се одвои една од друга пред да се прочисти од растворот. Секој метод на екстракција работи добро во лабораторија, но аналитичарите обично го избираат својот претпочитан метод врз основа на фактори како што се цената, вклученото време, количината на добиената ДНК и квалитетот на добиената ДНК.
2.2 ОФПД анализа
Ограничувачкиот фрагмент на полиморфистичка должина (ОФПД). се залага за полиморфизам со должина на рестриктивен фрагмент и, во смисла на ДНК анализа, опишува метод за тестирање на ДНК кој користи рестриктивни ензими за да ја „пресече“ ДНК на кратки и специфични секвенци низ примерокот. За да започнете со обработка во лабораторија, примерокот најпрвин треба да помине низ протокол за екстракција, кој може да варира во зависност од типот на примерокот или лабораториските стандардни оперативни процедури. Откако ДНК ќе се „извлече“ од клетките во примерокот и ќе се одвои од надворешни клеточни материјали и какви било нуклеази што би ја разградиле ДНК, примерокот потоа може да се воведе до саканите рестриктивни ензими за да се исече на видливи фрагменти. По дигестијата на ензимот, се врши саудерн блот. Овој метод на сепарација се заснована на големина што се изведува со радиоактивни или хемилуминисцентни сонди. ОФПД може да се спроведе со сонди со еден или повеќе локус (сонди кои таргетираат или една местоположба на ДНК или повеќе места на ДНК). Вградувањето на сонди со повеќе места овозможило поголема моќ на дискриминација за анализата, но завршувањето на овој процес може да потрае неколку дена до една недела за еден примерок поради екстремното време потребно за секој чекор потребен за визуелизација на сондите.
2.3 ПВР анализа
Техниката била развиена во 1983 година од Кари Мулис. ПВР денес е вообичаена и важна техника што се користи во медицинските и биолошките лаборатории за истражување за различни апликации.
ПВР, или полимераза верижна реакција, е широко користена техника на молекуларна биологија за засилување на специфична ДНК секвенца.
Засилувањето се постигнува со серија од три чекори:
1- Денатурација: Во овој чекор, ДНК се загрева до 95 °C за да се дисоцираат водородните врски помеѓу комплементарните базни парови на двоверижна ДНК.
2-Греење: Во оваа фаза реакцијата се лади на 50-65 °C. Ова им овозможува на прајмерите да се прикачат на одредена местоположба на едноверижниот шаблон ДНК по пат на водородна врска.
3-Екстензија: Во овој чекор најчесто се користи термостабилна ДНК полимераза која е Taq полимераза. Ова се прави на температура од 72 °C. ДНК полимеразата додава нуклеотиди во насока 5'-6' и ја синтетизира комплементарната нишка на моделот на ДНК.
2.4 КТП анализа
Системот за ДНК анализа што се користи денес се базира на полимеразна верижна реакција (ПВР) и користи едноставни секвенци.
Од земја до земја, се користат различни системи за анализа на ДНК базирани на КТП. Во Северна Америка, системите кои ги засилуваат јадрените локуси CODIS 20 се речиси универзални, додека во Обединетото Кралство се користи системот на локуси ДНК-17, а Австралија користи 18 основни маркери.
Вистинската моќ на оваа анализа е во нејзината статистичка моќ на дискриминација. Бидејќи 20-те локуси кои моментално се користат за дискриминација во CODIS се независно сортирани (имањето одреден број повторувања на еден локус не ја менува веројатноста да се има било кој број повторувања на кој било друг локус), може да се примени правилото за производ за веројатности. Ова значи дека, доколку некој има ДНК тип на ABC, каде што трите локуси биле независни, тогаш веројатноста таа единка да го има тој ДНК тип е веројатноста да има тип А пати поголема од веројатноста да има тип Б повеќе од веројатноста да има тип В. Ова резултирало со способност да се генерираат веројатности за совпаѓање од 1 во квинтилион (1x10 <sup>18</sup> ) или повеќе. Сепак, пребарувањата на базата на податоци на ДНК покажале многу почести од очекуваните совпаѓања на лажни ДНК профили.
2.5 Анализа на Y-хромозом
Поради татковското наследство, Y-хаплотиповите даваат информации за генетското потекло на машката популација. За да се истражи историјата на оваа популација и да се обезбедат проценки за фреквенциите на хаплотипот во криминалните случаи, „Y хаплотип референтна база на податоци (YHRD)“ била основана во 2000 година како онлајн ресурс. Во моментов содржи повеќе од 300.000 минимални (8 локуси) хаплотипови од популации ширум светот.
2.6 Митохондриска ДНК
мтДНК може да се добие од материјал како влкна од коса и стари коски или заби. Ова е контролен механизам базиран на точка на интеракција со податоци. Ова може да се утврди со алатно поставување во примерокот.
3 Прашања со форензички ДНК примероци
Кога луѓето размислуваат за начинот на кој се прави ДНК анализа, тие често размислуваат за телевизиски емисии и серии како ''NCIS'' или ''Истрага на местото на злосторството'', кои прикажуваат примероци од ДНК кои доаѓаат во лабораторија и веднаш се анализираат, проследено со сликање на осомничениот во рок од неколку минути. Меѓутоа, реалноста е сосема поинаква, а совршените примероци на ДНК често не се собираат од местото на злосторството. Жртвите на убиства често се оставаат изложени на сурови услови пред да бидат пронајдени, а предметите што се користат за извршување на злосторства честопати се ракувани од повеќе од едно лице. Двата најраспространети прашања со кои се среќаваат форензичарите при анализа на примероците на ДНК се деградираните примероци и смесите на ДНК.
3.1 Деградирана ДНК
Пред да постојат современи методи на полимераза верижна реакција, било речиси невозможно да се анализираат деградираните примероци на ДНК. Методите како полиморфизам со должина на рестриктивен фрагмент или ограничувачки фрагмент на полиморфистичка должина (ОФПД), која била првата техника користена за анализа на ДНК во форензичката наука, бара ДНК со висока молекуларна тежина во примерокот со цел да се добијат веродостојни податоци. Сепак, ДНК со висока молекуларна тежина недостасува во деградираните примероци, бидејќи ДНК е премногу фрагментирана за прецизно да се спроведе ОФПД. Дури кога биле измислени техниките на ПВР, можело да се изврши анализа на деградираните примероци на ДНК полимеразна верижна реакција. Мултиплекс ПВР особено овозможил да се изолираат и да се засилат малите фрагменти од ДНК кои сè уште се оставени во деградирани примероци. Кога методите на мултиплекс ПВР се споредуваат со постарите методи како ОФПД, може да се види огромна разлика. Мултиплекс ПВР теоретски може да засили помалку од 1 ng на ДНК, но ОФПД мора да има најмалку 100 ng на ДНК со цел да се спроведе анализа.
3.2 ДНК со низок шаблон
ДНК со низок шаблон може да се случи кога има помалку од 0,1 ng() од ДНК во примерок. Ова може да доведе до повеќе стохастички ефекти (случајни настани) како што се алелно опаѓање или алелно паѓање што може да ја смени интерпретацијата на ДНК анализата. Овие стохастички ефекти може да доведат до нееднакво засилување на двете алели кои доаѓаат од хетерозиготна единка. Особено е важно да се земе предвид ДНК со низок шаблон кога се работи со мешавина на ДНК примерок. Ова е затоа што за еден (или повеќе) од придонесувачите во смесата, тие имаат поголема веројатност да имаат помала количина на ДНК од оптималната количина за правилно функционирање на ПВР реакцијата. Затоа, стохастичките прагови се развиени за интерпретација на ДНК профилот. Стохастичкиот праг е минималната висина на врвот (вредност на RFU), што се гледа во електроферограм каде што се јавува отпаѓањето. Доколку вредноста на висината на врвот е над овој праг, тогаш разумно е да се претпостави дека алелното опаѓање не се случило. На пример, доколку се гледа само 1 пик за одреден локус во електроферограмот, но неговата висина е над стохастичкиот праг, тогаш разумно може да се претпостави дека оваа единка е хомозиготна и дека не му недостасува својот хетерозиготен партнер алел кој инаку би испаднал. поради тоа што има ДНК со низок шаблон. Алелното напуштање може да се случи кога има ДНК со низок образец затоа што има толку малку ДНК за да се започне со тоа што во овој локус придонесувачот за примерокот на ДНК (или смесата) е вистински хетерозигот, но другиот алел не е зацврстен и така би било изгубени. Алелно паѓање може да се случи и кога има ДНК со низок шаблон бидејќи понекогаш врвот на пелтечење може да се засили. За време на ПВР реакцијата, ДНК полимеразата ќе влезе и ќе додаде нуклеотиди од прајмерот, но целиот овој процес е многу динамичен, кое означува дека ДНК полимеразата постојано се врзува, никнува и потоа повторно се врзува. Затоа, понекогаш ДНК полимеразата ќе се придружи на краткото тандемско повторување пред него, што ќе доведе до кратко повторување во тандем што е 1 повторување помалку од шаблонот. За време на ПВР, доколку ДНК полимеразата се поврзе со локус и почне да го засилува за да направи многу копии, тогаш овој производ за пелтечење ќе се појави случајно во електроферограмот, што ќе доведе до алелно паѓање.
3.2.1 Мини-КТП анализа
Во случаите кога примероците на ДНК се деградирани, како на пример доколку има интензивни пожари или сè што останува се фрагменти од коски, стандардната КТП анализа на тие примероци може да биде несоодветно. Кога се прави стандардната КТП анализа на високо деградирани примероци, поголемите КТП локуси често опаѓаат и се добиваат само делумни ДНК профили. Делумните ДНК профили можат да бидат моќна алатка, но веројатноста за случајно совпаѓање е поголема отколку ако се добие целосен профил. Еден метод што е развиен за анализа на деградирани примероци на ДНК е да се користи технологијата мини-КТП. Во новиот пристап, прајмерите се специјално дизајнирани да се врзуваат поблиску до регионот КТП.
При нормално КТП тестирање, прајмерите се врзуваат за подолги секвенци кои го содржат КТП регионот во сегментот. Сепак, мини-КТП анализата ја таргетира само локацијата на КТП, што резултира со производ на ДНК кој е многу помал.
Со поставување на прајмерите поблиску до вистинските КТП региони, постои поголема шанса да се случи успешно засилување на овој регион. Сега може да се случи успешно засилување на тие КТП региони и може да се добијат поцелосни ДНК профили. Успехот што помалите ПВР производи произведуваат поголема стапка на успех со високо деградирани примероци за првпат бил пријавен во 1995 година, кога технологијата мини-КТП била искористена за да се идентификуваат жртвите од пожарот во Вако.
3.3 ДНК мешавини
Мешавините се уште еден заеднички проблем со кој се соочуваат форензичарите кога анализираат непознати или сомнителни примероци на ДНК. Мешавината се дефинира како примерок од ДНК што содржи два или повеќе поединечни придонесувачи. Тоа често може да се случи кога примерокот од ДНК се брише од предмет со кој ракува повеќе од едно лице или кога примерокот содржи ДНК и на жртвата и на напаѓачот. Присуството на повеќе од еден поединец во примерок од ДНК може да претставува предизвик за откривање на поединечни профили, а толкувањето на мешавините треба да се врши единствено од страна на високо обучени лица. Мешавините кои содржат две или три единки многу потешко се толкуваат. Мешавините кои содржат четири или повеќе единки се премногу згрчени за да може да се добијат поединечни профили. Едно вообичаено сценарио во кое често се добива мешавина е во случај на сексуален напад. При таков случај, може да се собере примерок кој содржи материјал од жртвата, консензуалните сексуални партнери на жртвата и сторителот(ите).
Мешавините генерално може да се разделат во три категории: Тип А, Тип Б и Тип Ц. Мешавините од типот А имаат алели со слични висини наоколу, така што придонесувачите не можат да се разликуваат едни од други. Мешавините од типот Б може да се деконволтираат со споредување на односот врв-висина за да се одреди кои алели се донирани заедно. Мешавините од типот C не можат безбедно да се толкуваат според денешната технологија, бидејќи примероците се погодени од деградација на ДНК или присутна премала количина на ДНК.
Кога се гледа електроферограм, можно е да се одреди бројот на придонесувачи во помалку сложените мешавини врз основа на бројот на врвови кои се наоѓаат во секој локус. Во споредба со еден изворен профил, кој ќе има единствено еден или два врва на секој локус, мешавина е кога има три или повеќе врвови на два или повеќе локуси. Доколку има три врвови само на еден локус, тогаш можно е да се има еден придонесувач кој е три-алеличен на тој локус. Мешавините за две лица ќе имаат помеѓу два и четири врвови на секој локус, а мешавините за три лица ќе имаат помеѓу три и шест врвови на секој локус. Мешавините стануваат сè потешко да се деконволтираат како што се зголемува бројот на придонесувачи.
Како што напредуваат методите за откривање во профилирањето на ДНК, форензичарите гледаат повеќе примероци на ДНК кои содржат мешавини, бидејќи дури и најмалиот придонесувач денес може да се открие со современи тестови. Леснотијата во која форензичарите имаат меѓусебно продирање во ДНК смесите во голема мера зависи од односот на ДНК присутна од секој поединец, комбинациите на генотипот и вкупната количина на засилена ДНК. Односот на ДНК често е најважниот аспект што треба да се разгледа при одредувањето дали смесата може да се толкува. На пример, доколку примерокот на ДНК има два придонесувачи, би било лесно да се интерпретираат поединечни профили ако соодносот на ДНК придонесен од едно лице е многу поголем од второто лице. Кога примерокот има три или повеќе придонесувачи, станува исклучително тешко да се одредат поединечни профили. За среќа, напредокот во веројатностичкото генотипирање може да го овозможи тој вид определување во иднина. Веројатното генотипирање користи комплексен компјутерски софтвер за да помине низ илјадници математички пресметки за да произведе статистичка веројатност за поединечни генотипови пронајдени во мешавина.
ДНК профилирање во растение
Анализата на растителна ДНК е метод за идентификување на сорти кое користи техники на молекуларни маркери. Овој метод привлекува внимание поради правата на интелектуална сопственост поврзани со трговијата (TRIPs) и Конвенцијата за биолошка разновидност (CBD).
Предности
Идентификација, автентикација, специфична дистинкција, откривање на фалсификување и идентификување на фитоконституенти се можни со отпечатоци од ДНК во медицински растенија.
Маркерите базирани на ДНК се клучни за овие апликации, одредувајќи ја иднината на научните студии во фармакогнозијата.
Исто така, помага во одредувањето на особините (како што се големината на семето и бојата на листовите) кои веројатно ќе го подобрат потомството или не.