Повторна репликација на ДНК

Повторната репликација на ДНК е непосакувана и фатална појава во еукариотските клетки во кои геномот се реплицира повеќе од еднаш по клеточен циклус. Се верувало дека повторната репликација води до геномска нестабилност и е вмешана во патологиите на различни видови рак кај луѓето. За да се спречи повторната репликација, еукариотските клетки еволуирале повеќе, преклопувачки механизми за да ја инхибираат хромозомската ДНК делумно или целосно да се реплицира во даден клеточен циклус. Овие контролни механизми се потпирале на активноста на киназа зависна од циклин (CDK). Механизмите за контрола на репликацијата на ДНК тие соработувале за да спречат релиценцирање на потеклото на репликацијата и да ги активираат контролните точки на клеточниот циклус и оштетувањето на ДНК.
1 Иницирање на репликација на потекло
Репликацијата на ДНК секогаш започнувала со потеклото на репликацијата. Кај квасецот, потеклото содржело автономно реплицирачки секвенци (ARS), кои биле распоредени низ хромозомот на околу 30 kb едни од други. Тие овозможувале репликација на ДНК каде и да биле поставени. Секој од нив бил долг 100-200 bp, а елементот А бил еден од најзачуваните протегања. Заедно со другите конзервирани Б елементи, тие го формирале делот каде што ORC се собирале за да започнат со репликација. Повторувањето на овие секвенци можело да биде најважно за препознавање на потеклото.
Во животинските клетки, потеклото на репликацијата можело да изгледа како случајно да е поставено низ хромозомот, понекогаш дури и како ARS, но локалната структура на хроматин играла голема улога во одредувањето каде ќе се случува репликацијата. Потеклото на репликацијата не било рамномерно распоредено низ хромозомот. Репликонските кластери, кои што содржеле 20-80 почетоци по кластер, се активирале во исто време во фазата S. Иако сите тие биле активирани за време на S фаза, хетерохроматинот имал тенденција да се реплицира во доцната S фаза, бидејќи било потешко да им се пристапи од еухроматинот. Епигенетските фактори исто така имале големо влијание врз тоа што се реплицира и кога.
2 Лиценцирање за потекло
Сите познати механизми кои спречувале репликација на ДНК кај еукариотските организми го инхибирале лиценцирањето за потекло. Лиценцирањето за потекло бил прелиминарен чекор за нормално започнување на репликацијата за време на доцната G1 и раната S фаза и вклучувало регрутирање на пред-репликативниот комплекс (пред-RC) до потеклото на репликацијата. Лиценцирањето започнувало со врзување на мулти-судединицата аденозинтрифосфатаза, комплексот за препознавање на потекло (ORC), за ДНК на потеклото на репликацијата. Откако ќе се сврзело за хроматин, ORC ги регрутирал AAA-белковини аденозинтрифосфатазата Cdc6 и протеинот на доменот со свиткана намотка Cdt1. Врзувањето на Cdt1 и активноста на аденозинтрифосфатаза на ORC и Cdc6 го олеснувало вчитувањето на протеините за одржување на минихромозомот (MCM) 2-7 на хроматинот. Комплексот MCM е ДНК хеликаза што ја отворало спиралата на почетокот на репликацијата и ги одмотувало двете нишки додека виљушките за репликација патувале долж ДНК. Зголемената активност на ЦДК на крајот од G1 предизвикувала пукање на потеклото и демонтирање на пред-РК. Високите нивоа на CDK, кои се одржувале до крајот на митозата, ги инхибирало или уништувало компонентите пред-RC и го спречувало повторното лиценцирање на потеклото. Нов MCM комплекс не можело да се вчита на потеклото додека пред-RC подединиците не се реактивирале со опаѓање на активноста на CDK на крајот на митозата.
3 Модел со две состојби за регулација на репликација на ДНК
Раните експериментални докази за регулирање на репликацијата на ДНК сугерирале дека потеклото на репликацијата постоело во една од двете состојби во текот на клеточниот циклус: пререпликативната состојба во G1 и пострепликативната состојба од моментот на иницијација до преминување низ митозата. Потеклото на репликацијата наизменично се менувало помеѓу овие две различни состојби во текот на клеточниот циклус. Факторот за лиценцирање кој бил потребен за започнување на репликацијата се врзувал за потеклото во предрепликативната состојба. При транзиција G1/S, факторот бил деактивиран и не можел да се врати додека не заврши клеточниот циклус. Идентификацијата и карактеризацијата на протеините на ORC, Cdc6, Cdt1 и MCM комплексот како фактор за лиценцирање му давал доверба на овој модел и сугерирал средство со кое може да ја регулира репликацијата.
4 Регулација на репликација
4.1 Младиот квасец
Регулацијата на повторна репликација најдобро се разбирала кај младиот квасец. Клетките на ''Saccharomyces cerevisiae'' ја спречувале репликацијата со регулирање на пред-RC спојувањето преку CDK-посредуваната фосфорилација на пред-RC компонентите Cdc6, MCM2-7 и ORC подединици. Фосфорилацијата на овие компоненти започнувала на почетокот на S фазата и се одржувала во текот на остатокот од клеточниот циклус бидејќи активноста на CDK останувала висока. Фосфорилираниот Cdc6 бил врзан со убиквитин-протеинската лигаза SCF што довело до негова протеолитичка деградација. CDK-зависната фосфорилација на MCM2-7 протеините резултирала со извоз на комплексот од јадрото. (Cdt1 кој се поврзувал со комплексот MCM на сличен начин се извезувал од јадрото). Фосфорилацијата на ORC подединиците веројатно ја нарушувало способноста на ORC да ги врзува другите пред-RC компоненти. Така, повеќе механизми гарантирале дека пред-RC не може повторно да се состави на пострепликативно потекло.
''Забелешка:'' Бидејќи почетоците биле активирани во различни периоди во текот на S фазата, од клучно значење е инхибиторните механизми што спречувале ново регрутирање на MCM2-7 да не ги дестабилизираат постоечките пред-RC. Pre-RC можеле да останат склопени на почетоци кои не се активирале, иако механизмите за инхибиција на повторна репликација ги инхибирале или уништувале компонентите пред-RC.
4.2 Други организми
Иако CDK регулацијата на пред-RC склопувањето се чинело дека е високо еволутивно зачувана, биле забележани некои разлики меѓу организмите. Кај повеќеклеточните еукариоти, пред-RC склопот бил регулиран со комплексот за промовирање на анафазата (APC) покрај CDKs. APC, ензим Е3, го убиквитинирал протеинот геминин и го таргетирал за разградување. Геминин нормално го спречувал лиценцирањето за потекло преку врзување и инхибиција на Cdt1. Во G1, активноста на APC била адекватна за да се потисне акумулацијата на геминин, а со тоа индиректно промовирајќи го пред-RC склопувањето.
Cdt1 обично се регулирал преку E2F-посредувана транскрипциска активација и со врзување на човечка ацетилаза за Orc1. Протеолитичката деградација на Cdt1 била зачуван механизам и кај различни еукариоти од повисок ред. Cdt1 се разградувал преку комплексот Cul4-Ddb1-Cdt2 E3 убиквитин лигаза, така што контролата на лиценцирањето на ДНК се одржувало во S и G2. Cdt1 бил важен регулаторен протеин, а еволуцијата довела до различни патишта на регулација кај различни организми. Прекумерното изразување на Cdt1 или инкактивирањето на геминин можело да доведе до повторна репликација, бидејќи Cdt1 можел да предизвика пред-RC спојување.
Регулацијата пред-РК кај повеќето животни сè уште не била добро разбрана.
5 Последици од повторна репликација во еукариотските клетки
Повторната репликација и митотичната инсуфициенција генерално не се програмирани настани, туку се резултат спонтано од дефекти во механизмите на клеточниот циклус. Повторната репликација се чини дека доведува до прекини на dsDNA што предизвикува одговор на оштетување на ДНК и ги стопира клетките во G2. Контролната точка ефективно предизвикува трајно запирање на клеточниот циклус и евентуална апоптоза.
Повторната репликација може да биде експериментално предизвикана со истовремено нарушување на неколку механизми кои го спречуваат повторното лиценцирање на потеклото. На пример, дерегулацијата на механизмите на ORC, MCM2-7 и Cdc6 може да предизвика ререпликација во клетките на квасецот што се развива.
''Забелешка:'' Неодамнешните докази сугерирале дека иако се преклопуваат, механизмите за регулирање на повеќекратната репликација тие не треба да се сметаат за функционално непотребни; иако еден механизам може да ја потисне репликацијата со поголема од 99% ефикасност, можеби нема да биде доволен за одржување на стабилноста на геномот во текот на многу генерации. Наместо тоа, се верувало дека мултипликативниот ефект на многу механизми што се преклопуваат е она што доволно ја спречувало повторната репликација и обезбедувало верен пренос на геномот на клетката.
6 Спречување на повторување
Клетките со репликациски стрес ги активираат контролните точки за репликација така што S фазата е одложена и го забавува преминот кон фазата G2/M. Кога репликативниот стрес е препознаен од U-2-OS клетките, клеточните линии на човечки остеосарком со ретинобластом од див тип (RB) и p53, се активира мрежата за оштетување на ДНК регулирана со ATM/ATR. Овој одговор на контролниот пункт се активира поради прекумерна експресија на циклин Е, кој се покажал дека е важен во регулирањето на системот за лиценцирање. Кога циклинот Е е прекумерно изразен во клеточните линии U-2-OS, мрежата за оштетување на ДНК регулирана со ATM/ATR резултира со зголемување на Ser 15-фосфорилираниот p53, γ-H2AX и Ser 966-фосфорилираниот кохезин SMC1. Одговорот за повторна репликација на ДНК е различен од одговорот што се зема кога оштетувањето се должи на создавање на радикали на кислород. Оштетувањето од генерациите на радикали на кислород доведува до одговор од онкогенот Myc, кој ги фосфорилира p53 и H2AX.
Мрежата за оштетување на ДНК на ATM/ATR, исто така, ќе одговори на случаи каде што има прекумерна експресија на Cdt1. Прекумерното изразување на Cdt1 доведува до акумулација на ssDNA и DSB. Атаксија телеангиектазија и поврзана со Rad3 (ATR) се активира порано кога детектира ssDNA во претходните фази на повторна репликација на ДНК. ATR фосфорилира низводно фактори на репликација, како што се RPA2 и MCM2 или преку модулација на Rb или p53. Атаксија телеангиектазија мутирана (ATM) се активира откако ќе се открие поголемо количество на DSB во подоцнежните фази на повторна репликација на ДНК. Додека АТМ учествувала во стопирањето на клеточниот циклус, апоптозата и стареењето, исто така се сомневало дека игра улога во посредувањето на поправката на DSB, но точните механизми сè уште не биле разбрани.
7 Повторна репликација кај ракот
Повторната репликација е вмешана во туморигенезата кај моделните организми и кај луѓето. Протеините за иницијација на репликација се прекумерно експресирани во примероци од ткиво од неколку типови човечки канцери и експерименталната прекумерна експресија на Cdt1 и Cdc6 може да предизвика развој на тумор во клетките на глувчето. Слично на тоа, Geminin аблацијата кај нокаут глувците е пријавена дека го подобрува формирањето на тумор. Понатаму, овие студии покажувале дека повторната репликација може да резултира со зголемување на анеуплоидија, хромозомски фузии и прекини на ДНК.
Кај квасецот, зголемената активност на активноста на G1 CDK обично го инхибира составувањето на пред-RCs и влегувањето во S фаза со помалку активно потекло, но кај клетките на ракот, патиштата p53 и Rb/E2F се дерегулирани и овозможуваат влез во S фаза со намалена количина од активно потекло. Ова доведува до прекини на двојни жици во ДНК, зголемена рекомбинација и неточни хромозомски аранжмани. Механизмот со кој се јавува оваа штета сè уште не е познат. Една од можностите е дека намаленото активирање на потеклото доведува до нецелосна репликација на ДНК. Значајна повторна репликација е забележана само кога сите регулаторни патишта на CDK се инхибирани.
Во клетките на цицачите, Cdt1 и Cdc6 се многу поважни за регулација на репликацијата. Прекумерна експресија на Cdt1 и Cdc6 била пронајдена во 43/75 случаи на неситноклеточни белодробни карциноми. Таргетирањето на Cdc6 или ORC во клетките на цицачите не предизвикува суштинска повторна репликација. Прекумерното изразување на Cdt1, од друга страна, може да доведе до потенцијално смртоносни нивоа на повторна репликација самостојно. Овој одговор е забележан само во клетките на ракот. Прекумерното изразување на членовите на семејството E2F придонесува за зголемување на експресијата на Cdt1 и Cdc6. Губење на регулацијата на p53 во клетките, исто така, често може да се забележи кај клеточните линии кои прекумерно изразуваат Cdt1 или Cdc6.
8 Ендодупликација
За специјалниот случај на репликација на ДНК регулирана со клеточен циклус во која синтезата на ДНК е откачена од прогресијата на клеточниот циклус, се однесува на ендодупликацијата. Ендодупликацијата е важен и широко распространет механизам кај многу типови на клетки. Не се придржува до многу контролни точки на клеточниот циклус и контролите на оштетувањето во клетките кои редовно се делат, но не резултира со неконтролирана повторна репликација. Ендодупликацијата е контролиран процес кој се јавува за извршување на одредена клеточна функција. Во некои клетки, предложено е ендодупликацијата да се користи како начин за складирање на нуклеотиди за ембриогенеза и ртење. Во други случаи, ендодупликацијата може да се користи во клетки кои се користат само за складирање на хранливи материи.