Лурија-Делбриков опит

Лурија-Делбриков опит (исто така наречен тест на флуктуација) ― опит од 1943 година, кој покажал дека кај бактериите, генетските мутации се јавуваат во отсуство на селективен притисок наместо да бидат одговор на него. Така, опитот заклучил дека Дарвиновата теорија за природна селекција која дејствува на случајни мутации се однесува на бактериите, како и на посложените организми. Макс Делбрик и Салвадор Лурија за овој труд ја добиле Нобеловата награда за физиологија или медицина во 1969 година.
1 Историја
До 1940-тите, идеите за наследување и мутација биле општо прифатени, иако улогата на ДНК како наследен материјал сè уште не била воспоставена. Било сметано дека бактериите се некако различни и можат да развијат наследни генетски мутации во зависност од околностите во кои се нашле: накратко, дали мутацијата кај бактериите била претходно приспособена (претходно постоечка) или после приспособена (насочена приспособување)?
Во нивниот опит, Лурија и Делбрик инокулирале мал број бактерии (''Escherichia coli'') во посебни епрувети за култура. По одреден период на раст, тие поставиле еднакви волумени од овие посебни култури на агар кој го содржи T1 бактериофагот (вирус). Ако отпорноста кон вирусот кај бактериите била предизвикана од индуцирана активација кај бактериите, т.е. ако отпорноста не се должи на наследни генетски компоненти, тогаш секоја плоча треба да содржи приближно ист број на отпорни колонии. Претпоставувајќи постојана стапка на мутација, Лурија претпоставил дека ако се случат мутации по и како одговор на изложеноста на селективниот агенс, бројот на преживеани ќе биде распределен според Поасоновата распределба со средна вредност еднаква на варијансата. Ова не било она што го откриле Делбрик и Лурија: Наместо тоа, бројот на отпорни колонии на секоја плоча драстично варирала: варијансата била значително поголема од просечната.
Лурија и Делбрик предложиле дека овие резултати би можеле да бидат објаснети со појавата на постојана стапка на случајни мутации во секоја генерација на бактерии кои растат во почетните епрувети со култура. Врз основа на овие претпоставки, Делбрик извел веројатносна распределба (сега наречена Лурија-Делбрикова распределба) која дава врска помеѓу моментите доследни со опитно добиените вредности. Затоа, заклучокот бил дека мутациите кај бактериите, како и кај другите организми, се случајни, а не насочени.
Резултатите од Лурија и Делбрик биле потврдени на повеќе графички, но помалку квантитативен начин од Њукомб. Њукомб инкубирал бактерии во Петриева чинија неколку часа, а потоа репликата ја обложил на две нови Петриеви садови третирани со бактериофаг. Првата плоча била оставена нераспространета, а втората плоча потоа била повторно распространета, односно бактериските клетки биле преместени наоколу дозволувајќи им на поединечните клетки во некоја колонија да образуваат свои нови колонии. Ако колониите содржеле отпорни бактериски клетки пред да стапат во допир со вирусот на бактериофагот, би било очекувано дека некои од овие клетки ќе образуваат нови отпорни колонии на садот за повторно распространување и така да биде најден поголем број на преживеани бактерии таму. Кога двете чинии биле инкубирани за раст, всушност имаше дури 50 пати поголем број на бактериски колонии на садот за премачкување. Ова покажало дека бактериските мутации на отпорноста на вирусот случајно се случиле за време на првата инкубација. Уште еднаш, мутациите се случија пред да биде применета селекцијата.
Неодамна, резултатите од Лурија и Делбрик биле доведени во прашање од Кернс и други, кои ги проучувале мутациите во метаболизмот на шеќерот како облик на стрес во околината. Некои научници предложуваат дека овој резултат можеби е предизвикан од селекција за генско засилување и/или повисока стапка на мутација во клетките кои не можат да се делат. Други го бранеле истражувањето и предложиле механизми кои ги објаснуваат набљудуваните феномени во согласност со приспособувачка мутагенеза.
Се чини дека оваа распределба првпат била одредена од Халдан. Необјавен ракопис бил откриен во 1991 година на Универзитетскиот колеџ во Лондон кој ја опишувал оваа распределба. Изведувањето е различно, но резултатите е тешко да бидат пресметаат без употреба на сметач.
2 Опис на тестот
Мал број клетки се користени за инокулација на напоредни култури во неселективен медиум. Културите се одгледувани до заситеност за да се добие еднаква густина на клетките. Клетките се поставувани на селективни медиуми за да биде добиен бројот на мутанти (''r''). Разредувањата се поставувани на богат медиум за да биде пресметан вкупниот број на одржливи клетки (''Nt''). Бројот на мутанти кои се појавуваат во заситената култура е мерка и за стапката на мутации и за тоа кога мутантите се појавуваат за време на растот на културата: мутантите што се појавуваат рано во растот на културата ќе пропагираат многу повеќе мутанти од оние што се појавуваат подоцна во текот на раст. Овие фактори предизвикуваат честотата (''r'' / ''N''<sub>t</sub>) да варира во голема мера, дури и ако бројот на мутациски настани (''m'') е ист. Честотата не е доволно точна мерка за мутација и секогаш треба да биде пресметувана стапката на мутација (''m'' / ''N''<sub>t</sub>).
Проценката на стапката на мутација (μ) е сложена. Лурија и Делбрук го процениле овој параметар од средната вредност на распределбата, но овој проценувач последователно бил покажан дека е пристрасен.
Леа-Коулсоновиот метод на медијаната бил воведен во 1949 година. Овој метод бил заснован на равенката
:<math> \frac{ r }{ m } - \ln( m ) - 1.24 = 0 .</math>: Каде:
: r = просечен број на колонии на една плоча што го содржи показателот (на пр. рифампицин, натриум хлорат, стрептомицин)
: m = променлива која ќе варира, одговара на мутациите/културата
:: Вредноста на променливата m се прилагодува додека вкупната вредност на равенката не се приближи до 0. Потоа, стапката на мутација (веројатност за мутација/клетка/делба или генерирање) може да биде пресметана како една од трите формули:
: (1) <math>\mu = m/median(N_t)</math>: (2) <math>\mu = m/(2*median(N_t))
</math>: (3) <math>\mu = m*ln(2)/median(N_t)</math>: каде што N<sub>t</sub> е медијана на бројот на одржливи клетки на непоказателска плоча (често агар со Луриева смеса без додаток)
: Изборот на која формула да биде користена зависи од тоа во која фаза од клеточната делба е очекувано да бидат појавени мутациите.:
Овој метод оттогаш е подобрен, но овие попрецизни методи се сложени. Проценувачот на максимална веројатност на Ма-Сандри-Саркар е моментално најпознатиот проценувач. Опишани се голем број дополнителни методи и проценки од опитни податоци.
Две мрежни апликации за пресметување на стапката на мутација се слободно достапни: Falcor и . Bz-rates применува општа верзија на проценувачот на максимална веројатност на Ма-Сандри-Саркар што може да ја земе предвид релативната диференцијална стапка на раст помеѓу мутантните и клетките од див вид, како и проценувач на создавачки функции што може да ги процени и стапката на мутација и диференцијална стапка на раст. Работен пример е прикажан во овој труд од Џонс и колегите.
3 Распределба
Во сите овие модели, стапката на мутација ( ''μ'' ) и стапката на раст ( ''β'' ) биле претпоставувани како постојани. Моделот може лесно да биде генерализиран за да бидат релаксирани овие и други ограничувања. Овие стапки веројатно ќе се разликуваат во неопитните поставки. Моделите бараат и ''N''<sub>''t''</sub>''μ'' >> 1 каде ''N''<sub>''t''</sub> е вкупниот број на организми. Оваа претпоставка веројатно ќе важи во повеќето вистински или опитни поставки.
Лурија и Делбрик ја процениле стапката на мутација (мутации по бактерија по единица време) од равенката
:<math> \mu = \frac{ \beta \ln( \rho ) }{ n_0[1 - \exp(\beta t )] } </math>
каде ''β'' е стапката на клеточен раст, ''n''<sub>0</sub> е почетниот број на бактерии во секоја култура, ''t'' е времето и
:<math> \rho = \frac{ N_s } N </math>
каде ''N''<sub>''s''</sub> е бројот на култури без отпорни бактерии и ''N'' е вкупниот број на култури.
Моделот на Леа и Коулсон се разликувале од првичниот модел по тоа што тие разгледувале збирка на независни Јулеови постапки (филтриран Поасонова постапка). Бројчаните споредби на овие два модели со вистински вредности на параметрите покажале дека тие се разликуваат само малку. Генераторската функција за овој модел била пронајдена од Бартлет во 1978 година и е
:<math> G( z, \mu, \phi) = \exp\left( \frac{ \mu }{ \phi }\left( \frac{ 1 }{ z } - 1 \right) \log\left( 1 - \phi z \right) \right)</math>
каде ''μ'' е стапката на мутација (се претпоставува дека е константна), со ''β'' како стапка на клеточен раст (исто така се претпоставува дека е постојана) и ''t'' како време.
Одредувањето на ''μ'' од оваа равенка се покажало тешко, но решението било откриено во 2005 година. Диференцијацијата на создавачката функција во однос на ''μ'' овозможува примена на Њутн-Рафсоновиот методот кој заедно со употребата на бодовната функција овозможува да бидат добиени интервали на доверба за ''μ''.
4 Молекуларна биологија
Механизмот на отпорност на бактериофагот Т1 се чини дека се должи на мутации во генот ''fhu''A - мембранска белковина кој делува како рецептор Т1. Производот на генот ''ton''B е исто така потребен за инфекција со Т1. Белковината FhuA е активно вклучена во преносот на ферихром, албомицин и рифамицин. Исто така, дава чувствителност на микроцин J25 и колицин М и делува како рецептор за бактериофагите T5 и phi80 како и T1.
Белковината FhuA има бета-барелски домен (остатоци од 161 до 714) кој е затворен со топчест плутест домен (остатоци од 1 до 160). Во доменот на плута е обврзувачкиот регион TonB (остатоци од 7 до 11). Големите мембрани кои ги опфаќаат мономерните β-барел домени имаат 22 β-нишки со променлива должина, од кои неколку се протегаат значително подалеку од хидрофобното јадро на мембраната во екстрацелуларниот простор. Постојат 11 екстрацелуларни јамки набројани од L1 до L11. Јамката L4 е местото каде што е врзуван бактериофагот Т1.