16S рибозомна РНК

16S рибозомната РНК (16S рРНК) е компонента на 30S малата подединица на прокариотскиот рибозом, која се врзува за Шајн-Далгарновата низа (анг. Shine-Dalgarno sequence). Гените кои кодираат за оваа рРНК молекула се нарекуваат 16S рРНК-гени и тие се користат во реконструкцијата на филогениите поради исклучително бавната стапка на еволутивни промени на кои подлежат овие гени. Карл Воуз и Џорџ Е. Фокс биле првите кои предложиле употреба на 16S рРНК-гените во филогенетиката.
Во една бактерија можат да постојат повеќе копии на 16S рРНК-генот.
1 Функции
16S рРНК има неколку функции:
* Како и големата (23S) рибозомна РНК, таа има структурна улога, функционирајќи како скеле кое ги одредува позициите на рибозомните белковини.
* 3’ крајот на 16S рРНК ја содржи анти-Шајн-Далгарновата низа, која се врзува погоре од AUG старт кодонот на иРНК. 3’ крајот се врзува и за белковините S1 и S21, кои се вклучени во иницијацијата на биосинтезата на белковини.
* Стапува во интеракција со 23S рРНК, и на тој начин помага во спојување на двете рибозомни подединици (50S + 30S).
* Ги стабилизира точните кодон-антикодон парови во А местото на рибозомот, преку создавање на водородна врска помеѓу N1 атомите на аденините 1492 и 1493 и 2’ОН групата од ’рбетот на иРНК.
2 Универзални прајмери
16S рРНК-генот се користи во филогенетските истражувања, бидејќи е исклучително сочуван кај различните видови на бактерии и археи. Карл Воуз беше пионер во употребата на 16S рРНК за филогенетски цели. Се претпоставува дека 16S рРНК-генот може да се користи како веродостоен молекуларен часовник, бидејќи 16S рРНК-низите од далечно сродните бактериски лози се покажало дека имаат слични функционалности. Некои термофилни и хипертермофилни археи од редот Thermoproteales содржат интрони на 16S рРНК-генот кои се локализирани во високо сочувани региони и можат да влијаат на издолжувањето на „универзалните“ прајмери (зачетници).
Најчестиот пар на прајмери бил пронајден од Вајсбург и соработниците и моментално е познат како 27F и 1492R; меѓутоа за некои апликации потребни се пократки ампликони.
Име на прајмер, Низа (5'-3'), Наводи
8F, AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG,
U1492R, GGT TAC CTT GTT ACG ACT T, види горе
928F, TAA AAC TYA AAK GAA TTG ACG GG,
336R, ACT GCT GCS YCC CGT AGG AGT CT, види горе
1100F, YAA CGA GCG CAA CCC
1100R, GGG TTG CGC TCG TTG
337F, GAC TCC TAC GGG AGG CWG CAG
907R, CCG TCA ATT CCT TTR AGT TT
785F, GGA TTA GAT ACC CTG GTA
805R, GAC TAC CAG GGT ATC TAA TC
533F, GTG CCA GCM GCC GCG GTA A
518R, GTA TTA CCG CGG CTG CTG G
27F, AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG,
1492R, CGG TTA CCT TGT TAC GAC TT, види горе
2.1 Апликација во PCR методот и во новата генерација на секвенционирање (NGS)
Во прилог на високосочуваните места за врзување на прајмери, 16S рРНК-генските низи содржат и хиперваријабилни региони, кои можат да служат како низи специфични за видот, па така можат да бидат корисни за идентификација на прокариотите. Како резултат на тоа, 16S рРНК секвенционирањето стана распространет метод во медицинската микробиологија, како брза и евтина алтернатива на фенотипските методи за идентификација на бактериите. Иако првично беше користен само за идентификација на бактериите, подоцна беше утврдено дека 16S рРНК секвенционирањето може да послужи за рекласификација на бактериите во нови видови или родови. Исто така, методот се користи за опишување на новооткриени прокариотски видови кои никогаш не биле успешно култивирани. Со доспевањето на третата генерација на секвенционери во многу лаборатории, се овозможи брза идентификација на илјадници 16S рРНК-низи за време од само неколку часа. Ова го отвори патот на метагеномските истражувања, како на пример секвенционирање на целата цревна флора кај човекот.
2.2 Хиперваријабилни региони
Бактерискиот 16S рРНК-ген содржи девет хиперваријабилни региони (V1-V9), кои имаат околу 30-100 базни парови и се вклучени во формирањето на вторичната структура на малата рибозомна подединица. Степенот на сочуваност во голема мера варира помеѓу хиперваријабилните региони, така што повеќе сочуваните региони соодветствуваат со таксономија од повисоко ниво, а помалку сочуваните региони соодветствуваат со таксономија од пониско ниво (род и вид). Додека целата 16S рРНК-низа овозможува споредба на сите хиперваријабилни региони, долги приближно 1500 базни парови (бп), ова може да биде премногу скапо за истражувања кои имаат за цел да ги идентификуваат или да ги карактеризираат различните бактериски заедници. Ваквите истражувања најчесто ја користат платформата Illumina, која прави читање на низи со стапки 50 пати и 12,000 пати поевтино од 454 пиросеквенционирањето и Sanger-секвенционирањето, соодветно. Иако е поевтино и овозможува широка покриеност на бактериската заедница, Illumina секвенционирањето може да чита базни парови долги само 75-150 (Illumina MiSeq може да чита и до 250-300 бп) и нема етаблиран протокол за веродостојна интеграција на цел ген од примероци на бактериска заедница.
Додека 16S хиперваријабилните региони можат драстично да варираат од еден до друг бактериски вид, 16S генот како целина одржува исклучителна хомогеност, што значително го олеснува порамнувањето на низите. Дополнително, 16S генот содржи високо сочувани низи измеѓу хиперваријабилните региони, што овозможува дизајнирање на универзални прајмери, кои веродостојно можат да ги продуцираат истите региони од низата на 16S рРНК кај различните таксони. Иако ниту еден хиперваријабилните регион не може точно да ги класифицира сите бактерии, од ниво на домен до ниво на вид, некои од нив доследно предвидуваат одредени таксономски нивоа. Од овие причини, многу истражувања на бактериски заедници избираат полусочувани хиперваријабилните региони, како што е V4, бидејќи тие даваат резолуција на нивото на колено исто толку точно како и целокупната 16S генска низа. Додека помалку сочуваните региони тешко можат да класифицираат нови видови кога таксономијата од повисоко ниво е непозната, тие често се користат за откривање на присуството на специфични патогени.
Додека анализата на 16S хиперваријабилните региони е моќна алатка за проучување на бактериската таксономија, таа е од мала полза кога станува збор за многу блиску сродни видови. Членовите на фамилиите Enterobacteriaceae, Clostridiaceae и Peptostreptococcaceae можат да споделуваат и до 99% сличнност во целокупната 16S низа. Како резултат на тоа, V4 низите можат да се разликуваат само во неколку нуклеотидни позиции, поради што референтните бази на податоци се неспособни точно да ги класифицираат бактериите во рамките на пониските таксономски нивоа. Со ограничување на 16S анализата на само одбрани хиперваријабилните региони, ваквите истражувања не можат да ги пронајдат разликите кај блиску сродните таксони и да ги групираат во поединечни таксономски единици, со што се потценува целокупниот микробиолошки диверзитет на примерокот. Понатаму, бактериските геноми можат да содржат повеќе 16S рРНК-гени, кај кои V1, V2 и V6 регионите го имаат најголемиот диверзитет во рамките на истиот вид. Иако не е најпрецизниот метод за класификација на бактериските видови, анализата на хиперваријабилните региони сè уште е една од најкористените алатки за проучување на бактериските заедници.
3 Поврзано
* рРНК
* 23S рРНК
* 30S