Фосфопротеомика

Фосфопротеомика ― гранка на протеомиката која ги идентификува, каталогизира и карактеризира белковините кои содржат фосфатна група како послепреведувачка модификација. Фосфорилацијата е клучна реверзибилна модификација која ја регулира функцијата на белковините , подклеточната локализација, образувањето комплекси, разградувањето на белковините и со тоа клеточните сигнални мрежи. Со сите овие резултати од модификацијата, се проценува дека помеѓу 30-65% од сите белковини може да бидат фосфорилирани, некои повеќе пати. Врз основа на статистички проценки од многу збирки на податоци, 230.000, 156.000 и 40.000 места за фосфорилација треба да постојат кај човекот, глушецот и квасецот, соодветно.
Во споредба со анализата на изразување, фосфопротеомиката обезбедува два дополнителни слоја на информации. Прво, дава индиции за тоа која белковина или патека може да биде активирана бидејќи промената во статусот на фосфорилација речиси секогаш ја одразува промената во активноста на белковините. Второ, укажува на тоа кои белковини би можеле да бидат потенцијални цели на лекови, како што е примерот со инхибиторот на киназата Gleevec. Додека фосфопротеомиката во голема мера ќе го прошири знаењето за бројот и видовите на фосфобелковини, нејзиното најголемо ветување е брзата анализа на цели сигнални мрежи засновани на фосфорилација.
1 Преглед
Примерок од големи размери фосфопротеомска анализа вклучува одгледувани клетки кои се подложени на кодирање преку техникага стабилно означување на изотоп со аминокиселини во клеточна култура; клетките се стимулирани со фактор на интерес (на пр. фактор на раст, хормон); стимулацијата може да се појави за различни временски периоди за временска анализа, клетките се лизирани и ензиматски се вари, пептидите се одвојувани со помош на јонска хроматографија; фосфопептидите се збогатувани со користење на фосфоспецифични антитела, имобилизирана метална афинитетна хроматографија или титан диоксид (TiO<sub>2</sub>) хроматографија; фосфопептидите се анализирани со помош на масена спектрометрија, а пептидите се секвенционирани и анализирани.
2 Алатки и методи
Анализата на целиот комплемент на фосфорилирани белковини во клетката е секако изводлива можност. Ова се должи на оптимизацијата на протоколите за збогатување на фосфобелковините и фосфопептидите, подобрите техники на расцепкување со користење на хроматографија и подобрувањето на методите за избрано гледање на фосфорилираните остатоци со помош на масена спектрометрија. Иако сегашните процедури за фосфопротеомска анализа се значително подобрени, сè уште има губење на примерокот и недоследности во однос на подготовката, збогатувањето и инструментацијата на примерокот. Алатките за биоинформатика и базите на податоци за биолошката секвенца се исто така неопходни за високопропусни фосфопротеомски студии.
2.1 Стратегии за збогатување
Претходните процедури за изолирање на фосфорилирани белковини вклучуваа радиоактивно означување со <sup>32</sup>P-означен ATP проследено со SDS полиакриламид гел електрофореза или тенкослојна хроматографија. Овие традиционални методи се неефикасни бидејќи е невозможно да бидат добиени големи количини на белковини потребни за анализа на фосфорилација. Затоа, тековните и наједноставните методи за збогатување на фосфобелковините се афинитетно прочистување со употреба на фосфоспецифични антитела, имобилизирана метална афинитетна хроматографија, хроматографија со силна катјонска размена (SCX) или хроматографија со титан диоксид. Антифосфотирозинските антителата се докажани како многу успешни во прочистувањето, но помалку извештаи се објавени за користење на антитела против белковините што содржат фосфосерин или фосфотреонин. Збогатувањето преку имобилизирана метална афинитетна хроматографија се заснова на фосфатен афинитет за имобилизиран метален хелат во смолата. SCX ги одвојува фосфорилираните од нефосфорилираните пептиди врз основа на негативно наелектризираната фосфатна група. Хроматографијата со титан диоксид е понова техника која бара значително помалку време за подготовка на колоната. Многу фосфопротеомски студии користат комбинација од овие стратегии за збогатување за да биде добиен најчист можен примерок.
2.2 Анализа на масена спектрометрија
Масената спектрометрија во моментов е најдобриот метод за соодветно споредување на парови белковински примероци. Двете главни процедури за извршување на оваа задача се користење на изотопски кодирани афинитетни ознаки и стабилни изотопски аминокиселини во клеточна култура. Во постапката со изотопски кодирани афинитетни ознаки, примероците се означуваат поединечно по изолацијата со масовно кодирани реагенси кои ги модифицираат остатоците од цистеин. Во техниката со стабилни изотопски аминокиселини во клеточна култура, клетките се одгледувани одделно во присуство на различни изотопски означени аминокиселини за неколку клеточни поделби што им овозможува на клеточните белковини да ја вградат ознаката. Масената спектрометрија последователно е користена за да бидат идентификувани фосфосерин, фосфотреонин и пептиди кои содржат фосфотирозин.
3 Студии за сигнална трансдукција
Меѓуклеточната сигнална трансдукција првенствено е посредувана од реверзибилна фосфорилација на различни сигнални молекули со ензими наречени кинази. Киназите ги пренесуваат фосфатните групи од ATP до специфичните остатоци од серин, треонин или тирозин од целните молекули. Резултирачката фосфорилирана белковина може да има изменето ниво на активност, подклеточна локализација или терциерна структура.
Фосфопротеомските анализи се идеални за проучување на динамиката на сигналните мрежи. Во дизајнот на една студија, клетките се изложени на означување преку стабилни изотопски аминокиселини во клеточна култура и потоа стимулирани од специфичен фактор на раст. Клетките се собирани во различни временски точки, а лизатите се комбинирани за анализа со тандем со масената спектрометрија. Ова им овозможува на опитниците да ја следат состојбата на фосфорилација на многу фосфобелковини во клетката со текот на времето. Способноста да се измери општата состојба на фосфорилација на многу белковини во различни временски точки го прави овој пристап многу помоќен од традиционалните биохемиски методи за анализа на однесувањето на сигналната мрежа.
Една студија била во можност истовремено да ја измери преклопната промена во состојбата на фосфорилација на 127 белковини помеѓу нестимулираните и стимулираните клетки со EphrinB1. Од овие 127 белковини, 40 покажале зголемена фосфорилација со стимулација од EphrinB1. Истражувачите беа во можност да ги користат овие информации во комбинација со претходно објавените податоци за да конструираат мрежа за сигнална трансдукција за белковините да течат низводно од приемникот EphB2.
Друга неодамнешна фосфопротеомска студија вклучува идентификација и квантификација на настаните на фосфорилација предизвикани од антидиуретичниот хормон вазопресин во бубрежниот собирен канал. Идентификувани се вкупно 714 места на фосфорилација на 223 уникатни фосфобелковини, вклучувајќи три нови места на фосфорилација во вазопресин-чувствителниот воден канал аквапорин-2 (AQP2).
4 Истражување на ракот
Од почетокот на фосфопротеомиката, истражувањето на ракот се насочувало на промените на фосфопротеомот за време на развојот на туморот. Фосфобелковините можат да бидат маркери за рак корисни за дијагностика и терапевтски мерки на рак. Всушност, истражувањата покажаа дека постојат различни фосфотирозински протеоми на туморите на дојката и црниот дроб. Исто така, постојат докази за хиперфосфорилација на остатоците од тирозин во туморите на дојката, но не и во нормалните ткива. Наодите како овие наведуваат дека е можно да биде ваден туморскиот фосфопротеом за потенцијални биомаркери.
Достапни се зголемени количини на податоци кои сугерираат дека карактеристични фосфобелковини постојат во различни тумори и дека профилирањето на фосфорилација може да биде користено за рак на отпечатоци од прсти од различно потекло. Дополнително, систематското каталогизирање на туморско специфичните фосфобелковини кај поединечни пациенти може да открие повеќе предизвикувачки чинители за време на создавањето на ракот. Со корелација на овие опитни податоци со клиничките податоци како што се одговорот на лекот и исходот на болеста, потенцијалните маркери за рак може да бидат идентификувани за дијагноза, прогноза, предвидување на одговорот на лекот и потенцијалните цели на лекот.
5 Ограничувања
Додека фосфопротеомиката во голема мера го проширила знаењето за бројот и видовите на фосфобелковини, заедно со нивната улога во сигналните мрежи, сè уште има неколку ограничувања на овие техники. За почеток, методите на изолација како што се антифосфотирозинските антитела не прават разлика помеѓу изолирање на тирозинско фосфорилирани белковини и белковини поврзани со тирозинско фосфорилираните белковини. Затоа, иако меѓудејствијата белковина со белковина зависни од фосфорилација се многу важни, важно е да биде запаметено дека белковината откриен со овој метод не е нужно директен супстрат на која било тирозинска киназа. Само со варење на примероците пред имунопреципитација може да се произведе изолација само на фосфобелковини и временски профили на поединечни места на фосфорилација. Друго ограничување е тоа што некои релевантни белковини најверојатно ќе бидат пропуштени, бидејќи нема услови за екстракција што ги опфаќа сите. Можно е белковините со ниска стехиометрија на фосфорилација, во многу мала количина или фосфорилирани како цел за брзо разградување да бидат изгубени. Биоинформатичките анализи на податоците за фосфорилација со низок пропуст заедно со податоците од фосфопротеомиката со висок пропуст (најчесто врз основа на масена спектрометрија) проценуваат дека тековните протоколи со висока пропусност, по неколку повторувања се способни да заробат 70% до 95% од вкупните фосфобелковини, но само 40 % до 60% од вкупните места на фосфорилација.
6 Поврзано
* Гликопротеомика