Рендгенска кристалографија

Рендгенска кристалографија или рендгеностроежна анализа — техника што се користи за одредување на атомскиот и молекуларниот строеж на даден кристал. Кристалниот строеж предизвикува дифракција на влезен рендгенски зрак (Х-зрак) во мноштво на определени правци. Со мерење на аглите и интензитетите на овие дифракциони зраци, кристалографот може да создаде тридимензионална слика (дифрактограм) за електронската густина во кристалот. Од оваа електронска густина може да се утврдат средните положби на атомите во кристалот, како и нивните хемиски врски, нивниот кристалографски неред и разни други информации.
Бидејќи многу материјали можат да образуваат кристали (солите, металите, минералите, полуспроводниците и разни неоргански, органски и биолошки соединенија) рендгенската кристалографија е фундаментална метода во развојот на многу научни полиња. На почетоците, со оваа метода се одредувала големината на атомите, должините и типовите на хемиските врски и разликите на атомско ниво помеѓу различни материјали, особено минералите и легурите. Исто така, со оваа метода била откриена структурата и функцијата на многу биолошки молекули, вклучувајќи ги витамините, белковините и нуклеинските киселини. Рендгенската кристалографија сè уште е најупотребуваната метода за карактеризирање на атомската структура на новите материјали.
Кај монокристалните мерења на дифракцијата на рендгенските зраци, кристалот се поставува на гониометар. Гониометарот се користи за позиционирање на кристалот во одредени ориентации. Кристалот се осветлува со фокусиран монохроматски рендгенски зрак, при што создава дифракциона шема на правилно распоредени точки познати како ''рефлексии''. Дводимензионалните слики направени на различни ориентации се претвораат во тридимензионален модел на електронска густина во кристалот со помош на математичкиот метод на Фурјеови транформации, заедно со познати хемиски податоци за примерокот. Доколку кристалите се премногу мали или доколку внатрешната структура не им е доволно униформна, резолуцијата може да биде слаба (нејасност) или да настанат грешки.
Рендгенската кристалографија е сродна со неколку други методи за одредување на атомските структури. Слични дифракциони шеми можат да се добијат со расејување на електрони или неутрони, кои исто така се толкуваат со помош на Фурјеова трансформација. Доколку не можат да се добијат кристали со доволна големина, се применуваат разни други методи со рендгенски зраци за да се добијат помалку детални информации; таквите методи вклучуваат дифракција на влакна, рендгенска прашковна дифракција и (доколку примерокот не е кристализиран) малоаголно расејување на рендгенски зраци (англ. Small-angle X-ray scattering, SAXS). Доколку супстанцијата која се изучува е достапна само во форма на нанокристални прашоци или слабо кристализира, можат да се применат методите на електронска кристалографија за одредување на нејзината атомска структура.
За сите горенаведени методи на дифракција на зраците, расејувањето е еластично, т.е. расејаните рендгенски зраци ја имаат истата бранова должина како влезните рендгенски зраци. Спротивно на тоа, нееластичните методи на расејување на рендгенските зраци се корисни во проучувањето на екцитациите на примерокот, како што се плазмоните, екцитациите на кристалното поле, орбиталните екцитации, магноните и фононите, наместо на неговата атомска структура.
1 Историја
1.1 Почетокот на научните откритија на рендгенските зраци и строежот на кристалите
Кристалите не биле научно истражувани сè до XVII век. Во своето дело ''Strena seu de Nive Sexangula'' (Новогодишен подарок од шестаголен снег) (1611 година) Јоханес Кеплер претпоставувал дека шестаголната симетрија на снежните кристалите се должи на правилно пакување на сферични водени честички.
Данскиот научник Николас Стено (1669 година) бил пионер во експерименталните истражувања на кристалната симетрија. Стено покажал дека аглите меѓу страните на даден кристал се еднакви кај сите примероци на дадениот кристал. Рене Жист Аиј (1784 година) покажал дека секоја страна на еден кристал може да се опише со едноставни модели на подредување на блокови кои сите имаат ист облик и големина. Оттука, Вилијам Халовес Милер, во 1839 година, бил во можност да даде на секоја страна (лице) на кристалот уникатна ознака од три мали цели броеви, наречени Милерови индекси, кои до ден денес се користат за идентификување на страните на еден кристал. Делата на Аиј довеле до точната идеја дека кристалите се правилни тридимензионални решетки (Бравеови решетки) на атоми и молекули, т.е. елементарната ќелија им се повторува неограничено во трите главни правци кои не се задолжително нормални (под прав агол). Во 19 век, бил разработен комплетен каталог на сите можни симетрии на кристалите од Јохан Хесел, Огист Браве, Евграф Федоров, Артур Шоенфлис и Вилијам Барлоу (1894 година). Барлоу предложил неколку кристални структури во 1880-тите години, кои подоцна биле потврдени со рендгенска кристалографија, но достапните податоци биле премалку во 1880-тите години за неговите модели да бидат прифатени како точни.
Во 1895 година, Вилхелм Рентген ги открил рендгенските зраци. На почетокот физичарите не биле сигурни за природата на рендгенските зраци, но потоа станало јасно дека тие се електромагнетни бранови, т.е., форма на светлина. Во тоа време брановиот модел за природата на светлината, т.е. Максвеловата теорија за електромагнетно зрачење, била добро прифатена од научниците, а експериментите на Чарлс Гловер Баркла покажале дека рендгенските зраци покажуваат феномени поврзани со електромагнетните бранови, вклучувајќи ги поларизацијата и спектралните линии, слично како кај видливата светлина. Експериментите во лабораторијата на Арнолд Зомерфелд покажале дека рендгенските зраци имаат бранова должина од околу 1 ангстрем. Сепак, рендгенските зраци се составени од фотони, па затоа не се само бранови на електромагнетно зрачење, туку покажуваат и својства на честички. Концептот на фотон го вовел Алберт Ајнштајн во 1905 година, но тој не бил широко прифатен сè до 1922 година, кога Артур Комптон го потврдил расејувањето на рендгенските зраци од електрони. Затоа, овие честични својства на рендгенските зраци, како што е јонизацијата на гасовите, го натерале Вилијам Хенри Брег да тврди, во 1907 година, дека рендгенските зраци не се електромагнетно зрачење. Сепак, тврдењето на Брег не било широко прифатено и набљудувањето на појавата на дифракција кај рендгенските зраци, од страна на Макс фон Лауе во 1912 година, за повеќето научници значело потврда дека рендгенските зраци се навистина форма на електромагнетно зрачење.
1.2 Дифракција на рендгенски зраци
Кристалите се структури изградени од повторлива шема на специфично подредени (организирани во просторот) атоми или молекули, а рендгенските зраци може да се сметаат за бранови на електромагнетно зрачење. Атомите ги расејуваат рендгенските бранови, бидејќи стапуваат во интеракција со нивните електрони. Рендгенскиот зрак кој се судрува со електронот создава секундарни сферични бранови кои се шират од електронот. Овој феномен е познат како еластично расејување, а електронот се нарекува ''расејувач''. Правилна групација на вакви расејувачи продуцира правилна шема на сферични бранови. Иако овие бранови се поништуваат меѓусебно во повеќето правци по пат на деструктивна интерференција, во неколку специфични правци тие конструктивно интерферираат, што е изразено со Бреговиот закон:
:<math>2d \sin \theta = n \lambda</math>
Овде ''d'' е растојанието помеѓу дифракциските рамнини, ''θ'' е влезниот агол, ''n'' е цел број, а ''λ'' е брановата должина на зракот. Овие специфични правци се јавуваат како точки на дифракционата слика (дифрактограмот) и се нарекуваат ''рефлексии''. На овој начин, дифракцијата на рендгенските зраци произлегува од судирот на електромагнетниот бран (рендгенскиот зрак) со правилно распоредените расејувачи (правилниот распоред на атомите во кристалот).
Брановата должина λ на рендгенските зраци обично е од ист ред на величина (1-100 ангстреми) со растојанието ''d'' меѓу рамнините во кристалот. Во принцип, секој бран што доаѓа во контакт со правилно распоредени расејувачи создава дифракција, како што првично предвидел Франческо Марија Грималди во 1665 година. За да се добие значителна дифракција, треба да бидат слични во големина растојанието помеѓу расејувачите и брановата должина на ударниот бран. Првите вештачки дифракциони решетки за видлива светлина биле направени од Дејвид Ритенхаус во 1787 година и Јозеф фон Фраунхофер во 1821 година. Сепак, видливата светлина има премногу голема бранова должина (обично 5500 ангстреми) за да се набљудува дифракција од кристалите. Пред првите експерименти со дифракција на рендгенски зраци, растојанијата помеѓу рамнините во кристалната решетка не биле познати.
Идејата дека кристалите можат да се користат како дифракциона решетка за рендгенски зраци, се јавила во 1912 година во разговор помеѓу Пол Петер Евалд и Макс фон Лауе во Минхен. Евалд предложил модел на резонатор за кристалите за неговата теза, но овој модел не можел да се потврди со користење на видлива светлина, бидејќи брановата должина била поголема од растојанието меѓу резонаторите. Макс фон Лауе сфатил дека е потребно електромагнетно зрачење со пократка бранова должина за да се набљудуваат таквите мали простори и предложил дека рендгенските зраци можеби имаат бранова должина споредлива со растојанието помеѓу елементарните ќелии во кристалите. Фон Лауе работел со двајца техничари, Волтер Фридрих и неговиот помошник Пол Нипинг, за да пуштат рендгенски зрак низ кристал од бакар(II) сулфат и да ја снимат неговата дифракција на фотографска плоча. По развивањето, на плочата имало голем број на јасни точки поредени во кругови, кои се пресекувале околу централна точка продуцирана од централниот зрак. Фон Лауе го открил законот за врската помеѓу аглите на расејување и големината и ориентацијата на елементарните ќелии во кристалот, за што добил Нобелова награда за физика во 1914 година.
1.3 Расејување
Како што е опишано во математичката деривација подолу, рендгенското расејување зависи од електронската густина во кристалот. Бидејќи енергијата на рендгенскиот зрак е многу поголема од онаа на валентниот електрон, расејувањето може да се прикаже како Томсоново расејување, т.е. интеракција на електромагнетен зрак со слободен електрон. Овој модел е општо прифатен за да се опише поларизацијата на расејаното зрачење.
Интензитетот на Томсоновото расејување за една честичка со маса ''m'' и елементарен електричен полнеж ''q'' е::<math>
I_o = I_e \left(\frac{q^4}{m^2c^4}\right)\frac{1+\cos^22\theta}{2} = I_e7.94.10^{-26}\frac{1+\cos^22\theta}{2} = I_ef
</math>
Оттука, атомските јадра, кои се многу потешки од електроните, придонесуваат занемарливо малку за расејувањето на рендгенските зраци.
1.4 Развојот на техниката од 1912 до 1920 година
По пионерското истражување на Макс фон Лауе, рендгенската кристалографија брзо напредувала, особено благодарение на физичарите Вилијам Лоренс Брег и неговиот татко Вилијам Хенри Брег. Во 1912-1913 година, помладиот Брег го развил Бреговиот закон, кој го поврзува набљудуваното расејување со рефлексии од рамномерно распоредени рамнини во кристалот. Таткото и синот Брег ја добиле Нобеловата награда за физика во 1915 година за нивната работа во полето на кристалографијата. Најраните структури обично биле едноставни и со еднодимензионална симетрија. Меѓутоа, како што сметачките и експерименталните методи се подобрувале во текот на следните децении, станало возможно точно да се откријат атомските позиции за покомплексните дво- и тридимензионални аранжмани на атомите во елементарната ќелија.
Потенцијалот на рендгенската кристалографија за одредување на структурата на молекулите и минералите (до тогаш познати нејасно од хемиски и хидродинамички експерименти) бил веднаш реализиран. Најраните структури биле едноставни неоргански кристали и минерали, но дури и овие откриле основни закони на физиката и хемијата. Првата структура со атомска резолуција која била „одгатната“ (одредена) во 1914 година била онаа на готварската сол. Распределбата на електроните во структурата на готварската сол покажала дека кристалите не мора да се состојат од молекули со ковалентни хемиски врски и го докажале постоењето на јонските соединенија. Структурата на дијамантот била одгатната истата година, со што бил потврден тетраедарскиот аранжман на неговите хемиски врски и било откриено дека должината на C-C единечната врска изнесува 1,52 ангстреми. Други структури кои биле рано откриени се бакарот, калциум флуоридот (CaF<sub>2</sub>, исто така познат како флуорит), калцитот (CaCO<sub>3</sub>) и пиритот (FeS<sub>2</sub>) во 1914 година; шпинелот (MgAl<sub>2</sub>O<sub>4</sub>) во 1915 година; рутилот и анатасот, кои се форми на титан диоксид (TiO<sub>2</sub>) во 1916 година; пирохроитот Mn(OH)<sub>2</sub> и бруцитот Mg(OH)<sub>2</sub> во 1919 година. Исто така, во 1919 година, натриум нитратот (NaNO<sub>3</sub>) и цезиум дихлоројодидот (CsICl<sub>2</sub>) биле утврдени од Ралф Валтер Грејстон Викоф, а структурата на вурцитот (шестоаголен ZnS) била утврдена во 1920 година.
Структурата на графитот била откриена во 1916 година со помош на сродниот метод на рендгенска прашковна дифракција, развиена од Петер Дебај и Пол Шерер, а независно од Алберт Хал во 1917 година. Структурата на графитот била определена со монокристална дифракција во 1924 година од страна на две групи независно. Хал, исто така, го користел методот на рендгенска прашковна дифракција за да ги одреди структурите на различни метали, како што се железото и магнезиумот.
2 Придонеси за хемијата и другите науки
Рендгенската кристалографија довела до подобро разбирање на хемиските врски и нековалентните заемодејства. Најраните испитувања ги откриле типичните полупречници на атомите и потврдиле многу теоретски модели на хемиските врски, како што се тетраедарското врзување на јаглеродните атоми во структурата на дијамантот, октаедарското врзување на металите во амониум хексахлороплатинат (IV), и резонанцијата во планарната структура на карбонатот и ароматичните органски молекули. Структурата на хексаметилбензенот, добиена од Кејтлин Лонсдејл во 1928 година, ја потврдила шестаголната симетрија на бензенот и јасно ја покажала разликата во должината на врската помеѓу алифатичните C-C врски и ароматичните C-C врски; овој наод довел до идејата за резонанција помеѓу хемиските врски. Нејзините заклучоци биле навестени од Вилијам Хенри Брег, кој објавил модели на нафтален и антрацен во 1921 година врз основа на други молекули, што претставува рана форма на молекулска замена.
Исто така, во 1920-тите години, Виктор Мориц Голдшмит и Лајнус Полинг развиле правила за елиминирање на хемиски неверојатните структури и за одредување на релативните големини на атомите. Овие правила довеле до откривањето на структурата на брукитот (1928 година) и разбирањето на релативната стабилност на рутилот, брукитот и анатасот, сите форми на титан диоксид.
Растојанието помеѓу два хемиски врзани атоми е чувствителна мерка за јачината на хемиската врска и нејзиниот ред, па затоа рендгенските кристалографски студии довеле до откривање на уште поегзотични видови на врзување во неорганската хемија, како што се двојните врски метал-метал, метал-метал четворните врски и три-централни, две-електронски врски. Рендгенската кристалографија или, постриктно, експериментот за нееластично Комптоново расејување, исто така дала доказ за делумно ковалентниот карактер на водородните врски. Во полето на органометалната хемија, рендгенската структура на фероценот иницирала научни истражувања за сендвич соединенијата, додека структурата на калиум трихлоро(етен)платинат (II) го стимулирала истражувањето на „заднинското врзување“ и метал-пи комплексите. Конечно, рендгенската кристалографија имала пионерска улога во развојот на супрамолекуларната хемија, особено во разјаснувањето на структурите на круна-етерите и на принципите на хемијата домаќин-гостин.
Во науката за материјали, многу комплицирани неоргански и органометални системи се анализирани со користење на монокристални методи, како што се фулерени, металопорфирини и други сложени соединенија. Монокристалната дифракција, исто така, се користи во фармацевтската индустрија, поради неодамнешните проблеми со полиморфите. Главните фактори кои влијаат врз квалитетот на монокристалните структури се големината и регуларноста на кристалот; вообичаена техника за подобрување на овие фактори кај кристалите со мали молекули е рекристализацијата. Кембричката база на податоци за структури (англ. Cambridge Structural Database, CSD) содржи повеќе од 800.000 структури до септември 2016 година; над 99% од овие структури биле одредени со рендгенска кристалографија.
2.1 Минералогија и металургија
Од 1920-тите години, дифракцијата на рендгенските зраци била главната метода за одредување на организацијата на атомите во кристалните структури на минералите и металите. Примената на рендгенската кристалографија во минералогијата започнала со структурата на гранатот, која во 1924 година ја утврдил Мензер. Систематската рендгенска кристалографска студија на силикатите била спроведена во 1920-тите години. Оваа студија покажала дека, како што се менува односот Si/O, силикатните кристали покажуваат значителни промени во организацијата на нивните атоми. Махачки ги проширил овие согледувања на минерали, во кои алуминиумот ги заменува силициумовите атоми на силикатите. Првата примена на рендгенската кристалографија во металургијата исто така се случила во средината на 1920-тите години. Најважно, структурата на легурата Mg<sub>2</sub>Sn, утврдена од Лајнус Полинг, довела до неговата теорија за стабилноста и структурата на комплексните јонски кристали.
На 17 октомври 2012 година, Curiosity роверот на планетата Марс, на местото наречено „Rocknest“ ја извршил првата анализа на дифракција на рендгенски зраци на површината на Марс. Резултатите од ХеМин (CheMin) анализаторот на роверот откриле присуство на неколку минерали, вклучувајќи ги момирок, пироксени и оливин.
2.2 Органски и мали биолошки молекули
Првата структура на органско соединение, хексаметилентетрамин, била решена во 1923 година. По ова следеле структури на масни киселини со долги јаглеводородни синџири. Во 1930-тите години биле решени структурите на многу поголеми и посложени планарни молекули како фталоцијанинот, која е сродна со структурата на важните биолошки молекули хем, корин и хлорофил.
Англиската хемичарка Дороти Хоџкин со помош на рендгенска кристалографија ги открила структурите на многу биолошки значајни молекули, како што се холестеролот (1937 година), пеницилинот (1946 година) и витаминот Б<sub>12</sub> (1956 година), за што ја добила Нобеловата награда за хемија во 1964 година. Во 1969 година, таа успеала да ја открие структурата на инсулинот, на која работела повеќе од триесет години.
2.3 Биолошка макромолекуларна кристалографија
Кристалните структури на белковините почнале да се решаваат кон крајот на 1950-тите години, почнувајќи со структурата на миоглобинот на китот ''Physeter macrocephalus'', од страна на Џон Кендру, за која тој ја добил Нобеловата награда за хемија во 1962 година, заедно со Макс Перуц. Од тоа време до денес утврдени се 132055 рендгенски кристални структури на белковини, нуклеински киселини и други биолошки молекули. За споредба, со методот на јадрено магнетно резонантна (NMR) спектроскопија, утврдени се 11904 хемиски структури. Освен тоа, со кристалографија може да се одредат структурите на неограничено големи молекули, додека со NMR на раствори може да се одредат структурите само на релативно мали молекули (помалку од 70 kDa). Рендгенската кристалографија денес рутински се користи од научниците за да се утврди како одредена фармаколошки активна супстанција стапува во интеракција со нејзиниот рецептор и кои промени можат да ја подобрат таа интеракција. Сепак, кристализацијата на трансмембранските белковини сè уште е голем предизвик, бидејќи за нивна екстракција од мембраната потребни се детергенти или други средства кои често интерферираат со кристализацијата. Ваквите мембрански белковини се значајна компонента на геномот и ги вклучуваат јонските канали, активните транспортери и рецепторите. Хелиумската криогеника се користи за да се спречи радијационо оштетување во белковинските кристали.
3 Однос кон другите техники на расејување
3.1 Еластично наспроти нееластично расејување
Рендгенската кристалографија е форма на еластично расејување; излезните зраци имаат иста енергија (а со тоа и иста бранова должина) како и влезните зраци, само им е променета насоката. За разлика од еластичното расејување, кај нееластичното расејување дел од енергијата на влезните рендгенски зраци се предава на честичките на кристалот, на пример, со возбудување на електроните од внатрешната обвивка на повисоко енергетско ниво. Ваквото нееластично расејување ја намалува енергијата (односно ја зголемува брановата должина) на излезниот зрак. Нееластичното расејување затоа е корисно за испитување на екцитационите состојби на материјата, но не е корисно за одредување на дистрибуцијата на расејувачите во дадениот материјал, што е цел на рендгенската кристалографија.
Брановата должина на рендгенските зраци изнесува помеѓу 10 и 0,01 nm, а типичната бранова должина која се користи во кристалографијата е 1 Å (0,1 nm), која одговара на димензијата на ковалентните хемиски врски и полупречникот на еден атом. Фотоните со подолга бранова должина (како што е ултравиолетовото зрачење) немаат доволна резолуција за утврдување на позициите на атомите. Од друга страна, фотоните со пократка бранова должина, како што се гама-зраците, тешко се продуцираат во голем број, тешко се фокусираат и премногу јако стапуваат во интеракција со материјата, создавајќи парови на честички и античестички.
3.2 Други техники со рендгенски зраци
Други техники со еластично расејување на рендгенски зраци вклучуваат дифракција на влакна, рендгенска прашковна дифракција и малоаголно расејување на рендгенски зраци (англ. Small-angle X-ray scattering, SAXS), кои англиската хемичарка Розалинд Френклин ги користела за одредување на двојната завојна структура на ДНК молекулата. Генерално, монокристалната рендгенска дифракција нуди повеќе структурни информации во споредба со овие други техники; сепак, за нејзино изведување се потребни доволно големи и правилни кристали, кои не се секогаш достапни.
Овие методи на расејување обично користат ''монохроматски'' рендгенски зраци, кои се ограничени на само една бранова должина, со мали отстапувања. Широк спектар на рендгенски зраци (што претставува мешавина на повеќе различни бранови должини на рендгенски зраци), исто така може да се користи за дифракција на рендгенски зраци, техника позната како методот на Лауе. Тоа е методот кој се користел во оригиналното откривање на дифракцијата на рендгенските зраци. Расејувањето на Лауе дава многу структурни информации со кратка изложеност на рендгенскиот зрак и затоа се користи во структурни студии на многу брзи настани (временска кристалографија). Меѓутоа, тој не е толку погоден како монохроматското расејување за одредување на целосната атомска структура на кристалот, па затоа е посоодветен за кристали со релативно едноставно структурирање на атомите.
Повратната рефлексија на Лауе ги снима рендгенските зраци кои се расејани назад од изворот со широк спектар. Оваа метода е корисна доколку примерокот е премногу дебел за да ги пропушти зраците.
3.3 Дифракција на електрони и неутрони
Можат да се користат и други честички, како што се електроните и неутроните, за да се добие дифракциона слика. Иако расејувањата на електроните, неутроните и рендгенските фотони се засноваат на различни физички процеси, добиените дифракциони слики се анализираат со помош на истите техники на кохерентна дифракциона обработка (англ. Coherent diffractive imaging, CDI).
Како што е објаснето подолу, електронската густина во рамките на кристалот и дифракционите слики се поврзани со едноставен математички метод, Фурјеова трансформација, која овозможува лесно пресметување на густината од сликите. Сепак, ова функционира само доколку расејувањето е слабо, односно, доколку расејаните зраци се помалку интензивни од влезниот зрак. Слабо расејаните зраци минуваат низ остатокот од кристалот без да претрпат второ расејување. Повторно расејаните зраци се нарекуваат „секундарно расејување“ и ја попречуваат анализата. Секој доволно дебел кристал произведува секундарно расејување, но бидејќи рендгенските зраци релативно слабо реагираат со електроните, ова обично не претставува проблем. За разлика од нив, електронските зраци можат да создадат силно секундарно расејување дури и кај релативно тенките кристали (> 100 nm). Бидејќи оваа дебелина одговара на пречникот на многу вируси, ветувачка метода е електронската дифракција на изолирани макромолекуларни агрегати, како што се вирусните капсиди и молекуларните машини, која може да се изведе со крио-електронски микроскоп. Покрај тоа, силната интеракција на електроните со материјата (околу 1000 пати посилна отколку рендгенските зраци) овозможува одредување на атомската структура на екстремно мали волумени. Апликациите за електронската кристалографија се движат од биомолекули, како мембрански белковини, до органски тенки филмови, до комплексни структури на (нанокристални) интерметални соединенија и зеолити.
Неутронското расејување е одличен метод за одредување на структури, иако е тешко да се добијат интензивни, монохроматски неутронски зраци во доволни количини. Традиционално се користат јадрени реактори, иако извори кои создаваат неутрони со спалација стануваат сè повеќе достапни. Бидејќи не се наелектризирани, неутроните се расејуваат многу повеќе од атомските јадра отколку од електроните. Затоа, неутронското расејување е многу корисно за набљудување на позициите на лесни атоми со само неколку електрони, особено водородот, кој во суштина е невидлив кај рендгенската дифракција. Неутронското расејување, исто така има, извонредна особина да растворувачот може да се направи невидлив со прилагодување на односот меѓу нормалната вода, H<sub>2</sub>O, и тешката вода, D<sub>2</sub>O.
4 Методи
4.1 Преглед на монокристална дифракција на рендгенски зраци
Најстариот и најпрецизниот метод на рендгенска кристалографија е ''монокристална рендгенска дифракција'', во која рендгенскиот зрак озрачува еден кристал, со што се создаваат расејани зраци. Кога расејаните зраци удираат на детекторот тие создаваат дифракциона шема на точки; јачините и аглите на овие зраци се евидентираат како што кристалот постепено се ротира. Секоја точка се нарекува ''рефлексија'', бидејќи одговара на рефлексијата на рендгенските зраците од еден збир на рамномерно распоредени рамнини во рамките на кристалот. За монокристали со доволна чистота и правилност во структурата, со податоците за дифракцијата на рендгенските зраци може да се одредат средните должини и агли на хемиската врска во рамките на неколку илјадити делови од ангстрем и во рамките на десетти делови од степен, соодветно. Атомите во кристалот не се статични, но осцилираат околу нивните средни положби, обично за помалку од неколку десетти од ангстрем. Рендгенската кристалографија овозможува мерење на големината на овие осцилации.
4.1.1 Процедура
Техниката на монокристална рендгенска кристалографија има три основни чекори. Првиот, и најчесто најтешкиот чекор, е да се добие соодветен кристал за материјалот кој се изучува. Кристалот треба да биде доволно голем (обично поголем од 0,1 mm во сите димензии), со чист состав и правилна структура, со незначителни внатрешни несовршености, како што се пукнатини или сраснување.
Во вториот чекор, кристалот се поставува во интензивен зрак од рендгенски фотони, обично со една бранова должина (монохроматски зрак), кој ја создава правилната шема на рефлексии. Аглите и интензитетите на дифрактираните рендгенски зраци се мерат, при што секое соединение има уникатна шема на дифракција. Како што кристалот постепено се ротира, претходните рефлексии исчезнуваат и се појавуваат нови; интензитетот на секоја точка бива снимен при секоја ориентација на кристалот. Можеби ќе треба да се соберат повеќе збирови од податоци, со тоа што секој збир покрива малку повеќе од половина полна ротација на кристалот и обично содржи десетици илјади рефлексии.
Во третиот чекор, овие податоци се комбинираат во пресметките со комплементарни хемиски информации за да се создаде и усоврши моделот на распоредот на атомите во кристалот. Конечниот модел за распоредот на атомите (сега наречен ''кристална структура'') обично се чува во јавна база на податоци.
4.1.2 Ограничувања
Како повторувачката единица на кристалот (елементарната ќелија) станува сè поголема и посложена, сликата на атомско ниво, создадена со рендгенска кристалографија, станува сè понејасна за одреден број од набљудуваните рефлексии. Познати се два ограничувачки случаи на рендгенска кристалографија – „маломолекулска“ (која вклучува континуирани неоргански цврсти материи) и „макромолекулска“ кристалографија. Кристалографијата со мали молекули (маломолекулска) обично вклучува кристали со помалку од 100 атоми во нивната асиметрична ќелија; таквите кристални структури обично имаат толку добра резолуција што атомите можат да се препознаат како изолирани „топчиња“ на електронска густина. За разлика од нив, кај макромолекуларната кристалографија често има десетици илјади атоми во елементарната ќелија. Овие кристални структури обично имаат помала резолуција (тие се повеќе „размачкани“); атомите и хемиските врски се гледаат како цевки од електронска густина, а не како изолирани атоми. Малите молекули полесно можат да се кристализираат од макромолекулите; сепак, рендгенската кристалографија успешно се изведува и за вируси и белковини со стотици илјади атоми преку подобрени кристалографски слики и подобрена технологија. Иако нормално рендгенската кристалографија може да се изврши само ако примерокот е во кристална состојба, направени се нови истражувања за некристални форми на примероци.
4.2 Кристализација
За рендгенската кристалографија потребен е чист кристал со висока правилност во структурата за да може успешно да се реши структурата на комплициран распоред на атоми. Чисти и правилни кристали понекогаш можат да се добијат од природни или синтетички материјали, како што се примероци од метали, минерали или други макроскопски материјали. Редовноста на таквите кристали понекогаш може да се подобри со макромолекуларно кристално жарење (нормализација) и други методи. Сепак, во многу случаи, добивањето на кристал со дифракциски квалитет е главната пречка за решавање на неговата структура со атомска резолуција.
Маломолекулската и макромолекуларната кристалографија се разликуваат во опсегот на можни техники за производство на кристали со дифракциски квалитет. Малите молекули обично имаат само неколку степени на конформациона слобода и можат да бидат кристализирани со широк спектар на методи, како што се CVD (англ. Chemical Vapour Deposition) и рекристализација. За разлика од нив, макромолекулите обично имаат многу степени на слобода и нивната кристализација мора да биде изведена на таков начин што ќе се одржи нивната стабилна структура. На пример, белковините и поголемите РНК молекули не можат да се кристализираат ако не е формирана нивната терцијарна структура; затоа, опсегот на услови на кристализација е ограничен на услови на растворање во кои макромолекулите остануваат склопени.
Белковинските кристали речиси секогаш се растат во раствор. Најчестиот пристап е постепено да се намали растворливоста на белковината; доколку ова се изведе премногу брзо, молекулите ќе преципитираат (исталожат) од растворот, формирајќи бескорисен прашкаст талог или аморфен гел на дното од тубата. Кристалниот раст во растворот се одликува со два чекора: ''нуклеација'' на микроскопски кристалит (од веројатно само 100 молекули), проследено со ''раст'' на тој кристалит, идеално во кристал со дифракциски квалитет. Условите во растворот кои го поддржуваат првиот чекор (нуклеацијата) не се секогаш истите услови кои го поддржуваат вториот чекор (растот). Целта на кристалографот е да ги идентификува условите на растворот кои го поддржуваат формирањето на еден, голем кристал, бидејќи поголемите кристали нудат подобрена резолуција на молекулата. Следствено, условите на растворот треба да не се соодветни за првиот чекор (нуклеација), но да го поддржуваат вториот чекор (растот), така што само еден голем кристал се формира од една капка. Ако нуклеацијата е премногу фаворизирана, во капката ќе се формираат еден куп на мали кристалити, наместо еден голем кристал; но ако премалку се фаворизира, нема да се формира никаков кристал. Другите пристапи вклучуваат кристализирање на белковините во маслена средина, каде водените раствори на водорастворливи белковини се внесуваат во течно масло, а водата испарува низ слојот од масло. Различните масла имаат различна пропустливост за испарување, па затоа даваат промени во стапките на концентрација од различни смеси на перципиент/белковина. Техниката се заснова на доведување на белковината директно во зоната на нуклеација со мешање на белковината со соодветна количина на перципиентот за да се спречи дифузија на водата од капката.
Многу е тешко да се предвидат добри услови за нуклеација или раст на правилно структурирани кристали. Во пракса, поволните услови се идентификуваат со скрининг; се подготвуваат голем број на одделни раствори на молекулата и се тестираат за кристализација. Се испробуваат стотици, а понекогаш и илјадници, услови на растворот додека не се пронајде најсоодветниот. Различните услови можат да користат еден или повеќе физички механизми за да ја намалат растворливоста на молекулата; на пример, некои ја менуваат рН вредноста, некои содржат соли од серијата на Хофмајстер или супстанци кои ја намалуваат диелектричната константа на растворот, а некои содржат големи полимери како што е полиетилен гликолот, кои ја отстрануваат молекулата од растворот по пат на ентрописки ефекти. Исто така вообичаено е да се испробаат неколку температури за поттикнување на кристализацијата, или постепено да се намалува температурата за растворот да стане презаситен. Овие методи бараат големи количества од испитуваната молекула, бидејќи тие користат висока концентрација на молекулите кои треба да се кристализираат. Поради тешкотијата за добивање на такви големи количества (милиграми) на белковини за кристализација, создадени се роботи кои се способни за прецизно земање на примерок од капка која може да биде само 100 нанолитри во волумен. Ова значи дека во еден експеримент со автоматизација се користи десетпати помало количество од белковината отколку во експеримент изведен со мануелна работа, каде се ракува со количини од еден микролитар.
Познати се неколку фактори кои ја инхибираат или нарушуваат кристализацијата. Растечките кристали обично се одржуваат на константна температура и се заштитени од шокови или вибрации кои може да ја нарушат нивната кристализација. Нечистотиите во растворите за кристализација честопати се штетни за кристализацијата. Конформационата флексибилност во молекулата, исто така, има тенденција да ја направи кристализација помалку веројатна, поради ентропијата. Молекулите кои имаат тенденција да се агрегираат во правилни завојници честопати тешко се агрегираат во кристали. Кристалите можат да бидат нарушени поради сраснување, што може да се случи кога елементарната ќелија може подеднакво поволно да се формира во повеќе различни ориентации; иако неодамнешниот напредок во сметачките методи може да ја реши структурата и на некои сраснати кристали.
4.3 Собирање на податоци
4.3.1 Местење на кристалот
Кристалот се мести за мерење така што да биде постојано изложен на рендгенскиот зрак и да може да се ротира. Постојат неколку начини на местење на кристалот. Во минатото, кристалите биле местени во стаклени капилари со растворот за кристализација. Денес, кристалите изградени од мали молекули обично се прикачуваат со масло или лепило на стаклено влакно или јамка, која е направена од најлон или пластика и е прикачена на цврста дршка. Земањето примероци од белковинските кристали се врши со помош на јамка, а потоа бргу се замрзнуваат со течен азот. Замрзнувањето го намалува оштетувањето од рендгенските зраците, а и ги минимизира топлинските движења кои на дифрактограмот го засилуваат шумот (ефект на Дебај-Велер). Пред замрзнувањето, белковинскиот кристал се третира со раствор на криопротектант бидејќи нетретираните белковински кристали често пукаат при замрзнувањето. За жал, самиот третман на кристалот со криопротектант може да предизвика кршење на кристалот, правејќи го неупотреблив за кристалографија. Општо земено, успешните крио-услови можат да се одредат само по пат на обиди и грешки.
Капиларот или јамката се мести на гониометар, така да биде прецизно позиционирана во точка низ која минува рендгенскиот зрак и да може да се ротира. Бидејќи и кристалот и зракот често се многу мали, кристалот мора да биде во рамките на зракот со точност од околу 25 микрометри, што се постигнува со помош на камера која е фокусирана на кристалот. Најчестиот тип на гониометар е „капа гониометарот“, кој нуди три агли на ротација: ω аголот, кој ротира околу оската нормална (под прав агол) на зракот; κ аголот, околу оската приближно 50° од ω оската; и φ аголот, околу оската на јамката/капиларот. Кога κ аголот е нула, ω и φ оските се порамнети. Ротацијата на κ овозможува погодно местење на кристалот. Осцилациите кои се изведуваат за време на собирањето на податоци (наведени подолу) ја вклучуваат само ω оската.
4.3.2 Извори на рендгенско зрачење
Кристалот потоа се поставува во дифрактометар кој е поврзан со извор на рендгенско зрачење. Извор на рендгенско зрачење може да биде рендгенска цевка со стационарна анода (со моќност на влезниот електронски зрак од околу 2 kW), извор со вртечка анода (со моќност на влезниот електронски зрак од околу 14 kW), или синхротрон (значително појак флукс на фотони).
Синхротронското зрачење е најјакото зрачење кое се произведува на Земјата. Таа е најмоќната алатка достапна за рендгенските кристалографи. Ова зрачење се состои од рендгенски зраци генерирани во големи машини наречени синхротрони. Во синхротроните се забрзуваат електрично наелектризирани честички (најчесто електрони) скоро до брзината на светлината, а траекторијата им се ограничува со употреба на јаки магнетни полиња.
Синхротроните обично се национални капацитети, кои првично биле дизајнирани од физичарите кои ги проучувале субатомските честички и космичките феномени. Најголемата компонента на секој синхротрон е неговиот прстен за складирање на електрони. Овој прстен, всушност, не е совршен круг, туку многустран многуаголник. Во секој агол од многуаголникот, или сектор, има прецизно поставени магнети кои го искривуваат протокот на електрони. Како што траекторијата на електроните се искривува, тие испуштаат енергија во вид на рендгенски зраци.
Користењето на синхротронското зрачење честопати бара специфични услови за нејзината употреба во рендгенската кристалографија. Интензивното јонизирачко зрачење може да предизвика оштетување на примероците, особено макромолекуларните кристали. Крио-кристалографијата го штити примерокот од оштетување од зрачењето, со замрзнување на кристалот на температурата на течен азот (околу 100 K). Меѓутоа, синхротронското зрачење ја има можноста за менување на брановите должини, што е критично за експериментите како што се SAD (од англ. Single-wavelength anomalous diffraction) и MAD (од англ. Multi-wavelength anomalous dispersion).
Неодамна, развиени се ласери со слободни електрони за употреба во рендгенската кристалографија. Ова се моментално најсветлите извори на рендгенски зраци. Интензитетот на изворот е таков што шемите на дифракција со атомска резолуција може да се решат за кристали кои се премногу мали за собирање. Сепак, интензивниот извор на светлина го уништува примерокот, што бара замена на примероците и снимање на повеќе од нив. Бидејќи секој кристал е случајно ориентиран во зракот, мора да се соберат стотици илјади поединечни дифрактограми за да се добие комплетен збир на податоци. Овој метод, сериска фемтосекундна кристалографија, бил користен за решавање на структурата на голем број белковински кристали.
4.3.3 Снимање на рефлексиите
Кога еден кристал е наместен и изложен на интензивен зрак од рендгенски зраци, тој ги расејува рендгенските зраци во облик на точки наречени ''рефлексии'', кои може да се набљудуваат на екран зад кристалот. Релативните интензитети на овие точки даваат информации за утврдување на распоредот на молекулите во кристалот во атомски детали. Интензитетите на овие рефлексии можат да се снимат на фотографски филм или со CCD (charge-coupled device) детектор. Пиковите на малите агли одговараат на податоците со ниска резолуција, додека оние на големите агли претставуваат податоци со висока резолуција; на овој начин, горната граница на евентуалната резолуција на структурата може да се одреди од првите неколку снимки. Одредени мерења за квалитетот на дифракцијата може да се изведат во овој момент, како што е мозаичноста на кристалот и неговиот севкупен неред, што се забележува по ширината на пикот. Одредени недостатоци на кристалот кои би го направиле непогоден за решавање на структурата, исто така, може брзо да се дијагностицираат во овој момент.
Една слика од точки не е доволна за да се реконструира целиот кристал; таа претставува само мал дел од целата Фурјеова трансформација. За да се соберат сите потребни информации, кристалот мора да се ротира чекор-по-чекор низ 180° и да се прави снимка на секој чекор; всушност, потребно е малку повеќе од 180° за покривање на реципрочниот простор, поради закривеноста на Евалдовата сфера. Меѓутоа, доколку кристалот има симетрија од повисок ред, може да се сними помал аголен опсег, како што е 90° или 45°. Оската на вртење треба да се промени барем еднаш, за да се избегне појавување на „слепа точка“ во реципрочниот простор близу до оската на вртење.
4.4 Анализа на податоците
4.4.1 Кристална симетрија, елементарна ќелија и скалирање на слики
Снимената серија на дводимензионални дифракциони шеми, од кои секоја одговара на различна ориентација на кристалот, се претвора во тридимензионален модел на електронска густина; процесот на претворање ја користи математичката техника на Фурјеови трансформации, што е објаснето подолу. Секоја точка одговара на различен тип на варијација во електронската густина; кристалографот мора да одреди која варијација одговара на која точка (''индексирање''), релативните јачини на точките во различните слики (''спојување'' и ''скалирање'') и како овие варијации треба да се искомбинираат за да се добие вкупната електронска густина (решавање на фазниот проблем).
Обработката на податоци започнува со ''индексирање'' на рефлексиите. Ова значи да се идентификуваат димензиите на елементарната ќелија и кој пик во сликата одговара на која позиција во реципрочниот простор. Нуспроизвод на индексирањето е да се одреди симетријата на кристалот, односно неговата ''просторна група''. Некои просторни групи можат да се елиминираат од самиот почеток. На пример, симетрии на рефлексија не можат да се набљудуваат кај хиралните молекули; па затоа од 230 можни, дозволени се само 65 просторни групи за белковинските молекули, кои речиси секогаш се хирални. Индексирањето обично се постигнува со користење на ''автоиндексирачка'' рутина. По назначувањето на симетријата, податоците се ''интегрираат''. Ова ги претвора стотиците слики, кои содржат илјадници рефлексии, во една податотека, која се состои од (во најмала рака) записи на Милеровиот индекс за секоја рефлексија и интензитетот за секоја рефлексија (во оваа состојба податотеката вклучува и проценки за грешки и мерки на пристрасност (кој дел од дадената рефлексија е снимен на таа слика)).
Целосниот збир на податоци може да се состои од стотици одделни слики земени при различни ориентации на кристалот. Првиот чекор е да се спојат и да се скалираат овие различни слики, т.е. да се одреди кои пикови се појавуваат во две или повеќе слики (спојување) и да се наместат така што ќе имаат доследна скала на интензитет (скалирање). Оптимизирањето на скалата на интензитет е критично, бидејќи релативниот интензитет на пиковите е клучната информација од која се одредува структурата. Репетитивната техника на собирање на кристалографски податоци и високата симетрија на кристалните материјали прават дифрактометарот повеќепати да снима мноштво на симетрично-еквивалентни рефлексии. Ова овозможува пресметување на R-факторот поврзан со симетријата, кој е индекс на доверливост заснован на тоа колку се слични мерените интензитети на симетрично-еквивалентните рефлексии, со што се проценува квалитетот на податоците.
4.4.2 Првично решавање на фазниот проблем
Податоците собрани од експериментот се реципрочна просторна репрезентација на кристалната решетка. Позицијата на секоја дифракциона „точка“ зависи од големината и обликот на елементарната ќелија и внатрешната симетрија на кристалот. Се снима интензитетот на секоја дифракциона „точка“, и овој интензитет е пропорционален на квадратот на амплитудата на ''структурниот фактор''. Структурниот фактор е комплексен број, кој содржи информации и за амплитудата и за фазата на бранот. За да се добие мапа на електронската густина, која ќе може да се толкува, мора да се знаат и амплитудата и фазата (мапата на електронска густина му овозможува на кристалографот да изгради почетен модел на молекулата). Фазата не може директно да се одреди за време на експериментот: ова е познато како фазен проблем. Првични проценки за фазата можат да се добијат на неколку различни начини:
*''Ab initio'' решавање на фазниот проблем или директни методи – Ова е обично метод од избор за помали молекули (<1000 неводородни атоми) и успешно се користи за решавање на фазните проблеми кај малите белковини. Ако резолуцијата на податоците е подобра од 1,4 Å (140 пикометри), може да се искористат директните методи за добивање на информации за фазата, со искористување на познати фазни врски помеѓу одредени групи на рефлексии.*Молекулска замена – ако е позната сродна структура, таа може да се користи за одредување на ориентацијата и позицијата на молекулите во елементарната ќелија. Фазите кои се добиени на овој начин можат да се користат за создавање на мапи на електронската густина.*Аномално расејување на рендгенски зрак (''MAD'' или ''SAD'' решавање на фазниот проблем) - MAD (од англ. Multi-wavelength anomalous dispersion) е техника која се користи во рендгенската кристалографија за да го олесни определувањето на тридимензионалната структура на биолошките макромолекули преку решавање на фазниот проблем. SAD (од англ. Single-wavelength anomalous dispersion) за разлика од MAD користи еден збир на податоци на една соодветна бранова должина.
*Методи со тешки атоми (MIR, од англ. Multiple isomorphous replacement) - Ако во кристалот можат да се внесат метални атоми со голема електронска густина, можат да се употребат директни методи или Патерсоновата функција за да се одреди нивната локација и да се добијат првични фази. Таквите тешки атоми може да се внесат во кристалот или со негово натопување во раствор кој го содржи тешкиот атом или по пат на кокристализација (растење на кристалот во присуство на тешкиот атом). Како и кај MAD методот, промените во амплитудите на расејувањето може да се толкуваат за да се добијат фазите. Иако ова е оригиналниот метод со кој биле решени кристалните структури на многу белковини, тој во голема мера е заменет со MAD методот кој користи селенометионин.
4.4.3 Развивање на моделот и подобрување на фазата
По добивањето на почетните фази, може да се изгради првичен модел на структурата. Атомските позиции во моделот и нивните соодветни Дебај-Валерови фактори (или B-фактори, кои се однесуваат на топлинското движење на атомот) можат да бидат подобрени (пречистени) за да одговараат на набљудуваните податоци од дифракцијата, идеално давајќи подобар збир на фази. Потоа може да се изработи нов модел за да одговара на новата мапа на електронска густина, а потоа повторно се изведуваат неколку циклуси на подобрување (пречистување) на податоците. Овој процес продолжува сè додека не се максимизира корелацијата помеѓу податоците од дифракција и моделот. Усогласеноста се мери со ''R''-фактор, кој се дефинира како
:<math>R = \frac{\sum_{\mathrm{all\ reflections \left|F_{obs} - F_{calc} \right|}{\sum_{\mathrm{all\ reflections \left|F_{obs} \right|}</math>
каде ''F'' е структурниот фактор. Сличен критериум за квалитет е ''R''<sub>free</sub>, кој се пресметува од подмножество (~10%) на рефлексии кои не биле вклучени во пречистувањето на структурата. Двата ''R'' фактори зависат од резолуцијата на податоците.
Понекогаш не е возможно да се набљудува секој атом во асиметричната елементарна ќелија. Во многу случаи, кристалографскиот неред ја размачкува мапата на електронска густина. Атомите на водород, кои слабо расејуваат, обично се невидливи. Исто така е можно да еден атом се појави неколкупати во мапата на електронска густина, на пример, доколку некој белковински страничен ланец има повеќе (<4) дозволени конформации. Во други случаи, кристалографот може да забележи дека решената ковалентна структура за молекулата е неточна или изменета. На пример, белковините може да подлежат на пост-транслациони модификации кои не биле откриени пред кристализацијата.
4.4.4 Неред
Чест предизвик во подобрувањето на кристалните структури е кристалографскиот неред. Нередот може да има многу форми, но генерално станува збор за истовремено постоење на две или повеќе типови на конформации. Доколку не се препознае нередот може да дојде до неточна интерпретација на податоците.
4.5 Депонирање на структурата
Откако моделот на структурата на молекулата е готов, тој се депонира во кристалографска база на податоци, како што е Кембричката база на податоци за структури (англ. Cambridge Structural Database, CSD) (за мали молекули), Базата на податоци за неоргански кристални структури (англ. Inorganic Crystal Structure Database, ICSD) (за неоргански соединенија) или Банката на податоци за белковини (англ. Protein Data Bank, PDB). Многу структури кои се добиени за приватни комерцијални цели (кристализација на медицински релевантни белковини) не се депонираат во јавните кристалографски бази на податоци.
5 Теорија на дифракција
Главната цел на рендгенската кристалографија е да се одреди електронската густина ''f''(r) низ волуменот на кристалот, каде r претставува тридимензионалниот вектор на положба во рамките на кристалот. За да се направи ова, се користи расејувањето на рендгенските зраци за да се соберат податоци за неговата Фурјеова трансформација ''F''(q), кој претрпува математичка инверзија да се добие густината во реалниот простор, со употреба на формулата
:<math>f(\mathbf{r}) = \frac{1}{\left(2\pi\right)^{3 \int F(\mathbf{q}) e^{\mathrm{i}\mathbf{q}\cdot\mathbf{r \mathrm{d}\mathbf{q}</math>
каде интегралот се зема од сите вредности на q. Тридимензионалниот реален вектор q претставува точка во реципрочен простор, т.е. до одредена осцилација во електронската густина при движење во правецот во кој q е насочен. Должината на q одговара на 2<math>\pi</math> поделен со брановата должина на осцилацијата. Соодветната формула за Фурјеова трансформација ќе се користи подолу
:<math>F(\mathbf{q}) = \int f(\mathbf{r}) \mathrm{e}^{-\mathrm{i}\mathbf{q}\cdot\mathbf{r\mathrm{d}\mathbf{r}</math>
каде интегралот е на сите можни вредности на векторот на положба r во рамките на кристалот.
Фурјеовата трансформација ''F''(q) генерално е комплексен број, и затоа има величина |''F''(q)| и фаза ''φ''(q) поврзани со равенката
:<math>F(\mathbf{q}) = \left|F(\mathbf{q}) \right|\mathrm{e}^{\mathrm{i}\phi(\mathbf{q})}</math>
Интензитетите на рефлексиите кои се набљудуваат кај рендгенската дифракција ги даваат величините |''F''(q)|, но не и фазите ''φ''(q). За начинот на кој се добиваат фазите види погоре во текстот. Обединувањето на величините и фазите ја дава целосната Фурјеова трансформација ''F''(q), од која со превртување се добива електронската густина ''f''(r).
Кристали често се идеализирани како ''совршено'' периодични. Во идеален случај, атомите се позиционирани на совршена решетка, електронската густина е совршено периодична и Фурјеовата трансформација ''F''(q) е нула, освен кога q припаѓа на реципрочната решетка (т.н. ''Брегови пикови''). Во реалноста кристалите не се совршено периодични; атомите вибрираат околу нивните средни положби, а можат да постојат и различни типови на неред, како што се мозаичност, дислокација, разни точкести дефекти и хетерогеност во конформацијата на кристализираните молекули. Затоа Бреговите пикови имаат ограничена ширина и може да има значително ''дифузно расејување'', односно континуум на расејани рендгенски зраци кои се наоѓаат помеѓу Бреговите пикови.
5.1 Интуитивно разбирање од Бреговиот закон
Интуитивно разбирање за рендгенската дифракција може да се добие од Бреговиот закон (Брегов модел на дифракција). Во овој модел, дадена рефлексија е поврзана со група на рамномерно распоредени рамнини кои го пресекуваат кристалот, обично минувајќи низ центрите на атомите на кристалната решетка. Ориентацијата на одредена група на рамнини се идентификува со нејзините три Милерови индекси (''h'', ''k'', ''l'') и нека растојанието меѓу нив се обележи со ''d''. Вилијам Лоренс Брег предложил модел во кој влезните рендгенски зраци се расејуваат спекуларно (огледално) од секоја рамнина; оттука, рендгенски зраци кои се расејани од соседните рамнини конструктивно интерферираат (конструктивна интерференција) кога аголот θ помеѓу рамнината и рендгенскиот зрак резултира во разлика во должината на патеката која е цел множител ''n'' на брановата должина λ.
:<math>2 d\sin\theta = n\lambda\,</math>
За рефлексијата се вели дека е ''индексирана'' кога нејзините Милерови индекси (или, поточно, нејзините векторски компоненти на реципрочната решетка) се идентификувани од познатата бранова должина и аголот на расејување 2θ. Таквото индексирање ги дава параметрите на елементарната ќелија, должините и аглите на елементарната ќелија, како и нејзината просторна група. Бидејќи Бреговиот закон не ги толкува релативните интензитети на рефлексиите, тој не е соодветен за решавање на распоредот на атомите во елементарната ќелија, па затоа, мора да се изведе методата на Фурјеова трансформација.
5.2 Расејувањето како Фурјеова трансформација
Влезниот рендгенски зрак има поларизација и треба да биде претставен како бранов вектор; меѓутоа, заради едноставност, овде нека биде претставен како скаларен бран. Исто така се игнорира компликацијата на временската зависност на бранот и само се концентрира на просторната зависност на бранот. Плоснатите бранови можат да бидат претставени со бранов вектор k<sub>in</sub>, па така јачината на влезниот бран во време ''t=0'' е изразена со
:<math>A \mathrm{e}^{\mathrm{i}\mathbf{k}_{\mathrm{in \cdot \mathbf{r</math>
На позиција r во примерок, нека има густина на расејувачите ''f''(r); овие расејувачи треба да создадат расејан сферичен бран со амплитуда која е пропорционална на локалната амплитудата на влезниот бран помножено со бројот на расејувачи во мал волумен ''dV'' околу r
:<math>\mathrm{amplituda\ na\ rasejan\ bran} = A \mathrm{e}^{\mathrm{i}\mathbf{k} \cdot \mathbf{r S f(\mathbf{r}) \mathrm{d}V</math>
каде што ''S'' е константа на пропорционалност.
Ајде да го разгледаме делот од расејаните бранови кои излегуваат со вектор на бран k<sub>out</sub> и удираат на екранот во r<sub>screen</sub>. Бидејќи нема загуба на енергија (еластично расејување), брановите должини се исти, а исти се и величините на векторите на бранот |k<sub>in</sub>|=|k<sub>out</sub>|. Од времето кога фотонот е расејан на r до времето кога е апсорбиран на r<sub>screen</sub>, фотонот подлежи на фазна промена
:<math>e^{i \mathbf{k}_{out} \cdot \left( \mathbf{r}_{\mathrm{screen - \mathbf{r} \right)}</math>
Нето зрачењето кое пристигнува на r<sub>screen</sub> е збирот на сите расејани бранови низ кристалот
:<math>A S \int \mathrm{d}\mathbf{r} f(\mathbf{r}) \mathrm{e}^{\mathrm{i} \mathbf{k}_{in} \cdot \mathbf{r
e^{i \mathbf{k}_{out} \cdot \left( \mathbf{r}_{\mathrm{screen - \mathbf{r} \right)} =
A S e^{i \mathbf{k}_{out} \cdot \mathbf{r}_{\mathrm{screen}
\int \mathrm{d}\mathbf{r} f(\mathbf{r}) \mathrm{e}^{\mathrm{i} \left( \mathbf{k}_{in} - \mathbf{k}_{out} \right) \cdot \mathbf{r </math>
што може да биде напишан како Фурјеова транформација
:<math>A S \mathrm{e}^{\mathrm{i} \mathbf{k}_{out} \cdot \mathbf{r}_{\mathrm{screen}
\int d\mathbf{r} f(\mathbf{r}) \mathrm{e}^{-\mathrm{i} \mathbf{q} \cdot \mathbf{r =
A S \mathrm{e}^{\mathrm{i} \mathbf{k}_{out} \cdot \mathbf{r}_{\mathrm{screen} F(\mathbf{q})</math>
каде q = k<sub>out</sub> – k<sub>in</sub>. Измерениот интензитет на рефлексијата ќе биде квадратот на оваа амплитуда
:<math>A^{2} S^{2} \left|F(\mathbf{q}) \right|^{2}</math>
5.3 Фриделови и Бијвоетови придружници
За секоја рефлексија која одговара на точка q во реципрочниот простор, постои уште една рефлексија со ист интензитет на спротивната точка -q. Оваа спротивна рефлексија е позната како ''Фриделов придружник'' на оригиналната рефлексија. Оваа симетричност резултира од математичкиот факт што електронската густина ''f''(r) на позиција r секогаш е реален број. Како што е наведено погоре, ''f''(r) е инверзната трансформација на нејзината Фурјеова трансформација ''F''(q); сепак, ваква инверзна трансформација генерално е комплексен број. За да се осигура дека ''f''(r) е реален број, Фурјеовата трансформација ''F''(q) мора да биде таква што Фриделовите придружници ''F''(−q) и ''F''(q) се конјугирани комплексни броеви еден со друг. На тој начин, ''F''(−q) ја има истата величина како ''F''(q), но тие имаат спротивна фаза, т.е., ''φ''(q) = −''φ''(q)
:<math>F(-\mathbf{q}) = \left|F(-\mathbf{q}) \right|\mathrm{e}^{\mathrm{i}\phi(-\mathbf{q})} = F^{*}(\mathbf{q}) = \left| F(\mathbf{q}) \right|\mathrm{e}^{-\mathrm{i}\phi(\mathbf{q})} </math>
Еднаквоста на нивните величини гарантира дека Фриделовите придружници го имаат истиот интензитет |''F''|<sup>2</sup>. Оваа симетричност овозможува да се измери целата Фурјеова трансформација од само половина од реципрочниот простор, на пример, со ротирање на кристалот малку повеќе од 180°, наместо целосна револуција од 360°. Кај кристалите со значителна симетрија, дури и повеќе рефлексии може да го имаат истиот интензитет (Бијвоетови придружници); во такви случаи, дури и помалку од реципрочниот простор треба да се измери. Во поволните случаи на висок степен на симетричност, понекогаш само 90°, или дури само 45°, на податоци се потребни за целосно истражување на реципрочниот простор.
Условот на Фриделовиот придружник може да биде изведен од дефиницијата за инверзната Фурјеова трансформација
:<math>f(\mathbf{r}) = \int \frac{d\mathbf{q{\left(2\pi\right)^{3 F(\mathbf{q}) \mathrm{e}^{\mathrm{i}\mathbf{q}\cdot\mathbf{r =
\int \frac{d\mathbf{q{\left(2\pi\right)^{3 \left|F(\mathbf{q}) \right|\mathrm{e}^{\mathrm{i}\phi(\mathbf{q})} \mathrm{e}^{\mathrm{i}\mathbf{q}\cdot\mathbf{r </math>
Бидејќи Ојлеровата формула наведува дека e<sup>i''x''</sup> = cos(''x'') + i sin(''x''), инверзната Фурјеова трансформација може да биде расчленета на збир од чисто реален дел и чисто имагинарен дел
:<math>f(\mathbf{r}) =
\int \frac{d\mathbf{q{\left(2\pi\right)^{3 \left|F(\mathbf{q}) \right|\mathrm{e}^{\mathrm{i}\left(\phi+\mathbf{q}\cdot\mathbf{r}\right)} =
\int \frac{d\mathbf{q{\left(2\pi\right)^{3 \left|F(\mathbf{q}) \right|
\cos\left(\phi+\mathbf{q}\cdot\mathbf{r}\right) +
i \int \frac{d\mathbf{q{\left(2\pi\right)^{3 \left|F(\mathbf{q}) \right|
\sin\left(\phi+\mathbf{q}\cdot\mathbf{r}\right) = I_{\mathrm{cos + iI_{\mathrm{sin</math>
Функцијата ''f''(r) е реална ако и само ако вториот интеграл ''I''<sub>sin</sub> е нула за сите вредности на r. Ова е точно ако и само ако горниот услов е задоволен
:<math>I_{\mathrm{sin = \int \frac{d\mathbf{q{\left(2\pi\right)^{3 \left|F(\mathbf{q}) \right|\sin\left(\phi+\mathbf{q}\cdot\mathbf{r}\right) =
\int \frac{d\mathbf{q{\left(2\pi\right)^{3 \left|F(\mathbf{-q}) \right|
\sin\left(-\phi-\mathbf{q}\cdot\mathbf{r}\right) = -I_{\mathrm{sin</math>
бидејќи ''I''<sub>sin</sub> = −''I''<sub>sin</sub> подразбира дека ''I''<sub>sin</sub>=0.
5.4 Евалдова сфера
Секој дифракција на Х-зраци претставува само еден пресек, сферичен пресек на реципрочен простор, како што може да се види од конструкцијата на Евалдовата сфера. Двете k<sub>out</sub> и k<sub>in</sub> имаат иста должина, поради еластичното расејување, бидејќи брановата должина не се променила. Затоа, тие можат да бидат претставени како два радијални вектора во сфера во реципрочен простор, што ги покажува вредности на q кои се земени како примерок од дадена дифракциона слика. Бидејќи постои мало ширење на влезните бранови должини на влезниот зрак, вредностите на |''F''(q)| може да се измерат само за q векторите кои се наоѓаат помеѓу двете сфери кои одговараат на тие полупречници. Затоа, за да се добие целосен збир на податоци на Фурјеова трансформација потребно е кристалот да се ротира малку повеќе од 180°, или понекогаш и помалку, ако е присутна доволна симетрија. Потполна ротација од 360° не е потребна, поради интринзичната симетрија во Фурјеовите трансформации на реалните функции (како што е електронската густина), но потребно е малку повеќе од 180° за да се покрие целиот реципрочен простор во рамките на дадената резолуција, поради закривеноста на Евалдовата сфера.
5.5 Патерсонова функција
Добро познат резултат на Фурјеовите трансформации е теоремата на автокорелација, која наведува дека автокорелацијата ''c''(r) на функцијата ''f''(r)
:<math>c(\mathbf{r}) = \int d\mathbf{x} f(\mathbf{x}) f(\mathbf{x} + \mathbf{r}) = \int \frac{d\mathbf{q{\left(2\pi\right)^{3 C(\mathbf{q}) e^{i\mathbf{q}\cdot\mathbf{r</math>
има Фурјеова трансформација ''C''(q) која е квадратната величина на ''F''(q)
:<math>C(\mathbf{q}) = \left|F(\mathbf{q}) \right|^{2}</math>
Затоа, функцијата на автокорелација ''c''(r) на електронската густина (исто така позната како ''Патерсонова функција'') може да биде директно пресметана од интензитетите на рефлексиите, без пресметка на фазите. Во принцип, ова може да се користи за директно одредување на кристалната структура, меѓутоа во пракса тешко се изведува. Функцијата на автокорелација одговара на дистрибуцијата на векторите помеѓу атомите во кристалот; на тој начин, кристал со ''N'' атоми во елементарната ќелија може да има ''N(N-1)'' пикови во неговата Патерсонова функција. Со оглед на неизбежните грешки во мерењето на интензитетите и математичките тешкотии во реконструкцијата на атомските позиции од меѓуатомските вектори, оваа техника ретко се користи за решавање на структурите, со исклучок на наједноставните кристали.
5.6 Предности на кристалите
Во принцип, атомската структура може да се одреди со примена на рендгенско расејување на некристални примероци, дури и на една молекула. Меѓутоа, кристалите даваат многу посилен сигнал што се должи на нивната периодичност. Кристалниот примерокот по дефиниција е периодичен; кристалот се состои од повеќе елементарни ќелии кои неограничено се повторуваат во три независни правци. Таквите периодични системи имаат Фурјеова трансформација која е концентрирана на периодично повторувачки точки во реципрочен простор познати како ''Брегови пикови''; Бреговите пикови одговараат на точките на рефлексиите на сликата на дифракција. Бидејќи амплитудата на овие рефлексии расте линеарно со бројот ''N'' на расејувачи, набљудуваниот ''интензитет'' на овие точки треба квадратно да расте, како ''N''<sup>2</sup>. Со други зборови, употребата на кристал го концентрира слабото расејување на поединечните елементарни ќелии во многу посилна, кохерентна рефлексија која може да се набљудува над шумот. Ова е пример за конструктивна интерференција.
6 Нобелови награди за рендгенска кристалографија
Година, Лауреат, Награда, Образложение
1914, Макс фон Лауе, Физика, „За неговото откритие на дифракцијата на X-зраците од кристали“, важен чекор во развојот на рендгенската спектроскопија.
1915, Вилијам Хенри Брег, Физика, „За нивната работа во анализата на кристалната структура со помош на X-зраци“
1915, Вилијам Лоренс Брег, Физика, „За нивната работа во анализата на кристалната структура со помош на X-зраци“
1962, Макс Ф. Перуц, Хемија, „За нивното проучување на структурата на глобуларните белковини“
1962, Џон Кендру, Хемија, „За нивното проучување на структурата на глобуларните белковини“
1962, Џејмс Вотсон, Медицина, „За нивното откритие на молекуларната структура на нуклеинските киселини и нејзината значајност за трансфер на информации во живата материја“<ref>
1962, Франсис Хари Комптон Крик, Медицина, „За нивното откритие на молекуларната структура на нуклеинските киселини и нејзината значајност за трансфер на информации во живата материја“
1962, Морис Хју Фредерик Вилкинс, Медицина, „За нивното откритие на молекуларната структура на нуклеинските киселини и нејзината значајност за трансфер на информации во живата материја“
1964, Дороти Хоџкин, Хемија, „За нејзините одредувања со помош на рендгенски техники на структурите на важни биохемиски супстанци“
1972, Стенфорд Мур, Хемија, „За нивниот придонес во разбирањето на врската помеѓу хемиската структура и каталитичката активност на активниот центар на рибонуклеазната молекула“
1972, Вилијам Х. Штајн, Хемија, „За нивниот придонес во разбирањето на врската помеѓу хемиската структура и каталитичката активност на активниот центар на рибонуклеазната молекула“
1976, Вилијам Н. Липскомб, Хемија, „За неговите проучувања на структурата на бораните што илуминира проблеми за хемиското врзување“
1985, Џером Карле, Хемија, „За нивните извонредни успеси во развојот на директни методи за одредувањето на кристални структури“
1985, Херберт А. Хауптман, Хемија, „За нивните извонредни успеси во развојот на директни методи за одредувањето на кристални структури“
1988, Јохан Дајзенхофер, Хемија, „За нивното одредување на тридимензионалната структура на фотосинтетски реакционен центар“
1988, Хартмут Мичел, Хемија, „За нивното одредување на тридимензионалната структура на фотосинтетски реакционен центар“
1988, Роберт Хјубер, Хемија, „За нивното одредување на тридимензионалната структура на фотосинтетски реакционен центар“
1997, Џон Е. Вокер, Хемија, „За нивното разјаснување на ензиматскиот механизам за синтеза на аденозин трифосфат (ATP)“
2003, Родерик Меккинон, Хемија, „За откритија кои се однесуваат на канали во клеточни мембрани [...] за структурно и механистичко проучување на јонски канали“
2003, Петер Агре, Хемија, „За откритија кои се однесуваат на канали во клеточни мембрани [...] за откритието на водните канали“
2006, Роџер Д. Корнберг, Хемија, „За неговите проучувања на молекуларната основа на еукариотската транскрипција“
2009, Ада Е. Јонат, Хемија, „За истражувања на структурата и функцијата на рибозомот“
2009, Томас А. Штајц, Хемија, „За истражувања на структурата и функцијата на рибозомот“
2009, Венкатраман Рамакришан, Хемија, „За истражувања на структурата и функцијата на рибозомот“
2012, Брајан Кобилка, Хемија, „За проучувања на рецептори поврзани со G-белковина“
7 Поврзано
* Брегов закон
* Дифракција на електрони
* Дифракција на неутрони
* Рендгенска прашковна дифракција
* Џон Дезмонд Бернал
7.1 Меѓународни табели за кристалографија
***
7.2 Збирки на статии
***
7.3 Учебници
************** ,
**
7.4 Применета компјутерска анализа на податоци
*
7.5 Историски
***** Ewald, P. P., editor (Reprinted in pdf format for the IUCr XVIII Congress, Glasgow, Scotland, International Union of Crystallography).
***
7.6 Вежби
* (англиски)
* (англиски)
* , видео серијал на Кралската институција на Велика Британија (англиски)
* (PDF) мрежно место на Илиноишкиот институт за технологија (англиски)
* (англиски)
* (англиски)
* , демонстрира својства дифракциона слика на 2D кристал (англиски)
* , илустрирање на односот помеѓу кристалот и дифракционата слика во 2D (англиски)
* (англиски)
* од страна на Ричард Ј. Матји (англиски)
* од Кралската институција на Велика Британија (англиски)
7.7 Основни бази на податоци
* (PDB)
* (NDB)
* (CSD)
* (ICSD)
* (BMCD)
7.8 Изведени бази на податоци
***** Структурна класификација на белковините база на податоци
* CATH база на податоци
*
7.9 Структурна валидација
*** (проверува за неповолни ротамери на Asn и Gln остатоци)
* (идентификува белковини слични на дадена белковина)