Обратна генетика

Обратна генетика — метод во молекуларната генетика што се користи за да помогне во разбирањето на функцијата на генот преку анализа на фенотипските ефекти предизвикани од генетско инженерство и специфични секвенци на нуклеинска киселина во генот. Процесот продолжува во спротивна насока за да се проследат генетските екрани на класичната генетика. Додека напредната генетика се обидува да ја пронајде генетската основа на фенотипот или особина, обратната генетика бара да открие кои фенотипови се контролирани од одредени генетски секвенци.
Автоматското секвенцирање на ДНК релативно брзо генерира големи количини на податоци за геномската секвенца. Обратна генетика се обидува да поврзе дадена генетска секвенца со специфични ефекти врз организмот. Системите за обратна генетика, исто така, можат да овозможат закрепнување и генерирање на заразни или неисправни вируси со посакувани мутации. Ова овозможува можност за проучување на вирусот ''ин витро'' и ''ин виво''.
1 Користени техники
Со цел да го научат влијанието што една низа го има врз фенотипот или да ја откријат неговата биолошка функција, истражувачите можат да направат промена или да ја нарушат дезоксирибонуклеинската киселина. Откако ќе се направи оваа промена, истражувачот може да го бара ефектот од таквите промени во целиот организам. Постојат неколку различни методи на обратна генетика:
1.1 Насочени бришења и точкести мутации
Локусната насочена мутагенеза е софистицирана техника која може или да ги промени регулаторните региони во промоторот на генот или да направи суптилни промени на кодот во отворената рамка за читање за да се идентификуваат важните амино остатоци за протеинската функција.
Алтернативно, техниката може да се користи за создавање на нулти алели, така што генот не е функционален. На пример, бришење на ген со таргетирање на гените ( генски нокаут) може да се направи кај некои организми, како што се квасец, глувци и мов. Уникатен меѓу растенијата, кај Physcomitrella patens, генетскиот нокаут преку хомологна рекомбинација за создавање на нокаут мов (види слика) е речиси исто толку ефикасен како кај квасецот Во случајот на системот за модел на квасец, создадени се насочени бришења во секој несуштински ген во геномот на квасецот. . Во случајот со системот на растителен модел, создадени се огромни мутантни податоци врз основа на конструкции за нарушување на генот. Во генетскиот нок-ин, ендогениот егзон се заменува со изменета секвенца на интерес.
Во некои случаи условните алели може да се користат така што генот има нормална функција додека не се активира условниот алел. Ова може да доведе до „удирање“ на местата на рекомбинација што ќе предизвика бришење на генот кој е од интерес кога ќе се индуцира специфична рекомбиназа (како CRE, FLP). Рекомбиназите Cre или Flp може да се индуцираат со хемиски третмани, третмани со топлински шок или да се ограничат на одредена подгрупа на ткива.
Друга техника што може да се користи е TILLING. Ова е метод кој комбинира стандардна и ефикасна техника на мутагенеза со хемиски мутаген како што е етил метансулфонат (EMS) со чувствителна техника за скрининг на ДНК која ги идентификува точкестите мутации во целниот ген.
Во областа на вирологијата, техниките на обратна генетика може да се користат за обновување на инфективни вируси со целосна должина со посакувани мутации или вметнувања во вирусните геноми или во специфичните гени на вирусот. Технологиите кои ги дозволуваат овие манипулации вклучуваат кружна реакција на екстензија на полимераза (КРЕП) која првпат била искористена за генерирање на инфективна cDNA за вирусот Кунџин, близок роднина на Западнонилскиот вирус. КРЕП, исто така, успешно се користи за генерирање на низа РНК вируси со позитивна смисла, како што е SARS-CoV-2, предизвикувачкиот агенс на КОВИД-19.
1.2 Замолчување на гените
Откритието на т.н. замолчување на гените со користење на двоверижна РНК, исто така познато како РНК интерференција (РНКи), и развојот на генски нокдаун со помош на Морфолино олигос, го направиле нарушувањето на генската експресија пристапна техника за многу повеќе истражувачи. Овој метод често се нарекува генски нокдаун бидејќи ефектите од овие реагенси се генерално привремени, за разлика од генските нокаути кои се трајни.
РНКи создава специфичен нокаут ефект без всушност да мутира на ДНК од интерес. Во C. elegans, РНКи се користи за систематско мешање со изразувањето на повеќето гени во геномот. РНКи делува така што ги насочува клеточните системи да ја деградираат целната гласничка РНК (mRNA).
Интерференцијата на РНКи, конкретно замолчувањето на гените, станала корисна алатка за замолчување на изразувањето на гените и за идентификување и анализа на нивниот фенотип за губење на функцијата. Кога се случуваат мутации во алели, функцијата што ја претставува, исто така, е мутирана и изгубена; ова генерално се нарекува мутација со губење на функцијата. Способноста да се анализира фенотипот со губење на функцијата овозможува анализа на функцијата на генот кога нема пристап до мутантните алели.
Додека РНКи се потпира на клеточните компоненти за ефикасност, едноставна алтернатива за соборување на гените е Morpholino antisense oligos. Морфолиносите се врзуваат и го блокираат пристапот до целната mRNA без да бараат активност на клеточните протеини и без нужно да ја забрзаат деградацијата на mRNA. Морфолиносите се ефикасни во системи кои се движат по сложеност од превод без клетки во епрувета до ин виво студии кај големи животински модели.
1.3 Пречки со помош на трансгени
Молекуларниот генетски пристап е создавање на трансгенски организми кои прекумерно изразуваат нормален ген од интерес. Резултирачкиот фенотип може да ја одразува нормалната функција на генот.
Алтернативно, можно е прекумерно да се изразат мутантни форми на ген кои се мешаат во функцијата на нормалниот (див тип) ген. На пример, прекумерното изразување на мутантен ген може да резултира со високи нивоа на нефункционален протеин кое може да резултира со доминантна негативна интеракција со протеинот од див тип. Во овој случај, мутантската верзија ќе се натпреварува за партнерите од дивиот тип протеини што ќе резултира со мутант фенотип.
Други мутантни форми може да резултираат со протеин кој е ненормално регулиран и конститутивно активен („вклучен“ цело време). Ова може да се должи на отстранување на регулаторен домен или мутација на специфичен амино остаток што е реверзибилно модифициран (со фосфорилација, метилација или убиквитинација). Секоја промена е критична за модулирање на протеинската функција и често резултира со информативни фенотипови.
2 Синтеза на вакцини
Атенуираните вируси се создаваат со размножување на жив вирус под нови услови, како што е јајцето од пиле. Ова произведува вирусен сој кој е сè уште жив, но не е патоген за луѓето, бидејќи овие вируси се претвораат во дефекти со тоа што не можат да го реплицираат нивниот геном доволно за да се размножуваат и доволно да заразат домаќин. Сепак, вирусните гени сè уште се изразуваат во клетката на домаќинот преку еден циклус на репликација, што овозможува развој на имунитет.
Вакцините создадени преку обратни генетски методи се познати како атенуирана вакцини, именувани затоа што содржат ослабени (атенуирани) живи вируси. Атенуираните вакцини се создаваат со комбинирање на гени од нов или актуелен вирус на вирус со претходно атенуирани вируси од истиот вид. Атенуираните вируси се создаваат со размножување на жив вирус во нови услови, како што е јајцето од пиле. Ова создава вирусен вид кој е сè уште жив, но не е патоген за луѓето, бидејќи овие вируси се претвораат во дефекти со тоа што не можат доволно да го реплицираат нивниот геном за да се размножуваат и доволно да заразат домаќин. Сепак, вирусните гени сè уште се изразуваат во клетката на домаќинот преку еден циклус на репликација, што овозможува развој на имунитет.
2.1 Вакцина против грип
Вообичаен начин да се создаде вакцина користејќи обратни генетски техники е да се користат плазмиди за синтеза на атенуирани вируси. Оваа техника најчесто се користи во годишното производство на вакцини против грип, каде што осум плазмиден систем може брзо да произведе ефективна вакцина. Целиот геном на вирусот на инфлуенца А се состои од осум РНК сегменти, така што комбинацијата од шест атенуирани вирусни cDNA плазмиди со два плазмиди од див тип овозможуваат конструирање на атенуиран сој на вакцина. За развој на вакцини против грип, четвртиот и шестиот сегмент на РНК, коишто ги кодираат протеините на хемаглутинин и неураминидаза, соодветно, се земени од циркулирачкиот вирус, додека другите шест сегменти се добиени од претходно атенуиран главен сој. Протеините HA и NA покажуваат висока разновидност на антиген, и затоа се земени од тековниот сој за кој се произведува вакцината за да се создаде добро усогласена вакцина.
Плазмидот што се користи во овој систем со осум плазмиди содржи три главни компоненти кои овозможуваат развој на вакцина. Прво, плазмидот содржи рестриктивни места кои ќе овозможат инкорпорирање на гени на грип во плазмидот. Второ, плазмидот содржи ген за отпорност на антибиотици, што овозможува избор на само плазмиди кои го содржат точниот ген. И на крај, плазмидот содржи два промотори, човечки pol 1 и pol 2 промотор кои ги транскрибираат гените во спротивни насоки.
cDNA секвенците на вирусна РНК се синтетизираат од атенуирани мастер соеви со користење на RT-PCR . Оваа cDNA потоа може да се вметне помеѓу промотор на РНК полимераза I (Pol I) и терминаторска секвенца преку дигестија со рестриктивен ензим. Секвенцата на cDNA и pol I потоа, пак, е опкружена со промотер на РНК полимераза II (Pol II) и полиаденилација . Целата оваа низа потоа се вметнува во плазмид. Шест плазмиди добиени од атенуираниот главен вид cDNA се котрансфектираат во целна клетка, често пилешко јајце, заедно со два плазмида од тековно циркулирачкиот вид на грип од див тип. Внатре во целната клетка, двата „наредени“ ензими Pol I и Pol II ја транскрибираат вирусната cDNA за да ги синтетизираат и вирусната РНК со негативна смисла и mRNA со позитивна смисла, ефикасно создавајќи атенуиран вирус. [1] Резултатот е дефектен сој на вакцина кој е сличен на сегашниот вид на вирус, што му овозможува на домаќинот да изгради имунитет. Овој синтетизиран сој на вакцина потоа може да се користи како вирус на семе за да се создадат дополнителни вакцини.
2.2 Предности и недостатоци
Вакцините направени од обратна генетика имаат неколку предности во однос на традиционалните дизајни на вакцини. Најзабележителна е брзината на производство. Поради високата антигенска варијација во HA и NA гликопротеините, обратниот генетски пристап овозможува брзо формулирање на потребниот генотип (т.е. оној што содржи HA и NA протеини земени од тековно циркулирачките вирусни соеви). Дополнително, бидејќи финалниот производ на производството на вакцини ослабено со обратна генетика е жив вирус, се покажува повисока имуногеност отколку кај традиционалните инактивирани вакцини, кои мора да се уништат со употреба на хемиски процедури пред да се пренесат како вакцина. Сепак, поради живата природа на атенуираните вируси, може да настанат компликации кај пациенти со имунодефициенција. Исто така, постои можност дека мутацијата на вирусот би можела да доведе до тоа вакцината да се претвори во жив неослабен вирус.
3 Дополнителна литература
***