Пиридоксал фосфат

Пиридоксал фосфат (PLP, пиридоксал 5'- фосфат, P5P), активната форма на витамин Б<sub>6</sub>, е коензим во различни ензимски реакции. Меѓународната унија за биохемија и молекуларна биологија има каталогизирано повеќе од 140 PLP-зависни активности, што одговара на ~4% од сите класифицирани активности. Разновидноста на PLP произлегува од неговата способност ковалентно да се врзува за подлогата, а потоа да дејствува како електрофилен катализатор, со што се стабилизираат различни видови карбанионски реакциски меѓупроизводи.
1 Улога како коензим
PLP делува како коензим во сите реакции на трансаминација и во одредени реакции на декарбоксилација, деаминација и рацемизација на аминокиселини. Алдехидната група на PLP формира Шифова базална врска (внатрешен алдимин ) со ε-амино групата на специфична лизинска група на ензимот аминотрансфераза. α-амино групата на аминокиселинскиот супстрат ја поместува ε-амино групата на лизинскиот остаток на активното место во процес познат како трансалдиминација. Резултирачкиот надворешен алдимин може да изгуби протон, јаглерод диоксид или страничен ланец на аминокиселина за да стане хиноноиден меѓупроизвод, кој пак може да дејствува како нуклеофил во неколку реакциони патишта.
При трансаминација, по депротонацијата, хиноноидниот меѓупроизвод прифаќа протон на различна позиција за да стане имин. Добиениот кетимин се хидролизира, така што амино групата останува на комплексот. Покрај тоа, PLP се користи од аминотрансферази (или трансаминази) кои дејствуваат врз необични шеќери како што се перозамин и дезозамин. Во овие реакции, PLP реагира со глутаминска киселина, кој ја пренесува својата алфа-амино група во PLP за да направи пиридоксамин фосфат (PMP). PMP потоа го пренесува својот азот во шеќерот, создавајќи амино шеќер.
PLP е исто така вклучен во разни реакции на елиминација на бета-азиди, како што се реакциите што ги извршуваат серин дехидратазата и GDP-4-кето-6-деоксиманоза-3-дехидратазата (ColD).
Исто така е активен во реакцијата на кондензација при синтезата на хемот.
PLP игра улога во конверзијата на леводопа во допамин, го олеснува претворањето на возбудливиот невротрансмитер глутаминска киселина во инхибиторен невротрансмитер Гама-аминобутерна киселина и овозможува SAM да се декарбоксилира за да формира пропиламин, кој е претходник на полиамините.
2 Улога во човечкото тело
Пиридоксал фосфатот има бројни улоги во човечкото тело. Неколку примери подолу:
* Метаболизам и биосинтеза на серотонин. Пиридоксал фосфатот е кофактор на ароматичната L-аминокиселина декарбоксилаза. Ова овозможува конверзија на 5-хидрокситриптофан (5-HTP) во серотонин (5-HT). Оваа реакција се одвива во серотонергични неврони.
* Метаболизам и биосинтеза на хистамин. Пиридоксал фосфатот е кофактор на L-хистидин декарбоксилазата. Ова овозможува конверзија на хистидинот во хистамин. Оваа реакција се одвива во Голџиевиот апарат во мастоцитите и кај базофилите. Потоа, хистаминот се складира грануларно во мастоцитите како комплекс со киселински остатоци од хепарин протеогликан, додека кај базофилите како комплекс со хондроитин сулфат.
* Метаболизам и биосинтеза на ГАБА (γ-аминобутерна киселина). Пиридоксал фосфатот е кофактор на глутаминската киселина декарбоксилаза (GAD). Ова овозможува конверзија на глутаминска киселина во ГАБА. Реакцијата се одвива во цитоплазмата на завршетокот на ГАБА-ергичните неврони, па затоа недостатокот на витамин Б<sub>6</sub> може да предизвика епилептични напади кај децата. Пиридоксал фосфатот, исто така, учествува во оксидативната деаминација на ГАБА, каде што е кофактор на ГАБА аминотрансферазата.
* Метаболизам на орнитин. Пиридоксал фосфатот е кофактор на орнитин карбоксилазата.
* Трансаминација. Пиридоксал фосфатот учествува во разградувањето и синтезата на аминокиселини, масти и јаглехидрати, како и во биосинтезата на хормони, невротрансмитери и хемот.
3 Апсорпција и транспорт
Во нормални услови, човечкото црево апсорбира главно нефосфорилиран витамин Б6. Фосфорилираните форми на Б6 и гликозидот на пиридоксин можат да се хидролизираат со цревни фосфатази и цревна гликозидаза, соодветно, за да се поттикне пасивна дифузија на пиридоксамин, пиридоксин и пиридоксал. Во црниот дроб или цревата, тие потоа се рефосфорилираат со пиридоксал киназа (EC 2.7.1.35) за да се избегне инверзна дифузија транспортен протеин / мембрански носач на PLP (и други фосфорилирани форми на Б6) е човечкиот мембрански ензим NAPE-PLD N-ацил фосфатидилетаноламин-специфична фосфолипаза D на ендоканабиноидниот систем. Во присуство на жолчни киселини (на пр., варење), NAPE-PLD со својот внатрешен канал создава мембрански пори како динамични спроводливи патишта преку кои наелектризираните кофактори на витамин Б6 можат да дифундираат низ клеточните мембрани и мембраните на субцелуларните оддели (на пр., митохондрии, пероксизом и ендозом), каде што ги извршуваат специфичните ензимски активности. NAPE-PLD е функционален за интрацелуларно апсорбирање и мобилизација на PLP, како и за зголемената побарувачка на кофакторот во патолошки состојби со повисок ендоканабиноиден тон. Концентрациите на интрацелуларно слободни PLP се одржуваат на приближно 1 μM за да се спречат несоодветни реакции. Протеините што се врзуваат за PLP и помагаат во одржувањето на ниски концентрации на слободни PLP вклучуваат гликоген фосфорилаза во мускулите, хемоглобин во еритроцитите, албумин во плазмата и NAPE-PLD главно во мозокот, цревата, црниот дроб, бубрезите и репродуктивниот систем. Кога внесот на витамини Б6 ги надминува барањата, PLP се дефосфорилира (главно во црниот дроб) и пиридоксалот се оксидира до пиридоксична киселина пред да се излачи во урината.
4 Невообичаени места на PLP
PLP се наоѓа и на гликоген фосфорилазата во црниот дроб, каде што се користи за разградување на гликогенот при гликогенолиза кога глукагонот или адреналинот му сигнализираат да го стори тоа. Сепак, овој ензим не ја експлоатира реактивната алдехидна група, туку ја користи фосфатната група на PLP за да ја изврши својата реакција.
Иако огромното мнозинство PLP-зависни ензими формираат внатрешен алдимин со PLP преку лизински остаток на активното место, некои PLP-зависни ензими немаат овој лизински остаток, туку имаат хистидин во активното место. Во таков случај, хистидинот не може да го формира внатрешниот алдимин и, затоа, кофакторот не станува ковалентно врзан за ензимот. GDP-4-кето-6-деоксиманоза-3-дехидратаза (ColD) е пример за таков ензим. Човечката серин хидроксиметилтрансфераза 2 ги регулира реакциите на пренос на еден јаглерод потребни за метаболизмот на аминокиселините и нуклеотидите и постои во димерни и тетрамерни форми. Димерната SHMT2 варијанта е моќен инхибитор на ензимскиот комплекс BRISC деубиквитилаза, кој го регулира имунолошкиот систем за сигнализација на клетките. Неодамнешните студии покажуваат дека тетрамеризацијата на SJMT2 е индуцирана од PLP. Ова спречува интеракција со комплексот деубикутилаза на BRISC, што потенцијално ги поврзува нивоата на витамин Б6 и метаболизмот со воспаление.
5 Каталитички механизам
Ензимите зависни од пиридоксал-5'-фосфат (PLP ензими) катализираат безброј реакции. Иако обемот на реакциите катализирани од PLP се чини дека е огромен, обединувачкиот принцип е формирање на внатрешен алдимин добиен од лизин. Откако амино супстратот ќе реагира со активното место, се генерира нова Шифова база, вообичаено наречена надворешен алдимин. По овој чекор, патеката за секоја реакција катализирана од PLP се разликува.
6 Специфичност
Специфичноста се должи на фактот дека, од четирите врски на алфа-јаглеродот на аминокиселината алдимин, врската нормална на пиридинскиот прстен ќе биде прекината (Дунатанова стереоелектронска хипотеза). Следствено, специфичноста е диктирана од тоа како ензимите се врзуваат за своите супстрати. Дополнителна улога во специфичноста игра леснотијата на протонирање на азотот во пиридинскиот прстен.
7 PLP-ензими
PLP се задржува на активното место не само благодарение на лизинот, туку и благодарение на интеракцијата на фосфатната група и делот за врзување на фосфати, а во помала мера и благодарение на натрупувањето на базите на пиридинскиот прстен со надвиснат ароматичен остаток, генерално тирозин (кој исто така може да учествува во киселинско-базната катализа). И покрај ограничените барања за џеб за врзување на PLP, PLP ензимите припаѓаат само на пет различни семејства. Овие семејства не корелираат добро со одреден тип на реакција. Петте семејства се класифицирани како типови на преклопување проследени со римски број.* Тип I на преклопување — семејство на аспартат аминотрансферази
* Тип II на преклопување — семејство на триптофан синтаза
* Тип III на преклопување — семејство на аланин рацемаза (TIM-цилиндар)
* Тип IV на преклопување — семејство на D-аминокиселински аминотрансферази
* Тип V на преклопување — семејство на гликоген фосфорилази
8 Биосинтеза
8.1 Од витамини
Животните се ауксотрофни за овој ензимски кофактор и бараат тој да се дополнува, па оттука и неговата класификација како витамин, за разлика од MoCo или CoQ10 на пример. PLP се синтетизира од пиридоксал од страна на ензимот пиридоксал киназа (ген PDXK), за што е потребен еден молекул на ATP. PDXK може да произведе и 5'-фосфати на другите витамини (пиридоксин и пиридоксамин), со пиридоксин 5'-фосфат оксидаза која ги претвора овие алтернативни 5'-фосфати во PLP.
PLP се создава и метаболизира во црниот дроб. PLP и другите фосфати на витамин Б6 можат да се разградат од пиридоксал фосфатазата, која ја отстранува фосфатната група.
8.2 Прототрофија
Моментално се познати два природни патишта за PLP: едниот бара деоксиксилулоза 5-фосфат (DXP), додека другиот не, па затоа се познати како DXP-зависни и DXP-независни. Овие патишта се опширно проучувани кај ''Escherichia coli'' и ''Bacillus subtilis'', соодветно. И покрај разликата во почетните соединенија и различниот број на потребни чекори, двата патишта поседуваат многу заеднички карактеристики.
8.2.1 DXP-зависна биосинтеза
DXP-зависниот биосинтетски пат бара неколку чекори и конвергенција на две гранки, едната произведува 3-хидрокси-1-аминоацетон фосфат од еритроза 4-фосфат, додека другата (единечен ензим) произведува деоксиксилулоза 5-фосфат (DXP) од глицералдехид 3-фосфат (GAP) и пирогроздова киселина. Производот на кондензација на 3-хидрокси-1-аминоацетон фосфат и деоксиксилулоза 5-фосфат е пиридоксин 5'-фосфат. Кондензацијата е катализирана од PNP синтаза, кодирана од ''pdxJ'', што создава PNP (пиридоксин 5' фосфат). Крајниот ензим е PNP оксидаза (''pdxH''), која ја катализира оксидацијата на 4' хидроксилната група во алдехид користејќи диоксиген, што резултира со водород пероксид.
Првата гранка е катализирана во ''E. coli'' од ензими кодирани од ''epd'', ''pdxB'', ''serC'' и ''pdxA'' . Овие делат механистички сличности и хомологија со трите ензими во биосинтезата на серин (''serA'' (хомолог на ''pdxB''), ''serC'', ''serB'' - сепак, ''epd'' е хомолог на ''gap''), што укажува на заедничко еволутивно потекло на двата патишта. Кај неколку видови постојат два хомолога на генот ''serC''''на E. coli'', генерално едниот во ser оперон (''serC''), а другиот во pdx оперон, во кој случај се нарекува ''pdxF''.
Во библиотека за прекумерна експресија беше пронајден „случаен пат“ кој можеше да ја потисне ауксотрофијата предизвикана од бришењето на pdxB (кодирање на еритронат 4 фосфат дехидрогеназа) во ''E. coli''. Случајниот пат беше многу неефикасен, но беше можен поради промискуитетната активност на различни ензими. Започна со 3-фосфохидроксипирогроздова киселина (производ на ензимот кодиран ''од serA'' во биосинтезата на серин) и не бараше еритронат-4-фосфат. 3PHP беше дефосфорилиран, што резултираше со нестабилен меѓупроизвод кој спонтано декарбоксилира (оттука и присуството на фосфатот во биосинтетскиот пат на серин) до гликалдехид. Гликалдехидот беше кондензиран со глицин, а фосфорилираниот производ беше 4-фосфохидрокситреонин (4PHT), каноничниот супстрат за 4-PHT дехидрогеназа (''pdxA'').
8.2.2 DXP-независна биосинтеза
DXP-независниот PLP-биосинтетски пат се состои од чекор катализиран од пиридоксал 5'-фосфат синтаза (хидролизирање на глутамин), ензим составен од две подединици. PdxS катализира кондензација на рибулоза 5-фосфат, глицералдехид-3-фосфат и амонијак, а овие втори молекули се произведуваат од PdxT кој катализира производство на амонијак од глутамин. PdxS е (β/α)8 буре (исто така познато како TIM-буре) кое формира додекамер.
8.3 Абиотска синтеза
Широко распространетата употреба на PLP во централниот метаболизам, особено во биосинтезата на аминокиселини, и неговата активност во отсуство на ензими, сугерира дека PLP може да биде „пребиотско“ соединение - односно нешто што претходи на потеклото на органскиот живот (да не се меша со пребиотски соединенија, супстанции кои служат како извор на храна за корисни бактерии). Всушност, загревањето на амонијакот и гликолалдехид спонтано формира различни пиридини, вклучувајќи го и пиридоксал. Под одредени услови, PLP се формира од цијаноацетилен, диацетилен, јаглерод моноксид, водород, вода и фосфорна киселина.
9 Инхибитори
Познати се неколку инхибитори на PLP ензимите.
Еден тип на инхибитор формира електрофил со PLP, предизвикувајќи тој неповратно да реагира со лизинот на активното место. Ацетиленските соединенија (на пр. пропаргилглицин) и винилните соединенија (на пр. винилглицин) се такви инхибитори. Различен тип на инхибитор го инактивира PLP, а такви се α-метил и амино-окси аналози на супстрат (на пр. α-метилглутаминска киселина). Други инхибитори имаат добри заминувачки групи кои нуклеофилно го напаѓаат PLP. Таков е хлороаланин, кој инхибира голем број ензими.
Примери за инхибитори:
* Левотироксин Кај стаорци дадени само 10 μg D, L-тироксин дневно во тек на 15 дена, активноста на цистеин десулфхидразата во црниот дроб исчезнува, а активностите на серин и треонин дехидразата и аланин глутаминска киселина трансаминазата се намалуваат за околу 40%. Или ин виво внесувањето пиридоксал-5-фосфат или ин витро додавањето на коензимот во препаратите за црниот дроб ја враќа целосната активност на сите овие ензими, а малата ин витро инхибиција во присуство на <sup>10−5</sup> M тироксин е исто така поништена од пиридоксал-5-фосфат.* Неактивната форма пиридоксин компетитивно го инхибира активниот пиридоксал-5'-фосфат. Следствено, симптомите на суплементација со витамин Б6 во форма на пиридоксин можат да ги имитираат оние на недостаток на витамин Б6; ефект кој можеби би можел да се избегне со суплементација со P5P наместо тоа.* AlaP (аланин фосфонат) ги инхибира аланин рацемазите, но неговиот недостаток на специфичност доведе до понатамошни дизајни на ALR инхибитори.* Габакулин и вигабатрин ја инхибираат ГАБА аминотрансферазата
* Каналин и 5-флуорометилорнитин ја инхибираат орнитин аминотрансферазата
* Амино-окси SAM ја инхибира ACC синтазата
10 Еволуција
Ензимите зависни од пиридоксал-5-фосфат (витамин Б6) имаат повеќекратно еволутивно потекло. Вкупните ензими на Б6 се разделија во четири независни еволутивни линии: α семејство (т.е. аспартат трансаминаза), β семејство (серин дехидратаза), D- аланин трансаминаза семејство и аланин рацемаза семејство. Пример за еволутивната сличност во бета семејството се гледа во механизмот. β ензимите се сите лиази и катализираат реакции каде што учествуваат Cα и Cβ. Генерално, кај Витамин Б6 -зависните ензими, PLP во секој случај е ковалентно врзан преку иминска врска со амино групата во активното место.