Функционално клонирање

Функционално клонирање ― техника на молекуларно клонирање која се потпира на претходно знаење за секвенцата или функцијата на кодираната белковина за идентификација на гените. Во оваа анализа, геномска библиотека или библиотека на комплементарна ДНК е проверувана за да биде идентификувана генетската секвенца на белковина од интерес. Изразувачките библиотеки на комплементарна ДНК може да бидат видени со антитела специфични за белковината од интерес или може да се потпрат на селекција преку белковинската функција. Историски гледано, аминокиселинската секвенца на белковината била користена за да се подготват дегенерирани олигонуклеотиди кои потоа биле испитани во библиотеката за да биде идентификуван генот што ја кодира белковината од интерес. Откако ќе бидат идентификувани кандидатските клонови кои го носат генот од интерес, тие се секвенционираат и нивниот идентитет е потврден. Овој метод на клонирање им овозможува на истражувачите да прегледаат цели геноми без претходно знаење за локацијата на генот или генетската секвенца.
Оваа техника може да биде користена за да бидат идентификувани гени кои кодираат слични белковини од еден организам до друг. Слично на тоа, оваа техника може да биде поврзана со метагеномски библиотеки за да бидат идентификувани нови гени и белковини кои вршат слични функции, како што е идентификација на нови антибиотици со проверка за активност на бета-лактамаза или избирање за раст во присуство на пеницилин.
1 Опитен работен тек
Работниот тек на опитот за функционално клонирање варира во зависност од изворот на генетскиот материјал, степенот на претходно познавање на белковината или генот од интерес и способноста за проверка на белковинската функција. Општо земено, опитот за функционално клонирање се состои од четири чекори: 1) собирање примероци, 2) подготовка на библиотеката, 3) скрининг или селекција и 4) секвенционирање.
1.1 Собирање примероци
Генетскиот материјал е собиран од одреден тип на клетка, организам или примерок од околината релевантен за биолошкото прашање. Во функционалното клонирање, информациската РНК најчесто е изолирана и комплементарната ДНК е подготвувана од изолираната информациска РНК (екстракција на РНК). Во одредени околности, геномската ДНК може да биде изолирана, особено кога примероците од околината се користени како извор на генетски материјал.
1.2 Подготовка на библиотека
Ако почетниот материјал е геномска ДНК, ДНК е вадена за да бидат добиени фрагменти со соодветна должина за векторот на избор. Фрагментите од ДНК или комплементарна ДНК потоа се третирани со рестриктивни ендонуклеази и се врзуваани со плазмид или хромозомски вектори. Во случај на анализи кои ја проверуваат белковината или неговата функција, користен е изразувачки вектор за да биде осигурано дека генскиот производ е изразен. Изборот на векторот ќе зависи од потеклото на ДНК или комплементарна ДНК за да биде обезбедено правилно изразување и да биде осигурано дека кодираниот ген ќе падне во границите на големината на вметнувањето на векторот.
Изборот на домаќин е важен за да биде осигура дека употребата на кодонот ќе биде слична на организмот-дарител. Домаќинот исто така ќе треба да гарантира дека ќе се случат соодветни послепреведувачки модификации и преклопување на белковините за да биде овозможено правилно функционирање на изразените белковини.
1.3 Проверка или селекција
Методот на проверка на подготвените геномски или библиотеки на комплементарна ДНК за генот од интерес е многу променлив во зависност од опитниот дизајн и биолошкото прашање. Еден метод на проверка е да бидат испитани колониите преку Саутерновиот метод со дегенерирани олигонуклеотиди подготвени од аминокиселинската секвенца на бараната белковина. Во библиотеките за изразување, белковината од интерес може да биде идентификувана со проверка со антитело специфично за бараната белковина преку западниот Саутернов метод за да бидат идентификувани колониите кои го носат генот од интерес. Во други околности, специфична анализа може да биде користена за проверка или избор на активноста на белковината. На пример, гените кои даваат отпорност на антибиотици може да бидат избрани со одгледување на колониите од библиотеката на медиум што содржи одреден антибиотик. Друг пример е проверка за ензимска активност со инкубирање со супстрат кој е катализиран до колориметриско соединение кое лесно може да биде виден.
1.4 Секвенционирање
Последниот чекор од функционалното клонирање е да биде секвенционирана ДНК или комплементарна ДНК од клоновите кои биле успешно идентификувани во проверката или чекорот на селекција. Редоследот потоа може да биде означен и да биде користен за надолни примени, како што се изразување на белковини и прочистување за индустриски примени.
2 Предности
Предностите на функционалното клонирање ја вклучуваат можноста за проверка на нови гени со посакувана примена во организми кои не можат да бидат одгледувани, особено од бактериски или вирусни примероци. Дополнително, гените кои кодираат белковини со сродни функции може да бидат идентификувани кога има мала сличност во секвенцата поради способноста да биде направена проверка само на белковинската функција. Функционалното клонирање овозможува идентификација на генот без претходно знаење за геномската секвенца на организмот или положбата на генот во геномот.
3 Ограничувања
Како и со другите техники на клонирање, изборот на вектор и домаќин влијае на успехот на идентификацијата на гените преку функционално клонирање поради пристрасност кон клонирање. Векторот мора да има големина на внес која ќе ја смести целата секвенца на ДНК на изразената белковина. Дополнително, во изразувачките вектори, промоторите и терминаторите мора да функционираат во рамките на избраниот организам домаќин. Изборот на домаќинот може да влијае на транскрипцијата и преводот поради различната употреба на кодони, транскрипциските и преведувачките машини или послепреведувачките изменувања во домаќинот.
Други ограничувања вклучуваат трудоинтензивна подготовка на библиотеката и потенцијални проверки кои можат да бидат и скапи и одземаат многу време.
4 Алтернативни пристапи
4.1 Положбено клонирање
Положбеното клонирање е друга техника на молекуларно клонирање за идентификација на ген од интерес. Овој метод користи точно хромозомско место наместо функција за да ја води идентификацијата на гените. Поради ова, овој метод е насочен на целиот генетски материјал во хромозомскиот локус и не прави претпоставки за функцијата. Кај моделните организми како што се глувците или квасецот, овој метод е користен почесто бидејќи информациите за положбата на генот од интерес може да бидат добиени од секвенционираниот геном. Сепак, овој метод станува многу понезгоден кога информациите за секвенцата не се достапни. Во овој случај, може да биде користена и анализа на поврзување. Функционалното клонирање од друга страна полесно е користемо кај организми како што се бактериски патогени кои се остварливи, но не можат да бидат одгледувани и каде што податоците за секвенцата не се достапни, но генската хомологија или белковинската функција е сè уште од интерес.
Начин да биде направена разлика помеѓу функционалното и положбеното клонирање е да бидат видени гените како зборови. Функционалното клонирање е како користење на речник за барање зборови и избирање нови зборови кои имаат исти значења (или функции). Положбеното клонирање е повеќе како да изберете одредена страница од речник и потоа да ја прелистувате само таа страница за какви било зборови од интерес.
4.2 Сметачки определена хомологија
Со доаѓањето на технологијата за секвенционирање станува поевтина и поевтина, сега е поизводливо да биде секвенциониран непознат геном и потоа сметачки да биде одреден хомологијата наместо проверка. Ова ја носи дополнителната придобивка од можноста за проверка на повеќе гени од интерес во исто време и го намалува времето на опитување. Тоа, исто така, овозможува да бидат избегнати трудоинтензивните процедури за клонирање. Меѓутоа, ако се оди по овој пат, има и други предрасуди и пречки што треба да бидат земани во предвид. Со користење на секвенционирани податоци, може да биде направена проверка само врз основа на хомологија. Така, пристапот заснован на функции овозможува откривање на нови ензими чии функции не би биле предвидени само врз основа на секвенцата на ДНК. Затоа, иако секвенционирањето опитно е помалку трудоинтензивно, исто така може да доведе до пропуштени гени од интерес поради различната хомологија на секвенцата во гените со сродна функција.
4.3 Гибсоново составување
Гибсонското склопување е брз метод на клонирање кој користи три примарни ензими; 5' егзонуклеаза, полимераза и лигаза. Егзонуклеазата го вари 5' крајот на фрагментите на ДНК оставајќи 3' настрешница. Ако има значителна хомологија (20-40 bp) на секој крај од внесот на ДНК, може да биде анелирано со комплементарен столб. После тоа, полимеразата може да ги пополни празнините додека лигазата ги спојува процепите на крајот. Овој метод во голема мера ја зголемува стапката на клонирање и стапката на успех на клонирање во векторски столб. Сепак, потребно е фрагментот на ДНК да има значителна хомологија со плазмидот. Поради оваа причина, знаењето за секвенцата што е клонирана мора да биде знаено претходно. Ова не е услов со функционалното клонирање.
4.4 Клонирање засновано на изомераза
Клонирањето засновано на изомераза е метод на клонирање што користи Taq полимераза. Ова е затоа што Taq остава единечен аденозин настрешница на 3'-крајот на производите за реакција на полимеразната верижна реакција. Користејќи го ова знаење, 'рбетот со 5' тимин надвиснат може да бидат користени за цели на клонирање. Во овој случај мора да биде знаено знаењето за фрагментот што е клониран за да може да бидат направени прајмери на полимеразна верижна реакција за него и бројот на вектори што одговараат со клонирањето со изомераза е релативно мал. Сепак, тоа дава предност што за реакциите се потребни само околу 5 минути.
4.5 Клонирање со рекомбинација на влез
Клонирањето со рекомбинација на влезот е метод на клонирање во кој фрагмент на ДНК се преместува од еден плазмиден столб во друг преку единствен хомологен настан на рекомбинација. Меѓутоа, за да функционира овој метод, фрагментот на ДНК од интерес мора да биде опкружен со места за рекомбинација. Иако овој метод не е строго алтернатива, тој овозможува движење на фрагментите на ДНК од еден плазмид до друг побрзо отколку создавање на сосема нова геномска библиотека. Причината поради која овој метод може да биде користен во врска со функционалното клонирање е да биде ставена библиотека под различен промотор или на столб со различен маркер за селекција. Ова може да биде корисно ако поединецот сака да проба функционално клонирање во широк опсег на бактерии за да се обиде да се избори со проблемот со пристрасност на кодонот.
5 Примени
5.1 Утврдување на хомологија во животната средина
Метагеномиката е едно од најголемите полиња што најчесто користи функционално клонирање. Метагеномиката го проучува целиот генетски материјал од специфичен примерок од околината, како што е микробиомот на цревата или езерската вода. Создавани се функционални библиотеки кои содржат фрагменти на ДНК од околината. Бидејќи првобитната бактерија од која потекнува секвенцата на ДНК не може лесно да биде откриена, создавањето метагеномски функционални библиотеки има предности. Помалку од 1% од сите бактерии лесно се одгледуваат во лабораторија, оставајќи голем процент на бактерии кои не можат да бидат одгледуваат. Со користење на функционални библиотеки, генските функции на неодгледани бактерии сè уште може да бидат проучувани. Понатаму, овие некултурни микроби обезбедуваат извор за откривање на нови ензими со биотехнолошки примени. Некои нови белковини кои се откриени од морските средини вклучуваат ензими како што се протеази, амилази, липази, хитинази, деоксирибонуклеази и фосфатази.
5.2 Одредување на хомологија кај познат вид
Постојат ситуации во кои е императив да биде утврден дали генот хомолог од еден извор е присутен во друг организам. На пример, идентификација на нови ДНК-полимерази за реакции на полимеразна верижна реакција кои синтетизираат молекули на ДНК од деоксирибонуклеотиди. Додека човечката полимераза оптимално функционира на 37 °C, ДНК не се денатурира до 94-98 °C. Ова претставува проблем бидејќи на овие температури човечката ДНК-полимераза би денатурирала за време на чекорот на денатурација на полимеразната верижна реакција што резултира со нефункционален полимеразна белковина и неуспешна полимеразна верижна реакција. За борба против ова може да биде користена ДНК-полимераза од термофил, или бактерија која расте на високи температури. Пример е Taq полимеразата која доаѓа од термофилната бактерија ''Thermus aquaticus''. Може да биде поставена функционална клонирачка контрола за да бидат пронајдени хомологни полимерази кои имаат дополнителна предност што се термостабилни на високи температури.
Имајќи го ова на ум, 3173 полимераза, друг полимеразен ензим, кој сега најчесто е користен во реакциите на обратната транскрипција на полимеразна верижна реакција, бил откриен користејќи ја горната теорија. Во обратната транскрипција на полимеразна верижна реакција, најчесто се користеји два одделни ензими. Првата е ретровирусна обратна транскриптаза за претворање на РНК во комплементарна ДНК. Втората е термостабилна ДНК полимераза за засилување на целната секвенца. 3173 Полимеразата е способна да ги извршува двете ензимски функции што резултира со подобра можност за обратната транскрипција на полимеразна верижна реакција. Ензимот е откриен со помош на функционално клонирање од вирус домаќин првично пронајден во топлите извори Октопус (93 °C) во Националниот парк Јелоустоун.
5.3 Примени за човековото здравје
Еден од тековните предизвици за лекување на бактериски инфекции е отпорноста на антибиотици, која вообичаено се појавува кога пациентите не го земаат целосниот третман со лекови и оттука им дозволуваат на бактериите да развијат отпорност на антибиотици со текот на времето. За да биде разбрано како да има борба против отпорноста на антибиотици, важно е да биде разбрано како бактерискиот геном се развива и менува кај здрави поединки без неодамнешна употреба на антибиотици за да биде обезбедена основната линија. Користејќи функционална техника заснована на клонирање, ДНК изолирана од човечка микрофлора била клонирана во вектори на изразување во ''Escherichia coli''. Потоа, антибиотиците се применувани како проверка. Ако плазмидот содржел генски внес што обезбедува отпорност на антибиотици, клетката преживеала и била избрана на плочката. Ако внесот не давал отпор, клетката умрела и не образувала колонија. Врз основа на изборот на клеточни колонии кои преживеале, била собрана подобра слика за генетските фактори кои придонесуваат за отпорност на антибиотици. Повеќето од гените за отпор кои биле идентификувани биле претходно непознати. Со користење на функционална техника заснована на клонирање, може да бидат разјаснети гените кои предизвикуваат отпорност на антибиотици за подобро разбирање на третманот за бактериски инфекции.
6 Поврзано
* Библиотека на комплементарна ДНК
* Генетска проверка
* Геномска библиотека
* Хибридизациска сонда
* Молекуларно клонирање
7 Наводи