Цитогенетика

Цитогенетика ― во суштина е гранка на генетиката, но исто така е дел од клеточната биологија/цитологија (поделба на човечката анатомија), која се занимава со тоа како хромозомите се поврзани со однесувањето на клетките, особено со нивното однесување за време на митоза и мејоза. Техниките што се користени се кариотипизација, анализа на хромозоми со G-појас, други техники за цитогенетско поврзување, како и молекуларна цитогенетика како што е флуоресцентна „на лице место“ хибридизација и споредбена геномска хибридизација.
1 Историја
1.1 Почетоци
Хромозомите првпат биле забележани во растителните клетки од Карл Негели во 1842 година. Нивното однесување во клетките на животните (саламандери) било опишано од Валтер Флеминг, откривачот на митозата, во 1882 година. Името било измислено од страна друг германски анатом, фон Валдејер во 1888 година.
Следната фаза се случи по развојот на генетиката на почетокот на 20 век, кога било ценето дека збирот на хромозоми (кариотипот) е носител на гените. Се чини дека Левицки е првиот што го дефинирал кариотипот како фенотипски изглед на соматските хромозоми, за разлика од нивната генска содржина. Истражувањето на човечкиот кариотип траело многу години за да биде решено најосновното прашање: колку хромозоми содржи нормална диплоидна човечка клетка? Во 1912 година, Ханс фон Винивартер пријавил 47 хромозоми во сперматогонија и 48 во оогонија, заклучувајќи XX/XO механизам за определување на полот. Сликарот во 1922 година не бил сигурен дали диплоидниот број на луѓе е 46 или 48, најпрвин фаворизирајќи 46. Подоцна го ревидирал своето мислење од 46 на 48 и правилно инсистирал луѓето да имаат XX/XY систем на определување пол. Со оглед на нивните техники, овие резултати биле доста извонредни. Во научните книги, бројот на човечки хромозоми останал на 48 повеќе од триесет години. Биле потребни нови техники за да биде поправена оваа грешка. Џо Хин Тџио работела во лабораторијата на Алберт Леван бил одговорен за наоѓање на пристапот:
:# Користење на клетки во културата
:# Клетките пред-третман во хипотоничен раствор, кој ги отекува и ги шири хромозомите
:# Запирање на митоза во метафаза со раствор на колхицин
:# Стискање на препаратот на слајдот принудувајќи ги хромозомите во една рамнина
:# Сечење фотомикрограф и распоредување на резултатот во неоспорен кариограм.
Било потребно до 1956 година за да биде општо прифатено дека кариотипот на човекот вклучува само 46 хромозоми. Големите човеколики мајмуни имаат 48 хромозоми. Човечкиот хромозом 2 е создаден со спојување на хромозоми на предците, со што се намалува бројот.
2 Примени на цитогенетиката
2.1 Работата на Меклинток за пченката
Барбара Меклинток ја започнала својата кариера како цитогенетичар на пченка. Во 1931 година, Меклинток и Хариет Крејтон покажаа дека цитолошката рекомбинација на означените хромозоми е во корелација со рекомбинација на генетски особини (гени). Меклинток, додека била во Карнегиевиот институт, продолжила со претходните студии за механизмите на кршење на хромозомите и фузија на пченката. Таа идентификувала одреден настан на кршење на хромозомот што секогаш се случувал на истиот локус на 9-тиот хромозом на пченка, која го нарекла „дисоцијациски“ локус. Меклинток ја продолжила својата кариера во цитогенетиката проучувајќи ја механиката и наследувањето на скршените и прстенестите (кружни) хромозоми на пченката. За време на нејзината цитогенетска работа, Меклинток открила транспозони, откритие што на крајот доведе до нејзината Нобелова награда во 1983 година.
2.2 Природни населенија на Drosophila
Во 1930-тите, Добжански и неговите соработници ги собрале ''Drosophila pseudoobscura'' и ''D. persimilis'' од диви населенија во Калифорнија и соседните држави. Користејќи ја техниката на Painter. тие ги проучувале политенските хромозоми и откриле дека дивите населенија се полиморфни за хромозомски инверзии. Сите муви изгледаат слично без оглед на инверзии што ги носат: ова е пример за криптичен полиморфизам.
Брзо биле собрани докази за да биде покажано дека природната селекција е одговорна. Користејќи го методот измислен од Л'еритје и Тејсје, Добжански одгледувал животни во кафези, што овозможило хранење, размножување и земање примероци додека го спречувало бегството. Ова имало корист од елиминирање на преселувањето како можно објаснување на резултатите. Залихите што содржат инверзии со позната почетна честота може да се одржуваат во контролирани услови. Откриено е дека различните врсти на хромозоми не флуктуираат по случаен избор, како што би флуктуираат кога би биле селективно неутрални, туку се прилагодуваат на одредени честоти на кои тие се стабилизираат. До моментот кога Добжански го објавил третото издание на својата книга во 1951 година, тој бил убеден дека морфите на хромозомите се одржувани во населението поради селективната предност на хетерозиготите, како и кај повеќето полиморфизми.
2.3 Лилјана и глушец
Лилјаната е омилен организам за цитолошко испитување на мејозата бидејќи хромозомите се големи и секоја морфолошка фаза на мејозата може лесно да биде идентификувана микроскопски. Хота, Чендли и сор. ги претставиле докази за вообичаена шема на синтеза на пробивање и поправка на ДНК кај машките мејотски клетки на лилјаните и глодарите за време на зиготен-пахитенските фази на мејозата кога било претпоставувано дека се случува вкрстување. Присуството на заедничка шема помеѓу организмите толку филогенетски оддалечени како крин и глушец ги навело авторите да заклучат дека организацијата за мејотично вкрстување кај барем повисоките еукариоти е веројатно универзална по распространетост.
3 Човечки абнормалности и медицински примени
По појавата на процедури кои овозможуваа лесно набројување на хромозомите, брзо беа направени откритија поврзани со аберантните хромозоми или хромозомскиот број.
Конституционална цитогенетика: кај некои вродени нарушувања, како што е Даунов синдром, цитогенетиката ја открила природата на хромозомскиот дефект: „едноставна“ трисомија. Абнормалностите кои произлегуваат од недисјункционите настани може да предизвикаат клетки со анеуплоидија (додавања или бришења на цели хромозоми) кај еден од родителите или кај фетусот. Во 1959 година, Лежун открил дека пациентите со Даунов синдром имаат дополнителна копија од хромозомот 21. Даунов синдром е нарекуван и како трисомија 21.
Други откриени бројчани абнормалности се абнормалности на половите хромозоми. Жена со само еден Х хромозомот има Тарнеров синдром, додека мажот со дополнителен Х хромозом, што резултира со вкупно 47 хромозоми, има Клинефелтеров синдром. Многу други комбинации на полови хромозоми се компатибилни со живо раѓање, вклучувајќи XXX, XYY и XXXX. Способноста на цицачите да толерираат анеуплоиди во половите хромозоми произлегува од способноста да ги исклучат, што е потребно кај нормалните женки за да биде надокнадено поради тоа што имаат две копии од хромозомот. Не сите гени на X хромозомите се исклучени, поради што постои фенотипски ефект забележан кај единки со дополнителни Х хромозоми.
Трисомија 13 била поврзана со Патауовиот синдром и трисомија 18 со Едвардсовиот синдром.
Стекната цитогенетика: Во 1960 година, Питер Ноуел и Дејвид Хангерфорд откриле мал хромозом во белите крвни зрнца на пациенти со Хронична миелогидна леукемија. Овој абнормален хромозом бил наречен филаделфиски хромозом - додека и двајцата научници го правеле своето истражување во Филаделфија, Пенсилванија. Тринаесет години подоцна, со развојот на понапредни техники, Џенет Роули покажала дека абнормалниот хромозом е резултат на транслокација на хромозоми 9 и 22. Идентификацијата на филаделхискиот хромозом со цитогенетика е дијагностичка за хроничната миелогидна леукемија. Повеќе од 780 леукемии и стотици цврсти тумори (бели дробови, простата, бубрези итн.) сега се карактеризирани со стекната хромозомска абнормалност, чија прогностичка вредност е клучна. Идентификацијата на овие хромозомски абнормалности доведе до откривање на многу голем број „гени за рак“ (или онкогени). Зголеменото знаење за овие гени за рак сега овозможува развој на насочени терапии, кои ги преобразуваат изгледите за преживување на пациентот. Така, цитогенетиката имала и продолжува да има суштинска улога во напредокот на разбирањето на ракот. Големите бази на податоци (Атлас на генетиката и цитогенетиката во онкологијата и хематологијата, базата на податоци за рак на COSMIC, Мителмановата база на податоци за аберации на хромозомите и фузијата на гените кај ракот) им овозможуваат на истражувачите и лекарите да го имаат потребниот корпус за нивната работа во оваа област.
3.1 Доаѓањето на техниките на бендирање
Во доцните 1960-ти, Торбјерн Касперсон развил техника на квинакрино флуоресцентно боење која открила уникатни обрасци на ленти за секој пар на хромозом. Ова им овозможи на хромозомските парови со инаку еднаква големина да бидат разликувани со различни хоризонтални обрасци. Сега се користени обрасци за поврзување за да се разјаснат точките на прекин и составните хромозоми вклучени во хромозомските транслокации. Бришењето и инверзиите во поединечен хромозом, исто така, може да бидат идентификувани и попрецизно да бидат опишани со користење на стандардизирана номенклатура за ленти. Поврзувањето „G“ (користење трипсин и Гимзово/Рајтово боење) било истовремено развиена во раните 1970-ти и овозможува визуелизација на обрасците на ленти со помош на микроскоп со светло поле.
Дијаграмите што ги идентификуваат хромозомите врз основа на обрасците на ленти се познати како идиограми. Овие карти станале основа и за пренаталните и за онколошките полиња за брзо преместување на цитогенетиката во клиничката лабораторија каде кариотипизацијата им овозможи на научниците да бараат хромозомски промени. Техниките биле проширени за да биде овозможена култура на слободни амниоцити обновени од плодовата вода и техники на издолжување за сите врсти култури кои овозможуваат појаси со поголема резолуција.
3.2 Почетоци на молекуларната цитогенетика
Во 1980-тите, бил постигнат напредок во молекуларната цитогенетика. Додека сонди означени со радиоизотоп беа хибридизирани со ДНК од 1969 година, сега беше направено движење со користење на флуоресцентни означени сонди. Нивното хибридирање со хромозомски препарати со користење на постоечки техники стана познато како флуоресцентна „на лице место“ хибридизација. Оваа промена значително ја зголемила употребата на техники на сондирање бидејќи сондите означени со флуоресцентни се побезбедни. Понатамошните достигнувања во микроманипулацијата и испитувањето на хромозомите доведоа до техника на микродисекција на хромозомите при што аберациите во хромозомската структура можеле да бидат изолирани, клонирани и да бидат проучувани подетално.
4 Техники
4.1 Кариотипизација
Рутинската анализа на хромозомите (кариотипирање) се однесува на анализа на метафазните хромозоми кои се врзани со помош на трипсин проследено со Гимза, Лајшманс или мешавина од двете. Ова создава уникатни обрасци на ленти на хромозомите. Молекуларниот механизам и причината за овие обрасци се непознати, иако најверојатно се поврзани со времето на репликација и хроматинското пакување.
Во цитогенетските лаборатории се користени неколку техники за поврзување на хромозомите. Квинакринското подредување било првиот метод на боење што било користено за производство на специфични обрасци на подредување. Овој метод бара флуоресцентен микроскоп и веќе не е толку широко користен како Гимзовото подредување. Обратното подредување бара топлинска обработка и ја менува вообичаената црно-бела шема што се гледа во квинаринската и Гимзовата техника. Овој метод е особено корисен за боење на дисталните краеви на хромозомите. Други техники на боење се конститутативното хетерохроматинско подредување и нуклеоларните организациски региони. Овие последни методи конкретно обојуваат одредени делови од хромозомот. Конститутативното хетерохроматинско подредување го обојува конститутивниот хетерохроматин, кој обично лежи во близина на центромерот и боењето со нуклеоларните организациски региони ги истакнува сателитите и стебленцата на акроцентричните хромозоми.
Поврзувањето со висока резолуција вклучува боење на хромозомите за време на профазата или раната метафаза (прометафаза), пред да достигнат максимална кондензација. Бидејќи профазните и прометафазните хромозоми се попроширени од метафазните хромозоми, бројот на опсези што може да бидат набљудувани за сите хромозоми (редови по хаплоиден сет; „ниво на опсег“) се зголемува од околу 300 на 450 на дури 800. Ова овозможува откривање на помалку очигледни абнормалности кои обично не се гледани со конвенционалното подредување.
4.2.1 Подготовка на слајд
Клетките од коскената срцевина, крвта, амнионската течност, крвта од папочната врвца, туморот и ткивата (вклучувајќи кожа, папочна врвца, хорионски ресички, црн дроб и многу други органи) може да се култивираат со користење на стандардни техники на клеточна култура со цел да се зголеми нивниот број. Потоа во културата се додава митотичен инхибитор (колхицин, колцемид). Ова ја запира клеточната делба при митоза што овозможува зголемен принос на митотичните клетки за анализа. Клетките потоа се центрифугираат и медиумот и митотичниот инхибитор се отстранети и се заменуваат со хипотоничен раствор. Ова предизвикува отекување на белите крвни зрнца или фибробластите, така што хромозомите ќе се шират кога ќе се додадат на слајд, како и ќе ги лизираат црвените крвни зрнца. Откако ќе им се дозволи на клетките да седат во хипотоничен раствор, се додава фиксаторот на Карној (3:1 метанол до заледена оцетна киселина). Ова ги убива клетките и ги стврднува јадрата на преостанатите бели крвни зрнца. Клетките обично се фиксираат постојано за да се отстранат сите остатоци или преостанатите црвени крвни зрнца. Потоа, клеточната суспензија се испушта на слајдовите на примерокот. По стареење на лизгалките во рерна или чекање неколку дена тие се подготвени за ленти и анализа.
4.2.2 Анализа
Анализата на појасните хромозоми се прави на микроскоп од страна на клинички лабораториски специјалист по цитогенетика. Претежно се анализирани 20 клетки што е доволно за да биде исклучен мозаицизмот на прифатливо ниво. Резултатите се сумираани и се давани на цитогенетичар овластен од одборот за преглед и да напише толкување земајќи ја предвид претходната историја на пациентот и другите клинички наоди. Резултатите потоа се дадени, пријавени во ''Меѓународен систем за човечка цитогенетска номенклатура 2009 година'' (ISCN2009).
4.2 Флуоресцентна „на лице место“ хибридизација
Флуоресцентната „на лице место“ хибридизација се однесува на користење на флуоресцентно означена сонда за хибридирање со цитогенетски клеточни препарати.
Покрај стандардните препарати, Флуоресцентната „на лице место“ хибридизација може да биде изведувана и врз:
* брисеви од коскена срцевина
* крвни размаски
* ткивни препарати вградени во парафин
* ензимски дисоцирани ткивни примероци
* неодгледувана коскена срцевина
* неодгледувани амниоцити
* цитоспински препарати
4.2.1 Подготовка на слајд
Слајдот се старее со користење на солен раствор кој обично се состои од 2X SSC (сол, натриум цитрат). Слајдовите потоа се дехидрирани во етанол и се додава смесата од сондата. Примерокот од ДНК и другата ДНК од сондата потоа взаемно се денатурираат со помош на загреана плоча и се оставаат повторно да се анелираат најмалку 4 часа. Слајдовите потоа се миени за да биде отстранет вишокот на неврзаната сонда и се обоени со 4',6-Дијамидино-2-фенилиндол или пропидиум јодид.
4.2.2 Анализа
Анализата на примероците од флуоресцентната „на лице место“ хибридизација е вршена со флуоресцентна микроскопија од клинички лабораториски специјалист по цитогенетика. За онкологија, претежно, голем број интерфазни клетки се бодирани со цел да биде исклучено ниско ниво на резидуална болест, претежно се броени и бодирани помеѓу 200 и 1.000 клетки. За вродени проблеми обично 20 метафазни клетки се бодирани.
5 Иднината на цитогенетиката
Напредокот сега е насочен на молекуларната цитогенетика, вклучително и автоматизирани системи за броење на резултатите од стандардните препарати со флуоресцентната „на лице место“ хибридизација и техники за виртуелна кариотипизација, како што се споредбените геномски хибридизациски низи и полиморфистичките низи со единечни нуклеотиди.
6 Поврзано
* Цитотаксономија
* Кариотип
* Молекуларна цитогенетика
* Плоидност
* Виртуелен кариотип