Ozon u restaurativnoj stomatološkoj terapiji: antibakterijski efekat i uticaj na VEGF u zubnoj pulpi

Univerzitet u Istočnom Sarajevu, Medicinski fakultet Foča

<s>Ova doktorska teza je urađena na Medicinskom fakultetu Univerziteta u Istočnom Sarajevu, u saradnji sa Službom za medicinsku mikrobiologiju sa parazitologijom i virusologijom Univerzitetske bolnice u Foči, Institutom za stomatološku farmakologiju i Institutom za humanu genetiku Stomatološkog fakulteta Univerziteta u Beogradu.</s><s>Dio teze je urađen u sklopu projekta „Ozon u restaurativnoj i endodontskoj stomatološkoj terapiji: antibakterijski efekat i uticaj na VEGF u zubnoj pulpi“ finansiranog od strane Ministarstva nauke i tehnologije RS (broj: 19/06-020/961-174/12).</s>
<s>Zahvaljujem: mentoru, prof. dr Dragici Stojić, sa Instituta za stomatološku farmakologiju Stomatološkog fakulteta u Beogradu, koja me je upoznala sa naučnim svijetom i vodila sa velikom profesionalnošću kroz dodiplomske i poslijediplomske studije.</s><s>Hvala joj što me je, više od deceniju, strpljivo usmjeravala, prijateljski pomagala, nesebično dijelila svoje ogromno znanje i iskustvo, učila da sagledavam kompleksnije i sveobuhvatnije i uvijek bila dostupna i kao učitelj i kao prijatelj; komentoru, prof. dr Slavoljubu Živkoviću, sa Klinike za bolesti zuba Stomatološkog fakulteta u Beogradu, za veliko razumijevanje, svesrdnu podršku u svim fazama rada i sugestijama koje su oblikovale doc. dr Nikoli Stojanoviću, koji mi je prenio nepocjenjivo praktično i stručno znanje neophodno za izradu ovog doktorskog rada, na posvećenosti i stalnom podsticaju; doc. dr Jeleni Roganović i asist. dr Ljiljani Đukić, sa Instituta za stomatološku farmakologiju Stomatološkog fakulteta u Beogradu, koje su me upoznale sa ELISA imunoesejskim protokolom, uradile sve potrebne analize, kao i one koje prevazilaze okvire ovog doktorata, a posebno na njihovoj predanosti i nesebičnoj podršci;</s>
<s>Zahvaljujem: doc. dr Branki Popović, sa Instituta za humanu genetiku Stomatološkog fakulteta u Beogradu, za susretljivost, podršku i nesebičnu pomoć u organizaciji i realizaciji molekularnih analiza i dragocjenim smjernicama za interpretaciju rezultata; doc. dr Ladu Davidoviću, za svesrdnu podršku i angažovanje tokom cijelog istraživanja; prof. dr Slobodanki Đukić, sa Instituta za mikrobiologiju i imunologiju Medicinskog fakulteta u Beogradu, na konstruktivnim savjetima i smjernicama za definisanje eksperimentalnog protokola za mikrobiološku analizu i tumačenju rezultata; prim. dr Radi Mrgud i dr Ružici Lukić, kao i svom osoblju Službe za medicinsku mikrobiologiju sa parazitologijom i viruslogijom Univerzitetske bolnice u Foči, koji su otvorili vrata svoje laboratorije za mikrobiološku analizu i učinili da se osjećam dijelom njihovog tima; dr sc. Ivani Simić, na pomoći pri prikupljanju uzoraka i cjelokupnom angažovanju oko dijela kliničkog istraživanja;</s>
<s>Zahvaljujem: stomatološkim sestrama pri Katedri za bolesti zuba i endodonciju i Katedri za oralnu rehabilitaciju, kao i Službi za biohemiju i hematologiju Univerzitetske bolnice u Foči za tehničku podršku; kolegama sa Katedre za bolesti zuba i endodonciju, a posebno v. asist. dr Brankici Davidović, na podršci, pomoći, razumijevanju i smijehu; prijateljima, jer su uvijek tu.</s>
<s>Uvod.</s><s>Ozon ima široku primjenu u medicini, a posljednjih godina se primjenjuje u stomatologiji zbog izraženog antimikrobnog djelovanja bez pojave antimikrobne rezistencije.</s><s>Manji broj kliničkih studija ukazuje na mogućnost primjene ozona u terapiji karijesnih lezija i za dezinfekciju kaviteta.</s><s>Za odontoantiseptike je od značaja njihov farmakodinamski efekat kao i njihov bezbjednosni profil.</s><s>Najveći broj do sada objavljenih radova o antibakterijskoj efikasnosti ozona na kariogene bakterije odnosi se na rezultate in vitro studija, a mali broj radova na ispitivanje biokompatibilnosti ozona na zubnu pulpu in vivo.</s><s>Cilj.</s><s>Cilj ove teze je bio da se ispita antibakterijski efekat primjene ozona na ukupan broj bakterija, Lactobacillus spp. i pojedine vrste Lactobacillus spp. poslije nepotpunog uklanjanja karijesa, kao i da se odredi koncentracija vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGF) i superoksid dismutaze (SOD) u zubnoj pulpi zdravih zuba poslije primjene ozona.</s><s>Materijal i metode.</s><s>Studija I je uključila ukupno 48 zdravih osoba oba pola, starosti od 19-48 godina, kod kojih je dijagnostikovana najmanje jedna duboka karijesna lezija (>1/2 debljine dentina) na okluzalnoj ili okluzalnoj i aproksimalnoj površini bočnog zuba.</s><s>Ispitanici su u zavisnosti od primjenjenog antiseptika za dezinfekciju kaviteta podijeljeni u dvije grupe: eksperimentalna, u kojoj je korišćen ozon u obliku gasa, i komparativna grupa, gdje je primjenjen 2% hlorheksidin.</s><s>Uzorci dentina su uzeti iz karijesnih kaviteta poslije nepotpunog uklanjanja karijesa i poslije primjene antiseptika i analizirani su kultivisanjem, lančanom reakcijom polimeraze (PCR) i „real-time“ PCR (qPCR).</s><s>Studijom II su obuhvaćene 38 zdrave osobe oba pola, starosti 18-40, kod kojih je indikovana ekstrakcija intaktnih i klinički zdravih donjih molara.</s><s>Poslije preparacije kaviteta na okluzalnoj površini zuba u eksperimentalnoj grupi je primjenjen ozon u obliku gasa, dok u kontrolnoj grupi kaviteti nisu tretirani (fiziološki rastvor).</s><s>U zubnim pulpama određen je nivo VEGF imunoesejskom tehnikom (ELISA) i nivo SOD spektrofotometrijskom metodom.</s><s>Rezultati.</s><s>Studija I. Jednokratna primjena ozona i hlorheksidina u preparisani kavitet je dovela do značajnog smanjenja ukupnog broja aerobnih i anaerobnih bakterija, Streptococcus spp., Lactobacillus spp., ali ne i pojednih vrsta Lactobacillus spp., nezavisno od metode identifikacije bakterija.</s><s>Komparativna analiza antibakterijskog efekta ozona i hlorheksidina ispitivana metodom kultivisanja je pokazala da je ozon izazvao značajno smanjenje broja Lactobacillus spp. (p=0,041), a hlorheksidin značajno smanjenje broja Streptococcus spp. (p=0,041).</s><s>Primjenom PCR i qPCR metode nije zabilježena razlika u efikasnosti ozona i hlorheksidina na kariogene bakterije.</s><s>Studija II.</s><s>Koncentracija VEGF u grupi tretiranoj ozonom je bila značajno veća (p<0,0001), a nivo SOD značajno manji (p=0,002) u odnosu na vrijednosti dobijene za pulpe kontrolnih zuba.</s><s>Zaključci.</s><s>Komparativna analiza rezultata o antibakterijskoj efikasnosti jednokratno primjenjenog ozona i 2% hlorheksidina u ispreparisani kavitet zuba pokazuje da su oba antiseptika podjednako efikasna.</s><s>Poslije jednokratne primjene ozona kao antiseptika u kavitet zuba povećava se nivo VEGF, koji ne predstavlja patološko povećanje, i aktivira se antioksidativni sistem u tkivu pulpe, što ukazuje na njegovu biokompatibilnost sa zubnom pulpom.</s>
<s>Introduction.</s><s>Ozone is widely used in medicine, and recently it is used in dentistry due to its strong antimicrobial activity without antimicrobial resistance.</s><s>A small number of clinical studies evaluated the effect of ozone in therapy of dental caries and for cavity disinfection.</s><s>For dental antiseptics use, both their pharmacodynamic effects and safety profile are of the importance.</s><s>Most of published works considering the antibacterial effect of ozone on cariogenic bacteria has been conducted in vitro, and a small number of studies investigated biocompatibility of ozone on dental pulp in vivo.</s><s>Aim.</s><s>The aim of this thesis was to investigate the effect of ozone on total bacteria, Lactobacillus spp., and different Lactobacillus spp. strains after incomplete caries removal, as well as to determine the concentration of vascular endothelial growth factor (VEGF) and superoxide dismutase (SOD) in the dental pulp of healthy teeth after ozone application.</s><s>Material and methods.</s><s>Study I included 48 healthy subjects of both gender, aged 19-48 years, with at least one tooth with diagnosed deep caries (> 1/2 of the thickness of dentin) on occlusal or occlusal and interproximal tooth surface.</s><s>Subjects were divided into two groups according to the cavity disinfectant used: the experimental group, where ozone gas was used, and the comparative group, where 2% chlorhexidine was used.</s><s>Dentine samples were taken from the cavity after partial caries removal and after application of antiseptic, and analyzed using cultivation, polymerase chain reaction (PCR) and "real-time" PCR (qPCR) methods.</s><s>Study II included 38 healthy subjects of both gender, aged 18-40 years, in which the extraction of sound mandibular molars were indicated.</s><s>After cavity preparation on the occlusal surface of the tooth ozone gas was applied in the experimental group, while saline was applied in the control group.</s><s>The levels of VEGF and SOD in dental pulp were determined by immunoassay technique (ELISA) and by spectrophotometric method, respectively.</s><s>Results.</s><s>Study I. Single application of ozone and chlorhexidine into the cavity resulted in a significant decrease of the total number of aerobic and anaerobic bacteria, Streptococcus spp., and Lactobacillus spp., but not of the Lactobacillus spp. strains, irrespective of the method for bacteria enumeration.</s><s>Comparative analysis of antibacterial effect of ozone and chlorhexidine using cultivation revealed that the number of Lactobacillus spp. was significantly lower in the ozone group while the number of Streptococcus spp. was significantly lower after chlorhexidine treatment (p=0.041).</s><s>By using PCR and qPCR methods, no difference in the effectiveness of ozone and chlorhexidine on cariogenic bacteria was noted.</s><s>Study II.</s><s>In the group treated with ozone the concentration of VEGF was significantly higher (p<0.0001), and the level of SOD was significantly lower (p=0.002) compared to the values obtained for the control pulps.</s><s>Conclusions.</s><s>Comparative analysis of the antibacterial efficiency of once applied ozone and 2% chlorhexidine in tooth cavities indicates that both antiseptics are equally effective.</s><s>After single application of ozone in tooth cavity the level of VEGF in dental pulp increases, which does not present pathological increase, and the antioxidant system activates, which indicates its biocompatibility with dental pulp.</s>
<s>4.2.2.</s><s>Studija II: biokompatibilnost ozona u odnosu na zubnu pulpu.</s><s>4.4.1.</s><s>Određivanje ukupnog broja bakterija, Lactobacillus spp. i Streptococcus spp. metodom kultivisanja</s>
<s>4.4.3.</s><s>Određivanje ukupnog broja anaerobnih bakterija i Lactobacillus spp. „real-time“ lančanom 4.4.4.</s><s>Određivanje učestalosti vrste Lactobacillus casei/paracasei lančanom reakcijom polimeraze 4.6.</s><s>STATISTIČKA OBRADA PODATAKA</s>
<s>5.2.1.</s><s>Efekti ozona i hlorheksidina na ukupan broj bakterija ispitivani metodom kultivisanja ..............</s><s>5.2.1.1.</s><s>Broj kaviteta sa aerobnim bakterijama 5.2.1.3.</s><s>Broj kaviteta sa anaerobnim bakterijama 5.2.2.</s><s>Efekti ozona i hlorheksidina na Lactobacillus spp. ispitivani metodom kultivisanja i biohemijskom 5.2.2.3.</s><s>Učestalost pojedinih vrsta Lactobacillus spp.</s><s>5.2.3.1.</s><s>Broj kaviteta sa Streptococcus spp.</s><s>5.2.4.</s><s>Korelacija kliničkih karakteristika lezije i prosječnog broja bakterija u cjelokupnom uzorku 5.2.5.</s><s>Komparativna analiza antibakterijskog efekta ozona i hlorheksidina ispitivanog metodom 5.2.5.1.</s><s>Poređenje broja kaviteta pozitivnih na aerobne bakterije, anaerobne bakterije, Lactobacillus 5.2.5.2.</s><s>Poređenje prosječnog broja aerobnih bakterija, anaerobnih bakterije, Lactobacillus spp. i Streptococcus spp. prije primjene antiseptika 5.2.5.3.</s><s>Poređenje broja kaviteta pozitivnih na različite vrste Lactobacillus spp. prije primjene 5.2.5.4.</s><s>Poređenje broja kaviteta pozitivnih na aerobne bakterije, anaerobne bakterije, Lactobacillus 5.2.5.5.</s><s>Poređenje prosječnog broja aerobnih bakterija, anaerobnih bakterija, Lactobacillus spp. i 5.2.5.6.</s><s>Poređenje broja kaviteta pozitivnih na različite vrste Lactobacillus spp. poslije primjene 5.2.6.1.</s><s>Broj kaviteta sa anaerobnim bakterijama 5.2.7.</s><s>Efekti ozona i hlorheksidina na ukupan broj Lactobacillus spp. ispitivani metodom qPCR ..........</s><s>5.2.8.</s><s>Efekti ozona i hlorheksidina na prisustvo vrste L. casei/paracasei ispitivani metodom PCR .......</s><s>5.2.9.</s><s>Komparativna analiza antibakterijskog efekta ozona i hlorheksidina ispitivanog metodom qPCR53 5.2.9.1.</s><s>Poređenje broja kaviteta pozitivnih na anaerobne bakterije i Lactobacillus spp. prije primjene 5.2.9.2.</s><s>Poređenje prosječnog broja anaerobnih bakterija i Lactobacillus spp. prije primjene 5.2.9.3.</s><s>Poređenje broja kaviteta pozitivnih na anaerobne bakterije i Lactobacillus spp. poslije primjene antiseptika</s>
<s>5.2.9.4.</s><s>Poređenje prosječnog broja anaerobnih bakterija i Lactobacillus spp. poslije primjene 5.2.10.</s><s>Komparativna analiza antibakterijskog efekta ozona i hlorheksidina na vrstu L. casei/paracasei 5.2.10.1.</s><s>Poređenje broja kaviteta pozitivnih na L. casei/paracasei prije i poslije primjene antiseptika 5.3.</s><s>KARAKTERISTIKE ISPITANIKA I UZORKA</s>
<s>1.1.</s><s>KARIJES ZUBA I HIPOTEZE O NJEGOVOM NASTANKU Karijes predstavlja jedno od najčešćih hroničnih oralnih oboljenja modernog doba koje se i pored široke primjene profilaktičke terapije javlja kod školske djece sa učestalošću od 30-90%, a kod odraslih do 100% (Bratthall, 2005; Petersen i sar., 2005).</s><s>Na pojavu karijesa utiču brojni faktori kao što su ishrana, oralnohigijenske navike i primjena fluorida.</s><s>Socio-ekonomski status i genetska predispozicija su takođe od značaja u etiologiji karijesa.</s><s>Karijes zuba nastaje kao posljedica interakcije bakterija iz dentalnog plaka, ugljenih hidrata i brojnih faktora domaćina u funkciji vremena (Selwitz i sar., 2007).</s><s>Dentalni plak predstavlja mekanu nemineralizovanu naslagu koja se sastoji od mikroorganizama, adhezivnih glikoproteina i vanćelijskog mikrobnog polimernog matriksa.</s><s>Početna karijesna lezija na površini gleđi se vidi kao kredasto zamućenje-„bijela mrlja“.</s><s>Ukoliko se ne liječi, lezija napreduje dublje u dentin, uzrokuje gubitak zubne supstance i pojavu kaviteta, a na kraju i infekciju okolnih struktura.</s><s>Postoji nekoliko različitih hipoteza o nastanku karijesa, koje su se razvijale uporedo sa istraživanjima o sastavu i organizaciji dentalnog plaka.</s><s>Jedna o prvih hipoteza je bila „hipoteza o specifičnom plaku“ prema kojoj karijes nastaje kao posljedica djelovanja specifičnih bakterija iz dentalnog plaka (Loesche, 1976), u prvom redu mutans streptococci i Lactobacillus spp..</s><s>Međutim, uočeno je da do razvoja karijesa može doći i bez prisustva mutans streptococci, kao i da njihovo prisustvo nije uvijek povezano sa procesima demineralizacije (Marsh i sar., 1989).</s><s>Ovi nalazi su doveli do razvoja „hipoteze o nespecifičnom plaku“ prema kojoj oboljenje nastaje kao posljedica interakcije svih bakterija dentalnog plaka (Theilade, 1986).</s><s>Iako je karijes posmatran kao nespecifično oboljenje, uočeno je da se određene vrste bakterija češće izoluju sa oboljelih mjesta i da se razlikuju od onih koje se nalaze na zdravim površinama zuba.</s><s>To je dovelo do razvoja „hipoteze o ekološkom plaku“ (Marsh, 2003; Takahashi i Nyvad, 2011).</s><s>Prema ovoj hipotezi u dentalnom plaku, kao dinamičkom ekosistemu, ne-mutansne bakterije imaju glavnu ulogu u održavanju homeostaze (stadijum dinamičke stabilnosti).</s><s>Promjene u spoljašnoj sredini (smanjeno lučenje pljuvačke ili povećan unos ugljenih hidrata) dovode do povećane produkcije kiselina i povećanja broja acidogenih bakterija kao i bakterija koje tolerišu niske vrijednosti pH.</s><s>Ovaj poremećaj destabilizuje bakterijsku homeostazu i balans procesa remineralizacije-demineralizacije što za posljedicu ima gubitak mineralnih materija (acidogeni stadijum).</s><s>Kada se uspostavi acidogena sredina, raste broj mutans grupe Streptococcus spp. i drugih bakterija koje podnose kiselu sredinu i tako dovode do nastanka lezije (stadijum acidogene tolerancije).</s><s>Skorija istraživanja Simón-Soro i sar. (2013) i Simón-Soro i Mira (2015) ukazuju i na „tkivno-zavisnu hipotezu“ u nastanku karijesa.</s><s>Ovom hipotezom uočava se razlika u vrsti bakterija prouzrokovača karijesa u zavisnosti od toga da li je u pitanju karijes dentina ili karijes gleđi.</s><s>U odnosu na gleđ, dentin predstavlja drugačiju ekološku sredinu za kariogene bakterije jer sadrži više organskih materija i manje mineralnih materija; hidroksiapatit dentina je siromašniji kalcijumom a bogatiji karbonatima, a razgradnja dentina se odvija pri višim vrijednostima pH (Vanuspong i sar., 2002; Berkovitz i UVOD</s>
<s>Simón-Soro i Mira, 2015) sar., 2009).</s><s>Karijesne lezije u gleđi karakteriše prisustvo acidogenih bakterija koje adheriraju na zubna tkiva i koje fermentišu ugljene hidrate.</s><s>Sa druge strane u dentinskim lezijama se u većem broju nalaze proteolitičke, anaerobne bakterije koje su zavisne od osmotskog pritiska (Simón-Soro i sar.</s><s>,2013; Simón1.2. MIKROORGANIZMI PROUZROKOVAČI KARIJESA Centralna uloga za nastanak karijesa se pripisuje mutans streptococci i Lactobacillus spp..</s><s>Smatra se da mutans streptococci (Streptococcus mutans i Streptococcus sobrinus) iniciraju karijesni proces na površini krunice i/ili korijena.</s><s>Dokazi za ovo su radovi u kojima je pokazano da se ove bakterije često izoluju iz karijesnih kaviteta, uzrokuju karijes u eksperimentalnim uslovima, stvaraju kiseline, dobro podnose kiselu sredinu i imaju sposobnost stvaranja površinskih antigena I/II i u vodi nerastvorljivog glukana, koji olakšavaju njihovu adheziju za zubna tkiva i druge bakterije (Hamada i Slade, 1980).</s><s>Takođe, mogu da prežive i u nedostatku egzogenih ugljenih hidrata jer deponuju intracelularne polisaharide (Takahashi i sar., 1991).</s><s>U slučajevima kada se izoluju iz dubokih karijesnih lezija mutans streptococci nisu uvijek najbrojnije vrste na ovom nivou karijesne lezije, što ukazuje na značaj drugih acidogenih bakterija ovog roda u razvoju i progresiji oboljenja (Lima i sar., 2011; Simón-Soro i sar., 2013).</s><s>Zanimljivo je istaći da kod 10-20% osoba sa aktivnim karijesom nisu izolovane Streptococcus spp. iz mutans grupe (Beighton, 2005; Aas i sar., 2008).</s><s>Lactobacillus spp. su najčešće bakterije koje se izoluju iz dubokih karijesnih lezija dentina što ukazuje na njihov veliki značaj za progresiju karijesnog procesa, ali ne i za nastanak karijesa (Aas i sar., 2008; Simón-Soro i sar., 2013; Obata i sar., 2014; Simón-Soro i Mira, 2015).</s><s>Ove bakterije stvaraju kiseline i podnose izrazito kiselu sredinu.</s><s>Na činjenicu da Lactobacillus spp. nema značaj u nastanku karijesa ukazuju nalazi o maloj količini ovih bakterija u dentalnom plaku (Aas i sar., 2008; Simón-Soro i sar., 2013;</s>
<s>U posljednih dvadeset pet godina, zahvaljujući uvođenju metoda molekularne biologije, kao što je lančana reakcija polimeraze (PCR), za izolaciju i identifikaciju bakterija, utvrđeno je da mnogo veći broj bakterija, za koje se do tada nije znalo, različito učestvuje u dinamici karijesnog procesa: zdrava gleđi, početna karijesna lezija u gleđi, karijes dentina i duboka karijesna lezija u dentinu.</s><s>Supragingivalni dentalni plak zdravih zuba naseljavaju bakterije Actinomyces spp. i Streptococcus spp. iz mitis grupe (Streptococcus sanguinis, Streptococcus oralis i Streptococcus mitis) (Li i sar., 2004).</s><s>Sastav dentalnog plaka na zdravim površinama zuba karakteriše prisustvo i drugih, uglavnom Gram pozitivnih bakterija.</s><s>Tako su Aas i sar. (2008) u opsežnoj molekularnoj studiji izolovali Kingella oralis, Eubacterium saburreum cl.</s><s>GT038, Gemella morbilorum, Streptococcus cristatus, Streptococcus intermedius, Streptococcus sp. cl.</s><s>CH016, Streptococcus sp. grupa H6, Leptotrichia sp. cl.</s><s>DT031, Eubacterium sp. cl.</s><s>EI074, Campylobacter showae, Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum i Capnocytophaga sputigena u većem broju sa površine intaktne gleđi stalnih zuba.</s><s>Interesantno je spomenuti da su isti autori uočili razliku u bakterijskom profilu plaka koji prekriva intaktnu gleđ stalnih zuba kod osoba bez UVOD</s>
<s>Simón-Soro i Mira, 2015) karijesa i restauracija u poređenju sa intaktnom gleđi osoba sa prisutnim karijesnim lezijama (Aas i sar., 2008).</s><s>Gross i sar. (2010) povezuju bakterije S. mitis- Streptococcus pneumoniae- Streptococcus infantis, Corynebacterium matruchotii, Streptococcus gordonii, S. cristatus, Capnocytophaga gingivalis, Eubacterium IR009, Campylobacter rectus i Lachnospiraceae sp.</s><s>C1 sa zdravljem zuba.</s><s>Sa površine zdrave gleđi kod osoba bez karijesnih lezija su kao najčešće izolovane S. sanguinis, Treponema spp., Capnocytophaga sputigena, Anginosus grupa 3, Fusobacteria spp.</s><s>4, S. gordonii, Fusobacteria spp.</s><s>1, Gemella morbillorum i S. mitis u istraživanju Wolff i sar. (2013), odnosno Streptococcus spp., Neisseiria spp., Corynebacterium spp., Rothia spp., Haemophilus spp. i Veillonella spp. u istraživanju Kianoush i sar.</s><s>Početnu karijesnu leziju u gleđi karakteriše prisustvo Veillonella spp., Actinomyces sp. cl.</s><s>GU067, S. sanguinis, Leptotrichia sp. cl.</s><s>GT018, Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum, Eubacterium sp. cl.</s><s>EI074, Fusobacterium animalis, Leptotrichia spp., Selenomonas sp. cl.</s><s>EY047 i S. mitis (Aas i sar., 2008).</s><s>Streptococcus spp., Rothia spp., Leptotrichia spp. i Veillonella spp. su najčešće izolovane bakterije iz karijesnih lezija u gleđi u studiji Simón-Soro i sar. (2014).</s><s>Karijesnu lezija u dentinu karakteriše prisustvo 6-37 različitih vrsta bakterija, uglavnom anaerobnih Gram pozitivnih koka i štapićastih bakterija i Gram negativnih štapićastih bakterija (Martin i sar., 2002; Chhour i sar., 2005; Aas i sar., 2008; Lima i sar., 2011) i u odnosu na zdravu gleđ i početnu karijesnu leziju u gleđi, bakterijska raznolikost u dentinu je manja (Aas i sar., 2008; Gross i sar., 2010; Wolff i sar., 2013).</s><s>U dentinskim lezijama se najčešće izoluju Lactobacillus spp., Shlegelella spp., Pseudoramibacter spp., i Atopobium spp. (Simón-Soro i sar., 2014).</s><s>Kianoush i sar. (2014) nalaze da su najzastupljenije bakterije u karijesnim kavitetima Lactobacillus spp., Atopobium spp., Olsenella spp., Propionibacterium spp., Bifidobacterium spp., Dialister spp., Sphingomonas spp. i Parascardovia spp..</s><s>Istraživanje Obata i sar. (2014) je pokazalo prisustvo Lactobacillus spp., Propionibacterium spp., Atopobium spp., Streptococcus spp., Prevotella spp., Olsenella spp., Actinomyces spp., Veillonella spp., Pseudoramibacter spp., Mitsuokella spp. i Scardovia spp. u karijesnim lezijama u dentinu.</s><s>Schulze-Schweifing i sar. (2014) su u dentinskim karijesnim lezijama izolovali rodove bakterija Prevotella, Lactobacillus, Selenomonas i Streptococcus kao najbrojnije.</s><s>Isti autori nalaze da su najbrojnije vrste bakterija u uzrocima karijesnog dentina Lactobacillus gasseri, Prevotella denticola, Alloprevotella tannerae, S. mutans i Streptococcus sp.</s><s>Zanimljivo je istaći da su pojedini autori analizirali različite nivoe dentinske karijesne lezije primjenom molekularnih tehnika.</s><s>Tako, Aas i sar. (2008) nalaze u karijesnim lezijama dentina Streptococcus parasanguinis, Streptococcus salivarius, Leptotrichia sp. cl.</s><s>GT018, Campylobacter gracilis i Selemonas sp. cl.</s><s>EY04 kao najčešće bakterijske vrste, dok u dubokim karijesnim lezijama dentina S. mutans, Lactobacillus spp., Propionibacterium sp.</s><s>FMA5 i Atopobium genomospecies C1 kao dominantne bakterije (Aas i sar., 2008).</s><s>Munson i sar. (2004) su analizirali uzorke središnjeg i najdubljeg sloja duboke karijesne lezije dentina i izolovali različite vrste, ali S. mutans, Rothia dentocariosa i Propionibacterium acidifaciens kao najčešće u oba ispitivana sloja.</s><s>Lima i sar. (2011) su analizirali tri sloja duboke karijesne lezije dentina: površinski, središnji i duboki.</s><s>Autori su uočili da su najbrojnije bakterije u površinskom sloju lezije Atopobium genomospecies C1, Streptococcus spp., Fusobacterium nucleatum i Veillonella spp..</s><s>U UVOD</s>
<s>Simón-Soro i Mira, 2015) središnjem sloju najbrojnije su bile Atopobium C1, F. nucleatum, Veillonella spp., Lactobacillus fermentum i Lactobacillus casei, dok su najdubljim slojevima karijesne lezije dentina najbrojnije bile Atopobium C1, F. nucleatum, S. mutans, Streptococcus spp. i Veillonella spp.</s><s>Međutim, ni u jednoj od studija nije zabilježena značajna razlika u učestalosti različitih vrsta bakterija u odnosu na ispitivani sloj duboke karijesne lezije, osim za učestalost vrste Olsenella uli u studiji Lima i sar. (2011).</s><s>1.3.</s><s>PRINCIPI TERAPIJE DUBOKOG KARIJESA</s>
<s>Duboka karijesna lezija predstavlja leziju koja je zahvatila veći dio dentina i gdje tanak sloj razmekšanog dentina razdvaja karijesnu leziju i zubnu pulpu.</s><s>Terapija dubokog karijesa ima za cilj zaustavljanje karijesnog procesa, očuvanje vitaliteta pulpe i stimulisanje procesa remineralizacije i dentinogeneze.</s><s>Metode indirektnog i direktnog prekrivanja pulpe se koriste u terapiji dubokih karijesnih lezija Postoje dva pristupa indirektnog liječenja dubokog karijesa: jednoseansni i dvoseansni.</s><s>Kod jednoseansne terapije poslije djelimičnog uklanjanja karijesa kavitet se adherento zatvara definitivnim ispunom u prvoj i jedinoj posjeti.</s><s>Količina karijesnog tkiva koja se uklanja varira.</s><s>Naime, u nekim istraživanjima kavitet se defintivno restauriše poslije uklanjanja samo podminirane gleđi bez uklanjanja karijesnog dentina (MertzFairhurst i sar., 1998; Phonghanyudh i sar., 2012), a u drugim poslije uklanjanja gleđi i dijela karijesnog dentina, ostavljajući vlažne i mekane karijesne mase na dnu kaviteta (Lula i sar., 2009).</s><s>U najvećem broju slučajeva, karijesno tkivo se uklanja u tom obimu da na dnu kaviteta ostane tanak sloj oboljelog tkiva „kožaste“ konzistencije (Casagrande i sar., 2010; Gruythuysen i sar., 2010; Franzon i sar., 2014).</s><s>Dno kaviteta se zatim prekriva zaštitnom podlogom na bazi kalcijum hidroksida koja ispoljava antibakterijski efekat, stimuliše dentinogenezu i remineralizaciju demineralizovanog dentina i kavitet se trajno restauriše.</s><s>Dvoseansnu terapiju duboke karijesne lezije karakteriše uklanjanje najvećeg dijela karijesom izmijenjenog tkiva, i postavljanje zaštitne podloge prije privremenog zatvaranja kaviteta.</s><s>U drugoj posjeti, poslije određenog perioda, uklanja se karijesno tkivo u cjelosti, dno kaviteta se prekriva zaštitnom podlogom (kalcijum hidoksid) i kavitet se trajno restauriše.</s><s>Brojna klinička, mikrobiološka, radiografska i laboratorijska ispitivanja su pokazala da karijesni dentin koji ostaje u kavitetu poslije zatvaranja prelazi u inaktivnu formu, na šta ukazuju klinički nalazi karijesnog dentina koji postaje tvrđi, suvlji i tamnije boje, sa smanjenim brojem bakterija i povećanom radiografskom gustinom (Lula i sar., 2009; Bjørndal i sar., 2010; Lula i sar., 2011; Maltz i sar., 2012b).</s><s>Sa druge strane, smanjenje broja bakterija i zaustavljanje karijesnog procesa poslije nepotpunog uklanjanja karijesa i restauracije zuba nije zabilježeno u istraživanjima Weerheijm i sar. (1992) i Wicht i sar. (2004).</s><s>Kada su poredili uspjeh liječenja dubokog karijesa u jednoj ili dvije posjete Orhan i sar. (2008) su našli da je poslije 12 mjeseci uspjeh liječenja približno isti (100% vs.</s><s>98%).</s><s>Sa druge strane uspješan ishod liječenja dubokog karijesa u dvije posjete u trogodišnjem opservacionom periodu je bio znatno manji u odnosu na jednoseansnu terapiju u istraživanju Maltz i sar. (2012a)(91% vs.</s><s>61%).</s><s>Manji uspjeh liječenja autori povezuju sa većim rizikom od eksponiranja pulpe tokom uklanjanja karijesa u drugoj posjeti (Maltz i sar., 2012a; Maltz i sar., 2013).</s><s>Neki autori ukazuju da UVOD</s>
<s>Simón-Soro i Mira, 2015) su prednosti jednoseansne terapije u odnosu na dvoseansnu terapiju i ekonomska strana (Schwendicke i sar., 2013c) i manja neprijatnost samog postupka, jer se liječenje završava u istoj posjeti.</s><s>Direktno prekrivanje pulpe je terapijska procedura koje se sprovodi u onim slučajevima kada je uklanjanje karijesa dovelo do eksponiranja pulpne komore.</s><s>Otvaranje pulpne komore se obično dešava kao posljedica uklanjanja karijesnih masa u cjelosti prije postavljanja definitivnog ispuna.</s><s>Naime, istraživanja pokazuju da je kompletna ekskavacija karijesnog tkiva u jednoj posjeti u terapiji dubokog karijesa povezana sa većim rizikom za otvaranjem pulpne komore i pojavom postoperativnih simptoma u poređenju sa indirektnim jednoseansnim ili dvoseansnim prekrivanjem (Bjørndal i sar., 2010; Schwendicke i sar., 2013a; Schwendicke i sar., 2013b; Ricketts i sar., 2013; Franzon i sar., 2014).</s><s>Uspješan ishod direktnog prekrivanja je mali u onim slučajevima kada je pulpa eksponirana prilikom uklanjanja karijesa (Al-Zayer i sar., 2003; Bjørndal i sar., 2010).</s><s>Ovi nalazi kao i rezultati preglednih studija i meta analiza pokazuju da indirektna terapija dubokog karijesa ima kliničku prednost u poređenju sa kompletnom ekskavacijom karijesnog dentina (Ricketts i sar., 2006; Hayashi i sar., 2011; Schwendicke i sar., 2013a; Schwendicke i sar., 2013b; Ricketts i sar., 2013).</s><s>Poznato je da se kompletnom ekskavacijom karijesnog tkiva ne uklanjaju sve bakterije iz kaviteta (Maltz i sar., 2012b).</s><s>Problem perzistencije bakterija još je veći kod manje invazivnih terapijskih procedura, koje imaju za cilj maksimalno čuvanje zubne supstance (Maltz i sar., 2002; Maltz i sar., 2012b).</s><s>Bakterije koje ostaju poslije ekskavacije karijesa i restauracije kaviteta mogu da perzistiraju i proliferišu i godinu dana poslije postavljanja ispuna i dovedu do sekundarnog karijesa i oštećenja pulpe (Gu i sar., 2010).</s><s>Važno je istaći da ni jedan od dostupnih restaurativnih materijala ne obezbjeđuje adekvatno zaptivanje kaviteta u dužem vremenskom periodu.</s><s>Uzimajući ove činjenice u obzir, preporučena je primjena antibakterijskih supstanci poslije završene preparacije kaviteta a prije postavljanja zaštitnih podloga i definitivnog ispuna 1.4.</s><s>EFIKASNOST ODONTOANTISEPTIKA U RESTAURATIVNOJ TERAPIJI Idealan odontoantiseptik u restaurativnoj terapiji bi trebao da, poslije primjene u kavitetu, eliminiše preostale bakterije, spriječi nastanak sekundarnog karijesa i inflamacije pulpe i da smanji postoperativnu osjetljivost zuba bez štetnih uticaja na pulpo-dentinski kompleks i kvalitet adhezije restaurativnih materijala za zubna tkiva.</s>
<s>Odontoantiseptici koji se koriste u restaurativnoj terapiji su hlorheksidin, etilendiaminotetraacetatna kiselina, natrijum hipohlorit i vodonik peroksid (Shafiei i Memarpour, 2012).</s><s>1.4.1.</s><s>Hlorheksidin</s>
<s>Hlorheksidin, hlorfenil bisgvanid, ispoljava širok spektar djelovanja na Gram pozitivne i na Gram negativne bakterije, gljivice, dermatofite i neke lipofilne viruse (Jones, 1997).</s><s>Hlorheksidin smanjuje ukupan broj kariogenih bakterija, kao i Streptococcus spp. i Lactobacillus spp. i Actinomyces naeslundii (Wicht i sar., UVOD</s>
<s>2004, Borges i sar., 2012; Kollmuss i sar., 2014).</s><s>Zbog izraženog efekta na bakterije, hlorheksidin u kavitetima smanjuje učestalost karijes recidiva i postoperativnu osjetljivost (Siso i sar., 2009).</s><s>Gram pozitivne bakterije, kao što su S. mutans i S. sorbinus, koje se povezuju sa nastankom karijesa, su osjetljivije na djelovanje hlorheksidina od Gram negativnih bakterija (Emilson, 1977).</s><s>Po nekim autorima osjetljivost Streptococcus spp. je izraženija u poređenju sa Lactobacillus spp. (van Lunsen i sar., 2000; Botelho, 2000; Ersin i sar., 2006), dok pojedini nalaze da je hlorheksidin podjednako efikasan protiv oba roda bakterija (Borges i sar., 2012).</s><s>Istraživanja pokazuju da hlorheksidin smanjuje broj S. mutans in vitro (Järvinen i sar., 1993; Turkun i sar., 2006; Kollmuss i sar., 2014) i u kliničkim uslovima u okluzalnim fisurama, na površini korijena zuba i u karijesnim kavitetima (Fure i Emilson, 1990; Schaeken i sar., 1991; Ersin i sar., 2006).</s><s>Hlorheksidin sa pozitivno naelektrisanim azotnim atomima na obje strane heksametilenskog lanca vezuje se za negativno naelektrisane proteine i fosfolipide ćelijske membrane bakterija, čime povećava permeabilnost membrane i uzrokuje izlazak intracelularnih komponenti iz ćelije.</s><s>U većim koncentracijama ispoljava baktericidno djelovanje koje je posljedica koagulacije citoplazme.</s><s>Pozitivno naelektrisana molekula hlorheksidina se sa visokim afinitetom vezuje i za druge negativno naelektrisane površine u usnoj duplji, kao što su gleđ, dentin i oralna mukoza što znatno doprinosi njegovoj adsorptivnosti i produženom antibakterijskom djelovanju.</s><s>Pored antibakterijskog djelovanja, hlorheksidin u kavitetima inhibira metaloproteinaze (MMP), MMP-2, MMP-8 i MMP-9 što sprječava degradaciju kolagena u hibridnom sloju in vivo i in vitro (Ricci i sar., 2010; Lindblad i sar., 2012).</s><s>Takođe, kada se primjeni u obliku vodenog rastvora, hlorheksidin može da rehidrira suv mineralizovani dentin održavajući eksponiranu mrežu kolagena (Soares i sar., 2008).</s><s>Naime, kolagen predstavlja neophodnu komponentu za vezivanje kompozitnih materijala za dentin.</s><s>Istraživanja pokazuju da hlorheksidin, bilo da se primjeni prije ili poslije kiselinskog nagrizanja dentina, nema uticaj na kvalitet veze adhezivnih sistema za dentin i kvalitet zaptivanja (Chang i Shin, 2010; Celik i sar., 2010).</s><s>Međutim, u određenim situacijama, hlorheksidin može da smanji jačinu veze materijala za dentin i poveća Kresin (1996) su pokazali da hlorheksidin stvara sloj koji je otporan na kiselinsko nagrizanje što može da smanji penetraciju hidrofilne smole u dentin.</s><s>Takođe, hlorheksidin koji zaostaje u kavitetu poslije primjene može da interreaguje sa kalcijumovim i fosfatnim jonima i tako smanji jačinu veze (Vieira i da Silva, 2003).</s><s>Hlorheksidin ne utiče na tvrdoću dentina (Aslantas i sar., 2014), osim u slučajevima produženog djelovanja (Oliveira i sar., 2007).</s><s>Dugotrajna primjena hlorheksidina može biti povezana i sa nekim drugim neželjenim efektima kao što su: prebojavanje zuba, poremećaj ukusa, stvaranje supragingivalnih konkremenata, u rjeđim slučajevima erozije sluznice, usporeno zarastanje rana i vrlo rijetko uvećanje parotidne pljuvačne žlijezde (Dumitrescu, 2011).</s><s>Ovi neželjeni efekti nisu izraženi kada se koristi u toku restaurativnog zahvata za dezinfekciju kaviteta, zbog kratkotrajnog djelovanja.</s><s>Hlorheksidin ima malu toksičnost koja nije ćelijski specifična (Giannelli i sar., 2008; Bernardi i Teixeira, 2015).</s><s>Zabilježena je negova citotoksičnost na humane gingivalne fibroblaste, ćelije oralnog epitela, ćelije periodontalnog ligamenta, ćelije alveolarne kosti i osteoblastne ćelije (Mariotti i Rumpf 1999; Huth i sar., 2006; Almazin i sar., 2009; Lee i sar., 2010).</s><s>Smatra se da je ovaj efekat zavisan od primjenjene doze i vremena djelovanja (Gomes i sar., 2013; Bernardi i Teixeira, 2015).</s><s>Citotoksičan efekat hlorheksidina zavisan od primjenjene koncentracije (0,0024%, 0,004% i 0,02%) na ćelije koje liče na odontoblaste UVOD</s>
<s>Bernardi i Teixeira, 2015). pokazan je i u studiji de Souza i sar. (2007).</s><s>Oblik primjenjenog lijeka i sastav medijuma na koji hlorheksidin djeluje takođe determinišu citotoksično djelovanje (Babich i sar., 1995; Gomes i sar., 2013;</s>
<s>1.4.2.</s><s>Etilendiaminotetraacetatna kiselina Etilendiaminotetraacetatna kiselina (EDTA) ima slab antibakterijski efekat.</s><s>Može da smanji broj crno obojenih Gram negativnih anaerobnih bakterija i nekih fakultativnih anaerobnih bakterija, bez uticaja na Gram pozitivne bakterije (Siqueira i sar.</s><s>,1998; Grawehr i sar., 2003).</s><s>Zabilježen je i antifugalni efekat ovog sredstva (Ballal i sar., 2011).</s><s>EDTA predstavlja helator kacijumovih jona, ali i jona magnezijuma, mangana i cinka, koji su važni u morfogenezi, adherenciji i rastu gljivica (Ates i sar., 2005; Ballal i sar., 2011).</s><s>Pojedini autori smatraju da smanjenje broja bakterija poslije primjene EDTA nastaje zbog njegovog efekta na razmazni sloj prije nego antiseptičkog djelovanja (Di Lenarda i sar., 2000).</s><s>Zbog izraženog helatnog djelovanja, odnosno oslobađanja kalcijumovih jona i dekalcifikacije dentinskog tkiva, kao i rastvaranja organskih komponenti dentina (Beltz i sar., 2003; Nishitani i sar., 2005) EDTA se koristi za uklanjanje razmaznog sloja u restaurativnoj terapiji.</s><s>EDTA smanjuje mikrotvrdoću dentina (Eldeniz i sar., 2005; Aslantas i sar., 2014).</s><s>Nygaard-Ostby (1957) je ispitivao uticaj 15% EDTA na humanu pulpu i periapeksno tkivo zuba sa vitalnom i nekrotičnom pulpom.</s><s>Rezultati tog istraživanja pokazali su da EDTA ne dovodi do oštećenja periapeksnog tkiva 14 mjeseci poslije iniciranja u periapeksno tkivo, kao i da njegova primjena u trajanju od 28 dana ne dovodi do nekroze pulpe poslije pulpotomije.</s><s>U komercijalnim preparatima za dezinfekciju kaviteta u kombinaciji sa kvaternernim jedinjenjima amonijaka (Tubilicid), EDTA eliminiše bakterije iz kaviteta prije postavljanja ispuna bez štetnog djelovanja na pulpu (Brannstrom i Nyborg, 1973).</s><s>Druga istraživanja ukazuju na njen izražen citotoksični efekat.</s><s>Zabilježen je citotoksični efekat EDTA na fibroblaste i makrofage koji je dozno zavisan (Sousa i sar., 2005; Amaral i sar., 2007; Ballal i sar., 2009).</s><s>Kada se primjeni u tkivo dovodi do izražene iritacije, koja može biti prisutna i 28 dana poslije primjene (Segura i sar., 1996, Segura i sar., 1997; 1.4.3.</s><s>Natrijum hipohlorit</s>
<s>Natrijum hipohlorit (NaOCl) ispoljava širok spektar nespecifičnog djelovanja na bakterije, spore i viruse (McDonnell i Russell, 1999).</s><s>Istraživanja pokazuju da ovaj antiseptik djeluje na kariogene bakterije: S. mutans, S. sorbinus i Lactobacillus acidophilus (Ergücü i sar., 2005).</s><s>Antibakterijski efekat se pripisuje oslobađanju hidroksilnih jona i hlora, koji dovode do ireverzibile oksidacije sulfhidrilnih grupa esencijalnih bakterijskih enzima.</s>
<s>Pored antiseptičkog dejstva, natrijum hipohlorit takođe rastvara organsko i nekrotično tkivo jer transformiše masne kiseline i masti u soli (sapun) i glicerol (alkohol).</s><s>Može da se primjeni i kao hemostatik kod direktnog prekrivanja pulpe i vitalne amputacije (Hafez i sar., 2002).</s><s>Natrijum hipohlorit rastvara kolagen, magnezijumove i fosfatne jone iz dentina dok povećava nivo karbonata i negativno utiče na UVOD</s>
<s>Bernardi i Teixeira, 2015). mehaničke karakteristike dentina: tvrdoću, modul elastičnosti i otpornost na savijanje (Pascon i sar., 2009; Aslantas i sar., 2014).</s><s>Zbog djelovanja na organske komponente dentina, može da remeti stvaranje hibridnog sloja u kavitetima i negativno utiče na kvalitet veze adhezivnih sistema za dentin i smanji marginalno zaptivanje kompozitnih restauracija (Erdemir i sar., 2004; Pappas i sar., 2005; Saber i ElAskary, 2009; Ercan i sar., 2009), ali taj efekat zavisi od vrste primjenjenog adheziva (Shinohara i sar., 2004; Shafiei i Memarpour, 2012).</s><s>Prisustvo radikala porjeklom iz proteina hloramina natrijum hipohlorita može da dovede do preranog završetka polimernog lanca i nepotpune polimerizacije kompozitnih smola (Lai i sar., 2001).</s><s>Neželjena svojstva natrijum hipohlorita su i neprijatan miris i ukus i izražena toksičnost na oralna tkiva, gingivalne fibroblaste i oralne epitelne ćelije (Barnhart i sar., 2005; Huth i sar., 2006).</s><s>Smanjenjem koncentracije i dužine djelovanja smanjuje mu se toksičnost, ali i antibakterijski efekat i efekat rastvaranja tkiva (Mohammadi, 2008; Alkahtani i sar., 2014).</s><s>1.4.4.</s><s>Vodonik peroksid</s>
<s>Vodonik peroksid djeluje na veliki broj mikroorganizama: bakterije, gljivice, viruse i spore (McDonnell i Russell, 1999).</s><s>Bakterije koje ne pokazuju katalaznu aktivnost, kao što su Streptococcus spp. i Lactobacillus spp., posebno su osjetljive na djelovanje ovog antiseptika (Turkun i sar., 2006; Ikai i sar., 2010).</s><s>Antibakterijski efekat se zasniva na djelovanju hidroksilnih radikala koji, kao jaki oksidansi, lako reaguju sa makromolekulima kao što su DNK i lipidi u membrani ćelija i dovode do smrti ćelije.</s><s>Pored antiseptičkog, vodonik peroksid ima i dezodorantno dejstvo, jer uklanja i oksidiše organske materije neprijatnog mirisa, hemostatičko djelovanje, jer taloži fibrinogen, a zbog naglog oslobađanja kiseonika i stvaranja obilne pjene mehanički uklanja ostatke tkiva.</s><s>Sposobnost vodonik peroksida da oksidiše organske komponente zubnih tkiva, koristi se za bijeljenje zuba.</s><s>To djelovanje nije povezano sa promjenama u proteinskom i mineralnom sastavu gleđi i dentina (Eimar i sar., 2012) iako su nalazi o uticaju sredstava za biljeljenje zuba na mehaničke karakteristike zubnih tkiva često različiti i kontradiktorni (Ittatirut i sar., 2014).</s><s>Kiseonik oslobođen iz vodonik peroksida inhibira polimerizaciju adhezivnih sistema (Nikaido i Nakabayashi, 1988; Torneck i sar., 1990, Cadenaro i sar., 2006), i negativno utiče na kvalitet veze ovih sistema za dentin (Erdemir i sar., 2004; Ercan i sar., 2009) kao i na fizičke karakteristike kompozitnih materijala (Gurgan i Yalcin Cakir, 2008).</s><s>Neželjeni efekti koji mogu da se jave usljed primjene vodonik peroksida su ulceracije mukoze (Rees i Orth, 1986) i patološke promjene vezane za preneoplastične lezije (Weitzman i sar., 1986).</s><s>Vodonik peroksid ispoljava citotoksičan efekat na gingivalne fibroblaste i oralne epitelne ćelije (Huth i sar., 2006).</s><s>Zbog male molekulske mase, vodonik peroksid i njegovi produkti mogu lako da difunduju kroz zubna tkiva i uzrokuju oksidativni stres u pulpnim ćelijama i ćelijsku smrt (Soares i sar., 2014a; Soares i sar., 2014b).</s><s>Taj efekat je dozno i vremenski zavisan.</s><s>1.4.5.</s><s>Druga sredstva sa antiseptičkim djelovanjem Zanimljivo je istaći da u savremenoj restaurativnoj stomatologiji postoji tendencija da se u sastav kompozitnih smola i glas jonomer cemenata dodaju različite supstance sa antibakterijskim djelovanjem.</s>
<s>Iako mogu djelovati na bakterije u karijesnim kavitetima, ove supstance istovremeno utiču i na mehaničke karakteristike i vezivanje materijala za zubna tkiva (Imazato, 2003; Li i sar., 2009).</s><s>Problemi vezani za ove materijale su kontrola kinetike oslobađanja antimikrobne supstance i obezbjeđivanje protrahovanog antibakterijskog efekta (Imazato, 2003; Li i sar., 2009).</s><s>Interesantan je podatak da su sintetisani monomeri koji omogućavaju dugotrajan antibakterijski efekat adheziva i kompozitnih materijala i poslije njihovog postavljanja u kavitet, bez oslobađanja aktivnih supstanci.</s><s>Ispoljavaju kontaktni inhibitorni efekat na bakterije izolovane iz karijesnih lezija krunice i korijena (Imazato i sar., 2001; Imazato, 2003; Korkmaz i sar., 2008), a poslije polimerizacije inhibiraju adherenciju i rast bakterija na svojoj površini.</s><s>Dodavanje ovih monomera ne remeti vezivanje materijala za zubna tkiva, ne utiče na kvalitet polimerizacije, marginalnu adaptaciju i citotoksičnost materijala nosača antibakterijske supstance (Bortolotto i sar., 2007; Imazato i sar., 2007).</s><s>Postoje podaci da se dezinfekcija kaviteta može postići i primjenom lasera (Klinke i sar., 1997).</s><s>Energija lasera može da se koristi samostalno (Walsh i sar., 2003; Xia i sar., 2012) ili mogu da se kombinuju sa fotosenzitivnim supstancama za eliminaciju bakterija u karijesnim lezijama (Walsh i sar., 2003; Lima i sar., 2009).</s><s>Tretiranje kaviteta laserom ne utiče na vezivanje adheziva za zubna tkiva, ali je sam postupak primjene kompleksan i ekonomski je zahtjevniji oblik terapije u poređenju sa drugim dostupnim metodama dezinfekcije (Siso i sar., 2009).</s><s>1.5.</s><s>OZON KAO ODONTOANTISEPTIK</s>
<s>Ozon je našao široku primjenu u medicini gdje se koristi u terapiji očnih oboljenja, akutnih i hroničnih oboljenja izazvanih bakterijama, virusima i gljivicama, ishemičnih oboljenja, starenjem uzrokovane makularne degeneracije, oboljenja koštanog sistema, kožnih, plućnih, bubrežnih i neurodegenerativnih oboljenja i oboljenja hematopoeznog organa.</s><s>Poslednjih godina ozon se kao antiseptik primjenjuje i u stomatologiji zbog izraženog djelovanja na bakterije, viruse, gljivice i protozoe, bez pojave antimikrobne rezistencije (Paraskeva i Graham, 2002).</s><s>U in vitro uslovima ozon primjenjen u obliku gasa efikasno djeluje na kariogene bakterije: S. mutans, L. casei, Lactobacillus paracasei, A. neaslundii (Polydorou i sar., 2006; Castillo i sar., 2008; Johansson i sar., 2009; Polydorou i sar., 2012; Kollmuss i sar., 2014).</s><s>Takođe, ozon pokazuje efikasnost na bakterije koje se nalaze u primarnim karijesnim lezijama korijena zuba (Baysan i sar., 2000; Baysan i Lynch, 2004).</s><s>Njegova efikasnost u kliničkim uslovima ispitivana je u malom broju studija, a dobijeni rezultati su oprečni.</s><s>Pojedini autori nalaze da ovaj antiseptik dovodi do smanjenja broja kariogenih bakterija u karijesnim kavitetima (Bysan i Lynch, 2007; Dukić i sar., 2013) dok drugi nisu zabilježili njegov antibakterijski efekat (HauserSa kliničkog aspekta značajni su radovi u kojima je ispitivan efekat ozona na kliničke parametre karijesa.</s><s>Holmes i sar. (2003) su pokazali da je ozon, uz primjenu remineralizacionih sredstava (pasta, vodica za ispiranje i sprej) u opservacionom periodu od 18 mjeseci doveo do značajnog zaustavljanja karijesnih lezija UVOD</s>
<s>Azarpazhooh i Limeback, 2008). korijena.</s><s>Slično, Baysan i Lynch (2007) su zapazili da oko 51% karijesnih lezija korijena očvršćava 6 mjeseci poslije terapije ozonom.</s><s>U nekoliko studija je ispitivan efekat ozona na okluzalni karijes kod djece i adolescenata u opservacionom periodu od 3 mjeseca (Huth i sar., 2005), 6 mjeseci (Atabek i Oztas, 2011), 8 mjeseci (Dähnhardt i sar., 2006) i 12 mjeseci (Johansson i sar., 2014).</s><s>Rezultati ukazuju da ozon dovodi do zaustavljanja karijesa i progresije oboljenja, ali ne u svim slučajevima (Johansson i sar., 2014).</s><s>Uočeno je da kod početnih aproksimalnih karijesnih lezija, 18 mjeseci poslije primjene gasnog ozona, dolazi do uklanjanja bakterija iz spoljašnjih djelova lezije i zaustavljanja demineralizacije, ali bez njegovog uticaja na dublje slojeve (Yazıcıoğlu i Ulukapi, 2014).</s><s>Po nekim autorima antimikrobno djelovanje ozon ostvaruje na dva načina: direktnim djelovanjem molekularnog ozona ili preko reaktivnih produkata koji nastaju njegovim razlaganjem, kao što su hidroksilni anjon (OH-), superoksidni anjon (O2-), perhidroksiradikal (HO2-) (Khadre i sar., 2001).</s><s>Nespecifičnim mehanizmom ozon oštećuje ćelijski zid i citoplazmatsku membranu bakterijskih ćelija.</s><s>Naime, oksidacijom glikoproteina, glikolipida i drugih aminokiselina inhibira i blokira enzimsku kontrolu ćelije i dovodi do povećanja ćelijske permeabilnosti i smrti ćelije.</s><s>Takođe, ozon može da reaguje sa brojnim biomolekulima koje sadrže cistein, metionin i histidin.</s><s>Ćelijska smrt usljed dejstva ozona može da nastane i zbog oštećenja enzima i nukleinskih kiselina u citoplazmi mikrobne ćelije (Khadre i sar., 2001;</s>
<s>Antibakterijski efekat ozona zavisi od nekoliko faktora: primjenjene doze, dužine primjene, prisustva organskog sadržaja, bakterijske vrste na koje djeluje, temperature sredine i pH.</s><s>Još uvijek ne postoje standardizovani protokoli primjene ozona u restaurativnoj proceduri u pogledu dužine primjene i potrebne doze.</s><s>Istraživanja pokazuju da se sa povećanjem dužine primjene povećava i efikasnost, a da doze ozona na mjestu aplikacije variraju od primjenjenog generatora ozona.</s><s>U in vitro studiji Castillo i sar. (2008) su pokazali da poslije primjene ozona u trajanju od 10, 20 i 40 sekundi na S. mutans izolovan iz karijesnih lezija djece sa visokim rizikom za nastanak karijesa, ozon značajno redukuje ove bakterije poslije 10 i 20 sekundi, a potpuno uništava poslije 40 sekundi.</s><s>Tuncer i sar. (2013) i Kollmuss i sar. (2014) nalaze da se sa povećanjem doze i dužine djelovanja povećava antiseptički efekat ozona na oralne bakterije.</s><s>Prisustvo organskog sadržaja smanjuje ozonsku efikasnost.</s><s>Pljuvačka i dentalni plak, kao organski supstrati, u kliničkim uslovima reaguju sa ozonom smanjujući količinu dostupnog ozona za interakciju sa bakterijama.</s><s>Takođe, bakterije organizovane u biofilmove imaju manju metaboličku aktivnost i otpornije su na djelovanje antiseptika od bakterija koje se nalaze u planktonskom obliku, a polimerni matriks biofilma sprječava difuziju antibakterijskih supstanci (Lima i sar., 2009).</s><s>Johansson i sar. (2009) su u in vitro studiji pokazali da pljuvačka smanjuje efikasnost ozona na kariogene bakterije i da se inhibitroni efekat pljuvačke gubi sa produžavanjem djelovanja.</s><s>Müller i sar. (2007) su u svojoj in vitro studiji pokazali na ograničen antiseptički efekat ozona na različite bakterijske vrste organizovane u kariogene biofilmove, dok, sa druge strane, Nagayoshi i sar. (2004) nalaze izraženi antibakterijski efekat ozonirane vode na bakterije u eksperimentalnom i humanom dentalnom plaku.</s><s>U pogledu osjetljivosti pojednih vrsta mikroorganizama na ozon postoji veoma malo slaganja među istraživačima.</s><s>Takođe, osjetljivost pojedinih vrsta se razlikuje između studija.</s><s>Vrsta, starost bakterijske kulture, broj bakterija, način primjene ozona, način mjerenja efekta neki su od faktora koji otežavaju komparaciju između studija.</s><s>Uočeno je da su na djelovanje ozona manje osjetljive Gram pozitivne bakterije u odnosu na Gram negativne, kao i aerobne u UVOD</s>
<s>Gupta i Mansi, 2012) poređenju sa anaerobnim bakterijama.</s><s>Jedan od razloga manje osjetljivost Gram pozitivnih bakterija u poređenju sa Gram negativnim je veća koncentracija peptidoglikana u ćelijskom omotaču koji je relativno rezistentan na djelovanje ozona.</s><s>Ozon efikasnije djeluje na obligatne anaerobne bakterije, zbog njihove intolerancije na prisustvo kiseonika.</s><s>Sa druge strane, on može predstavljati donator kiseonika za aerobne i fakultativno aerobne bakterije koje ga koriste za rast (Bezirtzoglou i sar., 2008) tako da je djelovanje ozona na ove vrste ograničeno, posebno kada se primjeni u nižim koncentracijama.</s><s>Uticaj temperature na efikasnost ozona se ogleda u smanjenju rastvorljivosti i stabilnost, a povećanju reaktivnosti sa supstratom sa povećavanjem temperature.</s><s>Na smanjenje stabilnosti ozona utiče i povećanje alkaliteta, iako se smatra da pH u opsegu od 5,7-10,1 nema uticaj na njegovo djelovanje (Khadre i sar., 2001).</s><s>Pored antimikrobnog, ozon ispoljava i druge značajne efekte na zubna tkiva.</s><s>Interesantan je podatak da primjena ozona na nekarijesni dentin sprječava stvaranje biofilmova S. mutans i L. acidophilus na površini zuba u trajanju od četiri nedjelje (Knight i sar., 2008).</s><s>Sličan efekat ozona na sprječavanje stvaranja dentalnog plaka zabilježili su Nagayoshi i sar. (2004) primjenom ozonirane vode na površini dekalcifikovanih zuba.</s><s>Postoje podaci koji ukazuju da oksidativnim djelovanjem ozon može da stimuliše remineralizaciju demineralizovanog dentina (Baysan i Lynch, 2004).</s><s>Djelovanjem na bakterije koje se nalaze u karijesnoj leziji ozon dovodi do promjene sredine iz acidogene u onu koja pospješuje procese remineralizacije.</s><s>Takođe, pirogrožđanu kiselinu, jednu od najjačih prirodnih kiselina koju stvaraju bakterije, ozon dekarboksiluje u acetatnu kiselinu i ugljen dioksid.</s><s>Stvaranje ove i drugih kiselina sa visokim pKa u plaku može da utiče na neutralizaciju plaka i procese remineralizacije početnih karijesnih lezija.</s><s>Ozon reaguje i sa organskim materijama u karijesnim lezijama čime omogućava penetraciju kalcijumovih i fosfatnih jona kroz leziju, što pospješuje remineralizaciju (Tahmassebi i sar., 2014).</s><s>Ipak, in vitro studije pokazuju da kada se primjeni samostalno, ozon ne sprječava demineralizaciju niti pospješuje remineralizaciju dentina (Zaura i sar., 2007; Tahmassebi i sar., 2014), ali i ne potencira procese demineralizacije sveže remineralizovanih dentinskih lezija, kao što je to zabilježeno za natrijum hipohlorit (Zaura i sar., 2007).</s><s>U kombinaciji sa supstancama koje stimulišu remineralizaciju, ozon ne ispoljava značajan efekat na smanjenje demineralizacije tvrdih zubnih tkiva in situ (Duggal i sar., 2012).</s><s>Ipak, treba uzeti u obzir ograničenja in vitro istraživanja i odsustvo reakcije vitalne komponente pulpo-dentinskog kompleksa na djelovanje ozona, uzimajući u obzir ulogu pulpe u procesima remineralizacije i dentinogeneze.</s><s>Za razliku od drugih oksidativnih supstanci, ozon ne remeti vezivanje adhezivnih sistema za zubna tkiva, čak i povećava jačinu veze, i smanjuje mikrocurenje (Schmidlin i sar., 2005; Cadenaro i sar., 2009; Magni i sar., 2011; Kapdan i Oztas i sar., 2015).</s><s>Takođe, ozon ne utiče na mikromehaničke karakteristike gleđi (Celiberti i sar., 2006), dentina (Magni i sar., 2010) i kompozitnih materijala (Magni i Interesantno je pomenuti da ozon ispoljava i druge farmakodinamske efekte na tkiva.</s><s>Naime, poboljšava protok krvi i dopremanje kiseonika u tkiva, što dovodi do aktiviranja ćelijskih aerobnih procesa i metabolizma u tkivima.</s><s>Ozon povećava sintezu antioksidativnih enzima i umjereno aktivira imuni sistem i stimuliše oslobađanje faktora rasta, NO sintaze i aktivira stem ćelije (Bocci, 2005; Sagai i Bocci, 2011;</s>
<s>1.6.</s><s>PRINCIPI ISPITIVANJA BEZBJEDNOSTI ODONTOANTISEPTIKA Odontoantiseptici su sredstva koja se primjenjuju lokalno za dezinfekciju kaviteta zuba poslije preparacije kaviteta (sredstva za ispiranje kaviteta) ili za ispiranje i dezinfekciju kanala korijena zuba poslije endodontskog liječenja (intrakanalni irigansi i medikamenti).</s><s>Za odontoantiseptike, kao i druge stomatološke materijale koji se takođe primjenjuju lokalno na oralna tkiva, od značaja je njihov farmakodinamski efekat, kao i njihov bezbjednosni profil tj. potencijalni rizik da oštete zubna ili oralna tkiva sa kojima dolaze u kontakt.</s><s>Dva važna fenomena citotoksičnost i biokompatibilnost određuju bezbjednosni profil dentalnih materijala (uključujući i odontoantiseptike) ili šire stomatoloških materijala.</s><s>Citotoksičnost predstavlja molekularne promjene koje dovode do oštećenja ćelija (Aldridge, 1993).</s><s>Biokompatibilnost predstavlja reakciju na primjenjeni materijal od strane tkiva ili cijelog organizma (van Loon i Mars, 1997).</s><s>Preporučeni protokol Međunarodne organizacije za standardizaciju (ISO) za ispitivanje citotoksičnosti i biokompatibilnosti dentalnih materijala uključuje i njihovo poređenje sa pozitivnom i negativnom kontrolom (ISO 10993, 1992; ISO 7405, 1996).</s><s>Pomenuti ISO protokol ima četiri faze: u prvoj fazi citotoksični efekti materijala se mjere u in vitro uslovima na jednoslojnim ćelijskim kulturama što omogućuje dobru reproduktivnost rezultata (Schmalz, 1988; Schmalz i sar., 1996).</s><s>Materijali koji u ovim testovima pokažu mali nivo citotoksičnosti se dalje implantiraju u male laboratorijske životinje, obično glodare, i porede sa kontrolama čime se dobijaju in vivo citotoksične i biokompatibilne karakteristike (ISO 10993, 1992; ISO 7405, 1996).</s><s>Materijali koji pokažu dobru komplijansu u ovim in vivo testovima postavljaju se u kavitete V klase zuba primata, ne računajući humani model, uz primjenu kontrole, uslovi koji imitiraju restaurativnu proceduru za ispitivanje biokompatibilnosti i citotoksičnosti (Cox i sar., 1987; Cox i sar., 1998).</s><s>Poslije ovih testova zubi se ekstrahuju i histološki ispituju.</s><s>Ukoliko zubna tkiva pokažu nizak nivo ćelijskih oštećenja zajedno sa odsutnim ili minimalnim stepenom zapaljenja smatra se da je materijal prošao ISO zahtjeve i može se primjeniti u ispitivanjima na pacijentima (ISO 10993, 1992; ISO 7405, 1996).</s><s>Razumije se da su rezultati o bezbjednosnom profilu dentalnog materijala dobijeni u kliničkim studijama najvalidniji.</s><s>Ove kliničke studije mogu biti dizajnirane kao retrospektivne, studije presjeka, prospektivne uz randomizaciju, kao kontrolisana studija, po mogućnosti primjenom jednostruko ili dvostruko slijepe metode.</s><s>Iako je antimikrobni efekat ozona procjenjivan u brojnim istraživanjima, samo u nekoliko studija je ispitana biokompatibilnost ovog antiseptika sa oralnim tkivima.</s><s>Tako na primjer, Huth i sar. (2006) su pokazali u in vitro studiji na kulturama humanih ćelija oralnog epitela i gingivalnih fibroblasta da ozon, primjenjen u obliku gasa, ispoljava citotoksičan efekat na ćelije, dok primjenjen kao ozonirana voda ispoljava optimalnu biokompatibilnost.</s><s>U istoj studiji autori su uporedili biokompatibilnost ova dva oblika ozona sa najčešće primjenjivanim oralnim antisepticima: hlorheksidinom, natrijum hipohloritom i vodonik peroksidom.</s><s>Ozonirana voda ne ispoljava toksičan efekat na humane ćelije oralnog epitela i gingivalne fibroblaste, dok je efekat gasnog ozona u rangu ili čak manji od onog koji je zabilježen za 2% hlorheksidin, 2,25% i 5,25% natrijum hipohlorit i 3% vodonik peroksid (Huth i sar., 2006).</s><s>Druga studija je takođe pokazala biokompatibilnost ozonirane vode na kulture ćelija fibroblasta (Nagayoshi i sar., 2004) i odontoblasta (Noguchi i sar., 2009).</s><s>Ozon primjenjen kao ozonirani medijum (ozonirana voda bez fetalnog seruma) u kulturi humanih oralnih epitelnih ćelija, gingivalnih fibroblasta i HeLa ćelija inhibira nuklearni UVOD</s>
<s>UVOD faktor kapa B (NF-kB), oslobođen pod uticajem faktora nekroze tumora (Huth i sar., 2007).</s><s>U istom istraživanju inhibitorni efekat ozoniranog medijuma na NF-kB je zabilježen i u periodontalnom ligamentu parodontološki kompromitovanih zuba.</s><s>Ovi rezultati ukazuju na antiinflamatorni i imunomodulatorni potencijal ozona (Huth i sar., 2007).</s>
<s>Ozon predstavlja jako oksidativno sredstvo i njegovo je razlaganje praćeno oslobađanjem vodonik peroksida i drugih reaktivnih vrsta kiseonika (engl.</s><s>Reactive oxygen species (ROS)).</s><s>ROS predstavljaju produkte metabolizma kiseonika u fiziološkim uslovima i imaju značajnu ulogu u signalnim ćelijskim procesima, proliferaciji ćelija i ćelijskom preživljavanju.</s><s>Pretjerano stvaranje ROS dovodi do oštećenja ćelijskih struktura, stanja poznatog kao oksidativni stres koji se povezuje sa nastankom brojnih oboljenja (Valko i sar., 2007; Buczko i sar., 2015).</s><s>Odbrambeni mehanizmi protiv oksidativnog stresa podrazumijevaju: preventivne i reparatorne mehanizme, fiziološku odbranu i antioksidativnu zaštitu (Valko i sar., 2007).</s><s>Antioksidativnu zaštitu čine neenzimski antioksidansi, kao što su askorbinska kiselina, α-tokoferol, glutation, karetenoidi, flavonoidi, i enzimski antioksidansi, kao što su glutation peroksidaza (GPx), katalaza (CAT) i superoksid dismutaza (SOD) (Valko i sar., 2007).</s><s>SOD je jedan od najvažnijih antioksidativnih enzima koji reaguje sa ROS, posebno sa superoksidnim anjonskim radikalom stvarajući vodonik peroksid i kiseonik (Davis i sar., 1991).</s><s>Razlikuju se tri izoforme ovog enzima: citosolna Cu, Zn SOD, mitohondrijalna Mn-SOD i ekstraćelijska SOD. Ovaj oksidativni enzim je nađen u zdravom tkivu pulpe (Davis i sar., 1991; Bödör i sar., 2007).</s><s>Prisustvo SOD u zubnoj pulpi ukazuje na njen biološki zaštitni mehanizam protiv ROS nastalih tokom inflamacionih promjena (Davis i sar., 1991; Bödör i sar., 2007).</s><s>Varvara i sar. (2012) su uočili da preparacija kaviteta povećava nivo SOD. Do sličnih nalaza su došli i Baumgardner i sar. (1999) koji su još ukazali da je SOD rani i osjetljivi indikator inflamatornog stresa u pulpi.</s><s>Povećanje nivoa SOD je zabilježeno i u tkivu ireverzibilno infamirane pulpe (Davis i sar., 1991; Bödör i sar., 2007).</s><s>Takođe je uočeno da u toku inflamacije različite forme izoenzima SOD, Cu, Zn SOD i Mn-SOD pokazuju različitu ekspresiju, što možda predstavlja jedinstvenu karakteristiku inflamacione reakcije u pulpnom tkivu (Bödör i sar., 2007).</s><s>Sa druge strane, Varvara i sar. (2005) ukazuju ne na povećanje već na smanjenje SOD u ireverzibilno inflamiranoj pulpi.</s><s>Ovo smanjenje autori povezuju sa progresijom inflamacije u pulpi koja je dovela do trošenja i razgradnje SOD. Uzimajući u obzir da je SOD glavni enzimski odbrambeni mehanizam protiv toksičnih ROS koje nastaju tokom normalnog oksidativnog metabolizma i tokom inflamacije (Davis i sar., 1991; Varavara i sar., 2012) i na osnovu prikazanih istraživanja može se smatrati da je jedan od načina za mjerenje biokompatibilnosti odontoantiseptika, u odnosu na pulpno tkivo, ispitivanje njihovog uticaja na SOD u zubnoj pulpi.</s><s>Faktor rasta vaskularnog endotela (VEGF) ima značajnu ulogu u razvoju tkiva, ćelijskoj migraciji, inflamaciji i reparaciji (Mantellini i sar., 2006).</s><s>VEGF potencira proces neovaskularizacije kako iz postojeće kapilarne mreže (angiogeneza), tako i de novo (vaskulogeneza) u fiziološkim i patološkim uslovima što čini da je ovaj faktor rasta kritična komponenta za rast i reparaciju tkiva i organa.</s><s>Pored toga što djeluje na vaskularne endotelne ćelije, uočeno je da je VEGF multifunkcionalni signalni faktor koji ostvaruje brojne biološke efekte djelujući i na druge ćelije (Byrne i sar., 2005).</s><s>Ćelije zubne pulpe ljudi spontano stvaraju VEGF VEGFR-3 (Matsushita i sar., 1999; Grando Mattuella i sar., 2007, Virtej i sar., 2013).</s><s>Matsushita i sar. (2000) su pokazali da VEGF stimuliše proliferaciju pulpnih ćelija i povećava nivo alkalne fosfataze važne za UVOD</s>
<s>RADNA HIPOTEZA procese biomineralizacije.</s><s>Ova i druga istraživanja ukazuju da VEGF, pored uloge u angiogenezi koja prethodi formiranju reparatornog dentina, ima direktan uticaj na diferencijaciju odontoblasta i njihovu aktivnost (Matsushita i sar., 2000; Scheven i sar., 2008).</s><s>Povećan nivo VEGF u odontoblastima i fibroblastima je zabilježen kod zuba sa nezavršenim u odnosu na zube sa završenim rastom korijena, što ukazuje na ulogu VEGF u maturaciji zuba (Wang i sar., 2007).</s><s>Različita patološka stanja mogu dovesti do promjena u nivou VEGF.</s><s>Artese i sar. (2002) su ispitujući ireverzibilno promjenjene i zdrave pulpe uočili da je u pulpama sa ireverzibilnim zapaljenjem nivo VEGF povećan u ćelijama koje čine inflamacioni infiltrat, ali smanjen u stromalnim ćelijama pulpe.</s><s>Bakterije i njihovi produkti, lipopolisaharid i lipoteihoična kiselina, indukuju povećanje VEGF u ćelijama zubne pulpe (Matsushita i sar., 1999; Soden i sar., 2009).</s><s>Veći nivo VEGF u ćelijama pulpe je zabilježen poslije povrede (Tran-Hung i sar., 2008) i stanjima hipoksije (Aranha i sar., 2010), kao i u tkivu pulpe, odontoblastima i makrofagima poslije primjene 2-hidroksi-etil metakrilata (HEMA) (Mantellini i sar., 2006; Tran-Hung i sar., 2008).</s><s>Uzimajući u obzir da VEGF daje značajne informacije o vitalnosti i funkcionalnosti ćelija (Paranjpe i sar., 2007) može se koristi za određivanje biokompatibilnosti odontoantiseptika u odnosu na pulpno tkivo.</s>
<s>Primjena ozona u trajanju od 40 sekundi na duboku karijesnu leziju značajno smanjuje ukupan broj bakterija i Lactobacillus spp. u karijesnim kavitetima.</s><s>Istovremeno, ozon povećava nivo VEGF i SOD u zubnoj pulpi.</s>
<s>Imajući u vidu činjenicu da se najveći broj do sada objavljenih studija o antibakterijskoj efikasnosti ozona na kariogene bakterije odnosi na rezultate dobijene u in vitro studijama i sa druge strane činjenicu da postoji mali broj radova koji se odnose na biokompatibilnost ozona na zubnu pulpu u in vivo uslovima postavljeni su sljedeći ciljevi:</s>
<s>1. Ispitati antibakterijski efekat primjene ozona i hlorheksidina, pojedinačno na ukupan broj bakterija i Lactobacillus spp. u karijesnim kavitetima poslije nepotpunog uklanjanja karijesa.</s><s>2. Ispitati antibakterijski efekat primjene ozona i hlorheksidina pojedinačno na pojedine vrste Lactobacillus spp. u karijesnim kavitetima poslije nepotpunog uklanjanja karijesa.</s><s>3. Uporediti antibakterijsku efikasnost ozona i hlorheksidina u karijesnim kavitetima poslije nepotpunog uklanjanja karijesa.</s>
<s>4. Odrediti koncentraciju VEGF i SOD u zubnoj pulpi poslije primjene ozona na otvorene dentinske kanaliće u ispreparisanim kavitetima intaktnih zuba koji su iz protetskih razloga indikovani za devitalizaciju ili iz ortodontskih razloga za ekstrakciju i uporediti sa koncentracijom VEGF i SOD u zubnoj pulpi intaktnih zuba koji su iz protetskih razloga indikovani za devitalizaciju ili iz ortodontskih razloga za ekstrakciju.</s>
<s>Ispitivanje predstavlja interventnu randomizovanu kontrolisanu kliničku studiju.</s><s>Istraživanje je sprovedeno u periodu od januara 2013. do septembra 2014. godine.</s><s>Sve osobe koje su uključene u istraživanje pismeno su upoznate sa ciljevima i očekivanim ishodima istraživanja, procedurom uzimanja uzorka i potpisale su pristanak za učešće.</s><s>Sa svim ispitanicima postupalo se po principima dobre kliničke prakse.</s><s>Etički komitet Medicinskog fakulteta Univerziteta u Istočnom Sarajevu, Republika Srpska, dao je saglasnost za sprovođenje ovog istraživanja.</s><s>4.2.</s><s>ISPITANICI</s>
<s>U studiji su ispitanici podijeljeni u dvije grupe: studija I: ispitivanje antibakterijskog efekta ozona u karijesnim kavitetima zuba i studija II: ispitivanje biokompatibilnosti ozona u odnosu na zubnu pulpu.</s><s>4.2.1.</s><s>Studija I: antibakterijski efekat ozona u karijesnim kavitetima zuba.</s><s>Ispitivanjem su obuhvaćene osobe starije od 18 godina koje su se javile na Katedru za dentalnu patologiju Medicinskog fakulteta Univerziteta u Istočnom Sarajevu, Republika Srpska, radi sanacije karijesa.</s><s>Kriterijumi za uključivanje u studiju su bili: postojanje najmanje jedne duboke karijesne lezije na okluzalnoj ili okluzalnoj i aproksimalnoj površini bočnih zuba koja je zahvatila više od polovine debljine dentina, procjenjeno na osnovu retroalveolarnog radiograma; odsustvo kliničkih znakova i simptoma ireverzibilnog oštećenja pulpe, kao što su spontani bolovi ili perzistencija bola poslije djelovanja podražaja; pozitivan test vitaliteta na hladni (Endo-Frost-50C; Coltene/Whaledent, Altstatten, Switzerland) i električni (Analytical Technologies, Redmond, WA) nadražaj, odsustvo apscesa i otoka u parodoncijumu i parodontalnih džepova dubine >4mm; odsustvo radioloških znakova oboljenja apeksnog i lateralnog parodoncijuma, odustvo radioloških znakova interne i eksterne resorpcije i/ili kalcifikacija u zubnoj pulpi.</s><s>Osobe sa sistemskim oboljenjima, žene u toku trudnoće i osobe koje su uzimale antibiotsku terapiju najmanje mjesec dana prije uzimanja uzorka nisu uključene u istraživanje.</s><s>Od svakog ispitanika u istraživanje je uključen samo jedan zub.</s><s>4.2.2.</s><s>Studija II: biokompatibilnost ozona u odnosu na zubnu pulpu.</s><s>Ispitivanjem su obuhvaćene osobe starije od 18 godina koje su se javile na Katedru za oralnu rehabilitaciju Medicinskog fakulteta Univerziteta u Istočnom Sarajevu, Republika Srpska, radi ekstrakcije donjih molara iz ortodontskih razloga ili devitalizacije ovih zuba iz protetskih razloga.</s><s>U istraživanje su uključeni intaktni MATERIJAL I METODE</s>
<s>4.1.</s><s>DIZAJN STUDIJE zubi bez kliničkih znakova i simptoma ireverzibilnog oštećenja pulpe koji su reagovali na hladni (EndoFrost-50C; Coltene/Whaledent, Altstatten, Switzerland) i električni (Analytical Technologies, Redmond, WA) nadražaj i kod kojih nisu zabilježeni apsces i otok u parodoncijumu i parodontalni džep dubine >4mm, kao i radiološki znaci oboljenja apeksnog i lateralnog parodoncijuma, internih i eksternih resorpcija i/ili kalcifikacija u zubnoj pulpi.</s><s>Ispitanici koji su u anamnezi dali podatak o postojanju sistemskog oboljenja ili koji su uzimali antibiotsku ili antiinflamatornu terapiju najmanje mjesec dana prije uzimanja uzorka pulpe su isključeni iz istraživanja.</s><s>Od svakog ispitanika u istraživanje je uključen samo jedan zub.</s><s>4.2.3.</s><s>Veličina uzorka</s>
<s>Studija I- Veličina uzorka za ocjenu razlike u antibakterijskom efektu ozona i 2% hlorheksidina određena je na osnovu istraživanja Müller i sar. (2007).</s><s>Pri statističkoj moći testa od 80% (greška II tipa) i nivoom značajnosti od 5% (greška I tipa) izračunata je veličina uzorka od 48 karijesnih lezija, po 24 u grupi Studija II- Uzimajući u obzir da nema dostupnih podataka o uticaju ozona na nivo VEGF u zubnoj pulpi, potreban broj uzoraka određen je na osnovu pilot istraživanja na 12 uzoraka.</s><s>Na osnovu dobijenih srednjih vrijednosti i standardnih devijacija u grupi tretiranoj ozonom i kontrolnoj grupi, najmanje 19 zuba po grupi je bilo potrebno da bi se obezbjedila moć testa od 80% i nivo značajnosti od 5% (G*Power 3.1, 4.2.4.</s><s>Randomizacija</s>
<s>U studiji I i II tretmani su dodijeljeni izvlačenjem terapijskog protokola iz zapečaćene koverte od osobe koja nije bila uključena u istraživanje.</s><s>Jedna osoba je sprovela sve terapijske procedure u studiji I i II u cilju standardizacije protokola i načina uzimanja uzoraka.</s><s>Uzimajući u obzir izgled i karakteristike aparata za generisanje ozona, ispitanici su kao i osoba koja je sprovela klinički dio istraživanja bili upoznati sa vrstom tretmana.</s><s>Da bi se smanjila pristrasnost, u studiji I randomizacija je izvršena neposredno poslije uzimanja prvog uzorka karijesnog dentina, odnosno poslije preparisanja kaviteta na okluzalnoj površini zuba u studiji II.</s><s>Svi uzorci su bili kodirani brojevima, a osobe koje su sprovele analize uzoraka nisu bile upoznate kojoj terapijskoj grupi uzorak pripada.</s>
<s>4.3.</s><s>KLINIČKA PROCEDURA I UZIMANJE UZORAKA Poslije primjene lokalnog anestetika (1,8ml, Scandonest 3%, Plain, Septodont, Paris, France) operativno područje je izolovano.</s><s>Sterilnim rotirajućim okruglim dijamantskim instrumentom za visokoturažnu bušilicu uz vodeno hlađenje otvoren je kavitet i/ili uklonjena podminirana gleđ.</s><s>Sterilnim rotirajućim okruglim karbidnim instrumentom za kolenjak uklonjen je karijesno promijenjeni dentin sa gleđnodentinske granice i bočnih zidova kaviteta.</s><s>Uklonjen je samo površinski dio karijesnog dentina.</s><s>Klasifikacija MATERIJAL I METODE</s>
<s>4.1.</s><s>DIZAJN STUDIJE karijesnog dentina je izvršena na osnovu vlažnosti (suv, vlažan), boje (žuta, svijetlo smeđa i tamno smeđa) i konzistencije (tvrda-tvrdoća kao i zdrav dentin, srednje tvrda, („kožasta“ konzistencija)-može da se ukloni ekskavatorom uz primjenu većeg pritiska, i meka konzistencija-lako može da se ukloni ekskavatorom) (Maltz i sar., 2002; Gu i sar., 2010).</s><s>Poslije ispiranja kaviteta sterilnom destilovanom vodom i posušivanja sterilnom vaticom, prvi uzorak dentina (S1) uzet je sa bukalne polovine karijesne lezije sterilnim karbidnim svrdlom za kolenjak veličine 3 (Kidd i sar., 1993), prethodno natopljenim u sterilni fiziološki rastvor.</s><s>Da bi se obezbijedilo uzimanje približno istih količina karijesnog dentina sa mjesta uzorokovanja, prije početka istraživanja izvršena je kalibracija istraživača na 20 zuba sa dubokim karijesom, koji nisu uključeni u istraživanje.</s><s>Težina uzoraka karijesnog dentina kretala se od 0,9 do 1,5 mg, a dobijena je kao razlika težine svrdla sa uzorkom i težine samog svrdla (Adventure TM, OHAUS, Corp., Pine Brook, NY, USA).</s><s>Uzorak dentina je prenesen u Ependorf posudu (2ml) u kojoj se nalazio 1ml tioglikolata i u roku od pola sata transportovan u mikrobiološku laboratoriju radi daljih analiza.</s><s>U prvoj, eksperimentalnoj grupi primjenjen je ozon (OZ-grupa) (ElectroMagneTron®, Biozon Mylius Company, München, Germany) pomoću CA sonde sa silikonskom kapicom na vrhu, u cilju obezbjeđivanja što intimnijeg kontakta sonde sa tretiranom površinom.</s><s>Kavitet je tretiran ozonom u trajanju od 40 sekundi i pri intenzitetu 5 (jako visoki intenzitet, intenzitet 0-5), prema preporuci proizvođača za dezinfekciju kaviteta.</s><s>Potom je uzet drugi uzorak dentina (S2) na isti način kao prvi, samo sa oralne polovine lezije.</s><s>Ovim postupkom omogućeno je da oba uzorka dentina budu uzeta sa iste dubine kaviteta (Massara i sar., 2002).</s><s>U drugoj, komparativnoj grupi, prema uputstvu proizvođača manja količina 2% hlorheksidina (HH-grupa) (Consepsis, Ultradent, South Jordan, Utah, USA) četkicom je primjenjena u kavitet u trajanju od 60 sekundi.</s><s>Poslije posušivanja kaviteta, drugi uzorak dentina je uzet na isti način kao u grupi tretiranoj ozonom.</s><s>Po uzimanju uzoraka, karijesno promijenjeno tkivo je u potpunosti uklonjeno, zubi su zaštićeni subpodlogom na bazi kalcijum hidroksida i restaurisani direktnim restaurativnim ispunima.</s><s>Ni jedan od primjenjenih antiseptika nije inaktivisan prije uzimanja drugog uzorka dentina.</s>
<s>Za lokalnu anesteziju je upotrebljen 1,8 ml 3% mepivakain (Scandonest 3%, Plain, Septodont, Paris, France), anestetik bez adrenalina, da bi se održao nivo intrapulpne cirkulacije.</s><s>Poslije primjene lokalnog anestetika, operativno područje je izolovano i očišćeno 2% hlorheksidinom.</s><s>Na okluzalnoj provršini zuba visokoturažnom bušilicom uz vodeno hlađenje formiran je kavitet u dentinu sterilnim rotirajućim okruglim i fisurnim dijamantskim instrumentima odgovarajuće veličine.</s><s>Rotirajući instrumenti su mijenjani poslije svake četvrte preparacije, da bi se spriječilo zagrijavanje zubne pulpe.</s><s>Širina preparisanog kaviteta je bila 4mm, a dubina kaviteta 2/3 debljine dentina, određena na osnovu preoperativnog retroalveolarnog radiograma i prenesena u kavitet pomoću endodontskog instrumenta sa graničnikom.</s><s>U grupi tretiranoj ozonom (ElectroMagneTron®, Biozon Mylius Company, München, Germany) kavitet je izložen djelovanju gasnog ozona u trajanju od 40 sekundi pri intenzitetu 5 (jako visoki intenzitet, intenzitet 0-5), prema preporuci proizvođača za dezinfekciju kaviteta, uz korišćenje CA sonde sa silikonskom kapicom na vrhu (u cilju obezbjeđivanja što intimnijeg kontakta sonde sa kavitetom).</s><s>U kontrolnoj grupi u kavitet je postavljena sterilna vatica natopljena fiziološkim rastvorom.</s><s>Trepanacija pulpne komore u obje grupe je urađena sterilnim okruglim i fisurnim dijamantskim rotirajućim instrumentima za visokoturažnu bušilicu MATERIJAL I METODE</s>
<s>4.1.</s><s>DIZAJN STUDIJE uz vodeno hlađenje.</s><s>Poslije pažljivog uklanjanja krova komore pulpe, pristupni kavitet je ispran fiziološkim rastvorom da se uklone ostaci dentina.</s><s>Pulpa je iz komore uklonjena sterilnim pulpekstirpatorom odgovarajuće veličine i prenijeta u Ependorf posude (2ml) kojima je prethodno određena težina.</s><s>Epruvete sa tkivom su opet izmjerene, zamrznute u tečnom azotu i čuvane na temperaturi od -80°C do daljih analiza.</s><s>Poslije uzimanja uzorka zubi su ili ekstrahovani ili je nastavljeno endodontsko liječenje prema standardnoj proceduri.</s><s>Mjerenje težine je obavljeno na Adventure TM digitalnoj vagi (OHAUS, Corp., Pine Brook, NY, USA).</s><s>Težina uzorka određena je kao razlika težine Ependorf posude sa uzorkom i prazne Ependorf posude.</s>
<s>Uzorci karijesnog dentina su vorteksirani u trajanju od 30 sekundi i razblaženi u sterilnom fiziološkom rastvoru.</s><s>Po 0,1 ml nerazblaženog i razblaženog uzorka, razblaženja do 10-6, zasijano je na različitim hranjivim podlogama.</s><s>Za izolaciju Lactobacillus spp. korišćen je Man, Rogosa i Sharpe agar (MRS) (Difco Laboratories, Teddington, Middlesex, UK).</s><s>Za izolaciju bakterija Streptococcus spp. korišćen je Mitis Salivarius agar (MSA) sa dodatkom sterilnog 1% kalijum telurita (Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland).</s><s>Ukupan broj bakterija je određen na krvnom agaru sa dodatkom 5% ovčije krvi (Brain heart infusion agar).</s><s>Sve podloge su inkubirane u uslovima sa 10% C02 na temperaturi od 37°C u periodu od 48h (Lima i sar., 2009).</s><s>Krvni agar je inkubiran i u aerobnim uslovima na temperaturi od 37°C u periodu od 48h radi određivanja ukupnog broja aerobnih bakterija.</s><s>Prisustvo Lactobacillus spp. i Streptococcus spp. na hranjivim podlogama potvrđeno je na osnovu makroskopskog izgleda kolonija, bojenja po Gramu i biohemijskih testova.</s><s>Broj bakterijskih kolonija (engl.</s><s>Colony forming units (CFU)) određen je makroskopski, na hranjivoj podlozi sa određenim razblaženjem na kojoj se nalazilo između 20-300 bakterijskih kolonija, i izražen je po mililitru uzorka (CFU/ml).</s><s>4.4.2.</s><s>Identifikacija različitih vrsta Lactobacillus spp. biohemijskim testom Identifikacija Lactobacillus spp. do nivoa vrste urađena je pomoću biohemijskog testa API 50 CH (bioMérieux, Inc., Lyon, France) koji se bazira na fermentaciji 49 različitih ugljenih hidrata.</s><s>Postupak je sproveden u potpunosti prema uputstvu proizvođača.</s><s>Sterilnim brisom kolonije Lactobacillus spp. različitog izgleda uzete su sa MRS podloge i rastvorene u sterilnom 0,85% rastvoru NaCl dok se nije dobila zamućenost rastvora koja odgovara 2McFarland standardu (Densichek™. bioMérieux, Inc., Lyon, France), a zatim je rastvor dodat API CHL medijumu.</s><s>Poslije homogenizacije, bakterijski rastvor je inokulisan u 50 epruveta na API 50 CH trakama, vodeći računa da u epruvetama ne zaostanu mjehurići vazduha.</s><s>Epruvete su zatim prekrivene mineralnim uljem i inkubirane u aerobnim uslovima na temperaturi od 36°C±2°C. Rezultati su očitani poslije 48h. Pozitivan test odgovara promjeni ljubičaste boje bromokrezola u žuto, osim za eculin test (epruveta broj 25) gdje se boja mijenja u crno.</s><s>Promjena boje je posljedica oksidacije i stvaranja kiseline u anaerobnim uslovima koja djeluje na pH indikator koji se nalazi u epruveti.</s><s>Epruveta MATERIJAL I METODE</s>
<s>kultivisanja pod rednim brojem 1. predstavlja negativnu kontrolu i u njoj se ne nalazi niti jedan aktivni sastojak.</s><s>Nalaz testova je zabilježen na papirnim šemama i konačan biohemijski profil je određen na osnovu identifikacionog softvera apiwebTM (bioMérieux, Inc., Lyon, France).</s><s>Mikrobiološka analiza uzoraka kultivisanjem i biohemijska identifikacija Lactobacillus spp. do nivoa vrste sprovedena je u Službi za medicinsku mikrobiologiju sa parazitologijom i virusologijom Univerzitetske bolnice u Foči, Republika Srpska.</s>
<s>Lančana reakcija polimeraze (PCR) predstavlja in vitro reakciju umnožavanja unaprijed poznatog segmenta DNK, primjenom dizajniranih prajmera, nukleotida i termostabilne Taq-polimeraze u prisustvu jona Mg2+.</s><s>Milionsko umnožavanje ciljne sekvence DNK ograničene prajmerima omogućena je smjenom tri procesa koji se odvijaju na različitim temperaturama (denaturacija, 94-95°C; hibridizacija, 50-60°C i elongacija, 72°C) u određenim vremenskim intervalima, kroz niz ponovljenih ciklusa, od 35-40.</s><s>Za razliku od klasične PCR reakcije, gde se prisustvo specifične ciljne sekvence dokazuje kada je reakcija ušla u plato fazu, kod „real-time“ lančane reakcije polimeraze (qPCR) softverski se prati prinos amplifikacije kroz cikluse, putem detekcije fluorescentih signala koji emituju fluorescentne boje, koje se vezuju za PCR produkte.</s><s>Za procjenu zastupljenosti bakterija putem qPCR u ovom istraživanju korišćeni su odgovarajući referentni sojevi kao standardi (serija različitih razblaženja DNK).</s><s>Kvantitativna analiza ukupnog broja anaerobnih bakterija izražena je u broju kopija gena za 16S rRNK po miligramu uzorka (genska kopija/mg).</s><s>U kompleksnoj bakterijskoj populaciji nije moguće procijeniti broj ćelija putem qPCR jer različite bakterijske vrste posjeduju različit broj vezanih gena za rRNK (operoni, od 1 do 15) (Vianna i sar., 2006).</s><s>Za izolaciju totalne bakterijske DNK (Gram pozitivne i Gram negativne anaerobne bakterije) iz uzorka dentina korišćen je komercijalni kit „Qiamp DNA Mini Kit“ (Qiagen, Hilden, Germany).</s><s>Nakon primjenjenog protokola za izolaciju bakterijska DNK je rastvorena u 100 μl pufera za eluciju.</s><s>Prajmeri koji su korišćeni za detekciju genoma svih anaerobnih bakterijskih vrsta hibridizuju sa visoko konzerviranom sekvencom gena za 16S rRNK (rDNK geni), a koja odgovara poziciji 331-797bp kod Escherichia coli (tabela 1.) (Nadkarni i sar., 2002).</s><s>Amplifikacija date ciljne sekvence u okviru gena za 16S RNK prethodno je dokazana klasičnom PCR reakcijom dok je specifičnost PCR produkta veličine 466bp. provjerena na 8% poliakrilamidnom gelu (PAA).</s><s>Primjenom komercijalnog kita "Luminaris Color HiGreen qPCR Master Mix" (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) qPCR reakcija je praćena na „Line-Gene“ PCR aparatu (Bioer Technology Co.,Ltd, Tokyo, Japan).</s><s>Reakcionu smješu u volumenu od 20 μl za qPCR reakciju činile su sljedeće komponente: 10 μl 2X SYBR Green Master Mix, 0,25 μM prajmera-EuF, EuR (po 1 μl), 6 μl H2O i 2 μl uzorka DNK izolovane iz dentina.</s><s>Temperaturni profil reakcije prikazan je u tabeli 1. Za provjeru specifičnosti qPCR reakcije nakon amplifikacije, reakcija je bila podvrgnuta temperaturnom opsegu od 72 do 95°C, koji dovodi do denaturacije produkta od 466bp na određenoj temperaturi (82°C) u svim uzorcima.</s><s>Svaki uzorak je analiziran u duplikatu.</s>
<s>Kao referentni soj za dobijanje standardne krive korišćena je bakterija Prevotella melaninogenica (ATCC 25845).</s><s>Na osnovu baze podataka (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome) veličina genoma P. melaninogenica iznosi 3,17Mb (3,17·106 baza), a što konverzijom u težinu iznosi 3,24fg (težina jedne kopije genoma).</s><s>Konverzija je urađena na osnovu formule: DNA težina (pg) = veličina genoma (bp)·1,023 E-9 (Dolezel i sar., 2003).</s><s>Za procjenu broja kopija gena za rRNK u svaku qPCR reakciju pored uzoraka koji su analizirani bila je uključena i serija standarda (DNK P. melaninogenica) sa faktorom razblaženja od 10X. Pošto 3,24fg DNK vrste P. melaninogenica predstavlja jednu ćeliju (jedna kopija bakterijskog genoma), a poznato je da različite vrste Prevotella spp. imaju maksimalno 2 rDNK operona (grupe gena za rRNK), napravljena je serija razblaženja za standard od 32,4fg DNA (20 gena za rDNA) do 32,4ng DNA (2·107 gena za rDNA).</s><s>Kvantitativni podaci su dobijeni primjenom „Line Gene K“ programa (Bioer Technology Co.,Ltd, Tokyo, Japan).</s><s>U svakom analiziranom uzorku dentina određen je broj genskih kopija poređenjem sa brojem genskih kopija standardne krive, odnosno putem putem očitavanja korelacije između Ct vrednosti (vrijeme kada reakcija ulazi u eksponencijalni rast) i broja genskih kopija.</s><s>Tabela 1. PCR prajmeri i temperaturni profili za identifikaciju ukupnog broja anaerobnih bakterija, Lactobacillus spp. i vrste Lactobacillus casei/paracasei metodama qPCR i PCR Prajmer</s>
<s>Po istom principu kao za ukupan broj anaerobnih bakterija, u karijesnom dentinu analizirana je zastupljenost svih bakterija Lactobacillus spp..</s><s>Broj različitih vrsta roda Lactobacillus spp. izražen je u broju ćelija, odnosno genskih kopija po miligramu uzorka (genska kopija/mg) (sve vrste imaju isti broj gena za rRNK) (Byun i sar., 2004).</s><s>Kao referentni soj za kvantitativnu analizu bakterija Lactobacillus spp. korišćena je vrsta L. casei (ATCC 393).</s><s>Prema podacima o sekvenci genoma prosječna veličina DNK svih vrsta Lactobacillus spp. pronađenih u usnoj duplji je 2,2Mb, a primjenom odgovarajuće formule izračunata je težina jednog genoma (1 ćelija) koji ima vrijednost 2,3fg DNK (Byun i sar., 2004).</s><s>Serija standarda koja je korišćena u qPCR reakciji za kvantifikaciju ukupnog broja Lactobacillus spp. predstavljala je seriju razblaženja L. casei od 230fg DNK (102 ćelija) do 2,3ng DNK (106 ćelija).</s><s>U svakoj PCR reakciji pored uzoraka DNK iz dentina korišćeni su i standardi različite koncentracije sa ciljem da se odredi broj kopija genoma koji je u direktoj korelaciji sa brojem ćelija.</s><s>Prije qPCR, za dokazivanje prisustva genoma MATERIJAL I METODE</s>
<s>Lactobacillus spp. od oko 230bp korišćena je klasična PCR reakcija.</s><s>Sekvence prajmera i temperaturni profil za detekciju ukupnog broja Lactobacillus spp. dati su u tabeli 1. Reakciona smeša za qPCR reakciju je bila identična recepturi navedenoj za kvantifikaciju ukupnog broja anaerobnih bakterija.</s><s>Specifičnost reakcije je dodatno potvrđena na osnovu krive topljenja PCR produkata od 230bp.</s><s>4.4.4.</s><s>Određivanje učestalosti vrste Lactobacillus casei/paracasei lančanom reakcijom polimeraze (PCR)</s>
<s>Primjenom klasičnog PCR određena je zastupljenosti vrste Lactobacillus casei/paracasei u uzorcima karijesnog dentina.</s><s>Prajmeri specifične sekvence u temperaturnim uslovima, navedenim u tabeli 1., dovode do sinteze PCR produkata dužine 117bp.</s><s>U svakoj PCR reakciji paralelno sa testiranim uzorcima korišćena je pozitivna (referentni soj) i negativna kontrola (voda) sa ciljem da se izbjegnu lažno negativni i lažno pozitivni rezultati.</s><s>Za reakciju amplifikacije korišćen je „PCR Master Mix“ (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) i to 10 μl, po 1 μl LcaseF i LcaseR prajmera, 6 μl H2O i 2 μl uzorka DNK izolovane iz dentina.</s><s>Putem elektroforeze na 8% PAA gelu provjereno je prisustvo specifičnog amplifikata od 117bp.</s><s>Vizuelizacija PCR produkata izvršena je putem bojenja sa etidijum bromidom.</s><s>Mikrobiološka analiza uzoraka metodama qPCR i PCR je sprovedena na Institutu za humanu genetiku, Stomatološkog fakulteta Univerziteta u Beogradu, Republika Srbija.</s><s>4.5.</s><s>KVANTIFIKACIJA VEGF I SOD U ZUBNOJ PULPI 4.5.1.</s><s>Priprema uzoraka</s>
<s>Nakon odmrzavanja, u Ependorf posude sa uzorkom unijeta je određena količina pufera za lizu tkiva (20ml/1g tkiva; CellLytic MT, Sigma Aldrich, Buchs, Switzerland) i uzorak je mašinski homogenizovan na temperaturi od 4°C. Lizat je zatim centrifugiran na 12000-20000xg u trajanju od 10 minuta u mikrocentrifugi Heraeus* Biofuge Primo R (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).</s><s>Izdvojeni supernatant za svaki uzorak je zatim podijeljen u dvije Ependorf posude, alikot za analizu nivoa VEGF i alikot za analizu nivoa SOD. Supernatanti su čuvani na -20°C do daljih analiza.</s><s>4.5.2.</s><s>Određivanje nivoa VEGF u zubnoj pulpi imunoesejskom tehnikom Kvantitativno određivanje nivoa VEGF u pulpi sprovedeno je sendvič ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) imunoesejskom tehnikom uz korišćenje komercijalnog kompleta „Human VEGF ELISA Kit“ (Sigma Aldrich, Buchs, Switzerland) za ćelijski i tkivni lizat.</s><s>Postupak je sproveden u potpunosti prema uputstvu proizvođača.</s><s>U svaku od 96 reakcionih komora na mikrotitracionoj pločici ubačeno je po 100 μl standarda ili uzorka.</s><s>Poslije inkubacije od 2 sata i 30 minuta na sobnoj temperaturi i ispiranja reakcionih komora uliveno je po 100 μl pripemljenog biotin antitijela i pločica je ponovo inkubirana na sobnoj temperaturi uz lagano miješanje u trajanju od jednog sata.</s><s>Poslije ispiranja reakcionih komora dodato je u svaku od njih 100 μl pripremljenog rastvora streptavidina i ponovljena je inkubacija u trajanju MATERIJAL I METODE</s>
<s>40 ciklusa od 45 minuta na sobnoj temperaturi uz lagano miješanje.</s><s>Zatim je ponovljen postupak ispiranja i dodat je rastvor peroksidaznog supstrata 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (100 μl).</s><s>Poslije inkubacije od 30 minuta na sobnoj temperaturi uz lagano miješanje bez prisustva svjetlosti, dodato je u svaku od komora 50 μl rastvora 0,2 M sumporne kiseline za prekidanje enzimske reakcije, pri čemu se boja reakcionih rastvora mijenjala iz različitih inteziteta plave boje u žutu boju različitih inteziteta.</s><s>Odmah zatim je izvršeno očitavanje optičkih gustina rastvora na aparatu Multiskan EX (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).</s><s>Korišćenjem programa Sigma Plot 12 (SyStat Software Inc, IL, USA) određena je formula standardne krive na osnovu optičkih gustina faktora rasta poznatih koncentracija.</s><s>Za svaki uzorak i standard su sprovedena mjerenja u duplikatu i krajnja koncentracija uzorka i standarda je izračunata kao njihova srednja vrijednost.</s><s>Nivo VEGF prikazan je po jedinici zapremine (pg/ml).</s><s>4.5.3.</s><s>Određivanje nivoa SOD u zubnoj pulpi spektrofotometrijskom metodom Aktivnost SOD je određena spektrofotometrijskom metodom pomoću „SOD Assay Kit-WST“ (Sigma Aldrich, Buchs, Switzerland).</s><s>Postupak je sproveden u potpunosti prema uputstvu proizvođača.</s><s>U unaprijed određene reakcione komore na mikrotitracionoj pločici aplikovano je po 20 μl uzorka (komore označene kao „sample“ i „blank 2“) i 20 μl dvostruko destilovane vode (komore „blank 1“ i „blank 3“).</s><s>Zatim je u svaku od komora dodato 200 μl rastvora tetrazolijumske soli (2-(4-lodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolijum, mononatrijumska so).</s><s>U sljedećem koraku po 20 μl pufera je dodato u komore označene kao „blank 2“ i „blank 3“ i po 20 μl enzimskog rastvora u komore označene kao „sample“ i „blank 1“.</s><s>Pločica je inkubirana na temperaturi od 37°C u trajanju od 20 minuta.</s><s>SOD aktivnost je određena kao procenat inhibicije stvaranja boje WAST-1 formazana (2-(4-lodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolijum, mononatrijumska so) na aparatu Multiskan EX (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) pri absorbansi od 440nm.</s><s>Aktivnost SOD (% inhibicije) je izračunata matematički prema sljedećoj formuli:</s>
<s>Statistička obrada podataka je urađena u SPSS programu 19.0 (IBM SPSS Statistics for Windows, Version 19.0.</s><s>Armonk, NY: IBM Corp, USA).</s><s>Rezultati su prikazani kao srednje vrijednosti i standardne devijacije (SD) za numerička i učestalosti za atributivna obilježja.</s><s>Izvršeno je testiranje normalnosti raspodjele u studiji I (Kolmogorov-Smirnovljev test) i dobijeno je da godine imaju normalnu raspodjelu (KolmogorovSmirnovljev test, p>0,05) dok broj bakterija nije pratio normalnu raspodjelu (Kolmogorov-Smirnovljev test, p<0,05).</s><s>Razlike u karakteristikama ispitanika i uzorka između grupa određene su t-testom za dva nezavisna uzorka (godine) i hi-kvadrat testom (pol, kliničke karakteristike uzorka).</s><s>Za ispitivanje antibakterijskog efekta antiseptika primijenjeni su MekNemarov test za atributivna i Vilkoksonov test MATERIJAL I METODE</s>
<s>40 ciklusa ekvivalentnih parova za numerička obilježja.</s><s>Za komparativnu analizu antibakterijskog efekta ozona i hlorheksidina primjenjeni su hi-kvadrat test za atributivna i Man-Vitnijev test za numerička obilježja.</s><s>Poveznost kliničkih karakteristika lezije i broja bakterija određena je primjenom Spirmanovog koeficijenta korelacije.</s><s>U studiji II podaci su pratili normalnu raspodjelu (Kolmogorov-Smirnovljev test, p>0,05), te su za ispitivanje razlika između grupa primjenjeni t-test za dva nezavisna uzorka za numerička (godine, nivo VEGF i SOD) i hi-kvadrat test za atributivna obilježja (pol).</s><s>Vrijednosti p<0,05 su smatrane statistički značajnim u svim analizama.</s>
<s>5.1.</s><s>KARAKTERISTIKE ISPITANIKA I KARIJESNOG UZORKA Dijagram 1. predstavlja tok odabira ispitanika i formiranje istraživačkih grupa.</s><s>Od 72 pregledane osobe, 24 njih je isključeno iz daljeg istraživanja jer nisu ispunile kriterijume za uključivanje u studiju (n=18), jer su odbile da učestvuju (n=4) ili su isključene zbog drugih razloga (n=2).</s><s>U istraživanje je uključeno ukupno 48 osoba koje su metodom slučajnog uzorka podijeljene u dvije grupe, eksperimentalnu, gdje je kao antiseptik korišćen ozon (OZ-grupa) i komparativnu, gdje je kao antiseptik korišćen hlorheksidin (HHgrupa).</s><s>Kod svih ispitanika eksperimentalni protokol je sproveden u jednoj posjeti i svi uzorci karijesnog dentina su analizirani.</s><s>Prilikom izvođenja terapijskog postupka nisu zabilježeni neželjeni efekti.</s><s>U tabeli 2. prikazane su demografske karakteristike ispitanika i kliničke karakteristike uzorka u grupi tretiranoj ozonom i grupi tretiranoj hlorheksidinom.</s><s>Grupu gdje je za dezinfekciju kaviteta korišćen ozon sačinjavalo je po 12 žena i muškaraca, starosti od 20-48 godina, a grupu gdje je korišćen hlorheksidin sačinjavalo je 10 žena i 14 muškaraca starosti od 19-40 godina.</s><s>Između ove dvije terapijske grupe nije zabilježena značajna razlika u pogledu pola i starosne strukture (p>0,05).</s><s>Uzorak su sačinjavali 14 premolara i 10 molara u grupi gdje je korišćen ozon, odnosno 15 premolara i 9 molara u grupi gdje je primjenjen hlorheksidin.</s><s>Karijesna lezija je bila lokalizovana kod oko 58,3% zuba na okluzalnoj, odnosno kod oko 41,7% zuba na okluzalnoj i aproksimalnoj površini zuba u grupi gdje je korišćen ozon, dok je u grupi gdje je primjenjen hlorheksidin kod 66,7% zuba lezija lokalizovana samo na okluzalnoj, a kod 33,3% zuba je zahvatila i aproksimalnu površinu zuba.</s><s>Nije uočena značajna razlika u zastupljenosti zuba u odnosu na morfološku grupu i lokalizaciji karijesa između dvije grupe (p>0,05).</s>
<s>Tabela 2. Demografske karakteristike ispitanika i kliničke karakteristike uzorka u grupi tretiranoj ozonom (OZ-grupa) i grupi tretiranoj hlorheksidinom (HH-grupa) Karakteristike</s>
<s>U tabeli 3. su prikazane karakteristike karijesnog dentina u eksperimentalnoj i komparativnoj grupi.</s><s>U grupi tretiranoj ozonom kod najvećeg broja kaviteta karijesne mase su okarakterisane kao vlažne (66,7%), srednje-tvrde (kožaste) konzistencije (50%) i svijetlo smeđe boje (41,7%).</s><s>U grupi gdje je primjenjen hlorheksidin u najvećem broju slučajeva karijes je ocijenjen kao vlažan (62,5%), meke konzistencije (29,2%).</s><s>Nije zabilježena značajna razlika u pogledu ispitivanih kliničkih karakteristika karijesnog dentina Tabela 3. Karakteristike karijesnog dentina u grupi tretiranoj ozonom (OZ-grupa) i grupi tretiranoj hlorheksidinom (HH-grupa)</s>
<s>5.2.1.1.</s><s>Broj kaviteta sa aerobnim bakterijama Prije primjene oba antiseptika, kako ozona tako i hlorheksidina, iz svih kaviteta izolovane su aerobne bakterije.</s><s>Aerobne bakterije su izolovane i iz svih kaviteta poslije primjene ozona, dok poslije primjene hlorheksidina aerobne bakterije nisu izolovane iz 12,5% kaviteta.</s><s>Smanjenje broja kaviteta iz kojih su izolovane aerobne bakterije nije bilo statistički značajno ni u jednoj od grupa (p>0,05) (tabela 4.).</s><s>Tabela 4. Broj kaviteta u kojima je zabilježeno prisustvo aerobnih bakterija prije (S1) i poslije (S2) primjene antiseptika u grupi tretiranoj ozonom (OZ-grupa) i grupi tretiranoj hlorheksidinom (HHgrupa)</s>
<s>5.2.1.2.</s><s>Prosječan broj aerobnih bakterija Prosječan broj aerobnih bakterija izolovanih iz karijesnog dentina prije i poslije dezinfekcije kaviteta prikazan je u tabeli 5. U kavitetima koji su tretirani ozonom prosječan broj aerobnih bakterija je iznosio oko 1,0·105 CFU/ml prije primjene ozona, dok je poslije primjene taj broj smanjen na 2,1·104 CFU/ml (p<0,0001).</s><s>Poslije primjene hlorheksidina prosječan broj aerobnih bakterija je značajno smanjen sa REZULTATI</s>
<s>Tabela 5. Prosječan broj aerobnih bakterija prije (S1) i poslije (S2) primjene antiseptika u grupi tretiranoj ozonom (OZ-grupa) i grupi tretiranoj hlorheksidinom (HH-grupa) Tretman</s>
<s>5.2.1.3.</s><s>Broj kaviteta sa anaerobnim bakterijama U svim netretiranim uzorcima karijesnog dentina izolovane su anaerobne bakterije.</s><s>Ozon je doveo do eliminacije anaerobnih bakterija iz 4,2% kaviteta dok hlorheksidin iz 16,7% kaviteta.</s><s>Ni jedan od primjenjenih antiseptika nije doveo do značajnog smanjenja broja kaviteta sa anaerobnim bakterijama Tabela 6. Broj kaviteta u kojima je zabilježeno prisustvo anaerobnih bakterija prije (S1) i poslije (S2) primjene antiseptika u grupi tretiranoj ozonom (OZ-grupa) i grupi tretiranoj hlorheksidinom (HHgrupa)</s>
<s>5.2.1.4.</s><s>Prosječan broj anaerobnih bakterija U tabeli 7. je prikazan ukupan broj anaerobnih bakterija koje su izolovane iz karijesnih kaviteta prije i poslije dezinfekcije kaviteta.</s><s>U uzorcima dentina prije primjene ozona prosječan broj anaerobnih bakterija je iznosio oko 1,1·105 CFU/ml dok je poslije primjene taj broj značajno smanjen na 2,7·104 CFU/ml (p<0,0001).</s><s>U komparativnoj grupi, prosječan broj anaerobnih bakterija je poslije primjene hlorheksidina Tabela 7. Prosječan broj anaerobnih bakterija prije (S1) i poslije (S2) primjene antiseptika u grupi tretiranoj ozonom (OZ-grupa) i grupi tretiranoj hlorheksidinom (HH-grupa) Tretman</s>
<s>5.2.2.1.</s><s>Broj kaviteta sa Lactobacillus spp.</s><s>U grupi gdje je korišćen ozon Lactobacillus spp. su izolovane iz 75,0% kaviteta prije i iz 66,7% kaviteta poslije primjene lijeka.</s><s>U grupi gdje je primjenjen hlorheksidin, u inicijalnim uzorcima karijesa izolovane su Lactobacillus spp. iz 45,8% kaviteta, a poslije tretiranja kaviteta antiseptikom taj broj je smanjen na 25%.</s><s>Ni u jednoj od ispitivanih grupa antiseptik nije doveo do značajnog smanjenja broja kaviteta sa Lactobacillus spp. (p>0,05), ali značajno smanjenje je zabilježeno na nivou cijelog uzorka (p=0,016) (tabela REZULTATI</s>
<s>Tabela 8. Broj kaviteta u kojima je zabilježeno prisustvo Lactobacillus spp. prije (S1) i poslije (S2) primjene antiseptika u grupi tretiranoj ozonom (OZ-grupa) i grupi tretiranoj hlorheksidinom (HHgrupa)</s>
<s>5.2.2.2.</s><s>Prosječan broj Lactobacillus spp.</s><s>U tabeli 9. prikazan je prosječan broj bakterija Lactobacillus spp. u karijesnom dentinu prije i poslije primjene antiseptika u eksperimentalnoj i komparativnoj grupi.</s><s>Prosječan broj bakterija je značajno snižen sa 2,0·104 CFU/ml na 3,2·103 CFU/ml poslije primjene ozona (p<0,0001).</s><s>Tretiranje karijesnog kaviteta hlorheksidinom dovelo je do značajnog smanjenja prosječnog broja Lactobacillus spp. sa početnih 2,7·104 CFU/ml na 4,9·103 CFU/ml poslije primjene antiseptika (p=0,003).</s><s>Tabela 9. Prosječan broj Lactobacillus spp. prije (S1) i poslije (S2) primjene antiseptika u grupi tretiranoj ozonom (OZ-grupa) i grupi tretiranoj hlorheksidinom (HH-grupa) Tretman</s>
<s>5.2.2.3.</s><s>Učestalost pojedinih vrsta Lactobacillus spp.</s><s>Pomoću biohemijskog testa API 50 CH prije primjene ozona iz 18 kaviteta izolovano je 14 različitih vrsta Lactobacillus spp., najčešće između jedne i dvije različite vrste po uzorku (83,3%).</s><s>Najčešće su izolovani Lactobacillus brevis 1 (38,9%), Lactobacillus plantarum 1 (27,8%) Lactobacillus fermentum 1 (22,2%), Lactobacillus rhamnosus (16,7%), Lactobacillus acidophilus 1 (11,1%), Lactobacillus acidophilus 2 (11,1%) i Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii (11,1%), dok je učestalost ostalih vrsta bila manja od 10%.</s><s>Poslije primjene ozona Lactobacillus spp. su izolovane iz 14 kaviteta.</s><s>Izolovane su sve vrste Lactobacillus spp. koje su izolovane i prije primjene antiseptika, ali u nešto manjem procentu, osim Lactobacillus brevis 3, Lactobacillus fermentum 2 i Lactobacillus plantarum 2 koje nisu nađene (p>0,05) (tabela 10.).</s><s>U grupi gdje je korišćen hlorheksidin iz 11 karijesnih kaviteta, iz kojih su izolovane Lactobacillus spp., API 50 CH biohemijskim testom izolovano je 8 različitih vrsta.</s><s>U najvećem broju kaviteta nalazile su se između jedne i dvije vrste (72,7%), a najviše tri.</s><s>Najčešće izolovane vrste su bile Lactobacillus paracasei ssp. (18,2%).</s><s>Izlaganje karijesnog kaviteta djelovanju hlorheksidina dovelo je do smanjenja broja kaviteta sa Lactobacillus spp. i učestalost pojedinih vrsta, dok vrste L. plantarum 1, Lactobacillus paracasei ssp. paracasei 2 i Lactobacillus salivarius koje su nađene u inicijalnim uzorcima nisu izolovane (p>0,05) (tabela REZULTATI</s>
<s>Tabela 10.</s><s>Učestalost pojedinih vrsta Lactobacillus spp. prije (S1) i poslije (S2) primjene ozona (OZ-grupa) Učestalost pojedinih vrsta Lactobacillus spp. (ukupan broj pozitivnih uzoraka 18)</s>
<s>Tabela 11.</s><s>Učestalost pojedinih vrsta Lactobacillus spp. prije (S1) i poslije (S2) primjene hlorheksidina Učestalost pojedinih vrsta Lactobacillus spp. (ukupan broj pozitivnih uzoraka 11)</s>
<s>U cjelokupnom uzorku na početku istraživanja iz 29 kaviteta izolovano je 17 različitih vrsta Lactobacillus spp., u najvećem broju između jedne i dvije vrste po uzorku (79,3%).</s><s>Najčešće su izolovane L. brevis 1 kaviteta antiseptikom, zabilježeno je smanjenje broja kaviteta iz kojih su izolovane Lactobacillus spp. (45,8%) i učestalost pojedinih vrsta, dok vrste L. brevis 3, L. fermentum 2, L. plantarum 2, L. paracasei ssp. paracasei 2, izolovane prije dezinfekcije, nisu nađene.</s>
<s>5.2.3.1.</s><s>Broj kaviteta sa Streptococcus spp.</s><s>U svim uzorcima karijesnog dentina u grupi gdje je korišćen ozon izolovane su Streptococcus spp. prije tretiranja kaviteta antiseptikom.</s><s>Poslije primjene ozona došlo je do eliminacije ove bakterijske vrste u samo jednom uzorku (p>0,05).</s><s>U komparativnoj grupi, Streptococcus spp. su izolovane iz 95,8% kaviteta prije i iz 50% kaviteta poslije primjene hlorheksidina.</s><s>Ovo smanjenje broja kaviteta u grupi tretiranoj hlorheksidinom je bilo statistički značajno (p=0,001) (tabela 12.).</s><s>Tabela 12.</s><s>Broj kaviteta u kojima je zabilježeno prisustvo Streptococcus spp. prije (S1) i poslije (S2) primjene antiseptika u grupi tretiranoj ozonom (OZ-grupa) i grupi tretiranoj hlorheksidinom (HHgrupa)</s>
<s>5.2.3.2.</s><s>Prosječan broj Streptococcus spp.</s><s>Prosječan broj Streptococcus spp. je značajno snižen sa 5,8·104 CFU/ml prije primjene ozona na 1,3·104 CFU/ml poslije primjene (p<0,0001).</s><s>Značajno smanjenje prosječnog broja Streptococcus spp. sa početnih 5,8·104 CFU/ml na 1,2·104 CFU/ml zabilježeno je poslije tretiranja karijesnog kaviteta hlorheksidinom REZULTATI</s>
<s>Tabela 13.</s><s>Prosječan broj Streptococcus spp. prije (S1) i poslije (S2) primjene antiseptika u grupi tretiranoj ozonom (OZ-grupa) i grupi tretiranoj hlorheksidinom (HH-grupa) Tretman</s>
<s>U tabeli 14. prikazana je povezanost kliničkih karakteristika karijesnih lezija (vlažnost, konzistencija i boja karijesnog tkiva) i prosječnog broja Lactobacillus spp. i Streptococcus spp..</s><s>Vlažnost, konzistencija i boja karijesnog dentina su međusobno značajno povezani (svi p<0,0001).</s><s>Vlažan karijesni dentin je povezan sa svjetlijom bojom tkiva i mekšom konzistencijom, a karijes koji je okarakterisan kao suv tamnije je boje i tvrđe je konzistencije.</s><s>Veća kolonizacija karijesnih kaviteta Lactobacillus spp. zabilježena je kod lezija sa vlažnim karijesnim masama (p=0,033), a veći broj Streptococcus spp. je zabilježen kod lezija tamnije boje REZULTATI</s>
<s>5.2.5.1.</s><s>Poređenje broja kaviteta pozitivnih na aerobne bakterije, anaerobne bakterije, Lactobacillus spp. i Streptococcus spp. prije primjene antiseptika Poređenje broja kaviteta pozitivnih na aerobne bakterije, anaerobne bakterije i Lactobacillus spp. i Streptococcus spp. prije primjene antiseptika između terapijskih grupa prikazano je na grafikonu 1. Broj kaviteta iz kojih su izolovane aerobne i anaerobne bakterije je bio isti u obje grupe, dok je broj kaviteta pozitivnih na Lactobacillus spp. i Streptococcus spp. bio nešto veći u eksperimentalnoj u odnosu na komparativnu grupu, ali ta razlika nije bila značajna (p>0,05).</s>
<s>Grafikon 1. Poređenje broja kaviteta u kojima je zabilježeno prisustvo aerobnih bakterija, anaerobnih bakterija, Lactobacillus spp. i Streptococcus spp. prije primjene antiseptika (S1) između grupe tretirane ozonom (OZ-grupa) i grupe tretirane hlorheksidinom (HH-grupa) Hi-kvadrat test</s>
<s>5.2.5.2.</s><s>Poređenje prosječnog broja aerobnih bakterija, anaerobnih bakterija, Lactobacillus spp. i Streptococcus spp. prije primjene antiseptika U grupi tretiranoj ozonom prosječan broj aerobnih bakterija je bio veći, a broj anaerobnih bakterija i Lactobacillus spp. manji u odnosu na komparativnu grupu, ali ta razlika nije bila značajna (p>0,05).</s><s>U obje grupe na početku terapije broj Streptococcus spp. je bio približno isti (grafikon 2.).</s>
<s>Grafikon 2. Poređenje prosječnog broja (±SD) aerobnih bakterija, anaerobnih bakterija, Lactobacillus spp. i Streptococcus spp. prije primjene antiseptika (S1) između grupe tretirane ozonom (OZ-grupa) i grupe tretirane hlorheksidinom (HH-grupa)</s>
<s>Grafikon 3. prikazuje odnos pojedinih vrsta Lactobacillus spp. u karijesnim lezijama na početku liječenja između grupe tretirane ozonom i grupe tretirane hlorheksidinom.</s><s>L. acidophilus 1, L. brevis 1, L. plantarum 1, L. rhamnosus i L. salivarius su izolovani u obje grupe, dok su ostale vrste izolovane ili u grupi tretiranoj ozonom ili u grupi tretiranoj hlorheksidinom.</s><s>Značajna razlika je zabilježena u učestalosti L. paracasei ssp. paracasei 1 (p=0,001) i L. paracasei ssp. paracasei 3 (p=0,014), koji su izolovani samo u grupi tretiranoj hlorheksidinom.</s>
<s>Grafikon 3. Poređenje učestalosti pojedinih vrsta Lactobacillus spp. prije primjene antiseptika (S1) između grupe tretirane ozonom (OZ-grupa) i grupe tretirane hlorheksidinom (HH-grupa) 5.2.5.4.</s><s>Poređenje broja kaviteta pozitivnih na aerobne bakterije, anaerobne bakterije, Lactobacillus spp. i Streptococcus spp. poslije primjene antiseptika Poređenje broja kaviteta iz kojih su izolovane aerobne bakterije, anaerobne bakterije, Lactobacillus spp. i Streptococcus spp. između grupa poslije dezinfekcije prikazano je na grafikonu 4. U grupi tretiranoj ozonom broj kaviteta iz kojih su izolovane aerobne i anaerobne bakterije, Lactobacillus spp. i Streptococcus spp. je bio veći u odnosu na komparativnu grupu, pri čemu je značajna razlika zabilježena za broj kaviteta pozitivnih na Lactobacillus spp. i Streptococcus spp. (oba p=0,041).</s>
<s>Grafikon 4. Poređenje broja kaviteta u kojima je zabilježeno prisustvo aerobnih bakterija, anaerobnih bakterija, Lactobacillus spp. i Streptococcus spp. poslije primjene antiseptika (S2) između grupe tretirane ozonom (OZ-grupa) i grupe tretirane hlorheksidinom (HH-grupa) 5.2.5.5.</s><s>Poređenje prosječnog broja aerobnih bakterija, anaerobnih bakterija, Lactobacillus spp. i Streptococcus spp. poslije primjene antiseptika Prosječan broj aerobnih i anaerobnih bakterija u uzorcima karijesnog dentina poslije dezinfekcije kaviteta je bio približno isti u obje grupe, eksperimentalnoj i komparativnoj.</s><s>U grupi u kojoj je korišćen ozon prosječan broj Lactobacillus spp. je bio značajno manji (p=0,041), a prosječan broj Streptococcus spp. značajno veći (p=0,041) u odnosu na grupu gdje je primijenjen hlorheksidin (grafikon 5.).</s><s>5.2.5.6.</s><s>Poređenje broja kaviteta pozitivnih na različite vrste Lactobacillus spp. poslije primjene antiseptika</s>
<s>Poslije primjene antiseptika nije zabilježena značajna razlika u učestalosti različitih vrsta Lactobacillus spp. između grupe tretirane ozonom i grupe tretirane hlorheksidinom, osim za učestalost L. paracasei ssp. paracasei 1 (p=0,014), koji je izolovan u grupi tretiranoj hlorheksidinom (grafikon 6.).</s>
<s>Grafikon 5. Poređenje prosječnog broja (±SD) aerobnih bakterija, anaerobnih bakterija, Lactobacillus spp. i Streptococcus spp. poslije primjene antiseptika (S2) između grupe tretirane ozonom (OZ-grupa) i grupe tretirane hlorheksidinom (HH-grupa)</s>
<s>Grafikon 6. Poređenje učestalosti pojedinih vrsta Lactobacillus spp. poslije primjene antiseptika (S2) između grupe tretirane ozonom (OZ-grupa) i grupe tretirane hlorheksidinom (HH-grupa) Aerobne bakterije</s>
<s>5.2.6.1.</s><s>Broj kaviteta sa anaerobnim bakterijama Broj kaviteta iz kojih su izolovane anaerobne bakterije prije i poslije dezinfekcije kaviteta ozonom i hlorheksidinom, primjenom metode qPCR, prikazan je u tabeli 15.</s><s>U obje grupe, u svim uzorcima dentina na početku terapije izolovane su anaerobne bakterije kao i poslije primjene antiseptika.</s><s>Tabela 15.</s><s>Broj kaviteta u kojima je zabilježeno prisustvo anaerobnih bakterija prije (S1) i poslije (S2) primjene antiseptika u grupi tretiranoj ozonom (OZ-grupa) i grupi tretiranoj hlorheksidinom (HHgrupa)</s>
<s>5.2.6.2.</s><s>Prosječan broj anaerobnih bakterija U kavitetima u kojima je primjenjen ozon prosječan broj anaerobnih bakterija je iznosio oko 7,5·105 genskih kopija/mg prije primjene ozona, dok je poslije tretiranja kaviteta taj broj smanjen na 2,4·105 genskih kopija/mg (p=0,001).</s><s>Prije dezinfekcije kaviteta hlorheksidinom prosječan broj anaerobnih bakterija je iznosio oko 8,7·105 genskih kopija/mg.</s><s>Poslije primjene hlorheksidina broj anaerobnih bakterija je smanjen na 5,7·105 genskih kopija/mg (p=0,001) (tabela 16.).</s>
<s>Tabela 16.</s><s>Prosječan broj anaerobnih bakterija prije (S1) i poslije (S2) primjene antiseptika u grupi tretiranoj ozonom (OZ-grupa) i grupi tretiranoj hlorheksidinom (HH-grupa) Tretman</s>
<s>5.2.7.1.</s><s>Broj kaviteta sa Lactobacillus spp.</s><s>Lactobacillus spp. je izolovan u svim uzorcima karijesnog dentina i prije i poslije primjene antiseptika u grupi gdje je korišćen ozon kao i u grupi gdje je primjenjen hlorheksidin (tabela 17.).</s><s>Tabela 17.</s><s>Broj kaviteta u kojima je zabilježeno prisustvo Lactobacillus spp. prije (S1) i poslije (S2) primjene antiseptika u grupi tretiranoj ozonom (OZ-grupa) i grupi tretiranoj hlorheksidinom (HHgrupa)</s>
<s>5.2.7.2.</s><s>Prosječan broj Lactobacillus spp.</s><s>Prosječan broj bakterija je značajno snižen sa početnih 5,0·104 genskih kopija/mg na 3,5·104 genskih kopija/mg poslije tretiranja kaviteta ozonom (p<0,0001).</s><s>Izlaganje karijesnog kaviteta djelovanju hlorheksidina dovelo je do značajnog smanjenja prosječnog broja Lactobacillus spp. sa početnih 5,0·104 genskih kopija/mg na 1,7·104 genskih kopija/mg (p<0,0001)(tabela 18.).</s><s>Tabela 18.</s><s>Prosječan broj Lactobacillus spp. prije (S1) i poslije (S2) primjene antiseptika u grupi tretiranoj ozonom (OZ-grupa) i grupi tretiranoj hlorheksidinom (HH-grupa) Tretman</s>
<s>5.2.8.1.</s><s>Broj kaviteta sa L. casei/paracasei Učestalost vrste L. casei/paracasei, izolovane metodom PCR, u karijesnim uzorcima prije i poslije dezinfekcije kaviteta u grupi tretiranoj ozonom i grupi tretiranoj hlorheksidinom prikazana je u tabeli 19.</s><s>U grupi gdje je korišćen ozon, ova vrsta je izolovana iz polovine kaviteta i prije i poslije primjene lijeka (p>0,05).</s><s>U kavitetima gdje je korišćen hlorheksidin, L. casei/paracasei je izolovana iz 33,3% uzoraka prije primjene, odnosno iz 29,2% uzoraka poslije primjene komparatora (p>0,05).</s>
<s>Tabela 19.</s><s>Broj kaviteta u kojima je zabilježeno prisustvo L. casei/paracasei prije (S1) i poslije (S2) primjene antiseptika u grupi tretiranoj ozonom (OZ-grupa) i grupi tretiranoj hlorheksidinom (HHgrupa)</s>
<s>Iz svih kaviteta prije primjene antiseptika izolovane su anaerobne bakterije i Lactobacillus spp. i u grupi tretiranoj ozonom i u grupi tretiranoj hlorheksidinom (p>0,05) (grafikon 7.).</s><s>5.2.9.2.</s><s>Poređenje prosječnog broja anaerobnih bakterija i Lactobacillus spp. prije primjene antiseptika</s>
<s>Poređenje prosječnog broja anaerobnih bakterija i Lactobacillus spp. prije dezinfekcije kaviteta između eksperimentalne i komparativne grupe prikazano je na grafikonu 8. Broj anaerobnih bakterija je bio nešto veći u komparativnoj grupi, dok je broj Lactobacillus spp. bio približno isti u obje ispitivane grupe, grupe tretirane ozonom i grupe tretirane hlorheksidinom (p>0,05).</s>
<s>Grafikon 7. Poređenje broja kaviteta u kojima je zabilježeno prisustvo anaerobnih bakterija i Lactobacillus spp. prije primjene antiseptika (S1) između grupe tretirane ozonom (OZ-grupa) i grupe tretirane hlorheksidinom (HH-grupa)</s>
<s>Grafikon 8. Poređenje prosječnog broja (±SD) anaerobnih bakterija i Lactobacillus spp. prije primjene antiseptika (S1) između grupe tretirane ozonom (OZ-grupa) i grupe tretirane hlorheksidinom (HH-grupa) Man-Vitnijev test</s>
<s>Poslije primjene antiseptika anaerobne bakterije i Lactobacillus spp. su izolovane iz svih kaviteta i u eksperimentalnoj i u komparativnoj grupi (p>0,05) (grafikon 9.).</s><s>Grafikon 9. Poređenje broja kaviteta u kojima je zabilježeno prisustvo anaerobnih bakterija i Lactobacillus spp. poslije primjene antiseptika (S2) između grupe tretirane ozonom (OZ-grupa) i grupe tretirane hlorheksidinom (HH-grupa)</s>
<s>Poređenje prosječnog broja anaerobnih bakterija i Lactobacillus spp. poslije primjene antiseptika između eksperimentalne i komparativne grupe prikazano je na grafikonu 10.</s><s>Poslije primjene antiseptika u komparativnoj grupi je zabilježen veći broj anaerobnih bakterija i manji broj Lactobacillus spp. u poređenju sa grupom gdje je korišćen ozon, ali ta razlika nije bila statistički značajna (p>0,05).</s>
<s>Grafikon 10.</s><s>Poređenje prosječnog broja (±SD) anaerobnih bakterija i Lactobacillus spp. poslije primjene antiseptika (S2) između grupe tretirane ozonom (OZ-grupa) i grupe tretirane hlorheksidinom (HH-grupa) Man-Vitnijev test</s>
<s>5.2.10.</s><s>Komparativna analiza antibakterijskog efekta ozona i hlorheksidina na vrstu L. casei/paracasei ispitivanog metodom PCR 5.2.10.1.</s><s>Poređenje broja kaviteta pozitivnih na L. casei/paracasei prije i poslije primjene antiseptika</s>
<s>Poređenje učestalosti vrste L. casei/paracasei u karijesnim kavitetima prije i poslije primjene antiseptika između grupe tretirane ozonom i grupe tretirane hlorheksidinom prikazano je na grafikonu 11.</s><s>Učestalost L. casei/paracasei je bila veća u karijesnim uzorcima u grupi gdje je korišćen ozon, i prije i poslije primjene lijeka, ali ta razlika nije bila statistički značajna (p>0,05).</s>
<s>Grafikon 11.</s><s>Poređenje broja kaviteta u kojima je izolovan L. casei/paracasei prije (S1) i poslije (S2) primjene antiseptika između grupe tretirane ozonom (OZ-grupa) i grupe tretirane hlorheksidinom (HHgrupa)</s>
<s>Dijagram 2. predstavlja tok odabira ispitanika i formiranje istraživačkih grupa.</s><s>Pregledano je 55 osoba i njih 38, koje su ispunile kliničke i radiografske kriterijume, su uključene u istraživanje.</s><s>Metodom slučajnog izbora ispitanici su podijeljeni u dvije grupe, eksperimentalnu, gdje je korišćen ozon (OZ-grupa) i kontrolnu.</s><s>Kod svih ispitanika eksperimentalni protokol je sproveden u jednoj posjeti i svi uzorci pulpe su analizirani.</s><s>Prilikom izvođenja terapijskog postupka nisu zabilježeni neželjeni efekti.</s><s>Dijagram 2. Odabir ispitanika i formiranje istraživačkih grupa Pregledano</s>
<s>U tabeli 20. prikazane su karakteristike ispitanika uključenih u istraživanje u eksperimentalnoj i kontrolnoj grupi.</s><s>U ispitivanoj populaciji veća je bila zastupljenost osoba ženskog pola: 73,7% u grupi tretiranoj ozonom i 84,2% u kontrolnoj grupi.</s><s>Ispitanici u grupi gdje je korišćen ozon su imali između 20 i 40 godina (prosječna starost 26,9 godina), dok su ispitanici u kontrolnoj grupi imali između 18 i 40 godina (prosječna starost 25 godina).</s><s>Nije zabilježena značajna razlika u pogledu pola i starosne struktrure između grupa Tabela 20.</s><s>Demografske karakteristike ispitanika u grupi tretiranoj ozonom (OZ-grupa) i kontrolnoj grupi Veličina uzorka</s>
<s>* t-test za dva nezavisna uzorka za godine starosti; Hi-kvadrat test za pol 5.4.</s><s>EFEKAT OZONA NA NIVO VEGF U ZUBNOJ PULPI Koncentracije VEGF u grupi tretiranoj ozonom i kontrolnoj grupi su prikazane u tabeli 21.</s><s>Koncentracije VEGF u zdravoj pulpi zuba čiji su kaviteti izloženi djelovanju gasnog ozona su značajno veće, za oko 24% u odnosu na vrijednosti dobijene za pulpe kontrolnih zuba (p<0,0001).</s>
<s>5.5.</s><s>EFEKAT OZONA NA NIVO SOD U ZUBNOJ PULPI Tabela 22. prikazuje aktivnost SOD u eksperimentalnoj i kontrolnoj grupi.</s><s>U pulpama zdravih zuba čiji su kaviteti tretirani ozonom aktivnost SOD je bila značajno manja, za oko 6%, u odnosu na kontrolne pulpe Tabela 22.</s><s>Aktivnost SOD u grupi tretiranoj ozonom (OZ-grupa) i kontrolnoj grupi Tretman</s>
<s>U studiji I ispitivan je antiseptički efekat ozona na bakterije u dubokom karijesu poslije djelimičnog uklanjanja karijesnog tkiva.</s><s>Primjenom kultivisanja ili molekularnih metoda (PCR ili qPCR) određen je ukupan broj bakterija i bakterija Streptococcus spp. i Lactobacillus spp., kao i pojedinih vrsta Lactobacillus spp. prije i poslije primjene antiseptika.</s><s>Antibakterijski efekat ozona poređen je sa 2% hlorheksidinom (komparator) jednim od najčešće korišćenih antiseptika za dezinfekciju kaviteta prije primjene restaurativnih materijala (Lafuente, 2012).</s><s>U ovom istraživanju je ispitivano ukupno 48 karijesnih lezija od 48 ispitanika.</s><s>Broj uzoraka je određen prije početka istraživanja, na osnovu nalaza in vitro studije o antibakterijskoj efikasnosti gasnog ozona i 2% hlorheksidina, kultivisanjem bakterija (Müller i sar., 2007).</s><s>Rezultati ove in vitro studije moguće da nisu najpodesniji za kontrolu veličine uzorka za ispitivanje efikasnosti antiseptika u kliničkim uslovima, posebno kada se u istraživanju primjenjuje qPCR metod.</s><s>Međutim, razlog za uzimanje ove studije je taj što su u periodu dizajniranja istraživanja to bili jedini dostupni podaci.</s><s>Za sada antibakterijska efikasnost ozona i hlorheksidina u in vivo uslovima komparativno je ispitivana samo u jednom istraživanju Hauser-Gerspach i sar. (2009), ali je korišćen 1% hlorheksidin.</s><s>Uključivanjem samo jednog zuba kod jednog pacijenta, ograničen je statistički efekat grupisanja podataka (Schwendicke i sar., 2013a).</s><s>Pristrasnost prilikom biranja i randomizacije uzorka je veoma važan faktor u kliničkim istraživanjima kako bi se obezbjedila objektivnost i validnost rezultata (Schwendicke i sar., 2013a).</s><s>U ovom istraživanju klinički postupak uzimanja uzoraka sproveo je jedan istraživač, u cilju obezbjeđivanje standardizovane procedure.</s><s>Ispitanici i istraživač su bili upoznati kojoj terapijskoj grupi ispitanik pripada, jer zbog fizičko-hemijskih karakteristika primjenjenih antiseptika nije bilo moguće obezbjediti „slijep“ dizajn.</s><s>Da bi se umanjila pristrasnost prilikom uzimanja uzoraka, pripadnost grupi je određena tek poslije uzimanja prvog uzorka karijesnog dentina izvlačenjem terapijskog protokola iz zapečaćene koverte.</s><s>Uzorci su kodirani brojevima i njihova mikrobiološka analiza je vršena simultano, odnosno u istom aktu analizirani su uzorci dentina prije i poslije primjene antiseptika.</s><s>Analize uzoraka kultivisanjem i molekularnim metodama (PCR i qPCR) su uradila dva istraživača, koja nisu učestvovala u kliničkom dijelu ispitivanja.</s><s>Uzorak karijesnog dentina uzet je prema metodologiji preporučenoj od strane Kidd i sar. (1993).</s><s>Broj bakterija određen kultivisanjem nije izražen u jedinici mase (CFU/mg) već u jedinici volumena (CFU/ml), kao i u drugim sličnim istraživanjima (Toi i sar., 2003; Bönecker i sar., 2003; Orhan i sar., 2008; Duque i sar., 2009; Rolland i sar., 2011).</s><s>Uzimajući u obzir da je ovom metodom omogućeno uzimanje sličnih količina karijesnog dentina različitih konzistencija sa mjesta uzorkovanja (Bjørndal i sar., 1997, Paddick i sar., 2005) i da je izvršena kalibracija istraživača na ekstrahovanim zubima prije početka istraživanja, može se pretpostaviti da nije postojala značajna razlika u količini uzorkovanog dentina između grupa.</s><s>Dobijeni rezultati pokazuju da ne postoji značajna razlika u demografskim karakteristikama ispitanika (pol, starosna dob) i kliničkih karakteristika uzorka (morfološka grupa zuba, površina zuba sa karijesom, vlažnost, konzistencija i boja karijesnog dentina) između ispitivanih grupa.</s><s>Eksperimentalna i DISKUSIJA</s>
<s>6. DISKUSIJA komparativna grupa nisu se razlikovale u broju aerobnih i anaerobnih bakterija, Lactobacillus spp. i Streptococcus spp. određenih kultivisanjem, kao ni u ukupnom broju anaerobnih bakterija i Lactobacillus spp. određenih metodom qPCR i učestalosti L. casei/paracasei određene PCR na početku istraživanja.</s><s>Jedina značajna razlika je zabilježena u učestalosti vrsta Lactobacillus spp. i to L. paracasei ssp. paracasei 1 i L. paracasei ssp. paracasei 3 jer su izolovane samo u grupi tretiranoj hlorheksidinom kultivisanjem.</s><s>Stoga, može se pretpostaviti da su sve promjene u broju bakterija zabilježene poslije primjene antiseptika posljedica njihovog direktnog djelovanja.</s><s>Identifikacija i određivanje ukupnog broja bakterija (aerobnih i anaerobnih), Streptococcus spp., Lactobacillus spp., kao i pojedinih vrsta Lactobacillus spp. izvršena je kultivisanjem.</s><s>Kultivisanje je metod koji se najčešće koristi za određivanje broja i vrste bakterija u karijesnim kavitetima, kao i za ispitivanje efikasnosti različitih antibakterijskih protokola u terapiji karijesa (Frencken i sar., 2007; Orhan i sar., 2008; Duque i sar., 2009; Rolland i sar., 2011; Maltz i sar., 2012a).</s><s>Ovaj metod se karakteriše zasijavanjem inokuluma odmah po uzimanju uzorka na odgovarajućim hranjivim podlogama u precizno definisanim laboratorijskim uslovima.</s><s>U našem istraživanju, prosječan broj aerobnih i anaerobnih bakterija, Lactobacillus spp. i Streptococcus spp., određen kultivisanjem poslije djelimičnog uklanjanja karijesa, a prije primjene antiseptika je u okvirima onih koji su zabilježeni u drugim sličnim istraživanjima (Bjørndal i Bakterijski sastav lezije predstavlja odraz lokalnih uslova sredine, uključujući i karakteristike same lezije.</s><s>Sve lezije su prije primjene antiseptika klasifikovane na osnovu boje, vlažnosti i konzistencije tkiva kako bi se ispitao mogući uticaj ovih kliničkih karakteristika na bakterijski sastav.</s><s>Rezultati korelacione analize su pokazali da sva tri ispitivana klinička parametra lezije međusobno značajno koreliraju.</s><s>Kako se konzistencija tkiva mijenja od mekših ka tvrđim, tako se mijenja i vlažnost, od vlažnijih ka suvim karijesnim masama, i boja, od svjetlijih ka tamnijim nijansama.</s><s>Ovi rezultati su u skladu sa nalazima koji ukazuju na povezanost boje i konzistencije dentina kao i na poveznost vlažnosti i konzistencije (Orhan i sar., 2008; Corralo i Maltz, 2013).</s><s>Rezultati istraživanja o povezanosti kliničkih karakteristika lezija i broja bakterija pokazuju da je ukupan broj bakterija, kao i broj S. mutans i Lactobacillus spp. je značajno veći u lezijama sa mekšim i vlažnijim karijesnim masama (Ayna i sar., 2003; Orhan i sar., 2008).</s><s>U našem istraživanju broj Lactobacillus spp. je značajno veći u karijesnim lezijama mekše konzistencije, što ukazuje na veću bakterijsku aktivnost u razmekšanom u poređenju sa čvršćim dentinom.</s><s>Postoje analize koje pokazuju da boja karijesnog dentina nije povezana sa stepenom bakterijske infekcije tako da boja nije adekvatan parametar za dijagnostikovanje oboljenja i određivanje aktivnosti lezije (Orhan i sar., 2008; Lula i sar., 2011; Corralo i Maltz, 2013).</s><s>Ipak, veoma čest nalaz u karijesnim kavitetima jesu karijesne lezije tamnije boje i mekše konzistencije, što ukazuje na određenu aktivnost lezije.</s><s>U prilog tome govori i nalaz o značajnoj povezanosti Streptococcus spp. sa lezijama tamnije boje u našem istraživanju.</s><s>Poslije primjene ozona u trajanju od 40 sekundi na karijesni dentin, kultivisanjem bakterija zabilježeno je značajno smanjenje ukupnog broja bakterija za 75,4%, za aerobne, odnosno za 79% za anaerobne bakterije u poređenju sa vrijednostima prije primjene antiseptika.</s><s>Slično smanjenje ukupnog broja bakterija je zabilježeno i poslije primjene 2% hlorheksidina u trajanju od 60 sekundi (77,2% za aerobne i 80% za anaerobne bakterije).</s><s>Razlika između eksperimentalne i komparativne grupe nije bila statistički DISKUSIJA</s>
<s>6. DISKUSIJA značajna.</s><s>Pored efekta na ukupan broj bakterija, oba terapijska protokola su dovela i do značajnog smanjenja ukupnog broja Lactobacillus spp. i Streptococcus spp., kao i smanjenje učestalosti, iako ne značajnog, pojedinih vrsta Lactobacillus spp..</s><s>Poređenjem antibakterijskog efekta između grupa uočeno je da je broj Lactobacillus spp. bio značajno manji, a broj Streptococcus spp. značajno veći poslije primjene ozona u poređenju sa hlorheksidinom.</s><s>Takođe, broj kaviteta iz kojih su izolovane pomenute bakterijske vrste je bio značajno veći poslije primjene ozona u poređenju sa hlorheksidinom.</s><s>Posmatrano u odnosu na vrstu, značajna razlika je zabilježena u učestalosti L. paracasei ssp. paracasei 1, koja je izolovana u većem broju iz kaviteta u komparativnoj grupi, ali treba imati u vidu da je značajna razlika u učestalosti ove vrste između grupa zabilježena i prije primjene antiseptika.</s><s>Iako nisu doveli do potpune eliminacije bakterija, značajno smanjenje broja bakterija u karijesnom tkivu poslije primjene ozona i hlorheksidina u ovom istraživanju ukazuje na značaj primjene antiseptika u indirektnoj terapiji dobokog karijesa.</s><s>Pored velikog broja in vitro i in situ istraživanja (Nagayoshi i sar., 2004; Polydorou i sar., 2006; Müller i sar., nekoliko studija ispitivan je efekat ozona na kariogene bakterije u kliničkim uslovima primjenom metode kultivisanja.</s><s>U dvije studije zabilježeno je značajno smanjenje broja bakterija poslije djelovanja ozona, ali bez poređenja rezultata sa kontrolnom grupom.</s><s>Baysan i Lynch (2007) su, ispitujući uticaj ozona na mirkroorganizme u primarnim karijesnim lezijama korijena i njegov efekat na progresiju oboljenja, našli da primjena ozona u trajanju od 10 ili 20 sekundi značajno smanjuje ukupan broj mikroorganizama.</s><s>Takođe, na kontrolnim pregledima 3 i 5,5 mjeseci poslije primjene ozona autori su našli da je kod 50,8% od analiziranih lezija došlo do očvršćavanja dentina, kod 41,5% do smanjenja indeksa oštećenja sa vrijednosti 2 na vrijednost 1, a kod 7,7% lezija nisu zabilježili nikakve promjene poslije primjene ozona u trajanju od 10 ili 20 sekundi.</s><s>Klinička studija Dukić i sar. (2013) ukazuje da primjena ozona u trajanju od 40 sekundi na karijesni dentin u dubokim karijesnim lezijama na stalnim molarima dovodi do značajnog smanjenja ukupnog broja bakterija, kao i S. mutans i Lactobacillus spp..</s><s>Nalazi o antibakterijskoj efikasnosti hlorheksidina na karijesni dentin u kliničkim uslovima su različiti.</s><s>Ersin i sar. (2006) su ispitivali uticaj atraumatske restaurativne terapije, kao i antibakterijski uticaj hlorheksidina kao dezinficijensa u karijesnim kavitetima, i to istog oblika koji je korišćen u našem istraživanju.</s><s>Autori su uočili da je 6 mjeseci od završene restaurativne terapije, primjena hlorheksidina dovela do značajnog smanjenja broja bakterija u poređenju sa kontrolnom grupom, u kojoj nije korišćen antiseptik za dezinfekciju.</s><s>Frencken i sar. (2007) su ispitivali efekat dodavanja hlorheksidina glas jonomer cementu u cilju poboljšavanja njegovog antibakterijskog djelovanja u karijesnim kavitetima.</s><s>Autori su zabilježili da 7 dana poslije primjene, kombinacija ova dva materijala značajno smanjuje ukupan broj bakterija u karijesnom i od karijesa očišćenom dentinu i da je to smanjenje značajno veće u poređenju sa kontrolnom grupom (konvencionalni glas jonomer cement).</s><s>Sa druge strane, Wicht i sar. (2004) nisu zabilježili značajan antibakterijski efekat laka koji predstavlja kombinaciju 1% hlorheksidina i 1% timola na ukupan broj bakterija 6 nedjelja poslije primjene na karijesno tkivo za razliku od kombinacije demeklociklina (antibiotika) i triamcinolona (kortikosteroida) u obliku paste.</s><s>Samo u jednoj kliničkoj studiji poređen je efekat gasnog ozona u odnosu na 1% hlorheksidin, kao pozitivnu kontrolnu grupu, na bakterije koje se nalaze u karijesnim kavitetima mliječnih molara (Hauser-Gerspach i DISKUSIJA</s>
<s>6. DISKUSIJA sar., 2009).</s><s>Rezultati pomenutog istraživanja pokazuju da primjena gasnog ozona u trajanju od 30 sekundi i 1% hlorheksidina u istom trajanju ne dovodi do značajnog smanjenja broja bakterija u otvorenim karijesnim lezijama mliječnih molara.</s><s>Značajno smanjenje nije zabilježeno ni poslije djelimičnog uklanjanja karijesa ni u jednoj od ispitivanih grupa, što je u suprotnosti sa rezultatima našeg istraživanja.</s><s>Razlika u odnosu na naše istraživanje se može pripisati velikom broju bakterija u karijesnom dentinu prije uklanjanja karijesa i primjene antiseptika (log 7,9-odgovara približno 100 miliona ćelija) i u uzorcima dentina poslije djelimičnog uklanjanja karijesa i primjene antiseptika (log 7,5) u pomenutoj studiji.</s><s>Naime, smanjenje broja bakterija je izražajnije ukoliko je početni broj bakterija manji u odnosu na one karijesne lezije koje karakteriše prisustvo većeg broja bakterija (Thanomsub i sar., 2002), kao što je u istraživanju Hauser-Gerspach i sar. (2009).</s><s>U obzir treba uzeti i da se bakterijski sastav karijesnih lezija mliječnih zuba značajno razlikuje i manje je raznolik od sastava bakterija koje se nalaze u karijesnim lezijama stalnih zuba (Aas i sar., 2008).</s><s>Naime, efikasnost antibakterijskih supstanci zavisna je od vrste bakterija na koje djeluju.</s><s>Važan faktor koji determiniše antibakterijsko djelovanje je i doza primjenjenog antiseptika.</s><s>U pomenutom istraživanju korišćen je zatvoreni sistem generatora ozona (HealOzone, KaVo, Biberach, Germany) koji proizvodi ozon u tačno određenoj koncentraciji, od 2100 ppm i protoku od 613 cm3/min.</s><s>Sa druge strane generator ozona primjenjen u našem istraživanju pripada otvorenom sistemu generatora.</s><s>Prema uputstvu proizvođača generator stvara 2,9 mg/s ozona (AV sonda intnezitet 5), odnosno na mjestu primjene od 1 do 300 000 ppm ozona zavisno od izabranog programa, što predstavlja ograničenje ovog načina primjene antiseptika.</s><s>Prednost u odnosu na zatvoreni sistem se ogleda u tome što preko posebnih nastavaka-sondi, ozon može biti primijenjen i na manje dostupna mjesta (parodontalni džep i kanal korijena).</s><s>Pored razlike u koncentracijama ozona, koncentracija primjenjenog 2% hlorheksidina kao komparatora u našem istraživanju je veća od koncentracije primjenjene u studiji Hauser-Gerspach i sar. (2009), gdje je korišćen 1% hlorheksidin.</s>
<s>Identifikacija i kvantifikacija ukupnog broja anaerobnih bakterija i Lactobacillus spp. i vrste L. casei/paracasei izvršena je i primjenom molekularnih metoda: qPCR ili PCR.</s><s>Analiza broja bakterija qPCR pokazuje da se poslije primjene ozona od 40 sekundi značajno smanjuje broj anaerobnih bakterija (68%) i Lactobacillus spp. (30%) od početnih vrijednosti, dok je učestalost L. casei/paracasei, određena PCR, ostala skoro nepromijenjena.</s><s>Hlorheksidin (2%) primjenjen u trajanju od 60 sekundi je doveo do značajnog smanjenja broj anaerobnih bakterija, za 34,5%, i broja Lactobacillus spp., za 66%, od vrijednosti koje su zabilježene prije primjene antiseptika.</s><s>Vrsta L. casei/paracasei je poslije primjene hlorheksidina izolovana iz sedam od osam kaviteta koji su bili pozitivni na ovu vrstu prije primjene antiseptika.</s><s>Komparativna analiza nije pokazala postojanje značajne razlike u antibakterijskoj efikasnosti između ozona i hlorheksidina.</s><s>Značajno smanjenje broja bakterija poslije primjene antiseptika određeno qPCR metodom, pored već zabilježenog smanjenja broja bakterija kultivisanjem, pokazuje na značaj primjene ozona i hlorheksidina u indirektnoj terapiji dubokog karijesa.</s><s>Uzimajući u obzir da su molekularne metode korišćene za ispitivanje efikasnosti restaurativnih protokola u veoma malom broju studija (Gu i sar., 2010), kao i da u tim studijama nije ispitivana efikasnost ozona i/ili hlorheksidina, nije moguće izvršiti komparativnu analizu dobijenih rezultata.</s><s>PCR predstavlja molekularni metod koji omogućava kvalitativnu identifikaciju određenog mikroorganizma primjenom prajmera za specifičan gen.</s><s>Nedostatak ove metode, u nemogućnosti kvantifikacije broja DISKUSIJA</s>
<s>6. DISKUSIJA mikroorganizama, prevaziđen je qPCR. qPCR predstavlja enzimsku reakciju u kojoj se dva sintetska oligonukleotidna prajmera i fluoroscentna proba hibridizuju sa nukleotidnom baznom sekvencom koja je karakteristična za ciljani organizam u uzorku.</s><s>Praćenjem oslobađanja fluoroscence sa svakim PCR ciklusom, progresija reakcije i količina DNK mogu da se prate u funkciji vremena, čime je omogućeno određivanje ukupnog broja mikroorganizama, bakterija ili pojedinih bakterijskih vrsta.</s><s>U našem istraživanju ukupan broj anaerobnih bakterija i Lactobacillus spp. određen metodom qPCR kao i učestalosti L. casei/paracasei određena PCR su značajno veće u poređenju sa vrijednostima dobijenim kultivisanjem, što je u skladu sa nalazima i drugih studija gdje je komparirana osjetljivost ove dvije metode identifikacije i kvantifikacije bakterija (Nadkarni i sar., 2002; Martin i sar., 2002; Byun i sar., 2004).</s><s>Veći broj kopija gena u odnosu na broj kolonija određen kultivisanjem, posljedica je veće osjetljivosti qPCR, kojom može da se detektuje između 10 i 108 ćelija (Heid i sar., 1996).</s><s>Osim teoretski veće osjetljivosti qPCR, veći broj bakterija određen ovom molekularnom metodom je posljedica i nekih ograničenja kultivisanja.</s><s>U slučajevima kada se bakterije nalaze u agregatima, kao što je slučaj sa dentalnim plakom i karijesom, disperzija bakterija u pojedinačne ćelije prije zasijavanja na hranjive podloge može biti nepotpuna poslije miješanja uzorka.</s><s>Sa druge strane, pretjerano miješanje koje se koristi u toku kultivisanja može dovesti do smrti ćelije.</s><s>Takođe, mogu se kultivisati samo žive ćelije, ukoliko se bakterijama obezbjede metaboličke i fiziološke potrebe koje imitiraju uslove in vivo.</s><s>Uzmajući u obzir kompleksnost oralne flore i specifične nutritivne potrebe pojedinih bakterija nekada je ove uslove teško obezbjediti u eksperimentalnim uslovima.</s><s>Smatra se da oko 50% oralne flore još uvijek nije moguće kultivisati (Nadkarni i sar., 2002).</s><s>Treba uzeti u obzir i da jedna kolonija na hranjivoj podlozi ne predstavlja uvijek jednu bakterijsku ćeliju, što je još jedan od razloga manjeg broja bakterija određenih kultivisanjem.</s><s>Jedan od glavnih nedostataka qPCR metode je što određuje DNK ne samo živih već i mrtvih i liziranih ćelija u uzorku.</s><s>Tako, stres i oštećenja bakterija uzrokovani djelovanjem antiseptika kao i promjene u njihovoj metaboličkoj aktivnosti (Fogel i sar., 1999) mogu uticati na veći broja bakterija određenih qPCR metodom u poređenju sa kultivisanjem.</s><s>Primjena „reverse-transcriptase“ qPCR (RT-qPCR), kojom se određuje broj samo metabolički aktivnih bakterija, mogla bi dati realniju sliku o odnosu kultivisanja i molekularnih metoda u određivanju broja bakterija u karijesnim uzorcima, kao i efikasnosti pojedinih terapijskih protokola.</s>
<s>Imajući u vidu da je qPCR osjetljivija metoda za kvantifikaciju bakterija u odnosu na kultivisanje bakterija sa jedne strane, i sa druge strane naše nalaze da se antibakterijski efekat ozona i hlorheksidina ne razlikuje metodom qPCR, zapažene razlike između antibakterijskog efekta ozona i hlorheksidina prema Lactobacillus spp. odnosno Streptococcus spp. dobijene kultivisanjem su najvjerovatnije posljedica manje osjetljivosti metode kultivisanja, a ne razlike u antibakterijskom efektu ozona i hlorheksidina.</s>
<s>U studiji II ispitivana je biokompatibilnosti ozona u odnosu na tkivo pulpe određivanjem nivoa VEGF i SOD poslije njegove primjene na otvorene dentinske kanaliće u trajanju od 40 sekundi.</s><s>Istraživanjem su obuhvaćeni klinički zdravi i intaktni zubi, bez znakova patoloških promjena u pulpnom tkivu ili apeksnom i lateralnom parodoncijumu.</s><s>Između ispitanika eksperimentalne i kontrolne grupe nije zabilježena značajna razlika u pogledu pola i starosne strukture, uzimajući u obzir da pojedini autori nalaze da starenje ima uticaj na nivo VEGF i SOD u zubnoj pulpi (Davis i sar., 1991; Matsuzaka i sar., 2008).</s><s>Na svakom zubu ispreparisani su duboki kaviteti (2/3 debljine dentina) da bi se imitirali uslovi koji odgovaraju upotrebi ozona kao odontoantiseptika u terapiji dubokog karijesa.</s><s>Preparacija kaviteta je sprovedena uz obilno hlađenje i rotirajući instrumenti su mijenjani poslije svake četvrte preparacije da se spriječi uticaj toplote na tkivo pulpe (Costa i sar., 2011).</s><s>Naime, postoje nalazi koji ukazuju da preparacija kaviteta može dovesti do inflamatorne reakcije u pulpi i povećanja nivoa SOD (Baumgardner i sar., 1999; Varavara i sar., Klinički postupak uzimanja uzoraka sproveo je jedan istraživač, u cilju obezbjeđivanja standardizovane procedure.</s><s>Ispitanici i istraživač su bili upoznati kojoj terapijskoj grupi ispitanik pripada zbog fizičkohemijskih karakteristika generatora ozona.</s><s>Da bi se umanjila pristrasnost prilikom uzimanja uzoraka, pripadnost grupi je određena tek poslije završene preparacije kaviteta, izvlačenjem terapijskog protokola iz zapečaćene koverte.</s><s>Uzorci su kodirani brojevima i analiza je spovedena od strane osobe koja nije učestvovala u kliničkom dijelu istraživanja.</s><s>VEGF je faktor rasta čije prisustvo utiče na vitalnost i funkcionalnosti ćelija (Paranjpe i sar., 2007).</s><s>Iako postoje istraživanja o nivou VEGF u zdravoj pulpi, ovakvih podataka nema za pulpu izloženu djelovanju ozona.</s><s>Rezultati ove studije, dobijene ELISA imunoesejom, su pokazali da je koncentracija VEGF u zdravoj pulpi bila 776,2 pg/ml.</s><s>Ovi nalazi su u skladu sa rezultatima Tran-Hung i sar. (2008) koji su supernatantima dobijenim iz kulture intaktnih ćelija humane pulpe odredili nivo VEGF od 769 pg/ml.</s><s>Ilić i sar. (2012) su našli koncentraciju VEGF od 68 pg/mg u zubnoj pulpi zdravih osoba, a Roberts-Clark i Smith (2000) su u rastvorljivoj frakciji dentina našli koncentraciju VEGF od 63 pg/mg.</s><s>Koncentracija VEGF u pulpi 20 minuta poslije primjene ozona na otvorene dentinske kanaliće zdravih zuba u trajanju od 40 sekundi je bila značajno veća u poređenju sa vrijednošću koja je dobijena za kontrolnu pulpu i iznosila je 1023,4 pg/ml.</s><s>Povećanje nivoa VEGF u zubnoj pulpi ukazuje da ozon može da penetrira kroz dentinske kanaliće i ispolji uticaj na tkivo pulpe poslije primjene u dubokim kavitetima.</s><s>Prema nekim studijama ozon ispoljava antibakterijsko djelovanje u debljini dentina do 2 mm (Hugh, 2005), ali bez horizontalne difuzije sa mjesta primjene (Nakano i sar., 2012).</s><s>Sa druge strane, važno je napomenuti da vodonik peroksid, jedan od produkata raspadanja ozona, zbog rastvorljivosti u vodi i male molekulske mase, lako penetrira kroz dentinske kanaliće do tkiva pulpe (Kwon i sar., 2013; Berger i sar., 2013).</s><s>Istraživanja pokazuju da ozon u krvi dovodi do povećanja koncentracije transformišućeg faktora rasta b1 Bocci 1999; Bocci 2005; Re i sar., 2010).</s><s>Kim i sar. (2009) su pokazali da lokalna primjena ozona na akutno izazvano oštećenje kože eksperimentalnih životinja povećava nivo PDGF, TGF i VEGF i ubrzava zarastanje oštećenog tkiva.</s><s>Povećanje vaskularizacije i nivoa VEGF poslije primjene ozona povezuje se sa stvaranjem ROS, produkata raspadanja ozona, i to u prvom redu vodonik peroksida.</s><s>Poluživot vodonik peroksida u DISKUSIJA</s>
<s>DISKUSIJA krvi je veoma kratak, 0,5-1 minuta, jer biva neutralisan od strane antioksidativnog sistema organizma, ali ipak dovoljno dug da aktivira brojne biološke procese među kojima i angiogenezu (Sagai i Bocci, 2011; Pecorelli i sar., 2013).</s><s>Pokazano je da ekstraćelijski vodonik peroksid stimuliše ekspresiju VEGF-A i VEGFR2 receptora (receptori za koje se VEGF-A vezuje)(Roy i sar., 2008).</s><s>Intraćelijski vodonik peroksid je neophodan za uspješnu propagaciju angiogenih signala koji nastaju poslije vezivanja VEGF-A za VEGFR-2 i njegove sljedstvene aktivacije (Roy i sar., 2008).</s><s>VEGF je faktor rasta uključen u mnogim fiziološkim i patološkim procesima.</s><s>Povećan nivo VEGF odgovoran je za patološke promjene kod nekih bolesti, kao što su dijabetes melitus ili neoplazme, tako da je primarni cilj u terapiji ovih oboljenja smanjenje efekata VEGF (prevenstveno angiogeneze) (Ho i sar., 2012, Eichten i sar., 2013).</s><s>Sa druge strane, povećanje nivoa VEGF, koje je značajno manje od patološki povećanog nivoa VEGF, poželjno je tokom procesa zarastanja rana (Maulik, 2006).</s><s>U tkivu pulpe VEGF je odgovoran za angiogenezu koja prethodi formiranju reparativnog dentina kao i za diferencijaciju odontoblasta i njihovu aktivnost (Matsushita i sar.</s><s>2000; Scheven i sar.</s><s>2008).</s><s>Značajno je istaći da naši rezultati pokazuju da je nivo VEGF u zdravoj, netretiranoj pulpi sličan nivou VEGF koji je dobijen u istim uslovima u drugim studijama (Tran-Hung i sar., 2008; Ilić i sar., 2012).</s><s>Ovaj nalaz najprije ukazuje na farmakokinetičko svojstvo ozona i njegovih produkata da efikasno prolaze kroz dentinske kanaliće i dospjevaju do pulpnog tkiva.</s><s>Sa druge strane, povećan nivo VEGF od oko 24% u tkivu pulpe poslije primjene ozona korespondira sa prolaznim povećanjem VEGF koje nastaje poslije mehaničke povrede pulpnog tkiva (oko 23%), kako su to pokazali Tran-Hung i sar. (2008).</s><s>Međutim, isti autori su pokazali značajno dozno zavisno povećanje VEGF za oko 31% odnosno oko 49% poslije primjene 50 μM i 100 μM HEMA (monomer koji ulazi u sastav dentalnih adheziva i kompozita) (Tran-Hung i sar., 2008).</s><s>Imajući to u vidu, može se pretpostaviti da je ozon biokompatibliniji u odnosu na HEMA.</s><s>Na biokompatibilnost ozona još više ukazuje podatak da u toku dijabetes melitusa tip 2 patološki porast VEGF u pulpi u odnosu na kontrolne uslove iznosi oko 33% (Ilić i sar., 2012) što je znatno više od onog koji je dobijen poslije primjene ozona (oko 24%).</s><s>Na kraju treba istaći da povećani nivo VEGF zapažen u našoj studiji najvjerovatnije korespondira sa njegovim remineralizacionim potencijalom, koji je zabilježen u pojedinim kliničkim studijama (Baysan i Lynch, 2004).</s><s>Uzimajući u obzir oksidativni potencijal ozona i stvaranje sekundarnih glasnika, ROS i produkata lipidne oksidacije (engl.</s><s>Lipid oxydation products (LOP)), od važnosti je ispitati njegov mogući uticaj na aktivnost antioksidativnih enzima pulpe.</s><s>SOD se smatra jednim od najvažnijih antioksidativnih enzima, čije je prisustvo dokazano u tkivu pulpe u fiziološkim uslovima (Davis i sar., 1991; Bödör i sar., 2007).</s><s>SOD ima ulogu u zaštiti ćelija od nekroze i matriksa od degradacije što omogućava reparaciju tkiva tokom inflamacije (Davis i sar., 1991).</s><s>U ovom istraživanju nivo SOD u zdravoj pulpi kontrolnih zuba je iznosio 92% i bio je značajno veći od onog koji je zabilježen u pulpama izloženim djelovanju ozona (88,7%).</s><s>U većem broju istraživanja pokazano je da ponovljena primjena ozona u toku dužeg vremenskog perioda (od nekoliko dana do nekoliko nedjelja) povećava antioksidativni status kod pacijenata sa koronarnom bolešću i dijabetičnim stopalom posredstvom povećanja nivoa SOD i drugih antioksidativnih enzima (Martínez-Sánchez i sar., 2005; Martínez-Sánchez i sar., 2012; Re i sar., 2014).</s><s>Nasuprot tome, u našem istraživanju ispitivan je neposredni efekat jednokratne primjene ozona.</s><s>U vezi sa tim značajno je istaći da poslije kontakta sa organskim materijama u krvi ozon veoma brzo nestaje (za 2 minute) uz stvaranje ROS i LOP.</s><s>Nastali ROS izaziva prolazno smanjenje antioksidativnog rezervoara krvi, za 2-25% u zavisnosti od DISKUSIJA</s>
<s>ZAKLJUČCI primijenjene doze, koje se koriguje za manje od 20 minuta (Bocci, 2005).</s><s>Može se smatrati da je SOD u pulpi smanjen za oko 3% zato što je to količina SOD koja je utrošena za smanjenje ROS izazvanog jednokratnom primjenom ozona u preparisani kavitet zuba.</s><s>Odsustvo povećanja nivoa SOD neposredno poslije tretiranja ozonom indirektno ukazuje na činjenicu da preparacija kaviteta nije dovela do inflamatornih promjena u pulpi, kako je nađeno u drugim studijama (Varvara i sar., 2012).</s><s>Moguće je da bi produžavanje opservacionog perioda, poslije jednostruke primjene, ili ponovljene aplikacije, kako je preporučeno u terapiji karijesa, bilo povezano sa povećanjem nivoa antioksidativne zaštite, što bi ukazalo na značajnu ulogu ozona u odgovoru pulpe na povredu i infekciju.</s>
<s>1. Jednokratna primjena ozona u preparisani kavitet zuba kao i primjena 2% hlorheksidina, kao antiseptika, prouzrokuje značajno smanjenje ukupnog broja aerobnih i anaerobnih bakterija.</s><s>Rezultati dobijeni kultivisanjem bakterija.</s>
<s>2. Jednokratna primjena ozona u preparisani kavitet zuba kao i primjena 2% hlorheksidina, kao antiseptika, prouzrokuje značajno smanjenje ukupnog broja Lactobacillus spp.</s><s>Rezultati dobijeni kultivisanjem bakterija.</s>
<s>3. Nema razlike u učestalosti pojedinih vrsta Lactobacillus spp. poslije jednokratne primjene ozona u preparisani kavitet zuba kao i primjene 2% hlorheksidina, kao antiseptika.</s><s>Rezultati dobijeni kultivisanjem bakterija.</s>
<s>4. Jednokratna primjena ozona u preparisani kavitet zuba kao i primjena 2% hlorheksidina, kao antiseptika, prouzrokuje značajno smanjenje ukupnog broja bakterija Streptococcus spp..</s><s>Rezultati dobijeni kultivisanjem bakterija.</s>
<s>5. Jednokratna primjena ozona u preparisani kavitet zuba kao i primjena 2% hlorheksidina, kao antiseptika, prouzrokuje značajno smanjenje ukupnog broja anaerobnih bakterija.</s><s>Rezultati dobijeni qPCR metodom.</s>
<s>6. Jednokratna primjena ozona u preparisani kavitet zuba kao i primjena 2% hlorheksidina, kao antiseptika, prouzrokuje značajno smanjenje ukupnog broja Lactobacillus spp..</s><s>Rezultati dobijeni qPCR metodom.</s>
<s>7. Nema razlike u učestalosti vrste L. casei/paracasei poslije jednokratne primjene ozona kao i 2% hlorheksidina, kao antiseptika u preparisani kavitet zuba.</s><s>Rezultati dobijeni PCR metodom.</s><s>8. Komparativna analiza rezultata o antibakterijskoj efikasnosti jednokratno primjenjenog ozona i 2% hlorheksidina u ispreparisan kavitet zuba pokazuje da su oba antiseptika podjednako efikasna.</s><s>9. Poslije jednokratne primjene ozona kao antiseptika u kavitet zuba nivo VEGF u tkivu zubne pulpe je povećan u odnosu na kontrolne netretirane kavitete što ukazuje da ozon i njegovi produkti prolaze kroz dentinske kanaliće i povećavaju nivo VEGF (farmakokinetički aspekt), kao i da je ta količina biokompatibilna sa pulpnim tkivom; šta više da je taj VEGF uključen u procese reparativne dentinogeneze.</s><s>10.</s><s>Poslije jednokratne primjene ozona kao antiseptika u kavitet zuba nivo SOD u tkivu zubne pulpe je za oko 3% smanjen u odnosu na nivo u kontrolnim netretiranim kavitetima što ukazuje da je ozon aktivirao antioksidativni sistem zubne pulpe.</s>
<s>62.</s><s>Duggal MS, Nikolopoulou A, Tahmassebi JF.</s><s>The additional effect of ozone in combination with adjunct remineralisation products on inhibition of demineralisation of the dental hard tissues in situ.</s><s>J Dent 2012;40:934-940.</s>
<s>Ilić J, Radović K, Roganović J, Brković B, Stojić D. The levels of vascular endothelial growth factor and bone morphogenetic protein 2 in dental pulp tissue of healthy and diabetic patients.</s><s>J Endod 2012;38:764-768.</s>
<s>СТОМАТОЛОШКОЈ ТЕРАПИЈИ: АНТИБАКТЕРИЈСКИ ЕФЕКАТ И УТИЦАЈ НА VEGF У  резултат сопственог истраживачког рада;  да докторска дисертација у цјелини ни у дјеловима није била предложена за стицање било које дипломе на другим високошколским установама;  да су резултати коректно наведени и</s>
<s>АНТИБАКТЕРИЈСКИ ЕФЕКАТ И УТИЦАЈ НА VEGF У ЗУБНОЈ ПУЛПИ__________ Изјављујем да је штампана верзија моје докторске дисертације истовјетна електронској верзији коју сам предао/ла.</s>
<s>Ову изјаву дајем у сврху похрањивања моје докторске дисертације у Дигитални репозиторијуму Универзитета у Источном Сарајеву.</s>
<s>Моју докторску дисертацију похрањену у Дигиталном репозиторијуму Универзитета у Источном Сарајеву и доступну у отвореном приступу могу да користе сви који поштују одредбе садржане у одабраном типу лиценце Креативне заједнице (Creative Commons) за коју сам се одлучио/ла.</s>
<s> Ауторство – некомерцијално – без прерада (CC BY-NC-ND)  Ауторство – некомерцијално – дијелити под истим условима (CC BY-NC-SA)  Ауторство – дијелити под истим условима (CC BY-SA) Потпис аутора</s>
<s>1. Ауторство (CC BY).</s><s>Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дјела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце, чак и у комерцијалне сврхе.</s><s>Ово је најслободнија од свих лиценци.</s><s>2. Ауторство - некомерцијално (CC BY-NC).</s><s>Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дјела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце.</s><s>Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дјела.</s><s>3. Ауторство - некомерцијално - без прерада (CC BY-NC-ND).</s><s>Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дјела, без промјена, преобликовања или употребе дјела у свом дјелу, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце.</s><s>Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дјела.</s><s>У односу на све остале лиценце, овом лиценцом се ограничава највећи обим права коришћења дјела.</s><s>4. Ауторство - некомерцијално - дијелити под истим условима (CC BY-NC-SA).</s><s>Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дјела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце и ако се прерада дистрибуира под истом или сличном лиценцом.</s><s>Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дјела и прерада.</s>
<s>5. Ауторство - без прерада (CC BY-ND).</s><s>Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дјела, без промјена, преобликовања или употребе дјела у свом дјелу, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце.</s><s>Ова лиценца дозвољава комерцијалну употребу дјела.</s>
<s>6. Ауторство – делити под истим условима (CC BY-SA).</s><s>Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дјела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце и ако се прерада дистрибуира под истом или сличном лиценцом.</s><s>Ова лиценца дозвољава комерцијалну употребу дјела и прерада.</s><s>Слична је софтверским лиценцама, односно лиценцама отвореног кода.</s><s>Напомена: Овај текст није саставни дио изјаве аутора о коришћењу, већ представља објашњење појединих лиценци.</s>