La infección respiratoria aguda (IRA) es la enfermedad más frecuente en la vida del ser humano. En la mayoría de los casos, estas infecciones sólo afectan al tracto respiratorio superior y pueden considerarse leves. Sin embargo, se estima que alrededor del 5% pueden afectar al tracto respiratorio inferior, y constituir infecciones potencialmente graves, en niños, ancianos y pacientes inmunodeprimidos o con enfermedad pulmonar subyacente. Según los datos publicados en una revisión reciente realizada en España en pacientes en edad infantil 1 , las IRA constituyen aproximadamente el 70% de las enfermedades infecciosas que son motivo de consulta en pediatría extrahospitalaria y, de ellas, más de la mitad tiene un origen viral.
Hasta la fecha se han identificado más de 200 virus diferentes implicados en la patogenia de los distintos cuadros que pueden reconocerse en la IRA (tabla 1). Como Hasta la fecha se han identificado más de 200 virus pertenecientes a 6 familias taxonómicas diferentes asociados con la infección del tracto respiratorio humano. La utilización generalizada de métodos moleculares en los laboratorios de microbiología clínica no sólo ha aportado grandes ventajas al diagnóstico de estas infecciones, sino también está permitiendo profundizar en el conocimiento de la enfermedad y el comportamiento epidemiológico de los virus causantes. Esta tecnología incrementa de manera notable el rendimiento de detección de virus en las muestras respiratorias, debido a su elevada sensibilidad en comparación con las técnicas clásicas y a la posibilidad de identificar virus no cultivables o de crecimiento fastidioso en las líneas celulares habituales, lo que permite realizar el diagnóstico etiológico con mayor rapidez. Sin embargo, también comporta algunos inconvenientes, como son detectar virus que se encuentran colonizando la mucosa respiratoria de personas asintomáticas, o en secreciones de pacientes que ya se han recuperado de una infección pasada, a consecuencia de excreción prolongada de éstos. La secuenciación de los productos obtenidos en la reacción de amplificación genómica permite caracterizar de forma adicional los virus detectados mediante su genotipado, realizar estudios de epidemiología molecular e identificar resistencias a determinados antivirales, por citar sólo algunos ejemplos.
Palabras clave: Diagnóstico molecular. Epidemiología molecular. Reacción en cadena de la polimerasa. Gripe. Virus respiratorios. Infección respiratoria.
To date, more than two hundred viruses, belonging to six different taxonomic families, have been associated with característica general de estas infecciones, un mismo cuadro respiratorio puede ser causado por virus diferentes, y un mismo virus puede originar diversos cuadros. Sin embargo, es frecuente la asociación entre un determinado virus y un cuadro en particular, dependiendo de la estacionalidad y de la edad del paciente, de manera que es posible aventurar un diagnóstico presuntivo basado en las características clínicas y epidemiológicas de la infección. En cualquier caso, el diagnóstico etiológico definitivo siempre debe efectuarse mediante la identificación del agente infeccioso en un laboratorio de microbiología.
La utilización generalizada de métodos moleculares en los laboratorios de microbiología clínica ha aportado notables ventajas al diagnóstico de las IRA de origen viral. En comparación con las técnicas de diagnóstico clásicas, como son el cultivo de virus en líneas celulares (CC) o la detección de antígenos mediante ensayos de inmunofluorescencia (IF) u otros métodos, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), en sus múltiples variantes, ha permitido incre-mentar de manera considerable el número de muestras respiratorias en las que se detecta la presencia de alguno de los virus asociados con IRA. Este hecho está contribuyendo a mejorar el conocimiento de los cuadros respiratorios en los que están implicados cada uno de estos virus, particularmente los que presentan dificultades para su aislamiento o no replican en las líneas celulares utilizadas habitualmente.
La gran cantidad de virus diferentes que pueden estar involucrados y su enorme heterogeneidad condicionan la utilización de técnicas de amplio espectro que posibiliten la detección múltiple de un número considerable de virus en una única alícuota de muestra. Los métodos de PCR múltiple constituyen una herramienta muy útil en el complicado diagnóstico de la IRA, con independencia del sistema empleado para detectar los productos de amplificación, ya sea electroforesis en geles de agarosa, espectrometría de masas o arrays de ácido desoxirribonucleico (ADN). La aportación más novedosa en este sentido está llegando de la mano de los denominados arrays de ADN en fase líquida. En estos sistemas, la accesibilidad de las sondas nucleotídicas se ha mejorado respecto a los arrays de ADN que utilizan sondas unidas a un soporte sólido, de manera que se ha logrado una sensibilidad comparable a métodos de PCR simple. Otra forma de mejorar el diagnóstico de las IRA de origen viral es utilizar métodos de PCR genéricos, que permitan identificar grupos de virus genéticamente relacionados. Estos métodos se basan en la utilización de iniciadores degenerados. Los iniciadores de reacción, por consiguiente, no son 2, sino un conjunto de especies moleculares diferentes, cuyo número dependerá de la cantidad de posiciones variables y de la variabilidad de éstas. Para que el grado de degeneración de los oligonucleótidos sea mínimo, éstos deben diseñarse en regiones del genoma muy conservadas del grupo de virus que se pretenda identificar, ya sean genes exclusivos o regiones de determinados genes específicas de grupo. Otra estrategia muy utilizada para reducir el grado de degeneración de los oligonucleótidos es la incorporación de inosina en las posiciones degeneradas, capaz de unirse con cualquiera de las 4 bases habituales del genoma. En líneas generales, el diagnóstico molecular de adenovirus, enterovirus o rinovirus en la IRA se basa en la utilización de métodos genéricos de PCR, con posibilidad de identificar los 52 adenovirus y alrededor del centenar de enterovirus y rinovirus diferentes identificados hasta la fecha.
La elevada sensibilidad de los ensayos de PCR también comporta algunos inconvenientes para el diagnóstico etiológico de la IRA, como son la detección de virus que se encuentran colonizando la mucosa respiratoria de personas asintomáticas o la detección, a consecuencia de excreción prolongada, del virus en secreciones de pacientes que ya se han recuperado de una infección. Este hecho es, sin duda alguna, la causa de la elevada tasa de IRA atribuidas a más de una especie viral diferente. Posiblemente, la cuantificación de los virus presentes en las muestras respiratorias mediante la utilización de técnicas de PCR cuantitativa en tiempo real pueda ayudar a discernir entre una IRA verdadera o una simple colonización del tracto respiratorio. No obstante, debemos ser conscientes de los problemas que plantea este tipo de muestras, muy variables en lo que respecta a localización, cantidad de muestra obtenida y homogeneidad de éstas, que no son comparables a las muestras de suero donde los estudios de carga viral están más normalizados. Los métodos de PCR en tiempo real, con independencia del sistema de emisión-detección de fluorescencia empleado (sondas TaqMan, FRET o molecular beacon), cuentan con otra serie de ventajas interesantes como son la rapidez y la elevada sensibilidad alcanzada en una única amplificación, comparable a los métodos de PCR convencional que utilizan 2 amplificaciones secuenciales (nested-PCR), así como la disminución de las contaminaciones por producto de amplificación.
Además de mejorar el rendimiento en el diagnóstico, la secuenciación de los productos obtenidos en la PCR permite realizar estudios adicionales de epidemiología molecular, genotipado y sensibilidad a determinados antivirales. Las características y las técnicas moleculares utilizadas se detallarán a continuación para los diferentes virus respiratorios.
La gripe es una IRA que puede afectar a las vías respiratorias altas y bajas, suele presentar un patrón epidémico y es causa importante de morbilidad en la población general y de mortalidad en personas de riesgo alto. Los virus gripales se agrupan en 3 géneros distintos: Influenzavirus A, B y C, pertenecientes a la familia Orthomyxoviridae, cuyo genoma está compuesto por ácido ribonucleico (ARN) fragmentado de polaridad negativa. Los virus gripales A y B contienen 8 segmentos: hemaglutinina (HA), neuraminidasa (NA), nucleoproteína (NP), matriz (M), PA, PB1, PB2 y NS. Los Influenzavirus C incluyen 7 fragmentos, pues la función de la hemaglutinina y la neuraminidasa está contenida en una única proteína: hemaglutinina estearasa (HEF). Los Influenzavirus están sujetos a importantes cambios genéticos inherentes a su doble condición de virus de ARN carente de actividad correctora por parte de la polimerasa y genoma fragmentado que permite la recombinación entre los distintos segmentos. La variabilidad genética es mayor para los virus gripales A, siendo los virus C los más conservados en términos evolutivos. Los pequeños cambios genéticos o mutaciones puntuales dan lugar a la aparición de cepas lo suficientemente diversas como para ser origen de las epidemias estacionales que determinan la necesidad de una reformulación anual de la vacuna. La recombinación en los virus gripales A puede tener lugar entre segmentos génicos de virus de distintos orígenes (mamíferos, aves), que originan un nuevo subtipo que nunca haya circulado entre la población humana, y dan lugar a un virus con potencial pandémico. Todos estos fenómenos junto con la aparición cada vez más frecuente de cepas resistentes a los antivirales, determinan la necesidad de realizar una caracterización genética exhaustiva de los virus gripales.
Entre los métodos de biología molecular aplicados a la detección de los virus gripales, la amplificación genómica mediante PCR es la técnica más empleada, ya sea en tiempo final o en tiempo real. Los segmentos diana de las técnicas de PCR encaminadas al diagnóstico de la infección gripal suelen seleccionarse en genes muy conservados, como los que codifican para la proteína M, la NP o el segmento génico NS, que permiten diferenciar entre los 3 géneros (A, B y C) con independencia de las tasas de evolución del virus. Hay diversos métodos diseñados en estos genes, tanto de PCR convencional 2 , en tiempo real 3,4 y amplificación isotérmica de ARN (NASBA) acoplada a detectar mediante sondas fluorogénicas del tipo molecular beacon 5 . En la tabla 2 se resumen los diversos métodos moleculares que pueden utilizarse en la detección y/o la caracterización de virus gripales.
Los genes considerados de más interés para vigilar la infección producida por virus gripales son la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA), que en el caso de los Influenzavirus A definen el subtipo. La variabilidad genética, consecuencia de mutaciones espontáneas, es más evidente en estos genes codificantes de proteínas de superficie, que son los que están sujetos a presión inmunológica. En consecuencia, el diseño de cebadores en estos genes resulta complicado y, en ocasiones, es necesario degenerar o inosinar determinadas posiciones para poder detectar todas las variantes de virus circulantes. Los subtipos de virus gripales A más importantes desde el punto Enferm Infecc Microbiol Clin. 2008;26 Supl 9:15-25 de vista clínico-epidemiológico son H3N2, H1N1 y H5N1. Los 2 primeros son virus de carácter epidémico y el tercero es un virus con potencial pandémico que produce infecciones graves con elevada mortalidad, por lo que la identificación del subtipo puede tener importantes repercusiones en el ámbito clínico, terapéutico y epidemiológico. La detección de infecciones en humanos causadas por virus gripales pertenecientes a subtipos distintos de los habituales (H5N1, H7N7, H7N3 y H9N2) ha favorecido en los últimos años el diseño y la comercialización de técnicas de subtipado de los virus gripales A, y especialmente de detección del subtipo H5N1, ya sea mediante PCR 6,7 , sistemas de detección basados en microarrays o biochips 8 , e incluso arrays de ADN en fase líquida 9 .
Los métodos de PCR pueden acoplarse a técnicas de tipado rápido y caracterización, como la determinación del polimorfismo genómico en función de los fragmentos obtenidos tras la digestión de éste con enzimas de restricción (RFLP) y, especialmente, la secuenciación completa o parcial de los segmentos génicos virales. La técnica de RFLP es capaz de subtipar HA y NA y, a la vez, caracterizar genes internos, lo que facilita la detección de recombinantes y la determinación del origen de los distintos segmentos (humano o zoonótico) 10 . La PCR-RFLP también se ha utilizado para detectar resistencias a adamantanos 11 . Tiene los inconvenientes de no permitir la automatización ni la diferenciación entre genes con bajo nivel de polimorfismo. Una caracterización genética más precisa puede realizarse mediante secuenciación, seguida de análisis filogenético y del estudio de los aminoácidos clave implicados en alguna actividad biológica: unión a receptores, antigenicidad, actividad enzimática, o unión de antivirales, y cuyas mutaciones puedan repercutir en las características clínicas y patogénicas de la cepa estudiada. Por tanto, la secuenciación de genes como la HA, NA y el segmento M aportan mucha información en la caracterización y la epidemiología molecular. La HA es el principal determinante antigénico de los virus gripales y contiene las subunidades HA1 y HA2, estando en la primera los aminoácidos causantes de la antigenicidad y de la unión al receptor celular. Por tanto, la secuenciación de esta región proporciona información referente a las características antigénicas y de afinidad por el receptor. Otra zona de la HA fundamental desde el punto de vista de la virulencia y que permite diferenciar entre virus de alta y baja patogenicidad en los subtipos H5 y H7 es la que codifica el péptido de fusión, para el que se ha descrito un método de PCR en tiempo real para su diferenciación 12 . La NA, al igual que la HA, presenta capacidad antigénica, aunque en menor grado que ésta. Desde la comercialización y la utilización en la práctica clínica de los antivirales inhibidores de la neuraminidasa (zanamivir y oseltamivir), se ha observado un incremento de la frecuencia de resistencias a este grupo de antivirales en niños tratados e inmunodeprimidos, y no se descarta la aparición de variantes resistentes estables surgidas por mutación espontánea. Por ello, una de las principales aplicaciones de la secuenciación de la NA es el seguimiento de las resistencias genotípicas a los inhibidores de neuraminidasa. De igual manera, la secuenciación del segmento M, y en concreto la zona que codifica la proteína M2, permite detectar los cambios que confieren resistencia a los adamantanos (amantadina y rimantadina). Utilizando tecnología basada en la pirosecuenciación, se ha desarrollado un método para detectar de forma rápida resistencias a adamantanos 13 .
La caracterización genética se ha centrado en el estudio de los virus gripales A y B debido a que los Influenzavirus C apenas experimentan cambios genéticos, en general carecen de estacionalidad y habitualmente se les atribuye la producción de casos esporádicos. Sin embargo, recientemente se ha publicado un brote epidémico ocurrido en Japón 14 , donde el diagnóstico se realizó detectando el gen NS y la caracterización del brote mediante secuenciación del gen que codifica para la proteína de superficie HEF. 
El virus respiratorio sincitial (VRSH) y el Metapneumovirus (MPVH), se clasifican en la familia Paramyxoviridae, subfamilia Pneumovirinae, géneros Pneumovirus y Metapneumovirus. Están distribuidos por todo el mundo, y ocasionan un número elevado de IRA, con un rango de gravedad que abarca desde una enfermedad leve hasta muy grave, especialmente en niños de corta edad, ancianos y adultos con inmunodepresión importante.
El VRSH se considera uno de los virus humanos con más potencial infeccioso, el cual se transmite mediante gotículas grandes o fómites. El período de incubación es de 4-5 días, seguido de un cuadro clínico cuya duración puede variar. La excreción de virus en los niños puede prolongarse entre 1 y 3 semanas después de la recuperación, y llegar hasta 6 semanas en pacientes inmunodeprimidos. Este virus presenta un claro tropismo por el aparato respiratorio y parece que el daño citopático causado directamente por el virus contribuye significativamente a la enfermedad. La respuesta inflamatoria es muy importante en la generación de la enfermedad respiratoria por VRSH. El sistema inmunitario adaptativo desempeña un papel primordial en la recuperación de la infección y en la resistencia a la reinfección. Ambas respuestas, celular y humoral, contribuyen a la recuperación, y se comprueba que es crucial para ella el equilibrio entre sus distintos componentes. Los cuadros clínicos producidos por el MPVH son semejantes, aunque no idénticos, a los descritos en la infección por el VRSH 15 .
El VRSH produce brotes anuales durante los meses de invierno en los países de clima templado, mientras que en los tropicales las infecciones ocurren sobre todo en la estación lluviosa. El MPVH también cursa en brotes, en general de menor intensidad, al final del invierno o durante la primavera. Aunque no se entiende bien el motivo, el VRSH es capaz de infectar durante los primeros meses de vida a pesar de la existencia de anticuerpos maternos. El MPVH también infecta a los lactantes más jóvenes, pero no suele producir cuadros graves en edad tan temprana. La práctica totalidad de los niños presentan la primoinfección por VRSH durante los primeros 2 años de vida y alrededor de la mitad de ellos experimenta también al menos una reinfección en ese tiempo. Lo mismo puede decirse del MPVH en los primeros 5 años de vida 16 . Además, el VRSH es una causa muy importante de hospitalización de lactantes y de infección nosocomial en niños y pacientes inmunodeprimidos. Dado que los adultos continúan presentando reinfecciones durante su vida, aun cuando la clínica se va suavizando con ellas, el personal sanitario puede diseminar el virus dentro del hospital si no se aplican las debidas precauciones 17 . Se han diferenciado 2 grupos o subtipos antigénicos en el VRSH (A y B), distinguibles por su reacción frente a anticuerpos monoclonales y mediante análisis genéticos, distribuidos por todo el mundo 18 . También en el MPVH se han podido identificar subtipos antigénicos y genéticos 19 y en ellos, diferenciar genotipos (tabla 1).
Las partículas virales de VRSH y MPVH (revisión actualizada en Collins y Crowe 20 ) son redondeadas, con diámetros de 150-300 nm, aunque muchas veces se presen-
El VRSH presenta en el extremo 3' de su genoma una secuencia no codificante, que contiene las señales para la iniciación de la síntesis del ARN, seguida de los genes que codifican las diferentes proteínas del virus (3'-[NS1-NS2]-N-P-M-SH-F-G-L-5'), separados por regiones intergénicas no codificantes. En el extremo 5' hay otra región no codificante, que contiene los promotores para la replicación del ARN viral y las señales para el empaquetamiento del genoma. Los genes cuyas proteínas se necesitan en mayor cantidad se encuentran próximos al extremo 3', de manera que su transcripción se ve favorecida. Mucha de esta información podría extenderse también al MPVH, mucho menos estudiado todavía, ya que se identificó por primera vez en 2001 16 .
En niños con bronquiolitis o con episodios repetitivos de asma y en ancianos con bronquitis, neumonía o exacerbaciones asmáticas, ocurridos durante brotes epidémicos, debe establecerse una sospecha de infección por VRSH o MPVH. También debe procederse al diagnóstico microbiológico en caso de brotes, especialmente si se producen en hospitales o en instituciones cerradas. Como ya se ha indicado antes, es importante realizar el diagnóstico diferencial con otros virus respiratorios. El aislamiento viral, en especial en el caso del MPVH, es muy complicado por la poca sensibilidad en los CC habituales y la aparición tardía del efecto citopático 21 . Probablemente ésta fue la causa de la tardanza en el descubrimiento del MPVH. En el VRSH, los métodos rápidos (ELISA, IF e inmunocromatografía) fueron sustituyendo a los CC, sobre todo tras la aparición de los anticuerpos monoclonales. En concreto, la IF proporciona una gran sensibilidad y especificidad y es un método barato, pero tiene el inconveniente de requerir una gran experiencia en la lectura de las preparaciones. Algunos laboratorios la están empleando ahora también con éxito en la detección del MPVH 22 . Dadas las dificultades encontradas para efectuar el diagnóstico virológico de estos virus, los métodos moleculares han supuesto una gran ayuda para mejorar el conocimiento de estas infecciones. La técnica molecular con más sensibilidad y utilidad ha sido la PCR en sus diferentes modalidades. Para detectar estos virus en las muestras clínicas se amplifican fundamentalmente frag-mentos de los genes internos, más conservados, como los que codifican la nucleoproteína N o la proteína matriz M. Puede utilizarse también el gen de la proteína de fusión F, más variable que los anteriores, por lo que además del diagnóstico permite diferenciar los 2 subtipos de VRSH 2 . El diagnóstico del MPVH se ha basado desde sus comienzos en las reacciones de amplificación e identificación genómica. En los primeros trabajos se utilizó el gen L de la polimerasa 16 , pero después se ha extendido el uso de otros genes, como N y M 23, 24 . La rapidez y la cuantificación en el diagnóstico se han alcanzado gracias a la introducción de técnicas de PCR en tiempo real 25 .
Para los estudios epidemiológicos se analizan los genes de mayor variabilidad. El gen de la glucoproteína G es el más adecuado para realizar estudios de epidemiología molecular en ambos virus por su elevada variabilidad. No obstante, se han utilizado también los genes de la proteína SH, de variabilidad intermedia y F con menor capacidad de variación. El estudio de diversos genes ha mostrado resultados concordantes para la diferenciación de los subtipos. Dentro de cada subtipo, en ambos virus se distinguen genotipos diferentes, entre los que no siempre se encuentran diferencias antigénicas. Sin embargo, se ha comprobado que en las epidemias pueden encontrarse circulando a la vez los 2 subtipos, e incluso varios genotipos de cada uno de ellos. La secuenciación de los fragmentos amplificados permite establecer relaciones filogenéticas y estudiar la evolución de los linajes de virus. La utilización de programas informáticos para comparar secuencias y la facilidad de acceso a las secuencias depositadas en las bases de datos, están permitiendo también el diseño de ensayos simplificados de RFLP, que pueden ser de gran utilidad para el subtipado o la identificación de genotipos 26 . La incorporación de los métodos moleculares al diagnóstico etiológico de estos virus está permitiendo tomar medidas de control, así como profundizar en el conocimiento de estas infecciones e identificar las diferencias clínicas y epidemiológicas.
Los virus parainfluenza se han asociado con todo tipo de IRA de vías altas (laringotraqueítis) y bajas (bronquiolitis, bronquitis, neumonía). Actualmente se reconocen 5 virus parainfluenza diferentes (tabla 1): a) los virus parainfluenza 1 y 3 (VPI-1 y VPI-3) encuadrados en el género Respirovirus, y b) los virus parainfluenza 2, 4A y 4B (VPI-2, VPI-4A y VPI-4B), pertenecientes al género Rubulavirus, ambos en la familia Paramyxoviridae. Los virus parainfluenza tienen un genoma constituido por una molécula de ARN de polaridad negativa y codifican 6 proteínas estructurales: a) 2 proteínas de superficie, la hemaglutinin-neuraminidasa (HN) implicada en el reconocimiento del receptor, y la proteína de fusión (F) que cataliza la entrada del virus en la célula infectada; b) 3 proteínas que forman parte del complejo de la nucleocápside, como son la nucleoproteína (N), fosfoproteína (P) y proteína L, y c) la proteína matriz (M). El número de proteínas no estructurales es variable, dependiendo del tipo de virus parainfluenza, pero codifican al menos una proteína de este tipo. De manera general, podemos representar el mapa genómico de los virus parainfluenza como 3'-N-P-M-F-HN-L-5'. Debido a que la mayoría de las de cepas de VPI-4 y algunas variantes de VPI-2 y VPI-3 son de difícil cultivo, han sido las técnicas de diagnóstico molecular, las que han adjudicado a estos virus un papel cada vez más destacado en la etiología de la IRA. Los virus parainfluenza tienen menor diversidad genética que otros virus respiratorios, como los virus gripales A o el VRSH, por lo que para el diseño de técnicas de detección molecular se han utilizado genes diana muy diversos, entre los que se incluyen los genes que codifican proteínas de superficie (HN y F), sometidos a mayor presión selectiva y que, por tanto, presentan una variabilidad mayor. Los segmentos utilizados en el diagnóstico molecular y la diferenciación de los virus parainfluenza mediante técnicas de PCR múltiple convencional son los que codifican la HN, para VPI-1, VPI-2 y VPI-3 27,28 , y la fosfoproteína (P), para distinguir VPI-4A y VPI-4B 27 . Una importante ventaja de estos métodos es que la secuenciación posterior del producto de amplificación permite realizar estudios de epidemiología molecular 27, 29 . Estos mismos genes también se han utilizado como dianas en el diseño de PCR múltiple en tiempo real 30 y NASBA adaptada a la detección mediante sondas del tipo molecular beacon 31 . El gen N es uno de los segmentos más conservados y el que presenta mayor número de transcritos. La disminución prematura de actividad polimerasa, común para todos los Paramyxovirus, da como resultado un gradiente de transcripción de manera que los genes próximos al promotor proximal 3' del genoma se transcriben más eficientemente que los genes distales, más próximos al extremo 5'. Por esta razón, algunas técnicas de PCR para la detección y la cuantificación de virus parainfuenza se han diseñado en este segmento 32 .
Los virus parainfluenza, y en concreto el VPI-3, se han asociado con brotes nosocomiales, fundamentalmente en unidades de trasplante de médula ósea. El estudio de la epidemiología molecular de estos brotes se ha basado en la caracterización de los genes que codifican las proteínas de superficie (HN y F), las cuales, al ser más variables, son las que más información epidemiológica proporcionan 33 . Es posible discernir la cadena de transmisión y la existencia de múltiples reintroducciones de cepas virales circulantes en ese momento en la comunidad, pero debido a la relativa baja variabilidad que presentan los virus parainfluenza, la epidemiología molecular aplicada al estudio de estos virus, siendo una herramienta útil, debe siempre apoyarse en los datos epidemiológicos y clínicos.
Como consecuencia de la escasez de métodos rápidos para el diagnóstico y su difícil crecimiento en cultivo celular, el VPI-4 es un virus al que se le ha otorgado escasa importancia y se dispone de poca información acerca de sus características clínicas y epidemiológicas 34 . Los estudios de epidemiología molecular realizados sobre este virus se han basado en la caracterización completa de los genes F y HN 35 o P 36 . Los trabajos publicados hasta el momento coinciden en la mayor incidencia de infecciones por VPI-4A respecto a VPI-4B.
Los adenovirus (ADV) humanos están asociados a una gran variedad de cuadros clínicos y destacan, entre las IRA, la neumonía y otras afecciones del tracto respirato-rio inferior. Los 52 serotipos/genotipos de ADV humanos reconocidos hasta la fecha, clasificados en 6 especies distintas, A-F (tabla 1), se encuadran dentro de la familia Adenoviridae, en el género Mastadenovirus. La clasificación taxonómica de los ADV, basada tradicionalmente en los anticuerpos neutralizantes generados frente a determinadas proteínas de la cápside viral, coincide exactamente con la clasificación más actualizada, basada en la homología en la secuencia de nucleótidos del genoma o de los aminoácidos correspondientes. Son virus sin envuelta, cuya cápside de simetría icosaédrica mide 70-90 nm. Los viriones contienen 11 tipos de proteínas diferentes, 7 de ellas localizadas en la cápside y 4, en el core. En cada uno de los vértices de la cápside se imbrica una proteína denominada fibra, acabada en una cabeza redondeada. La proteína de la base de la fibra se denomina pentón y la mayoritaria de la cápside es el hexón.
Desde el punto de vista patogénico, estos virus se transmiten por vía oral utilizando como receptores el ácido siálico y el receptor común para Coxsackievirus y ADV (CAR). Los cuadros respiratorios asociados más frecuentes son bronquiolitis, bronquitis necrosante y neumonía intersticial. Otros cuadros clínicos no respiratorios como la infección ocular, la cistitis hemorrágica aguda y la meningoencefalitis, pueden comenzar también con sintomatología respiratoria. Son ubicuos en el organismo y se excretan durante varios meses, lo que es de enorme importancia a la hora de interpretar resultados positivos de diagnóstico. Además de los casos esporádicos que se producen durante todo el año de manera individual, son frecuentes como agentes causales de brotes escolares, guarderías o cuarteles que pueden llegar a ser epidémicos.
Está constituido por una única molécula lineal de ADN bicatenario, con una longitud de 26-45 Kb, asociado a proteínas codificadas por el virus. Los extremos 5' de cada cadena de ADN están unidos covalentemente a una proteína terminal codificada por el virus.
Al tratarse de virus ADN, los métodos de extracción de ácidos nucleicos de muestras respiratorias deben asegurar la obtención tanto de ARN como de ADN. Los métodos moleculares están sustituyendo a los tradicionales, basados en el aislamiento en CC y en la detección de antígenos por IF. Los métodos más utilizados se basan en la posibilidad de detección simultánea de los 52 serotipos conocidos mediante PCR genérica. Los oligonucleótidos se diseñan en regiones conservadas, frecuentemente en el gen L3 que codifica el hexón 37 , aunque hay métodos diseñados en el gen L5 que codifica la fibra o el gen que codifica la ADN polimerasa 38 . Algunos métodos detectan una única especie de las 6 reconocidas 39 , lo que les circunscribe a un número parcial de serotipos. La introducción de la PCR en tiempo real supone una gran ventaja por su rapidez y, además, permite cuantificar la cantidad de ADN genómico de los diferentes serotipos 40 .
Al igual que ocurre en los métodos de diagnóstico, los métodos tradicionales de tipificación basados en la neutralización, en la inhibición de la hemaglutinación con sueros tipo específicos o la PCR-RFLP, se han sustituido por métodos moleculares. Muchos de estos métodos se basan en el análisis de la secuencia del producto de amplificación y están diseñados en regiones que codifican los determinantes antigénicos para poder diferenciar de manera precisa la totalidad de los serotipos de ADV reconocidos hasta ahora 41, 42 . Estos métodos están permitiendo asociar a cuadros respiratorios determinados serotipos de ADV que tradicionalmente no se han asociado a IRA. En algunos de los serotipos (ADV3 y ADV7, por ejemplo), el análisis de la secuencia genómica de determinados genes ha revelado una variabilidad importante, de manera que, además, permitiría poder identificar el origen biogeográfico de las cepas asociadas a brotes epidémicos concretos.
La familia Picornaviridae está compuesta por virus encuadrados en un total de 9 géneros, de los cuales 5 producen infección en humanos: Rinovirus, Enterovirus, Hepatovirus, Kobuvirus y Parechovirus. En concreto, los Rinovirus (RV), y en menor medida los Enterovirus (EV), se han asociado con IRA. Son virus muy simples, pequeños (20-30 nm), con forma esférica. Su cápside, de simetría icosaédrica y sin envuelta lipídica, está compuesta por 60 monómeros de 4 proteínas estructurales, VP1, VP2, VP3 y VP4, organizados en 12 pentámeros.
Los RV son los virus más frecuentes en el catarro común, aunque en estudios recientes se han asociado a infecciones del tracto respiratorio inferior más graves, sobre todo en niños, ancianos y pacientes inmunodeprimidos. El riesgo de producir una infección grave en personas con enfermedad respiratoria previa (asma, bronquitis crónica, fibrosis quística) es muy elevado. Se han descrito un total de 100 serotipos diferentes agrupados en 2 especies, A y B (tabla 1), y más recientemente una nueva especie C 43 . Los métodos de PCR son los de elección para realizar una detección y una tipificación molecular de elevada sensibilidad directamente en muestra clínica de cada uno del centenar de RV conocidos.
Los EV se asocian a un número muy elevado de cuadros clínicos y, aunque su nombre alude a infección entérica, no producen sólo infección gastrointestinal, sino también son muy comunes en cuadros respiratorios y neurológicos. Las vías de transmisión habituales son la respiratoria y la oral-fecal. Los cuadros de bronquitis y de neumonía intersticial son ocasionales. Se han descrito cerca de 100 serotipos y genotipos que se agrupan en 4 especies: A-D (tabla 1). Los métodos de PCR son de elección para realizar una detección sensible, una tipificación molecular y una caracterización de los diferentes linajes dentro de cada serotipo circulante.
Está constituido por una molécula de ARN de polaridad positiva que se empaqueta en la cápside. El 90% del genoma es codificante, aunque en ambos extremos hay secuencias no codificantes que participan en la replicación y la traducción del ARN. En la porción codificante del genoma se pueden diferenciar 3 regiones bien definidas: a) P1 que constituirá las proteínas estructurales (VP4, VP2, VP3 y VP1); b) P2 que constituirá las proteínas 2A, 2B y 2C, y c) P3 que constituirá las proteínas 3A, 3B, 3C y 3D. La proteína 3D se define funcionalmente como la ARN polimerasa dependiente del ARN. La organización del genoma en EV y RV es similar, con la excepción de una deleción de 120 nucleótidos en la región 5'NCR de los RV.
La aplicación de los métodos moleculares ha introducido numerosos cambios en el diagnóstico de RV y EV. Las principales ventajas de estos métodos son la diferenciación entre ambos géneros y la posibilidad de detección directa en muestras clínicas, gracias al diseño de métodos con elevada sensibilidad y especificidad.
Los métodos de PCR genéricos para la detección simultánea y la diferenciación posterior de EV y RV están diseñados de manera que la deleción de 120 nucleótidos de los RV en la región 5'NCR se incluya en el producto de amplificación. Esta región contiene fragmentos de secuencias conservadas para ambos géneros, que son la diana para el diseño de los oligonucleótidos genéricos. Para diferenciar EV de RV, se realiza un análisis posterior del producto amplificado, ya sea por diferenciación del tamaño mediante electroforesis en gel de agarosa 44 , por hibridación con sondas específicas 45, 46 o secuenciación 47 . La PCR en tiempo real permite detectar y cuantificar estos virus en un período breve 48 .
En el caso de los métodos de PCR específicos, la diversidad de RV y EV es un gran problema para el diseño de oligonucleótidos y sondas específicas que permitan detectar de forma eficaz todos los serotipos/genotipos de cada género en las muestras clínicas. Además, en el caso de los RV, la falta de secuencias en las bases de datos públicas dificulta el diseño de nuevos métodos moleculares. Son escasas las referencias de métodos convencionales específicos 49,50 y de PCR en tiempo real 51, 52 . No ocurre lo mismo en el caso de los EV, para los que se dispone de un buen número de métodos de PCR específicos convencionales 53-55 y PCR en tiempo real 56, 57 .
En la actualidad, tras el uso de métodos de PCR, la secuenciación de los productos de amplificación y el análisis filogenético de estas secuencias son la herramienta más generalizada para la identificación, clasificación y la epidemiología molecular de los RV y EV. Estos métodos se diseñan en regiones genómicas que presenten suficiente variabilidad para definir con rango taxonómico los picornavirus conocidos o los posibles nuevos picornavirus. Este sistema ha sustituido al tradicional de serotipificación. En el caso de los EV, estas regiones suelen corresponder con los genes que codifican la proteína estructural VP1 y la no estructural 3D (polimerasa) 58, 59 . Además, en los últimos años se ha descubierto un gran número de nuevos EV (EV74-76, EV79-91, EV94, EV97, EV100 y EV101), identificados a partir de diferencias genéticas y encuadrados en alguna de las 4 especies reconocidas 58,60-63 . Por otro lado, el estudio de la secuencia completa o parcial del gen de la proteína VP1 de determinados serotipos muy prevalentes es fundamental para conocer la evolución del virus en el tiempo, así como su capacidad de infectar durante diferentes temporadas de circulación a un gran número de personas. La definición de linajes y sublinajes y su presentación en el ámbito local y global es de enorme interés en los estudios de epidemiología de determinadas infecciones 64 . Respecto a RV, hay trabajos en los que se secuencian y analizan las proteínas estructurales VP4, VP2 y VP1 [65] [66] [67] .
Los coronavirus (CoV), del orden Nidovirales, familia Coronaviridae, género Coronavirus, son grandes virus con envuelta y genoma ARN de polaridad positiva, que reciben su nombre por las proteínas de la espícula que presentan de forma radiada en la superficie del virión. El género Coronavirus se ha dividido clásicamente en 3 grupos. Antes del descubrimiento del SARS-CoV, los CoV humanos conocidos eran el CoV humano 229E (HCoV-229E) y el OC43 (HCoV-OC43). El grupo 1 contiene, además de HCoV-229E, virus porcinos productores de gastroenteritis y virus felinos productores de peritonitis. El grupo 2 incluye HCoV-OC43, coronavirus bovinos y virus de la hepatitis murinos. El grupo 3 está formado únicamente por virus aviares productores de bronquitis infecciosa. En noviembre de 2002 apareció en China el síndrome respiratorio agudo grave (SARS, en inglés), que se extendió rápidamente y llegó a afectar a 8.096 personas en 29 países y causó 774 muertes (Organización Mundial de la Salud). En marzo de 2003 se identificó un nuevo CoV (SARS-CoV) como el agente causal de la enfermedad. Desde la aparición del SARS-CoV, dada la elevada mortalidad asociada a éste, se ha incrementado el interés por los CoV, lo que ha permitido identificar, al menos, 3 nuevos CoV humanos, incluido el propio SARS-CoV, y la descripción de nuevos subgrupos de CoV. El SARS-CoV presenta una entidad tal que se ha considerado como una nueva especie asociada filogenéticamente al subgrupo 2b. En el año 2004 se describió el HCoV-NL-63, que representa una nueva especie de CoV incluida en el grupo 1b; y en el año 2005 se identificó el HCoV-HKU1 como integrante del grupo 2 68 .
Los CoV humanos clásicos (HCoV-229E y HCoV-OC43) son virus causantes de resfriado común, que pueden llegar a provocar IRA más graves en niños, ancianos, y personas con una enfermedad de base. Sin embargo, los virus HCoV-HKU1 y HCoV-NL63 se han asociado a infecciones tanto del tracto respiratorio superior como inferior, y el HCoV-NL63 se ha asociado al síndrome croup o laringotraqueítis aguda. El SARS-CoV es el CoV humano más agresivo, que ocasiona una enfermedad pulmonar que puede ser causa de muerte hasta en un 10% de los casos.
Está constituido por una molécula de ARN de polaridad positiva con un tamaño variable entre 27 y 33 Kb, lo que les convierte en los más grandes entre los virus ARN. Todos los CoV comparten una organización conservada de su genoma, donde los 2 tercios próximos al extremo 5' contienen los genes no estructurales que codifican el conjunto de proteínas necesarias para la replicación (1ab o replicasa). El tercio 3' restante del genoma contiene los genes que codifican las proteínas estructurales, espícula (S), proteína de la envuelta (E), membrana (M) y nucleoproteína (N), que generalmente se encuentran en el orden 5'-Rep1a-1b-S-E-M-N-3'. Sólo algunos miembros del grupo 2 contienen también la proteína hemaglutinina es-terasa (HE). Además, el genoma de los CoV contiene un número variable de genes que codifican proteínas no estructurales que se intercalan entre estos genes en un orden característico de cada grupo de virus.
Clásicamente, las infecciones causadas por CoV se diagnosticaban mediante aislamiento en CC, microscopia electrónica y serología. Después, el diagnóstico se basó en ensayos de detección antigénica y PCR, siendo estos últimos los más utilizados actualmente, debido a su mayor sensibilidad y a la posibilidad de detectar varios virus simultáneamente en la misma muestra. Los primers para los ensayos de PCR se pueden diseñar para que de forma genérica reconozcan todos los miembros del género, o para que reconozcan un determinado virus. La mayoría de los métodos de PCR utilizados en el diagnóstico de CoV humanos se basan en la amplificación de la secuencia correspondiente a la polimerasa (ARN polimerasa, ARN dependiente o RpRd) dentro del gen Rep1ab, tanto PCR en tiempo real 69 , como PCR convencional 70 . Otro de los genes utilizados para este fin es el gen N 71,72 .
La secuenciación de los productos de amplificación y su posterior análisis filogenético se utilizan para identificar, clasificar y realizar el estudio evolutivo de los CoV. Para estos estudios, se han utilizado también los genes N y replicasa, especialmente la secuencia correspondiente a RpRd, junto con el gen más variable, S 73-76 . La secuencia de RpRd es la más versátil, puesto que contiene zonas muy conservadas entre todos los miembros del género CoV, intercaladas por secuencias variables. En lo que respecta a SARS-CoV, la aplicación de las técnicas moleculares a la detección y análisis filogenético ha permitido realizar estudios exhaustivos en cuanto a evolución del virus, los mecanismos del salto interespecie y la adaptación al nuevo huésped tras encontrar el reservorio animal natural de los CoV 77 .
El bocavirus humano (HBoV) fue descubierto en 2005 y es, hasta el momento, el último en incorporarse a la larga lista de los virus asociados con infección respiratoria. Según estudios de homología de secuencia se asignó al género Bocavirus, hasta entonces compuesto por otros 2 virus, uno bovino y otro canino (que dan origen al nombre del género), perteneciente a la subfamilia Parvovirinae, familia Parvoviridae 78 . Como todos los parvovirus, son virus esféricos de pequeño tamaño (18-26 nm de diámetro) y simetría icosaédrica, carentes de envoltura, y con genoma constituido por una molécula lineal de ADN monocatenario de alrededor de 5 Kb. La estructura del genoma es similar a la que se observa en los parvovirus autónomos, que presentan un gen que codifica para una proteína no estructural, NS-1, localizado en uno de los extremos y otro que codifica las proteínas de la cápside, VP1 y VP2, en el otro. La presencia de un tercer gen localizado entre los 2 anteriores y que codifica otra proteína no estructural, NP-1, de función desconocida, es una característica exclusiva del género Bocavirus.
Desde su descubrimiento, HBoV se ha asociado con IRA en niños de corta edad, y ha causado cuadros que van desde una simple infección del tracto respiratorio superior, a enfermedades más graves, como sibilancias recurrentes, bronquiolitis o neumonía. Hasta la fecha, HBoV no ha podido replicarse in vitro en CC, por consiguiente, el único método diagnóstico es la detección del genoma en muestras respiratorias mediante PCR, en la mayor parte de los casos diseñadas para amplificar un fragmento de los genes más conservados del genoma, NS-1 y NP-1. Las tasas de prevalencia observadas en los diferentes estudios realizados en todo el mundo varían entre el 1,5 y el 19%, probablemente debido a diferencias propias a las poblaciones estudiadas, tipo de muestra obtenida o sensibilidad de los métodos de PCR empleados, más que a diferencias inherentes a la propia prevalencia del virus 79 .
A pesar de que HBoV se detecta como patógeno único en un porcentaje nada desdeñable de muestras respiratorias de pacientes con IRA, la tasa de codetección con otros virus respiratorios es elevada, con un rango que oscila entre el 37 y el 90% 80 . Este hecho hace que el papel patógeno de este virus en la infección respiratoria sea cuestionado por determinados autores. Sin embargo, en la mayor parte de los estudios en los que se ha comparado, la prevalencia de HBoV en pacientes con IRA ha sido significativamente superior a la que se ha observado en pacientes asintomáticos [81] [82] [83] . No obstante, es preciso indicar que un problema inherente a los estudios que incluyen pacientes asintomáticos es que las muestras respiratorias obtenidas en estos controles no es comparable, en cuanto a su volumen y calidad, con las que se obtienen a partir de pacientes sintomáticos.
Los estudios de cuantificación viral en muestras respiratorias también podrían ser concluyentes en atribuir a HBoV un papel patógeno en la IRA. Se ha propuesto que una carga viral elevada estaría asociada con enfermedad respiratoria, en tanto que la detección de una carga viral baja no parece tener relevancia clínica y podría ser indicativa de una excreción prolongada del virus después de haber causado la infección 79, 83 . Sin embargo, otros autores no han observado correlación alguna entre carga viral de HBoV y gravedad de los síntomas 84-86 . una caracterización más completa de los virus detectados. La utilización de estos métodos se generalizará en la medida que los potenciales usuarios se vayan familiarizando con las técnicas moleculares, éstas vayan aumentando su nivel de automatización, y se comercialicen técnicas aprobadas para el diagnóstico.
Los autores han declarado no tener ningún conflicto de intereses.