Xét nghiệm PCR - ý nghĩa và một số kỹ thuật thường dùng
Thứ Năm, 21 tháng 1, 2021
ThS. Phạm Quỳnh Liên, Trung tâm Xét nghiệm

Có lẽ trong chúng ta không ít người đã từng thực hiện xét nghiệm PCR. Đây là một kỹ thuật xét nghiệm đang được sử dụng phổ biến hiện nay bởi cho phản ứng nhạy và kết quả có độ chính xác cao. Điều đáng nói là ngay cả những người đã từng thực hiện xét nghiệm này cũng ít ai biết chính xác nó là gì, được thực hiện ra sao, có ý nghĩa như thế nào,...

sub_title: 1. Ý nghĩa của xét nghiệm PCR trong y học hiện đại
sub_content: Xét nghiệm PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong y học hiện đại để chẩn đoán một số bệnh đặc hiệu có liên quan đến những virus khó hoặc không thể tìm thấy trong xét nghiệm truyền thống. Xét nghiệm này có ý nghĩa đặc biệt với:


- Phát hiện một số tác nhân khó hoặc không thể nuôi cấy trong môi trường xét nghiệm thường quy như: vi khuẩn (Mycoplasma, Chlamydia,...), virus (HIV, Dengue, H5N1, viêm gan B, viêm gan C, SARS,...).
- Tìm và phát hiện những tác nhân đã nuôi cấy nhưng thất bại bởi trước đó do bị chết hoặc có rất ít trong mẫu bệnh phẩm như: viêm màng não mủ bị mất đầu, vi khuẩn lao bị thất bại trong nuôi cấy,...
- Tìm và phát hiện chủng vi khuẩn kháng thuốc.
- Phát hiện các chủng của virus Dengue gây ra bệnh sốt xuất huyết.
- Xác định các đột biến gen liên quan đến ung thư như đột biến gen, gen BRCA1 - BRCA2 trong ung thư vú, đột biến gen APC trong ung thư đại tràng,...
- Nghiên cứu hệ kháng nguyên bạch cầu ở người.

sub_title: 2. Một số kỹ thuật PCR thường dùng
sub_content: 2.1. Thành phần cần có của xét nghiệm PCR
Để thực hiện được một xét nghiệm PCR cần có các thành phần sau:
- ADN mẫu chứa đoạn ADN cụ thể đã được tinh sạch để dùng nhân bản về sau.
- Primers (đoạn ADN mồi) dài khoảng vài chục Kb để định vị điểm bắt đầu và điểm kết thúc đoạn ADN mẫu.
- DNA polymerase (enzyme đóng vai trò tổng hợp các đoạn ADN bản sao của ADN mẫu). Đây phải là loại enzyme có khả năng chịu nhiệt cao.
- Nucleotides gồm 4 loại: A, T, C và G có vai trò cấu tạo nên cấu trúc của ADN  bản sao.
- Dung dịch đệm để cung cấp môi trường cho enzyme DNA polymerase hoạt động.
- Ống PCR plastic chuyên dụng để phối trộn dung dịch phản ứng PCR trước khi cho vào thiết bị làm xét nghiệm PCR.
2.2. Những kỹ thuật PCR thường dùng trong xét nghiệm
Để thực hiện xét nghiệm PCR, hiện nay người ta thường dùng một số kỹ thuật sau:
- PCR đơn mồi
Kiểu PCR này tương đối cổ điển, nó chỉ dùng 1 cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại cho 1 đoạn trình tự mục tiêu duy nhất mà thôi.


- PCR đa mồi
Đây là kỹ thuật PCR dùng nhiều cặp mồi khác nhau để khuếch đại cho các trình tự mục tiêu khác nhau có trong cùng 1 mix phản ứng. Muốn tạo được phản ứng đa mồi thì các cặp mồi được mang vào sử dụng cần phải có cùng nhiệt độ bắt cặp và chúng không được bắt cặp cùng hoặc bắt cặp chéo nhau.
Thêm vào đó, độ nhạy của PCR đa mồi cũng cần tương đương đơn mồi. Tuy nhiên, do điều này khó thực hiện được PCR đa mồi thường được dùng ở các tế bào nuôi cấy vì khi ấy trình tự đích sẽ có số lượng đủ lớn để không đòi hỏi quá khắt khe về độ nhạy.
- PCR tổ
Với kỹ thuật PCR tổ cần có 2 cặp mồi: 1 cặp mồi bên ngoài và 1 cặp mồi bên trong. Trong đó, cặp mồi bên ngoài tham gia PCR lần 1 trước nhằm làm tăng số lượng DNA chứa trình tự đích; còn cặp mồi bên trong tham gia PCR lần 2 giúp phát hiện trình tự đích. Thường thì khi cặp mồi đặc hiệu cho trình tự đích cho độ nhạy kém người ta sẽ sử dụng kỹ thuật PCR tổ.
- RT-PCR
Khi trình tự đích là RNA thì sẽ sử dụng quy trình kỹ thuật RT-PCR. Muốn vậy, trước khi PCR, cần thực hiện thêm bước dùng enzyme reverse transcriptase để chuyển RNA thành cDNA. Đây chính là giai đoạn RT.
+ RT-PCR 1 bước: chỉ thực hiện RT và PCR trong 1 ống nghiệm duy nhất, các thành phần cho RT lẫn cho PCR đều chứa cả trong mix ban đầu.
+ RT-PCR 2 bước: ủ RT ở 1 ống nghiệm riêng. Để thực hiện PCR, người ta sẽ cho DNA tạo thành vào ống nghiệm chứa PCR mix.
+ Realtime PCR: bản chất Realtime PCR cũng là quá trình nhân bản ADN trong ống nghiệm, tuy nhiên nó có một ưu điểm vượt trội là có khả năng hiển thị kết quả ngay tại từng thời điểm (realtime) và được ứng dụng trong các xét nghiệm định lượng như định lượng virus viêm gan B, C,... Để có được những ưu điểm trên, ngoài thành phần tương tự như một phản ứng PCR truyền thống, trong phản ứng Realtime PCR còn được bổ sung các đoạn đầu dò (probe) gắn huỳnh quang, các huỳnh quang này sẽ được máy đọc thu nhận lại và báo cáo trên màn hình hiển thị.

sub_title: 3. Quy trình thực hiện và lưu ý về mẫu bệnh phẩm của xét nghiệm PCR
sub_content: 3.1. Quy trình thực hiện
Để thực hiện xét nghiệm PCR thì tất cả các thành phần của PCR cần phải được trộn lẫn với nhau sau đó thông qua chuỗi 3 phản ứng tuần hoàn chính ở một máy điều nhiệt tự động với quy trình khép kín gồm 3 bước:
- Bước 1: Biến tính
Làm nóng hỗn hợp PCR phản ứng đến 94 độ C trong khoảng thời gian 15 - 30 giây. Việc làm này nhằm giúp cho DNA sợi kép bị phá vỡ trong các liên kết hydro yếu nên biến tính thành những chuỗi đơn.
- Bước 2: Ủ
Giai đoạn này cần hạ nhiệt độ xuống 54 - 60 độ C, duy trì khoảng 20 - 40 giây. Mục đích của việc làm ấy là giúp cho các mồi được ủ với trình tự bổ sung của chúng có trong DNA mẫu.
- Bước 3: Kéo dài
Nhiệt độ cần đạt là 72 - 80 độ C. Đây là giai đoạn enzyme polymerase tuần tự bổ sung các bazơ, mở rộng trình tự DNA. Khi đạt điều kiện tối ưu, sẽ có thêm DNA polymerase trong 1.000 bp/phút.
3.2. Lưu ý về mẫu bệnh phẩm
Xét nghiệm PCR có nhiều ưu điểm nổi bật như độ nhạy, độ đặc hiệu cao, thời gian xét nghiệm ngắn, đặc biệt hữu dụng trong việc phát hiện các tác nhân khó hoặc không thể nuôi cấy, các tác nhân có số lượng hiện diện ít và các đột biến gen,... Tuy nhiên, xét nghiệm này cũng có những lưu ý nhất định như sau:
- Mẫu bệnh phẩm phải được lấy đúng chỗ, đúng vùng cần xác định sự hiện diện của DNA đang muốn tìm.


- Đảm bảo tinh sạch về mặt sinh học đối với dụng cụ và đồ dùng lấy, chứa bệnh phẩm. Nếu không sạch thì nó sẽ làm phân hủy các acid nucleic của tác nhân đích có trong mẫu hoặc khiến cho mẫu thử chứa các chất ức chế phản ứng khuyếch đại về sau. Ngoài ra, những đồ dùng này chỉ được phép dùng duy nhất 1 lần, cấm tái sử dụng.
- Không dùng được cho những bệnh nhân đang điều trị kháng sinh tại vị trí lấy bệnh phẩm hoặc đang trong chu kỳ kinh nguyệt với các bệnh phẩm đường sinh dục, các mẫu bệnh phẩm lẫn máu, bệnh phẩm lấy vào ống chống đông heparin, bệnh phẩm bảo quản trong formol, bệnh phẩm có lẫn sợi bông,...
Mặc dù xét nghiệm PCR có độ chính xác cao đối với chẩn đoán nhiều bệnh lý nhưng muốn đạt được điều ấy nó cần được tiến hành trong môi trường xét nghiệm, trang thiết bị y tế hiện đại và đội ngũ nhân sự giàu kinh nghiệm với trình độ chuyên môn cao. Tất cả những yếu tố này chỉ có được ở một cơ sở y tế được đầu tư nghiêm túc cả về cơ sở vật chất lẫn đội ngũ nhân lực. Vì thế, khi cần thực hiện xét nghiệm PCR, người bệnh nên tìm đến địa chỉ y tế uy tín đã được Bộ y tế cấp phép.
Bệnh viện Đa khoa MEDLATEC là một trong số ít cơ sở y tế tư nhân làm được điều ấy. Bằng tiềm lực và ý thức trách nhiệm của mình, bệnh viện đã và đang được người bệnh đánh giá cao về thời gian cũng như độ chính xác của các xét nghiệm PCR. Mọi thông tin cần tìm hiểu thêm bạn đọc có thể liên hệ tổng đài 1900 56 56 56 để được chuyên viên y tế giải đáp chi tiết.