Câu hỏi: Cách tiến hành phương pháp định lượng vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi ra sao?

Theo tiểu mục 9.1 Mục 9 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7903:2008 (ISO 21871 : 2006) nêu rõ cách tiến hành phương pháp định lượng vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi như sau:
- Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng:
+ Xem phần thích hợp của TCVN 6507 (ISO 6887) tùy thuộc vào sản phẩm có liên quan, hoặc
+ TCVN 6263 (ISO 8261).
CHÚ THÍCH Để định lượng các bào tử Baclillus cereus giả định, cần làm nóng dung dịch pha loãng ban đầu ở 80 0C trong 10 min trên nồi cách thủy.
- Cấy và ủ
+ Cấy vào một dãy ba ống nghiệm chứa môi trường nồng độ kép mỗi ống 10 ml dung dịch pha loãng ban đầu (huyền phù ban đầu) và trộn các phần mẫu thử với môi trường sử dụng dụng cụ trộn ống thử nghiệm. Các phần mẫu thử này tương ứng với 1 g mẫu trên ống.
+ Cấy vào một dãy ba ống nghiệm chứa môi trường nồng độ đơn mỗi ống 1 ml dung dịch pha loãng ban đầu (huyền phù ban đầu) (bằng 0,1 g mẫu trên ống) hoặc của các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo (bằng 0,01 g, 0,001 g, ...mẫu thử trên ống) và trộn các phần mẫu thử với môi trường sử dụng dụng cụ trộn ống thử nghiệm.
+ Ủ các đĩa đã cấy trong tủ ấm ở 30 0C trong 48 h ± 4 h.
- Cấy truyền
+ Sau khi trộn kỹ ống nghiệm bằng dụng cụ trộn ống dùng vòng que cấy cấy vạch dịch cấy từ mỗi ống lên bề mặt thạch xanh bromothymol mannitol lòng đỏ trứng pyruvat polymyxin (PEMBA) hoặc thạch polymyxin lòng đỏ trứng mannitol (MYP).
+ ủ các đĩa đã cấy cùng với nắp đậy ở 37 0C (PEMBA) hoặc ở 30 0C (MYP) trong 18 h đến 24 h. Nếu các khuẩn lạc chưa được rõ ràng thì ủ tiếp các đĩa này thêm 24 h. Nếu sử dụng PEMBA thì việc ủ thêm có thể tiến hành ở nhiệt độ phòng.
- Chọn các đĩa
+ Yêu cầu chung: Sau khi ủ xong, kiểm tra các đĩa về sự có mặt của các khuẩn lạc điển hình hoặc không điển hình.
+ Khuẩn lạc điển hình
++ Trên PEMBA, các khuẩn lạc điển hình của Bacillus cereus giả định có kích thước từ 2 mm đến 5 mm, có viền ngoài không đều, rời rạc và giống hình rễ có bề mặt phản chiếu, có màu xanh ngọc lam đến xanh biếc, có thể có tâm khuẩn lạc màu xám trên nền xanh và có quầng kết tủa (phản ứng của lòng đỏ trứng) rộng đến 5 mm.
++ Trên MYP, các khuẩn lạc điển hình của Bacillus cereus giả định có kích thước từ 2 mm đến 5 mm và rời rạc. Chúng có màu hồng trên nền đỏ thẫm và có quầng kết tủa bao quanh (phản ứng của lòng đỏ trứng) rộng đến 5 mm.
+ Khuẩn lạc không điển hình
Nếu các đĩa có một lượng lớn hệ vi sinh nền mà lên men mannitol, thì độ màu đặc trưng của các khuẩn lạc và của nền có thể bị giảm hoặc không nhìn thấy được. Ngoài ra, một số chủng Bacillus cereus giả định chỉ phản ứng nhẹ lòng đỏ trứng hoặc hoàn toàn không phản ứng. Trong các trường hợp đó và trong mọi trường hợp nghi ngờ, thì các khuẩn lạc này cần được gửi đi để khẳng định.
- Khẳng định
+ Yêu cầu chung
Các khuẩn lạc điển hình và các khuẩn lạc không điển hình trên PEMBA hoặc MYP phải được khẳng định bằng phép thử tan máu trên thạch máu cừu. Cách khác, các khuẩn lạc điển hình và các khuẩn lạc không điển hình trên PEMBA (nhưng không trên MYP) có thể được khẳng định bằng kiểm tra qua kính hiển vi.
+ Chọn và tinh sạch các khuẩn lạc để khẳng định
++ Từ mỗi đĩa đã chọn trong tiết 9.1.4 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7903:2008 (ISO 21871 : 2006) chọn lấy ba khuẩn lạc. Nếu trên đĩa có ít hơn ba khuẩn lạc thì lấy tất cả các khuẩn lạc có mặt. Khẳng định các khuẩn lạc này theo quy định trong 9.1.5.3 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7903:2008 (ISO 21871 : 2006) hoặc 9.1.5.4 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7903:2008 (ISO 21871 : 2006)
Nếu trên các đĩa có các khuẩn lạc mọc quá dày và không thể chọn được khuẩn lạc tách biệt rõ, thì lấy từng phần khuẩn lạc từ ba điểm và cấy vạch lên các đĩa chứa môi trường đặc chọn lọc ủ trong tủ ấm ở 37 0C (PEMBA) hoặc 30 0C (MYP) trong 18 h đến 24 h. Từ mỗi đĩa chọn ít nhất một khuẩn lạc tách biệt tốt. Khẳng định các khuẩn lạc này theo 9.1.5.3 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7903:2008 (ISO 21871 : 2006) hoặc 9.1.5.4 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7903:2008 (ISO 21871 : 2006)
+ Khẳng định bằng phép thử tan máu trên thạch máu cừu (MYP hoặc PEMBA)
++ Cấy vạch các khuẩn lạc đã chọn từ MYP hoặc PEMBA lên bề mặt thạch máu cừu theo cách sao cho các khuẩn lạc mọc tách biệt tốt phát triển.
++ Ủ ở 30 0C trong 24 h và đọc phản ứng thử tan máu.
++ Mỗi khuẩn lạc được bao quanh bởi quầng sáng được coi là dương tính với thử tan máu.
+ Khẳng định bằng kiểm tra qua kính hiển vi (PEMBA)
++ Nhuộm màu
Chuyển một số phần từ tâm của khuẩn lạc trong trường hợp các dịch cấy được 24 h hoặc từ phía ngoài nếu các khuẩn lạc được cấy lâu hơn, sử dụng vòng que cấy sang phiến kính hiển vi đã tẩy nhờn và nghiền trong một giọt nước nhỏ.
Để khô trong không khí và cố định bằng nhiệt nóng. Sau đó nhuộm màu các bào tử trên nồi nước sôi có dung dịch xanh malachit.
Sau 2 min, tráng rửa lượng thuốc nhuộm dư bằng nước, làm khô phiến kính và phủ lên một lớp Sudan đen B để nhuộm chất béo trong tế bào. Để phản ứng xảy ra trong 15 min, rồi rửa bằng xylen, làm khô bằng giấy lọc và nhuộm lại bằng dung dịch safranin để nhuộm các túi bào tử. Sau 20 s, đổ lượng thuốc nhuộm dư, tráng bằng nước và để khô trong không khí.
++ Kiểm tra bằng kính hiển vi
Kiểm tra phiến kính dưới kính hiển vi sử dụng dầu.
Thông thường các tế bào dạng trực khuẩn lớn của Bacillus cereus giả định được sắp xếp theo chuỗi và có chiều dài từ 4 mm đến 5 mm, rộng từ 1 mm đến 1,5 mm và chứa các lượng lớn chất béo trong tế bào được nhuộm màu đen.
Các bào tử màu xanh có thể ở trung tâm hoặc ở gần cuối, nhưng chúng không bao giờ làm phình các túi bào tử màu đỏ.

Từ khóa: Vi sinh vật, Tiêu chuẩn Việt Nam
Ngày đăng: 11/03/2024