Câu hỏi: Phương pháp ELISA được thực hiện theo trình tự, thủ tục như thế nào để có thể chẩn đoán bệnh lưỡi xanh ở bò?

Theo Phụ lục E Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-43:2019 về Bệnh động vật - Quy trình chuẩn đoán - Phần 43: Bệnh lưỡi xanh quy định về phương pháp ELISA như sau:
Phụ lục E
(Tham khảo)
Phát hiện kháng thể vi rút Bluetongue bằng phương pháp ELISA
(Ví dụ: Sử dụng bộ kít ID Screen Bluetongue competition, mã sản phẩm BTC-5P của nhà sản xuất ID.VET - Pháp)
E.1 Chuẩn bị nguyên liệu
- Đưa tất cả các nguyên liệu trong bộ kít ổn định ở nhiệt độ phòng (21 °C ± 2 °C) và lắc đều để đồng nhất trước khi sử dụng
- Chuẩn bị dung dịch rửa 1X: Lắc dều dung dịch rửa nồng độ đậm đặc (20X) để chắc chắn dung dịch rửa đã hòa tan hoàn toàn và pha loãng với nước cất theo tỉ lệ 1/20 để được dung dịch rửa nồng độ 1X
E.2 Các bước thực hiện
- Cho 50 μl của Dilution Buffer 2 đến tất cả các giếng phản ứng.
- Cho 50 μl của Positive Control đến giếng A1 và B1.
- Cho 50 μl của Negative Control đến giếng C1 và D1.
- Cho 50 μl mẫu xét nghiệm vào các giếng còn lại.
- Ủ 45 phút ± 4 phút ở nhiệt độ 21 °C ± 5 °C.
- Chuẩn bị Conjugate 1X bằng cách pha loãng Conjugate 10X theo tỷ lệ 1/10 trong Dilution Buffer 2.
Lưu ý, không rửa đĩa ở bước này.
- Cho thêm vào 100 μl Conjugate 1X đến tất cả các giếng.
- Ủ (30 ± 3) phút ở nhiệt độ (21 ± 5) °C.
- Rửa đĩa 300 μl/giếng, lặp lại 3 lần với nước rửa (Wash Solution).
- Cho 100 μl của Substrate (TMB) vào tất cả các giếng.
- Ủ (15 ± 2) phút ở nhiệt độ (21 ± 5) °C trong tối.
- Cho thêm 100 μl dung dịch dừng phản ứng (Stop Solution) đến tất cả các giếng phản ứng.
- Đọc đĩa và ghi nhận giá trị OD ở bước sóng 450 nm.
E.3 Kết quả
• Đánh giá kết quả
- Giá trị OD trung bình của đối chứng âm (OD Negative control_ ODNC) lớn hơn 0,7.
ODNC > 0,700.
- Tỷ lệ giá trị trung bình của đối chứng dương (OD Positive control_ODPC) và Giá trị OD trung bình của đối chứng âm (OD Negative control_ ODNC) phải nhỏ hơn 0,3.
ODPC/ODNC<0,3.
• Phân tích kết quả
Mỗi mẫu xét nghiệm, được tính theo phần trăm cạnh tranh (S/N %)
Phần trăm cạnh tranh (S/N %) = (OD mẫu / OD NC) x 100
• Giải thích kết quả
Phần trăm cạnh tranh trong mẫu được tính như sau:
- Nếu mẫu lớn hơn hoặc bằng 40 % là mẫu âm tính.
- Nếu mẫu nhỏ hơn 40 % là mẫu dương tính.
Theo tiêu chuẩn trên thì để thực hiện phương pháp ELISA thì cần chuẩn bị một số nguyên liệu như dung dịch rửa 1X và kít ELISA, sau đó thực hiện theo trình tự sau:
- Cho 50 μl của Dilution Buffer 2 đến tất cả các giếng phản ứng.
- Cho 50 μl của Positive Control đến giếng A1 và B1.
- Cho 50 μl của Negative Control đến giếng C1 và D1.
- Cho 50 μl mẫu xét nghiệm vào các giếng còn lại.
- Ủ 45 phút ± 4 phút ở nhiệt độ 21 °C ± 5 °C.
- Chuẩn bị Conjugate 1X bằng cách pha loãng Conjugate 10X theo tỷ lệ
- Cho thêm vào 100 μl Conjugate 1X đến tất cả các giếng.
- Ủ (30 ± 3) phút ở nhiệt độ (21 ± 5) °C.
- Rửa đĩa 300 μl/giếng, lặp lại 3 lần với nước rửa (Wash Solution).
- Cho 100 μl của Substrate (TMB) vào tất cả các giếng.
- Ủ (15 ± 2) phút ở nhiệt độ (21 ± 5) °C trong tối.
- Cho thêm 100 μl dung dịch dừng phản ứng (Stop Solution) đến tất cả các giếng phản ứng.
- Đọc đĩa và ghi nhận giá trị OD ở bước sóng 450 nm.

Từ khóa: Bệnh lưỡi xanh ở bò
Ngày đăng: 14/12/2022