Câu hỏi: Chẩn đoán Bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển trong phòng thí nghiệm bằng phương pháp Nested RT - PCR ra sao?

Căn cứ Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-2:2019, chẩn đoán Bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển trong phòng thí nghiệm bằng phương pháp Nested RT - PCR như sau:
Phương pháp Nested RT - PCR (Reverse transcriptase-polymerase chain reaction)
- Lấy mẫu
Cá <1 cm: Lấy nguyên con từ 5 -10 con
Cá từ 1 đến 6 cm: Lấy phần đầu bao gồm mắt, não của 3-5 con
Cá lớn: Lấy não, mắt
Cá bố mẹ: Lấy não, mắt, Trứng, sẹ
Lượng mẫu lấy để tách chiết ARN khoảng 30 mg.
Mẫu được nghiền nhuyễn với tỷ lệ 1 thể tích mẫu trong 9 thể tích dung dịch muối đệm PBS, để tạo thành huyễn dịch 10 % (sử dụng cân phân tích cân trọng lượng mẫu được nghiền để điều chỉnh lượng dung dịch PBS nhằm đảm bảo tạo được huyễn dịch 10%).
- Bảo quản mẫu
Trong quá trình vận chuyển, mẫu được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C không quá 48 h hoặc bảo quản trong etanol từ 96 % đến 100 %. Đối với loại mẫu dùng cho phương pháp cắt mô cần phải cố định trong dung dịch formalin 10% và không bảo quản ở nhiệt độ âm;
Mẫu chuyển đến phòng thí nghiệm nếu chưa phân tích ngay phải được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C đến âm 80 °C hoặc trong etanol từ 96 % đến 100 %.
- Cách tiến hành
+ Tách chiết ARN
Sử dụng bộ kít tách chiết thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
VÍ DỤ: Kít Invitrogen PureLink Viral RNA/DNA Mini Kit (Cat No. 69506)1) (xem phụ lục B TCVN 8710-2:2019).
+ Chuẩn bị mồi
Phương pháp RT PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu F2/R3 và F’2/R’3/ để phát hiện vi rút VNN Trình tự cặp mồi (xem phụ lục C, Bảng C1 TCVN 8710-2:2019).
Mồi được chuẩn bị như sau:
- Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Dùng dung dịch đệm TE để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 µM làm gốc.
- Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 µM: pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (10 µl mồi gốc và 40 µl nước tinh khiết không có nuclease).
+ Tiến hành phản ứng Nested RT - PCR
Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen theo phương pháp nested RT- PCR bao gồm 2 giai đoạn (hoặc 2 bước): Giai đoạn 1 (bước 1), thực hiện phản ứng RT - PCR sử dụng cặp mồi F2/R3 ; Giai đoạn 2 (bước 2), thực hiện phản ứng nested RT - PCR sử dụng cặp mồi F’2/R’, sử dụng kít nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất (xem phụ lục C TCVN 8710-2:2019).
+ Điện di
++ Chuẩn bị bản gel
Pha thạch với nồng độ agarose từ 1,5 % đến 2 % bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X vào chai thủy tinh 250 ml, lắc đều rồi đun sôi;
Khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 40 °C đến 50 °C thì bổ sung 10 µl chất nhuộm màu vào mỗi 100 ml thạch. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để chất nhuộm màu tan đều.
Tiến hành đổ thạch vào khay điện di đã được cài lược; không nên đổ bản thạch dày quá 0,8 cm.
Khi bản thạch đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản thạch.
Chuyển bản gel vào bể điện di, đổ dung dịch đệm (TBE 1X hoặc TAE 1X) cùng loại với dung dịch pha thạch agarose đã đun vào bể điện di cho tới khi ngập bản thạch.
CHÚ THÍCH: Có thể dùng các sản phẩm có sẵn chất nhuộm DNA để pha chế thạch agarose (ví dụ: Sybr safe DNA gel stain2) và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất.
++ Chạy điện di
Hút 2 µl chất đệm tải mẫu (Loading dye 6X) vào 8 µl sản phẩm Nested RT - PCR (bước 2) trộn đều và cho vào các giếng trên bản thạch.Thực hiện điện di trong bộ điện di, chạy kèm theo thang chuẩn DNA (Ladder) để dự đoán kích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 µl thang chuẩn DNA (Ladder) vào một giếng trên bản thạch.
Điện di ở hiệu điện thế 100 V trong thời gian 30 min.
+ Đọc kết quả
Sau khi điện di, đọc kết quả trên máy đọc gel.
Điều kiện của phản ứng được công nhận khi:
++ Đối chứng âm có kết quả âm tính (không có sản phẩm khuếch đại);
++ Đối chứng dương có kết quả dương tính được thể hiện bằng vệt sáng rõ có kích thước 420 bp và 294 bp.
Với điều kiện phàn ứng trên
Mẫu xét nghiệm âm tính khi:
++ Tại giếng của mẫu thử không xuất hiện vạch sáng (không có sản phẩm khuếch đại);
++ Thang chuẩn ADN sáng và chia vạch rõ ràng.
Mẫu xét nghiệm dương tính khi:
++ Tại giếng của mẫu thử có sản phẩm khuếch đại có kích thước 420 bp và 294 bp, hoặc chỉ có sản phẩm khuếch đại có kích thước 294 bp;
++ Thang chuẩn ADN sáng và chia vạch rõ ràng.
CHÚ THÍCH: Trong trường hợp mẫu dương tính yếu, có thể chỉ phát hiện được sản phẩm của bước hai 294 bp.

Từ khóa: Bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển, Tiêu chuẩn Việt Nam
Ngày đăng: 16/05/2024