Mistanken falt på James Hepburn, 4. jarl av Bothwell, og hans tilhengere, i særdeleshet Archibald Douglas, sogneprest av Douglas. Dennes sko ble funnet ved åstedet, og av Maria Stuart selv. Bothwell «kidnappet» siden dronning Maria og holdt henne fanget i en uke inntil hun til slutt gikk med på å gifte seg med ham. Darnleys død var en nøkkelhendelse i den synkende spiralen som førte til at hun tapte den skotske tronen.