Stefan begynte å studere fysikk og matematikk i 1853 ved Universitetet i Wien. Etter han ble ferdig i 1857, arbeidet han som lektor i en realskole og ble i 1863 professor ved det samme universitetet. Noen få år senere ble han leder for det fysikalske instituttet og sekretær i vitenskapsakademiet i Wien. Han publiserte storparten av sine arbeider gjennom dette.