I 1607 ble Vartov innredet til hospital, dvs. pleiehus for fattige, syke og gamle. Inntil da var den funksjonen blitt ivaretatt av Københavns Helligånds-hospital i Helligåndshuset, som ble opprettet etter reformasjonen i 1536 for å videreføre det som tidligere hadde vært de katolske klostrenes hjelpearbeid. Etter en del økonomiske problemer og personlige stridigheter ved hospitalet ble det i begynnelsen av 1600-tallet skrevet nye vedtekter. Etter dette ble «lemmerne» (beboerne) flyttet til Vartov og Helligåndshuset ble inndratt til barnehjem og tukthus.