Den andre defenestrasjonen i Praha var sentral i utløsningen av trettiårskrigen i 1618. Det bøhmiske aristokrati var i opprør etter valget av habsburgeren Ferdinand II til konge, noe som knyttet Böhmen enda nærmere det katolske tysk-romerske rike. Etter Rudolfs abdikasjon i 1611 og senere død i 1612 flyttet hans bror Matthias hoffet fra Praha til Wien. Han trakk også tilbake Rudolfs keiseredikt som hadde gitt protestantene like rettigheter i Böhmen. Under et møte på – borgen i Praha – ble Matthias' to stattholdere og deres skriver kastet ut av et vindu under en storming av palasset den 23. mai 1618. De overlevde alle det 16 meter høye fallet – de landet nemlig i en haug med møkk.