Breasted var fra 1894 dosent og fra 1905 professor for egyptologi og Orientens historie ved University of Chicago. I 1901 ble han direktør for . I 1919 grunnla han med Rockefeller-stiftelsens stiftelse Oriental Institute of the University of Chicago og ledet instituttets arkeologiske utforskninger i Egypt. I 1919 ledet Breasted den første amerikanske ekspedisjon noensinne for arkeologisk utgraving i Egypt. I 1923 ble hanvalgt til medlem av . Hans faglige tyngdepunkt var samling av innskrifter, noe som gjorde Chicago til et internasjonalt sentrum innen epigrafikk.