Ved universitetet i Padova (opprettet 1222) var det flere viktige forskere innen botanikk. Francesco Bonafede arbeidet for opprettelsen av et eget anlegg, og ved et dekret 29. juni 1545 ble Orto Botanico opprettet av republikken Venezia. Orto Botanico har blitt mønsterdannende og har helt fra starten blitt brukt til studiet av medisinske planter, og området kan godt ha vært brukt til det også tidligere ettersom området ble overtatt fra en benediktinsk orden.