Dufek begynte på U.S. Naval Academy i Annapolis, Maryland i 1921. Etter uteksaminering i 1925 startet han sin karriere om bord i slagskipet USS «Maryland». I 1932–33 gjennomførte han flygertrening ved Naval Air Station Pensacola i Florida og tjenestegjorde deretter som navigatør og nestkommanderende på tre forskjellige marinefartøyer.