Marias dårlige helse hadde framkalt hennes andre innbilte svangerskap, og etter en slik vrangforestilling i 1558 skrev hun i sitt testamente at hennes ektemann skulle være regent til barnet nådde myndighet. Maria fødte dog aldri noe barn, og døde av influensa eller kreft i St. James's Palace den 17. november 1558, førtito år gammel. Kanskje skjulte det innbilte svangerskapet hennes egentlige dødsårsak. Det er mulig at en svulst i en eggstokk var grunnen til at hun ikke fikk barn, og at denne svulsten også var dødsårsaken.