Ynglekolonier består vanligvis av 50-100 hunner og er ofte lokalisert i bygninger. Forplantningen finner sted særlig på ettersommeren. På kontinentet er det kjente masseforekomster på underjordiske overvintringslokaliteter, men overvintring kan også finne sted i bygninger. Arten regnes som i hovedsak stasjonær med trekkdistanser som vanligvis er på mindre enn 100 km mellom sommer- og vintertilholdssted. Tusseflaggermus er i all hovedsak en "husflaggermus". Sommerkolonier anlegges så å si utelukkende i bygninger . Arten opptrer dessuten gjerne i store kolonier, om enn noe mindre enn koloniene til dvergflaggermus.