Han etterfulgte sin far i India i 1530 mens halvbroren Kamran Mirza, som ble en bitter rival, fikk herredømmet over Kabul og Lahore, de mer nordlige delene av fares rike. Humayun kom først på tronen da han var 22 år gammel og var da uerfaren i å regjere. Han tapte sine områder til pashtunadelen, men med persisk støtte klarte han til siste å skaffe dem tilbake. Humayuns kom fra Persia med et stort følge av persiske adelsmenn, signaliserte store endringer i Mogulrikets hoffkultur da den sentralasiatiske opprinnelsen til dynastiet i stor grad ble overskygget av innflytelse fra persisk kunst, arkitektur, språk og litteratur. I løpet av meget kort tid var Humayun i stand til utvide riket ytterligere og etterlot en betydelig arv til sin sønn Akbar.