Som ung professer i filologi tilbrakte Mouhot minst ti år i Russland hvor han underviste i språk. Han reiste gjennom Europa med sin bror Charles, hvor han studerte de fotografiske teknikkene Louis Daguerre hadde utviklet. I 1856 henga han seg tl studier i naturvitenskap. Samme år giftet han seg med en etterkommer (sannsynligvis et barnebarn) til den skotske oppdagelsesreisende Mungo Park. Etter å ha lest av Sir James Bowring i 1857, besluttet Mouhot seg for å reise til Indokina for å foreta en serie botaniske ekspedisjoner for å samle inn nye zoologiske eksemplarer. Hans første forespørsler om lån og reise ble avvist av franske selskaper og regjeringen under Napoleon 3.. Det Kongelige Geografiske Selskap og Det Zoologiske Selskap i London ga ham så støtte og han satte kursen mot Bangkok, via Singapore.