Giftvirkningen av rotenon skyldes stoffets spesifikke virkning på cellene. Rotenon blokkerer elektrontransportsystemet i mitokondriene, noe som medfører at cellenes åndedrett nedsettes. Rotenon er svært giftig for fisk på grunn av at gjellene raskt og effektivt tar opp stoffet. Fugler og pattedyr er motstandsdyktige mot rotenon både tilført gjennom munnen og huden i de konsentrasjoner som benyttes ved rotenonbehandlinger. For pattedyr og mennesker er det innånding av stoffet som er giftig. Rotenon er et krystallisk stoff. Damptrykket for rotenon er derfor svært lavt. Det vil derfor ikke dampe skadelige mengder rotenon, verken av behandlet vann eller konsentrert løsning under en behandling. Ved spyling med rotenonholdig vann brukes det vernemaske for at behandlere ikke skal bli eksponert for aerosoler (sprøytetåke) av fortynnet CFT-Legumin.