Handlingen er historisk fiksjon basert på ordentlige hendelser og følger den eldgamle krangelen mellom oppdiktede versjoner av Assasinene, som kjemper for fred med fri vilje, og Tempelridderne, som vil ha fred med kontroll. Rammen rundt dette er satt i det 21. århundre og fremviser protagonisten Desmond Miles som ved hjelp av en maskin kalt «the Animus» kan gjenleve minnene til sine forfedre for å finne en måte å unngå 2012-apokalypsen. Mye av spillet foregår i 16. århundre Konstantinopel med Ezio Auditore da Firenze, og i 12. og 13. århundre Masyaf med Altaïr Ibn-La'Ahad. Hovedhistorien følger snikmorderen Ezio på hans reise for å låse opp hemmelighetene i Altaïrs hvelv i Masyaf ved bruk av diskus-lignende artefakter som inneholder Altaïrs minner.