På 1300-tallet ble byen sete for de mähriske markgrevene, og fikk rundt nye bygninger og et innbyggertall på , i stor grad takket være en rekke handelsprivilegier. Fra midten av 1300-tallet ble byen sentrum for Mähren-regionens samling sammen med Olomouc, hvor politiske, rettslige og finansielle spørsmål ble avgjort. Under husitterkrigene forble byen tro mot kong Sigismund og ble beleiret to ganger (1428 og 1430) uten resultat. I 1454 ble jødene utvist fra byen, og de var formelt ekskludert fra byen frem til 1848. Under kong Georg av Poděbrady støttet Brno motstanderen hans Mattias Corvinus. Under begge borgerkrigene på 1400-tallet stagnerte byens utvikling.