Men før de kan komme noe lenger med Desmond, blir han brutt ut av Abstergo av en kvinnelig medarbeider, Lucy Stillman. Han blir fraktet til et skjulested hvor de møter to andre snikmordere: Shaun Hastings og Rebecca Crane. Rebecca er skaperen av Animus 2.0, en oppgradering til Animusen Abstergo brukte. Når Desmond blir synkronisert med Animus 2.0, gjenlever han minnene til Ezio Auditore da Firenze, en italiensk adelsmann fra Firenze, Italia, som jobber med å hevne sin far og brødre etter at de ble henrettet på grunnlag av bedrageri. Han blir bedt av faren sin å hente gjenstander som er lokalisert i et hemmelig rom bak kontoret hans. I kisten Ezio finner, finnes det snikmorderkappe, en ødelagt skjult klinge (), et sverd, og dokumenter med bevis for farens uskyld. Men dokumentene er ikke nok, ettersom den han skal levere dem til er korrupt. Han flykter med moren og søsteren til onkelens villa i Monteriggioni. Onkelen trener opp Ezio og gir husly for moren og søsteren. Ezio eliminerer flere Tempelriddere, hvilket også er personer som faktisk levde. Det hele ender med en kamp mellom Ezio og Rodrigo Borgia i et palass i Roma. Ezio seirer og bruker sitt Apple of Eden til å åpne et hvelv skjult under palasset, bare for å finne et hologram av en kvinne fra den eldgamle sivilisasjonen. Hun kontakter Desmond direkte og advarer ham mot katastrofen som er på vei; en ny solstorm vil treffe jorden i 2012.