I 2009 vant Serena Australian Open i januar i singel, og i double med Venus. Hun Leverte deretter noen semifinaler i blant annet Dubai og Paris indoors. I French Open ble det et knepent tap mot Svetlana Kuznetsova (RUS) 6-7, 7-5, 5-7 etter å ha ledet 3-1 i avgjørende sett. Det ble en opptur i Wimbledon hvor hun vant i både singel og double med Venus. Hun reddet forøvrig matchball mot Elena Dementieva (RUS) i semifinalen i singel, og slo Venus i singlefinalen 7-6, 6-2. Søstrene fikk med seg en turneringsseier i Stanford i double før det like etter ble seier i Us Open double. I single endte det med tap for Kim Clijsters (BEL) 4-6, 5-7. Serena vant den siste turneringen av 2009, WTA Championships, mot søster Venus 7-6, 6-2 i finalen og endte med det året som nummer 1 på rankingen for andre gangen i karrieren.