I første halvdel av 1400-tallet begynte den katolske kirke selv å mistenke at dokumentet umulig kunne være ekte. Den italienske humanisten Lorenzo Valla kunne i 1440 føre tekstkritiske beviser for at dokumentet ikke kunne ha blitt forfattet på 300-tallet. Det inneholdt enkelte formuleringer som ikke var utviklet på dette tidspunkt, og han påpekte også at dokumentets egen datering ikke rimer (et par senere hendelser er nevnt). Senere kunne andre forskere påpeke at noen andre elementer, som Sylvesters helbredelse av Konstantin, går tilbake til senere legendedannelser.