Universitetet ble grunnlagt av landgreve Philipp den 1. juli 1527, og hadde fra begynnelsen elleve professorer og 84 studenter. Universitetet holdt til i forskjellige klostre som tidligere hadde tilhørt de katolske dominikanerne, fransiskanerne og Brødrene av Felleslivet. To år senere fant religionssamtalene i Marburg mellom Luther, Zwingli og Melanchthon sted i Marburg. Landgreve Philipp fikk universitetsprivilegier av keiser Karl V i 1541.