I 1539 var en dommer i Padova blitt interessert i Vesalius' arbeid og gav ham adgang til å utføre disseksjoner på likene av henrettede forbrytere. Ut fra dette materiale bygde han opp en meget omfattede samling av anatomiske diagrammer. Mange av dem ble utført av profesjonelle tegnere og fikk langt høyere kvalitet enn hans tidligere arbeider. Mens han var i Bologna, gikk det i 1541 opp for Vesalius at alle de studier Galen hadde gjort var foretatt på dyr, idet disseksjon var forbudt i Romerriket. Derfor hadde Galen i stedet dissektert aper fordi de anatomisk ligner mennesker. Det resulterte i at Vesalius utgav en korreksjon av Galens berømte verk og samtidig begynte å skrive sitt eget anatomiske verk. Inntil Vesalius påpekte det, var Galens iakttagelser ukritisk benyttet som grunnlag for studiet av menneskekroppen. Men ikke alle var parate til å oppgi Galen som autoritet, og mange vendte seg mot Versalius, fordi han hadde påpekt feil hos Galen. Vesalius fortsatte uforknytt med å skape rot i det legevitenskapen da han også offentliggjorde beviser på at autoriteter som Mondino de Liuzzis og Aristoteles’ arbeider bygget på feilaktige antagelser; for eksempel hadde de og Galen beskrevet hjertets oppbygning og funksjon på en feilaktig måte. I 1543 utførte Vesalius en offentlig disseksjon av Jakob Karrer von Gebweiler, en forbryter fra Basel. Som hjelper hadde han kirurgen Franz Jeckelmann, og han samlet skjelettet som ble donert til universitetet i Basel. Dette preparat er det eneste urført av Vesalius som er bevart for ettertiden.