Etter at Karl V ble myndig i 1515 gjorde han opprør mot Margaretes påvirkning, men innså snart at hun var en av hans beste rådgivere, og hun ble igjen guvernør for Nederlandene (1519–1530) fram til hun døde. I 1529, sammen med Louise av Savoia, forhandlet hun fram Cambrai-traktat av 1529, den såkalte .