Elektroner fra NADH og FADH går via en serie av elektronbærere som alle er knyttet til den indre membranen i mitokondriet. Denne bevegelsen av elektroner gjør at protoner aktivt kan fraktes ut av matriks. NADH og FADH oksideres og sender to elektroner hver over til elektrontransportkjeden. NADH sørger for at ca. 3H blir pumpet inn fra matriks og inn i rommet mellom indre og ytre membran, mens FADH sørger for at 2H blir pumpet inn, da den først kan oksidere lengre ned på elektrontransportkjeden. Dermed bygges det opp en protongradient (H-gradient) mellom matriks og det ytre rommet inne i mitokondriet. Denne gradienten vil bli brukt i oksidativ fosforylering.