Selv om idretten nesten eksklusivt spilles av menn kan kvinner delta i amerikansk fotball i high school, college og på profesjonelt nivå. Ingen kvinner har noensinne spilt i NFL, men kvinner har spilt i kamper i både high school og college. I 2018 var 1 100 av de 225 000 spillerne i Pop Warner Little Schoolars, amerikansk fotball for barn og unge, jenter, og rundt 11% av de 5,5 millioner amerikanere som svarte at de spilte tackle football var kvinner ifølge Sports and Fitness Industry Association. Kvinner kan også jobbe som dommere; Sarah Thomas ble den første kvinnelige dommeren i NFL i 2015.