Alice Hamilton vokste opp i Fort Wayne i Indiana som den nest eldste av fem søsken. Hun fikk sin grunnleggende skolegang ved hjemmeundervisning og gikk seinere på Miss Porter's School, en universitetsforberedende privatskole for jenter i Connecticut. Hun var opptatt av å få en utdannelse som kunne gjøre henne sjølforsørgende, og valget falt på medisinen, et fag som var åpent for kvinner, samtidig som det kunne gjøre henne til et uavhengig og samfunnsnyttig menneske.