Peter Parker, hans bestevennen Harry Osborn, og Mary Jane Watson er på skole-tur sammen med resten av klassen sin, til ett laboratorium som forsker på genetikk. Peter blir bitt av en edderkopp som hadde gått gjennom en genetisk konstruert mutasjon, og han blir syk. I mellomtiden forsøker Harrys far Norman Osborn (spilt av Willem Dafoe) en vitenskapsmann og eier av Oscorp, å sikre en viktig kontrakt med det amerikanske militæret. Han forsøker et eksperiment på seg selv, som inneholder ustabile ytelsesfremmende kjemikalier. Han opplever en psykopatisk episode, og dreper assistenten sin.