Under Kyros og den påfølgende persiske konge Dareios den store, ble Babylon hovedstaden for 9. satrapi (Babylonia i sør og Athura (arameisk for Assyria) i nord), foruten også at byen ble sentrum for lærdom og vitenskapelig framgang. I Akamenide-dynastiet i Perserriket ble de gamle babylonske virksomhetene innenfor astronomi og matematikk revitalisert og blomstret, og babylonske lærde utarbeidet detaljerte kart over stjernebildene. Byen ble den administrative hovedstaden i det persiske riket, det mest framtredende makten i den da kjente verden, og Babylon spilte en vital del i historien i denne regionen i over to århundrer. Mange betydningsfulle arkeologiske oppdagelser, ikke minst Kyrossylinderen, er blitt gjort som kan gi bedre forståelse av tiden.