I første del av middelalderen var byen under Bysants, som bygget fortet Akronafplia. I 1212 ble byen erobret av frankerne, som solgte den videre til Venezia i 1388. Byen fikk da navnet 'Napoli di Romania'. Italienerne avverget flere tyrkiske angrep, før de måtte gi tapt i 1540. Tyrkerne gjorde Nafplio til hovedstad i provinsen Morea.