Maria Stuart ble snart fokus for opprør. I 1569 snakket opprørere fra Nord-Englands reisning om å frigjøre henne, og det ble planlagt å gifte henne til Thomas Howard, 4. hertug av Norfolk. Elizabeth reagerte med å få Howard henrettet. Pave Pius V utstedte en pavelig bulle i 1570 kalt som erklærte «Elizabeth, den angivelige dronning av England og en tjener av forbrytelser», for å være en kjetter og fritok alle hennes undersåtter fra deres lydighet til henne. Engelske katolikker hadde en ekstra drivkraft for å se på Maria Stuart som den rettmessige overhode av England. Maria Stuart ble antagelig ikke fortalt om hvert eneste katolske komplott som ble planlagt for å sette henne på den engelske tronen, men fra Ridolfikonspirasjonen av 1571 til Babingtonkonspirasjonen av 1586, kunne Elizabeths sjef for de hemmelige tjenestene, sir Francis Walsingham, og det kongelige rådet, sette sammen en sak mot henne. I begynnelsen motsatte Elizabeth seg krav om Marias henrettelse, men ved slutten av 1586 hadde hun blitt overtalt til å gå for en rettssak med bevis i en rekke brev skrevet under Babingtonkonspirasjonen. Elizabeths proklamasjon av dommen annonserte at «den nevnte Maria, som foregir å ha tittelen til den sammen kronen, har planlagt og forestilt seg innenfor det samme rike atskillige ting med den hensikt å skade, drepe og ødelegge vår kongelige person.» Den 8. februar 1587 ble Maria Stuart halshogd ved Fotheringhay Castle i Northamptonshire. Hun ble 44 år gammel.