I 1569 ble universitetsbiblioteket grunnlagt. Noen tid etter at reformasjonen ble gjennomført i Rostock ble universitetet selv protestantisk. I 1760 ble det delt i et borgerlig universitet i Rostock, underlagt byens råd, og et fyrstelig universitet i Bützow. Universitetene ble gjenforent i 1789. Humanisme og lutherdom var bestemmende for universitetet. Under tredveårskrigen ble universitetets internasjonale betydning redusert. Sammen med universitetet i Rinteln og universitetet i Wittenberg spilte universitetet i Rostock en betydelig rolle under hekseprosessene.