Mellom 1594 og 1603 møtte Elizabeth sin vanskeligste prøvelse i Irland med opprøret, kjent som Tyrones opprør, eller den irske niårskrigen. Dets leder, Hugh O'Neill, jarl av Tyrone, ble støttet av Spania. Våren 1599 sendte Elizabeth Robert Devereux, for å slå ned opprøret. Til hennes frustrasjon, fikk han liten framgang og reiste tilbake til England uten tillatelse. Han ble erstattet av Charles Blount, lord Mountjoy, som brukte tre år på å slå ned opprøret. O'Neill overga seg til slutt i 1603, noen få dager etter at Elizabeth var død.