Tre år etter hendelsene i er Larry Daley (spilt av Ben Stiller) tidligere nattevakt ved American Museum of Natural History, eier i hans eget selskap. Han reiser til museet hvor han tidligere jobbet, og han oppdager at de fleste av utstillingene snart vil bli flyttet. Flere eiendeler tilhørende Ahkmenrah (fra den første -filmen) skal forbli ved museet, og disse karakterene blir derfor uten mulighet til å komme til liv om natten slik de kunne tidligere. Larry reiser til Washington, DC og navigerer seg frem til korrekt arkiv med hjelp fra sønnen sin Nick.