På slutten av 1500-tallet etablerte jesuittordenen seg i kolonien. Paraguay var da vesentlig større enn i dag, med grense mot Peru og Bolivia. Støttet av den spanske regjeringen ble de innfødte i dette store området isolert fra berøring med andre hvite enn jesuitter. Slik ble de spart for den brutale utbyttingen indianerne ellers ble utsatt for. Der hvite og mestiser trengte inn, ga jesuittene de innfødte våpen til å forsvare seg med. Snart vant jesuittene indianernes tillit, og det ble bygd kirker, skoler og sykehus. Jesuittene underviste i jordbruk; de innførte appelsinen til Paraguay og tilpasset den klimaet der. Jorden var så fruktbar at det var mulig å få fire maisavlinger i året. To dager i uken arbeidet jordbrukerne på felles marker under jesuittenes ledelse, og det ble organisert vakthold rundt maismarkene som ellers ble plyndret av papegøyer. Ingen fikk lønn i penger, folk fikk i stedet klær, tobakk og te; teen skulle venne folk av med alkohol. Det ble arrangert idrettsleker og utflukter. Men med opplysningstidens fremvekst møtte jesuittene voksende motstand i Europa, og i 1767 ble de utvist fra Spanias søramerikanske kolonier. Dermed var Paraguays indianere utlevert til den samme brutale utbyttingen som resten av søramerikanske indianere, og ble nesten utryddet.