Panzer I ble først brukt i 1936 under den spanske borgerkrigen, som en del av de tyske styrkene som ble sendt for å støtte general Franco og nasjonalistene. Den viste seg fort å være både undermotorisert, underbevæpnet og utklasset av sovjetiske T-26 og BT-5 i bruk på republikansk side. Et antall Panzer I ble erobret av republikanske styrker, og utstyrt med 20 mm eller 25 mm panservernkanoner.