På begynnelsen av sitt styre kunngjorde han ved lov kirkens tro i spørsmålet om Treenigheten og Inkarnasjonen, og truet alle kjettere med nødvendige straffer, hvor han deretter erklærte at han hadde til hensikt å avskjedige alle som forstyrret den rette tro i henhold til loven. Han gjorde nikensk-konstantinopel-trosbekjennelse som den eneste rette trosbekjennelsen i kirken, i overensstemmelse med tolkningene til de fire økumenisk konsilene. Biskopene som var til stede ved den andre konsil i Konstantinopel i 553 anerkjente at ingenting kunne bli gjort i kirken som stred mot keiserens vilje og påbud, mens han på sin side, som keiser, i samarbeid med patriark Anthimus, forsterket kirkens bannlysningen med midlertidig forbud. Justinian beskyttet kirkens renhet ved å undertrykke de som kirken utpekte som kjettere. Han overså ingen anledning til å sikre kirken og de geistliges rettigheter og beskytte og utvide munkevesenet. Han bevilget munkene retten til å arve eiendom fra private borgere og retten til å motta , det vil si årlige gaver fra den keiserlige skattkiste, eller fra skatter fra bestemte provinser, og han forbød verdslig beslagleggelse av eiendommer tilhørende klostrene.