Johanitterne grunnla Valletta og i 1571 overtok Valletta som hovedstad. Birgu beholdt sin viktige forsvarsstrategiske posisjon. Millitæranleggene ble videreutviklet. Dockyard Creek ble havnen for ordenens flåte. Pave Gregor XIII gjorde i 1574, som en erstatning for hovedstadsfunksjonen, Birgu til residens for Maltas inkvisitor. Dette varte til 1798.