Bismarcks første trekk var å la forbundsdagen vedta at Holstein skulle besettes av forbundsstyrker, og vedtaket ble satt i verk julen 1863. Deretter fikk Danmark 16. januar 1864 et ultimatum som krevde at novemberforfatningen skulle oppheves innen 48 timer. Da Danmark avviste kravet, gikk prøyssiske og østerrikske tropper inn i Slesvig. I mange land var det en opinion til støtte for Danmarks sak, og den britiske regjering inviterte til en fredskonferanse i London, men forhandlingene her brøt sammen i juni.