Familien Roothaans røtter var i Frankfurt am Main i Tyskland. Derfra emigrerte de til Amsterdam, der de konverterte fra den evangeliske protestantiske tro til katolisismen. Joannes Roothaan var sønn av kirurgen Matthias Egbert Roothaan og hans hustru Marie Angela Ter Horst. Han gikk på gymnas i Amsterdam, og fortsatte deretter på , en privat høyskole, og studerte under professor Jacob van Lennep.