Man må utforske store 3D-verdener med mange farer og feller og hjelpe snille karakterer. Hver verden inneholder ti gylne «jiggies», som ser ut som puslespill-biter. Spilleren bruker disse for å åpne nye verdener. Hver verden har også en 'boss', som er en mektig fiende som er vanskelig å slå. Man får tak i puslespill-bitene på mange ulike måter. I Banjo-Kazooie foregikk handlingen i Gruntilda sin hule, og verdenene var der inne. I Banjo-Tooie kan man gå inn i hulen, men inngangen til verdenene er blokkert. I stedet utspiller handlingen seg på 'Isle of Hags' (Kjerringøya), som viser seg å være halvøya som grenser til Spiral Mountain. Banjo og Kazooie må spille seg gjennom verdenene for å få flere jiggies og nye teknikker så de kan komme seg videre på øya, og til slutt komme frem til Gruntilda's nye slott på fjelltoppen. Der deltar man, akkurat som i Banjo-Kazooie, i en quiz med spørsmål om spillet og innhold, før man hiver seg løs på den siste bossen, som er Gruntilda i sin borremaskin. Etter at hun er beseiret, kan man fortsette å spille og samle de jiggiene man ikke fant tidligere.