Hun giftet seg snart for tredje gang, med James Hepburn, 4. jarl av Bothwell, som det er grunn til å anta sto bak mordet på Darnley. Etter et opprør mot ekteparet ble Maria fengslet i Loch Leven Castle den 15. juni og tvunget til å abdisere til fordel for sin et år gamle sønn, Jakob VI av Skottland. Etter et mislykket forsøk på å gjenerobre tronen flyktet Maria til England og søkte beskyttelse hos farens kusine, dronning Elisabeth I av England. Maria hadde tidligere fremmet seg selv som arveberettiget til Englands trone. Elisabeth I opplevde henne som en trussel, og beordret henne arrestert. Mange engelske katolikker betraktet imidlertid Maria Stuart som Englands rettmessige hersker.