Som enke ville hun gjerne gifte seg med Cosimo de Medici, men ettersom en ny pave da regjerte, ble det i stedet arrangert et ekteskap med et medlem av den nye pavens familie. Hun giftet seg motvillig og kom til bryllupet kledd i sørgeklær. Ektefellene levde for det meste separert. Margareta befant seg i en ustabil situasjon ettersom overhøyheten over Parma var omstridt av paven og keiseren. Først i 1556 ble familien Farneses eiendomsrett over Parma og Piacenza fastslått. Margaretas sønn ble sendt til Madrid for å bli oppfostret der. En spansk garnison var stasjonert i Piacenza frem til hennes død.