Ferdinand var, etter Christinas eksempel, mesen, alliert og venn for Galileo Galilei. Han fikk Galileos dedikasjon på verket «Dialog om de to verdenssystemene» som utkom i februar 1632. Dette arbeidet førte til Galileos andre runde med høringer for inkvisisjonen. Ferdinand forsøkte med kontakter til Den hellige stol å forhindre høringene, og holdt Galileo i Firenze til desember 1632, da den romerske inkvisisjonen til slutt truet med å hente Galileo med makt, og ta ham med til Roma i lenker hvis han ikke kom frivillig. I juni 1633, ble Galileo dømt for «sterk mistanke om kjetteri», og livstids fengselstraff. Dette ble endret til husarrest, og dommen kunne avsones under Ferdinands beskyttelse.