PCR-maskinen varmer opp blandingen til ca. 95ºC (temperaturen kan heves noe hvis templatet er stort) i rundt 1 minutt eller mer. Da denatureres DNA, dvs. at det går fra dsDNA til ssDNA fordi hydrogenbindingene mellom nukleotidene i spiralen brytes. Bindingene i enkelttrådene brytes først ved høyere temperaturer.