Tyroksin blir syntetisert av follikelcellene i kjertelen fra fritt tyrosin og fra tyrosinenhetene på et protein kalt tyreoglobulin (TG, tidligere kalt "kolloid"). Jod fanges opp av hydrogenperoksid som dannes av enzymet tyreoperoksidase (TPO) og festes på posisjonene 3' og 5' på benzenringen til tyrosinenhetene på TG og på fritt tyrosin. Ved stimulering med thyreoideastimulerende hormon (TSH, et hormon fra hypofysen) vil follikelcellene reabsorbere TG og ved en prosess kalt proteolyse "klippe av" jodiserte tyrosiner fra TG og dermed danne T4 og T3 (T3 har ett jodatom mindre festet til seg enn T4), og frigjøre dem til blodbanen. Skjoldbruskkjertelhormonene som frigjøres består av ca. 90 % T4 og 10 % T3.