Grunnet Manuels forbindelse med nabolandet Castilla er hans regjeringstid også preget av forfølgelse både av den mauriske(muslimake]og den jødiske befolkningen. De katolske monarker, Isabella I av Castilla og hennes medregent Ferdinand II av Aragón hadde forvist alle jøder i sine to riker i 1492. Da Manuel I ønsket å gifte seg med deres datter, inngikk han en ekteskapskontrakt som krevde at han måtte forfølge jødene i Portugal. I desember 1496 ble det bestemt alle jøder i Portugal måtte enten tvangskonverteres til kristendommen eller forlate landet sine barn.