Den doble DNA-tråden denaturerer og splittes i to enkelttråder ved temperaturer omkring 93-98°C. Dette gjør det mulig å få tilgang til sekvensen som ellers ligger gjemt inne i dobbelttråden. Primere, som er designet av brukeren og tilsettes i reaksjonen, kan binde til ønsket sekvens i DNA. Et enzym kopierer sekvensen, normalt ved 72°C. Deretter denatureres DNA igjen, og dette gjentas 15-30 ganger for å få ønsket mengde kopier av DNA-fragmentet. PCR foregår i spesielle maskiner som justerer temperaturen automatisk ut fra et forhåndslaget program.