To år etter Norman Osborns død er Peter Parker, i hemmelighet superhelten Spider-Man, fremmedgjort fra både kjæresten Mary Jane Watson og hans beste venn Harry Osborn. Han oppdager også at hans tante May risikerer utkastelse fra leiligheten hennes. I tillegg opplever han midlertidige, men tilbakevendende, tap av super-kreftene sine. Harry, som nå er sjef for en avdeling i farens gamle bedrift Oscorp som arbeider med genetisk forskning, sponser et nytt prosjekt ledet av atom-forsker Otto Octavius.