Under annen verdenskrig ble gardens militære profil styrket og det ble tatt inn flere frivillige, blant annet fra Romas jødiske befolkning. I september 1943, da tyske styrker besatte Roma etter Italias inngåelse av våpenhvile med de allierte, fikk garden ansvar for å beskytte Vatikanbyen og forskjellige vatikanske bygninger rundt om i Roma og den pavelige sommervilla i Castel Gandolfo. Gardistene patruljerte Vatikanets murer, hager og gårdsrom og stod vakt ved pavelige bygninger som samtidig tjente som fristeder for ettersøkte. Det kom flere ganger til konfrontasjoner, da oftest med italienske fascistiske politienheter som samarbeidet med tyskerne som ville trenge seg inn og arrestere folk som skjulte seg i kirkenes ekstraterritoriale bygninger. Ved krigsutbrudd hadde garden sin normale maksimalstyrke på 500 mann, men den tyske okkupasjon førte til rekruttering av mange flere. I juni 1944 dreide det seg om rundt 2000 mann, mange av dem folk som selv var i faresonen for deportasjon til tyske konsentrasjonsleirer.