I kontrast til Mary hadde Elizabeths andre datter, Anne Boleyn, et nært og tett forhold til sin mor. Elizabeth hadde ansvaret for Annes første utdannelse og hun hadde lært henne musikk og om religion foruten brodering, lesning og skriving. I 1525 ble Henrik VIII forelsket i henne og Elizabeth ble hennes beskyttende chaperone (anstand). Hun fulgte Anne til hoffet ettersom Anne forsøkte å unngå et seksuelt forhold til kongen. Det var Elizabeth som reiste sammen med Anne for å se Palace of Whitehall etter fallet til Boleyn-familiens store politiske motstander, kardinal Thomas Wolsey – en intrige som hadde gikk Anne hennes første virkelige smak på politisk makt. Hun ble kronet som dronning av England fire år senere.