Pizarro deltok i en koloniseringsekspedisjon under ledelse av Alonso de Ojeda til den karibiske kysten av Sør-Amerika på en ekspedisjon som la ut fra Spania i 10. november 1509. Ekspedisjonens leder, Alonso de Ojeda, reiste tilbake til Santo Domingo med et skip for å skaffe nødvendige forsyninger for at kolonien skulle overleve. Pizarro ble utnevnt til koloniens leder i Ojedas fravær. Da kolonistene forgjeves hadde ventet på Ojeda og nye forsyninger i flere måneder,og kolonistenes antall var blitt betydelig redusert av sykdom og sult, bestemte Pizarro seg for å forlate kolonien med de gjenværende kolonistene. Målet var å seile tilbake til Santo Domingo. Men underveis langs kysten østover møtte de på en suppleringsflåte med forsyninger under ledelse av Enciso, Ojedas medspiller. Ojeda selv visste ingen noe om. Pizarro og hans menn fikk ordre om å følge med tilbake til Santa Marta, som ble rekolonisert under ledelse av Enciso. Santa Marta var imidlertid et like ubeboelig sted som før, og kolonien ble etter kort tid flyttet vestover til Darien i dagens Panama, og fikk navnet Santa Maria Antigua. Enciso var en upopulær leder, og kolonistene gjorde opprør i 1510 og avsatte ham under ledelse av Vasco Núñez de Balboa, som ble den nye lederen i kolonien. Balboa sørget for å få kontroll over indianerne i nabolaget og forsyne seg av de verdier av gull og sølv som han fikk tak i. Deres gulltørst var så stor at indianerne i håp om å bli kvitt dem fortalte dem om at det på andre siden av fjellene fantes et hav, og sørover ved dette havet var det et rike som var dekket av gull (El Dorado). Denne beretningen førte strakt til planlegging av en ekspedisjon for å finne dette havet, og i 1513 ble «Sydhavet» (Stillehavet) oppdaget av en ekspedisjon ledet av Balboa over Panamaeidet, og som Pizarro deltok på.