Det kan være vanskelig å etablere diagnosen multippel sklerose i tidlige stadier av sykdommen. McDonald-kriteriene er en internasjonalt brukt standardisering av diagnose-kriteriser, som tar i bruk kliniske opplysninger, laboratorieundersøkelser og bildediagnostikk. Kliniske opplysninger alene kan være nok for å stille diagnosen MS. Dersom en person har opplevd to separate episoder med nevrologiske symptomer som er karakteristisk ved MS, og som har konkrete separate nevrologiske tegn som understøtter dette ved klinisk undersøkelse, kan diagnosen stilles uten videre undersøkelser. Ettersom mange pasienter oppsøker lege etter det første anfall, vil ytterligere undersøkelser ofte være påkrevd. Magnetresonanstomografi (MR) av hjernen og ryggmargen brukes ofte for å vurdere personer som mistenkes å ha MS. MR vil avdekke områder med demyelinisering som hvite lesjoner på T2-vektede og FLAIR-(fluid attenuated inversion recovery)sekvenser. Gadolinium-kontrastmiddel brukes for å påvise aktive plaque på T1-vektede bilde. Ettersom MR kan påvise lesjoner som har oppstått tidligere, men som ikke har gitt kliniske symptomer, kan dette utgjøre beviset for at det dreier seg om en kronisk sykdom, og således utgjøre det definitive holdepunkt for å stille diagnosen MS. Om en person kun har hatt ett attakk, så kan man fortsatt sette diagnosen om man viser at lesjoner har oppstått på ulike tidspunkt. Dette gjøres enten ved at man viser at det har dukket opp nye lesjoner på en ny MR, eller at man samtidig har lesjoner som har tatt opp kontrastmiddel og som ikke har det. Undersøkelse av cerebrospinalvæsken kan utgjøre bevis for kroniske inflammatoriske forandringer i sentralnervesystemet. Ved MS kan man påvise oligoklonale bånd ved immunoforese, som er immunoglobuliner, som finnes hos 85 % til 95 % av personer med sikker MS (men kan også ses ved andre sykdomstilstander). Kombinert med MR og kliniske opplysninger, kan tilstedeværelsen av oligoklonale bånd være med på å stille en sikker diagnose. Cerebrospinalvæsken til undersøkelse samles ved lumbalpunksjon. Hjernen til en person med MS responderer ofte i mindre grad ved stimulasjon av synsnerven og sensoriske nerver. Disse hjerneresponsene kan undersøkes med visuelt evokerte potensialer (VEP) og sensorisk evokerte potensialer/somatosensorisk evokerte potensialer (SEP). Redusert aktivitet ved disse testene kan avsløre demyelinisering, som kan være asymptomatisk.