Etter at Henrik VIII fikk annullert ekteskapet med Anne Boleyn, ble Elizabeth og halvsøsteren Maria erklært å være født utenfor ekteskap og fjernet fra arverekkefølgen. Deres yngre halvbror Edvard VI av England etterfulgte Henrik VIII på tronen. Da den 15 år gamle Edvard døde i 1553 ble Maria hans etterfølger. I Marias regjeringstid ble Elisabeth først satt i Tower of London og deretter i husarrest, fordi Maria mistenkte henne for delaktighet i et protestantisk opprør.