I 1657 anskaffet biblioteket også manuskriptene som hertugene av Urbino hadde samlet. I 1661 ble grekeren Leo Allatius utnevnt til bibliotekar. Christina av Sverige sørget for at hennes bibliotek, som i praksis var omtrent alt som hadde hørt til det svenske kongelige bibliotek, også ble del av Vatikanbiblioteket ved hennes død i 1689.