Mellom 1804 og 1806 ledet han så, sammen med William Clark, Lewis-og-Clark-ekspedisjonen over ukjent mark fra St. Louis til Stillehavet og tilbake. I sine dagbøker og beretninger beskrev Lewis det han fant ut av interesse om geologi og geografi og et antall inntil da ukjente planter, dyr, og dessuten nye indianerstammer. Han noterte seg også hvor han mente at militære støttepunkter og handelsposter kunne innrettes.