På 1500-tallet ble byen et fristed for religiøse som var forfulgt i sine hjemland, blant annet jøder fra Spania og Portugal, som flyktet fra den spanske inkvisisjonen, og hugenotter fra Frankrike. Jødene grunnla en omfattende diamanthandel, som byen dog stort sett mistet etter andre verdenskrig fordi den jødiske befolkningen ble deportert. Diamanthandelen og den stadig stigende østersjøhandelen gav byen et nytt oppsving. Da åttiårskrigen (1568–1648) brøt ut, holdt Amsterdam seg en tid tilbake, og først i 1578 sluttet den seg til opprøret. Da Antwerpen ble erobret av Spania i 1585 og dens handel ødelagt, var Amsterdam kvitt sin største konkurrent, og da noen av kjøpmennene fra de erobrede provinsene flyktet til Amsterdam, begynte byens egentlige storhetstid. Mellom 1585 og 1595 ble byens innbyggertall nesten fordoblet.