I 1642 utførte han sitt mest berømte verk, «Nattevakten» (egentlig «Kaptein Banning Cocqs kompani», eller «Skyttergildet»). Man trodde lenge at det handlet om en nattlig scene på grunn av patinaen. Først i 1947 fikk maleriet en skikkelig rengjøring. Maleriet er enestående i sin lysende fargebehandling og ekstreme kjellerlys. Rembrandt fremstiller øyeblikket da kompaniet får marsjordre.