Der traff han botanikeren Aimé Bonpland. Med tillatelse fra den spanske regjeringen til å reise frit rundt det i spanske Amerika (en tillatelse som ingen før ham hadde fått) innledet de sammen reisen fra La Coruña den 5. juni 1799 og landsteg i Cumaná i Venezuela den 16. juli samme år. I atten måneder studerte de Venezuela, fortsatte deretter fra Puerto Caballo over Calabozos gresstepper til Apurefloden og dro oppover Orinoco og Casiquiare til Amazonasflodens bielv Rio Negro, hvorved Orinocos forbindelse med Amazonfloden ble bekreftet. I Cumaná, dit de hadde vendt tilbake langs Orinoco, innskipet de seg den 24. november 1800 til Cuba. De dro i mars 1801 til Cartagena og oppover Magdalenafloden til Bogotás og Quitos høysletter, der de besteg Chimborazo 23. juni 1802 til datidens største oppnådde høyde av mennesker (5 800 meter), skjønt ikke helt opp til selve toppen. Humboldt var den første som vitenskapelig beskrev effektene av høydesyke (oksygenmangel i blodet).