Landets militarisme førte til at landet erklærte krig mot Argentina og Brasil i 1864. Disse allierte seg med Uruguay til trippelalliansen. Den såkalte trippelalliansekrigen varte til 1870 og ble altødeleggende for Paraguay. Soldaten døde på begge sider i svært store tall, mest på grunn av sykdom. Hele enheter døde av kolera på vei til krigssonen. For Paraguay er det sannsynlig at minst to tredjedeler av den voksne mannlige befolkningen døde, enkelte mener opp til 90%. Fra en befolkning på i underkant av en halv million endte landet med ca. 150-180.000 innbygger, derav ca. 28.000 menn. Som tapende part måtte Paraguay avstå omtrent 140 000 km² til Brasil og Argentina. Som resultat stoppet utviklingen i landet etter at Paraguay hadde tidligere hatt en av Sør-Amerikas mest lovende økonomiske utviklinger.