Etter Christian IIIs død i 1559 overtok hun Sønderborg slott og Sønderborg. Som enkedronning bodde hun for det meste på Koldinghus. Hun forsøkte å gifte seg med Christian IIIs halvbror, hertug Hans den eldre, men ble forhindret både av kirken og deler av familien. Dorothea var en aktiv dronning, som til sønnen Frederik IIs store irritasjon, blandet seg i alt fra lokalpolitikk til invasjonen av Ditmarsken og ikke minst i den nordiske syvårskrig. Her skrev hun, bak ryggen på ham, til sin nevø Erik XIV av Sverige, for å forhandle om fred. Det ble aldri et varmt forhold mellom mor og sønn, og kong Frederik fratok henne gleden ved å se kongen gift, som han ventet med til hun var død.