Mukwege var tredje av ni barn av en pinsepastor og hans kone. Han studerte medisin fordi han ønsket å helbrede de syke som hans far ba for. Fra 1983 arbeidet han på et sykehus i fjellene. Etter å ha sett komplikasjonene som kunne ramme fødende kvinner som ikke hadde tilgang til spesialisttjeneste, reiste han til Frankrike i 1984 for å studere obstetrikk og gynekologi og ble ferdig spesialist i 1989. I 2008 hadde han behandlet ca. kvinner i løpet av den 12 år lange krigen i Kongo, noen av dem mer enn én gang. Han kan ha opp til ti operasjoner på én dag i arbeidsdager som varer 18 timer og har fortalt at pasienter noen ganger kommer nakne til sykehuset, ofte blødende og med urin og avføring som lekker fra istykkerrevne vaginaer.