Markovnikov er mest kjent for Markovnikovs regel, som han utviklet i 1869 for å beskrive addisjonsreaksjoner mellom HX og alkener. Ifølge denne regelen vil det nukleofile X- binde seg til karbonatomet i dobbeltbindingen med færrest hydrogenatomer, mens protonet binder seg til karbonatomet med flest hydrogenatomer bundet til seg fra før. Av den grunn dannes 2-klorpropan (CHCHClCH) fremfor isomeren 1-klorpropan (CHCHCHCl) når det skjer addisjon av hydrogenklorid (HCl) til propen. Regelen er nyttig for å forutsi de molekylære strukturene til produkter i addisjonsreaksjoner. Hvorfor hydrogenbromid både fulgte Markovnikovs regel og en motsatt mekanisme, kjent som anti-Markovnikov-addisjon, ble derimot ikke forstått før Morris S. Kharasch kom med en forklaring i 1933.