Denne gangen la han kursen lenger syd enn på den første reisen, og det første land han så var Dominica. Derfra fulgte han nordvestover kjeden av øyer som har fått navnet De små Antiller, der han ga navn til Guadeloupe, Montserrat, Antigua og Nevis. Disse gjorde han krav på som spansk territorium, på samme måte som Jomfruøyene og Puerto Rico. Deretter dro han til Hispaniola, der han fant La Navidad brent til grunnen og kolonistene drept. Han fant ut at kolonistene hadde kommet i strid med indianerne, som hadde utslettet den første hvite kolonien på amerikansk jord. Han etablerte en ny bosetting ved Isabella, lenger øst på nordsiden av Hispaniola, der skipene stanset opp på grunn av motvind. Columbus anså det som Guds tegn på at det var her kolonien skulle ligge. Den hadde dårlig beliggenhet, og bosettingen varte ikke lenge. Han utforsket de indre deler av øya, og fant litt gull, hvor han etablerte et fort. Senere utforsket han sørkysten av Cuba, men snudde før han nådde vestspissen, og han var derfor sikker på at dette var en halvøy, ikke en øy. Han oppdaget også Jamaica, som han kalte for «Santiago» og Isla de la Juventud, som han kalte for «La Evangelista». Før han dro ut på den andre reisen, hadde han fått beskjed av Ferdinand og Isabella om å opprettholde et vennlig forhold til de innfødte. Men på turen sendte Columbus et brev tilbake der han foreslo å gjøre noen av de innfødte til slaver, særlig karibene, som bodde på øyene i De små Antiller, fordi de var så aggressive. Dette forslaget ble avvist. Likevel tok han i februar 1495 1600 tainoer til fange. 550 av disse ble sendt til Spania, hvorav 200 døde på reisen. Etter en rettssak ble de som overlevde turen satt fri og sendt tilbake. 500 av fangene ble fordelt som slaver blant kolonistene. Columbus slapp fri de resterende 400 av fangene, de fleste kvinner med små barn, og de flyktet opp i fjellet, slik at de ifølge Columbus gjorde det vanskelig å fange dem igjen senere. Denne ugjerningen var den første store konfrontasjonen mellom spanjoler og innfødte i «den nye verden».