Bartholin ble i 1677 professor i filosofi (utnevnt allerede i 1674, men tiltrådte professoratet først etter en treårig utenlandsreise), og etterfulgte faren som professor i medisin i 1680. Han var sterkt påvirket av Steno og oppdaget selv en spyttkjertelgang og noen kjertler i de kvinnelige kjønnsorganene (bartholinske kjertler). Utover sine anatomiske skrifter skrev han også flere arkeologiske verk. I 1691 ble han høyesterettsassessor, i 1719 generalprokurator og i 1724 assisterte med styringen av landets finanser. Han var den første ikke adelige som fikk dannebrogordenen (1729), og ble 1731 sammen med alle andre av farens etterkommere adlet.