Han er den antatte gjerningsmannen for mordet på Maria Stuarts mann lord Darnley i 1567. Han ble gift med henne etterpå, noe som vakte så stor oppmerksomhet at hun måtte abdisere fra Skottlands trone. Hepburn flyktet til Norge, hvor han ble arrestert for brudd på et tidligere ekteskapsløfte til en norsk adelsdame, Anna Rustung, datter av Christoffer Trondsen. Fra 1567 var Hepburn statsfange i Danmark, blant annet på Malmøhus, men det meste av tiden på Dragsholm slott, hvor han satt fengslet fra 1573 til sin død i 1578. Han ble bisatt i Fårevejle kirke, hvor et mumifisert lik har helt siden 1858 blitt ansett å være hans.