Hun hadde to eldre søsken, Eleonora og Karl, samt de tre yngre søsknene Ferdinand, Maria og Katarina. Isabella og hennes søsken ble ansett som den tids «edleste barn», Isabella er også den uten sammenligning fornemste dronningen Danmark har hatt. Hennes brødre ble som tysk-romerske keisere Europas mektigste menn. De måtte imidlertid kjempe med religiøse problemer utløst av Martin Luther og reformasjonen. Søstrene hennes ble dronninger i henholdsvis Portugal, Frankrike, Böhmen og Ungarn.