Det har blitt spekulert om Thutmoses far var Amenhotep I. Hans mor, Senseneb, var en antagelig en kvinne av folket, og kan ha vært en elskerinne eller en sekundær hustru av lav status. Dronning Ahmose, som holdt tittelen som «store kongelige hustru» (førstehustru) av Thutmose, var antagelig en datter av Ahmose I og søster av Amenhotep I. Hun ble imidlertid aldri kalt for «kongens datter» og det er derfor heftet tvil til dette, og en del forskere mener hun kan ha vært Thutmoses egen søster. Forutsatt at hun var beslektet med Amenhotep er det tenkt at hun ble gift med Thutmose for å sikre etter etterfølgelsen. Men dette er neppe riktig av to årsaker. For det første, Amenhoteps alabastbåt ble bygd ved Karnak for å assosiere Amenhoteps navn med Thutmoses navn i god tid før Amenhoteps død. For det andre var Thutmoses førstefødte sønn med Ahmose, Amenmose, åpenbart født lenge før Thutmose selv ble farao. Sønnen kan bli sett på en stele fra Thutmoses fjerde regjeringsår hvor han er framstilt på jakt i nærheten av Memfis og han ble «kommandant av hæren til sin far» en tid før han døde, noe som ikke var senere enn Thutmoses egen død i hans tolvte regjeringsår.