Den andra hertugen, Cosimo de' Medici, etablerte en sterk florentinsk flåte og ekspanderte staten ved et innkjøp av øya Elba, og erobringen av republikken Siena. I år 1569 opphøyde pave Pius V så Cosimo til hertug i storhertugdømmet Toscana. Dermed ble også hertugdømmet Firenze innforlivet i storhertugdømmet Huset Medici styrte Toscana frem til 1737.