Ekspedisjonen krysset Urabá-bukta, og kom raskt i voldsom kamp med indianere på Darién-kysten. Spanjolene seiret, og plyndret indianernes landsbyer, som inneholdt store verdier av gull, slik Balboa hadde forutsagt. En ny koloni under navnet Santa Maria la Antigua de Darién ble etablert, og herfra fortsatte spanjolene sine erobrings- og plyndringstokter med hell. Enciso ønsket å følge en mer diplomatisk linje overfor indianerstammene i nabolaget, mens flertallet av hans menn, med Balboa i spissen, overkjørte ham med en krigersk linje. Encisos forsøk på å ta kontrollen ved å straffe overivrige undersåtter førte til opprør. Balboa påpekte at de nå var utenfor Ojedas og Encisos domene, ettersom de nå var på Darién-kysten, der Nicuesa var rettighetshaver. Enciso hadde derfor ingen rettmessig myndighet i kolonien Santa Maria, og han ble arrestert og satt i fengsel. Balboa ble valgt til koloniens borgermester.