Syrekulturen (av noen også kalt starterkultur) som tilsettes ved produksjon av cheddar, er subsp og subsp som sammen utgjør en O-kultur. Disse melkesyrebakteriene er homofermentative, og kan da danne kun melkesyre fra laktose, men de er også med på å danne det karakteristiske utseendet, konsistensen og smaken på cheddar under modning gjennom frigjørelse av enzymer i form av proteaser og peptidaser, og lipaser som bidrar til proteolyse og lipolyse. I tillegg til starterkulturen kan det, i likhet med andre oster, forekomme vekst av såkalte NSLAB (non starter lactic acid bacteria) som ikke tilsettes i ystemelken, men som kan komme naturlig fra melken, blant annet på grunn av feil under pasteurisering eller fra omgivelsene som blant annet ystekar eller pressutstyr. Eksempler på NSLAB i cheddar er , og som i likhet med andre NSLAB kan bidra til dannelse av større mengder små peptider og aminosyrer i sluttproduktet og danne forløpere til aromakomponenter som artene i O-kulturen kan omdanne videre til aromastoffer. Enkelte NSLAB kan imidlertid også gi sprekkdannelse og hulldannelse som ikke er ønsket i cheddarost.