Mellom 1503 og 1522 ble byen omsluttet av en bymur med ni byporter og tre tårn. Vilnius nådde høyden av sin utvikling under styret til Sigismund II Augustus som flyttet sitt hoff dit i 1544. I de neste århundrene utviklet Vilnius seg til stadig å bli en større og mer moderne by. Denne veksten skyldtes delvis grunnleggelsen av Vilnius universitet av kong og storfyrst Stefan Bathory i 1579. Universitetet utviklet seg til å bli et av de viktigste vitenskapelige og kulturelle sentra i regionen og det viktigste vitenskapelige senter i Storfyrstedømmet Litauen. Selvsagt var det politiske, økonomiske og sosiale liv i full sving. Dette underbygges av byens statutter fra 1500-tallet, der de siste fremdeles var i kraft på 1800-tallet. I 1769 ble Rasos-kirkegården etablert; i dag er den en av de eldste gravlundene i verden.