TB-3 ble brukt under slaget ved Khalkhin Gol mot Japan og i Vinterkrigen mot Finland. Selv om den offisielt var trukket fra tjeneste i 1939 ved begynnelsen på den store patriotiske krig den 22. juni 1941, hadde Sovjets flyvåpen 516 operative TB-3 med ytterligere 25 operert av den russiske marine. Stasjonert fjernt fra USSR's vestlige front, unngikk ТB-3nkatastrofale tap under de første tyske luftangrep. Senere begynte TB-3 fra 3. TBAP (Heavy Bomber Regiment) å utføre nattbombing fra 23. juni. Mangel på kampklare fly krevde også bruk av TB-3 uten jagereskorte og i denne rolle opererte bombeflyene i lav til middels høyder, led store tap mot fiendens jagerfly og antiluftskyts. I august 1941 utgjorde TB-3 25% av Soviets bombestyrker og ble operert av eliten av mannskaper som fløy opp til tre kampoppdrag hver natt. Flyene deltok i alle store kamper gjennom 1943, inklusive slaget om Smolensk, slaget om Moskva, slaget om Stalingrad, beleiringen av Leningrad og slaget om Kursk. Den 1. juli 1945 hadde 18. Air Army fremdeles ti TB-3s i aktiv tjeneste.