Johanna ble født i Toledo, hovedstaden i kongeriket Castilla. Hun var datter av Isabella I av Castilla og Ferdinand II av Aragón (begge av huset Trastámara). Hun var et intelligent barn, og lærte seg alle de iberiske språk, såvel som fransk og latin. Samtidig var hun en skjør og reservert ung kvinne, i en slik grad at det vakte oppmerksomhet.