Dee ble født i Tower Ward i London. Hans far Roland var tekstilhandler av walisisk avstamning og medlem av handelsmennenes laug. Moren, Jane eller Joanna Wild, giftet seg med Roland som femtenåring, og sønnen ble født tre år senere. Roland tjente ved Henrik 8.s hoff som med ansvar for innkjøp og stell av sjeldne, kostbare tekstiler. Dee var stolt av sin ætt, besøkte Wales og påstod at han hadde sporet familien sin tilbake til Rhodri Mawr, kongen av Gwynedd på 800-tallet. Et horoskop som oppbevares blant Dees papirer i Bodleian-biblioteket i Oxford, angir nøyaktig fødselsøyeblikk. Familienavnet var egentlig , walisisk for «svart».