I 1877 tok Pasteur fatt på videre studium av sykdommer i husdyr og mennesker. Han studerte miltbrann (anthrax), i husdyr, og gjorde forsøk som viste at denne ble forårsaket av bakterier. Så rettet Pasteur en tid arbeidet mot hønsekolera. I et forsøk der hønene skulle infiseres med kolerabakterier ble det ved en feil gitt svekkede bakterier (assistenten Charles Chamberland hadde tatt ferie og gav hønene en måned gamle bakteriekulturer). I stedet for å dø av sykdommen ble hønene bare litt syke, og frisknet så til. Pasteur gjettet at de ville ha utviklet immunitet, slik dyr som hadde overlevde miltbrann gjorde det, og dette viste seg å være rett. Pasteur utviklet nå også en miltbrannsvaksine på samme vis. Her benyttet han egentlig en metode utviklet av sin rival, Jean-Joseph-Henri Toussaint, men hevdet offentlig at han hadde svekket miltbrann-bakterien ved å utsette den for oksygen. Først etter å ha fått patent på vaksinen klarte Pasteur å framstille den på denne måten. Påstanden om en kur ble først møtt med skepsis, men et forsøk med vaksinerte og uvaksinerte dyr viste nytten av vaksinen. Denne metoden å vaksinere på, der en selv laget svekkede bakterier, var ny. Tidligere hadde en brukt naturlig forekommende svakere smittestoff til dette, som kukopper mot kopper.