Før spanjolene kom til Ecuador fantes det en landsby der Guayaquil nå ligger. Det er uenighet både om dato og årstall både for når byen ble grunnlagt, og hvem som gjorde det, men kolonibosetningen fikk navnet Muy Noble y Muy Leal Ciudad de Santiago de Guayaquil. Byen har valgt å markere sin etablering den 25. juli. Årstallet kan være frs 1535 til 1538, byen kan ha vært tatt tilbake av indianere før den til sist ble grunnlagt som en spansk koloniby i Quitoprovinsen.