Spillet tar plass i og rundt dagens London. Hovedpersonen er Hershel Layton, professor i arkeologi ved fiktive Gressenheller University, som er stolt av sin opptreden som gentleman og hans gåtemestring. Etter hendelsene i , er Layton fulgt av Flora Reinhold som hjelper med å rydde hans kontor på universitetet, men har også lyst til å bli med på Laytons eventyr. Layton møter ofte på politisjefen på Scotland Yard, Inspector Chelmey, i sine eventyr. Layton møter også på en begavet oppfinner med navn Don Paolo, som er en mester i forkledning. Han mener også at han er erkesnemesisen til Layton, fordi han mistet sin ungdoms-kjærlighet, Claire, til Laytons sjarm. I den etterfølgende trilogien blir Laytons tidligere assistent, Emmy Altava, med på Luke og Laytons eventyr.