Anna Midelfart ble utdannet sivilingeniør med 2. avdeling biokjemi fra NTH i 1971. Deretter begynte hun å studere medisin. Hun tok medisinsk embedseksamen i 1978 og den medisinske doktorgrad i 1988. Samme år ble hun godkjent som spesialist i øyesykdommer. Hun har også en mastergrad i helseadministrasjon. Hun hadde både kliniske og vitenskapelige stillinger frem til 1996, da hun ble utnevnt til Norges første kvinnelige professor i øyesykdommer (oftalmologi) ved NTNU. Hun ble også overlege i bistilling ved øyeavdelingen ved St. Olavs hospital. Fra 1996 til 2001 var hun også professor II i biofysikk ved NTNU.