Hertug Albrecht av Brandenburg-Ansbach, stormester av Den tyske orden, kalte ham deretter til teologiprofessor ved det nyopprettede universitetet "Albertina" (grl. 1544) i Königsberg. Her ble Osiander forviklet i en disputt om et teologisk punkt som skulle vise seg å bli et kjernepunkt for den lutherske tro, nemlig læren om rettferdiggjørelsen. Den såkalte osiandriske strid stod på i årevis og førte til en splittelse innen den protestantiske bevegelse.