Mens han eksperimenterte med elektrisitet, oppdaget han den 8. november 1895 en ny form for stråling som han kalte «X-stråler», siden de var ukjente. På engelsk kalles de fremdeles , men på noen språk, som tysk og skandinavisk, brukes betegnelsen «røntgenstråling», enda Röntgen selv ikke ønsket navnet sitt i betegnelsen for strålingen. Det hele startet med hans forskning på katodestråler, dvs. elektriske utladninger i glassrør som inneholder fortynnet gass. Også Thomas Alva Edison og Kristian Birkeland var opptatt av dette; Birkeland la grunnlaget for sine teorier om nordlys ved hjelp av slik forskning. Röntgen på sin side eksperimenterte en kveld i et mørklagt rom med et katoderør som var pakket inn i svart papp. En plate med barium platinocyanid som lå bordet ved siden av, blusset med luminescens hver gang det kom en utladning i katoderøret. Bare bly og platina var ugjennomtrengelige for de uforklarlige strålene. Röntgen la merke til at holdt han hånden sin mellom røret og platen, kunne han se håndknoklene sine. Han studerte fenomenet i syv uker hvor han både spiste og sov i laboratoriet. Så ba han sin kone Anne Bertha om å legge hånden over en fotografisk plate. Etter bestråling med katoderøret i et kvarter, så man etter fremkalling av platen Anne Berthas hånd, knoklene inni dem og de to ringene på ringfingeren hennes.