Fra 1540 til 1542 var han leder av en ekspedisjon som søkte etter den legendariske gullbyen El Dorado. Da Francisco Pizarro døde i 1541 ble det fra Spania sendt en visekonge Blasco Núñez Vela som overtok styret i Peru i 1544, men som ble svært upopulær blant encomenderoene. Audienciaen gjorde felles sak med encomenderoene og avsatte visekongen, og utpekte Gonzalo Pizarro til midlertidig overhode. Visekongen samlet en styrke rundt seg, og han og Pizarro møttes i et slag i 1546, der Pizarros styrker seiret, og visekongen ble drept. Da ny visekonge ankom, nektet Pizarro å overgi seg, og han ble sett på som opprører. Han ble til slutt tatt til fange, og ble dømt til døden for høyforræderi og tyranni. Den 9. april 1548 ble han halshugd i Peru.