Spillet starter hos hovedkarakteren Desmond Miles i 2012. Desmond Miles er den eneste som kan redde verden. Desmond må lete tilbake i fortiden hos forfedrene sine ved hjelp av en maskin kalt Animus 2.0. Han finner ut at det finnes noen guddommelige objekter kalt .Disse bærer stor kraft og kan bli brukt til mye ondt. Han finner også ut at flere verdensledere har eid minst ett av disse objektene. Desmond får hjelp fra tre forskere som heter Sean Hastings, Lucy Stillman og Rebecca Crane. Assassin's Creed: Brotherhood er en fortsettelse av bestselgeren Assassin's Creed II så historien følger videre på det som har skjedd tidligere. Vi møter Ezio igjen. Ezio har vokst og blitt eldre og visere. I forrige spill var det en hard kamp mellom Ezio og Rodrigo Borja, men i dette spillet er det en hard kamp mellom Ezio Auditore og Cesare Borgia. Ezio dreper mange historiske personer i en søken om å nå Cesare.