Spanjolene møtte sterk motstand i Oaxaca, og først i 1529 bet de seg fast i den nygrunnlagte byen Oaxaca by. Conquistadoren Hernán Cortés gav seg selv store jordegods i Oaxaca, og som overalt ellers måtte urbefolkningen arbeide hardt under slavelignende forhold på de spanske storgodsene. Befolkningen gikk sterkt tilbake, det bodde ca. 150 000 mennesker i sentraldalene i 1568, 70 år senere var befolkningen redusert til 40–50 000 mennesker. I kolonitiden var spesielt sentraldalene viktige for produksjonen av cochinille, en rødfarge som utvinnes av et spesielt tre.