Theiler ønsket å fortsette en karriere innen forskning, så i 1922 tok han en stilling ved Harvard University ved avdelingen for tropisk medisin. Han tilbrakte mange år med å undersøke amøbedysenteri og forsøkte å utvikle en vaksine fra rottebittfeber. Han ble assistent til Andrew Sellards og begynte å arbeide med gulfeber. I 1926 motbeviste de Hideyo Noguchi og teorien om at gulfeber ble forårsaket av bakterien , og i 1928, året etter at sykdommen endelig ble identifisert som et virus, viste de at de afrikanske og søramerikanske virusene er immunologisk identiske. Dette fant de ut etter at Adrian Stokes hadde indusert gulfeber i rhesusaper fra India. I løpet av denne forskningen ble Theiler selv smittet av gulfeber, men overlevde og utviklet immunitet.