Som følge av henrettelsen av den pro-romerske østgotiske dronningen Amalasuntha og da den østgotiske kong Teodahad nektet å si fra seg kontrollen over Italia, beordret Justinian at også Italia skulle erobres, det antikke kjernen i riket. Fra 534 til 540 drev de østromerske styrkene krigføring i Italia og erobret Ravenna, den østgotiske og tidligere vestromerske hovedstaden, i 540. Den gotiske motstanden ble samlet på nytt under kong Totila i 541, og ble kun beseiret som følge av krigføringen til general Narses, som også slo tilbake invasjoner av Italia av frankerne og alamannerne. Justinian kunngjorde pragmatisk sanksjon for å reorganisere styret av Italia. En del byer i nordlige Italia fortsatte å holde ut til fram på 560-tallet. Mot slutten av konflikten opplevde Italia betydelige ødeleggelser og avbefolkning, som kombinert av de katastrofale effektene av den justinianske pesten gjorde det vanskelig å beholde grepet i påfølgende århundrene.