Nei til EU, ledet av Kristen Nygaard og ungdomsorganisasjonen Ungdom mot EU var den viktigste organisasjonen på nei-siden. Organisasjonen ble grunnlagt i 1990 med henblikk på å forhindre både medlemskap i EU og tilslutning til EØS-avtalen, selv om det sistnevnte perspektivet ble tonet ned i selve EU-kampen. Senterpartiet, Sosialistisk Venstreparti og Rød Valgallianse var rene nei-partier, mens Venstre og Kristelig Folkeparti også tok stilling mot medlemskap, selv om det i begge partiene var betydelige mindretall som var for medlemskap. Blant næringslivet var bonde- og fiskerinteressene viktige for nei-siden, og utgjorde dens viktigste økonomiske fundament.