Maria Stuart hadde også betenkeligheter i over hvor klokt det var å fornærme og motarbeide dronning Elisabeth, og hun gjorde forsøk på å bedre forholdet ved å invitere den engelske dronning til å besøke Skottland, uten at hun ville signere Edinburgh-traktaten av den grunn. Elisabeth nektet, og det dårlige forholdet mellom dem fortsatte. Maria sendte da William Maitland av Lethington som ambassadør til det engelske hoffet for å fremme saken med Maria Stuart som en mulig arving til den engelske tronen. Elisabeths svar skal etter sigende ha omfattende følgende utsagn: «Som for tittelen på min krone, for min tid tror jeg ikke at hun vil oppnå den.» Imidlertid fortalte Maria noe annet i hennes eget brev til hennes onkel på morsiden, hertug Frans av Guise, hva Maitland hadde rapportert til henne, inkluderte at Elisabeths egentlige utsagn skal ha vært «Jeg for min del vet ikke bedre, eller at jeg selv ville foretrekke henne» (). Elisabeth var oppmerksom på den rolle som det engelske parlamentet ville ha i denne saken.