Men i 1587 endret dette seg; da ble Nagasakis velstand berørt av at Toyotomi Hideyoshi kom til makt i landet. Han var bekymret over den store kristne innflytelsen i det sørlige Japan, og beordret alle misjonærer utvist. Nå ble alt tilbakeført til keiserlig kontroll. Japanske og utenlandske kristne ble forfulgt, og i 1596 korsfestet Hideyoshi 26 kristne i Nagasaki for å avskrekke alle som måtte ha tanker om å vende seg mot ham. De portugisiske handelsfolkene ble imidlertid ikke fordrevet, og byens økonomi ble ikke skadelidende.