Santoro fikk rollen som den persiske keiseren Xerxes I i filmen 300, basert på Frank Millers tegneserie med samme navn, i 2007. Denne rollen hadde mange spesielle krav, som for eksempel intensiv trening for å klare de fysiske kravene. Han måtte også gjennom en fjerning av alt hans kroppshår, først ved hjelp av voksing, og deretter ved barbering da voksingen ble for smertefull. Hans øyenbryn ble beholdt intakt i første omgang, men dekket over med protetikk og trukket i stedet for å bli barbert. Santoro var den første brasilianske skuespilleren som noensinne har blitt nominert til en MTV Movie Awards innen kategorien for beste skurk. Imidlertid vant han ikke denne prisen, og den ble gitt til Jack Nicholson for hans rolle i filmen The Departed.