I mellomtiden mener en menneskelig organisasjon kalt Cerberus at mennesker fortjener en større plass i det galaktiske samfunnet. De støtter prinsippet om at alle metoder for å fremme menneskehetens oppstigning er fullstendig rettferdiggjort, inkludert ulovlig eksperimentering og terror-aktiviteter. Spillets hovedperson er kommandør Shepard, en menneskelig elitesoldat som er øverstkommanderende for stjerneskipene SSV Normandy og Normandy SR-2. Medlemmer av Shepards enhet inkluderer Cerberus-operatørene Jacob Taylor og Miranda Lawson, medarbeidere Garrus Vakarian og Tali'Zorah, forsker Mordin Solus, den kriminelle Jack, den gen-manipulerte krogan-supersoldaten Grunt, morderen Thane Krios, asari Justicar Samara, og Morinth. Andre karakterer inkluderer pilot Jeff «Joker» Moreau, og Cerberus-lederen Illusive Man. I 2183, kort tid etter hendelsene i Mass Effect, blir SSV Normandy angrepet av et ukjent fartøy. Dette tvinger mannskapet til å forlate romskipet. Shepard dytter Joker inn i den siste rømningsboksen før han blir sprengt ut i verdensrommet.