På 1200-tallet med det fjerde korstog begynte italienere å invadere deler av Dodekanesene som hadde vært under herredømmet til keiserriket Nikea. Herskerfamilier fra republikkene Venezia (Querini, Cornaro) og Genova (Vignoli) behersket en del av øyene for en tid mens basilioske munker hersket på Patmos og Leros. På 1300-tallet ebbet den bysantinske epoken ut da øyene ble tatt med makt av hospitallerordenen (den senere malteserordenen): Rhodos ble erobret i 1309 og de øvrige øynene falt gradvis i løpet av de neste tiårene. Ridderorden gjorde Rhodos til sin hovedbase, omformet hovedstaden til en storslått middelalderby, dominert av en mektig festning, og spredte festninger og forsvarsanlegg over resten av øya.