Johann begynte å studere medisin ved universitetet i Basel. Faren hans ønsket at han skulle studere handel og ta over familiens krydderhandel, men Johann Bernoulli mislikte handel, og overbeviste faren om at han skulle la ham studere medisin i stedet. Men Johann Bernoulli likte ikke medisin heller, og begynte å studere matematikk på siden, sammen med sin eldre bror.. Mens han studerte på Universitetet i Basel, brukte Bernoulli-brødrene mye tid på å studere matematisk analyse som nylig var oppdaget. De var blant de første matematikerne som ikke bare studerte og forstod matematisk analyse, men som også anvendte det til diverse problemer.