Jakob ble formelt kronet til konge i Stirling 29. juli 1567. Han ble oppfostret som medlem av den skotske protestantiske kirken og utdannet av menn med presbyterianske sympatier. Under Jakob VIs tidlige styre, ble makten holdt av en rekke medregenter, der den første var James Stewart, 1. jarl av Moray, hans mors illegitime halvbror. Maria flyktet fra fengselet i 1568, noe som førte til en kort periode med voldeligheter. Lord Moray beseiret Marias tropper i slaget ved Langside og tvang Maria til å flykte til England, hvor hun ble fengslet av den engelske dronningen, Elisabeth I.