Colston etterfulgte sin far i familiens bedrift som kjøpmann. Firmaet handlet i utgangspunktet med vin, frukt og tekstiler, hovedsakelig i Spania, Portugal og andre europeiske havner. Fra 1680 ble han involvert i slavehandelen som medlem av Royal African Company, som hadde monopol på engelsk handel med afrikanske slaver. Han var assisterende guvernør av selskapet i 1689-1690.