Avtalen ble ikke strengt etterfulgt, og Spania tillot blant annet at den portugisiske kolonien Brasil ekspanderte over grenselinjen. Mellom 1580 og 1640 var i tillegg Portugal i personalunion med Spania, noe som gjorde at avtalen ikke fungerte. Tordesillastraktaten ble etterfulgt av Madridtraktaten i 1750 som sikret Portugal kontroll over alle territoriene de hadde kolonisert.