Leonardo fremstiller øyeblikket hvor Jesus sier: «en av dere skal forråde meg», og vi blir vitne til hvordan ordene virker i forsamlingen. De som sitter nærmest Kristus, farer forferdet opp, bøyer seg frem, rykker tilbake, mens bevegelsen etterhvert ebber bort hos de apostlene som sitter lengst borte. Hver disippel reagerer ulikt på ordene, og vi ser reaksjonene også i håndbevegelser og minespill. Kristus selv er fylt av en opphøyet ro som demper lidenskapene. Han er ensom midt i disippelskaren, omgitt av en tom lyskrets. Rommet rundt Jesus og disiplene er nakent og skal først og fremst fremheve perspektivet. Vinduet bak Jesus fremhever hans silhuett nesten som en glorie. Disiplene er delt opp i grupper på tre og tre. Nærmest Jesus, til venstre sitter Johannes, deretter Peter. Judas blir i denne gruppen presset frem over bordet, og hans ansikt ligger i skyggen. Ved å komponere bildet på denne måten oppnår Leonardo at Jesus blir midtpunktet. Forsvinningspunktet som er i Jesu høyre øye understreker dette. Jesus er dessuten den eneste som er fremstilt med helt rene fargetoner. Denne fordelingen mellom Jesus og disiplene gir bildet en klar over- og underordning, dette kalles en hypotaktisk struktur. Et annet trekk som er verdt å legge merke til er at belysningen kun fremhever det viktige i bildet, resten ligger i halvskygger. Dette er et typisk høyrenessansetrekk. Leonardos hensikt har vært å vise hvordan en felles opplevelse virker på en gruppe mennesker alt etter alder og temperament.