Spillet inneholder flere uavhengige nivåer som kan nås fra spillets sentrum, Delfino Plaza. Gameplayet er basert på å samle sammen Shine Sprites ved å løse forskjellige oppgaver i nivåene. I begynnelsen har hvert nivå en oppgave som må utføres for å få en Shine Sprite. Spilleren returneres deretter til Delfino Plaza og en ny oppgave blir låst opp i det nivået. Hvert nivå omfatter åtte oppgaver som kan spilles på nytt etter at de er blitt fullført. Når spilleren har samlet sammen nok Shine Sprites, låses et nytt nivå opp i Delfino Plaza, enten gjennom en ny hendelse i historien eller ved at man får et nytt hjelpemiddel. Shine Sprites kan også skaffes ved å samle sammen og bytte blå mynter. Etter at alle «Shadow Mario»-relaterte oppdrag er fullført, får spilleren adgang til nivået hvor den siste bossen i spillet befinner seg.