Gjengen i Mystery Inc. - Fred (Freddie Prinze jr.), Daphne (Sarah Michelle Gellar), Shaggy (Matthew Lillard), Velma (Linda Cardellini) og Scooby-Doo (stemme fra Neil Fanning) - blir invitert til Coolsville Museum of Criminology som æresgjester, men får flere overraskelser enn de setter pris på da en maskert kriminell stjeler to av monsterkostymene i museet. De mistenker at deres gamle fiende Jonathan Jacobo (Tim Blake Nelson) står bak og at han prøver å få de gamle kostymene til å gjenoppstå - men det er flere mistenkte i saken. Det er opp til Mystery Inc.-gjengen å løse mysteriet, redde Coolsville og dermed vise for verden at de fortsatt kan sakene sine.