I 1964 hadde Hepburn hovedrollen i George Cukors filmmusikal , som var basert på Broadway-musikalen . Selv om tilhengere av musikalen forventet at Julie Andrews skulle gjenta rollen fra Broadway, var det Hepburn som til slutt fikk rollen som Eliza Doolittle. Eliza er en cockneytalende blomsterpike som blir lært opp av en professor (Rex Harrison) til å bli en dannet frøken med velartikulert tale. Hepburns sangstemme ble dubbet av Marni Nixon, selv om hun ble lovet å få synge låtene selv. Hepburn fikk god kritikk og ble nominert til en ny Golden Globe for rolleskildringen. Bosley Crowther fra skrev at hun gir filmen «det lille ekstra av subtil magi og egenart». Filmkritiker Roger Ebert skrev i 2006 at Hepburn mestret filmens språklige utfordringer «med likegyldig selvtillit».