I 1520 brøt Comunerosopprøret ut. Opprørerne motsatte seg det de oppfattet som en fremmed hersker. For å gi opprøret legitimitet vendte de seg til Johanna, som formelt fremdeles var den egentlige herskerinne. Hun var ikke uten velvilje, men av frykt for at en støtteerklæring til opprørerne ville skade både landet og hennes sønn, avstod hun fra å gi noen slik støtte. Året etter seiret Karl I i slaget ved Villalar, og med det var opprøret over.