Johanna kom aldri over sjokket etter Filips plutselige død i 1506, og hun nektet å skille lag med hans balsamerte lik. Fra 1509 og frem til sin død bodde hun under bevoktning i Santa Clara-klosteret i Tordesillas. Hun var Spanias lovlige dronning i sønnen Karls lange regjeringstid. Hun kan ha vært rammet av en rekke mentale sykdommer, som depresjon eller schizofreni. Samtidig virker det som tilstanden forverret seg med alle dødsfallene rundt henne: To eldre søskens død, søstersønnen Miguels død, morens og særlig ektefellens død. Det må også bemerkes at både ektefellen og sønnen Karl hadde alt å vinne på at Johanne ble erklært uskikket til å styre.