Mål-DNA blir syntetisert av DNA polymerase fra primerne. Dette skjer ved ca. 72ºC. Ved oppvarming til 95ºC ved denatureringen vil DNA polymerase fra E. coli. ødelegges. Hvis man skal slippe å tilsette ny polymerase for hvert polymiseringstrinn, må det brukes et enzym som tåler høyere temperaturer. Derfor brukes en varmestabil DNA polymerase fra bakterien Thermus aqaticus, kalt Taq polymerase. Denne fungerer best ved 72ºC. DNA-syntesen går fra den frie 3’OH-enden på begge primere. Primer 1 syntetiserer den ene DNA-tråden, mens primer 2 syntetiserer den andre. De to første produktene vil være halvlange, siden flankerende DNA fra bare den ene siden (før primeren) er borte fra det opprinnelige templatet.