Da andre verdenskrig hadde brutt ut, ble det tyske regimet enda hardere. Særlig etter 27. september 1941 da Reinhard Heydrich ble utnevnt til assisterende riksprotektor og i realiteten alenehersker, da han fikk alle de fullmaktene som Neurath hadde hatt. Under Heydrich ble statsminister Alois Eliáš arrestert og senere henrettet, det tsjekkiske styret ble omorganisert og alle tsjekkiske kulturinstitusjoner og -organisasjoner ble stengt. Gestapo gjennomførte omfattende arrestasjoner og henrettelser. Samtidig ble det organisert deportasjoner av jøder, og den tidligere festningsbyen Terezín ble omgjort til en ghetto for jødiske familier. 4. juni 1942 døde Heydrich etter de skadene han fikk under aksjonen mot ham fra den tsjekkiske motstandbevegelsen. Heydrichs etterfølger, generaloberst Kurt Daluege, beordret massearrestasjoner og henrettelser, samt fullstendig utslettelse av landsbyene Lidice og Ležáky.