Som i forgjengeren finner handlingen sted i slottet til Prinsesse Peach, og handlingen starter på nesten samme måte som i forgjengeren, ved at prinsessen inviterer Mario til sitt slott for å få en kake hun har bakt til ham. Forskjellen er at hun i har invitert ikke bare Mario, men også Yoshi, Wario og Luigi. Utseendessmessig er slottet likt det det var i , med tre etasjer, en vollgrav, en kjeller og en gårdsplass. Området utenfor slottet fungerer som en testplass som spilleren kan utforske og øve seg på spillfigurenes bevegelser. Hovedoppsettet er også det samme, ved at inngangene til forskjellige verdener og baner befinner seg innenfor slottet. Banene er fylt med fiendtlige skapninger som angriper spilleren, men det finnes også mer vennlige skapninger som kan tilby en hjelpende hånd. I hver av banene må spilleren samle kraftstjerner («Power Stars»). Hver av hovedbanene inneholder nå syv hovedstjerner (til forskjell fra forgjengeren hvor det var seks hovedstjerner). Mange av disse omfatter å nedkjempe ekstra sterke fiender, såkalte «bosser». Andre oppgaver kan være å løse gåter, kappløpe og å samle mynter. Hver av hovedbanene inneholder også en hemmelig stjerne som fås ved å samle 100 mynter i banen.