Mouskouri ble i 1950, som 16-åring antatt ved Hellenic Conservatory i Athen, med klassisk sang og opera som hovedretning. Hun kastet seg inn i studiene med både pågangsmot og entusiasme, og perfeksjonerte sin stemmebruk, samt tok klasser i piano og harmoni. Mouskouris venner var mer interesserte i jazz, og etter åtte år med intense studier og hard jobbing, klarte de å få henne med seg på å synge jazz på lokale nattklubber. Gruppen kom til og med på radio, men da Mouskouris professor og mentor ved konservatoriet oppdaget at hun «kastet bort tiden på slik verdiløs musikk», nektet han henne å ta eksamen. Hun ble utvist fra konservatoriet, og morens drøm falt i grus.