Han gjennomførte den første flyvningen fra nord til sør over Afrika. Det tok ham 77 dager. Mittelholzer begynte i Zürich 7. desember 1926 og fløy via Alexandria og landet i Cape Town 21. februar 1927. Tidligere hadde han vært den første til å foreta en rekognosering av Spitsbergen i et Junkers monoplan, i 1923. Den 15. desember 1929 ble han den første til å fly over Mt. Kilimanjaro, og han planla å fly over Mount Everest i 1930. I 1931 ble Mittelholzer utnevnt til teknisk direktør for det nye flyselskapet, Swissair, dannet av fusjon mellom av Ad Astra Aero og Balair. Hele sitt liv har han utgitt mange bøker om flyfotografering.