I 1525 begynte han å studere i Alcalá. Han levde av almisser, og virket som lærer og sjelesørger ved siden av studiene. Dette førte til at han ble mistenkt for heresi, ettersom han ikke var utdannet teolog. Han ble fengslet, og inkvisisjonen avhørte ham i 42 dager før de kom til at han var uskyldig og slapp ham fri. Ignatius reiste videre til Salamanca sammen med tre venner, og ble også der anklaget for heresi. Denne gang tok det tre uker før han ble erklært uskyldig.