Under sine studier ved Universitetet i München vinteren 1893–1894 ble Spemann nærmere kjent med August Pauly – et kjennskap av stor betydning for Spemann. Etter studiene var ferdig våren 1894, og frem til slutten av 1908, arbeidet han ved det zoologiske instituttet i Würzburg. Underveis tok han eksamen i zoologi, botanikk og fysikk for å supplere sine anatomiske studier. Han jobbet også under Theodor Boveri, Julius Sachs og Wilhelm Röntgen, som alle hadde stor innflytelse på hans vitenskapelige utvikling.