Tosca avbryter dem når hun kommer til kirken for å avtale et møte med Cavaradossi etter hennes opptreden om kvelden. Hun roper og Angelotti rekker å gjemme seg. Hun er imidlertid svært sjalu, og fatter mistanke, ettersom hun hørte Cavaradossi snakke med noen da hun kom, og hun kjente igjen portrettet av madonnaen. Hun mistenker ham for å ha en annen kvinne. Cavaradossi forsikrer henne om at det ikke er tilfelle, og til slutt forlater hun kirken.