X-35A fløy for første gang 24. oktober 2000 med testpilot Tom Morgenfeld bak spakene. Etter at testptogrammets 27 flyvninger var ferdig 20. november samme år, fløy det til Palmdale der ombyggingen til STOVL-versjonen startet umiddelbart. 12. mai 2001 var modifikasjonene utført, og flyet ble omdøpt til X-35B. Den første av totalt 39 flyvninger med B-versjonen ble gjennomført 24. juni 2001, og flyet hadde ved testprogrammets slutt tilsammen 48,9 flytimer. Det andre flyet, X-35C hadde sin jomfrutur 16. desember 2000, og gjennomførte totalt 73 testflyvninger.