Darnley var også i slekt med sin framtidige hustru på minst fire måter: de delte en bestemor i den engelske prinsessen Margaret Tudor (Maria Stuart nedstammet fra Margarets ekteskap med Jakob IV av Skottland, Darnley fra Margarets ekteskap med Archibald Douglas, 6. jarl av Angus), noe som plassert både Maria Stuart og Darnley høyt på listen av etterfølgere til den engelske trone; Darnley var en etterkommer av en datter av Jakob II av Skottland, og således sto han også i arverekkefølgen til den skotske tronen; begge var etterkommere av Joan Beaufort, skotsk dronning (Maria via Joans ekteskap med Jakob I av Skottland, Darnley gjennom hennes ekteskap med sir James Stewart, den svarte ridder av Lorn); og Darnleys familienavn Stuart (egentlig Stewart) var grunnet et langt mer fjernt slektskap med hans stamfar på farssiden, Alexander Stewart, 4. High Steward av Skottland.