Etter denne oppdagelsen blir Desmond dratt ut av Animusen fordi de blir angrepet av Tempelriddere, og Desmond bruker en effekt kalt "blødereffekten" (den gjør at alle evnene til Desmonds forfedre blir overført til ham, en bivirkning fra Animusen). De blir nødt til å flykte til et annet skjulested og dette skjulestedet viser seg å være i Monteriggioni, det samme stedet der villaen til Ezios onkel stod. Herfra hopper Desmond inn i Animusen igjen og fortsetter historien til Ezio, hvor han kjemper for rettferdighet og frihet fra familien Borgia, som har tatt makten i Roma. Hovedmålet til Ezio er Cesare Borgia, sønn av pave Alexander VI som er maktsyk og ønsker mer av Roma. Men Ezio kutter ned alle hans kontakter til han blir sittende igjen med ingenting. De avgjører alt med en sverdkamp på bymuren til Viana, Spania, hvor Cesare har beordret et angrep. Når Cesare ligger foran dødens dør, påstår han at intet menneske kan drepe ham. Ezio svarer med at han lar Cesare bli lagt i skjebnens hender, og kaster ham av muren. Etter at dette har hendt, drar Desmond og teamet hans avsted til Roma, for å finne eplet som Ezio gjemte. Desmond bruker "blødereffekten" igjen, og løser puslespillene som er satt opp på veien. Da teamet finner hvelvet, stanser tiden rundt Desmond, og han blir beordret av Juno, en kvinne fra den eldgamle sivilisasjonen, til å drepe Lucy. Han nekter, men er hjelpesløs når Juno tar kontroll over ham og tvinger ham. Når dåden er utført, faller begge to om. Desmond faller inn i koma.