Ved lav temperatur går reaksjonen sakte. Hastigheten på reaksjonen øker med temperaturen. Dette fordi molekylene som deltar i reaksjonen har større bevegelsesenergi ved høy temperatur, og dermed også større potensiell energi som kan bli brukt til å danne produktet. Den temperaturen som reaksjonen går fortest ved, kalles optimumstemperaturen. Et enzym virker optimalt ved en bestemt temperatur. Temperatur høyere enn optimumstemperaturen vil føre til denautering (ødeleggelse) av enzymet og følgelig at reaksjonen stopper opp. De fleste enzymene i menneskekroppen, har naturlig nok, en optimumstemperatur rundt 37 °C. Enzymer i vaskemidler virker best ved 30-50 °C. Ved temperatur over 60 °C denauteres enzymene og har da ingen virkning.