Quisling vokste opp i Fyresdal, Drammen og Skien, hvor han var elev ved Skiens Latinskole. I 1907 ble han student og begynte å studere medisin ved Universitetet i Kristiania. Han brukte 14 år før han fikk medisinsk embetseksamen med karakteren i 1921. Fra 1924 var han ansatt ved Ullevål sykehus, og fra 1932 privatpraktiserende lege i Oslo. Etter at hustruen døde av hjernesvulst i 1938 levde han et tilbaketrukket liv. Etter brorens avsettelse i 1945 ble han arrestert, men snart sluppet fri igjen.