Neste steg, kalt , er å overføre proteinene til en nitrocellulose- eller polyvinylidendifluoridmembran (PVDF) med hjelp av en elektrisk spenning. Når proteinene er blitt overført, blokkes membranen for å forhindre uspesifikk binding av antistoffene til membranens overflate. Vanlige blokkløsninger lages av bovint serumalbumin (BSA) eller fettfri tørrmelk. Etter blokkingen appliseres et spesifikt antistoff på membranen, hvis spesifisitet gjør at det binder til det proteinet som er av interesse. Deretter appliseres et som binder til det primære antistoffet. Det sekundære antistoffet er lenket til et enzym hvis katalytiske egenskap omdanner et substrat til et reaksjonsprodukt som kan detekteres, enten ved at man ser et fargeomslag på membranen, eller indirekte ved at man sender ut kjemiluminescent lys som kan fanges på lyssensitiv film, sees med CCD-kamera eller med en type phosphorimager.