I 1496 ble byen Nueva Isabela grunnlagt. Etter å ha blitt ødelagt av en orkan, ble den gjenoppbygd på motsatt side av Ozama-elven og kalt Santo Domingo. Det er den eldste permanente europeiske bosetningen i Amerika. Øya hadde en viktig rolle i etableringen av latinamerikanske kolonier i flere tiår framover. På grunn av sin strategiske beliggenhet var det den militære høyborgen til erobrere av det spanske imperiet, og fungerte som et hovedkvarter for den videre koloniale ekspansjonen til Amerika. Kolonien var et møtepunkt for europeiske oppdagere, soldater og nybyggere som brakte med seg kulturen, arkitekturen, lovene og tradisjonene i den gamle verden.