Hatshepsut var datter og eneste barn av Thutmose I og hans førstehustru Ahmose. Hennes ektemann Thutmose II var hennes halvbror som sønn av Thutmose I og hans annenhustru Mutnofret (som hadde tittelen «Kongens datter» og var således antagelig datter av Ahmose I). Hatshepsut og Thutmose II fikk en datter ved navn Neferure, men etter å ha født datteren, kunne ikke Hatshepsut lenger bære fram flere barn. Da han ikke kunne få en sønn med henne, sørget Thutmose II for å bli far til Thutmose III med en sekundær hustru, Iset.