I 1501 giftet hun seg med Philibert II, hertug av Savoia (1480–1504) som døde tre år senere. Dette ekteskapet var også barnløst. Hun ble utpekt for første gang som guvernør av det habsburgske Nederlandene (1507–1515) og ble formynder av sin unge nevø Karl, den framtidige Karl V av det tysk-romerske rike.