De nygifte kom godt overens til å begynne med, men gled etter hvert fra hverandre og bodde hver for seg, skjønt de behold en felles respekt. Hun viste en uavhengig holdning og vilje til utnytte den fraksjonsfylte skotske politikken både i konflikten med Jakob om omsorgen for prins Henry Frederick og om hans behandling av hennes venninne Beatrix Ruthven. Til hennes store sorg ble alle hennes barn tatt fra henne som spedbarn for å fostres av nære allierte etter gammel skotsk skikk. Det er mulig at hun på midten av 1590-årene konverterte til katolisismen, ektemannens religiøse tro, noe som gjorde henne upopulær i det presbyterianske Skottland; det skulle senere få samme effekt i det anglikanske England. I England skiftet Anna fokus fra fraksjonspolitikken til å bli opptatt av kunstartene og mens hennes ektemann foretrakk å gå på jakt utenfor London, konstruerte hun sitt eget storstilte hoff hvor hun var vertinne for en av de rikeste kulturelle salongene i Europa. Etter 1612 fikk hun stadig dårligere helse og trakk seg gradvis ut av hofflivet.