Etter at fredsprosessen kollapset og andre intifada brøt ut i år 2000, ledet Barghouti Fatahs militante fløy, Tanzim. Han ledet oppløp ved israelske kontrollposter og holdt taler med støtte til bruk av makt for å hive Israel ut av Vestbredden og Gaza. Til vestlige medier understreket han sin motstand mot angrep på sivile inne i Israel, «». Under intifadaen sprang en rekke mindre væpnede grupper fram, assosiert med Fatha og Tanzim. Av Israel ble Barghouti anklaget for å være grunnlegger og leder av al-Aqsa-martyrenes brigader som var knyttet til mange selvmordsangrep under intifadaen. Al-Aqsa-martyrene regnes som terrororganisasjon av USA, Canada og EU.