Mitsotakis er utdannet i USA. Han har bachelorgrad i samfunnsvitenskap Harvard University (1990), mastergrad i internasjonal politikk fra Stanford University (1993) og MBA-grad fra Harvard Business School (1995). Han har arbeidet i London for Chase Investment Bank (1990–1991) og McKinsey and Company (1995–1997). I Hellas har han også arbeidet i banksektoren og i en næringslivsorganisasjon.