Hans malerier kan tyde på at han kunne ha blitt en framstående kunstner. Hans far, derimot, så ham ikke som en fremtidig kunstner, og Louis selv viste en økende interesse for kjemi og andre naturvitenskapelige emner. Det høyeste ønske faren Pasteur hadde for sin sønn var at han skulle fullføre sin utdannelse på den lokale skolen og bli lærer i Arbois. Men rektoren der så at Louis kunne egne seg til vitenskapelig arbeid og overbeviste far og sønn til å begynne på École normale supérieure i Paris, et særlig fremstående universitet. Der ble Pasteur utdannet i fysikk og kjemi.