I 1562 ble han utsatt for en hodeskade da han falt ned en trapp. Han overlevde etter en trepanasjon av hodeskallen, gjennomført av den kjente anatomen Andreas Vesalius. Etter denne hendelsen, fikk Don Carlos en vanskelig adferd, hvor han blant annet begynte å mislike hertugen av Alba, som var kongens kommandant i Nederland, en stilling som var blitt lovet Don Carlos. Don Carlos skal da ha startet å konspirere med opprørere i Nederland. Han ble også fiendtlig innstilt overfor faren, og skal ha planlagt å ta livet av ham. Høsten 1567 var han i ferd med å flykte til Nederland, men planen ble avslørt av Don Juan de Austria.