Ved avbrudd etter oppskyting (TAL – Transatlantic Abort Landing) var tre nødlandingsbaner i Europa aktuelle: Zaragoza og Morón i Spania, og Istres i Frankrike. Oppskytingen fant sted 5. april 2010 klokken 06:21 lokal tid EDT eller UTC-4 (12:21 norsk tid). Astronautene Mastracchio og Anderson gjennomførte tre 6,5 timers romvandringer hvor de blant annet skiftet ut en ammoniakktank på romstasjonen. STS-131 var siste gang MLPM «Leonardo» ble bragt tilbake til Jorden. Landingen var planlagt klokken 08:35 lokal tid (14:35 norsk tid) 18. april på Kennedy Space Center, men ble utsatt til 20. april. Alternative landingssteder var Edwards Air Force Base og White Sands Space Harbor.