Gatúnsjøen og elven Chagres er hovedårene i kanalen og utgjør en betydelig del av strekningen. Gatúnsjøen fungerer som et vannreservoar som tillater slusene å operere selv i den tørre årstiden. Sjøen ble laget og elven gjort bredere og dypere under byggingen av Gatúndammen i elven Chagres. Det oversvømte den tidigere frodige dalen, og nå, nesten et århundre senere, finnes det fremdeles mahognytrær som stikker opp av vannet.