Etter at broren døde, rykket han opp i arverekkefølgen, og ble i 1586 regjerende . Samme år giftet han seg med sin kusine, Donna Maria d'Avalos, datter av markien av Pescara. To år senere startet hun og hertug Fabrizio Carafa av Andria en kjærlighetsaffære som de holdt gående i to år før Gesualdo begynte å ane hva som foregikk. En dag ga han beskjed om at han skulle ut på en flere dagers jakttur, men vendte tilbake samme kveld og tok kona og elskeren . Hva som så skjedde ble aldri fullstendig oppklart, men det regnes som ubestridt at han egenhendig drepte kona. Samme natt døde også elskeren hennes og et barn med uklart farskap, men rettsundersøkelsen klarte ikke å fastslå om det var han selv eller hans håndgangne menn som drepte dem. De mishandlede ofrene la han til alles påsyn foran palasset. Som høyadelig var Gesualdo fritatt fra rettsforfølgelse, men da han sto i fare for at ofrenes familier ville hevne udåden, flyktet han til familieslottet og holdt seg i ro der de neste fire årene.