Jernbanen som lå til grunn for byggingen av byen, er fremdeles en viktig del av samferdselen i Gaborone. Den går gjennom byen i nord–sør-retning. Det statseide jernbaneselskapet Botswana Railways driver en strekning fra Cape Town til Harare via Bulawayo. Stasjonen i Gaborone ligger sør for parlamentsbygningen i bysentret. Linja har holdeplasser i følgende byer i og nær Botswana: Ramatlabama på grensa til Sør-Afrika, Lobatse, Gaborone, Palapye, Serule, Francistown, Ramokgwebana og Plumtree på grensa til Zimbabwe. Siden 1. april 2009 har denne linja vært forbeholdt godstransport.