Siena sitt styre endte i 1559 da Karl V ga hele hertugdømmet til Cosimo I de' Medici, første storhertug av Toscana. I 1574 begynte byggingen av bymurer, og disse er fortsatt godt bevart. Den omliggende elvesletten ble drenert. Grosseto var likevel en liten by, og hadde bare 700 innbyggere på begynnelsen av 1700-tallet.