Zarlino var den første som definerte middeltone temperering på en presis måte: i (1558) beskriver han 2/7-komma middeltone. Han beskriver også en 1/4-komma og en 1/3-komma middeltone, og regner alle tre som brukbare. Disse stemmingene er forgjengerne til henholdsvis 50-, 31- og 19-toners temperert stemming. Videre var Zarlino var den første som forsto at det var bedre å basere harmonikken på treklangen framfor på intervallet. Han utviklet renstemming etter at han innså de pythagoreiske intervallenes begrensninger og i et ønske om å beholde så mye reinhet som mulig ved hjelp av et begrenset antall toner.