Byen Trujillo ble grunnlagt 6. desember 1534 av den spanske conquistadoren Diego de Almagro og døpt etter Francisco Pizarros fødeby Trujillo i regionen Extremadura i Spania. Den ble offisielt stiftet som by i den nyopprettede spanske kolonien den 5. mars 1535 av Francisco Pizarro. 23. november 1537 fikk Trujillo bystatus av spanskekongen Carlos I, og 7. desember samme år godkjente kongen byens våpenskjold og ga byen tittelen . Byen ligger på en fruktbar elveslette, og dyrking av sukkerrør og hvete, samt husdyrhold gjorde at Trujillo blomstret. I 1544 besto byen av 300 hus og omtrent 1 000 innbyggere.