Byen ble først grunnlagt av Cristóbal de Oñate i 1531, men måtte flyttes flere ganger på grunn av problemer med beliggenheten. Den 14. februar 1542 ga Karl V Guadalajara byprivilegier. I 1560 ble byen erklært hovedstad i den spanske kolonien Nueva Galicia, som var nokså uavhengig av Mexico by. I kolonitida var byen sentrum for et rikt jordbruksområde, og tjente som startsted for tallrike ekspedisjoner og erobringstokt til Nord-Mexico og Filippinene. Byen spilte også en viktig rolle tidlig i frigjøringskampen, da presten og uavhengighetsforkjemperen Miguel Hidalgo opererte fra byen. Også i Reformkrigen 1858–61 og i de meksikanske revolusjonskrigene ble det kjempet hardt rundt Guadalajara. I løpet av 1800-tallet gikk Guadalajara forbi Puebla som Mexicos nest største by på grunn av sterk industriutvikling. I 1992 førte en serie eksplosjoner i gassnettet til 205 døde, 500 sårede og 15 000 hjemløse.