I 2006 ble han igjen valgt til Italias statsminister med under 25 000 stemmers overvekt. 17. mai 2006 avløste han dermed statsminister Silvio Berlusconi. Manglende støtte fra livstids-senatorene førte til regjeringskrise i februar 2007, og Prodi leverte avskjedssøknad 22. februar. President Giorgio Napolitano aksepterte ikke anmodningen, og regjeringen fikk ny tillit fra senatet 28. februar med 162 mot 157 stemmer. Regjeringskrisen ble endelig avblåst 2. mars da deputertkammeret med 342 mot 253 stemmer godkjente regjeringen. I januar 2008 var det på ny regjeringskrise etter at det lille partiet Popolari UDEUR annonserte at partiet trakk sin støtte til regjeringen. Den 23. januar vant Prodi et tillitsvotum i deputertkammeret. Den 24. januar var det en tilsvarende avstemning i senatet, en avstemning regjeringen tapte.