En S.H.I.E.L.D.-forsker Dr. Curt Connors, injiserer seg selv med et av disse serumene for å bli Lizard. Han slår seg deretter sammen med Doctor Octopus og Electro, Rhino, Kraven the Hunter og Beetle som medlem av Sinister Six. I løpet av sesongen lærer Spider-Man mer om lagkameratenes opprinnelse: Ava Ayala har overtatt mantelen etter White Tiger etter at faren hennes Hector ble drept av Kraven.