I motsetning til lignende kunstmuseer på det europeiske fastlandet, ble ikke National Gallery opprettet for å nasjonalisere en eksisterende kunstsamling tilhørende de kongelige eller et fyrstehus. Det ble til da den britiske regjering kjøpte 38 malerier fra John Julius Angersteins arvinger i 1824. Angerstein var en forsikringsmegler og kunstmesén. Etter dette kjøpet ble museets samlinger formet hovedsakelig av dets første direktører, mest kjent er sir Charles Lock Eastlake, og av private donasjoner som til sammen utgjør to tredjedeler av dets samlinger. Den totale samlingens størrelse er liten sammenlignet med mange europeiske nasjonalgallerier, men den er encyklopedisk i sin utstrekning; de fleste betydelige utviklinger i vestens kunst «fra Giotto til Cézanne» er representert med viktige verker. Tidligere ble det sagt at dette nasjonalgalleriet var blant de få som hadde alle sine verker fast utstilt, men det er ikke lenger tilfelle.