Men deling av verden var ikke det største stridsemnet mellom de iberiske kongedømmene. Isabella I av Castilla og Ferdinand II av Aragón hadde flere døtre, men kun en mannlig arving, den svakelige Johan, prins av Asturias. Den eldste datteren, Isabella av Aragón, hadde vært trolovet til Afonso, prins av Portugal, siden barndommen. Afonso var Johans eneste sønn og høyt elsket av kongen. Om Ferdinand II døde uten en mannlig arving, noe som var sannsynlig, ville prins Afonso bli arving ikke bare av Portugals trone, men også de av kongedømmene Castilla og Aragón. Denne trusselen til uavhengigheten til Castilla og Aragón var reell, og de katolske monarker forsøkte alle diplomatiske triks for å få avviklet bryllupet mellom Isabella av Aragón og prinsen av Portugal. Først i 1491 ble det avklart da Afonso døde under mystiske omstendigheter etter å ha falt av hesten ved elven Tajo. Prinsen hadde vært en utmerket rytter, og samtidig flyktet hans kastiljanske kammertjener flyktet og ble aldri sett igjen. Om Isabella I og Ferdinand II var direkte involvert i prinsens død, ble det aldri bevist. Isabella av Aragón var ikke lenger bundet av å bli gift med Portugals prins og Castillas rival. Johan forsøkte uten suksess resten av livet å få sin sønn utenfor ekteskap, Jorge, hertug av Coimbra, anerkjent av paven. At dette ikke lyktes hadde blant sin årsak at dronning Leonora av Viseu hadde egen representasjon hos de katolske monarker og hos betydningsfulle adelsfamilier. Således kunne dronning Leonora hevne drapet på sin bror Diogo. Isteden ble det hennes bror Manuel I som ble Portugals konge etter Johan II.