Spillet baseres etter slutten på Assassin's Creed: Revelations hvor Desmond våkner opp etter å ha vært i koma. Han og teamet har funnet et "grand temple", et eldgammelt tempel bygget av Den Første Sivilisasjonen, som visstnok skal holde nøkkelen til verdens videre fremtid. De begir seg inn i en hule, som holder døren til templet skjult. Måten å åpne døren på er å sette Edens eple i nøkkelhullet. Når Desmond kommer inn i templet, finner han en slags kraftkilde, som han plugger inn og setter i gang alle systemene i templet. Men idet han står foran en annen dør, som trenger en annen nøkkel, blir alt rundt ham uklart. Han blir kontaktet av Juno, en av Den Første Sivilisasjonen, som gir ham beskjed om å finne nøkkelen. Faren hans prøver å få kontakt, men idet Desmond snur seg, ser han en mann som kaller ham "Sir". Detter skjer på grunn av blødereffekten, som har skjedd tidligere. Han blir plugget inn i Animusen, og gjenlever minnene til Haytham Kenway, en forfader fra 1700-tallets Amerika.