Pufendorf var sønn av presten Esaias Elias Pufendörfer og hustru Margarethe Hickmann. Han hadde flere brødre, deriblant filosofen Samuel. I årene 1639–45 gikk han på Fürstenschule Grimma, i 1648 ble han magister i Leipzig hvoretter han kom til Universitetet i Jena. Her ble han lærer for Otto Wilhelm von Königsmarck, sønn av den svenske hærfører Hans Christoph von Königsmarck (1600–1663).