Leroy Jethro Gibbs, spilt av Mark Harmon (sesong 1–19), er en spesialagent og leder for NCIS-laget. Han har en fortid som skarpskytter i USAs marine frem til 1991 da hans første kone Shannon og datter Kelly ble drept av en meksikansk narkolanger, etter at Shannon hadde vært vitne til et mord. Etter at Gibbs hadde tatt hevn over den som drepte sin kone og datter, sluttet Gibbs seg til NIS, senere omdøpt NCIS, med spesialagent Mike Franks som sin sjef. Han har vært gift fire ganger, men er for tiden singel, som ofte blir referert til på showet. Han har også et vanskelig forhold til sin far. Anthony «Tony» DiNozzo, spilt av Michael Weatherly (sesong 1–13), er en spesialagent og tidligere politibetjent fra Baltimore før han begynte hos NCIS i 2001. Gibbs anser DiNozzo å være en yngre versjon av seg selv. Han blir ansett som en kvinneelsker, med mye humor og artige påfunn. Ziva David, portrettert av Cote de Pablo (sesong 3–10), er kanskje det farligste medlemmet av gruppen. Hun ble i sesong 7 offisielt medlem av laget som spesialagent. Før den tid var hun med som en forbindelse mellom det Israelske Mossad og NCIS. Hun erstattet spesialagent Kate Todd, som ble skutt og drept av Zivas halvbror i finalen av sesong 2 «Twilight». Abigail «Abby» Sciuto, spilt av Pauley Perrette (sesong 1–15), er en etterforskningsspesialist som jobber med bevismateriale. Hun har en spesiell «goth»-stil med bruk av svarte klær og tatoveringer, og er avhengige av den fiktive merkevaren «Caf-Pow», en koffeinholdig drikk. Abbys karakter har oppnådd enorm popularitet nasjonalt og internasjonalt for den spesielle kombinasjonen av personalitet og utseende. Timothy McGee, spilt av Sean Murray (tilbakevendende seasong 1, hovedrolle sesong 2–), er en spesialagent. Han har en grad i dataetterforskning fra MIT, og fungerer sammen med Abby Sciuto som lagets teknologispesialister. McGee var opprinnelig tildelt til Norfolk Militærbase, men ble fast medarbeider i sesong 2 episode «See No Evil». Ofte kalt «Probie» av DiNozzo, til tross for at han ikke lenger er lagets nybegynner, samt andre slengord som «McGeek» og «McGoogle». Under pseudonyme Thom E. Gemcity forfattet han to bestselgende bøker ved hjelp av detaljer basert på medlemmene av gruppen, til stor irritasjon fra dem da dette ble kjent. Leon Vance, spilt av Rocky Carroll (sesong 6–), var tidligere assisterende direktør og høyre hånd til Jenny Shepard. Han ble direktør for NCIS når Jenny døde i siste episode av 5. sesong. Dr. Donald «Ducky» Mallard, spilt av David McCallum (sesong 1–20), er tidligere lege, sjefs obdusent, og psykolog. Han var nær venn med Jenny Shepard og er bestevenn med Gibbs. Jenny Shepard, spilt av Lauren Holly (sesong 3–5), var den andre direktøren for NCIS som er vist i serien. Hun har tidligere jobbet sammen med Gibbs i Europa, og var hans kjæreste på den tiden. Hun ble drept i «Judgment Day, Part 1» etter at et tidligere oppdrag viste seg å ha gått galt. Shepard fikk assistanse fra Mike Franks, Gibbs tidligere sjef, mot angrepet fra en hun skulle ha drept for flere år siden. Selv om hun sto imot døde hun av skadene. Caitlin «Kate» Todd, spilt av Sasha Alexander (sesong 1–2), jobbet tidligere som en Secret Service-agent før hun sluttet seg til NCIS i første episode av sesong 1. Gibbs ble en slags mentor for henne. Hennes to-årige karriere kom til en tragisk og brå slutt da siste episode av sesong 2, «Twilight», endte med at hun ble skutt i hodet av terroristen Ari Haswari (Ziva Davids halvbror). Hennes død traff NCIS-laget hardt, og Gibbs lot ingen røre hennes skrivebord eller garderobe ved NCIS. Jimmy Palmer, spilt av Brian Dietzen (tilbakevendende sesong 1–9, hovedrolle 10-), erstattet Gerald Jackson som assistent for Dr. Mallard.