Spillet foregår etter , og finner sted i The Mushroom World. Området blir invadert av Koopalings, Bowsers syv barn, og prinsesse Toadstool har blitt kidnappet av Koopa. Nå må Mario reise gjennom åtte nye verdener, hvor han møter nye fiender, gjenstander og egenskaper. Koopalingene erobrer alle kongedømmene ved å stjele kongens magiske tryllestav. Til slutt beseirer han Koopa og redder prinsesse Toadstool. I hvert slott er en Toad forskrekket fordi kongen har blitt transformert. Så Mario må fly opp på de flyvende skipene, og beseire Koopalingene. Da tar Mario tilbake de magiske stavene slik at kongene kan bli seg selv igjen, og hver gang får han et brev fra Toadstool om nye ting Mario nå kan gjøre.