Eleonora var den fjerde datteren til hertug Albrecht Friedrich av Preussen (1553–1618) og Marie Eleonore av Jülich-Kleve (1550–1608). Prinsessen vokste opp sammen med sine søstre i slottet i Königsberg. Den 2. november 1603 ble hun i Berlin viet til kurfyrste Joakim Frederik av Brandenburg som hans andre kone. Ekteskapet var politisk motivert. Etter i 1607 å ha født en datter, døde hun kort tid etter 23 år gammel. Hun ble begravet i Hohenzollernes gravkammer i Berliner Dom.