I Firenze gikk han i tjeneste som militær arkitekt og ingeniør hos Cesare Borgia, sønn av Rodrigo Borgia, senere kjent som pave Alexander VI. Det var også rundt denne tiden han begynte på Mona Lisa. I 1506 vendte han tilbake til Milano, som nå var i hendene på Maximilian Sforza, etter at leietropper hadde fordrevet franskmennene. Her møtte han også Francesco Melzi, som skulle bli en nær venn og Leonardos ledsager og arving.