Dette ble startskuddet til trippelalliansekrigen, den blodigste militære konflikt i Sør-Amerikas historie. I krigen sluttet Flores seg til alliansens side og deltok personlig i stridighetene. Han ledet alliansens styrker i slaget ved Jataí i 1865 der Paraguays avansement mot Montevideo ble stanset. Flores andre periode som president kom helt til å bli preget av krigen og et hardt og repressivt styre, noe som gjorde at misnøyen mot ham vokste i hans eget parti. Han gik frivillig av i 1868 ved ikke å stille opp til nyvalg.