Omkring 1554 inngikk Palestrina som sanger i pavens private ensemble i det sixtinske kapell. Dette ensemble nøt en høy status og det må anses som et viktig steg oppover i Palestrinas karriere, samtidig som det var en bekreftelse av at han hadde skapt seg et visst ry som musiker og tonesetter. Allerede i 1555 ble han imidlertid tvunget til å forlate denne stilling. Den da nytiltrådte pave Paul IV gjeninnførte nemlig en tidigere regel om att sangerne i ensemblet måtte være presteviede, noe som utelukket Palestrina (som var blitt gift i 1547 med Lucrezia Gori).