I Mosquito-bukta etablerte han en koloni ved navn Nombre de Dios, men det gikk like dårlig som med hans første ekspedisjon. Kolonien slet med matmangel, fiendtlige indianere og sykdommer. I 1510 ble han reddet av sin kompanjong Colmenares, som kom med forsyninger og flere menn. Med seg hadde Colmenares to menn fra en nyetablert koloni ved navn Santa María, som var blitt etablert i Darién av conquistadoren Balboa uten Nicuesas kjennskap. Mennene kom med tilbud om lojalitet fra kolonistene, men Nicuesa var ikke fornøyd med det, og forlot kolonien for å straffe kolonistene i Santa María og selv ta kontrollen. Utsendingene lyktes imidlertid med å komme Nicuesa i forkjøpet og advare Balboa, som dermed var forberedt på Nicuesas ankomst. Guvernøren ble nektet å gå i land, og hans menn fikk valget mellom å få komme i land og bli i kolonien eller å følge Nicuesa. De fleste valgte å gå i land og bli kolonister i Santa María, mens Nicuesa og 17 lojale menn ble sendt til havs igjen. Det antas at han forsøkte å nå Santo Domingo, men han kom aldri fram. Skipet forsvant, og ingen hørte noensinne mer til ham.