Kvinnen på bildet vises i halvfigur, med et fjernt landskap i bakgrunnen. På et tidspunkt etter Leonardos død ble bildet beskåret ved at et bord på hver side ble fjernet. Opprinnelig var Mona Lisa plassert mellom to søyler, som en kan se på tidlige kopier. Kanten av fundamentene er fortsatt synlig. Bildet er komponert over en pyramideform, der de foldede hendene danner det fremre hjørnet. Brystet, halsen og ansiktet gløder i det samme lyset som faller over hendene. Kvinnen i maleriet har ingen klare øyenbryn, dette forklares av forskere med at øyebryn på 1500-tallet ble sett på som skjemmende og stygt.