Nattfiol er knyttet til skog, lunder, eng, hei og beitemark og har ikke spesielle krav til næringsrik jord. Nattfiol vokser helt nord til Lebesby i Finnmark, og den går opp til 1300 meter over havet i Jotunheimen. Den er i rødlistevurderingen 2021 regnet som livskraftig (LC).