Den største rivalen var Spania som England var i konflikt med både i Europa og i det nyoppdagede Amerika. Konflikten eksploderte i Den engelsk-spanske krigen i årene 1585–1604. Et seriøst forsøk fra kong Filip II av Spania på å invadere England med Den spanske armada i 1588 ble slått tilbake i et berømt sjøslag. Krigslykken snudde for England i et katastrofalt lite heldig angrep på Spania med Drake-Norris-ekspedisjonen av 1589. Deretter støttet Spania militært de irske katolikker i en utmattende geriljakrig mot England og spanske marinestyrker og hærstyrker påførte England flere nederlag. Krigen hadde ødeleggende effekt på det engelske skattekammer og økonomien som hadde blitt forsiktig forbedret under dronning Elizabeths nøysomme ledelse. Engelsk kolonisering og handel ble lidende helt til signeringen av Londontraktaten av 1604 året etter Elizabeths død og som markerte avslutningen på den spansk-engelske krigen.