Det fantes ved denne tid frykt for at inkvisisjonen skulle innføres i Nederlandene fra Spania, oppmuntret av Filips religiøse intoleranse mot protestantene. I 1565 utferdiget Filip et påbud som syntes å bekrefte dette. Samme år utspilte bryllupet mellom Alexander Farnese og prinsesse Maria av Portugal seg ved Margaretas hoff i Brussel. Ved denne anledning var en stor del av adelen i Nederlandene til stede, og passet på å inngå en allianse som skulle motarbeide Filips påbud. Den 5. april 1565 måtte Margareta ta imot en delegasjon med klager over den religiøse undertrykkelse, og hun gav da et løfte om at det skulle opphøre, muligens fordi hun ikke hadde tilgang til noen tropper. I 1566 inntraff en bølge av ikonoklastiske oppløp over hele Nederlandene, og kirker og kloster ble ødelagt og plyndret.