De Niro vokste opp i Little Italy på Manhattan, hvor han bodde hos sin mor; foreldrene hans skilte seg to år etter han ble født da faren fortalte at han var homofil. Faren bodde i gangavstand og De Niro tilbrakte mye tid med han. Som ung ble han kalt «Bobby Milk» grunnet sin bleke hudfarge. I en alder av 16 år droppet han ut av high school for å satse fullt på en karriere innen skuespill. Han studerte skuespill på blant annet Lee Strasbergs Actors Studio, hvor blant andre James Dean, Al Pacino og Dustin Hoffman studerte.