Mellom 1669 og 1673 tjente han under kosakkhøvdingen hetman Petro Dorosjenko. Ved et tilfelle da han var som et sendebud til Konstantinopel, ble han tatt til fange av Moskvatrofaste zaporozjiekosakker og sendt til Moskva for å bli forhørt. Der ble han forhørt av Artamon Matvejev personlig, som fikk et godt inntrykk av den unge Masepa. Han ble sluppet fri og reiste tilbake til Ukraina. Under årene 1674-1681 tjente han hetman Ivan Samojlovitsj. Han steg hurtig i kosakkenes rangorden, og i 1682 ble han forfremmet til general jesaul.