I 1859 dro Hepburn til Japan som medisinsk misjonær. Etter ankomst til Nagasaki i oktober flyttet han ganske snart til den nylig åpnede traktathavn Kanagawa. Der åpnet han sin første klinikk i april 1861 ved Sokoji-tempelet. Først bodde han i Jobutsuji i Kanagawa, et forfallent tempel som tidligere huset det nederlandske konsulat. Hepburn ble så den første protestantiske misjonær i Yokohama. Han grunnla senere Hepburn-skolen, som utviklet seg senere til Meiji Gakuin University. Hepburns japanske studenter besto blant annet av Furuya Sakuzaemon, Takahashi Korekiyo og Numa Morikazu.