Genève utviklet seg på 1500-tallet til et sentrum for reformasjonen. Byen slo seg først sammen til et forbund med Bern og Fribourg på 1520-tallet. Kort tid etter kom Genève med i edsforbundet. Trebyalliansen kom først i stand for å få en felles front mot Savoia. I 1536 kom den franske reformatoren Jean Calvin til Genève. Genève utropte seg til republikk, men beholdt sine sterke bånd til edsforbundet. Calvin hadde brutt med den katolske kirke i 1532, men i ble i 1538 tvunget til å forlate byen. Calvin kom tilbake i 1541 og styrte Genève med det mål å skape en gudsstat i henhold til tanken om at velstand er Guds måte å belønne menneskelige dyder som flid og sparsommelighet. Calvins regime var strengt, og forbød blant annet sang og musikk, også orgelmusikk i kirken. I Calvins tid ble Genèveakademiet grunnlagt i 1559, og dette ble begynnelsen på det senere Universitetet i Genève.