Hun ble opprinnelig spilt av Arleen Sorkin i DC's Animated Universe. Siden den tid har hun dukket opp i mange andre DC-prosjekter og har blitt spilt av skuespillere som Tara Strong, Hynden Walch, Laura Bailey, Jenny Slate, Melissa Rauch, Laura Post, og Kaley Cuoco; sistnevnte ga karakterens stemme i den animerte Harley Quinn-serien fra 2019. Harley Quinn gjorde sin live-action film-debut i DC Extended Universe (DCEU) i filmen (2016), hvor hun er spilt av Margot Robbie. Robbie gjentok rollen i (2020) og (2021).