De første professorene, blant dem den romantiske rettsteoretikeren Carl von Savigny, var sentrale i å forme det nye universitetet i tråd med Humboldts ideer. Blant universitetets første rektorer er noen av filosofiens største navn på 1800-tallet, herunder Johann Gottlieb Fichte, Friedrich Schleiermacher og Georg Wilhelm Friedrich Hegel. Ved siden av de tradisjonelle disiplinene, teologi, rettsvitenskap, medisin, filosofi, filologi, historie og arkeologi, utviklet Universitetet i Berlin seg til et arnested for mange nye naturvitenskapelige fag. Dette skyldtes ikke minst innflytelsen til Wilhelm von Humboldts bror, naturforskeren Alexander von Humboldt. På 1800-tallet og første del av 1900-tallet var universitetet det fremste i verden innen naturvitenskap og medisin, men det var også blant verdens ledende universiteter innen mange humanistiske fag som filosofi, historie og arkeologi.