Serien handler om spesialagentene Fox Mulder (David Duchovny) og Dana Scully (Gillian Anderson) hos FBI som etterforsker X-filene, uløste saker som ofte handler om paranormale fenomener. En episode forklarte at disse sakene fikk dette navnet på grunn av at det ikke var mer plass under «U» i filkabinettet for uløste saker. Mulder er den som tror på utenomjordisk liv mens Scully er skeptikeren som ble gitt i oppdrag å jobbe med Mulder og analysere validiteten i hans arbeid i et forsøk på å nedlegge prosjektet av hennes overordnede. I løpet av serien blir de involvert i en større mytologi og de utvikler et nært og tvetydig vennskap som såkalte shippere så på som mer enn platonisk. har også flere episoder som ikke er en del av denne overhengende historien og de kan være en del av alt fra skrekksjangeren til komedie. I disse episodene etterforsker Mulder og Scully underlige og overnaturlige saker som ikke har noen innvirkning i andre episoder. Flertallet av episodene er av denne typen.