Da Johannitterordenen ble reetablert som Malteserordenen i 1530 førte deres angrep mot muslimske sjøstyrker raskt til at de kom i konflikt med den osmanske marine, som samlet en veldig styrke for å fjerne ridderne fra Malta. I 1565 invaderte de og innledet den store beleiringen av Malta som begynte 18. mai og varte til 8. september (og som er skildret i Matteo Perez d'Aleccios fresker i Hall of St. Michael and St. George). Til å begynne med så slaget ut til å bli en gjentagelse av det på Rhodos hvor nesten alle byene ble ødelagt og rundt halvparten av ridderne ble drept i kamp, men en unnsetningsstyrke fra Spania snudde slaget og rundt 30 000 osmanske soldater ble drept.