Glykolysen reguleres ved å stimulere eller hemme enzymene til de ulike trinnene i stoffskifteveien, som resulterer i at reaksjonshastigheten henholdsvis øker og avtar. Om et trinn er regulert, kjennes det gjerne igjen på en endring i fri energi, , for hvert reaksjonstrinn. Dersom produktene og reaktantene til et trinn står i likevekt, antas det at det ikke er regulert. Siden forandringen i fri energi er null for et system i likevekt, . Dersom et reaksjonstrinn regulert, så vil enzymet som katalyserer reaksjonen ikke omdanne reaktanter til produkter så raskt som det kan, noe som gir en opphopning av reaktanter som kunne bli omgjort til produkt om enzymet jobbet raskere. Ettersom reaksjonen er termodynamisk gunstig, vil trinnets forandring i fri energi være negativ. .