Hugo Theorell ble født i Linköping som sønn til militærlegen Thure Theorell og Armida Bill. Han studerte ved Katedralskolen i Linköping, og ble senere student ved Karolinska Institutet. Han var en av Gösta Mittag-Lefflers studenter, og dette ga ham muligheten til å studere ved Institut Pasteur i Paris samt hos Walther Nernst i Berlin. Disse studieoppholdene skaffet ham nye, gode kontakter. Han tok doktorgrad i fysiologisk kjemi ved Karolinska institutet i 1930, med en avhandlinger om lipoidene i blodet. I en periode jobbet han som Rockefellerstipendiat for Otto Heinrich Warburg.