Reformasjonen kom til Jena i 1523 med den radikale teologen Martin Reinhardt som ble fordrevet etter Martin Luthers inngripen 1524. 1525 ødela bønder og deler av byens befolkning karmelittklostret og dominikanerklostret. Etter nederlaget i den schmalkaldiske krig 1546–1547 tapte ernestinerne kurfyrsteverdigheten og Jena tilhørte igjen hertugdømmet Sachsen. En følge av dette ble at man grunnla en høyere skole i dominikanerklostret som erstatning for universitetet i Wittenberg som var en forgjenger til dagens universitet, Friedrich-Schiller-Universität Jena, som ble grunnlagt 1558.