Knüpfer var sønn av Thomas Knüpfer, kantor og organist i Aš. Den første utdanningen fikk Sebastian av sin far og allerede som tiåring utførte han organisttjenester i hjembyen. Fra 1646 til 1654 gikk han på gymnaset i Regensburg. Senere flyttet han til Leipzig hvor han studerte filosofi, blant annet under Johann Adam Scherzer. I 1657 ble han Tobias Michaels etterfølger som thomaskantor ved Thomasskolen i Leipzig. Rundt Knüpfer dannet det seg en krets av høyt ansette musikere som gjorde Leipzig til et betydelig musikksenter, blant dem var kantor i Nikolaikirche, Elias Nathusius, organistene i Thomaskirche, Gerhard Preisensin og Jacob Weckmann, samt legen Johann Kaspar Horn.