I 1856 dro Burton og Speke tilbake til Øst-Afrika, for å finne de store sjøene som det gikk rykter om skulle finnes i hjertet av kontinentet. De håpet også å finne Nilens kilder. Det ble en svært krevende tur, begge ble rammet av tropiske sykdommer og Speke ble for en tid blind og døv (det siste etter å ha måttet fjerne med kniv en bille som krøp inn i øret). De var de første europeere som så Tanganyikasjøen. De hørte der om en stor sjø i nord. Burton var for syk til å fortsette, men Speke dro alene nordover og fant Victoriasjøen. Den viste seg senere å være en av Nilens hovedkilder, men Speke hadde mistet mye av utstyret og kunne ikke utforske den.