Etter sin svigermor Isabella I av Castillas død i 1504 tok han i juli 1506 tittelen konge av Castilla - tvert i mot sin svigermors uttrykkelige ønske at Johanna skulle arve tronen. På denne måte gjorde han seg til uvenn med sin svigerfar, Ferdinand II av Aragon som ville ta denne tittel fra sin sinnssyke datter.