Han fremsatte tanken om sterile operasjoner mens han arbeidet ved Glasgow Royal Infirmary, da han oppdaget at karbolsyre påvirker bakteriene. Ved å rense sår og å legge på desinfiserte bandasjer, klarte han å unngå infeksjoner hos flere pasienter. Lister innførte med suksess anvendelsen av , en 2% oppløsning av karbol i vann (karbol er senere blitt kalt fenol), ved sterilisering av operasjonsudstyr og til rensing av sår, som tidligere hadde medført infeksjoner i forbindelse med operasjoner. Dessuten konstruerte han et apparat som kunne spraye karbolvann ut i luften i operasjonsstuen. Dette nedbragte forekomsten af bakterier sterkt, men kunne lett gi anledning til forgiftninger hos både pasient og operasjonspersonale. Til tross for denne risiko gjorde antiseptikken kirurgien mer sikker for patientene.