Før ELISA fantes metoden radioimmunologisk analyse (RIA), som første gang ble beskrevet i 1960, og som utnyttet radioaktivitet for merking og detektering av reaksjonsmaterialet. RIA ble utviklet til en svært anvendbar og følsomt metode, men en av fordelene med ELISA fremfor RIA var at man slipper å arbeide med radioaktive stoffer, ved å istedet utnytte enzymer for merking. At det skulle være mulig å merke antistoffer med enzymer, som er relativt store molekyler, uten at deres egenskaper ble merkbart endret, var først ikke åpenbart. Flere forskergrupper arbeidet imidlertid med dette på slutten av 1960-årene, og forskerne bak ELISA og EIA bygde videre på deres resultater.