Abbott er mest kjent for å ha opptrådt som Lou Costellos straight man i komikerparet Abbott og Costello i perioden 1931–1957. I begynnelsen ble inntektene delt mellom dem 60 %–40 %, siden den som spilte straight man ble ansett til å være det mest verdifulle medlemmet i teamet. Dette ble etterhvert endret til 50 %–50 %, men etter et år i Hollywood forlangte Costello 60 %–40 %-splitt i hans favør, noe som varte til partnerskapet var over. Costello forlangte også at navnet skulle endres til Costello og Abbott, men Universal nektet. Parets popularitet dalte på 1950-tallet og i 1957 gikk de hver til sitt. De hadde avsluttet samarbeidet en gang tidligere, i 1945, da Abbott hadde ansatt en hushjelp Costello hadde sparket. «» Imidlertid risikerte begge to et heftig søksmål fra Universal, så de startet opp igjen. Costello døde av hjerteinfarkt i 1959.