Francesco II Sforza døde i 1535 uten arvinger fra Huset Sforza til hertugdømmet, og arvespørsmålet ble igjen komplisert. Både den tysk-romerske keiseren og den franske kongen gjorde krav på hertugdømmet. I 1545 ble Hertugdømmet Parma opprettet ved at den delen av Hertugdømmet Milano som lå sør for Po, sentrert rundt byen Parma, ble gitt i len til pave Paul IIIs illegitime sønn, Pier Luigi Farnese. Den tysk-romerske keiseren holdt kontrollen over resten av hertugdømmet, og ga det til sin sønn Filip og kom dermed under Spania, noe som ble formalisert ved freden i Cateau-Cambrésis i 1559 som avsluttet de italienske kriger.