Da Maria var blitt enke, vendte hun tilbake til Skottland og kom til Leith den 19. august 1561. Fire år senere giftet hun seg med sin fetter, Henry Stuart, Lord Darnley. Ekteskapet var ikke lykkelig, men de fikk et barn sammen: Sønnen Jakob. I februar 1567 ble Darnley funnet død i hagen ved Kirk o'Field, etter en stor eksplosjon i huset.