Niels Palladius var yngre bror til Peder Palladius, som ble den første lutherske biskop (superintendent) på Sjælland. Niels utdannet seg, likesom broren, først i Odense og senere i Wittenberg. Der studerte han for blant andre Martin Luther og Philipp Melanchthon, som satte et tydelig preg på ham, og han fikk i 1540 den akademiske tittelen magister. Han giftet seg i 1541 og vendte tilbake til klosteret i Maribo i 1544. Han trivdes dårlig med å være prest for de gjenstridige nonnene og vendte i stedet snart tilbake til Wittenberg.