Twombly studerte ved School of the Museum of Fine Arts i Boston i 1948–1949. I 1952 mottok Twombly et stipend fra Virginia Museum of Fine Arts, og dette gjorde det mulig ham til å reise til Nord-Afrika, Spania, Italia og Frankrike for å studere kunst. Mellom 1954 og 1956 underviste han ved Southern Seminary og Junior College i Buena Vista, Virginia.