Byggingen ble tidligst påbegynt sommeren 1524, og det hersker temmelig stor enighet om at slottet stod ferdig i 1532. Det fungerte som den katolske kirkens siste skanse i Norge før erkebiskopen ble tvunget i landflyktighet ved reformasjonen i 1537. I perioden 1532–1556 bodde også lensherren fast på Steinvikholm, og Trondhjems len bar da navnet Steinvikholm len. I 1542 ble slottet rammet av en brann, og det ble foretatt en del ombygginger. Under den nordiske syvårskrigen ble Steinvikholm beleiret og etter hvert oppgitt uten kamp. Lensherren hadde Steinvikholm som representasjonsbolig frem til 1575, da aktiviteten på slottet tilsynelatende opphørte for godt.