Et år senere den 29. juni 1475 ble hennes søster Beatrice d'Este født, og i 1476 og 1477 to brødre, Alfonso og Ippolito. I 1479 og 1480 ble ytterligere to brødre født, Ferrante og Sigismondo. Av alle barna ble Isabella betraktet som yndlingsbarnet. I 1479, et år etter Ferrantes fødsel, reiste barna til Napoli sammen med sin mor. Da hennes mor reiste tilbake til Ferrara fulgte Isabella med henne, mens de andre barna ble igjen hos deres bestefar i de neste åtte årene. Det var i løpet av reisene med sin mor at Isabella ble bevandret i diplomatiet og statsmannskunst.