L-1649A-prototypen fløy første gang 11. oktober 1956. (Prototyp [N1649] forble hos Lockheed til tidlig 1970-tallet, da den ble solgt til Japan.) Som rutefly begynte de sin karriere 1. juni 1957 med en TWA-rute fra New York til London og Frankfurt. TWA kalte sine L-1649 «Jetstreams» og brukte dem på lange innenriksruter, og fra New York til Europa og videre mot Østen. I juli 1958 hadde TWA 60 flyvninger i uken fra Europa til New York, 30 med L-1649, inklusive syv nonstop i uken fra Paris, fem fra London, fire fra Frankfurt, to hver fra Madrid, Lisboa og Genève, en fra Zürich og en fra Roma. Tre L-1649 i uken fløy Polarruten fra Europa til California, enkelte nonstop.