Perugino ble gjort til prior av Perugia i 1501. Ved en anledning anklaget Michelangelo ham for å være en kunsttyv (): Vannucci, som 1501 hadde blitt valgt for dommer, forsøkte å stille Michelangelo for domstolen for ærekrenkelse, men lyktes ikke. Perugino framstilte mesterstykket «Madonna og helgenene» for klosteret Certosa di Pavia, i dag tatt fra hverandre og spredt i ulike deler blant ulike museer. Den eneste delen i Certosa i dag er «Gud faderen med kjeruber». En «Bebudelse» har også forsvunnet; en altertavle med tre paneler, bestående av Jomfruen med Jesubarnet, erkeenglene Mikael og Rafael, og Tobias, er blant verkene i det britiske Nasjonalgalleri i London. Det ble etterfulgt i 1504-1507 av Annunziata-altertavlen for høyalteret i Basilica dell'Annunziata i Firenze. Det var en malerisyklus som ble startet av Filippino Lippi og fullført av Perugino. Også dette verket er i dag spredt i ulike deler mellom forskjellige museer i Italia, Tyskland, USA og i en privat samler i Sør-Afrika. Til tross for det omfattende konseptet var verket som helhet mislykket og ble anklaget for å mangle innovasjon. Perugino mistet studenter og mot 1506 forlot han Firenze for siste gang og dro til Perugia, og derfra oppholdt han seg i Roma et år eller to.