Det ble grunnlagt som i 1777 med fire fakulteter: teologi, jus, medisin og (historisk-filosofisk). I 1784 tildelte keiser Josef II universitetet retten til å tildele lisensiat- og doktorgrader, som var anerkjent i hele det tysk-romerske rike. Universitetet ble stengt under den franske okkupasjonen i 1798. Først den 18. oktober 1818 ble det åpnet igjen, denne gangen under dagens navn til ære for kong Fredrik Wilhelm III av Preussen som det tredje prøyssiske universitetet etter Humboldt-universitetet i Berlin og universitetet i Breslau.