Molekylene i en gitt prøve er ionisert, og det første spektrometeret (betegnet ) skiller disse ionene ved deres masse-til-ladningsforhold (ofte gitt som m/z eller m/Q). Ioner med et bestemt m/z-forhold som kommer fra MS1 blir valgt og deretter laget for å splitte i mindre fragmentioner, f.eks. ved kollisjonsindusert dissosiasjon, ion-molekylreaksjon eller fotodissosiasjon. Disse fragmentene blir deretter introdusert i det andre massespektrometeret (), som igjen skiller fragmentene med deres m/z-forhold og oppdager dem. Fragmenteringstrinnet gjør det mulig å identifisere og skille ioner som har veldig like m/z-forhold i vanlige massespektrometre.