I 1529 ble han borgermester i København, til tross for kong Frederik Is viten om hans glødende interesser. Samme år begynte Hans Tausen sin virksomhet i byen. Under de stridigheter som oppsto med den katolske kirke sto Ambrosius Bokbinder i spissen for en borgerskare som 3. juledag 1530 trengte inn i Vor Frue kirke mitt under messen, og vandaliserte kirkerommet ved å ødelegge billeder og annet inventar som bød reformasjonen imot, samt utskjelle de katolske prestene. Kirken ble lukket for begge parter, og da Christian II gjorde landgang i Norge, og situasjonen var blitt faretruende for rikenes sikkerhet, ble Ambrosius og hans tilhengere fjernet fra rådet.