Mitsotakis kommer fra et av de politiske dynastiene i Hellas. Han er sønn av Konstantinos Mitsotakis, som var statsminister fra 1990 til 1993. Oldemoren hans var søster av Eleftherios Venizelos, som var statsminister i åtte perioder mellom 1910 og 1933, og som hadde en sønn, Sofoklis Venizelos, som var statsminister tre ganger. Mitsotakis har en søster Dora Bakoyannis, som har vært utenriksminister og ordfører i Athen. Hennes sønn Kostas Bakoyannis ble i 2019 selv ordfører i Athen.