Tjue år gammel dro han til Roma og fortsatte utdannelsen, blant annet ved å kopiere Raphael, som også var fra Urbino. Han malte helst religiøse motiver, og allerede som ung fikk han en viss berømmelse gjennom å male store altertavler. Han fikk derfor i oppdrag å utsmykke takfresken i pave Pius IVs i Vatikanhagene i Roma (). Det skulle bli hans mest kjente verk. Mens han holdt på med det, fikk han en matforgiftning som holdt på å ta livet av ham. Han returnerte derfor til Urbino i 1563 og ble værende der resten av livet, merket av forgiftningen, noe som gjorde at han bare kunne male få timer daglig.