På sine ornitologiske ekskursjoner til Stillehavet og Ny-Guinea mellom 1928 og 1930 begynte Mayr å reflektere over artsdannelse og artsbegrepet. Hva en art er, hadde man tidligere ikke hatt noen klare forestillinger om. Darwin hadde unngått dette spørsmålet nesten fullstendig (han så på dem som nokså vilkårlig definerbare enheter), og heller ikke i årtiene som fulgte hadde artsproblemet fått noen særlig oppmerksomhet, for ikke å snakke om noen tilfredsstillende løsning. På 1940-tallet kom Mayr, i samarbeid med Theodosius Dobzhansky og andre genetikere, til å formulere sin forestilling om hva slags enhet en art er: en gruppe av naturlige populasjoner som forplanter seg med hverandre, og som forplantningsmessig er isolert fra andre slike grupper. Denne definisjonen er i dag kjent som det biologiske artsbegrepet. Mange andre definisjoner har sett dagens lys i etterkant, men disse er enten variasjoner over Mayrs definisjon eller definerer artsgrenser basert på større eller mindre grad av skjønn. Sånn sett kan Mayr sies å ha vært opphavsmannen til erkjennelsen av at arter er objektive, dvs. reelt eksisterende enheter i naturen.