Etter Gianfrancescos død styrte Isabella Mantova som regent for sin sønn Federico. Hun fortsatte å spille en økende betydningsfull rolle i italiensk politikk, og økte stadig Mantovas posisjon. Hun var sterkt medvirkende i å opphøye Mantova til et hertugdømme som ble oppnådde ved behendig diplomatisk bruk av hennes sønn ekteskapskontrakt. Hun oppnådde også å skaffe sin andre sønn en posisjon som kardinal. Hun viste en politisk skarpsindighet i sine forhandlinger med César de Borja som hadde fordrevet Guidobaldo da Montefeltro, hertug av Urbino, ektefelle av hennes svigerinne og god venninne Elisabetta Gonzaga i 1502.