Som troende katolikk ble Maria mistenkeliggjort av mange av hennes undersåtter, og ikke minst av hennes fars kusine, Elisabeth I, monarken i det protestantiske nabolandet. Skottland var revet mellom katolske og protestantiske fraksjoner, og Marias illegitime halvbror James Stewart, 1. jarl av Moray, var lederen av den protestantiske fraksjonen. Den protestantiske religiøse lederen var John Knox som nådeløst prekte mot sin dronning, fordømte henne for å høre messe, for at hun danset, for at hun kledde seg kunstferdig, for å være en kvinne, og av mange andre reelle og oppdiktede forseelser.