Eugène Tisserant kom fra en slekt med veterinærer; faren var dertil kirkevert. Han ble utdannet ved bispedømmet Nancys seminar, ved Det katolske institutt i Paris og ved Det pavelige bibelinstitutt i Jerusalem. Han begynte da å lære seg en rekke faglig relevante språk, og med årene behersket han amharisk, arabisk, akkadisk, engelsk, fransk, gresk, hebraisk, italiensk, latinsk, persisk, russisk, assyrisk og tysk.