Det første steget ved en WB-analyse er å frembringe proteininnholdet fra de celler eller vev som skal studeres. For å kunne separere proteinene fra cellenes andre bestanddeler må man første behandle celler og vev slik at de kan analyseres. Vevprøver kan nedbrytes i en homogenisator eller med ultrasonikering. Celler kan behandles på samme måte som vev, eller . Lysering av celler skjer ved at cellemembranen løses opp med en detergent. Lysatet man har utvunnet sentrifugeres for å separere proteinene fra lipider, cellekjerner og andre cellestrukturer.