Standardbevæpningen på Mk.I-modellen var 8 .303 Browning maskingevær. Under slaget om Storbritannia ble No. 19 Squadron som et forsøk utstyrt med Spitfire Mk.IB, hvor fire av maskingeværene var erstattet med to eksperimentelle 20 mm maskinkanoner. Den opprinnelige varianten med åtte mitraljøser fikk etter dette betegnelsen Mk.IA. Kanonen hadde stor slagkraft, men ammunisjonen hadde en tendens til å kile seg fast. På tross av dette ble 92 Squadron også utstyrt med den nye Mk.IB. Den første Mk.IB var en ombygget standard Mk.I og ble første gang testet i februar 1940. Ved en tilfeldighet skjøt en slik testmaskin ned en tysk Dornier Do 17 allerede i mars 1940. Mk.IB ble forløperen til de senere variantene med to maskinkanoner og fire mitraljøser (se Mk Vb og c).