Da hans teser av 31. oktober 1517 ble kjent i universitetskretsene fikk de, og senere reformasjonen, rask spredning ikke minst fordi studentmassen kom fra hele det nordlige Tyskland. Wittenberg var en av de første byer som sluttet seg til den lutherske reformasjon. Så tidlig som den 25. oktober 1521 avskaffet augustiner-eremittene, den munkeorden Luther tilhørte, privatmesser. Fra nyttår 1522 feiret man gudstjenesten etter Luthers ordning i bykirken, og utdelte nattverden under begge skikkelser. I 1523 ble Johannes Bugenhagen den første lutherske sokneprest i Wittenberg. Under Luthers opphold på Wartburg instigerte hans mangeårige medarbeider Karlstadt en radikal billedstorm. Men Luther hastet tilbake til byen og gjenopprettet orden.