I 1348 ble Karlsuniversitetet grunnlagt av Karl IV. Siden slutten av 1300-tallet har hovedsetet vært i Karolinum som ligger i gamlebyen i Praha. I 1357 begynte Karl IV å bygge en ny bro over Vltava som forbinder gamlebyen med Malá Strana. I 1391 ble Bethlehemkapellet bygget i gamlebyen for prekener på tsjekkisk. Kapellet spilte en viktig rolle i den böhmiske reformasjonen og husittbevegelsen. I 1402–1413 forkynte kirkereformatoren Jan Hus der.