Anfinsen ble født i Monessen i Pennsylvania, hvor han vokste opp i en familie av innvandrere fra Bergen, Norge, der foreldrene kom fra. I 1937 oppnådde han bachelorgrad ved Swarthmore College, mastergrad i organisk kjemi ved University of Pennsylvania i 1939, og ble kreert Ph.D. i 1939 ved Harvard University. Han ble valgt inn i National Academy of Sciences i 1963.