Det deltok 24 mannlige collegestudenter i eksperimentet. Disse var blitt valgt på grunnlag av en personlighetsundersøkelse som kartla dem som de 24 mest mentalt stabile individene av den opprinnelige gruppen på 72 som ønsket å delta. På denne måten sikret man at deltakerne var normale, fungerende, mennesker. Disse ble ved tilfeldig utvelgelse satt til å spille rollene som enten fange eller fangevokter. Eksperimentlederne ga fangevokterne instrukser om å «holde orden på fangene» og presiserte at fysisk vold ikke var tillatt, men utover dette ble det ikke gitt nøyaktige instrukser til deltakerne. Fangene satt innesperret 24 timer i døgnet, mens fangevokterne jobbet daglige 8-timers skift. For å gjøre det enklere å gå inn i de ulike rollene fikk gruppene utdelt uniformer. Fangevokterne fikk militærliknende uniform og solbriller, mens fangene ble tildelt ukomfortable antrekk som var ment å være ydmykende. Philip Zimbardo, en av eksperimentlederne, spilte også rollen som fengselsbestyrer i forsøket.