Med Louis Pasteur som forbilde gikk Jacobsen inn for å brygge øl på vitenskapelig grunnlag, og i 1875 grunnla han og satte på denne måten preg på utviklingen av moderne ølfremstilling. Lagringen var viktig og skulle foregå ved jevn temperatur i mørke. Jacobsen søkte derfor militæret om tillatelse til å benytte de forlatte gamle kruttkamrene i Københavns voller. Det ble en suksess, ettersom folk ellers måtte ta til takke med øl av ujevn kvalitet. Jacobsen så seg nå om etter et sted med rent vann, og det fant han i kildevannet fra Valby bakke. Jernbanen hadde nettopp gravd seg gjennom bakkens sydlige del, noe som ga gode transportmuligheter. Jacobsen oppkalte sitt bryggeri etter sønnen Carl - i farten ble Valby bakke til et berg, derav navnet Carlsberg.