Da den konservative senatoren og demokraten John C. Stennis trakk seg fra Kongressen i 1988, stilte Lott som kandidat. Lott ble valgt inn i Senatet i 1989 og sist gjenvalgt i 2006. Han var majoritetsleder i Senatet fra 1996 til 6. juni 2001, avbrutt i en kort periode i januar 2001, hvor han var minoritetsleder. Etter at senatoren Jim Jeffords forlot Det republikanske partiet og ble uavhengig i juni 2001, ble han minoritetsleder, noe han var fram til han trakk seg i desember 2002. I 2007 ble han igjen valgt inn i Senatets ledelse, som minoritetspartiets innpisker.