Hun var seks dager gammel da faren døde, og ble da umiddelbart Skottlands dronning. Moren, Maria av Guise, overtok regentskapet, og datteren ble kronet ni måneder senere. I 1558 ble Maria gift med François, (tronarving) av Frankrike. Han overtok tronen som François II (Frans II av Frankrike) i 1559. Imidlertid var Maria ikke dronning av Frankrike lenge; hun ble enke knapt året etter den 5. desember 1560. Som det første medlemmet av Huset Stuart, tok Maria i bruk den franske stavemåte «Stuart» (tidligere skrevet Stewart), en praksis som siden festet seg.