Den 8. februar 1601 sluttet Tresham seg til jarlen av Essex' åpne opprør mot styresmaktene. Essex hadde sikring av egne ambisjoner som mål, men jesuitten Henry Garnet omtalte de unge mennene som hadde sluttet seg til ham, som mest av alt opptatt av fremmingen av den katolske sak. Fanget og innesperret anket Tresham til Katherine Howard, men anken ble avvist. Treshams søster, Lady Mountegle, varslet sin fetter John Throckmorton, som vendte seg til «tre høyst beærede prester og et helt spesielt virkemiddel» for hjelp. Identiteten til disse personene er ikke kjent, men Tresham ble lovet sin frihet på den betingelse at hans far i løpet av de neste tre månedene betalte £2 100 til William Ayloffe. Han ble løslatt 21. juni, men var ikke avskrekket fra å involvere seg i nye konspirasjoner; i 1602 og 1603 var han involvert i oppdrag til det katolske Spania, gjennomført av Thomas Wintour, Anthony Dutton (muligens et alias for Christopher Wright) og Guy Fawkes, senere omtalt av engelske styresmakter som «Spanish Treason» (). Da Jakob I tiltrådte den engelske tronen, fortalte han imidlertid til Thomas Wintour, som var sekretær til Treshams svoger, William Parker, 4. baron av Monteagle, at han ville «støtte kongen til det fulle» og at han «ikke ville høre snakk om Spania».