Den 28. januar 1516 døde Ferdinand, og etterlot seg Cisneros som regent av Kastilla for Karl (senere Karl V), da en yngling på seksten år i Nederlandene. Selv om Cisneros med en gang tok et fast grep om tøylene av regjeringen, och styrte på en besluttsom og til og med eneveldig måte, ble Cisneros' posisjon sterkt skadet av den turbulente kastiljanske adelen og av intrigene hos Karl Vs flamlendske rådgivere. I strid mot loven sluttet seg Cisneros seg til Karls ønske om å utropes til konge; han beskyttet Karls yngre bror Ferdinand I; han plasserte hoffet i Madrid, og han etablerte en stående armé ved å øve borgerne i byene.