Selv om Vicentino skrev to bøker med madrigaler og motetter i en sofistikert harmonisk stil, fikk han størst betydning som musikkteoretiker. I hovedverket (Roma 1555) forsøkte han å knytte antikkens kromatiske og enharmoniske skalaer sammen med samtidens nyskapende verk som var i behov av et system for justering av tonehøyden i kromatiske intervaller.