Medici-motstanderne nyttet ikke kaste familien fra makten, selv med likvideringen av Alessandro i 1537. Den eneste mulige arvingen Cosimo il Giovane opparbeidet seg respekt og innførte gradvis et autokratisk regime. Under hans styre ble de konkurrerende familiene knust, og staten styrket ved å underlegge Siena i 1555. Han fikk en suveren tittel fra paven, og ble den 5. mars 1570 kronet storhertug av Toscana av pave Pius V.