Jakob Regnart ble født inn i en musikerfamilie. Etter egne uttalelser tjenestegjorde han som korgutt hos habsburgerne. Høyst sannsynlig var han i Praha ved hoffkapellet til erkehertug og senere keiser Maximilian II av Det tysk-romerske rike, under ledelse av Jacobus Vaet. Maxmillians hoffregnskaper belegger at Regnart fra 1560 var aktiv som tenor i Praha.