Tittelen og handlingen i spillet er basert på den bibelske fortellingen om Abraham som skulle ofre sønnen sin Isak. Handlingen går ut på at moren til Isaac hører en stemme ovenfra, trolig Gud, som krever at hun tar livet til sønnen som bevis på at hun er gudfryktig. Isaac flykter ned til kjelleren for å slippe unna moren og må navigere seg gjennom rommene i kjelleren, som har flere monstre. Spilleren navigerer Isaac gjennom rommene og skyter tårer på monster for å komme videre. Når Isaac mister all helse, taper man spillet og må starte fra begynnelsen tilbake. Et særmerket trekk ved er at rommene i kjelleren blir tilfeldig genererte og er annerledes bygd opp hver gang spilleren starter på nytt.