Under keiser Karl V (1500–1558) var det både konflikter med hensyn til arvefølgen til den spanske tronen, men det var særlig stridigheter knyttet til religion. Allerede før Karl V ble keiser hadde Martin Luther i 1517 satt i gang prosessen som førte fram til reformasjonen. På denne tiden så mange lokale hertuger reformasjonen og endringen i trosretningen som en mulighet til å utfordre den sterke stillingen til keiser Karl V. Dette første til at Det tysk-romerske riket ble splittet langs religiøse linjer, hvor særlig nord og øst, med mange av de viktige byer som Strasbourg, Frankfurt am Main og Nürnberg ble protestantiske, mens sør og vest forble hovedsakelig katolske.