Lord Moray ble myrdet av en av Marias tilhengere i 1570. Han ble etterfulgt av Jakobs farfar, Matthew Stewart, 4. jarl av Lennox som led en lignende død i 1571. Nestemann var Jakob VIs vokter, John Erskine, 1. jarl av Mar som døde i 1572. Den siste av regentene var James Douglas, 4. jarl av Morton som i løpet av de to foregående regentskapene hadde vært den mektigste skotske adelsmannen, mer mektig enn regentene selv. Historikeren og poeten George Buchanan var ansvarlig for Jakobs utdannelse.