James var den eldste sønnen til dronning Maria I av Skottland og hennes andre ektemann, Henry Stuart (mer kjent som lord Darnley). På grunn av det dårlige forholdet mellom ektefellene, har det vært spekulert i at Jakob ikke var biologisk sønn av Darnley, men heller av Marias sekretær David Rizzio eller James Hepburn, den 4. jarlen av Bothwell, og som ble Marias siste ektemann. Dersom Jakob var legitim, ville han ha vært en direkte etterkommer av Henrik VII, ettersom hans oldemor var Margaret Tudor, søster av Henrik VIII.