Fra 1940-åra og heilt opp til 70-tallet etterforsket FBI spionasje mot USA og landets allierte. Blant annet ble åtte nazi-agenter arrestert (og seks av dem henretta), etter at de hadde planlagt sabotasje mot amerikanske mål (). FBI var også tungt inne i Venona-prosjektet, der de sammen med Storbritannia lyktes å knekke kommunikasjonskodene til sovjetisk diplomati og etterretning. Gjennom dette fikk de stadfestet at det var amerikanere som jobbet for sovjetisk etterretning. Hoover var leder for dette prosjektet, men unnlot å varsle Central Intelligence Agency (CIA) før i 1952. En annen kjent sak var arrestasjonen av den sovjetiske spionen Rudolf Abel i 1957.