Han var sønn av borgermester i Skien Caspar Barnholt (1600–1670) og Dorthe Zachariasdatter. Barnholt studerte teologi såvel som filosofi og jus på reiser rundt i Europa. Han ble gift første gang den 15. januar 1665 med Margrethe Stockfleth (1642–1685), datter av biskop i Christiania Henning Stockfleth (d. 1664) og Magdalena Schnell (d. 1674). Andre gang giftet han seg den 31. mars 1687 med Juliane Augustua Cranenburg.