Traktaten holdt ikke lenge. Nybyggerne strømmet fortsatt inn på cherokeenes område, spesielt i den nordlige delen. Når cherokeene forsøkte å straffe dem i henhold til traktaten, fengslet man i stedet indianerne, og i 1791 måtte stammen skrive under en ny traktat. Denne gangen måtte den avstå alt gjenværende land i Kentucky. Som betaling skulle stammen få de fengslede stammemedlemmene tilbake, og USA skulle årlig betale $ 1000 i erstatning til stammen. Amerikanske nybyggere skulle ha fri passasje på en vei gjennom området, og de skulle ha rett til å ferdes fritt på Tennessee-elva. Cherokeenes område skulle merkes tydelig opp, og indianerne kunne stadig fordrive de som slo seg ned på området. Indianerne som begikk forbrytelser mot hvite skulle utleveres til amerikanerne, og straffes av de hvite etter amerikansk lovgivning. Holston-traktaten, som den ble kalt, inneholdt også bestemmelser om at cherokeene skulle slutte å være jegere, og i stedet bli jordbrukere.