Ved kjemisk ionisering (CI) blir en reagensgass, vanligvis metan eller ammoniakk, introdusert i massespektrometeret. Avhengig av hvilken teknikk (positiv CI eller negativ CI) som er valgt, vil denne reagensgassen samhandle med elektronene og analytten og forårsake en 'myk' ionisering av molekylet av interesse. En mykere ionisering, fragmenterer molekylet i lavere grad enn hard ionisering av EI. En av de viktigste fordelene ved å bruke kjemisk ionisering er at det produseres et massefragment som tilsvarer molekylvekten til analytten av interesse.