Kloramfenikol virker ved å hemme enzymet peptidyl transferase, som hemmer ribosomal aktivitet og proteinsyntese ved å hindre binding av amino-acyl-tRNA til A-setet på 50S delen av ribosomet. Virkningsmekanismen er helt tilsvarende makrolidenes. Kloramfenikols viktigste egenskap er en ekstrem fettløselighet, noe som gir god penetrans til de fleste vev. Dette utnyttes ved behandling av hjernehinnebetennelse hos små barn som er den eneste tilstanden hvor kloramfenikol brukes systemisk. Faren for agranulocytose anses som så stor at medikamentet ellers bare benyttes til lokalbehandling.