En mye større osmansk invasjon kom i 1565, under Den store beleiringen av Malta. Under beleiringen var den osmanske flåten basert i Marsamxett, og kanoner ble plassert på Tigné Point for å bombardere Fort St. Elmo. Under angrepet ble den osmanske admiralen Dragut drept av streifskudd. Beleiringen opphørte til slutt, og malteserordenen og malteserne gikk av med seieren. En ny by ble bygget på Sciberras-halvøya, som fikk navnet Valletta etter Jean Parisot de la Valette, stormester i malteserordenen, som var initiativtakeren. Forstaden Floriana ble senere bygget utenfor byen, og den er etter hvert blitt en egen by.