Desmond blir plugget inn i Animusen igjen, som en siste sjanse til å bli reddet. I disse minnene han gjenlever, reiser Ezio, nå 50 år, til Masyaf for å søke visdommen til Altaïrs bibliotek, plassert under snikmordernes fort. Men området er okkupert av bysantinske Tempelriddere, og Ezio kjemper seg gjennom, men mislykkes, mister den ene klingen og skal bli henrettet av Tempelridderne. Men Ezio unnslipper og flykter til Konstantinopel (dagens Istanbul). Der møter han Yusuf Tazim, en tyrkisk snikmorder som hjelper ham å gjenopprette utstyret han mistet i kampen i Masyaf, og Ezio hjelper til med å forbedre snikmordernes innflytelse i Konstantinopel. Samtidig som han hjelper det tyrkiske brorskapet, har Ezio et annet oppdrag i Konstantinopel, å finne nøklene til det hemmelige biblioteket i Masyaf som inneholder visdommen til en snikmorderlegende.