I en typisk MS-prosedyre ioniseres en prøve, som kan være fast, væske eller gass, for eksempel ved å bombardere den med en elektronstråle. Dette kan føre til at noen av prøvenes molekyler fragmenteres i positivt ladede fragmenter eller bare blir positivt ladede uten fragmentering. Disse ionene (fragmentene) blir deretter separert i henhold til deres masse-til-ladnings-forhold, for eksempel ved å akselerere dem og underkaste dem et elektrisk eller magnetisk felt: ioner med samme masse-til-ladningsforhold vil gjennomgå samme mengde avbøyning. Ionene blir oppdaget av en mekanisme som er i stand til å oppdage ladede partikler, for eksempel en elektronmultiplikator. Resultatene vises som spektra av signalintensiteten til oppdagede ioner som en funksjon av forholdet mellom masse og ladning. Atomer eller molekyler i prøven kan identifiseres ved å korrelere kjente masser (f.eks. Et helt molekyl) til de identifiserte massene eller gjennom et karakteristisk fragmenteringsmønster.