Sammen med sin datter ble han i 1560 med ekspedisjonen til Pedro de Ursúa ned elvene Marañón og Amazonas med 300 spanjoler og hundrevis av innfødte. Ursúas egentlige målsetning var å sende vekk veteraner fra de tidligere borgerkrigene i Peru og derved hindre dem i å lage bråk, og brukte myten om El Dorado som lokkemat. Et år senere deltok han da Ursúa og hans etterfølger Fernando de Guzmán ble styrtet og drept, og Aguirre overtok ledelsen av ekspedisjonen. Han nådde Atlanterhavet, sannsynligvis via Orinoco, og ødela innfødte landsbyer på veien. Den 23. mars 1561 oppfordret Aguirre 186 kapteiner og soldater til å undertegne en lov som ville erklære han som fyrste av Peru, Tierra Firma og Chile.