Río Magdalena har sitt utspring i Colombia-massivet, som er en del av Andesfjellene, beliggende i departementet Huila sør i landet. Elva renner ut i Det karibiske hav ved byen Barranquilla. Største sideelv er Cauca, som kommer fra Cali og har tilførsel fra elva Porce fra Medellín. Ei annen sideelv i øst starter ved hovedstaden Bogotá, slik at alle Colombias fire millionbyer ligger i Magdalena-vassdraget.