Det lange parlamentet, som ble innkalt i november 1640, løslot ham, og under borgerkrigen støttet han parlamentarianerne. Han deltok ved rettssaken mot Laud, som endte med dødsdom over erkebiskopen. Samtidig endret konstellasjonene seg, slik at Prynne som tidligere hadde vært fremst i den radikale opposisjonen nå tilhørte de konservative presbyterianistene som sto mot Oliver Cromwells uavhengige.