Justinian ble smittet av pesten tidlig på 540-tallet, men han overlevde. Teodora døde i 548, kanskje av kreft, i en relativ ung alder; Justinian overlevde henne med bortimot tyve år. Han hadde stor interesse i teologiske spørsmål, deltok aktivt i debatter om kristne doktriner, og ble en mer hengiven kristen under de siste år av sitt liv. Da han døde, om natten mellom 13. og 14. november i året 565, hadde han ingen barn. Han ble etterfulgt av Justinus II, som var sønn av hans søster Vigilantia, og var gift med Sofia, niesen til keiserinne Teodora. Justinians legeme ble gravlagt i et mausoleum i Den hellige apostelkirken i Konstantinopel.