Henslowe ble født i Lindfield i Sussex i en familie med røtter i Devon. Hans far Edmund Henslowe ble i 1539 utpekt som , tilsvarende norsk tittel er tilnærmet jaktmester, for skogen Ashdown Forest i Sussex. Han holdt posisjonen fram til sin død i 1562. Før farens død ble hans søster giftet bort til Ralf Hogge, en jernmester som hadde klatret fra enkle kår til å styre sine egne bruk, og blant annet produserte kanoner for monarken. Henslowe opprettholdt forbindelsene med Sussex hele livet ved sine forretningsinteresser og sin familie hvor de fleste bodde her.