Han ble satrap i Lydia og Karia i 413 f.Kr. og øverstkommanderende i den persiske hær i Lilleasia. Da Dareios II beordret innkreving av de utestående skattene til de greske byene, inngikk han en allianse med Sparta mot Athen, noe som i 412 førte til erobringen av store deler av Jonia. Men Tissafernes var ikke villig til å handle og forsøkte å nå sitt mål gjennom forhandlinger. Alkibiades overtalte ham om at Persias beste politikk var å holde balansen mellom Athen og Sparta, og rivalisering med hans nabo Farnabazos i Frygia tappet ham ytterligere for energi. Da kongen i 408 bestemte seg for å støtte Sparta, ble Tissafernes fjernet som general og begrenset til Karia, mens Lydia og krigsbestrebelsene ble betrodd Kyros den yngre.