Audrey Kathleen van Heemstra Ruston ble født 4. mai 1929 i Ixelles, en tospråklig kommune i Brussel i Belgia. Faren Joseph Victor Anthony Ruston (1889–1980) var britisk, og ble født i Úžice i Böhmen i Østerrike-Ungarn. Han la senere til Hepburn i etternavnet fordi han trodde han var en fjern slektning av James Hepburn, Maria Stuarts tredje ektefelle. Audrey Hepburn var født britisk statsborger gjennom sin far og hun gikk som barn på skole i England. Audrey Hepburns mor Ella van Heemstra (1900–1984) var en nederlandsk baronesse. Britiske myndigheter regnet moren som britisk statsborger. Hun var datteren til Aarnoud van Heemstra, som var borgermester i Arnhem fra 1910 til 1920. Han var også guvernør i Surinam i Sør-Amerika, da en nederlandsk koloni, fra 1921 til 1928. Både Ruston og van Heemstra hadde vært gift tidligere, og Ella hadde to sønner fra sitt ekteskap.