Handlingen begynner utenfor huset til Mario og Luigi. Etter at Luigi har hentet inn posten, oppdager brødrene at Mario har fått et brev fra Prinsesse Peach. I brevet står det at prinsessen har fått snusen i en fantastisk skatt, og hun ber Mario om å komme til en fremmed by, kalt Rogueport, for å bistå henne med å finne denne skatten. De fikk også med seg et kart. Mario tar båt til den ukjente byen, og går av ved havnen i Rogueport. Spilleren får knapt lagret fremgangen før problemer dukker opp. Man får straks vite at Peach har forsvunnet, og Mario møter Goombella, en kvinnelig Goomba, som er blitt angrepet av Lord Crump med sine X-Nauts. Mario hjelper Goombella vekk fra Lord Crump og kommer i kontakt med Professor Frankly, som hjelper dem med å finne de syv krystallstjernene. De går ned i kloakken og finner tusenårsdøren.