I DESI er det to typer ioniseringsmekanismer, en som gjelder molekyler med lav molekylvekt og en annen for molekyler med høy molekylvekt. Molekyler med høy molekylvekt, slik som proteiner og peptider, viser elektrospray som spektre der det blir observert multiladede ioner. Dette antyder desorpsjon av analytten, hvor flere ladninger i dråpen lett kan overføres til analytten. Den ladede dråpen treffer prøven, sprer seg over en diameter større enn den opprinnelige diameteren, løser opp proteinet og spretter tilbake. Dråpene beveger seg til massespektrometerinnløpet og blir videre desolvert. Løsningsmidlet som vanligvis brukes til elektrospray er en kombinasjon av metanol og vann.