Tidlig på 1500-tallet hadde Det osmanske rike begynt å spre seg over regionen til det nådde det sørøstlige Europa. Den spanske kongen Karl V fryktet at Roma ville falle i hendene på de muslimske tyrkerne, noe som ville bety slutten på det kristne Europa. I 1522 drev sultan Suleiman I den store den kristne munkeordenen johanitterordenen ut av Rhodos. Deretter flakket ordenen rundt om i Europa, før paven og spanskekongen ga den lov til å slå seg ned på Malta i 1530 for å beskytte Europa og spesielt Roma fra muslimsk invasjon fra sør. Som symbolsk leie for øya skulle ordenen gi kongen en malteserfalk hvert år på allehelgensdag. Etter 1530 ble ordenen kjent som Malteserordenen, og kom til å spille en betydelig rolle i Maltas historie. I de neste 275 årene gjorde disse berømte «ridderne av Malta» øyene til sitt maktområde. De bygget byer, palasser, kirker, haver og festningsanlegg, og forskjønnet øyene med tallrike kunstverker og økte dens kulturelle arv.