Justinian så ortodoksien (rettroenheten) i riket truet av sprikende religiøse retninger, særlig monofysittisme, som hadde mange tilhengere i de østlige provinsene i Syria og Egypt. Den monofysittiske lære hadde blitt fordømt som kjetteri av konsilet i Kalkedon i 451, og den tolerante politikken til keiserne Zenon og Anastasios I hadde vært en kilde til spenninger med biskopene i Roma. Justinian endret denne utviklingen da han bekreftet den kalkedonske lære og fordømte monofysittene.