Elizabeths politikk ovenfor nabolandet Skottland var i førstningen å motsette seg den franske tilstedeværelsen der. Skottland hadde tradisjonelt orientert seg i en allianse med Frankrike som en motvekt mot å bli overkjørt av sin langt sterkere fiende England. Elizabeth og hennes rådgivere fryktet at Frankrike ville invadere England nordfra og plassere Maria Stuart, skottenes dronning på Englands trone. Maria var betraktet av mange som den rettmessige arvingen, særlig av katolikker. Elizabeth lot seg overtale til å sende en militær styrke til Skottland for å støtte de protestantiske opprørerne, og selv om militærkampanjen ikke førte fram, fikk den som resultat Edinburgh-traktaten inngått i juli 1560. Her stod det at de franske styrkene måtte trekkes ut. Da den katolske Maria Stuart kom tilbake til Skottland i 1561 og overtok kongsmakten, hadde landet allerede en etablert protestantisk kirke og ble styrt av en protestantisk adel som var støttet av Elizabeth. Den skotske dronningen ga seg ikke uten kamp, og nektet i årevis å signere traktaten ettersom den anerkjente Elizabeth som Englands rettmessige dronning. Dette stridsspørsmålet ble en vedvarende splid mellom de to dronningene.