Ackles ble født i Dallas i Texas som sønn av Roger Alan Ackles, en lokal teaterskuespiller, og Donna Joan Shaffer. Ackles har en bror, Joshua, som er tre år eldre, og en søster, Mackenzie, som er syv år yngre. Hans familie kommer fra England, Irland og Skottland. Han hadde egentlig planlagt å studere idrettsmedisin på Texas Tech University for å bli fysioterapeut, men flyttet i stedet til Los Angeles for å bli skuespiller.