Duke (Channing Tatum) og Ripcord (Marlon Wayans er to soldater som blir frastjålet topphemmelige våpen av en ond organisasjon kalt Cobra. De må dermed bli med en gruppe supersoldater, bare kjent som G.I. Joe, for å rette opp denne feilen. General Hawk (Dennis Quaid), lederen av G.I. Joe, sender dem og sine beste soldater ut for å stoppe Cobra fra å ta over verden og dermed bevise at organisasjonen hans er ekte amerikanske patrioter og helter. For Duke er det imidlertid ett stort problem: en av hovednøklene til Cobra er hans eks-kjæreste, Anastasia DeCobray (Sienna Miller).