Matulionis studerte i Antalieptė fra 1887 til 1892, og deretter på realgymnasiet i Daugpilis (Dvinsk) fra 1892 til 1900. Han ble uteksaminert fra realgymnasiet i Lettland med artium, og søkte han om tillatelse til å begynne på seminaret. Seminaret i Vilnius krevde imidlertid latinartium og anerkjente ikke realartium. Men så fikk han høre at Det katolske akademi (seminaret) i Sankt Petersburg (før 1914: St Petersburg; 1914-24: Petrograd; 1924-91: Leningrad, fra 1991 igjen St Petersburg) aksepterte både latin- og realartium, så han reiste dit til den russiske hovedstad og begynte på seminaret der (1892-1900). Han studerte også russisk, latvisk og polsk. Som student på Det keiserlige romersk-katolske teologiske akademi ble han usikker på om han egnet seg som prest, så han forlot seminaret for å undervise i noen år (1893-95). Men så vendte han tilbake for å fullføre sine studier.