Mk.II ble også produsert i to varianter, Mk.IIA (åtte maskingevær) og IIB med to 20 mm Hispano maskinkanoner + fire maskingeværer. Erfaringen fra krigens første år viste at maskinkanoner var en stor fordel, særlig overfor bombefly. Trommelmagasinene og matingen på de nye Hispano Mk.I-kanonene viste seg å være upålitelige når det ble skutt mens flyet manøvrerte, og fikk lett forkiling bare etter noen få skudd. De fleste Mk.II ble derfor likevel utstyrt med maskingeværer som sin forgjenger. Leveransene fra fabrikkene økte i takt, og innen april 1941 var hele RAFs beholdning av Mk.I byttet ut. Totalt 920 Spitfire Mk.II ble produsert.