Året er 2012 og bartenderen Desmond Miles har blitt bortført av et firma som bedriver genetisk minne-forskning. Firmaet bruker en «Animus» for å se inn i fortiden til personen som ligger i animusen-maskinen. Maskinen går inn i minner som er lagret i kroppens DNA. Spilleren styrer Desmond Miles, etterkommer av snikmorderen Altaïr Ibn la-Ahad («Sønn av ingen mann»), medlem av «Assassinersekten». Spilleren blir tatt tilbake til tiden under det tredje korstoget i år 1191, hvor Altaïr har fått i oppdrag å stjele «Edens Eple» fra Tempelridderne, en gjenstand hvis kraft er ukjent, men som blant annet kan framkalle illusjoner. Etterhvert som historien utspiller seg lærer man at firmaets egentlige hensikt ikke er genetisk minne-forskning, men å finne ut hvor «Edens Eple» befinner seg i vår tid, ved å bruke Desmond Miles' minne.