Down ble født i Torpoint i Cornwall. Han var irsk på farssiden, og hans tippoldefar hadde vært biskop i Derry. John Down gikk på skole i området, deriblant Devonport Classical and Mathematical School. Som 14-åring begynte han å jobbe i farens butikk. Det var imidlertid ikke det han ville. Etter å ha fått Arnotts «Physics» av presten, bestemte han seg for en karriere innen naturvitenskapen. Som 18-åring dro han derfor til London hvor han fikk jobb hos en kirurg i Whitechapel Road (i distriktet hvor Jack the Ripper holdt til). Der måtte han trekke tenner, vaske flasker og lage og dele ut medisiner. Senere begynte han å jobbe i et farmasøytisk laboratorium i Bloomsbury Square, og her vant han en pris i organisk kjemi. Han møtte også Michael Faraday og hjalp ham med hans arbeid om gasser. Mer enn en gang dro han tilbake til Torpoint for å hjelpe sin far fram til faren døde i 1853.