Da hennes to eldre søsken, Johan (fyrste av Asturias) og Isabella (dronning av Portugal) døde, og deretter også Isabellas sønn Miguel, ble Johanna arving til de spanske kongerikene. Hennes to yngre søsken var Maria (dronning av Portugal) og Katarina (dronning av England). Den kastiljanske Cortes anerkjente i 1502 Johanna som arving til Castillas trone, og hun fikk tittelen fyrstinne av Asturias. Samme år sverget den aragonske Cortes troskap til henne.