John Florio giftet seg med Rose eller Rosa Daniel, søsteren til poeten Samuel Daniel og musikeren John Daniel. Hun arbeidet i husholdningen til grevinnen av Pembroke, Mary Sidney, den gang senteret til den litterære Wilton-sirkelen. Rosa var modell for Edmund Spensers figur «Rosalind» i hans diktverk (, 1579). Sammen fikk de 4 barn. I 1617 etter den første konenes død giftet han seg på nytt, denne gangen med Rose Spicer.