Raskt etter grunnleggelsen ble universitet en viktig utdannings- og forskningsinstitusjon, og forble dette gjennom mellomkrigstiden. Samtidig var perioden preget av økonomisk usikkerhet og mangel på finansiering. Etter Tysklands annektering av Tsjekkoslovakia i 1939 ble universitetet stengt. Det ble gjenåpnet etter krigen, og byttet i 1960 navn til . På 1960-tallet opplevde universitetet på ny framgang, men perioden etter at landet ble invadert av land fra Warszawapakten i 1968 var preget av stagnasjon. Universitetet fikk tilbake sitt originale navn i 1990 etter at kommunistregimet var blitt styrtet året før. Tiden etter dette har vært preget av ny fremgang og utvidelse, mye takket være omfattende satsing fra myndighetenes side. En rekke nye fakulteter har blitt åpnet og byggingen av en ny campus ble påbegynt i 2002. De første ferdigstilte delene av denne ble tatt i bruk i 2005.