I åtterårsalderen flyttet Prelog sammen med sin familie til Zagreb og senere til Osijek i dagens Kroatia. Etter å ha tatt doktorgraden i Praha ble han lektor ved Universitetet i Zagrebs tekniske fakultet, hvor han i ble den første til å syntetisere adamantan og i samarbeide med legemiddelselskapet Pliva d.d. fremstilte han streptazol, en av de første sulfonamidene. Lavoslav Ružička inviterte Prelog til Eidgenössische Technische Hochschule Zürich i 1941. Der forsket Prelog i stereokjemi, naturproduktkjemi og strukturkjemi. Blant annet utformet han, Robert Cahn og Christopher Ingold de såkalte Cahn-Ingold-Prelog-reglene for navngiving av stereoisomerer.