I 1555 døde Henrik II av Navarra og Johanna og hennes ektefelle ble Navarras regenter. På juledag 1560 konverterte hun og ble dermed Frankrikes mektigste hugenott. Hun innkalte til en konferanse med hugenottministrene noe som ledet til att hun erklærte kalvinismen som offisiell religion i kongedømmet. Hun forbød katolskr ritualer, forvisye katolske prester og nonner, ødela katolske kirker og bestilte en offentlig oversettelse av Bibelen til baskisk og bearnesisk for allmenhetens regning. Hun gjenomførte også en omorganisering og flere økonomiske og juridiske reformer.