РЕАССОРТАНТНЫЙ ШТАММ ВИРУСА ГРИППА RN 1/09-SWINE A(H7N1) ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К НЕЙРАМИНИДАЗЕ ПРИ ГРИППОЗНОЙ ИНФЕКЦИИ И ВАКЦИНАЦИИ
REASSORTANT RN A9-SWINE A(H7N1) INFLUENZA VIRUS STRAIN FOR NEURAMINIDASE ANTIBODY ASSAY IN INFLUENZA INFECTION AND VACCINATION

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для диагностических целей при гриппозной инфекции, а также для оценки иммуногенности при вакцинации гриппозными вакцинами.
Современная эпидемическая ситуация по гриппу характеризуется одновременной циркуляцией сразу нескольких вариантов вируса семейства Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus A(H1N1), A(H3N2) и В. В последнее время проявляется также активизация вирусов гриппа животных и птиц, к которым иммунитет у большинства людей отсутствует. В таких условиях наличие антител к минорному поверхностному антигену вируса (нейраминидазе N1) у контингента людей, прививаемых сезонными гриппозными вакцинами, или у лиц, перенесших естественную инфекцию эпидемическими штаммами вируса гриппа А, может оказаться решающим в снижении смертности и ограничении распространения пандемии [PLoS Med. - 2007. - Jun; 4(6). -e 212]. Традиционно иммуногенность гриппозных вакцин оценивается по формированию после прививки антител к гемагглютинину (НА) в сыворотке крови [приказ №156/29 МЗ РФ 07.05.1998]. Однако в отношении живых вакцин до сих пор не было показано прямой связи серологической эффективности, которую оценивают по приростам антигемагглютинирующих антител, с высоким уровнем защитной эффективности.
По мере создания новых гриппозных вакцин против пандемических штаммов появляется необходимость использования дополнительных эффективных и доступных критериев оценки иммуногенности вакцинных штаммов.
Для определения антител к нейраминидазе вируса гриппа ранее применялись реассортантные штаммы на основе вируса гриппа А/лошадь/Прага/1/56(Н7N7), содержащие нейраминидазу эпидемических вирусов человека A(H1N1) и A(H3N2) [Вопр. вирусологии. - 1985. - №1, - стр.35-39]. При этом использовался тест ингибиции элюции, основанный на блокировании антителами сиалидазной активности нейраминидазы, которую оценивали по задержке элюции предварительно агглютинированных вирусом гриппа эритроцитов.
В настоящее время в циркуляции появились новые варианты вирусов гриппа, такие как вирус свиного происхождения А(Н1N1) и птичьи вирусы А(Н5N1), в связи с чем возникла необходимость разработки новых диагностических штаммов, содержащих соответствующую нейраминидазу.
RN1/09-swine
A(H7N1)
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение реассортантного штамма, содержащего нейраминидазу N1 пандемического вируса свиного происхождения А/Калифорния/07/09(Н1N1). Реассортантный штамм -  получен методом классической генетической реассортации в развивающихся куриных эмбрионах (КЭ) вируса А/лошадь/Прага/1/1956(Н7N7) и вакцинного штамма А/17/Калифорния/09/38(N1N1) с последующей селекцией при пониженной до 25°С температуре в присутствии поликлональных антител к гемагглютинину вируса гриппа Н1.
Вакцинный штамм А/17/Калифорния/09/38(N1N1), полученный из коллекции отдела вирусологии НИИЭМ СЗО РАМН, являлся реассортантом с формулой генома 6:2 на основе холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(Н2N2) и содержал поверхностные антигены НА и NA от пандемического вируса А/Калифорния/07/09(Н1N1).
Вирус А/лошадь/Прага/1/1956(Н7N7) был получен из центра по контролю и предупреждению заболеваний США (Атланта, Джорджия).
RN1/09-swine А(Н7N1)
Реассортант  унаследовал ген NA от штамма А/Калифорния/07/09(Н1N1). На фиг.1 представлен пример анализа гена NA при помощи полимеразно-цепной реакции (ПЦР) с набором праймеров, специфичных для нейраминидазы подтипов N7 и N1. Дорожки имеют следующее соответствие: 1 - ДНК-маркер (100 bp), 2 - А/лошадь/Прага/1/1956(Н7N7), 3 - А/17/Калифорния/09/38(N1N1), 4 - RN1/09-swine A(H7N1), 5 А/лошадь/Прага/1/1956(Н7N7), 6 - А/17/Калифорния/09/38(N1N1), 7 - RN1/09-swine A(H7N1). Наличие амплификации реассортанта RN1/09-swine (4-я дорожка) (H7N1) с праймерами N1 подобно родительскому штамму А/17/Калифорния/09/38 (3-я дорожка) и отсутствие амплификации с праймерами N7 (7-я дорожка) свидетельствуют об идентичности гена NA реассортанта RN1/09-swine и штамма А/Калифорния/07/09(Н1N1).
ПЦР-рестрикционный анализ шести генов негликозилированных белков [J. Virol. Method. - 1995. - №55. - Р.445-446] показал, что все они были унаследованы от аттенуированного донорского штамма A/Лeнингpaд/134/17/57(H2N2). Принадлежность гемагглютинина реассортанта родительскому штамму A/лошадь/Прага/1/56(H7N7) подтверждена в реакции торможения гемагглютинации (РТГА).
Отсутствие перекрестных реакций реассортантного штамма A(H7N1) с эпидемическими вирусами A(H1N1) и A(H3N2) продемонстрировано в РТГА с сыворотками волонтеров, привитых сезонной тривалентной живой гриппозной вакциной (ЖГВ). Показано, что к компонентам вакцины A(H1N1) и A(H3N2) после прививки наблюдаются приросты антител, при этом у тех же волонтеров перекрестно-реагирующие антитела к лошадиному вирусу A(H7N7) отсутствуют (см. таблицу 1).
Таблица 1
Антигемагглютинирующие антитела к вирусам A(H1N1), A(H3N2) и A(H7N1) в сыворотках волонтеров после прививки сезонной тривалентной ЖГВ
Группы
A(H1N1)
A(H3N2)
A(H7N7)
% сероконверсий
СГТ-
% сероконверсий
СГТ-
% сероконверсий
СГТ-
ЖГВ
30
13,8
40
21,6
0
5,0
Плацебо
0
9,1
5
11,7
0
5,0
Показано также, что реассортантный вирус не проявляет перекрестного реагирования с вирусом птичьего гриппа А/утка/Потсдам/1402-6/86 (H5N2) (см. таблицу 2).
Таблица 2
Титры антигемагглютинирующих антител к вирусам A(H5N2) и A(H7N1) в сыворотках волонтеров, привитых моновалентной ЖГВ из штамма А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5N2)
СГТ антигемагглютинирующих антител к вирусам
A(H5N2)
A(H7N7)
До прививки
21-е сутки
42-е сутки
До прививки
21-е сутки
42-е сутки
ЖГВ
4,8
7,0
14,0
5,0
5,0
5,0
Плацебо
5,0
5,2
5,3
5,0
5,0
5,0
Таким образом, представленный реассортантный штамм обладает антигенной специфичностью гемагглютинина вируса А/лошадь/Прага/1/56(Н7N7), что исключает перекрестное реагирование с гемагглютининами циркулирующих сезонных вирусов А(Н1N1) и A(H3N2), а также с гемагглютининами вирусов гриппа птиц подтипа Н5.
Наличие нейраминидазы вируса гриппа птиц N1 делает возможным применение указанного штамма для выявления перекрестно-реагирующих антител в данной нейраминидазе у лиц, перенесших инфекцию или прошедших вакцинацию гриппозными вакцинами.
50
Репродуктивная активность штамма в куриных эмбрионах составляет 8,8 Ig ЭИД/ 0,2 мл.
Штамм депонирован в Государственной коллекции вирусов Учреждения Российской Академии Медицинских Наук Института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН под №ГКВ №2473. Морфология штамма - полиморфная, типичная для вируса гриппа.
ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛУЧЕННОГО ШТАММА.
50
Инфекционная активность при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 33°С в течение 36 часов - 8,8 Ig ЭИД/ 0,2 мл.
Гемагглютинирующая активность - 1:512.
Паспорт на вакцинный штамм RN1/09-swine A(H7N1) прилагается.
ПАСПОРТ ШТАММА
вируса гриппа RN1/09-swine А(Н7N1)
RN1/09-swine A(H7N1)
1. Название штамма -  [А/лошадь/Прага/1/1956(Н7)-А/17/Калифорния/09/38(N1)]
2. Серия - серия 1
3. Метод получения - реассортация
4. Характеристика родительских вирусов:
а) вирус гриппа лошади - А/лошадь/Прага/1/1956(Н7N7);
б) вакцинный штамм А/17/Калифорния/09/38(Н1N1) на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/1957(H2N2)
5. Количество пассажей - 6 в процессе рекомбинации; 3 накопительных пассажа в системе развивающихся куриных эмбрионов
6. Характеристика штамма до лиофилизации:
а) оптимальные условия репродукции - 33°С, 48 часов;
б) гемагглютинирующая активность 1:512;
50
в) инфекционная активность 8,8 Ig ЭИД/ 0,2 мл;
г) чувствительность к ингибиторам: ингибиторорезистентный;
д) структура генома реассортанта:
- гены от вируса гриппа лошади: НА;
- гены от вакцинного штамма - РВ2, РВ1, PA, NP, M, NS и NA
7. Характеристика штамма после лиофилизации:
а) дата лиофилизации: 24.12.2009;
б) объем материала в ампуле: 1 мл;
50
в) инфекционная активность - 6,05 Ig ЭИД/ 0,2 мл;
д) гемагглютинирующая активность - 1:160
8. Антигенная специфичность:
а) гемагглютинина - идентичен вирусу А/лошадь/Прага/1/1956(Н7N7) по данным РТГА с крысиной антисывороткой и ПЦР-рестриктазного анализа ДНК-копий гена;
б) нейраминидазы - идентична вирусу А/17/Калифорния/09/38(Н1N1) по данным ПЦР-рестриктазного анализа ДНК-копий гена
9. Бактериологический контроль лиофилизированного материала: дата проведения - 13.01.2010 - стерилен.
Назначение полученного штамма - качественное и количественное определение антител к NA штамма А/Калифорния/07/09(Н1N1) пандемического вируса гриппа в сыворотках крови.
1. Штамм может применяться для выявления антинейраминидазных антител в тесте ингибирования сиалидазной активности NA, а также иммуноферментного анализа (ИФА) в сыворотках лабораторных животных после инокуляции вирусом гриппа.
Методика такого выявления основана на определении титра антинейраминидазных ингибирующих антител, представляющих собой величину, обратную последнему разведению тестируемой сыворотки, в котором еще наблюдается блокирование сиалидазной активности NA диагностического штамма RN1/09-swine A(H7N1). Сиалидазная активность NA определяется по отношению к натуральному субстрату (фетуин) с последующим узнаванием демаскированных полисахаридов пероксидазно-меченным лектином.
При проведении твердофазовой ИФА диагностический штамм RN1/09-swine A(H7N1) может применяться в качестве подложки для сорбции на 96-луночных планшетах, куда позднее вносятся падающие разведения тестируемых сывороток и пероксидазно-меченный коньюгат, специфичный к определяемому классу иммуноглобулинов. Титры антинейраминидазных антител определяется в десятичных логарифмах величины, обратной последнему разведению тестируемой сыворотки, в котором наблюдается двукратное превышение над средним значением оптической плотности лунок отрицательного контроля.
Для получения иммунных сывороток мышей иммунизируют живым или убитым вирусом гриппа различными способами (интраназально, внутримышечно, интраперитонеально). Эвтаназию проводят согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных». Взятие крови осуществляется из подключичной артерии, сыворотки крови отбираются после центрифугирования и хранятся при -20°С.
Пример выполнения эксперимента.
6
50
Мышам линии СВА вводили интраназально однократно реассортантный штамм А/17/Калифорния/09/38(Н1N1) в дозе 10 ЭИД/0,05 мл. Сыворотки крови иммунизированных мышей были получены через 14 дней после иммунизации. Показано, что в сыворотках иммунизированных мышей определялись специфические антитела к гемагглютинину и нейраминидазе штамма А/Калифорния/07/09(Н1N1) (см. таблицу 3). В контрольной группе интактных животных специфические антитела к вирусу А/Калифорния/07/09(Н1N1) выявлены не были.
Таблица 3
Приросты антител в сыворотках мышей через 14 дней после однократного введения вакцинного штамма А/17/Калифорния/09/38(Н1N1)
Группы
Антитела к НА
Антитела к NA
РТГА (СГТ)
Фетуиновый тест (СГТ)
ИФА(Ig)
Вакцина
17,4
31,7(р<0,02)
1,7±0,3
Контроль
7,6
10,6
1,0±0,0
10
10
Было проведено сравнение результатов ИФА, полученных с использованием в качестве подложки очищенного реассортантного вируса RN1/09-swine A(H7N1) (100 ГАЕ) или очищенной нейраминидазы вируса гриппа А/Калифорния/07/09(Н1N1) (1 мкг/мл). На фиг.2 представлена достоверная корреляция для обоих видов антигена (Тау Кендалла 0,538; р<0,05). По оси абсцисс представлены титры сывороточных иммуноглобулинов класса G (IgG) в сыворотках мышей к очищенной NA пандемического штамма А/Калифорния/07/09(Н1N1), выраженные в log. По оси ординат представлены титры сывороточных IgG к цельному реассортантному штамму RN1/09-swine A(H7N1), также выраженные в log.
2. Штамм может применяться для выявления антинейраминидазных антител в тесте ингибирования сиалидазной активности NA и ИФА в сыворотках привитых и переболевших лиц.
У обследуемых волонтеров отбираются пробы крови из пальца до и после вакцинации. Полученные после центрифугирования сыворотки крови хранятся при
-20°С.
Пример выполнения эксперимента.
7
50
С целью клинического изучения моновалентной ЖГВ А/17/Калифорния/09/38(Н1N1) волонтерам вводили препарат двукратно интраназально с интервалом в 21 день в дозе не менее 10 ЭИД/0,5 мл. Сыворотки крови были собраны до прививки, после первой вакцинации и ревакцинации. Антитела к нейраминидазе определяли в фетуиновом тесте и ИФА. Показано увеличение после двукратной прививки средних титров антител к нейраминидазе вируса гриппа по данным двух тестов (см. таблицу 4). Наиболее выраженные приросты антител к нейраминидазе выявлены у переболевших лиц.
Таблица 4
Формирование сывороточных антител к нейраминидазе у волонтеров, привитых моновалентной ЖГВ А/17/Калифорния/09/38(Н1N1)
Группы
Число в группе
Фетуин-лектиновый тест, СГТ у лиц с сероконверсиями (61%)
ИФА(Log10)
До прививки
После прививки
До прививки
После прививки
ЖГВ двукратно
31
12,4
22,3
2,2±0,3
2,5±0,3
Переболевшие
5
н/д
177,7
н/д
3,4±0,3
Плацебо
10
12,2
12,2
2,4±0,5
2,4±0,4
Результаты экспериментов четко демонстрируют пригодность заявляемого реассортантного штамма для выявления антител к нейраминидазе N1 вируса гриппа свиного происхождения, благодаря чему этот штамм может быть использован для диагностики, для изучении иммуногенности гриппозной вакцины, для анализа фоновых значений антинейраминидазных антител в популяции в целом в условиях циркуляции пандемического вируса гриппа A(H1N1).