Изучение влияния технологических параметров процесса получения массы для капсулирования с тритикаином -альфа

УДК 615.453.4

http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2686-6838-2019-21-10-131-137

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ ПРОЦЕССА ПОЛУЧЕНИЯ МАССЫ ДЛЯ КАПСУЛИРОВАНИЯ

С ТРИТИКАИНОМ -АЛЬФА.

Краснюк И.И., Тарасов В. В., Козлова Ж. М.

ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет),

г. Москва, Российская Федерация

STUDYING THE INFLUENCE OF TECHNOLOGICAL PARAMETERS OF THE PROCESS OF OBTAINING MASS FOR ENCAPSULATION WITH TRITICAINE-ALPHA.

Krasnyuk I.I., Tarasov V.V., Kozlova Zh.M.

First Moscow state medical university named after I.M. Sechenov, (Sechenov University),

Moscow, Russian Federation

Аннотация. В статье приведены результаты изучения влияния технологических параметров процесса перемешивания активной фармацевтической субстанции тритикаин-альфа (лио-филизат) со вспомогательными веществами на физико-химические и технологические характеристики полученной смеси для наполнения твердых капсул. При разработке новой лекарственной формы- твердых капсул вопросы однородности, сыпучести смеси для наполнения капсул, которая не должна расслаивается в процессе смешения и дозирования является актуальной задачей. Поскольку тритикаин-альфа - реком-бинантный термолабильный белок, представляет собой волокнистую структуру, для получения однородной смеси использовали смеситель «Glatt» модели TMG, серии «Mini» (Германия) при различных температурных режимах перемешивания. Оценку качества полученный массы для капсулирования проводили по технологическим показателям, а также продуктам разложения белка. В ходе эксперимента определены оптимальные условия перемешивания.

Annotation. The article presents the results of studying the influence of technological parameters of the process of mixing the active pharmaceutical substance triticain-alpha (lyophilisate) with excipients on the physicochemical and technological quality indicators of triticain-alpha in the resulting mixture for filling hard capsules. When developing a new dosage form -hard capsules, issues of uniformity, flowability of the mixture for filling the capsules, which does not separate during mixing and dosing, are an urgent task. Since triticaine-alpha is a recombinant thermolabile protein, it has a fibrous structure, to obtain a homogeneous mixture, the TMG model Glatt mixer, Mini series (Germany) was used under various temperature mixing conditions. Quality assessment of the obtained mass for encapsulation was carried out according to technological indicators, as well as protein decomposition products. During the experiment, optimal mixing conditions were determined.

Ключевые слова: смесители, перемешивание,

тритикаин-альфа, однородность дозирования,

технологические свойства, масса для каспулиро-

вания.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

[1] Андрюшкин А. Ю. Перемешивание компонентов технологических смесей (об-зор)//Конструкции из композиционных материалов. 2011. №4. С.19-37

[2] Патент RU 2674763 «Способ получения лекарственного средства для лечения целиа-кии и лекарственное средство, поученное эти способом»

[3] Патент RU 2603054 «Способ получения белков семейства цистеиновых протеаз пшеницы (Шйсит aestivum) и препарат белка тритикаин-альфа, полученный этим способом»

[4] Краснюк И.И., Тарасов В.В., Козлова Ж.М., Степанова О.И., Краснюк (мл), И.И., Кугач

B.В. Изучение технологических и физико-химических свойства тритикаин-альфа.// Вестник фармации. 2019.№ 1 (83), С. 5357.

[5] Хаджиева З. Д., Кузнецов А. В., Бирюкова Д. В. Технологические аспекты использования вспомогательных веществ в производстве лекарственных препаратов//Фундамен-тальные исследования. 2012. № 5 (2).

C.436-440.

[6] Хесс Т. От влажного гранулирования - к прямому прессованию // Фармацевтические технологии и упаковка. 2013. № 6. С 106109

[7] Государственная фармакопея РФ XIV изд. Т. II. - М.: ФЭМБ, 2018.

[8] Фармацевтическая разработка: концепция и практические рекомендации. Научно-практическое руководство для фармацевтической отрасли. -М. Издательство Перо, 2015. - 472 с.

Keywords: mixers, mixing, triticain-alpha, dosage uniformity, technological properties, mass for encapsulation.

REFERENCES

[1] Andryushkin A. Yu. Mixing the components of technological mixtures (review) // Designs from composite materials. 2011. No4. S.19-37

[2] Patent RU 2674763 "A method of obtaining a medicinal product for the treatment of celiac disease and a medicinal product taught by this method"

[3] Patent RU 2603054 "A method for producing proteins of the wheat cysteine protease family (triti-cum aestivum) and a protein preparation of triticain-alpha obtained by this method"

[4] Krasnyuk I.I., Tarasov V.V., Kozlova Zh.M., Ste-panova O.I., Krasnyuk (ml), II, Kugach V.V. The study of technological and physico-chemical properties of triticaine-alpha. / / Bulletin of pharmacy. 2019.No 1 (83), S. 53-57.

[5] Khadzhieva Z. D., Kuznetsov A. V., Biryukova D. V. Technological aspects of the use of excipients in the production of drugs // Fundamental research. 2012. No. 5 (2). S.436-440.

[6] T. Hess. From wet granulation to direct compression // Pharmaceutical Technologies and Packaging. 2013. No 6. C 106-109

[7] State Pharmacopoeia of the Russian Federation XIV ed. T. II. - M.: FEMB, 2018.

[8] Pharmaceutical development: concept and practical recommendations. Scientific and practical guidance for the pharmaceutical industry. -M. Pero Publishing House, 2015 .-- 472 p.

В настоящее время в качестве лабораторных смесителей для получения порошкообразных продуктов используются такие смесители, как V-образные, «пьяная бочка», смеситель с

S -образными лопастями. Подобные аппараты, работающие по принципу перемешивания материалов в двух плоскостях, широко применяются в фармацевтической промышленности для интенсивного перемешивания, диспергирования, гомогенизации и грануляции порошкообразных и сыпучих материалов с введением минимального количества связывающей жидкости или без нее. В процессе перемешивания основная задача — это обеспечение равномерного распределение действующих и вспомогательных веществ с различными физико-химическими и технологическими свойства. В процессе перемешивания присутствуют два эффекта: эффект агрегации и эффект сегрегации [1]. Спустя некоторое время с начала перемешивания между агрегацией и сегрегацией устанавливается равновесие. На это равновесие можно повлиять, используя соответствующие вспомогательные вещества.

Тритикаин-альфа - лиофилизированный рекомбинантный белок цистеиновых протеи-наз папаинового типа, полученный в соответствии с патентом RU 2603054 [2, 3]. Учитывая состояние белка, представляющего собой волокнистую структуру, его физико-химические и технологические свойства [4] вопросы однородности дозирования и качества тритикаин-альфа при разработке новой лекарственной формы - твердых капсул являются весьма актуальными. Для решения данной задачи необходимо подобрать и оценить технологические параметры процесса перемешивания тритикаин альфа со вспомогательными веществами, способными образовывать с лиофилизатом однородную, сыпучую, смесь, не расслаивающуюся в процессе смешения и дозирования [5, 6].

Материалы и методы. Образцы лиофилизированной субстанции тритикаина-альфа (тритикаин-а : маннитол : ПВП в процентном соотношении 50 : 25 : 25). Вспомогательные вещеста: МКЦ 102, Ликатаб С, стеарат магния.

Смесителе «Glatt» модели TMG, серии «Mini» (Германия). Технические характеристики смесителя: максимальная скорость - 2200 об/мин; допустимая температура окружающей среды - 10°C<Ta< 40°C±10°C; допустимая температура процесса - 10°C<Tp< 60°C; допустимая температура воздуха при входе в контейнер - 10°C<TLz< 40°C; допустимая влажность воздуха - от 25 до 75% относительной влажности.

Определение продуктов разложения белка. Метод ВЭЖХ (спектрофотометрический детектор).

Испытуемый раствор. Помещают 1 мг субстанции в пластиковую пробирку вместимостью 2 мл, прибавляют 2 мл воды и центрифугируют при скорости 10000хg в течение 5 мин. Отбирают надосадочную жидкость и хроматографируют.

Стандартный раствор субстанции готовят аналогично испытуемому раствору субстанции, используя ее стандартный образец (стандарт фирмы).

Хроматографические условия

Колонка - Symmetry 3,9x150 мм, 300 С18, 5 мкм

Подвижная фаза: 0,1% раствор трифторуксусной кислоты (Fluka, кат. №91707, Германия) (фаза А) - ацетонитрил (Panreac, кат. №221881, Испания) (фаза Б) с использованием градиентной системы элюирования со следующими параметрами: линейный градиент от 0 до 60% фазы Б и от 100 до 40% фазы А в течение 15 мин., скорость потока - 1,0 мл/мин; температура колонки - 25°С; детектор - УФ 280 нм; объем вводимой пробы - 200 мкл; время хроматогра-фирования - 15 мин.

В петлю хроматографа вводят 200 мкл испытуемого раствора субстанции. Детектор хроматографа устанавливают на 280 нм, скорость потока 1 мл/мин. Включают градиентный режим: фаза А - 100% - 1 мин; градиент от 0 % фазы Б до 60 % фазы Б за 15 мин; 60 % фазы Б - 1 мин; градиент от 60 % до 0 % фазы Б за 1 мин. Данные анализа обсчитывают с помощью встроенной программы Breeze V 3.30 C Waters, каталожный номер 667001583.

На основании этих данных рассчитывают усреднённое время удерживания Тср для каждого пика и сумму площадей пиков Sni для каждой группы пиков в каждом опыте:

Sn(a-d) =сумма Sni для 1 -й группы пиков и Sn(e-g) =сумма Sni для 2-й группы пиков, где i - пик (a-d в 1-й группе и e-g во 2-й группе), Тп(ср)=сумма Tn(a-g)/m, где n - номер опыта, m - число используемых значений времен удерживания в расчёте для каждого опыта (здесь от 2-х до 7).

Определение белка проводят спектрофотометрическим методом с раствором бицинхо-ниновой кислоты (ВСА).

Реактивы: Набор для определения белка «Bicinchoninic Acid Protein Assay Kit» (Каталожный номер BCA1, Sigma-Aldrich, США). Белковый стандарт, ампула с 1 мл раствора бычьего сывороточного альбумина (BSA) с концентрацией 1 мг/мл (Каталожный номер P0914, Sigma-Aldrich, США). Таблетки фосфатного буфера (PBS), 1 таблетка на 200 мл воды (Каталожный номер P4417, Sigma-Aldrich, США). Вода (CAS 7732-18-5) Millipore Milli-Q PLUS (R318,2 МОм^м).

Раствор А - Раствор бицинхониновой кислоты (BCA) (готовый раствор, Каталожный номер B9643, Sigma-Aldrich, США (или в составе Набора для определения белка «Bicinchoninic Acid Protein Assay Kit», Каталожные номера BCA1 и B9643, Sigma Aldrich, США)). Раствор Б - 4% раствор меди (II) сульфата пентагидрата (готовый раствор, каталожный номер C2284, Sigma-Aldrich, США (или в составе Набора для определения белка «Bicinchoninic Acid Protein Assay Kit», каталожный номер BCA1 и B9643, Sigma-Aldrich, США)). Буфер В - PBS (1 таблетку фосфатного буфера (PBS, Кат. № P4417, Sigma-Aldrich, США) растворяют в 200 мл воды).

Стандартный раствор белка - готовый раствор бычьего сывороточного альбумина (BSA) с концентрацией белка 1 мг/мл (каталожный номер P0914, SigmaAldrich, США). В соответствии с данными таблицы 1, готовят калибровочные растворы белка, которые в дальнейшем модифицируют реагентами для получения окрашенных веществ.

Приготовление модифицированного раствора для окрашивания калибровочных растворов белка (раствор Г). Смешивают 6 мл раствора А и 120 мкл раствора Б в пластиковой пробирке с крышкой. Полученный раствор стабилен в течение 24 ч при хранении при комнатной температуре. Окрашивание калибровочных растворов белка. Смешивают 30 мкл каждого раствора белка с 600 мкл раствора Г, смесь выдерживают 30 мин при 370С и проводят измерения на спектрофотометре. Окрашенные образцы калибровочных растворов помещают в кварцевую кювету и проводят измерение оптической плотности (о.е.) при длине волны 562 нм. На основании полученных данных строят калибровочный график зависимости концентрации белка (мг/мл) от поглощения при длине волны 562 нм.

Таблица 1

Калибровочные растворы белка (BSA).

№ Объём белкового стандарта с концентрацией 1 мг/мл), мл Объём буфера В, мл Конечная концентрация белка, мг/мл Примечание

1 0,2 0,8 0,2

2 0,4 0,6 0,4

3 0,5 0,5 0,5

4 0,6 0,4 0,6

5 0,8 0,2 0,8

6 1,0 1,0 Используется неразбавленным стандарт PBS

Буфер В - PBS (Каталожный номер № №P4417, раствор в 200 мл воды).

Измерение содержания белка в капсулах тритикаин-альфа. Смесь содержимого пяти капсул тритикаин-альфа растворяют в 250 мл буфера В и центрифугируют со скоростью 10000 об/мин. В каждую из 4 пробирок помещают по 30 мкл полученного белкового раствора, добавляют по 600 мкл раствора Г. Растворы выдерживают в течение 30 мин в термостате при 370С, измеряют поглощение при 562 нм. Определение содержания белка тритикаина-а в капсулах проводят по калибровочному графику.

Результаты. Изучение наиболее важных технологических характеристик — сыпучести, угла естественного откоса, насыпной плотности, рассчитанных значений индексов Карра и Хауснера - свидетельствовали о хорошей степени сыпучести тритикаина-альфа [4]. Однако для обеспечения точности дозирования лекарственного препарата, с учетом волокнистой структуры белка, потребуется введение вспомогательных веществ с целью улучшения степени сыпучести до очень хорошей либо превосходной без использования стадии гранулирования.

Смешение тритикаин -альфа и вспомогательных веществ осуществляли в смесителе «Glatt» модели TMG, серии «Mini» (Германия) при следующих режимах: скорость вращения мешалки 50 - 100 об/мин, чоппера 500 - 1000 об/мин. При этом вначале загружали МКЦ 102, как более кристаллическую смесь, и перемешивали 5 минут, затем вводили Ликатаб С и перемешивали 20 минут, добиваясь равномерного распределения. Далее в смесь при перемешивании и при увеличенные скоростей вращения (чоппера до 1000 об/мин, мешалки до 100 об/мин) вводили субстанцию -лиофилизат тритикаин-альфа, которую не подвергали предварительному измельчению и стеарат магния. Перемешивание осуществляли в смесителе в течение 5 мин, затем скорость вращения чоппера уменьшали до исходной - 500 об/мин. Перемешивание продолжали в течение 10 минут. Температура смеси за указанное время оставалась постоянной и составляла +20°C±1°C.

Принимая во внимание природу действующего вещества - рекомбинантный белок, а также отсутствие лабораторных смесителей с охлаждаемой поверхностью, проводили

перемешивание по вышеизложенной схеме с использованием охлажденных до минус 20°С±2°С смеси МКЦ 102 и Ликатаба С. Возможные продукты разложения методом ВЭЖХ и количественное содержание белка в смеси, полученной при различных температурных режимах представлены на рис. 1, 2.

Рис. 1 - Хроматограмма, отражающая характеристики (возможные продукты разложения и содержание белка) исследуемой массы для капсулирования, полученной при перемешивании

ингредиентов при температуре +20°С.

Рис.2 - Хроматограмма, отражающая характеристики (возможные продукты разложения и содержание белка) исследуемой массы для капсулирования, полученной при перемешивании отдельных ингредиентов (МКЦ 102 и Ликатаба С) при охлаждении - температуре -20°С±2°С.

Как следует из данных, приведенных на рис. 1 и 2, следов разложения рекомбинантного белка тритикаина-альфа при различных способах получения массы для капсулирования не обнаружено. Таким образом, для дальнейшее изучение технологических свойств массы для капсулированы использовали образцы, полученные при перемешивании компонентов при температуре +20°С.

Оценку качества полученной смеси проводили в соответствии требованиями ГФ XIV изд. [7, 8] по следующим показателям: однородность дозирования, сыпучесть, насыпной массы, содержания влаги.

Сыпучесть готовой для капсулирования порошкообразной массы составила 17,6±0,3 г/с, свободная насыпная плотность - 588,6±3,05 кг/м3, предельная насыпная плотность - 629,1 кг/м3; угол естественного откоса составил 25,8±0,3, индекс Карра - 6,4, содержание влаги -2,91%.

Однородность распределения теритикаина-альфа в смеси определялась методом УФ-спектрофотометрии (с использованием бицинхониновой кислоты, метод ВСА) после отбора пробы порошка из 5 различных точек смеси, последующего их растворения и центрифугирования при 12600хg. Содержание белка во всех точках смеси укладывается в диапазон 20,00±2,00 мг.

Выводы. На основании проведенных исследований установлено, что оптимальная температура перемешивания с тритикаином -альфа и вспомогательных веществ составляет +20°С±1°С при скорости вращения мешалки -100 об/мин, чоппера - 1000 об/мин с последующим снижением до 500 об/мин Полученная масса для капсулирования соответствует требованиям ГФ XIV издания.