Пути совершенствования лабораторной диагностики бешенства на территории России

2014, Т. 4, № 1

Материалы научно-практической конференции «От эпидемиологии к диагностике актуальных инфекций...»

Материалы и методы. Молодые люди 18—20 лет были двукратно привиты ЖГВ А (H5N2), А (H1N1) pdm2009 или препаратом плацебо. Образцы венозной крови и носовых секретов собирали до вакцинации (день 0), через 21 день после первой вакцинации (день 21), через 21 день после ревакцинации (день 42) и через 42 дня после ревакцинации (день 63). Для определения титров сывороточных и локальных антител использовали РТГА и иммуно-ферментный анализ. Процент вирус-специфичных CD3+CD4+IFNy+ и CD3+CD8+IFNy+ определяли методом проточной цитометрии.

Результаты. Обе ЖГВ стимулировали продукцию как сывороточных, так и локальных антител. У части непривитых людей обнаруживались пере-крестнореагирующие Т-клетки к птичьему вирусу A (H5N2). Такие же клетки к вирусу A (H1N1)pdm2009 выявлялись еще до его эпидемического распространения в 2009—2010 гг. Процент таких предсуществу-ющих клеток существенно варьировал. После первой вакцинации достоверное увеличение уровней клеток происходило к вирусу А (H5N2) у 10—20% волонтеров, к вирусу А (H1N1) — у 38—69% лиц. После ревакцинации эти цифры увеличились до 30—40% и 69—75% соответственно. Выявлена обратная зависимость между уровнями вирусспецифичных Т-клеток до и после вакцинации. Кроме того, введение ЖГВ А (H5N2) индуцировало гетеросубти-пический иммунный ответ к другому сероподтипу вируса гриппа А.

Выводы. Обе изученные вакцины — A/17/Duck/ Potsdam/86/92 (H5N2) и A/17/California/ 2009/38 (H1N1) — индуцировали гуморальный и Т-клеточ-ный иммунный ответ у волонтеров. ЖГВ A (H1N1) стимулировала продукцию вирусспецифичных CD4+ и CD8+ Т-клеток в большей степени, чем A (H5N2). Клетки иммунологической памяти, индуцированные вирусом A/17/Duck/Potsdam/86/92 (H5N2) обладали кроссреактивностью в отношении сезонного штамма A (H1N1).

ОЦЕНКА ЦИТОТОКСИЧНОСТИ И ЦИТОПАТОГЕННОСТИ ГЛИКОПРОТЕИНА КАПСУЛЫ BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI 100 НА МОДЕЛИ ПЕРЕВИВАЕМОЙ КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ

Е.В. Пименова, Н.П. Храпова

ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора

На сегодняшний день существует несколько альтернативных способов получения результатов по оценки токсичности различных соединений (химических и биологических). Одним из важных преимуществ моделей in vitro заключается в возможности работы со стандартными перевиваемыми линиями клеточных культур с известными свойствами. Модель in vitro обеспечивает хорошую воспроизводимость на всех этапах работы в связи с их однородной морфологией и характеристиками роста.

В качестве экспериментальной модели использовали культивируемые in vitro клетки линии L929, полученной из банка клеточных культур позвоночных института цитологии РАН, Санкт-Петербург). Пластины с высевами клеточных культур инкубировали в СО2-инкубаторе при 37°С, и насыщении атмосферы 5—7% СО2. Культивирование проводи-

ли в полусинтетической питательной среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной сыворотки плодов коровы, 2 mM глютамина, 4 mM пирувата натрия, пенициллин 100 ЕД/мл, стрептомицин 100 мкг/мл. Для пересева клеток использовали раствор трипси-на-версена 1:3.

Проверке цитотоксичности и цитопатогенно-сти подлежали 7 образцов формамидных экстрактов (ФЭ) В. pseudomallei 100, серии 5, 7, 16, 19, 22, 23, 24. Свежеприготовленную взвесь клеток вносили в 24-луночные пластины с концентрацией клеток в каждой лунке 1,6 х 105 в объеме 0,5 мл. Через сутки после образования плотного монослоя в опытные лунки вносили по 40 мкл одного из вариантов антигена. Время прямого контакта клеток-мишеней с антигеном составлял 3 суток; условия инкубации, как описано выше.

Ежедневно в течение срока эксперимента производили подсчет жизнеспособности, оценку роста клеток и оценку повреждения клеток в каждой лунке. После окончания опыта рассчитывали относительные показатели прироста или убывания числа клеток в популяции L929.

К концу 3 суток было зарегистрировано торможение роста популяции в лунках с антигеном серий 5, 16, 19, 24 по сравнению с контрольными лунками, что свидетельствовало об отсроченном цитопатоген-ном эффекте гликопротеина капсулы В. pseudomallei 100 этих образцов 5, 16, 19, 24 на клетки-мишени.

ПУТИ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ БЕШЕНСТВА НА ТЕРРИТОРИИ РОССИИ

Е.М. Полещук1, А.А. Девяткин2, М.В. Бекова2, В.Г. Дедков2

1ФБУН Омский НИИприродно-очаговых инфекций Роспотребнадзора

2 ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва

Бешенство включено в кодекс здоровья наземных животных и признано заболеванием, имеющим значение для международной торговли (OIE). Оно входит в пятерку инфекционных болезней, общих для человека и животных, наносящих наибольший экономический ущерб, является серьезной проблемой общественного здравоохранения (WHO). В этих условиях решающую роль играет быстрая и надежная лабораторная диагностика. Бешенство — зооноз, для которого методы диагностики стандартизированы на международном уровне.

На территории России диагностику инфекции определяют ГОСТ 26075-84 и МУ от 14 мая 1997 г., включающие методы: МФА, ИФА, гистологический (обнаружение телец Негри), реакция преципитации, биопроба. Наибольшее распространение в лабораторной практике получили МФА, ИФА, биопроба.

Случайное использование молекулярно-генети-ческих методов, при подтверждении диагноза у людей больных энцефалитом неясной этиологии, позволило констатировать бешенство в трех случаях, дополнительно к данным официальной статистики (Леонова и др., 2009; Дедков и др., 2014), что позже было подтверждено стандартными методами. Эти факты указывают на несомненную роль в диагностике бешенства молекулярно-генетических методов, рекомендованных ВОЗ, в качестве дополнительных.

Материалы научно-практической конференции «От эпидемиологии к диагностике актуальных инфекций...»

Инфекция и иммунитет

Ретроспективная расшифровка случаев заболеваний бешенством людей является основанием для совершенствования лабораторной диагностики и оптимизации надзорных мероприятий.

Использование ПЦР в лабораторной диагностике требует стандартизированного, сертифицированного набора реагентов для выявления РНК. С этой целью авторами разработана тест-система для выявления РНК вируса бешенства методом ПЦР в формате real-time. Эффективность ее работы подтверждена на полевом материале (n = 128), полученном от разных видов животных, содержащем вирусы 4-х филогрупп классического вида (n = 50), выявленные на территории России. Вирусы детектированы и идентифицированы ранее в МФА, ИФА, биопробе, ПЦР с форезной детекцией с использованием сек-венирования. Диагностическая чувствительность системы составила 100%, аналитическая специфичность — 100%.

В дальнейшем, следует рассмотреть вопрос о необходимости обязательного исследования на лисса-вирусы материала от людей, погибших от энцефалита неясной этиологии, методом ПЦР.

ЗАБОЛЕВАНИЯ ВЕРХНИХ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ У ДЕТЕЙ В НИЖЕГОРОДСКОЙ ОБЛАСТИ

А.А. Пономарева1, Т.М. Конышкина1, С.В. Кононова1, Н.Н. Чеснокова1, Е.В. Алакаева1, И.В. Жданович1

ГБОУ ВПО Нижегородская государственная медицинская академия МЗ РФ

В ходе проведенного исследования ретроспективно были проанализированы истории болезни 383 пациентов с острым синуситом и 219 пациентов с внебольничной пневмонией, получавших лечение в детской больнице в 2010 и 2012 гг.

В ЛОР отделении детской больницы находились на лечении дети с различными клиническими формами острого синусита: отечно-катаральная форма — 67%; гнойный синусит — 5%; гемисинусит — 5%; пансинусит — 23%.

При анализе историй болезни детей с внеболь-ничной пневмонией выяснилось, что у 86% пациентов имело место заболевание средней степени тяжести, а у 14% наблюдалось тяжелое течение болезни.

Бактериологические исследования проводились с целью выявления бактериального агента, а также его вида для принятия решения о назначении необходимого антибиотика или смене неэффективного препарата.

а) Острый синусит. В 2012 г. бактериологический анализ при остром синусите проводился в 47,5% случаев, что всего лишь на 2,24% больше, чем в 2010 г., причем в 98% случаев бактериологический анализ проводился уже после того, как пациент начинал получать АБТ. Положительные результаты бактериологического анализа были получены лишь в 28% случаев, в 72% случаев результаты оказались отрицательными. Выявлены следующие возбудители заболевания: Streptococcus epidermidis (S. epider-midis) — в 40 случаях, S. aureus — в 4 случаях, S.pneumoniae — в 3 случаях, Haemophylus influenzae, бактерии рода Enterobacter и Klebsiella — встречались в единичных случаях.

б) Внебольничная пневмония. Бактериологический анализ при лечении внебольничных пневмоний в 2012 г. проводился лишь у 27 пациентов из 219,

что составило 12%. Это на 23% меньше, чем в 2010 г. Таким образом, проведение бактериологического анализа в 2012 г. сократилось, по сравнению с 2010 г. Результаты оказались положительными в 20 случаях (74%) из 27. Выявленные возбудители заболевания: P. aeruginosa, бактерии рода Klebsiella, грибы рода Candida, бактерии рода Enterobacter, бактерии рода Acinetobacter, S. pyogenes, S. pneumoniae, S. aureus, B. catarrhalis встречались одинаково часто.

ФОРМИРОВАНИЕ ОЧАГОВ ЛИХОРАДКИ ЗАПАДНОГО НИЛА В УРБАНИЗИРОВАННЫХ БИОЦЕНОЗАХ САРАТОВА

А.М. Поршаков, С.А. Яковлев, К.С. Захаров

ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», г. Саратов

В настоящее время для многих стран мира актуальной является проблема расширения нозоа-реала лихорадки Западного Нила (ЛЗН). Ключевую роль в трансмиссивной передаче и сохранении ВЗН играют кровососущие комары. Исследования осуществляли с сентября по ноябрь 2013 г. в закрытых биотопах (подвалы, подъезды многоэтажных домов) в районах эпидемических проявлений ЛЗН на территории Саратова. В ходе исследования были проведены учеты численности имаго и личинок комаров Culex pipiens. Установлена высокая численность переносчиков: в подвалах — от 10 до 800 экз. на 1 м2, в подъездах — от 1 до 30 экз. Численность личинок в затопленных подвалах составила от 600 до 3800 экз.

на 1 м2.

В подвалах и подъездах многоэтажных домов со стен и потолков было собрано 9317 экземпляров комаров. Для исследования было сформировано 186 проб, из них антигены ВЗН выявлены в 3 пробах, что составляет 1,6%. За период работы было собрано 6800 экз. личинок, объединенных в 136 проб. Из этого количества в 5 пробах (3,7%) были выявлены антигены ВЗН.

Для изучения вылета выплаживающихся комаров в затопленном подвале был использован стационарный имагоуловитель (для отлова вылетающих амфибиотических насекомых). Его нижняя рамка (площадью 0,5 м2) устанавливалась на дно затопленной части подвала, боковые стенки из плотной ткани препятствовали двухсторонней миграции личинок. Ловушка сконструирована так, что выплодившиеся из куколок комары остаются внутри имагоуловителя и не имеют возможности разлета и питания, а также препятствует попаданию насекомых извне. Для исследования из выплодившихся имаго было сформировано 49 проб. Антигены ВЗН были выявлены в 4 пробах (8,2%).

Таким образом, в результате обследования урбанизированных биоценозов Саратова выяснили, что в затопленных теплых подвалах многоэтажных домов складываются оптимальные микроклиматические условия для круглогодичного развития всех стадий комаров. В таких условиях возможно формирование стойких микроочагов ЛЗН. В процессе проведенных исследований была выявлена трансовари-альная и трансфазовая передача ВЗН в популяции комара C. pipiens. Автогенно размножающиеся самки подвальных комаров этого вида вполне могут обеспечивать сохранение вируса в межэпидемический период в урбанизированных биоценозах.