АНТИТЕЛА ПРОТИВ ANG-2, СОДЕРЖАЩИЕ ТОЛЬКО ТЯЖЕЛУЮ ЦЕПЬ
ANTIBODIES AGAINST ANG-2 CONTAINING ONLY HEAVY CHAIN

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительным патентным заявкам США 62/198518 от 29 июля 2015 г. и 62/205185 от 14 августа 2015 г., полное описание которых включено в настоящий документ посредством ссылки.
Уровень техники
[0002] Ангиогенез - образование новых кровеносных сосудов из ранее существовавшей сосудистой сети - является основным компонентом нескольких заболеваний сосудов сетчатки, вызывающих слепоту, например, ретинопатии недоношенных, пролиферативной диабетической ретинопатии, диабетического отека макулы и возрастной макулофистрофии. Неоваскуляризация глаза представляет собой патологическое или чрезмерное образование кровеносных сосудов в глазу. Показано, что неоваскуляризация глаза имеет значение как при диабетической ретинопатии, так и при макулодистрофии.
[0003] Возрастная макулодистрофия (ВМД) является основной причиной слепоты у пожилых людей; различают сухую и влажную формы ВМД. Сухая (или неэкссудативная) форма включает как атрофические, так и гипертрофические изменения пигментного эпителия сетчатки (RPE). Сухая форма характеризуется образованием друз в области макулы, которые представляют собой пигментированные области, содержащие мертвые клетки и продукты метаболизма, деформирующие сетчатку и в конечном итоге приводящие к потере остроты зрения. Неэкссудативная (сухая) форма ВМД может прогрессировать до влажной (или экссудативной или неоваскулярной) ВМД, при которой под сетчаткой развиваются патологические хориоидальные неоваскулярные мембраны (CNVM), происходит утечка жидкости и крови, и в конечном счете при отсутствии лечения в течение относительно короткого периода времени формируется дисковидный рубец, приводящий к потере центрального зрения. Хориоидальная неоваскуляризация (CNV), представляющая собой рост новых кровеносных сосудов из капиллярной сети хориоидеи через область контакта базальной пластинки/RPE в нервный слой сетчатки, приводит к отслоению сетчатки, субретинальному и интраретинальному отеку и рубцеванию.
[0004] Диабет может оказывать воздействие на глаза различными путями. Диабетическая ретинопатия (ДР) является осложнением диабета в результате повреждения кровеносных сосудов светочувствительной ткани в задней части глаза (сетчатки). Вначале диабетическая ретинопатия может проходить бессимптомно или вызывать лишь легкие проблемы со зрением. Однако в конечном итоге диабетическая ретинопатия может привести к слепоте. Диабетический отек макулы (DME) представляет собой отек сетчатки при сахарном диабете из-за утечки жидкости из кровеносных сосудов в области макулы.
Сущность изобретения
[0005] В настоящем документе описаны моноспецифические антитела, содержащие только тяжелую цепь (HCAb), обладающие специфичностью по отношению к ANG-2, и биспецифические антитела, обладающие специфичностью по отношению к ANG-2 и ТФР или ФРЭС.
[0006] Так, в некоторых вариантах реализации описаны антитела, содержащие только тяжелую цепь (HCAb) с антигенсвязывающей специфичностью по отношению к ANG-2. В некоторых вариантах реализации HCAb содержит аминокислотную последовательность VH SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 или SEQ ID NO: 24.
[0007] В других вариантах реализации области, определяющие комплементарность (CDR) HCAb, содержат SEQ ID NO:12, 14 и 16. В других вариантах реализации CDR HCAb содержат SEQ ID NO:26, 27 и 28. В других вариантах реализации CDR HCAb содержат SEQ ID NO:29, 30 и 31. В других вариантах реализации CDR HCAb содержат SEQ ID NO:32, 33 и 34. В других вариантах реализации CDR HCAb содержат SEQ ID NO:35, 36 и 37.
[0008] Кроме того, в настоящем документе описаны HCAb с антигенсвязывающей специфичностью по отношению к ANG-2, в которых CD1 содержит последовательность GFTFSSYW (SEQ ID NO: 12) и в которых одна, две, три, четыре или все аминокислоты в положениях 1, 3, 4, 5, 6 замещены любой аминокислотой. В других вариантах реализации одна, две, три, четыре или все аминокислоты в положениях 1, 3, 4, 5, 6 замещены консервативной аминокислотой. В других вариантах реализации одна, две, три, четыре или все аминокислоты в положениях 1, 3, 4, 5, 6 замещены аминокислотой того же класса.
[0009] Кроме того, в настоящем документе описаны HCAb с антигенсвязывающей специфичностью по отношению к ANG-2, в которых CD2 содержит последовательность INSDGSST (SEQ ID NO: 14) и в которых одна, две, три, четыре или все аминокислоты в положениях 1, 3, 6, 7 или 8 замещены любой аминокислотой. В других вариантах реализации одна, две, три, четыре или все аминокислоты в положениях 1, 3, 6, 7 или 8 замещены консервативной аминокислотой. В других вариантах реализации одна, две, три, четыре или все аминокислоты в положениях 1, 3, 6, 7 или 8 замещены аминокислотой того же класса.
[0010] Кроме того, в настоящем документе описаны HCAb с антиген-связывающей специфичностью по отношению к ANG-2, в которых CD3 содержит последовательность AREGYSSGGQFDY (SEQ ID NO: 16) и в которых одна, две или все аминокислоты в положениях 1, 10 или 11 замещены любой аминокислотой. В других вариантах реализации одна, две или все аминокислоты в положениях 1, 10 или 11 замещены консервативной аминокислотой. В других вариантах реализации одна, две или все аминокислоты в положениях 1, 10 или 11 замещены аминокислотой того же класса.
[0011] Кроме того, в настоящем документе описаны гуманизированные антитела или антитела человека, конкурирующие за связывание с ANG-2 с VH-областями HCAb A33A8, A1G2, A1F8, А2В6 или A1B1.
[0012] В некоторых вариантах реализации предложены биспецифические антитела, обладающие первой антигенсвязывающей специфичностью по отношению к ANG-2, и второй антигенсвязывающей специфичностью по отношению к ФРЭС. В других вариантах реализации первая антигенсвязывающая специфичность представлена A33A8, A1G2, A1F8, A2B6 или A1B1 или их VH-доменом. В других вариантах реализации вторая антигенсвязывающая специфичность представлена бевацизумабом или его VH- или VL-областью. В некоторых вариантах реализации вторая антигенсвязывающая специфичность представлена ранибизумабом или его VH- или VL-областью.
[0013] Кроме того, описаны биспецифические антитела, обладающие первой антигенсвязывающей специфичностью по отношению к ANG-2, и второй антигенсвязывающей специфичностью по отношению к ТФР. В некоторых вариантах реализации первая антигенсвязывающая специфичность представлена A33A8, A1G2, A1F8, A2B6 или A1B1 или их VH-доменом. В других вариантах реализации вторая антигенсвязывающая специфичность представлена HCAb P36F3.
[0014] Кроме того, в настоящем документе описаны способы лечения офтальмологических расстройств, включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, HCAb, содержащего VH-область, описанного в настоящем документе, или биспецифического антитела, описанного в настоящем документе.
[0015] Кроме того, в настоящем документе описано применение HCAb, содержащего VH-область, описанного в настоящем документе, или биспецифического антитела, описанного в настоящем документе, при получении лекарственного средства для лечения офтальмологического расстройства у субъекта, нуждающегося в этом.
[0016] В некоторых вариантах реализации офтальмологическое расстройство выбрано из группы, состоящей из сухой (неэкссудативной) возрастной макулодистрофии, влажной (экссудативной или неоваскулярной) возрастной макулодистрофии, хориоидальной неоваскуляризации (CNV), кистозного отека макулы (СМЕ), хориоидальной неоваскуляризации, ассоциированной с миопией, сосудистых полос сетчатки, диабетического отека макулы (DME), отека макулы, окклюзии вен сетчатки, аномального ангиогенеза в роговице, крыловидной плевы конъюнктивы, субретинального отека или интраретинального отека. В некоторых вариантах реализации аномальный ангиогенез в роговице обусловлен кератитом, пересадкой роговицы, керапластикой или гипоксией.
Краткое описание чертежей
[0017] На фиг. 1А изображен локус иммуноглобулина человека у трансгенной мыши HCAb (Harbor Antibodies). На фиг. 1В изображена структура антитела HCAb, продуцируемого HCAb-мышью.
[0018] На фиг. 2A-E изображены несколько форм биспецифических антител, в том числе одиночный VH-домен (фиг. 2A); биспецифические HCAb-антитела (фиг. 2B и 2C); тетрамерное антитело/VH-биспецифические антитела (фиг. 2D); биспецифические Fab/VH-антитела (фиг. 2E). Второй антигенсвязывающий домен изображен в виде овала. Необязательные положения для второго антигенсвязывающего домена обозначены звездочками.
[0019] На фиг. 3 изображена структура гена гуманизированного HCAb, описанного в настоящем документе.
е
[0020] На фиг. 4 изображено специфическое связывание HCAb человека A33A8 против ANG-2 с использованием системы fortéBio OCTET QK, оснащенной захватывающим наконечником для биосенсора с антителами против Fc IgG человека и биосенсорами, покрытыми стрептавидином. Данные обрабатывали и анализировали с помощью программного обеспечения OCTET 6.4 для анализа данных.
[0021] На фиг. 5 изображены результаты хемилюминесцентного твердофазного ИФА, позволяющего обнаруживать связывание комплексов, образованных серийными разведениями HCAb человека A33A8 против ANG-2 и ANG-2, с Tie-2.
[0022] На фиг. 6 изображен анализ связывания на основе целых клеток, в котором HCAb человека A33A8 против ANG-2 полностью блокировало связывание ANG-2 с рецептором Tie-2, сверхэкспрессируемым на клетках НЕК293.
[0023] На фиг. 7A-D изображены гели для электрофореза в ПААГ, окрашенные Кумасси голубым: фиг. 7A - A33A8 (средняя полоса) и биспецифическое HCAb-антитело A33A8/P36F3 (P36F3 представляет собой HCAb, специфичное по отношению к ТФР) в формате, представленном на фиг. 2B; фиг. 7B - отдельная область A33A8; фиг. 7C - биспецифическое антитело A33A8/бевацизумаб с формате, представленном на фиг. 2D; фиг. 7D - биспецифическое антитело A33A8/ранибизумаб в формате, представленном на FIG. 2E.
e
[0024] На фиг. 8 изображено связывание VH A33A8 с использованием системы fortéBio OCTET QK.
[0025] На фиг. 9 изображен анализ профиля связывания биспецифического HCAb-антитела A33A8/P36F3 (см. фиг. 2B).
e
[0026] На фиг. 10 изображено связывание IgG A33A8 VH/ранибизумаб (см. фиг. 2D) с использованием системы fortéBio OCTET QK.
[0027] На фиг. 11 изображен гель для электрофореза в ПААГ с биспецифическим Fab-фрагментом A33A8/ранибизумаб, окрашенный Кумасси голубым.
Подробное описание изобретения
[0028] В настоящем документе описаны моноспецифические антитела, содержащие только тяжелую цепь (HCAb), обладающие специфичностью по отношению к ANG-2, и биспецифические антитела, обладающие специфичностью по отношению к ANG-2 и ТФР или ФРЭС.
[0029] Ангиопоэтины человека-1 и -2 (ANG-1 и ANG-2 UniProtKB - O15123 (ANGP2_HUMAN]; SEQ ID NO:1; альтернативные сокращения ANGPT2 или ANG2)) были открыты в качестве лигандов Tie - семейства тирозинкиназ, селективно экспрессирующихся в эндотелии сосудов. Семейство антиопоэтинов включает четыре точно определенных члена. Ангиопоэтин-3 и -4 (ANG-3 и ANG-4) могут представлять собой широко дивергировавшие аналоги одного и того же генного локуса у мыши и человека. ANG-1 и ANG-2 первоначально были выявлены в экспериментах на культурах клеток как агонист и антагонист, соответственно. Все известные ангиопоэтины связываются в первую очередь с Tie-2. ANG-1 поддерживает выживаемость эндотелиальных клеток (EC) и способствует целостности эндотелия, в то время как ANG-2 оказывал противоположный эффект и способствовал дестабилизации и регрессии кровеносных сосудов в отсутствие факторов выживания ФРЭС или основного фактора роста фибробластов. Однако многие исследования функции ANG-2 показали, что ситуация является более сложной. ANG-2 может быть комплексным регулятором ремоделирования сосудов, который играет определенную роль как в прорастании, так и в регрессии сосудов. Подтверждая такую роль ANG-2, анализ экспрессии показывает, что при прорастании сосудов у взрослых ANG-2 быстро индуцируется совместно с ФРЭС, в то время как при регрессии сосудов ANG-2 индуцируется в отсутствие ФРЭС. В соответствии с контекстно зависимой ролью, ANG-2 специфически связывается с теми же эндотелий-специфическими рецепторами Tie-2, которые активирует ANG-1, но при активации оказывает контекстно зависимое воздействие.
[0030] ANG-1 и ANG-2 оказывают аналогичное влияние в анализах ангиогенеза в роговице, действуя синергично с ФРЭС и стимулируя рост новых кровеносных сосудов. При высокой концентрации ANG-2 действует как фактор выживания эндотелиальных клеток при апоптозе, вызванном отсутствием сыворотки, за счет активации Tie-2 через киназу PI-3 и путь Akt.
[0031] Считается, что роль ANG-1 консервативна у взрослых индивидов, где он конститутивно экспрессируется во всем организме. В противоположность этому экспрессия ANG-2 главным образом ограничена областями ремоделирования сосудов, где он, согласно представлениям, блокирует конститутивную стабилизирующую или способствующую созреванию функцию ANG-1, обеспечивая возвращение и стабилизацию пластического состояния сосудов, в котором они могут быть более чувствительными к сигналам прорастания.
[0032] ANG-2 экспрессируется во время развития в областях, где происходит ремоделирование кровеносных сосудов. У взрослых индивидов экспрессия ANG-2 ограничивается областями ремоделирования сосудов, а также опухолями с высокой степенью васкуляризации. ANG-2 необходим для постнатального ангиогенеза. Запрограммированная в ходе развития регрессия сосудистой системы стекловидного тела не происходит у мышей с нокаутом ANG-2, и кровеносные сосуды их сетчатки не могут прорастать из центральной артерии сетчатки. Делеция ANG-2 приводит к значительным дефектам формирования и функции лимфатической сосудистой сети. Генетическая компенсация за счет ANG-1 исправляет дефекты лимфомы лимфатической системы, но не ангиогенеза.
[0033] Таким образом, в настоящем документе описаны моноспецифические и биспецифические HCAb-антитела против ANG-2 и способы лечения офтальмологических расстройств с применением описанных антител.
[0034] Антитела для лечения заболеваний широко известны в данной области техники. В настоящем документе термин «антитело» относится к мономерному или мультимерному белку, содержащему одну или более из полипептидных цепей, содержащих антигенсвязывающие сайты. Антитело специфически связывается с антигеном и может модулировать биологическую активность антигена. В настоящем документе термин «антитело» может включать «полноразмерное антитело» и «фрагменты антител». Термины «сайт связывания» или  «антигенсвязывающий сайт» в настоящем документе обозначают область(и) молекулы антитела, с которыми фактически связывается лиганд. Термин «антигенсвязывающий сайт» включает вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела и вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела.
[0035] Специфичность антитела относится к селективному распознаванию антителом конкретного эпитопа антигена. Естественные антитела, например, являются моноспецифическими. Термин «моноспецифическое» антитело в настоящем документе обозначает антитело, содержащее один или более из сайтов связывания, каждый из которых связывается с одним и тем же эпитопом одного и того же антигена. Одновалентные моноспецифические антитела, описанные в настоящем документе, специфичны по отношению к ANG-2.
[0036] Термин «биспецифические антитела» относится к антителам, обладающим двумя различными антигенсвязывающими специфичностями. Биспецифические антитела, описанные в настоящем документе, специфичны по отношению к ANG-2 и ФРЭС или ТФР.
[0037] В настоящем документе термин «валентный» обозначает наличие указанного количества сайтов связывания в молекуле антитела. Таким образом, термины "двухвалентный", "четырехваленный" и "шестивалентный" указывают на наличие двух сайтов связывания, четырех сайтов связывания и шести сайтов связывания, соответственно, в молекуле антитела. Биспецифические антитела, описанные в настоящем документе, являются «двухвалентными». Однако моноспецифические двухвалентные антитела, в которых два антигенсвязывающих сайта связывают один и тот же антиген, входят в рамки настоящего изобретения. Антигенсвязывающие сайты моноспецифических двухвалентных антител могут связывать один и тот же эпитоп или различные эпитопы антигена.
[0038] В настоящем документе под «полноразмерным антителом» подразумевают структуру, представляющую собой естественную биологическую форму антитела, содержащую вариабельные и константные области. Например, у большинства млекопитающих, включая человека и мышь, полноразмерное антитело класса IgG представляет собой тетрамер и состоит из двух идентичных пар двух цепей иммуноглобулинов, причем каждая пара содержит одну легкую и одну тяжелую цепь, каждая легкая цепь содержит иммуноглобулиновые домены VL и CL, а каждая тяжелая цепь содержит иммуноглобулиновые домены VH, CH1, CH2 и CH3. У некоторых млекопитающих, например, верблюдов и лам IgG-антитела состоят лишь из двух тяжелых цепей (HCAb), каждая тяжелая цепь состоит из вариабельного домена, присоединенного к Fc-области (доменам СН2 и СН3).
[0039] Структурная единица естественного антитела обычно содержит тетрамер. Каждый тетрамер обычно состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, причем каждая пара содержит одну «легкую» цепь (молекулярная масса которой обычно составляет приблизительно 25 кДа) и одну тяжелую цепь (молекулярная масса которой обычно составляет приблизительно 50-70 кДа). Каждая из легких и тяжелых цепей состоит из двух отдельных областей, называемых вариабельной и константной областями. У иммуноглобулинов класса IgG тяжелая цепь состоит из четырех иммуноглобулиновых доменов, связанных от N-конца к C-концу в порядке VH-CH1-CH2-CH3, что означает вариабельный домен тяжелой цепи, 1 константный домен тяжелой цепи, 2 константный домен тяжелой цепи и 3 константный домен тяжелой цепи, соответственно (или VH-Cγ1-Cγ2-Cγ3, что означает вариабельный домен тяжелой цепи, 1 константный гамма-домен, 2 константный гамма-домен и 3 константный гамма-домен, соответственно). Легкая цепь IgG состоит из двух иммуноглобулиновых доменов, связанных от N- к C-концу в порядке VL-CL, что означает вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи, соответственно. Константные области характеризуются меньшим разнообразием последовательности и отвечают за связывание ряда природных белков, которое вызывает важные биохимические явления.
[0040] Вариабельная область антитела содержит антигенсвязывающие детерминанты молекулы и, таким образом, определяет специфичность антитела по отношению к его антигену-мишени. Вариабельная область носит такое название, поскольку ее последовательность в наибольшей степени отличается от других антител этого же класса. В вариабельной области собраны три петли для каждого из V-доменов тяжелой цепи и лёгкой цепи, образующие антигенсвязывающий сайт. Каждая из этих петель называется областью, определяющей комплементарность (далее «CDR»), в пределах которой изменчивость аминокислотной последовательности наиболее значительна. Всего есть шесть CDR, по три CDR для тяжелой и легкой цепей, обозначаемые как CDR1 VH, CDR2 VH, CDR3 VH, CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL. Вариабельную область за пределами CDR называют каркасной (FR) областью. Хотя FR-области не так разнообразны, как CDR, в FR-области различных антител наблюдается изменчивость последовательности. В целом эта характерная архитектура антител образует стабильной каркас (FR-область), позволяющий иммунной системе использовать значительное разнообразие антигенсвязывающих структур (CDR) для формирования специфичности по отношению к широкому спектру антигенов.
[0041] Гены, кодирующие локусы иммуноглобулинов, содержат несколько последовательностей V-области наряду с более короткими нуклеотидными последовательностями, обозначаемыми буквами «D» и «J», и именно комбинация нуклеотидных последовательностей V, D и J порождает разнообразие VH-областей.
[0042] Антитела подразделяются на классы, также называемые изотипами, генетически определяемые константной областью. Константные области легких цепей человека подразделяются на каппа- (Сκ) и лямбда- (Сλ) легкие цепи. Тяжелые цепи подразделяются на мю (μ), дельта (δ), гамма (γ), альфа (α) или эпсилон (ε) и определяют изотип антитела Ig M, IgD, IgG, IgA и IgE, соответственно. Антитела класса IgG наиболее часто применяют в терапевтических целях. У человека этот класс включает подклассы IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. У мыши этот класс включает подклассы IgG1, IgG2a, IgG2b и IgG3. IgM включает несколько подклассов, в том числе IgM1 и IgM2, но не ограничивается ими. IgА включает несколько подклассов, в том числе IgA1 и IgA2, но не ограничивается ими. Таким образом, термин «изотип» в настоящем документе означает любой класс или подкласс иммуноглобулинов, заданный химическими и антигенными характеристиками их константных областей. Известные изотипы иммуноглобулинов человека представляют собой IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM1, IgM2, IgD и IgE. Описанные HCAb-антитела и биспецифические антитела могут содержать константные области, полностью или частично соответствующие вышеописанным изотипам.
2
[0043] Кроме того, в рамки настоящего изобретения входят фрагменты антител, включая (i) Fab-фрагмент, содержащий VL, CL, VH и CH1-домены, (ii) Fd-фрагмент, содержащий VH и CH1-домены, (iii) Fv-фрагмент, содержащий VL и VH-домены одного антитела; (iv) dAb-фрагмент, содержащий единственную вариабельную область, (v) выделенные CDR-области, (vi) F(ab')-фрагмент, двухвалентный фрагмент, содержащий два соединенных Fab-фрагмента, и (vii) одноцепочечную Fv-молекулу (scFv), где VH-домен и VL-домен соединены пептидным линкером, обеспечивающим объединение двух доменов с образованием антигенсвязывающего сайта, но не ограничиваясь ими. В некоторых вариантах реализации антитела продуцируют методиками рекомбинантных ДНК. В дополнительных вариантах реализации антитела продуцируют ферментативным или химическим расщеплением природных антител.
[0044] Под «гуманизированным» антителом в настоящем документе понимают антитело, содержащее каркасную область (FR) человека и одну или более из областей, определяющих комплементарность (CDR), из антитела нечеловеческого происхождения (обычно мыши или крысы). Антитело нечеловеческого происхождения, из которого получают CDR, называют «донорным», а иммуноглобулин человека, из которого получают каркас, называют «акцепторным». В некоторых вариантах реализации гуманизация главным образом основана на пересадке донорных CDR на акцепторные VL и VH-каркасные области (человека). Эту стратегию называют «пересадкой CDR». Для восстановления сродства, теряющегося в первоначальном конструкте после пересадки, часто требуется «обратная мутация» отдельных акцепторных каркасных остатков в соответствующие донорные остатки. Гуманизированные антитела также содержат по меньшей мере фрагмент константной области иммуноглобулина, обычно иммуноглобулина человека, и, таким образом, обычно содержат Fc-область человека. Гуманизация или другие способы снижения иммуногенности вариабельных областей антитела нечеловеческого происхождения могут включать способы модификации поверхности. В одном варианте реализации для гуманизации и/или созревания сродства вариабельных областей антитела, т.е. увеличения сродства вариабельной области к ее антигену-мишени можно использовать способы на основе отбора. Другие способы гуманизации могут включать пересадку лишь фрагментов CDR, включая способы, описанные в патенте США 6797492, включенном в настоящий документ посредством ссылки в отношении всей описанной в нем информации о пересадке CDR, но не ограничиваясь ими. Для гуманизации и созревания сродства можно использовать структурные способы, например, описанные в патенте США 7117096, включенном в настоящий документ посредством ссылки в отношении всей описанной в нем информации о гуманизации и созревании сродства.
[0045] В различных вариантах реализации, описанных в настоящем документе, антитела представляют собой антитела, содержащие только тяжелые цепи (HCAb). У верблюдовых (верблюдов, дромедаров и лам), помимо обычных антител, содержащих тяжелые и легкие цепи (2 легких цепи и 2 тяжелые цепи в составе одного антитела), есть одноцепочечные антитела (содержащие только тяжелые цепи) (см. фиг. 1B). Они кодируются отдельным набором VH-сегментов, называемых VHH-генами. VH и VHH содержатся в геноме вперемежку (т.е. они смешаны друг с другом). Выявление идентичного D-сегмента в кДНК VH и VHH указывает на совместное использование D-сегмента VH и VHH. В природных VHH-содержащих антителах полностью отсутствует CH1-домен константной области тяжелой цепи. Экзон, кодирующий CH1-домен, присутствует в геноме, но удаляется при сплайсинге из-за потери последовательности функционального акцепторного сайта сплайсинга с 5'-стороны экзона CH1. В результате VDJ-область в ходе сплайсинга присоединяется к экзону CH2. При рекомбинации VHH с такими константными областями (CH2, CH3) образцется антитело, действующее как одноцепочечное антитело (т.е. антитело из двух тяжелых цепей, не взаимодействующих с легкими цепями). Связывание антигена отличается от связывания, наблюдаемого у обычных антител, однако при этом достигается высокое сродство за счет гипермутирования вариабельной области и отбора клеток, экспрессирующих такие антитела с высоким сродством.
[0046] В типичном варианте реализации описанные HCAb продуцируют путем иммунизации трансгенной мыши, у которой исключена экспрессия эндогенных антител мыши и введены трансгены человека (см. фиг. 1A). HCAb мыши описаны в патентах US8883150, US8921524, US8921522, US8507748, US8502014, US 2014/0356908, US2014/0033335, US2014/0037616, US2014/0356908, US2013/0344057, US2013/0323235, US2011/0118444 и US2009/0307787, все из которых включены в настоящий документ в качестве ссылок в отношении всей описанной в них информации об антителах, содержащих только тяжелую цепь, и их продукции у трансгенных мышей. HCAb-мышей иммунизировали и полученные примированные клетки селезенки сливали с клетками миеломы мыши с образованием гибридом. Затем полученное HCAb можно сделать полностью человеческим, заменив СН2 и CH3-области мыши последовательностями человека.
[0047] Кроме того, в настоящем документе описаны бифункциональные антитела, в которых два антигенсвязывающих домена соединены с образованием одной биспецифической молекулы. Бифункциональные антитела могут принимать различные формы, включая (i) биспецифические Fv-фрагменты (фиг. 2A); (ii) HCAb, содержащие первую специфичную структуру, связанную со вторым VH-доменом, содержащим вторую специфичную структуру (фиг. 2B и 2C); (iii) тетрамерные моноклональные антитела, содержащие первую специфичную структуру, связанную со вторым VH-доменом, содержащим вторую специфичную структуру, причем второй VH-домен связан с первым VH-доменом (фиг. 2D); и (iv) Fab-фрагменты (VH-CH1/VL/CL), содержащие первую специфичную структуру, связанную со вторым VH-доменом, содержащим вторую специфичную структуру (фиг. 2E-2F). Типичные Fab-фрагменты изображены на фиг. 2E, где вторая VH-последовательность, содержащая вторую специфичную структуру, связана с C-концом или N-концом первого VH-домена или C-концом или N-концом первого CH1- или первого CL-домена. В дополнительных вариантах реализации, также изображенных на фиг. 2E, VH-последовательности, содержащие вторую и/или третью специфичную структуру, могут быть связаны с C-концом или N-концом первого VH-домена или C-концом или N-концом первого CH1- или первого CL-домена.
n
[0048] Биспецифические антитела могут содержать линкерные последовательности, соединяющие последовательность ANG-2-специфического антитела, например, A33A8, с VH-областью, содержащей вторую специфичную структуру, что обеспечивает надлежащий фолдинг последовательностей с получением желательной трехмерной конформации и профилей связывания антигена. Подходящие линкеры включают EPKSCD (SEQ ID NO:2), ASTKGP (SEQ ID NO:3) и (GGGGS) (SEQ ID NO:4), где n - целое число между 0 и 8, но не ограничиваются ими. В одном варианте реализации n равно 1.
[0049] Биспецифические антитела, описанные в настоящем документе, являются двухвалентными и содержат первую структуру, специфичную по отношению к ANG-2, а вторая специфичная структура может обладать специфичностью по отношению к фактору роста эндотелия сосудов (ФРЭС, VEGF) и тромбоцитарному фактору роста (ТФР, PDGF), но не ограничивается ими. В рамки настоящего изобретения входят биспецифические антитела, в которых первая и вторая специфические структуры независимо обладают специфичностью по отношению к ANG-2, ФРЭС или ТФР, причем единственным ограничением является то, что первая и вторая специфичные структуры не могут обладать специфичностью по отношению к одному и тому же соединению.
[0050] Семейство ФРЭС (VEGF) у млекопитающих включает пять членов: ФРЭС-A, фактор роста плаценты (ФРП), ФРЭС-B, ФРЭС-C и ФРЭС-D. Все члены семейства ФРЭС стимулируют клеточные реакции, связываясь с тирозинкиназными рецепторами (VEGFR) на поверхности клеток, вызывая их димеризацию и активируя их посредством трансфосфорилирования, однако различаются по сайтам, времени и степени трансфосфорилирования. Рецепторы ФРЭС содержат внеклеточный фрагмент, состоящий из 7 иммуноглобулин-подобных доменов, одну трансмембранную область и внутриклеточный фрагмент, содержащий разделенный тирозинкиназный домен. ФРЭС-A связывается с VEGFR1 (Flt-1) и VEGFR2 (KDR/Flk-1). VEGFR2, по-видимому, опосредует почти все известные клеточные реакции в ответ на ФРЭС. Функции рецептора VEGFR1 определены менее чётко (хотя полагают, что он модулирует сигналы VEGFR2). Ещё одна функция VEGFR1 — он может выступать как «пустой» рецептор/рецептор-ловушка, изолируя белок ФРЭС от связывания с VEGFR2 (что представляется особенно важным при васкулогенезе в зародыше). ФРЭС-C и ФРЭС-D, но не ФРЭС-A, являются лигандами третьего рецептора (VEGFR3/Flt4), опосредующего лимфоангиогенез. Этот рецептор (VEGFR3) представляет собой сайт связывания основных лигандов (ФРЭС-C и ФРЭС-D), опосредующий постоянное действие и функцию лигандов на клетках-мишенях. ФРЭС-C стимулирует лимфоангиогенез (через VEGFR3) и ангиогенез через VEGFR2. ФРЭС-A представляет собой 232-аминокислотную последовательность (UniProtKB - P15692).
[0051] ТФР играет значительную роль в образовании кровеносных сосудов (ангиогенезе), росте кровеносных сосудов из уже существующей ткани кровеносных сосудов. ТФР является мощным митогеном для клеток мезенхимального происхождения, в том числе фибробластов, клеток гладких мышц и клеток глии. ТФР представляет собой димерный гликопротеин, состоящий из двух A- (-AA) или двух B- (-BB) субъединиц, или комбинации этих двух субъединиц (-AB). Субъединица A представляет собой 211-аминокислотную последовательность (UniProtKB - P04085), а субъединица B - 241-аминокислотную последовательность (UniProtKB - P01127). Таким образом, в различных вариантах реализации описано антитело, обладающее специфичностью по отношению к ТФР-AA, ТФР-BB, ТФР-AB и/или их фрагменту. Как у мыши, так и у человека сигнальная сеть ТФР состоит из четырех лигандов - ТФРA-D и двух рецепторов - PDGFR-альфа и PDGFR-бета (рецепторных тирозинкиназ). Все ТФР функционируют в виде секретируемых связанных дисульфидными связями гомодимеров, но только ТФР-A и B могут образовывать функциональные гетеродимеры.
[0052] Таким образом, в настоящем документе описаны HCAb, специфичные по отношению к ANG-2, и биспецифические антитела, специфичные по отношению как к ANG-2, так и ТФР, или специфичные по отношению как к ANG-2, так и ФРЭС. В других вариантах реализации биспецифическое антитело против ANG-2/ФРЭС представляет собой биспецифическое антитело, образованное из HCAb-антитела человека A33A8 против ANG-2, описанного в настоящем документе, и VH- и/или VL-областей любого антитела человека или гуманизированного антитела, специфичного по отношению к ФРЭС. Антитела, специфичные по отношению к ФРЭС, могут включать антитела, описанные в патентах US7297334, US6884879, US8945552, WO1998045331, US20150175689 и US20090142343, но не ограничиваются ими. Бевацизумаб и ранибизумаб являются типичными гуманизированными антителами против ФРЭС.
[0053] В некоторых вариантах реализации биспецифическое антитело против ANG-2/ФРЭС представляет собой биспецифическое антитело, образованное из HCAb-антитела человека A33A8 против ANG-2, описанного в настоящем документе, и VH- и/или VL-область бевацизумаба (AVASTIN, Genentech). Аминокислотная последовательность бевацизумаба описана в патенте US7297334, включенном в настоящий документ посредством ссылки в отношении всей описанной в нем информации об аминокислотной последовательности антител против ФРЭС. В некоторых вариантах реализации VH-последовательность бевацизумаба представляет собой EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMN WVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:5), а VL-последовательность бевацизумаба представляет собой DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO:6).
[0054] В некоторых вариантах реализации биспецифическое антитело против ANG-2/ФРЭС представляет собой биспецифическое антитело, образованное из HCAb-антитела человека A33A8 против ANG-2, описанного в настоящем документе, и VH- и/или VL-областей ранибизумаба (LUCENTIS, Genentech). Аминокислотная последовательность ранибизумаба описана в патенте US6884879, включенном в настоящий документ посредством ссылки в отношении всей описанной в нем информации об аминокислотной последовательности антител против ФРЭС. В некоторых вариантах реализации VH-последовательность ранибизумаба представляет собой EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYDFT HYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPYYYGTSHWYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:7), а VL-последовательность ранибизумаба представляет собой DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSL HSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO:8).
[0055] В других вариантах реализации биспецифическое антитело против ANG-2/ТФР представляет собой биспецифическое антитело, образованное из HCAb-антитела человека A33A8 против ANG-2, описанного в настоящем документе, и VH- и/или VL-областей любого антитела человека или гуманизированного антитела, специфичного по отношению к ТФР. Типичные гуманизированные антитела проив ФРЭС описаны в заявках WO 2014/072876, WO2005087812 и WO2014109999, включенных в настоящий документ посредством ссылок в отношении всей описанной в них информации об антителах против ТФР. Типичные антитела против ТФР также описаны в находящихся на совместном рассмотрении заявках на патент США №62/205191 от 14 августа 2015 г. и 62/333772 от 9 мая 2016 г. под номером патентного реестра 19864(NTB), включенных в настоящий документ посредством ссылок в отношении всей описанной в них информации об антителах против ТФР.
[0056] Кроме того, в рамки настоящего изобретения входят варианты аминокислотных последовательностей моноспецифических или биспецифических антител человека против ANG-2, полученные внесением соответствующих нуклеотидных изменений в ДНК антитела или пептидным синтезом. Такие варианты включают, например, делеции и/или инсерции и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антител, представленных в разделе «Примеры» настоящей заявки. Для получения конечного конструкта вносят любую комбинацию делеций, инсерций и замен при условии, что конечный конструкт обладает желательными характеристиками. Аминокислотные замены также могут изменять посттрансляционный процессинг гуманизированных или вариантных антител, например, изменяя количество или положение сайтов гликозилирования.
[0057] Подходящий способ идентификации определенных остатков или областей антител, которые являются предпочтительными положениями для мутагенеза, называется «аланин-сканирующим мутагенезом». Остаток или группу остатков-мишеней (например, заряженные остатки, например, Arg, Asp, His, Lys и Glu) идентифицируют и заменяют нейтральной или отрицательно заряженной аминокислотой (наиболее предпочтительно, аланином или полиаланином) с целью влияния на взаимодействие аминокислот с антигеном. Затем уточняют аминокислотные положения, демонстрирующие функциональную чувствительность к заменам, путем введения дальнейших или других вариантов в сайты замен. Таким образом, при заранее определенном сайте внедрения вариации аминокислотной последовательности сама природа мутации не обязательно является предопределенной. Например, для анализа производительности мутации в данном сайте выполняют сканирование аланином или случайный мутагенез кодона или области-мишени и скрининг желательной активности экспрессированных вариантов антитела.
[0058] Инсерции в аминокислотную последовательность включают N- и/или C-концевые гибриды длиной от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков, а также инсерции одного или нескольких аминокислотных остатков внутри последовательности. Примеры концевых инсерций включают антитело против ANG-2 антитело с N-концевым остатком метионина или антитело, объединенное с эпитопным маркером. Другие инсерционные варианты молекул антитела включают присоединение фермента или полипептида к N- или C-концу антитела, что увеличивает период полувыведения антитела из сыворотки.
[0059] Другой тип варианта представляет собой вариант, основанный на замене аминокислотных остатков. В этих вариантах удален по меньшей мере один аминокислотный остаток в молекуле антитела, а на его место вставлен другой остаток. Сайты, представляющие наибольший интерес для осуществления замещающего мутагенеза, включают гипервариабельные области, однако рассматриваются и модификации FR . Консервативные замены приведены в таблице 1 под заголовком «Предпочтительные замены» (аминокислота, показанная в этом столбце, при замене аминокислотой, показанной в столбце «Исходный остаток», называется «консервативной аминокислотой»). Если такая замена приводит к изменению биологической активности, то можно внести более значительные изменения, обозначенные как «типичные замены» в Таблице 1, или описанные ниже по отношению к классам аминокислот, и выполнить скрининг продуктов.
Таблица 1
Исходный остаток
Типичныезамены
Предпочтительные замены
Ala (A)
Val; Leu; Ile
Val
Arg (R)
Lys; Gln; Asn
Asn (N)
Gln; His; Asp; Lys; Arg
Gln
Asp (D)
Glu; Asn
Glu
Cys (C)
Ser; Ala
Ser
Gln (Q)
Asn; Glu
Asn
Glu (E)
Asp; Gln
Asp
Gly (G)
His (H)
Asn; Gln; Lys; Arg
Arg
Ile (I)
Leu; Val; Met; Ala; Phe; норлейцин
Leu
Leu (L)
Норлейцин; Ile; Val; Met; Ala; Phe
Ile
Lys (K)
Arg; Gln; Asn
Arg
Met (M)
Leu; Phe; Ile
Leu
Phe (F)
Leu; Val; Ile; Ala; Tyr
Tyr
Pro (P)
Ser (S)
Thr
Thr
Thr (T)
Ser
Ser
Trp (W)
Tyr; Phe
Tyr
Tyr (Y)
Trp; Phe; Thr; Ser
Phe
Val (V)
Ile; Leu; Met; Phe; Ala; норлейцин
Leu
[0060] Существенные модификации биологических свойств антитела осуществляют путем выбора замен, значительно отличающихся по действию на (а) структуру полипептидного каркаса в области замены, например, конформацию листа или спирали, (b) заряд или гидрофобность молекулы в сайте-мишени или (с) размер боковой цепи. Природные остатки подразделяют на группы на основе общих свойств боковой цепи:
(1) Гидрофобные:Норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) Нейтральные гидрофильные:Cys, Ser, Thr;
(3) Кислые:Asp, Glu;
(4) Основные:Asn, Gin, His, Lys, Arg;
(5) Остатки, влияющие на ориентацию цепи:Gly, Pro; и
(6) Ароматические:Trp, Tyr, Phe.
[0061] Неконсервативные замены приводят к замене представителя одного из этих классов на представителя другого класса.
[0062] Любой остаток цистеина, не участвующий в поддержании правильной конформации моноспецифических или биспецифических антител против ANG-2, также можно заменить, обычно серином, для улучшения окислительной стабильности молекулы и предотвращения неправильного перекрестного связывания. И наоборот, в антитело можно добавить цистеиновую(ые) связь(и) для улучшения его стабильности (в частности, когда антитело представляет собой фрагмент антитела, например, Fv-фрагмент).
[0063] Еще один тип вариантов, полученных путем замены, включает замену одного или более остатков гипервариабельной области исходного антитела (например, гуманизированного антитела или антитела человека). В общем случае полученный(е) вариант(ы), выбираемые для дальнейшей разработки, обладают улучшенными биологическими свойствами по сравнению с исходным антителом, из которого они получены. Подходящий способ получения таких вариантов путем замены представляет собой созревание сродства с помощью фагового дисплея. Вкратце, несколько сайтов гипервариабельной области (например,6-7 сайтов) мутируют, получая все возможные аминокислотные замены по каждому сайту. Варианты антитела, полученные таким образом, одновалентно экспонируют на поверхности частиц нитевидных фагов в виде гибридных белков с продуктами гена IIII M13, упакованных в каждую частицу. Затем выполняют скрининг вариантов, подвергнутых фаговому дисплею, на предмет их биологической активности (например, связывающей активности), как описано в настоящем документе. Для идентификации сайтов гипервариабельной области, являющихся кандидатами для модификации, можно выполнить мутагенез путем сканирования аланином, идентифицируя остатки гипервариабельной области, вносящие значительный вклад в связывание антигена. В качестве альтернативы или дополнения может быть выгодно проанализировать кристаллическую структуру комплекса антиген-антитело для идентификации точек контакта между антителом и ANG-2 человека. Такие контактные остатки и соседние с ними остатки являются кандидатами для замены в соответствии с методиками, разработанными в настоящем изобретении. После получения таких вариантов панель вариантов подвергают скринингу, как описано в настоящем документе, и отбирают антитела с лучшими свойствами для дальнейшей разработки с помощью одного или более из соответствующих анализов.
[0064] Еще один тип аминокислотного варианта антитела изменяет первоначальный профиль гликозилирования антитела. Под изменением подразумевается удаление одной или более углеводной молекулы антитела и/или добавление одного или более сайтов гликозилирования, которые отсутствуют в антителе.
[0065] Гликозилирование антител обычно является N-связанным или O-связанным. N-связанное гликозилирование относится к присоединению углеводной группы к боковой цепи остатка аспарагина. Трипептидные последовательности аспарагин-X-серин и аспарагин-X-треонин, где X - любая аминокислота, кроме пролина, представляют собой распознаваемые последовательности для ферментативного присоединения углеводной группы к боковой цепи аспарагина. Таким образом, присутствие любой из этих трипептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный сайт гликозилирования. О-связанное гликозилирование относится к присоединению одного из углеводов - N-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы - к гидроксиаминокислоте, чаще всего - серину или треонину, хотя также можно использовать 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин.
[0066] Добавление сайта гликозилирования в антитело удобно осуществлять путем модификации аминокислотной последовательности таким образом, чтобы она содержала одну или более из вышеописанных трипептидных последовательностей (для сайтов N-связанного гликозилирования). Модификацию также можно осуществить путем добавления или замены на один или более остатков серина или треонина в составе последовательности исходного антитела (для сайтов О-связанного гликозилирования).
[0067] Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие аминокислотные последовательности моноспецифических или биспецифических антител против ANG-2, получают с помощью различных способов, известных в данной области техники. Эти способы включают выделение из природного источника (в случае природных вариантов аминокислотной последовательности), или получение путем олигонуклеотид-опосредованного (или сайт-специфического) мутагенеза, ПЦР-мутагенеза и кассетного мутагенеза ранее полученной вариантной или невариантной версии антитела против ANG-2, но не ограничиваются ими.
[0068] Рассматриваются другие модификации моноспецифических или биспецифических антител против ANG-2. Например, может быть желательна модификация антител по отношению к эффекторной функции, например, с целью повышения эффективности антитела при лечении заболевания. Например, в Fc-область можно внедрить остаток(ки) цистеина, тем самым обеспечивая образование межцепочечной дисульфидной связи в этой области. Гомодимерное антитело, полученное таким образом, может обладать улучшенной способностью к интернализации и/или повышенной способностью вызывать комплемент-опосредованное уничтожение клеток и антителозависимой клеточной цитотоксичностью (ADCC). Кроме того, можно получить гомодимерные антитела с усиленной противоопухолевой активностью, используя гетеробифункциональные перекрестно связывающие агенты. В качестве альтернативы можно сконструировать антитело, содержащее двойные Fc-области и, возможно, вследствие этого обладающее усиленной способностью вызывать комплементзависимый лизис и ADCC.
[0069] В настоящем документе также описаны иммуноконъюгаты, содержащие антитело, описанное в настоящем документе и конъюгированное с цитотоксическим агентом, например, химиотерапевтическим агентом, токсином (например, токсином бактериального, грибного, растительного или животного происхождения, обладающим ферментативной активностью, или его фрагментами) или радиоактивным изотопом (т.е. радиоконъюгат).
212
131
131
90
186
[0070] Описаны химиотерапевтические агенты, пригодные для получения таких иммуноконъюгатов. Токсины, обладающие ферментативной активностью, и их фрагменты, которые можно использовать, включают цепь А дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь А экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), цепь А рицина, ботулинические токсины, цепь А абрина, цепь А модессина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки диантина, белки Phytolaсca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Saponaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены. Для получения радиоконъюгированных моноспецифических или биспецифических антител против ANG-2 доступны разнообразные радионуклиды. Примеры включают Bi, I, In, Y и Re.
[0071] Конъюгаты антитела и цитотоксического агента получают, используя разнообразные бифункциональные белок-связывающие агенты, например, N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитиол)пропионат (SPDP), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (например, диметиладипимидат HCL), активные эфиры (например, дисукцинимидилсуберат), альдегиды (например, глутаральдегид), бис-азидосоединения (например, бис-(p-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (например, бис-(p-диазонийбензоил)-этилендиамин), диизоцианаты (например, толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (например, 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). 1-Изотиоцианатбензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (MX-DTPA), меченая углеродом-14, представляет собой типичный хелатирующий агент для конъюгирования радионуклеотида с антителом.
[0072] В еще одном варианте реализации антитело можно конъюгировать с «рецептором» (например, стрептавидином) для предварительного адресного воздействия при введении конъюгата антитело-рецептор пациенту с последующим удалением несвязавшегося конъюгата из циркуляторного русла с помощью очищающего агента и последующим введением «лиганда» (например, авидина), конъюгированного с цитотоксическим агентом (например, радионуклидом).
[0073] Моноспецифические или биспецифические антитела против ANG-2, описанные в настоящем документе, также можно получить в форме липосом. Липосомы, содержащие антитело, получают с помощью способов, известных в данной области техники, например, описанных в патентах US4485045, US4544545 и US5013556. Особенно подходящие липосомы можно получать при помощи способа обращенно-фазового выпаривания с применением композиции липидов, содержащей фосфатидилхолин, холестерин и производные фосфатидилэтаноламина и ПЭГ (ПЭГ-PE). Липосомы продавливают через фильтры с определенным размером пор, получая липосомы желательного диаметра. Fab'-фрагменты антител можно конъюгировать с липосомами посредством реакции обмена дисульфидными группами.
[0074] Кроме того, в рамки настоящего изобретения входят ковалентные модификации моноспецифических или биспецифических антител против ANG-2. В соответствующих случаях их можно получить путем химического синтеза или ферментативного или химического расщепления антитела. Другие виды ковалентных модификаций антителл вносят в молекулу путем взаимодействия аминокислотных остатков-мишеней в составе антитела с органическим модифицирующим агентом, способным реагировать с выбранными боковыми цепями или N- или С-концевыми остатками. Типичные ковалентные модификации полипептидов описаны в патенте US5534615, специфически включенном в настоящий документ в качестве ссылки в отношении всей описанной в нем информации о ковалентных модификациях полипептидов. Типичный вид ковалентной модификации антитела включает связывание антитела с одним из различных небелковых полимеров, например, полиэтиленгликолем, полипропиленгликолем или полиоксиалкиленами, способом, приведенным в патентах US4640835, US4496689, US4301144, US4670417, US4791192 или US4179337.
[0075] Моноспецифические или биспецифические антитела против ANG-2, описанные в настоящем документе, можно получить рекомбинантными способами. Так, в настоящем документе описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела, экспрессирующие векторы, содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела, и клетки, содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела. Способы рекомбинантной продукции широко известны в данной области техники и включают экспрессию белка в прокариотических и эукариотических клетках с последующим выделением антитела и, обычно, его очисткой до фармацевтически приемлемой степени чистоты. Для вышеупомянутой экспрессии антител в клетке-хозяине нуклеиновые кислоты, кодирующие последовательности антител, вставляют в экспрессирующие векторы стандартными способами. Экспрессию выполняют в соответствующих прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах, например, клетках CHO, клетках NS0, клетках SP2/0, клетках HEK293, клетках COS, клетках PER. C6, дрожжевых клетках или клетках E. coli, и выделяют антитело из клеток (супернатанта или клеток после лизиса).
[0076] Соответственно некоторые варианты реализации, описанные в настоящем документе, включают способ получения моноспецифического или биспецифического антитела, включающий этапы а) трансформации клетки-хозяина по меньшей мере одним экспрессирующим вектором, содержащим молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитело; b) культивирование клетки-хозяина в условиях, обеспечивающих синтез молекулы антитела; и c) выделение указанной молекулы антитела из культуры.
[0077] Антитела соответствующим образом отделяют от культуральной среды с помощью стандартных процедур очистки иммуноглобулинов, например, гель-фильтрации на белок A-сефарозе, хроматографии на гидроксиапатите, гель-электрофореза, диализа или аффинной хроматографии.
[0078] В настоящем документе выражения «клетка», «линия клеток» и «культура клеток» используются на равных основаниях, и все эти определения включают потомство. Таким образом, слова «трансформанты» и «трансформированные клетки» включают первичные клетки-субъекты и культуры, полученные из них, независимо от количества пересевов. Кроме того, следует понимать, что потомство может быть не полностью идентично в отношении ДНК вследствие целенаправленных или случайных мутаций. Настоящее изобретение включает вариантное потомство, обладающее аналогичной функцией или биологической активностью, выявленной при скрининге исходно трансформированных клеток. Если предусмотрены разные обозначения, это будет ясно из контекста.
[0079] В настоящем документе термин «трансформация» относится к процессу переноса векторов/нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина. При использовании клеток без труднопреодолимых клеточных стенок в качестве клеток-хозяев трансфекцию можно выполнить, например, осаждением с фосфатом кальция. В то же время можно использовать другие способы введения ДНК в клетки, например, внутриядерную инъекцию или слияние протопластов. При использовании прокариотических клеток или клеток, содержащих прочные конструкции клеточной стенки, например, одним из способов трансфекции является обработка хлоридом кальция.
[0080] В настоящем документе термин «экспрессия» относится к процессу, при котором нуклеиновая кислота транскрибируется в мРНК, и/или процесс, при котором транскрибированная мРНК (также назваемая транскриптом) транслируется в пептиды, полипептиды и белки. Транскрипты и кодируемые полипептиды совместно называются продуктами гена. Если полинуклеотид получен из геномной ДНК, экспрессия в эукариотических клетках может включать сплайсинг мРНК.
[0081] «Вектор» представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, в частности, самореплицирующуюся, которая переносит вставленную молекулу нуклеиновой кислоты в и/или между клетками-хозевами. Данный термин включает векторы, используемые главным образом для внедрения ДНК или РНК в клетку (например, интеграции в хромосому), реплицируемые векторы, используемые главным образом для репликации ДНК или РНК, и экспрессирующие векторы, используемые для транскрипции и/или трансляции ДНК или РНК. Кроме того, данный термин включает векторы, обладающие более чем одной из описанных функций.
[0082] «Экспрессирующий вектор» представляет собой полинуклеотид, который при введении в соответствующую клетку-хозяина может транскрибироваться и транслироваться с образованием полипептида. «Система экспрессии» обычно относится к подходящей клетке-хозяину, содержащей экспрессирующий вектор, которая может функционировать, производя желательный продукт экспрессии.
[0083] В настоящем документе термин «клетка-хозяин» обозначает любую клеточную систему, которую можно сконструировать для получения антител, описанных в настоящем документе. В одном варианте реализации в качестве клеток-хозяев используют клетки HEK293 и клетки CHO.
[0084] Регуляторные последовательности, подходящие для прокариот, например, включают промотор, необязательную последовательность оператора и сайт связывания рибосом. Известно, что эукариотические клетки используют промоторы, энхансеры и сигналы полиаденилирования.
[0085] Нуклеиновая кислота является «функционально связанной», если она вступает в функциональное взаимодействие с другой нуклеотидной последовательностью. Например, ДНК последовательности-предшественника или секреторного лидера функционально связана с ДНК полипептида, если она экспрессируется в виде белка-предшественника, участвующего в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связаны с кодирующей последовательностью, если они влияют на транскрипцию этой последовательности; или сайт связывания рибосом функционально связан с кодирующей последовательностью, если он расположен так, что это облегчает трансляцию. В общем случае «функционально связанные» означает, что связанные последовательности ДНК непрерывны, а в случае секреторного лидера, непрерывны и в рамке считывания. Однако энхансеры не должны быть непрерывными. Связывание сопровождается лигированием по подходящим участкам рестрикции. Если такие сайты отсутствуют, в соответствии с общепринятой практикой используют синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры.
[0086] Кроме того, в настоящем документе описана выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая моноспецифические или биспецифические антитела человека против ANG-2, векторы и клетки-хозяева, содержащие указанные нуклеиновые кислоты, и рекомбинантные методики для продукции антител.
[0087] Для рекомбинантной продукции антител нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, можно выделить и вставить в реплицируемый вектор для дальнейшего клонирования (амплификации ДНК) или экспрессии. В некоторых вариантах реализации антитело можно получить гомологичной рекомбинацией, например, описанной в патенте US5204244, специфически включенном в настоящий документ посредством ссылки в отношении всей описанной в нем информации о получении антитела. ДНК, кодирующую антитело, легко выделить и секвенировать с помощью стандартных процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, способных специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антитела). Доступно большое количество векторов. Компоненты вектора обычно включают один или более из следующих элементов: сигнальную последовательность, сайт инициации репликации, один или более из маркерных генов, энхансерный элемент, промотор и терминатор транскрипции, но не ограничиваются ими, например, как описано в патенте US5534615, специфически включенном в настоящий документ посредством ссылки в отношении всей описанной в нем информации об экспрессии белка.
[0088] Подходящими клетками-хозяевами для клонирования или экспрессии ДНК в векторах, описанных в настоящем документе, являются клетки прокариот, дрожжей или высших эукариот, описанные выше. Прокариоты, подходящие для данной цели, включают эубактерий, например, грамотрицательные и грамположительные организмы, например, Enterobacteriaceae, например, Escherichia, например, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, например, Salmonella typhimurium, Serratia, например, Serratia marcescans, и Shigella, а также Bacilli, например, B. subtilis и B. licheniformis, Pseudomonas, например, P. aeruginosa, и Streptomyces. Одним из типичных хозяев для клонирования на основе E. coli является E. coli 294 (ATCC 31446), хотя можно использовать и другие штаммы, например, E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31537) и E. coli W3110 (ATCC 27325). Эти примеры являются иллюстративными, а не ограничивающими.
[0089] Кроме прокариот подходящими хозяевами для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих моноспецифическое или биспецифическое антитело человека против ANG-2, являются эукариотические микроорганизмы, например, мицелиальные грибы или дрожжи. Saccharomyces cerevisiae, или пекарские дрожжи, является наиболее широко используемым микроорганизмом-хозяином среди низших эукариот. В то же время для целей настоящего изобретения могут быть использованы общедоступные организмы, относящиеся к ряду других родов, видов и штаммов, например, Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces, например, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12424), K. bulgaricus (ATCC 16045), K. wickeramii (ATCC 24178), K. waltii (ATCC 56500), K. drosophilarum (ATCC 36906), K. thermotolerans, and K. marxianus; yarrowia (EP 402226); Pichia pastoris (EP 183070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244234); Neurospora crassa; Schwanniomyces, например, Schwanniomyces occidentalis; и мицелиальные грибы, например, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium и Aspergillus, например, A. nidulans и A. niger.
[0090] Подходящие клетки-хозяева для экспрессии гликозилированных моноспецифических или биспецифических антител человека против ANG-2 происходят от многоклеточных организмов, включая клетки беспозвоночных, например, клетки растений и насекомых. Выявлены многочисленные штаммы и варианты бакуловирусов и соответствующие клетки-хозяева восприимчивых к ним насекомых, например, Spodoptera frugiperda (гусеница совки), Aedes aegypti (комар), Aedes albopictus (комар), Drosophila melanogaster (плодовая муха) и Bombyx mori. Общедоступен ряд вирусных штаммов для трансфекции, например, вариант L-1 NPV Autographa californica и штамм Bm-5 NPV Bombyx mori; такие вирусы можно использовать в качестве вируса согласно настоящему изобретению, в частности, для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda. Кроме того, в качестве хозяев можно использовать культуры клеток растений - хлопчатника, кукурузы, картофеля, сои, петунии, помидора и табака.
[0091] В то же время наибольший интерес вызывают клетки позвоночных, и размножение клеток позвоночных в культуре (тканевой культуре) стало повседневной процедурой. Примеры используемых линий клеток-хозяев млекопитающих представляют собой линию клеток почки обезьяны CV1, трансформированную SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); линию эмбриональной почки человека (293 или клетки 293, субклонированные для роста в суспензии); клетки почки новорожденного хомяка (BHK, ATCC CCL 10); клетки яичника китайского хомячка /-DHFR (CHO); клетки Сертоли мыши (TM4); клетки почки обезьяны (CV1 ATCC CCL 70); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76, ATCC CRL-1587); клетки рака шейки матки человека (HELA, ATCC CCL 2); клетки почки собаки (MDCK, ATCC CCL 34); клетки печени крысы линии buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); клетки легкого человека (W138, ATCC CCL 75); клетки печени человека (Hep G2, HB 8065); клетки опухоли молочной железы мыши (MMT 060562, ATCC CCL51); клетки TRI; клетки MRC 5; клетки FS4; и линию гепатомы человека (Hep G2).
[0092] Клетки-хозяева трансформируют вышеописанными экспрессирующими векторами с целью продукции моноспецифического или биспецифического антитела против ANG-2 и культивируют в традиционных питательных средах, при необходимости модифицированных для индукции промоторов, отбора трансформантов или амплификации генов, кодирующих желательные последовательности.
[0093] Клетки-хозяева, используемые для продукции моноспецифических или биспецифических антител против ANG-2, можно культивировать в различных средах. Для культивирования клеток-хозяев подходят доступные для приобретения среды, например, среда Хэма F10 (Sigma), минимальная поддерживающая среда ((MEM) (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) и среда Игла, модифицированная по Дульбекко ((DMEM), Sigma). Кроме того, в качестве сред для культивирования клеток-хозяев можно использовать среды, описанные в патентах US4767704; US4657866; US4927762; US4560655; или US5122469; WO 90/03430; WO 87/00195; или US Re. 30985. В любую из этих сред при необходимости можно добавлять гормоны и/или другие факторы роста (например, инсулин, трансферрин или эпидермальный ростовой фактор), соли (например, хлорид натрия, кальций, магний и фосфат), буферы (например, HEPES), нуклеотиды (например, аденозин и тимидин), антибиотики (например, гентамицин (GENTAMYCIN™)), микроэлементы (определяемые как неорганические соединения, обычно присутствующие в конечных концентрациях, находящихся в микромолярном диапазоне) и глюкозу или эквивалентный источник энергии. Кроме того, в среду можно включать любые другие необходимые добавки в соответствующих концентрациях, известных специалистам в данной области техники. Такие условия культивирования, как температура, рН и т.п., совпадают с условиями, использованными ранее при культивировании клеток-хозяев, выбранных для экспрессии, и очевидны для специалиста в данной области техники.
[0094] При использовании рекомбинантных методик антитело можно продуцировать внутриклеточно, в периплазматическом пространстве или напрямую секретировать в среду. При внутриклеточной продукции антитела на первом этапе удаляют остаточные частицы, клетки-хозяева или лизированные фрагменты, например, путем центрифугирования или ультрафильтрации.
[0095] Композицию антител, полученную из клеток, можно очистить с помощью, например, хроматографии на гидроксиапатите, гель-электрофореза, диализа и аффинной хроматографии, причем аффинная хроматография является предпочтительной методикой очистки. Возможность использования белка А в качестве аффинного лиганда зависит от вида и изотипа Fc-домена иммуноглобулина, присутствующего в составе антитела. Белок A можно использовать для очистки антител, основанных на тяжелых цепях γ1, γ2 или γ4 человека. Белок G рекомендуется для всех изотипов мыши и для γ3 человека. Матрикс, к которому присоединяют аффинный лиганд, чаще всего представляет собой агарозу, однако также доступны и другие матриксы. Механически устойчивые матриксы, например, стекло с контролируемым размером пор или поли(стиролдивинил)бензол, дают возможность достижения более высоких скоростей потока и более короткого времени обработки, чем при использовании агарозы. Если антитело содержит CH3-домен, для очистки можно использовать смолу Bakerbond ABX™. Кроме того, в зависимости от антитела, подлежащего очистке, доступны другие методики очистки белка, например, фракционирование на ионообменной колонке, осаждение этанолом, обращенно-фазная ВЭЖХ, хроматография на гепарин-сефарозе™, хроматография на анионно- или катионообменной смоле (например, на колонке с полиаспарагиновой кислотой), хроматофокусирование, электрофорез в ДСН-ПААГ и осаждение сульфатом аммония.
[0096] В соответствии с любым(и) предварительным(и) этапом(ами) очистки смесь, содержащую интересующие исследователя антитела и загрязняющие примеси, можно подвергать гидрофобной хроматографии при низких рН, используя буфер для элюции с рН в диапазоне приблизительно 2,5-4,5, предпочтительно выполняемой при низких концентрациях солей (например, приблизительно 0-0,25 М соли).
[0097] Кроме того, в настоящем документе описаны способы применения моноспецифических и биспецифических антител человека против ANG-2 для лечения офтальмологических расстройств. Примеры офтальмологических расстройств включают сухую (неэкссудативную) возрастную макулодистрофию, влажную (экссудативную или неоваскулярную) возрастную макулодистрофию, хориоидальную неоваскуляризацию (CNV), кистозный отек макулы (СМЕ), хориоидальную неоваскуляризацию, ассоциированную с миопией, сосудистые полосы сетчатки, диабетический отек макулы (DME), отек макулы, отек макулы вследствие окклюзии вен сетчатки и ангиогенез в передней части глаза, например, ангиогенез в роговице после, например, кератита, трансплантации роговизы или керапластики, ангиогенез в роговице вследствие гипоксии (при чрезмерном ношении контактных линз), крыловидную плеву конъюнктивы, субретинальный отек или интраретинальный отек, но не ограничиваются ими.
[0098] Макулодистрофия, также называемая возрастрой макулодистрофией, является наиболее распространенной причиной потери зрения в США у лиц в возрасте 50 лет и старше, и ее превалентность увеличивается с возрастом. ВМД подразделяется на влажную (неоваскулярную) и сухую (без неоваскуляризации) формы. Сухая форма заболевания распространена в наибольшей степени. Она возникает при деформации, пигментировании или, чаще всего, истончении центральной сетчатки; этот процесс ассоциирован с атрофией пигментного эпителия сетчатки и потерей макулярных фоторецепторов. В результате возникает центральная географическая атрофия. Влажная форма заболевания ответственна за наиболее тяжелую потерю зрения. Влажная форма обычно ассоциирована со старением, однако другие заболевания, способные вызывать влажную макулодистрофию, включают тяжелую миопию и некоторые инфекции глаз, например, гистоплазмоз, который может осложняться у индивидов со СПИД. Влажная форма характеризуется патологическим ростом кровеносных сосудов через пигментный эпителий сетчатки, что приводит к кровоизлияниям, образованию экссудата, рубцеванию или отслойке сетчатки.
[0099] В настоящем документе описаны составы моноспецифических и биспецифических антител человека против ANG-2 с замедленным высвобождением для лечения расстройств глаз. Так, моноспецифические и биспецифические антитела человека против ANG-2 можно высвобождать в стекловидное тело в течение 3-6 месяцев из системы доставки лекарственных средств с замедленным высвобождением для долгосрочного лечения хронических заболеваний глаз, например, сухой ВМД.
[0100] Гидрогель представляет собой коллоидный гель в виде дисперсии в воде или другой водной среде. Так, гидрогель образуется при образовании коллоида, в котором дисперсную фазу (полимер) объединяют с непрерывной фазой (т.е. водой), получая вязкий студенистый продукт; например, коагулированную кремниевую кислоту. Гидрогель представляет собой трехмерную сеть из гидрофильных полимерных цепей, перекрестно связанных физическими или химическими связями. Из-за гидрофильной природы полимерных цепей гидрогели поглощают воду и набухают (при условии, что они уже не набрали максимальное для них количество воды). Процесс набухания аналогичен растворению гидрофильных полимеров, не связанных перекрестными связями. Вода по определению составляет по меньшей мере 10% общей массы (или объема) гидрогеля.
[0101] Примеры гидрогелей включают синтетические полимеры, например. полигидроксиэтилметакрилат, и химически или физически перекрестно сшитые поливиниловый спирт, полиакриламид, поли(N-винилпирролидон), полиэтиленоксид и гидролизованный полиакрилонитрил. Примеры гидрогелей, представляющих собой органические полимеры, включают перекрестно сшитые ковалентными или ионными связями гидрогели на основе полисахаридов, например, соли поливалентных металлов и альгината, пектина, карбоксиметилцеллюлозы, гепарина, гиалуроната и гидрогели на основе хитина, хитозана, пуллулана, геллана и ксантана. Конкретные гидрогели, использованные в наших экспериментах, представляли собой соединения целлюлозы (т.е. гидроксипропилметилцеллюлозу [ГПМЦ]) и высокомолекулярную гиалуроновую кислоту (HA).
[0102] В некоторых вариантах реализации описан состав гидрогеля для интравитреальных инъекций с использованием полимерной гиалуроновой кислоты и моноспецифических или биспецифических антител человека против ANG-2, описанных в настоящем документе. Эта система доставки лекарственного вещества может обеспечить устойчивое высвобождение низкой суточной дозы моноспецифических или биспецифических антител человека против ANG-2 в течение 3-6 месяцев и предотвращение перехода ВМД от сухой к влажной форме. Система доставки лекарственного вещества также может включать инкапсуляцию моноспецифических или биспецифических антител человека против ANG-2 в гидрогеле в микросферы. Система доставки лекарственного вещества с замедленным высвобождением может обеспечить необходимую блокаду глаза против ANG-2 для снижения вероятности прогрессирования ВМД от сухой к влажной форме. Кроме того, низкие дозы лекарственного вещества, высвобождаемые в глаз в течение длительного времени, не обеспечивают системного токсического уровня агента.
[0103] Система доставки лекарственного вещества с замедленным высвобождением также может обеспечить блокаду против ANG-2 с замедленным высвобождением у пациентов с окклюзией центральной вены сетчатки, подверженных риску неоваскуляризации, и у пациентов с тяжелой непролиферативной диабетической ретинопатией, подверженных риску прогрессирования заболевания до стадии неоваскуляризации
[0104] В качестве альтернативы, система доставки лекарственного вещества может представлять собой PLGA-имплантат, антитела, инкапсулированные в липосомах и, необязательно, в перекрестно сшитой гиалуроновой кислоте. Кроме того, можно применять микросферы, микрокапсулы (размером от 0,001 до 100 микрон) и липосомы с модифицированной поверхностью с целью обеспечения взаимодействия с полимером гидрогеля для модификации высвобождения.
[0105] Кроме того, рамки настоящего изобретение включают конкретные составы для системы доставки лекарственного вещества и способы введения этих систем доставки лекарственного вещества для лечения заболеваний глаз. Внутриглазное введение можно выполнить путем имплантации или инъекции в полость стекловидного тела (заднюю камеру) глаза. Системы доставки лекарственных веществ в рамках настоящего изобретения могут представлять собой биоразлагаемые имплантаты и/или микросферы. Системы доставки лекарственных веществ могут быть монолитными, т.е. с равномерным распределением или диспергированием активного агента по всему объему биоразлагаемого полимера. Терапевтический агент может высвобождаться из систем доставки лекарственных веществ, полученных согласно настоящему изобретению, в течение времени от приблизительно 2 часов до 12 месяцев или более. Важной особенностью систем доставки лекарственных веществ является то, что они не содержат каких-либо средств (например, колпачка, выступа или петли для шва) для фиксации системы доставки лекарственного вещества в области внутри глаза, куда ее вводят.
[0106] Важной особенностью системы доставки лекарственного вещества в рамках настоящего изобретения является возможность ее имплантации или введения в область внутри глаза (например, в переднюю подкапсульную область, субконъюнктивально, интравитреально или супрахориоидально) с целью обеспечения замедленного высвобождения терапевтического агента без возникновения или поддержания сильной иммуногенности в и области внутриглазной имплантации или инъекции и прилегающих областях.
[0107] Полилактидные (PLA) полимеры существуют в двух химических формах - поли(L-лактида) и поли(D,L-лактида). Чистый поли(L-лактид) является стереорегулярным и поэтому также кристаллизован в высокой степени, что обуславливает его крайне медленное разложение in vivo. Поли(D,L-лактид) является стереонерегулярным, что приводит к более быстрому разложению in vivo. Поэтому PLA-полимер, представляющий собой смесь преимущественно полимера поли(L-лактида) и остальных компонентов, представляющих собой полимер поли(D-лактида), должен разлагаться in vivo медленнее, чем PLA-полимер, являющийся преимущественно полимером поли(D-лактида). PLGA представляет собой сополимер поли(D,L-лактида) и поли(гликолида) во всевозможных соотношениях. Чем выше содержание гликолида в PLGA, тем быстрее происходит разложение полимера.
[0108] В некоторых вариантах реализации система доставки лекарственного вещества для внутриглазного введения (т.е. путем интравитреальной имплантации или инъекции) содержит, сконфигурирована, состоит из или главным образом состоит из по меньшей мере 75 массовых процентов PLA и не более чем приблизительно 25 массовых процентов сополимера поли(D,L-лактид-гликолид).
[0109] Кроме того, настоящее изобретение охватывает суспензии микросфер (содержащих антинеоваскулярный агент) в гидрогеле (например, полимерной гиалуроновой кислоте), которые можно вводить в область внутри глаза через иглу шприца. Для введения такой суспензии необходимо, чтобы вязкость суспензии микросфер при 25°C была менее приблизительно 300000 сП. Вязкость воды при 25°C составляет приблизительно 1,0 сП (сП - сантипуаз, единица вязкости). Вязкость оливкового масла при 25°C составляет 84 сП, касторового масла - 986 сП, а глицерина - 1490 сП.
[0110] Антитела в системе доставки лекарственного вещества могут быть равномерно диспергированы в биоразлагаемом полимере системы доставки лекарственного вещества. Выбор используемого биоразлагаемого полимера может зависеть от желательной кинетики высвобождения, переносимости пациентом, природы заболевания, подвергаемого лечению, и т.п. Рассматриваемые характеристики полимеров включают биосовместимость и биоразлагаемость в месте имплантации, совместимость с целевым активным агентом и температуры обработки, но не ограничиваются ими. Биоразлагаемый полимерный матрикс обычно составляет по меньшей мере приблизительно 10, по меньшей мере приблизительно 20, по меньшей мере приблизительно 30, по меньшей мере приблизительно 40, по меньшей мере приблизительно 50, по меньшей мере приблизительно 60, по меньшей мере приблизительно 70, по меньшей мере приблизительно 80 или по меньшей мере приблизительно 90 процентов от массы имплантата. В одном варианте реализации биоразлагаемый полимерный матрикс составляет от приблизительно 40 % до 50% от массы системы доставки лекарственного вещества.
[0111] Биоразлагаемые полимеры, которые можно использовать, включают полимеры, полученные из таких мономеров, как органические сложные или простые эфиры, разложение которых приводит к физиологически приемлемым продуктам, но не ограничиваются ими. Также могут быть использованы ангидриды, амиды, ортоэфиры и т.п. непосредственно или в комбинации с другими мономерами. Полимеры, как правило, представляют собой конденсационные полимеры. Полимеры могут быть или не быть поперечно сшитыми.
[0112] По большей части, помимо углерода и водорода, полимеры должны содержать кислород и азот, в особенности кислород. Кислород может присутствовать в виде оксигруппы, например, гидроксигруппы или простой эфирной группы, карбонильной группы, например, не являющейся оксокарбонильной группой, например, в виде сложного эфира карбоновой кислоты и т.п. Азот может присутствовать в виде амидной, циано- и аминогруппы. Примерный перечень биоразлагаемых полимеров, которые можно использовать, описаны в Heller, Biodegradable Polymers in Controlled Drug Delivery, In:“CRC Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems”, Vol. 1. CRC Press, Boca Raton, Fla. (1987).
[0113] Особый интерес представляют полимеры гидроксиалифатических карбоновых кислот, как гомо-, так и сополимеры, а также полисахариды. Представляющие интерес сложные полиэфиры включают гомо- и сополимеры D-молочной кислоты, L-молочной кислоты, рацемической молочной кислоты, гликолевой кислоты, капролактона и их комбинаций. Сополимеры гликолевой и молочной кислот представляют особый интерес, если скорость биоразложения контролируется отношением гликолевой кислоты к молочной кислоте. Содержание каждого мономера в сополимере поли(молочной/гликолевой)кислоты (ПМГК) может составлять 0-100%, приблизительно 15-85%, приблизительно 25-75% или приблизительно 35-65%. В некоторых вариантах используют сополимеры 25/75 ПМГК и/или 50/50 ПМГК. В других вариантах сополимеры ПМГК используют в сочетании с полилактидными полимерами.
[0114] В составе для системы доставки лекарственного вещества в различных целях можно использовать другие агенты. Например, можно использовать буферные агенты и консерванты. Консерванты, которые можно использовать, включают гидросульфит натрия, гидросульфат натрия, тиосульфат натрия, хлорид бензалкония, хлорбутанол, тиомерсал, ацетат фенилртути, нитрат фенилртути, метилпарабен, поливиниловый спирт и фенилэтиловый спирт, но не ограничиваются ими. Примеры буферных агентов, которые можно использовать, включают карбонат натрия, борат натрия, фосфат натрия, ацетат натрия, гидрокарбонат натрия и т.п. агенты, одобренные FDA для желательного пути введения, но не ограничиваются ими. Кроме того, состав может содержать поверхностно-активные вещества, которые можно использовать для стабилизации частиц в коллоиде и/или электролитах, например, хлориде натрия и хлориде калия. Система доставки лекарственного вещества также может содержать кислые и основные вспомогательные вещества для контроля рН в микроокружении, а также на границах раздела (диффузионном застойном слое).
[0115] Биоразлагаемые системы доставки лекарственных веществ также могут содержать дополнительные гидрофильные или гидрофобные соединения, которые ускоряют или замедляют высвобождение активного агента. Кроме того, имплантаты могут содержать модуляторы высвобождения, например, описанные в патенте США № 5869079. Используемое количество модулятора высвобождения должно зависеть от желательного профиля высвобождения, активности модулятора и от профиля высвобождения глюкокортикоида в отсутствие модулятора. Если буферный агент или усилитель или модулятор высвобождения является гидрофильным, он также может действовать как ускоритель высвобождения. Гидрофильные добавки увеличивают скорость высвобождения за счет ускорения растворения материала, окружающего частицы лекарственного вещества, что увеличивает площадь поверхности препарата, подвергаемую воздействию, и тем самым увеличивает скорость диффузии лекарственного вещества. Аналогичным образом, гидрофобный буферный агент или усилитель или модулятор может растворяться с меньшей скоростью, замедляя воздействие на частицы лекарственного вещества, и, таким образом, замедляя скорость диффузии лекарственного вещества.
[0116] Система доставки лекарственного вещества согласно настоящему изобретению может представлять собой частицы активного агента-антитела, диспергированные в биоразлагаемом полимере. Безотносительно к теоретическим представлениям считается, что высвобождение активного агента может достигаться за счет эрозии биоразлагаемого полимерного матрикса и диффузии частиц агента во внутриглазную жидкость, например, стекловидное тело, с последующим растворением полимерного матрикса и высвобождением активного агента. Факторы, которые влияют на кинетику высвобождения активного агента из имплантата, могут включать такие характеристики, как размер и форма имплантата, размер частиц активного агента, растворимость активного агента, отношение активного агента к полимеру(ам), способ производства, площадь открытой поверхности, плотность имплантата и скорость эрозии полимера(ов).
[0117] Скорость высвобождения активного агента может по меньшей мере частично зависеть от скорости разложения каркасного компонента или компонентов полимера, составляющих биоразлагаемый полимерный матрикс. Например, конденсационные полимеры могут разлагаться путем гидролиза (в числе прочих механизмов) и, следовательно, любое изменение состава имплантата, усиливающее поглощение воды имплантатом, вероятно, увеличит скорость гидролиза, тем самым увеличивая скорость разложения и эрозии полимера, и, таким образом, увеличивая скорость высвобождения активного агента. Скорость высвобождения активного агента также может зависеть от кристалличности активного агента, рН в пределах имплантата и рН на границах раздела.
[0118] Кинетика высвобождения систем доставки лекарственного вещества согласно настоящему изобретению может зависеть от площади поверхности систем доставки лекарственного вещества. При увеличении площади поверхности большее количество полимера и активного агента подвергается воздействию глазной жидкости, что приводит к более быстрой эрозии полимера и растворению частиц активного агента в жидкости.
[0119] Кроме того, в настоящем документе описаны фармацевтические композиции, содержащие моноспецифическое HCAb человека против ANG-2 и/или биспецифическое антитело, одна из специфичностей представляет собой специфичность к ANG-2. Кроме того, описано применение антител, описанных в настоящем документе, для получения фармацевтической композиции. Кроме того, описаны способы применения описанных антител и фармацевтических композиций, содержащих антитела, для лечения офтальмологических расстройств
[0120] В настоящем описании термин «фармацевтический носитель» включает всевозможные растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие всасывание агенты и т.п. вещества, являющиеся физиологически совместимыми. В предпочтительном случае носитель подходит для внутривенного, внутримышечного, внутриглазного, интравитреального, подкожного, парентерального, спинального или эпидермального введения (например, путем инъекции или вливания).
[0121] Композиции, описанные в настоящем документе, можно вводить с помощью разнообразных способов, известных в данной области техники. Специалист должен принимать во внимание, что путь и/или режим введения варьируется в зависимости от желательных результатов. Для введения описанных антител посредством определенного пути введения может быть необходимо связать или совместно вводить антитела с материалом для предотвращения их инактивации. Например, антитела можно ввести в организм субъекта в подходящем носителе, например, липосомах, или разбавителе. Фармацевтически приемлемые разбавители включают физиологический раствор и водные буферные растворы. Фармацевтические носители включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для немедленного приема или стерильные растворы или дисперсии для инъекций. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ известно в данной области техники.
[0122] Фразы «парентеральное введение» и «введенный парентерально», как используются здесь, означают способы введения, не являющиеся энтеральным и местным введением, обычно выполняемые путем инъекции и включающие, без ограничения, внутривенные, внутримышечные, внутриартериальные, интратекальные, внутрисуставные, внутриглазничные, внутрисердечные, внутриглазные, интравитреальные, внутрикожные, внутрибрюшинные, транстрахеальные, подкожные, подкутикулярные, внутрисуставные, субкапсулярные, субарахноидальные, интраспинальные, эпидуральные и внутригрудинные инъекции и вливания.
[0123] Указанные композиции также могут содержать адъюванты, например, консерванты, увлажнители, эмульгаторы и диспергаторы. Предотвращение присутствия микроорганизмов можно обеспечить как за счет процедур стерилизации, описанных выше, так и включения различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, парабена, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты и т.п. Также может быть целесообразно включение в композицию изотонических агентов, например, углеводов, хлорида натрия и т.п. Кроме того, длительное поглощение фармацевтической формы, вводимой путем инъекции, можно обеспечить за счет включения агентов, замедляющих поглощение, например, моностеарата алюминия и желатина.
[0124] Независимо от выбранного пути введения, описанные антитела, которые можно использовать в подходящей гидратированной форме, и/или фармацевтические композиции, содержащие антитела, составляют в виде фармацевтически приемлемых лекарственных форм с использованием обычных способов, известных специалистам.
[0125] Фактическую дозировку активного ингредиента в фармацевтических композициях можно изменять с целью получения количества активного ингредиента, являющегося эффективным с точки зрения достижения желательного терапевтического ответа у конкретного пациента при данной композиции и режиме введения и не являющегося токсичным для пациента. Выбранная дозировка зависит от различных фармакокинетических факторов, включая активность конкретных используемых композиций согласно настоящему изобретению, пути введения, времени введения, скорости выведения конкретного используемого соединения, продолжительности лечения, других лекарственных веществ, соединений и/или материалов, используемых в комбинации с конкретными используемыми композициями, возраста, половой принадлежности, общего состояния здоровья и предыдущей истории болезни пациента, подвергаемого лечению, и т.п. факторов, общеизвестных в области медицины.
[0126] Подходящие дозы фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе, при интравитреальной доставке находятся в диапазоне от приблизительно 0,1 мг до приблизительно 50 мг на глаз. Дополнительные подходящие дозы включают от приблизительно 0,2 мг до приблизительно 40 мг на глаз, от приблизительно 0,3 мг до приблизительно 30 мг на глаз, от приблизительно 0,4 мг до приблизительно 20 мг на глаз, от приблизительно 0,5 мг до приблизительно 15 мг на глаз, от приблизительно 0,5 мг до приблизительно 10 мг на глаз, приблизительно 0,5 мг на глаз, приблизительно 0,75 мг на глаз, приблизительно 1 мг на глаз, приблизительно 1,5 мг на глаз, приблизительно 2 мг на глаз, приблизительно 2,5 мг на глаз, приблизительно 3 мг на глаз, приблизительно 3,5 мг на глаз, приблизительно 4 мг на глаз, приблизительно 4,5 мг на глаз, приблизительно 5 мг на глаз, приблизительно 5,5 мг на глаз, приблизительно 6 мг на глаз, приблизительно 6,5 мг на глаз, приблизительно 7 мг на глаз, приблизительно 7,5 мг на глаз, приблизительно 8 мг на глаз, приблизительно 8,5 мг на глаз, приблизительно 9 мг на глаз, приблизительно 9,5 мг на глаз, приблизительно 10 мг на глаз, приблизительно 11 мг на глаз, приблизительно 12 мг на глаз, приблизительно 13 мг на глаз, приблизительно 14 мг на глаз, приблизительно 15 мг на глаз, приблизительно 15 мг на глаз, приблизительно 17 мг на глаз, приблизительно 18 мг на глаз, приблизительно 19 мг на глаз или приблизительно 20 мг на глаз, но не ограничиваются ими.
[0127] Композиция должна быть стерильной и в достаточной степени жидкой для возможности ее доставки с помощью шприца. Кроме воды носитель предпочтительно представляет собой изотонический забуференный раствор хлорида натрия.
[0128] Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, путем использования покровных материалов, например, лецитина, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем использования ПАВ. Во многих случаях предпочтительно включать в композицию изотонические агенты, например, углеводы, многоатомные спирты, например, маннит или сорбит, и хлорид натрия.
[0129] Фармацевтические композиции и системы доставки лекарственных веществ, содержащие моноспецифические и/или биспецифические антитела человека против ANG-2 можно вводить в область внутри глаза с помощью шприца или можно вставлять (имплантировать) в глаз различными способами, в том числе путем размещения с помощью пинцета, троакара или других типов аппликаторов после рассечения склеры. В некоторых случаях троакар или аппликатор можно использовать без выполнения надреза. В предпочтительном варианте для помещения одного или более биоразлагаемых имплантатов в глаз используют ручной аппликатор. Ручной аппликатор, как правило, содержит иглу из нержавеющей стали 18-30 калибра (GA), рычаг, привод и поршень. Подходящие устройства для помещения имплантата или имплантатов в заднюю область глаза включают устройства, описанные в патенте US7090681.
[0130] Способ введения, как правило, в первую очередь включает достижение целевого участка в области глаза с помощью иглы, троакара или устройства для имплантации. После попадания в целевую область, например, полость стекловидного тела, нажимают рычаг на ручном устройстве, чтобы привод переместил поршень вперед. По мере движения поршня вперед он выталкивает имплантаты в целевую область (т.е. стекловидное тело).
[0131] В рамках настоящего изобретения можно применять различные методики изготовления имплантатов. Методики, которые можно применять, включают способы разделения фаз, межфазные способы, способы экструзии, способы сжатия, способы формования, способы литья под давлением, способы прессования в горячем виде и т.п.
[0132] Термин «внутриглазная инъекция» относится к инъекции, вводимой в глазное яблоко пациента. Термин «окологлазничная инъекция» относится к инъекции, вводимой за глазное яблоко пациента за пределами оболочек глаза. Термин «трансзонулярный» относится к инъекции через ресничный поясок, который представляет собой ряд волокон, соединяющих ресничное тело и хрусталик глаза. Термин «интравитреальный» относится к инъекции через глаз пациента непосредственно во внутреннюю полость глаза.
[0133] Фармацевтические составы, описанные в настоящем документе, можно доставлять с помощью внутриглазной интравитреальной инъекции, которая может быть трансзонулярной, или, при желании, не трансзонулярной. Внутриглазная интравитреальная инъекция этого состава, выполненная трансзонулярно или непосредственно через плоскую часть ресничного тела (транссклерально), доставляет сильнодействующие антибиотики широкого спектра непосредственно в гнойную ткань без необходимости срочного составления нескольких отдельных лекарственных средств или нескольких отдельных инъекций в глаз.
[0134] Как правило, фармацевтическая композиция, описанная выше, предназначена для внутриглазного введения субъекту-млекопитающему (например, человеку, кошке, собаке, другому мелкому домашнему животному, домашним, диким или сельскохозяйственным животным), нуждающемуся в лечении. Композицию следует вводить интравитреально и трансзонулярно с использованием способов и методик, известных специалистам в области офтальмологии.
[0135] Как правило, доставка может быть выполнена через обычную канюлю 27 калибра с использованием 1-мл шприца для введения туберкулина, уделяя особое внимание ресуспендированию композиции резким постукиванием и встряхиванием непосредственно перед инъекцией. Объем (т.е. дозировка) лекарственного средства, необходимый для данного состава, зависит от вида офтальмологического расстройства и анатомических соображений относительно доступного объема инъекции, добавляемого в закрытое внутриглазное пространство.
[0136] Кроме того, в рамки настоящего изобретения входит внутрикамерная инъекция (т.е. в переднюю камеру глаза).
[0137] В альтернативных вариантах реализации при желании или необходимости составы также можно доставлять в виде глазных капель или глазных спреев, а также субконъюнктивальной инъекцией, внутриглазной внутрикамерной инъекцией, субтеноновой инъекцией, внутрисуставной инъекцией или внутриочаговой инъекцией, в частности, в некоторых случаях, при необходимости доставки дополнительного лекарственного средства, если она оправдана потребностями пациента, но не ограничиваясь этим.
[0138] Следующие примеры, перечень последовательностей и чертежи предназначены для облегчения понимания настоящего изобретения, реальные рамки которого заданы прилагаемой формулой изобретения. Следует понимать, что в вышеприведенные процедуры можно внести модификации без отклонения от сущности изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. HCAb с константными областями мыши против ANG-2
[0139] Все процедуры на животных выполнены в соответствии с руководствами, установленными комитетом организации по уходу за животными и их использованию. HCAb-мышей из Harbor Antibodies (Кембридж, штат Массачусетс, США) использовали для получения антител против ANG-2.
[0140] Пять самок HCAb-мышей первоначально иммунизировали внутрибрюшинной инъекцией 10 мкг очищенного ANG-2 человека (R&D systems, Миннеаполис, штат Миннесота, США) и полного адъюванта Фрейнда (CFA, Sigma, Сент-Луис, штат Миссури, США) в день 0. Мышей повторно стимулировали внутрибрюшинной инъекцией 10 мкг очищенного ANG-2 человека и неполного адъюванта Фрейнда (IFA, Sigma, Сент-Луис, штат Миссури, США) в 15, 30 и 45 дни. Титры антител против ANG-2 в сыворотке определяли в 60 день по графику иммунизации. За три дня до извлечения селезенок мышей стимулировали внутривенной инъекцией ANG-2 человека (10 мкг/мышь). Слияние клеток выполняли в соответствии со стандартными методиками гибридомной технологии с использованием SP20 в качестве партнера по слиянию. Супернатанты гибридом подвергали скринингу с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (твердофазного ИФА) с целью обнаружения антител против ANG-2 человека. Позитивные культуры размножали и дважды субклонировали путем лимитирующего разведения. Препараты антител, очищенных белком A, использовали во всех исследованиях.
Пример 2. HCAb с константными областями человека против ANG-2
[0141] Из желательных гибридом выделяли общую РНК и амплифицировали ее с помощью ПЦР с использованием специфических праймеров. Выделенные VH-области из каждой гибридомы (фиг. 3) присоединяли к шарнирной области IgG1 и областям СН2/СН3 с образованием последовательности HCAb в экспрессирующей плазмиде GS SYSTEM™ (Lonza, Базель, Швейцария). Экспрессирующую плазмиду трансфицировали в линию клеток CHO для продукции рекомбинантного полностью человеческого HCAb.
[0142] Типичное антитело человека против ANG-2, полученное описанными способами, получило название A33A8 и содержало аминокислотную последовательность, приведенную в таблице 2. Каркасную (FR), шарнирную и константные (CH) области можно использовать с любыми CDR HCAb.
Таблица 2
Область
Последовательность
SEQ ID NO:
A33A8 VH-CH2-CH3
QVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLVWVSR INSDGSSTSY ADSVKGRFTI SRDNAKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAREG YSSGGQFDYW GQGTLVTVSS EPKSCDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
9
A33A8 VH-шарнир
QVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLVWVSR INSDGSSTSY ADSVKGRFTI SRDNAKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAREG YSSGGQFDYW GQGTLVTVSS EPKSCDKTHT CP
10
A33A8 VH
QVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLVWVSR INSDGSSTSY ADSVKGRFTI SRDNAKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAREG YSSGGQFDYW GQGTLVTVSS
25
FR1
QVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAAS
11
A33A8 CDR1
GFTFSSYW
12
FR2
WMHWVRQAPG KGLVWVSR
13
A33A8 CDR2
INSDGSST
14
FR3
ADSVKGRFTI SRDNAKNTLY LQMNSLRAED TAVYYC
15
A33A8 CDR3
AREGYSSGGQFDY
16
FR4
WGQGTLVTVSS
17
Шарнирная область
EPKSCDKTHTCP
18
CH2
PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA K
19
CH3
GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK
20
[0143] Дополнительные HCAb против ANG-2, получившие обозначения A1G2, A2F8, A2B6 и A1B1, содержат следующие аминокислотные последовательности VH-областей:
Таблица 3
Область
Последовательность
SEQ ID NO:
A1G2 VH
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPG KGLVWVSRINSDGSSTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMN SLRAEDTAVYYCSSEGFSSGEHSEFWGQGTLVTVSS
21
A1G2 CDR1
GFTFSSYW
26
A1G2 CDR2
INSDGSST
27
A1G2 CDR3
SSEGFSSGEHSEF
28
A1F8 VH
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLV WVSRINSDGSSTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTA VYYCSSEGYSSEAHSQYWGQGTLVTVSS
22
A1F8 CDR1
GFTFSSYW
29
A1F8 CDR2
INSDGSST
30
A1F8 CDR3
SSEGYSSEAHSQY
31
A2B6 VH
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFAAYWMHWVRQAPGKGLVWV SRINSDGSSTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AREGYSSGGQFDYWGQGTLVTVSS
23
A2B6 CDR1
GYTFAAYW
32
A2B6 CDR2
INSDGSST
33
A2B6 CDR3
AREGYSSGGQFDY
34
A1B1 VH
QVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSYAAFWMSWVRQAPGK GLEWVSAINSDGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSL RAEDTAVYYCAREGYSSGGQFDYWGQGTLVTVSS
24
A1B1 CDR1
GYSYAAFW
35
A1B1 CDR2
INSDGSST
36
A1B1 CDR3
AREGYSSGGQFDY
37
Пример 3. Оценка характеристик HCAb против ANG-2
e
асс
дисс
[0144] Измерения сродства выполняли с использованием системы fortéBIO OCTET QK, оснащенной захватывающим наконечником для биосенсора с антителами против Fc IgG человека (AHC) и биосенсорами, покрытыми стрептавидином (fortéBIO, Менло-Парк, штат Калифорния, США). Для измерения сродства AHC очищенное HCAb A33A8 против ANG-2 тестировали на предмет способности связываться с AHC-наконечниками сенсора. Наконечники загружали 20 мкг/мл HCAb A33A8 против ANG-2 . Загрузка продолжалась 300 с, полученные уровни захвата составили от 1,8 до 2 нм. Антиген ANG-2 (R & D systems) подготавливали к анализу связывания путем разбавления до концентрации 20-500 нМ в 1xPBS. Ассоциацию инициировали и контролировали в течение 200 сек, после чего наконечники переносили в 1xPBS-буфер без факторного белка (Gibco, PBS, рН 7,2) с целью мониторинга диссоциации. Затем выполняли мониторинг связывающей активности HCAb A33A8 против ANG-2 в режиме реального времени с использованием интерферометрии в биослое. Сродство связывания с антигеном рассчитывали для тестируемого ANG-2 на основании измеренных констант ассоциации («K») и диссоциации («К»). Данные обрабатывали и анализировали с помощью программного обеспечения OCTET 6.4 для анализа данных (fortéBIO) (фиг. 4). A33A8 связывается с ANG-2 с Kd менее 1 пикомоля. Он не реагирует с ANG-2 крысы, но перекрестно реагирует с ANG-2 кролика. Кроме того, A33A8 не реагирует с ANG-1.
[0145] Tie-2-hFc (R & D Systems) наносили на 96-луночные титрационные микропланшеты в количестве два микрограмма на миллилитр на лунку в течение ночи при 4°С. В отдельном планшете серийные разведения HCAb A33A8 инкубировали с 2 нМ биотинилированного ANG-2 человека (R & D Systems) в течение 1 ч. Сто микролитров смеси A33A8-ANG-2 наносили на титрационные микропланшеты, покрытые Tie-2-hFc, на 1 ч. Затем добавляли детектирующее антитело (антитело против биотина, конъюгированное с ПХ) на 1 ч, проявляли ИФА хемилюминесцентным субстратом ПХ и считывали с помощью планшет-ридера для твердофазного ИФА (фиг. 5). A33A8 полностью блокировало связывание ANG-2 с его рецептором Tie-2.
Пример 4. Конкурентный твердофазный ИФА HCAb против ANG2
[0146] Tie-2-hFc (R&D Systems) наносили на 96-луночные титрационные микропланшеты в количестве два микрограмма на миллилитр на лунку в течение ночи при 4 °С. В отдельном планшете серийные разведения HCAb инкубировали с 2 нМ биотинилированного ANG-2 человека (R&D Systems) в течение 1 ч. Сто микролитров смеси "HCAb против ANG-2 - ANG-2" наносили на титрационные микропланшеты, покрытые Tie-2-hFc, на 1 ч. Затем добавляли детектирующее антитело (антитело против биотина, конъюгированное с ПХ) на 1 ч, проявляли ИФА хемилюминесцентным субстратом ПХ и считывали с помощью планшет-ридера для твердофазного ИФА. Данные анализировали при помощи GraphPad Prism 6.
Пример 5. Анализ сканирования аланином молекулы HCAb A33A8 против ANG-2
[0147] Сканирование аланином использовали для выявления положений аминокислот в последовательностях CDR, модификация которых приводила к изменению сродства связывания HCAb A33A8 против ANG-2.
[0148] Конкретные CDR для использования в описанном HCAb A33A8 против ANG-2 представлены в таблице 4, подчеркнуты аминокислоты, замена которых на аланин существенно снижала связывание.
Таблица 4
HC CDR1
GFTFSSYW
SEQ ID NO:12
HC CDR2
INSDGSST
SEQ ID NO:14
HC CDR3
AREGYSSGGQFDY
SEQ ID NO:16
[0149] Таким образом, HCAb-антитела, содержащие замены по определенным остаткам в CDR A33A8, входят в рамки настоящего изобретения. В одном варианте реализации CDR1 A33A8 содержит последовательность GFTFSSYW (SEQ ID NO:12), в которой одна, две, три, четыре или все аминокислоты в положениях 1, 3, 4, 5, 6 замещены любой аминокислотой. В других вариантах реализации CDR1 A33A8 содержит последовательность GFTFSSYW, в которой одна, две, три, четыре или все аминокислоты в положениях 1, 3, 4, 5, 6 замещены консервативной аминокислотой, как описано в настоящем документе. В еще одном варианте реализации CDR1 A33A8 содержит последовательность GFTFSSYW, в которой одна, две, три, четыре или все аминокислоты в положениях 1, 3, 4, 5, 6 замещены аминокислотой того же класса, согласно определению в настоящем документе.
[0150] В одном варианте реализации CDR2 A33A8 содержит последовательность INSDGSST (SEQ ID NO:14), в которой одна, две, три, четыре или все аминокислоты в положениях 1, 3, 6, 7 или 8 замещены любой аминокислотой. В других вариантах реализации CDR2 A33A8 содержит последовательность INSDGSST, в которой одна, две, три, четыре или все аминокислоты в положениях 1, 3, 6, 7 или 8 замещены консервативной аминокислотой, как описано в настоящем документе. В еще одном варианте реализации CDR2 A33A8 содержит последовательность INSDGSST, в которой одна, две, три, четыре или все аминокислоты в положениях 1, 3, 6, 7 или 8 замещены аминокислотой того же класса, согласно определению в настоящем документе.
[0151] В еще одном варианте реализации CDR3 A33A8 содержит последовательность AREGYSSGGQFDY (SEQ ID NO:16), в которой одна, две или все аминокислоты в положениях 1, 10 или 11 замещены любой аминокислотой. В других вариантах реализации CDR3 A33A8 содержит последовательность AREGYSSGGQFDY, в которой одна, две или все аминокислоты в положениях 1, 10 или 11 замещены консервативной аминокислотой, как описано в настоящем документе. В других вариантах реализации CDR3 A33A8 содержит последовательность AREGYSSGGQFDY, в которой одна, две или все аминокислоты в положениях 1, 10 или 11 замещены аминокислотой того же класса, согласно определению в настоящем документе.
[0152] Если не указано иное, все числа, выражающие количества ингредиентов, такие свойства, как молекулярная масса, условия реакции и т.д., используемые в описании и формуле изобретения, во всех случаях следует понимать как модифицированные термином «приблизительно». В настоящем документе термины «около» и «приблизительно» означают в пределах 10-15%, предпочтительно в пределах 5-10%. Соответственно, если не указано иное, численные параметры, приведенные в настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения, являются приближенными значениями, которые могут изменяться в зависимости от желательных свойств, которые должны быть получены с помощью настоящего изобретения. По меньшей мере и не в качестве попытки ограничить применение доктрины эквивалентов к сущности формулы изобретения, каждый числовой параметр следует воспринимать по меньшей мере в свете количества приведенных значащих цифр и с применением обычных способов округления. Несмотря на то, что численные диапазоны и параметры, представляющие основную сущность изобретения, являются приближенными, численные значения, изложенные в конкретных примерах, приведены как можно точнее. В то же время любое численное значение по своей сути содержит определенные ошибки, неизбежно происходящие от стандартного отклонения, обнаруживаемого при соответствующих тестовых измерениях.
[0153] Формы единственного числа и аналогичные обозначения, используемые в контексте описания изобретения (особенно в контексте формулы изобретения, приведенной ниже) следует рассматривать как охватывающие и единственное, и множественное число, если иное не обозначено в настоящем документе или не следует из контекста явным образом. Перечисление диапазонов значений в настоящем документе используют лишь для укорачивания описания способа, относящегося к каждому отдельно взятому значению, лежащему в пределах этого диапазона. Если в настоящем документе не указано иное, каждое отдельное значение включено в описание, как если бы оно было отдельно приведено в настоящем документе. Все способы, описанные в настоящем документе, можно выполнять в любом порядке, если иное не указано в настоящем документе или не следует из контекста явным образом. Подразумевают, что использование всевозможных примеров или иллюстративных выражений (например, «такой, как») представлено в настоящем документе лишь для лучшего освещения изобретения и не предполагает ограничения рамок изобретения, если иное не указано в формуле изобретения. Ни одно выражение в описании не следует рассматривать в качестве обозначения элемента, не предусмотренного формулой изобретения и необходимого для осуществления изобретения.
[0154] Группировка альтернативных элементов или вариантов реализации изобретения, описанных в настоящем документе, не должна истолковываться в качестве ограничений. Каждый член группы может упоминаться и входить в состав формулы изобретения по отдельности или в любой комбинации с другими членами группы или другими элементами, содержащимися в настоящем документе. Предполагается, что один или более членов группы могут быть включены или удалены из группы из соображений удобства и/или патентоспособности. При таком включении или удалении считается, что настоящее описание содержит модифицированную группу, таким образом соответствуя письменному описанию всех групп Маркуша, используемых в прилагаемой формуле изобретения.
[0155] В настоящем документе описаны некоторые варианты реализации настоящего изобретения, включая наилучшие способы его осуществления, известные авторам. Разумеется, изменения указанных описанных вариантов реализации очевидны для специалистов при чтении вышеприведенного описания. Авторы настоящего изобретения предполагают, что специалисты при необходимости будут использовать такие изменения, и предусматривают, что настоящее изобретение может быть осуществлено иначе, чем описано в настоящем документе. Соответственно, настоящее изобретение включает все модификации и эквиваленты объекта изобретения, описываемого формулой изобретения, прилагаемой к настоящему документу, как предусмотрено действующим законодательством. Более того, настоящее изобретение включает любые комбинации вышеописанных элементов и их всевозможных вариантов, если иное не указано в настоящем документе или не следует из контекста явным образом.
[0156] Конкретные варианты реализации, описанные в настоящем документе, могут быть дополнительно ограничены в формуле изобретения с использованием выражений «состоящий из» или «состоящий в основном из». При использовании в формуле изобретения, независимо от его употребления при подаче заявки или добавлении поправок, переходный термин «состоящий из» исключает любой элемент, этап, или ингредиент, не указанный в формуле изобретения. Переходный термин «состоящий в основном из» ограничивает сущность формулы изобретения указанными материалами или этапами, а также материалами или этапами, не оказывающими существенного влияния на основные и новые характеристики. Варианты реализации настоящего изобретения, указанные в формуле изобретения таким образом, естественным образом или специально описаны и включены в настоящий документ.
[0157] Кроме того, по всему описанию приведены многочисленные ссылки на патенты и печатные публикации. Каждый из процитированных выше источников и печатных публикаций по отдельности полностью включен в настоящий документ посредством ссылки.
[0158] В заключение следует понимать, что описанные в настоящем документе варианты реализации иллюстрируют принципы настоящего изобретения. Другие модификации, которые можно использовать, входят в рамки настоящего изобретения. Таким образом, в качестве примера, но не ограничения, можно применять альтернативные конфигурации вариантов реализации настоящего изобретения согласно приведенным в настоящем документе инструкциям. Соответственно, настоящее изобретение не ограничивается тем, что продемонстрировано и описано в данном документе.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Allergan Plc
<120>  Антитела против ANG-2, содержащие только тяжелую цепь
<130>  19864(NTB)
<150>  US 62/198 518
<151>  29.07.2015
<150>  US 62/205 185
<151>  14.08.2015
<160>  25
<170>  Версия PatentIn 3.5
<210>  1
<211>  496
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  1
Met Trp Gln Ile Val Phe Phe Thr Leu Ser Cys Asp Leu Val Leu Ala
1               5                   10                  15
Ala Ala Tyr Asn Asn Phe Arg Lys Ser Met Asp Ser Ile Gly Lys Lys
20                  25                  30
Gln Tyr Gln Val Gln His Gly Ser Cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro
35                  40                  45
Glu Met Asp Asn Cys Arg Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Val Ser Asn Ala
50                  55                  60
Val Gln Arg Asp Ala Pro Leu Glu Tyr Asp Asp Ser Val Gln Arg Leu
65                  70                  75                  80
Gln Val Leu Glu Asn Ile Met Glu Asn Asn Thr Gln Trp Leu Met Lys
85                  90                  95
Leu Glu Asn Tyr Ile Gln Asp Asn Met Lys Lys Glu Met Val Glu Ile
100                 105                 110
Gln Gln Asn Ala Val Gln Asn Gln Thr Ala Val Met Ile Glu Ile Gly
115                 120                 125
Thr Asn Leu Leu Asn Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg Lys Leu Thr Asp
130                 135                 140
Val Glu Ala Gln Val Leu Asn Gln Thr Thr Arg Leu Glu Leu Gln Leu
145                 150                 155                 160
Leu Glu His Ser Leu Ser Thr Asn Lys Leu Glu Lys Gln Ile Leu Asp
165                 170                 175
Gln Thr Ser Glu Ile Asn Lys Leu Gln Asp Lys Asn Ser Phe Leu Glu
180                 185                 190
Lys Lys Val Leu Ala Met Glu Asp Lys His Ile Ile Gln Leu Gln Ser
195                 200                 205
Ile Lys Glu Glu Lys Asp Gln Leu Gln Val Leu Val Ser Lys Gln Asn
210                 215                 220
Ser Ile Ile Glu Glu Leu Glu Lys Lys Ile Val Thr Ala Thr Val Asn
225                 230                 235                 240
Asn Ser Val Leu Gln Lys Gln Gln His Asp Leu Met Glu Thr Val Asn
245                 250                 255
Asn Leu Leu Thr Met Met Ser Thr Ser Asn Ser Ala Lys Asp Pro Thr
260                 265                 270
Val Ala Lys Glu Glu Gln Ile Ser Phe Arg Asp Cys Ala Glu Val Phe
275                 280                 285
Lys Ser Gly His Thr Thr Asn Gly Ile Tyr Thr Leu Thr Phe Pro Asn
290                 295                 300
Ser Thr Glu Glu Ile Lys Ala Tyr Cys Asp Met Glu Ala Gly Gly Gly
305                 310                 315                 320
Gly Trp Thr Ile Ile Gln Arg Arg Glu Asp Gly Ser Val Asp Phe Gln
325                 330                 335
Arg Thr Trp Lys Glu Tyr Lys Val Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu
340                 345                 350
Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Val Ser Gln Leu Thr Asn Gln Gln Arg
355                 360                 365
Tyr Val Leu Lys Ile His Leu Lys Asp Trp Glu Gly Asn Glu Ala Tyr
370                 375                 380
Ser Leu Tyr Glu His Phe Tyr Leu Ser Ser Glu Glu Leu Asn Tyr Arg
385                 390                 395                 400
Ile His Leu Lys Gly Leu Thr Gly Thr Ala Gly Lys Ile Ser Ser Ile
405                 410                 415
Ser Gln Pro Gly Asn Asp Phe Ser Thr Lys Asp Gly Asp Asn Asp Lys
420                 425                 430
Cys Ile Cys Lys Cys Ser Gln Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp
435                 440                 445
Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Tyr Tyr Pro Gln Arg Gln
450                 455                 460
Asn Thr Asn Lys Phe Asn Gly Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp Lys Gly Ser
465                 470                 475                 480
Gly Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Ala Asp Phe
485                 490                 495
<210>  2
<211>  6
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический линкер
<400>  2
Glu Pro Lys Ser Cys Asp
1               5
<210>  3
<211>  6
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический линкер
<400>  3
Ala Ser Thr Lys Gly Pro
1               5
<210>  4
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический линкер
<220>
<221>  ПОВТОР
<222>  (1)..(5)
<223>  Возможен повтор до 8 раз
<400>  4
Gly Gly Gly Gly Ser
1               5
<210>  5
<211>  123
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH бевацизумаба
<400>  5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50                  55                  60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  6
<211>  108
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL бевацизумаба
<400>  6
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100                 105
<210>  7
<211>  123
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH ранибизумаба
<400>  7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr
20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50                  55                  60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  8
<211>  108
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL ранибизумаба
<400>  8
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100                 105
<210>  9
<211>  352
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCAb A33A8 VH-CH2-CH3
<400>  9
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val
35                  40                  45
Ser Arg Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Gly Tyr Ser Ser Gly Gly Gln Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
115                 120                 125
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
130                 135                 140
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
145                 150                 155                 160
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
165                 170                 175
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
180                 185                 190
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
195                 200                 205
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
210                 215                 220
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
225                 230                 235                 240
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
245                 250                 255
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
260                 265                 270
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
275                 280                 285
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
290                 295                 300
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
305                 310                 315                 320
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
325                 330                 335
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340                 345                 350
<210>  10
<211>  132
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCAb A33A8 VH
<400>  10
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val
35                  40                  45
Ser Arg Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Gly Tyr Ser Ser Gly Gly Gln Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
115                 120                 125
His Thr Cys Pro
130
<210>  11
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCAb FR1
<400>  11
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20                  25
<210>  12
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCAb A33A8 CDR1
<400>  12
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Trp
1               5
<210>  13
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCAb FR2
<400>  13
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val
1               5                   10                  15
Ser Arg
<210>  14
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCAb A33A8 CDR2
<400>  14
Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr
1               5
<210>  15
<211>  36
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCAb FR3
<400>  15
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
1               5                   10                  15
Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
20                  25                  30
Val Tyr Tyr Cys
35
<210>  16
<211>  13
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCAb A33A8 CDR3
<400>  16
Ala Arg Glu Gly Tyr Ser Ser Gly Gly Gln Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>  17
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCAb FR4
<400>  17
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>  18
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Шарнирная область HCAb
<400>  18
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>  19
<211>  111
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCAb CH2
<400>  19
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
1               5                   10                  15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20                  25                  30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35                  40                  45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50                  55                  60
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
65                  70                  75                  80
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
85                  90                  95
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
100                 105                 110
<210>  20
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCAb CH3
<400>  20
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
1               5                   10                  15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20                  25                  30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35                  40                  45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50                  55                  60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65                  70                  75                  80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85                  90                  95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100                 105
<210>  21
<211>  120
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCAb A1G2 VH
<400>  21
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val
35                  40                  45
Ser Arg Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ser Ser Glu Gly Phe Ser Ser Gly Glu His Ser Glu Phe Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  22
<211>  120
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCAb A1F8 VH
<400>  22
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val
35                  40                  45
Ser Arg Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ser Ser Glu Gly Tyr Ser Ser Glu Ala His Ser Gln Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  23
<211>  120
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCAb A2B6 VH
<400>  23
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Ala Tyr
20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val
35                  40                  45
Ser Arg Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Gly Tyr Ser Ser Gly Gly Gln Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  24
<211>  120
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCAb A1B1 VH
<400>  24
Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Tyr Ala Ala Phe
20                  25                  30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ala Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Gly Tyr Ser Ser Gly Gly Gln Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  25
<211>  120
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCAb A33A8 VH
<400>  25
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val
35                  40                  45
Ser Arg Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Gly Tyr Ser Ser Gly Gly Gln Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  26
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCAb A1G2 CDR1
<400>  26
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Trp
1               5
<210>  27
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCAb A1G2 CDR2
<400>  27
Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr
1               5
<210>  28
<211>  13
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCAb A1G2 CDR3
<400>  28
Ser Ser Glu Gly Phe Ser Ser Gly Glu His Ser Glu Phe
1               5                   10
<210>  29
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCAb A1F8 CDR1
<400>  29
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Trp
1               5
<210>  30
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCAb A1F8 CDR2
<400>  30
Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr
1               5
<210>  31
<211>  13
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCAb A1F8 CDR3
<400>  31
Ser Ser Glu Gly Tyr Ser Ser Glu Ala His Ser Gln Tyr
1               5                   10
<210>  32
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCAb A2B6 CDR1
<400>  32
Gly Tyr Thr Phe Ala Ala Tyr Trp
1               5
<210>  33
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCAb A2B6 CDR2
<400>  33
Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr
1               5
<210>  34
<211>  13
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCAb A2B6 CDR3
<400>  34
Ala Arg Glu Gly Tyr Ser Ser Gly Gly Gln Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>  35
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCAb A1B1 CDR1
<400>  35
Gly Tyr Ser Tyr Ala Ala Phe Trp
1               5
<210>  36
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCAb A1B1 CDR2
<400>  36
Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr
1               5
<210>  37
<211>  13
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCAb A1B1 CDR3
<400>  37
Ala Arg Glu Gly Tyr Ser Ser Gly Gly Gln Phe Asp Tyr
1               5                   10
<---