АДАПТИРОВАННАЯ РЕКОМБИНАЗА ДЛЯ РЕКОМБИНАЦИИ АСИММЕТРИЧНЫХ УЧАСТКОВ-МИШЕНЕЙ ВО МНОЖЕСТВЕ ШТАММОВ РЕТРОВИРУСОВ

1. Способ приготовления экспрессионного вектора, кодирующего адаптированную рекомбиназу, которая способна к рекомбинации асимметричных последовательностей-мишеней внутри LTR провирусной ДНК множества ретровирусных штаммов, включающий стадии
a) идентификации последовательностей с гомологией, по крайней мере, 30% в отношении последовательности левой половины участка и последовательности правой половины участка, по крайней мере, одного известного рекомбиназного участка-мишени в последовательности LTR провирусной ДНК множества штаммов ретровирусов, где гомологичные последовательности разделены спейсером в 5-12 нуклеотидов, и где асимметричная последовательность-мишень обнаруживается во множестве штаммов ретровирусов;
(b) идентификации двух последовательностей, где первая последовательность соответствует последовательности асимметричной последовательности-мишени стадии (а), гомологичной левой половине участка указанного известного участка-мишени, и называется «последовательность половины участка 1», и где вторая последовательность соответствует последовательности асимметричной последовательности-мишени стадии (а), гомологичной правой половине участка, и называется «последовательность половины участка 2»;
(c) определения нуклеотидов внутри последовательностей стадии (b), отклоняющихся от соответствующих гомологичных последовательностей левой половины участка и правой половины участка, по крайней мере, известного гомологичного участка-мишени стадии (a);
(d) генерации первой подгруппы двух нуклеиновых кислот-мишеней, содержащих последовательности-мишени, где первая последовательность-мишень обозначена подгруппой 1 и включает, друг рядом с другом и в направлении от 5' к 3', последовательность половины участка 1 стадии (b), спейсерную последовательность асимметричной последовательности-мишени и инвертированный повтор последовательности половины участка 1, и где вторая последовательность-мишень обозначена подгруппой 2 и включает, друг рядом с другом и в направлении от 5' к 3', последовательность половины участка 2, спейсерную последовательность асимметричной последовательности-мишени и последовательность половины участка 2 стадии (b);
(е) генерации второй подгруппы нуклеиновых кислот-мишеней, содержащих модифицированные последовательности-мишени на основе последовательностей-мишеней в первой подгруппе стадии (d),
где, в последовательностях на основе подучастка 1, в последовательности левой половины участка, часть нуклеотидов, отклоняющихся от соответствующей гомологичной последовательности половины участка, по крайней мере, одного известного участка-мишени стадии (а) заменяют нативными нуклеотидами, встречавшимися в указанном известном участке-мишени, до тех пор, пока указанная последовательность половины участка не будет содержать один, два или три нуклеотида, отклоняющихся от указанного известного участка-мишени, где правая половина участка указанной модифицированной последовательности-мишени образована инвертированным повтором указанной модифицированной последовательности левой половины участка, которая отделена от указанной модифицированной последовательности левой половины участка спейсерной последовательностью асимметричной последовательности-мишени, и
где, в последовательностях на основе подучастка 2, в последовательности правой половины участка, часть нуклеотидов, отклоняющихся от соответствующей гомологичной последовательности половины участка, по крайней мере, одного известного участка-мишени стадии (а) заменяют нативными нуклеотидами, встречавшимися в указанном известном участке-мишени, до тех пор, пока указанная последовательность половины участка не будет содержать один, два или три нуклеотида, отклоняющихся от указанного известного участка-мишени, где левая половина участка указанной модифицированной последовательности-мишени образована инвертированным повтором указанной модифицированной последовательности правой половины участка, которая отделена от указанной модифицированной последовательности правой половины участка спейсерной последовательностью асимметричной последовательности-мишени,
так что во всех модифицированных последовательностях половин участка, происходящих из одной последовательности-мишени первой подгруппы стадии (d), вместе взятых, можно обнаружить все отклоняющиеся нуклеотиды, тогда как ни одна из указанных модифицированных последовательностей половин участка на всем протяжении не содержит все отклоняющиеся нуклеотиды,
(f) применения отдельно молекулярной направленной эволюции, по крайней мере, на одной рекомбиназе, узнающей известный гомологичный участок-мишень в соответствии со стадией (а), с использованием каждой нуклеиновой кислоты второй подгруппы, полученной на стадии (e), в качестве субстрата;
(g) перетасовывания рекомбиназных библиотек, образованных на стадии (f), где все рекомбиназные библиотеки, образованные на последовательностях на основе подучастка 1, объединяют и перетасовывают, и где все рекомбиназные библиотеки, образованные на последовательностях на основе подучастка 2, объединяют и перетасовывают;
(h) применения молекулярной направленной эволюции на перетасованных библиотеках, полученных на стадии (g), с использованием каждой нуклеиновой кислоты подгруппы в соответствии со стадией (d) в качестве субстрата;
(i) перетасовки рекомбиназных библиотек, образованных на стадии (h);
(j) применения молекулярной направленной эволюции на перетасованной библиотеке, полученной на стадии (g), с использованием нуклеиновой кислоты, содержащей асимметричную последовательность-мишень стадии (а), в качестве субстрата, до тех пор, пока не получится, по крайней мере, одна рекомбиназа, которая действует на асимметричную последовательность-мишени внутри LTR ретровирусной ДНК стадии (a);
(k) выделения нуклеиновой кислоты, кодирующей, по меньшей мере, одну рекомбиназу, полученную на стадии (j) из библиотеки; и
(l) клонирования нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (k), в подходящем экспрессионном векторе.
2. Способ по п.1, где ретровирус представляет собой ВИЧ, предпочтительно ВИЧ-1.
3. Способ по п.2, где ретровирус представляет собой ВИЧ-1, и асимметричная последовательность-мишень имеет последовательность SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2.
4. Способ по любому из пп.1-3, где, по крайней мере, одна известная рекомбиназа, чья последовательность-мишень используется на стадии (a) и на которой молекулярная направленная эволюция применяется на стадии (f), является частью рекомбиназной библиотеки.
5. Способ по п.1, где примененная молекулярная направленная эволюция представляет собой субстрат-связанную белковую эволюцию.
6. Способ по п.1, где экспрессионный вектор на стадии (l) выбирают из группы, состоящей из векторов ретровирусов, векторов лентивирусов, векторов спумавирусов и векторов аденовирусов.
7. Способ приготовления адаптированной рекомбиназы, где указанный способ включает способ по любому из пп.1-6 и дополнительную стадию экспрессии адаптированной рекомбиназы с нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбиназу, встроенную в экспрессионный вектор в подходящей клетке-хозяине, где рекомбиназа необязательно экспрессируется в качкстве слитого полипептида, содержащего аминокислотную последовательность адаптированной рекомбиназы.
in vitro
8. Способ приготовления трансформированных клеток, где указанный способ включает способ по любому из пп.1-6 и дополнительную стадию введения экспрессионного вектора в клетку, где клетка предпочтительно представляет собой взрослую стволовую клетку.
9. Способ по любому из пп. 1, 7 и 8, дополнительно включающий стадию приготовления экспрессионного вектора, рекомбиназы или клетки в качестве фармацевтической композиции.
10. Нуклеиновая кислота, кодирующая адаптированную рекомбиназу; адаптированная рекомбиназа, которая способна к рекомбинации асимметричных последовательностей-мишеней внутри LTR провирусной ДНК множества ретровирусных штаммов, где аминокислотная последовательность адаптированной рекомбиназы имеет, по крайней мере, 97% идентичности последовательности SEQ ID NO: 38, где нуклеиновая кислота необязательно представляет собой экспрессионный вектор.
11. Нуклеиновая кислота как получаемая со стадии (k) способа по любому из пп.1-6 или экспрессионный вектор как получаемый способом по любому из пп.1-6, где аминокислотная последовательность адаптированной рекомбиназы необязательно имеет, по крайней мере, 97% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 38 и/или где адаптированная рекомбиназа, кодируемая нуклеиновой кислотой, необязательно содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37.
12. Нуклеиновая кислота по п.10 или 11, где адаптированная рекомбиназа содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, где указанная адаптированная рекомбиназа содержит, по крайней мере, одну, предпочтительно 2, 3, 4, 5, 6 или 7 определенных аминокислотных замен, по сравнению с последовательностью Cre (SEQ ID NO: 36), выбранных из группы, состоящей из: P12S, P15L, M44V, K86N, G93A, A175S и P307A.
13. Нуклеиновая кислота по п.10 или 11, где аминокислотная последовательность адаптированной рекомбиназы содержит последовательность SEQ ID NO: 38, где аминокислотная последовательность адаптированной рекомбиназы необязательно содержит последовательность SEQ ID NO: 39, и/или где аминокислотная последовательность адаптированной рекомбиназы необязательно выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 40-64 и комбинации последовательностей из группы, состоящей из SEQ ID NO: 40-64.
14. Адаптированная рекомбиназа, кодируемая нуклеиновой кислотой по любому из пп.10-13, которую необязательно экспрессируют как слитый белок.
15. Трансформированная клетка, содержащая нуклеиновую кислоту по любому из пп.10-13, где указанная клетка предпочтительно представляет собой стволовую клетку из гематопоэтической линии.
16. Фармацевтическая композиция, содержащая нуклеиновую кислоту по любому из пп.10-13, адаптированную рекомбиназу по п. 14 и/или трансформированную клетку по п.15.
17. Фармацевтическая композиция по п.16, где фармацевтическая композиция предназначена для применения при лечении или профилактике ретровирусной инфекции у субъекта, где ретровирус предпочтительно представляет собой ВИЧ, в частности ВИЧ-1, где фармацевтическую композицию необязательно составляют для введения субъекту, если провирусная ДНК, обнаруженная в образцах, полученных от субъекта, содержит асимметричную последовательность-мишень, идентифицированную на стадии (а), на которой рекомбиназа был отобрана.