Способ повышения противоопухолевой резистентности, антиоксидантного и иммуностимулирующего воздействия на организм
METHOD FOR INCREASING ANTITUMOUR RESISTANCE, ANTIOXIDANT AND IMMUNOSTIMULATING EFFECTS ON THE BODY

Изобретение относится к медицине, а именно к средствам профилактики и лечения онкологических заболеваний на основе вакцинных препаратов.
Известно, что некоторые вакцины оказывают профилактическое и лечебное действие в отношении опухолей. В частности, вакцина БЦЖ, на основе туберкулезных микобактерий, оказалась эффективной в отношении рака мочевого пузыря (RU 2555327, 2014; RU 2350338, 2008), туляремийная живая вакцина оказалась эффективной для комплексного лечения больных раком тела матки и рака легкого (RU 2092186, 1997), вакцина, приготовленная из вируса папилломы человека, предлагается для профилактики развития рака шейки матки (RU 2180593, 2002; RU 2196568, 2003). В качестве средства, ограничивающего опухолевый рост, предложено использовать коревую вакцину (US 7393527, 2007).
Как правило, практически все вакцины имеют ограниченный спектр действия и имеют незначительную способность повышать неспецифическую противоопухолевую резистентность.
В настоящее время большое внимание уделяется использованию в качестве противоопухолевого средства ингредиентов, входящих в различные противогриппозные вакцины (US 2019032084, 2018; CN 105530954, 2016 JP 2019052175; СА 2627105, 2007; KR 20040070099 и другие).
В частности, показано перспективность лечения больных раком с использованием рекомбинантного вектора вируса гриппа, содержащему ген NS, который реплицируется в IFN-чувствительной опухоли клетки и не реплицируется в нормальных, неопухолевых клетках и экспрессирует гетерологичный иммуностимулирующий полипептид (US 2019032084, 2018); ген вируса гриппа предлагается использовать в составе ДНК-вакцинной композиции для повышения ее иммуногенности (KR 20040070099, 2004).
1
1
3
2
Наиболее близкой по технической сущности к заявляемому изобретению является использование в качестве средства для повышения противоопухолевой резистентности гриппозной тривалентной вакцины «Гриппол», которую профилактически вводят подкожно в эффективном количестве (RU 2418599, 2011). Вакцина содержит поверхностные гликопротеины (гемагглютинин и нейраминидаза), выделенные из очищенных вирусов гриппа типа А и В, и кроме того, имеет в своем составе водорастворимый высокомолекулярный иммуностимулятор-N-оксидированное производное поли-1, 4-этиленпиперазина (полиоксидоний). Одна иммунизирующая доза вакцины «Гриппол» для подкожного введения человеку (0,5 мл) содержит, согласно инструкции по применению, по 5 мкг гемагглютинина штаммов вируса гриппа типа А (подтипы HN и HN), 11 мкг гемагглютинина штаммов вируса гриппа типа В и 500 мкг полиоксидония. (Инструкция по применению вакцины гриппозной тривалентной полимерсубъединичной жидкой «Гриппол». Регистрационное удостоверение №96.309.23.) По представленным данным введение лабораторным животным противогриппозной вакцины «Гриппол» подкожно до инокуляции перевивной опухоли или до облучения в канцерогенной дозе значительно повышает противоопухолевую резистентность организма.
Недостатком использования вакцины является отсутствие ее воздействия на такой мощный фактор стимулирования противоопухолевой активности, как уровень в крови супероксиддисмутазы (СОД), а также сложность ее получения и наличие в ее составе адъюванта, что может вызывать негативное воздействие на организм в виде аутоиммунных реакций.
Задачей, решаемой авторами, являлось создание противоопухолевого средства, обладающего повышенной эффективностью за счет того, что способного наряду с противоопухолевым оказывать антиоксидантное и иммуностимулирующее воздействие на организм за счет введения в организм экзогенной супероксиддисмутазы (СОД) и индуцирования образования собственной.
Технический результат достигался за счет использования гриппозной вакцины с содержанием гемагглютинина штаммов вируса гриппа типа А (далее ГГА) от 30 до 120 мкг/ доза
Исследования показали, что наличие в вакцине менее 30 мкг/мл практически не влияет на выход СОД и не повышает противоопухолевую активность, использование ГГА в концентрации более 120 мкг/мл не приводит к существенному повышению противоопухолевой резистентности и экономически нецелесообразно. При этом использование для данных целей повышенной концентрации гемагглютинина штаммов вируса гриппа типа В не оказывает существенного влияния на продуцирование СОД.
В качестве препарата используют моно-, три- или тетравалентную вакцину без адъювантов. Необходимую концентрацию ГГА получают, как правило, в процессе приготовления моновалентов на основе штаммов вируса типа А или ведением дополнительных количеств ГГА в вакцинный препарат для приготовления вакцины.
Промышленная применимость способа иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Приготовление противоопухолевого препарата на основе моновалентной вакцины из штамма вируса гриппа H3N2
Вирус гриппа штамм Х-79 (H3N2) размножают в куриных эмбрионах, аллантоисную жидкость, содержащую вирус, осветляют микрафильтрацией, концентрируют ультрафильтрацией, очищают гель хроматографией на колонке с носителем Вирохром МПС-2000/П. После очистки вирус в количестве 20 мл с концентрацией по ГА 5 мг/мл смешивают с 20 мл фреона 113. Через 15 мин после перемешивания при +4°С супернатант, содержащий вирус, отбирают и центрифугируют в градиенте тартрат-сахароза (50-20%) в течение 18 ч. Опалесцирующую вирусную зону отбирают, диализуют против фосфатно-солевого буфера (ФСБ) 0,05 М фосфат, 0,13 М NaCl (рН 7,7), Полученный раствор (концентрация по белку 5 мг/мл) смешивают с раствором в-октилгликозида до конечной концентрации детергента 3% и оставляют при комнатной температуре на 20 мин. Затем препарат разводят вдвое ФСБ и центрифугируют при 90000xg и 4°С в течение 3 ч. Надосадок освобождают от детергента диафильтрацией в тангенциальном потоке, используя мембраны с порогом исключения 30 КДа применяя 10 объемов ФСБ, затем пропускают через фильтр с порами диаметром 0,22 МК, разводят ФСБ до концентрации 30 мкг/мл и используют как противоопухолевой препарат. Препарат состоит из гликопротеинов вируса гриппа, содержит 80% гемагглютинина, около 10% нейраминидазы, примесные белки составляют не более 10%, липиды практически не определяются. Центрифугирование в градиенте тартрат-сахароза (50-20%) обусловлено плотностью вируса, которая соответствует примерно 38% раствору.
Пример 2. Приготовление противоопухолевого препарата на основе моновалентной вакцины
Куриные эмбрионы получали из птицехозяйств, благополучных по инфекционной заболеваемости кур. Качество поставляемых эмбрионов подтверждалось ветеринарными свидетельствами и справками ветеринарной лаборатории о санитарном состоянии поголовья, включающими микробиологические и биохимические контроли. Куриные эмбрионы 10-12-суточного возраста заражали вирусом гриппа H1N1 в аллантоисную полость. Зараженные эмбрионы помещали в термальную комнату при температуре 32-35°С и влажности (60±10) на 48 ч. По окончании инкубации эмбрионы проверяли с помощью овоскопов и жизнеспособные эмбрионы помещали в холодильную камеру при температуре (4±2)°С на (18±2) ч для охлаждения. Сбор вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ) осуществляли методом слива в бутыль. В бутыли, содержащие 5-6 л вируссодержащей аллантоисной жидкости, добавляли равное количество фосфатного буферного раствора, перемешивали в течение 10 мин на шейкере и проводили микрофильтрацию через каскад фильтрующих элементов в тангенциальном потоке с размерами пор соответственно: 2,3; 1,2; 0,8; 0,44 мкм. В содержимое бутыли (фильтрат) добавляли раствор бета-пропиолактона до конечной концентрации 0,1%, тщательно перемешивали и оставляли в холодильной камере на шейкере на 17-18 часов. Далее проводили концентрирование и частичную очистку инактивированной ВАЖ: ультрафильтрацию проводили на установке для ультрафильтрации в тангенциальном потоке с 4 кассетными модулями с размером пор 300 кД. Полученный концентрат ВАЖ промывали 3-4 объемами фосфатного буферного раствора и дополнительно очищали ультрацентрифугированием в градиенте плотности при помощи двух растворов сахарозы 50% и 20% при скорости вращения ротора 30000 об/мин. Содержимое ротора раскапывали по фракциям объемом 20 мл. После чего титровали в РГА для определения пика вируса и собирали в единый объем с максимальным содержанием гемагглютинина. Для очистки ультрацентифугата (концентрата после ультрацентрифуги) использовали гель-хроматографию на полимерном носителе с порогом исключения не менее 10000 КДа. Объем носителя для хроматографии определяли из расчета 5 объемов носителя к одному объему пробы. Колонку уравновешивали трис-буфером, наносили концентрат с сахарозой на колонку через насос, затем элюировали трис-буфером. Сбор целевого элюата осуществляли по оптической плотности при длине волны 280 нм. Для инактивации вируса использовали установку, содержащую источник ультрафиолетовых лучей с силой потока ультрафиолетового облучения не менее 90 люменов. Для разрушения инактивированного вирусного концентрата использовали в-октилгликозид (Octil-D-Glucopyranoside) в массовом соотношении детергента к суммарному белку 10:1 Инкубацию проводили в течение 1 часа в холодильной камере при температуре 5±3°С. Далее концентрирование расщепленного вирусного препарата проводили на установке ультрафильтрации с 2 кассетными модулями диаметром пор 30 кДа. Сконцентрированный расщепленный препарат далее очищали от нуклеопротеида ультрацентрифугированием при ускорении 90000 g в течение 2 часов при температуре от 2 до 8°С. От детергента препарат освобождали методом гельфильтрации на хроматографическом носителе на основе агарозы с пределом эксклюзии 150 кД. Элюат собирали в стерильную емкость и проводили стерилизующую фильтрацию через набор фильтров с диаметром пор 0,45 и 0,22 мкм. Полученный полуфабрикат (моновалентная субстанция) контролировали по следующим показателям: стерильность, остаточное содержание детергента, специфическая активность по ОРИД (содержание гемагглютинина), гемагглютинирующая активность, специфическая безопасность, подлинность, белок по методу Лоури с осаждением. После проведения контроля моновакцины хранили в холодильной камере при температуре 4±2°С. Концентрация ГГА составляла 75 мкг/мл.
Пример 3. Приготовление противоопухолевого препарата на основе моновалентной вакцины на основе вирусов гриппа типа В 2 (препарат сравнения)
Вакцинные моноингредиенты на основе вирусов гриппа типа В 2 получали по технологии примера 1, за исключением того, что продолжительность инкубации препарата на основе вируса типа В 2 составляло - 72 ч. Концентрация ГТБ составляла 80 мкг/мл.
Пример 4. Приготовление противоопухолевого препарата на основе тривалентной вакцины
1
1
3
2
Вакцинные моноингредиенты на основе вирусов гриппа типа А HN и HN и типа В 1 получали по технологии примера 1, за исключением того, что продолжительность инкубации препарата на основе вируса типа В 1 составляло - 72 ч. После проведения контроля моновакцины хранили в холодильной камере при температуре 4±2°С. Штаммы вируса гриппа: тип А (H1N1; H3N2) и типа В1, прошедшие все контроли, разбавляли фосфатным буфером до конечной концентрации каждого антигена 90 мкг/мл и объединяли в стерильной бутыли в равном соотношении (1:1:1) и полученный объединенный балк помещали в холодильную камеру на +4С.
Конечный препарат представляет собой трехвалентную вакцину, содержащую ГГА 60 мкг/мл.
Пример 5. Приготовление улучшенного противоопухолевого препарата на основе тривалентной вакцины
В препарат, полученный по примеру 3, было добавлены ГГА до концентрации 120 мкг/мл.
Пример 6. Приготовление улучшенного противоопухолевого препарата на основе тетравалентной вакцины
1
1
3
2
Вакцинные моноингредиенты на основе вирусов гриппа типа A HN и HN и типа В1 и В2 получали по технологии примера 1, за исключением того, что продолжительность инкубации препарата на основе вируса типа В 1 составляло - 72 ч.
После проведения контроля моновакцины хранили в холодильной камере при температуре 4±2°С. Штаммы вируса гриппа: тип A (H1N1; H3N2) и типа В1, В2, прошедшие все контроли, разбавляли фосфатным буфером до конечной концентрации каждого антигена 120 мкг/мл и объединяли в стерильной бутыли в равном соотношении (1:1:1:1) и полученный объединенный балк помещали в холодильную камеру на +4С. Концентрация ГГА составила 60 мкг/мл
Пример 7. Изучение иммуностимулирующей активности препаратов вируса гриппа
57
Препараты вируса гриппа, полученные в примерах 1-5, анализировали на способность стимуляции антителообразующих клеток (АОК). Для этого группы из 12 мышей линии СВА-СД1 массой 16-18 г иммунизировали 0,1; 1; 10 каждого препарата внутрибрюшинно. Сразу после иммунизации мышам вводят эритроциты барана (ЭБ) в дозе 4*10 клон/мышь. На 4-й день после инъекций определяли количество АОК в селезенках опытных и контрольных групп мышей (контрольным вместо препарата вводят физиологический раствор), методом Ерне в модификации Каннингема. Полученные результаты приведены в таблице 1.
Полученные данные показали, что анализируемые препараты обладают иммуностимулирующим действием. Лучшие результаты достигаются при использовании препаратов с концентрацией ГГА 120 мкг/мл. Пример 8. Изучение супероксиддисмутазной активности препаратов вируса гриппа.
Определение СОД активности осуществляли в системе индукции хемилюминесценции перекисью водорода в сыворотке крови человека.
Смесь сывороток здоровых людей разводили в 10 раз физиологическим раствором, затем к 0,5 мл разведенной сыворотки добавляли 0,5 мл препаратов Полученные данные показали, что полученных в примерах 1-5 и предварительно разведенных до концентрации I y.e./мл, или бычью супероксиддисмутазу (бСОД фирмы "Сигма"). Реакцию запускали внесением в систему перекиси водорода до его концентрации 0,53%. В качестве контроля использовали физиологический раствор.
Хемилюминесценцию определяли в условных единицах с помощью хемилюминометра. Результаты опытов представлены в табл. 2.
Полученные данные показали, что супероксиддисмутазная активность исследуемых препаратов превышает активность бычьей СОД, то есть эти препараты обладают супероксиддисмутазной активностью (тушением радикалов), что особенно важно при использовании в онкологии.
Пример 9. Исследование противоопухолевого действия препаратов на животных
Самкам крыс имбредной линии AG/Gc массой 150-160 г облучали дозой 500 Р, после чего вводили препараты дважды через день по 10у на крысу внутрибрюшинно. Для сравнения использовали бСОД, а в качестве контроля - физиологический раствор. Группа животных для каждого препарата составляла 12 особей. Результаты исследований представлены в таблице 3.
Полученные результаты показали, что введение предлагаемых противоопухолевых препаратов предотвращает гибель облученных животных и снижает процент образования опухолей. По эффективности предлагаемые препараты превосходили бычий СОД.
Пример 10. Применение противоопухолевого препарата ГГА для лечения больных злокачественной опухолью
В ходе исследований, поведенных в Онкоцентре (С.Бетербург) было пролечено 14 больных с диагнозом рак шейки матки. У всех больных определялась инфильтрация сводов, вагинальной и параметральной клетчатки, в соответствии со стадией процесса наблюдалось увеличение тела матки. Больные страдали анемией, наблюдались температурные реакции 38-39°С.
Всем больным в лимфатические сосуды нижних конечностей вводили по 30 мкг препарата ГГА, полученного в примере 1, разведенного в 4-5 мл физиологического раствора. Препарат вводили 3-4 раза с интервалом в 2-3 дня. Осложнений после введения препарата не наблюдалось. Через 5-7 дней после последней инъекции установлено, что опухоль шейки матки подверглась регрессии у 10 из 14 больных, у 4 - опухоль осталась без видимых изменений.
Контрольную группу составили 7 больных, которым вместо предлагаемого препарата вводили БЦЖ 4 раза с интервалами 2-3 дня эндолимфально в нижние конечности. В группе у 5 из 7 больных отмечены тошнота, слабость, боли внизу живота, падение числа лейкоцитов. После курса лечения лишь у 2 больных наблюдалась резорбция опухоли. Полной регрессии опухоли не наблюдалось.
Таким образом, клинические результаты показали, что у больных, ослабленных запущенной стадией опухолевого процесса, под воздействием предлагаемого противоопухолевого препарата наблюдается резорбция опухолей, уменьшается инфильтрация тканей, не наблюдается общетоксических проявлений в виде тошноты, рвоты, температуры, лейкопепии.
Представленные результаты показали, что препараты, содержащие ГГА, перспективны применяться для лечения опухолей, причем сочетание их свойств: супероксиддисмутазная активность и иммуностимулирующая активность - делают их универсальными.