ВЫСОКОЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ ИММУНОАНАЛИЗЫ И НАБОРЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРЕДСТАВЛЯЮЩИХ ИНТЕРЕС ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ
HIGH-SENSITIVITY IMMUNOASSAYS AND KITS FOR DETECTING PEPTIDES AND PROTEINS OF INTEREST

Область техники изобретения
Изобретение относится к области иммуноанализов, которые позволяют определять пептиды и белки в образцах, и которые обладают более высокой чувствительностью по сравнению с анализами, применяемыми в настоящее время. Изобретение также относится к наборам, предоставляющим компоненты, необходимые для проведения указанных иммуноанализов.
Уровень техники
Болезнь Альцгеймера (AD) является прогрессивным дегенеративным заболеванием центральной нервной системы, характеризующимся прогрессирующей и возрастающей потерей памяти, с последующей потерей контроля над функциями тела и конечностей и возможной смертью. Она, безусловно, является наиболее частой причиной деменции, от которой страдают от 1 до 6% людей в возрасте старше 65 лет и от 10 до 20% людей старше 80 лет.
40
42
AD отличается от других типов деменции рядом патологических признаков, включая прогрессирующее возникновение в головном мозге пациентов сенильных бляшек во внеклеточном пространстве между нейронами. Бляшки имеют сердцевину из отложений амилоида, образованных в основном фибриллами пептида из 40-42 аминокислот, называемого β-амилоидным пептидом (Aβ), окруженную дегенерированными нейритами и глиальными клетками. Данный пептид возникает в результате протеолитического процессинга белка-предшественника, называемого белком-предшественником β-амилоида (βAPP). βAPP встречается в организме в виде различных изоформ, возникающих в результате альтернативного сплайсинга первичного транскрипта гена, кодирующего βAPP. В основном данные изоформы представляют собой βAPP-695, βAPP-751 и βAPP-770, где цифры означают число аминокислот. У людей ген βAPP присутствует на хромосоме 21, трисомия которой (синдром Дауна) приводит к избыточной экспрессии белка и раннему появлению амилоидных бляшек в головном мозге пациентов (Selkoe D.J. (2001) Physiol. Rev. 81, 741-766). βAPP представляет собой трансмембранный белок, который может процессироваться различными протеолитическими ферментами (секретазами) с образованием различных продуктов. Как правило, βAPP претерпевает расщепление альфа-секретазой в его внеклеточной области с образованием длинного растворимого секретируемого фрагмента и более короткого заякоренного в мембране фрагмента, называемого C83, который дополнительно расщепляется γ-секретазой с образованием пептида p3 (p3 или p3), а также пептида 57 или 59, который далее расщепляется другими протеазами. Если βAPP расщепляется β-секретазой, в результате образуется растворимый секретируемый фрагмент (sβAPP-β) и фрагмент C99, который может расщепляться γ-секретазой с образованием амилоидного пептида Aβ и пептида из 57 или 59 аминокислот, заякоренного в мембране (Selkoe D.J. (2001) Physiol. Rev. 81, 741-766).
По времени возникновения AD можно классифицировать на раннюю (возраст до 60 лет) и позднюю (возраст старше 60 лет), а по наличию аутосомно доминантного наследования - на семейную AD или спорадическую AD. Раннее развитие семейных форм AD может быть связано с известной мутацией в генах, кодирующих βAPP, пресенилин 1 и пресенилин 2 (расположенных, соответственно, на хромосомах 21, 14 и 1). Данные классификации не являются взаимно исключающими. Наиболее часто встречающимися формами являются спорадические поздние формы.
В клинической практике диагноз AD ставят, используя клинические критерии, основанные на присутствии типичных клинических признаков, и исключая другие типы деменции при помощи методов нейровизуализации и анализа крови. При использовании данных критериев диагностическая надежность является приемлемой, хотя, согласно исследованиям, проведенным с использованием аутопсии мозга, от 10 до 20% пациентов с диагнозом AD страдали от другого заболевания. Более того, принятые в настоящее время способы диагностики можно использовать, только если нейродегенеративный процесс зашел настолько далеко, что пациент страдает от сильно выраженной деменции, и повреждения мозга настолько велики, что число терапевтических мер ограничено. Для окончательного диагноза необходимо посмертное патологическое исследование мозговой ткани.
Вследствие этого, существует потребность в опознавательных биомаркерах для ранней диагностики AD, которые были бы чувствительными и специфическими, и которые позволяли бы отличать возрастные когнитивные нарушения от тех, которые связаны с ранними симптомами процесса, а также различать изменения, вызванные AD и вызванные другими дегенеративными состояниями. Согласно Growdon et al. (Neurobiol. Aging, 1998, 19: 109-116), идеальный маркер для AD должен удовлетворять следующим требованиям:
- он должен выявлять фундаментальный признак нейропатологии;
- его достоверность должна быть доказана в случаях болезни, подтвержденных нейропатологическими методами;
- он должен иметь чувствительность как минимум 80% для выявления AD;
- он должен иметь специфичность как минимум 80%, чтобы отличать AD от деменции других типов, и
- он должен быть надежным, воспроизводимым, неинвазивным, простым для осуществления и недорогим.
В настоящее время известны способы диагностирования AD путем определения уровней биомаркеров, присутствующих в головном мозге или СМЖ (CSF) пациентов. Охарактеризованы различные биомаркеры, определение которых проводят в СМЖ. СМЖ напрямую отражает состав внеклеточного пространства центральной нервной системы и, таким образом, обеспечивает более высокие концентрации в качестве биомаркеров. Однако СМЖ можно извлекать только путем люмбальной пункции, которая не является рутинным диагностическим методом, легко применимым к пациентам, страдающим деменцией, не говоря уже о пациентах с расстройством памяти. Таким образом, существует потребность в биомаркерах AD, которые можно определять в образцах, которые можно получать из организма неинвазивным путем.
Подходящие биомаркеры AD, которые соответствуют известному уровню техники, и которые можно определять в плазме, включают (i) маркеры из амилоидной бляшки, (ii) аутоантитела против Aβ или βAPP, (iii) маркеры воспаления, такие как IL-6, его рецептор или gp130, C-реактивный белок или маркеры окислительного стресса (изопростаны), (iv) маркеры липидного метаболизма (apoE, продукты окисления холестерина) и (v) маркеры сосудистых заболеваний (гомоцистеин, липопротеин b C1q) (Scheuner D et al. (1996) Nature Med. 2, 864-870).
Однако, учитывая тот факт, что Aβ накапливается в головном мозге пациентов с AD и является центральным элементом в патогенезе AD, данный белок можно рассматривать в качестве наиболее подходящего кандидата на роль биомаркера AD. Однако использование Aβ в качестве биомаркера AD в плазме сталкивается с той проблемой, что концентрации пептидов Aβ (Aβ (1-40) и Aβ (1-42)) в сыворотке чрезвычайно низки, так что не существует анализов, достаточно чувствительных для надежного определения указанных видов пептидов.
141I
K670N
M671L
V7171
Scheuner et al. (Nature Med., 1996, 2: 864-870) провели предварительное исследование для определения того, возрастают ли внеклеточные концентрации пресенилина 1, пресенилина 2 или βAPP у пациентов из семей, где имеются мутации, ассоциированные с семейной AD. Хотя повышенные уровни Aβ 1-42(43) наблюдали в плазме субъектов с FAD-связанными мутациями PS1 (P<0,0001), PS2N (P=0,009), APP,  (P<0,0001) и APP (один субъект), такие исследования не были утверждены для анализа спорадической AD, при которой концентрации пептидов Aβ в сыворотке гораздо ниже. Набор реактивов, используемый в данном документе, представляет собой набор реактивов для сэндвич-анализа ELISA, ранее описанного Suzuki N. et al. (Science, 1994, 264: 1336-1340), в котором используют иммобилизующее антитело и конъюгированное с пероксидазой проявляющее антитело.
Высказано предположение, что не существует корреляции между уровнями Aβ и спорадической AD. Соответственно, Tamaoka A et al. (J. Neurol. Sci., 1996, 141, 65-68) измеряли уровни Aβ в плазме от 28 пациентов со спорадической AD, 40 пациентов с другим неврологическим процессом с деменцией, а также от 40 здоровых контрольных субъектов. Авторы сделали вывод, что уровни в плазме Aβ40 и Aβ42 одинаковы у контрольных субъектов и у пациентов, страдающих от спорадической AD. Аналогичные результаты получили Kosaka et al. (Neurology, (1997) 48, 741-745). Анализ, примененный Tamaoka с сотрудниками, дополнительно охарактеризован в WO200722015 для измерения Aβ1-40 в плазме. Анализ представляет собой сэндвич-анализ ELISA, где пептиды Aβ40 и Aβ42 иммобилизуют на твердой подложке при помощи моноклонального антитела (mAb) 1A10 и выявляют при помощи конъюгированного с пероксидазой mAb 14F1. Данный анализ обеспечивает уровень чувствительности в диапазоне одного разряда пг/мл.
Vanderstichele H et al. (Amyloid, 2000, 7, 245-258) определяли уровни Aβ(1-42) в СМЖ, плазме и моче у 12 здоровых контрольных субъектов, 39 пациентов с AD и 6 пациентов, страдающих от деменции телец Леви, 10 пациентов с другими типами деменции и 9 пациентов с другими неврологическими патологиями, не проявляющих признаков деменции, однако не наблюдали корреляции между уровнями Aβ(1-42) и диагнозом, половой принадлежностью или результатами MMSE. Для этих исследований использовали тест INNOTEST на β-амилоид (1-42), основанный на сэндвич-анализе ELISA, где Aβ(1-42) иммобилизуют на твердой подложке при помощи mAb 21F12, которое узнает N-концевую область Aβ(1-42), и выявляют при помощи биотинилированного mAb 3D6, которое узнает C-концевую область Aβ(42), и стрептавидина, конъюгированного с HRP.
Fukomoto et al. (Arch. Neurol. 2003, 60, 958-964) изучали корреляцию уровней в плазме Aβ40 и Aβ42 относительно различных клинических, демографических и генетических параметров у 146 пациентов с AD, 37 пациентов с умеренными когнитивными нарушениями и 96 пациентов с болезнью Паркинсона. Результаты свидетельствовали, что существует существенное увеличение с возрастом, однако, отсутствуют различия с точки зрения диагноза, семейного анамнеза, генотипа ApoE или лечения различными лекарственными средствами, такими как ингибитор ацетилхолинэстеразы или статины. Измерения проводили при помощи сэндвич-анализа ELISA, используя mAb, которое узнает аминокислоты 11-28 в Aβ (BNT77), и конъюгированные с HRP mAb, которые специфически узнают Aβ40 и Aβ42 (mAb BA27 и BC05).
Mehta et al. (Arch. Neurol. 57, 2000, 100-105) измеряли уровни Aβ40 и Aβ42 в плазме и СМЖ у 78 пациентов с AD и 61 здорового контрольного субъекта и установили, что уровни Aβ40 в плазме выше у пациентов с AD, имеющих аллель ApoE4, по сравнению с контрольной группой, не имеющей данный аллель, что уровни Aβ42 одинаковы у пациентов с AD и контрольных субъектов, и что отсутствуют различия с точки зрения половой принадлежности или баллов по Краткой шкале оценки психического статуса (MMSE). Измерения проводили при помощи сэндвич-анализа ELISA, где использовали анти-Aβ mAb 6E10 в качестве иммобилизующего антитела и биотинилированную антисыворотку против пептидов, специфическую для Aβ42 и Aβ40.
Mayeux R. et al. (Ann. Neurol. 1999, 46, 412-416) измеряли уровни Aβ40 и Aβ42 в плазме у группы субъектов (530) и спустя 18 месяцев (307 субъектов), используя такой же анализ ELISA, что и Mehta et al. (Arch. Neurol. 57, 2000, 100-105). Они наблюдали, что субъекты, у которых развивалась AD, имели более высокие уровни Aβ42, чем те, у которых не развивалась AD в процессе исследования. Уровни Aβ42 снижались после трех лет подтвержденного диагноза AD. Разницы с точки зрения фенотипа AD не наблюдали.
Lanz T.A. и Schacthter J.B. (J. Neuroscience Methods, 2006, 157: 71-81) описывают колориметрический и флуорометрический сэндвич-анализы ELISA для определения либо общего содержания пептидов Aβ, либо отдельно количеств пептидов Aβ40 и Aβ42. Для определения общего количества пептидов Aβ использовали mAb 6E10 для иммобилизации пептидов Aβ, а затем выявляли при помощи биотинилированного 4G8 и либо конъюгированного с европием стрептавидина, либо HRP-стрептавидина. Для определения количества пептидов Aβ40 и Aβ42 использовали mAb 6E10 в качестве иммобилизующего антитела и биотинилированные поликлональные антитела кролика, специфичные для каждого из фрагментов, с последующим использованием конъюгированного с европием стрептавидина или HRP-стрептавидина. Однако данный метод обеспечивал нижний предел чувствительности 10 пг/мл и использовался только для измерения Aβ в экстрактах мозга.
В WO200750359 описывают иммуноанализ для определения мультимерных форм Aβ42, который включает иммобилизацию пептидов, происходящих из Aβ42, при помощи поликлональных антител, специфичных для указанных мультимерных форм, и определение количества связавшихся пептидов при помощи mAb и конъюгированных с HRP антител против IgG мыши. Однако данный анализ обеспечивает нижний предел чувствительности 1000-3000 пМ, что соответствует 4000 пг/мл.
В WO0162801 описывают сэндвич-анализ ELISA для определения Aβ, в котором используют mAb 3D6 против N-концевой части в качестве покрывающего антитела и mAb, которое узнает аминокислоты 15-24 зрелого Aβ, для определения, однако, его используют только для измерения значений концентрации Aβ в диапазоне 100-200 пг/мл.
В WO0315617 описывают анализ ELISA для измерения количества Aβ40 и Aβ42 в плазме, в котором используют антитело, узнающее аминокислоты 13-28 зрелых пептидов Aβ, но в котором возможно определять концентрации указанных пептидов только в диапазоне 250-400 пг/мл, и который, таким образом, подходит только для измерения Aβ в плазме при фамильной AD.
В WO0246237 описывают сэндвич-анализ ELISA для количественного определения всех видов Aβ (Aβ40 и Aβ42) в гомогенате головного мозга, в котором используют mAb, специфичное для аминокислот 13-28 в Aβ42, в качестве иммобилизующего антитела и биотинилированное mAb 3D6, специфичное для N-концевой области пептида Aβ42, а затем стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой. В этом документе также описывают специфичный для Aβ42 сэндвич-анализ ELISA, в котором используют mAb 21F12, специфичное для аминокислот 33-42 в Aβ42, в качестве иммобилизующего антитела и биотинилированное mAb 3D6 в качестве проявляющего антитела. Однако данные анализы имеют нижний порог чувствительности, соответствующий 50 нг/мл, для анализа на общий Aβ и 125 мг/мл для Aβ42-специфичного анализа, что делает их неподходящими для измерения общего Aβ или Aβ42 в плазме или сыворотке.
В WO 0413172 описывают сэндвич-анализ ELISA для количественного определения β-амилоида (1-42) в экстрактах головного мозга в муравьиной кислоте и в СМЖ при помощи mAb 3D6 в качестве проявляющего антитела и поликлональных антител, специфичных для различных областей зрелых пептидов Aβ, в качестве иммобилизующих антител.
Однако все основанные на ELISA анализы, известные до настоящего времени, имеют низкий предел чувствительности, который находится в диапазоне одноразрядного числа пг/мл в лучшем случае, что является достаточным для определения Aβ40 и Aβ42 в СМЖ, а также для определения указанных видов в плазме пациентов, страдающих от семейной AD, однако, не подходит для определения Aβ42 в плазме пациентов, страдающих от спорадической AD, при которой концентрации Aβ42 в плазме намного ниже. В частности, тест INNOTEST на β-амилоид (1-42) имеет более низкий предел чувствительности, равный 20 пг/мл, что позволяет определять Aβ42 в СМЖ, а также проводить измерения в плазме пациентов с семейной AD, но является недостаточно чувствительным для определения Aβ42 у пациентов, страдающих от спорадической AD, у которых гораздо более низкие уровни Aβ42 в плазме. Данный набор рекомендован только для количественного определения уровней пептидов Aβ в СМЖ. Данные рекомендации получили дополнительное подтверждение в недавнем исследовании с использованием теста INNOTEST на β-амилоид (1-42), где показано, что уровни пептида в СМЖ в 100-1000 раз выше, чем в плазме (Lewczuk, P et al. (2004) Neurobiol. Aging 25, 273-281).
Другими коммерческими наборами являются наборы Biosource на β-амилоид (1-40) и на β-амилоид (1-42). Данные наборы предназначены для сэндвич-анализа ELISA, где пептиды иммобилизуют на подложке при помощи mAb, направленных против амино-конца зрелого пептида, и проявляют при помощи поликлонального антитела кролика, которое взаимодействует с C-концевой областью зрелых β-пептидов, и конъюгата с пероксидазой антител против IgG кролика. Данный набор обеспечивает чувствительность, согласно инструкциям производителя, менее чем 10 пг/мл, однако, его используют для определения концентраций Aβ в диапазоне от 15,6 до 1000 пг/мл. Наборы Biosource рекомендованы производителями для определения пептидов Aβ в сыворотке, СМЖ и культуре клеток. Однако средние уровни Aβ40 и Aβ42 в сыворотке пациентов со спорадической AD находятся ниже нижнего предела чувствительности анализов, так что не представляется возможным использование их для измерений в сыворотке.
В канадской патентной заявке (CA2585148), которая соответствует международной патентной заявке WO200646644, описывают единственный анализ на пептид Aβ, нижний предел чувствительности которого составляет 0,5 пг/мл. Анализ, используемый в данном документе, представляет собой электрохемилюминесцентный (ECL) сэндвич-анализ, в котором mAb 21F12 (которое узнает аминокислоты 33-42 из Aβ42) связано с магнитными гранулами, которые затем используют для иммобилизации пептида Aβ42 в образце, содержащем Aβ42, и затем приводят в контакт с mAb 3D6, конъюгированным с рутениевым комплексом. Количество связавшегося антитела 3D6 затем определяют по люминесценции, испускаемой рутениевым комплексом при подаче электроэнергии. При использовании данного анализа авторам изобретения удалось определить всего 0,5 пг/мл стандарта Aβ42. Однако когда тот же анализ использовали для сравнения Aβ42 в образцах плазмы от пациентов с AD и здоровых контрольных субъектов, не удалось обнаружить никаких существенных различий между двумя группами пациентов, из чего авторы изобретения сделали вывод, что количество интактного Aβ42 в сыворотке очень мало вследствие деградации, и обратились к конкурентному анализу ELISA с использованием mAb 21F12, которое обеспечивают более низкие уровни чувствительности в диапазоне концентраций нг/мл.
Вследствие этого, в данной области существует потребность в усовершенствованных иммунологических анализах и наборах для определения пептидов из Aβ, которые преодолеют недостатки методов и наборов, известных в данной области, в частности, которые будут достаточно чувствительными, чтобы достоверным образом определять пептиды Aβ в плазме пациентов, страдающих от спорадической AD.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В первом аспекте изобретение относится к набору для обнаружения или определения целевого полипептида, выбранного из группы Aβ42, Aβ40 и их смеси, включающему
(i) первое антитело или сочетание антител, которые узнают указанный целевой полипептид;
(ii) второе антитело или сочетание антител, которые узнают иную область целевого полипептида, чем область, узнаваемая первым антителом или сочетанием антител;
(iii) реагент, обладающий аффинностью в отношении второго антитела, который связан с первым компонентом связывающейся пары, и
(iv) второй компонент связывающейся пары, присоединенный к детектируемому маркеру.
Во втором аспекте данное изобретение относится к использованию набора по изобретению для определения или обнаружения целевого полипептида в образце, а также для диагностики нейродегенеративного заболевания у субъекта.
В третьем аспекте изобретение относится к способу определения или обнаружения количества целевого полипептида, выбранного из группы Aβ42, Aβ40 или их смеси, в образце, включающему стадии
(i) иммобилизации целевого полипептида, присутствующего в образце, первым антителом или сочетанием антител, которые специфически связывают указанный целевой полипептид,
(ii) создания контакта между иммунными комплексами, образованными на стадии (a), и вторым антителом или сочетанием антител, которые узнают область целевого полипептида, отличную от области, которую узнает первое антитело или сочетание антител,
(iii) создания контакта между комплексами, образованными на стадии (ii), и реагентом, обладающим аффинностью в отношении второго антитела и связанным с первым компонентом связывающей пары,
(iv) создания контакта между комплексами, образованными на стадии (iii), и вторым компонентом связывающей пары, который присоединен к детектируемому маркеру, и
(v) определения или обнаружения активности или количества детектируемого маркера, присоединенного ко второму компоненту связывающей пары.
В четвертом аспекте изобретение относится к способу диагностики дегенеративного заболевания у субъекта, который включает определение количества Aβ40 или Aβ42 в образце от пациента при помощи способа по изобретению и проведение корреляции между концентрацией одного или обоих пептидов в образце от указанного субъекта относительно концентрации указанного пептида или пептидов в образце от здорового индивидуума и развитием дегенеративного заболевания.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фигуре 1 представлена стандартная кривая титрования сэндвич-анализа ELISA, изображающая зависимость поглощения при 450 нм от известных концентраций стандартных препаратов Aβ40 (в пг/мл).
На фигуре 2 представлена стандартная кривая титрования сэндвич-анализа ELISA, изображающая зависимость поглощения при 450 нм от известных концентраций стандартных препаратов Aβ42 (в пг/мл).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы настоящего изобретения к своему удивлению обнаружили, что при использовании набора, включающего компоненты, перечисленные в пункте 1 формулы изобретения, становится возможным определять уровни Aβ40 и Aβ42 с нижним пределом чувствительности менее чем 0,1 пг/мл. Данный набор позволяет достоверно количественно определять указанные виды молекул в любом образце от любого субъекта и, в частности, в плазме у субъектов, предположительно страдающих спорадической AD, при которой концентрации в плазме настолько низки, что до настоящего времени не представлялось возможным проводить достоверные измерения.
Соответственно, в первом аспекте изобретение относится к набору для определения или обнаружения целевого полипептида, выбранного из группы Aβ42, Aβ40 и их смеси, включающему
(i) первое антитело или сочетание антител, которые узнают указанный целевой полипептид
(ii) второе антитело или сочетание антител, которые узнают иную область целевого полипептида, чем область, узнаваемая первым антителом или сочетанием антител
(iii) реагент, обладающий аффинностью в отношении второго антитела, который связан с первым компонентом связывающейся пары, и
(iv) второй компонент связывающейся пары, присоединенный к детектируемому маркеру.
Без привязки к какой-либо конкретной теории, считается, что повышенной чувствительности достигают благодаря применению реагента (iii), который способствует амплификации сигнала от проявляющего антитела.
Как используют в данном документе, «Aβ42» означает пептид из 42 аминокислот, соответствующий аминокислотам 672-713 (SEQ ID №: 4), который получается в результате последовательного протеолитического расщепления белка-предшественника амилоида (SEQ ID №: 6) β- и γ-секретазами.
Как используют в данном документе, «Aβ40» означает пептид из 40 аминокислот, соответствующий аминокислотам 672-711 (SEQ ID №: 5), который получается в результате последовательного протеолитического расщепления белка-предшественника амилоида (SEQ ID №: 6) β- и γ-секретазами.
В контексте настоящего изобретения первое антитело будет называться «иммобилизующее антитело», это означает, что данное антитело используют для извлечения из образца всех видов молекул, с которыми данное антитело специфически связывается. Не существует практически никаких ограничений в отношении типа антитела, которое можно использовать в качестве иммобилизующего антитела, при условии, что оно содержит как минимум один антигенсвязывающий центр, специфичный для Aβ40 и/или Aβ42. Вследствие этого, молекулы антител, подходящие для использования в качестве иммобилизующих антител, включают
- «интактные» антитела, которые содержат антигенсвязывающую вариабельную область, а также константный домен легкой цепи (CL) и константные домены CH1, CH2 и CH3 тяжелой цепи,
- «Fab»-фрагменты, возникающие в результате расщепления папаином интактного антитела, которые содержат одну антигенсвязывающую область, а также область CL и CH1,
2
- «F(ab')»-фрагменты, возникающие в результате расщепления пепсином интактного антитела, которые содержат два антигенсвязывающих центра,
- «Fab'»-фрагменты содержат константный домен легкой цепи и первый константный домен (CH1) тяжелой цепи и имеют только один антигенсвязывающий центр. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов наличием нескольких дополнительных остатков на карбоксильном конце домена CH1 тяжелой цепи, включая один или более остатков цистеина из шарнирной области антитела.
- «Fv» представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит целый антигенузнающий и антигенсвязывающий центр. Эта область состоит из димера одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи в прочной нековалентной ассоциации. Именно в такой конфигурации три гипервариабельные области (CDRs) каждого вариабельного домена взаимодействуют с образованием антигенсвязывающего центра на поверхности димера VH-VL. Шесть гипервариабельных областей коллективно определяют антигенсвязывающую специфичность антитела. Однако даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три гипервариабельных области, специфичные для антигена) обладает способностью узнавать и связывать антиген, хотя и с меньшей аффинностью, чем целый связывающий центр.
- Одноцепочечные фрагменты FV или «scFv» антитела содержат VL и VH домены антитела, где данные домены находятся на одной полипептидной цепи. Предпочтительно, области VL и VH соединены полипептидным линкером, который позволяет scFv образовывать необходимую для связывания антигена структуру.
- «Диатела» содержат вариабельный домен тяжелой цепи (VH), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) на одной и той же полипептидной цепи (VH-VL), соединенные полипептидным линкером, который является слишком коротким, чтобы допускать образование пар между двумя доменами на одной и той же цепи. Это приводит к вынужденному образованию пар с комплементарными доменами другой цепи и способствует сборке димерной молекулы с двумя функциональными антигенсвязывающими центрами.
- «Биспецифические антитела» (BAbs) представляют собой одиночные бивалентные антитела (или их иммунотерапевтически эффективные фрагменты), которые обладают двумя антигенсвязывающими центрами различной специфичности. Два антигенсвязывающих центра можно соединять вместе химическим путем или генно-инженерными методами, известными в данной области.
Все эти фрагменты антител можно дополнительно модифицировать общепринятыми методами, известными в данной области, например, используя делецию(и), вставку(ки), замену(ны), добавление(я) и/или рекомбинацию (и/или любую другую модификацию(и) аминокислот (например, посттрансляционные или химические модификации, такие как гликозилирование и фосфорилирование), известные в данной области, либо в отдельности, либо в сочетании. Способы внесения подобных модификаций в последовательность ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность цепи иммуноглобулинов, хорошо известны специалисту в данной области; смотри, например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2-е издание 1989 г. и 3-е издание 2001 г.
Corynebacterium parvum
Concholepas concholepas
2
Антитела, подходящие для использования в качестве иммобилизующих антител, включают как поликлональные, так и моноклональные антитела. Для получения поликлональных антител различных хозяев, включая коз, кроликов, крыс, мышей, двугорбых и одногорбых верблюдов, лам, людей, птиц и других, можно иммунизировать инъекцией пептида, соответствующего фрагменту Aβ40 или Aβ42, который обладает иммуногенными свойствами. В зависимости от вида хозяев можно использовать различные адъюванты для усиления иммунного ответа. Такие адъюванты включают, но не ограничиваются ими, адъювант Фрейнда, минеральные гели, такие как гидроокись алюминия, и поверхностно активные вещества, такие как лизолецитин, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, KLH и динитрофенол. Среди адъювантов, применяемых для человека, особенно предпочтительными являются БЦЖ (BCG) (бацилла Кальметта-Герена) и . Если антиген представляет собой пептид, может оказаться полезным конъюгировать его с белком, который является иммуногенным для тех видов, которые предполагают иммунизировать. Например, антиген можно конъюгировать с гемоцианином фиссуреллы (KLH), голубым носителем (гемоцианином, выделенным из ), тиреоглобулином крупного рогатого скота или соевым ингибитором трипсина, используя бифункциональный или дериватизирующий агент, например, малеимидобензоилсульфосукцинимидный сложный эфир (конъюгация через остатки цистеина), N-гидроксисукцинимид (через остатки лизина), глютаральдегид, янтарный ангидрид или SOCl.
in vivo
Для получения моноклональных антител можно использовать общепринятые методы. Например, моноклональные антитела можно получать с помощью гибридомного метода, впервые описанного Kohler et al, Nature, 256: 495 (1975), используя методику, описанную подробно в разделах 11.4-11.11 книги Ausubel F. M. et al. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc; скрепленное кольцами издание, 2003). Альтернативно, моноклональные антитела можно выделять с помощью методов рекомбинантной ДНК из фаговых библиотек антител, полученных при помощи методов, описанных в McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990). В Clacksoii et al., Nature, 352: 624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) описывают выделение мышиных и человеческих антител, соответственно, при помощи фаговых библиотек. В следующих публикациях описывают получение высокоаффинных (нМ диапазон) человеческих антител путем перетасовки цепей (Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)), а также комбинаторной инфекции и  рекомбинации в качестве стратегии для конструирования очень больших фаговых библиотек (Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993)). Таким образом, данные методы для выделения моноклональных антител являются приемлемой альтернативой традиционным методам получения моноклональных антител с помощью гибридом.
Поликлональные антитела можно использовать непосредственно в виде антисыворотки, полученной от иммунизированных хозяев, после сбора крови и отделения фибринового сгустка. Моноклональные антитела можно использовать непосредственно в виде супернатанта от культуры гибридом или асцитной жидкости после имплантации гибридомы в перитонеальную полость подходящего хозяина. Альтернативно, молекулы иммуноглобулинов, как поликлональные, так и моноклональные, можно перед их использованием очищать общепринятыми способами, такими как аффинная очистка с помощью пептидов, полученных из Aβ40 или Aβ42 очистка в геле в неденатурирующих условиях, ВЭЖХ или ОФ-ВЭЖХ, гель-фильтрация, очистка на колонке с белком A, или любое их сочетание.
В предпочтительном варианте осуществления иммобилизующие антитела узнают область, общую для Aβ40 и Aβ42, что позволяет одновременно иммобилизовать оба пептида с помощью одного вида антител. В принципе, любое антитело, специфичное для области, общей для последовательностей как Aβ40, так и Aβ42, можно использовать в качестве иммобилизующего антитела. Предпочтительные эпитопы, на которые может быть нацелено иммобилизующее антитело, включают эпитопы, находящиеся в составе последовательности аминокислот 1-16, 1-17, 13-28, 15-24, 1-5 и 1-11 из Aβ40 или Aβ42. В более предпочтительном варианте осуществления иммобилизующее антитело направлено против области в Aβ40 и/или Aβ42, которая отлична от C-концевой области. В еще более предпочтительном варианте осуществления иммобилизующее антитело направлено против эпитопа в N-концевой области пептидов Aβ40 и Aβ42. В еще одном предпочтительном варианте осуществления иммобилизующее антитело представляет собой моноклональное антитело. В еще более предпочтительном варианте осуществления иммобилизующее антитело узнает область, соответствующую аминокислотам 1-16 пептидов Aβ. В еще более предпочтительном варианте осуществления моноклональное антитело, используемое в качестве иммобилизующего антитела, представляет собой mAb 6E10, как описано в Kim, K.S. (Neuroscience Res. Comm. 1988, 2: 121-130).
Второй компонент набора по изобретению соответствует антителу или сочетанию антител, которые узнают иную область целевого полипептида, чем область, узнаваемая первым антителом или сочетанием антител. В контексте настоящего изобретения второе антитело будет называться «проявляющее антитело», так как данное антитело будут использовать для определения количества антигена, который удержан иммобилизующим антителом.
Как и в случае с иммобилизующим антителом, практически не существует ограничений в отношении типа антитела, которое можно использовать в качестве проявляющего антитела. Однако специалист в данной области осознает, что проявляющее антитело (i) должно связывать область антигена, которая не скрыта иммобилизующим антителом, и (ii) должно содержать не только антигенсвязывающий центр, но также дополнительную область или области, которые должны специфически узнаваться реагентом, обладающим высокой аффинностью связывания в отношении указанного антитела, чтобы было возможно выявлять антитело, которое связано с антигеном, иммобилизованным иммобилизующим антителом. Предпочтительно, указанные дополнительные области, которые может специфически связывать указанный реагент, соответствуют константной области молекулы иммуноглобулина.
2
Подходящие проявляющие антитела включают интактные антитела, фрагменты Fab, F(ab'), Fab' и Fv, одноцепочечные антитела FV, диатела, биспецифические антитела и тому подобное, данные соединения являются такими, как описано ранее. Как и в случае с иммобилизующим антителом, проявляющее антитело может быть поликлональным или моноклональным, нативным или подвергнутым пост-трансляционной модификации, а также чистым или обогащенным по антигенсвязывающим молекулам при помощи таких же методов, которые описаны для иммобилизующих антител. Специалист понимает, что для того чтобы использовать проявляющее антитело, его следует разводить до соответствующей рабочей концентрации и что указанную степень разведения можно определять обычным образом для каждой партии антител. Кроме того, очевидно, что соответствующее рабочее разведение будет различаться в зависимости от того, используют ли антисыворотку или очищенную фракцию IgG. Как правило, разведения составляют 1/1000, 1/2000, 1/3000, 1/4000, 1/5000, 1/6000, 1/7000, 1/8000, 1/9000, 1/10000 и тому подобное.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения проявляющее антитело представляет собой любое поликлональное антитело, выбранное из группы
(i) поликлонального антитела, полученного против пептида, соответствующего C-концевой области пептида Aβ42, которое связывается специфически с Aβ42 без существенного перекрестного реагирования с Aβ40 или Aβ43,
(ii) поликлонального антитела, полученного против пептида, соответствующего C-концевой области пептида Aβ40, которое связывается специфически с Aβ40 без существенного перекрестного реагирования с Aβ42, Aβ39, Aβ38, Aβ41 или Aβ43,
(iii) антитела, которое узнает одновременно C-концевую область как Aβ40, так и Aβ42, или
(iv) сочетания антител из пунктов (i) и (ii).
В более предпочтительном варианте осуществления пептид, соответствующий C-концевой области пептида Aβ42, используемый для получения специфичного для Aβ42 антитела, представляет собой пептид, обладающий последовательностью SEQ ID №:1 или SEQ ID №:2. В другом предпочтительном варианте осуществления пептид, соответствующий C-концевой области пептида Aβ40, используемый для получения специфичного для Aβ40 антитела, представляет собой пептид, обладающий последовательностью SEQ ID №:3. Антитела, специфичные для Aβ40 и Aβ42, и способы их получения подробно описаны в WO2004024770 и WO2004098631, содержание которых включено в данный документ посредством ссылок.
Рядовой специалист в данной области понимает, что можно использовать способ определения Aβ40, Aβ42 или обоих видов одновременно в зависимости от типа иммобилизующих и проявляющих антител, используемых в данном способе.
Для специфического обнаружения или определения Aβ40, иммобилизующее антитело может представлять собой антитело, которое узнает N-концевую область Aβ40 (а также Aβ42, поскольку оба пептида обладают идентичными N-концевыми областями), а проявляющее антитело может представлять собой антитело, которое специфически узнает C-концевую область Aβ40 без какого-либо перекрестного реагирования с Aβ42. Альтернативно, Aβ40 можно специфически выявлять при помощи иммобилизующего антитела, которое узнает C-концевую область Aβ40 без какого-либо перекрестного реагирования с Aβ42, и проявляющего антитела, которое узнает область Aβ40, которая является общей для Aβ40 и Aβ42, предпочтительно, N-концевую область Aβ42/Aβ40.
Для специфического обнаружения или определения Aβ42 иммобилизующее антитело может представлять собой антитело, которое узнает N-концевую область Aβ42 (а также Aβ40, поскольку оба пептида обладают идентичными N-концевыми областями), а проявляющее антитело может представлять собой антитело, которое специфически узнает C-концевую область Aβ42 без какого-либо перекрестного реагирования с Aβ40. Альтернативно, Aβ42 можно специфически выявлять при помощи иммобилизующего антитела, которое узнает C-концевую область Aβ42, и проявляющего антитела, которое узнает область Aβ42, которая является общей для Aβ42 и Aβ40.
Для обнаружения или определения одновременно Aβ42 и Aβ40 иммобилизующее антитело может представлять собой антитело, которое узнает N-концевую область, общую для Aβ42 и Aβ40, а проявляющее антитело может представлять собой сочетание как минимум двух антител, где первое антитело специфически узнает C-концевую область Aβ42 без какого-либо перекрестного реагирования с Aβ40, а второе антитело специфически узнает C-концевую область Aβ40 без какого-либо перекрестного реагирования с Aβ42 Альтернативно, иммобилизующее антитело может представлять собой антитело, которое узнает N-концевую область, общую для Aβ42 и Aβ40, а проявляющее антитело может представлять собой антитело, которое узнает C-концевую область как Aβ40 так и Aβ42. Альтернативно, Aβ42 и Aβ40 можно одновременно выявлять, используя в качестве иммобилизующего антитела смесь как минимум двух антител, включающую первое антитело, которое специфически узнает C-концевую область Aβ42 без какого-либо перекрестного реагирования с Aβ40, и второе антитело, которое специфически узнает C-концевую область Aβ40 без какого-либо перекрестного реагирования с Aβ42, а также проявляющее антитело, которое узнает N-концевую область, общую для Aβ42 и Aβ40. Альтернативно, Aβ42 и Aβ40 можно одновременно выявлять, используя в качестве иммобилизующего антитела антитело, которое узнает C-концевую область как Aβ40, так и Aβ42, и проявляющее антитело, которое узнает N-концевую область, общую для Aβ42 и Aβ40.
В предпочтительном варианте осуществления первое и/или второе антитела, или сочетания антител, аффинно очищены с использованием полипептида, который обладает последовательностью полипептида, используемого для их получения.
Третий элемент набора представляет собой реагент, который обладает аффинностью в отношении проявляющего антитела и который соединен с первым компонентом связывающей пары. Связывающий антитело реагент может нековалентно связывать антитело или фрагменты антитела определенного типа(ов), определенного класса(ов) и/или определенного подкласса(ов). Альтернативно, связывающий антитело реагент может нековалентно связывать антитело, специфичное для конкретного антигена. В определенных вариантах осуществления связывающий антитело реагент нековалентно связывает Fc-область или F(ab)-область проявляющего антитела. Предпочтительные связывающие антитело реагенты включают белок A, белок G, белок V, белок L, анти-Fc антитело или антителосвязывающий фрагмент, а также Fc-рецептор (FcR) или его антителосвязывающий фрагмент. Неограничивающие примеры антител, которые могут нековалентно связывать проявляющее антитело, включают моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела, человеческие антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела, однодоменные антитела, одноцепочечные Fvs (scFv), одноцепочечные антитела, Fab-фрагменты, F(ab')-фрагменты, связанные дисульфидными мостами Fvs (sdFv), интратела и анти-идиотипические (анти-Id) антитела, а также эпитопсвязывающие фрагменты любого из вышеперечисленных. Неограничивающие примеры Fc-рецепторов включают FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIC, FcγRIIIAα, FcγRIIIB, FcεRIα, FcεRIξ и FcγRIIIAξ.
Четвертый элемент набора по изобретению соответствует второму компоненту связывающей пары, который присоединен к детектируемому маркеру. Подходящие связывающие пары включают
▪ гаптен или антиген/антитело, например, дигоксин и антитела против дигоксина
▪ биотин или аналоги биотина (например, аминобиотин, иминобиотин или дезтиобиотин)/авидин или стрептавидин,
▪ сахар/лектин,
▪ фермент и кофактор,
▪ фолиевая кислота/фолат,
▪ двунитевые олигонуклеотиды, которые избирательно связываются с белками/факторы транскрипции,
▪ нуклеиновая кислота или аналог нуклеиновой кислоты/комплементарная нуклеиновая кислота,
▪ рецептор/лиганд, например, рецептор стероидного гормона/стероидный гормон.
Очевидно, что термины «первый» и «второй» компонент связывающей пары являются относительными, и что каждый из вышеуказанных компонентов можно рассматривать как первый или второй компонент связывающей пары. В предпочтительном варианте осуществления первым компонентом связывающей пары является биотин или его функционально эквивалентный вариант, а вторым компонентом связывающей пары является авидин, стрептавидин или его функционально эквивалентный вариант.
В предпочтительном варианте осуществления вторым компонентом связывающей пары является стрептавидин.
Подходящие детектируемые маркеры включают, без ограничения, флуоресцентные функциональные группы (например, флуоресцеин, родамин, фикоэритрин, кумарин, оксазин, резоруфин, цианин и их производные), люминесцентные функциональные группы (например, наночастицы Qdot™, поставляемые корпорацией Quantum Dot Corporation, Palo Alto, CA). Если детектируемым маркером является фермент, то такой фермент должен быть способен генерировать детектируемый сигнал, например, при добавлении активатора, субстрата, усиливающего агента и тому подобного. Ферменты, которые являются подходящими в качестве детектируемых маркеров по настоящему изобретению, и соответствующие субстраты включают:
• Щелочную фосфатазу:
- хромогенные субстраты: субстраты, имеющие в основе п-нитрофенилфосфат (p-NPP), 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат/нитросиний тетразолий (BCIP/NPT), быстрый красный/нафтол-AS-TS фосфат,
- флуорогенные субстраты: 4-метилумбеллиферилфосфат (4-MUP), 2-(5'-хлор-2'-фосфорилоксифенил)-6-хлор-4-(3H)-хиназолинон (CPPCQ), 3,6-флуоресцеиндифосфат (3,6-FDP), быстрый голубой BB, быстрый красный TR или быстрый красный фиолетовый LB, диазониевые соли.
• Пероксидазы:
- хромогенные субстраты, имеющие в основе 2,2-азинобис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота) (ABTS), o-фенилендиамин (OPT), 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (TMB), o-дианизидин, 5-аминосалициловая кислота, 3-диметиламинобензойная кислота (DMAB) и 3-метил-2-бензотиазолингидразон (MBTH), 3-амино-9-этилкарбазол (AEC)- и 3,3'-диаминобензидинтетрагидрохлорид (DAB).
- флуорогенные субстраты: 4-гидрокси-3-метоксифенилуксусная кислота, восстановленные феноксазины и восстановленные бензотиазины, включая реагент Amplex красный, Amplex инфракрасный и восстановленные дигидроксантены.
• Гликозидазы:
- хромогенные субстраты: o-нитрофенил-β-D-галактозид (o-NPG), п-нитрофенил-β-D-галактозид и 4-метилумбеллифенил-β-D-галактозид (MUG) для β-D-галактозидазы.
- флуорогенные субстраты: резоруфин-β-D-галактопиранозид, флуоресцеиндигалактозид (FDG), флуоресцеиндиглюкуронид, 4-метилумбеллиферил-β-D-галактопиранозид, карбоксиумбеллиферил-β-D-галактопиранозид и фторированные кумарин-β-D-галактопиранозиды.
• Оксидоредуктазы (люцифераза):
- люминесцентные субстраты: люциферин.
В предпочтительном варианте осуществления детектируемый маркер представляет собой пероксидазу хрена и проявляющий реагент представляет собой TMB.
В предпочтительном варианте осуществления набор дополнительно содержит твердую подложку. Как используют в данном документе, термин «подложка» или «поверхность» означает твердую фазу, которая представляет собой пористый или непористый нерастворимый в воде материал, который может иметь любую из множества форм, такую как полоска, стержень, частицы, включая латексные частицы, магнитные частицы, микрочастицы, гранулы, мембраны, лунки планшета для микротитрования и пластиковые трубки. В принципе, любой материал подходит для использования в качестве твердой подложки, при условии, что он способен связывать достаточные количества иммобилизующего антитела. Таким образом, выбор материала твердой фазы определяется характеристиками проведения анализа нужного формата. Материалы, подходящие для твердой подложки, включают полимерные материалы, в частности, целлюлозные материалы и материалы, производные от целлюлозы, такие как волокнистая бумага, например, фильтровальная бумага, хроматографическая бумага, стекловолоконная бумага и так далее; синтетические или модифицированные природные полимеры, такие как нитроцеллюлоза, ацетат целлюлозы, поли(винилхлорид), полиакриламид, перекрестно сшитый декстран, агароза, полиакрилат, полиэтилен, полипропилен, поли(4-метилбутен), полистирен, полиметакрилат, поли(этилентерефталат), нейлон, поливинилбутират) и так далее; эфиры, используемые самостоятельно или в соединении с другими материалами; стекло, такое как, например, стекло, используемое как биостекло, керамику, металлы и тому подобное. Предпочтительными являются не сшитые перекрестно полимеры стирена и карбоксилированного стирена или стирена, функционализированного другими активными группами, такими как амино, гидроксил, гало и тому подобными. В некоторых случаях используют сополимеры замещенных стиренов с диенами, такими как бутадиен.
Твердая подложка и иммобилизующее антитело могут поставляться в наборе раздельно или, альтернативно, подложка может поставляться уже предварительно покрытая иммобилизующим антителом. В данном случае подложка может быть обработана блокирующим раствором после связывания иммобилизующего антитела. Если подложка заранее покрыта, предпочтительно обрабатывать подложку концентрированным раствором трегалозы и давать высохнуть, в этом случае высохшая трегалоза образует оболочку на подложке. Такие подложки, содержащие высохшую трегалозу, являются чрезвычайно стабильными и могут храниться вплоть до двух лет, если хранить при 4°C в темноте.
Дополнительные компоненты набора могут включать:
• Средства для забора у пациента образца для анализа.
• Буферные растворы и растворы, необходимые для построения стандартных кривых для целевых пептидов.
• Буферные растворы и растворы для промывания и блокирования твердой подложки в процессе анализа
• Буферные растворы и растворы для покрытия твердой подложки покрывающим антителом
• Реагенты для проявления окрашенного или флуорогенного сигнала от детектируемого маркера.
2
4
• Реагенты для остановки образования окрашенного или флуорогенного продукта из детектируемого маркера (например, 1Н HSO).
• Средства для поддержания пептидов в развернутом состоянии (например, концентрированный гуанидингидрохлорид).
• Образец, содержащий маточный раствор пептида Aβ40 или Aβ42, или их сочетание.
В предпочтительном варианте осуществления иммобилизующее антитело иммобилизовано на твердой подложке. Иммобилизацию можно проводить перед связыванием целевого полипептида, подлежащего определению, или после того, как пептид/белок связан иммобилизующим антителом. В любом случае, если используют твердую подложку, удобно блокировать избыток центров связывания белка на носителе до добавления образца, содержащего целевой полипептид, подлежащий определению. Предпочтительно, блокирование или гашение пептидсвязывающих центров на подложке проводят, используя тот же буфер, который используют для промывания комплексов после каждой реакции связывания (например, 50 мМ Tris-HCl, pH 8, PBS или TBS по выбору, содержащий Tween 20) с добавлением макромолекулярного соединения (например, бычьего сывороточного альбумина, обезжиренного сухого молока, реагента для вестерн-блоттинга, казеина, лактальбумина, овальбумина) в концентрациях примерно от 0,05% до 10%, предпочтительно, от 1 до 5%, более предпочтительно, примерно 3%. Если подложку, содержащую иммобилизованное иммобилизующее антитело, необходимо хранить некоторое время, предпочтительно обрабатывать подложку концентрированным раствором трегалозы и давать высохнуть, в этом случае высохшая трегалоза образует оболочку на подложке. Такие подложки, содержащие высохшую трегалозу, являются чрезвычайно стабильными и могут храниться вплоть до двух лет, если хранить при 4°C в темноте.
Наборы по изобретению позволяют обнаруживать или определять с высокой чувствительностью полипептиды, которые специфически узнаются компонентами первого и второго антитела из набора. Таким образом, в следующем аспекте изобретение относится к использованию набора по изобретению для определения белка или белка в образце. В предпочтительном варианте осуществления набор используют для определения в образце пептида, выбранного из группы Aβ40, Aβ42 и их сочетания.
«Образец», согласно настоящему изобретению, включает любое из культуры тканей, плазмы, сыворотки, слюны, семенной жидкости, мокроты, спинномозговой жидкости (СМЖ), слез, слизи, пота, молока, экстрактов мозга и тому подобного. В предпочтительном варианте осуществления образец представляет собой образец плазмы.
Учитывая свойство набора по изобретению обеспечивать высокочувствительное определение концентраций Aβ40 и Aβ42 в любом образце, его можно использовать для диагностики любого заболевания, при котором происходит изменение концентрации любого из данных двух пептидов в любой клеточной жидкости или ткани, в частности, дегенеративных заболеваний и, более конкретно, нейродегенеративных заболеваний. Неограничивающие примеры дегенеративных заболеваний, которые можно диагностировать на основании изменения уровней Aβ40 и/или Aβ42, включают:
• дегенеративные заболевания костей, такие как остеопения, остеомаляция, остеопороз, остеомиелома, остеодистрофия, болезнь Педжета, несовершенный остеогенез, костный склероз, апластическое заболевание костей, гуморальная гиперкальцемическая миелома, множественная миелома и истончение костей вследствие метастаза.
• дегенеративные заболевания хрящей, такие как синдром Горама-Стаута; артрогенные заболевания; остеоартрит; ревматоидный артрит; псориатический артрит; ревматоидный артрит и болезнь ломких костей.
• мышечные дегенеративные заболевания, такие как мышечная дистрофия, мышечная атрофия, застойное обструктивное легочное заболевание, синдром атрофии мышц, саркопения, кахексия.
• сердечные дегенеративные заболевания, включая гибель сердечных клеток вследствие ишемии, гибель ткани или органа вследствие отторжения трансплантата, потерю слуха вследствие аутотоксичности.
• дегенеративные заболевания сетчатки, такие как пигментная дегенерация сетчатки
• дегенеративные заболевания нервной системы, такие как болезнь Александера, болезнь Альпера, болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз, телеангиоэктатическая атаксия, болезнь Баттена, губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота (BSE), болезнь Канавана, синдром Коккейна, кортикобазальная дегенерация, болезнь Крейтцфельда-Якоба, болезнь Гентингтона, ВИЧ-ассоциированная деменция, болезнь Кеннеди, болезнь Краббе, болезнь телец Леви, болезнь Мачадо-Джозефа (спинально-церебеллярная атаксия 3 типа), рассеянный склероз, множественная системная атрофия, нейроборрелиоз, болезнь Паркинсона, болезнь Пелицеуса-Мерцбахера, болезнь Пика, первичный боковой склероз, прионовая болезнь, болезнь Рефсума, болезнь Сандгоффа, болезнь Шильдера, шизофрения, болезнь Спилмейера-Вогта-Шегрена-Баттена (также известная как болезнь Баттена), спинально-церебеллярная атаксия, спинальная мышечная атрофия, болезнь Стиля-Ричардсона-Олжевски, сухотка спинного мозга. В предпочтительном варианте осуществления нейродегенеративное заболевание, которое диагностируют при помощи набора по изобретению, представляет собой болезнь Альцгеймера.
Следует принимать во внимание, что параметр, который может потребоваться для принятия решения о возможном заболевании, представляет собой не только абсолютные концентрации Aβ40 и Aβ42, но также параметры, полученные из сочетания указанных значений, например, соотношение Aβ40/Aβ42 или Aβ42/Aβ40, процентное содержание Aβ42 и Aβ40 относительно общего количества пептидов Aβ или увеличение концентраций Aβ42 и Aβ40.
В предпочтительном варианте осуществления заболевание, которое можно диагностировать, представляет собой болезнь Альцгеймера, более конкретно, спорадическую AD, основываясь на появлении в образце пациента с AD более низких концентраций пептидов Aβ40 и/или Aβ42, чем количества указанного пептида или пептидов в биологическом образце того же происхождения, полученном от здорового индивидуума.
В процессе использования набора по изобретению возможно осуществлять пятиэтапный способ определения в образце количества целевого полипептида, выбранного из группы Aβ42, Aβ40 и их сочетания. Указанный способ, который является следующей целью настоящего изобретения, включает стадии
(i) иммобилизации целевого полипептида, присутствующего в образце, при помощи первого антитела или сочетания антител, которые специфически связывают указанный целевой полипептид,
(ii) создания контакта между иммунными комплексами, образованными на стадии (a), и вторым антителом или сочетанием антител, которые узнают иную область целевого полипептида, чем первое антитело или сочетание антител,
(iii) создания контакта между комплексами, образованными на стадии (ii), и реагентом, обладающим аффинностью в отношении второго антитела, который соединен с первым компонентом связывающей пары,
(iv) создания контакта между комплексами, образованными на стадии (iii), и вторым компонентом связывающей пары, который соединен с детектируемым маркером, и
(v) обнаружения активности фермента или эмиссии флуоресценции соединения, связанного со вторым компонентом связывающей пары.
В предпочтительном варианте осуществления пептиды, которые обнаруживают, соответствуют неолигомерным формам указанного пептида, более предпочтительно, мономерным формам либо Aβ40, либо Aβ42.
Реагенты, используемые на каждой стадии способа, подробно описаны выше.
На первой стадии способа по настоящему изобретению образец, который содержит пептиды Aβ40 и/или Aβ42, приводят в контакт с первым антителом так, чтобы образовался первый иммунный комплекс.
После проведения первой стадии связывания комплексы можно промывать для удаления любого избытка белка/пептида, находящегося в исходном образце, который не связался с иммобилизующим антителом. Предпочтительные промывающие буферные растворы, которые можно использовать в контексте настоящего изобретения, включают любой буферный раствор со значением pH, близким к физиологическому (например, 50 мМ Tris-HCl), необязательно содержащий соли (например, 150 мМ NaCl) и необязательно содержащий детергент в низких концентрациях (например, 0,05% Tween-20).
На второй стадии комплексы, образованные между иммобилизующим антителом и пептидом или пептидами Aβ в образце, затем приводят в контакт со вторым антителом так, чтобы образовались иммунные комплексы типа «сэндвич».
После проведения второй стадии связывания иммунный комплекс можно промывать для удаления неспецифически связавшихся антител, используя в основном те же буферные растворы и методы, которые описаны ранее.
На третьей стадии способ по изобретению включает приведение в контакт комплексов, образованных между иммобилизованным пептидом или пептидами и проявляющим антителом, с реагентом, обладающим аффинностью в отношении проявляющего антитела, соединенным с первым компонентом связывающей пары.
На четвертой стадии способ по изобретению включает приведение в контакт комплексов, образованных между связывающим антитело реагентом и проявляющим антителом, со вторым компонентом связывающей пары, который соединен с детектируемым маркером.
На пятой стадии способа по изобретению способ включает обнаружение детектируемого маркера. Следует понимать, что обнаружение и/или количественное определение детектируемого маркера зависит от природы маркера, и соответствующие методы известны в данной области. Если интактный субстрат или детектируемый маркер содержит люминесцентный или окрашивающий компонент, обнаружение можно проводить посредством визуального наблюдения при помощи УФ-трансиллюминатора или при помощи системы видеообнаружения прибора с зарядовой связью (CCD) на основе УФ, лазерного сканнера гелей, системы видеообнаружения CCD на основе ксенона, фотоаппарата поляроид, объединенного с УФ-трансиллюминатором, а также при помощи множества других детектируемый маркер является ферментом, пятый этап способа по изобретению включает воздействие на иммунокомплексы, меченные маркером (например, иммобилизованный пептид, проявляющее антитело и реагент, меченный детектируемым маркером), активаторами, субстратами или усиливающими агентами фермента, используемого в качестве детектируемого маркера. Хорошо известные детектируемые маркеры, способные генерировать измеряемый сигнал, включают меченные ферментом антитела. Типичные ферменты, широко используемые для данных целей, включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу и гликозидазы, включая β-галактозидазу, β-глюкозидазу и β-глюкуронидазу. В качестве примера, реагент, который специфически связывается с проявляющим антителом, можно метить пероксидазой хрена. После образования комплекса иммобилизованная молекула-проявляющее антитело-реагент можно проводить определение при помощи любого из широкого диапазона хорошо известных субстратов для ферментов, используемых в качестве детектируемых маркеров.
В другом аспекте изобретение относится к способу диагностики нейродегенеративного заболевания, который включает измерение уровней Aβ40 и/или Aβ42 в образце от субъекта, предположительно страдающего от указанного заболевания, и проведение корреляции между концентрацией одного и/или обоих пептидов в образце от указанного субъекта относительно концентрации указанного пептида или пептидов в образце от здорового индивидуума и развитием нейродегенеративного заболевания.
В предпочтительном варианте осуществления нейродегенеративное заболевание представляет собой болезнь Альцгеймера, при которой количество пептидов Aβ40, Aβ42 или их сочетания в указанном образце, более низкое, чем количество указанного пептида или пептидов в образце от здорового индивидуума, является указанием на то, что субъект страдает болезнью Альцгеймера. Предпочтительно, определение проводят в образце плазмы или сыворотки.
Предпочтительно выполнять различные стадии способа, используя параллельно образцы для определения и ряд образцов, имеющих возрастающие и известные концентрации определяемого соединения. Если нужно определять Aβ40 и/или Aβ42, следует построить стандартную кривую для каждого пептида, используя возрастающие концентрации. Построение стандартных кривых преследует две цели (i) установление диапазона концентраций, в котором сигнал возрастает линейно с увеличением концентрации целевого пептида, и (ii) определение концентрации пептидов в исследуемом образце путем интерполяции сигнала, полученного от тестируемых образцов, на кривой для получения значений концентраций. Принимая во внимание высокую чувствительность анализа по изобретению, предпочтительные концентрации тестируемых образцов составляют, например, 3,125; 6,25; 12,5; 25; 50; 100 и 200 пг/мл. Следует признать, что концентрации образцов, используемые для построения стандартной кривой, будут варьировать для каждого тестового субстрата. Однако определение линейного диапазона для анализа может легко осуществлять квалифицированный специалист общепринятыми способами. Принимая во внимание более высокое содержание пептидов Aβ42 и Aβ40 в образцах СМЖ, а также в образцах плазмы пациентов с фамильными формами AD, по сравнению с сывороткой пациентов со спорадической AD, предпочтительно, если набор по изобретению используют для определения пептидов Aβ в образцах СМЖ или сыворотки от пациентов с фамильной AD, то образцы следует разводить так, чтобы конечные концентрации Aβ40/Aβ42 попадали в диапазон, находящийся в пределах линейной части кривой анализа.
Следующие далее примеры приведены в качестве иллюстрации и не должны истолковываться как ограничивающие объем изобретения.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1
Колориметрический сэндвич-анализ ELISA с биотин-стрептавидиновым усилением
Для повышения чувствительности сигнал можно усиливать при помощи пары биотин-стрептавидин. Планшет покрывали иммобилизующим антителом mAb 6E10, которое узнает аминокислоты 1-17 как в амилоидном пептиде Aβ40, так и в амилоидном пептиде Aβ42. Покрытие проводили при концентрации 5 мкг/мл в 100 мМ карбонат-бикарбонатном буфере, pH 9,6, в течение ночи при 4°C. Затем планшет блокировали 300 мкл блокирующего раствора (50 мМ Tris-HCl, pH 8, 0,2% Tween-20, 0,5% BSA) в течение 3 ч при комнатной температуре со встряхиванием или в течение 2 ч при 37°C. При необходимости, после блокирования планшеты можно обрабатывать 100 мкл раствора 50 мМ Tris-HCl pH 8, содержащего 20 мг/мл трегалозу. Планшеты оставляли для высушивания до появления белой оболочки, характерной для трегалозы. Обработанные таким образом планшеты могут храниться при 4°C покрытыми алюминиевой фольгой, и являются стабильными в течение двух лет.
Образцы для стандартной кривой готовили из 200 пг/мл маточного раствора пептидов Aβ40 и Aβ42 на планшетах, покрытых mAb 6E10 и обработанных трегалозой. Для данных растворов выполняли серийные разведения 1:2 в SDB так, чтобы получить концентрации, равные 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25 и 3,125 пг/мл. По 100 мкл каждого разведенного или неразведенного образца добавляли разведенным или неразведенным в SDB (1/1000000) и инкубировали в течение ночи при 4°C (или в течение 2 ч при 37°C).
Проявляющее антитело (поликлональное антитело, полученное против пептида, соответствующего C-концевой области пептида Aβ42 или поликлональное антитело, полученное против пептида, соответствующего C-концевой области пептида Aβ40, в зависимости от того, определяли ли Aβ42 или Aβ40) добавляли разведенным в SDB. 100 мкл добавляли в каждую лунку и затем инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре.
Далее, добавляли 100 мкл разведенного 1/5000 в SDB меченного биотином антитела против IgG кролика (SIGMA) и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре со встряхиванием. Затем добавляли 100 мкл разведенного 1/4000 в SDB конъюгированного с HRP стрептавидина (SIGMA) в каждую лунку и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре.
2
4
Для развития окраски в планшете добавляли 100 мкл хромогенного субстрата TMB (ZEU Inmunotec). TMB добавляли и инкубировали в темноте в течение 15-30 минут. В качестве останавливающего раствора добавляли 50 мкл 1 Н HSO в каждую лунку. Поглощение при 450 нм определяли на планшетном ридере Synergy HT (BioTek Instruments).
После каждой стадии планшет промывали с помощью автоматического промывающего устройства для планшетов (Elx50 Bio Tek Instruments), запрограммированного для выполнения 5 промывок каждый раз. Промывающий раствор содержал 50 мМ Tris-HCl pH 8, 0,05% Tween-20 и 150 мМ NaCl (профильтрован перед использованием).
ПРИМЕР 2
Флуоресцентный сэндвич-анализ ELISA
Планшет покрывали 6E10 в бикарбонатном буфере (5 мкг/мл) в течение ночи при 4°C. Затем планшет блокировали 3 ч при комнатной температуре со встряхиванием (300 мкл/лунку). Затем в планшеты добавляли тестируемые образцы и образцы для стандартной кривой и инкубировали в течение ночи при 4°C. Проявляющее антитело (анти-Aβ40 или анти-Aβ42 сыворотка) в разведении 1/4000 добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре со встряхиванием. Конъюгированное с FITC антиантитело в серийных разведениях (разведения 1/1000, 1/5000, 1/10000) добавляли и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте. Для флуоресценции использовали длину волны возбуждения 485 нм и длину волны эмиссии 528.
Quanta-Blu
Альтернативно анализ проводят с использованием флуоресцентного субстрата  (PIERCE), который повышает чувствительность анализа ELISA. Максимальное возбуждение соответствует 325 нм и максимальная эмиссия соответствует 420 нм. Детектирование можно проводить в диапазоне возбуждения 315-340 нм и диапазоне эмиссии 370-470 нм. Рабочий раствор QuantaBlu готовят, смешивая 9 частей раствора субстрата QuantaBlu с 1 частью стабильного раствора пероксидазы QuantaBlu (раствор стабилен в течение 24 ч при комнатной температуре). Инкубацию можно проводить от 1,5 минут до 90 минут при комнатной температуре и снимать показания, останавливая реакцию или без остановки (развивается голубое окрашивание).
Планшет покрывают mAb 6E10 в бикарбонатном буфере (5 мкг/мл) в течение ночи при 4°C и затем блокируют в течение 3 ч при комнатной температуре со встряхиванием (300 мкл/лунку). Затем получают различные стандартные кривые со следующими концентрациями пептидов Aβ42 и Aβ40:
• 1000; 500; 250; 125; 62,5; 31; 25 и 15,65 пг/мл
• 200; 100; 50; 25; 12,5; 6,25 и 3,125 пг/мл
• 25; 12,5; 6,25; 3,125; 1,56; 0,78 и 0,39 пг/мл
• 10; 5; 2,5; 1,25; 0,625; 0,3125 и 0,156 пг/мл
• 5; 2,5; 1,25; 0,625; 0,3125; 0,156 и 0,078 пг/мл
• 1; 0,5; 0,25; 0,125; 0,0625; 0,03125 и 0,0156 пг/мл
Добавляют проявляющее антитело (анти-Aβ40 или анти-Aβ42 сыворотка) (разведение 1/4000) на 1 ч при комнатной температуре со встряхиванием. Затем добавляют конъюгированное с HRP антитело против IgG кролика, разведенное 1/1000, и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре со встряхиванием. Для развития реакции добавляют 100 мкл рабочего раствора Quanta-Blue и затем инкубируют в течение 30', 60' и 90' при комнатной температуре в темноте. Вслед за этим снимают показания флуоресценции (возбуждение: 360/40 нм; эмиссия: 460/40 нм) через 30', 60' и 90' без остановки реакции или останавливая реакцию останавливающим раствором.
ПРИМЕР 3
Построение стандартных кривых для A
40 и A
42
ββ
Для построения стандартной кривой для Aβ40 лиофилизированный образец Aβ40 человека восстанавливали до концентрации 10 мкг/мл. Из маточного раствора готовили образцы, имеющие следующие концентрации (в пг/мл): 25000 пг/мл, 2500 пг/мл, 25 пг/мл, 12,5 пг/мл, 6,25 пг/мл, 3,125 пг/мл, 1,56 пг/мл, 0,78 пг/мл. Образцы готовили в присутствии 1 мМ ингибитора протеаз AEBSF. Затем образцы обрабатывали способом, описанным в предыдущих примерах. Результаты представлены на фигуре 1.
Для построения стандартной кривой для Aβ42 лиофилизированный образец Aβ42 человека восстанавливали до концентрации 10 мкг/мл. Из маточного раствора готовили образцы, имеющие следующие концентрации: 25000 пг/мл, 2500 пг/мл, 25 пг/мл, 12,5 пг/мл, 6,25 пг/мл, 3,125 пг/мл, 1,56 пг/мл, 0,78 пг/мл. Образцы готовили в присутствии 1 мМ ингибитора протеаз AEBSF. Затем образцы обрабатывали способом, описанным в предыдущих примерах. Результаты представлены на фигуре 2.
ПРИМЕР 4
Корреляция между диагнозом AD и уровнями A
40/Aβ
β
42
Уровни Aβ40 и Aβ42 определяли сэндвич-анализом ELISA, описанным в предыдущих примерах, в образцах плазмы из группы контрольных субъектов и из группы пациентов с AD, диагностированной при помощи Краткой шкалы оценки психического статуса (MMSE) с пороговым значением, равным 24. Концентрации Aβ40 и Aβ42 в пг/мл представлены в таблице 1.
Таблица 1
Здоровые
AB40
AB42
AB40/AB42
AB42/AB40
AB40+AB42
% AB40
% AB42
LSA
31,2
160,1
0,19
5,13
191,30
16,31
83,69
СРВ
93,4
159,4
0,59
1,71
252,80
36,95
63,05
CFA
730,5
893,6
0,82
1,22
1624,10
44,98
55,02
VCL
145,0
329,6
0,44
2,27
474,60
30,55
69,45
FLA
430,1
19,6
21,94
0,05
449,70
95,64
4,36
ILS-7
102,9
34,2
3,01
0,33
137,05
75,08
24,92
MPG-8
57,0
59,2
0,96
1,04
116,17
49,07
50,93
PLA-17
29,6
8,7
3,39
0,30
38,27
77,21
22,79
ARL-24
34,0
25,8
1,32
0,76
59,82
56,89
43,11
BGM-28
23,4
7,4
3,16
0,32
30,77
75,95
24,05
AD
AB40
AB42
AB40/AB42
AB42/AB40
AB40+AB42
% AB40
% AB42
BEG
12,0
71,5
0,17
5,96
83,50
14,37
85,63
CPG
74,3
136,7
0,54
1,84
211,00
35,21
64,79
VAC
26,7
34,7
0,77
1,30
61,40
43,49
56,51
MTF
55,6
141,7
0,39
2,55
197,30
28,18
71,82
CPG
34,2
28,0
1,22
0,82
62,24
54,95
45,05
MVA-5
17,2
21,9
0,79
1,27
39,05
43,99
56,01
JGS-40
13,6
16,6
0,82
1,22
30,18
45,10
54,90
PTG-35
37,3
24,8
1,50
0,66
62,11
60,07
39,93
CBC-30
11,6
6,1
1,90
0,53
17,63
65,51
34,49
JHC-2
25,4
23,4
1,09
0,92
48,84
52,07
47,93
Средние значения рассчитаны, и результаты приведены в таблице 2.
Таблица 2
Здоровые
Пациенты с AD
Aβ40 пг/мл)
167,70
30,78
Aβ42 пг/мл)
169,75
50,53