Способ получения кормового микробиологического белка
METHOD FOR PRODUCING FODDER MICROBIOLOGICAL PROTEIN

Изобретение относится к области биотехнологии, микробиологической, комбикормовой и перерабатывающей промышленности и может быть использовано для получения биомассы кормовых дрожжей путем их выращивания на питательных средах на основе отходов переработки зерновых или бобовых культур для использования ее в качестве кормовой добавки в рацион с/х животных и птицы.
Кормовой микробиологический белок (кормовые дрожжи) – это сухая концентрированная биомасса дрожжевых клеток, специально выращиваемая на корм сельскохозяйственным животным, птице, пушным зверям, рыбе. Кормовые дрожжи богаты белками и витаминами, имеют высокую питательную ценность. Микробный протеин, синтезируемый дрожжами, по усвояемости и содержанию аминокислот, превосходит протеин животного происхождения, повышает биологическую ценность белков других кормов. Белок кормовых дрожжей переваривается в организме животных на 95%. Сера и ее соединения, входящие в состав, участвуют в биологических процессах образования аминокислот. Ферментные системы дрожжей катализируют процессы усвоения аминокислот и синтеза белка. Фосфор и кальций в составе дрожжей способствуют нормальному развитию костного скелета сельскохозяйственных животных. Противопоказаний к применению кормовых дрожжей не имеется. Передозировка кормовых дрожжей не вызывает побочных явлений. Применение продукта не влияет на сроки убоя животных и использование молока.
Белки являются существенной частью кормовых рационов. Жизнь животных неразрывно связана с образованием и распадом белков в организме. Для полноценного роста, для продукции молока, для набора живой массы, животное должно получать необходимое количество белков в составе рациона. Важнейшим критерием качества кормов является аминокислотный состав белковых компонентов. В настоящее время выделено и описано около ста аминокислот. Аминокислоты в кормах могут быть в составе белков, и в свободном состоянии. Лизин используется для синтеза тканевых белков. Аргинин способствует синтезу мочевины, участвует в образовании семени производителей, мышечных белков и инсулина. Гистидин необходим для образования гемоглобина и адреналина. Цистин активирует инсулин. Метионин участвует в процессах обмена жира, триптофан – в обновлении белков плазмы крови.
По содержанию и соотношению незаменимых аминокислот протеины кормов классифицируют на полноценные и неполноценные. Если в рационе присутствует лишь растительный белок (зерно, жмых, сено и т.п.), то такой рацион вряд ли удастся сбалансировать по аминокислотам. В белках животного происхождения незаменимых аминокислот больше, чем в растительных. К незаменимым относят следующие аминокислоты: аргинин, валин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, треонин, триптофан, фенилаланин. Среди незаменимых аминокислот выделяют особо важные, которые называют критическими. Это лизин, метионин+цистии, треонин и триптофан. Недостаток, отсутствие или дисбаланс незаменимых аминокислот в рационах животных сопровождается ухудшением использования протеина, нарушением обмена веществ, снижением продуктивности. Уже небольшой дефицит белка в рационе замедляет метаболизм, вызывает мышечную слабость и снижение объема мышц. Обогащение кормовых смесей дрожжевым белком повысит энергетическую ценность корма и изменит в нужном направлении баланс аминокислот (Косолапов В. М. Проблемы кормопроизводства и пути их решения на современном этапе //Достижения науки и техники АПК. – 2010. – № 11).
Ускоренное развитие животноводства предполагает значительное расширение производства кормов и создание крупнотоннажных производств на основе таких технологий как силосование, дрожжевание и разработка премиксов. В нашей стране производство кормовых дрожжей было начато в середине 1930-х гг. Отходы сельскохозяйственных производств, таких как солома, кукурузные кочерыжки, опилки, подвергали гидролизу серной кислотой, гидролизаты нейтрализовали и использовали для выращивания дрожжей Saccharomyces cerevisiae (Косолапов В. М., Трофимов И. А., Трофимова Л. С., Яковлева Е. П. Кормопроизводство определяющий фактор сельского хозяйства России // Вестник ОрелГАУ. 2012. №1).
Совершенствование кормопроизводства требует биотехнологической оптимизации продуцентов кормового белка и тщательного подбора субстрата для выращивания дрожжей для получения сбалансированного аминокислотного состава готовой кормовой смеси.
В процессе роста биомассы в дрожжевой клетке происходит ферментативный синтез белка. В качестве сырья (субстрата) для питательных сред используют углеводороды нефти (очищенные жидкие парафины), низшие спирты (этанол и метанол), гидролизаты древесных отходов (опилки, стружка, щепа), гидролизаты с/х отходов (солома, шелуха семян, кукурузная кочерыжка и т. п.), сульфитные щелока целлюлозно-бумажного производства, послеспиртовые барды гидролизно- и сульфитно-спиртовых производств.
Известны различные способы получения кормового микробиологического белка (КМБ), включающие гидролиз или ферментолиз отходов переработки зерновых или бобовых культур при определенной температуре с последующим выращиванием культур дрожжей-продуцентов белка (патент RU 2041946, оп. 20.08.1995; патент RU 2042331, оп. 27.08.1995; патент RU 2333665, оп. 20.08.2008; патент RU 2384612, оп. 20.03.2010; патент RU 2437931, оп. 27.12.2011; патент RU 2478701, оп. 10.04.2013).
Известен, например, способ получения кормового микробиологического белка, включающий предварительную обработку отходов растительного сырья гидролизом и выращивание на полученном гидролизате дрожжей . Предварительная обработка субстрата осуществляется кислотным гидролизом при рН 0,8-1,3, температуре 118-123°С в течение 30 мин. В качестве отхода растительного сырья используется кофейный шлам, а биомасса дрожжей представляет собой биомассу дрожжей Saccharomyces cerevisiae (патент RU 2393719, оп. 10.07.2010).
Недостатками гидролиза минеральными кислотами является недостаточное образование простых углеводов для последующего процесса ферментации, связанное с тем, что при кислотном гидролизе гидролизуется не только крахмал до глюкозы, но происходит разрушение самой глюкозы и разрушение пятиатомных сахаров до фурфурола и оксиметилфурфурола.
Известен способ получения кормового микробиологического белка, включающий измельчение растительного сырья (бобов сои), обработку сырья ферментами с обеспечением разрушения клетчатки растительного сырья до глюкозы, внесение в полученную питательную среду минеральных солей, внесение в питательную среду культуры дрожжей сахаромицетов с обеспечением размножения дрожжей, инактивацию дрожжевых клеток (пастеризацию) и сушку полученного продукта (патент US 3958015, оп. 18.05.1976). Однако в качестве исходного сырья в известном способе используется необезжиренная соя. Растительное масло, которое содержится в соевых бобах, препятствует действию ферментов, а также может выступать в качестве ингибитора процесса развития дрожжей. Кроме того, соя содержит ряд антипитательных веществ, для нейтрализации которых требуется проведение тепловой обработки.
o
Известен способ получения кормового микробиологического белка, предусматривающий измельчение отходов зернопроизводства, разбавление сырья водой (СВ) и нагрев его до температуры 65-58C со скоростью нагрева 1,5°C/мин в присутствии гипохлорита щелочного или щелочноземельного металла (0,2-0,8% к СВ) и сульфата аммония (0,1% к СВ), массу выдерживают при этой температуре в течение 1 ч, после чего обрабатывают амилосубтилином при 50°C в течение 1,5-2,5 ч. Полученный субстрат используют для выращивания дрожжей-продуцентов белка. Способ позволяет получать кормовой продукт с повышенным содержанием белка (патент RU 2091492, оп. 27.09.1997).
Недостатками известных способов, включающих стадии гидролиза или ферментолиза, являются сложность технологического процесса, длительность, трудоемкость, а также высокая стоимость протеолитических или амилолитических ферментов, которая приводит к удорожанию и снижению конкурентоспособности готового продукта.
Современные технологии обогащения кормов белком основаны на дрожжевании более питательных субстратов. При дрожжевании белок нарабатывается в составе концентрированного корма в процессе приготовления.
В качестве ближайшего аналога (прототипа) принят способ получения кормового микробиологического белка, включающий измельчение подсолнечного шрота, формирование водной суспензии измельченного подсолнечного шрота, ферментативный гидролиз суспензии подсолнечного шрота с обеспечением разрушения клетчатки шрота до моносахаров, внесение в полученную питательную среду культуры дрожжей сахаромицетов и обеспечение их размножения, инактивацию дрожжевых клеток и сопутствующей микрофлоры термическим способом и сушку полученного продукта. Массовая доля сырого протеина (в пересчете на абсолютно сухое вещество) составляет в целевом продукте 33,5-39,0% (Патент RU 2561535, оп. 27.08.2015).
Недостатками ближайшего аналога являются сложность технологического процесса, длительность и высокая себестоимость целевого продукта.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка простого и экономичного способа получения кормового микробиологического белка на основе штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae с использованием отходов переработки зерновых и бобовых культур.
Технический результат, проявляющийся при решении поставленной задачи – упрощение способа и снижение себестоимости целевого продукта, обладающего повышенным содержанием белка и сбалансированным составом аминокислот.
Поставленная задача решается тем, что в способе получения кормового микробиологического белка, включающем предварительное получение культуры дрожжей Saccharomyces cerevisiae, которую добавляют к субстрату в форме шрота и воде, культивирование биомассы дрожжей при перемешивании и аэрации с последующей сушкой полученного продукта, культуру дрожжей выращивают на основе штамма-продуцента Saccharomyces cerevisiae Scm, соединяют с субстратом в виде смеси, содержащей в масс.%: шрот соевый - 30,0, мучка рисовая - 60,0, шелуха рисовая - 10,0 и далее – с водой дистиллированной и культивируют при температуре 32-34°С в течение 10-18 часов при скорости вращения мешалки 1000-1200 об/мин и подаче воздуха 2-4 л/мин.
Кроме того, питательная среда для выращивания штамма-продуцента Saccharomyces cerevisiae Scm содержит дрожжевой экстракт - 10,0%, пептон - 20,0%, декстрозу - 20,0%, воду дистиллированную – до 100%.
Кроме того, на 1 кг смеси берут 0,4-0,5 л дрожжей и воду дистиллированную до 4 л.
Кроме того, сушку полученного продукта осуществляют слоями толщиной 2-5 см при температуре 70-85°С.
Сопоставительный анализ совокупности существенных признаков предлагаемого технического решения и совокупности существенных признаков прототипа и аналогов свидетельствует о его соответствии критерию «новизна».
При этом отличительные признаки формулы изобретения решают следующие функциональные задачи.
Признак «культуру дрожжей выращивают на основе штамма-продуцента Saccharomyces cerevisiae Scm» позволяет повысить содержания белка в целевом продукте.
Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae Scm обладает следующими свойствами: накапливаемая биомасса более 10 г/л; массовая доля белка в биомассе по Барнштейну > 50%; получаемый белок не токсичен; штамм-продуцент хранится без потери качества более 24 часов в жидкой среде при температуре 4-8°С, более 10 суток на полутвердой среде при температуре 4-8°С и более 60 суток при температуре ниже -70°С в специальной среде с криоконсервантом (10% глицерина).
Признаки «субстрат в виде смеси, содержащей в масс.%: шрот соевый - 30,0, мучка рисовая - 60,0, шелуха рисовая - 10,0» обеспечивают сбалансировать смеси по аминокислотам, а также позволяют получить полноценный кормовой микробиологический белок с низкой себестоимостью.
Признаки «культуру дрожжей… соединяют с субстратом… и далее – с водой дистиллированной» и признаки второго зависимого пункта формулы обеспечивают возможность формирования культуральной среды.
Признаки «культивируют при температуре 32-34°С в течение 10-18 часов при скорости вращения мешалки 1000-1200 об/мин и подаче воздуха 2-4 л/мин» описывают оптимальные условия для выращивания биомассы дрожжей.
Признаки первого зависимого пункта формулы описывают оптимальный состав питательной среды для выращивания штамма-продуцента Saccharomyces cerevisiae Scm.
Признаки третьего зависимого пункта формулы описывают режим сушки полученного продукта.
Таким образом, заявляемый способ позволяет получить легкоусвояемый, сбалансированный по аминокислотному составу целевой продукт с повышенным содержанием белка.
Заявляемый способ осуществляют по стандартной технологии на стандартном оборудовании.
На первом этапе проводят подготовку штамма к инокуляции и его выращивание. Для этого, культуру дрожжей Saccharomyces cerevisiae Scm переносят на чашку с агаризованной средой YPD и инкубируют чашки 18-36 часов при температуре 30°C без режима перемешивания. По достижении колониями размера 2-3 мм, осуществляют инокуляцию отдельной колонии в жидкую среду YPD, содержащую пептон – 20%, дрожжевой экстракт – 10%, декстрозу – 20%, воду дистиллированную – до 100% для получения ночной культуры. Растят в течение 18 часов на шейкере-инкубаторе при 30°C и 250 об/минуту.
Затем готовят субстрат в виде смеси, содержащей в масс.%: шрот соевый 30,0, мучка рисовая 60,0, шелуха рисовая 10,0.
В биореактор добавляют расчетное количество смеси, затем вносят штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae Scm, добавляют воду дистиллированную (на 1 кг смеси берут 0,4-0,5 л дрожжей и воду дистиллированную до 4 л) и проводят культивирование в течение 10-18 часов при температуре 32-34°С, при скорости вращения мешалки 1000-1200 оборотов в минуту и подаче воздуха (аэрации) 2-4 литра в минуту.
По окончанию культивирования суспензию биомассы дрожжей помещают в поддоны слоем 2-5 см и сушат при 70-85°С, при периодическом перемешивании. Высушенный КМБ измельчают и фасуют в тару.
Целевой продукт представляет собой порошок, чешуйки или гранулы от светло-желтого до серовато-коричневого цвета. Выход целевого продукта составляет 95-97%. Массовая доля сырого протеина (в пересчете на абсолютно сухое вещество) составляет 40-55%; Массовая доля белка по Барнштейну (в пересчете на абсолютно сухое вещество) составляет 50-55%; Массовая доля влаги – 10-15%.
КМБ хранят в сухом, защищенном от света месте, при температуре от 0 до + 25°С. Срок годности КМБ составляет 1 год.
Описание компонентов кормовой смеси.
При переработке риса на зернозаводах, кроме основного продукта, получают в большом количестве рисовую мучку, шелуху и зерновые отходы. Использование этих отходов в кормопроизводстве связано с некоторыми трудностями: рисовая мучка быстро прогоркает, шелуха обладает низкими питательными свойствами. Кормовые мучки считаются высокопитательными кормовыми продуктами, так как в их состав входят частицы мучнистого ядра, плодовых и семенных оболочек, волосков зерна и частично зародыши, а также некоторое количество размельченной цветочной пленки. В кормовой мучке содержится много крахмала и меньше клетчатки. Переваримость питательных веществ кормовых мучек хорошая не только у жвачных животных, но и у свиней и птицы. Пшеничная кормовая мучка переваривается на 86-90%, ржаная – на 76-83, ячменная – на 75-80%, овсяная – на 75-76, рисовая – на 65-70, гороховая – на 90-91 и гречневая – на 70-73%. В рисовой мучке, составляющей 60% кормовой смеси, используемой в качестве субстрата, содержится около 8% сырого протеина.
Рисовая шелуха, составляющая 10% кормовой смеси, богата углеводами, витаминами (тиамин, рибофлавин и др.). Рисовая шелуха имеет в своем составе органические соединения (сахар, азот, аминокислоты, органические кислоты) и неорганические вещества (Са, Р, Mg, К, Na, Mn, Zn, Fe, Cu).
Использование в кормовой смеси соевого протеина является недорогим и оптимальным решением обогащения субстрата кормовым белком. Бобы сои содержат 33% сырого протеина. В 1 кг зерна сои содержится 31,9 г лизина. По сравнению со злаковыми культурами, в зерне бобовых в 2-3 раза больше сырого протеина и в 3-5 раз больше лизина - основной лимитирующей аминокислоты. Белок сои по этому показателю близок к животным белкам, вследствие чего соя - превосходный компонент комбикормов для свиней и птицы. В таблице 1 представлена характеристика питательной ценности зерна бобовых культур.
Таблица 1
Показатели питательной ценности зерновых и бобовых культур
Соевый шрот, составляющий 30% кормовой смеси, представляет собой остатки маслоэкстракционного производства.
Содержание аминокислот в целевом продукте определяли известными способами (Методы контроля качества аминокислот в фармацевтическом анализе. Разработка и регистрация лекарственных средств, №11, май 2015). Полученные данные по содержанию аминокислот в целевом продукте (КМБ) приведены в Таблице 2.
Таблица 2
Содержание аминокислот в целевом продукте
Аминокислота (АК)
Содержание, г/кг
Cвязанные АК
Свободные АК
Аланин
28,57
2,54
Глицин
7,12
0,61
Валин
18,3
1,50
Лейцин
37,42
2,60
Изолейцин
5,20
0,48
Пролин
26,65
0,44
Треонин
2,31
0,04
Метионин
0,44
<0,01
Фенилаланин
5,05
4,06
Гистидин
9,23
0,36
Тирозин
28,92
1,14
Триптофан
0,94
0,19
Аспарагиновая кислота
0,03
<0,01
Лизин
0,51
0,10
Из таблицы 2 видно, что в составе белка (КМБ) наиболее представлены аминокислоты аланин, лейцин, пролин, тирозин и валин.
Таким образом, баланс кормовой смеси по аминокислотам осуществляют за счет дрожжевания субстрата штаммом дрожжей Saccharomyces cerevisiae Scm.
Из расчета состава субстрата, содержание белка в КМБ складывается из белка соевого шрота, белка рисовой мучки и дрожжевого белка, наработанного штаммом Saccharomyces cerevisiae Scm. Содержание сырого протеина в КМБ составляет 40,0 г/100 г дрожжевой биомассы. Обменная энергия в дрожжевой биомассе составляет 220 ккал/100 г, следовательно, дрожжевая биомасса добавляет к обменной энергии КМБ 62,7 ккал/100 г.
В таблице 3 представлены данные по составу белка КМБ.
Таблица 3
Характеристики исходного сырья и кормового микробиологического белка
Из таблицы 3 видно, что обменная энергия в КМБ составляет 238,9 ккал/100 г.
Таким образом, разработанная технология позволяет получать полноценный кормовой микробиологический белок (КМБ), пригодный для кормления различных сельскохозяйственных животных. КМБ не является токсичным, не содержит токсичных элементов, обладает приятным характерным запахом и имеет достаточно высокую кормовую ценность: содержание белка более 40%, содержание обменной энергии около 240 ккал/100 г.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.
Пример 1.
На первом этапе провели подготовку штамма к инокуляции и выращивание культуры штамма-продуцента на жидкой питательной среде. Для этого произвели посев микробиологической петлей культуры дрожжей Saccharomyces cerevisiae Scm на чашку с агаризованной средой YPD. Инкубировали чашки 18-36 часов при температуре 30°C в атмосфере окружающего воздуха на шейкере инкубаторе без режима перемешивания. По достижении колониями размера 2-3 мм с использованием микробиологической петли провели инокуляцию отдельной колонии в жидкую среду YPD, содержащую пептон – 20%, дрожжевой экстракт – 10%, углевод (декстрозу или глюкозу) – 20%, воду дистиллированную – до 100% для получения ночной культуры. Растили в течение 18 часов на шейкере-инкубаторе при 30°C и 250 об/мин.
Подготовили смесь, содержащую шрот соевый 30,0%, мучку рисовую 60,0%, шелуху рисовую 10,0%, представляющую собой порошок с размером частиц не более 1 мм. Для этого компоненты смеси смешали в следующей пропорции: шрот соевый 300 г, мучка рисовая 600 г, шелуха рисовая 100 г.
В биореактор объемом 5 литров (BIOSTAT, Sartorius) добавили субстрат в количестве 1 кг, внесли 400 мл выращенной культуры штамма Saccharomyces cerevisiae Scm и добавили воду дистиллированную до 4-х литров. Культивирование провели в автоматическом режиме при температуре 32°С, в течение 10 часов при скорости вращения мешалки 1200 об/мин и подаче воздуха 4 л/мин.
По окончанию культивирования суспензию биомассы дрожжей помещали в поддоны слоем 2 см и сушили в сушильном шкафу при периодическом перемешивании при 70°С. Остаточная влажность биомассы составляла 10%. Высушенный КМБ измельчали и фасовали в тару. Вес препарата, полученного после высушивания, составлял ~ 950 грамм.
Пример 2.
На первом этапе провели подготовку штамма к инокуляции и выращивание культуры штамма-продуцента аналогично примеру 1.
Подготовили субстрат в виде смеси, содержащей шрот соевый 30,0%, мучку рисовую 60,0%, шелуху рисовую 10,0%.
В биореактор объемом 5 литров (BIOSTAT, Sartorius) добавили субстрат в количестве 1 кг, 500 мл культуры штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae Scm и воду дистиллированную до 4-х литров. Культивирование провели при температуре 34°С, в течение 18 часов при скорости вращения мешалки 1000 об/мин и подаче воздуха 2 л/мин.
По окончанию культивирования суспензию биомассы дрожжей помещали в поддоны слоем 5 см и сушили в сушильном шкафу при 85°С при периодическом перемешивании. Остаточная влажность биомассы составляла 12%. Высушенный КМБ измельчали в равномерный порошок молотковой дробилкой и фасовали в тару. Вес препарата, полученного после высушивания, составлял ~ 970 грамм.
Разработанный способ отличается простотой и позволяет получать полноценный кормовой микробиологический белок (КМБ) с достаточно низкой себестоимостью за счет использования отходов зернозаводов, пригодный для кормления различных сельскохозяйственных животных.
КМБ не является токсичным, не содержит токсичных элементов, обладает приятным характерным запахом и имеет достаточно высокую кормовую ценность: содержание белка более 40%, содержание обменной энергии около 240 ккал/100 г.