Штамм бактерий Acinetobacter johnsonii A1 для повышения урожайности зерновых культур
ACINETOBACTER JOHNSONII A1 BACTERIAL STRAIN TO INCREASE GRAIN YIELD

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии и сельскому хозяйству и касается получения штаммов бактерий, обладающих азотфиксирующей фитопротекторной и ростостимулирующей активностью. Штамм перспективен для получения бактериальных препаратов для улучшения питания растений, оздоровления биоценоза и повышения урожая зерновых культур.
Известно использование штамма бактерий Azotobacter chroococcum 3064 ВКПМ В-3721, проявляющего азотфиксирующую активность в составе препарата, для повышения урожайности, приживаемости растений при одновременном повышении качества стандартного посадочного материала, выхода его, а также повышения зимостойкости культур, в особенности плодовых (п. РФ № 2127509, МПК A01G 7/00, опубл. 23.03.1999).
Однако данный штамм предлагается к использованию только в составе биопрепаратов.
Pseudomonas aureofaciens ИБ 51 и Pseudomonas putida ИБ 17 (п. РФ № 2203945, МПК C12N 1/20, опубл. 2003; п. РФ № 2213774, МПК C12N 1/20, опубл. 2003), обладающие способностью оказывать антагонистическое действие на возбудителей заболеваний пшеницы твердой головней и корневыми гнилями.
Недостатком штаммов является их сравнительно невысокая антагонистическая активность и неспособность к фиксации атмосферного азота и синтезу ростостимулирующих веществ, т.е. отсутствие комплексности воздействия на фитопатогены и растения.
Известны штаммы микроорганизмов, непосредственно стимулирующие рост и способствующие повышению продуктивности растений, такие как Pseudomonas putida ВКПМ В-4308 (п. РФ № 2051586, МПК A01N 63/00, C12N 1/20, опубл. 10.01.1996), Pseudomonas lemoignei ВКМ В-6615 (п. РФ № 2121271, МПК A01N 63/00, C12N 1/20, опубл. 10.11.1998), Streptomyces chrysomallus Р-21 (п. РФ № 2226214, МПК C12N 1/20, A01N 63/00, опубл. 27.03.2004), Bacillus subtilis 8А (п. РФ № 2495119, МПК C12N 1/20, C12R 1/125, A01N 63/00, опубл. 10.10.2013), Serratia ficaria ВКПМ В-11403 (п. РФ № 2545398, МПК A01N 63/02, C12N 1/20, C12R 1/425, опубл. 27.03.2015), Bacillus pumilus А1.5 (п. РФ №2551968, опубл. 10.06.2015), Bacillus atrophaeus ВКПМ В-11474 (п. РФ № 2570624, МПК C12N 1/20, A01N 63/02, C12R 1/07, опубл. 10.12.2015), Bacillus cereus 875 TS (п. РФ № 2624032, МПК C12N 1/20, A01N 63/02, C12R 1/085, опубл. 30.06.2017).
Однако ни для одного из перечисленных штаммов не указаны возможные механизмы прямой стимуляции роста растений, что не позволяет делать уверенные прогнозы относительно эффективности их применения в различных условиях и на различных культурах.
Штамм бактерий Pseudomonas sp. ИБ-4 (п. РФ № 2529958, МПК А01N 63/00, C12N 1/20, опубл. 10.10.2014) обладает высокой продуктивностью, нитрогеназной и ростостимулирующей активностями. Штамм бактерий Pseudomonas sp. депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под регистрационным номером ВКМ В-2830D и может быть использован при получении биопрепарата для снижения заболеваемости растений, вызываемой фитопатогенными грибами, и повышения урожайности растений. Изобретение позволяет повысить урожай пшеницы.
Недостатком данного штамма является его низкая азотфиксирующая способность.
Таким образом, все известные штаммы, используемые в качестве фиксаторов азота воздуха или обладающие фитопротекторной и/или ростостимулирующей активностью, имеют ряд недостатков вследствие недостаточно высокой эффективности и трудоемкости способа получения биомассы, низким уровнем азотфиксирующей способности и стимуляции роста растений. Кроме того, большинство известных штаммов, для достижения указанных свойств, используются только в составе консорциумов, и не обладают самостоятельной фитпротекторной и ростостимулирующей активностью.
Технической проблемой, поставленной перед изобретением, является расширение ассортимента штаммов, обладающих азотфиксирующей, фитопротекторной и ростостимулирующей активностью.
Поставленная техническая проблема решается выявлением нового природного штамма Acinetobacter johnsonii A1 ВКПМ В-13867, который обладает значительной азотфиксирующей способностью, а также фитопротекторной и ростостимулирующей активностью.
Штамм Acinetobacter johnsonii A1 выделен в естественных условиях из почвы (Приморский край, Россия) путем прямого высева на агаризованную среду Эшби при 22-25°С и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-13867.
2
4
Штамм Acinetobacter johnsonii A1 ВКПМ В-13867 обладает азотфиксирующей способностью. Активность фиксации азота определяли ацетиленовым методом с помощью газового хроматографа и выражали в наномолях образовавшегося этилена за 1 час инкубации (нМ СН/ч).
Штамм идентифицировали помощью анализа 16S РН. Была проанализирована последовательность длинной 598 пар оснований. Для амплификации участка 16S рРНК образцов использовали пару праймеров BAK11w 5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3' и BAK2 5’-GGACTACHAGGGTATCTAAT-3’, которые оптимизированы для идентификации широкого спектра бактериальной ДНК (Zucol et al., 2006). Реакцию амплификации проводили с помощью термоциклера iCycler (Bio-Rad Laboratories, USA), программированном на следующие условия реакции: предварительная денатурация 96°С — 1 мин, 30 циклов, включавших 96°С — 10 сек, 55°С — 20 сек, 72°С — 30 сек и финальная элонгация 55°С — 20 сек, 72°С — 3 мин. Объем реакционной смеси составлял 25 мкл, содержащей по 0,3 мM праймеров BAK11w и BAK2, 0,2 мM каждого нуклеотида, 2,5 мкл 10X Encyclo буфера, 0,5 мкл 50X Encyclo полимеразы и 50 нг образца ДНК. Результат амплификации анализировали в 1 %-ном агарозном геле с добавлением бромида этидия. Полученный специфичный продукт размером 780 п.н. вырезали из геля, очищали и использовали в реакции секвенирования с помощью BigDye Terminator v3.1 согласно рекомендациям фирмы-производителя (Thermo Fisher Scientific, USA).
Культурально-морфологические и биохимические особенности штамма:
На агаризованной среде Эшби штамм образует округлые, гладкие, выпуклые, блестящие непрозрачные колонии белого цвета с ровными краями, центр не выражен. В мазке обнаруживаются палочки размером 0,5-1,0×1,0-3,0 мкм, грамотрицательные. В активной фазе роста клетки в виде палочек шириной 1,1-1,4 мкм, длиной 1,6-2,4 мкм. Стационарной фазе роста клетки укорачиваются, становясь почти сферическими. По грамму окрашиваются отрицательно, подвижны. Каталазаположительные. Оксидазоотрицатиельные. Строгие Аэробы. Утилизируют соли аммония и нитраты, используют глюкозу, Л-арабинозу, ксилозу, рибозу.
Для длительного хранения культуру бактерий высевали уколом на столбик полужидкого питательного агара (состав г/л: мясной экстракт – 3,0; пептон – 3,0; агар – 4,0) и через 3 дня заливали стерильным вазелиновым маслом слоем в 0,5-1 см. Полученные таким образом музейные культуры были помещены в холодильник при 4°С.
Размножение штамма проводили на скошенном столбике ГРМ-агара (состав гр/л: панкреатический гидролизат рыбной муки- 12,0; пептон ферментативный – 12,0; натрия хлорид – 6,0; агар микробиологический – 10,0) при 25-30°С.
Ферментацию штамма проводили путем посева в ГРМ-бульон (состав гр/л: панкреатический гидролизат рыбной муки- 8,0; пептон ферментативный – 8,0; натрия хлорид – 6,0) при 22-25°С в течение 6 дней при постоянном перемешивании до достижения численности бактерий не менее 1×107 м.кл./мл.
Пример 1. Фиксация молекулярного азота культурой бактерий Acinetobacter johnsonii A1 ВКПМ В-13867.
2
4
Активность фиксации азота определяли ацетиленовым методом с помощью газового хроматографа. Культуру бактерий Acinetobacter johnsonii A1 ВКПМ В-13867 выращивали в ГРМ-бульоне (состав г/л: панкреатический гидролизат рыбной муки - 8,0; пептон ферментативный – 8,0; натрия хлорид – 6,0) при 22-25°С в течение 6 дней при постоянном перемешивании до достижения численности бактерий не менее 1×107 мкл/мл. Затем во флакон с культурой вносили 2% глюкозы, перемешивали, закрывали флакон ватно-марлевой пробкой и помещали в термостат на 24 часа при 28°С. После чего флаконы с культурой закрывали резиновыми пробками и внутрь каждого флакона вводили 1 мл ацетилена и вновь помещали в термостат при 28°С. Через 1 сутки инкубации из флакона отбирали газовую пробу и вводили ее в газовый хроматограф медицинским шприцем. Колонка газового хроматографа обеспечивает разделение газов метана, пропана, этилена, ацетилена. Азотфиксирующую активность выражали в наномолях образовавшегося этилена за 1 час инкубации (наномоль СН/ч). Активность азотфиксации вычисляли по формуле: АФ = (0,0067 × S × V) / t, где 0,0067 — калибровочная коэффициента на этилен, S — площадь пика этилена (мВ·сек), V — объем воздуха в пенициллиновом флакончике, T — время инкубации с ацетиленом (ч).
2
4
В результате установлена азотфиксирующая способность культуры бактерий Acinetobacter johnsonii A1 ВКПМ В-13867 на уровне 5,4 нМ СН/ч
Ростостимулирующее и фитопротекторное действие  изучали посредством выявления потенциального эффекта исследуемых бактерий при воздействии на прорастание семян злаковых растений.
Пример 2. Оценка воздействия штамма Acinetobacter johnsonii A1 ВКПМ В-13867 на энергию прорастания семян злаковых культур
9
Готовили рабочий раствор: штамм Acinetobacter johnsonii A1 ВКПМ В-13867 подращивали на жидкой питательной среде при 23-25°С в течении 5-7 суток до достижения концентрации 1*10 КОЕ/мл.  Семена растений, в количестве 100 штук каждого сорта, замачивали в  рабочем растворе, время экспозиции составляло 30 минут. Затем все семена раскладывали по 10 штук на поверхность фильтровальной бумаги, смоченной стерильной водой, в стерильных чашках Петри для прорастания. Семена проращивали при 23°С. На 3-и сутки определяли энергию прорастания. В результате воздействия препарата наблюдали увеличение энергии прорастания семян пшеницы в среднем на 20%, семян ячменя — в среднем на 22% по сравнению с необработанным контролем.
Пример 3. Оценка воздействия штамма Acinetobacter johnsonii A1 ВКПМ В-13867 на лабораторную всхожесть семян злаковых культур.
9
Готовили рабочий раствор: штамм Acinetobacter johnsonii A1 ВКПМ В-13867 подращивали на жидкой питательной среде при 23-25°С в течении 5-7 суток до достижения концентрации 1*10 КОЕ/мл.  Семена растений, в количестве 100 штук каждого сорта, замачивали в рабочем растворе, время экспозиции составляло 30 минут. Затем все семена раскладывали по 10 штук на поверхность фильтровальной бумаги, смоченной стерильной водой, в стерильных чашках Петри для прорастания. Семена проращивали при 23°С. На 7-е сутки оценивали лабораторную всхожесть семян. В результате воздействия препарата наблюдали увеличение лабораторной всхожести семян ярового ячменя на 18%, яровой пшеницы – на 20%.
Пример 4. Оценка воздействия штамма Acinetobacter johnsonii A1 ВКПМ В-13867 на длину побега и длину корней проростков семян злаковых культур.
9
Готовили рабочий раствор: штамм Acinetobacter johnsonii A1 ВКПМ В-13867 подращивали на жидкой питательной среде при 23-25°С в течении 5-7 суток до достижения концентрации 1*10 КОЕ/мл.  Семена растений, в количестве 100 штук каждого сорта, замачивали в  рабочем растворе, время экспозиции составляло 30 минут. Затем все семена раскладывали по 10 штук на поверхность фильтровальной бумаги, смоченной стерильной водой, в стерильных чашках Петри для прорастания. Семена проращивали при 23°С. На 7-е оценивали длину побега и длину корней проростков. В результате воздействия препарата наблюдали увеличение длины надземной части ярового ячменя на 24 %, яровой пшеницы – на 8%; увеличение длины корня ярового ячменя на 34%, яровой пшеницы – на 70%.
Пример 5. Протравка семян ячменя и пшеницы перед посевом штаммом бактерий Acinetobacter johnsonii A1 ВКПМ В-13867.
4
Семена опрыскивали из пульверизатора культурой бактерий Acinetobacter johnsonii A1 ВКПМ В-13867 в концентрации 1х10 КОЕ/мл из расчета 100 мл на 1 кг семян. Обработанные таким образом семена ячменя и пшеницы раскладывали, соблюдая стерильность, на чашки Петри с плотной средой Чапека. На одну чашку выкладывали 10 семян. Всего в эксперимент брали 100 семян ячменя и 100 семян пшеницы. Контроль – необработанные семена. В результате эксперимента наблюдали 100% фунгицидную и бактерицидную активность бактерий Acinetobacter johnsonii A1 ВКПМ В-13867.