СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСНОГО КОРМОВОГО ПРЕПАРАТА С ПРОДУЦЕНТОМ ЛИЗИНА НА ОСНОВЕ CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM
PRODUCTION METHOD OF COMPLEX FEED PREPARATION WITH LYSIN PRODUCER BASED ON CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM

Изобретение относится к кормопроизводству, в частности к способам приготовления биологически активных пробиотических добавок кормового назначения для животных, птицы, рыбы, повышающих эффективность пищеварения, оказывающих разностороннее действие на животный организм и позволяющих применять их как для профилактики желудочно-кишечных заболеваний, так и для стимуляции роста и повышения продуктивности.
Для получения новых биологически активных препаратов используют различные виды пробиотических бактерий - продуцентов биологически активных веществ, комбинируют комплексы пробиотиков с фитобиотиками.
Лизин, обязательный компонент кормов для животных, необходим животным для синтеза нуклеотидов и хромопротеинов, а также для регуляции обмена азота и углеводов. Являясь природным иммуномодулятором, лизин участвует в окислительно-восстановительных реакциях, положительно влияет на синтез эритроцитов, обеспечивает аккумуляцию кальция в костной ткани, способствует полноценному усвоению фосфора, обеспечивает переаминирование и дезаминирование аминокислот. Лизин, ускоряя процесс и восстановление костной ткани, способствует росту молодняка, быстрому усвоению кормов, образованию меланина при оперении птиц. Доступный (усваиваемый) лизин используется для выработки белков, участвующих в формировании скелетных и мышечных тканей, ферментов, гормонов.
Дефицит лизина в настоящее время чаще всего восполняется введением в корма синтетического кормового лизина - продукта микробиологического синтеза или кристаллического L-лизина моногидрохлорида, полученного также микробиологическим способом. Исследования по определению возможности замены в кормах кристаллического лизина на микробиологический препарат продуцента лизина Escherichia coli VL 613 при выращивании цыплят-бройлеров высокопродуктивного кросса «Кобб Авиан-48» показали, что его применение было более эффективным в первый период выращивания птицы, когда дефицит по лизину составлял 118 г на 100 кг корма. При этом наибольшей биологической активностью отличалась лиофильно высушенная форма препарата, меньшей - препарат, представляющий собой биомассу, нанесенную на цеолит. Препарат в жидкой форме был менее эффективен по сравнению с другими формами. Это позволило получить в 3-недельном возрасте показатели по живой массе цыплят опытных групп, превышающие контроль на 5,8%, 2,6% и 1,7% соответственно. Подобная тенденция по активности препаратов отмечена и во втором периоде выращивания птицы. Так, живая масса бройлеров, получавших препарат на основе сухой формы продуцента лизина Escherichia coli VL 613, к концу выращивания превышала контроль на 0,8%. При этом живая масса петушков была выше на 2,7%, курочек - ниже на 1,3%. Выявлено отставание по живой массе цыплят опытной группы, получавшей препарат Escherichia coli VL 613, нанесенный на цеолит, в сравнении с контролем и бройлерами опытной группы, которым вводили в комбикорма сухую форму препарата. Цыплята опытной группы, получавшие жидкую форму препарата, имели живую массу ниже контроля на 5,4% (Р<0,001). В итоге сделан вывод, что замена синтетического (кристаллического) лизина на сухой лиофилизированный микробиологический препарат Escherichia coli VL 613 в комбикормах для цыплят- бройлеров обеспечивает в нем необходимый для реализации продуктивных качеств птицы уровень содержания лизина. Харламов К.В. Научно-практическое обоснование повышения эффективности использования кормов в птицеводстве. Автореферат диссертации на соискание уч. ст.д. с/х. н. Сергиев Посад, 2011.
Очевидно, что такой препарат имеет недостатки: а) продуцент - генномодифицированный микроороганизм; б) лиофилизированная культура генномодифицированного штамма бактерий дорогая и экономически не выгодна для использования в кормах сельскохозяйственных животных в качестве заменителя синтетического лизина.
Эхинацея пурпурная обладает иммуномодуляторными свойствами. Химический состав: все органы растения содержат полисахариды, эфирное масло (цветки до 0,5%, трава до 0,35%, корни до 0,25%). Главная составная часть эфирного масла - нециклические сесквитерпены. В корнях обнаружены гликозид эхинакозид, бетаин (0,1%), смолы (около 2%), органические кислоты (пальмитиновая, линолевая, церотиновая), а также фитостерины. Основные действующие вещества, обладающие иммуностимулирующей активностью - полисахариды. Полисахариды эхинацеи пурпурной повышают резистентность иммунодефицитных мышей к инфекции Candida albicans и Listeria monocytogenes. Полисахариды эхинацеи пурпурной также стимулируют цитотоксичность макрофагов в отношении опухолевых и микробных клеток.
Расторопша пятнистая используется для профилактики различных поражений печени. Расторопша уникальна тем, что способствует очищению и образованию новых клеток печени. Препараты из расторопши повышают защитные свойства печени к инфекции и отравлениям, стимулируют образование и выведение желчи. Расторопша пятнистая - растение, содержащее эфирные масла и флавоноиды (силибин, силикокристин, силидиамин), обладающие мощным детоксицирующим, гепатопротекторным, антиоксидантным действием, является незаменимой в восстановлении микрофлоры человека. Из расторопши получены 2 препарата: "Мариол" в виде порошка со свойствами флавоноида (силимарина), выпускаемый по РУ МЗ РФ 000554.Р.643.11.98; и "Мариол-МК" в виде масла расторопши, календулы и ромашки, выпускаемый по РУ МЗ РФ 001625.Р.643.06.2000. Основными действующими веществами масла являются эссенциальные (незаменимые) полиненасыщенные кислоты (не менее 55 г/в 100 мл), биогенные амины, фосфолипиды, токоферолы, каратиноиды, эфирные масла; витамины A, D, Е, К, F. RU 22171562 С2, 27.11.2003.
Настоящее изобретение связано с получением комплексного кормового биологически активного препарата, включающего ассоциацию пробиотических бактерий, штамм - продуцент лизина и фитобиотики - порошки лекарственных растений травы эхинацеи пурпурной и плодов расторопши пятнистой.
Ближайшим аналогом заявленного способа является способ получения пробиотической кормовой добавки Ферм КМ, которую получают путем раздельного глубинного культивирования штаммов Bacillus subtilis ВКПМ В-8130, Bacillus subtilis ВКПМ В -2984, Bacillus subtilis ВКПМ В-4099 и Bacillus licheniformis ВКПМ В-4162 и последующего твердофазного ферментирования. Для чего полученные жидкие культуры Bacillus subtilis ВКПМ В-8130, Bacillus subtilis ВКПМ В -2984 и Bacillus ВКПМ В-4099 смешивают в соотношении 6:6:1 до объема 65 л, наносят на 200 кг стерильного свекловичного жома, который предварительно обрабатывают целлюлолитическим ферментом, растворенным в питательной среде, содержащей на 30 л воды: мелассу - 255-265 г, калий фосфорнокислый двузамещенный - 98-102 г, магний сернокислый-25-26 г, дрожжи -1,8-2,2 г, доводят рН до 6,0-6,5 и выдерживают 2 ч при температуре 45-50°С. После предобработки свекловичного жома к нему добавляют смесь культуральных жидкостей Bacillus subtilis ВКПМ В-8130, Bacillus subtilis ВКПМ В-2984 по 30 л на загрузку, и Bacillus subtilis ВКПМ В-4099 - 5 л на загрузку, доводят рН до 7,5-8.0 и влажность замеса до 43-48%. Смесь тщательно перемешивают, ведут твердофазную ферментацию в условиях ограниченного доступа кислорода в течение 48 ч при температуре 45-50°С и высушивают при температуре 50°С до влажности 8-10%. При этом жидкую культуру Bacillus licheniformis ВКПМ В-4162 непосредственно смешивают со свекловичным жомом и высушивают до влажности 8-9%, полученные высушенные продукты перемешивают в течение 0,5 ч и подвергают дроблению до получения однородного продукта. RU 2412612 С1, 27. 02. 2011.
Технический результат изобретения заключается в получении препарата, более эффективного, чем пробиотическая кормовая добавка Ферм КМ, что выражается в получении дополнительного прироста живой массы, в снижении затрат корма на единицу  полученного прироста, повышении сохранности (выживаемости) поголовья.
2
4
4
4
4
8
Технический результат достигается в результате создания технологии получения комплексного кормового препарата с продуцентом лизина - штаммом Corynebacterium glutamicum Е-531 ВКПМ В-1959 с помощью твердофазной ферментации фитосубстрата. Готовят  жидкую культуру штамма Corynebacterium glutamicum  ВКПМ В-1959 -  продуцента лизина глубинным способом культивирования при аэрации на питательной среде, содержащей, г/л: меласса - 250,0, кукурузный экстракт - 80,0, КНРO - 1,0, NHCI - 20,0, NHHPO - 10,0, мел - 20,0, вода - остальное и жидкие культуры штаммов Bacillus subtilis ВКПМ В-8130, Bacillus subtilis ВКПМ В -2984, Bacillus subtilis ВКПМ В-4099 и Bacillus licheniformis ВКПМ В-4162, затем 30 л жидкой культуры Corynebacterium glutamicum  ВКПМ В-1959 добавляют к 35 л  смеси, состоящей из жидких культур Bacillus subtilis ВКПМ В-8130, Bacillus subtilis ВКПМ В - 2984, Bacillus subtilis ВКПМ В-4099, взятых в соотношении 6:6:1, соответственно, и полученную  общую смесь жидких культур в количестве 65 л наносят на 200 кг предварительно подготовленного носителя - стерильного  свекловичного жома, обработанного целлюлолитическим ферментом и обогащенного  ферментолизатом дрожжей Saccharomyces cerevisiae, для получения которого готовят: мелассу - 255-265 г, калий фосфорнокислый двузамещенный - 98-102 г, магний сернокислый - 25-26 г, дрожжи Saccharomyces cerevisiae - 3 кг и воду до 30 л, смесь стерилизуют при температуре 120°С в течение 30 мин и добавляют к носителю, в который вносят   раствор  целловиридина или целлюлокса F с содержанием целлюлазы не менее 2000 ед./г из расчета 200 г на общий объем жидкости, доводят рН до 6,0-6,5, смесь перемешивают, выдерживают 2 ч при температуре 45-50°С, и проводят твердофазную ферментацию в условиях ограниченного доступа кислорода при температуре 37-50°С, рН 7,5-8,0 и влажности замеса 43-48% в течение 48-50 ч,  добавляют 65 л жидкой культуры Bacillus licheniformis ВКПМ В-4162, содержащей не менее 5,6×10 КОЕ/г, смесь тщательно перемешивают и высушивают до влажности 8-10%, после чего добавляют сухие порошки травы эхинацеи пурпурной и плодов расторопши пятнистой, соответственно,  из расчета 20-50 г на 1 кг конечного продукта, полученную смесь перемешивают и подвергают дроблению до получения однородной массы. Полученному комплексному кормовому препарату модифицированной форме препарата Ферм-КМ -  присвоено наименование ПроСтор с лизиновым продуцентом.
Препарат вводят как кормовую добавку в рацион животных в количестве 0,5-2,0 кг/т комбикорма в зависимости от вида животного.
Изобретение поясняется следующим примером.
2
4
4
4
4
2
4
4
8
Пример. Получают жидкую культуру штамма Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-1959 - продуцента лизина глубинным способом при аэрации на питательной среде, содержащей, г/л: меласса - 250,0, кукурузный экстракт - 80,0, КНРO - 1,0, NHC1 - 20,0, NHHPO - 10,0, мел - 20,0, вода - остальное. Проводят раздельное глубинное культивирование штаммов Bacillus subtilis ВКПМ В-8130 и Bacillus subtilis ВКПМ В -2984 на питательной среде, содержащей, г/л: меласса - 24, глютен кукурузный - 14, кукурузный экстракт - 1, калий фосфорнокислый двузамещенный - 2, натрий хлористый - 9, магний сернокислый - 0,4, вода - остальное. Культивирование штамма Bacillus subtilis ВКПМ В-4099 ведут на питательной среде, содержащей, г/л: меласса -14, глютен кукурузный - 9, кукурузный экстракт - 9, аммоний фосфорнокислый двузамещенный - 1, натрий хлористый - 9, магний сернокислый - 0,4, вода - остальное, а штамма Bacillus licheniformis ВКПМ В-4162 - на питательной среде, содержащей, г/л: меласса - 26, кукурузный экстракт - 22, калий фосфорнокислый двузамещенный - 3, натрий хлористый - 10, магний сернокислый - 0,4, вода - остальное, в течение 20 ч. Полученные жидкие культуры Bacillus subtilis ВКПМ В-8130, Bacillus subtilis ВКПМ В-2984 и Bacillus subtilis ВКПМ В-4099 смешивают в соотношении 6:6:1, соответственно, до объема 35 л, и добавляют жидкую культуру Corynebacterium glutamicum Е-531 ВКПМ В-1959 в количестве 30 л до получения конечного объема 65 л. Общую смесь жидких культур используют для твердофазной ферментации и наносят на предварительно подготовленный носитель. В качестве носителя для твердофазной ферментации используют 200 кг свекловичного жома, который увлажняют 10 л воды, стерилизуют при постоянном перемешивании и температуре 110°С в течение 30 мин. По окончании процесса стерилизации носитель охлаждают до 48-50°С, свекловичный жом обрабатывают целлюлолитическим ферментом и обогащают дрожжевым ферментолизатом. Для чего к 200 кг охлажденного носителя добавляют 30 л суспензии термически инактивированных  дрожжей Saccharomyces cerevisiae в растворе мелассы с минеральными солями, приготовленной следующим образом: смешивают мелассу - 260 г (1,3 г на 1 кг носителя), КНРO - 100 г (0,5 г на 1 кг носителя), MgSO - 26 г (0,13 г на 1 кг носителя), дрожжи Saccharomyces cerevisiae - 3,0 кг и воду до 30 л, стерилизуют в ферментере при температуре 120°С в течение 30 мин и вносят в смеситель с охлажденным стерильным носителем. В 4 л воды растворяют целловиридин или целлюлокс F с содержанием целлюлазы не менее 2000 ед./г из расчета 200 г на общий объем жидкости  и вносят в смеситель. Смесь тщательно перемешивают, доводят рН смеси до 6,0, выдерживают при температуре 48-50°С в течение 2 ч, и проводят твердофазную ферментацию в условиях ограниченного доступа кислорода при температуре 44°С, рН 7,8-8,0 и влажности замеса 45% в течение 50 ч, добавляют 65 л жидкой культуры Bacillus licheniformis ВКПМ В-4162, содержащей не менее 5,6х10 КОЕ/г. Полученный  продукт сушат до влажности 9 %,  добавляют сухие порошки травы эхинацеи пурпурной и плодов расторопши пятнистой из расчета 25,0 г порошка эхинацеи и 50,0 г порошка расторопши пятнистой на 1 кг конечной смеси,  тщательно перемешивают в течение 0,5 ч и подвергают дроблению  для получения однородного продукта с крупностью, соответствующей требованиям продукции комбикормовой промышленности.
Полученный комплексный кормовой препарат ПроСтор с лизиновым продуцентом используется как кормовая добавка для повышения эффективности пищеварения, стимуляции иммунитета введением   ее в кормовые рационы животных и птицы при дозе 0,5-1 кг/т, а рыб -2,0 кг/т прямым вводом в комбикорм или вводом ее в премиксы, БМВД, суперконцентраты или другие составляющие комбикорма.
Препарат показал высокую эффективность при введении в рацион животных, существенно повысил выход животноводческой продукции и показатели прироста живой массы тела грызунов, свиней, цыплят-бройлеров, рыб (осетровых) при снижении кормозатрат. Результаты сравнительных испытаний на животных представлены в таблицах 1-3.
Таблица 1. Сравнение эффективности применения кормовых добавок на лабораторных мышах при норме ввода 0,5 кг/т гранулированного корма «Лаборатор - корм для содержания крыс, мышей, хомяков»
начало опыта 28.02.2012 г.
Номер образца
Препарат
16.03.2012 г.
Средний привес на 1 мышь, г
% к контролю
Образец 1
Твердофазная ферментация культур: Bacillus subtillis, В.licheniformis, Corynebacterium glutamicum Е-531 + травы (ПроСтор с лизиновым продуцентом)
2,13
120,3
Образец 2
Препарат Ферм-КМ (производственная партия)
1,87
105,6
Контроль
Без добавок
1,77
100
Таблица 2. Результаты проверки эффективности применения кормовой добавки с продуцентом лизина на лабораторных мышах при норме ввода 1,0 кг/т гранулированного корма «Лаборатор - корм для содержания крыс, мышей, хомяков»
начало опыта 21.03.2012 г.
Образец
Состав
21.03.12 вес группы
26.03.12вес группы
30.03.12вес груп-пы
04.04.12вес группы
Средний привес на 1 мышь, г (% к контролю)
Образец 1
Твердофазная ферментация культур: Bacillus subtillis, В.licheniformis, Corynebacterium glutamicum Е-531+ травы (ПроСтор с лизиновым продуцентом)
97,3
102,0
105,3
108,0
2,14 (222,9%)
Контроль
Без добавок
96,6
98,9
101,7
101,4
0,96 (100%)
Таблица 3
Зоотехнические показатели в опыте на доращиваемых поросятах (М±m), норма ввода  препарата 1,0 кг/т комбикорма
Показатель
Группа
1 - контрольная
2-опытная с препаратом Ферм-КМ
3-опытная с препаратом ПроСтор с лизиновым продуцентом
Живая масса, кг - в 65-дневном возрасте, кг
18,6±1,66
18,6±0,78
18,7±1,01
- в 95-дневном возрасте, кг
32,0±3,03
33,5±2,53
35,5±3,87
% к контролю
100,0
104,7
110,9
Валовой прирост живой массы, кг
13,4±1,94
14,9±1,90
16,8±1,20
% к контролю
100,0
111,2
125,4
Расход корма на 1 кг живой массы, кг
3,10±0,18
2,75±0,24
2,59±0,06
% к контролю
100,0
88,7
83,5
Среднесуточный прирост живой массы, г
447±64,6
498±63,38
560,8±40,0
% к контролю
100,0
111,4
125,5
Опыт продемонстрировал возможность эффективного введения в комбикорм модифицированной формы препарата Ферм-КМ - ПроСтор с лизиновым продуцентом комплексного препарата нового поколения.
Испытания эффективности ввода 1,0 кг/т комбикорма  препарата ПроСтор с лизиновым продуцентом при выращивании бройлеров позволило повысить сохранность в опыте на 0,3%, снизить конверсию корма на 0,6%, повысить с/суточный привес в опыте по сравнению с контролем на 0,65 г.
Эффективность препарата нового поколения ПроСтор с лизиновым продуцентом в комбикормах для рыб показана в опыте с молодью осетровых. Препарат в количестве 2 кг на тонну комбикорма ввели в комбикорм ОТ-7 для осетровых. Сеголеток содержали в аквариумах группами по 15 особей в течение месяца. Рыбы в соответствующих контрольных группах получали комбикорм без препарата. Рыбоводно-биологические показатели молоди карпа и осетровых по окончании периода экспериментального кормления по абсолютному приросту и среднесуточной скорости роста были выше в опытной группе по сравнению с контролем на 130%. В группе опытных осетровых выживаемость молоди была на 20% выше аналогичного показателя для контрольной рыбы.