Короткие АФП14_20-подобные мотивы онкофетальных белков как возможные структурные маркеры их общих функций

МЕДИКО-БМОЛОГИНЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ

Короткие АФП14-20-подобные мотивы онкофетальных белков как возможные структурные маркеры их общих функций

А.А.Терентьев, Н.Т.Молдогазиева, И.М.Мохосоев

Российский государственный медицинский университет, кафедра биохимии лечебного факультета, Москва

В первичной структуре факторов роста, белков клеточной адгезии и ряда других белков, обладающих онкофетальны-ми свойствами, нами обнаружены прямые и инвертированные мотивы, сходные с последовательностью LDSYQCT аль-фа-фетопротеина человека (а.о. 14-20). При этом часть аминокислотных остатков как прямых, так и инвертированных мотивов, названных АФП14_20-подобными мотивами, является высококонсервативной и может участвовать в связывании с рецептором. Прямые и инвертированные мотивы мозаичных, полифункциональных белков связаны консенсусным мотивом CXXGY/FXGX и обнаруживаются в составе их ЭФР-подобных модулей. Предполагается, что эти мотивы могут рассматриваться в качестве маркеров участия этих белков в регуляции эмбрионального развития и опухолевого роста. Ключевые слова: альфа-фетопротеин, эпидермальный фактор роста, рецептор ЭФР, прямые и инвертированные мотивы, онкофетальные белки

Short AFP14-20 motifs of oncofetal proteins as possible structural markers for their common functions

A.A.Terentiev, N.T.Moldogazieva, I.M.Mokhosoev

Russian State Medical University, Department of Biochemistry of Medical Faculty, Moscow

In this article we demonstrate that short sevenamino-acid residue motifs with high degree of similarity to the sequence LDSYQCT (residues 14-20) of human alpha-fetoprotein (AFP) are characteristic for a number of tumor-associated fetal proteins. In mosaic and multi-modular proteins such motifs, termed AFP14-20-like motifs, are localized within their EGF-like modules. Interestingly, AFP14-20-like motifs were found in the proteins not only in the direct, but also in the inverted form and they are linked with each other though consensus octapeptide CXXGY/FXGX. Here we suppose that short AFP14-20-like motifs are responsible for common functions of the proteins and may be considered as a signature of their participation in regulation of embryonic and tumor cell proliferation, differentiation, migration and survival.

Key words: alpha-fetoprotein, epidermal growth factor, receptor for EGF, direct and inverted motifs, oncofetal proteins

В течение последнего десятилетия накоплены данные, свидетельствующие о наличии ряда важных общих свойств у онкофетальных белков, к которым принадлежит аль-фа-фетопротеин (АФП), и полипептидных факторов роста. Во-первых, у этих двух групп негомологичных белков существует ряд общих структурных особенностей, например высокое содержание остатков цистеина, включая наличие сдвоенных ци-стеинов. Во-вторых, факторы роста, как и АФП, способны регулировать пролиферацию, дифференцировку, миграцию и апоптоз эмбриональных и опухолевых клеток, т.е. они могут рассматриваться в качестве онкофетальных белков [1-3].

При сравнительном анализе первичных структур факторов роста и АФП ранее в составе последнего был обнаружен

Для корреспонденции:

Молдогазиева Нурбубу Тентиевна, кандидат биологических наук, доцент кафедры биохимии лечебного факультета Российского государственного медицинского университета Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1 Телефон: (495) 434-0588

Статья поступила 06.05.2008 г., принята к печати 25.02.2009 г.

структурный мотив, сходный с функционально важным участком эпидермального фактора роста (ЭФР) [4]. Последовательности LDSYQCT в составе АФП человека (аминокислотные остатки (а.о.) 14-20) и LDKYACN в составе ЭФР человека (а.о. 26-32) показали 57% идентичности и 86% общего сходства (с учетом консервативных замен а.о.) [5]. Последовательность LDKYACN в составе ЭФР человека содержит а.о., принимающие участие в связывании с рецептором. Исходя из этого можно предположить, что последовательность LDSYQCT в составе АФП также может являться частью его рецепторсвязывающего участка.

Длинные, содержащие от 25 до 40 а.о., ЭФР-подобные модули ранее были обнаружены в составе ряда мозаичных, мультимодульных белков, таких как факторы роста суперсемейства ЭФР, а также ряда мембранных белков, факторов коагуляции, ферментов и белков клеточной адгезии, участвующих в регуляции эмбрионального развития и опухолевого роста. Видимо, ЭФР-подобные модули этих белков играют роль сигналов, определяющих их участие в регуляции пролиферации и дифференцировки клеток [6].

А.А.Терентьев и др. / Вестник PTMy, 2009, №2, с. 65-6В

Факторы роста семейства ЭФР и их рецепторы. ЭФР

синтезируется в виде большой молекулы предшественника (препро-ЭФР), состоящей из 1207 а.о., из которой образуется зрелая молекула (53 а.о.). Примечательно, что в состав предшественника входят восемь ЭФР-подобных модулей и гидрофобный участок, расположенный у С-конца, благодаря которому он может существовать в виде гликозилированно-го мембранного белка [7].

Семейство эпидермального фактора роста, кроме самого ЭФР, включает TGF-a, амфирегулин, гепаринсвязывающий ЭФР-подобный фактор роста, бетацеллюлин, эпирегулин, томорегулин и различные изоформы неурегулинов (NRG-1, NRG-2, NRG-3 и NRG-4). Все члены этого семейства обладают общностью строения, а именно, их зрелые молекулы состоят примерно из 50-60 а.о. и содержат в своем составе шесть остатков цистеина, образующих три внутримолекулярные дисульфидные связи [8]. Дисульфидные мостики между С6-С20, С14-С31 и С33-С42 формируют три петли: А, В и С соответственно (рисунок). Факторы роста семейства ЭФР осуществляют свое действие с участием мембранного рецептора, который принадлежит к семейству рецепторов ErbB. У млекопитающих оно включает в себя четыре рецептора: ErbBI (обозначаемый также РЭФР или HER1), ErbB2 (HER2/Neu), ErbB3 (HER3) и ErbB4 (HER4). Рецепторы данного семейства состоят из внеклеточного лигандсвязы-вающего домена, единственного гидрофобного трансмембранного домена и внутриклеточного домена, обладающего тирозинкиназной активностью. Внеклеточный домен РЭФР человека состоит из 619 а.о. и подразделяется на четыре субдомена, обозначаемые I, II, III и IV.

Анализ кристаллической структуры комплекса ЭФР с его рецептором показывает, что в составе РЭФР можно выделить три участка взаимодействия с молекулой лиганда: участок 1 локализован в субдомене I рецептора, а участки 2 и 3 - в субдомене III рецептора. Петля B в составе ЭФР (а.о. 20-31) взаимодействует с участком 1, петля А (а.о. 6-19) и R41 в составе ЭФР взаимодействуют с участком 2, а С-концевая часть и R45 молекулы ЭФР - с участком 3 [9]. При этом наиболее важными для взаимодействия оказываются следующие а.о. в составе ЭФР:

1) в составе петли B - это М21, I23, L26 и А30, которые участвуют в гидрофобных взаимодействиях с участком 1 рецептора. Аминокислотный остаток N32 в составе ЭФР участвует в образовании водородных связей. Важность этих а.о. была подтверждена в экспериментах по мутагенезу ЭФР, показавших, что точечные замены этих а.о. приводят к уменьшению или потере связывающей способности;

2) а.о. Н10, Y13 и L15 в составе петли А участвуют в образовании гидрофобных связей между ЭФР и участком 2 рецептора;

3) третью группу составляют а.о, входящие в состав С-кон-цевого участка ЭФР: это L47, который участвует в образовании гидрофобных взаимодействий с а.о. участка 3 рецептора, а также R41, Q43 и R45, которые, видимо, участвуют в образовании водородных связей (рисунок).

Альфа-фетопротеин. Как и все секретируемые белки, АФП синтезируется в виде предшественника, из которого путем отщепления сигнального пептида в ходе процессинга образуется зрелая молекула, состоящая у человека из 591 а.о.

АФП является гликопротеидом с молекулярной массой около 69 кДа и содержанием углеводов до 3-5% (базы данных Swiss-Prot/TrEMBL, GenBаnk). АФП относится к белкам, богатым остатками цистеина, которые составляют 5,4% аминокислотных остатков в его составе, причем половина из них является сдвоенными цистеинами. Остатки цистеина, включая сдвоенные цистеины, характеризуются высокой степенью консервативности: они обнаруживаются в последовательностях всех белков семейства альбумина, к которому принадлежит АФП, и у всех биологических видов. С ис-

Таблица 1. Прямые и инвертированные АФП14_20-подобные мотивы белков, регулирующих эмбрио- и канцерогенез

Название белка и номера а.о. АФП14-20-подобных и консенсусного мотивов Аминокислотная последовательность прямых, инвертированных и консенсусных мотивов Шифр белка в базе данных Swiss-Prot / TrEMBL

ЭФР человека (а.о. 26-47) LDKYACN CVVGYIGE RCQYRDL P01133

ЭФР мыши (а.о. 26-47) TGF-a человека (а.о. 27-48) Бетацеллюлин человека (а.о. 57-78) LDSYTCN CVIGYSGD RCQTRDL EDKPACV CHSGYVGA RCEHADL EQTPSCV CDEGYIGA RCERVDL P01132 P01135 P35070

ГС-ЭФР человека (а.о. 88-109) LRIPSCH CLPGYHGQ RCHGLTL Q06175

Простагландин G/H синтаза-1 человека (а.о. 28-49) LDRYQCD C(T)RTGYSGP NCTIPGL P23219

Вирусный фактор роста человека (а.о. 45- 66) IDGMYCR CSHGYTGIRCQHVVL P20494

Эпиген человека (а.о. 48-69) LEKAICR CFTGYTGE RCEHLTL Q6UW88

Нейрогенный белок Notch (а.о. 720-741) INGYNCS CLAGYSGA NCQYKLN P07207

Лактадгерин человека (а.о. 27-48) FPSYTCT CLKGYAGN HCETKCV Q08431

Родственный кадерину опухолевый супрессор (а.о. 3989-4010) LDGAVCQ CDSGFRGE RCQSDID Q14517

Матрилин-2 человека (а.о. 357-378) DDSYTCE CLEGFRLA EDGKRCR 000339

Ламинин-2 (a-цепь) человека (а.о.1467-1489) LDDYRCT (A)CPRGYEGQ YCERCAP P24043

Фактор коагуляции VII человека (а.о. 65-86) LQSYICF CLPAFEGR NCETHKD P08709

Фактор коагуляции IX человека (а.о. 84-105) INSYECW CPFGFEGK NCELDVT P00740

Фактор коагуляции X человека (а.о. 65-86) Томорегулин человека (а.о. 68-89) Белок, подобный дельта-4 человека (а.о. 279-300) Полидом мыши: а) а.о.1270-1291 LGEYTCT CLEGFEGK NCELFTR GESYQNE CYLRQAAC KQQSEIL QRSYTCT CRPGYTGV DCELELS LASYRCT CVKGYMGV HCETDVN P00742 Q9UK5 Q9NR61 Q9ES77

б) а.о. 1384-1405 LNSYSCK CQPGFSGH RCETEQP Q9ES77

в) а.о. 4148-4269 NGSYVCS CNPPYTGD GKNCAEP Q9ES77

Сокращения: АФП - альфа-фетопротеин, ЭФР - эпидермальный фактор роста, TGF-a (transforming growth factor-a) - трансформирующий фактор роста-a, ГС-ЭФР - гепаринсвязывающий ЭФР. Нумерация а.о. дана для зрелых полипептидных цепей. Курсивом выделены мотивы, соответствующие консенсусному CXXGY/FXGX.

Короткие АФП14-20-подобные мотивы онкофетальных белков как возможные структурные маркеры их общих функций

Таблица 2. АФП14-2:-подобные мотивы трансформирующих факторов роста TGF-P человека

Названия белков и номера а.о. Аминокислотные составы Степень Доля консервативных Суммарное Шифр белка

в их АФП14-20-подобных мотивах АФП14-20-подобных мотивов идентичности замен а.о. сходство, % в базе данных

Swiss-Prot/ TrEMBL

АФП человека (а.о.14-20) TGF-p1 (а.о. 2-8) L D S Y Q C T L D T N Y C F 7/7 (100%) 3/7 (43%) 0/7 (0%) 3/7 (42%) 100 85 P02771 P01137

TGF-P1 (а.о. 54-60) L D T Q Y S K 2/7 (28%) 4/7 (57%) 85 P61812

TGF-P3 (а.о. 2-8) L D T N Y C F 3/7 (43%) 3/7 (42%) 85 P10600

Сокращения: АФП - альфа-фетопротеин, TGF-fi (transforming growth factor-в) - трансформирующий фактор роста-fí. Нумерация а.о. дана для зрелых молекул белков.

пользованием метода кругового дихроизма продемонстрировано, что вторичная структура АФП представлена, в основном, а-спиралью (до 65-67%) и не содержит р-складча-той структуры [10]. Пространственная организация АФП была изучена методом электронной микроскопии, который продемонстрировал существование и-образной структуры с тремя областями плотности масс: одна - на вершине и две -по краям молекулы. Таким образом, была показана трехдо-менная организация молекулы АФП. Домены I, II и III имеют сходную вторичную структуру и содержат 68, 55 и 71% а-спирали, соответственно, но отличаются параметрами третичной структуры. Домены I и III имеют жесткую, компактно упакованную третичную структуру и связаны между собой протеолитически лабильным, гибким доменом II. С-кон-цевая часть домена II содержит шарнирный участок, который придает всем остальным доменам подвижность и тем самым может способствовать взаимодействию АФП с лиган-дами или с другими белками.

Способность АФП стимулировать пролиферацию, диффе-ренцировку и апоптоз клеток, как эмбриональных, так и опухолевых, опосредуется рецепторами, существующими на их поверхности [11]. Однако строение рецептора для АФП, а также механизмы белок-рецепторного взаимодействия и передачи сигнала остаются неизученными.

Интенсивные исследования, осуществляемые в течение последнего десятилетия с целью выяснения биологической роли АФП и выявления его функционально важных участков, показали, что он является мультимодульным и полифункциональным белком. В составе АФП обнаружено более 20 коротких аминокислотных последовательностей, сходных

Петля А

/G - D - H* - S - L - P - C - E - S - D - S - N • C - L* - H - D - G - V - C - M* - Y*

Y*

N32

N-конец

1(971) Петля В

/С - A* - Y* - K - D - L*I - A - E - I*

С - V - V - G - Y

Г

E - G - I

Петля С

С - R*

\ Y - R* - D - L

- K - W - W - E - L - К 53 (1023) \

С-конец

Рисунок. Первичная структура ЭФР человека с картированием АФП14-20-подобных и консенсусного мотивов. Выделены мотивы, сходные с гептапептидом LDSYQCT АФП человека: прямой LDKYACN (а.о. 26-32) и инвертированный RCQYRDL (а.о. 41-47). Звездочкой (*) отмечены а.о., для которых показано участие в связывании с рецептором (РЭФР). N32 - шарнирный участок. Нумерация а.о. дана для зрелой молекулы, в скобках дана нумерация для полной полипептидной цепи.

с функционально важными участками ряда физиологически активных белков, в том числе полипептидных факторов роста. Часть из этих последовательностей получена путем химического синтеза в виде отдельных пептидных фрагментов и изучена в различных тестах биологической активности.

Одним из этих функционально важных участков является гептапептид LDSYQCT (а.о. 14-20), сходный с частью рецеп-торсвязывающего участка ЭФР человека (табл. 1). Этот геп-тапептид был получен методом химического синтеза на твердой фазе и изучен нами в различных тестах биологической активности. Выяснилось, что синтетический пептид способен регулировать пролиферацию лимфоцитов периферический крови человека, активационный апоптоз клеток больных инфекционным миокардитом и бронхиальной астмой, а также поглощение глюкозы эритроцитами больных сахарным диабетом.

Методами молекулярной динамики нами были также изучены конформационно-динамические свойства гептапепти-да LDSYQCT и его аналогов, полученных с помощью точечных замен аминокислотных остатков [12, 13]. Показана значительная консервативность конформационно-динамиче-ских свойств пептида при заменах Y17F, Y17S и D15E. Установлено, что замены C19A и S16V вызывают только локальные изменения в динамическом поведении пептида, а химическая модификация цистеина (С19) или димеризация пептида путем образования дисульфидной связи между остатками цистеина двух параллельных пептидных цепей, а также замены C19G, C19S, Q18E и D15N изменяют конформа-ционные возможности и динамическое поведение всех аминокислотных остатков. При этом наиболее существенные изменения происходят при заменах незаряженного аминокислотного остатка на заряженный и наоборот.

Обнаружение АФП^о-подобных мотивов в белках, ассоциированных с эмбрио- и канцерогенезом. Прямые АФПц-20-подобные мотивы. Как уже упоминалось ранее, нами в составе домена I АФП и петли В ЭФР человека обнаружены сходные структурные мотивы. Это последовательности LDSYQCT в составе АФП (а.о.14-20) и LDKYACN в составе ЭФР человека (а.о. 26-32). С использованием программы для локального выравнивания FASTA из базы данных первичных структур белков Swiss-Prot/TrEMBL нами были извлечены последовательности, содержащие аналогичные мотивы, обозначенные как АФПм-щ-подобные мотивы. Такие мотивы были обнаружены нами также в составе других факторов роста семейства ЭФР и в ЭФР-подобных модулях и их повторах в белках клеточной адгезии, некоторых мембранных белках, факторах коагуляции и ферментах, участвующих в регуляции эмбрио- и канцерогенеза (табл. 1). АФП14-20-подобные мотивы обнаружены также в составе трансформирующих факторов роста TGF-P1 и TGF-P2 чело-

А.А.Терентьев и др. / Вестник РГМУ, 2009, №2, с. 65-68

века (табл. 2). Следовательно, в составе этих неродственных и негомологичных белков обнаруживаются сходные мотивы, что указывает на существование структурных предпосылок для наличия у них общих функциональных свойств.

Инвертированнные АФП14-20-подобные мотивы. Структурные мотивы, сходные с АФПм_20-подобными, но уже в инвертированном виде, обнаруживаются в составе ряда белков семейства ЭФР и в составе ЭФР-подобных модулей и их повторах в ряде белков. При этом прямые и инвертированные мотивы оказываются связанными через октапептидный мотив, общая формула которого для разных последовательностей соответствует CXXGY/FXGX. Как продемонстрировано ниже, инвертированные мотивы так же, как и прямые, могут содержать а.о., необходимые для связывания с рецептором, т.е могут иметь важное функциональное значение.

Возможное функциональное значение АФП добных мотивов. На основании сравнения АФП^о-подоб-ных мотивов различных белков можно сделать предположение о том, что аминокислотные остатки в их составах также могут участвовать во взаимодействии с рецептором. Так, сравнение последовательностей LDSYQCT в составе АФП (а.о.14-20) и LDKYACN в составе ЭФР человека (а.о. 26-32) показывает, что а.о. L26 и А30 соответствуют L14 и Q18 в составе АФП человека, которые также способны участвовать в гидрофобных взаимодействиях с рецептором. А остатку N32 в составе ЭФР соответствует Т20 в составе АФП, гидро-ксильная группа которого может участвовать в образовании водородных связей.

Четыре из семи а.о. инвертированного АФП^о-подобно-го мотива RCQYRDL (а.о. 41-47) в составе ЭФР человека, а именно, R41, Q43, R45, L47, участвуют во взаимодействии с рецептором. Если сравнивать прямой и инвертированный мотивы ЭФР (LDKYACN и RCQYRDL), то L47 соответствует L26, Q43 соответствует А30, а R41 - N32 и боковые цепи этих а.о. участвуют в образовании гидрофобных или водородных взаимодействий. Видимо, взаимодействие ЭФР с его рецептором осуществляется, в основном, без участия СО- и NH-групп остова полипептидной цепи, т.е. направление полипептидной цепи не имеет значения. В этом случае можно предполагать, что инвертированные последовательности, обнаруженные в составе других факторов роста семейства ЭФР, также могут принимать участие в связывании с рецептором.

Возможно, короткие АФПм_20-подобные мотивы ответственны за наличие общих функций у онкофетальных белков и могут рассматриваться в качестве структурных маркеров белков, участвующих в регуляции пролиферации, диффе-ренцировки, миграции и апоптоза эмбриональных и опухолевых клеток.

Таким образом, альфа-фетопротеин, факторы роста суперсемейств ЭФР и TGF-b, а также ряд белков клеточной адгезии и миграции демонстрируют ряд сходных структурно-функциональных свойств, среди которых в первую очередь хотелось бы выделить наличие сходных пептидных мотивов, в том числе и в инвертированном виде. Наличие сходных гептапептидных мотивов создает структурные предпосылки для существования общих функциональных свойств у этих групп неродственных и негомологичных белков. Возможное

функциональное значение как прямых, так и инвертированных АФПм-20-подобных мотивов может заключаться в связывании с рецептором и опосредовании передачи сигнала внутрь клетки. При этом, вероятно, направление полипептидной цепи не имеет значения при взаимодействии аминокислотных остатков лиганда с рецептором.

Литература

1. Татаринов Ю.С. Содержание эмбриоспецифического альфа-глобулина в сыворотке крови плода человека, новорожденных и взрослых людей при первичном раке печени // Вопр. химии. - 1965. - T. 11. - C.20-24.

2. Abelev G.I. Alpha-fetoprotein in ontogenesis and its association with malignant tumors // Adv. Cancer Res. - 1971. - V.14. - P.295-358.

3. Favoni R.E., De Cupis A. The role of polypeptide growth factors in human carcinomas: new targets for a novel pharmacological approach // Pharmacol. Rev. -2000. - V.52. - №2. - P.179-206.

4. Терентьев А.А. Выявление гомологичных участков в первичных структурах альфа-фетопротеина, инсулина и некоторых факторов роста // Вестн. РГМУ. - 1997. - №3 . - C. 76-79.

5. Терентьев А.А., Молдогазиева Н.Т. Структурно-функциональное картирование альфа-фетопротеина //Биохимия. - 2006. - Т.71. - С.157-172.

6. Engel J. EGF-like domains in extracellular matrix proteins: localized signals for growth and differentiation? // FEBS Lett. - 1989. - V. 251. - P.1-7.

7. Brown P.M., Debanne M.T., Grothe S. et al. The extracellular domain of the epidermal growth factor receptor. Studies on the affinity and stoichiometry of binding, receptor dimerization and a binding-domain mutant // Eur. J. Biochem. -1994. - V. 225. - P.223-233.

8. Olayioye M.A., Neve R.M., Lane H.A., Hynes N.E. The ErbB signaling network: receptor heterodimerization in development and cancer // EMBO J. - 2000. - V. 19 - P.3159-3167.

9. Ogiso H., Ishitani R., Nureki 0. et al. Crystal structure of the complex of human epidermal growth factor and receptor extracellular domains // Cell. - 2002. -V.110. - P.775-787.

10. Luft A.J., Loscheider F.L. Structural analysis of human and bovine a-fetoprotein by electron microscopy, image processing and circular dichroism // Biochemistry. -1983. - V.22. - P.5971-5978.

11. Молдогазиева Н.Т., Терентьев А.А. Альфа-фетопротеин и факторы роста: структурно-функциональные взаимоотношения и аналогии // Успехи биол. хим. - 2006. - Т.46. - С. 99-148.

12. Молдогазиева Н.Т., Шайтан К.В., Терешкина К.Б., Антонов М.Ю., Терентьев А.А. Молекулярная динамика аналогов гептапептида LDSYQCT - фрагмента аль-фа-фетопротеина человека. Влияние диэлектрической проницаемости среды // Биофизика. - 2007.- Т.52 - С. 611-624.

13. Молдогазиева Н.Т., Терентьев А.А., Казимирский А.Н., Антонов М.Ю., Шайтан К.В. Конформационная динамика аналогов гептапептида LDSYQCT -фрагмента альфа-фетопротеина человека // Биохимия. - 2007. - Т.72. -С. 655-667.

Информация об авторах:

Терентьев Александр Александрович, член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой биохимии

Российского государственного медицинского университета

Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1

Телефон: (495) 434-0588

E-mail: aaterent@mtu-net.ru

Мохосоев Иннокентий Маркович, кандидат биологических наук,

старший преподаватель кафедры биохимии Российского государственного

медицинского университета

Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1

Телефон: (495) 434-0588

E-mail: imokhosoev@mail.ru