СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ПАРТЕНИТ ТРЕМАТОД (TREMATODA: DIGENEA) У БРЮХОНОГИХ МОЛЛЮСКОВ СЕМЕЙСТВА LYMNAEIDAE
METHOD FOR DETECTING AND IDENTIFYING TREMATODA PARTENITIS (TREMATODA: DIGENEA) IN PAST-FEATHER MOLLUSCS OF THE LYMNAEIDAE FAMILY

Изобретение относится к паразитологии, медицине и молекулярной генетике. Способ позволяет осуществить видовую идентификации широкого спектра трематод (Trematoda: Digenea) на ранней стадии их развития в брюхоногих моллюсках семейства Lymnaeidae.
Выявление зараженности и определение видового состава паразитов, присутствующих в теле хозяина имеет большое значение для мониторинга и предотвращения заражений людей и животных. Трематоды (Trematoda: Digenea) отличаются от остальных червей наличием сложного жизненного цикла, связанного со сменой животных-хозяев (Корсуненко А.В. Геномная вариабельность трематод (Trematoda) на стадии промежуточного хозяина-моллюска: дис. - Институт биологии гена Российской академии наук, 2010). Роль первого промежуточного хозяина у трематод всегда выполняют разные виды моллюсков. Представители моллюсков семейства Lymnaeidae широко распространены практически во всех пресных водоемах и являются промежуточными хозяевами для значительного числа видов трематод. Выявление и идентификация трематод на этапе инфицирования моллюска позволит осуществлять мониторинг пресных водоемов на наличие опасных паразитов, предотвращая заражение людей и животных. Значительное число видов трематод представляю серьезную угрозу для жизни людей и животных, поражая покровы тела (церкариозы) (Беэр С.А., Воронин М.В. Церкариозы в урбанизированных экосистемах. М.: Наука. 2007. С. 240), и внутренние органы (трематодозы) (Колесников В.И., Атаев A.M., Газимагомедов М.Г. Трематодозы животных. Ставрополь - Махачкала, 2011. С. 112).
Определение видовой принадлежности трематод на ранних этапах развития затруднено из-за отсутствия четких морфологических критериев и гостальной специфичности, выходом из сложившейся ситуации являются молекулярно-генетические методы, которые обеспечивают стабильный безошибочный результат.
Среди опубликованных по данной тематике статей в научных журналах и патентных исследований следует выделить две работы, которые применяют молекулярный подход для идентификации трематод в брюхоногих моллюсках. В статье (Routtu J. et al. Selective and universal primers for trematode barcoding in freshwater snails // Parasitology research. - 2014. - T. 113. - №. 7. - C. 2535-2540) представлено исследование по идентификации трематод в брюхоногих моллюсках при помощи ядерного маркера 18S рРНК. Данный метод был разработан для тропических пресноводных моллюсков родов Melanoides, Melanopsis и Theodoxus. Стоит отметить, что 18S рРНК у трематод имеет низкий уровень генетической изменчивости, что затрудняет идентификацию паразитов разных видов, относящихся к одному роду.
В качестве прототипа к предлагаемому способу был выбран патент (RU 2509156, опубл. 10 марта 2014). В патенте предложен способ видовой ДНК-дифференциации на разных стадиях жизненного цикла гельминтов-возбудителей церкариального дерматита человека на основе определения длин амплифицированных фрагментов транскрибируемого спейсера ITS2 для представителей рода Trichobilharzia. Данный способ позволяет определять вид трематод Trichobilharzia на основании анализа длин амплифицированных фрагментов транскрибируемого спейсера ITS2 рДНК в последовательно выполняемых двух полимеразных цепных реакциях. Праймеры предложенные в этом способе в ходе полимеразной цепной реакции отжигаются непосредственно на последовательности спейсера, что делает их специфичными к трематодам рода Trichobilharzia. Недостатком данного способа является узкая специализация на трематодах одного рода, которая в свою очередь может быть достоинством при выявлении церкариозов, вызываемых этими трематодами.
Задачей предлагаемого изобретения является создание надежного и точного способа для выявления и идентификации партенит трематод (Trematoda: Digenea) на стадии инфицирования брюхоногих пресноводных моллюсков Lymnaeidae, с использованием в качестве генетического маркера консервативной последовательности транскрибируемого спейсера ITS2.
В результате использования предлагаемого способа появляется возможность точного выявления и видовой идентификации широкого спектра трематод на ранней стадии жизненного цикла, что значительно повышает эффективность действий, направленных на мониторинг и выявление пресных водоемов, которые могут выступать в качестве природных очагов церкариозов и трематодозов.
Вышеуказанный результат достигается тем, что в предлагаемом способе видовой идентификации трематод на стадии партенит, включающем выделение геномной ДНК сорбционным методом из образцов брюхоногих моллюсков, амплификацию транскрибируемого спейсера ITS2 с использованием двух специфических праймеров
LT1: 5'-TCGTCTGTGTGAGGGTCG-3',
ITS4: 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3',
с проведением горизонтального электрофореза продуктов реакции в агарозном геле и выявлением образцов, в которых проходила амплификация двух фрагментов, наибольший из которых длиной от 412 до 548 пар оснований принадлежит моллюску, второй длиной от 302 до 378 пар оснований трематоде, с последующей экстракцией из геля сорбционным методом фрагментов характерных по длине оснований для трематод, секвенированием данных фрагментов с каждым из праймеров по отдельности в двух направлениях и прочтением нуклеотидных последовательностей с определением по базам данных видовой принадлежности трематод. Представленный способ позволяет одновременно выявлять образцы зараженных прудовиков и проводить видовую идентификацию широкого спектра трематод, которые используют брюхоногих моллюсков семейства Lymnaeidae в качестве промежуточных хозяев.
В предлагаемом способе выявления и видовой идентификации трематод, включающем сбор образцов брюхоногих моллюсков Lymnaeidae, предположительно инфицированных паразитами, выделение из них ДНК сорбционным методом, исследование полученной геномной ДНК при помощи ПЦР с двумя консервативными праймерами, визуализацию амплифицированных спейсеров ITS2 при помощи электрофореза в агарозном геле, с выявлением инфицированных образцов в следствие наличия двух продуктов синтеза, вырезанием и экстракцией из геля фрагмента меньшего по длине, секвенирование очищенных фрагментов в двух направлениях с прочтением электрофореграмм и установлением генетических последовательностей трематод, поиск аналогичных последовательностей с использованием программы BLAST в международной базе данных GenBank (NCBI), установление посредством анализа поиска родовой или видовой принадлежности трематод.
Сбор и фиксация образцов.
Брюхоногие моллюски семейства Lymnaeidae являются неотъемлемыми представителями фауны пресных водоемов. Основная масса прудовиков располагается в прибрежной зоне на поверхности растений, водорослей, камней и затопленных остатков древесины. При внимательном осмотре литорали пресных водоемов этих брюхоногих моллюсков достаточно легко обнаружить и осуществить сбор. Образцы брюхоногих моллюсков семейства Lymnaeidae, отобранные на литорали водоема, фиксируют, поместив в 96% этиловый спирт, с условием, что объем образцов по отношению к объему спирта не должно превышать соотношение 1:5 (на один объем, занимаемый моллюсками, должно приходиться 5 объемов этилового спирта). Соотношение 1:5 обеспечивает качественную фиксацию образцов и является залогом положительных результатов при выполнении дальнейших молекулярно-генетических операций.
Выделение ДНК
Для выделения геномной ДНК из тканей брюхоногих моллюсков Lymnaeidae используют набор реагентов NucleoSpin Tissue (Macherey-Nagel, Германия). С помощью пинцета и скальпеля отделяют от фиксированного образца моллюска ногу и пищеварительную систему. Из отрезанных тканей удаляют остатки этилового спирта посредством надавливания скальпелем на ткани на поверхности фильтровальной бумаги до тех пор, пока из образца не перестанет выходить спирт. Отжатый образец мелко нарезают хирургическими ножницами и переносят в 1.5 мл пробирки типа "Эппендорф".
К измельченным тканям добавляют 180 мкл буфера Т1, 25 мкл раствора протеиназы К и перемешивают на вортексе. Пробирки с образцами инкубируют в термостате при температуре 56°С до полного лизиса биологического материала (0.5-4 ч). В процессе лизирования пробирки периодически встряхивают на вортексе. Далее в образцы добавляют 200 мкл буфера В3, энергично встряхивают на вортексе до получения гомогенной смеси и ставят инкубировать в термостат при температуре 70°С на 10 мин. Затем образцы центрифугируют 5 мин при 12000 об/мин и переносят супернатант в чистые пронумерованные пробирки. Далее в каждый образец вносят по 210 мкл 96% этилового спирта и интенсивно встряхивают пробирки на вортексе.
Переносят каждый раствор лизата каждого образца в подписанную колонку NucleoSpin Tissue Column и центрифугируют 1 мин при 12000 об/мин. После фугования сборники с раствором выбрасывают, а колонки со связанной на мембране ДНК переносят в новые пробирки-сборники. Далее в колонки добавляют 500 мкл буфера BW и центрифугируют 1 мин при 12000 об/мин. Колонки переносят в свежие сборники и добавляют 600 мкл буфера В5. Из пробирок-сборников водоструйным насосом отбирают раствор. Колонки с ДНК помещают в пустые сборники и фугуют 1 мин при 12000 об/мин для удаления остатков этилового спирта. Далее колонки переносят в чистые подписанные 1.5 мл пробирки типа "Эппендорф" и вносят в центр мембраны по 30 мкл предварительно нагретого при температуре 70°С буфера BE. Инкубируют колонки при комнатной температуре в течение 1 мин и центрифугируют при 12000 об/мин 1 мин. После фугования раствор с ДНК образцов оказывается в пробирках, а колонки выбрасываются. Концентрацию ДНК, выделенной из образцов, определяют на спектрофотометре Nanodrop 2000/2000С (Thermo Fisher Scientific, США) или Implen NanoPhotometer N (Implen, Inc. США). Выделенные образцы ДНК хранят в морозильной камере при температуре -20°С. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).
Из образцов выделенной геномной ДНК амплифицируют в термоциклере Veriti (Thermo Fisher Scientific, США) или С1000 Touch thermal cycler (Bio-Rad Laboratories, Inc., США) транскрибируемый спейсер ITS2 с применением специфических праймеров LT1 (5'-TCGTCTGTGTGAGGGTCG-3') и ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') при температурных и временных режимах, представленных в таблице 1.
4
2
4
2
2
Раствор для амплификации фрагментов состоит из 50-100 нг геномной ДНК, 2,5 мкл Taq-буфера (67 мМ Tris-HCl, 16.6 мМ (NH)SO; 0.01% Tween-20) (СибЭнзим, Россия), 1 мкл раствора MgCl (50 мМ), 2,5 мкл раствора всех dNTP (2 мМ), по 1 мкл обоих праймеров (10 пМ), 1 ед. Taq-ДНК-полимеразы (СибЭнзим, Россия) и доведена деионизированной водой (ddH0) до объема 25 мкл.
Синтезированные продукты полимеразной цепной реакции разделяют путем горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле и после окрашивания бромистым этидием визуализируют в системе гельдокументирования.
Анализ результатов электрофореза
Для выявления наличия трематод в образцах прудовиков продукты полимеразной цепной реакции разделяют, используя электрофорез в агарозном геле. Гель-электрофорез проводят в горизонтальной камере в однократном трис-боратном буфере (ТВЕ), (0,089 М трис-бората, 0,089 М борной кислоты и 0,002 М ЭДТА). При внесении продуктов полимеразной цепной реакции в ячейки геля используется краситель (бромфеноловый синий растворенный в 40%-ном растворе сахарозы). Электрофорез осуществляют при 100V в течение 40 мин. Для анализа длины фрагментов используют ДНК-маркеры 100 bp (10 фрагментов от 100 до 1000 bp) (СибЭнзим, Россия). После электрофореза гель окрашивают в растворе бромистого этидия в течение 10 минут. В ходе визуализации результата электрофореза продуктов полимеразной цепной реакции выявляем образцы, инфицированные трематодами путем сравнения количества и длин амплифицированных фрагментов. На фигуре 1 представлен результат электрофореза, из которого четко видно, что образцы в дорожках 1-5 имеют по одному амплифицированному фрагменту спейсера ITS2, которые имеют длину характерную для моллюсков Lymnaeidae. Тогда как образцы в дорожках 6-9 имеют два продукта амплификации, верхний из которых характерен по длине прудовикам, а нижний является продуктом амплификации спейсера ITS2 с ДНК трематоды. В 10 дорожке находится маркер для анализа длины амплифицированных фрагментов. Согласно проведенных исследований длина амплифицируемых фрагментов спейсера моллюсков составляет от 412 до 548 пар оснований, а длина этого же фрагмента трематод составляет от 302 до 378 пар оснований. Данный подход позволяет выявить образцы моллюсков, которые были инфицированы трематодами.
Далее образцы продуктов полимеразной цепной реакции, в которых были выявлена амплификация спейсера ITS2 полностью переносят в увеличенные ячейки геля и осуществляют электрофорез в течение 90 мин. После элетрофореза гель окрашивают бромистым этидием и при помощи трансиллюминатора проводят вырезание фрагмента геля с продуктом амплификации спейсера ITS2, который характерен для трематод. Экстракцию продукта проводят с применением набора Cleanup Mini (ЗАО Евроген, Россия) согласно прилагаемой к набору инструкции. У экстрагированных образцов определяют концентрацию продукта и готовят на секвенирование с использованием прямого и обратного праймеров. После проведения реакции амлификации с набором реагентов ABI PRISM BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3730 (Thermo Fisher Scientific, США) на выходе получаются нуклеотидные электрофореграммы, которые позволяют определить нуклеотидную последовательность спейсера ITS2 трематоды. Полученные электрофореграммы в прямом и обратном направлении расшифровывают с использованием программы BioEdit 7.0.9. (Thomas Hall, http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html). Полученные последовательности при помощи программы BLAST в международной базе данных NCBI сравнивают с уже задепонированными последовательностями, что позволяет определить вид обнаруженной в моллюске трематоды.
По результатам многолетних экспедиционных научных исследований были получены сведения, подтверждающие сущность изобретения. Исследования носили международный характер и проводились с целью изучения пресноводных брюхоногих моллюсков Lymnaeidae в различных географических районах земного шара, включая Россию, Китай, США, Канаду, Словакию, Испанию и Южную Корею. Общее количество исследуемых образцов составило 476, из этого числа 10,1% моллюсков были поражены трематодами. В ходе проведенных исследований было идентифицировано 18 разных видов трематод, принадлежащих к 9 родам.
В таблице 2 представлены представители брюхоногих моллюсков семейства Lymnaeidae, в которых были выявлены и идентифицированы трематоды.
Примеры выполнения заявленного способа.
Пример 1. В 2019 году силами экспедиционного отряда ФИЦКИА УрО РАН были обследованы участки литорали озера Ажабачье (координаты 56.176602 СШ, 161.785123 ВД) в Камчатском крае РФ на предмет определения видового состава моллюсков семейства Lymnaeidae, обитающих в данном пресном водоеме, а также степени поражения их трематодами Digenea. Было собрано 40 образцов брюхоногих моллюсков Lymnaeidae, из них 7,7% моллюсков были инфицированы двумя видами трематод рода Plagiorchis.
Пример 2. В 2019 году силами экспедиционного отряда ФИЦКИА УрО РАН были обследованы участки литорали реки Челбас рядом со станицей Каневская (координаты 46.083745 СШ, 38.976981 ВД) в Краснодарском крае РФ на предмет определения видового состава моллюсков семейства Lymnaeidae, обитающих в данном пресном водоеме, а также степени поражения их трематодами Digenea. Было собрано 30 образцов брюхоногих моллюсков Lymnaeidae, из них 8,2% моллюсков были инфицированы трематодами двух родов Tylodelphys и Telorchis.