Антибактериальная композиция на основе штаммов бактериофагов для профилактики или лечения сальмонеллеза и/или эшерихиоза сельскохозяйственных животных или птиц, или человека
ANTIBACTERIAL COMPOSITION BASED ON STRAINS OF BACTERIOPHAGES FOR PREVENTING OR TREATING SALMONELLOSIS AND / OR ESCHERICHIOSIS OF FARM ANIMALS OR BIRDS OR HUMANS

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарной медицине, а именно к созданию антибактериальной композиции для профилактики или лечения сальмонеллеза и/или эшерихиоза у сельскохозяйственных животных и птиц, а также человека.
Бактериальные инфекции в птицеводстве - это проблема экономики и здравоохранения во всем мире. Распространенность сальмонеллеза среди домашней птицы колеблется от 75 до 90%, что приводит к клиническим или субклиническим инфекциям у человека. В США ежегодные экономические потери, связанные с сальмонеллезной инфекцией, составляют от 1,188 млрд. до более чем 11,588 млрд. долларов США [Wernicki A., Nowaczek A., Urban-Chmiel R. Bacteriophage therapy to combat bacterial infections in poultry //Virology journal. - 2017. - Т. 14. - №. l. - C. 179.].
Некоторые штаммы E.coli, патогенные для птиц, являются возбудителями колибактериоза - одной из основных причин заболеваемости и смертности домашней птицы во всем мире [Joshi S., Singh R., Singh S. P. Antibiotic resistance profile of Escherichia coli isolates from colibacillosis in and around Pantnagar, India //Veterinary World. - 2012. - T. 5. - №. 7. - C. 405.]. Кроме того, штаммы E.coli, колонизирующие домашнюю птицу, являются потенциальным источником генов антибиотикорезистентности, которые могут передаваться людям [Overdevest I. et al. Extended-spectrum β-lactamase genes of Escherichia coli in chicken meat and humans, The Netherlands //Emerging infectious diseases. - 2011. - T. 17. - №. 7. - C. 1216.; Kheiri R., Akhtari L. Antimicrobial resistance and integron gene cassette arrays in commensal Escherichia coli from human and animal sources in IRI //Gut pathogens. - 2016. - T. 8. - №. 1. - C. 40.].
Регулярное использование антибиотиков для оздоровления птицы и в качестве стимуляторов роста считается основным фактором развития антибиотико-резистентных штаммов у зоонозных бактерий [Aarestrup, F.M. The livestock reservoir for antimicrobial resistance: a personal view on changing patterns of risks, effects of interventions and the way forward. Philos Trans R Soc Lond В Biol Sci. 2015; Seiffert, S.N., Hilty, M., Perreten, V., and Endimiani, A. Extended-spectrum cephalosporin-resistant gram-negative organisms in livestock: an emerging problem for human health?. Drug Resist Updat. 2013; 16: 22-45].
Требования контролирующих органов по снижению использования антибиотиков в кормах, а в дальнейшем их полный запрет, привело к поиску альтернативных средств для контроля за патогенными бактериями. Бактериофаги - строгоспецифичные антибактериальные агенты, способные к инфицированию только одного вида или штамма бактерий, становятся перспективной альтернативой антибактериальным препаратам, вакцинам и пробиотикам для биоконтроля за массовыми болезнями птиц.
Известный препарат "Стрептофагин" для животноводства, включающий в свой состав смесь 4-х бактериофагов Streptococcus bovis в жидкой или сухой формах. Жидкая форма содержит смесь 4-х стерильных фаголизатов, сухая форма - лиофильно высушенные фаголизаты с наполнителями, предпочтительно с кукурузной мукой или ячменными отрубями. Препарат предназначен для скармливания лактирующим коровам (RU №2059723, C12N 7/00, опубл. 10.05.1996 г.). Недостатком препарата "Стрептофагин" является ограниченность спектра действия, так как он направлен против узкой группы заболеваний, вызванных возбудителем Streptococcus bovis.
Известен также противосальмонеллезный препарат для перорального или аэрозольного введения, содержащий фильтрат культуральной жидкости штамма бактериофага Bacteriophagum salmonellae ГосНИИ особо чистых препаратов NCФ-17, аминопептид и бактериостатик (хинозол, метацид, ампициллин). Препарат лизирует сальмонеллы серологических групп А, В, С, D, Е (RU №2080384, C12N 7/00, опубл. 27.05.1997). Недостатком препарата является отсутствие стабилизированных форм препарата, вследствие чего активность препарата может снижаться в организме.
Известен также биопрепарат на основе бактериофагов для профилактики и лечения сальмонеллеза животных, содержащий 11 штаммов бактериофагов, хинозол и стабилизатор. Биопрепарат активен против Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Salmonella heidelberg, Salmonella choleraesuis, Salmonella gallinarum-pullorum (RU №2232808 C12N 7/00, опубл. 20.07.2004). Недостатком препарата является наработка фильтрата бактериофагов в питательном бульоне без последующей очистки, вследствие чего в полученных фильтратах присутствует значительное количество эндотоксина.
Известен препарат бактериофага для лечения и профилактики колибактериоза телят, содержащий смесь суспензий фагов штаммов Phagum coli ВГНКИ №132, Phagum coli ВГНКИ №844, Phagum coli ВГНКИ №C-1-272, Phagum coli ВГНКИ №K-3-273, Phagum coli ВГНКИ № Ф-1-06, Phagum coli ВГНКИ № Ф-2-05, хинозол, фенол и дистиллированную воду (RU №1533330, C12N 7/00, опубл. 10.10.1995). Однако этот препарат имеет низкий титр баткериофагов и содержит значимые количества эндотоксина, что негативно отражается на продуктивности птицы.
Известен биопрепарат на основе бактериофагов для профилактики и лечения колибактериоза (эшерихиоза) животных, содержащий штаммы фагов ЕсО21-ДЕП, и/или Phagum Escherichia coli Ес0782-ДЕП, и/или Phagum Escherichia coli ЕсО781-ДЕП, и/или Phagum Escherichia coli EPZ-1-ДЕП, и/или Phagum Escherichia coli EPZ-2-ДЕП, и/или Phagum Escherichia coli ЕГ-5-ДЕП, и/или Phagum Escherichia coli ВС-1-ДЕП, и/или Phagum Escherichia coli М78-ДЕП, и/или Phagum Escherichia coli Шексна 2к-ДЕП, антисептик и стабилизатор (RU №2244747 С2). Недостатком данного препарата является узконаправленное действие против одного вида возбудителя и высокое содержание эндотоксина.
В странах Европы и США зарегистрированы препараты на основе бактериофагов, которые используются перед упаковыванием продукции, для контроля за пищевыми бактериальными патогенами человека, на поверхности полуфабрикатов, овощей, фруктов, листьев салата и т.д [Sulakvelidze A. Using lytic bacteriophages to eliminate or significantly reduce contamination of food by foodborne bacterial pathogens //Journal of the Science of Food and Agriculture. - 2013. - T. 93. - №. 13. - C. 3137-3146; Teufer, Т., Von Jagow, C, Which Path To Go?; European Food and Feed Law Review (EFFL), June 2007, Vol 3 pp136-145].
В настоящее время на рынке представлены следующие наименования этих препаратов:
Secure Shield E1™ - натуральный препарат, содержащий 6 бактериофагов в готовой форме коммерческого продукта, лизирующих шига-токсин продуцирующую Е. coli О157:Н7 и не О157:Н7 штаммы Е. coli, производимый компанией FINK TEC GmbH (Hamm, Germany). [https://www.finktec.de/]
EcolicidePX™ - натуральный препарат, содержащий 7 штаммов бактериофагов, лизирующих шига-токсин продуцирующую Е. coli О157:Н7, производимый компанией Intralytix Inc. USA. [http://www.intralytix.com/]
EcoShield™ - натуральный, не содержащий химических добавок препарат, состоящий из 3 вирулентных бактериофагов лизирующих Escherichia coli О157:Н7, производимый компанией Intralytix Inc. USA. [http://www.intralytix.com/]
Finalyse - препарат содержащий специфичный бактериофаг против Е. coli О157:Н7, 0,2% м-крезола и 0,07% фенола качестве консерванта, производимый компанией Passport Food Safety Solutions (West Des Moines, IA, USA). [http://www.passportfoodsafety.com]
SalmoFresh™ - натуральный, не содержащий химических добавок препарат литических бактериофагов активных в отношении Salmonella enterica, производимый компанией Intralytix Inc. USA. [http://www.intralytix.com/]
SALMONELEX ™ - натуральный препарат, содержащий бактериофаги активные в отношении ряда серотипов сальмонелл, [http://www.micreos.com/]
Biotector - натуральный препарат, содержащий бактериофаги активные в отношении ряда серотипов сальмонелл, в частности Salmonella gallinarum и Salmonella pullorum, производимый компанией Cheil Jedang Co. Korea. [http://www.cj.co.kr/cj-en/index]
Недостатком данных препаратов является их узконаправленное действие в отношении конкретного вида возбудителя, в то время как другие возбудители могут продолжать размножаться, вызывая инфекционный процесс.
К наиболее значимым бактериальным патогенам сельскохозяйственных животных и птиц, которые наносят непоправимый экономический ущерб и увеличивают риск возникновения у людей инфекций, передающихся пищевым путем, относятся представители Salmonella spp., шига-токсин продуцирующие Е. coli О157:Н7 и не О157:Н7 шига-токсин продуцирующие Е. Coli. Нами сконструирован коктейль бактериофагов против широкого спектра штаммов указанных возбудителей.
Технической проблемой, решаемой изобретением, является расширение спектра специфической активности композиции лечебно-профилактического назначения на основе штаммов бактериофагов за счет включения в ее состав поливалентного коктейля вирулентных бактериофагов с неперекрывающимся спектром литической активности в отношении возбудителей сальмонеллезной и эшерихиозной инфекций у сельскохозяйственных животных, птиц и человека. Данная композиция направлена не только на лечение уже заболевших особей, но и на профилактику и борьбу с носительством возбудителей колибактериоза и сальмонеллеза у сельскохозяйственных животных и птиц.
10
Поставленная задача реализуется за счет того, что заявляемая антибактериальная композиция включает комбинацию стерильных, очищенных от токсинов фильтратов фаголизатов с титром каждого из бактериофагов не ниже 10 БОЕ/мл по Грациа в отношении наиболее часто выделяемых с птицефабрик и свиноводческих предприятий эпидемиологически значимых микроорганизмов, способных вызывать массовые болезни птиц, сельскохозяйственных животных и человека.
В состав композиции входит фильтрат фаголизата Salmonella Enteritidis, полученный с использованием штамма бактериофага Salmonella Enteritidis BF-1354, депонированного во «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных» (Федеральный Научный Центр - Всероссийский Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской Академии Наук) под номером BF - 1354; фильтрат фаголизата Salmonella Infantis, полученный с использованием штамма бактериофага Salmonella Infantis BF-1355, депонированного во «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных» (Федеральный Научный Центр - Всероссийский Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской Академии Наук) под номером BF - 1355; фильтрат фаголизата Salmonella Typhimurium, полученный с использованием штамма бактериофага Salmonella Typhimurium BF-1356, депонированного во «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных» (Федеральный Научный Центр - Всероссийский Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской Академии Наук) под номером BF - 1356; фильтрат фаголизата Escherichia coli, полученный с использованием штамма бактериофага Escherichia coli BF-1352, депонированного во «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных» (Федеральный Научный Центр - Всероссийский Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской Академии Наук) под номером BF - 1352; фильтрат фаголизата Escherichia coli, полученный с использованием штамма бактериофага Escherichia coli BF-1353, депонированного во «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных» (Федеральный Научный Центр - Всероссийский Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской Академии Наук) под номером BF - 1353; фильтрат фаголизата Escherichia coli, полученный с использованием штамма бактериофага Escherichia coli BF-1351, депонированного во «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных» (Федеральный Научный Центр - Всероссийский Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской Академии Наук) под номером BF - 1351.
10
Содержание видоспецифических активных бактериофагов в готовой форме продукта должно составлять не менее 10 БОЕ/мл. Концентрация вирусных частиц подобрана на основании данных зарубежной научной литературы и проведенных собственными силами лабораторных и промышленных испытаний, экономической целесообразности с учетом последующего разведения не менее чем в 100 раз. Композиция может включать целевые добавки в количестве 99-99,99 мас. % от массы композиции в виде смеси ингредиентов, выбранных в зависимости от назначения. Данная композиция в связи с достаточным спектром литической активности и стабильным титром бактериофагов может быть использована для профилактики или лечения сальмонеллезной и эшерихиозной инфекции у сельскохозяйственных животных, птиц или человека и представлена в виде жидкой кормовой добавки, аэрозоля, спрея и т.д.
Техническим результатом заявленного изобретения является создание антибактериальной композиции в виде поливалентного коктейля бактериофагов с неперекрывающимся спектром литической активности в отношении бактерий, наиболее часто выделяемых с птицеводческих предприятий и свиноводческих комплексов, а также разработка комплексного подхода в отношении профилактических и лечебных мероприятий по устранению сальмонеллезной и эшерихиозной инфекций. Созданная композиция не обладает риском токсических или побочных эффектов для человека и животных, обеспечивает стабильность титра бактериофагов и эффективность применения. Антибактериальная активность композиции проявляется в отношении 83,72% изолятов сальмонелл, выделенных от птиц, и в отношении 90,63% изолятов сальмонелл, выделенных от свиней, что и составляет спектр литического действия.
В случае обработки парного мяса бактериофагами обсемененность мяса сальмонеллами снизилась на 99,95%, а эшерихиями на 99,98%. Обработка бактериофагами охлажденного мясо привела к снижению количества клеток сальмонелл на 99,99%, а эшерихий на 99,78%.
5
3
Обсемененность проб кормов эшерихиями до введения бактериофагов, взятых непосредственно из кормушки у животных, составил 4,6*10 КОЕ/г, в то время как в кормах, обогащенных композицией, данный показатель не превышал 5,2*10 КОЕ/г, что в свою очередь в 88,4 раза ниже, чем при использовании кормов без нее.
Процент выживаемости животных опытных групп на свиноводческих предприятиях составил 90,38%, при условии неиспользования для лечения каких-либо дополнительных кроме бактериофагов антибактериальных средств и препаратов.
Именно эти данные говорят о возможности эффективного использования предлагаемой композиции в промышленном птицеводстве и свиноводстве, а также в качестве профилактического средства с данными инфекциями при потреблении человека соответствующих продуктов питания.
Согласно изобретению отбор 6 вирулентных штаммов бактериофагов с максимально широким спектром литической активности осуществляли, используя собственный банк патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, выделенных с птицеводческих и свиноводческих предприятий Российской Федерации.
Среды и условия культивирования бактерий
Бактериальные культуры выращивали на жидких и плотных питательных средах общего назначения: мясопептонный бульон; агар Мюллера-Хинтона (HiMedia, India); 2% мясопептонный агар (МПА).
Оценка литической активности бактериофагов
Спектр литической активности бактериофагов оценивали:
- методом нанесения фага (spot-тест) на газон бактериальной культуры. В чашки Петри разливали 1,5% МПА. После застывания и подсушивания агара на чашки Петри наносили по 0,1 мл 16-18 часовой бульонной культуры микроорганизмов, растирали шпателем по всей поверхности чашки, чтобы получить равномерный сплошной рост культуры. После того, как культура впиталась и чашки подсохли, на них каплями (spot-тест) наносили бактериофаги. После того, как жидкость впиталась в среду, чашки перевертывали вверх дном и ставили в термостат при 37°С на 18-24 часа. На следующие сутки производили учет результатов - наличие или отсутствие «пятна лизиса».
Получение отдельных фаголизатов и их комбинации
9
6
7
12
4,5 мл 18 часовой бактериальной культуры штамма-хозяина в титре 10 КОЕ/мл засевают в матрац для культивирования - скошенная плотная питательная среда с толщиной слоя от 10 мм до 25 мм, культивируют в течение 3-3,5 часов при оптимальной температуре, для роста культуры штамма-хозяина, затем на полученный газон культуры штамма-хозяина засевают маточный бактериофаг в титре 10-10 БОЕ/мл, герметично закрывают сосуд для культивирования. Культивируют в течение 15-18 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма бактериофага и толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 25 мм до 40 мм, получают фаголизат при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды физиологическим раствором или буферным раствором с рН 7,0-7,2 в количестве 9-10 мл, перемещают фаголизат в стерильную емкость, центрифугируют в течение 30 минут при 5000 об./мин, надосадок пропускают через бактериальный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Для получения антибактериальной композиции смешивают профильтрованные жидкости, содержащие бактериофаги, и пропускают полученный фильтрат через колонку, содержащую агент, аффинный к эндотоксину. В результате получаем комбинацию стерильных фильтратов фаголизатов, очищенных от токсинов, содержащий не менее 10 БОЕ/мл каждого бактериофага.
Оценка безопасности антибактериальной композиции
Острую токсичность антибактериальной композиции оценивали в соответствии с «Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств / Под ред. А.Н. Миронова - М.: Гриф и К, 2013. т. 2. Иммунобиологические лекарственные средства» на 10 здоровых белых мышах обоих полов, весом 19-21 г после однократного интраперитонеального введения в течение 7 дней. Контрольная группа получала 0,9% раствор натрия хлорида по той же схеме. В результате проведенных экспериментов было показано, что при однократном введении максимальной дозы (1,0 мл - внутрибрюшинно) исследуемого продукта, признаков интоксикации у мышей не наблюдалось.
Оценку хронической (подострой) токсичности антибактериальной композиции проводили на 10 здоровых белых мышах обоего пола массой 20-21 г. Кормовую добавку вводили животным внутрижелудочно по 0,5 мл 1 раз в день в течение 14 дней. Мышам из контрольной группы давали по 0,5 мл внутрижелудочно 0,9% раствора натрия хлорида также в течение 14 дней. У всех животных ежедневно регистрировали массу тела, наличие клинических симптомов общей интоксикации, а также возможную гибель. Изучение хронической токсичности антибактериальной композиции также не выявило ее негативного воздействия на организм экспериментальных мышей.
Штаммы вирулентных бактериофагов, используемые для получения стерильных фильтратов фаголизатов, очищенных от токсинов.
11
12
1. Штамм бактериофага BF-1354, эффективный в отношении бактерий серотипа Salmonella Enteritidis. Он был выделен из образца почвы, отобранного в Московской области и депонирован во «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных» (Федеральный Научный Центр - Всероссийский Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской Академии Наук) под номером BF - 1354. Бактериофаг хорошо культивируется, достигая репродукции 10-10 БОЕ/мл на индикаторной культуре Salmonella Enteritidis В-1024. Негативные колонии прозрачные, округлые, 3,0-4,0 мм в диаметре.
Оценку спектра литической активности фага определяли на 34 индикаторных штаммах Salmonella enterica сероваров Enteritidis методом спот-теста. Наработанный фильтрат фаголизата наносили на свежезасеянные газоны Salmonella Enteritidis. О чувствительности штаммов Salmonella Enteritidis к фагу судили по появлению стерильного пятна на выросшем через 16-18 часов газоне испытуемого бактериального штамма. Результаты изучения спектра литического действия бактериофага представлены в табл. 1.
Примечание: «+» - наличие стерильного пятна на бактериальном газоне, отражающего лизис бактериальной культуры; «-» - отсутствие стерильного пятна.
Как следует из полученных данных, спектр литического действия бактериофага BF1354 составляет 85,2%.
Бактериофаг BF-1354 устойчив к воздействию хлороформа. Так, при обработке хлороформом в течение 30 минут фаг не терял своей активности.
При изучении жизнеспособности бактериофага BF-1354 выявлена его устойчивость к высоким температурам: только нагревание бактериофага в течение 15 минут при температуре выше 65° полностью инактивировала его. Оптимальная температура хранения для поддержания исходного титра фагов в течение года составляет от 2 до 8°С.
11
12
2. Штамм бактериофага BF-1355, эффективный в отношении бактерий Salmonella Infantis. Он был выделен из экскрементов крупного рогатого скота в одном из хозяйств Московской области и депонирован во «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных» (Федеральный Научный Центр - Всероссийский Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской Академии Наук) под номером BF - 1355. Бактериофаг хорошо культивируется, достигая репродукции 10-10 БОЕ/мл на индикаторной культуре S. Infantis В-1026. Негативные колонии прозрачные, округлые, 1,0-2,0 мм в диаметре.
Оценку спектра литической активности фага определяли на 22 индикаторных штаммах Salmonella enterica сероваров Infantis методом спот-теста. Наработанный фильтрат фаголизата наносили на свежезасеянные газоны Salmonella Infantis. О чувствительности штаммов Salmonella Infantis к фагу судили по появлению стерильного пятна на выросшем через 16-18 часов газоне испытуемого бактериального штамма. Результаты изучения спектра литического действия бактериофага представлены в табл. 2.
Примечание: «+» - наличие стерильного пятна на бактериальном газоне, отражающего лизис бактериальной культуры; «-» - отсутствие стерильного пятна.
Как следует из полученных данных, спектр литического действия бактериофага BF-1355 составляет 77,2%.
Бактериофаг BF-1355 устойчив к воздействию хлороформа. Так, при обработке хлороформом в течение 30 минут фаг не терял своей активности.
При изучении жизнеспособности бактериофага BF-1355 выявлена его устойчивость к высоким температурам: только нагревание бактериофага в течение 10 минут при температуре выше 60°С полностью инактивировала его. Оптимальная температура хранения для поддержания исходного титра фагов в течение года составляет от 2 до 8°С.
11
12
3. Штамм бактериофага BF-1356, эффективный в отношении бактерий Salmonella Typhimurium. Он был выделен из экскрементов кур с одной из птицефабрик Калужской области и депонирован во «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных» (Федеральный Научный Центр - Всероссийский Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской Академии Наук) под номером BF - 1356. Бактериофаг хорошо культивируется, достигая репродукции 10-10 БОЕ/мл на индикаторной культуре S. Typhimurium В-1025. Негативные колонии прозрачные, округлые, 1,0-3,0 мм в диаметре.
Оценку спектра литической активности фага определяли на 22 индикаторных штаммах Salmonella enterica сероваров Typhimurium методом спот-теста. Наработанный фильтрат фаголизата наносили на свежезасеянные газоны Salmonella typhimurium. О чувствительности штаммов Salmonella Typhimurium к фагу судили по появлению стерильного пятна на выросшем через 16-18 часов газоне испытуемого бактериального штамма. Результаты изучения спектра литического действия бактериофага представлены в табл. 3.
Примечание: «+» - наличие стерильного пятна на бактериальном газоне, отражающего лизис бактериальной культуры; «-» - отсутствие стерильного пятна.
Как следует из полученных данных, спектр литического действия бактериофага BF-1356 составляет 86,3%.
Бактериофаг BF-1356 устойчив к воздействию хлороформа. Так, при обработке хлороформом в течение 30 минут фаг не терял своей активности.
При изучении жизнеспособности бактериофага BF-1356 выявлена его устойчивость к высоким температурам: только нагревание бактериофага в течение 15 минут при температуре выше 65°С полностью инактивировала его. Оптимальная температура хранения для поддержания исходного титра фагов в течение года составляет от 2 до 8°С.
11
12
4. Штамм бактериофага BF-1352 выделен из фекалий кур на культуре штамма Escherichia coli О104:Н4, вызвавшего вспышку геморрагического колита среди жителей Германии и Франции весной-летом 2011 г. Данный бактериофаг обладает литической активностью по отношению к шига-токсин продуцирующим штаммам Escherichia coli О104:Н4; 0157:Н7, а также к клинически значимым Е. coli других серогрупп: О26, О126, О25. Бактериофаг депонирован во «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных» (Федеральный Научный Центр - Всероссийский Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской Академии Наук) под номером BF-1352. Бактериофаг хорошо культивируется, достигая репродукции 10-10 БОЕ/мл на непатогенной культуре Е. coli В-1027. Негативные колонии прозрачные, округлые, 1,0-2,0 мм в диаметре. Колонии мелкие, четкие, с ровными краями.
Оценку спектра литической активности фага BF-1352 определяли на 51 патогенном штамме Escherichia coli методом спот-теста. Наработанный фильтрат фаголизата наносили на свежезасеянные газоны Escherichia coli. О чувствительности штаммов Escherichia coli к фагу судили по появлению стерильного пятна на выросшем через 16-18 часов газоне испытуемого бактериального штамма. Результаты изучения спектра литического действия бактериофага представлены в табл. 4.
Примечание: «+» - наличие стерильного пятна на бактериальном газоне, отражающего лизис бактериальной культуры; «-» - отсутствие стерильного пятна.
Как следует из полученных данных, спектр литического действия бактериофага BF-1352 составляет 64,7%.
Бактериофаг BF-1352 устойчив к воздействию хлороформа. Так, при обработке хлороформом в течение 30 минут фаг не терял своей активности.
При изучении жизнеспособности бактериофага BF-1352 выявлена его устойчивость к высоким температурам: только нагревание бактериофага в течение 10 минут при температуре выше 65°С полностью инактивировала его. Оптимальная температура хранения для поддержания исходного титра фагов в течение года составляет от 2 до 8°С.
11
12
5. Штамм бактериофага BF-1353 выделен из сточных вод одного из коровников, расположенных в Московской области. Проявляет специфическую активность в отношении Escherichia coli О157:Н7. Бактериофаг депонирован во «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных» (Федеральный Научный Центр - Всероссийский Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской Академии Наук) под номером BF-1353. Бактериофаг хорошо культивируется, достигая репродукции 10-10 БОЕ/мл на непатогенной культуре Е. coli В-1027. Негативные колонии прозрачные, округлые, 2,0-3,0 мм в диаметре. Колонии округлой формы, четкие, с ровными краями.
Оценку спектра литической активности фага BF-1353 определяли на 51 патогенном штамме Escherichia coli методом спот-теста. Наработанный фильтрат фаголизата наносили на свежезасеянные газоны Escherichia coli. О чувствительности штаммов Escherichia coli к фагу судили по появлению стерильного пятна на выросшем через 16-18 часов газоне испытуемого бактериального штамма. Результаты изучения спектра литического действия бактериофага представлены в табл. 5.
Примечание: «+» - наличие стерильного пятна на бактериальном газоне, отражающего лизис бактериальной культуры; «-» - отсутствие стерильного пятна.
Как следует из полученных данных, спектр литического действия бактериофага BF-1353 составляет 72,5%.
Бактериофаг BF1353 устойчив к воздействию хлороформа. Так, при обработке хлороформом в течение 30 минут фаг не терял своей активности.
При изучении жизнеспособности бактериофага BF-1353 выявлена его устойчивость к высоким температурам: только нагревание бактериофага в течение 10 минут при температуре выше 65°С полностью инактивировала его. Оптимальная температура хранения для поддержания исходного титра фагов в течение года составляет от 2 до 8°С.
11
12
6. Штамм бактериофага BF-1351 выделен из сточных вод в Московской области. Проявляет специфическую активность в отношении Escherichia coli О157:Н7. Бактериофаг депонирован в «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных» (Федеральный Научный Центр - Всероссийский Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской Академии Наук) под номером BF - 1351. Бактериофаг хорошо культивируется, достигая репродукции 10-10 БОЕ/мл на непатогенной культуре Е. coli В-1027. Негативные колонии прозрачные, округлые, 1,0 мм в диаметре.
Получена нуклеотидная последовательность генома штамма SEQ ID NO:1, соответствующая таковой на прилагаемом машиночитаемом носителе.
Оценку спектра литической активности фага BF-1351 определяли на 112 патогенных штаммах Escherichia coli методом спот-теста. Наработанный фильтрат фаголизата наносили на свежезасеянные газоны Escherichia coli. О чувствительности штаммов Escherichia coli к фагу судили по появлению стерильного пятна на выросшем через 16-18 часов газоне испытуемого бактериального штамма. Результаты изучения спектра литического действия бактериофага представлены в табл. 6.
*«-» - отсутствие зоны лизиса, «+» - наличие зоны лизиса, «пол» - расщепление лактозы, «отр» - отсутствие расщепления лактозы, «» - наличие зоны гемолиза, «отсут» -отсутствие зоны гемолиза.
Как следует из полученных данных, спектр литического действия бактериофага BF-1351 составляет 62,5%.
Бактериофаг BF-1351 устойчив к воздействию хлороформа. Так, при обработке хлороформом в течение 30 минут фаг не терял своей активности.
При изучении жизнеспособности бактериофага BF-1351 выявлена его устойчивость к высоким температурам: только нагревание бактериофага в течение 15 минут при температуре выше 60°С полностью инактивировала его. Оптимальная температура хранения для поддержания исходного титра фагов в течение года составляет от 2 до 8°С.
Состав антибактериальной композиции
10
Действующим веществом антибактериальной композиции является смесь стерильных фильтратов фаголизатов, активных в отношении Salmonella spp.и шига-токсин продуцирующих Е. coli в том числе Е. coli O157:Н7 и Е. coli O154:Н4. Содержание видоспецифических активных бактериофагов в готовой форме продукта составляет не менее 10 БОЕ/мл. Концентрация фаговых частиц подобрана на основании данных зарубежной научной литературы и проведенных собственными силами лабораторных и промышленных испытаний, экономической целесообразности с учетом последующего разведения не менее чем в 100 раз. В качестве вспомогательного компонента был использован 0,9% NaCl. В таблице 7. приведен состав антибактериальной композиции.
Сущность изобретения поясняется на следующих примерах:
Пример №1. Получение фильтратов фаголизатов для производства антибактериальной композиции.
9
6
7
12
4,5 мл 18 часовой бактериальной культуры штамма-хозяина (из ряда: S. enteritidis В-1024; S. typhimurium В-1025; S. infantis В-1026; Е. coli В-1027; Е. coli В-1028) в титре 10КОЕ/мл засевают в матрац для культивирования - скошенная плотная питательная среда с толщиной слоя от 10 мм до 25 мм, культивируют в течение 3-3,5 часов при 37°С, затем на полученный газон культуры штамма-хозяина засевают маточный бактериофаг (гомологичный бактериальной культуре) в титре 10-10 БОЕ/мл, герметично закрывают сосуд для культивирования. Культивируют в течение 14-16 часов при температуре 37°С и толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 25 мм до 40 мм, получают фаголизат при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды физиологическим раствором или буферным раствором с рН 7,0-7,2 в количестве 9-10 мл, отсасывают фаголизат в стерильную емкость, добавляют хлороформ в количестве 1:10, выдерживают в течение 30 минут при непрерывном шуттелировании 170 об/мин, центрифугируют в течение 30 минут при 5000 об./мин. После центрифугирования для получения антибактериальной композиции смешивают надосадочные жидкости, содержащие бактериофаги S. enteritidis BF-1354, S. typhimurium BF-1356, S. infantis BF-1355, E.coli BF-1352, E. coli BF-1353, E. coli BF-1351, затем стерилизуют смесь фильтрацией через фильтр с мембраной из полиэфирсульфона с диаметром пор 0,2-0,22 мкм, затем пропускают полученный фильтрат через колонку, содержащую лиганд, аффинный к эндотоксину. В результате получаем композицию антибактериальную, содержащую комбинацию стерильных фильтратов фаголизатов S. enteritidis BF-1354, S. typhimurium BF-1356, S. infantis BF-1355, E. coli BF-1352, E. coli BF-1353, E. coli BF-1351, очищенных от токсинов, с титром каждого бактериофага не менее 10 БОЕ/мл.
Пример №2. Определение спектра литического действия бактериофагов, входящих в состав антибактериальной композиции, по отношению к музейным и полевым (эпизоотическим) изолятам S. Typhimurium, S. Enteritidis, S. Infantis.
Спектр литического действия штаммов бактериофагов, входящих в состав антибактериальной композиции проверяли методом спот-теста с использованием музейных культур, а также полевых изолятов сальмонелл выделенных в период 2016-2018 годов в птицеводческих и свиноводческих предприятиях на территории Российской Федерации в ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН. Проведение спот-теста реализовывалось согласно следующим этапам:
3
1) подготавливались чашки Петри с 1,5% мясопептонным агаром (20 см агара на чашку);
3
2) после застывания и подсушивания чашек с МПА производился засев газона испытуемых культур в объеме 0,1 см на чашку с последующим равномерным распределением этой культуры шпателем;
8
3) после того, как инокулированная суспензия впиталась, и чашки с газоном подсохли на них каплями вносились испытуемые бактериофаги в концентрации 10 БОЕ/мл в объеме по 20 мкл. После того как капли суспензии бактериофага впитались, чашки помещали на культивирование в термостат с температурным режимом 37°С, продолжительность культивирования составляла 18 часов;
4) спустя 18 часов культивирования проверяется наличие зон лизиса по принципу: «+» - наличие стерильного пятна на бактериальном газоне, отражающего лизис бактериальной культуры; «-» - отсутствие стерильного пятна, свидетельствующего о том, что бактериофаг не активен по отношению к данной культуре.
Результаты определения спектра литического действия бактериофагов S. enteritidis BF-1354, S. typhimurium BF-1356, S. infantis BF-1355, по отношению к штаммам сальмонелл эпизоотического значения представлены в таблице №8.
* Указано количество штаммов определенного серотипа выделенных от конкретного вида животных и птиц.
В ходе проведенной работы было установлено, что несмотря на возможность участия в патологическом процессе фагорезистентных культур сальмонелл, антибактериальная активность композиции проявляется в отношении 83,72% изолятов сальмонелл, выделенных от птиц, и в отношении 90,63% сальмонеллы выделенных от свиней соответственно, что и составляет спектр литического действия. Именно эти данные говорят о возможности эффективного использования предлагаемой композиции в промышленном птицеводстве. Кроме того, зафиксированная активность фагов в отношении сальмонелл, выделенных от свиней, позволяет считать целесообразным и перспективным их использования в свиноводческой отрасли, при том, что бактериофаг BF-1355 продемонстрировал возможность лизировать не только культуры сальмонелл серовара Infantis, но и Choleraesuis - наиболее адаптивного именно для поросят.
Пример №3. Определение спектра литического действия бактериофагов, входящих в состав антибактериальной композиции, по отношению к музейным и полевым (эпизоотическим) изолятам различных патотипов Е. coli.
Исследование литического действия эшерихиозных фагов проводили методом спот-теста, описанным во 2 примере.
Результаты определения спектра литического действия бактериофагов Е. coli BF-1351, Е. coli BF-1352 и Е. coli BF-1353, входящих в состав антибактериальной композиции, по отношению к штаммам эшерихий эпизоотического значения представлены в таблице №9.
Как видно из представленных в таблице №9 данных, спектр литического действия трех эшерихиозных бактериофагов BF-1351, BF-1352 и BF-1353, входящих в состав антибактериальной композиции, по отношению к эпизоотическим изолятам различных патотипов эшерихий, равен 71,8; 78,1 и 73,9% соответственно. Поскольку все три эшерихиозных бактериофага являются неотъемлемой частью одного конечного продукта, то окончательную антибактериальную эффективность заявленной композиции мы можем рассчитать исходя из максимального количества выявленных фагочувствительных культур. Таким образом, полный спектр литического действия эшерихиозных бактериофагов, входящих в состав заявленной композиции, составляет 89,8%.
Пример №4. Принципы применения и режимы дозирования антибактериальной композиции для птицеводческих и свиноводческих предприятий.
3
Одна доза, составляет 0,1 см, в которой содержится не менее 10 (БОЕ) каждого бактериофага. Антибактериальная композиция может использоваться следующими способами:
4.1) Пероральная выпойка. Данный подход описан в примерах №4-7;
4.2) Аэрозольная обработка. Данный подход подробно описан в примере №8.
4.3) Воздушно-капельное орошение. Данный подход подробно описан в примере №9.
4.4) Биологическая дезинфекция инкубационного и товарного яйца. Данный подход подробно описан в примере №10.
4.5) Деконтаминация птицеводческой и животноводческой продукции методом погружения и орошения. Данный подход подробно описан в примере №11.
4.6) Использование композиции для биологического консервирования и обезвреживания кормов от возбудителей сальмонеллеза и эшерихиоза для свиней при жидком типе кормления. Данный подход подробно описан в примере №12.
4.7) Комбинированное использование. Данный подход подробно описан в примере №13 и №14.
На территории неблагополучных по сальмонеллезу и эшерихиозу предприятий антибактериальная композиция используется путем чередовании выпойки с аэрозольной и/или воздушно-капельной обработкой с целью уничтожения стационарности очага инфекционного процесса и санации окружающей среды. В таком случае наиболее эффективно зарекомендовала себя следующая схема:
Первая неделя - выпойка препарата;
Вторая неделя - аэрозольная и/или воздушно капельная обработка;
Третья неделя - выпойка препарата;
Четвертая неделя - аэрозольная и/или воздушно капельная обработка;
и т.д. до уничтожения очага инфекционного процесса и/или до момента прекращения бактерионосительства среди птицы и животных.
4.1) Пероральная выпойка.
3
8
Одна доза, составляет 0,1 см, в которой содержится не менее 10 (БОЕ) каждого бактериофага.
Композиция может использоваться для птицы и животных любой возрастной категории и физиологического состояния. Пероральное использование композиции с профилактической целью проводят согласно следующему принципу и режиму дозирования:
Для кур:
Птицам яичного направления в племенных, товарных хозяйствах и репродукторах второго порядка композицию в обязательном порядке назначают по 1 дозе в возрасте 3-5, 55-60, 140-150 дней, далее - ежеквартально. В каждом случае выпойка производится двукратно с интервалом в 48-72 часа.
Цыплятам 3-5-дневного возраста композицию выпаивают дважды по 0,5 дозы, во все последующие сроки (по назначению) - по 1 дозе на выпойку.
Цыплятам-бройлерам 3-5-дневного возраста препарат выпаивают дважды с интервалом 48-72 часа по 0,5 дозы на цыпленка. За 5 дней до убоя бройлеров обрабатывают по 1 дозе на голову дважды с интервалом 48-72 часа, что вызывает санацию организма птицы от сальмонелл и эшерихий и предотвращение попадания их в пищевую продукцию.
Для перепелов:
Перепелам яичного направления композицию назначают в 3-5-дневном возрасте, выпаивание производится дважды по 0,25 дозы с интервалом 48-72 часа, далее - по 0,5 дозы двукратно в возрасте 40-45 дней, 140-150 дней и т.д. ежеквартально.
Перепелов-бройлеров выпаивают дважды с интервалом 48-72 часа: по 0,25 дозы в возрасте 3-5 дней, по 0,5 дозы за 5 дней до убоя бройлеров.
Для гусей и уток:
композицию применяют с 3-5-дневного возраста по 1 дозе двукратно с интервалом 48-72 часа, затем в 40-45- и 130-140-дневном возрасте по 2 дозы, далее - ежеквартально по 3 дозы двукратно с интервалом 48-72 часа. За 5 дней до убоя птицам назначают по 3 дозы на голову дважды с интервалом 48-72 часа.
Для индеек:
композицию применяют с 3-5-дневного возраста по 1 дозе двукратно с интервалом 48-72 часа, затем в 40-45-дневном возрасте и ежеквартально по 2 дозы двукратно с интервалом 48-72 часа. За 5 дней до убоя птиц обрабатывают в количестве по 2 дозы на голову дважды с интервалом 48-72 часа.
Для фазанов, цесарок:
композицию применяют с 3-5-дневного возраста по 0,5 дозы двукратно с интервалом 48-72 часа, затем в 40-45-дневном возрасте и ежеквартально по 1 дозе двукратно с интервалом 48-72 часа. За 5 дней до убоя птиц обрабатывают в количестве по 1 дозе на голову дважды с интервалом 48-72 часа.
Для голубей:
композицию применяют с 2-дневного возраста по 0,25 дозы двукратно с интервалом 48-72 часа, затем в 40-45-дневном возрасте, перед яйцекладкой, вакцинацией и перегруппировкой, по 0,5 дозы двукратно с интервалом 48-72 часа.
Для декоративных и других птиц:
композицию применяют с 3-5-дневного возраста по 0,25-0,5 дозы двукратно с интервалом 48-72 часа, затем в 40-45-дневном возрасте и ежеквартально по 1 дозе птице массой до 2 кг, по 2 дозы птице массой 2-4 кг, по 3 дозы птице массой 4-8 кг, по 4 дозы птице массой более 8 кг, двукратно с интервалом 48-72 часа.
Для свиней.
Антибактериальная композиция для поросят может использоваться в любой возрастной категории и в любом физиологическом состоянии при необходимости нормализации деятельности желудочно-кишечного тракта, в случае развития поражений, вызванных сальмонеллами и энтеропатогенными эшерихиями, а также для санации организма животных-бактерионосителей.
8
Для поросят, находящихся на подсосе у маток, композицию на основе бактериофагов используют с первых дней прикорма и/или, в случае проявления соответствующих признаков нарушения деятельности желудочно-кишечного тракта из расчета 5*10 (БОЕ) каждого бактериофага, т.е. 0,5 мл коммерческого препарата на голову. Курс применения препарата должен составлять 3-5 дней в зависимости от тяжести инфекционного процесса.
При индивидуальной выпойке молодняку, композиция может вводиться через рот шприцом с резиновой трубкой. В данном случае ее эффективность увеличивается за счет предотвращения потерь, происходящих при групповой выпойке. При индивидуальном способе обработки, композиция может назначаться молодняку с первого дня жизни.
В последующем, после перевода на доращивание, композиция вводится поросятам смешивая с водой. Режимы дозирования композиции для свиней должны быть следующими:
Для свиней 30-80 дней жизни - 10-20 доз, курсом 3-5 дней;
Для свиней 81-180 дней жизни - 20-30 доз, курсом 3-5 дней;
Для взрослых животных (хряков, ремонтных свинок, свиноматок) - 30-40 доз, курсом 3-5 дней.
Дополнительно препарат может назначаться в любые моменты жизни птицы и свиней в случае возникновения необходимости нормализации деятельности пищеварительной системы, а также в случае возникновения рисков вспышки инфекции как превентивная мера.
Пример №5. Определение необходимого объема композиции для пероральной выпойки групповым методом.
Предварительно, за сутки до начала назначения композиции птицам или животным, групповым методом, проводится определение количества воды, потребляемой поголовьем, подлежащим обработке, в течение 2-4 часов. В качестве примечания стоит отметить, что оптимальнее всего композицию выпаивать в течение 2-4 часов после приготовления маточного раствора, при этом необходимо постоянно помешивать концентрат.
3
Например, для корпуса с родительским поголовьем кур несушек в возрасте 352 дней, общей численностью 11882 головы, объем потребляемой воды за четыре часа был равен 1340 литров воды, что в пересчете на каждую голову составляет 28,1 см воды в час. В качестве примечания, стоит отметить, что объем потребляемой воды зависит от многих факторов, таких как возраст птицы, ее физиологическое состояние, температура в помещении содержания, рацион, влажность и т.д., ввиду чего в других условиях объем потребляемой птицей воды может отличаться. Определившись с необходимым количеством доз композиции (11882) и количеством воды, которое необходимо птице на 4 часа, готовится маточный раствор. В случае, когда медикатор настроен на 1%-ый раствор, нам необходимо подготовить 13,4 литра маточного раствора композиции, который в свою очередь составляет 1% от объема потребляемой птицей за 4 часа воды. В рассматриваемом случае потребовалось использовать 1223,8 мл композиции (с учетом 3% потерь на систему водопоя и т.д.) который был ресуспендирован в 12,2 литрах воды. Перед использованием композиции за 2-3 часа до выпойки прекращают подачу воды. (Состав: 0,1 мас. % от массы композиции - коктейль бактериофагов, 99,9 мас. % от массы композиции - вода очищенная).
Расчет необходимого объема композиции для свиней и ее выпойка производится аналогичным образом, что и для птицы.
Пример №6. Динамика персистенции фаговых частиц, входящих в состав композиции, в разные промежутки времени после однократного и двукратного выпаивания птице.
С целью определения динамики распределения сальмонеллезных и эшерихиозных фагов в пищеварительной системе птицы, предварительно инфицированной смесью вирулентных культур сальмонелл и эшерихий, было проведено исследование фекалий на наличие в них ранее выпоенных фагов, методом Грациа.
В опыте использованы 14-ти дневные цыплята в количестве 40 голов, из которых было сформированы 2 опытные группы по 20 голов в каждой.
50
50
50
50
50
50
50
6
6
6
7
8
8
3
3
Инфицирование птенцов в возрасте 14-ти дней жизни проводили пероральным заражением культурами трех серотипов сальмонелл и трех культур эшерихий, а именно S. enteritidis: №R-6 LD 3,5* 10 мкр. кл.; S. typhimurium: 3 LD 1*10 мкр. кл.; S. infantis: №1451 LD 9,6*10 мкр. кл.; Е. coli ЕТЕС: №320 (О78:К80), LD 1,2*10 мкр. кл.; Е. coli ЕРЕС: №733 (О119:К69:Н4), LD 4,5*10 мкр. кл.; Е. coli ЕАЕС: №857 (О86:К61:Н32), LD 3,1*10 мкр. кл. в дозе равной значению 1 LD, в виде суспензии суточной агаровой культуры на основе стерильного физиологического раствора, в объеме равном 0,2 см для каждого штамма. Конечный объем инфицирующей суспензии для птенцов составил 1,2 см. Иннокуляция заражающей суспензии проводилась индивидуально с использованием шприца с катетером.
3
9
3
Выпойка композиции на основе бактериофагов проводилась через 12 часов после инфицирования. Так, в случае опыта, при необходимости обработки 2-х опытных групп, состоящих из 40 голов цыплят, в возрасте 14-ти дней, при минимальном потреблении одним цыпленком 4,7 см воды было использовано по 0,1 мл композиции, содержащей не менее 10 (БОЕ) каждого бактериофага. Иными словами, 2 мл композиции было растворено и тщательно шуттелировано в течение 5 минут в 188 см воды, что достаточно для однократной выпойки.
Результаты испытаний приведены в таблице №10. Исследованию подвергалась сборная проба фекалий от птиц, собранная с интервалом в два часа.
В результате проведенного опыта установлено, что в экскрементах цыплят, которые орально получали композиции, в наибольшей концентрации определяются сальмонеллезные бактериофаги. Так, максимальный титр сальмонеллезных фагов при исследовании фекалий обеих опытных групп, составил 8,9 lg БОЕ/г в то время, как максимальный титр эшерихиозных фагов был равен 6,7 lg БОЕ/г. При этом стоит отметить, что в ходе опыта мы не проводили разделения эшерихиозных фагов, поэтому в таблице №10 приведены результаты персистенции всех трех культур. Кроме того, из приведенных в таблице №10 данных видно, что максимальная концентрация фаговых частиц BF-1356 и BF-1354 была достигнута к 10 часу с момента выпойки коктейля, a BF-1355 к 10-12-ому часу соответственно. В отношении эшерихиозных бактериофагов был установлен аналогичный результат, когда максимальный титр фагов достигался к 10 часу после выпойки композиции. Снижение титра фага спустя указанные периоды стоит рассматривать как уменьшение концентрации возбудителя в организме.
Вторая выпойка композиции производилась спустя 48 часов после первой ранее указанным методом. При этом, цыплята обеих опытных групп не проявляли каких-либо массовых клинических проявлений сальмонеллезной и эшерихиозной инфекции. Результаты определения динамики персистирования фаговых частиц в кишечнике птицы в разные промежутки времени после двукратного выпаивания приведены в таблице №11.
Анализируя данные, приведенные в таблице №11, можно прийти к выводу о том, что спустя 48 часов после первой выпойки в организме птицы продолжают циркулировать сальмонеллезные фаги, при том, что титр эшерихиозных фагов становится минимальным. За счет второй выпойки удается увеличить титр фагов в кишечнике птицы спустя 6-10 часов, после чего титр фагов падает. Данное явление можно объяснить снижением количества возбудителя в организме, что и является основной целью выпойки птиц с помощью композиции.
Пример №7. Использование антибактериальной композиции на основе бактериофагов для лечения сочетанной сальмонелла- и колиинфекции у поросят.
С целью определения эффективности использования коктейля бактериофагов для лечения поросят был воспроизведен острый опыт. Предварительно, до заражения животных, были исследованы их фекалии на наличие в них сальмонелл и патогенных эшерихий и определение литической активности фагов, входящих в состав коктейля. В результате было установлено, что в фекалиях животных не было бактерий вида Salmonella sp.и патогенных эшерихий, а выделенные непатогенные культуры Е. coli не были чувствительны к фагам.
В опыте были использованы 28-ми дневные поросята в количестве 12 голов, из которых было сформированы 2 опытные группы по 5 голов в каждой и одна контрольная группа из 2-х голов (не подвергавшаяся обработке коктейлем бактериофагов с целью подтверждения заражения).
Выбор данной возрастной категории поросят, был обусловлен тем, что к данному периоду у поросят, полученных от ранее вакцинированных маток, снижается и/или прекращает действовать колостральный иммунитет против эшерихиоза, что снижает естественную сопротивляемость организма к действию патогенных эшерихий, а также тем, что в этот период происходит отъем от матки и/или перевод животных на доращивание, что является стресс фактором, провоцирующим заболевание. Кроме того, именно в данный период поросята чаще всего подвержены колибактериозной инфекции, протекающей в форме диареи поросят-отъемышей (PWD - postweaning disease) и отечной болезни (ED - edema disease) вызванные ETEC, ЕРЕС, EDEC.
50
3
3
Инфицирование поросят в 28-ми дневном возрасте проводили пероральным заражением культурами трех серотипов сальмонелл и трех культур эшерихий (что и при опыте приведенном в примере №6), но в дозе 10 LD, в виде суспензии суточной агаровой культуры на основе стерильного физиологического раствора, в объеме равном 5,0 см для каждого штамма. Конечный объем инфицирующей суспензии для поросят составил 30,0 см. Иннокуляция заражающей суспензии проводилась индивидуально с использованием шприца без иглы.
Выпойка композиции на основе бактериофагов начиналась с момента проявления клинических признаков, свойственных сальмонеллезу и/или эшерихиозу, а именно повышения температуры и развития диареи. Так, первые признаки инфекции проявились у инфицированных животных спустя 36 часов после пероральной выпойки заражающей суспензии. В таком случае согласно режиму дозирования, приведенному в пункте №4.1.
9
дозировка препарата для животных составляет 10 доз (т.е. 1 мл с титром 10 БОЕ каждого бактериофага). Выпойка композиции бактериофагов проводилась индивидуально, в продолжении 5-ти дней. Использование композиции позволило прекратить развитие патогенеза ассоциированной патологии за три дня, так диарея у поросят прекратилась после 2-3-х выпоек. Несмотря на то, что при проведении опыта мы смогли остановить диарею, мы не могли однозначно утверждать, что мы прекратили выделение культур во внешнюю среду, именно поэтому мы продолжили курс до 5-ти дней согласно режиму дозирования.
При проведении данного испытания, на ежедневной основе, от животных опытной группы отбирались фекалии с целью выделения ранее введенных инфицирующих культур. Определение наличия в фекалиях именно ранее введенных инфицирующих культур эшерихий было проведено за счет серотипирования изолятов Е. coli сыворотками «О»- коли агглютинирующими. Серотипирование сальмонелл проводили наборами сывороток сальмонеллезных О-комплексных и монорецепторньгх О- и Н- агглютинирующих. В результате проделанной работы было установлено, что на 4 день после начала использования композиции на основе коктейля бактериофагов прекратилось выделение культур сальмонелл, которые ранее выделялись в течение первых трех дней. Выделение патогенных серогрупп эшерихий (О78, О119, О86) прекратилось на 5-ый день. Для подтверждения эффективности коктейля бактериофагов фекалии от животных исследовались еще 5-ти дней, в течении которых выделение сальмонелл и патогенных эшерихий также не повторялось.
Животным контрольной группы бактериофаг не выпаивался, на фоне чего ассоциированная инфекция прогрессировала и привела к гибели одного из двух инфицированных животных с явлениями обезвоживания, изнуряющей диареей: кожа приобрела серый оттенок, глаза стали впалыми на 4 день после инфицирования. Второй контрольный поросенок погиб на 6-ой день с аналогичными признаками. При патологоанатомическом исследовании трупов павших животных были зафиксированы признаки, свойственные эшерихиозной и сальмонеллезной этиологии, а именно: ткани и органы обезвожены, просвет кишечника расширен и заполнен фекалиями с большим количеством слизи и хлопьев казеина, слизистая оболочка тонкого отдела кишечника отечная (свойственно для эшерихиоза). Кроме того, были отмечены кровоизлияния под эпикардом, плеврой, на слизистых оболочках желудка, под капсулой почек, на печени были обнаружены некротические очаги (свойственно для сальмонеллеза). С целью подтверждения участия в развитии данных патологоанатомических изменений ранее введенных инфицирующих культур, был произведен отбор секционного материала от павших животных с целью их выделения рутинными бактериологическими методами. В результате все ранее введенные культуры были зафиксированы в различной локализации, а именно, в тонком и толстом отделе кишечника и печени.
Пример №8. Использование заявленной композиции для санации животноводческих и птицеводческих помещений, методом аэрозольной газации.
Аэрозольная обработка помещений содержания птицы и животных композициями на основе бактериофагов является эффективным средством профилактики и борьбы с сальмонеллезом и эшерихиозом, основной эффект которого достигается благодаря уничтожению очага инфекции, прерывания путей передачи и распространения возбудителя. На наш взгляд, для предотвращения развития инфекционной патологии на птицеводческих и животноводческих предприятиях целесообразно исключать следующие пути передачи и распространения патогенов, а именно: 1) из кормов - к птице/животным; 2) от птицы/животных - в подстилку; 3) из подстилки - к птице/животным; 4) от птицы/животных - к птице/животным; 5) от птицы/животного - к человеку; 6) от человека - к птице/животным; 7) от продуктов убоя - к человеку; 8) от человека - к продуктам убоя. Разрушив обозначенные пути, мы можем контролировать и предотвращать развитие инфекции, а также циркулирование возбудителя в виде бактерионосительства.
Сложность реализации обозначенной задачи заключается в наличии различных способов, а также методов содержания птицы и животных, где использование препаратов на основе бактериофагов исключительно в виде оральной выпойки не является полноценным средством профилактики поскольку очаг инфекции зачастую находится не в самом макроорганизме, а в окружающей его среде. Данное явление стоит рассмотреть на примере птицеводческой отрасли, когда птица может содержаться напольным путем и в клетках. Схема использования бактериофагов в двух этих случаях не может быть одинаковой, так как при напольном содержании птицы, возбудитель может находиться в подстилке, ввиду чего, даже после выпойки с использованием композиции на основе бактериофагов, птица спустя какое- то время будет повторно инфицирована, так как постоянно контактирует с подстилкой; и чем длительнее период содержания птицы, тем выше риск ее инфицирования или формирования бактерионосительства. Например, в помещении для содержания кур несушек родительского стада через 350-400 дней слой подстилки, в которой может находиться патогенный микроорганизм, может достигать 30-45 см. Во втором варианте, когда птица выращивается в клетках, риск повторной инфекции за счет контакта с инфицированной подстилкой отсутствует.
Дополнительное преимущество проведения аэрозольной обработки препаратами на основе бактериофагов птицеводческих и животноводческих предприятий заключается в возможности проведения данной санации в присутствии птицы и животных. Помимо этого, аэрозольная обработка позволяет распространиться и проникнуть бактериофагам в сложно доступные места локализации инфекционного агента, усиливая эффективность санации. В качестве примера стоит рассмотреть ситуацию, когда дезинфекция и санация помещений для содержания птицы и животных не могут быть проведены, так как технологическая схема производства не позволяет освобождать эти площади. Так, на свиноводческих предприятиях существуют участки осеменения, где содержатся ремонтные и основные свиноматки. Проблема обработок и дезинфекций данных участков заключается в том, что они никогда не освобождаются от животных, а следовательно, ни полная механическая мойка помещения, ни полная дезинфекция не может быть проведена. Мойка в таких случаях производится локально, т.е. секциями, при этом один раз в пару месяцев, что приводит к тотальному бактерионосительству среди родительского поголовья.
Принцип проведения аэрозольной обработки с использованием заявленной композиции должен быть следующим:
1) необходимо определиться с возможностью герметизации вентиляционной системы. В случае, если нет возможности обеспечить герметичность обрабатываемых помещений, то их санацию целесообразнее проводить не аэрозольной обработкой, а воздушно-капельным орошением, благодаря использованию соответствующих генераторов (например САГ), что описано в следующем примере;
2) аэрозольную обработку композицией на основе бактериофагов не целесообразно проводить при высокой температуре окружающей среды, когда вентиляционная система не справляется с охлаждением и/или ее отключение приведет к существенному нарушению микроклимата. Ввиду обозначенного, аэрозольную обработку стоит использовать в прохладных условиях, в противном случае это может привести к тепловому удару и снижению продуктивности. Для санации помещений в жаркий период времени стоит использовать орошение воздушно-капельным путем, что описано в примере №8;
9
3
3
3
3
3) рассчитывается объем композиции, необходимый для обработки помещения. Так, для помещений, в которых содержится птица и животные, расход композиции с концентрацией 10 БОЕ каждого фага в 1 мл, составляет 100 см на 1000 м. При этом, ввиду возможных потерь используемой композиции на подготовительном этапе разведения, а также ввиду потерь его в генераторе аэрозолей, целесообразно учитывать это при расчете потребности препарата, добавляя 3-5%. Так, согласно технологическому паспорту корпуса для содержания птицы, его объем составляет 8376 м, ввиду чего необходимый для обработки данного помещения объем используемой композиции должен составлять 862,7 см (с учетом возможных 3% потерь).
3
3
4) подготовка композиции для аэрозольной газации при помощи аэрозольного генератора (на примере САГ). Для аэрозольной обработки композицией животноводческих помещений, рекомендуется использовать минимум по одной установке САГ на каждые 3000 м, что позволяет сократить срок обработки помещений, и повысить ее эффективность. Помимо САГ, могут использоваться другие типы генераторов аэрозолей, при этом работа с ними должна выполняться в соответствии с инструкцией. В нашем примере для помещения объемом 8376 м использовалось три установки САГ, в каждый из которых было внесено для газации по 287,5 мл композиции, предварительно растворенной и тщательно перемешанной в 6,7 литрах воды, таким образом, чтобы конечный объем раствора составлял по 7 литров (полный объем установки САГ).
Полная обработка аэрозольной газацией проводилась в течение 30 минут, из которых 15 потребовалось на распыление препарата, а остальные 15 минут была экспозиция выдержки для более эффективного распределения фаговых частиц по всему объему помещения.
Эффективность данного метода санации помещений от возбудителя в качестве профилактики сальмонеллеза и эшерихиоза, была подтверждена тем, что распыляемые бактериофаги в ходе лабораторных исследований были обнаружены в степ-пробах, смывах со стен, взлетках и крышках гнезд.
Для усиления эффекта от аэрозольной обработки, можно использовать смесь водного раствора композиции с глицерином, подготовленном в соотношении 1:1. Благодаря глицерину взвесь в обрабатываемом помещении дольше находится и поддерживается в воздухе. (Состав: 0,12 мас % - коктейль бактериофагов; 49,88 мас % - 0,9% NaCl; 50 мас % - глицерин).
Пример №9. Использование композиции для санации животноводческих и птицеводческих помещений методом воздушно-капельного орошения (спрей обработка).
Воздушно-капельное орошение животноводческих и птицеводческих помещений является альтернативным методом их санации от бактериальных патогенов по сравнению с аэрозольной газацией. Как уже было сказано в предыдущем примере, воздушно-капельное орошение целесообразнее использовать в случае, когда невозможно произвести герметизацию этих помещений, при высокой температуре окружающей среды, в также в случае отсутствия генераторов аэрозолей. В остальных случаях воздушно-капельное орошение с использованием заявленной композиции на основе бактериофагов является эффективным средством прерывания путей передачи инфекционного процесса бактериальной этиологии.
Принцип проведения воздушно-капельного орошения птицеводческих и животноводческих площадок с использованием антибактериальной композиции должен быть следующим:
1) воздушно-капельное орошение проводится с использованием соответствующего оборудования, например портативными бензиновыми генераторами;
2) возможна обработка как пустых помещений после их механической чистки и дезинфекции химическими реагентами, так и при наличии животных и птицы в корпусе;
9
3
2
3) предварительно рассчитывается объем препарата, необходимого для обработки помещения. Так, для помещений в которых содержится птица и животные, расход композиции с концентрацией 10 БОЕ каждого фага в 1 мл, составляет 100 см на 1000 м. При этом, ввиду возможных потерь препарата на подготовительном этапе разведения и других потерь, целесообразно закладывать дополнительные 3-5% препарата, при расчетах;
4) при расчете площади, предназначенной для обработки, учитывается не только полезная площадь, но и стены высотой минимум 2 метра от уровня подстилки, вся поверхность взлетки и крышки гнезд.
Пример расчета площади обрабатываемой поверхности в корпусе:
2
* полезная площадь - 1152 м;
2
* стены (Н - 2 м, L - 168 м) - 336 м;
2
* взлетки -180 м;
2
* крышки гнезд - 270 м;
2
Итого: площадь обрабатываемой поверхности в конкретном случае составляет 1938 м для обработки которого необходимо 199,6 мл композиции (с учетом 3% возможных потерь).
5) необходимый объем композиции разводится в воде в 1000 раз последовательным разведением с обязательным шуттелированием. Орошение производится согласно инструкции на используемое оборудование, таким образом, чтобы препарат попал на все поверхности в корпусе.
Суть аэрозольной газации с использованием заявленной композиции, как и воздушно-капельное орошение нацелено на подавление возбудителя, находящегося в подстилке и окружающей среде. При условии постоянной обработки помещений вышеуказанными методами в них создается и поддерживается резервуар бактериофагов. (Состав: 0,12 мас % - коктейль бактериофагов; 49,88 мас % - 0,9% NaCl; 50 мас % - глицерин).
Пример №10. Использование композиции с целью дезинфекции инкубационного и товарного (пищевого) яйца против сальмонеллеза и эшерихиоза.
В целях усиления контроля сальмонеллезной инфекции, многие производители птицеводческой продукции заинтересованы в биологической защите яйца, в том числе посредством использования препаратов на основе бактериофагов. Эффективность использования заявленной композиции для деконтаминации инкубационного и товарного яйца против сальмонеллеза и эшерихиоза была определена на базе ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН, где реализован опыт по обработке композицией предварительно обсемененного яйца.
Ход исследования был следующим:
6
1) куриное, гусиное, утиное и перепелиное яйцо в количестве 15 штук каждого вида, в лабораторных условиях были обсеменены суспензией бактериальных клеток S. enteritidis №R-6; S. typhimurium 3; S. infantis №1451; E. coli ETEC №320 (O78:К80); E. coli EPEC №733 (О119:К69:H4); E. coli EAEC №857 (О86:К61:H32) с концентрацией 1*10 мкр. кл. каждого штамма путем полного погружения на 1 минуту;
2) после обсеменения, яйцо подсушивалось в ламинарном боксе до полного высыхания (вез воздействия ультрафиолета) в течении 1 часа;
3
11
8
3) после подсушивания, по 5 яиц каждого вида использовались в качестве положительного контроля, для подтверждения обсеменения яйца бактериологическими методами. Остальные яйца подвергались полному погружению в раствор композиции, приготовленный из расчета 10 см препарата с концентрацией 10 БОЕ/мл каждого бактериофага на 10 литров воды, то есть концентрация каждого фага в рабочем растворе составляла 10 БОЕ/мл. Экспозиция обработки составляла 3 минуты; (Состав: коктейль бактериофагов - 1 мас %; вода очищенная - 99 мас %).
4) после обработки композицией, яйца повторно подсушивались в ламинарных условиях на протяжении 1 часа;
5) спустя час после подсыхания, с половины яиц (по 5 каждого вида) были сделаны смывы для бактериологического исследования с целью выявления культур, которыми ранее проводили обсеменение яиц. Также бактериологическому исследованию было подвергнуто содержимое яйца. Кроме того, бактериологическому исследованию подвергли раствор композиции, в который погружались яйца для деконтаминации, согласно третьему пункту настоящего опыта. Все образцы исследовались индивидуально. Вторая часть яиц была упакована в герметичные контейнеры и помещена в термостат при температуре 37,5°С с целью имитации процедуры инкубирования в течение суток, после чего яйца также подвергались бактериологическому исследованию.
Результатом проведенного опыта стало доказательство высокой эффективности использования композиции для деконтаминации инкубационного и товарного яйца от сальмонелл и эшерихий, так как ни в одном из случав с поверхности яиц, а также из содержимого яиц не были выделены изоляты сальмонелл и эшерихий. Кроме того, бактериологическое исследование образцов композиции, взятых после погружения в них обсемененных яиц, также не выявил наличие в нем сальмонелл и эшерихий. Положительный контроль во всех случаях продемонстрировал наличие на поверхности яиц, культур сальмонелл и энтеропатогенных эшерихий.
Помимо обработки обсемененных яиц методом погружения, был воспроизведен опыт по апробации метода воздушно-капельной обработки благодаря опрыскиванию из пульверизатора. Данный метод не показал абсолютной эффективности, так как после его воспроизведения сальмонеллы были выделены в 67,5% случаев, а эшерихий в 35% соответственно.
Пример №11. Использование композиции для деконтаминации, обсемененного сальмонеллами и эшерихиями мяса птицы.
6
8
Использование композиции позволяет проводить деконтаминацию продукции птицеводства и животноводства. Для этого в лабораторных условиях был воспроизведен опыт по определению эффективности обработки композиции на основе бактериофагов предварительно обсемененного мяса птицы. Образцы мяса, 20 кусочков 5×5 см куриного филе, простерилизованные в 70% спирте, далее отмытые в стерильном физиологическом растворе, были контаминированы методом орошения культурами сальмонелл и эшерихий, а именно S. enteritidis №R-6; S. typhimurium 3; S. infantis №1451; E. coli ETEC №320 (O78:К80); E. coli EPEC №733 (О119:К69:H4); E. coli EAEC №857 (О86:К61:H32) с концентрацией 1*10 КОЕ/мл каждого штамма. После того как образцы были обсеменены, они подсушивались в стерильных лотках в течение 1 часа, для адаптации бактериальных клеток на поверхности кусочков мяса, затем по 5 кусочков филе были запакованы в индивидуальную упаковку и помещены на сутки в холодильник при температуре 4±2°С (положительный контроль №1 - имитация охлажденного мяса). По 5 кусочков мяса каждого вида использовались для бактериологического исследования сразу же после подсушивания (положительный контроль №2 - имитация парного мясо). Остальные образцы были подвергнуты обработке композицией методом полного погружения в раствор с концентрацией 10 БОЕ/мл каждого фага, с экспозицией - 30 секунд. После погружения в заявленную композицию и последующего подсушивания в течение 1 часа, по 5 образцов мяса было запаковано в индивидуальную упаковку и помещено на сутки в холодильник (опытные образцы №1 - имитация охлажденного мяса). Оставшиеся 5 образцов после обработки и подсушивания были направлены на бактериологическое исследование (Опытные образцы №2 - имитация парного мяса).
Результаты бактериологического исследования образцов мяса после погружения их в заявленную композицию приведены в таблице №12.
Как видно из данных, приведенных в таблице №12, использование композиции на основе бактериофагов для деконтаминации продукции птицеводства возбудителями сальмонеллеза и эшерихиоза, обладает высокой эффективностью. Так, в случае обработки парного мяса бактериофагами обсемененность мяса сальмонеллами снизилась на 99,95%, а эшерихиями на 99,98%. Обработанное бактериофагами охлажденное мясо привело к снижению количества клеток сальмонелл на 99,99%, а эшерихий на 99,78%.
Пример №12. Использование композиции для биологического консервирования и обезвреживания кормов от возбудителей сальмонеллеза и эшерихиоза свиней при жидком типе кормления.
Поскольку в некоторых случаях источником патогена являются корма, не прошедшие или прошедшие недостаточную термическую обработку, поиск новых эффективных средств защиты этих кормов является актуальной задачей для животноводства. На практике удалось установить высокую эффективность использования композиции в качестве средства биологического консервирования и обеззараживания жидких кормов, используемых в свиноводстве.
5
3
Технологические этапы жидкого кормления свиней подразумевают беспрерывные циклы подготовки и скармливания кормов, при котором в замешивающие чаны помещается сухой комбикорм, который в последующем смешивается с водой из расчета 1:4; т.е. 300 кг корма + 900 литров водопроводной воды. Благодаря мешалке осуществляется получение однородной массы корма, который в последующем передается по трубам в кормушки. По истечению определенных периодов корм, оставшийся в трубах, попадает в отстойный чан, который в последующем возвращается во вновь замешанную партию корма. Проблемой данного типа кормления является то, что корма при таком способе их подготовки могут становиться фактором распространения патогенов. В качестве средства обезвреживания таких кормов, нами были проведены испытания, при котором в указанный объем жидкого корма вводилась композиция в объеме 0,6 литра (Состав: 1 мас % - коктейль бактериофагов, 99 мас % - вода очищенная) на 1200 кг корма, или 0,5 литра на 1 тонну. Результатом данного опыта стало снижение обсемененности кормов эшерихиями, выраженном в показателе КОЕ (колониеобразующих единиц). Так, обсемененность проб кормов эшерихиями до введения бактериофагов, взятых непосредственно из кормушки у животных, составил 4,6*10 КОЕ/г, в то время как в кормах, обогащенных композицией, данный показатель не превышал 5,2*10 КОЕ/г, что в свою очередь в 88,4 раза ниже, чем при использовании кормов без нее.
Пример №13. Эффективность использования заявленной композиции в промышленных птицеводческих условиях.
9
8
Определение эффективности использования композиции подтвердилось в условиях птицеводческого предприятия РФ, на которых в течение 2017 года обнаруживали S. enteritidis и S. infantis. В испытаниях было использовано родительское поголовье кур несушек, содержащихся напольным методом в количестве 120000 голов (10 корпусов по 12 тысяч колов птицы в каждом) начиная посадки, перед которой была проведена полная механическая чистка и дезинфекция. Испытания проводились в течении 6-ти месяцев. Обработка птицы проводилась посредством выпаивания композиции (Состав: 0,01 мас % - коктейль бактериофагов, 99,99 мас % - вода) с титром 10 БОЕ/мл, разовая доза на птицу составляла 10 БОЕ. Поскольку птица содержалась напольным образом, то с целью деконтаминации подстилки, в чередовании с выпойкой, была рекомендована аэрозольная обработка композицией (Состав: 0,12 мас % - коктейль бактериофагов, 49,88 мас % - 0,9% NaCl, 50 мас % - глицерин) всех помещений, содержащих птиц. Принцип комплексного подхода, используемого на предприятии, был описан в четвертом примере, а именно:
первая неделя - выпойка препарата;
вторая неделя - аэрозольная и/или воздушно капельная обработка;
третья неделя - выпойка препарата;
четвертая неделя - аэрозольная и/или воздушно капельная обработка;
и т.д. до уничтожения очага инфекционного процесса и/или до момента прекращения бактерионосительства среди птиц.
Использование антибиотиков, воздействующих на грамотрицательную флору, во время испытаний было минимизировано, и они использовались лишь в крайних случаях с целью предотвращения потерь среди поголовья.
Оценку эффективности использования композиции проводили благодаря ежемесячному бактериологическому мониторингу, для чего отбирались следующие образцы: клоакальные смывы - 5 свабов с корпуса (по 5 голов на сваб); степ-пробы - 2 пары с корпуса; корпусная пыль - 1 объединенная проба с корпуса; смывы с напольного и инкубационного яйца - по 1 пробе (с десяти яиц); смывы с ленты яйцесбора - 1 проба с корпуса.
Результат использования композиции стал наблюдаться на 3-тий месяц с начала применения. Так, в первые два месяца бактериологический мониторинг подтверждал наличие S. enteritidis и S. infantis в клоакальных смывах, степ-пробах и корпусной пыли. Начиная с третьего месяца применения композиции, выделение сальмонелл полностью прекратилось и не подтверждалось до момента окончания опыта; иными словами, в течение последующих 4-ех месяцев выделение сальмонелл не подтверждалось.
Пример №14. Эффективность использования заявленной композиции в промышленных свиноводческих условиях.
Эффективность использования композиции подтвердилась в условиях свиноводческого предприятия, расположенного в Псковской области, на животноводческих площадках которого имелась проблема эшерихиозной этиологии. Основная проблема для предприятия заключалась в диарее новорожденных поросят (неонатальной диарее), вызванной энтеротоксигенными штаммами (ETEC) Е. Coli, в частности от животных были выделены серотипы О8, О149. Патология развивалась у животных, начиная с первого дня жизни и в 70% случаев проходила самостоятельно в легкой форме к 4-5 дню. В остальных же случаях инфекция имела тяжелую форму и сопровождалась рвотой у больных поросят, изнуряющей диареей, провоцирующей обезвоживание. Цвет фекалий у таких животных имел серо-белый и/или желтый оттенок.
8
В качестве средства устранения данной патологии была использована антибактериальная композиция на основе коктейля бактериофагов из расчета 5*10 (БОЕ) каждого бактериофага, т.е. на каждую голову было использовано по 5 доз (разовая выпойка). Препарат применялся индивидуально путем пероральной выпойки. Для удобства выпойки он предварительно был ресуспендирован в воде (состав: 0,1 мас % - коктейль бактериофагов, 99,9 мас % - вода очищенная). Затем, благодаря использованию шприца дозатора, на канюлю которого был одет резиновый шланг, препарат заливался в рот животным. Продолжительность курса терапии определялась по результатам эффективности применения средства, но не превышала 5 дней.
Таким образом, курсовой терапией были обработаны животные 4-х разных партий общей численностью 926 голов, изначально демонстрирующие признаки неонатальной диареи, самостоятельно не проходящей в течение первых 4-5 дней жизни. Клинические признаки преимущественно исчезали после первых трех выпоек, но в тяжелых случаях после 4-5. Процент выживаемости животных опытных групп составил 90,38%, при условии неиспользования для лечения каких-либо дополнительных антибактериальных средств и препаратов. Полученные результаты говорят о высокой терапевтической эффективности использования антибактериальной композиции на основе штаммов бактериофагов при использовании в условиях промышленных свиноводческих предприятий.