СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ МИКОБАКТЕРИЯМИ, ШТАММ КАЛЛУСНОЙ КУЛЬТУРЫ Ungernia victoris UV-22-ПРОДУЦЕНТ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО КОМПЛЕКСА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ МИКОБАКТЕРИЯМИ, И СПОСОБ ЕГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ (ВАРИАНТЫ)
AGENT FOR DISEASES CAUSED BY MYCOBACTERIA OF Ungernia victoris UV-22 CALLUS CULTURE STRAIN - PRODUCER OF BIOLOGICALLY ACTIVE COMPLEX FOR TREATING DISEASES CAUSED BY MYCOBACTERIA AND CULTIVATION TECHNIQUE (VERSIONS)

Изобретение относится к области медицины, точнее к средствам для лечения заболеваний, вызываемых микобактериями, и технологии их получения, в частности новому штамму-продуценту и технологии выращивания клеток растений с помощью микроклонального размножения.
Изобретение относится к области медицины и биотехнологии, а именно к новым лекарственным средствам для лечения таких заболеваний, вызываемых микобактериями (МБ), как лепра (проказа) и туберкулез, а также к способам их получения, в частности, с помощью технологии культивирования клеточной ткани.
Заболевания, вызываемые микобактериями, в частности туберкулез и лепра, относятся к числу наиболее трудноизлечимых. Исследования, проведенные Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ), показали, что проблема туберкулеза (ТБ) стоит чрезвычайно остро, о чем свидетельствует уровень инфицированности населения земного шара, составляющий свыше 1 миллиарда человек, из них 44% болеют наиболее опасной для окружающих легочной формой этого заболевания. Около 8 миллионов человек заболевают туберкулезом и около 2 млн. человек умирает от этого заболевания каждый год. Возбудителем заболевания является Mycobacterium tuberculosis, главным образом человеческого, редко бычьего и в исключительных случаях птичьего типа. (Dye С, Scheele S, Dolin P, Pathania V and Ravinglione M С, 1999, JAMA, 282, 7, 677-686).
Mycobacterium leprae
Проказа (лепра) вызывается  и характеризуется поражением кожи, нервной системы, костей и глаз и приводит к инвалидизации, слепоте и смерти. (humbio.rn/humbio/infect_har/0032c27b.htm) Она менее распространена, чем туберкулез, однако в современном мире, преимущественно в развивающихся странах, насчитывается около 2 млн. больных. Современная клинико-эпидемиологическая ситуация по лепре в России отличается рядом особенностей. Заболеваемость носит спорадический характер, новые случаи практически не регистрируются, имеющийся контингент больных в основном составляют лица пожилого и преклонного возраста, страдающие от сопутствующей соматической патологии. Около 18 процентов больных имеют осложнения лепрозного процесса (нейротрофические язвы стоп, амиотрофии, мутиляции пальцев), поражения печени и т.п.
Основным направлением при лечении различных форм туберкулеза является химиотерапия препаратами, воздействующими на МБ, подавляя их размножение и уменьшая их вирулентность. К ним относятся, в частности, производные изоникотиновой кислоты, такие препараты, как гидразид изоникотиновой кислоты (изониазид) и его производные соли парааминосалициловой кислоты (ПАСК), антибиотики, а также канамицин, этионамид, протионамидтиоацетозон, флоримицин (Машковский М.Д. Лекарственные средства, ч.2. - М.: Медицина, 1985, с.314-327). Как правило, применяют 2-3 противотуберкулезных препарата в течение длительного срока (9-18 и более месяцев) с учетом их переносимости больным и устойчивости МБ. Общепринятая традиционная антибактериальная терапия предусматривает применение, как правило, тубазида (изониазида), рифампицина и стрептомицина (Машковский М.Д. Лекарственные средства. - M.: Медицина, 1993, т.2, с.366-367; Урсов И.Г., Боровинский А.И., Федорова Т.А., Фоминцева О.А., Зырянова Т.В. Проблема туберкулеза, 1993, N 2. - М.: Медицина, с.34-36). Было предложено использовать при лечении туберкулеза метилурацил в сочетании с общепринятой комплексной терапией (антибактериальной, дезинтоксикационной) и витаминами. (Козленко Л.С. Проблемы туберкулеза, 1993, N 6, с.52-53). Наиболее эффективным препаратом для лечения туберкулеза является рифампицин, который вводится в организм перорально в виде капсул в суточной дозе 150 мг. Для снижения скорости выведения рифампицина из организма с мочой препарат вводится на фоне приема пиразинамида (Г.Б.Соколова и др. Антибиотики и химиотерапия, 2000, 45, №9, с.30-37).
Недостатками используемой химиотерапии является относительно низкая эффективность и большое число противопоказаний (болезни печени, почек, анемии и т.п.), а также наличие негативных побочных эффектов, таких как слабость, головные боли, поражения, что негативно сказывается на состоянии других систем организма.
Лечение лепры осуществляется также в рамках комплексной терапии путем применения 2-3 противолепрозных препаратов (диафенилсульфона, солюсульфона, диуцифона) в сочетании с общеукрепляющими средствами курсами по 9-18 мес. (Справочник практического врача. - М., Медицина, 1982, с.464; Машковский М.Д. Лекарственные средства, ч.2, М.: Медицина, 1985, с.329-331).
Недостатками используемых препаратов являются относительно невысокая эффективность, большое число противопоказаний (болезни печени, почек, анемии, эпилепсия и т.п.), а также наличие негативных побочных эффектов, таких как слабость, головные боли, поражения печени (Справочник практического врача. - М.: Медицина, 1982, с.120-122).
В народной медицине известно значительное количество средств, рекомендуемых для лечения туберкулеза и проказы. В частности, предлагаются составы и сборы на основе алтея, очитка, золотарника, буквицы, маргаритки многолетней, сосновых почек и др. (А.Аксенов. Энциклопедия знахаря. ACT, Донецк, 1982, 482-484), а также целесообразно использовать для этих целей имбирь, лимон с медом, алоэ с медом и сливочным маслом и другие средства (Полная энциклопедия народной медицины, т.3, Москва, АНС, 1999, 440, 441, 454, 520). Для лечения проказы рекомендуется использование листьев хны (Полная энциклопедия народной медицины, т.3, Москва, АНС, 1999, стр.532). Однако данное использование природного сырья, как правило, недостаточно эффективно и имеет значительное число противопоказаний.
Технической задачей, стоявшей перед авторами, являлось создание эффективного и более безопасного средства для лечения заболеваний, вызываемых микобактериями, и технологии его получения.
Технический результат был достигнут использованием для данных целей водно-спиртового экстракта штамма каллусной ткани растения Унгерния Виктора (Ungernia victoris)UV-22.
Экстракт, содержащий 0.01-0.05% сухого вещества, представляющего собой набор биологически активных веществ (БАВ), применяется для профилактики и лечения заболеваний, как правило, в дозе по 0,1-10 капель экстракта на 20 кг веса тела в качестве добавки в воду или сок после приема пищи 3 раза в день. Конкретная доза и режим приема устанавливают исходя из особенностей, стадии и характера протекания заболевания.
Унгерния Виктора Ungernia victoris (УВ) - эндемическое луковичное растение Памиро-Алая, произрастающее только на Гиссарском хребте и его южных отрогах. Луковицы, корни и листья УВ содержат важные для медицины галантамин, ликорин и другие изохинолиновые алкалоиды, а в каллусной ткани обнаружен комплекс биологически активных веществ, обладающий широким спектром позитивного воздействия на организм. В частности, он обладает радиопротекторным, антимутагенным, гепатозащитным, антиканцерогенным действием, повышает физическую и умственную работоспособность (RU 0010088, 21.10.1998; RU 2147439, 28.10.98; RU 2215762, 28.12.01; RU 0011467, 18.06.99; RU 2221584, 11.04.02; RU 2186577, 02.03.01; RU 2178979, 25.05.00). Вместе с тем, лечебное воздействие на заболевания, связанные с микобактериями, ранее не изучалось, причем предварительные исследования с использованием данного экстракта, выпускаемого под названием «Влаирин» (см. примеры), показали, что такое воздействие недостаточно высоко.
Использование для получения биологически активных веществ клубней Унгернии имеет свои ограничения, т.к. природная сырьевая база данного растения ограничена, а интродукция Унгернии успехом не увенчалась. В этой связи авторы рассматривали альтернативой природного размножения биотехнологические методы, в частности, способ микроклонального размножения в культуре in vitro нативной клеточной ткани. Преимуществами этого способа размножения в сравнении с традиционными методами являются более высокие коэффициенты размножения, миниатюризация процесса, оздоровление посадочного материала от разного вида инфекций.
В настоящее время для многих видов растений известны различные способы микроклонального размножения растительных клеток, включая клетки каллусной ткани (Калинин Ф. Л., Кушнир Г.П., Сарнацкая В.В. Технология микроклонального размножения растений. - К.: Наук. думка, 1992. - 230 с.; RU 2052925; RU 2130709; RU 2171841; RU 2141525). Преимуществами этого вида размножения в сравнении с традиционными методами являются более высокие коэффициенты размножения, миниатюризация процесса, оздоровление посадочного материала от разного вида инфекций.
Основными этапами при микроклональном размножении растений является получение регенерантов из эксплантов, которые выделяют из различных органов и тканей растений, и размножение регенерантов с помощью стимуляций.
Культивирование эксплантов до образования регенерантов и укоренения микрочеренков осуществляют, как правило, на агаризованных питательных средах. За основу сред используют среду Мурасиге-Скуга (Murashige T.,Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Phisiol. Plant. 1962. v.15. N13. p.473-497), которая содержит, мг/100 г:
4
3
3
4
2
2
2
2
4
- макросоли: NHNO 1650, KNO 1900, MgSO×7HO 1900, CaCl×2HO 440, KHPO 170;
4
2
3
3
4
2
2
2
4
2
4
2
- микросоли: MgSO×4HO 22.3, НВО 6.2, ZnSO×4HO 8.6, CoCl×6HO 0.025, CuSO×5HO 0.025, NaMoO×2HO 0.025; KI 0.83;
- витамины: тиамин 0.1, миоинозитол 80, пиродоксин 0.5, никотиновая кислота 0.5;
- источник углерода - сахароза - 20000;
- агар - 7000;
- добавки для повышения скорости формирования регенерантов - гиббереловая кислота 2.0, кинетин - 1.0;
- вода - остальное.
На втором этапе в данную среду, как правило, дополнительно вводят β-индолилуксусную кислоту - 0.05 мг/л или b-индолилмасляную кислоту - 0.1 мг/л.
Однако используемые при этом биологически активные вещества (БАВ) способны вызывать генетические изменения в клетках, которые в процессе культивирования накапливаются, что приводит к увеличению количества регенерантов, отличающихся от исходного типа (Леонова Н.С. Сибирский вестник сельскохозяйственных наук, 1986, №3, с.18-23). Кроме того, практически все указанные технологии видоспецифичны, т.е. пригодны для определенной группы растений и без модификации не могут использоваться для культивирования клеток других растений. В частности, для культивирования калуссной ткани Silene vulgaris (RU 2169769) используют агаризованную среду, содержащую макро- и микросоли по Мурасиге-Скуга, гормоны роста, включая 6-БАП и 2,4 Д, фолиевую кислоту, рибофлавин, биотин, Сф-пантотенат и кобаламин; для культивирования калуссной ткани Lemna minor (RU 2171840) используют агаризованную среду, содержащую макро- и микросоли по Мурасиге-Скуга, витамины, гормоны роста, включая 6-БАП и 2,4 Д, фолиевую кислоту, рибофлавин, биотин, Сф-пантотенат и никатинамид.
Однако предложенные для культивирования данных растительных штаммов среды и технологии культивирования при культивировании клеток Унгернии Виктора не позволяют добиться решения поставленных задач без их модификации, т.к. использование для их культивирования таких стандартных питательных сред, как среды Мурасиге-Скуга, Линсмайер-Скуга, Гамборга, В 5, Эриксона, Уайта, оказалось малоэффективным - индукцию регенерации микролуковичек наблюдали у 2-3% эксплантов.
В настоящее время известен используемый для получения биологически активных веществ (БАВ) штамм культивируемых клеток листьев Ungernia victoris - продуцент алкалоидов (галантамина и ликорина) (RU 1806188, 1993). Для культивирования клеток используют модифицированную среду Мурасиге-Скуга, в которую в качестве добавок введены альфа-НУК и тирозин, а в качестве дополнительного источника углерода и азота - гидролизованный казеин. Однако данный штамм используется только для получения алкалоидов группы галантамина и ликорина, что не позволяет использовать продуцируемые им БАВ для профилактики и лечения заболеваний, вызываемых микобактериями.
Наиболее близким к заявляемому новому штамму по технической сущности и достигаемому эффекту является созданный ранее авторами на основе каллусной ткани растения - штамм культивируемых клеток Унгернии Виктора - Ungernia victoris UV-2, являющийся продуцентом БАВ, перспективных для использования в качестве радиопротекторного и антимутагенного препарата (UA №39572, 2001). Водно-спиртовый экстракт БАВ данного штамма, послуживший основой биологически активной добавки (БАД) «Влаирин», как показали проведенные исследования, обладает также гепатозащитным, антиканцерогенным действием, повышает физическую и умственную работоспособность (RU 0010088, 1998; RU 2147439, 198; RU 2215762, 2001; RU 0011467, 1999; RU 2221584, 2002; RU 2186577, 2001; RU №2178979, 2000).
Штамм культивируется в виде каллуса одностадийным способом в питательной среде, имеющей следующий состав, мг/л:
4
3
3
4
2
4
4
2
3
2
2
4
2
4
4
2
4
макросоли: NHNO - 400-600; KNO - 1000-1200; (NH)SO - 200-400; MgSO×7HO - 400-600; Са(NO)×4НO - 800-1000; NHHPO - 500-700; (NH)HPO - 90-110; KCI - 60-80;
4
2
2
4
2
4
2
2
2
3
3
4
2
4
2
4
2
микросоли: MnSO×5НO - 23-25; KI - 0,8-0,9; NaMoO×2НO - 0,2-0,3; CuSO×5НO - 0,02-0,03; СоСl×6НO - 0,02-0,03; НВО - 5-8; ZnSO×4НO - 7-9; FeSO×7НO - 27-28; MnSO×5НO - 23-25;
2
натриевая соль этилендиаминотетрауксусной кислоты (NaЭДТА) - 37-38;
витамины: тиамин 0,8-1,2;
сахароза 40000-60000;
агар 6000-8000;
рН до автоклавирования составлял 5,8-6,2.
Выход сырой биомассы из 1 л на 65-е сутки роста составляет 400-550 г. В перерасчете на сухую биомассу выход составляет 20-35 г/л.
Недостатком данного штамма является длительность времени выращивания (более 60 дней). Недостатком его комплекса БАВ является, как показали проведенные эксперименты, недостаточная эффективность при лечении таких заболеваний, как туберкулез и проказа.
Основой заявляемой группы изобретений являлось создание нового штамма каллусной культуры UNGERNIA VICTORIS UV-22, депонированного в Коллекции клеточных культур при Институте молекулярной биологии и генетики НАН Украины. Коллекционный номер штамма 13/2008.
Генеалогия штамма
Исходным материалом для получения каллусной ткани служила луковица унгернии массой 135 г. Перед введением в культуру in vitro луковицу выдерживали 18 месяцев в покоящемся состоянии при температуре 6-10°С. В качестве эксплантов использовали базальные части внутренних луковичных чешуй.
Стандартные условия выращивания
Штамм культивируется в виде каллуса (на агаризованной питательной среде) или в виде суспензии (в жидкой среде) при температуре 24-26°С, относительной влажности воздуха 70-80% в темноте.
Суспензионную культуру выращивают при постоянном перемешивании на качалках при 80-100 об/мин, для каллусной культуры качалка не используется. Выращивание штамма Унгерния UV-12 осуществляется способом в питательной среде состава, мг/л:
NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub>
400-600
KNO<sub>3</sub>
1000-1200
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
200-400
MgSO<sub>4</sub>x7H<sub>2</sub>O
400-600
Са(NO<sub>3</sub>)<sub>2</sub>×4Н<sub>2</sub>О
800-1000
NH<sub>4</sub>H<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
500-700
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
90-110
KCI
60-80
KJ
0,8-0,9
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>×2H<sub>2</sub>O
0,2-0,3
CuSO<sub>4</sub>×5H<sub>2</sub>O
0,02-0,03
CoCl<sub>2</sub>×6H<sub>2</sub>O
0,02-0,03
MnSO<sub>4</sub>×5H<sub>2</sub>O
23-25
Н<sub>3</sub>ВО<sub>3</sub>
5-8
ZnSO<sub>4</sub>×4H<sub>2</sub>O
7-9
FeSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
27-28
Nа<sub>2</sub>ЭДТА
37-38
Тиамин
0,8-1,2
Пиридоксин
0,5-1,0
Никотиновая кислота
0,5-1,0
Глицин
1,5-2,5
1-нафтилуксусная кислота
1,8-2,2
Кинетин
0,8-1,2
Гидролизат казеина
450-500
Мезоинозин
70-100
Сахароза
50000-60000
Агар
6000-8000
рН до автоклавирования
5,8-6,2.
Для суспензионной культуры используют аналогичную среду, отличающуюся тем, что из нее исключен агар.
Для выращивания культуры используют стеклянные сосуды (банки, колбы) объемом 250-300 мл, содержащие 50-60 мл среды. Каллусную культуру можно выращивать также в пробирках и чашках Петри разных размеров.
Кратность рассева: 8-12.
Культуральные особенности
Биомасса культивируемых клеток штамма Унгерния UV-12 состоит из клеток и клеточных агрегатов разной плотности. Размер клеточных агрегатов суспензионной культуры составляет около 0,5 см в диаметре. При выращивании на твердой (агаризованной) питательной среде каллусная культура более гетерогенна, она состоит из агрегатов от 0,1 до 0,8 см в диаметре более плотных, чем агрегаты суспензии. Цвет культуры - от светло-серого до светло-желтого.
Продолжительность пассажа и режим пересевов суспензионной культуры - 45-55 суток, каллусной культуры - 55-65 суток.
Каллусная культура не теряет жизнеспособности и заметно не изменяет основных параметров при выращивании в стандартных условиях без пересадки на протяжении 90-95 суток. Масса инокулята составляет 100-120 г живой биомассы в перерасчете на 1 л питательной среды.
Ростовые признаки
Тип роста неорганизованный. Ростовой индекс 3-5 для суспензионной культуры и 4-7 - для каллусной. Кривая роста имеет типичный S-подобный характер с выходом на плато на 45-50-е сутки роста для суспензии и на 55-60-е сутки роста для каллуса. Жизнеспособность клеток составляет 85-90% в стандартных условиях культивирования.
Выход сырой биомассы из 1 л на 65-е сутки роста составляет 400-550 г. В перерасчете на сухую биомассу выход составляет 20-35 г/л.
Кривая митотической активности имеет, как правило, один подъем с максимумом на 8-10-е сутки роста в суспензии и на 10-15-е сутки роста на агаризованной среде. Количество клеток, находящихся в разных стадиях митоза (митотический индекс), в максимуме митотической активности достигает 1,4-2,5%.
Кариологические признаки
Культура является миксоплоидной популяцией. Распределение клеток по числу хромосом имеет границы варьирования от 16 до 92 хромосом. Модальный класс формируют клетки с 22-30 хромосомами, что составляет 50% популяции. Частота аберраций хромосом в анафазе - около 8%.
Цитоморфологические признаки
Как суспензионную, так и каллусную культуру формируют клетки паренхимного и меристематического типа, в основном округлой формы. Они составляют небольшие агрегаты, от 4-8 до 25-35 клеток. Размер клеток меристематического типа колеблется в пределах 25-65 мкм, размеры их ядер - 15-25 мкм. Клетки паренхимного типа имеют размеры 80-300 мкм. Их ядра более гетерогенные по размерам и форме, размер ядер от 12 до 30 мкм. Чаще ядра паренхимных клеток имеют размеры 20-28 мкм, иногда (в 10-15% случаев) такие клетки содержат несколько (как правило, 2-4) ядра. В стареющей культуре (после 30-35 суток роста) возрастает количество элементов клеточной дифференциации. В частности, количество трахеид может достигать на 50-е сутки роста и позже 2,5% и более от всех клеток. Возрастает также полиморфизм ядер: появляются пикнотические, удлиненные, лентообразные, сплющенные, гантелевидные ядра, большие диффузные ядра неправильной формы, ядра с большим количеством (четырьмя-шестью) ядрышек и т.д.
Маркерные признаки
Окраска культуры от светло-серого до светло-желтого цвета, способность к неорганизованному типу роста как на агаризованной, так в жидкой среде с минеральной основой по (UA №10338, 25.12.1996, МПК С 12 N 5/00, С 12 N 5/02) без стимуляторов роста. Прирост биомассы составляет на 65-е сутки роста 400-550 г сырой массы. В перерасчете на сухую биомассу это составляет 20-35 г на 1 л среды. Ростовой индекс 5-8.
На протяжении пассажа (50-60 суток) кривая митотической активности характеризуется одним подъемом митотической активности с пиком на 10-15-е сутки роста. Значение митотического индекса в максимуме - 1,4-2,5%.
Модальный класс формируют клетки с 22-30 хромосомами, частота клеток с этим числом составляет около 50%. Уровень аберраций хромосом в анафазе - около 6%, преобладающее количество среди которых составляют анафазы с мостами без фрагментов.
Культура формируется, в основном, небольшими клетками меристематического типа со сравнительно крупными ядрами, собранными в агрегаты. Размер таких клеток 25-65 мкм, их ядра имеют размеры 15-25 мкм. При старении культуры в ней возрастает количество элементов дифференциации, в частности количество трахеидных элементов может превышать 2,5%. В стандартных условиях выращивания культура не способна к органогенезу.
Основной вариант способа культивирования клеток Унгернии Виктора заключается в том, что эксплантаты фрагментов чешуи луковицы помещают на питательную среду следующего состава, мг/л:
NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub>
400-600
KNO<sub>3</sub>
1000-1200
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
200-400
MgSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
400-600
Ca(NO<sub>3</sub>)<sub>2</sub>×4H<sub>2</sub>O
800-1000
NH<sub>4</sub>H<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
500-700
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
90-110
KCI
60-80
KJ
0,8-0,9
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>×2H<sub>2</sub>O
0,2-0,3
CuSO<sub>4</sub>x5H<sub>2</sub>O
0,02-0,03
CoCl<sub>2</sub>×6H<sub>2</sub>O
0,02-0,03
MnSO<sub>4</sub>×5H<sub>2</sub>O
23-25
Н<sub>3</sub>ВО<sub>3</sub>
5-8
ZnSO<sub>4</sub>×4H<sub>2</sub>O
7-9
FeSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
27-28
Nа<sub>2</sub>ЭДТА
37-38
Тиамин
0,8-1,2
Пиридоксин
0,5-1,0
Никотиновая кислота
0,5-1,0
Глицин
1,5-2,5
Производные уксусной кислоты
0,5-2,2
Кинетин
0,8-1,2
Гидролизат казеина
50-500
Мезоинозин
20-100
Сахароза
50000-60000
Агар
6000-8000
рН до автоклавирования
5,8-6,2,
где в качестве производных уксусной кислоты используют 1-нафтилуксусную (НУК) или индолилуксусную (ИУК) кислоту, затем полученные луковички размножают на среде следующего состава, мг/л:
NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub>
400-600
KNO<sub>3</sub>
1000-1200
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
200-400
MgSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
400-600
Ca(NO<sub>3</sub>)<sub>2</sub>×4H<sub>2</sub>O
800-1000
NH<sub>4</sub>H<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
500-700
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
90-110
KCI
60-80
KJ
0,8-0,9
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>×2H<sub>2</sub>O
0,2-0,3
CuSO<sub>4</sub>×5H<sub>2</sub>O
0,02-0,03
CoCl<sub>2</sub>×6H<sub>2</sub>O
0,02-0,03
MnSO<sub>4</sub>×5H<sub>2</sub>O
23-25
Н<sub>3</sub>ВО<sub>3</sub>
5-8
ZnSO<sub>4</sub>×4H<sub>2</sub>O
7-9
FeSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
27-28
Na<sub>2</sub>ЭДTA
37-38
Тиамин
0,8-1,2
Пиридоксин
0,5-1,0
Никотиновая кислота
0,5-1,0
Глицин
1,5-2,5
Индолилуксусная кислота
1,8-2,2
Кинетин
0,01-0,03
Гидролизат казеина
40-60
Мезоинозин
15-30
Сахароза
50000-60000
Агар
6000-8000.
Дополнительный вариант, используемый в случае необходимости добиться ускоренного роста микролуковиц, заключается в том, что эксплантаты фрагментов чешуи луковицы помещают на питательную среду следующего состава, мг/л:
NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub>
400-600
KNO<sub>3</sub>
1000-1200
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
200-400
MgSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
400-600
Ca(NO<sub>3</sub>)<sub>2</sub>×4H<sub>2</sub>O
800-1000
NH<sub>4</sub>H<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
500-700
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
90-110
KCI
60-80
KJ
0,8-0,9
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>×2H<sub>2</sub>O
0,2-0,3
CuSO<sub>4</sub>×5H<sub>2</sub>O
0,02-0,03
CoCl<sub>2</sub>×6H<sub>2</sub>O
0,02-0,03
MnSO<sub>4</sub>×5H<sub>2</sub>O
23-25
Н<sub>3</sub>ВО<sub>3</sub>
5-8
ZnSO<sub>4</sub>×4H<sub>2</sub>O
7-9
FeSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
27-28
Nа<sub>2</sub>ЭДТА
37-38
Тиамин
0,8-1,2
Пиридоксин
0,5-1,0
Никотиновая кислота
0,5-1,0
Глицин
1,5-2,5
Производные уксусной кислоты
0,5-2,2
Кинетин
0,8-1,2
Гидролизат казеина
50-500
Мезоинозин
20-100
Сахароза
50000-60000
Агар
6000-8000
рН до автоклавирования
5,8-6,2,
где в качестве производных уксусной кислоты используют 1-нафтилуксусную (НУК) или индолилуксусную (ИУК) кислоту, а полученные микролуковицы выращивают на среде следующего состава, мг/л:
NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub>
400-600
KNO<sub>3</sub>
1000-1200
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
200-400
MgSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
400-600
Ca(NO<sub>3</sub>)<sub>2</sub>×4H<sub>2</sub>O
800-1000
NH<sub>4</sub>H<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
500-700
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
90-110
KCI
60-80
KJ
0,8-0,9
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>×2H<sub>2</sub>O
0,2-0,3
CuSO<sub>4</sub>×5H<sub>2</sub>O
0,02-0,03
CoCl<sub>2</sub>×6H<sub>2</sub>O
0,02-0,03
MnSO<sub>4</sub>×5H<sub>2</sub>O
23-25
Н<sub>3</sub>ВО<sub>3</sub>
5-8
ZnSO<sub>4</sub>×4H<sub>2</sub>O
7-9
FeSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
27-28
Nа<sub>2</sub>ЭДТА
37-38
Тиамин
0,8-1,2
Пиридоксин
0,5-1,0
Никотиновая кислота
0,5-1,0
Глицин
1,5-2,5
1-нафтилуксусная кислота
0,2-0,5
Кинетин
0.02-0,1
Гидролизат казеина
40-60
Мезоинозин
15-25
Сахароза
50000-60000
Агар
6000-8000.
Как показали проведенные эксперименты, от одной луковички за 1,5-2 года удается получить более 1 млн. посадочных микролуковиц, стадия которых соответствует природным луковицам 5-7-летнего возраста, способных продуцировать БАВ, обладающих широким диапазоном биологической активности, в частности перспективных для лечения заболеваний, вызываемых микобактериями.
Сущность заявляемой группы изобретений иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Луковицу Унгернии Виктора, находящуюся в стадии покоя, очищают от внешних сухих чешуи, после чего снимают дополнительно 1-2 слоя внешних живых чешуи, стерилизуют и в стерильных условиях разделяют на отдельные чешуи. Для дальнейшей работы используют базальную часть чешуи, для чего от каждой чешуи отрезают верхнюю треть, которую удаляют. Базальные части чешуи нарезают скальпелем на кусочки (фрагменты, экспланты) размером 0,5-1×0,5-1 см и высаживают на питательную среду. Используют питательную среду следующего состава, мг/л:
NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub>
500
КНО<sub>3</sub>
1100
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
300
MgSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
500
Ca(NO<sub>3</sub>)<sub>2</sub>×4H<sub>2</sub>O
900
NH<sub>4</sub>H<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
600
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
100
KCI
70
KJ
0,85
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>×2H<sub>2</sub>O
025
CuSO<sub>4</sub>×5H<sub>2</sub>O
0,024
CoCl<sub>2</sub>×6H<sub>2</sub>O
0,025
MnSO<sub>4</sub>×5H<sub>2</sub>O
24
Н<sub>3</sub>ВО<sub>3</sub>
6
ZnSO<sub>4</sub>×4H<sub>2</sub>O
8
FeSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
27,5
Nа<sub>2</sub>ЭДТА
37,5
Тиамин
1,0
Пиридоксин
0,8
Никотиновая кислота
0,8
Глицин
2,0
НУК
2,0
Кинетин
1,0
Гидролизат казеина
480
Мезоинозин
80
Сахароза
55000
Агар
7000
рН до автоклавирования
6,0.
Среду разливали в колбы и стерилизуют горячим паром 20 мин при 1 атм.
После высадки эксплантатов колбы помещали в термостатированное помещение при температуре 24-26°С при относительной влажности 79-80%. Через 45 суток из 425 просмотренных луковиц на 127 (30%) стали образовываться в среднем по 3,1 микролуковички.
Полученные регенераты для мультипликации переносят на среду следующего состава, мг/л:
NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub>
500
KNO<sub>3</sub>
1100
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
300
MgSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
500
Са(NO<sub>3</sub>)<sub>2</sub>×4H<sub>2</sub>O
900
NH<sub>4</sub>H<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
600
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
100
KCI
70
KJ
0,85
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>×2H<sub>2</sub>O
025
CuSO<sub>4</sub>×5H<sub>2</sub>O
0,024
CoCl<sub>2</sub>×6H<sub>2</sub>O
0,025
MnSO<sub>4</sub>×5H<sub>2</sub>O
24
Н<sub>3</sub>ВО<sub>3</sub>
6
ZnSO<sub>4</sub>×4H<sub>2</sub>O
8
FeSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
27,5
Nа<sub>2</sub>ЭДТА
37,5
Тиамин
1,0
Пиридоксин
0,8
Никотиновая кислота
0,8
Глицин
2,0
ИУК
2,0
Кинетин
0.02
Гидролизат казеина
50
Мезоинозин
20
Сахароза
55000
Агар
7000
Полученные результаты размножения приведены в таблице 1.
Пример 2. Выращивают экспланты в условиях примера 1 на среде следующего состава, мг/л:
NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub>
600
KNO<sub>3</sub>
1000
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
400
MgSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
400
Са(NO<sub>3</sub>)<sub>2</sub>×4H<sub>2</sub>O
1000
NH<sub>4</sub>H<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
500
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
110
KCI
60
KJ
0,9
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>×2H<sub>2</sub>O
0,2
CuSO<sub>4</sub>×5H<sub>2</sub>O
0,03
CoCl<sub>2</sub>×6H<sub>2</sub>O
0,02
MnSO<sub>4</sub>×5H<sub>2</sub>O
25
Н<sub>3</sub>ВО<sub>3</sub>
5
ZnSO<sub>4</sub>×4H<sub>2</sub>O
9
FeSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
27
Nа<sub>2</sub>ЭДТА
38
Тиамин
0,8
Пиридоксин
1,0
Никотиновая кислота
0,5
Глицин
2,5
НУК
2,2
Кинетин
0,8
Гидролизат казеина
500
Мезоинозин
70
Сахароза
60000
Агар
6000
рН до автоклавирования
5,8.
Среду разливали в колбы и стерилизуют горячим паром 25 мин при 1 атм.
После высадки эксплантатов колбы помещали в термостатированное помещение при температуре 24-26°С при относительной влажности 79-80%. Через 60 суток из 346 просмотренных луковиц на 88 (25%) стали образовываться в среднем по 2,9 микролуковички.
Полученные регенераты для мультипликации переносят на среду следующего состава, мг/л:
NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub>
600
KNO<sub>3</sub>
1000
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
400
MgSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
400
Са(NO<sub>3</sub>)<sub>2</sub>×4H<sub>2</sub>O
1000
NH<sub>4</sub>H<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
500
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
110
KCI
60
KJ
0,9
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>×2H<sub>2</sub>O
0,2
CuSO<sub>4</sub>×5H<sub>2</sub>O
0,03
CoCl<sub>2</sub>×6H<sub>2</sub>O
0,02
MnSO<sub>4</sub>×5H<sub>2</sub>O
25
Н<sub>3</sub>ВО<sub>3</sub>
5
ZnSO<sub>4</sub>×4H<sub>2</sub>O
9
FeSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
27
Nа<sub>2</sub>ЭДТА
38
Тиамин
0,8
Пиридоксин
1,0
Никотиновая кислота
0,5
Глицин
2,5
ИУК
2,2
Кинетин
0.03
Гидролизат казеина
60
Мезоинозин
15
Сахароза
60000
Агар
6000
Полученные результаты размножения приведены в таблице 1.
Пример 3. Выращивают эксплантаты в условиях примера 1 на среде следующего состава, мг/л:
NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub>
400
KNO<sub>3</sub>
1200
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
200
MgSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
600
Са(NO<sub>3</sub>)<sub>2</sub>×4H<sub>2</sub>O
800
NH<sub>4</sub>H<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
700
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
90
KCI
80
KJ
0,8
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>×2H<sub>2</sub>O
0,3
CuSO<sub>4</sub>×5H<sub>2</sub>O
0,02
CoCl<sub>2</sub>×6H<sub>2</sub>O
0,03
MnSO<sub>4</sub>×5H<sub>2</sub>O
23
Н<sub>3</sub>ВО<sub>3</sub>
8
ZnSO<sub>4</sub>×4H<sub>2</sub>O
7
FeSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
28
Na<sub>2</sub>ЭДTA
37
Тиамин
1,2
Пиридоксин
0,5
Никотиновая кислота
1,0
Глицин
1,5
ИУК
1,8
Кинетин
1,2
Гидролизат казеина
450
Мезоинозин
100
Сахароза
50000
Агар
8000
рН до автоклавирования
6,2.
Среду разливали в колбы и стерилизуют горячим паром 30 мин при 1 атм.
После высадки эксплантатов колбы помещали в термостатированное помещение при температуре 24-26°С при относительной влажности 79-80%. Через 60 суток из 450 просмотренных луковиц на 200 (45%) стали образовываться в среднем по 2,0 микролуковички.
Полученные регенераты для мультипликации переносят на среду следующего состава, мг/л:
NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub>
400
KNO<sub>3</sub>
1200
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
200
MgSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
600
Са(NO<sub>3</sub>)<sub>2</sub>×4H<sub>2</sub>O
800
NH<sub>4</sub>H<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
700
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
90
KCI
80
KJ
0,8
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>×2H<sub>2</sub>O
0,3
CuSO<sub>4</sub>×5H<sub>2</sub>O
0,02
CoCl<sub>2</sub>×6H<sub>2</sub>O
0,03
MnSO<sub>4</sub>×5H<sub>2</sub>O
23
Н<sub>3</sub>ВО<sub>3</sub>
8
ZnSO<sub>4</sub>×4H<sub>2</sub>O
7
FeSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
28
Nа<sub>2</sub>ЭДТА
37
Тиамин
1,2
Пиридоксин
0,5
Никотиновая кислота
1,0
Глицин
1,5
ИУК
1,8
Кинетин
0,01
Гидролизат казеина
40
Мезоинозин
30
Сахароза
50000
Агар
8000
Полученные результаты размножения приведены в таблице 1.
Пример 4. Готовили питательную среду по примеру 1, в которой количество 1-нафтилуксусной кислоты уменьшали до 0,5 мг/л, кинетина - до 0,02 мг/л, мезоинозита - до 20 мг/л, гидролизата казеина - до 50 мг/л (среда 5СЗН). При этих же условиях выращивания на изолированных фрагментах чешуи через 60 суток культивирования образуются микролуковички. Для ускоренного развития отдельных луковичек их переносят на среду 5СЗН (состав среды приведен в примере 2), в которой количество НУК уменьшают до 0,2 мг/л. Микролуковицы помещали на среду следующего состава, мг/л:
NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub>
500
KNO<sub>3</sub>
1100
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
300
MgSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
500
Ca(NO<sub>3</sub>)<sub>2</sub>×4H<sub>2</sub>O
900
NH<sub>4</sub>H<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
600
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
100
KCI
70
KJ
0,85
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>×2H<sub>2</sub>O
0,25
CuSO<sub>4</sub>×5H<sub>2</sub>O
0,02
CoCl<sub>2</sub>×6H<sub>2</sub>O
0,03
MnSO<sub>4</sub>×5H<sub>2</sub>O
24
Н<sub>3</sub>ВО<sub>3</sub>
7
ZnSO<sub>4</sub>×4H<sub>2</sub>O
8
FeSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
27,5
Nа<sub>2</sub>ЭДТА
37,5
Тиамин
1,0
Пиридоксин
0,8
Никотиновая кислота
0,8
Глицин
2,0
1-нафтилуксусная кислота
0,4
Кинетин
0.5
Гидролизат казеина
50
Мезоинозин
20
Сахароза
55000
Агар
7000.
Пробирки с высаженными луковичками ставят в термостатированные условия (22-26°С) с 14-16-часовым световым днем и с освещением 1000-2500 люкс. Через 20-40 суток луковички формируют корни и листочки и растут, а через 50-60 суток переходят в состояние покоя, при этом листочек засыхает. При перенесении спящей луковички на свежую среду она снова формирует 1-2 листочка (в зависимости от возраста луковицы) и весь цикл повторяется.
Пример 5. В питательной среде по примеру 4 вместо НУК вносили 2 мг/л индолилуксусной кислоты (среда 5СЗИ). При тех же условиях выращивания через 60 суток культивирования на около 29% эксплантов образуются микролуковички, на каждом из таких эксплантов образуется в среднем по 4 микролуковички.
полученные микролуковицы выращивают на среде следующего состава, мг/л:
NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub>
600
KNO<sub>3</sub>
1000
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
400
MgSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
400
Ca(NO<sub>3</sub>)<sub>2</sub>×4H<sub>2</sub>O
1000
NH<sub>4</sub>H<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
500
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
110
KCI
60
KJ
0,9
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>×2H<sub>2</sub>O
0,2
CuSO<sub>4</sub>×3Н<sub>2</sub>О
0,03
CoCl<sub>2</sub>×6H<sub>2</sub>O
0,02
MnSO<sub>4</sub>×5H<sub>2</sub>O
25
Н<sub>3</sub>ВО<sub>3</sub>
5
ZnSO<sub>4</sub>×4H<sub>2</sub>O
9
FeSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
27
Nа<sub>2</sub>ЭДТА
38
Тиамин
0,8
Пиридоксин
1,0
Никотиновая кислота
0,5
Глицин
2,5
1-нафтилуксусная кислота
0,2
Кинетин
0,1
Гидролизат казеина
40
Мезоинозин
25
Сахароза
50000
Агар
8000.
Пробирки с высаженными луковичками ставят в термостатированные условия (22-26°С) с 14-16-часовым световым днем и с освещением 1000-2500 люкс. Через 30-40 суток луковички формируют корни и листочки и растут, а через 50-60 суток переходят в состояние покоя, при этом листочек засыхает.
Пример 6. Культивирование эксплантов проводилось в условиях примера 5. Затем полученные микролуковицы выращивают на среде следующего состава, мг/л:
NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub>
400
KNO<sub>3</sub>
1200
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
200
MgSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
600
Ca(NO<sub>3</sub>)<sub>2</sub>×4Н<sub>2</sub>О
800
NH<sub>4</sub>H<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
700
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
90
KCI
80
KJ
0,8
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>×2H<sub>2</sub>O
0,3
CuSO<sub>4</sub>×5H<sub>2</sub>O
0,02
CoCl<sub>2</sub>×6H<sub>2</sub>O
0,03
MnSO<sub>4</sub>×5H<sub>2</sub>O
23
Н<sub>3</sub>ВО<sub>3</sub>
8
ZnSO<sub>4</sub>×4H<sub>2</sub>O
7
FeSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
28
Nа<sub>2</sub>ЭДТА
37
Тиамин
1,2
Пиридоксин
0,5
Никотиновая кислота
1,0
Глицин
1,5
1-нафтилуксусная кислота
0,5
Кинетин
0.02
Гидролизат казеина
60
Мезоинозин
15
Сахароза
60000
Агар
6000.
Пробирки с высаженными луковичками ставят в термостатированные условия (22-26°С) с 14-16-часовым световым днем и с освещением 1000-2500 люкс. Через 30-40 суток луковички формируют корни и листочки и растут, а через 50-55 суток переходят в состояние покоя, при этом листочек засыхает.
Пример 7. Сопоставляли эффективность мультипликации луковичек, полученных по примерам 1-3, и клеточного материала штаммов аналогов на среде, приготовленной по примеру 1.
Для этого каждую луковичку-регенерант отделяли от эксплантата, на котором она образовалась, и переносили на среду 5СЗИ. Полученные результаты приведены в таблице 1.
Таблица 1
Зависимость эффективности культивирования Унгернии Виктора от технологии получения исходного материала
Исходный материал
Изучено эксплантов, шт.
Экспланты, регенерирующие микролуковицы, %
Среднее количество микролуковиц на регенерирующий
Пример 1 UV -22
190
57,5±4,7
5,9
Пример 2 UV -22
108
47,8±4,3
4,8
Пример 3 UV -22
127
43,1±4,2
4,9
Пример 4 UV -22
225
40,1±2,2
4,0
Штамм UV -2
175
21,2±3,7
4,3
Штамм UV -12
113
37,5±4,7
3,9
Полученные данные свидетельствуют о том, что заявляемая технология позволяет получать от отдельной луковички через 40 суток 3-6 и больше новых микролуковичек. При необходимости дальнейшего размножения образованный пучок луковичек разделяют на отдельные луковицы и снова переносят на ту же среду. Способность регенерированных луковичек к микроразмножению (мультипликации) сохраняется самое малое на протяжении 5 лет.
Пример 8. Полученный по примерам 1-3 клеточный материал измельчали и экстрагировали 40% водно-спиртовым раствором, после чего проводили испытания биологической активности экстрагированных БАВ.
Оценку эффективности заявляемого средства проводили на 140 белых беспородных мышах-самцах с генерализованным туберкулезом, вызванным введением в боковую хвостовую вену культуры М. Bovis 8 в дозе 0,1 мг в 2 мл физиологического раствора.
Мышей делили на 6 групп по 20 животных:
1 группа - контроль - мыши, не получавших препарат;
2 группа - контроль - мыши, получавшие рифампицин (Рф) перорально в дозе 10 мг/кг;
3 группа - контроль - мыши, получавшие БАД «Влаирин» перорально 3 раза в день в виде раствора в дозе 2 капли на мышь;
4-6 группы - мыши, получавшие заявляемое средство по примерам 1-3,3 раза в день перорально в виде раствора в дозе 2 капли на мышь;
7 группа - мыши, получавшие ежедневно рифампицин перорально в дозе 10 мг/кг, и средство, полученное по примеру 1, перорально в виде раствора в дозе 4 капли на мышь.
Эффективность лечения туберкулезного процесса оценивали по результатам: динамики массы тела мышей; выживаемости животных; индекса поражения легких; высеваемости микобактерий из селезенки. Индекс поражения легких высчитывали в соответствии с количеством и выраженностью очагов специфического воспаления, выявляемых при макроскопическом осмотре. При этом единичные субмилиарные очаги оценивались в 0,5 балла; многочисленные (не более 20) - в 1,5 балла; единичные милиарные - в 1,75 балла; многочисленные сливающиеся субмиллиарные единичные миллиарные - в 2,0 балла, миллиарные - (не более 10) и в 2,25 балла, многочисленные миллиарные сливающиеся - 2,75 балла, наличие мелких казеозных некротических фокусов - 3,0 балла; обширный казеоз - 4,0 балла; сплошное поражение легких - 5,0 баллов. В случаях серозного пропитывания ткани легких к вычисленному индексу поражения прибавлялись от 0,25 до 1,0 балла в зависимости от площади поражения.
Для бактериологического исследования проводился дозированный посев гомогената ткани селезенки на плотную питательную среду Левенштейна-Йенсена. Массивность роста микобактерий туберкулеза (МБТ) оценивали через три недели инкубации посевов селезенки (37°С) и выражали в колониеобразующих единицах - КОЕ. При этом использовалась следующая методика подсчета колоний: при регистрации до 50 колоний - приводили их полное число; при росте на 1/3 пробирки - принимали число колоний за 100 КОЕ; при росте на 2/3 пробирки - за 200 КОЕ; при сплошном росте колоний - за 300 КОЕ.
Статистическую обработку полученных результатов проводили по параметрическому тесту Стьюдента-Фишера и по непараметрическому тесту Вилкинсона-Манна-Уитни с использованием критерия U. Сравнительные данные об эффективности разных препаратов приведены в таблице 2.
Таблица 2
Сопоставление эффективности воздействия препаратов на защиту организма от воздействия микобактерий туберкулеза
Группа
Препарат
К-во мышей
Выживаемость, %
Прирост массы тела, %
Индекс поражения легких
Высеваемость МБТ из селезенки, КОЕ
1
Нет
20
20,0
-2,4
3,1±0.2
300
2
РФ
20
90,0
10,6
2,3±0.2
46,1±4.2
3
Влаирин
20
60,0
7,8
2,9±0.1
100*
4
Пр.1
20
75,0**
10,0*
2,7±0.1*
100*
5
Пр.2
20
65,0*
8,7*
2,9±0.1
100*
6
Пр.3
20
65,0*
9,2*
2,9±0.1
100*
7
РФ+прим.1
20
100,0
33,8**
1,9±0.1**
21,9±6.1**
Результаты исследований свидетельствуют о достаточно высокой эффективности заявляемого средства, сопоставимой с использованием рифампицина, причем более высокие результаты были получены при использовании средства по примеру 1 на фоне стандартной терапии с использованием рифампицина.
Пример 9. Клиническое исследование препарата, полученного по примеру 1 (экстракт УВ), осуществлялось на базе I легочного отделения областного туберкулезного диспансера г.Астрахани.
Было обследовано 20 больных (мужчины в возрасте от 19-50 лет) туберкулезом легких. Среди обследованных - 2 больных диссеминированным, 6 - инфильтративным туберкулезом, 1 - плевритом туберкулезной этиологии, у 1 больного диагностирована туберкулема. Из них 3 являлись бактериовыделителями; у 5 отмечалась деструкция легочной ткани. Сопутствующей патологии у больных не выявлено.
Для оценки эффективности препарата были выделены две группы, идентичные по половозрастному составу, клиническим формам и фазам течения специфического процесса:
1 группа (контроль) - 10 больных, получавших стандартную комплексную терапию;
2 группа - 10 больных, в комплексную терапию которых был включен препарат по примеру 1.
Стандартная комплексная терапия, обусловленная характером специфического процесса, включала противотуберкулезные препараты (изониазид, рифампицин, пиразинамид, этамбутол, стрептомицин), гепатопротекторы (ЛИВ-52), патогенетические мероприятия (тиосульфат натрия, аутогемоновокаиновая терапия, преднизолон, витаминотерапия).
Больным опытной группы на фоне стандартной терапии давали препарат Унгернии по примеру 1 по 1 капле на 20 кг веса тела на 100 мл воды после приема пищи 3 раза в день.
Перед применением препарата и в динамике проводились клинико-рентгенологическое обследование, общий анализ крови, биохимический анализ крови (билирубин, АЛТ, сиаловая и тимоловая пробы, СРБ), определялась иммунограмма, исследовалась сыворотка крови методом клиновидной дегидратации и поляризационной микроскопии с последующим анализом полученных данных. Критериями оценки эффективности являлись показатели клинических, лабораторных и рентгенологических методов исследования, анализируемые до лечения и в динамике (в течение 2,5 месяцев). Результаты исследования представлены в табл.3-6.
Таблица 3
Биохимические показатели больных туберкулезом легких, получивших лечение экстрактом УВ и стандартными способами до начала лечении и в динамике.
Показатели
Опытная группа (п=10)
Контрольная группа (п=10)
до
+ЛИВ 2 нед.
1 мес.
2 мес.
до
1 мес.
2 мес.
Трансамилазы (АЛТ, ACT)
снижено
-
1
3
2
-
2
1
повышено
4
6
2
-
5
7
5
норма
6
3
1
8
5
1
4
Тимоловая проба
снижено
-
1
-
-
-
1
1
повышено
4
5
1
1
7
4
3
норма
6
4
9
9
3
5
6
Сиаловая проба
снижено
-
-
2
-
-
-
-
повышено
10
8
3
1
8
6
4
норма
-
2.
5
9
2
4
6
«С» реактив
отрицат.
6
8
10
10
5
7
10
ный
положит.
4
2
-
-
5
3
-
Таблица 4
Показатели общего анализа крови больных туберкулезом легких, получивших лечение экстрактом УВ и стандартными способами до начала лечения и в динамике.
Показатели
Опытная группа (п=10)
Контрольная группа (п=10)
до
1 мес.
2 мес.
до
1 мес.
2 мес.
Гемоглобин
норма 6
4
5
5
1
6
повышено
3
5
-
3
1
снижено 4
1
-
5
S
2
Лейкоциты
повышено 7
3
6
8
6
4
норма 2
2
-
2
1
1
снижено 1
5
4
-
J
5
Лимфоциты
норма 6
1
6
6
:1
''
повышено
8
J
:1
6
3
снижено 4
-
1
1
2
2
Моноциты
норма 9
9
8
10
7
4
повышено 1
1
2
-
3
4
снижено
-
-
-
4
2
СОЭ
норма 2
2
3
3
2
1
повышено 8
-
1
7
1
3
снижено
8
6
-
7
6
Таблица 5
Показатели иммунограмм больных туберкулезом легких, получивших лечение экстрактом УВ и стандартными способами до начала лечения и в динамике.
Показатели
Опытная группа (п=10)
Контрольная группа (п=10)
до
1 мес.
2 мес.
до
1 мес.
2 мес.
Т-лимфоциты отн.%
снижено
2
3
2
1
2
2
повышено
8
6
7
5
4
3
норма
-
1
1
4
4
5
р-лимфоциты отн.%
снижено
3
2
1
2
2
1
повышено
6
8
2
4
3
4
норма
1
-
8
4
5
5
Процент фагоцитоза, %
снижено
3
5
-
8
6
5
повышено
-
1
5
-
-
-
норма
7
4
1
2
4
5
Фагоцитарное число
снижено
-
8
4
3
3
4
повышено
3
1
8
-
-
1
норма
7
1
1
7
7
5
Количество активных фагоцитов
снижено
2
6
1
4
5
5
повышено
-
3
6
1
1
2
норма
8
1
3
5
4
3
IgM
снижено
4
2
1
6
5
6
повышено
1
8
2
-
1
2
норма
5
-
8
4
4
2
IgG
снижено
7
4
2
1
2
2
повышено
2
3
4
1
-
1
норма
1
3
4
8
8
7
IgA
снижено
22
7
5
5
5
4
повышено
5
2
2
4
3
4
норма
3
1
3
4
2
2
Таблица 6
Показатели структурной организации сыворотки крови больных туберкулезом легких, получивших лечение экстрактом УВ и стандартными способами до начала лечения и в динамике.
Сроки лечения
Группы
Типы фасций
Патологические элементы
Упоряд
Депрес
Реакт
бл
скл
жг
яз
лис.
сер.
Пиг
2-ая фац.
До лечения
Контр. группа
5
4
1
8
5
2
2
1
-
-
1
Опыта. группа
3
6
1
6
3
-
2
2
3
1
3
2 недели
Контр. группа
5
4
1
8
6
2
2
1
2
-
2
Опыта. группа
4
6
-
8
6
2
4
3
2
4
2
4 недели
Контр. группа
5
5
-
7
5
2
3
1
2
1
2
Опыта. группа
3
7
-
9
6
4
2
3
3
3
2
6 недель
Контр. группа
4
6
-
7
5
1
2
1
2
-
1
Опыта. группа
3
7
-
7
4
3
2
4
1
4
1
8 недель
Контр. группа
4
6
-
7
4
-
2
2
1
-
1
Опыта. группа
4
6
-
7
4
1
-
4
2
2
2
10 недель
Контр. группа
5
5
-
6
3
1
2
2
1
-
-
Опыта. группа
6
4
-
5
4
-
-
4
1
1
1
У больных отмечалась хорошая переносимость препарата, побочных явлений и аллергических реакций на фоне ее применения зарегистрировано не было; у пациентов опытной группы наблюдалась более значимая по сравнению с контролем положительная динамика анализируемых клинических показателей (повышение аппетита, снижение количества влажных и сухих хрипов, исчезновение тяжести в правом подреберье), исчезновение признаков интоксикации (слабость, потливость, субфебрильная температура), прибавление в весе за более короткий срок в среднем на 1,5 кг, а также улучшение показателей лабораторных анализов (нормализация печеночных проб и уровня трансаминаз, снижение СОЭ, повышение уровня гемоглобина и количества лимфоцитов в периферической крови).
По данным иммунограмм, отмечено нормализация абсолютных и относительных показателей В- и Т-лимфоцитов, но снижение показателей процента фагоцитоза, фагоцитарного числа и количества активных фагоцитов, повышение уровня IgM и IgG, снижение IgA.
Изучение структурной организации сыворотки крови методом клиновидной дегидратации показало повышение уровня структурирования и упорядочения основных элементов фации в опытной группе в более ранние сроки по сравнению с контролем.
Пример 10. Во ФГУ НИИ по изучению лепры Росздрава в течение 2006 года проводились клинические исследования по возможности использования экстракта каллусной ткани, полученной по примеру 1, в комплексной терапии больных лепрой. Под наблюдением находилось 20 больных лепрой в возрасте от 46 до 72 лет, из них 12 женщин, 8 мужчин.
Больные были разделены на две группы по 10 человек (опытную и контрольную), сопоставимых по возрасту, полу и клиническим проявлениям. В опытной группе на фоне стандартной комплексной терапии назначался экстракт по примеру 1 по 1 капле на 20 кг веса массы тела в разведении на 100 мл воды после приема пищи три раза в д., в контрольной - "карсил".
Стандартная химиотерапия включала применение комбинированной противолепрозной химиотерапии по схемам ВОЗ, антигистаминных, сосудистых, витаминных препаратов. Терапия проводилась в течение трех месяцев под клинико-лабораторным контролем, включавшим динамическое клиническое наблюдение, исследование гемограммы, печеночных проб, белковых фракций и структурной организации сыворотки крови, УЗИ печени.
За период наблюдения нами была отмечена хорошая переносимость исследуемого препарата, побочных явлений и аллергических реакций на фоне его применения зарегистрировано не было. Отмечено улучшение общего состояния (сна, аппетита, общего тонуса), уменьшение или исчезновение субъективных жалоб на чувство тяжести в правом подреберье, горечи во рту. Отмечено улучшение ряда лабораторных показателей (таблицы 7).
Таблица 7
Динамика показателей гемограммы больных лепрой, получавших экстракт УВ
Показатели
Опытная группа
До лечения
После лечения
Гемоглобин (г/л)
121,41±3,62
130,82±4,15
Лейкоциты (10<sup>9</sup>/л)
4,23±0,21
6,51±0,34
Лимфоциты (%)
21,42±3,63
31,22±1,91
Моноциты (%)
2,12±0,34
4,44±0,15
Скорость оседания эритроцитов (мм/ч)
11,45±0,18
9,53±0,21
Общий белок (г/л)
83,02±3,15
82,19±2,95
Альбумин (г/л)
39,91±2,78
44,61±3,25
Билирубин общий (мкмоль/л)
11,16±0,41
12,31±0,12
Билирубин конъюгированный (мкмоль/л)
2,78±0,22
2,84±0,61
Креатинин (мкмоль/л)
83,88±4,17
82,11±3,64
Мочевина (ммоль/л)
6,48±0,31
6,56±0,61
Остаточный азот (ммоль/л)
18,64±1,12
17,87±2,11
Тимоловая проба (Ед)
4,11±0,52
3,56±0,45
АсАТ (мкмоль/л)
0,65±0,01
0,51±0,22
АлАТ (мкмоль/л)
0,45±0,04
0,53±0,18
Как следует из приведенных таблиц, на фоне применения экстракта УВ происходило достоверное уменьшение СОЭ (р<0,05), тенденция к уменьшению тимоловой пробы, уровня трансаминаз, происходило уменьшение воспалительных явлений, стабилизация дегенеративных изменений.
Изучение структурной организации сыворотки крови методом клиновидной дегидратации показало повышение уровня структурирования и упорядочения основных элементов фации в опытной группе больных, что свидетельствовало об гармонизации адаптивных реакций организма. В контрольной группе больных подобной положительной динамики отмечено не было.
Анализ полученных результатов показал, что экстракт Унгернии Виктора эффективен для использования в курсе лечения заболеваний, вызванных микобактериями. Причем наиболее эффективен экстракт, полученный из каллуса штамма UV-22. Предложенная технология культивирования наряду с продуцированием более эффективных БАВ позволяет существенно сократить сроки культивирования луковиц Унгернии и решить проблемы их размножения.