Гибридные белки и белковые конъюгаты на основе белка теплового шока-70 (БТШ70) и способы их применения (варианты)
HYBRID PROTEINS AND PROTEIN CONJUGATES BASED ON HEAT SHOCK PROTEIN-70 (HSP70) AND METHODS FOR USE THEREOF (VERSIONS)

1. РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка составлена согласно Договору о патентной кооперации и претендует на приоритет предварительной заявки на выдачу патента США №61/576,288, поданной 15 декабря 2011 г., которая полностью включена в данную заявку посредством ссылок.
2. ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Белок теплового шока-70 (БТШ70) является одним из белков, относящихся к общему классу белков теплового шока (БТШ), участвует в целом ряде процессов, в частности, в ренатурации денатурированных белков, активации ферментных комплексов и транспорте белков. Кроме того, БТШ способствует поддержанию целостности клеток в нормальных и патологических условиях (Vigh et al. 1997). Установлено, что повреждения тканей, возникающие в результате операций, травм или болезней, вызывают индукцию БТШ. Индуцибельная форма белка семейства БТШ70 - БТШ72 была обнаружена как в клетках различных органов, так и во внеклеточном пространстве, в том числе в скелетных мышцах в ответ на физические нагрузки.
Взаимосвязанные процессы восстановления нативной структуры белков и выживания клеток при экстремальных воздействиях являются основными механизмами действия молекулярных шаперонов (БТШ), которые играют ключевую роль в процессах ремоделирования клеток при интенсивных физических нагрузках (Morton et al. 2009; Whitman et al. 2008). Защитные свойства БТШ используют для лечения различных расстройств и заболеваний: при диабете; заживлении ран (Atalay et al. Curr. Pep. Prot. Sc. 2009; 10:85); раке (Ciocca et al., Stress Cell Chap. 2005; 10:86; Guzhova et al. Tsitologia 2005, 47:187); сепсисе (McConnell et al; J. Immun. 2011; 186:3718; Kustanova et al. Cell Stress Chap. 2006; 11:276); поражениях миокарда (Knowlton et al. Am. J. Physiol. Heart Cir. Physiol. 2001; 280:H455); повреждениях и дегенерации мышц; восстановлении после физических нагрузок (Morton et al. Sports Med. 2009; 39(8):643); нейродегенеративных заболеваниях, в том числе болезнях Паркинсона, Альцгеймера, Хантингтона, боковом амиотрофическом склерозе (Turturici et al., Biochem. Res. Int. 2011); при спинальном параличе (Reddy et al. Neurosurg. Focus 2008, 25(5): 1); черепно-мозговых травмах; инсульте; нейродегенеративных заболеваниях глаз, в том числе глаукоме и макулодистрофии (Levin, Surv. Ophthalm. 2003; 48:S21); эпилепсии (Ekimova et al. J. Neurochem. 2010; 115:1035).
Установлено, что у пациентов с синдромом хронической усталости (СХУ) при физических нагрузках происходит активация окислительного стресса. У этих больных значительно снижены (по сравнению группой контроля) как исходный уровень БТШ70, так и его уровень после интенсивных физических нагрузок (Jammes et al. 2009). С этих позиций, индуцированный БТШ70 играет ключевую роль в механизме действия таких фитоадаптогенов, как родиола розовая и элеутерококк колючий, которые повышают внимание, когнитивные функции, умственную работоспособность при усталости и СХУ, а также показатели выносливости. БТШ70 подавляет экспрессию NO-синтазы II и изменяет уровень циркулирующего кортизола путем прямого воздействия на рецепторы глюкокортикоидов и JNK-киназный каскад. Следовательно, профилактика NO-обусловленного стресса и связанного с ним снижения синтеза АТФ повышает работоспособность и выносливость (Panossian et al. 2009).
В настоящее время известны способы применения БТШ70 для лечения многих БТШ-зависимых расстройств и заболеваний, в частности, в ряде патентов и опубликованных заявок приводятся данные, свидетельствующие об эффективности использования БТШ70 для восстановления после травм (Slepian, US Patent 5,914,345; Srivastava, US Patent Application US 2003/0012793). Кроме того, имеются патенты и заявки, касающиеся лекарственных средств, активирующих синтез БТШ70, в частности, таких, как геранилгеранилацетон, который защищает пациентов от последствий ишемических реперфузионных повреждений (Takahashi N, US Patent Application 6,846,845 B2).
Несмотря на то, что указанные исследования показали перспективность применения БТШ70, известные способы контроля синтеза БТШ70 in vivo не удовлетворяют потребностям в данной области. Кроме того, использование экзогенного БТШ70 не получило широкого распространения по причине его низкой стабильности. Таким образом, существует острая потребность в разработке новых способов лечения, отвечающих текущим запросам.
3. СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к новым способам терапии, которые используют БТШ70 для лечения БТШ70-зависимых расстройств или заболеваний путем применения экзогенного БТШ70 в виде гибридного белка на основе БТШ70. В связи с этим, данное изобретение представляет гибридный белок и белковые конъюгаты на основе БТШ70, а также лекарственные формы на их основе в качестве средств, обладающих терапевтической эффективностью в отношении БТШ70-зависимых расстройств или заболеваний. Кроме того, настоящее изобретение включает способы применения указанного гибридного белка на основе БТШ70 для лечения БТШ70-зависимых расстройств или заболеваний таких, как например, повреждения мышц, обусловленные интенсивными физическими нагрузками, в частности без анаболических эффектов; инсульт; фиброз печени; меланома, а также для повышения работоспособности (физической и умственной), в частности повышения выносливости.
При этом, в одном из вариантов изобретение представляет гибридный белок на основе БТШ70, обладающий пролонгированными усиленными свойствами БТШ70, представленный последовательностью SEQ ID NO: 1 (далее по тексту также - «БТШ70-Fc»), состоящей из Fc-фрагмента человеческого иммуноглобулина G1 (IgG1) (далее по тексту также - «Fc-домен»), сшитого посредством пептидного линкера с сайтом расщепления протеазой вируса табачной мозаики (далее по тексту также - «линкерный фрагмент», «линкерный домен») с N-концом человеческого БТШ70 (далее по тексту также - «БТШ70-домен»).
124
125
131
124
125
131
В другом варианте изобретение представляет гибридный белок на основе БТШ70, обладающий усиленной противоопухолевой активностью, состоящий из Fc-фрагмента человеческого IgG1, сшитого посредством пептидного линкера с сайтом расщепления протеазой вируса табачной мозаики с N-концом человеческого БТШ70, представленный последовательностью SEQ ID NO: 1, в котором водород замещен на радиоактивный изотоп, выбранный из группы: I, I, I, по крайней мере, в одном из следующих положений: 3 - фенольного кольца остатков тирозина, 5 - фенольного кольца остатков тирозина, 1 - имидазольного кольца остатков гистидина, 2 - имидазольного кольца остатков гистидина, 5 - имидазольного кольца остатков гистидина (далее по тексту, соответственно, - «конъюгаты гибридного белка на основе БТШ70 с радиоактивными изотопами», «конъюгат БТШ70-Fc с радиоактивным изотопом», «I-БТШ70-Fc», «I-БТШ70-Fc», «I-БТШ70-Fc»).
Еще в одном варианте изобретение представляет фармацевтическую композицию для повышения работоспособности при интенсивных физических нагрузках или лечения БТШ-зависимого расстройства или заболевания, выбранного из группы, состоящей из повреждений мышц, обусловленных интенсивными физическими нагрузками, инсульта, фиброза печени, меланомы, содержащую эффективное количество БТШ70-Fc и фармацевтически приемлемый носитель.
124
125
131
В другом варианте изобретение представляет фармацевтическую композицию для лечения меланомы, содержащую эффективное количество конъюгата БТШ70-Fc с радиоактивным изотопом, выбранного из группы: I-БТШ70-Fc, I-БТШ70-Fc, I-БТШ70-Fc и фармацевтически приемлемый носитель.
В следующем из вариантов изобретение предлагает способ повышения работоспособности при интенсивных физических нагрузках, включающий введение млекопитающему БТШ70-Fc в эффективном количестве.
Еще в одном варианте изобретение представляет способ лечения БТШ70-зависимого расстройства или заболевания, выбранного из группы, состоящей из повреждений мышц, обусловленных интенсивными физическими нагрузками, инсульта, фиброза печени, меланомы, включающий введение субъекту БТШ70-Fc в терапевтически эффективном количестве.
124
125
131
В дополнение к предыдущим вариантам изобретение представляет способ радиоиммунотерапии меланомы, включающий введение субъекту конъюгата БТШ70-Fc с радиоактивным изотопом, выбранного из группы: I-БТШ70-Fc, I-БТШ70-Fc, I-БТШ70-Fc в терапевтически эффективном количестве.
Во всех представленных в рамках изобретения вариантах способов в качестве субъекта воздействия БТШ70-Fc или его конъюгатами с радиоактивным изотопом выступает млекопитающее, а в качестве млекопитающего выступает человек.
4. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАЦИЙ
В приложении приведены: последовательность аминокислот БТШ70-Fc, характеризуемая SEQ ID NO: 1, и последовательность аминокислот Fc-фрагмента человеческого IgG1, характеризуемая SEQ ID NO: 2.
На фиг. 1 показано изменение физической работоспособности крыс (по показателю «продолжительность бега на тредбане «до отказа») под влиянием БТШ70 (50 и 100 мкг) в сравнении с результатами первой нагрузочной пробы.
На фиг. 2 представлена электронная микроскопия (х15000) мышцы животного группы контроля. Четко видны повреждение и отек мышечных волокон, капиллярный отек, как проявления рабдомиолиза. Активированный подоцит находится в верхнем левом углу.
На фиг. 3 - электронная микроскопия (х15000) мышцы животного, получавшего препарат (БТШ70, 100 мкг). На изображении видна активированная сателлитная клетка с большим ядром, богатым эухроматином.
На фиг. 4 - электронная микроскопия (х15000) мышцы животного, получавшего препарат (БТШ70, 100 мкг). На изображении видна активированная сателлитная клетка с многочисленными митохондриями.
На фиг. 5 - оптическая микроскопия (х400) мышцы животного, получавшего препарат (БТШ70, 100 мкг). Четко видны участки активации неоангиогенеза и повреждение единичных мышечных волокон.
На фиг. 6 - оптическая микроскопия (х400) мышцы животного, получавшего препарат (БТШ70, 100 мкг). Четко видны зоны неоангиогенеза с большими активированными лимфоцитами и повреждением единичных мышечных волокон.
На фиг. 7 представлена электронная микроскопия (х15000) мышцы пациента до применения препарата с БТШ70. Повреждение мышцы проявляется в расслоении и деградации мышечных волокон, формировании скоплений гликогена между мышечными волокнами.
На фиг. 8 - электронная микроскопия (х15000) мышцы пациента после применения препарата с БТШ70. Регенерация мышцы проявляется в нормализации структуры мышечных волокон и увеличении активности ядер миоцитов.
На фиг. 9 представлены результаты электрофореза БТШ70-Fc в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ-электрофорез, SDS-PAGE).
На фиг. 10 представлены результаты определения АТФ-азной активности БТШ70-Fc. Указанный белок в возрастающем количестве (от 0,001 до 1 мкг) добавляли в реакционную смесь. Через 45 мин реакцию останавливали и определяли количество неорганического фосфата (Pi) в реакционной смеси с помощью реактива малахитового зеленого.
На фиг. 11 показано изменение физической работоспособности крыс (по показателю «продолжительность бега на тредбане «до отказа») под влиянием БТШ70 (100 мкг) и БТШ70-Fc (100 мкг) в сравнении с результатами первой нагрузочной пробы.
5. ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Несмотря на имеющиеся сведения, что гибридные белки в редких случаях усиливали действие терапевтического средства, это ни в коем случае не может считаться очевидным, более того, невозможно гарантировать, что гибридный белок вообще будет обладать биологической активностью. Хотя выбор структуры гибридного белка является существенным, имеется множество дополнительных непрогнозируемых факторов, влияющих на возможность получения биологически активных гибридных белков. Это особенно актуально для случаев, когда присоединение какого-либо фрагмента к молекуле белка происходит в тех областях, в отношении которых известно, что они оказывают значимое влияние на активность белка, например областей, задействованных в процессах «сворачивания» или «связывания». В этой связи, наличие биологической активности у описываемых в настоящем изобретении гибридных белков на основе БТШ70, когда присоединение происходит на N-концевых и С-концевых участках молекулы БТШ70, является неожиданным, учитывая известность того, что N-концевая область молекулы БТШ70 связывает АТФ и играет важную роль в процессах восстановления нарушенной конформации белков (рефолдинге), а С-концевая область молекулы БТШ70 участвует в связывании пептидов и подавлении апоптоза.
Настоящее изобретение представляет новый гибридный белок на основе БТШ70 (БТШ70-Fc) и его конъюгаты с радиоактивными изотопами, обладающие повышенной биологической активностью, предназначенные для повышения работоспособности при интенсивных физических нагрузках, а также для лечения БТШ70-зависимых расстройств или заболеваний. В частности, изобретение относится к новым фармацевтическим композициям и способам лечения, когда субъекту назначают гибридный белок на основе БТШ70 или его конъюгаты с радиоактивными изотопами. Изобретение включает лекарственные средства, способы и фармацевтические композиции, которые будут описаны с отсылкой на определения, для удобства представленные ниже. Если не указано иначе, термины, используемые в тексте, имеют следующие определения.
5.1. Определения
В данном контексте, термины, употребляемые в различных грамматических формах, являются равнозначными терминами, используемыми для данного изобретения (особенно в контексте формулы изобретения), и должны интерпретироваться для применения как в единственном, так и во множественном числе, если в тексте не указано иное, или если это противоречие четко не ясно из контекста.
В данном контексте, термины «БТШ70» и «белок теплового шока 70», которые используются в тексте в качестве взаимозаменяемых, представляют собой экзогенные производные белка теплового шока, относящиеся к семейству белков теплового шока с массой 70 кДа, структура которых хорошо известна. Кроме того, используемый в тексте термин «БТШ70» подразумевает нативный БТШ70, рекомбинантный БТШ70 (рчБТШ70), а также производные БТШ70, например пегилированный БТШ70 (БТШ70-ПЭГ). Домен гибридного белка, представляющий собой аминокислотную последовательность молекулы БТШ70, как составной части гибридного белка, описывается в тексте термином «БТШ70-домен».
В данном контексте под «БТШ70-зависимыми расстройствами или заболеваниями» понимаются расстройства или заболевания, основой патогенеза при которых является дефицит образования или мобилизации эндогенного БТШ70 в ответ на различные раздражители. В частности, к БТШ70-зависимым расстройствам или заболеваниям относятся, но не ограничиваются ими: повреждения или дегенерация мышц, обусловленные интенсивными (экстремальными) физическими нагрузками; приобретенные или возрастные изменения мышц (саркопения); травматический токсикоз, вызванный повреждениями при авариях и травмах; геморрагический шок; сепсис; отек легкого (острый респираторный дистресс-синдром); ишемические повреждения миокарда (в том числе инфаркт) и головного мозга (в том числе инсульт); черепно-мозговая травма; нейродегенеративные заболевания (болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз, рассеянный склероз); фиброз печени и легкого; рак, в том числе меланома.
В конкретных случаях БТШ70-зависимые расстройства или заболевания представлены повреждениями мышц, обусловленными интенсивными физическими нагрузками, в частности без анаболических эффектов; инсультом; фиброзом печени и меланомой.
В данном контексте, термин «экзогенный» подразумевает внешнее происхождение БТШ70, или, иначе говоря, экзогенный БТШ70, описанный в тексте, получен вне организма субъекта, например путем рекомбинантного синтеза.
В данном контексте, термин «выносливость» подразумевает способность выдерживать физическую нагрузку, продолжительно обеспечивать субмаксимальную частоту сокращений мышцы сердца, или прикладывать усилия в течение длительного периода времени. В конкретном случае, выносливость может включать в себя аэробную и анаэробную, скоростную и силовую выносливость. В конкретном случае, повышение выносливости описывается как возможность выдерживать физическую нагрузку в течение более длительного периода времени или с меньшими прилагаемыми усилиями.
В данном контексте, термин «работоспособность» подразумевает потенциальную возможность индивида выполнять заданную функцию физического или умственного характера на заданном уровне эффективности в течение определенного времени. Повышение умственной или физической работоспособности относится к повышению способности индивида выполнять задачу или несколько последовательных задач. Кроме того, лекарственные средства настоящему изобретению направлены на улучшение показателей физической и умственной работоспособности. В конкретном случае, где работоспособность является физической работоспособностью, повышение работоспособности может включать в себя повышение выносливости и мышечной силы. В другом случае, где работоспособность является умственной, повышение умственной работоспособности может включать в себя улучшение осознанного восприятия, запоминания и ясности ума.
В данном контексте, если не указано иное, термины «лечить», «леченный», «лечение» подразумевают полное излечение расстройства или заболевания, или уменьшение выраженности одного или нескольких симптомов, характерных для данного расстройства или заболевания. В конкретных случаях указанные термины используются для того, чтобы отразить минимизацию прогрессирования расстройства или заболевания вследствие применения лекарственных средств по настоящему изобретению у пациентов с конкретными расстройствами или заболеваниями. В некоторых случаях указанные термины относятся к применению описанных в рамках настоящего изобретения лекарственных средств - изолированно или в сочетании с другими активными средствами - после появления у пациента симптомов, характерных для конкретных видов расстройств или заболеваний. Термин «лечение» во всех его грамматических формах, используемых в тексте, подразумевает лечение расстройства или заболевания у конкретного субъекта, например у млекопитающего, и включает в себя реализацию как минимум одного из пунктов: (i) предотвратить развитие расстройства или заболевания, то есть задержать или остановить его прогрессирование; (ii) уменьшить тяжесть течения расстройства или заболевания, то есть добиться уменьшения выраженности или исчезновения симптомов расстройства или заболевания; (iii) обеспечить излечение или добиться ремиссии расстройства или заболевания, предпочтительно путем устранения причины возникновения расстройства или заболевания. В конкретных случаях, используемый в тексте термин «лечение» во всех его грамматических формах предусматривает лечение расстройства или заболевания у млекопитающего, например примата, в частности человека, в вариантах, описанных как минимум в одном из упомянутых выше пунктов (i), (ii) и (iii). Известно, что при назначении системной терапии, что относится также и к применению лекарственных средств по настоящему изобретению, необходимо вносить дополнительные коррективы в зависимости от возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола, диеты, времени приема гибридного белка, взаимодействия с другими лекарственными средствами, тяжести состояния, которые являются предметом рутинной практики для среднего специалиста в данной области.
В данном контексте, термины «субъект» и «пациент» являются взаимозаменяемыми. Термины «субъект» и «пациент» относятся к животному (например, к птицам, таким как курица, перепел или индейка) или млекопитающему, включая, как не приматов (например, корова, свинья, лошадь, овца, кролик, морская свинка, крыса, кошка, собака и мышь), так и приматов (например, обезьяна, шимпанзе и человек). В конкретном случае, в качестве субъекта выступает человек.
В данном контексте, если не указано иное, термины «проводить профилактику», «профилактический» и «профилактика» подразумевают предотвращение возникновения, развития или рецидива расстройства или заболевания, либо одного или нескольких их симптомов. В конкретных случаях термины относятся к введению субъекту гибридного белка на основе БТШ70 изолированно или в сочетании с другими средствами для профилактики, с тем, чтобы предотвратить появление симптомов, в частности у пациентов, относящихся к группе риска для расстройства или заболевания из числа описанных здесь. Термины подразумевают также подавление или снижение выраженности симптома конкретного расстройства или заболевания. Пациенты с семейной предрасположенностью к данному расстройству или заболеванию заслуживают, в частности, особого внимания как кандидаты для профилактики. Кроме того, субъекты, которые имеют в анамнезе рецидивы расстройств или заболеваний, также являются потенциальными кандидатами для профилактики. В связи с этим, термин «профилактика» может быть использован взаимозаменяемо с термином «профилактическое лечение». В некоторых случаях, профилактика достигается путем введения гибридного белка на основе БТШ70 по настоящему изобретению в эффективном для профилактики количестве.
В данном контексте, если не указано иное, «терапевтически эффективное количество» активного лекарственного средства, например гибридного белка на основе БТШ70, означает количество, достаточное для обеспечения терапевтического эффекта при лечении расстройства или заболевания, или для того, чтобы препятствовать развитию одного или несколько симптомов, характерных для конкретного расстройства или заболевания, или минимизировать их выраженность. Терапевтически эффективное количество гибридного белка на основе БТШ70 означает количество указанного гибридного белка, которое при его применении изолированно или в сочетании с другими видами терапии обеспечивает терапевтический эффект при лечении расстройства или заболевания. Термин «терапевтически эффективное количество» может подразумевать также количество лекарственного средства, которое позволяет повысить эффективность общей терапии, снизить выраженность симптомов или устранить причины расстройства или заболевания или способствует повышению терапевтической эффективности других лекарственных средств.
В данном контексте, если не указано иное, термины «проводить терапию», «терапевтический», «терапия» подразумевают предотвращение или замедление прогрессирования, распространения или повышения тяжести течения расстройства или заболевания либо одного или нескольких симптомов. Часто положительные эффекты, полученные у субъекта в результате применения средства для профилактики и/или лекарственного средства, не приводят к излечению расстройства или заболевания. В связи с этим, термин «терапия» подразумевает также лечение субъекта, страдающего от конкретного расстройства или заболевания, которое проводится с целью предотвратить или минимизировать вероятность рецидива расстройства или заболевания.
В данном контексте, если не указано иное, «эффективное для профилактики количество» активного лекарственного средства, например гибридного белка на основе БТШ70, означает количество, достаточное для предотвращения расстройства или заболевания, для устранения вероятности его рецидива. Эффективное для профилактики количество гибридного белка на основе БТШ70 означает количество указанного гибридного белка, которое при его применении изолированно или в сочетании с другими активными средствами обеспечивает профилактический эффект, заключающийся в предотвращении развития заболевания. Термин «эффективное для профилактики количество» может подразумевать также количество, которое способствует повышению эффективности общей профилактики или усиливает действие другого средства для профилактики.
2
2
2
2
2
2
Термин «полиэтиленгликоль» или «ПЭГ» относится к соединениям полиалкиленгликолей или их производных с или без связующих веществ, или их производных со связывающими или активирующими группами. В своей обычной форме ПЭГ является линейным полимером с концевой гидроксильной группой и имеет формулу НО-СНСН-(СНСНО)n-СНСН-ОН. Количество звеньев «n» в ПЭГ определяет молекулярную массу, выражаемую в дальтонах (Да).
Термин «Fc-фрагмент» или «Fc-домен», принятый в рассматриваемой области, представляет собой С-концевую область тяжелой цепи иммуноглобулина, включая Fc-фрагменты нативной последовательности и вариантные Fc-фрагменты. В некоторых случаях, несмотря на то, что границы Fc-фрагмента тяжелой цепи иммуноглобулина могут меняться, Fc-фрагмент тяжелой цепи человеческого иммуноглобулна G (IgG) обычно включает последовательность аминокислот от аминокислотного остатка на позиции Cys226 или от Pro230 до карбоксильного конца иммуноглобулина. С-концевой лизин (остаток 447 по Европейской системе нумерации) Fc-фрагмента может быть удален, например, при синтезе рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь антитела. Если не указано иное, в данном контексте номера аминокислотных остатков в тяжелой цепи иммуноглобулина соответствуют индексу Европейской системы нумерации, представленной в работе Kabat et al. (Kabat E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5th ed. Bethesda, MD: Public Health Service. National Institutes of Health, 1991), включенной в данную заявку посредством ссылки. Индекс Европейской системы нумерации, представленный в работе Kabat et. al., отражает нумерацию аминокислотного остатка в человеческом EU антителе типа IgG1.
«Fc-фрагмент нативной последовательности» означает последовательность аминокислот, идентичную аминокислотной последовательности Fc-фрагмента, встречающейся в природе. Человеческие Fc-фрагменты нативной последовательности включают Fc-фрагменты нативной последовательности человеческого IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, а также их варианты природного происхождения.
«Вариантный Fc-фрагмент» означает аминокислотную последовательность, которая отличается от нативной последовательности Fc-фрагмента наличием, как минимум, одной аминокислотной модификации, преимущественно с одним или более аминокислотным замещением. В конкретных примерах, вариантный Fc-фрагмент имеет, как минимум, одно аминокислотное замещение по сравнению с нативной последовательностью Fc-фрагмента или с последовательностью Fc-фрагмента исходного белка, например в пределах от одного до десяти аминокислотных замещений или в пределах от одного до пяти аминокислотных замещений в сравнении с нативной последовательностью Fc-фрагмента или с последовательностью Fc-фрагмента исходного белка. В данном контексте, аминокислотная последовательность вариантного Fc-фрагмента, предпочтительно, более чем на 80% совпадает с нативной аминокислотной последовательностью Fc-фрагмента и/или последовательностью Fc-фрагмента исходного белка, причем предпочтительным является совпадение не менее чем 90% аминокислотной последовательности, более предпочтительным - совпадение более чем 95% аминокислотной последовательности.
5.2. Гибридные белки по настоящему изобретению
Новые соединения, описанные в рамках настоящего изобретения, - гибридные белки на основе БТШ70 и их конъюгаты, а также производные БТШ70 могут быть использованы в лекарственных средствах и способах, как это указано в изобретении.
В конкретном примере осуществления изобретения представлен гибридный белок на основе БТШ70 (БТШ70-Fc), обладающий пролонгированными усиленными свойствами БТШ70, представленный последовательностью SEQ ID NO: 1, состоящей из Fc-фрагмента (Fc-домена), сшитого посредством линкерного фрагмента (линкерного домена) с N-концом БТШ70-домена - молекулы БТШ70, которая представляет собой рчБТШ70.
В конкретных примерах осуществления изобретения Fc-фрагмент идентичен нативному константному Fc-фрагменту человеческого IgG1. Известно, что длительность периода полувыведения иммуноглобулинов, в частности IgG, определяется наличием Fc-фрагмента, который обусловливает способность IgG к рециркуляции в эндотелии сосудов. Более подробно этот процесс может быть описан следующим образом: как только IgG поступает в эндосомы эндотелиальных клеток, его Fc-фрагмент связывается с неонатальными Fc-рецепторами клеток эндотелия сосудов (FcRn) (Olafsen Т. Fc engineering: serum half-life modulation through FcRn binding. Methods Mol. Biol. 2012; 907:537-556; Bumbaca D. et al. Physiochemical and biochemical factors influencing the pharmacokinetics of antibody therapeutics. AAPS J. 2012; 14(3):554-558). Связывание Fc-фрагмента с FcRn способствует возвращению IgG обратно к поверхности эндотелиальных клеток с последующим высвобождением его в кровеносное русло и обеспечивает защиту IgG от лизосомального расщепления. В частных случаях, IgG может быть представлен IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.
В конкретных примерах реализации изобретения в составе гибридного белка на IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.основе БТШ70 присутствует линкерный фрагмент, содержащий спейсерный сайт и сайт расщепления протеазой вируса табачной мозаики (TEV-протеазой). Возможны также альтернативные варианты, где линкерный фрагмент в гибридном белке отсутствует.
В конкретных примерах реализации Fc-фрагмент соединен (слит) с N-концевым участком молекулы БТШ70, который, как было указано выше, как правило, участвует в процессах рефолдинга белков. Возможны также альтернативные варианты, где Fc-фрагмент соединен с C-концевым участком молекулы БТШ70, который, как было отмечено выше, участвует в процессах связывания, в частности связывания пептидов, и обладает антиапоптозными свойствами.
В конкретных примерах реализации БТШ70 представлен в нативной форме или в виде его производных, например в виде БТШ70-ПЭГ, или в виде гибридного белка, где молекула БТШ70 соединена с Fc-фрагментом IgG. В конкретных примерах БТШ70, представляет собой рчБТШ70. В некоторых примерах БТШ70 представляет собой производное рчБТШ70, в частности рчБТШ70-ПЭГ.
Аминокислотная последовательность нативного человеческого БТШ70 (чБТШ70) зарегистрирована в GenBank (Accession № AAD21816), его экспрессия осуществляется с помощью комплементарной ДНК (кДНК, cDNA), зарегистрированной в GenBank (Accession № М24743) (Hunt et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. 82:6455-6489). Для получения рчБТШ70 кДНК чБТШ70 может быть клонирована, например в вектор рЕТ27а (Novagen), чтобы получить экспрессирующий вектор pET27hhsp70, который затем трансфицируют в клетки штамма Escherichia coli К12 HMS174(DE3) (Novagen).
В конкретном примере реализации изобретения БТШ70-Fc представляет собой последовательность аминокислот, характеризуемую SEQ ID NO: 1, приведенную ниже.
Молекулярная масса: 99,4 кДа SEQ ID NO: 1;
АА1-225 Fc-фрагмент;
АА226-233 Линкерный фрагмент: спейсерный сайт;
АА234-242 Линкерный фрагмент: сайт расщепления протеазой вируса табачной мозаики (TEV-протеазой);
АА243-883 БТШ70 (N-конец соединен с линкерным фрагментом)
В частных случаях, гибридные белки на основе БТШ70, описываемые в настоящем изобретении, например рчБТШ70-Fc, характеризуются тем, что скорость их выведения из сыворотки крови, по крайней мере, на порядок ниже в сравнении с аналогичным показателем рчБТШ70.
В частных случаях, биодоступность гибридных белков на основе БТШ70 по настоящему изобретению, например рчБТШ70-Fc, при внутрилегочном и интраназальном введении, по крайней мере, на порядок выше в сравнении с аналогичным показателем рчБТШ70.
В конкретных примерах реализации изобретения, гибридные белки на основе БТШ70 по настоящему изобретению, например рчБТШ70-Fc, обладают высокой эффективностью в лечении злокачественных новообразований.
H
H
H
H
H
В частных случаях, БТШ70-Fc по настоящему изобретению имеет гетерологичный участок, соединенный с N-концом Fc-фрагмента C-концевой области молекулы иммуноглобулина. Предпочтительно, чтобы для синтеза использовалась последовательность, начинающаяся в шарнирной области выше линии расщепления папаином, например, начиная с остатка константной области тяжелой цепи под номером 114 или занимающего аналогичное положение в других иммуноглобулинах. В одном из вариантов, гетерогенный участок представляет собой участок, соединяющий шарнирную область и домены C2 и 3 или участок, соединяющий домен C1, шарнирную область и домены C2 и 3 константной области тяжелой цепи IgG1, IgG2 или IgG3. В некоторых случаях, точный участок (сайт), на котором происходит соединение (слияние), не является решающим, и оптимальный сайт может определяться экспериментально с помощью рутинных методов.
В примерах реализации для человеческих Fc-фрагментов предпочтительно использовать последовательности человеческих IgG1 и IgG3 иммуноглобулинов. Основным преимуществом использования последовательности IgG1 является то, что подобный гибридный белок можно легко и с высокой эффективностью очистить на колонке с иммобилизированным белком А. Напротив, очистка гибридного белка, в котором использована последовательность IgG3, требует белка G - значительно менее подвижной среды. Однако для каждого конкретного случая при выборе IgG гибридного партнера для синтеза гибридного белка должны учитываться также и другие структурные и функциональные свойства иммуноглобулинов. Например, шарнирная область IgG3 является более длинной и гибкой, поэтому она может размещать большие гетерогенные участки, которые не смогут сгибаться или функционировать надлежащим образом при слиянии с IgG1. Другим соображением, которое следует принимать во внимание, является валентность: иммуноадгезины IgG являются двухвалентными гомодимерами, тогда как субтипы, подобные IgA и IgM, могут приводить к димерным или пентамерным структурам, соответственно, основных Ig гомодимерных единиц.
Для гибридных белков на основе БТШ70, созданных для применения in vivo, важны также фармакокинетические свойства и эффекторные функции, обусловленные действием Fc-фрагмента. Несмотря на то, что IgG1, IgG2 и IgG4 имеют in vivo период полувыведения, составляющий 21 день, их относительная способность активировать систему комплимента различна. Так, IgG4 не обладает способностью активировать комплемент, а у IgG2 способность к активации комплемента выражена значительно менее, чем у IgG1. Кроме того, IgG2, в отличие от IgG4, не способен связываться с рецепторами Fc на мононуклеарных клетках или нейтрофилах. В то же время, IgG3 обладает выраженной способностью к активации системы комплемента, а его период полувыведения in vivo составляет примерно 1/3 аналогичных параметров IgG других изотипов. Однако выбор конкретного иммуноглобулина должен осуществляться с учетом совокупности указанных факторов и функционального назначения синтезируемого гибридного белка.
Другим важным фактором, который должен учитываться при создании гибридного белка, предназначенного для применения в терапии, является количество аллотипических вариантов определенных изотипов. В общем случае, предпочтительными являются изотипы IgG с пятью серологически определяемыми аллотипами. Например, IgG имеет только четыре серологически определяемых аллотипичных участка (сайта), два из которых расположены в Fc-домене, при этом один из указанных сайтов является неиммуногенным. Напротив, IgG3 имеет 12 серологически определяемых аллотипов, локализованных в Fc-домене, и только три из этих сайтов имеют один аллотип, который является неиммуногенным. В связи с этим, потенциальная иммуногенность гибридного белка IgG3 выше, чем у гибридного белка IgG1.
В вариантах осуществления изобретения, Fc-фрагмент, используемый в гибридных белках на основе БТШ70, может включать в себя одно или более структурных изменений (модификаций), по сравнению с природным Fc-доменом. При этом модифицированные Fc-фрагменты должны устойчиво сохранять необходимые для терапевтического применения свойства, улучшенные по сравнению с их природным аналогом. Например, полагают, что в результате модификации структуры Fc-фрагмента могут быть получены изменения (например, или повышение, или снижение) способности к связыванию белка C1q и/или комплиментзависимой цитотоксичности (CDC), например, как это описано в WO 99/51642. См. также Duncan et al., Nature 322:738-40 (1988); патент США №5,648,260; патент США №5,624,821 и WO 94/29351, касающиеся других примеров модификаций Fc-фрагмента. WO 00/42072 (Presta) и WO 2004/056312 (Lowman) описывают варианты антител с улучшенным или ухудшенным связыванием с FcRs. Содержание указанных опубликованных патентных документов включено в настоящую заявку путем ссылки. См. также Sheilds et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001). Антитела с увеличенным периодом полураспада и повышенной способностью к связыванию с неонатальным рецептором Fc (FcRn), который отвечает за перенос материнского IgGs к плоду (Guyer al., J. Immunol. 117:587 (1976) и Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), описаны в заявке US 2005/ 0014934 A1 (Hilton et. al.). Эти антитела содержат Fc-рецептор с одним или более замещениями, что приводит к улучшению связывания Fc-фрагмента с FcRn. Полипептидные варианты с измененными аминокислотными последовательностями Fc-фрагмента и с повышенной или пониженной способностью к связыванию C1q описаны в патенте США №6,194,551; W0 99/51642; Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000). Содержание указанных документов включено в настоящую заявку путем ссылки.
Примерная структура Fc-фрагмента, представленная последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 2, приведена ниже:
В некоторых случаях, Fc-фрагмент имеет одну или несколько мутаций в аминокислотных остатках, таких как Asp-265, Lys-322 и Asp-434. В отдельных случаях, мутантный Fc-фрагмент, имеющий одну или более указанных мутаций (например, мутацию Asp-265), обусловливал снижение способности к связыванию с гамма-рецептором (FcγRs) по сравнению с природным Fc-фрагментом. В других случаях мутантный Fc-фрагмент, имеющий одну или более указанных мутаций (например мутацию Asn-434), обеспечивал повышение способности связывания с Fc-подобным рецептором белка главного комплекса гистосовместимости (ГКГС, МНС) класса I по сравнению с природным Fc-фрагментом.
5.2.1. БТШ70, конъюгированный с радиоактивными изотопами
На мышиной модели рака толстой кишки было показано, что введение БТШ70 в сочетании с дендритными клетками (ДК) в облученную радиоактивным излучением опухоль вызывает более выраженный противораковый эффект, чем при изолированном введении ДК (Wang Y.S., Liu S.J., Huang S.C., Chang C.C., Huang Y.C., Fong W.L., Chi M.S., Chi K.H. Recombinant heat shock protein 70 in combination with radiotherapy as a source of tumor antigens to improve dendritic cell immunotherapy. Front. Oncol. 2012 (2)148). БТШ70 активировал опухоль-специфический цитотоксический T-клеточный иммунный ответ или задерживал рост опухоли. Эти результаты позволяют предположить, что сочетанное применение БТШ70 и радиационной терапии может повысить эффективность радиоиммунотерапии рака. Комбинация этих двух способов - иммунотерапии и радиотерапии - при применении гибридных белков на основе БТШ70 по настоящему изобретению может являться эффективной стратегией противоопухолевой терапии.
131
131
125
125
125
Более того, было показано, что меченный радиоактивным изотопом I интерлейкин-8 (IL-8) - цитокин, который активирует нейтрофилы, улучшает визуализацию (диагностику) инфекции в организме человека (Gross М.D., Shapiro В., Fig L.М., Steventon R., Skinner W.S., Hay R.V. Imaging of Human Infection with I-labeled Recombinant Human Interleukin-8, J. Nucl. Med., 2001 (42(11))1656). В то же время I применяют в клинической практике для лечения рака предстательной железы (брахитерапия), а в ряде исследований антитела к ICAM-1 (молекулам клеточной аднезии, предварительно активированным провоспалительными цитокинами), конъюгированные с меченными I наночастицами золота, используют для диагностики артрита у крыс с помощью гамма-камеры (Shao X., Zhang Н., Rajian J., Chamberland D.L., Sherman P., Quesada C.A., Koch A., Kotov N., Wang X. I-labeled Gopld Nanorods for Targeted Imaging of inflammation, ACS Nano, 2011(5911))8967). Эти исследования свидетельствуют о возможности применения радиоактивных изотопов как для лечения, так и для диагностики заболеваний (визуализация патологических образований).
123
124
125
131
В этой связи, гибридный белок на основе БТШ70 может быть конъюгирован с радиоактивным изотопом, выбранным из группы: I, I, I, I. Некоторые из указанных радиоактивных изотопов, выполняющих функцию доставки источника гамма-излучения к раковым клеткам, могут также использоваться как источник энергии, обеспечивающий возможность визуализации рака с целью диагностики.
131
131
123
123
В конкретном примере реализации изобретения представлен гибридный белок на основе БТШ70, состоящий из Fc-фрагмента человеческого IgG1, сшитого посредством пептидного линкера с сайтом расщепления протеазой вируса табачной мозаики с N-концом человеческого БТШ70, представленный последовательностью SEQ ID NO: 1, конъюгированный с радиоактивным изотопом I (I-БТШ70-Fc), который обладал выраженным противоопухолевым эффектом в отношении меланомы у мышей. В другом конкретном примере гибридный белок на основе БТШ70, конъюгированный с I, при его использовании для анализа биораспределения I-БТШ70-Fc в организме мышей с перевитой меланомой В16 показал преимущественное накопление указанного радиофармпрепарата в опухоли.
5.3. Способы по настоящему изобретению
Настоящее изобретение относится к способам использования лекарственных средств или препаратов, которые содержат БТШ70, в частности рчБТШ70, для повышения работоспособности и для лечения БТШ70-зависимых расстройств или заболеваний.
В одном из конкретных примеров реализации изобретения представлен способ повышения работоспособности при интенсивных физических нагрузках, включающий введение субъекту, например млекопитающему, гибридного белка на основе БТШ70 по настоящему изобретению (БТШ70-Fc) в эффективном количестве, обеспечивающем повышение работоспособности у субъекта. В конкретных примерах реализации изобретения лекарственное средство, содержащее гибридный белок на основе БТШ70 по настоящему изобретению (БТШ70-Fc), вводят внутривенно, перорально или ингаляционно.
В другом конкретном примере реализации изобретение представляет способ лечения БТШ70-зависимого расстройства или заболевания, включающий введение субъекту, например млекопитающему, гибридного белка на основе БТШ70 по настоящему изобретению (БТШ70-Fc) в терапевтически эффективном количестве для того, чтобы обеспечить лечение у субъекта БТШ70-зависимого расстройства или заболевания.
В рамках осуществления изобретения, БТШ70-зависимые расстройства или заболевания могут включать: повреждения или дегенерацию мышц, обусловленные интенсивными (экстремальными) физическими нагрузками; приобретенные или возрастные изменения мышц (саркопения); травматический токсикоз, вызванный повреждениями при авариях и травмах; геморрагический шок; сепсис; отек легкого (острый респираторный дистресс-синдром); ишемические повреждения миокарда (в том числе инфаркт) и головного мозга (в том числе инсульт); черепно-мозговую травму; нейродегенеративные заболевания (болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз, рассеянный склероз); фиброз печени и легкого; рак, в том числе меланому.
В одном из конкретных примеров осуществления изобретения БТШ70-зависимое расстройство или заболевание представляет собой повреждения мышц, обусловленные интенсивными физическими нагрузками, в частности без анаболических эффектов. В другом конкретном примере БТШ70-зависимое расстройство или заболевание представлено инсультом. Еще в одном конкретном примере БТШ70-зависимым расстройством или заболеванием является фиброз печени. В следующем конкретном примере в качестве БТШ70-зависимого расстройства или заболевания выступает меланома. В конкретных примерах реализации изобретения лекарственное средство, содержащее гибридный белок на основе БТШ70 по настоящему изобретению (БТШ70-Fc), вводят внутривенно, внутрилегочно, подкожно, интраназально, перорально или ингаляционно.
124
125
131
124
125
131
В другом конкретном примере реализации, изобретение предлагает способ радиоиммунотерапии, включающий введение субъекту, например млекопитающему, конъюгата гибридного белка на основе БТШ70 по настоящему изобретению с радиоактивным изотопом, выбранного из группы: I-БТШ70-Fc, I-БТШ70-Fc, I-БТШ70-Fc. В конкретных примерах реализации изобретения лекарственное средство, содержащее конъюгат гибридного белка на основе БТШ70 по настоящему изобретению с радиоактивным изотопом (I-БТШ70-Fc, I-БТШ70-Fc, I-БТШ70-Fc), вводят, внутривенно или интратуморально.
В конкретных примерах реализации изобретения в качестве субъекта выступает млекопитающее, а в качестве млекопитающего выступает человек.
Кроме того, настоящее изобретение распространяется на любой новый способ приготовления лекарственных средств или препаратов по настоящему изобретению.
В частных конкретных случаях скорость выведения из сыворотки крови гибридного белка на основе БТШ70 (БТШ70-Fc), по крайней мере, на порядок ниже, в сравнении с аналогичным показателем БТШ70.
В частных конкретных случаях, при внутрилегочном или интраназальном введении биодоступность гибридного белка на основе БТШ70 (БТШ70-Fc), по крайней мере, на порядок выше, в сравнении с аналогичным показателем БТШ70.
Не ограничиваясь только теоретическими выкладками, в конкретных примерах реализации изобретения экспериментально доказано, что действие гибридного белка на основе БТШ70 по настоящему изобретению (БТШ70-Fc) направлено на стимуляцию неоангеогенеза мышц и активацию клеток-сателлитов мышц - ключевой популяции стволовых клеток мышц.
5.4. Лекарственные средства по настоящему изобретению
Лекарственные средства по настоящему изобретению включают в себя гибридные белки на основе БТШ70, в частности БТШ70-Fc, которые в терапевтически эффективном количестве могут вводиться в организм любым способом, значимо не влияющим на целевую активность указанного гибридного белка, например путем внутривенных инъекций, перорального, интраназального, внутрилегочного, интравагинального, ректального или ингаляционного введения.
Таким образом, один из примеров реализации изобретения представляет фармацевтическую композицию, содержащую гибридный белок на основе БТШ70 по настоящему изобретению (БТШ70-Fc), например терапевтически эффективное количество указанного гибридного белка, и фармацевтически приемлемый носитель. В конкретных примерах осуществления изобретения, препарат, созданный на базе лекарственного средства по настоящему изобретению, предназначен для внутривенного, внутрилегочного, подкожного, интраназального, перорального или ингаляционного введения.
124
125
131
124
125
131
В других конкретных примерах реализации изобретения, гибридный белок на основе БТШ70 конъюгирован с радиоактивным изотопом, в качестве которого может быть использован I, I или I. В указанных примерах представлена фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат гибридного белка на основе БТШ70 по настоящему изобретению с радиоактивным изотопом, выбранный из группы: I-БТШ70-Fc, I-БТШ70-Fc, I-БТШ70-Fc.
В конкретных примерах реализации изобретения, БТШ70 представляет собой рчБТШ70.
В частных случаях осуществления изобретения, БТШ70 представляет собой БТШ70-ПЭГ, например рчБТШ70-ПЭГ.
Гибридный белок на основе БТШ70 по настоящему изобретению, например рчБТШ70-Fc, может быть получен в виде фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество БТШ70 и фармацевтически приемлемый носитель. «Терапевтически эффективное количество» - это количество, достаточное для получения целевого терапевтического эффекта. Предпочтительно, чтобы при таком количестве вероятность возникновения побочных эффектов была минимальной. Количество рчБТШ70-Fc, вводимого с целью получения целевого терапевтического эффекта, базируется на БТШ70-активности гибридного белка по настоящему изобретению (БТШ70-Fc), которая определяется путем оценки БТШ70-активности с помощью способов, известных в данной области. Терапевтически эффективное количество, необходимое для проведения лечения у конкретного пациента, может быть определено с учетом различных факторов, таких как: выраженность у пациента специфических патологических изменений, наличие общесоматической патологии, способ введения лекарственного средства, выраженность побочных эффектов и т.п.
В конкретных примерах реализации изобретения, для приготовления фармацевтических композиций, содержащих гибридный белок на основе БТШ70, например рчБТШ70-Fc, эффективное количество лекарственного средства смешивают с фармацевтически приемлемым носителем (растворителем, наполнителем). Предпочтительно, чтобы такой носитель (растворитель, наполнитель) был инертным. Фармацевтически приемлемым носителем может быть любое совместимое, нетоксичное вещество, пригодное для доставки лекарственных средств на основе БТШ70 по настоящему изобретению в организм пациента. В качестве фармацевтически приемлемых носителей могут быть использованы, например физиологический раствор, раствор Рингера, раствор глюкозы и раствор Хэнкса. Могут применяться также неводные носители, такие как нелетучие масла и этилолеат. Наиболее предпочтительным носителем является 5% раствор декстрозы в физиологическом растворе. Носитель может содержать небольшие количества примесей, в частности веществ, которые повышают изотоничность и химическую стабильность, например буферные растворы и консерванты. Лекарственные средства по настоящему изобретению могут вводиться перорально или с помощью инъекций. Обычно используют внутримышечные, подкожные, внутрикожные или внутривенные инъекции. В отдельных случаях могут применяться внутрисуставные инъекции или другие способы введения лекарственного средства. В случае парентерального введения БТШ70-Fc предпочтительным является использование стандартных дозированных форм для инъекций (раствор, суспензия, эмульсия), связанных с используемым носителем, см. например Avis et al. Pharmaceutical Dosage Form: Parenteral Medications, Dekker N.Y. (1993); Lieberamn et al. Pharmaceutical Dosage Form: Tablets, Dekker N.Y. (1990); Lieberamn et al. Pharmaceutical Dosage Form: Disperse Systems, Dekker N.Y. (1990). Лекарственные средства по настоящему изобретению могут быть доставлены в организм пациента с помощью имплантируемой или инъецируемой систем для доставки лекарственного препарата, см. например Urquhart et al. Ann, Rev. Pharmacol. Toxicol, 24:199-236, (1984); Lewis ed. Controlled release of Pesticides and Pharmaceuticals, Plenum Press, New York (1981); U.S. Pat. Nos 3,773,919; 3,270,960 и т.п. Гибридный белок на основе БТШ70 можно вводить с помощью водных растворителей, таких как вода, солевые или буферные растворы с или без использования различных добавок и/или разбавителей. Приготовление таких фармацевтических композиций известно в данной области, см. например  Pharmaceutical Science and U.S. Pharmacopeia: National Formulary Mack Publishing Company, Easton Pa (1984).
5.4.1. Введение лекарственного средства по настоящему изобретению
В общем случае, фармацевтические композиции по настоящему изобретению, которые включают в себя гибридные белки на основе БТШ70, можно вводить в различных лекарственных формах, которые не влияют или значимо не снижают высокую стабильность указанных гибридных белков (т.е. не препятствуют достижению целевого терапевтического эффекта), включая, но не ограничиваясь, твердыми или жидкими лекарственными формами, формами для перорального, парентерального, интраназального введения, суппозиториями, пастилками, таблетками для рассасывания, формами для трансбуккального и сублингвального введения, формами с контролируемым, импульсным или немедленным высвобождением, растворами для внутривенного введения, суспензиями или их комбинациями. Лекарственная форма может представлять собой форму для перорального введения. Указанная лекарственная форма может быть выполнена в виде таблеток или капсул. Препарат можно вводить, например перорально или парентерально, в том числе внутривенно, внутримышечно, внутрибрюшинно, подкожно, внутрикожно, ингаляционно (аэрозоль), ректально, вагинально и путем местного введения или нанесения (в том числе, трансбуккально и сублингвально). В одном из конкретных примеров реализации изобретения препараты, содержащие гибридные белки на основе БТШ70, доставляют в нужное место, например головной мозг, путем непрерывного вливания через шунты. В другом конкретном примере, препараты, включающие гибридные белки на основе БТШ70, доставляют непосредственно в злокачественные новообразования, например в меланому, путем интратуморальных инъекций.
В других конкретных примерах препараты по настоящему изобретению можно вводить парентерально, например внутривенно. Обычно препарат, предназначенный для введения в организм, включает в себя гибридный белок на основе БТШ70, растворенный в фармацевтически приемлемом носителе. В качестве приемлемых растворов и растворителей могут использоваться вода, раствор Рингера, а также изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, применяются также стерильные нелетучие масла в сочетании с синтетическими моно- или диглицеридами. Стерильные нелетучие масла можно также использовать традиционным способом, в виде раствора или питательной смеси. С этой целью также можно использовать любое мягкое нелетучее масло, в том числе синтетические моно- или диглицериды. Кроме того, для приготовления лекарственных форм для инъекций могут применяться жирные кислоты, такие как олеиновая. Эти растворы являются стерильными и свободными от нежелательных примесей. Указанные препараты можно стерилизовать с помощью обычных хорошо известных способов стерилизации. Препараты могут содержать фармацевтически приемлемые наполнители, необходимые для обеспечения физиологических условий, например регуляторы кислотности и буферные агенты, антитоксиканты, например натрия ацетат, натрия хлорид, калия хлорид, кальция хлорид, натрия лактат и т.п. В таких препаратах концентрация гибридного белка на основе БТШ70 может широко варьировать, и подбор ее будет основываться, в первую очередь, на объеме жидкости, вязкости, массе тела и т.п. в соответствии с конкретным способом введения и потребностью пациента. Стерильный препарат для внутривенного введения может быть приготовлен в виде стерильных суспензий для инъекций, таких как стерильная водная или масляная суспензия для инъекций. Такую суспензию можно приготовить с помощью известных способов с использованием подходящих диспергирующих и суспендирующих агентов. Стерильный препарат для инъекций может также представлять собой стерильный инъекционный раствор или суспензию, приготовленную с использованием нетоксичного, парентерально приемлемого растворителя, такого как раствор 1,3-бутандиола.
В одном конкретном примере реализации изобретения, гибридные белки на основе БТШ70 могут применяться путем введения в центральную нервную систему субъекта, например в спинномозговую жидкость. Препараты для введения, как правило, содержат гибридный белок на основе БТШ70, растворенный в фармацевтически приемлемом носителе. В конкретных случаях гибридный белок вводят в полость позвоночного канала, например в поясничную область или в мостомозжечковую цистерну. В других случаях гибридный белок вводят интраокулярно, обеспечивая тем самым контакт с ретинальными и ганглиозными клетками сетчатки.
Фармацевтические средства могут быть суспендированы в водных растворителях и введены с помощью обычных игл для подкожных инъекций или инфузоматов. Перед введением средство может быть стерилизовано предпочтительно с помощью гамма-излучения или облучения электронным пучком.
Препараты для перорального введения, как правило, могут быть представлены в виде единичных лекарственных форм, таких как таблетки, пилюли, капсулы; в виде порошка или гранул; в виде водного раствора, суспензии, жидкости, геля, сиропа, кашицы и т.п., то есть в виде форм, пригодных для приема внутрь пациентом. В состав таблеток для перорального применения могут входить активные ингредиенты вместе с фармацевтически приемлемыми наполнителями, такими как инертные разбавители, дезинтегрирующие (разрыхляющие) агенты, связующие вещества, смазывающие вещества, подслащивающие вещества, корригенты, красители и консерванты. Подходящие инертные разбавители включают, но не ограничиваются, такими веществами как натрия карбонат и кальция карбонат, натрия фосфат и кальция фосфат, лактоза, в то время как кукурузный крахмал и альгиновая кислота являются подходящими разрыхляющими веществами (дезинтегрантами). Связующие вещества могут быть представлены, включая, но не ограничиваясь, крахмалом и желатином, а в роли смазывающего вещества (если оно присутствует), как правило, могут выступать стеарат магния, стеариновая кислота или тальк. При желании таблетки могут быть покрыты таким материалом как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат, чтобы замедлить всасывание в желудочно-кишечном тракте.
Фармацевтические композиции для перорального применения можно получить с помощью комбинирования гибридного белка на основе БТШ70 с твердым наполнителем, который дополнительно измельчают, а затем полученную смесь перерабатывают до смеси гранул для получения лекарственного средства в виде таблетки или сердцевины драже после добавления, при желании, соответствующих составов. Подходящими твердыми наполнителями, в дополнение к ранее упомянутым, являются углеводные или белковые наполнители, например сахар, в том числе лактоза, сахароза, маннит или сорбит; кукурузный, пшеничный, рисовый, картофельный крахмал или крахмал, полученный из других растений; целлюлоза, например метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза или натрий-карбоксиметилцеллюлоза, камедь, в том числе аравийская и трагакант, а также белки, такие как желатин и коллаген. Дополнительно могут быть добавлены дезинтегрирующие или солюбилизирующие агенты, такие как сшитый поливинилпирролидон, агар, альгиновая кислота или ее соль, такая как альгинат натрия.
Капсулы для перорального применения представляют собой твердые желатиновые капсулы, в которых активный ингредиент смешан с твердым наполнителем, и мягкие желатиновые капсулы, в которых активные ингредиенты смешивают с водой или маслом, таким как арахисовое масло, жидкий парафин или оливковое масло.
Драже имеют подходящее покрытие. Для этой цели можно использовать концентрированные растворы сахара, которые могут по выбору содержать аравийскую камедь, тальк, поливинилпирролидон, гель карбопол, ПЭГ и/или диоксид титана, растворы лаков и подходящие органические растворители или смеси растворителей. В покрытие таблеток или драже можно добавлять красители или пигменты для идентификации или характеристики доз активного гибридного белка на основе БТШ70 с различными комбинациями ингредиентов.
Препарат по настоящему изобретению, предназначенный для введения через слизистую (например, трансбуккально, ректально, интраназально), может содержать смачивающие средства, обеспечивающие проникновение лекарственного средства через слизистую оболочку в планируемом месте введения. Такие смачивающие средства, как правило, являются общеизвестными для специалистов в данной области.
В частности, препараты по настоящему изобретению, могут быть введены в носовую полость в любой подходящей форме. Например, препараты по данному изобретению, могут быть введены в носовую полость в виде капель или спрея или порошков, полученных по настоящему изобретению, которые могут быть применены в виде аэрозоля. Одним из способов введения препаратов по данному изобретению может быть использование ингаляционного устройства для распыления аэрозолей. Указанное ингаляционное устройство может быть выполнено в виде устройства однократной доставки или в виде ингаляционной системы, обеспечивающей многократную доставку доз, например содержащей резервуар, насос и привод; сведения о подобных устройствах доступны из различных коммерческих источников, в том числе Pfeiffer (Германия), Valois (Франция), Calmar (Германия), Ursatech (Германия), Bespak (Великобритания) и Becton-Dickinson (США). Для интраназального введения препаратов по настоящему изобретению подходят также электростатические распылители, подобные описанным в патенте США №5.655.517.
Препараты для ректального введения могут быть представлены в виде суппозиториев, имеющих соответствующую основу, например из масла какао или эфира салициловой кислоты. Препараты, пригодные для вагинального введения, могут быть изготовлены в виде вагинальных суппозиториев, тампонов, гелей, пасты, пены или аэрозолей, содержащих, в дополнение к активному ингредиенту, такие носители, применение которых является в данной области общеизвестным. Для внутримышечного, внутрибрюшинного, подкожного и внутривенного введения гибридный белок на основе БТШ70, как правило, будет представлен в виде стерильных водных растворов или суспензий, буферизованных, с тем, чтобы обеспечить соответствующие pH и изотоничность. Подходящие водные носители включают раствор Рингера и изотонический раствор натрия хлорида. Водные суспензии могут включать суспендирующие агенты, такие как производные целлюлозы, альгинат натрия, поливинилпирролидон и трагакант и смачивающие агенты, такие как лецитин. Подходящими консервантами для водных суспензий являются этил- и н-пропил-п-гидроксибензоат.
Суппозитории для ректального применения гибридных белков на основе БТШ70 могут быть получены путем смешивания лекарственного средства с подходящим нераздражающим наполнителем, который является твердым при обычных температурах, но становится жидким при температуре, соответствующей ректальной, и поэтому будет плавиться в прямой кишке с высвобождением лекарственного средства. К таким материалам относятся масло какао и ПЭГ.
Препараты для трансдермального введения могут быть приготовлены в виде палочек-аппликаторов, растворов, суспензий, эмульсий, гелей, кремов, мазей, паст, желе, красок, порошков или аэрозолей.
Гибридные белки на основе БТШ70 могут быть также представлены в форме водных или липосомальных составов. Водные суспензии могут содержать гибридный белок на основе БТШ70 в смеси с наполнителями, пригодными для приготовления водных суспензий. В роли таких наполнителей могут быть использованы, включая, но не ограничиваясь, такие суспендирующие агенты, как натрий карбоксиметилцеллюлоза, метилцеллюлоза, гидроксипропил-метилцеллюлоза, альгинат натрия, поливинилпирролидон, трагакант и камедь акации, а также диспергирующие или смачивающие агенты, такие как природные фосфатиды (например, лецитин), продукт конденсации алкиленоксида с жирной кислотой (например, стеарат полиоксиэтилена), продукт конденсации этиленоксида с длинноцепочечными алифатическими спиртами (например, гептадекаэтилен оксицетанол), продукт конденсации этиленоксида со сложным эфиром, полученным из жирной кислоты и гексита (например, полиоксиэтилен сорбит моноолеат), или продукт конденсации этиленоксида со сложным эфиром, полученным из жирной кислоты и ангидрид гексита (например, полиоксиэтиленсорбитана моноалеат). Водная суспензия может также содержать один или несколько консервантов, например этил- или н-пропил п-гидроксибензоат, один или несколько красителей, один или несколько ароматизирующих агентов и один или несколько подслащивающих веществ, таких как сахароза, аспартам или сахарин. Вышеуказанные лекарственные формы могут поддерживать осмолярность.
Масляные суспензии можно приготовить путем суспендирования гибридных белков на основе БТШ70 в растительном масле, например в арахисовом, оливковом, кунжутном или кокосовом масле, а также в минеральном масле, типа жидкого парафина, или в смеси из указанных масел. Масляные суспензии могут содержать в себе загустители типа пчелиного воска, твердого парафина или ацетилового спирта. Для повышения вкусовых качеств препарата для перорального применения могут добавляться подсластители, такие как глицерин, сорбит или сахароза. Консервация таких составов обеспечивается за счет добавления антиоксидантов типа аскорбиновой кислоты. Пример инъекционного масляного препарата представлен, например в работе Minto (J. Pharmacol.exp.ther.281:93-102, 1997). Фармацевтические препараты могут быть приготовлены также в виде водомасляных эмульсий. Масляной фазой может быть растительное или минеральное масло, описанное выше, или смесь указанных видов масел. Соответствующими эмульгирующими веществами являются природные камеди, типа аравийской камеди и трагаканта, природные фосфатиды, типа соевого лецитина, сложные эфиры или неполные эфиры, полученные из сложных кислот и гекситангидрида, например сорбитанмонолаурат, и продукты конденсации этих неполных эфиров с оксидом этилена типа полиоксиэтилен сорбитан моноолеата. В состав эмульсии могут также входить подсластители и ароматизаторы, как и в состав сиропов и эликсиров. Такие составы могут также содержать вспомогательные вещества, смягчающие и уменьшающие раздражение, консерванты, или красители.
Кроме препаратов, описанных выше, гибридные белки на основе БТШ70 также могут быть получены в лекарственной форме «депо». Такие пролонгированные лекарственные формы могут вводиться в организм путем имплантации или чрезкожного введения (например, подкожного или внутримышечного), внутримышечной инъекции или с помощью трансдермального пластыря. Так, например, препараты могут быть приготовлены с применением подходящих полимерных или гидрофобных материалов (например, в виде эмульсии в приемлемом масле), ионообменных смол или в виде труднорастворимых производных, например в виде труднорастворимой соли.
Фармацевтические композиции могут также содержать подходящие твердые или гелеобразные носители или наполнители. Примерами подобных носителей или наполнителей могут служить, включая, но не ограничиваясь, кальция карбонат, кальция фосфат, различные сахара, крахмалы, производные целлюлозы, желатин и полимеры, такие как ПЭГ.
При использовании ингаляционного пути введения, препараты, как правило, вводят в виде аэрозольного спрея из аэрозольного баллона или небулайзера с применением подходящего пропеллента, например дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, диоксида углерода или другого подходящего газа. В случае применения аэрозольного баллона дозировочную единицу можно определить с помощью клапана для доставки отмеренного количества. Капсулы и картриджи, например из желатина, для использования в ингаляторе или инсуфляторе могут содержать порошкообразную смесь препарата и подходящую порошковую основу, такую как лактоза или крахмал.
В обычном состоянии подходящая доза будет находиться в диапазоне от 0,001 до 10 мг на кг массы тела реципиента в день, предпочтительно в интервале от 0,005 до 1 мг на кг массы тела в день. Необходимая доза, предпочтительно, должна применяться один раз в день, но может быть дозирована в виде двух, трех, четырех, пяти, шести или более субдоз, вводимых через соответствующие промежутки времени в течение дня.
Гибридные белки на основе БТШ70 можно вводить в качестве единственного активного агента или в комбинации с другими известными терапевтическими средствами, применяемыми для лечения БТШ70-зависимых расстройств или заболеваний. В любом случае, лечащим врачом может быть назначено профилактическое или терапевтическое лечение путем регулирования дозировки и частоты введения препарата на основе наблюдений за одним или более симптомами расстройства или заболевания в динамике процесса лечения.
Подробности о способах приготовления и путях введения лекарственных форм достаточно подробно описаны в научной и патентной литературе, см., например последнее издание  Pharmaceutical Sciences, Maack Publishing Co, Easton Pa.  После объединения лекарственного средства с фармацевтически приемлемым носителем, полученный препарат может быть помещен в контейнер с соответствующей этикеткой, отражающей его назначение для лечения конкретного расстройства или заболевания. Для применения БТШ70 такая этикетка будет включать, в частности инструкцию, содержащую сведения о дозе, частоте приема и способе применения данного препарата.
6. ПРИМЕРЫ
Настоящее изобретение иллюстрируется следующими примерами, которые не являются исчерпывающими.
6.1. Установление профилей активности БТШ70 и БТШ70-ПЭГ
6.1.1. Приготовление синтетических препаратов БТШ70 и БТШ70-ПЭГ
Пример 1. Ферментация рчБТШ70
Чтобы приготовить заданное количество БТШ70, 5 л штамма-продуцента E. coli генотипа HMS174 (DE3) hHSP70 выращивают в среде, содержащей 12 г фитона пептона, 60 г дрожжевого экстракта, 40 г хлорида натрия, 1 г метионина, и воду до 5 л. Перед посевом штамма-продуцента, среду стерилизуют с добавлением антибиотика канамицина в концентрации 30 мкг/мл, после чего засевают 1 л суточной культуры бактерий HMS174 (DE3) hHSP70.
В процессе ферментации постоянно контролируют значение pH, уровень растворенного кислорода и температуру внутри реактора-ферментера. При достижении культурой оптической плотности примерно 1,2 (например, через 2,5 ч после введения), добавляют изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ) до конечной концентрации 1 ммоль/л, чтобы инициировать экспрессию рчБТШ70. Рост культуры продолжают до достижения оптической плотности примерно 2,7 (например, через 3,5 ч после введения ИПТГ). Выделение ферментированных бактерий производят путем центрифугирования с использованием стандартных методик. Бактериальный осадок повторно суспендируют в 1 л 10 ммоль/л натрий-фосфатного буфера (PBS) (1 ммоль/л этилендиаминтетрауксусной кислоты /ЭДТА/, 10% глицерола. После этого ресуспендированные бактерии замораживают на сухом льду и хранят в таком виде до последующего применения. Для использования замороженные бактерии размораживают с последующим лизисом под давлением. Затем полученный лизат очищают и стерильно отфильтровывают.
Пример 2. Очистка рчБТШ70
Осуществляют двухступенчатую очистку бактериального лизата, содержащего рчБТШ70. Данный конкретный пример предусматривает использование 500 мл лизата; для других объемов лизата необходимо осуществлять соответствующую корректировку. На первой стадии очистки 500 мл очищенного лизата (приготовленного как это было описано в предыдущем примере) разбавляют в два раза 10 ммоль/л PBS, pH 7,0. Затем 1 л разбавленного и очищенного бактериального лизата вносят в колонку с ДЭАЭ-сефацел (DEAE Sephacel™, Pharmacia, Швеция) (13×15 см), предварительно уравновешенной двухкратным по отношению к объему колонки объемом буфера А (10 ммоль/л PBS; pH 7,0; 20 ммоль/л хлорида натрия; 10 ммоль/л сульфата аммония). Проводят элюирование двухкратным объемом буфера В (20 ммоль/л PBS, pH 7,0; 85 ммоль/л хлорида натрия; 10 ммоль/л сульфата аммония). Ожидаемый выход составляет около 2 л элюата. Затем проводят диафильтрацию (с заменой буфера) элюата против 10-кратного объема буфера С (20 ммоль/л цитрата натрия, pH 6,0; 100 ммоль/л хлорида натрия; 10 ммоль/л сульфата аммония).
На втором этапе очистки 700 мл объема колонки (13×5,5 см) с АТФ-агарозой (Sigma-Aldrich, США) уравновешивают равным объему колонки объемом буфера D (20 ммоль/л натрия цитрата, pH 6,0; 85 ммоль/л хлорида натрия; 10 ммоль/л сульфата аммония). Диафильтрированный раствор пропускают через колонку с АТФ-агарозой. Затем колонку промывают шестикратным объемом буфера D, после чего элюируют двухкратным объемом буфера Е (20 ммоль/л цитрата натрия, pH 6,0; 100 ммоль/л хлорида натрия; 10 ммоль/л сульфата аммония; 1 ммоль/л ацетата магния; 1 ммоль/л аденозинтрифосфата /АТФ/). Элюированный рчБТШ70, имеющий чистоту свыше 95%, помещают в забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), концентрируют до конечной концентрации 10-20 мг/мл, а затем стерильно отфильтровывают.
Пример 3. Технология пегилирования рчБТШ70
Эффективность терапевтического агента может быть повышена за счет улучшения его биодоступности несколькими средствами, одним из которых является пегилирование - процесс химического присоединения ПЭГ к целевому терапевтическому агенту, в результате которого будет получено производное с повышенным временем полураспада. Дополнительными преимуществами пегилированных продуктов являются также более низкая иммуногенность, снижение частоты приема, повышенная растворимость, повышенная стабильность, а также снижение почечного клиренса. Поскольку наиболее распространенными реакционноспособными участками белков (в том числе, пептидов) для крепления ПЭГ являются ε-аминогруппа лизина и α-аминогруппа N-концевого участка, известные способы пегилирования в конечном итоге приводят к модификации многочисленных участков, что не позволяет получить не только монопегилированное производное, состоящее из смеси позиционных изомеров, таких как PEGINTRON™ (Grace et al, J. Biol. Chem. 2005; 280:6327) и PEGASYS (Dhalluin et al, Bioconjugate Chem. 2005; 16:504), но также аддукты, включающие более одной ПЭГ цепи.
2
2
ПЭГ реагенты, используемые для получения пегилированных лекарственных средств по настоящему изобретению, могут содержать гетерогенную смесь ПЭГ, имеющую различное количество (n) этиленгликоля субъединиц в ПЭГ полимере. Одна этиленгликоля субъединица ПЭГ (-(СНСНО)) имеет молекулярную массу приблизительно 44 кДа. Таким образом, молекулярная масса ПЭГ полимера зависит от количества (n). Количество ПЭГ, присоединенных к рчБТШ70 при его пегилировании, в настоящем изобретении имеет n молекул ПЭГ в диапазоне от 400 до 1000 субъединиц. Предпочтительным является, когда количество молекул ПЭГ, присоединенных к молекуле БТШ70 при ее пегилировании в соответствии с настоящим изобретением, имеет (n) в интервале приблизительно от 400 до 750.
6.1.1.1. Активированный ПЭГ для амино- или иминосвязывания
Активированный связывающий агент (линкер), ковалентно присоединенный к одной или нескольким молекулам ПЭГ, может взаимодействовать с амино- или иминогруппой аминокислотного остатка, например с α-аминогруппой на N-концевом участке БТШ70, чтобы сформировать БТШ70-ПЭГ по настоящему изобретению.
Связывающий агент «активируется», если он химически активен и готов для ковалентной связи, например с аминогруппой аминокислотного остатка. Любой активированный связующий агент может быть использован в настоящем изобретении, при условии, что он может вместить одну или несколько молекул ПЭГ и сформировать ковалентную связь, например с аминогруппой аминокислотного остатка в подходящих условиях для реакции. Например, активированный связывающий агент присоединяется к α-аминогруппе с высокой избирательностью по сравнению с другими участками присоединения, например ε-аминогруппе лизина или иминогруппе гистидина.
Активированный ПЭГ может быть представлен формулой: (PEG)b-L', где PEG ковалентно присоединен к атому углерода связывающего агента, чтобы сформировать простую эфирную связь, b представляет собой число от 1 до 9 (т.е. от 1 до 9 молекул ПЭГ может быть присоединено к связывающему агенту) и L' содержит реакционноспособную группу (активированный остаток), который может вступать в реакцию с амино- или иминогруппами на аминокислотном остатке, чтобы обеспечить ковалентное присоединение ПЭГ к БТШ70.
2
2
В частном варианте реализации изобретения, активированный связывающий агент (L') содержит альдегид формулы RCHO, где R представляет собой линейный (с неразветвленной цепью) или разветвленный алкил. После ковалентного присоединения активированного связывающего агента к БТШ70, связывающий агент (обозначаемый -L- в структурных формулах, приведенных в тексте описания) между БТШ70 и ПЭГ содержит от 2 до 12 атомов углерода. Пропионовый альдегид является примером активированного связывающего агента, используемого в настоящем изобретении. ПЭГ-пропионовый альдегид, представленный формулой PEG-CHCHCHO, описан в патенте США №5.252.714 и доступен для приобретения у Shearwater Polymers (Huntsville, Ala).
В вариантах реализации изобретения, может быть использован подходящий активированный разветвленный связывающий агент. Для осуществления настоящего изобретения можно применять любой подходящий разветвленный связывающий агент ПЭГ, который может ковалентно присоединить две или более молекулы ПЭГ к аминогруппе аминокислотного остатка БТШ70, например к α-аминогруппе на N-концевом участке. Связывающий разветвленный агент, используемый в данном изобретении, может содержать две или три молекулы ПЭГ. Например, разветвленный связывающий агент ПЭГ, используемый в настоящем изобретении, может быть линейным или с разветвленными алифатическими группами, стабильными при гидролизе, и содержать активированную часть, например альдегидную группу, которая реагирует с аминогруппой аминокислотного остатка, как это описано выше. Алифатическая группа с разветвленным связывающим агентом может содержать от 2 до 12 атомов углерода. Например, алифатическая группа может представлять собой третичный бутил (трет-бутил), который содержит три молекулы ПЭГ на каждом из трех атомов углерода (т.е. в общей сложности 9 молекул ПЭГ), и активный альдегидный фрагмент на четвертом углероде трет-бутила. Примеры активированных разветвленных связывающих агентов ПЭГ описаны также в патентах США №№5.643.575, 5.919.455 и 5.932.462. Специалист в данной области, в свете настоящего изобретения, может при желании приготовить модификации разветвленных связывающих агентов ПЭГ, например, добавив активный альдегидный фрагмент.
Способы получения связывающих агентов для использования в настоящем изобретении хорошо известны в данной области, например, см. патенты США №№. 5,643,575, 5,919,455, и 5,932,462. Активированные связывающие агенты ПЭГ, такие как ПЭГ-альдегиды, могут быть доступны из коммерческих источников, например Shearwater Polymers, (Huntsville, Ala.) или Enzon, Inc. (Piscataway, N.J.).
6.1.1.2. Сопряжение реакции между ПЭГ и БТШ70 амино- или иминогруппами
Уравнение реакции, схематически описывающее взаимодействие между ПЭГ-альдегидом, как активированным связывающим агентом, и амино- или иминогруппой остатка аминокислоты одного из мономеров БТШ70 выглядит следующим образом:
1-11
где: R - алкил C;
N - азот реактивной аминогруппы аминокислотного остатка БТШ70 В этой реакции активированный ПЭГ ковалентно присоединяется к БТШ70 с образованием иминной связи. Превращение иминосвязи в связь с восстановителем, например цианборгидридом натрия (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo.), с образованием БТШ70-ПЭГ иллюстрируется следующим уравнением:
3
2
PEG-R-CH=N-HSP70+NaCNBH→PEG-R-CH-NH-HSP70
Вместо цианборгидрида натрия в указанной реакции можно использовать другие восстановители, например боргидрид натрия, трет-бутиламинборан, триацетил натрия боргидрид, диметиламин, триметиламинборан и пиридин. Цианборгидрид натрия использован в частных вариантах осуществления изобретения в связи с тем, что он превращает иминную связь в связь с восстановителем, которая формируется между альдегидной группой активированного ПЭГ и аминогруппой аминокислоты БТШ70.
Как показано в реакциях, в процессе получения БТШ70-ПЭГ образуется основание Шиффа. Это создает определенные проблемы в связи с тем, что данное промежуточное соединение очень трудно отделить от БТШ70-ПЭГ, что может значимо снизить чистоту БТШ70-ПЭГ. Одним из путей устранения этого негативного фактора является применение более высоких концентраций восстановителя, например от 75:1 до 350:1 (см., например, Kinstler et al., Pharm. Res. 13:996-1002 (1996) and Charnow et al, Bioconjugate Chem. 5: 133-140(1994)).
a
При осуществлении способа пегилирования по настоящему изобретению, для каталитического образования ковалентной связи ПЭГ с БТШ70 могут быть использованы различные водные буферы. Значение pH используемого буфера составляет от 5,5 до 7,8, например pH может находиться в нейтральном диапазоне, в частности приблизительно от 6,3 до 7,5. Этот нейтральный диапазон pH будет также способствовать увеличению сайт-специфического пегилирования БТШ70 с N-концевой α-аминогруппой по сравнению с другими имино- или аминогруппами остатков других аминокислот, например лизина или гистидина. В конкретных вариантах реализации используются буферы, имеющие значение pK (отрицательный десятичный логарифм константы диссоциации кислоты) близкое к нейтральной области pH, например фосфатный буфер.
Диапазон температур для получения БТШ70-ПЭГ по настоящему изобретению составляет приблизительно от 5 до 30°C. Например, в некоторых вариантах осуществления способа пегилирования температура составляет примерно от 18 до 25°C.
Реакция пегилирования может продолжаться от 3 до 48 ч, например от 10 до 24 ч. Реакцию можно контролировать с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), которая позволяет различать БТШ70 с различной степенью пегилирования, например БТШ70-моно-ПЭГ и БТШ70-ди-ПЭГ (т.е. пегилирование происходит на двух аминокислотных остатках БТШ70) и т.д. В любой момент, когда целевой БТШ70-ПЭГ получен, реакция может быть прекращена путем добавления раствора глицина для подавления активности оставшегося активированным ПЭГ.
Для очистки БТШ70-ПЭГ можно использовать известные способы разделения и очистки, принятые в данной области, например эксклюзивную хроматографию (в частности, гель-фильтрацию) и ионообменную хроматографию.
Предпочтительным является введение в способ получения лекарственного средства на основе БТШ70-ПЭГ, используемый в настоящем изобретении, дополнительного этапа разделения смеси БТШ70-ПЭГ. В ходе указанного этапа в смеси изомеров БТШ70-ПЭГ производят отделение менее стабильных изомеров БТШ70-ПЭГ (например, БТШ70-гис-ПЭГ) от устойчивых БТШ70-ПЭГ (например, N-концевых БТШ70-ПЭГ или БТШ70-лиз-ПЭГ), что позволяет обеспечить  степень гомогенности полученной промежуточной смеси БТШ70-ПЭГ, например составляющую 95% от аналогичного показателя готового лекарственного средства. Менее стабильные изомеры БТШ70-ПЭГ, например БТШ70-гис-ПЭГ, могут быть гидролизованы в ходе указанного дополнительного этапа. Полученная промежуточная смесь БТШ70-ПЭГ может быть инкубирована в водном буфере, например в Трис-буфере (например, от 10 до 300 ммоль, например, приблизительно от 30 до 70 ммоль) при pH приблизительно от 5,0 до 9,0, например при pH от 7,0 до 8,0 при температуре от 15 до 35°C в течение суток. Кроме того, промежуточная смесь на основе БТШ70-ПЭГ может быть обработана 0,05-0,4 моль гидроксиламина солянокислого (pH около 6,5) при комнатной температуре в течение 0,5-10 ч. Остатки гидролизованного БТШ70 и ПЭГ могут быть удалены из промежуточной смеси, содержащей стабильный БТШ70-ПЭГ, в ходе последующего этапа разделения/очистки с использованием, например гель-фильтрации или ионообменной хроматографии.
В патенте США №5.985.265 пегилирование интерферона при использовании альдегида, как связывающего агента, было достигнуто при кислом pH 4,0 при 4°C. Согласно общепринятой точке зрения в данной области, для наиболее активированного ПЭГ, в случае, если pH реакции увеличивается при базовых условиях, пегилирование происходит на более стабильных центрах белка. Для пегилированного интерлейкина10 (патент США №7.052.686) ПЭГ-сукцинимидил карбонат формирует около 90% лиз-ПЭГ-ИЛ-10 (более стабильного) и около 10% гис-ПЭГ-ИЛ-10 (менее стабильного) в реакции при pH 8,8 и около 64% лиз-ПЭГ-ИЛ-10 и 36% гис-ПЭГ-ИЛ-10 в реакции при pH 6,3.
6.1.1.3. Приготовление модифицированного по цистеину БТШ70-ПЭГ
В одном из вариантов реализации изобретения рчБТШ70-ПЭГ был получен при использовании ПЭГ-малеимид реагента 20 кДа (Nanocs, NY, USA). Малеимидная группа специфично реагирует с сульфгидрильными группами, когда pH реакционной смеси поддерживают между pH 6,5 и 7,5, в результате чего образуется стабильная необратимая тиоэфирная связь, которая не может быть разорвана при применении восстанавливающих агентов. БТШ70 имеет 5 цистеиновых групп в следующих АА позициях: 17, 267, 306, 574 и 603.
Известно, что цистеиновые тиолы не участвуют в образовании внутримолекулярных дисульфидных связей, и поэтому все цистеиновые остатки потенциально поддаются пегилированию, но в определенных условиях Cys574 может участвовать в образовании межмолекулярных дисульфидных связей (Nemoto et al. 2006). Остатки Cys267 и Cys306 могут быть спрятаны внутри молекулы белка и/или замаскированы субстратами, что значительно снижает их доступность и способность участвовать в реакции пегилирования. Тест Эллмана подтвердил наличие свободных тиоловых групп в молекуле БТШ70. Однако изменений структуры молекулы БТШ70 при попытке проведении реакции пегилирования в физиологическом растворе при pH 7,1 не выявлено, о чем свидетельствовало отсутствие изменения продолжительности удерживания по данным ВЭЖХ, а также отсутствие дополнительных продуктов реакции пегилирования кроме исходного неизмененного БТШ70 (по данным ДСН-ПААГ-электрофореза).
Пегилирование БТШ70 удалось осуществить только при его денатурации в присутствии 6 моль гуанидина, причем эффективность пегилирования БТШ70 существенно снижалась при снижении концентраци гуанидина или мочевины. Степень пегилирования цистеина зависела от изменения соотношений ПЭГ-малеимид, в среднем от 1 до 5 ПЭГ фрагментов на одну молекулу белка. На основании данных ВЭЖХ, пик, связанный с образованием белка, исчезал при использовании не менее 50 экв ПЭГ-малеимид. Окончательную очистку БТШ70-ПЭГ проводили с использованием эксклюзивной хроматографии в PBS при pH 7,4.
Пегилированные белковые продукты быстро свертываются при помещении их в PBS или во время проведения эксклюзивной хроматографии. Пегилированные продукты концентрировали до 0,5-2 мг/мл с использованием мембран Amicon (размер фильтра 0,22 мкм). Биологическую активность молекул БТШ70-ПЭГ выявляли путем определения активности аденозинтрифосфатазы (АТФ-азы) с использованием коммерческого набора (ENZO Life Sciences, Farmingdale, NY). Для повышения эффективности теста определения биологической активности АТФ-азы применяют такие соединения, как БТШ40 и модифицированный альбумин, однако максимальный эффект был получен при использовании 1 ммоль аденозиндифосфата (АДФ).
6.1.2. Применение рчБТШ70 и рчБТШ70-ПЭГ in vivo
Пример 4. Применение рчБТШ70 для повышения работоспособности при интенсивных физических нагрузках в эксперименте
Целью данного эксперимента являлось изучение влияния экзогенного рчБТШ70 на выносливость (физическую работоспособность) при интенсивных физических нагрузках у здоровых взрослых нелинейных белых крыс-самцов (масса тела 180-220 г, питомник «Рапполово», Россия). Исследуемый белок - рчБТШ70 - применяли в двух дозах - по 50 и по 100 мкг на крысу, при этом белок растворяли в воде для инъекций и вводили внутрибрюшинно в объеме 1,0 мл на животное. Эксперимент проводили на трех группах животных: 6 животных - контрольная группа (инъекция плацебо); 6 животных - рчБТШ70, 50 мкг; 6 животных - рчБТШ70, 100 мкг. В эксперимент отбирали животных, у которых были проведены предварительные тренировки, направленные на развитие выносливости, по следующей схеме: ежедневный бег на тредбане в течение 5 мин, период тренировки - 3 сут (скорость беговой дорожки 20 м/мин, угол наклона 20°). Экспериментальные исследования осуществляли с использованием теста «бег на тредбане «до отказа» (отказ животного от дальнейшего продолжения бега), при этом нагрузочные пробы в рамках данного теста проводили через сутки в течение 19 сут, в одно и то же время суток, общее количество - девять нагрузочных проб за период наблюдения. При проведении указанного теста БТШ70 вводили в ходе выполнения первых шести нагрузочных проб (в порядке отсчета), через 5-6 мин после завершения выполнения очередной пробы. Продолжительность бега животного на тредбане «до отказа» использовали в качестве показателя физической работоспособности (выносливости).
Результаты экспериментальных исследований представлены в табл. 1 и на фиг. 1.
Из данных табл. 1 видно, что статистически значимая разница в показателях физической работоспособности (выносливости) наблюдалась после третьей нагрузочной пробы, причем в контрольной группе и группе животных, получавших низкую дозу БТШ70, показатели работоспособности были аналогичны результатам, полученным после первой нагрузочной пробы, а в группе животных, которым вводили более высокую дозу БТШ70, отмечено достоверное повышение показателей работоспособности. В последующих нагрузочных пробах, проводимых в ходе указанного теста, результаты групп животных, получавших БТШ70, были выше результатов контрольной группы, при этом положительный эффект БТШ70 в отношении показателей работоспособности носил дозозависимый характер.
После пятой нагрузочной пробы выявлено снижение показателей работоспособности/выносливости во всех группах животных. Тем не менее, эта тенденция была намного менее выражена в группах животных, получавших БТШ70. После прекращения введения БТШ70, начиная с седьмой нагрузочной пробы, отмечалось дальнейшее снижение работоспособности, однако при всех последующих нагрузочных пробах значения показателей у животных, получавших БТШ70, были более высокими по сравнению с показателями контрольной группы, например после девятой нагрузочной пробы показатели в группе, получавшей БТШ70 в дозе 100 мкг, превышали показатели группы контроля на 35,5%.
После завершения серии интенсивных физических нагрузок - на 19-е сутки эксперимента - у животных контрольной группы выявлен повышение уровней общего белка, креатинина и натрия в крови в сравнении с аналогичными показателями в группах животных, получавших БТШ70 (табл. 2). Кроме того, у животных, получавших препарат БТШ70, отмечено существенное снижение активности креатининфосфокиназы (КФК) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ), что отражает цитопротективные свойства БТШ70. Важно отметить, что при этом не выявлено анаболического действия БТШ70: дополнительного увеличения массы тела животных в группах, получавших препарат, по сравнению с контрольной группой, не наблюдали, хотя у животных всех групп масса тела незначительно повысилась после завершения эксперимента.
Микроскопический анализ
Для подтверждения выводов физиологических функциональных испытаний и биохимического анализа крови, после окончания эксперимента была выполнена биопсия
4
мышц конечностей умерщвленных животных. Трансмиссионную электронную микроскопию осуществляли на электронных микроскопах JEOL 110 СХ (JEOL Ltd., Япония) и Hitachi Н-300 (Hitachi High Technologies, Япония) с использованием образцов, фиксированных в 2,5% глутаровом альдегиде с последующей обработкой тетраоксидом осмия (OsO) в растворе PBS и обезвоживанием в спирте/ацетоне (фиг. 2-4). Срезы тканей, выполненные на микротоме Ultracut-Reichert (Reichert Jung, Германия), окрашивали по методу Мэллори эозином и гематоксилином (фиг. 5, 6).
2
2
Выявленные структурные изменения в мышцах крыс свидетельствовали о наличии дистрофии мышц, рабдомиолиза и асептического воспаления и были менее выражены у животных, получавших лечение БТШ70. Известно, что активация ангиогенеза в значительной степени связана с регенерацией мышц (Borselli С. et al. Functional Muscle Regeneration with Delivery of Angiogenesis and Myogenesis Factors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2010, 107(8):3287-92). В этой связи, плотность капиллярной сети в мышцах является важным показателем, позволяющим оценить степень активации восстановительных процессов в этих структурах после интенсивных (экстремальных) физических нагрузок. Анализ результатов экспериментальных исследований, проведенных в рамках настоящего изобретения, показал (табл. 3), что у животных, получавших БТШ70 (в дозах 50 и 100 мкг), значительно (дозозависимо) увеличивалась плотность капиллярной сети, соответственно, на 330-360%, в частности с 275/мм в контрольной группе до 990/мм в группе, получавшей БТШ70 в дозе 100 мкг.
Кроме того, было выполнено окрашивание сателлитных клеток - популяции зрелых стволовых клеток, ассоциирующихся с миофибриллами и локализованных в базальной мембране мышечных волокон, которые, как полагают (Wagers AJ, Conboy IM. Cellular and Molecular Signatures of Muscle Regeneration: Current Concepts and Controversies in Adult Myogenesis. Cell 2005, 122:659-667), играют ведущую роль в процессах регенерации мышц. Результаты экспериментов в рамках настоящего изобретения показали, что у животных, которым вводили БТШ70, количество сателлитных клеток возрастало в 6-8 раз по сравнению с контрольной группой (табл. 3).
Пример 5. Применение рчБТШ70-ПЭГ для повышения работоспособности при интенсивных физических нагрузках в эксперименте
Целью данного эксперимента являлось изучение влияния экзогенного рчБТШ70-ПЭГ и рчБТШ70 на выносливость (физическую работоспособность) при интенсивных физических нагрузках у здоровых взрослых нелинейных белых крыс-самцов (масса тела 180-220 г, питомник «Рапполово», Россия). Исследуемые белки - рчБТШ70-ПЭГ и рчБТШ70 - применяли в дозе по 100 мкг на крысу, при этом каждый из белков растворяли в воде для инъекций и вводили внутрибрюшинно в объеме 1,0 мл на крысу. Эксперимент проводили на трех группах животных: 6 животных - контрольная группа (инъекция плацебо); 6 животных - БТШ70, 100 мкг; 6 животных - БТШ70-ПЭГ, 100 мкг. В эксперимент отбирали животных, у которых были проведены предварительные тренировки, направленные на развитие выносливости, по следующей схеме: ежедневный бег на тредбане в течение 5 мин, период тренировки - 3 сут (скорость беговой дорожки 20 м/мин, угол наклона 20°). Экспериментальные исследования осуществляли с применением теста «бег на тредбане «до отказа» (отказ животного от дальнейшего продолжения бега), при этом нагрузочные пробы в рамках данного теста проводили ежедневно в течение 10 сут, в одно и то же время, общее количество - 10 нагрузочных проб за период наблюдения. Препараты рчБТШ70 и рчБТШ70-ПЭГ вводили в ходе выполнения первых шести нагрузочных проб (в порядке отсчета), через 5-6 мин после завершения выполнения очередной пробы. Максимальное время пробега животного «до отказа» использовали в качестве показателя физической работоспособности (выносливости).
Результаты исследований представлены в табл. 4.
Данные табл. 4 показывают, что в ходе выполнения первых пяти нагрузочных проб не наблюдалось значимых различий между группами. В дальнейшем работоспособность животных контрольной группы снижалась приблизительно на 30-50% относительно результатов первой нагрузочной пробы, тогда как у животных опытных групп в динамике проведения теста аналогичные показатели возрастали до 115-125%. При этом использование БТШ70-ПЭГ обеспечивало более высокие показатели работоспособности в сравнении с БТШ70. Эти данные подтверждались более высокой плотностью капиллярной сети и большим количеством сателлитных клеток мышц.
По результатам указанных экспериментов также не выявлено анаболического эффекта у БТШ70 и БТШ70-ПЭГ - отсутствовали, как это следует из табл. 5, значимые различия в массе тела животных в контрольной и опытных группах.
Пример 6. Применение БТШ70 для лечения больных с приобретенной миопатией Пациент X., 62 года. Предъявлял жалобы на значительную потерю массы тела (35 кг в течение 1 года), атрофию мышц нижних и верхних конечностей, снижение мышечной силы и выносливости, развитие мышечных контрактур. Электронная микроскопия (фиг. 7) биоптатов из плечевой и икроножной мышц - выявлены выраженные признаки рабдомиолиза, повреждение структуры митохондрий с образованием многочисленных вакуолей, уменьшение числа сателлитных клеток мышц. Клинический диагноз: Приобретенная митохондриальная миопатия, выраженная кахексия был установлен в Военно-медицинской академии, Санкт-Петербург, Россия.
Пациенту вводили внутривенно БТШ70 в дозе 0,5 мг, в течение 7 сут.
Повторное обследование проведено через 6 недель после завершения курса лечения. Установлено, что масса тела пациента увеличился на 6,5 кг, что сопровождалось увеличением массы мышц и мышечной силы более чем на 30%. Кроме того, результаты электронной микроскопии (фиг. 8) показали восстановление нарушенной структуры мышечных волокон, значительное снижение их расслоения, восстановление структуры митохондрий и активацию ядерной функции миоцитов.
6.2. Определение профилей активности гибридных белков на основе БТШ70 Как было показано выше, целевыми эффектами БТШ70 являются лечение БТШ70-зависимых расстройств или заболеваний, в частности уменьшение выраженности повреждений мышц при интенсивных физических нагрузках, а также повышение физической работоспособности (выносливости). Результаты экспериментальных исследований, приведенные ниже, показывают, что гибридные белки на основе БТШ70 обладают биологической активностью, превышающей активность БТШ70 по ряду аспектов применения.
Пример 7. Экспрессия и биологическая активность БТШ70-Fc
6.2.1. Экспрессия и очистка
БТШ70-Fc (полный аминокислотный состав представлен SEQ ID NO: 1), в котором N-концевой участок рчБТШ70 соединен с Fc-фрагментом человеческого IgG1 через линкерный фрагмент, состоящий из шарнирного участка Fc и последовательности сайта расщепления TEV-протеазы (ASGAGSTTENLYFQGGS), был экспрессирован в клеточной линии 239 человеческого эмбриона (АТСС: Catalog № CRL-1573). Клон, экспрессирующий рчБТШ70 (OriGene, Catalog № SC116766; NM_005345.4; HuHSP70, США), состоял из векторной плазмиды pCMV6-XL5 (4,5 Kb; устойчива к ампициллину) и вставки (HuHSP70 2,5 Kb). Экспрессированный БТШ70-Fc был выделен и очищен в соответствии со следующим Регламентом.
Колонку со связывающим белком G трижды промывали 10-20-кратным по отношению к объему колонки объемом ледяного PBS, pH 7,4. Затем образец белка вносили в указанную колонку со связывающей способностью около 20 мг/мл в отношении БТШ70-Fc. Колонку дважды промывали 10-20 объемами PBS для удаления несвязанных и неспецифически связанных белков. Промывку колонки PBS продолжали до тех пор, пока поглощение при 280 нм не достигало фоновых значений (А<0,2). Элюирование целевого белка с колонки осуществляли элюирующим буфером с pH 2,7 (на основе 50 мМ глицина, Thermo Scientific, Catalog №21004) до сбора 1 мл фракций в пробирки, содержащие нейтрализующий буфер (1 М Трис-буфер, pH 9,0). Элюированный белок (SEQ ID NO: 1) диализовали против 2 смен по 1 л PBS (pH 7,2) каждая в течение 24 ч. ДСН-ПААГ-электрофорез проводили в готовых полиакриламидных гелях для электрофореза белков 4-12% NuPAGE Bis-Tris, результаты показаны на фиг. 9.
6.2.2. Биологическая активность in vitro
2
Экспериментально определяли АТФ-азную активность БТШ70-Fc, которая является основным показателем его биологического действия. При этом различные количества указанного белка инкубировали в смеси для количественного анализа, состоящей из 50 ммоль/л Трис-буфера (pH 7,5), 2,5 ммоль/л MgCl и 0,5 ммоль/л АТФ. Анализы выполняли при 37°C в течение 20 мин. Количественно определяли содержание свободного неорганического фосфата (Pi) в смеси в динамике с использованием коммерческого набора ATPase Assay Kit (Innova Biosciences, Catalog № Ca601-0121). Результаты представлены на фиг. 10. Как следует из графика, линейная зависимость отмечалась только при очень низкой концентрации белка (0-0,001 мкг белка). У БТШ70-Fc выявлен высокий уровень АТФ-азной активности (≥640 мкмоль Pi/ч/мкг белка). АТФ-азная активность БТШ70, определенная с использованием описанного выше анализа, не превышала 430 мкмоль Pi/ч/мкг белка.
6.2.3. Биологическая активность in vivo
6.2.3.1. Фармакокинетические свойства
Фармакокинетические свойства БТШ70-Fc определяли в экспериментах на крысах. В исследовании использовали 10 самок крыс CD (225-250 г) с имплантированным шейным венозным катетером (JUGVEIN, Charles River Laboratories, Catalog №24100511). При этом четырем крысам были сделаны внутривенные инъекции по 100 мкг БТШ70, растворенного в воде для инъекций, четырем крысам - инъекции по 100 мкг БТШ70-Fc (в том же растворе), две крысы служили в качестве контрольной группы и получали только воду для инъекций. Пробы крови забирали через 3 мин, 15 мин, 30 мин, 1 ч, 2 ч, 4 ч, 6 ч и 12 ч. Концентрацию БТШ70 и БТШ70-Fc в плазме определяли с использованием коммерческого набора для иммуноферментного анализа ELISA assay (Enzo Life Sciences, Catalog № ADI-EKS-715). 3a 100% принимали максимальную концентрацию БТШ70 и БТШ70-Fc, определяемую в плазме крови после введения указанных белков животным соответствующих опытных групп (достигалась через 3 мин). Сравнительные результаты изменения концентрации БТШ70 и БТШ70-Fc в плазме крови крыс в динамике представлены ниже:
Из приведенных данных видно, что в первые 2 ч после введения белков в организм экспериментальных животных уровень БТШ70-Fc в плазме крови значимо превышал уровень БТШ70. Через 4 ч после введения БТШ70 в плазме крови крыс не определялся, тогда как концентрация БТШ70-Fc в плазме крови составила: через 4 ч - 30% от первоначальной, через 6 ч - 25%, снижаясь к 24 ч до 11% от первоначальной. Таким образом, экспериментальное исследование фармакокинетики БТШ70-Fc свидетельствует о потенциальной возможности проявления более выраженного пролонгированного в сравнении с БТШ70 эффекта при его терапевтическом применении.
Пример 8. Применение БТШ70-Fc для лечения инсульта в мышиной модели ишемически-реперфузионного повреждения головного мозга
2
Для моделирования инсульта была использована методика, описанная в работе (Atochin D.N. et. al. The phosphorylation state of eNOS modulates vascular reactivity and outcome of cerebral ischemia in vivo. J. Clin Invest. 2007, 117(7), 1961-1967), предусматривающая окклюзию средней мозговой артерии (далее по тексту - «СМА»). Согласно указанной методике, экспериментальным животным вводили анестетик 1,5% изофлуран в смеси, содержащей 30% кислорода и 70% NO. Температуру тела поддерживали на уровне 37°C путем использования термостатического нагревающего одеяла (FHC). Гибкий волоконно-оптический зонд (Perimed) прикрепляли к черепу над той областью мозга, которая питается от СМА (2 мм кзади и 6-7 мм в поперечном направлении от теменной кости) для измерений кровотока с помощью лазерной допплеровской флуориметрии. Базовые значения кровотока измеряли до наложения лигатуры на внутреннюю сонную артерию и перевязки СМА и принимали их значения за 100% кровоток. Перевязку СМА осуществляли с использованием нейлоновой нити 8-0 (Doccol Corp.), покрытой силиконом, при этом нить передвигали по общей сонной артерии до основания СМА. Продолжительность окклюзии СМА составляла 60 мин. Ишемию подтверждали при снижении кровотока более чем на 20% от контрольных значений, которые определяли с применением лазерной допплеровской флуориметрии. Реперфузию подтверждали с помощью лазерной допплеровской флуориметрии после удаления лигатуры.
Определение размера очага поражения при инсульте. Размер очага поражения) определяли путем окрашивания 2,3,5-трифенилтетразолин хлоридом (ТТС) (Sigma-Aldrich, США). Срезы головного мозга толщиной 2 мкм получали с использованием матрицы головного мозга мышей (RBM-200C; Activational Systems), окрашивали их 2% ТТС в течение 1 ч при 37°C в темноте и фотографировали цифровой камерой. Фотографии срезов головного мозга анализировали с помощью компьютерной программы анализа изображений (MCID М4; Imaging Research).
Размер очага поражения определяли косвенным методом, который вводит поправку на отек мозга (контралатеральный полусферический объем минус объем неишемической псилатеральной полусферы).
Неврологическая оценка. Через 23 ч после перевязки СМА оценивали выраженность нейрогенной недостаточности у мышей по пятибалльной шкале. Нормальную двигательную активность оценивали как 0, сгибание контралатеральных мышц торса и предплечья при подъеме животного за хвост - 1, движение по кругу в контралатеральную сторону, но в нормальном положении в покое - 2, наклон на контралатеральную сторону в состоянии покоя - 3 и отсутствие спонтанной двигательной активности - 4.
Указанная модель ишемии головного мозга была реализована на 15 мышах, при этом 10 мышам вводили интраперитонеально исследуемые белки, растворенные в воде для инъекций: пяти мышам - по 10 мкг БТШ70 и пяти мышам - по 10 мкг БТШ70-Fc, а пять животных составили группу контроля (вода для инъекций в том же объеме). Через 30 мин осуществляли перевязку СМА и далее наблюдали за мышами в течение 48 ч.
Сравнение защитного эффекта БТШ70 и БТШ70-Fc при экспериментальном инсульте у мышей представлено ниже:
Анализ результатов эксперимента показал, что применение БТШ70 и БТШ70-Fc обеспечило 100%-ю выживаемость экспериментальных животных, тогда как в контрольной группе выживаемость мышей составила 40%. Размер очага поражения у животных, которым вводили БТШ70-Fc, был на 75% меньше чем аналогичный показатель в контрольной группе и на 49% меньше чем показатель в группе, получавшей БТШ70. При этом указанный показатель у мышей, которым вводили БТШ70, был на 50% меньше, чем у мышей контрольной группы. Общее количество баллов, характеризующее выраженность неврологических последствий, в группе мышей, которым вводили БТШ70-Fc, было меньше, в среднем, на 1,2 балла в сравнении с группой БТШ70 и на 2,6 балла в сравнении с контрольной группой.
Пример 9. Применение БТШ70-Fc для повышения работоспособности при интенсивных физических нагрузках в эксперименте
Целью данного эксперимента являлось изучение влияния экзогенного рчБТШ70-Fc и рчБТШ70 на выносливость (физическую работоспособность) при интенсивных физических нагрузках у здоровых взрослых нелинейных белых крыс-самцов (масса тела 180-220 г, питомник «Рапполово», Россия). Исследуемые белки (рчБТШ70-Fc и рчБТШ70) применяли в дозе по 100 мкг на крысу, при этом каждый из белков растворяли в воде для инъекций и вводили внутрибрюшинно в объеме 1,0 мл на животное. Эксперимент проводили на трех группах животных: 6 животных - контрольная группа (инъекция плацебо); 6 животных - рчБТШ70, 100 мкг; 6 животных - рчБТШ70-Fc, 100 мкг. В эксперимент отбирали животных, у которых были проведены предварительные тренировки, направленные на развитие выносливости, по следующей схеме: ежедневный бег на тредбане в течение 5 мин, период тренировки - 3 сут (скорость беговой дорожки 20 м/мин, угол наклона 20°). Экспериментальные исследования осуществляли с применением теста «бег на тредбане «до отказа» (отказ животного от дальнейшего продолжения бега), при этом нагрузочные пробы в рамках данного теста проводили ежедневно в течение 10 сут, в одно и то же время, общее количество - 10 нагрузочных проб за период наблюдения. Животные содержались на обычной диете и были выведены из эксперимента на 11-й день от начала проведения теста. Рассматриваемые белки - рчБТШ70 и рчБТШ70-Fc - вводили в ходе выполнения первых шести нагрузочных проб, через 5-6 мин после завершения выполнения очередной пробы. Максимальное время пробега животного «до отказа» использовали в качестве показателя физической работоспособности (выносливости). Общая продолжительность пробега для отдельного животного составляла от 8 до 25 мин. Результаты теста представлены в табл. 6 и на фиг. 11.
Как видно из данных табл. 6, начиная с седьмого дня эксперимента, выносливость у животных контрольной группы значимо снижалась, достигая по завершении эксперимента приблизительно 55% от исходного значения. Напротив, в группах животных, получавших БТШ70 и БТШ70-Fc, значения показателей выносливости на 7-е сутки достигали максимальных значений и незначительно снижались в последующие сутки, достоверно превышая исходные значения в течение всего срока наблюдения. При этом показатели выносливости в группе, получавшей БТШ70-Fc, были значимо выше, чем аналогичные показатели группы БТШ70. При введении БТШ70 и БТШ70-Fc также не наблюдалось значимого увеличения массы тела у животных в опытных группах в сравнении с контрольной.
На 11-й день после завершения серии интенсивных физических нагрузок в контрольной группе выявлены более высокие уровни общего белка крови, креатинина, натрия и калия в сравнении с опытными группами животных. Кроме того, у животных опытных групп в сравнении с животными контрольной группы отмечалось незначительное снижение активности ЛДГ (на 20%) и выраженное снижение КФК - на 35% у животных, получавших БТШ70, и на 84% у животных, получавших БТШ70-Fc, что свидетельствует о наличии цитопротективных свойств у обоих исследуемых белков (табл. 7).
Микроскопический анализ
Для подтверждения выводов физиологических функциональных испытаний, а также биохимических исследований крови, после окончания эксперимента была выполнена биопсия мышц конечностей умерщвленных животных. Трансмиссионную электронную микроскопию, включая используемое оборудование, подготовку образцов и их окрашивание выполняли аналогично описанному выше в Примере 4.
2
Выявленные структурные изменения в мышцах крыс, которые свидетельствовали о наличии дистрофии мышц, рабдомиолиза и асептического воспаления, были менее выражены у животных опытных групп. Исследование плотности капиллярной сети показало, что у животных, получавших БТШ70-Fc, значение указанного показателя (1317/мм) достоверно превышало значения аналогичных показателей не только контрольной группы животных (почти в 5 раз), но и группы, получавшей БТШ70 (в 1,5 раза). Число сателлитных клеток у крыс, которым вводили БТШ70-Fc, было существенно выше (на 920%) аналогичного показателя контрольной группы, достоверно превышая при этом (на 240%) значение показателя группы, получавшей БТШ70 (табл. 8).
Пример 10. Применение БТШ70-Fc при лечении меланомы
6
Перспективность применения БТШ70-Fc в терапии рака проверяли на модели меланомы В16 у мышей (Overwijk W.W., Restifo N.P. В16 as a mouse model for human melanoma. Curr. Protoc. Immunol. 2001, Chapter 20, Unit 20.1). Самкам мышей (36 особей) линии C57BL возраст 10-12 недель, вес 20-26 г (Питомник лабораторных животных «Пущино», Россия) вводили подкожно 1×10 клеток меланомы В16 (культура клеток меланомы была предоставлена НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова, Санкт-Петербург, Россия). Рост опухоли стал заметен через 10-12 дней. Он сопровождался снижением массы тела, подвижности и груминга.
Через 12 дней после перевивки опухоли животные были разделены на три группы - две опытных и контрольную (по 12 особей каждая). В первой из опытных групп животным интратуморально вводили БТШ70 - по 50 мкг/0,2 мл воды для инъекций, а во второй - БТШ70-Fc - по 50 мкг/0,2 мл воды для инъекций) на 12-й, 14-й и 16-й дни эксперимента; животным контрольной группы в те же дни вводили по 0,2 мл воды для инъекций. В контрольной группе животные начали погибать на 22-ой день. В связи с этим на 22-й день после перевивки меланомы контрольная и каждая из опытных групп были разделены на две подгруппы (по 6 особей каждая). За одной из подгрупп каждой группы наблюдали в течение 80 суток, фиксируя продолжительность жизни каждого животного, и определяли увеличение продолжительности жизни (в абсолютных и относительных единицах) в подгруппах опытных групп в сравнении со средней продолжительностью жизни в соответствующей подгруппе контрольной группы, которая составила 28,2 дня (принята за 100%). У животных второй подгруппы каждой из групп (опытных и контрольной) на 22-й день после перевивки опухоли забирали кровь для исследований при выведении животных из эксперимента, а также определяли размер опухоли по методике (Вершинина С.Ф., Стуков А.Н. Справочник по экспериментальной терапии опухолей. СПб.: 2008. 36 с.) и его уменьшение в сравнении с аналогичным показателем контрольной группы (принят за 100%), количество случаев метастазирования в сравнении с контрольной группой (принято за 100%) и количество метастазов на мышь. У животных указанных подгрупп оценивали также рост опухоли после инъекции опухолевых клеток в динамике. Результаты эксперимента представлены в табл. 9, 10.
2
Выявлено, что у животных опытных групп в сравнении с контрольными значительно уменьшился размер опухоли (соответственно, на 1405 и 2003 мм) и увеличилась продолжительность жизни (в среднем, соответственно, на 25,7 и 38 сут, составив, соответственно, 53,9 и 66,2 сут), а также снизилось количество случаев метастазирования и среднее число метастазов на одно животное. При этом все анализируемые показатели у животных, получавших БТШ70-Fc, были значимо меньше, чем у животных в группе БТШ70 Уровень интерлейкина 6 (IL-6) в крови животных опытных групп, был существенно ниже, чем у животных контрольной группы, причем указанный эффект был значимо более выражен в группе мышей, которым вводили БТШ70-Fc в сравнении с животными, получавшими БТШ70 (табл. 9). Исследование динамики размеров экспериментальных опухолей (табл. 10) показало, что применение БТШ70 и БТШ70-Fc приводило к снижению размеров опухоли в сравнении с группой контроля, начиная с 14-х суток эксперимента. При этом, на 18-е сут исследования отмечено достоверное снижение роста опухоли в группе, получавшей БТШ70-Fc, по сравнению с группой, получавшей БТШ70. В другие сроки наблюдения отмечалась тенденция к снижению роста опухоли. Таким образом, результаты экспериментальных исследований на модели мышиной меланомы показали, что эффективность лечения при применении БТШ70-Fc была значимо выше, чем при использовании БТШ70.
Гистологические исследования влияния БТШ70 и БТШ70-Fc показали наличие выраженной инфильтрации опухоли Т-лимфоцитами и макрофагами, которая отсутствовала в контрольной группе животных. Таким образом, экспериментально установлено, что интратуморальное введение исследуемых белков вызывало защитную иммунную реакцию против первичной опухоли и иммуногенное поражение опухолевых клеток в метастазах.
123
124
125
131
Пример 11. Приготовление БТШ70-Fc, конъюгированного с радиоактивными изотопами I, I, I, I, и использование указанных конъюгатов для визуализации и лечения опухоли
6.2.3.2. Конъюгирование с радиоактивными изотопами
123
124
125
131
Конъюгаты БТШ70-Fc с радиоактивными изотопами I, I, I, или I (далее по тексту также - «радиофармпрепараты», «РФП») готовили путем йодирования остатков тирозина и гистидина с использованием гранул йода, как это описано в работе (Schumacher T.N., Tsomides T.J. In Vitro Radiolabeling of Peptides and Proteins, Curr. Protoc. Protein Sci. 2001, Chapter 3, Unit 3.3). Гранулы радиоактивного йода представляют собой непористые полистироловые гранулы с иммобилизованным окисляющим веществом (N-хлорбензолсульфанамидом), обладающим способностью переводить йод в активную форму.
123
124
125
131
Гранулы радиоактивного йода (Pierce Protein Biology Products, США) промывали 1 мл 0,1 М фосфата натрия, высушивали на фильтровальной бумаге и ресуспендировали в 0,5 мл того же буфера. NaI, NaI, NaI или NaI добавляли к гранулам и перемешивали реакционную смесь в течение 5 мин, с последующим добавлением БТШ70-Fc и перемешиванием еще в течение 30 мин. Продукт реакции очищали путем пропускания через картридж Sep-Pak С18 с элюированием смесью воды и ацетонитрила в соотношении 1:1. После этого конъюгированный с радиоактивным изотопом белок выделяли с использованием вакуумного центрифужного испарителя Thermo Scientific SpeedVac (США). Встраивание радиоактивного йода составляло около 90-92%, а выход белка - около 88-90%.
123
123
123
6.2.3.3. Биораспределение в организме (in vivo) и исследования по визуализации Биораспределение I-БТШ70-Fc изучали на самках мышей линии C57BL (20 особей) с перевитой меланомой В16. Через 12 дней после инъекции опухолевых клеток мышам вводили в хвостовую вену I-БТШ70-Fc (0,37-0,74 МБк, 100 мкл РФП в воде для инъекций). Через 1, 3, 6, 24 и 48 ч после инъекции I-БТШ70-Fc группы мышей, по четыре особи каждая, выводили из эксперимента. Выбранные для исследования органы взвешивали и определяли накопление в них РФП с помощью гамма-счетчика. Накопление РФП выражали в процентах от инъекционной дозы на г ткани (% ID/г ткани).
123
Результаты, представленные в табл. 11, показывают, что I-БТШ70-Fc преимущественно накапливался в опухоли. Через 24 ч наиболее высокий уровень накопления РФП - почти 9,9% - наблюдался в меланоме, тогда как в других органах с высокими исходными уровнями накопления - печени и почках - анализируемый показатель составлял около 0,8%, т.е. имело место более чем 12-ти кратное превышение накопления РФП в опухоли. Эти результаты были подтверждены данными однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ, Single-photon emission computed tomography, SPECT).
6.2.3.4. Исследование эффективности применения in vivo
123
131
124
125
131
131
124
124
125
125
Анализ биораспределения I-БТШ70-Fc позволяет определить основные направления для применения конъюгатов БТШ70 и гибридного белка на его основе с радиоактивными изотопами I, I и I в терапии рака, что в рамках настоящего изобретения было реализовано на экспериментальной модели меланомы у самок мышей линии C57BL (90 особей). Перевивку мышам опухоли меланомы В16 осуществляли аналогично Примеру 10. Для введения указанных РФП была выбрана доза 37 МБк, обеспечивающая доставку 49 Гр в опухоль, что, по данным литературы, соответствует обычно используемой в медицинской практике эффективной дозе. РФП I-БТШР70, I-БТШ70-Fc, I-БТШ70, I-БТШ70-Fc, I-БТШ70 и I-БТШ70-Fc вводили внутривенно двухкратно (2×18,5 МБк) на 12-е и 16-е сут после введения опухолевых клеток в шести группах животных (по 10 мышей каждая). Для сравнения две группы мышей (по 10 особей каждая) в те же дни получали внутривенно инъекции БТШ70 и БТШ70-Fc (по 50 мкг белка/мышь в 0,2 мл воды для инъекций). Животным контрольной группы (10 особей) в те же дни вводили по 0,2 мл воды для инъекций.
В контрольной группе мыши начали погибать на 21-й день после инъекции опухолевых клеток. В связи с этим на 21-й день после перевивки меланомы контрольная и каждая из опытных групп были разделены на две подгруппы (по 5 особей каждая). За одной из подгрупп каждой группы наблюдали в течение 80 суток, фиксируя продолжительность жизни каждого животного, и определяли продолжительности жизни (в абсолютных и относительных единицах) в подгруппах опытных групп в сравнении со средней продолжительностью жизни в соответствующей подгруппе контрольной группы, которая составила 27,9 дня (принята за 100%). Животных второй подгруппы каждой из групп (опытных и контрольной) на 21-й день после перевивки опухоли выводили из эксперимента и определяли (аналогично Примеру 10) размер опухоли и его уменьшение в сравнении с аналогичным показателем контрольной группы (принят за 100%), количество случаев метастазирования в сравнении с контрольной группой (принято за 100%) и количество метастазов на мышь.
Результаты экспериментальных исследований представлены в табл. 12.
131
124
125
124
Из данных табл. 12 следует, что радиоиммунотерапия с использованием конъюгатов БТШ70 и БТШ70-Fc с радиоизотопами I, I и I обеспечивала у животных опытных групп (в сравнении с контрольной) значительное уменьшение размера опухоли, увеличение продолжительности жизни, а также снижение количества животных с метастазами и числа метастазов на мышь. В сравнении с эффективностью конъюгатов БТШ70 и БТШ70-Fc с указанными радиоактивными изотопами противоопухолевый эффект БТШ70 и БТШ70-Fc был значимо менее выражен. При этом эффективность конъюгатов БТШ70-Fc с радиоактивными изотопами достоверно превышала эффективность конъюгатов БТШ70. Наиболее выраженный (в сравнении с другими РФП) противоопухолевый эффект отмечался у I-БТШ70-Fc.
Пример 12. Применение БТШ70-Fc для лечения фиброза печени
4
Известно, что БТШ70 при его введении в организм естественным образом накапливается в печени (Takemoto S., Nishikawa М., Takakura Y. Pharmacokinetic and tissue distribution mechanism of mouse recombinant heat shock protein 70 in mice. Pharm. Res. 2005, 22(3), 419-426). В этой связи, целью эксперимента являлось изучение влияния БТШ70 и БТШ70-Fc на развитие фиброза печени. Для этого использовали мышиную модель фиброза, описанную в работе (Fujii Т. et al. Mouse model of carbon tetrachloride induced liver fibrosis: Histopathological changes and expression of CD133 and epidermal growth factor. BMC Gastroenterol. 2010, 10, 79). Как отмечено в указанной работе, введение мышам CCl в течение 15-17 недель приводило к развитию мостовидного фиброза (Ishak score 3-4), что проявлялось повышенной митотической активностью, интенсивной нейтрофильной инфильтрацией, распространенной жировой дистрофией и выраженным центролобулярным некрозом печени. Авторами цитируемой работы также выявлено значительное накопление коллагена и наличие псевдодольчатых образований в печени.
4
В рамках настоящего изобретения эксперимент проводили на 30-ти белых мышах-самцах инбредной линии A/J в возрасте 5 недель (Jackson Laboratory, США), которые были разделены на три группы (по 10 особей). Всем животным (контрольной и опытных групп) вводили по 0,04 мл 40% раствора тетрахлорида углерода (CCl) (Sigma-Aldrich, США) в оливковом масле, внутрибрюшинно, три раза в неделю в течение 17 недель. Начиная с 16-ой недели, животным одной из опытных групп вводили БТШ70 (по 50 мкг/мышь), а другой - БТШ70-Fc, при этом белки растворяли в воде для инъекций и вводили внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл на мышь, два раза в неделю на протяжении трех недель (16-я, 17-я, 18-я). Животным контрольной группы с той же кратностью в те же сроки вводили внутрибрющинно воду для инъекций в объеме 0,2 мл на мышь. Через четыре недели после начала введения БТШ70 и БТШ70-Fc (в конце 19-й недели) все животные были выведены из эксперимента с отбором образцов крови и биоптатов печени. Для сравнительной оценки защитного действия исследуемых белков определяли показатели цитолитического синдрома, в качестве которых использовали активность аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (ACT) в плазме крови, и морфологические характеристики поражения печени. Для гистологического анализа биоптаты печени фиксировали в 10% забуференном PBS формалине. Подготовка образцов ткани печени для гистологического исследования включала подготовку срезов толщиной 3-5 мкм с последующей заливкой в парафин. Срезы окрашивали гематоксилин-эозином (для общей оценки структурных изменений в органе) и трихромом (для определения уровня коллагена). Выраженность морфологических признаков воспалительного процесса в печени устанавливали с применением балльной оценки по шкале Ishak (Ishak score) (Ishak K. et al. Histological grading and staging of chronic hepatitis. J. Hepatol. 1995, 22(6), 696-699).
Результаты определений представлены в табл. 13.
4
Из данных табл. 13 следует, что гепатотоксическое действие CCl было значимо менее выражено в группах экспериментальных животных, которым вводили БТШ70 и БТШ70-Fc в сравнении с контрольной группой, что проявлялось как в значимом уменьшении выраженности морфологических признаков поражения печени (в 1,5 и 2,4 раза, соответственно), так и в существенном снижении уровней АЛТ (на 18,9 и 47,8%, соответственно) и ACT (на 23,7 и 49,4%, соответственно). При этом защитный эффект БТШ70-Fc был значимо более выражен в сравнении с БТШ70 и по морфологическим и по биохимическим показателям.
Источники информации
Jammes Y, Steinberg JG, Delliaux S, Bregeon F. Chronic Fatigue Syndrome Combines Increased Exercise-Induced Oxidative Stress And Reduced Cytokine and HSP Responses. J. Intern. Med. 2009, 266(2), 196-206.
Lee CE, McArdle A, Griffiths RD. The role of hormones, cytokines and heat shock proteins during age-related muscle loss. Clin. Nutr. 2007, 26(5), 524-534.
Maglara AA, Vasilaki A, Jackson MJ, McArdle A. Damage to Developing Mouse Skeletal Muscle Myotubes in Culture: Protective Effect of Heat Shock Proteins. J. Physiol. 2003, 548(3), 837-846.
Morton JP, Kayani AC, McArdle A, Drust B, Exercise-Induced Stress Response of Skeletal Muscle, with Specific Emphasis on Humans. Sport Med. 2009, 39(8), 643-662.
Panossian A, Wikman G. Evidence-Based Efficacy of Adaptogens in Fatigue, and Molecular Mechanisms Related to Their Stress-Protective Activity. Curr. Clin. Pharmacol. 2009, 4(3), 198-219.
Slepian MJ, Massia SP. Treatment of Tissues to Reduce Subsequent Response to Injury. US Patent 5,914,345.
Srivastava PK, Chandawarkar RY. Compositions and Methods for Promoting Tissue Repair Using Heat Shock Proteins. US Patent Application US 2003/0012793.
Takahashi N. Heat Shock Protein Inducer. US Patent Application 6,846,845 B2.
Balogh G, Glatz A,  Boros I,  Farkas B, Jaszlits L,  Maresca B. Bimoclomol: a Nontoxic, Hydroxylamine Derivative with Stress Protein-Inducing Activity and Cytoprotective Effect. Nature Medecine. 1997, 3(10), 1150-1154.
Whitham M, Fortes MB. Heat Shock Protein 72: Release and Biological Significance Front. Biosci. 2008, 13, 1328-1339.
Включение путем ссылки
Полное содержание всех патентов, опубликованных патентных заявок и других ссылок, указанных в настоящем документе, включено во всей полноте в описание данной заявки посредством ссылки.
Эквиваленты
Средние специалисты в данной области техники знают или будут способны установить с использованием рутинных экспериментов многочисленные эквиваленты конкретных процедур, описанных в настоящем документе. Такие эквиваленты рассматриваются, как входящие в объем настоящего изобретения, и охватываются формулой изобретения. Более того, любые численные или алфавитные диапазоны, представленные здесь, включают как верхние, так и нижние граничные значения указанных диапазонов. Кроме того, любой перечень или компоновка признаков подразумевают их реализацию, по меньшей мере, в одном варианте, что сделано для сокращения или удобства перечисления независимых вариантов, при этом каждый элемент списка (признак) как таковой следует рассматривать как отдельный вариант реализации.