РЕКОМБИНАНТНЫЙ МИКРООРГАНИЗМ ДЛЯ УЛУЧШЕННОГО ПОЛУЧЕНИЯ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ ТОНКОГО ОРГАНИЧЕСКОГО СИНТЕЗА

1. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, характеризующаяся последовательностью, выбранной из следующей группы:
(I) молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность SEQ ID NO: 1, 45 или 49, или
(II) молекула нуклеиновой кислоты, характеризующаяся по меньшей мере 80% идентичностью относительно молекулы нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 1, 45 или 49, или
(III) молекула нуклеиновой кислоты, гибридизующаяся с комплементом молекулы нуклеиновой кислоты, характеризующейся SEQ ID NO: 1, 45 или 49, при жестких условиях, или
(IV) молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид согласно SEQ ID NO: 2, 46 или 50, или
(V) молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, характеризующийся по меньшей мере 60% гомологией относительно полипептида согласно SEQ ID NO: 2, 46 или 50,
где кодон генов согласно (I)-(v), соответствующий положению 13-15 в SEQ ID NO: 1, не кодирует аминокислоту глутамин и не представляет собой стоп-кодон, или аминокислота белков, кодируемых генами согласно (I)-(v), соответствующая положению 5 в SEQ ID NO: 2, не представляет собой глутамин и не представляет собой стоп-кодон, и
где кодон генов согласно (I)-(v), соответствующий положению 913-915 в SEQ ID NO: 45, не кодирует аминокислоту аргинин и не представляет собой стоп-кодон, или аминокислота белков, кодируемых генами согласно (I)-(v), соответствующая положению 305 в SEQ ID NO: 46, не представляет собой аргинин и не представляет собой стоп-кодон, и
где кодон генов согласно (I)-(v), соответствующий положению 208-210 в SEQ ID NO: 49, не кодирует аминокислоту аланин и не представляет собой стоп-кодон, или аминокислота белков, кодируемых генами согласно (I)-(v), соответствующая положению 70 в SEQ ID NO: 50, не представляет собой аланин и не представляет собой стоп-кодон.
2. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по п. 1, характеризующаяся последовательностью согласно SEQ ID NO: 1, где кодон, кодирующий аминокислоту глутамин в положении 13-15, замещен кодоном, кодирующим аминокислоту гистидин или сходную с гистидином аминокислоту или другую основную аминокислоту, или кодоном, кодирующим аминокислоту аспарагин или сходную с аспарагином аминокислоту или другую алифатическую аминокислоту, или кодоном, кодирующим аминокислоту аргинин или сходную с аргинином аминокислоту или другую алифатическую аминокислоту, или кодоном, кодирующим аминокислоту тирозин или сходную с тирозином аминокислоту или другую ароматическую аминокислоту.
3. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по п. 1, характеризующаяся последовательностью согласно SEQ ID NO: 45, причем кодон, кодирующий аминокислоту аргинин в положении 913-915, замещен кодоном, кодирующим аминокислоту глицин или сходную с глицином аминокислоту или другую алифатическую аминокислоту.
4. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по п. 1, характеризующаяся последовательностью согласно SEQ ID NO: 49, причем кодон, кодирующий аминокислоту аланин в положении 208-210, замещен кодоном, кодирующим аминокислоту пролин.
5. Рекомбинантная молекула аминокислоты по п. 2, причем аминокислота глутамин в положении 5 замещена гистидином или сходной с гистидином аминокислотой или другой основной аминокислотой, или аспарагином или сходной с аспарагином аминокислотой или другой алифатической аминокислотой, или аргинином или сходной с аргинином аминокислотой или другой алифатической аминокислотой, или тирозином или сходной с тирозином аминокислотой или другой ароматической аминокислотой.
6. Рекомбинантная молекула аминокислоты по п. 3, в которой аминокислота аргинин в положении 305 замещена глицином или сходной с глицином аминокислотой или другой алифатической аминокислотой.
7. Рекомбинантная молекула аминокислоты по п. 4, в которой аминокислота аланин в положении 70 замещена пролином.
8. Рекомбинантная молекула аминокислоты, характеризующаяся последовательностью, выбранной из следующей группы:
(VI) молекула аминокислоты, содержащая последовательность согласно SEQ ID NO: 2, или
(VII) молекула аминокислоты, характеризующаяся по меньшей мере 60% идентичностью относительно молекулы нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 2, или
где аминокислота белка согласно (VII), соответствующая положению 5 в SEQ ID NO: 2, не представляет собой глутамин.
9. Рекомбинантная молекула аминокислоты, характеризующаяся последовательностью, выбранной из следующей группы:
(VI) молекула аминокислоты, содержащая последовательность согласно SEQ ID NO: 46, или
(VII) молекула аминокислоты, характеризующаяся по меньшей мере 60% идентичностью относительно молекулы нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 46, или
где аминокислота белка согласно (VII), соответствующая положению 305 в SEQ ID NO: 46, не представляет собой аргинин.
10. Рекомбинантная молекула аминокислоты, характеризующаяся последовательностью, выбранной из следующей группы:
(VI) молекула аминокислоты, содержащая последовательность согласно SEQ ID NO: 50, или
(VII) молекула аминокислоты, характеризующаяся по меньшей мере 60% идентичностью относительно молекулы нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 50, или
где аминокислота белка согласно (VII), соответствующая положению 70 в SEQ ID NO: 50, не представляет собой аланин.
11. Рекомбинантная экспрессионная конструкция, содержащая по меньшей мере один промотор, являющийся функциональным в микроорганизме, функционально связанный по меньшей мере с одной из молекул нуклеиновой кислоты, как определено в одном из пп. 1-4.
12. Рекомбинантный вектор, содержащий по меньшей мере одну из молекул нуклеиновой кислоты как определено в пп. 1-4 или рекомбинантную экспрессионную конструкцию как определено в п. 11.
13. Рекомбинантный микроорганизм, характеризующийся по меньшей мере одним из следующего:
a) введенная, увеличенная, усиленная или измененная активность и/или экспрессия гена lpd или его гомолога или его функционального варианта,
b) введенная, увеличенная, усиленная или измененная активность и/или экспрессия гена zipA или его гомолога или его функционального варианта,
c) (I) молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность SEQ ID NO: 1, или
(II) молекула нуклеиновой кислоты, характеризующаяся по меньшей мере 80% идентичностью относительно молекулы нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 1, или
(III) молекула нуклеиновой кислоты, гибридизующаяся с комплементом молекулы нуклеиновой кислоты, характеризующейся SEQ ID NO: 1, при жестких условиях, или
(IV) молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид согласно SEQ ID NO: 2, или
(V) молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, характеризующийся по меньшей мере 60% гомологией относительно полипептида согласно SEQ ID NO: 2,
где кодон генов согласно с) (I)-(V), соответствующий положению 13-15 в SEQ ID NO: 1, не кодирует аминокислоту глутамин и не представляет собой стоп-кодон, или аминокислота белков, кодируемых генами согласно с) (I)-(V), соответствующий положению 5 в SEQ ID NO: 2, не представляет собой глутамин.
14. Рекомбинантный микроорганизм по п. 13, причем ген lpd выбирается из следующей группы:
(i) молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность SEQ ID NO: 49, или
(ii) молекула нуклеиновой кислоты, характеризующаяся по меньшей мере 80% идентичностью относительно молекулы нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 49, или
(iii) молекула нуклеиновой кислоты, гибридизующаяся с комплементом молекулы нуклеиновой кислоты, характеризующейся SEQ ID NO: 49, при жестких условиях, или
(iv) молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид согласно SEQ ID NO: 50, или
(v) молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, характеризующийся по меньшей мере 60% гомологией относительно полипептида согласно SEQ ID NO: 50.
15. Рекомбинантный микроорганизм по п. 13, в котором ген zipA выбирается из следующей группы:
(i) молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность SEQ ID NO: 45, или
(ii) молекула нуклеиновой кислоты, характеризующаяся по меньшей мере 80% идентичностью относительно молекулы нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 45, или
(iii) молекула нуклеиновой кислоты, гибридизующаяся с комплементом молекулы нуклеиновой кислоты, характеризующейся SEQ ID NO: 45, при жестких условиях, или
(iv) молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид согласно SEQ ID NO: 46, или
(v) молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, характеризующийся по меньшей мере 60% гомологией относительно полипептида согласно SEQ ID NO: 46.
16. Рекомбинантный микроорганизм, содержащий по меньшей мере одну из рекомбинантных молекул нуклеиновой кислоты, как определено в одном из пп. 1-4, или рекомбинантную экспрессионную конструкцию по п. 11 или рекомбинантный вектор по п. 12.
17. Рекомбинантный микроорганизм по п. 16, дополнительно характеризующийся введенной, увеличенной или усиленной активностью и/или экспрессией гена alaD.
18. Рекомбинантный микроорганизм по п. 16, дополнительно характеризующийся сниженной, репрессированной или удаленной активностью и/или экспрессией гена pflB.
19. Рекомбинантный микроорганизм по п. 16, дополнительно характеризующийся сниженной, репрессированной или удаленной активностью и/или экспрессией гена adhE.
20. Рекомбинантный микроорганизм по п. 16, дополнительно характеризующийся сниженной, репрессированной или удаленной активностью и/или экспрессией гена ldhA.
21. Рекомбинантный микроорганизм по п. 16, дополнительно характеризующийся сниженной, репрессированной или удаленной активностью и/или экспрессией гена pta.
22. Рекомбинантный микроорганизм по п. 16, дополнительно характеризующийся сниженной, репрессированной или удаленной активностью и/или экспрессией frdA.
23. Рекомбинантный микроорганизм по п. 17, причем ген alaD выбирается из группы, состоящей из следующего:
(АА) молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность SEQ ID NO: 15, или
(ВВ) молекула нуклеиновой кислоты, характеризующаяся по меньшей мере 80% идентичностью относительно молекулы нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 15, или
(СС) молекула нуклеиновой кислоты, гибридизующаяся с комплементом молекулы нуклеиновой кислоты, характеризующейся SEQ ID NO: 15, при жестких условиях, или
(DD) молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид согласно SEQ ID NO: 16, или
(ЕЕ) молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, характеризующийся по меньшей мере 60% гомологией относительно полипептида согласно SEQ ID NO: 16.
24. Рекомбинантный микроорганизм по п. 17, причем ген alaD функционально связан с промотором, характеризующимся SEQ ID NO 54 или 55 или следующим:
(I) молекула нуклеиновой кислоты, характеризующаяся по меньшей мере 80% идентичностью относительно молекулы нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 54 или 55, или
(II) молекула нуклеиновой кислоты, гибридизующаяся с молекулой нуклеиновой кислоты, характеризующейся SEQ ID NO: 54 или 55, при условиях средней жесткости, или
(III) фрагмент, составляющий по меньшей мере 10 нуклеотидов молекулы нуклеиновой кислоты, характеризующейся SEQ ID NO: 54.
25. Рекомбинантный микроорганизм по п. 18, причем ген pflB выбирается из группы, состоящей из следующего:
(A) молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность SEQ ID NO: 5, или
(B) молекула нуклеиновой кислоты, характеризующаяся по меньшей мере 80% идентичностью относительно молекулы нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 5, или
(C) молекула нуклеиновой кислоты, гибридизующаяся с комплементом молекулы нуклеиновой кислоты, характеризующейся SEQ ID NO: 5, при жестких условиях, или
(D) молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид согласно SEQ ID NO: 6, или
(E) молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, характеризующийся по меньшей мере 60% гомологией относительно полипептида согласно SEQ ID NO: 6.
26. Рекомбинантный микроорганизм по п. 19, причем ген adhE выбирается из группы, состоящей из следующего:
(F) молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность SEQ ID NO: 7, или
(G) молекула нуклеиновой кислоты, характеризующаяся по меньшей мере 80% идентичностью относительно молекулы нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 7, или
(H) молекула нуклеиновой кислоты, гибридизующаяся с комплементом молекулы нуклеиновой кислоты, характеризующейся SEQ ID NO: 7, при жестких условиях, или
(I) молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид согласно SEQ ID NO: 8, или
(J) молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, характеризующийся по меньшей мере 60% гомологией относительно полипептида согласно SEQ ID NO: 8.
27. Рекомбинантный микроорганизм по п. 20, причем ген ldhA выбирается из группы, состоящей из следующего:
(К) молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность SEQ ID NO: 9, или
(L) молекула нуклеиновой кислоты, характеризующаяся по меньшей мере 80% идентичностью относительно молекулы нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 9, или
(М) молекула нуклеиновой кислоты, гибридизующаяся с комплементом молекулы нуклеиновой кислоты, характеризующейся SEQ ID NO: 9, при жестких условиях, или
(N) молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид согласно SEQ ID NO: 10, или
(О) молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, характеризующийся по меньшей мере 60% гомологией относительно полипептида согласно SEQ ID NO: 10.
28. Рекомбинантный микроорганизм по п. 21, причем ген pta выбирается из группы, состоящей из следующего:
(Р) молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность SEQ ID NO: 11, или
(Q) молекула нуклеиновой кислоты, характеризующаяся по меньшей мере 80% идентичностью относительно молекулы нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 11, или
(R) молекула нуклеиновой кислоты, гибридизующаяся с комплементом молекулы нуклеиновой кислоты, характеризующейся SEQ ID NO: 11, при жестких условиях, или
(S) молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид согласно SEQ ID NO: 12, или
(Т) молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, характеризующийся по меньшей мере 60% гомологией относительно полипептида согласно SEQ ID NO: 12.
29. Рекомбинантный микроорганизм по п. 22, причем ген frdA выбирается из группы, состоящей из следующего:
(U) молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность SEQ ID NO: 13, или
(V) молекула нуклеиновой кислоты, характеризующаяся по меньшей мере 80% идентичностью относительно молекулы нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 13, или
(W) молекула нуклеиновой кислоты, гибридизующаяся с комплементом молекулы нуклеиновой кислоты, характеризующейся SEQ ID NO: 13, при жестких условиях, или
(X) молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид согласно SEQ ID NO: 14, или
(Y) молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, характеризующийся по меньшей мере 60% гомологией относительно полипептида согласно SEQ ID NO: 14.
30. Рекомбинантный микроорганизм по одному из пп. 13-29, причем микроорганизм выбирается из рода из группы, состоящей из Corynebacterium, Bacillus, Erwinia, Escherichia, Pantoea, Streptomyces, Zymomonas и Rhodococcus.
31. Композиция, содержащая один или более рекомбинантных микроорганизмов по одному из пп. 13-30.
32. Композиция по п. 31, дополнительно содержащая среду и источник углерода.
33. Способ получения рекомбинантного микроорганизма с усиленным выходом пирувата, сукцината, аспартата, малата, лактата, валина, лейцина и/или аланина, который предусматривает следующие стадии:
(I) введение по меньшей мере одной из молекул нуклеиновой кислоты, как определено в одном из пп. 1-4, или по меньшей мере одной из молекул аминокислоты, как определено в одном из пп. 5-10, или экспрессионной конструкции по п. 11 или вектора по п. 12 в микроорганизм; и
(II) создание рекомбинантного микроорганизма с усиленным выходом пирувата, сукцината, аспартата, малата, лактата, валина, лейцина и/или аланина по сравнению с соответствующим микроорганизмом, не содержащим по меньшей мере одну из молекул нуклеиновой кислоты, как определено в одном из пп. 1-4, или по меньшей мере одну из молекул аминокислоты, как определено в одном из пп. 5-10, или экспрессионную конструкцию по п. 11 или вектор по п. 12.
34. Способ по п. 33, в котором применяемый в указанном способе рекомбинантный микроорганизм дополнительно характеризуется увеличенной или усиленной активностью и/или экспрессией гена, как определено в пп. 13, 15 или 17, и/или сниженной, репрессированной или удаленной активностью, и/или экспрессией по меньшей мере одного гена, как определено в одном из пп. 18-22.
35. Способ по одному из п. 33 или 34, в котором микроорганизм выбирается из рода из группы, состоящей из Corynebacterium, Bacillus, Erwinia, Escherichia, Pantoea, Streptomyces, Zymomonas и Rhodococcus.
36. Способ получения пирувата, сукцината, аспартата, малата, лактата, валина, лейцина и/или аланина, предусматривающий культивирование одного или более рекомбинантных микроорганизмов по одному из пп. 13-30 при условиях, которые обеспечивают возможность получения аланина.
37. Способ по п. 36, в котором микроорганизм культивируют в среде, содержащей 0,5%-30% (масс./объем) сахара.
38. Способ по п. 36, в котором выход пирувата, сукцината, аспартата, малата, лактата, валина, лейцина и/или аланина составляет по меньшей мере 80%.
39. Способ по любому одному из пп. 36-38, в котором хиральная чистота L-аланина составляет по меньшей мере 98%.
40. Способ культивирования или выращивания генетически модифицированного микроорганизма, предусматривающий инокуляцию среды для культивирования одним или более генетически модифицированными микроорганизмами по одному из пп. 13-30 и культивирование или выращивание указанного генетически модифицированного микроорганизма в указанной среде для культивирования.
41. Применение рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты по одному из пп. 1-4, рекомбинантной молекулы аминокислоты по одному из пп. 5-10, рекомбинантной экспрессионной конструкции по п. 11, рекомбинантного вектора по п. 12, рекомбинантного микроорганизма по одному из пп. 13-30 или композиции по одному из п. 31 или 32 для ферментативного получения пирувата, сукцината, аспартата, малата, лактата, валина, лейцина и/или аланина.
42. Способ ферментативного получения пирувата, сукцината, аспартата, малата, лактата, валина, лейцина и/или аланина, предусматривающий следующие стадии:
I) выращивание микроорганизма по одному из пп. 13 - 30 в ферментере и
II) извлечение пирувата, сукцината, аспартата, малата, лактата, валина, лейцина и/или аланина из ферментативного бульона, полученного на стадии I).
43. Рекомбинантная экспрессионная конструкция, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты, характеризующуюся последовательностью, выбранной из следующей группы:
(I) молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность SEQ ID NO: 15, или
(II) молекула нуклеиновой кислоты, характеризующаяся по меньшей мере 80% идентичностью относительно молекулы нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 15, или
(III) молекула нуклеиновой кислоты, гибридизующаяся с комплементом молекулы нуклеиновой кислоты, характеризующейся SEQ ID NO: 15, при жестких условиях, или
(IV) молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид согласно SEQ ID NO: 16, или
(V) молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, характеризующийся по меньшей мере 60% гомологией относительно полипептида согласно SEQ ID NO: 16,
функционально связанную с промотором, являющимся функциональным в микроорганизме, характеризующимся следующей последовательностью:
(VI) молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность SEQ ID NO: 54 или 55, или
(VII) молекула нуклеиновой кислоты, характеризующаяся по меньшей мере 80% идентичностью относительно молекулы нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 54 или 55, или
(VIII) молекула нуклеиновой кислоты, гибридизующаяся с молекулой нуклеиновой кислоты, характеризующейся SEQ ID NO: 54 или 55 при условиях средней жесткости, или
(IX) фрагмент, составляющий по меньшей мере 10 нуклеотидов молекулы нуклеиновой кислоты, характеризующейся SEQ ID NO: 54 или 55.
44. Рекомбинантный вектор, содержащий рекомбинантную экспрессионную конструкцию, как определено в п. 43.
45. Промотор, являющийся функциональным в микроорганизме, характеризующийся последовательностью, выбранной из следующей группы:
(I) молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность SEQ ID NO: 54 или 55, или
(II) молекула нуклеиновой кислоты, характеризующаяся по меньшей мере 80% идентичностью относительно молекулы нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 54 или 55, или
(III) молекула нуклеиновой кислоты, гибридизующаяся с молекулой нуклеиновой кислоты, характеризующейся SEQ ID NO: 54 или 55 при условиях средней жесткости, или
(IV) фрагмент, составляющий по меньшей мере 10 нуклеотидов молекулы нуклеиновой кислоты, характеризующейся SEQ ID NO: 54 или 55.
46. Рекомбинантная экспрессионная конструкция, содержащая промотор по п. 45, функционально связанный с гетерологичной молекулой нуклеиновой кислоты, подлежащей экспрессии.
47. Вектор, содержащий промотор по п. 45 или рекомбинантную экспрессионную конструкцию по п. 46.
48. Рекомбинантный микроорганизм, содержащий промотор по п. 45, рекомбинантную экспрессионную конструкцию по п. 46 или вектор по п. 47.
49. Способ экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты в микроорганизме, включающий стадии функционального связывания промотора по п. 45 с подлежащей экспрессии молекулой нуклеиновой кислоты, тем самым создавая рекомбинантную экспрессионную конструкцию, и введение указанной экспрессионной конструкции в микроорганизм.
50. Применение промотора по п. 45, рекомбинантной экспрессионной конструкции по п. 46 или вектора по п. 47 для экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты в микроорганизме.