Клонирование пенициллинацилазы из Escherichia coli. Каталитические свойства рекомбинантных ферментов

УДК 577.15.02

КЛОНИРОВАНИЕ ПЕНИЦИЛЛИНАЦИЛАЗЫ ИЗ Escherichia coli. КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНГНЫХ ФЕРМЕНТОВ

A.С. Ясная, О.В. Ямскова,* Д.Ф. Гуранда,* Т.А. Щербакова,* В.И. Тишков,

B.К. Швядас*

Ген пенициллинацилазы (ПА) из Escherichia coli был клонирован из штамма продуцента ПА, аналога штамма ATCC 11105. Оптимизация условий культивирования позволила получить до 130 мг активного фермента на литр культуральной жидкости. Методом сайт-специфического мутагенеза с помощью ПЦР был получен ряд одиночных, двойных и тройных мутантов. В результате процедур выделения и очистки были получены гомогенные препараты натив-ного фермента и его мутантов. Исследования показали, что 1) полученные ферменты имеют правильную структуру; 2) комплексоны и катионы металлов не влияют на их каталитическую активность; 3) мутантные ПА, аналогично дикому типу, эффективно инактивируются ФМСФ, что дает возможность титровать их активные центры; 4) полученные мутанты характеризуются большей константой специфичности в реакции гидролиза цветного субстрата, однако уступают дикому типу в синтезе ампициллина методом ацильного переноса.

Пенициллинацилаза (ПА) является одним из наиболее изученных представителей недавно открытого суперсемейства ферментов с Н-концевым нуклеофи-лом (№п-гидролаз), которые активируются посредством оригинального автокаталитического расщепления неактивного полипептидного предшественника [1, 2]. ПА из различных источников широко используется в фармацевтической промышленности для производства 6-аминопенициллановой (6-АПК) и 7-аминодеза-цетоксицефалоспорановой кислот (7-АДЦК) - ключевых соединений синтеза новых пенициллинов и цефа-лоспоринов [3]. Широкая субстратная специфичность и стереоселективность предоставляют возможность использования ПА в тонком органическом синтезе для получения энантиомеров а-, Р-, у-аминокислот [4, 5], для высокоэффективного хемо- и стереоселектив-ного ацилирования аминосоединений в водной среде и получения энантиомеров аминов, аминоспиртов [6, 7], аминонитрилов [8], хиральных сульфгидрильных соединений [9, 10].

Биокаталитический потенциал ПА позволяет использовать ее в биоинженерии для создания биокатализаторов с улучшенными свойствами. Показано, что методами генной инженерии можно изменить специфичность и синтетические свойства ПА [11-13]. В последней работе, в частности, в результате многоточечных замен существенным образом был изменен

участок связывания ацильной группы субстрата в активном центре, в результате чего стал возможным гидролиз цефалоспорина С [13]. Новые возможности в разработке методов рационального изменения ПА предоставляет молекулярное моделирование, позволяющее установить роль аминокислотных остатков активного центра в механизме действия фермента [14]. Другим важным для биоинженерии достижением последних лет является конструирование пермутирован-ной одноцепочечной ПА [15], экспрессия которой не зависит от автокаталитического расщепления.

Цель настоящего исследования - клонирование гена ПА из штамма E. coli - продуцента ПА и создание системы экспрессии фермента, а также получение и исследование каталитических свойств ряда мутантов ПА.

Экспериментальная часть

Клонирование гена ПА из E. coli. Для клонирования гена ПА дикого типа был использован штамм E. coli (продуцент ПА) из коллекции штаммов Государственного научного центра по антибиотикам. Ген ПА дикого типа получали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для выделения гена применяли следующие праймеры:

1. PAC_For: 5'-cttccagaggatcatatgaaaaatagaaatcgtatgatc-3';

2. PAC_Rev: 5'-tgccgaattcaagcttatctctgaacgatagatcc-3'.

Для удобства клонирования праймеры содержали сайты рестрикции: праймер № 1 - NdeI (обеспечивает встраивание под ATG кодон), праймер № 2 -EcoRI. Сайты рестрикции в последовательностях праймеров отмечены полужирным шрифтом. К смеси олигонуклеотидов (20 пкмоль каждого) добавляли 2,5 мкл 10-кратного буфера для ПЦР, поставляемого фирмой-производителем вместе с ферментом, 2 мкл раствора MgCl2 (25 мМ), 2 мкл раствора dNTP (2,5 мМ каждого), 1 мкл раствора плазмидной ДНК (50 нг/мкл), 0,5 мкл Taq ДНК полимеразы (5 ед./мкл) и 17 мкл деионизованной воды до общего объема 25 мкл. Для ПЦР использовались реактивы фирмы СибЭнзим. ПЦР проводили на приборе "Терцик" ("ДНК-Технологии", Россия) при следующих условиях: 25 циклов (1 мин при 94°C, 1 мин при 50°C и 2 мин при 72°C) с последующей 5-минутной инкубацией при 72°C. Продукты ПЦР очищали с помощью электрофореза в 1%-м агарозном геле. Для этого продукты ПЦР разгоняли в геле и вырезали кусочек геля, содержащий полоску нужного размера. ДНК из геля выделяли с помощью набора "DiatomTM DNA Elution" ("Лаборатория Изоген", Россия). Выделенный фрагмент обрабатывали эндонуклеазами рестрикции NdeI и EcoRI. В качестве вектора для клонирования нами был выбран pET24a ("Novagen"). Данный вектор содержит ген, обеспечивающий устойчивость к канамицину. Наличие сайта рестрикции NdeI позволяет встроить ген точно по ATG-кодону. Вектор обрабатывали теми же эндонуклеазами рестрикции: NdeI и EcoRI. Продукты рестрикции также очищали с помощью электрофореза в 1%-м агароз-ном геле. Рестрикционные фрагменты ПЦР-продукта и вектора для клонирования лигировали с помощью ДНК-лигазы фага Т4 ("СибЭнзим", Россия). Лигаз-ной смесью трансформировали клетки E. coli TG1. Плазмидную ДНК выделяли из отдельных клонов по стандартной методике [16]. Секвенирование ДНК проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом сек-венаторе ДНК ABI PRISM 3100-Avant (ЦКП "Геном").

Мутантные формы с точечными мутациями получали с помощью двухстадийной ПЦР. В каждой реакции участвовали два праймера: мутагенезный прай-мер (прямой или обратный) и праймер, обеспечивающий клонирование (с сайтами рестрикции BclI или PvuII). Полученные продукты очищали и добавляли в 3-ю ПЦР. Праймеры на место мутации проекти-

ровали таким образом, чтобы обеспечить достаточное перекрывание продуктов. При третьей ПЦР продукты двух предыдущих ПЦР отжигались друг с другом с образованием конечного продукта нужного размера с мутацией. Полученный на второй стадии ПЦР-продукт очищали, обрабатывали эндонуклеазами рестрикции BclI и PvuI. Поскольку рестриктаза BclI чувствительна к dam-метилированию ДНК, плазмиды, содержащие ген ПА дикого типа трансформировали в штамм E. coli JM110, дефектный по двум метилазам - dcm и dam. Неметилированную плазмиду pEPAC, содержащую ген ПА дикого типа, обрабатывали теми же эндонуклеазами рестрикции BclI и PvuI. Очищенные продукты рестрикции лиги-ровали и трансформировали лигазной смесью клетки E. coli TG1. Плазмидную ДНК выделяли из отдельных клонов по стандартной методике [16]. Секвенирование ДНК проводили с помощью набора реактивов "ABI PRISM BigDye™ Terminator v. 3.1" с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК "ABI PRISM 3100-Avant" (ЦКП "Геном").

Культивирование. Наработку биомассы клеток E. coli с рекомбинантной ПА проводили в качалоч-ных колбах объемом 100 мл или 1 л, содержащих 2 или 4 отбойника на шейкере "Multitrone" ("Infors", Германия). Рабочие объемы среды составляли 40 и 100 мл соответственно. Посевной материал выращивали в течение ночи при 37°С и 180 об/мин. Среда содержала 30 мкг/мл канамицина. В качестве индуктора биосинтеза белка использовали изопропил-ß-D-тиогалактозид (ИПТГ, конечная концентрация составляла 0,1 мM), который добавляли после достижения суспензией клеток оптической плотности 0,6-0,8 при 600 нм (^600). Далее клетки культивировали еще в течение 12-40 ч при 15-17°С. Клетки осаждали центрифугированием на центрифуге "Beckman J-21" (США) 20 мин при 7500 об/мин и 4°С. В качестве добавок при подборе условий культивирования использовали глицерин.

Выделение и очистка ферментов. Процедура выделения и очистки рекомбинантных ПА включала разрушение бактериальных клеток методом осмотического шока, гидрофобную хроматографию и обес-соливание. Суспензии биомассы клеток центрифугировали 20 мин при 3500 об/мин и 4°С (центрифуга "Beckman", Германия). После отделения супернатан-та осадок ресуспендировали в 1/10 объема охлажденного до 0°С осмотического шокового буфера А (20% сахароза, 100 мМ Tris-HCl, 10 мМ ЭДТА, рН 8,0) и

центрифугировали 10 мин при 5000 об/мин и 4°С. Супернатант отделяли, а осадок ресуспендировали в 1/10 объема охлажденного до 0°С осмотического шокового буфера В (1 мМ ЭДГА, рН 8,0) и центрифугировали 15 мин при 7000 об/мин и 4°С. К полученному супернатанту при перемешивании добавляли 1 М раствор KH2PO4, pH 7,0 до конечной концентрации фосфата 50 мМ, а затем - сульфат аммония до конечной концентрации 1,5 М сульфата. Аликвоту (3060 мл) полученного раствора ПА наносили на колонку "Butyl-Toyopearl 650 M", уравновешенную буфером 1 (50 мМ KH2PO4, 1,5 М (NH4)2SO4, 0,1 M KCl, 0,02% NaN3, pH 7,5) и элюировали в линейном градиенте 1,5-0,0 М (NH4)2SO4 при помощи буфера 2 (50 мМ KH2PO4, 0,02% NaN3, pH 7,5). Фракции, обладающие пенициллинацилазной активностью, объединяли с учетом распределения компонентов исходного раствора, обессоливали на колонке "HiTrap Desalting" с сефадексом G 25 ("Amersham Biosciences", Швеция) и концентрировали в ячейке для ультрафильтрации "Amicon M-3" ("Amicon Corp.", США) с использованием мембран "Diaflo" ("Amicon Corp.", США). К полученному препарату фермента добавляли глицерин (до 10%) и хранили при -20°С. Контроль чистоты осуществляли с помощью аналитического электрофореза в 12% полиакриламидном геле в присутствии додецильсульфата натрия (аппаратура для электрофореза фирмы "BioRad"). Чистота полученных ферментных препаратов составила не менее 95%.

Определение ферментативной активности.

Активность мутантных форм ПА определяли потен-циометрически и спектрофотометрически. В первом случае ферментативную активность определяли по гидролизу свежеприготовленного 2 мМ раствора бен-зилпенициллина титрованием образующейся в ходе реакции фенилуксусной кислоты (ФУК) раствором 0,02 н KOH на pH-стате "Titrino 719" ("Metrohm", Швейцария) при 25°С, pH 7,5, в присутствии 0,1 М KCl. Во втором случае активность ПА определяли по накоплению хромофора в процессе гидролиза 1 мМ раствора и-нитро-^-карбоксианилида ФУК (NIPAB) при 400 нм на спектрофотометре "Shimadzu UV-1601" (Япония). Реакцию проводили при 25°С в 0,01 М фосфатном буфере, pH 7,5, 0,1 М KCl.

Определение концентрации активных центров. Абсолютную концентрацию активных центров каждой из мутантных форм ПА определяли титрованием активных цетров фермента необратимым ингибитором фенилметилсульфонилфторидом (ФМСФ) по традици-

онной методике [17]. Остаточную ферментативную активность определяли спектрофотометрически по гидролизу цветного субстрата и потенциометрически по гидролизу природного субстрата, как описано выше.

Изучение влияния ионов металлов и комплексо-нов на ферментативную активность. Влияние

» Ж 2+

комплексонов и ионов металлов Ме на каталитическую активность нативной и рекомбинантных ПА изучали при определении ферментативной активности в отсутствие и в присутствии комплексонов - этилен-диаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и этиленгли-коль-бис(2-аминоэтил)^^Д',^-тетрауксусной кислоты (ЭГТА), а также солей CaCl2, MgCl2 MnCl2, CoCl2 при pH 7,5, 25°С в 0,1 М Трис-HCl, 0,1 М KCl. Концентрация добавленного эффектора в реакционной смеси составляла 1 мМ.

Определение кинетических параметров. Кинетические параметры ферментативного превращения (А"М и ккат) определяли путем анализа зависимости начальных скоростей гидролиза от концентрации субстрата. Реакции проводили в рамках схемы Михаэ-лиса-Ментен (S0 >> E0) в 0,01 М фосфатном буфере (pH 7,5, 0,1 М KCl) при 25 °С.

ВЭЖХ анализ. Количественное определение компонентов реакционной смеси проводили методом об-ращенно-фазовой ВЭЖХ на хроматографической системе "Perkin Elmer 200 Series" (США): колонка "Luna C18" ("Phenomenex", США), 250x4,6 мм, размер частиц 5 дм; подвижная фаза CHjCN-вода (40:60), 0,78 г/л KH2PO4, 0,5 г/л додецилсульфата натрия, pH 3,0; скорость потока 0,8 мл/мин; объем вко-ла 10 мкл; УФ-детектирование при 210 нм.

Исследование соотношения С/Г реакции ферментативного синтеза ампициллина. Начальные скорости накопления продуктов синтеза (С) и гидролиза (Г) в реакции синтеза ампициллина методом ацильного переноса от амида фенилглицина (Д-ФГА) на 6-АПК, катализируемого ПА, изучали при pH 6,3 в безбуферной среде при 25°С. Начальные концентрации реагентов: 500 мМ Д-ФГА, 300 мМ 6-АПК. Реакцию проводили в термостатируемой ячейке pH-стата "Titrino 719" ("Metrohm", Швейцария) при 25°С, pH 7,5, 0,1М KCl при постоянном перемешивании. Время проведения эксперимента составляло от 1 до 4 ч в зависимости от каталитической активности и концентрации препарата фермента. По ходу протекания реакции из реакционной смеси отбирали аликвоты, разбавляли их мобильной фазой и анализировали методом ВЭЖХ.

Обсуждение результатов

Для клонирования ПА использовали описанную ранее систему на основе векторов рЕТ [18, 19]. В результате были получены клоны, содержащие ген ПА дикого типа. Пробное культивирование рекомбинант-ной ПА показало наличие фермента в активной и растворимой формах. Культивирование при температуре 30-37°С приводит к преимущественному переходу фермента в тельца включения. Снижение температуры часто позволяет получить фермент в активной и растворимой формах [20], но вместе с тем приводит к замедлению роста клеток и увеличению времени культивирования. В связи с вышесказанным посевной материал выращивали при 37°С, и непосредственно перед добавлением индуктора (ИПТГ) температуру снижали. Оптимальная температура культивирования (17°С) была подобрана экспериментально. Дальнейшее снижение температуры в случае ПА дикого типа вызывает уменьшение выхода фермента. Оптимизация условий культивирования позволила получить примерно 20 мг активного фермента с литра культураль-ной жидкости. Таким образом, нами была создана конструкция для получения рекомбинантной ПА в активной и растворимой формах.

Созданная конструкция в дальнейшем была использована для получения ряда одиночных, двойных и тройных мутантов. При изучении влияния условий культивирования на выход мутантных форм было показано, что при снижении температуры культивирования от 17 до 15 °С для двойного мутанта М11 выход фермента возрастает с 10,2 до 72,2 мг/л, т.е. в 7 раз (табл. 1). В случае двойного мутанта М12 уменьшение температуры приводит к снижению выхода активного фермента. Добавление в систему глицерина до конечной концентрации 5 г/л приводит к аналогичному результату: выход фермента дополнительно удваивается и составляет 136 г/л в первом случае, а во втором - снижается в 2 раза. Причины снижения выхода мутанта М12 с уменьшением температуры культивирования и при добавлении глицерина не выявлены и требуют дальнейшего изучения. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о необходимости оптимизации условий культивирования каждого мутанта ПА.

С учетом особенностей культивирования каждого из препаратов, была наработана биомасса для препаративного получения ПА дикого типа, а также мутан-тных форм. После соответствующих процедур выде-

Т а б л и ц а 1

Культивирование биомассы клеток E. coli с рекомбинантной ПА при 17°C

Мутант Выход фермента

ЕД на 1 л среды, ед/л среда, мг/л влажные клетки, мг/г

ДТ 153 17,9 2,3

М1 150 18,1 2.4

М11 5 0,6 0,1

М12 80 10,2 2,1

М101 138 16,5 2,4

ления и очистки были получены гомогенные препараты рекомбинантных ферментов для дальнейших исследований. Согласно данным РСА [21] в структуре ПА из E. coli присутствует ион Ca2+, который координирует шесть аминокислотных остатков белковой глобулы с образованием EF-мотива, связывающего две a-спирали обеих полипептидных цепей фермента. Кинетические исследования показали, что присутствие в реакционной смеси комплексонов ЭДТА и ЭГТА и/или катионов ряда s- и d-металлов не влияет на активность исследуемых мутантных форм ПА.

Для целей количественного исследования и сравнения каталитических свойств мутантов ПА необходимо определить абсолютную концентрацию активных центров препаратов фермента. Известно, что ферменты этого семейства обладают высоким сродством к бензильному радикалу, а ФМСФ является чрезвычайно эффективным титрантом активных центров ПА [22]. Для оценки возможности применения ФМСФ для титрования полученных рекомбинантных ПА была изучена инактивация мутантов при инкубировании с этим реагентом. Исследования показали, что ФМСФ является сильным необратимым ингибитором всех мутантов ПА: реакция образования неактивного кова-лентного комплекса фенилметилсульфонил-ПА, как и в случае фермента дикого типа, протекает за несколько минут при эквимолярной концентрации титрующего агента, а комплекс в данных условиях очень стабилен. Независимое слежение за остаточной активностью по отношению к природному бензилпени-циллину и его аналогу - цветному субстрату NIPAB в процессе титрования активных центров ПА дикого

Титрование гомогенного препарата рекомбинантной пенициллинацилазы из E. coli фенилметилсульфонил-фторидом. Условия инкубирования: 0,002 М KH2PO4; pH 6,5; 25°C. Определение остаточной активности:

0,01 М KH2PO4; pH 7,5; 25°C

типа и мунантных форм показало, что модификация серина активного центра ПА во всех случаях приводит к одинаковой потере ферментативной активности по отношению к исследованным субстратам. Таким образом, можно утверждать, что ферментативное превращение субстратов происходит на одном и том же участке активного центра, что согласуется с данными [23]. Следует отметить, что концентрация каждого из рекомбинантных ферментов, определенная по титрованию активных центров (рисунок), равнялась концентрации белка, определенной по известному ко-

эффициенту молярного поглощения нативной ПА из E. coli при 280 нм (ц = 2,22 мл/(мг-см)). Этот факт свидетельствует о том, что полученные рекомбинантные ПА имеют правильную структуру.

Определение концентрации активных центров белка позволяет количественно охарактеризовать и сравнить каталитические свойства полученных препаратов ПА на основании абсолютных величин кинетических параметров ферментативных реакций. Кинетические параметры ферментативного гидролиза NIPAB (табл. 2) для ПА дикого типа, найденные в настоя-

Т а б л и ц а 2

Кинетические параметры ферментативного гидролиза NIPAB

Препарат фермента к с-1 ^кат? v КМ, мкМ ккат/КМ-, мкМ 1-с 1

ДТ 26 30 0,87 1

М1 53 9,0 5,9 6,8

М11 38 45 0,84 0,97

М12 40 15 2,7 3,1

М101 35 15 2,3 2,7

Т а б л и ц а 3

Начальные скорости накопления продуктов синтеза (С) и гидролиза (Г) реакции ферментативного синтеза ампициллина методом ацильного переноса

Препарат ПА из E. coli Начальные концентрации, мМ Начальные скорости

Д-ФГА 6-АПК v^/Eo, с-1 С/Г

ДТ 15 25 - 1,9

500 300 20 8,3

М1 500 300 1,2 3,7

М11 500 300 4,8 7,2

М12 500 300 1,3 0,8

М101 500 300 1,2 1,1

щей работе, полностью соответствуют результатам полученных нами ранее для ПА из штамма E. coli ATCC 9637. Экспериментальные данные показывают, что полученные мутанты характеризуются большей величиной каталитических параметров по сравнению с ферментом дикого типа (табл. 2).

Особый интерес представляет использование пе-нициллинацилазы как катализатора биокаталитического получения антибиотиков, в частности ампициллина. Определение начальных кинетических параметров реакции синтеза ампициллина методом ацильного переноса ацильного донора (Д-ФГА) на «ядро антибиотика» (6-АПК) показало (табл. 3), что в условиях, близких к оптимальным, для препаративного получения ампициллина мутант М11 наи-

более эффективно катализирует ацильный перенос и лишь немногим уступает в этой реакции ферменту дикого типа.

Гаким образом, в данной работе был выделен и клонирован ген ПА дикого типа, создана система экспрессии рекомбинантной ПА в активной и растворимой форме в клетках Escherichia coli, получены мутанты ПА, оптимизированы условия культивирования, выделения и очистки рекомбинантных ПА, а также отработана процедура характеристики препаратов ПА и проведены начальные кинетические исследования соответствующих ферментативных превращений. Сек-венирование ДНК проводили в межинститутском Центре коллективного пользования "Геном" ИМБ РАН (http://www.genome-centre.na-rod.ru/).

Работа выполнена при поддержке РФФИ (проект № 07-08-00696).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. MurzinA.G. // Curr. Opin. Struct. Biol. 1996. 6. P. 386.

2. Murzin A.G., Brenner S.E., Hubbard T., Chothia C. // J. Mol.

Biol. 1995. 247. P. 536.

3. BrugginkA., RoosE.C., de VroomE. // Org. Process Res. Dev.

1998. 2. P. 128.

4. Solodenko V.A., Belik M.Y., Galushko S.V., Kukhar V.P.,

Kozlova E.V., Mironenko D.A., Svedas V.K. // Tetrahedron: Asymmetry. 1993. 4. P. 1965.

5. Svedas V.K., Savchenko M.V., Beltser A.I., Guranda D.F. //

Ann. N.-Y. Acad. Sci. 1996. 799. P. 659.

6. Guranda D.T., van Langen L.M., van Rantwijk F., Sheldon

R.A., Svedas V.K. // Tetrahedron: Asymmetry. 2001. 12. P. 1645.

7. Guranda D.T., KhimiukA.I., van Langen L.M., van Rantwijk

F., Sheldon R.A., Svedas V.K. // Tetrahedron: Asymmetry. 2004. 15. P. 2901.

8. Chilov G.G., Moody H.M., Boesten W.H.J., Svedas V.K. //

Tetrahedron: Asymmetry. 2003. 14. P. 2613.

9. rypanda ff.T., 0anoeaMoea H.B., 0ex,dac B.K. // BuoopraH.

XHMHH. 2004. 30. C. 451.

10. GurandaD.T., KudryavtsevP.A., KhimiukA.Y., Shvedas V.K. // J. Chromatogr. A. 2005. 1095. P. 89.

11. Alkema W.B., de Vries E.,Floris R., Janssen D.B. // Eur. J. Biochem. 2003. 270. P. 3675.

12. Alkema W.B., Dijkhuis A.-J., de Vries E., Janssen D.B. // Eur. J. Biochem. 2002. 269. P. 2093.

13. Oh B., Kim K., Park J., Yoon J., Han D., Kim Y. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. 319. P. 486.

14. ЧиловГ.Г., Строганое O.B., ШвядасB.K. // Биохимия. 2007 (в печати).

15. Flores G., Soberyn X., Osuna J. // J. Protein Science 2006. 13. P. 1677.

16. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. N.Y., 1989.

17. ШвядасB.K., Марголин А.Л., Шерстюк С.Ф., Клесов A.A., Березин И.В. // Бгоорг. химия. 1977. 3. C. 546.

18. pET System Manual. 11th edition. Merck. Germany. 2004.

19. Xu Y., Rosenkranz S., Weng C.L., Scharer J.M., Moo-Young M. Chou C.P. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006.72. P. 529.

20. Gabor E.M., Janssen D.B. // Protein Engineering. 2004. 17. P. 571.

21. McDonoughM.A., Klei H.E., Kelly J.A. // Protein Sci. 1999. 8. P. 1971.

22. Швядас B.K., Марголин А.Л., Шерстюк С.Ф., Клесов A.A., Березин И.В. // Бииорг. химия. 1977. 3. C. 546.

23. Юшко М.И., Шамолина Т.А., Гуранда Д.Ф., Синев A.B., ШвядасB.K. // Биохимия. 1998. 63. C. 1295.

Поступила в редакцию 23.11.07

CLONING OF PENICILLIN ACYLASE FROM Escherichia coli. CATALYTIC PROPERTIES OF RECOMBINANT ENZYMES

A.S. Jasnaya, O.V. Jamskova, D.T. Guranda, T.A. Shcherbakova, V.I. Tishkov, V.K. Shvedas

Gene of penicillin acylase (PA) from Escherichia coli has been cloned from a producing strain analogous to strain ATCC 11105. Optimization of cultivation conditions allowed to obtain up to 130 mg of active enzyme from per litre of culture broth. A number of single, double and triple mutants has been produced by site specific mutagenesis. Homogeneous preparations of wild type enzyme and its mutants have been received due to isolation and purification. It was shown that 1) isolated enzymes have correctly folded structure; 2) complexing agents and metal ions do not inhibit catalytic activity; 3) penicillin acylase mutants are inactivated by phenylmethylsulphonyl fluoride as effective as a wild type enzyme what allows to use this reagent to titrate active sites of the mutants; 4) some of the tested enzyme mutants are characterized by higher specificity constants in hydrolysis of colorimetric substrate, however they are not as effective as a wild type penicillin acylase in biocatalytic ampicillin synthesis by acyl transfer.