Устройство для долгосрочного хранения биообразца с ДНК

Полезная модель относится к области биотехнологии и более точно касается устройства для долгосрочного хранения биологических образцов, содержащих молекулы ДНК, преимущественно человеческого происхождения, являющихся носителем характерных генов каждого индивидуума.
Лечение большей части заболеваний, трансплантация органов, терапия, направленная против старения - все это уже сегодня невозможно представить без генетического анализа. В обозримом будущем использование генной терапии войдет в повседневную практику. Однако, несмотря на то, что молекула ДНК является относительно стабильной, неблагоприятное воздействие окружающей среды может привести к ее разрушению. Среди факторов негативно влияющих на ДНК и приводящих к ее повреждению, можно назвать воздействие кислорода, ультрафиолетового и рентгеновского излучения, химический гидролиз и т.п. В то же время, имея в распоряжении через 10, 20 и более лет генетический материал, не подвергшийся разрушительному воздействию окружающей среды, мы будем иметь превосходный источник для использования в технологии генетической «реставрации» тела человека и продления жизни.
Кроме того, сохраненные образцы ДНК незаменимы при массовых ЧП, катастрофах и стихийных бедствиях для поиска терпящих бедствие и идентификации жертв.
В настоящее время наиболее распространенными устройствами для длительного хранения ДНК являются устройства криоконсервации, которые обеспечивают хранение биологических образцов в жидком азоте при постоянном поддержании температуры кипения азота (-195,8°С). Данные устройства позволяют замораживать биообразцы в максимально щадящем режиме и сохранять их без каких либо повреждений течении по существу неограниченного срока времени. Однако для осуществления способа криоконсервации требуется наличие лабораторных условий, использование сложного холодильного оборудования, привлечения профессионально обученных сотрудников а также больших затрат на поддержание бесперебойной работы этого оборудования и стабильности терморежима хранения.
Известно также устройство для сбора, хранения и транспортировки биологических образцов, раскрытое в патенте РФ 2616242 и содержащее карту-носитель, с размещенным на ней сорбционным пористым материалом, на который наносят жидкий биообразец, содержащий молекулы ДНК. Перед нанесением биообразца сорбционный материал пропитывают консервирующим составом на основе сахарозы и этилендиаминтетрауксусной кислоты, после чего наносят биообразец на карту-носитель, подвергают ее просушиванию. Устройство не требует больших затрат на изготовление, обеспечивает хранение в течение достаточно длительного времени жидких биообразцов без потери их первоначальных свойств, однако характеризуется невысокой надежностью (карта-носитель выполнена из бумаги) и требует для подготовки и обработки биообразца обязательного использования лабораторного оборудования. Так же указанное устройство не обеспечивает создания защитного барьера и биоматериал подвержен с течением времени действию разрушителей и окислителей
Известно, кроме того, устройство для иммобиизации образцов ДНК, описанное в патенте РФ 2346984, также, как и вышеописанное, содержащее бумажный носитель, на который наносят предварительно выделенную и очищенную ДНК, растворенную в бидистиллированной воде. После сушки в термостате, носитель с ДНК помещают в защитную оболочку, в качестве которой используют ламинатную пленку. Данное устройство обеспечивает надежное долгосрочное хранение молекул ДНК, однако, для приготовления препаратов ДНК и помещения носителя с ДНК в защитную оболочку требует использования лабораторного оборудования и дорогостоящих материалов.
И, наконец, известно (см. патент РФ 2228358) устройство для длительного хранения молекул ДНК, являющееся наиболее близким аналогом, которое содержит разъемную капсулу для размещения заключенного в твердую защитную оболочку из соответствующего полимера биообразца, содержащего молекулы ДНК и приспособленную для установки внутри герметичного ударопрочного контейнера со съемной крышкой. В данном устройстве капсула имеет овальную форму и выполнена из ковкого, стойкого к окислению и не загрязняющего ДНК металла, в частности, из золота или платины. Кроме того, в данном патенте указано, что перед помещением в капсулу ДНК необходимо подвергнуть многостадийному процессу очистки, включающему дезагрегацию клеток, удаление протеинов, выделение ДНК, амплификацию путем полимеризации, в результате чего получают материал ДНК в виде суспензии в спиртовом растворе. Порцию суспензии затем вводят в раствор акриловой или полиакриловой кислоты в метиловом спирте, спирт медленно выпаривают до получения вязкого геля и все вместе сушат при 50°С до образования твердого блока.
Данное устройство обеспечивает долговечную сохранность генетической информации в течение десятков тысяч лет при условии сохранения целостности капсулы, однако является дорогостоящим и требует больших затрат времени и наличия специального лабораторного оборудования и персонала для подготовки материала ДНК к упаковке в капсулу.
В основу настоящей полезной модели поставлена задача разработать устройство для долгосрочного хранения биологических образцов, содержащих ДНК, которое было бы простым и удобным в обращении, не требовало бы лабораторного оборудования для подготовки образца к консервации, могло бы быть использовано в любых, в том числе и полевых, условиях и при этом не требовало бы больших затрат для своего изготовления и обеспечения долгосрочного хранения генетического материала без потери его качества.
Поставленная задача решается тем, что устройство для долгосрочного хранения биологического образца с ДНК, содержащее ударопрочный герметичный контейнер со съемной крышкой и разъемную капсулу для размещения заключенного в твердую защитную оболочку сохраняемого образца ДНК, приспособленную для установки внутри контейнера, согласно предлагаемой полезной модели, дополнительно содержит емкость для дезинфицирующего раствора, имеющую съемную крышку, на внутренней поверхности которой закреплена с возможностью отсоединения крышка по форме входного отверстия капсулы, с закрепленным на ее внутренней поверхности стержнем, несущим на своем конце держатель биологического образца.
В предпочтительном варианте выполнения капсула имеет стаканообразную форму, в ее полости размещен консервирующий материал в вязкотекучем состоянии, в объеме, достаточном для полного погружения держателя с образцом ДНК, способный к формированию защитной оболочки образца ДНК при заданных условиях, при этом входное отверстие капсулы герметизировано посредством съемной защитной мембраны.
Возможно, чтобы консервирующий материал представляя собой эфирно-парафиновую смесь, содержащую не менее двух объемных долей парафина с температурой плавления превышающей 42°С и не более одной объемной доли эфира с температурой кипения не выше 25°С.
Вместо эфира консервирующий материал может содержать какое-либо другое летучее вещество, например сжиженный газ, обладающий способностью растворения парафина и с температурой кипения не выше 25°С.
Целесообразно держатель образца ДНК выполнить в виде разъемного сетчатого барабана, размер ячеек которого достаточен для свободного прохождения вязкотекучей эфирно - парафиновой смеси.
Желательно также в крышке капсулы выполнить по меньшей мере одно отверстие для выхода паров эфира..
Для повышения защиты капсулы от внешних воздействий можно стенку контейнера выполнить многослойной, содержащей, помимо наружного ударопрочного слоя, промежуточный термоизолирующий слой и внутренний слой из упругого, способного адсорбировать пары эфира, материала.
Целесообразно капсулу оснастить уникальной идентификационной меткой.
Для возможности использования устройства в качестве идентификатора индивидуума, на наружной поверхности крышки контейнера может быть закреплено кольцо, позволяющее владельцу постоянно носить контейнер с образцом ДНК в виде брелка или медальона.
Технический результат, достигаемый при использовании предлагаемой полезной модели, состоит в том, что при достаточно простой конструкции компонентов устройство не требует привлечения высококвалифицированного персонала для его обслуживания, а также сложного лабораторного оборудования для отбора и консервации биообразца, и к тому же с успехом может быть использовано в полевых условиях. Устройство обеспечивает долгосрочную (в течение десятков лет) сохранность ДНК без потери первоначальных свойств и при этом не требует больших затрат на свое изготовление и последующее хранение (хранение происходит в условиях естественной окружающей среды)
В дальнейшем полезная модель поясняется описанием конкретных вариантов ее осуществления и прилагаемыми чертежами, на которых:
фиг. 1 изображает капсулу для размещения биологического образца в исходном состоянии, герметизированную мембраной, изометрия;
фиг. 2 - емкость с дезинфицирующим раствором, изометрия;
фиг. 3 - крышку с держателем биообразца, изометрия;
фиг. 4 - капсулу с погруженным в консервирующую смесь биообразцом, изометрия;
фиг. 5 - контейнер, в общем виде, частичный разрез, изометрия.
Устройство для долгосрочного хранения биообразца с ДНК, согласно настоящей полезной модели, включает в себя капсулу 1 (фиг. 1) стаканообразной, в данном случае, цилиндрической формы, имеющую входное отверстие в исходном положении герметично закрытое съемной мембраной 2, выполненной, например, из пленки или металлической фольги. Сама капсула 1 может быть выполнена из любого ударопрочного инертного в отношении биообразца материала - металла, стекла, керамики, полимера и т.п. Кроме того, в состав устройства входит емкость 3 (фиг. 2) с дезинфицирующим раствором 4, герметично закрытая съемной крышкой 5, соединенной с емкостью 3 резьбовым соединением. На внутренней поверхности крышки 5 (фиг. 3) имеется центральный полый кольцеобразный выступ 6, в котором установлена с возможностью отсоединения, например, посредством плотной посадки, крышка 7 по форме входного отверстия капсулы 1, снабженная внутренней резьбой, соответствующей наружной резьбе, выполненной на горловине капсулы 1. На внутренней поверхности крышки 7 в ее центре укреплен стержень 8, несущий на своем конце держатель 9 биообразца, выполненный в виде разъемного сетчатого барабана.
В исходном состоянии устройства в капсуле 1 имеется консервирующий материал в вязкотекучем состоянии, способный при заданных условиях (в данном случае при нормальных температуре и давлении окружающей среды) переходить в твердое состояние. Объем консервирующего вязкотекучего материала выбран с учетом обеспечения полного погружения держателя 9 с образцом ДНК и обволакивания всей поверхности биообразца с последующим формированием твердой защитной оболочки.
В предпочтительном варианте выполнения консервирующий материал представляет собой эфирно-парафиновую смесь, содержащую не менее двух объемных долей парафина с температурой плавления 42-65°С и не более одной объемной доли эфира с температурой кипения не выше 25°С. Кроме того смесь может содержать 1,5-3% натурального воска в качестве пластификатора.
Размер ячеек сетчатого барабана держателя 9 выбран с учетом свободного прохождения вязкотекучей консервирующей смеси и обволакивания биообразца, находящегося внутри барабана. В крышке 7 (фиг. 4) капсулы 1 выполнено, по меньшей мере, одно, в описываемом примере четыре капиллярных отверстия 10 для выхода паров эфира, расширяющихся по ходу движения паров.
В состав устройства, согласно полезной модели, входит также ударопрочный герметичный контейнер 11 (фиг. 5) со съемной крышкой 12, предназначенный для помещения в него капсулы 1 с биообразцом.
Контейнер 11 имеет цилиндрическую форму и выполнен в предпочтительном варианте из антиалергенной стали. Стенка контейнера 11 выполнена многослойной и содержит помимо наружного ударопрочного стального слоя 13, промежуточный термоизолирующий слой 14, например, из войлока, и внутренний слой 15 из упругого, способного адсорбировать пары эфира, материала, например, из вспененного полиуретана, губчатой резины или иного материала, не впитывающего воду и обладающего амортизационными свойствами. Дно контейнера 11, также, как и его боковая стенка, имеет аналогичную многослойную структуру.
На наружной поверхности крышки 12 закреплено кольцо 16, позволяющее использовать контейнер в качестве медальона или брелка для постоянного ношения владельцем ДНК.
Капсула 1 снабжена уникальной идентификационной предпочтительно электронной меткой, например, электронным чипом, встроенным в стенку капсулы 1. Также уникальная информация может быть нанесена любым другим подходящим способом, например, наклеена в виде этикетки на стенку капсулы.
Устройство используют следующим образом.
Снимают крышку 5 (фиг. 2) с емкости 3 с дезинфицирующим раствором, например, 96% спиртом или другим дезинфицирующим и обезвоживающим раствором, и помещают внутрь разъемного сетчатого барабана - держателя 9, прикрепленного к крышке, твердый образец биологического материала, содержащий ДНК, например фрагмент ногтевой пластины или волосяную луковицу. Затем крышку 5 возвращают на место, при этом держатель 9 с биообразцом полностью погружается в дезинфицирующий раствор 4, после чего емкость 3 энергично встряхивают в течение « 5 секунд. В результате этих действий происходит очистка и обезвоживание образца. Далее с капсулы 1 (фиг. 1), содержащей вязкотекучую эфирно-парафиновую смесь, удаляют съемную герметизирующую мембрану 2, откручивают крышку 5 (фиг. 2) емкости 3 и, держа за крышку 5, перемещают обеззараженный и обезвоженный биообразец, находящийся в сетчатом барабане, в капсулу 1 (фиг. 4), полностью погружая держатель 9 с биообразцом в консервирующую смесь. При этом вязкотекучая смесь свободно проходит через ячейки сетчатого барабана и обволакивает биообразец со всех сторон. Капсулу 1 плотно закрывают, приводя во взаимодействие резьбу крышки 7 с резьбой входного отверстия капсулы 1, и отсоединяют крышку 5 от крышки 7. Капсулу 1 зажимают в руке и в течение нескольких минут (2-3 мин.) происходит отверждение парафина за счет тепла руки и испарения эфира через отверстия 10 в крышке 7. Сформированная твердая парафиновая оболочка на биообразце создает защитный барьер, исключающий доступ к нему окислителей и влаги.
Закрытую крышкой 7 капсулу 1 помещают в контейнер 11 (фиг. 5), который после этого герметично закрывают с помощью крышки 12 (завинчивают, заклеивают, заваривают и т.д.). Упругий внутренний адсорбирующий слой 15 поглощает остатки паров эфира и смягчает нагрузку на капсулу при резких перемещениях контейнера, промежуточный термоизоляционный слой 14 позволяет поддерживать в контейнере комфортную для биообразца температуру, предотвращая оплавление парафиновой оболочки и наружный ударопрочный слой 13 защищает капсулу 1 от механических повреждений.
Для проверки эффективности методики хранения ДНК, применяемой в предлагаемом устройстве, был проведен эксперимент на 10 опытных образцах биоматериала.
Для этого сначала в условиях пониженной температуры (минус 4-7 С) готовили консервирующую эфирно-парафиновую смесь. В раствор метилвинилового эфира (UN1087) массой - 32 доли при постоянном помешивании добавляли зерна парафина (парафин тугоплавкий 65°С) массой - 62 доли и воск - массой 6 долей. В результате была получена вязкотекучая субстанция, напоминающая по виду слабо текучий гель. Далее в пробирки емкостью 10 мл, помещали приготовленную смесь в количестве менее половины объема пробирки, которые затем герметизировали, запечатывая входные отверстия пробирок съемными мембранами из фольги. Прочностные параметры пробирок и герметизирующих мембран были выбраны с учетом выдерживания 2-х кратного превышения внутреннего давления (1052 мм р.с. X 2=2104 мм р.с). Запечатанные пробирки хранили при комнатной температуре. В сетчатые разъемные держатели помещали биобразы ДНК в виде фрагмента ногтевой пластины. Затем держатели с биообразцом помещали и выдерживали в емкости с 96% этиловым спиртом в течении 5 секунд, в результате чего происходило обезвоживание и дезинфекция биообразцов. После этого каждый обработанный дезинфицирующим раствором биообразец в течение 5-7 секунд выдерживали на открытом воздухе с целью испарения остатков спирта. С пробирок, содержащих вязкотекучую смесь метилвинилового эфира с парафином, удаляли мембрану и в каждую пробирку погружали держатель с обезвоженным и очищенным биобразцом. При нарушении герметичности в пробирке происходила реакция испарения эфира. В опытах срок испарения эфира не превышал 3 минут (консервирующая смесь была подобрана с учетом требуемого времени испарения не более 3 минут при температуре окружающей среды 22°С).
В результате реакции испарения в пробирках был получен твердый осадок, в объеме одной трети объема пробирки, полностью покрывающий и запечатывающий в себе биобразец.
Опытные образцы биоматериала прошли консервацию подобным образом в 1987 году на базе кафедры генетики Московской Ветеринарной Академии им. К. Скрябина. Пробирки с законсервированным биоматериалом были помещены в отдельный металический ящик и хранились с момента приготовления в лабораторном шкафу при средней температуре для таких помещений (+18 - +26С). В 2012 году, оставленные на хранение биообразцы, были подвергнуты депарафинизации путем растворения в соответствующем растворителе и последующему лизису для выделения ДНК. Многократные исследования, проводившиеся на протяжении всего срока с использованием образцов положенных на хранение в 1987 году показало, что при лизисе ДНК количество получаемого материала и его целостность по существу не отличались от аналогичных параметров для свежевзятых биообразцов.
Проведенный эксперимент подтвердил эффективность данной методики консервации биообразцов и возможность их долгосрочного (20 и более лет) хранения без потери качества в условиях окружающей среды.
Устройство и способ его применения, описанные в данной полезной модели, позволяют вне лаборатории, без использования какого либо специального оборудования и без привлечения существенных затрат обеспечить надежное длительное хранение биоматериала без потери его качества.
Вариант выполнения устройства, приспособленный для постоянного ношения владельцем и снабженный уникальной электронной меткой, содержащей данные о владельце будет незаменимым в случае массовых ЧП, при катастрофах и стихийных бедствиях для поиска потерпевших и идентификации жертв. При этом достаточно обыкновенного смартфона с установленной соответствующей программой для Считывания информации или обнаружения капсулы, в том числе и с удаленной базы данных, связанной с чипом, встроенным в капсулу.
Также, следует отметить, что возможно при изменении упомянутых в данной полезной модели материалов на аналогичные по своим свойствам, как и при изменении состава консервирующей смеси на аналогичный, приспособленный для создания защитной полимерной оболочки, вне лаборатории и специализированных учреждений, в течение короткого промежутка времени (не более 5 минут) достигнуть совокупного вышеуказанного эффекта.