СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ МНОЖЕСТВЕННОЙ МИЕЛОМЫ И ПЛАЗМОКЛЕТОЧНОГО ЛЕЙКОЗА ПОСРЕДСТВОМ Т-КЛЕТОЧНОЙ ТЕРАПИИ
METHODS OF MULTIPLE MYELOMA AND PLASMA CELL LEUKEMIA TREATMENT BY T-CELL THERAPY

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] По настоящей заявке испрашивается приоритет временных заявок на патент США № 62/216525, поданной 10 сентября 2015 года, и № 62/220641, поданной 18 сентября 2015 года, включенных в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.
1. ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0002] Настоящее изобретение относится к способам лечения множественной миеломы у пациента-человека, включающим введение пациенту-человеку популяции аллогенных клеток, содержащей WT1-специфичные аллогенные T-клетки. Настоящее изобретение также относится к способам лечения плазмоклеточного лейкоза у пациента-человека, включающим введение пациенту-человеку популяции аллогенных клеток, содержащей WT1-специфичные аллогенные T-клетки.
2. УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
9
[0003] Плазмоклеточный лейкоз (PCL) является редким и агрессивным вариантом множественной миеломы с очень неблагоприятным прогнозом (Jaffe et al., 2001, Ann Oncol 13:490-491). Вторичный и первичный плазмоклеточный лейкоз (pPCL) являются наиболее агрессивными формами плазмоклеточных дискразий. Первичный плазмоклеточный лейкоз определяют по наличию >2×10 плазматических клеток/л периферической крови или плазмоцитоза, составляющего >20% дифференциальной лейкоцитарной формулы, и он не развивается из уже существующей множественной миеломы (MM) (Jaffe et al., 2001, Ann Oncol 13:490-491; Hayman and Fonseca, 2001, Curr Treat Options Oncol 2:205-216). Однако вторичный PCL (sPCL) представляет собой лейкозную трансформацию конечной стадии MM. pPCL является редким, он присутствует лишь у 1-4% пациентов с MM (Gertz, 2007, Leuk Lymphoma 48:5-6; Noel and Kyle, 1987, Am J Med 83:1062-1068; Pagano et al., 2011, Ann Oncol 22:1628-1635; Tiedemann et al., 2008, Leukemia 22:1044-1052). Прогноз при pPCL является очень неблагоприятным с медианой общей выживаемости (OS) лишь 7 месяцев, при этом до 28 процентов пациентов умирают в течение первого месяца после постановки диагноза при стандартной химиотерапии. В случае рефрактерной или рецидивирующей множественной миеломы (sPCL) медиана общей выживаемости является даже меньшей (1,3 месяцев) (Tiedemann et al., 2008, Leukemia 22:1044-1052). Не существует излечивающих схем лечения для первичного или вторичного PCL. Из-за отсутствия крупных проспективных исследований лечение PCL основано на эмпирических рекомендациях или экстраполяции данных из литературы о множественной миеломе. Сообщают, что медиана выживаемости у пациентов с первичным PCL, которым проводят аутологичную трансплантацию стволовых клеток, составляет 28 месяцев. Аутологичную трансплантацию стволовых клеток (ауто-SCT) считают основным лечением при PCL. При ретроспективном анализе CIBMTR (Center for International Blood and Marrow Transplant Research) исход для 97 пациентов, которым проводили ауто-SCT, сравнивали с 50 пациентами, которым проводили аллогенную трансплантацию стволовых клеток (алло-SCT) с 1995 по 2006 год (Attal et al., 1996, N Engl J Med 335:91-97; Perez-Simon et al., 1998, Blood 91:3366-3371; Saccaro et al., 2005, Am J Hematol 78:288-294). Хотя кумулятивная частота рецидивов через 3 года была значимо ниже в группе аллогенной трансплантации (алло-SCT по сравнению с ауто-SCT, 38% по сравнению с 61%), TRM (связанная с трансплантацией смертность) через 3 года была значительно выше у пациентов, которым проводили аллогенную трансплантацию (алло-SCT по сравнению с ауто-SCT, 41% по сравнению с 5%). Это приводила к 3-летней OS 64% и 39% в группах ауто-SCT и алло-SCT, соответственно (Attal et al., 1996, N Engl J Med 335:91-97; Perez-Simon et al., 1998, Blood 91:3366-3371; Saccaro et al., 2005, Am J Hematol 78:288-294). Таким образом, для лечения pPCL и sPCL необходимы инновационные подходы, включающие новые способы улучшения исхода.
[0004] Лечение рецидивирующей/рефрактерной множественной миеломы (RRMM) представляет собой особую терапевтическую задачу из-за гетерогенности заболевания при рецидивировании и отсутствия четких биологически-обоснованных рекомендаций, касающихся выбора терапии спасения в различные моменты прогрессирования заболевания. Согласно критериям Международной группы по изучению множественной миеломы прогрессирующее заболевание (PD) определяют по по меньшей мере 25%-ному повышению парапротеина в сыворотке относительно низшего предела (абсолютное повышение должно составлять ≥0,5 г/дл), или парапротеина в моче (абсолютное повышение должно составлять ≥200 мг/24 часа), или по разнице уровней вовлеченной и невовлеченной свободной легкой цепи (FLC) (с аномальным соотношением FLC и разницей FLC >100 мг/л). У пациентов с отсутствием измеримых уровней парапротеина (олиго- или несекреторная миелома) для определения прогрессирования заболевания используют повышение плазматических клеток в костном мозге (повышение ≥10%), или новые очаги повреждения костей/мягких тканей, увеличивающие размер существующих повреждений, или необъяснимую концентрацию кальция в сыворотке >11,5 мг/дл. Рецидивирующую и рефрактерную множественную миелому определяют как прогрессирование заболевания во время терапии у пациентов, достигших минимального ответа (MR) или лучшего результата или прогрессирующих в течение 60 дней после последней терапии. Пациентов, никогда не достигавших, по меньшей мере, MR на исходную индукционную терапию и прогрессирующих во время терапии, определяют как "первично рефрактерных". Рецидивирующую множественную миелому определяют как заболевание у пациента с миеломой, которого ранее подвергали лечению, и у которого наблюдали PD, как определено выше, и который на момент рецидива не соответствует критериям рецидивирующей и рефрактерной или первичной рефрактерной множественной миеломы. Кроме того, цитогенетические признаки высоко риска, такие как del(17p) и t(4;14), коррелируют со сниженной выживаемостью.
[0005] Пациенты с рефрактерной или рецидивирующей и рефрактерной множественной миеломой, исчерпавшие возможности новых средств, имеют ограниченные варианты лечения и небольшую ожидаемую выживаемость. Хотя в недавнем исследовании фазы 3 MM-003 наблюдали значительные благоприятные эффекты отсутствия прогрессирования и общей выживаемости в случае помалидомида с низкими дозами дексаметазона по сравнению с высокими дозами дексаметазона у пациентов, которым не помогает бортезомиб и леналидомид. Но при медиане последующего наблюдения 15,4 месяцев выживаемость без прогрессирования составляла лишь 4,0 по сравнению с 1,9 месяцами (HR, 0,50; P<0,001), и медиана общей выживаемости составляла лишь 13,1 по сравнению с 8,1 месяцами (HR, 0,72; P=0,009) для этой выборки пациентов. В группе высокого риска помалидомид с низкими дозами дексаметазона по сравнению с высокими дозами дексаметазона улучшал выживаемость без прогрессирования у пациентов с del(17p) (4,6 по сравнению с 1,1 месяцами; HR, 0,34; P<0,001), t(4;14) (2,8 по сравнению с 1,9 месяцами; HR, 0,49; P=0,028) и стандартный риск (4,2 по сравнению с 2,3 месяцами; HR, 0,55; P<0,001). Общая выживаемость в случае лечения помалидомидом с низкими дозами дексаметазона по сравнению с высокими дозами дексаметазона составляла 12,6 по сравнению с 7,7 месяцами (HR, 0,45; P=0,008) у пациентов с del(17p), 7,5 по сравнению с 4,9 месяцами (HR, 1,12; P=0,761) при t(4;14), и 14,0 по сравнению с 9,0 месяцами (HR, 0,85; P=0,380) при стандартном риске. Частота объективного ответа была выше в случае помалидомида с низкими дозами дексаметазона, чем в случае высоких доз дексаметазона при стандартном риске (35,2% по сравнению с 9,7%) и del(17p) (31,8% по сравнению с 4,3%), и схожей при t(4;14) (15,9% по сравнению с 13,3%) (Dimopoulos et al., 2015, Haematologica pii: haematol.2014,117077, опубликованная он-лайн 6 августа 2015 года).
[0006] Пациентов с рецидивирующей множественной миеломой лечат инфузиями донорских лимфоцитов после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, истощенных по аллогенным T-клеткам (Tyler et al., 2013, Blood 121:308-317).
[0007] Протокол исследования фазы I пациентов с рецидивирующей/рефрактерной множественной миеломой и пациентов с плазмоклеточным лейкозом, которым после аллогенной трансплантации стволовых клеток вводят WT1-специфичные T-клетки, полученные от донора (из трансплантата стволовых клеток), доступен на веб-сайте clinicaltrials.gov (NCT01758328).
[0008] Ген опухоли Вильмса 1 (WT1) исходно идентифицировали у пациентов с неоплазией почек детского возраста, опухолью Вильмса (Call et al., 1990, Cell 60:509-520). Немутантную форму WT1 исходно классифицировали как ген опухолевого супрессора, играющий роль в транскрипционной регуляции ранних промоторов генов факторов роста. Недавно WT1 описали как онкоген. WT1 гиперэкспрессирован при ряде гемобластозов, включая до 70% случаев острого миелогенного лейкоза (AML), острого лимфобластного лейкоза (ALL), хронического миелогенного лейкоза (CML) и миелодиспластического синдрома (Miwa et al., 1992, Leukemia 6:405-409). Высокий уровень WT1 в лейкобластах при AML ассоциирован с плохим ответом на химиотерапию, более высоким риском рецидивирования заболевания и меньшей вероятностью продолжительной безрецидивной выживаемости. По этим причинам экспрессия WT1 служит прогностическим маркером. Несколько исследовательских группа используют способы количественной ПЦР для мониторинга ответа заболевания и минимальной остаточной болезни (Miwa et al., 1992, Leukemia 6:405-409; Inoue et al., 1994, Blood 84:3071-3079).
[0009] Также недавно показано, что клетки MM гиперэкспрессируют WT1. Экспрессия WT1 в костном мозге коррелирует со множеством прогностических факторов, включая стадию заболевания и соотношение M-белка (Hatta et al., 2005, J Exp Clin Cancer Res 24:595-599). Клетки MM очень восприимчивы к перфорин-опосредованной цитотоксичности WT1-специфичных цитотоксических T-лимфоцитов (CTL), и экспрессии WT1 достаточно для индукции WT1-специфичной продукции ИФНγ CTL (Azuma et al., 2004, Clin Cancer Res 10:7402-7412). Также наблюдают клинические ответы при использовании иммунотерапии на основе пептида WT1. После иммунизации с помощью синтетического пептида WT1 наблюдали значительное снижение миеломной нагрузки в костном мозге и уровня M-белка в моче вместе с улучшением остеосцинтиграммы. Этот частичный ответ на вакцинацию коррелировал с экспансией функциональных WT1-специфичных CTL (цитотоксических T-лимфоцитов) и миграцией WT1-специфичных T-клеток в костный мозг (Azuma et al., 2004, Clin Cancer Res 10:7402-7412).
[0010] Цитирование ссылок в настоящем описании не следует истолковывать как признание того, что они представляют собой предшествующий уровень техники для настоящего изобретения.
3. СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0011] Настоящее изобретение относится к способам лечения WT1 (белок опухоли Вильмса 1)-положительной множественной миеломы у пациента-человека. Настоящее изобретение дополнительно относится к способам лечения WT1-положительного плазмоклеточного лейкоза у пациента-человека.
[0012] Настоящее изобретение относится к способам лечения WT1-положительной множественной миеломы у пациента-человека, включающим введение пациенту-человеку популяции аллогенных клеток, содержащей WT1-специфичные аллогенные T-клетки.
in vitro
[0013] В одном из аспектов способы лечения WT1-положительной множественной миеломы у пациента-человека включают введение пациенту-человеку популяции аллогенных клеток, содержащей WT1-специфичные аллогенные T-клетки, где у популяции аллогенных клеток отсутствует значительная цитотоксичность  в отношении антигенпрезентирующих клеток, не нагруженных пептидом WT1 или не сконструированных генетически для экспрессии одного или нескольких пептидов WT1.
in vitro
in vitro
[0014] В конкретном варианте осуществления популяция аллогенных клеток лизирует 15% или менее немодифицированных, стимулированных фитогемагглютинином лимфобластов, полученных от пациента-человека, в анализе цитотоксичности , таким образом, у нее отсутствует значительная цитотоксичность  в отношении антигенпрезентирующих клеток, не нагруженных пептидом WT или не сконструированных генетически для экспрессии одного или нескольких пептидов WT1.
in vitro
in vitro
[0015] В другом конкретном варианте осуществления популяция аллогенных клеток лизирует 15% или менее немодифицированных, стимулированных фитогемагглютинином лимфобластов, полученных от донора популяции аллогенных клеток, в анализе цитотоксичности , таким образом, у нее отсутствует значительная цитотоксичность  в отношении антигенпрезентирующих клеток, не нагруженных пептидом WT или не сконструированных генетически для экспрессии одного или нескольких пептидов WT1.
in vitro
in vitro
[0016] В другом конкретном варианте осуществления популяция аллогенных клеток лизирует 15% или менее немодифицированных, несовпадающих по HLA клеток EBV BLCL в анализе цитотоксичности , таким образом, у нее отсутствует значительная цитотоксичность  в отношении антигенпрезентирующих клеток, не нагруженных пептидом WT или не сконструированных генетически для экспрессии одного или нескольких пептидов WT1.
in vitro
in vitro
in vitro
[0017] В другом конкретном варианте осуществления популяция аллогенных клеток лизирует 15% или менее немодифицированных, стимулированных фитогемагглютинином лимфобластов, полученных от пациента-человека, в анализе цитотоксичности , и популяция аллогенных клеток лизирует 15% или менее немодифицированных, несовпадающих по HLA клеток EBV BLCL в анализе цитотоксичности , таким образом, у нее отсутствует значительная цитотоксичность  в отношении антигенпрезентирующих клеток, не нагруженных пептидом WT или не сконструированных генетически для экспрессии одного или нескольких пептидов WT1.
in vitro
in vitro
in vitro
[0018] В другом конкретном варианте осуществления популяция аллогенных клеток лизирует 15% или менее немодифицированных, стимулированных фитогемагглютинином лимфобластов, полученных от донора популяции аллогенных клеток, в анализе цитотоксичности , и популяция аллогенных клеток лизирует 15% или менее немодифицированных, несовпадающих по HLA клеток EBV BLCL в анализе цитотоксичности , таким образом, у нее отсутствует значительная цитотоксичность  в отношении антигенпрезентирующих клеток, не нагруженных пептидом WT или не сконструированных генетически для экспрессии одного или нескольких пептидов WT1.
in vitro
in vitro
in vitro
in vitro
in vitro
[0019] В некоторых вариантах осуществления популяция аллогенных клеток дополнительно демонстрирует лизис 20% или более антигенпрезентирующих клеток, нагруженных пептидом WT1, в анализе цитотоксичности . В конкретном варианте осуществления популяция аллогенных клеток дополнительно демонстрирует лизис 20% или более нагруженных совокупностью пептидов WT1, стимулированных фитогемагглютинином лимфобластов, полученных от пациента-человека, в анализе цитотоксичности . В другом конкретном варианте осуществления популяция аллогенных клеток дополнительно демонстрирует лизис 20% или более нагруженных совокупностью пептидов WT1 антигенпрезентирующих клеток, полученных от донора популяции аллогенных клеток, в анализе цитотоксичности . В другом конкретном варианте осуществления популяция аллогенных клеток дополнительно демонстрирует лизис 20% или более нагруженных совокупностью пептидов WT1, стимулированных фитогемагглютинином лимфобластов, полученных от пациента-человека, в анализе цитотоксичности , и демонстрирует лизис 20% или более нагруженных совокупностью пептидов WT1 антигенпрезентирующих клеток, полученных от донора популяции аллогенных клеток, в анализе цитотоксичности .
[0020] В конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в течение 12 недель после постановки диагноза множественной миеломы. В конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 5 до 12 недель после постановки диагноза множественной миеломы.
[0021] В различных вариантах осуществления перед введением популяции аллогенных клеток пациенту-человеку проводят терапию множественной миеломы, отличающуюся от указанной популяции аллогенных клеток. Терапия может являться аутологичной трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток (HSCT), аллогенной HSCT, химиотерапией злокачественных новообразований, индукционной терапией, лучевой терапией или их комбинацией для лечения множественной миеломы. В конкретном варианте осуществления аутологичная HSCT является трансплантацией стволовых клеток периферической крови. В конкретном варианте осуществления аллогенная HSCT является трансплантацией стволовых клеток периферической крови. Популяцию аллогенных клеток можо получать от донора аллогенных HSCT или стороннего донора, отличающегося от донора аллогенных HSCT.
[0022] В некоторых вариантах осуществления терапия является HSCT.
[0023] В конкретном варианте осуществления терапия является аутологичной HSCT. В конкретном варианте осуществления аутологичная HSCT является трансплантацией стволовых клеток периферической крови. В некоторых вариантах осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в день аутологичной HSCT или до 12 недель позже. В конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 5 до 12 недель после аутологичной HSCT.
[0024] В другом конкретном варианте осуществления терапия является аллогенной HSCT. В конкретном варианте осуществления аллогенная HSCT является трансплантацией стволовых клеток периферической крови. В конкретном варианте осуществления популяцию аллогенных клеток получают от донора аллогенных HSCT. В другом конкретном варианте осуществления популяцию аллогенных клеток получают от или стороннего донора, отличающегося от донора аллогенных HSCT. В некоторых вариантах осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в день аутологичной HSCT или до 12 недель позже. В конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 5 до 12 недель после аллогенной HSCT.
[0025] В различных вариантах осуществления пациент-человек не получал пользу от терапии до указанного введения популяции аллогенных клеток. В конкретных вариантах осуществления, множественная миелома является рефрактерной к терапии или рецидивирует после терапии. В конкретном варианте осуществления множественная миелома является первичной рефрактерной множественной миеломой. В другом конкретном варианте осуществления множественная миелома является рецидивирующей множественной миеломой. В другом конкретном варианте осуществления множественная миелома является рецидивирующей и рефрактерной множественной миеломой. В конкретных вариантах осуществления пациент-человек прекращает терапию по причине непереносимости терапии.
[0026] В различных других вариантах осуществления перед введением популяции аллогенных клеток пациенту-человеку не проводят терапию множественной миеломы. В конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в течение 12 недель после постановки диагноза множественной миеломы. В конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 5 до 12 недель после постановки диагноза множественной миеломы.
[0027] В конкретных вариантах осуществления способов лечения WT1-положительной множественной миеломы, описанных выше, введение популяции аллогенных клеток не приводит к какой-либо реакции "трансплантат против хозяина" (GvHD) у пациента-человека.
[0028] Настоящее изобретение также относится к способам лечения WT1-положительного плазмоклеточного лейкоза у пациента-человека, включающим введение пациенту-человеку популяции аллогенных клеток, содержащей WT1-специфичные аллогенные T-клетки.
in vitro
[0029] В одном из аспектов способы лечения WT1-положительного плазмоклеточного лейкоза у пациента-человека включают введение пациенту-человеку популяции аллогенных клеток, содержащей WT1-специфичные аллогенные T-клетки, где у популяции аллогенных клеток отсутствует значительная цитотоксичность  в отношении антигенпрезентирующих клеток, не нагруженных пептидом WT1 или не сконструированных генетически для экспрессии одного или нескольких пептидов WT1.
[0030] В некоторых вариантах осуществления плазмоклеточный лейкоз является первичным плазмоклеточным лейкозом. В других вариантах осуществления плазмоклеточный лейкоз является вторичным плазмоклеточным лейкозом.
in vitro
in vitro
[0031] В конкретном варианте осуществления популяция аллогенных клеток лизирует 15% или менее немодифицированных, стимулированных фитогемагглютинином лимфобластов, полученных от пациента-человека, в анализе цитотоксичности , таким образом, у нее отсутствует значительная цитотоксичность  в отношении антигенпрезентирующих клеток, не нагруженных пептидом WT или не сконструированных генетически для экспрессии одного или нескольких пептидов WT1.
in vitro
in vitro
[0032] В другом конкретном варианте осуществления популяция аллогенных клеток лизирует 15% или менее немодифицированных, стимулированных фитогемагглютинином лимфобластов, полученных от донора популяции аллогенных клеток, в анализе цитотоксичности , таким образом, у нее отсутствует значительная цитотоксичность  в отношении антигенпрезентирующих клеток, не нагруженных пептидом WT или не сконструированных генетически для экспрессии одного или нескольких пептидов WT1.
in vitro
in vitro
[0033] В другом конкретном варианте осуществления популяция аллогенных клеток лизирует 15% или менее немодифицированных, несовпадающих по HLA клеток EBV BLCL в анализе цитотоксичности , таким образом, у нее отсутствует значительная цитотоксичность  в отношении антигенпрезентирующих клеток, не нагруженных пептидом WT или не сконструированных генетически для экспрессии одного или нескольких пептидов WT1.
in vitro
in vitro
in vitro
[0034] В другом конкретном варианте осуществления популяция аллогенных клеток лизирует 15% или менее немодифицированных, стимулированных фитогемагглютинином лимфобластов, полученных от пациента-человека, в анализе цитотоксичности , и популяция аллогенных клеток лизирует 15% или менее немодифицированных, несовпадающих по HLA клеток EBV BLCL в анализе цитотоксичности , таким образом, у нее отсутствует значительная цитотоксичность  в отношении антигенпрезентирующих клеток, не нагруженных пептидом WT или не сконструированных генетически для экспрессии одного или нескольких пептидов WT1.
in vitro
in vitro
in vitro
[0035] В другом конкретном варианте осуществления популяция аллогенных клеток лизирует 15% или менее немодифицированных, стимулированных фитогемагглютинином лимфобластов, полученных от донора популяции аллогенных клеток, в анализе цитотоксичности , и популяция аллогенных клеток лизирует 15% или менее немодифицированных, несовпадающих по HLA клеток EBV BLCL в анализе цитотоксичности , таким образом, у нее отсутствует значительная цитотоксичность  в отношении антигенпрезентирующих клеток, не нагруженных пептидом WT или не сконструированных генетически для экспрессии одного или нескольких пептидов WT1.
in vitro
in vitro
in vitro
in vitro
in vitro
[0036] В некоторых вариантах осуществления популяция аллогенных клеток дополнительно демонстрирует лизис 20% или более антигенпрезентирующих клеток, нагруженных пептидом WT1, в анализе цитотоксичности . В конкретном варианте осуществления популяция аллогенных клеток дополнительно демонстрирует лизис 20% или более нагруженных совокупностью пептидов WT1, стимулированных фитогемагглютинином лимфобластов, полученных от пациента-человека, в анализе цитотоксичности . В другом конкретном варианте осуществления популяция аллогенных клеток дополнительно демонстрирует лизис 20% или более нагруженных совокупностью пептидов WT1 антигенпрезентирующих клеток, полученных от донора популяции аллогенных клеток, в анализе цитотоксичности . В другом конкретном варианте осуществления популяция аллогенных клеток дополнительно демонстрирует лизис 20% или более нагруженных совокупностью пептидов WT1, стимулированных фитогемагглютинином лимфобластов, полученных от пациента-человека, в анализе цитотоксичности , и демонстрирует лизис 20% или более нагруженных совокупностью пептидов WT1 антигенпрезентирующих клеток, полученных от донора популяции аллогенных клеток, в анализе цитотоксичности .
[0037] В конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в течение 12 недель после постановки диагноза плазмоклеточного лейкоза. В конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 5 до 12 недель после постановки диагноза плазмоклеточного лейкоза.
[0038] В различных вариантах осуществления перед введением популяции аллогенных клеток пациенту-человеку проводят терапию плазмоклеточного лейкоза, отличающуюся от указанной популяции аллогенных клеток. Терапия может являться аутологичной трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток (HSCT), аллогенной HSCT, химиотерапией злокачественных новообразований, индукционной терапией, лучевой терапией или их комбинацией для лечения плазмоклеточного лейкоза. В конкретном варианте осуществления аутологичная HSCT является трансплантацией стволовых клеток периферической крови. В конкретном варианте осуществления аллогенная HSCT является трансплантацией стволовых клеток периферической крови. Популяцию аллогенных клеток можно получать от донора аллогенных HSCT или стороннего донора, отличающегося от донора аллогенных HSCT.
[0039] В некоторых вариантах осуществления терапия является HSCT.
[0040] В конкретном варианте осуществления терапия является аутологичной HSCT. В конкретном варианте осуществления аутологичная HSCT является трансплантацией стволовых клеток периферической крови. В некоторых вариантах осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в день аутологичной HSCT или до 12 недель позже. В конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 5 до 12 недель после аутологичной HSCT.
[0041] В другом конкретном варианте осуществления терапия является аллогенной HSCT. В конкретном варианте осуществления аллогенная HSCT является трансплантацией стволовых клеток периферической крови. В конкретном варианте осуществления популяцию аллогенных клеток получают от донора аллогенных HSCT. В другом конкретном варианте осуществления популяцию аллогенных клеток получают из или стороннего донора, отличающегося от донора аллогенных HSCT. В некоторых вариантах осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в день аутологичной HSCT или до 12 недель позже. В конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 5 до 12 недель после аллогенной HSCT.
[0042] В различных вариантах осуществления пациент-человек не получал пользу от терапии до указанного введения популяции аллогенных клеток. В конкретных вариантах осуществления, плазмоклеточный лейкоз является рефрактерным к терапии или рецидивирует после терапии. В конкретных вариантах осуществления пациент-человек прекращает терапию по причине непереносимости терапии.
[0043] В различных других вариантах осуществления перед введением популяции аллогенных клеток пациенту-человеку не проводят терапию плазмоклеточного лейкоза. В конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в течение 12 недель после постановки диагноза плазмоклеточного лейкоза. В конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 5 до 12 недель после постановки диагноза плазмоклеточного лейкоза.
[0044] В конкретных вариантах осуществления способов лечения WT1-положительного плазмоклеточного лейкоза, описанных выше, введение популяции аллогенных клеток не приводит к какой-либо реакции "трансплантат против хозяина" (GvHD) у пациента-человека.
[0045] В конкретном варианте осуществления популяция аллогенных клеток, которую вводят пациенту-человеку, рестриктирована по аллелю HLA, общему с пациентом-человеком.
[0046] В конкретных вариантах осуществления популяция аллогенных клеток, содержащая WT1-специфичные аллогенные T-клетки, имеет общие по меньшей мере 2 из 8 аллелей HLA (например, два аллеля HLA-A, два аллеля HLA-B, два аллеля HLA-C и два аллеля HLA-DR) с пациентом-человеком.
[0047] В конкретных вариантах осуществления способы лечения WT1-положительной множественной миеломы или плазмоклеточного лейкоза, представленные в настоящем описании, перед стадией введения дополнительно включают стадию определения по меньшей мере одного аллеля HLA пациента-человека посредством типирования высокого разрешения.
in vitro
[0048] В различных вариантах осуществления способы лечения WT1-положительной множественной миеломы или плазмоклеточного лейкоза перед стадией введения дополнительно включают стадию получения популяции аллогенных клеток .
in vitro
[0049] В некоторых вариантах осуществления стадия получения популяции аллогенных клеток  включает сенсибилизацию (т.е. стимуляцию) аллогенных клеток к одному или нескольким WT1, где аллогенные клетки содержат аллогенные T-клетки.
in vitro
[0050] В конкретном варианте осуществления стадия получения популяции аллогенных клеток  включает стадию обогащения T-клеток перед указанной сенсибилизацией.
in vitro
[0051] В конкретных вариантах осуществления стадия получения популяции аллогенных клеток  после сенсибилизации дополнительно включает криоконсервацию аллогенных клеток.
in vitro
[0052] В конкретных вариантах осуществления способы лечения WT1-положительной множественной миеломы или плазмоклеточного лейкоза, представленные в настоящем описании, перед стадией введения дополнительно включают стадию размораживания криоконсервированных, сенсибилизированных пептидом WT1 аллогенных клеток и экспансию аллогенных клеток  для получения популяции аллогенных клеток.
[0053] В конкретных вариантах осуществления способы лечения WT1-положительной множественной миеломы или плазмоклеточного лейкоза, представленные в настоящем описании, перед стадией введения дополнительно включают стадию размораживания криоконсервированной формы популяции аллогенных клеток.
in vitro
[0054] В некоторых вариантах осуществления стадия получения популяции аллогенных клеток  включает сенсибилизацию аллогенных клеток с использованием дендритных клеток, активированных цитокинами моноцитов, мононуклеарных клеток периферической крови или клеток EBV-BLCL (EBV-трансформированной линии B-лимфоцитов). В конкретных вариантах осуществления стадия сенсибилизации аллогенных клеток с использованием дендритных клеток, активированных цитокинами моноцитов, мононуклеарных клеток периферической крови или клеток EBV-BLCL включает нагрузку дендритных клеток, активированных цитокинами моноцитов, мононуклеарных клеток периферической крови или клеток EBV-BLCL по меньшей мере одним иммуногенным пептидом, полученным из WT1. В конкретных вариантах осуществления стадия сенсибилизации аллогенных клеток с использованием дендритных клеток, активированных цитокинами моноцитов, мононуклеарных клеток периферической крови или клеток EBV-BLCL включает нагрузку дендритных клеток, активированных цитокинами моноцитов, мононуклеарных клеток периферической крови или клеток EBV-BLCL совокупностью перекрывающихся пептидов, полученных из одного или нескольких пептидов WT1.
in vitro
[0055] В некоторых вариантах осуществления стадия получения популяции аллогенных клеток  включает сенсибилизацию аллогенных клеток с использованием искусственных антигенпрезентирующих клеток (AAPC). В конкретных вариантах осуществления стадия сенсибилизации аллогенных T-клеток с использованием AAPC включает нагрузку AAPC по меньшей мере одним иммуногенным пептидом, полученным из WT1. В конкретных вариантах осуществления стадия сенсибилизации аллогенных T-клеток с использованием AAPC включает нагрузку AAPC совокупностью перекрывающихся пептидов, полученных из одного или нескольких пептидов WT1. В конкретных вариантах осуществления стадия сенсибилизации аллогенных клеток с использованием AAPC включает конструирование AAPC для экспрессии по меньшей мере одного иммуногенного пептида WT1 в AAPC.
[0056] В конкретном варианте осуществления совокупность перекрывающихся пептидов является совокупностью перекрывающихся пентадекапептидов.
in vitro
[0057] В различных вариантах осуществления популяцию аллогенных клеток получают из линии T-клеток. В некоторых вариантах осуществления способы лечения WT1-положительной множественной миеломы или плазмоклеточного лейкоза, представленные в настоящем описании, перед стадией введения дополнительно включают стадию селекции линии T-клеток из банка множества криоконсервированных линий T-клеток. В некоторых вариантах осуществления способы лечения WT1-положительной множественной миеломы или плазмоклеточного лейкоза, представленные в настоящем описании, перед стадией введения дополнительно включают стадию размораживания криоконсервированной формы линии T-клеток. В конкретных вариантах осуществления способы лечения WT1-положительной множественной миеломы или плазмоклеточного лейкоза, представленные в настоящем описании, перед стадией введения дополнительно включают стадию экспансии линии T-клеток .
[0058] В конкретных вариантах осуществления WT1-специфичные аллогенные T-клетки, вводимые способами, представленными в настоящем описании, распознают эпитоп RMFPNAPYL WT1.
5
6
6
6
6
6
[0059] В некоторых вариантах осуществления введение осуществляют посредством инфузии популяции аллогенных клеток. В некоторых вариантах осуществления инфузия является болюсной внутривенной инфузией. В некоторых вариантах осуществления введение включает введение пациенту-человеку по меньшей мере приблизительно 1×10 клеток из популяции аллогенных клеток на килограмм на дозу. В некоторых вариантах осуществления введение включает введение пациенту-человеку от приблизительно 1×10 до приблизительно 5×10 клеток из популяции аллогенных клеток на килограмм на дозу. В конкретном варианте осуществления введение включает введение пациенту-человеку приблизительно 1×10 клеток из популяции аллогенных клеток на килограмм на дозу. В другом конкретном варианте осуществления введение включает введение пациенту-человеку приблизительно 3×10 клеток из популяции аллогенных клеток на килограмм на дозу. В другом конкретном варианте осуществления введение включает введение пациенту-человеку приблизительно 5×10 клеток из популяции аллогенных клеток на килограмм на дозу.
[0060] В некоторых вариантах осуществления способы лечения WT1-положительной множественной миеломы и плазмоклеточного лейкоза, представленные в настоящем описании, включают введение пациенту-человеку по меньшей мере 2 доз популяции аллогенных клеток. В конкретных вариантах осуществления способы лечения WT1-положительной множественной миеломы и плазмоклеточного лейкоза, представленные в настоящем описании, включают введение пациенту-человеку 2, 3, 4, 5 или 6 доз популяции аллогенных клеток. В конкретном варианте осуществления способы лечения WT1-положительной множественной миеломы и плазмоклеточного лейкоза, представленные в настоящем описании, включают введение пациенту-человеку 3 доз популяции аллогенных клеток.
[0061] В некоторых вариантах осуществления способы лечения WT1-положительной множественной миеломы и плазмоклеточного лейкоза, представленные в настоящем описании, включают период вымывания между двумя последовательными дозами, где в течение периода вымывания не вводят популяцию аллогенных клеток. В конкретных вариантах осуществления период вымывания составляет приблизительно 1, 2, 3 или 4 недели. В конкретном варианте осуществления период вымывания составляет приблизительно 4 недели.
6
6
6
6
6
6
6
6
[0062] В конкретном варианте осуществления введение включает введение пациенту-человеку 3 доз, где каждая доза находится в диапазоне от 1×10 до 5×10 клеток из популяции аллогенных клеток на килограмм, и где 3 дозы вводят с интервалом приблизительно 4 недели. В другом конкретном варианте осуществления введение включает введение пациенту-человеку 3 доз, де каждая доза находится в диапазоне от 1×10 до 5×10 клеток из популяции аллогенных клеток на килограмм, и где 3 дозы вводят с интервалом приблизительно 3 недели. В другом конкретном варианте осуществления введение включает введение пациенту-человеку 3 доз, где каждая доза находится в диапазоне от 1×10 до 5×10 клеток из популяции аллогенных клеток на килограмм, и где 2 дозы вводят с интервалом приблизительно 3 недели. В другом конкретном варианте осуществления введение включает введение пациенту-человеку 3 доз, где каждая доза находится в диапазоне от 1×10 до 5×10 клеток из популяции аллогенных клеток на килограмм, и где 3 дозы вводят с интервалом приблизительно 1 неделя.
[0063] Настоящее изобретение также относится к способам лечения WT1-положительной множественной миеломы или плазмоклеточного лейкоза, дополнительно включающим после введения пациенту-человеку популяции аллогенных клеток введение пациенту-человеку второй популяции аллогенных клеток, содержащей WT1-специфичные аллогенные T-клетки; где вторая популяция аллогенных клеток рестриктирована по другому аллелю HLA, общему с пациентом-человеком.
4. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фигура 1.
[0064] ОтветыWT1-специфичных T-клеток и оценка заболевания после адоптивного переноса WT1-специфичных T-клеток, полученных от донора, пациенту с вторичным плазмоклеточным лейкозом. (A) M-белок и (B) соотношение каппа:лямбда представлены в качестве маркеров заболевания после TCD HSCT. Абсолютные количества CD3+CD8+ и CD3+CD4+ после адоптивного переноса WT1-специфичных T-клеток. Количества CD4+ и CD8+ WT1-специфичных T-клеток в периферической крови пациента определяли посредством анализа внутриклеточного ИФНγ, и они представлены в отдельные моменты времени. Пациент достигал CR после 2 циклов, каждый из которых состоял из 3 инфузий с 4 недельными интервалами, WT1-специфичных CTL, полученных от донора.
Фигура 2.
[0065]  Ответы WT1-специфичных T-клеток и оценка заболевания после адоптивного переноса WT1-специфичных T-клеток, полученных от донора, пациенту с первичным плазмоклеточным лейкозом. Свободная легкая каппа-цепь представлена в качестве маркера заболевания после TCD HSCT. Абсолютные количества CD3+CD8+ и CD3+CD4+ после адоптивного переноса WT1-специфичных T-клеток. Количества CD4+ и CD8+ WT1-специфичных T-клеток в периферической крови пациента определяли посредством анализа внутриклеточного ИФНγ, и они представлены в отдельные моменты времени. Пациент достигал CR после 1 цикла, состоящего из 3 инфузий WT1-специфичных CTL, полученных от донора, с 4 недельными интервалами.
Фигура 3.
[0066]  Цитогенетический анализ обогащенной популяции плазматических клеток из костного мозга.
Фигура 4.
[0067]  Опухолевая нагрузка всего организма в случае ортометастатической модели мыши H929, которой вводили стороннюю линию T-клеток из ATA 520 (** указано p<0,01 по результатам ANOVA в группах низких и высоких доз по сравнению с группой, которой вводили наполнитель). Средние значения и распределение индивидуальных опухолевых масс в группе представлены на фигуре 5 в случае больных животных с H929 в последний день, день 28, после введения дозы.
Фигура 5.
[0068]  Опухолевая масса в день 28 в виде среднего значения и индивидуальных значений в случае больных животных с H929, которым вводили линии T-клеток из ATA 520 (**указано p<0,01 по результатам одностороннего ANOVA с поправкой по сравнению с группой, которой вводили наполнитель; *** указано p<0,001 по всем группам по результатам одностороннего ANOVA; ns=статистически незначимо по результатам ANOVA с поправкой).
Фигура 6.
[0069]  Опухолевая масса в день 21 в виде среднего значения и индивидуальных значений в случае модельных мышей L363, которым вводили линию T-клеток из ATA 520 (* указано p<0,05 по результатам одностороннего ANOVA с поправкой по сравнению с группой, которой вводили наполнитель; ** указано p<0,01 по результатам одностороннего ANOVA с поправкой по сравнению с группой, которой вводили наполнитель; ns=статистически незначимо по результатам ANOVA с поправкой).
5. ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0070] Настоящее изобретение относится к способам лечения WT1 (белок опухоли Вильмса 1)-положительной множественной миеломы у пациента-человека. Настоящее изобретение дополнительно относится к способам лечения WT1-положительного плазмоклеточного лейкоза у пациента-человека. Изобретение относится к способу T-клеточной терапии, являющейся эффективной в лечении WT1-положительной множественной миеломы и WT1-положительного плазмоклеточного лейкоза у пациента-человека при низкой токсичности или без нее.
5.1. Способы лечения множественной миеломы
[0071] Настоящее изобретение относится к способам лечения WT1-положительной множественной миеломы у пациента-человека, включающим введение пациенту-человеку популяции аллогенных клеток, содержащей WT1-специфичные аллогенные T-клетки.
in vitro
[0072] В одном из аспектов способы включают введение пациенту-человеку популяции аллогенных клеток, содержащей WT1-специфичные аллогенные T-клетки, где у популяции аллогенных клеток отсутствует значительная цитотоксичность  в отношении антигенпрезентирующих клеток, не нагруженных пептидом WT1 или не сконструированных генетически для (рекомбинантной) экспрессии одного или нескольких пептидов WT1. Таким образом, популяция аллогенных клеток не обладает значительными уровнями аллореактивности, что проявляется, как правило, в отсутствии реакции "трансплантат против хозяина" (GvHD) у пациента-человека. В конкретных вариантах осуществления популяция аллогенных клеток лизирует 15%, 10%, 5% или 1% или менее антигенпрезентирующих клеток, не нагруженных пептидом WT1 или не сконструированных генетически для (рекомбинантной) экспрессии одного или нескольких пептидов WT1. В конкретном варианте осуществления популяция аллогенных клеток лизирует 15% или менее антигенпрезентирующих клеток, не нагруженных пептидом WT1 или не сконструированных генетически для (рекомбинантной) экспрессии одного или нескольких пептидов WT1. В некоторых вариантах осуществления антигенпрезентирующие клетки получают от пациента-человека, например, немодифицированные, стимулированные фитогемагглютинином лимфобласты (т.е. стимулированные фитогемагглютинином лимфобласты, не нагруженные одним или несколькими пептидами WT1 и генетически сконструированные для экспрессии одного или нескольких пептидов WT1), полученные от пациента-человека. В других вариантах осуществления антигенпрезентирующие клетки получают от донора популяции аллогенных клеток, например, немодифицированные стимулированные фитогемагглютинином лимфобласты (т.е. стимулированные фитогемагглютинином лимфобласты, не нагруженные одним или несколькими пептидами WT1 и генетически сконструированные для экспрессии одного или нескольких пептидов WT1), полученные от донора популяции аллогенных клеток. В других вариантах осуществления антигенпрезентирующие клетки получают из немодифицированных, несовпадающих по HLA клеток из линии B-лимфоцитов, трансформированных с использованием вируса Эпштейна-Барр (EBV BLCL) (т.е. клеток EBV BLCL, не нагруженных одним или несколькими пептидами WT1 и не сконструированных генетически для экспрессии одного или нескольких пептидов WT1, и они не совпадают по HLA с популяцией аллогенных клеток).
in vitro
in vitro
[0073] В конкретном варианте осуществления популяция аллогенных клеток лизирует 15% или менее немодифицированных, стимулированных фитогемагглютинином лимфобластов, полученных от пациента-человека, в анализе цитотоксичности , таким образом, у нее отсутствует значительная цитотоксичность  в отношении антигенпрезентирующих клеток, не нагруженных пептидом WT или не сконструированных генетически для экспрессии одного или нескольких пептидов WT1.
in vitro
in vitro
[0074] В другом конкретном варианте осуществления популяция аллогенных клеток лизирует 15% или менее немодифицированных, стимулированных фитогемагглютинином лимфобластов, полученных от донора популяции аллогенных клеток, в анализе цитотоксичности , таким образом, у нее отсутствует значительная цитотоксичность  в отношении антигенпрезентирующих клеток, не нагруженных пептидом WT или не сконструированных генетически для экспрессии одного или нескольких пептидов WT1.
in vitro
in vitro
[0075] В другом конкретном варианте осуществления популяция аллогенных клеток лизирует 15% или менее немодифицированных, несовпадающих по HLA клеток EBV BLCL в анализе цитотоксичности , таким образом, у нее отсутствует значительная цитотоксичность  в отношении антигенпрезентирующих клеток, не нагруженных пептидом WT или не сконструированных генетически для экспрессии одного или нескольких пептидов WT1.
in vitro
in vitro
in vitro
[0076] В другом конкретном варианте осуществления популяция аллогенных клеток лизирует 15% или менее немодифицированных, стимулированных фитогемагглютинином лимфобластов, полученных от пациента-человека, в анализе цитотоксичности , и популяция аллогенных клеток лизирует 15% или менее немодифицированных, несовпадающих по HLA клеток EBV BLCL в анализе цитотоксичности , таким образом, у нее отсутствует значительная цитотоксичность  в отношении антигенпрезентирующих клеток, не нагруженных пептидом WT или не сконструированных генетически для экспрессии одного или нескольких пептидов WT1.
in vitro
in vitro
in vitro
[0077] В другом конкретном варианте осуществления популяция аллогенных клеток лизирует 15% или менее немодифицированных, стимулированных фитогемагглютинином лимфобластов, полученных от донора популяции аллогенных клеток, в анализе цитотоксичности , и популяция аллогенных клеток лизирует 15% или менее немодифицированных, несовпадающих по HLA клеток EBV BLCL в анализе цитотоксичности , таким образом, у нее отсутствует значительная цитотоксичность  в отношении антигенпрезентирующих клеток, не нагруженных пептидом WT или не сконструированных генетически для экспрессии одного или нескольких пептидов WT1.
in vitro
in vitro
in vitro
[0078] Во втором аспекте способы включают введение пациенту-человеку популяции аллогенных клеток, содержащей WT1-специфичные аллогенные T-клетки, где популяция аллогенных клеток демонстрирует значительную цитотоксичность  (например, демонстрирует значительный лизис) в отношении антигенпрезентирующих клеток, нагруженных пептидом WT1 или не сконструированных генетически для (рекомбинантной) экспрессии одного или нескольких пептидов WT1. В конкретных вариантах осуществления популяция аллогенных клеток демонстрирует лизис 20%, 25%, 30%, 35% или 40% или более антигенпрезентирующих клеток, нагруженных пептидом WT1, в анализе цитотоксичности . В конкретном варианте осуществления популяция аллогенных клеток демонстрирует лизис 20% или более антигенпрезентирующих клеток, нагруженных пептидом WT1, в анализе цитотоксичности . В некоторых вариантах осуществления антигенпрезентирующие клетки получают от пациента-человека, например, стимулированные фитогемагглютинином лимфобласты, полученные от пациента-человека. В других вариантах осуществления антигенпрезентирующие клетки получают от донора популяции аллогенных клеток, например, стимулированные фитогемагглютинином лимфобласты, полученные от донора популяции аллогенных клеток.
in vitro
[0079] В конкретном варианте осуществления популяция аллогенных клеток демонстрирует лизис 20% или более нагруженных пептидом WT1 (например, нагруженные совокупностью пептидов WT1), стимулированных фитогемагглютинином лимфобластов, полученных от пациента-человека, в анализе цитотоксичности .
in vitro
[0080] В другом конкретном варианте осуществления популяция аллогенных клеток демонстрирует лизис 20% или более нагруженных пептидом WT1 (например, нагруженных совокупностью пептидов WT1) антигенпрезентирующих клеток, полученных от донора популяции аллогенных клеток, в анализе цитотоксичности .
in vitro
in vitro
[0081] В другом конкретном варианте осуществления популяция аллогенных клеток демонстрирует лизис 20% или более нагруженных пептидом WT1 (например, нагруженных совокупностью пептидов WT1), стимулированных фитогемагглютинином лимфобластов, полученных от пациента-человека, в анализе цитотоксичности  и демонстрирует лизис 20% или более нагруженных пептидом WT1 (например, нагруженных совокупностью пептидов WT1) антигенпрезентирующих клеток, полученных от донора популяции аллогенных клеток, в анализе цитотоксичности .
[0082] В конкретных вариантах осуществления антигенпрезентирующие клетки нагружены совокупностью пептидов WT1. Совокупность пептидов WT1 может являться, например, совокупностью перекрывающихся пептидов (например, пентадекапептидов), охватывающих последовательность WT1. В конкретном варианте осуществления совокупность пептидов WT1 является такой, как описано в примере из раздела 6.
in vitro
in vitro
[0083] В третьем аспекте способы включают введение пациенту-человеку популяции аллогенных клеток, содержащей WT1-специфичные аллогенные T-клетки, где у популяции аллогенных клеток отсутствует значительная цитотоксичность  в отношении антигенпрезентирующих клеток, не нагруженных пептидом WT1 или не сконструированных генетически для (рекомбинантной) экспрессии одного или нескольких пептидов WT1, как описано выше, и демонстрирует значительную цитотоксичность  (например, демонстрирует значительный лизис) в отношении антигенпрезентирующих клеток, нагруженных пептидом WT1, как описано выше.
51
[0084] Цитотоксичность популяции аллогенных клеток в отношении антигенпрезентирующих клеток можно определять посредством любого анализа, известного в этой области для измерения опосредованной T-клетками цитотоксичности. В конкретном варианте осуществления цитотоксичность определяют посредством стандартного анализа высвобождения Cr, как описано в примере в разделе 6 или в Trivedi et al., 2005, Blood 105:2793-2801.
in vitro
[0085] Антигенпрезентирующие клетки, которые можно использовать в анализе цитотоксичности  с популяцией аллогенных клеток, включают, в качестве неограничивающих примеров, дендритные клетки, стимулированные фитогемагглютинином (PHA) лимфобласты, макрофаги, B-клетки, продуцирующие антитела, клетки EBV BLCL и искусственные антигенпрезентирующие клетки (AAPC).
[0086] В конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в течение 12 недель после постановки диагноза множественной миеломы. В конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 5 до 12 недель после постановки диагноза множественной миеломы. В другом конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 6 до 12 недель после постановки диагноза множественной миеломы. В другом конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 6 до 10 недель после постановки диагноза множественной миеломы. В другом конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 6 до 8 недель после постановки диагноза множественной миеломы.
[0087] В различных вариантах осуществления перед введением популяции аллогенных клеток пациенту-человеку проводят терапию множественной миеломы, отличающуюся от указанной популяции аллогенных клеток. Терапия может являться аутологичной трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток (HSCT), аллогенной HSCT, химиотерапией злокачественных новообразований, индукционной терапией, лучевой терапией или их комбинацией для лечения множественной миеломы. Если проводят индукционную терапию, она зачастую является первой фазой лечения множественной миеломы, и ее целью является снижение количества плазматических клеток в костном мозге и белков, продуцируемых плазматическими клетками. Индукционная терапия может являться любой индукционной терапией, известной в этой области для лечения множественной миеломы, и может являться, например, химиотерапией, направленной терапией, лечением с использованием кортикостероидов или их комбинацией. Аутологичная HSCT и/или аллогенная HSCT может являться трансплантацией костного мозга, трансплантацией пуповинной крови или, предпочтительно, трансплантацией стволовых клеток периферической крови. Популяцию аллогенных клеток можно получать от донора аллогенных HSCT или стороннего донора, отличающегося от донора аллогенных HSCT. Химиотерапия злокачественного новообразования может являться любой химиотерапией, известной в этой области для лечения множественной миеломы. Лучевая терапия также может являться любой лучевой терапией, известной в этой области для лечения множественной миеломы. В некоторых вариантах осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в день окончания последней такой терапии или до 12 недель позже. В конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 5 до 12 недель после окончания последней такой терапии. В другом конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 6 до 12 недель после окончания последней такой терапии. В другом конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 6 до 10 недель после окончания последней такой терапии. В другом конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 6 до 8 недель после окончания последней такой терапии. В некоторых конкретных вариантах осуществления последняя такая терапия является аутологичной HSCT. В других конкретных вариантах осуществления последняя такая терапия является аллогенной HSCT. Например, последняя такая терапия является аллогенной HSCT, которую проводят после аутологичной HSCT, которую проводят после индукционной терапии (например, индукционной химиотерапии).
[0088] В некоторых вариантах осуществления терапия является HSCT. В некоторых вариантах осуществления терапия включает HSCT.
[0089] В конкретном варианте осуществления терапия является аутологичной HSCT. В конкретном варианте осуществления терапия включает аутологичную HSCT. Аутологичная HSCT может являться трансплантацией стволовых клеток периферической крови, трансплантацией костного мозга и трансплантацией пуповинной крови. В конкретном варианте осуществления аутологичная HSCT является трансплантацией стволовых клеток периферической крови. В некоторых вариантах осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в день аутологичной HSCT или до 12 недель позже. В конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 5 до 12 недель после аутологичной HSCT. В другом конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 6 до 12 недель после аутологичной HSCT. В другом конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 6 до 10 недель после аутологичной HSCT. В другом конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 6 до 8 недель после аутологичной HSCT.
[0090] В другом конкретном варианте осуществления терапия является аллогенной HSCT (например, аллогенной HSCT с истощением T-клеток). В другом конкретном варианте осуществления терапия включает аллогенную HSCT (например, аллогенную HSCT с истощением T-клеток). Аллогенная HSCT может являться трансплантацией стволовых клеток периферической крови, трансплантацией костного мозга и трансплантацией пуповинной крови. В конкретном варианте осуществления аллогенная HSCT является трансплантацией стволовых клеток периферической крови. Популяцию аллогенных клеток можно получать от донора аллогенных HSCT или стороннего донора, отличающегося от донора аллогенных HSCT. В некоторых вариантах осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в день аутологичной HSCT или до 12 недель позже. В конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 5 до 12 недель после аллогенной HSCT. В другом конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 6 до 12 недель после аллогенной HSCT. В другом конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 6 до 10 недель после аллогенной HSCT. В другом конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 6 до 8 недель после аллогенной HSCT.
,
[0091] В различных вариантах осуществления пациент-человек не получает пользу от терапии до указанного введения популяции аллогенных клеток. Пациента-человека считают неполучающим пользу от терапии множественной миеломы, если множественная миелома является рефрактерной к терапии, рецидивирует после терапии, и/или если пациент-человек прекращает терапию по причине непереносимости терапии (например, токсичности терапии в контексте возраста или состояния пациента). Если терапия является аллогенной HSCT или включает ее, непереносимость может являться результатом реакции "трансплантат против хозяина" (GvHD), вызываемой аллогенной HSCT. В конкретных вариантах осуществления множественная миелома является рецидивирующей/рефрактерной множественной миеломой (RRMM), которая может являться, например, первичной рефрактерной множественной миеломой, рецидивирующей множественной миеломой или рецидивирующей и рефрактерной множественной миеломой. В конкретном варианте осуществления множественная миелома является первичной рефрактерной множественной миеломой. В другом конкретном варианте осуществления множественная миелома является рецидивирующей множественной миеломой. В другом конкретном варианте осуществления множественная миелома является рецидивирующей и рефрактерной множественной миеломой. Рецидивирующую и рефрактерную множественную миелому определяют как прогрессирование заболевания во время терапии у пациентов, достигших минимального ответа (MR) или лучшего результата, или у которых наблюдают прогрессирование в течение 60 дней их последней терапии. Пациентов, которые никогда не достигали, по меньшей мере, MR на исходную индукционную терапию, и у которых наблюдают прогрессирование во время терапии, определяют как "первичных рефрактерных". Рецидивирующую множественную миелому определяют как заболевание у пациента с миеломой, которого ранее подвергали лечению, достигшего ремиссии имеющего признаки PD (прогрессирующего заболевания), как определено ниже, и который на момент рецидива не соответствует критериям рецидивирующей и рефрактерной или первичной рефрактерной множественной миеломы в соответствии с критериями Международной группы по изучению множественной миеломы, PD определяют по по меньшей мере 25% повышению относительно низшего предела парапротеина в сыворотке (абсолютное повышение должно составлять ≥0,5 г/дл), или парапротеина в моче (абсолютное повышение должно составлять ≥200 мг/24 часа), или по разнице уровней вовлеченной и невовлеченной свободной легкой цепи (FLC) (при аномальном соотношении FLC и разнице FLC >100 мг/л). У пациентов с отсутствием измеримых уровней парапротеина (олиго- или несекреторная миелома) для определения прогрессирования заболевания используют повышение плазматических клеток в костном мозге (повышение ≥10%), или новые очаги повреждения костей/мягких тканей, увеличивающие размер существующих повреждений, или необъяснимую концентрацию кальция в сыворотке >11,5 мг/дл. В конкретном варианте осуществления комбинированная химиотерапия (например, комбинированная химиотерапия, включающая лечение леналидомидом и бортезомибом) не приносит пользу пациенту-человеку. В конкретном варианте осуществления пациенту-человеку не приносит пользу множество линий лечения, включая комбинированную химиотерапию (например, комбинированную химиотерапию, включающая лечение леналидомидом и бортезомибом) и аутологичную HSCT.
[0092] В различных других вариантах осуществления перед введением популяции аллогенных клеток пациенту-человеку не проводят терапию множественной миеломы. В таких вариантах осуществления популяцию аллогенных клеток вводят в качестве терапии множественной миеломы первой линии. В конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в течение 12 недель после постановки диагноза множественной миеломы. В конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 5 до 12 недель после постановки диагноза множественной миеломы. В другом конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 6 до 12 недель после постановки диагноза множественной миеломы. В другом конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 6 до 10 недель после постановки диагноза множественной миеломы. В другом конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 6 до 8 недель после постановки диагноза множественной миеломы.
[0093] В конкретных вариантах осуществления способов лечения WT1-положительной множественной миеломы, описанных вые выше, введение популяции аллогенных клеток не приводит к какой-либо реакции "трансплантат против хозяина" (GvHD) у пациента-человека.
5.2. Способы лечения плазмоклеточного лейкоза
[0094] Настоящее изобретение также относится к способам лечения WT1-положительного плазмоклеточного лейкоза у пациента-человека, включающим введение пациенту-человеку популяции аллогенных клеток, содержащей WT1-специфичные аллогенные T-клетки.
in vitro
[0095] В одном из аспектов способы включают введение пациенту-человеку популяции аллогенных клеток, содержащей WT1-специфичные аллогенные T-клетки, где у популяции аллогенных клеток отсутствует значительная цитотоксичность  в отношении антигенпрезентирующих клеток, не нагруженных пептидом WT1 или не сконструированных генетически для (рекомбинантной) экспрессии одного или нескольких пептидов WT1. Таким образом, популяция аллогенных клеток не обладает значительными уровнями аллореактивности, что, как правило, проявляется в отсутствии реакции "трансплантат против хозяина" (GvHD) у пациента-человека. В конкретных вариантах осуществления популяция аллогенных клеток лизирует 15%, 10%, 5% или 1% или менее антигенпрезентирующих клеток, не нагруженных пептидом WT1 или не сконструированных генетически для (рекомбинантной) экспрессии одного или нескольких пептидов WT1. В конкретном варианте осуществления популяция аллогенных клеток лизирует 15% или менее антигенпрезентирующих клеток, не нагруженных пептидом WT1 или не сконструированных генетически для (рекомбинантной) экспрессии одного или нескольких пептидов WT1. В некоторых вариантах осуществления антигенпрезентирующие клетки получают от пациента-человека, например, немодифицированные, стимулированные фитогемагглютинином лимфобласты (т.е. стимулированные фитогемагглютинином лимфобласты, не нагруженные одним или несколькими пептидами WT1 и генетически сконструированные для экспрессии одного или нескольких пептидов WT1), полученных от пациента-человека. В других вариантах осуществления антигенпрезентирующие клетки получают от донора популяции аллогенных клеток, например, немодифицированные, стимулированные фитогемагглютинином лимфобласты (т.е. стимулированные фитогемагглютинином лимфобласты, не нагруженные одним или несколькими пептидами WT1 и генетически сконструированные для экспрессии одного или нескольких пептидов WT1), полученные от донора популяции аллогенных клеток. В других вариантах осуществления антигенпрезентирующие клетки получают из немодифицированных, несовпадающих по HLA клеток из линии B-лимфоцитов, трансформированных с использованием вируса Эпштейна-Барр (EBV BLCL) (т.е. клеток EBV BLCL, не нагруженных одним или несколькими пептидами WT1 и не сконструированных генетически для экспрессии одного или нескольких пептидов WT1, и несовпадающих по HLA относительно популяции аллогенных клеток).
in vitro
in vitro
[0096] В конкретном варианте осуществления популяция аллогенных клеток лизирует 15% или менее немодифицированных, стимулированных фитогемагглютинином лимфобластов, полученных от пациента-человека, в анализе цитотоксичности , таким образом, у нее отсутствует значительная цитотоксичность  в отношении антигенпрезентирующих клеток, не нагруженных пептидом WT или не сконструированных генетически для экспрессии одного или нескольких пептидов WT1.
in vitro
in vitro
[0097] В другом конкретном варианте осуществления популяция аллогенных клеток лизирует 15% или менее немодифицированных, стимулированных фитогемагглютинином лимфобластов, полученных от донора популяции аллогенных клеток, в анализе цитотоксичности , таким образом, у нее отсутствует значительная цитотоксичность  в отношении антигенпрезентирующих клеток, не нагруженных пептидом WT или не сконструированных генетически для экспрессии одного или нескольких пептидов WT1.
in vitro
in vitro
[0098] В другом конкретном варианте осуществления популяция аллогенных клеток лизирует 15% или менее немодифицированных, несовпадающих по HLA клеток EBV BLCL в анализе цитотоксичности , таким образом, у нее отсутствует значительная цитотоксичность  в отношении антигенпрезентирующих клеток, не нагруженных пептидом WT или не сконструированных генетически для экспрессии одного или нескольких пептидов WT1.
in vitro
in vitro
in vitro
[0099] В другом конкретном варианте осуществления популяция аллогенных клеток лизирует 15% или менее немодифицированных, стимулированных фитогемагглютинином лимфобластов, полученных от пациента-человека, в анализе цитотоксичности , и популяция аллогенных клеток лизирует 15% или менее немодифицированных, несовпадающих по HLA клеток EBV BLCL в анализе цитотоксичности , таким образом, у нее отсутствует значительная цитотоксичность  в отношении антигенпрезентирующих клеток, не нагруженных пептидом WT или не сконструированных генетически для экспрессии одного или нескольких пептидов WT1.
in vitro
in vitro
in vitro
[0100] В другом конкретном варианте осуществления популяция аллогенных клеток лизирует 15% или менее немодифицированных, стимулированных фитогемагглютинином лимфобластов, полученных от донора популяции аллогенных клеток, в анализе цитотоксичности , и популяция аллогенных клеток лизирует 15% или менее немодифицированных, несовпадающих по HLA клеток EBV BLCL в анализе цитотоксичности , таким образом, у нее отсутствует значительная цитотоксичность  в отношении антигенпрезентирующих клеток, не нагруженных пептидом WT или не сконструированных генетически для экспрессии одного или нескольких пептидов WT1.
in vitro
in vitro
in vitro
[0101] Во втором аспекте способы включают введение пациенту-человеку популяции аллогенных клеток, содержащей WT1-специфичные аллогенные T-клетки, где популяция аллогенных клеток демонстрирует значительную цитотоксичность  (например, демонстрирует значительный лизис) в отношении антигенпрезентирующих клеток, нагруженных пептидом WT1. В конкретных вариантах осуществления популяция аллогенных клеток демонстрирует лизис 20%, 25%, 30%, 35% или 40% или более антигенпрезентирующих клеток, нагруженных пептидом WT1, в анализе цитотоксичности . В конкретном варианте осуществления популяция аллогенных клеток демонстрирует лизис 20% или более антигенпрезентирующих клеток, нагруженных пептидом WT1, в анализе цитотоксичности . В некоторых вариантах осуществления антигенпрезентирующие клетки получают от пациента-человека, например, стимулированных фитогемагглютинином лимфобласты, полученных от пациента-человека. В других вариантах осуществления антигенпрезентирующие клетки получают от донора популяции аллогенных клеток, например, стимулированные фитогемагглютинином лимфобласты, полученные от донора популяции аллогенных клеток.
in vitro
[0102] В конкретном варианте осуществления популяция аллогенных клеток демонстрирует лизис 20% или более нагруженных пептидом WT1 (нагруженных совокупностью пептидов WT1), стимулированных фитогемагглютинином лимфобластов, полученных от пациента-человека, в анализе цитотоксичности .
in vitro
[0103] В другом конкретном варианте осуществления популяция аллогенных клеток демонстрирует лизис 20% или более нагруженных пептидом WT1 (например, нагруженных совокупностью пептидов WT1) антигенпрезентирующих клеток, полученных от донора популяции аллогенных клеток, в анализе цитотоксичности .
in vitro
in vitro
[0104] В другом конкретном варианте осуществления популяция аллогенных клеток демонстрирует лизис 20% или более нагруженных пептидом WT1 (например, нагруженных совокупностью пептидов WT1), стимулированных фитогемагглютинином лимфобластов, полученных от пациента-человека, в анализе цитотоксичности , и демонстрирует лизис 20% или более нагруженных пептидом WT1 (например, нагруженных совокупностью пептидов WT1) антигенпрезентирующих клеток, полученных от донора популяции аллогенных клеток, в анализе цитотоксичности .
[0105] В конкретных вариантах осуществления антигенпрезентирующие клетки нагружены совокупностью пептидов WT1. Совокупность пептидов WT1 может являться, например, совокупностью перекрывающихся пептидов (например, пентадекапептидов), охватывающих последовательность WT1. В конкретном варианте осуществления совокупность пептидов WT1 является такой, как описано в примере в разделе 6.
in vitro
in vitro
[0106] В третьем аспекте способы включают введение пациенту-человеку популяции аллогенных клеток, содержащей WT1-специфичные аллогенные T-клетки, где у популяции аллогенных клеток отсутствует значительная цитотоксичность  в отношении антигенпрезентирующих клеток, не нагруженных пептидом WT1 или не сконструированных генетически для (рекомбинантной) экспрессии одного или нескольких пептидов WT1, как описано выше, и демонстрирует значительную цитотоксичность  (например, демонстрирует значительный лизис) в отношении антигенпрезентирующих клеток, нагруженных пептидом WT1, как описано выше.
51
[0107] Цитотоксичность популяции аллогенных клеток в отношении антигенпрезентирующих клеток можно определять посредством любого анализа, известного в этой области для измерения опосредованной T-клетками цитотоксичности. В конкретном варианте осуществления цитотоксичность определяют посредством стандартного анализа высвобождения Cr, как описано в примере в разделе 6 или в Trivedi et al., 2005, Blood 105:2793-2801.
in vitro
[0108] Антигенпрезентирующие клетки, которые можно использовать в анализе цитотоксичности  с популяцией аллогенных клеток, включают, в качестве неограничивающих примеров, дендритные клетки, стимулированные фитогемагглютинином (PHA) лимфобласты, макрофаги, B-клетки, продуцирующие антитела, и искусственные антигенпрезентирующие клетки (AAPC).
9
[0109] В некоторых вариантах осуществления плазмоклеточный лейкоз является первичным плазмоклеточным лейкозом. В других вариантах осуществления плазмоклеточный лейкоз является вторичным плазмоклеточным лейкозом. Первичный плазмоклеточный лейкоз определяют по наличию >2×10 плазматических клеток/л периферической крови или плазмоцитоза составляющего >20% дифференциальной лейкоцитарной формулы, и он не развивается из уже существующей множественной миеломы (MM) (Jaffe et al., 2001, Ann Oncol 13:490-491; Hayman and Fonseca, 2001, Curr Treat Options Oncol 2:205-216). Однако, вторичный PCL (sPCL) является лейкозной трансформацией терминальной стадии MM.
[0110] В конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в течение 12 недель после постановки диагноза плазмоклеточного лейкоза. В конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 5 до 12 недель после постановки диагноза плазмоклеточного лейкоза. В другом конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 6 до 12 недель после постановки диагноза плазмоклеточного лейкоза. В другом конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 6 до 10 недель после постановки диагноза плазмоклеточного лейкоза. В другом конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 6 до 8 недель после постановки диагноза плазмоклеточного лейкоза.
[0111] В различных вариантах осуществления перед введением популяции аллогенных клеток пациенту-человеку проводят терапию плазмоклеточного лейкоза, отличающуюся от указанной популяции аллогенных клеток. Терапия может являться аутологичной трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток (HSCT), аллогенной HSCT, химиотерапией злокачественных новообразований, индукционной терапией, лучевой терапией или их комбинацией для лечения плазмоклеточного лейкоза. Если проводят индукционную терапию, она зачастую является первой фазой лечения плазмоклеточного лейкоза, и ее целью является снижение количества плазматических клеток в костном мозге и белков, продуцируемых плазматическими клетками. Индукционная терапия может являться любой индукционной терапией, известной в этой области для лечения плазмоклеточного лейкоза, и может являться, например, химиотерапией, направленной терапией, лечением с использованием кортикостероидов или их комбинацией. Аутологичная HSCT и/или аллогенная HSCT может являться трансплантацией костного мозга, трансплантацией пуповинной крови или, предпочтительно, трансплантацией стволовых клеток периферической крови. Популяцию аллогенных клеток можно получать от донора аллогенных HSCT или стороннего донора, отличающегося от донора аллогенных HSCT. Химиотерапия злокачественного новообразования может являться любой химиотерапией, известной в этой области для лечения плазмоклеточного лейкоза. Лучевая терапия также может являться любой лучевой терапией, известной в этой области для лечения плазмоклеточного лейкоза. В некоторых вариантах осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в день окончания последней такой терапии или до 12 недель позже. В конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 5 до 12 недель после окончания последней такой терапии. В другом конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 6 до 12 недель после окончания последней такой терапии. В другом конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 6 до 10 недель после окончания последней такой терапии. В другом конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 6 до 8 недель после окончания последней такой терапии. В некоторых конкретных вариантах осуществления, последняя такая терапия является аутологичной HSCT. В других конкретных вариантах осуществления, последняя такая терапия является аллогенной HSCT. Например, последняя такая терапия является аллогенной HSCT, которую проводят после аутологичной HSCT, которую проводят после индукционной терапии (например, индукционной химиотерапии).
[0112] В некоторых вариантах осуществления терапия является HSCT. В некоторых вариантах осуществления терапия включает HSCT.
[0113] В конкретном варианте осуществления терапия является аутологичной HSCT. В конкретном варианте осуществления терапия включает аутологичную HSCT. Аутологичная HSCT может являться трансплантацией стволовых клеток периферической крови, трансплантацией костного мозга и трансплантацией пуповинной крови. В конкретном варианте осуществления аутологичная HSCT является трансплантацией стволовых клеток периферической крови. В некоторых вариантах осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в день аутологичной HSCT или до 12 недель позже. В конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 5 до 12 недель после аутологичной HSCT. В другом конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 6 до 12 недель после аутологичной HSCT. В другом конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 6 до 10 недель после аутологичной HSCT. В другом конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 6 до 8 недель после аутологичной HSCT.
[0114] В другом конкретном варианте осуществления терапия является аллогенной HSCT (например, аллогенной HSCT с истощением T-клеток). В другом конкретном варианте осуществления терапия включает аллогенную HSCT (например, аллогенную HSCT с истощением T-клеток). Аллогенная HSCT может являться трансплантацией стволовых клеток периферической крови, трансплантацией костного мозга и трансплантацией пуповинной крови. В конкретном варианте осуществления аллогенная HSCT является трансплантацией стволовых клеток периферической крови. Популяцию аллогенных клеток можно получать от донора аллогенных HSCT или стороннего донора, отличающегося от донора аллогенных HSCT. В некоторых вариантах осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в день аутологичной HSCT или до 12 недель позже. В конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 5 до 12 недель после аллогенной HSCT. В другом конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 6 до 12 недель после аллогенной HSCT. В другом конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 6 до 10 недель после аллогенной HSCT. В другом конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 6 до 8 недель после аллогенной HSCT.
[0115] В различных вариантах осуществления пациент-человек не получает пользу от терапии до указанного введения популяции аллогенных клеток. Пациента-человека считают неполучающим пользу от терапии плазмоклеточного лейкоза, если плазмоклеточный лейкоз является рефрактерным к терапии, рецидивирует после терапии, и/или если пациент-человек прекращает терапию по причине непереносимости терапии (например, токсичности терапии в контексте возраста или состояния пациента). Если терапия является аллогенной HSCT или включает ее, непереносимость может являться результатом реакции "трансплантат против хозяина" (GvHD), вызываемой аллогенной HSCT. Т.к. плазмоклеточный лейкоз является очень агрессивным заболеванием с коротким периодом выживаемости без прогрессирования, почти все пациенты являются рефрактерными. Плазмоклеточный лейкоз считают рефрактерным к терапии, если плазмоклеточный лейкоз не демонстрирует ответа, или наблюдают остаточную болезнь, или он прогрессирует во время терапии. В конкретном варианте осуществления пациент-человек не получает пользу от комбинированной химиотерапии (например, VDT-PACE, RVD, или их комбинации). VDT-PACE является схемой комбинированной химиотерапии с использованием бортезомиба, дексаметазона, талидомида, цисплатина, доксорубицина, циклофосфамида и этопозида. RVD является схемой комбинированной химиотерапии с использованием леналидомида, бортезомиба и дексаметазона. В конкретном варианте осуществления пациенту-человеку не приносит пользу множество линий лечения, включая комбинированную химиотерапию (например, VDT-PACE, RVD, или их комбинация) и аутологичную HSCT.
[0116] В различных других вариантах осуществления перед введением популяции аллогенных клеток пациенту-человеку не проводят терапию плазмоклеточного лейкоза. В таких вариантах осуществления популяцию аллогенных клеток вводят в качестве терапии плазмоклеточного лейкоза первой линии. В конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в течение 12 недель после постановки диагноза плазмоклеточного лейкоза. В конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 5 до 12 недель после постановки диагноза плазмоклеточного лейкоза. В другом конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 6 до 12 недель после постановки диагноза плазмоклеточного лейкоза. В другом конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 6 до 10 недель после постановки диагноза плазмоклеточного лейкоза. В другом конкретном варианте осуществления первую дозу популяции аллогенных клеток вводят в период от 6 до 8 недель после постановки диагноза плазмоклеточного лейкоза.
[0117] В конкретных вариантах осуществления способов лечения WT1-положительного плазмоклеточного лейкоза, описанных выше, введение популяции аллогенных клеток не приводит к какой-либо реакции "трансплантат против хозяина" (GvHD) у пациента-человека.
5.3. Популяция аллогенных клеток, рестриктированная по аллелю HLA, общему с пациентом-человеком
[0118] В рамках изобретения, пациенту-человеку вводят популяцию аллогенных клеток, содержащую WT1-специфичные аллогенные T-клетки. В конкретном варианте осуществления популяция аллогенных клеток, которую вводят пациенту-человеку, рестриктирована по аллелю HLA, общему с пациентом-человеком. Это рестриктирование по аллелю HLA можно обеспечивать посредством определения профиля HLA пациента-человека (например, с использованием клеток или ткани пациента-человека) и селекции популяции аллогенных клеток, содержащей WT1-специфичные аллогенные T-клетки (или линии T-клеток, из которой будут получать популяцию аллогенных клеток), рестриктированные по аллелю HLA пациента-человека.
[0119] В некоторых вариантах осуществления определения профиля HLA типируют по меньшей мере 4 локуса HLA (предпочтительно, HLA-A, HLA-B, HLA-C и HLA-DR). В некоторых вариантах осуществления определения профиля HLA типируют 4 локуса HLA (предпочтительно, HLA-A, HLA-B, HLA-C и HLA-DR). В некоторых вариантах осуществления определения профиля HLA типируют 6 локусов HLA. В некоторых вариантах осуществления определения профиля HLA типируют 8 локусов HLA.
[0120] В некоторых вариантах осуществления, предпочтительно, помимо того, что популяция аллогенных клеток, содержащая WT1-специфичные аллогенные T-клетки, рестриктирована по аллелю HLA, общему с пациентом-человеком, она имеет по меньшей мере 2 аллеля HLA, общих с пациентом-человеком. В конкретных вариантах осуществления популяция аллогенных клеток, содержащая WT1-специфичные аллогенные T-клетки, имеет общие по меньшей мере 2 из 8 аллелей HLA (например, два аллеля HLA-A, два аллеля HLA-B, два аллеля HLA-C и два аллеля HLA-DR) с пациентом-человеком. Наличие этих общих аллелей можно обеспечивать посредством определения профиля HLA пациента-человека (например, с использованием клеток или ткани пациента-человека) и селекции популяции аллогенных клеток, содержащей WT1-специфичные аллогенные T-клетки (или линии T-клеток, из которой будут получать популяцию аллогенных клеток), имеющей по меньшей мере 2 общих (например, по меньшей мере 2 из 8) аллеля HLA с пациентом-человеком.
[0121] Профиль HLA (т.е. тип локусов HLA) можно определять (т.е. типировать) любым известным в этой области способом. Неограничивающие примеры способов определения профиля HLA можно найти в ASHI Laboratory Manual, Edition 4.2 (2003), American Society for Histocompatibility and Immunogenetics; ASHI Laboratory Manual, Supplements 1 (2006) and 2 (2007), American Society for Histocompatibility and Immunogenetics; Hurley, "DNA-based typing of HLA for transplantation." в Leffell et al., eds., 1997, Handbook of Human Immunology, Boca Raton: CRC Press; Dunn, 2011, Int J Immunogenet 38:463-473; Erlich, 2012, Tissue Antigens, 80:1-11; Bontadini, 2012, Methods, 56:471-476; и Lange et al., 2014, BMC Genomics 15: 63.
[0122] В целом, типирование высокого разрешения является предпочтительным для типирования HLA. Типирование высокого разрешения можно осуществлять любым известным в этой области способом, например, как описано в ASHI Laboratory Manual, Edition 4.2 (2003), American Society for Histocompatibility and Immunogenetics; ASHI Laboratory Manual, Supplements 1 (2006) and 2 (2007), American Society for Histocompatibility and Immunogenetics; Flomenberg et al., Blood, 104:1923-1930; Kögler et al., 2005, Bone Marrow Transplant, 36:1033-1041; Lee et al., 2007, Blood 110:4576-4583; Erlich, 2012, Tissue Antigens, 80:1-11; Lank et al., 2012, BMC Genomics 13:378; или Gabriel et al., 2014, Tissue Antigens, 83:65-75. В конкретных вариантах осуществления способы лечения WT1-положительной множественной миеломы или плазмоклеточного лейкоза, представленные в настоящем описании, перед стадией введения дополнительно включают стадию определения по меньшей мере одного аллеля HLA пациента-человека посредством типирования высокого разрешения.
[0123] Аллель HLA, по которому рестриктирована популяция аллогенных клеток, можно определять любым известным в этой области способом, например, как описано в Trivedi et al., 2005, Blood 105:2793-2801; Barker et al., 2010, Blood 116:5045-5049; Hasan et al., 2009, J Immunol, 183:2837-2850; или Doubrovina et al., 2012, Blood 120:1633-1646.
[0124] Предпочтительно, аллель HLA, по которому рестриктирована популяция аллогенных клеток, и являющийся общим с пациентом-человеком, определяют посредством типирования высокого разрешения. Предпочтительно, аллели HLA, общие между популяцией аллогенных клеток и пациентом-человеком, определяют посредством типирования высокого разрешения. Наиболее предпочтительно, аллель HLA, по которому рестриктирована популяция аллогенных клеток, и являющийся общим с пациентом-человеком, и аллели HLA, общие между популяцией аллогенных клеток и пациентом-человеком, определяют посредством типирования высокого разрешения.
5.4. Получение популяции аллогенных клеток, содержащей WT1-специфичные аллогенные T-клетки
[0125] Популяцию аллогенных клеток, содержащую WT1-специфичные аллогенные T-клетки, которые вводят пациенту-человеку, можно получать известным в этой области способом или можно выбирать из уже существующего банка (коллекции) криоконсервированных линий T-клеток (где каждая линия T-клеток содержит WT1-специфичные аллогенные T-клетки), полученных известным в этой области способом, размороженных и, предпочтительно, подвергнутых экспансии перед введением. Предпочтительно, уникальный идентификатор для каждой линии T-клеток в банке связан с информацией о том, по каким аллелям HLA рестриктирована соответствующая линия T-клеток, о профиле HLA соответствующей линии T-клеток и/или цитотоксической активности против WT1 соответствующей линии T-клеток, измеряемой известным в этой области способом (например, как описано в Trivedi et al., 2005, Blood 105:2793-2801; или Hasan et al., 2009, J Immunol 183: 2837-2850). Популяцию аллогенных клеток и линии T-клеток в банке, предпочтительно, получают способами, описанными ниже.
[0126] В различных вариантах осуществления способы лечения WT1-положительной множественной миеломы или плазмоклеточного лейкоза перед стадией введения дополнительно включают стадию получения популяции аллогенных клеток.
[0127] В конкретных вариантах осуществления стадия получения популяции аллогенных клеток включает активируемую флуоресценцией сортировку клеток в отношении WT1-специфичных T-клеток из популяции клеток крови. В конкретном варианте осуществления популяция клеток крови представляет собой мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), выделенные из образцов крови, полученных от донора-человека. Активируемую флуоресценцией сортировку клеток можно осуществлять любым известным в этой области способом, как правило, включающим окрашивание популяции клеток крови с использованием антитела, распознающего по меньшей мере один эпитоп WT1, перед стадией сортировки.
in vitro
in vitro
[0128] В конкретных вариантах осуществления стадия получения популяции аллогенных клеток включает получение популяции аллогенных клеток . Популяцию аллогенных клеток можно получать  любым известным в этой области способом. Неограничивающие примеры способов получения популяции аллогенных клеток можно найти в Trivedi et al., 2005, Blood 105:2793-2801; Hasan et al., 2009, J Immunol 183: 2837-2850; Koehne et al., 2015, Biol Blood Marrow Transplant S1083-8791(15)00372-9, опубликованной он-лайн 29 мая 2015 года; O'Reilly et al., 2007, Immunol Res 38:237-250; Doubrovina et al., 2012, Blood 120:1633-1646; и O' Reilly et al., 2011, Best Practice & Research Clinical Haematology 24:381-391.
in vitro
in vitro
[0129] В некоторых вариантах осуществления стадия получения популяции аллогенных клеток  включает сенсибилизацию (т.е. стимуляцию) аллогенных клеток (включающих аллогенные T-клетки) к одному или нескольким пептидам WT1 таким образом, чтобы получать WT1-специфичные аллогенные T-клетки. Пептид WT1 может являться полноразмерным белком WT1 (например, полноразмерным белком WT1 человека) или его фрагментом (например, фрагментом пентадекапептида WT1). В конкретных вариантах осуществления стадия получения популяции аллогенных клеток  включает сенсибилизацию аллогенных клеток к одному или нескольким пептидам WT1, презентируемым антигенпрезентирующими клетками. В конкретном варианте осуществления сенсибилизацию осуществляют посредством культивирования аллогенных клеток с антигенпрезентирующими клетками в течение периода времени, достаточного для сенсибилизации и снижения аллореактивности. Это можно осуществлять, например, посредством культивирования аллогенных клеток с антигенпрезентирующими клетками в течение от 6 до 8 недель.
in vitro,
[0130] Аллогенная клетки, используемые для получения популяции аллогенных клеток  можно выделять из донора аллогенных клеток любым известным в этой области способом, например, как описано в Trivedi et al., 2005, Blood 105:2793-2801; Hasan et al., 2009, J Immunol 183: 2837-2850; или O'Reilly et al., 2007, Immunol Res. 38:237-250.
in vitro
in vitro
[0131] В конкретном варианте осуществления стадия получения популяции аллогенных клеток  включает стадию обогащения T-клеток перед указанной сенсибилизацией. T-клетки можно обогащать, например, из лимфоцитов периферической крови, отделенных от PBMC донора аллогенных клеток. В конкретном варианте осуществления T-клетки обогащают из лимфоцитов периферической крови, отделенных от PBMC донора аллогенных клеток посредством истощения прикрепленных моноцитов с последующим истощением естественных киллеров. В конкретном варианте осуществления стадия получения популяции аллогенных клеток  включает стадию очистки T-клеток перед указанной сенсибилизацией. T-клетки можно очищать, например, посредством приведения PBMC в контакт с антителами, распознающими специфичные для T-клеток маркеры.
in vitro
in vitro
in vitro
in vitro
in vitro
in vitro
in vitro
[0132] В различных вариантах осуществления аллогенные клетки подвергают криоконсервации для хранения. В конкретном варианте осуществления, где аллогенные клетки подвергают криоконсервации, криоконсервированные аллогенные клетки размораживают и подвергают экспансии  перед сенсибилизацией. В конкретном варианте осуществления, где аллогенные клетки подвергают криоконсервации, криоконсервированные аллогенные клетки размораживают, а затем сенсибилизируют, но не подвергают экспансии  перед сенсибилизацией, а затем, необязательно, подвергают экспансии. В конкретных вариантах осуществления аллогенные клетки подвергают криоконсервации после сенсибилизации (при сенсибилизации получают WT1-специфичные аллогенные клетки). В конкретном варианте осуществления, где аллогенные клетки подвергают криоконсервации после сенсибилизации, криоконсервированные аллогенные клетки размораживают и подвергают экспансии  для получения популяции аллогенных клеток, содержащей WT1-специфичные аллогенные T-клетки. В другом конкретном варианте осуществления, где аллогенные клетки подвергают криоконсервации после сенсибилизации, криоконсервированные аллогенные клетки размораживают, но не подвергают экспансии  для получения популяции аллогенных клеток, содержащей WT1-специфичные аллогенные T-клетки. В различных других вариантах осуществления аллогенные клетки не подвергают криоконсервации. В конкретном варианте осуществления, где аллогенные клетки не подвергают криоконсервации, аллогенные клетки подвергают экспансии  перед сенсибилизацией. В конкретном варианте осуществления, где аллогенные клетки не подвергают криоконсервации, аллогенные клетки не подвергают экспансии  перед сенсибилизацией. В конкретных вариантах осуществления стадия получения популяции аллогенных клеток  дополнительно включает криоконсервацию аллогенных клеток после сенсибилизации.
in vitro
[0133] В конкретных вариантах осуществления способы лечения WT1-положительной множественной миеломы или плазмоклеточного лейкоза, представленные в настоящем описании перед стадией введения дополнительно включают стадии размораживания криоконсервированных, сенсибилизированных пептидом WT1 аллогенных клеток и экспансии аллогенных клеток  для получения популяции аллогенных клеток.
in vitro
[0134] В некоторых вариантах осуществления стадия получения популяции аллогенных клеток  включает сенсибилизацию аллогенных клеток с использованием дендритных клеток (предпочтительно, дендритные клетки получают от донора аллогенных клеток). В конкретных вариантах осуществления стадия сенсибилизации аллогенных клеток с использованием дендритных клеток включает нагрузку дендритных клеток по меньшей мере одним иммуногенным пептидом, полученным из WT1. В конкретных вариантах осуществления стадия сенсибилизации аллогенных клеток с использованием дендритных клеток включает нагрузку дендритных клеток совокупностью перекрывающихся пептидов, полученных из одного или нескольких пептидов WT1.
in vitro
[0135] В некоторых вариантах осуществления стадия получения популяции аллогенных клеток  включает сенсибилизацию аллогенных T-клеток с использованием активированных цитокинами моноцитов (предпочтительно, активированные цитокинами моноциты получают от донора аллогенных клеток). В конкретных вариантах осуществления стадия сенсибилизации аллогенных клеток с использованием активированных цитокинами моноцитов включает нагрузку активированных цитокинами моноцитов по меньшей мере одним иммуногенным пептидом, полученным из WT1. В конкретных вариантах осуществления стадия сенсибилизации аллогенных клеток с использованием активированных цитокинами моноцитов включает нагрузку активированных цитокинами моноцитов совокупностью перекрывающихся пептидов, полученных из одного или нескольких пептидов WT1.
in vitro
[0136] В некоторых вариантах осуществления стадия получения популяции аллогенных клеток  включает сенсибилизацию аллогенных клеток с использованием мононуклеарных клеток периферической крови (предпочтительно, мононуклеарные клетки периферической крови получают от донора аллогенных клеток). В конкретных вариантах осуществления стадия сенсибилизации аллогенных клеток с использованием мононуклеарных клеток периферической крови включает нагрузку мононуклеарных клеток периферической крови по меньшей мере одним иммуногенным пептидом, полученным из WT1. В конкретных вариантах осуществления стадия сенсибилизации аллогенных клеток с использованием мононуклеарных клеток периферической крови включает нагрузку мононуклеарных клеток периферической крови совокупностью перекрывающихся пептидов, полученных из одного или нескольких пептидов WT1.
in vitro
[0137] В некоторых вариантах осуществления стадия получения популяции аллогенных клеток  включает сенсибилизацию аллогенных клеток с использованием EBV-трансформированной линии B-лимфоцитов (EBV-BLCL), например, трансформированной штаммом B95.8 EBV линии B-лимфоцитов (предпочтительно, EBV-BLCL получают от донора аллогенных T-клеток). Клетки EBV-BLCL можно получать любым известным в этой области способом или как описано ранее в Trivedi et al., 2005, Blood 105:2793-2801 или Hasan et al., 2009, J Immunol 183:2837-2850. В конкретных вариантах осуществления стадия сенсибилизации аллогенных клеток с использованием клеток EBV-BLCL включает нагрузку клеток EBV-BLCL по меньшей мере одним иммуногенным пептидом, полученным из WT1. В конкретных вариантах осуществления стадия сенсибилизации аллогенных клеток с использованием клеток EBV-BLCL включает нагрузку клеток EBV-BLCL совокупностью перекрывающихся пептидов, полученных из одного или нескольких пептидов WT1.
in vitro
[0138] В некоторых вариантах осуществления стадия получения популяции аллогенных клеток  включает сенсибилизацию аллогенных клеток с использованием искусственных антигенпрезентирующих клеток (AAPC). В конкретных вариантах осуществления стадия сенсибилизации аллогенных T-клеток с использованием AAPC включает нагрузку AAPC по меньшей мере одним иммуногенным пептидом, полученным из WT1. В конкретных вариантах осуществления стадия сенсибилизации аллогенных T-клеток с использованием AAPC включает нагрузку AAPC совокупностью перекрывающихся пептидов, полученных из одного или нескольких пептидов WT1. В конкретных вариантах осуществления стадия сенсибилизации аллогенных клеток с использованием AAPC включает конструирование AAPC для экспрессии по меньшей мере одного иммуногенного пептида WT1 в AAPC.
[0139] В различных вариантах осуществления совокупность пептидов является совокупностью перекрывающихся пептидов, охватывающих WT1 (например, WT1 человека). В конкретном варианте осуществления совокупность перекрывающихся пептидов является совокупностью перекрывающихся пентадекапептидов.
[0140] В конкретных вариантах осуществления популяцию аллогенных клеток подвергают криоконсервации для хранения перед введением. В конкретных вариантах осуществления популяцию аллогенных клеток не подвергают криоконсервации для хранения перед введением. В некоторых вариантах осуществления способы лечения WT1-положительной множественной миеломы или плазмоклеточного лейкоза, представленные в настоящем описании, перед стадией введения дополнительно включают стадию размораживания криоконсервированной формы популяции аллогенных клеток.
in vitro
in vitro
in vitro
in vitro
in vitro
in vitro
[0141] В различных вариантах осуществления популяцию аллогенных клеток получают из линии T-клеток. Линия T-клеток содержит T-клетки, но процентная доля T-клеток может составлять менее 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% или 10%. В конкретных вариантах осуществления линию T-клеток подвергают криоконсервации для хранения перед введением. В конкретных вариантах осуществления линию T-клеток не подвергают криоконсервации для хранения перед введением. В некоторых вариантах осуществления линию T-клеток подвергают экспансии  для получения популяции аллогенных клеток. В других вариантах осуществления линию T-клеток не подвергают экспансии  для получения популяции аллогенных клеток. Линию T-клеток можно сенсибилизировать к одному или нескольким пептидам WT1 (таким образом, чтобы получать WT1-специфичные аллогенные T-клетки, например, посредством стадии сенсибилизация, описанной выше) до или после криоконсервации (если линию T-клеток подвергают криоконсервации) и до или после экспансии  (если линию T-клеток подвергают экспансии ). В некоторых вариантах осуществления способы лечения WT1-положительной множественной миеломы или плазмоклеточного лейкоза, представленные в настоящем описании, перед стадией введения дополнительно включают стадию селекции линии T-клеток из банка множества криоконсервированных линий T-клеток (предпочтительно, каждая из них содержит WT1-специфичные аллогенные T-клетки). Предпочтительно, уникальный идентификатор для каждой линии T-клеток в банке связан с информацией о том, по каким аллелям HLA рестриктирована соответствующая линия T-клеток, а также, необязательно, о профиле HLA соответствующей линии T-клеток. В некоторых вариантах осуществления способы лечения WT1-положительной множественной миеломы или плазмоклеточного лейкоза, представленные в настоящем описании, перед стадией введения дополнительно включают стадию размораживания криоконсервированной формы линии T-клеток. В конкретных вариантах осуществления способы лечения WT1-положительной множественной миеломы или плазмоклеточного лейкоза, представленные в настоящем описании, перед стадией введения дополнительно включают стадию экспансии линии T-клеток (например, после размораживания криоконсервированной формы линии T-клеток) . Линию T-клеток и множества криоконсервированных линий T-клеток можно получать любым известным в этой области способом, например, как описано в Trivedi et al., 2005, Blood 105:2793-2801; Hasan et al., 2009, J Immunol 183: 2837-2850; Koehne et al., 2015, Biol Blood Marrow Transplant S1083-8791(15)00372-9, опубликованной он-лайн 29 мая 2015 года; O'Reilly et al., 2007, Immunol Res 38:237-250; или O' Reilly et al., 2011, Best Practice & Research Clinical Haematology 24:381-391, или как описано выше для получения популяции аллогенных клеток .
[0142] Популяция аллогенных клеток, содержащая WT1-специфичные аллогенные T-клетки, которые вводят пациенту-человеку, содержит CD8+ T-клетки, а в конкретном варианте осуществления также содержит CD4+ T-клетки.
[0143] WT1-специфичные аллогенные T-клетки, вводимые способами, представленными в настоящем описании, распознают по меньшей мере один эпитоп WT1. В конкретных вариантах осуществления WT1-специфичные аллогенные T-клетки, вводимые способами, представленными в настоящем описании, распознают эпитоп RMFPNAPYL WT1. В конкретном варианте осуществления WT1-специфичные аллогенные T-клетки, вводимые способами, представленными в настоящем описании, распознают эпитоп RMFPNAPYL, презентируемый HLA-A0201.
5.5. Введение и доза
[0144] Путь введения популяции аллогенных клеток и количество, подлежащее введению пациенту-человеку, можно определять с учетом состояния пациента-человека и навыков врача. Как правило, введение является внутривенным.
5
6
6
6
6
6
6
6
[0145] В некоторых вариантах осуществления введение осуществляют посредством инфузии популяции аллогенных клеток. В некоторых вариантах осуществления инфузия является болюсной внутривенной инфузией. В некоторых вариантах осуществления введение включает введение пациенту-человеку по меньшей мере приблизительно 1×10 клеток из популяции аллогенных клеток на килограмм на дозу. В некоторых вариантах осуществления введение включает введение пациенту-человеку от приблизительно 1×10 до приблизительно 10×10 клеток из популяции аллогенных клеток на килограмм на дозу. В некоторых вариантах осуществления введение включает введение пациенту-человеку от приблизительно 1×10 до приблизительно 5×10 клеток из популяции аллогенных клеток на килограмм на дозу. В конкретном варианте осуществления введение включает введение пациенту-человеку приблизительно 1×10 клеток из популяции аллогенных клеток на килограмм на дозу. В другом конкретном варианте осуществления введение включает введение пациенту-человеку приблизительно 3×10 клеток из популяции аллогенных клеток на килограмм на дозу. В другом конкретном варианте осуществления введение включает введение пациенту-человеку приблизительно 5×10 клеток из популяции аллогенных клеток на килограмм на дозу.
[0146] В некоторых вариантах осуществления способы лечения WT1-положительной множественной миеломы и плазмоклеточного лейкоза, представленные в настоящем описании, включают введение пациенту-человеку по меньшей мере 2 доз популяции аллогенных клеток. В конкретных вариантах осуществления способы лечения WT1-положительной множественной миеломы и плазмоклеточного лейкоза, представленные в настоящем описании, включают введение пациенту-человеку 2, 3, 4, 5, или 6 доз популяции аллогенных клеток. В конкретном варианте осуществления способы лечения WT1-положительной множественной миеломы и плазмоклеточного лейкоза, представленные в настоящем описании, включают введение пациенту-человеку 3 доз популяции аллогенных клеток.
[0147] В некоторых вариантах осуществления способы лечения WT1-положительной множественной миеломы и плазмоклеточного лейкоза, представленные в настоящем описании, включают период вымывания между двумя последовательными дозами, где в течение периода вымывания не вводят популяцию аллогенных клеток. В конкретных вариантах осуществления период вымывания составляет приблизительно 1-8 недель. В конкретных вариантах осуществления, период вымывания составляет приблизительно 1-4 недели. В конкретных вариантах осуществления период вымывания составляет приблизительно 4-8 недель. В конкретном варианте осуществления период вымывания составляет приблизительно 1 неделю. В другом конкретном варианте осуществления период вымывания составляет приблизительно 2 недели. В другом конкретном варианте осуществления период вымывания составляет приблизительно 3 недели. В другом конкретном варианте осуществления период вымывания составляет приблизительно 4 недели.
6
6
6
[0148] В конкретном варианте осуществления способы лечения WT1-положительной множественной миеломы и плазмоклеточного лейкоза, представленные в настоящем описании, включают введение пациенту-человеку 3 доз приблизительно 1×10 клеток из популяции аллогенных клеток на килограмм на дозу и период вымывания 4 недели между двумя последовательными дозами, где в течение периода вымывания не вводят популяцию аллогенных клеток. В другом конкретном варианте осуществления способы лечения WT1-положительной множественной миеломы и плазмоклеточного лейкоза, представленные в настоящем описании, включают введение пациенту-человеку 3 доз приблизительно 3×10 клеток из популяции аллогенных клеток на килограмм на дозу и период вымывания 4 недели между двумя последовательными дозами, где в течение периода вымывания не вводят популяцию аллогенных клеток. В другом конкретном варианте осуществления способы лечения WT1-положительной множественной миеломы и плазмоклеточного лейкоза, представленные в настоящем описании, включают введение пациенту-человеку 3 доз приблизительно 5×10 клеток из популяции аллогенных клеток на килограмм на дозу и период вымывания 4 недели между двумя последовательными дозами, где в течение периода вымывания не вводят популяцию аллогенных клеток.
6
6
6
6
6
6
6
6
[0149] В конкретном варианте осуществления введение включает введение пациенту-человеку 3 доз, где каждая доза находится в диапазоне от 1×10 до 5×10 клеток из популяции аллогенных клеток на килограмм, и где 3 дозы вводят с интервалом приблизительно 4 недели. В другом конкретном варианте осуществления введение включает введение пациенту-человеку 3 доз, где каждая доза находится в диапазоне от 1×10 до 5×10 клеток из популяции аллогенных клеток на килограмм, и где 3 дозы вводят приблизительно с интервалом 3 недели. В другом конкретном варианте осуществления введение включает введение пациенту-человеку 3 доз, где каждая доза находится в диапазоне от 1×10 до 5×10 клеток из популяции аллогенных клеток на килограмм, и где 2 дозы вводят с интервалом приблизительно 3 недели. В другом конкретном варианте осуществления введение включает введение пациенту-человеку 3 доз, где каждая доза находится в диапазоне от 1×10 до 5×10 клеток из популяции аллогенных клеток на килограмм, и где 3 дозы вводят с интервалом приблизительно 1 неделя.
[0150] В некоторых вариантах осуществления первый режим дозирования, представленный в настоящем описании, используют в течение первого периода времени, а затем второй и отличающийся режим дозирования, представленный в настоящем описании, используют в течение второго периода времени, где первый период времени и второй период времени, необязательно, разделены периодом вымывания (например, приблизительно три недели). Предпочтительно, второй режим дозирования используют, только если при первом режиме дозирования не наблюдают токсичность (например, без серьезных побочных эффектов степени 3-5 в соответствии с NCI CTCAE 4.0).
[0151] Термин "приблизительно" необходимо истолковывать так, чтобы была возможна нормальная вариация.
5.6. Последовательное лечение разными популяциями клеток
in vitro
in vitro
in vitro
in vitro
[0152] Настоящее изобретение также относится к способам лечения WT1-положительной множественной миеломы или плазмоклеточного лейкоза, после введения пациенту-человеку популяции аллогенных клеток дополнительно включающим введение пациенту-человеку второй популяции аллогенных клеток, содержащей WT1-специфичные аллогенные T-клетки; где вторая популяция аллогенных клеток рестриктирована по другому аллелю HLA, общему с пациентом-человеком. В конкретном варианте осуществления у второй популяции аллогенных клеток отсутствует значительная цитотоксичность  в отношении антигенпрезентирующих клеток, не нагруженных пептидом WT-1 или не сконструированных генетически для (рекомбинантной) экспрессии одного или нескольких пептидов WT1, так же, как описано выше для популяции аллогенных клеток. В другом конкретном варианте осуществления вторая популяция аллогенных клеток демонстрирует значительную цитотоксичность  (например, демонстрирует значительный лизис) в отношении антигенпрезентирующих клеток, не нагруженных пептидом WT-1, так же, как описано выше для популяции аллогенных клеток. В другом конкретном варианте осуществления у второй популяции аллогенных клеток отсутствует значительная цитотоксичность  в отношении антигенпрезентирующих клеток, не нагруженных пептидом WT-1 или не сконструированных генетически для (рекомбинантной) экспрессии одного или нескольких пептидов WT1, так же, как описано выше для популяции аллогенных клеток, и демонстрирует значительную цитотоксичность  (например, демонстрирует значительный лизис) в отношении антигенпрезентирующих клеток, не нагруженных пептидом WT-1, так же, как описано выше для популяции аллогенных клеток.
[0153] Вторую популяцию аллогенных клеток можно вводить любым путем и с использованием любой схемы дозирования/введения, как описано в разделе 5.5.
[0154] В некоторых вариантах осуществления пациент-человек не имеет ответа, имеет неполный ответ или субоптимальный ответ (т.е. пациент-человек все равно может получать значительную пользу от продолжающегося лечения, но имеет меньшие шансы на оптимальный долговременный исход) после введения популяции аллогенных клеток и до введения второй популяции аллогенных клеток.
[0155] В конкретных вариантах осуществления две популяции аллогенных клеток, содержащие WT1-специфичные аллогенные T-клетки, каждая из которых рестриктирована по разным аллелям HLA, общим с пациентом-человеком, вводят последовательно. В конкретных вариантах осуществления три популяции аллогенных клеток, содержащие WT1-специфичные аллогенные T-клетки, каждая из которых рестриктирована по разным аллелям HLA, общим с пациентом-человеком, вводят последовательно. В конкретных вариантах осуществления четыре популяции аллогенных клеток, содержащие WT1-специфичные аллогенные T-клетки, каждая из которых рестриктирована по разным аллелям HLA, общим с пациентом-человеком, вводят последовательно. В конкретных вариантах осуществления более четырех популяций аллогенных клеток, содержащих WT1-специфичные аллогенные T-клетки, каждая из которых рестриктирована по разным аллелям HLA, общим с пациентом-человеком, вводят последовательно.
6. ПРИМЕРЫ
[0156] Конкретные варианты осуществления, представленные в настоящем описании, проиллюстрированы с помощью следующих неограничивающих примеров, в которых показано, что терапия с использованием популяции аллогенных клеток, содержащей WT1-специфичные аллогенные T-клетки по изобретению, эффективна при лечении WT1-положительной множественной миеломы и плазмоклеточного лейкоза с низкой токсичностью или без нее.
6.1. Пример 1. Клиническое исследование фазы I лечения множественной миеломы и плазмоклеточного лейкоза с использованием WT1-специфичных цитотоксических T-клеток
6.1.1. Введение
[0157] Авторы настоящего изобретения разрабатывали клиническое исследование фазы I (IRB# 12-175), спланированное для лечения пациентов с pPCL, sPCL и рефрактерной миеломой с использованием аллогенной TCD HSCT (трансплантации гемопоэтических стволовых клеток с истощением T-клеток) с последующим введением WT1-специфичных цитотоксических T-клеток (WT1 CTL) донорского происхождения. WT1 CTL можно вводить уже, например, через 6 недель после TCD HSCT, т.к. у этих линий T-клеток отсутствует аллореактивность, и, таким образом, их можно вводить гораздо раньше, чем немодифицированные донорские лимфоциты без индуцирования GvHD. Раннее введение этих клеток после аллогенной HSCT у пациентов с плазмоклеточным лейкозом является предпочтительным, т.к. медиана выживаемости без прогрессирования и общая выживаемость составляет всего 9-12 недель после аллогенной HSCT. Первые результаты и соответствующие данные о пациентах, которых лечили с использованием этого подхода, являются многообещающими, и в случае раннего введения (6-8 недель после аллогенной HSCT) WT1-специфичных T-клеток донорского происхождения у 7 пациентов, которых лечили с использованием этих CTL, не наблюдали побочных эффектов, включая отсутствие GvHD в течение до 7 месяцев после аллогенной HSCT.
6.1.2. Способы и материалы:
Получение WT1-специфичных CTL
[0158]
in vitro
[0159] Для выделения T-клеток для сенсибилизации и экспансии  мононуклеарные клетки сначала выделяли из гепаринизированной крови или лейкаферезных препаратов лейкоцитов посредством центрифугирования в градиенте плотности фиколл-гипак. После промывки T-клетки обогащали, исходно истощая моноциты посредством адгезии к стерильным пластиковым флаконам для тканевых культур или с помощью микрочастиц CD14 клинической категории (Miltenyi), если эксперимент начинают с замороженных/размороженных PBMC (мононуклеарных клеток периферической крови). NK-клетки также подвергают истощению посредством инкубации с реагентом, содержащим микрочастицы против CD56 клинической категории (Miltenyi Biotech). Затем CD56+ и CD14+ клетки удаляют посредством адгезии частиц в намагниченной стерильной колонке. Затем обогащенные T-клетками фракции промывают и суспендируют в среде, содержащей 5% предварительно подвергнутой скринингу, термически инактивированной сыворотки AB, в препарате для сенсибилизации.
in vitro
6
6
2
[0160] Для сенсибилизации  аутологичные активированные цитокинами моноциты (CAM) и аутологичные EBV BLCL, полученные, как описано ранее (Doubrovina et al., 2004, Clin Cancer Res 10:7207-7219), нагружали совокупностью 141 перекрывающегося 15-мера, охватывающего последовательность WT1, где каждый 15-мер находится в концентрации 0,35 мкг/мл. Пептиды синтезированы Invitrogen и сертифицированы как на 95% чистые и микробиологически стерильные. Для нагрузки двух типов антигенпрезентирующих клеток (APC) совокупность нонапептидов, солюбилизированных в DMSO, добавляли к промытым DC (дендритным клеткам) или EBV BLCL (линиям B-лимфоцитов, трансформированных с использованием вируса Эпштейна-Барр), суспендированным в бессывороточной среде в концентрации 1×10 клеток/мл. Эти смеси клеток инкубировали в течение 3 часов, затем промывали бессывороточной средой и добавляли к T-клеткам, суспендированным в концентрации 2×10 T-клеток/мл в среде, содержащей 5% термически инактивированной сыворотки AB человека, при соотношении эффекторных T-клеток и APC 20:1. Культуры поддерживали при 37°C в атмосфере 5% CO в воздухе. Сначала культуры сенсибилизировали, а затем ресенсибилизировали 7 днями позже с использованием нагруженных пептидами CAM. Затем нагруженные пептидами EBV BLCL использовали для ресенсибилизации. Ресенсибилизацию осуществляли каждую неделю при соотношении T-клеток и APC 4:1. Через 7 дней начального культивирования добавляли ИЛ-2 с 3-дневными интервалами до концентрации 10 МЕ/мл. Также к средам для культивирования CTL еженедельно добавляли ИЛ-15 в концентрации 10 нг/мл.
[0161] Через 28-35 дней сенсибилизации, если T-клетки являлись цитотоксическими и специфичными, их подвергали экспансии, при необходимости, в крупномасштабных культурах с ИЛ-2 и OKT3 с помощью модификации способа Dudley и Rosenberg (Dudley and Rosenberg, 2007, Semin Oncol 34:524-531) с использованием облученных, аутологичных, нагруженных пептидом WT1 EBV BLCL в качестве облученных фидеров.
Оценка качества сенсибилизированных пептидом WT1 T-клеток перед выпуском для использования в адоптивной T-клеточной терапии
[0162]
51
[0163] Сенсибилизированные T-клетки оценивали на специфичность и реактивность в отношении пептидов WT1 1) посредством подсчета с помощью FACS CD3+, CD8+ и CD4+ T-клеток и 2) посредством оценки их цитотоксичности в отношении немодифицированных и нагруженных пептидом аутологичных и аллогенных антигенпрезентирующих клеток (APC) (таких как PHA-стимулированные бласты, полученные от донора или пациента, полученные от донора дендритные клетки и полученные от донора EBV-трансформированные B-клетки). Опосредованную T-клетками цитотоксичность измеряли с использованием стандартных анализов высвобождения Cr, как описано ранее (Trivedi et al., 2005, Blood 105:2793-2801).
[0164] Для криоконсервации и последующего использования для адоптивной иммунотерапии отбирали культуры T-клеток, содержащие необходимую дозу сенсибилизированных пептидом WT1 T-клеток, у которых отсутствуют ответы на ненагруженные клетки донора и реципиента, превышающие фоновые значения. Их также тестировали на микробиологическую стерильность посредством стандартного культивирования. Также осуществляли тесты на микоплазму и уровни эндотоксина.
[0165] T-клетки считали приемлемыми для введения, если:
[0166] 1. Жизнеспособность клеток составляет >70%;
[0167] 2. Идентичность T-клеток, как полученных из донорского трансплантата пациента, подтверждают посредством типирования HLA;
[0168] 3. T-клеточный продукт является микробиологически стерильным, не содержит микоплазму и содержит <5 ЕЭ эндотоксина/мл культуры T-клеток при конечной заморозке;
[0169] 4. T-клетки могут специфически лизировать >20% WT-1 всех аутологичных донорских APC, нагруженных совокупностью пептидов, и/или всех стимулированных PHA бластов, нагруженных совокупностью пептидов WT-1, с генотипом пациента;
[0170] 5. T-клетки лизируют <15% немодифицированных стимулированных PHA бластов реципиента трансплантата донорских (аутологичных) или аллогенных донорских T-клеток, подлежащего лечению;
[0171] 6. T-клетки лизируют <15% несовпадающих по HLA EBV BLCL; и
[0172] 7. Препараты T-клеток содержат <2% CD19+ B-клеток.
Количественный анализ функциональных WT1-специфичных T-клеток с помощью анализов внутриклеточного ИФНγ
[0173]
2
[0174] Количества WT1-специфичных T-клеток определяли в различные моменты времени до и после инфузий CTL посредством количественного анализа WT1-специфичной продукции ИФНγ. Анализ продукции внутриклеточного ИФНγ осуществляли, как описано ранее (Trivedi et al., 2005, Blood 105:2793-2801; Tyler et al., 2013, Blood 121:308-317). В кратком изложении, мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC; 106) смешивали с ненагруженными аутологичными PBMC или PBMC, нагруженными совокупностями перекрывающихся пентадекапептидов WT1 и/или пептидов-аналогов, при соотношении эффекторных-стимуляторных клеток 5:1 (Trivedi et al., 2005, Blood 105:2793-2801; Tyler et al., 2013, Blood 121:308-317). Контрольные пробирки, содержащие эффекторные клетки, инкубировали отдельно до окрашивания. К нестимулированным и стимулированным образцам добавляли брефелдин A (Sigma, St Louis, MO) в концентрации 10 мкг/мл. После инкубации в течение ночи во влажной камере при 5% CO и 37°C осуществляли окрашивание и анализ, как описано ранее (Trivedi et al., 2005, Blood 105:2793-2801; Tyler et al., 2013, Blood 121:308-317). Клетки окрашивали с использованием конъюгированного с аллофикоцианином (APC) антитела против CD3, меченого фикоэритрином (PE) антитела против CD8, конъюгированного с белком хлорофиллов перидином (PerCP) антитела против CD4, фиксировали/пермеабилизовали, а затем окрашивали с помощью антитела против ИФНγ с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) (все от BD Pharmingen, San Jose, CA). Сбор данных осуществляли с помощью проточного цитометра FACSCalibur с тройными лазерами для поддержки 10 цветов с использованием программного обеспечения BD FACSDiva (BD Biosciences). Анализ данных о количествах T-клеток осуществляли с использованием программного обеспечения FlowJo (Tree Star Inc, Ashland, OR).
51
[0175] Для определения полученного из WT1 эпитопа авторы настоящего изобретения оценивали способность T-клеток продуцировать внутриклеточный ИФНγ в ответ на PBMC, в которые вводили одну из 22 совокупностей пентадекапептидов. Затем отдельные пентадекапептиды из положительных совокупностей тестировали на индукцию внутриклеточного ИФНγ. Затем рестриктирование по HLA анализировали по цитотоксичности T-клеток, определяемой по их способности лизировать клетки-мишени с введенным пептидом или контрольные клетки-мишени с использованием стандартного анализа цитотоксичности с Cr, как описано ранее (Trivedi et al., 2005, Blood 105:2793-2801). Клетки-мишени включали полученный от пациента образец, содержащий плазматические клетки (периферическая кровь или костный мозг), стимулированные PHA бласты пациента и EBV-BLCL с известным типом HLA, в которые вводили соответствующие или несоответствующие пептиды, как описано ранее (Trivedi et al., 2005, Blood 105:2793-2801; Dudley and Rosenberg, 2007, Semin Oncol 34:524-531).
Определение количеств WT1-специфичных клеток посредством анализа тетрамеров MHC
[0176]
[0177] Количества WT1-специфичных T-клеток определяли в те же моменты времени у пациентов, экспрессирующих аллели HLA A*0201 и A*0301, посредством окрашивания с использованием соответствующих тетрамеров главного комплекса гистосовместимости (MHC) A*0201/RMF и A*0301/RMF, как описано ранее. В кратком изложении, PBMC окрашивали с использованием 25 мкг/мл PE-меченого тетрамерного комплекса, 3 мкл моноклонального антитела против CD3 с фикоэритринцианином-7 (PE-Cy7), 5 мкл антитела против CD8 PerCP, 5 мкл антитела против CD45RA APC и 5 мкл антитела против CD62L FITC (все от BD Bioscience) в течение 20 минут при 4°C. Также осуществляли соответствующие контрольные окрашивания с несовпадающими по HLA тетрамерами. Затем окрашенные клетки промывали, ресуспендировали в буфере для активируемой флуоресценцией сортировки клеток (FACS) (PBS++ с 1% BSA и 0,1% азида натрия). Сбор данных осуществляли с помощью проточного цитометра FACSCalibur с тройными лазерами для поддержки 10 цветов с использованием программного обеспечения BD FACSDiva (BD Biosciences). Анализ данных о количествах T-клеток осуществляли с использованием программного обеспечения FlowJo (Tree Star Inc, Ashland, OR).
Анализ цитотоксичности
in vitro
[0178]
in vitro
51
[0179] Для оценки эффективности использовали стандартный 4-часовой анализ цитотоксичности с меткой Cr. Клетки-мишени для лизиса включали HLA-A*02-положительные линии миеломных клеток человека (ранее идентифицированные посредством проточной цитометрии) и аутологичные и совпадающие по HLA (в случае полученных от донора T-клеток) CD138 миеломные клетки, подвергнутые положительной селекции с использованием магнитных частиц. В качестве отрицательных контролей использовали HLA-A*02-отрицательные линии миеломных клеток человека и аутологичные (или клетки совпадающего хозяина в случае полученных от донора T-клеток) мононуклеарные клетки периферической крови.
Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток с истощением T-клеток
[0180]
2
2
[0181] Всех пациентов подготавливали к аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток с истощением T-клеток (TCD HSCT) с использованием бусульфана (Busulfex) (0,8 мг/кг/дозу Q6H, 10 доз), мелфалана (70 мг/м/сутки, 2 дозы) и флударабина (25 мг/м/сутки, 5 доз). Дозы бусульфана и мелфалана корректировали в соответствии с идеальной массой тела, дозу бусульфана корректировали в соответствии с фармакокинетическими исследованиями первой дозы и дозы флударабина корректировали в соответствии с измеренным клиренсом креатинина. Пациентам также вводили ATG (Thymoglobulin) перед трансплантацией для стимуляции приживления и профилактики реакции "трансплантат против хозяина" после трансплантации.
[0182] Предпочтительным источником стволовых клеток являлись стволовые клетки периферической крови (PBSC), мобилизованные посредством введения донору Г-КСФ в течение 5-6 дней. Выделяли PBSC и T-клетки подвергали истощению посредством положительной селекции CD34+ клеток-предшественников с использованием системы селекции клеток CliniMACS. Затем CD34+ клетки-предшественники периферической крови, истощенные по T-клеткам, вводили пациентам после завершения циторедукции. Медикаментозную профилактику GvHD после трансплантации не проводили. Всем пациентам после трансплантации также вводили Г-КСФ для стимуляции приживления. Пациенты также имели донора трансплантата гемопоэтических стволовых клеток, давшего согласие сдавать дополнительную кровь для получения WT1-специфичных цитотоксических T-клеток.
6.1.3. Результаты:
[0183] В исследование включали пациентов с первичным плазмоклеточным лейкозом (pPCL) или вторичным плазмоклеточным лейкозом (sPCL) и рецидивирующей/рефрактерной множественной миеломой. По протоколу пациентов подвергали аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток с истощением T-клеток (TCD HSCT) с последующим внутривенным введением WT1-специфичных цитотоксических T-клеток, полученных от донора (WT1 CTL). WT1 CTL вводили уже через 6 недель после аллогенной TCD HSCT, т.к. эти линии T-клеток утрачивали аллореактивность, несмотря на сенсибилизацию при культивировании, и авторы настоящего изобретения предполагали, что эти клетки, таким образом, можно вводить гораздо раньше, чем немодифицированные донорские лимфоциты без индуцирования GvHD. Осуществляли раннее введение этих клеток пациентам с PCL или рецидивирующей/рефрактерной MM, т.к. медиана выживаемости без прогрессирования и общая выживаемость является небольшой.
6
6
6
[0184] Авторы настоящего изобретения включали в протокол 11 пациентов и 7 пациентам вводили WT1-специфичные CTL донорского происхождения после аллогенной TCD HSCT. Учитывая агрессивную природу PCL, у 4 пациентов наблюдали прогрессирование и их исключали из исследования до введения WT1-специфичных CTL. Для настоящего исследования WT1-специфичные T-клетки получали в отделении GMP посредством сенсибилизации лимфоцитов доноров с использованием антигенпрезентирующих клеток, в которые вводили совокупность перекрывающихся пентадекапептидов, охватывающих белок WT1. WT1 CTL вводили в количестве 1×10/кг/неделю, 3×10/кг/неделю или 5×10/кг/неделю в 3 дозах на каждом уровне доз и с 4 недельными интервалами, начиная через 6-8 недель после трансплантации. У этих пациентов не наблюдали побочных эффектов, включая GvHD. Авторы настоящего изобретения наблюдали впечатляющие клинические ответы у этих пациентов и анализировали WT1-специфичные T-клеточные ответы, ассоциированные с повышением CD8+ и CD4+ WT1-специфичных T-клеток в крови и костном мозге этих пациентов. Два примера представлены на фигурах 1 и 2.
[0185] Пациента, которого лечили, как показано на фигуре 1, подвергали аллогенной TCD HSCT по причине sPCL, рефрактерного к химиотерапии спасения с использованием VDT-PACE (схемы комбинированной химиотерапии с использованием бортезомиба, дексаметазона, талидомида, цисплатина, доксорубицина, циклофосфамида и этопозида). Как показано, у пациента все равно наблюдали значительное заболевание после TCD HSCT с концентрацией M-белка 0,8 г/дл и соотношением каппа:лямбда 24. Авторы настоящего изобретения анализировали количества WT1-специфичных T-клеток посредством анализа внутриклеточного ИФНγ, как описано выше, и строили график абсолютных количеств CD8+ и CD4+ WT1-специфичных T-клеток после инфузий WT1-специфичных T-клеток. Как показано на фигуре 1, маркеры заболевания снижались, в то время как абсолютные количества CD8+ и CD4+ WT1-специфичных CTL значительно повышались. У этого пациента развивалась полная ремиссия, длившаяся более 2 лет.
2
[0186] На фигуре 2 показаны результаты, полученные после аллогенной TCD HSCT и последующей инфузии WT1-специфичных CTL, полученных от донора, у пациента с pPCL, рефрактерным к предыдущему лечению, включая 5 циклов RVD (схемы комбинированной химиотерапии с использованием леналидомида, бортезомиба и дексаметазона), 2 циклов VDT-PACE и аутологичную трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток с использованием схемы кондиционирования 200 мг/м мелфалана. У этого пациента все равно наблюдали остаточную болезнь, измеряемую по свободным легким каппа-цепям после аутологичной трансплантации стволовых клеток, и, как показано, его специфический маркер заболевания все равно находился на повышенном уровне после аллогенной TCD HSCT, но снижался до нормального уровня после введения 3 доз WT1-специфичных CTL, при этом он достигал количеств CD8+ и CD4+ WT1-специфичных T-клеток, измеряемых посредством анализа внутриклеточного ИФНγ, после инфузий CTL. У этого пациента наблюдали CR (полный ответ) в течение >1,5 лет. Примечательно, что, как показано на фигуре 3, высокий риск по данным цитогенетического анализа, проводимого на обогащенной популяции плазматических клеток из его костного мозга, также снижался после инфузий WT1-специфичных CTL.
[0187] Лечению подвергали другого пациента, и он достигал полной ремиссии после индукционной химиотерапии с последующей аутологичной трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток. 3 месяцами позже этого пациента подвергали аллогенной TCD HSCT с использованием неродственного донора, а затем вводили 3 дозы WT1-специфичных CTL донорского происхождения. Этот пациент с sPCL находится в полной ремиссии в течение 2 лет.
[0188] Кроме того, 4 пациентов с рецидивирующей/рефрактерной множественной миеломой подвергали лечению с использованием аллогенной TCD HSCT с последующим введением WT1-специфичных CTL, полученных от донора. Все эти пациенты не отвечали на множество линий лечения, включая комбинированное лечение леналидомидом и бортезомибом и аутологичную трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток. У одного из этих пациентов развивался частичный ответ, и этот частичный ответ продолжали наблюдать через 18 месяцев после аллогенной HSCT. У двоих из этих пациентов развивалось стабильное заболевание в течение 19 месяцев после аллогенной HSCT. Только у одного из этих пациентов наблюдали агрессивное прогрессирование заболевание с развитием sPCL через 7 месяцев после аллогенной HSCT и 5 месяцев после введения WT1-специфичных CTL, впоследствии он умер от sPCL, рефрактерного к дальнейшей комбинированной химиотерапии.
6.2. Пример 2. Оценка эффективности сторонних WT1-специфичных цитотоксических T-клеток с использованием моделей H929 и L363 множественной миеломы/плазмоклеточного лейкоза
6.2.1. Краткое изложение
6.2.1.1. Период исследования
[0189] Более 3 месяцев.
6.2.1.2. Цель
[0190] Оценка эффективности ATA 520 против множественной миеломы (MM)/плазмоклеточного лейкоза (PCL) в моделях диссеминированного заболевания на мышах при использовании схемы со сторонним донором.
6.2.1.3. Животные
[0191] Самки мышей NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull (NOG) возрастом 5-6 недель.
6.2.1.4. Исследуемые препараты
[0192] Библиотека линий T-клеток: ATA 520. Линии T-клеток из ATA 520, выбранные по рестриктированию по аллелю HLA, общему с линией клеток-мишеней MM.
[0193] Линия клеток-мишеней MM H929, совпадающая по HLA A03:01 с линией T-клеток, обозначенная как лот № 3 из ATA 520.
[0194] Линия клеток-мишеней MM L363, совпадающая по HLA C07:01 с линией T-клеток, обозначенная как лот № 4 из ATA 520.
6.2.1.5. Способы
in vivo
6
6
[0195] Линии клеток MM типировали по HLA, и они совпадали с соответствующим образом рестриктированными линиями T-клеток из ATA 520, как указано в информации об исследуемых препаратах. Осуществляли два исследования эффективности в 3 группах с помощью выбранных моделей множественной миеломы (ксенотрансплантатов, полученных из линий клеток, "CDX") с использованием линий клеток L363 и H929. Оценку противоопухолевой активности внутривенно инъецируемых T-клеток в двух разных недельных дозах (2×10 клеток на мышь и 10×10 клеток на мышь, соответственно) в виде монотерапии осуществляли с помощью витальной визуализации с использованием флуоресцентно меченого антитела против CD138.
6
[0196] Эксперименты включали 8 животных/группу, которым внутривенно вводили опухолевые имплантаты (инъекция 5×10 клеток на животное). Минимальный размер группы при рандомизации составлял 7 животных/группу. Запланированный период исследования составлял 5 недель. В качестве референса включали контрольную группу, которой вводили наполнитель (наполнитель: фосфатно-солевой буфер).
in vivo
[0197] Осуществляли определение массы тела (дважды в неделю) и визуализацию заболевания ("IVI", один раз в неделю с использованием антитела против CD138).
[0198] По возможности, получали образцы грудины, задних конечностей, печени и селезенки для дальнейших анализов.
6.2.1.6. Результаты и выводы
[0199] После циклов введения 5 доз линий T-клеток из ATA 520 мышам, больным MM/PCL, лечение приводило к максимальному ингибированию роста заболевания на 51,9% в моделях H929 и 18,2% в моделях L363 по сравнению с контрольной группой, которой вводили наполнитель, в течение периода исследования (p<0,002 и p<0,01, соответственно, по данным одностороннего ANOVA). Уровень контроля заболевания в группах низких и высоких доз не отличался значимо в этих двух исследованиях.
[0200] Используя эти две модели в качестве доклинической модели для выпуска ATA 520 с использованием стороннего донора (ATA 520 частично совпадает по HLA с неродственными клетками-мишенями), в этом исследовании определяли способность ATA 520 значительно ингибировать рост опухоли диссеминированной множественной миеломы и плазмоклеточного лейкоза.
6.2.2. Список некоторых сокращений и определения
<b>Сокращение</b>
<b>Расширенный термин</b>
NOG
NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull
TGI
Ингибирование роста опухоли
ANOVA
Дисперсионный анализ
IACUC
Комитет по содержанию и использованию лабораторных животных
IV
Внутривенно
MM
Множественная миелома
QD
Один раз в сутки
SEM
Стандартная ошибка среднего
MM/PCL
Множественная миелома/Плазмоклеточный лейкоз
HLA
Лейкоцитарный антиген человека
6.2.3. Введение
[0201] ATA 520 является библиотекой различных линий T-клеток, специфичных к эпитопам WT-1, презентируемым специфичным HLA. Если используют линию T-клеток из ATA 520, рестрирктированную так, что она совпадает по эпитопу WT-1, презентируемому аллелем HLA, обнаруживаемым на аллогенных клетках-мишенях, линия T-клеток облегчает дегрануляцию и индуцируемую T-клетками элиминацию клеток-мишеней. WT1 является фактором транскрипции, как правило, встречающимся в ядерных областях клеток при его экспрессии. Экспрессия WT1 распространена при многих солидных злокачественных новообразованиях и гемобластозах. Существуют клинические данные об использовании линий T-клеток из ATA 520 в аллогенных условиях после трансплантации в группах пациентов с MM и PCL.
[0202] Для моделирования использования линий клеток из ATA 520 в условиях использования стороннего донора в схожей исследуемой группе в этом исследовании использовали мышей NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull (NOG), несущих ксенотрансплантаты клеток MM/PCL человека в качестве модели пациента с MM/PCL. Пораженные клетки в этой модели подвергали полному типированию HLA и сравнивали с линиями T-клеток из ATA 520 с рестриктированием по одному аллелю HLA. Учитывая совпадение по одному аллелю HLA, обнаруживаемому на клетках-мишенях, выбирали линии T-клеток из ATA 520, представляющие собой модель использования стороннего донора для выбора лечения.
in vivo
[0203] Таким образом, настоящее исследование осуществляли для анализа противоопухолевой эффективности ATA 520 при использовании в условиях использования стороннего донора в моделях MM/PCL.
6.2.4. Цели
in vivo
[0204] Настоящее исследование осуществляли для анализа противоопухолевой эффективности ATA 520 при использовании в сторонних условиях в моделях MM/PCL .
6.2.5. Лабораторные животные
Модели H929
[0205]
[0206] 24 самок мышей NOG
[0207] Источник: Taconic
[0208] Диапазон возраста на начало исследования: 5-6 недель
Модели L363
[0209]
[0210] 24 самок мышей NOG
[0211] Источник: Taconic
[0212] Диапазон возраста на начало исследования: 5-6 недель
6.2.6. Содержание лабораторных животных
[0213] Самок мышей NOG возрастом 5-6 недель содержали в виварии Oncotest/CRL. Мышей содержали в барьерной системе с контролируемой температурой (70°±10°F), влажностью (50%±20%) и циклом 12 ч. освещения/12 ч. темноты. Мышей держали в клетках-изоляторах (5 мышей на клетку), и они имели свободный доступ к стандартному гранулированному корму и воде в течение эксперимента. Всех мышей содержали в соответствии с рекомендациями Комитета по содержанию и использованию лабораторных животных (IACUC) Oncotest/CRL.
6.2.7. Исследуемые материалы
[0214] Линии T-клеток из ATA 520 (включая лот № 3 и лот № 4) получали в Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC), поддерживали в виде концентрированных растворов и хранили в жидком азоте до использования. ATA 520 получали способами, описанными в разделе 6.1.2.
6.2.8. Дизайн исследования
[0215] Протокол исследования представлен в таблице 1.
6
6
6
6
6
[0216] Самкам мышей NOG возрастом 5-6 недель внутривенно (IV) имплантировали 5×10 клеток H929 или L363. Еженедельную визуализацию осуществляли с использованием IV введение hCD138Ab-Alexa750 для отслеживания состояния приживления с использованием системы визуализации IVIS. После получения средних значений при измерения всего тела (~14-17 дней после инокуляции) мышей распределяли по трем группам для нормализации получаемого среднего сигнала на группу. Минимальный размер группы при рандомизации составлял 7 животных/группу. Затем мышам вводили 10 мл/кг наполнителя (т.е. фосфатно-солевого буфера) или линию T-клеток из ATA 520 в количестве 2×10 или 10×10 клеток/мышь (т.е. 5×10 клеток/мл или 25×10 клеток/мл в объеме 0,4 мл на мышь) по схеме Q7D (т.е. один раз каждые 7 дней) 5 раз. Визуализацию мышей проводили каждые 7 дней в течение периода введения доз для оценки опухолевой массы. Массу тела определяли дважды в неделю. По возможности, получали образцы грудины, задних конечностей, печени и селезенки для дальнейших анализов.
[0217] Таблица 1. Дизайн исследования
№ группы
Tx
Доза ATA 520
Объем дозы<sup>b</sup>
Дни введения доз
Путь
Наполнитель
n
Мониторинг
1
Наполнитель
-
20 мл/кг
Q7Dx5
IV
PBS
8
IVI Q7Dx6<sup>a</sup>
2
Низкая доза ATA 520
2×10<sup>6</sup> клеток/мышь
20 мл/кг
Q7Dx5
IV
PBS
8
IVI Q7Dx6
3
Высокая доза ATA 520
10×10<sup>6</sup> клеток/мышь
20 мл/кг
Q7Dx5
IV
PBS
8
IVI Q7Dx6
a
Q7Dx6 означает один раз каждые 7 дней всего 6 раз.
b
В целях вычисления дозы массу мышей принимали за 20 граммов.
6.2.9. Экспериментальные способы
6.2.9.1. Тестирование HLA и селекция линий клеток из ATA 520
[0218] Замороженные клеточные осадки линий клеток-мишеней H929 и L363 типировали по HLA с использованием секвенирования высокого разрешения Tier 1 (таблица 2). В целом, препараты gDNA получали из клеточных осадков с использованием наборов Qiagen. Затем осуществляли типирование с помощью ПЦР с сиквенс-специфичными олигонуклеотидами (ПЦР-SSOP) для определения основных групп аллелей до 4 знаков с некоторой вырожденностью (например, HLA-A*23:01/03/05/06).
[0219] Геномную ДНК амплифицировали с использованием ПЦР, затем инкубировали с панелью различных олигонуклеотидных зондов с использованием технологии Luminex xMAP; каждый олигонуклеотид имеет особенную реакционную способность в отношении разных типов HLA.
[0220] Затем полученные характеристики HLA для каждой из двух линий клеток-мишеней сравнивали с характеристиками рестриктирования в библиотеке AT-520 для идентификации совпадающих линий T-клеток для каждой линии клеток-мишеней (таблица 3). Затем одну совпадающую линию T-клеток использовали в схеме исследования для мышей, несущих мишене-специфичное заболевание MM/PCL, для каждой из двух линий клеток-мишеней.
6.2.9.2. Состав дозы и введение
6
6
[0221] Замороженные сосуды с концентрированными выбранными линиями T-клеток из ATA 520 осторожно размораживали на водяной бане при 37°C. Концентрированный раствор осторожно перемешивали и делали однородным посредством повторного пипетирования с использованием пипетки на 1 мл. Затем линии T-клеток из ATA 520 разводили в PBS +10% альбумина человека, получая сток с концентрацией 25×10 клеток/мл для группы высоких доз или 5×10 клеток/мл для группы низких доз. Делали свежие стоки в каждый день введения дозы.
[0222] Животным вводили дозы еженедельно в течение 5 недель (Q7Dx5) посредством внутривенной инъекции.
6.2.9.3. Противоопухолевая эффективность
In Vivo
6
[0223] 5×10 клеток MM/PCL имплантировали мышам NOG за 12-17 дней до начала исследования. В день 0 самкам мышей NOG вводили наполнитель или линию T-клеток из ATA 520 в двух разных дозах (согласно таблице 1) в течение 5 недельных циклов. Опухолевую массу подвергали мониторингу посредством введения hCD138-Alexa750 IV и измерения флуоресценции всего тела в качестве модели опухолевой массы в течение периода исследования. Анализировали изображения, вычисляли и регистрировали сумму дорзальных и вентральных сигналов. Вычисляли среднее и стандартную ошибку для сигналов всего тела для каждой исследуемой группы для каждого сеанса визуализации. Строили график сигналов всего тела ± стандартная ошибка среднего (SEM) относительно дня исследования для представления кинетики роста опухоли для каждой группы в течение исследования. Для вычисления ингибирования роста опухоли (TGI) в конце исследования вычисляли процент ингибирования сигнала всего тела для каждой мыши по сравнению с контрольной группой, которой вводили наполнитель. Получали средний процент ингибирования ± SEM для каждой группы. Указанные выше вычисления с отслеживанием стандартных ошибок осуществляли с использованием GraphPad Prism v.6.0c. Полученные значения TGI в группах анализировали посредством одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) и критерия множественного сравнения Тьюки.
6.2.9.4. Статистические способы
[0224] Все сравнения интенсивностей и вычисления TGI осуществляли с использованием GraphPad Prism v6.0c. Значения TGI в группах анализировали посредством одностороннего ANOVA и критерия множественного сравнения Тьюки.
6.2.10. Данные и результаты
6.2.10.1. Типирование HLA и рестриктирование ATA 520
[0225] Результаты типирования HLA уровня Tier 1 клеток-мишеней MM/PCL посредством ПЦР представлено в таблице 2.
[0226] Таблица 2. Типирование HLA клеток-мишеней L363 и H929*
<b>Семейство аллелей</b>
<b>L363</b>
<b>H929</b>
<b>HLA-A</b>
*02:01/01Q/01L/09/43N/66/75/83N/89/97/132/134/140/241/252/256/266/291/294/305N/327/329/356N/357/397/411/446/455/468N/469/48-483/491/501N/502/525N/530/533/538/539/542/552
*03:01/01N/20/21N/26/37/45/78/112/118/129N/132/134/162N/182/184/188/195/197N/209
<b>HLA-A1</b>
*31:01/14N/23/46/48/55/56/59/71/72/81/83/6
*24:02/02Q/09N/11N/40N/76/79/83N/144/150/153/154/155N/163N/183N/231/249-251/263-272/275/276/279/280/282/283/287/292
<b>HLA-B</b>
*07:02/44/49N/58/59/61/104/120/128-130/156/161N/169/212/217/221/224/230/231N/233/240/241
*07:02/07/44/49N/58/59/61/104/120/128-130/156/161N/169/212/217/221/224/230/231N/233/234/240/241
<b>HLA-B1</b>
*40:01/55/141/150/151/179/221/236/241/247/264/272/273/277/278/286N
*18:01/14/53/73/81/89/99/100/103
<b>HLA-C</b>
*03:04/100/101/105/106/186/193/208N/211/212-213/218/219/235/236/239/252/256/257/259
*07:01/06/18/19/52/103/131/153/166/301/303/310/311/313/331/337/343/362/366/369/371/377/385/386/407/408
<b>HLA-C1</b>
*07:02/50/66/74/159/160/167/195/245/305/306/308/319-321/327/334/339-341/344/345/348/349/350N/359/363/368/374/381-384/389/391/392/393N/398/400/401/405
*07:02/27/50/66/74/159/160/167/195/245/305/306/308/312/316/319-321/325/327/333/334/339-341/344/345/347N/348/349/350N/359/363/368/372/374/376/381-384/388/389/392/393N/396-398/400/401/405/409
*(Представлены данные для класса I; данные для класса II не представлены)
[0227] Данные о типировании HLA в таблице 2 соотносили с рестриктированием по HLA WT-1-специфичных CTL в библиотеке ATA 520 для идентификации линий T-клеток из ATA 520, совместимых с профилями аллелей HLA клеток-мишеней, посредством сопоставления рестриктирования по одному аллелю, обнаруживаемому на клетках-мишенях. Линии T-клеток из библиотеки ATA 520 с совпадением рестриктирования по одному аллелю по меньшей мере с одной из линий клеток-мишеней представлены в таблице 3.
[0228] Таблица 3. T Линии клеток из ATA 520, совместимые с профилями HLA клеток-мишеней
Уникальный ID лота
Рестриктирование WT-1 по HLA (только CTL)
Совпадающее семейство аллелей
H929
L363
Лот № 1
A 0201
A
Лот № 2
A 0201
A
Лот № 3
A 0301/01N
A
Лот № 4
C 0701/06/18
C
C
Лот № 5
A 2402 B 3503
A
Лот № 6
C 0701/06/18
C
C
Лот № 7
A 0201 C 0401
A
Лот № 8
A 0201 C 1203 DRB1 1302 DRB1 1104
A
[0229] В таблице 3 приведен ряд линий T-клеток из ATA 520 (идентификаторы линий клеток приведены в первой колонке), рестриктирование которых совпадает по меньшей мере по одному аллелю HLA, экспрессируемому на клетках-мишенях H929 или L363. Рестриктирование линий клеток из ATA 520 приведено в 4-ой колонке, и в правых двух колонках указано, какое семейство аллелей, обнаруживаемое в клетках-мишенях, совпадает с указанным рестриктированием для каждой линии T-клеток из ATA 520. Две линии T-клеток из ATA 520, выбранные для этого исследования на мышах, указаны серым цветом. Линию T-клеток W01-D1-136-10 выбирали для введения больным мышам с H929 с учетом совпадающего рестриктирования по аллелю HLA A03:01, обнаруживаемому в H929. Линию T-клеток W01-D1-088-10 выбирали для введения больным мышам с L363 с учетом совпадающего рестриктирования по аллелю HLA C07:01, обнаруживаемому в L363.
6.2.10.2. Клинические наблюдения
[0230] На всем протяжении периода введения доз животных наблюдали на наличие каких-либо клинически значимых отклонений и необычного поведения и реакций. Не отмечено неблагоприятных клинических наблюдений в течение прижизненной части настоящего исследования.
6.2.10.3.
Эффективность
in vivo
[0231] Опухолевая масса в группе MM у мышей, несущих H929 представлена в
[0232] таблице 4, а также приведена в виде графика с исходной энергетической яркостью для каждой группы, приведенной на фигуре 4. На фигуре 5 также представлен анализ групп в день 28.
[0233] Таблица 4. Кратное изменение опухолевой массы MM всего тела и SEM в случае H929
<b>Наполнитель</b>
<b>Низкая доза</b>
<b>Высокая доза</b>
<b>Дни после введения</b>
<b>Среднее</b>
<b>SEM</b>
<b>Среднее</b>
<b>SEM</b>
<b>Среднее</b>
<b>SEM</b>
<b>0</b>
9,066E+07
5,597E+06
9,176E+07
2,512E+06
8,893E+07
1,983E+06
<b>7</b>
1,859E+08
9,940E+06
1,818E+08
3,318E+06
1,770E+08
5,189E+06
<b>14</b>
2,992E+08
1,069E+07
2,736E+08
8,160E+06
2,721E+08
1,237E+07
<b>21</b>
4,118E+08
2,195E+07
3,065E+08
2,181E+07
2,908E+08
1,157E+07
<b>28</b>
4,653E+08
3,413E+07
2,238E+08
1,957E+07
2,310E+08
1,599E+07
[0234] Опухолевая масса в группе MM в случае мышей, несущих L363, в день 21 в виде средних и отдельных значений представлена на фигуре 6.
[0235] После циклов из 5 доз выбранной линии T-клеток из ATA 520 у мышей, больных MM/PCL, введение приводило к максимальному ингибированию роста заболевания на 51,9% в моделях H929 и 18,2% в моделях L363 по сравнению с контрольной группой, которой вводили наполнитель, в течение периода исследования (p<0,002 и p<0,01, соответственно, по результатам одностороннего ANOVA). В этих двух исследованиях уровень контроля заболевания в группах низких и высоких доз не отличался значимо.
6.2.11. Выводы
[0236] Противоопухолевую эффективность библиотеки линий T-клеток, обозначенной как ATA 520, исследовали на двух ортометастатических моделях ксенотрансплантатов множественной миеломы/плазмоклеточного лейкоза, исследуемых в условиях использования стороннего донора. Клетки-мишени типировали по HLA и независимо сопоставляли с двумя отдельными линиями T-клеток из ATA 520 с учетом рестриктирования линии T-клеток по аллелю HLA, экспрессируемому на клетках-мишенях. В двух моделях стороннего лечения MM/PCL с помощью ATA 520 в случае монотерапии ATA 520 наблюдали значительное ингибирование роста опухоли в схемах с использованием высоких и низких доз. В обоих исследованиях не наблюдали значимых различий в эффективности в схемах с использованием высоких и низких доз. Две независимые линии T-клеток из ATA 520, каждая из которых рестриктирована по разным аллелям HLA, значимо ингибировали рост соответствующим образом совпадающих клеток-мишеней заболевания в двух моделях лечения с использованием стороннего донора.
[0237] Эти результаты свидетельствуют о мощной противоопухолевой активности линий T-клеток из ATA 520 в усовершенствованных моделях MM/PCL и возможности использования схожего подхода для лечения с использованием сторонних линий T-клеток из ATA 520, совпадающих с пациентами по рестриктированию по аллелю линии T-клеток из ATA 520 (ассоциированному с их активностью).
7. Включение в качестве ссылки
[0238] Все цитируемые в настоящем описании ссылки включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме и для всех целей до той степени, как если бы каждая отдельная публикация, или патент, или патентная заявка были специально и конкретно указаны как включенные в настоящее описание в полном объеме в качестве ссылки для всех целей.
[0239] Можно осуществлять множество модификаций и вариантов настоящего изобретения без отклонения от его сущности и объема, как это будет очевидно специалистам в этой области. Конкретные варианты осуществления, представленные в настоящем описании, предложены исключительно в качестве примера, и настоящее изобретение ограничено исключительно формулой изобретения вместе с полным объемом эквивалентов, к которым относится такая формула изобретения.