СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ОСТЕОАРТРИТА У ЖИВОТНОГО СЕМЕЙСТВА КОШАЧЬИХ
METHODS AND COMPOSITIONS FOR DIAGNOSTICS OF OSTEOARTHRITIS AT CAT FAMILY

Область техники
Настоящее изобретение относится к идентификации новых маркеров остеоартрита у животного семейства кошачьих и к способам диагностики, композициям и наборам, связанным с этим.
Уровень техники
Артрит, более конкретно, остеоартрит (OA), представляет собой дегенеративное поражение суставов, широко распространенное среди людей и домашних животных. OA включает в себя прогрессирующую дегенерацию суставного хряща с потерей протеогликана и коллагена и с пролиферацией новой кости, сопровождающуюся воспалительной реакцией внутри синовиальной мембраны. Это самая широко распространенная форма суставного и скелетно-мышечного заболевания, которому подвержены собаки, но кошки также могут страдать этим заболеванием.
OA животного семейства кошачьих представляет собой заболевание, которому, прежде всего, подвержены животные семейства кошачьих в возрасте 10 лет или старше. Для животных, страдающих этим заболеванием, характерна меньшая склонность к прыжкам, меньшая высота прыжков или полное прекращение прыжков, избегание подъема или спуска по ступеням и тенденция более редкого использования кошачьего туалета. Оказывается также, что кошки, страдающие OA, менее дружелюбны, демонстрируют изменения характера сна-пробуждения и могут также иметь проблемы, связанные с уходом за шерстью. Терапия OA у кошек подобна схемам лечения для других видов, такие схемы включают изменение окружающей среды, лечение ожирения, контролируемую умеренную физическую нагрузку, контролирование болевого состояния и хирургическое вмешательство.
Изменения окружающей среды начинаются с размещения чаш с едой и туалетов в таких местах, куда не требуется прыгать или подниматься по ступеням. Могут быть построены небольшие уклоны к местам кормления или туалета. Само животное может делать попытки уменьшения больших прыжков вверх или вниз, побуждения к умеренной физической нагрузке и создания окружающей среды, где кошка не сталкивается с полосой препятствий при поддержании распорядка дня. Изменение окружающей среды не замедляет прогрессирования заболевания.
На кошек с превышением веса, страдающих OA, может оказать благотворительное воздействие контроль за весом. Уменьшение веса тела смягчает давление и боль в пораженном(ых) суставе(ах). Хотя потеря веса у кошек с превышением веса или с ожирением может помочь смягчить боль, вызванную OA, она не прекращает прогрессирование заболевания.
Контроль боли у кошек является проблемным, так как схемы лечения лекарственными средствами, которые безвредны для других видов, необязательно безвредны для кошек. Хотя многие фармацевтические компании апробируют нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (NSAID) для лечения боли у кошек, аспирин представляет собой единственное средство NSAID, для которого установлена безвредная постоянная доза для кошек. Кортикостероиды использовали для смягчения боли и воспаления, но их использование может вызвать прогрессирование OA. NSAID может помочь смягчить боль, но не изменяет прогрессирование OA.
Нутрицевтики использовали для смягчения боли у кошек, ассоциированной с OA. Хондроитин сульфат и глюкозамин HCl, используемые в комбинации или по отдельности, использовали в качестве схемы лечения OA у кошек. Не существует опубликованных клинических исследований, которые бы указывали, что эти нутрицевтики изменяют прогрессирование OA. Недавние данные для людей указывают, что хондроитин и глюкозамин могут помочь смягчить боль у людей, страдающих тяжелой формой OA.
Способы, описанные выше, хотя и помогают в некотором отношении для обеспечения симптоматического ослабления, не являются достаточно успешными при терапии заболевания, поскольку они абсолютно не лечат лежащую в основе патологию. Действительно, необходимы не только улучшенные способы лечения, но также улучшенные способы для отслеживания клинического прогресса у животного, страдающего OA, а также для постановки диагноза животному, которое страдает OA, и для выявления тех животных, которые могут быть генетически предрасположены к развитию OA, но у которых еще не проявлены клинические признаки заболевания. В настоящее время для подтверждения диагноза OA у животного, должны проводиться экстенсивные рентгенографические тесты, и эти тесты применяются только для идентификации животных, у которых имеются очевидные повреждения суставов и ткани. Таким образом, существует необходимость создания простого диагностического теста для детектирования OA у животных семейства кошачьих, а также создания улучшенных способов отслеживания клинического прогресса животного, страдающего OA.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к идентификации новых биомаркеров для OA у животных семейства кошачьих, и к способам детектирования животных, страдающих артритом, на основе характерной модели экспрессии генов для этих ОА-биомаркеров in vivo. Конкретно, способы по изобретению включают детектирование дифференциальной экспрессии по сравнению с контрольным уровнем экспрессии, по меньшей мере, одного биомаркера в образце из организма, предпочтительно, в образце крови, где детектирование дифференциальной экспрессии указанного биомаркера конкретно идентифицирует животных, которые страдают OA. Таким образом, способ основан на детектировании, по меньшей мере, одного биомаркера, который дифференциально экспрессируется при OA по сравнению с клетками здоровых или контрольных животных.
Биомаркеры по изобретению представляют собой белки и/или нуклеиновые кислоты, которые дифференциально экспрессируется при OA у животных семейства кошачьих. В одном аспекте, биомаркеры, представляющие конкретный интерес, включают биомаркеры, перечисленные в настоящей заявке в таблицах 1-3.
Экспрессия биомаркера может оцениваться по уровню белка или нуклеиновой кислоты с использованием разнообразных методов. Таким образом, в другом аспекте, изобретение относится к способам, в которых применяются антитела для детектирования экспрессии OA-биомаркерных белков в образцах от животных семейства кошачьих. В этом аспекте изобретения используется, по меньшей мере, одно антитело, направленное к конкретному представляющему интерес OA-биомаркеру. В следующем аспекте, уровень экспрессии также может детектироваться с помощью методов на основе нуклеиновых кислот, включающих, например, гибридизацию, методы с использованием микрочипа и РВ-ПЦР, включая количественную реакцию РВ-ПЦР. Масс-спектрометрия, клеточный сортер с активацией флуоресценции (FACS), или метод с применением гранул Luminex Xmap также может использоваться для детектирования уровня экспрессии одновременно на уровне белка и на уровне нуклеиновой кислоты.
В настоящей заявке дополнительно предполагается, что способы по настоящему изобретению могут использоваться в комбинации с традиционными методами диагностики, которые способны детектировать физические и морфологические характеристики дегенеративного поражения суставов. Таким образом, например, характеристика дифференциальной экспрессии генов для ОА-биомаркеров в клетках, полученных из образца крови животного, может комбинироваться с обычными методами диагностики (например, рентгенологическим методом) с целью подтверждения диагноза OA.
В следующем аспекте изобретение относится к композициям, включающим один или более зондов для нуклеиновой кислоты, которые специфически гибридизуются с нуклеиновой кислотой или ее фрагментом, кодирующими OA-биомаркер по настоящему изобретению.
В дополнительном аспекте, изобретение относится к композициям, включающим антитела, которые специфично связываются с полипептидом, кодируемым геном OA-биомаркера по настоящему изобретению.
Изобретение также относится к наборам реагентов для диагностики OA у животного семейства кошачьих, причем наборы реагентов включают компоненты, которые могут использоваться для детектирования экспрессии ОА-биомаркеров по настоящему изобретению, причем компоненты включают, но не ограничены ими, композиции и микрочипы, описанные в настоящей заявке.
Также в настоящей заявке предусмотрено, что настоящее изобретение относится к применению ОА-биомаркеров и композиций, раскрытых в настоящей заявке, в способах для диагностики OA у животного семейства кошачьих.
В другом аспекте, в настоящей заявке также предполагается, что изобретение относится к способам идентификации биоактивных пищевых компонентов или других природных соединений (обозначаемых ниже как "компоненты"), которые могут тестироваться на предмет способности лечить остеоартрит или улучшать состояние при остеоартрите у животного семейства кошачьих, причем способы включают: (а) контактирование клетки, способной экспрессировать РНК или белковый продукт одного или более ОА-биомаркеров, раскрытых в таблицах 1-3, с тестируемым компонентом; (b) определение количества указанных РНК и/или белкового продукта, продуцированными в клетках, контактировавших с тестируемым компонентом; и (с) сравнение количества указанных РНК и/или белкового продукта в клетках, контактировавших с тестируемым компонентом, с количеством тех же указанных РНК или белкового продукта, присутствующих в соответствующей контрольной клетке, которая не контактировала с тестируемым компонентом; где в случае если количество РНК или белкового продукта изменяется относительно количества к контроле, то компонент идентифицируют как компонент, который следует протестировать на предмет способности лечить остеоартрит или улучшать состояние при остеоартрите у животного семейства кошачьих.
Краткое описание фигур
На фиг.1 раскрыто относительное количество TGF-бета у здоровых и у страдающих артритом кошек, получающих различные типы питания. Что касается фиг.1 и 2-4, как указывается, "j/d" и "senior" обозначают типы питания, содержащие различные количества омега-3 жирных кислот, как раскрыто в патентах WO 2007/002837 A2 и WO 2006/074089 А2, соответственно.
На фиг.2 изображено относительное количество ИЛ-1 альфа у здоровых и страдающих артритом кошек с питанием j/d и senior.
На фиг.3 изображен уровень NTx у кошек, получающих питание с высоким содержанием ЕРА и DHA. Уровень детектируют с использованием обычных методов ELISA.
На фиг.4 изображен уровень CTX-II у кошек, получающих питание с высоким содержанием ЕРА и DHA. Уровень детектируют с использованием обычных методов ELISA.
В таблице 1 раскрыты OA-биомаркеры для животного семейства кошачьих, идентифицированные на основе критерия отбора, где величина p<0,001, и уровень экспрессии демонстрирует кратное изменение, составляющее >2. Что касается таблиц 1-3, а также тех, где среднее соотношение составляет>1, то ген подвергается апрегуляции при OA и уровень экспрессии приравнивается к позитивному кратному изменению. Напротив, там, где среднее соотношение составляет <1, ген подвергается даунрегуляции у животных, страдающих OA, и уровень экспрессии приравнивается к негативному кратному изменению.
В таблице 2 раскрыты ОА-биомаркеры животного семейства кошачьих, идентифицированные на основе критерия отбора, где величина p<0,001, и уровень экспрессии демонстрирует кратное изменение, составляющее>1,5.
В таблице 3 раскрыты ОА-биомаркеры животного семейства кошачьих, идентифицированные на основе анализа данных для животного семейства кошачьих с использованием количественного анализа РВ-ПЦР (qRT-PCR).
Подробное описание изобретения
В настоящем изобретении предлагаются композиции и способы для идентификации или диагностики остеоартрита у животных семейства кошачьих. Способы включают детектирование дифференциальной экспрессии конкретных биомаркеров, которые или селективно сверх-экспрессируются или экспрессируются на низком уровне при остеоартрите. Таким образом, биомаркеры по изобретению способны отличать животных, которые страдают OA от тех, которые не страдают этим заболеванием. Также в настоящей заявке предусмотрено, что возможно идентифицировать тех животных, которые могут быть предрасположены к развитию OA, или тех, которые страдают OA, но еще не проявляют морфологических или физических изменений. Указанные способы диагностики остеоартрита включают в себя детектирование дифференциальной экспрессии, по меньшей мере, одного биомаркера, который является показателем остеоартрита в образце ткани или в образце жидкости организма животного семейства кошачьих. В конкретных вариантах осуществления изобретения, для детектирования экспрессии представляющего интерес биомаркера используют антитела и методы иммуногистохимии или зонды для нуклеиновой кислоты и методы гибридизации. Дополнительно предлагаются наборы реагентов для практического осуществления способов по изобретению.
Подразумевается, что термин "диагностика остеоартрита" включает, например, диагностику или детектирование присутствия OA или генетической предрасположенности к этому заболеванию, отслеживание прогрессии заболевания и эффективности терапевтического воздействия, а также идентификацию или детектирование клеток или образцов, которые являются показателями остеоартрита. Термины диагностики, детектирования и идентификации остеоартрита используются в настоящей заявке взаимозаменяемо. Подразумевается, что с помощью термина "остеоартрит" обозначают такие заболевания, которые характеризуются дегенерацией суставного хряща на концах кости, которые образуют поверхность суставов и которые могут включать на поздних стадиях сопровождающиеся изменения в окружающей ткани, например, в кости, мышце, связках, мениске и синовиальной мембране. Такие физические изменения проявляются болью, опухолью, слабостью и потерей суставной функции.
OA классифицировали по различным степеням и стадиям. Стадия 1 характеризуется изменениями в метаболизме хондроцитов, такими что происходит увеличение количества ферментов, разрушающих хрящевой матрикс, таких как металлопротеазы. Протеазные ингибиторы синтезируются на недостаточном уровне для борьбы с разрушением хрящевого матрикса. Стадия 2 характеризуется эрозией хрящевой поверхности, которая вызывает детектируемое увеличение уровня фрагментов протеогликана и коллагена в синовиальной жидкости. В течение стадии 3, синовиальная мембрана является хронически воспаленной в результате действия продуктов разрушения хряща. Макрофаги в синовиальной мембране продуцируют цитокины, которые могут повреждать хрящ путем непосредственного разрушения ткани или путем стимулирования хондроцитов к продуцированию металлопротеиназ. Провоспалительные молекулы также могут вызывать повреждение на этой стадии. Полученное в результате повреждение хряща является сигналом к увеличению костного роста, поскольку организм пытается стабилизировать сустав, таким образом изменяя нормальные механические и конструкционные черты сустава.
Как обсуждается выше, предполагается, что способы по настоящему изобретению могут позволить идентификацию животных семейства кошачьих, которые могут быть предрасположены к развитию OA в будущем. Предполагается, что способы по настоящему изобретению могут конкретно применяться для этих животных, так как обычные методы, которые основаны на морфологических изменениях суставной ткани, обычно не могут идентифицировать. В этой связи конкретно могут применяться маркеры гаплотипа и однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) ОА-биомаркеров, раскрытые в настоящей заявке. В таких случаях, профилактические меры или другие терапии могут быть начаты в качестве средства предотвращения более ослабляющих организм симптомов или физического повреждения, ассоциированных с поздними стадиями OA.
Кроме того, в настоящей заявке предусмотрено, что в то время как ОА-биомаркеры, раскрытые в настоящей заявке, могут применяться для диагностики животного семейства кошачьих, страдающего OA, ОА-биомаркеры также могут применяться в качестве мишеней для терапевтического воздействия. Например, в настоящей заявке предусмотрено, что терапевтическое благоприятное воздействие может быть достигнуто перед проявлением патологических физических изменений у животного семейства кошачьих (или даже после появления физических изменений), путем изменения экспрессии любого одного или более биомаркеров, описанных в таблицах 1-3, представленных в настоящей заявке, например, путем уменьшения уровня экспрессии генов со сверхэкспрессией при OA и/или путем увеличения уровня экспрессии генов, которые имеют низкий уровень экспрессии при OA. В случаях некоторых биомаркеров, описанных подробно в разделе Примеров ниже, этого можно достичь путем введения нуждающемуся в этом животному семейства кошачьих лекарственной формы с высоким содержанием ЕРА и DHA.
Еще в настоящей заявке предусмотрено, что компоненты, которые могут применяться для лечения OA у животных семейства кошачьих или для улучшения состояния при OA, могут быть идентифицированы путем экспонирования клеток с тестируемыми компонентами in vitro и путем оценки изменений экспрессии генов одного или более ОА-биомаркеров. Такие in vitro-анализы хорошо известны специалисту в данной области и могут проводиться согласно обычным методам. Могут использоваться первичные культуры клеток животного семейства кошачьих, а также клеточные линии, выделенные из различных тканей животного семейства кошачьих, таких как, например, кровь, почка, мозг, язык или легкое. Клетки животного семейства кошачьих для in vitro-анализа могут быть получены коммерчески, например, из /Американской Коллекции Типовых Культур (АТСС, Manassas, VA). Компоненты-кандидаты, которые демонстрируют потенциал для влияния на экспрессию ОА-биомаркеров, могут затем быть отмечены для проведения дополнительных экспериментов, включающих их применении в качестве компонентов в составах пищи домашнего животного, таких как описанные ниже в разделе Примеров.
Не подразумевая ограничения конкретным механизмом, в настоящей заявке предусмотрено, что генотипический фингерпринт осеоартрита у животных семейства кошачьих может характеризоваться с помощью дифференциальной экспрессии дискретных генов или биомаркеров. Использование этих молекулярных биомаркеров OA в форматах анализа молекулярной диагностики может улучшить детектирование OA по сравнению с методами, использующимися в настоящее время. Таким образом, в конкретных вариантах осуществления изобретения, способ диагностики остеоартрита включает детектирование дифференциальной экспрессии биомаркера, где дифференциальная экспрессия биомаркера может представлять собой показатель нарушения биохимического пути, связанного или ассоциированного с OA, например, в виде причины или в виде эффекта. В других вариантах осуществления изобретения, способы включают детектирования дифференциальной экспрессии одного или более ОА-биомаркеров, например, ряда биомаркеров, представленных в настоящей заявке в таблицах 1-3. Таким образом, способы по настоящему изобретению не только позволяют идентификацию животного, страдающего остеоартритом, но также могут позволить идентификацию животного, которое может быть генетически предрасположено к развитию OA.
Способы, раскрытые в настоящей заявке, обеспечивают лучшее детектирование остеоартрита по сравнению с обычным диагностическим тестированием. "Обычные методы диагностики OA" хорошо известны специалисту в данной области и включают использование рентгеновского излучения, магнитно-резонансную томографию или использование ультразвука. В конкретных аспектах изобретения, точность настоящих способов является равной точности обычного рентгенологического или магнитно-резонансного тестирования или превосходит их при детектировании присутствия OA.
Биомаркеры по настоящему изобретению включают гены и белки и их варианты и фрагменты. Такие биомаркеры включают полинуклеотиды, например, ДНК, включающие полноразмерную или неполную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей биомаркер, или комплементарную цепь такой последовательности. Полинуклеотиды биомаркера также могут включать РНК, включающую полноразмерную ли неполную последовательность любой из представляющих интерес последовательностей нуклеиновой кислоты. Белок биомаркера представляет собой белок, кодируемый или соответствующий ДНК биомаркера по изобретению. Белок биомаркера включает полноразмерную или неполную аминокислотную последовательность любого из биомаркерных белков или полипептидов, раскрытых в настоящей заявке.
"Биомаркер" представляет собой любой ген или белок, чей уровень экспрессии в ткани или клетке изменяется по сравнению с уровнем в нормальной или здоровой клетке или ткани. Биомаркеры по настоящему изобретению дифференциально экспрессируются у животных семейства кошачьих, страдающих остеоартритом. Термин "дифференциально экспрессируются при остеоартрите" обозначает, что уровень экспрессии генов биомаркеров, представляющих интерес, или подвергается апрегуляции или даунрегуляции у субъекта, страдающего остеоартритом или предрасположенного к остеоартриту, по сравнению с уровнем соответствующих генов у контрольных субъектов, т.е. субъектов, не страдающих эти заболеванием и не предрасположенных к нему. В настоящей заявке предусмотрено, что детектирование биомаркеров по изобретению не только позволяет идентифицировать субъекта, страдающего OA, но также предоставляет средства для идентификации животного, предрасположенного к развитию этого аболевания, в идеале до проявления физических симптомов. По возможности, такое раннее детектирование позволит осуществлять улучшенный контроль за пациентом и сможет, возможно, предотвратить ассоциированное с заболеванием необратимое повреждение суставов.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, способы диагностики остеоартрита, раскрытые в настоящей заявке, могут осуществляться в качестве первичных средств скрининга остеоартрита у животного семейства кошачьих. Скрининг указанного животного семейства кошачьих может проводиться как часть обычного медосмотра. Скрининг животного семейства кошачьих может также проводиться согласно способам по настоящему изобретению, если информация на основе истории болезни его матери и/или отца указывает на то, что животное семейства кошачьих может быть генетически предрасположено к OA, или если на основе наблюдаемых изменений в характере поведения животного предполагается, что животное семейства кошачьих страдает заболеванием. Способы по настоящему изобретению также могут применяться как часть клинического исследования совместно с обычными методами диагностики OA у животного семейства кошачьих, например, вместе с рентгенологическим методом или МРТ, когда указанные обычные методы неубедительны или когда требуется подтверждение диагноза, поставленного на основе использования обычных методов.
Биомаркеры по изобретению включают полинуклеотид или белок, которые селективно дифференциально экспрессируются при остеоартрите, как определено выше в настоящей заявке. Хотя любой биомаркерный показатель остеоартрита может использоваться по настоящему изобретению, в определенных вариантах осуществления изобретения биомаркеры включают любой один или более биомаркеров или ряд биомаркеров, представленных в настоящей заявке в таблицах 1-3.
Хотя способы по изобретению требуют детектирования, по меньшей мере, одного биомаркера в образце пациента для детектирования остеоартрита, в настоящей заявке предусмотрено, что при практическом использовании настоящего изобретения могут применяться несколько или более биомаркеров. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения, применяются один или более биомаркеров, более предпочтительно, два или более комплементарных биомаркеров. С помощью термина "комплементарный" обозначают, что детектирование комбинации биомаркеров в образце организма приводит в результате к успешной идентификации остеоартрита в большем процентном содержании случаев, чем при идентификации с помощью использования только одного из биомаркеров. Таким образом, в некоторых случаях может производиться более точное определение остеоартрита при использовании, по меньшей мере, двух биомаркеров. Соответственно, при практическом применении диагностических способов, раскрытых в настоящей заявке, в случае, где используются, по меньшей мере, два биомаркера, могут использоваться, по меньшей мере, два антитела, направленных к различным биомаркерным белкам. Например, антитела или зонды для нуклеиновых кислот могут контактировать с образцом организма одновременно или последовательно.
В конкретных вариантах осуществления изобретения, способы диагностики по изобретению включают забор образца крови от пациента-животного семейства кошачьих, контактирование образца, по меньшей мере, с одним антителом, специфичным для представляющего интерес биомаркера и детектирование связывания антитела. Образцы, которые демонстрируют дифференциальную экспрессию биомаркера по изобретению, как определено с помощью детектирования связывания антитела, считаются позитивными для остеоартрита. В конкретных вариантах осуществления изобретения, образец из организма представляет собой образец крови, полученный от животного семейства кошачьих с помощью обычных методов, таких как методы разделения в градиенте плотности, например, метод с использованием Фикола-гипака, или метод с использованием пробирок для клеточных препаратов (пробирки СРТ™ tubes) от фирмы Becton Dickinson, или другие методы, хорошо известные специалисту в данной области.
Под термином "образец из организма" подразумевают любой забор образцов клеток, тканей или жидкостей организма, в которых может детектироваться экспрессия биомаркера. Примеры таких образцов из организма включают, но не ограничены ими, кровь, лимфу, мочу, биопсии и мазки. Образцы из организма могут быть получены от животного семейства кошачьих с помощью разнообразных методов, включающих, например, соскоб или смыв с участка, или использование иглы для аспирирования жидкостей организма. Методы забора разнообразных образцов из организма хорошо известны из области техники. В конкретных вариантах осуществления изобретения, образец из организма включает клетки крови.
Любые методы, доступные из области техники для идентификации или детектирования ОА-биомаркеров по настоящему изобретению, охвачены настоящей заявкой. Дифференциальная экспрессия биомаркера по изобретению может детектироваться на уровне нуклеиновой кислоты или на уровне белка. Как описано выше, с целью определения дифференциальной экспрессии, исследуемый образец из организма может быть сравнен с соответствующим образцом из организма, который взят от здорового субъекта. Поэтому, "нормальный" уровень экспрессии представляет собой уровень экспрессии биомаркера в клетках субъекта-животного семейства кошачьих, не пораженного остеоартритом или не предрасположенного к остеоартриту. В некоторых случаях, где для животного, страдающего артритом, известно соотношение экспрессии биомаркера к контролю, то дифференциальная экспрессия указанного биомаркера у животного может быть охарактеризована без непосредственного сравнения с нормальным уровнем.
Методы детектирования биомаркеров по изобретению включают любые методы, которые определяют количество или присутствие биомаркеров или на уровне нуклеиновой кислоты или на уровне белка. Такие методы хорошо известны из области техники и включают, но не ограничены ими, Вестерн блот-анализы, Нозерн блот-анализы, блот-анализы по Саузерну, ELISA,
иммунопреципитацию, иммунофлуоресценцию, проточную цитометрию, иммуноцитохимию, методы гибридизации нуклеиновой кислоты, методы обратной транскрипции нуклеиновой кислоты и методы амплификации нуклеиновой кислоты. В конкретных вариантах осуществления изобретения, дифференциальную экспрессию биомаркера детектируют на уровне белка с использованием, например, антител, которые направлены против специфичных биомакерных белков. Эти антитела могут использоваться в разнообразных методах, таких как Вестерн блот-анализ, ELISA, методы иммунопреципитации или иммуноцитохимии. Кроме того, могут быть получены данные обычной диагностической визуализации с использованием рентгеновского излучения или магнитного резонанса, и сравнены с иммуноцитохимической информацией или с информацией гибридизации зонда для нуклеиновой кислоты. Таким образом, детектирование биомаркеров может подтверждать результаты, полученные с помощью обычных диагностических методов, или вносить ясность, когда обычные методы неубедительны.
В одном варианте осуществления изобретения, антитела, специфичные для биомаркерных белков, применяются для детектирования дифференциальной экспрессии биомаркерного белка в образце из организма. Способ включает получение образца из организма субъекта, контактирование образца из организма, по меньшей мере, с одним антителом, направленным против биомаркера, который селективно дифференциально экспрессируется при остеоартрите, и детектирование связывания антитела для определения того, экспрессируется ли биомаркер в образце подобным дифференциальным образом. В предпочтительном аспекте настоящего изобретения предлагается иммуноцитохимический способ диагностики остеоартрита с использованием образца крови, взятого от субъекта.
В предпочтительном иммуноцитохимическом способе, производят забор образца крови у субъекта с использованием методов, хорошо известных специалисту в данной области. Например, как описано в примерах, представленных в настоящей заявке, в случае, где требуется выделение нуклеиновой кислоты, также могут применяться пробирки PAXgene blood RNA tubes (для использования в выделении РНК из клеток крови с помощью набора реагентов PAX gene). Образец крови может быть проанализирован немедленно или, для проведения анализа позже, может храниться при подходящих условиях, хорошо известных специалисту в данной области.
Альтернативно, антитело, конкретно, моноклональное антитело, направленное против представляющего интерес биомаркера, может инкубироваться с образцом крови, взятым от субъекта. Как отмечено выше, специалисту в данной области понятно, что более точный диагноз остеоартрита в некоторых случаях может быть получен путем детектирования более чем одного биомаркера в образце, взятом от пациента. Таким образом, в конкретных вариантах осуществления изобретения для детектирования остеоартрита применяются, по меньшей мере, два антитела, направленные против двух различных биомаркеров. В случае, где используется более чем одно антитело, эти антитела могут добавляться к одному образцу последовательно в виде индивидуальных реагентов-антител или одновременно в виде коктейля антител. Альтернативно, каждое индивидуальное антитело может добавляться к отдельным образцам, взятым от одного и того же пациента, и полученные данные затем объединяют.В конкретных вариантах осуществления изобретения, коктейль антител может включать несколько антител, где указанные антитела связываются, например, с рядом ОА-биомаркеров, раскрытых в таблицах 1-3.
Термины "антитело" и "антитела" в широком смысле охватывают природные формы антител и рекомбинантные антитела, такие как одноцепочечные антитела, химерные и гуманизированные антитела и мультиспецифичные антитела, а также фрагменты и производные всех вышеперечисленных, имеющие, по меньшей мере, один сайт связывания с антигеном. Полностью собранные антитела и фрагменты антител, которые могут связываться с антигеном, включены в это определение. Производные антител могут включать белок или химический компонент, конъюгированные с антителом.
"Фрагменты антитела" включают участок интактного антитела, предпочтительно, антиген-связывающий или вариабельный участок интактного антитела. Примеры фрагментов антитела включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv; диабоди (diabodies); линейные антитела (Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8(10): 1057-1062); молекулы одноцепочечных антител; и мультиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител. С помощью гидролиза антител папаином получают два идентичных антиген-связывающих фрагмента, называемых фрагментами "Fab", каждый с одним антиген-связывающим сайтом, и остаточный фрагмент "Fc". С помощью обработки пепсином получают фрагмент F(ab')2, который содержит два антигенсвязывающих центра антитела, и, тем не менее, способен к перекрестному связыванию антигена. В настоящей заявке описаны способы получения антител, способных специфично распознавать один или более дифференциально экспрессирующихся генов эпитопов. Такие антитела могут включать, но не ограничены ими, поликлональные антитела, моноклональные антитела (mAb), гуманизированные или химерные антитела, одноцепочечные антитела, Fab-фрагменты, F(ab')2-фрагменты, фрагменты, получаемые с помощью Fab-экспрессирующей библиотеки, анти-идиотипические антитела (анти-Id), и эпитоп-связывающие фрагменты любых перечисленных выше антител.
Для получения антител к дифференциально экспрессирующемуся гену, разнообразные животные-хозяева могут иммунизироваться с помощью инъекции белка или его части, кодируемых дифференциально экспрессирующимся геном. Такие животные-хозяева могут включать, но не ограничены ими, кроликов, мышей, крыс и цыплят, но редко. Для увеличения иммунологической реакции могут использоваться разнообразные адъюванты в зависимости от вида животного-хозяина, адъюванты включают, но не ограничены ими, реагент Фрейнда (полный и неполный), минеральные гели, такие как гидроксид алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, плюроновые полиолы, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианин лимфы улитки, динитрофенол и адъюванты, потенциально используемые для человека, такие как БЦЖ (бацилла Кальмета-Герена) и Corynebacterium parvum.
Поликлональные антитела представляют собой гетерогенные популяции молекул антител, выделенных из сыворотки животных, иммунизированных с помощью антигена, такого как целевой генный продукт или его производное с антигенной функцией. Для получения поликлональных антител могут быть иммунизированы животные-хозяева с помощью инъекции дифференциально экспрессирующегося генного продукта, с добавлением адъювантов, что также описано выше.
Моноклональные антитела, которые представляют собой гомогенные популяции антител к конкретному антигену, могут быть получены с помощью любого метода, который предусмотрен для получения молекул антител в культуре клеток с помощью стабильных клеточных линий. Эти методы включают, но не ограничены ими, гибридомный метод Келера и Мильштейна (Kohler и Milstein), (1975, Nature 256:495-497; и Пат. US No. 4376110), метод с использованием гибридомы В-клеток человека (Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4:72; Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030), и метод с использованием EBV-гибридомы (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96). Такие антитела могут представлять собой иммуноглобулины любого класса, включающие IgG, IgM, IgE, IgA, IgD и любой их подкласс. Гибридома, продуцирующая mAb по настоящему изобретению, может культивироваться in vitro или in vivo.
Кроме того, могут использоваться методы, разработанные для получения "химерных антител" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature, 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature, 314:452-454) с помощью сплайсинга генов из молекулы мышиного антитела подходящей антигенной специфичности вместе с генами из молекул человеческого антитела подходящей биологической активности. Химерное антитело представляет собой молекулу, в которой различные участки выделены из различных видов животных, такую молекулу, которая содержит вариабельный или гипервариабельный участок, выделенный из мышиного mAb, и константный участок человеческого иммуноглобулина.
Альтернативно, методы, описанные для получения одноцепочечных антител (US Пат.No. 4946778; Bird, 1988, Science 242:423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; и Ward et al., 1989, Nature 334:544-546), могут быть адаптированы для получения одноцепочечных антител к продуктам дифференциально экспрессирующихся генов.
Одноцепочечные антитела образуются с помощью соединения фрагментов тяжелой и легкой цепи Fv-участка посредством аминокислотного мостика с получением в результате одноцепочечного полипептида.
Наиболее предпочтительно, методы, применяемые для получения "гуманизированных антител", могут быть адаптированы для получения антител к полипептидам, фрагментам, производным и раскрытым в настоящей заявке функциональным эквивалентам. Такие методы хорошо известны специалистам в данной области и раскрыты, например, в патентах США №5932448; 5693762; 5693761; 5585089; 5530101; 5910771; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5545580; 5661016; и 5770429, содержание которых раскрыто в настоящей заявке с помощью ссылки.
Фрагменты антитела, которые распознают специфичные эпитопы, могут быть получены с помощью известных методов. Например, такие фрагменты включают, но не ограничены ими: F(ab')2-фрагменты, которые могут быть получены с помощью гидролиза молекулы антитела пепсином, и Fab-фрагменты, которые могут быть получены с помощью восстановления дисульфидных мостиков F(ab')2-фрагментов. Альтернативно, могут быть сконструированы Fab-экспрессирующие библиотеки (Huse et al., 1989, Science, 246:1275-1281), чтобы позволить быструю и легкую идентификацию моноклональных Fab-фрагментов целевой специфичности. Для легкого детектирования особенно предпочтительным является Сэндвич-анализ, у которого существует ряд вариаций, которые могут применяться в способах по настоящему изобретению. В частности, могут использоваться методы Elisa, включающие стандартную методику, сэндвич и методику микроформатного анализа Elisa, которые хорошо известны специалисту в данной области.
В некоторых случаях, немеченое антитело иммобилизуется на твердом субстрате, и тестируемый образец приводят в контакт со связанной молекулой. После завершения подходящего периода инкубации в течение периода времени, достаточного для того, чтобы позволить образование двойного комплекса антигена антитела, затем добавляют вторичное антитело, меченое с помощью репортерной молекулы, способной индуцировать детектируемый сигнал, и инкубируют в течение промежутка времени, достаточного для образования тройного комплекса антитело-антиген-меченое антитело. Любое не вступившее в реакцию вещество отмывают, и антиген определяют с помощью наблюдения сигнала, или он может определяться количественно путем сравнения с контрольным образцом, содержащим известные количества антигена. Вариации включают одновременный анализ, в котором оба - образец и антитело добавляют к связанному антителу одновременно, или анализ, в котором меченое антитело и тестируемый образец сначала объединяют, инкубируют и добавляют к антителу, связанному с немеченой поверхностью. Эти методы хорошо известны специалисту в данной области техники, и возможность минорных вариаций будет абсолютно очевидна.
Наиболее широко распространенные репортерные молекулы в этом типе анализа представляют собой или ферменты, молекулы, содержащие флуорофоры, или молекулы, содержащие радионуклиды. В случае иммуноферментного анализа, фермент конъюгируют со вторичным антителом, обычно посредством глутаральдегида или периодата. Однако абсолютно понятно, что существуют разнообразные методы лигирования, которые хорошо известные специалисту в данной области. Широко используемые ферменты среди прочих включают пероксидазу хрена, глюкозоксидазу, бета-галактозидазу и щелочную фосфатазу. Субстраты, используемые с определенными ферментами, как правило, выбирают так, чтобы после гидролиза с помощью соответствующего фермента, получить детектируемое изменение цвета. Например, п-нитрофенил фосфат подходит для использования с конъюгатами щелочной фосфатазы; для пероксидазных конъюгатов широко используются 1,2-фенилендиамин или толуидин. Также возможно применение флуорогенных субстратов, с помощью которых легче получают флуоресцентный продукт, чем с помощью хромогенных субстратов, отмеченных выше.
Спектрофотометрические методы также могут использоваться для оценки присутствия антигена в образце сыворотки.
Попеременно флуоресцентные соединения, такие как флуоресцеин и родамин, могут химически конденсироваться с антителами без изменения их связывающей способности. При активации с помощью облучения светом конкретной длины волны, меченое флуорохромом антитело поглощает световую энергию, индуцирующую состояние возбуждения в молекуле с последующей эмиссией света характерной длины волны. Эмиссия проявляется в виде характерного цвета, детектируемого визуально с помощью светового микроскопа. Методы иммунофлуоресценции и ИФА (EIA), оба очень хорошо установлены в области техники и представляются конкретно предпочтительными для способа по настоящему изобретению. Однако также могут применяться другие репортерные молекулы, такие как радиоизотопы, хемилюминесцентные молекулы или биолюминесцентные молекулы. Специалисту в данной области абсолютно очевидно как варьировать процедуру соответственно требуемому применению.
Что касается детектирования окрашивания антитела в иммуноцитохимических способах по изобретению, то в области техники также существуют видео-микроскопия и компьютерные методы для количественного определения количества множества видов молекул (например, биомаркерных белков) в биологическом образце, где каждый вид присутствующих молекул выявляют с помощью характерного окрашивающий маркера, обладающего определенным цветом. Такие методы также известны в области техники как методы калориметрического анализа. В этих методах видео-микроскопию используют для обеспечения изображения биологического образца после его окрашивания для визуального выявления присутствия конкретного представляющего интерес биомаркера. Некоторые из этих методов, такие как раскрытые в патенте US 7065236, введенные в настоящую заявку с помощью ссылки, раскрывают использование системы изображения и ассоциированного с ней компьютерного обеспечения для определения относительных количеств каждого присутствующего вида молекул на основе присутствия характерного цветового окрашивающего маркера, которые выявляют с помощью оптической плотности этих цветовых окрашивающих маркеров или с помощью величины коэффициента пропускания, определяемых с помощью системы изображения и ассоциированного с ней компьютерного обеспечения. Эти методы обеспечивают количественные определения относительных количеств каждого вида молекул в окрашенном биологическом образце с использованием одного видеоизображения, которое "анализируется" в его цветовые компоненты.
Для практического применения изобретения выбирают антитела, имеющие высокую специфичность к представляющим интерес биомаркерным белкам. В то время как методы получения антител и выбора подходящих антител известны в области техники и описаны выше, в настоящей заявке также предполагается, что в некоторых вариантах осуществления изобретения, при практическом применении изобретения могут использоваться коммерческие антитела, направленные к определенным биомаркерным белкам.
Специалисту в данной области будет понятно, что концентрация конкретного антитела, используемого при практическом применении способов по изобретению, может варьироваться в зависимости от таких факторов, как время связывания, уровень специфичности антитела к биомаркерному белку, и метод получения образца из организма. Кроме того, при использовании множества антител, на требуемую концентрацию может влиять порядок, в котором антитела применяются к образцу, т.е., одновременно в виде коктейля, или последовательно в виде индивидуальных реагентов-антител. Более того, химия детектирования, используемая для визуализации связывания антитела с представляющим интерес биомаркером, также может быть оптимизирована с получением целевого соотношения сигнала к фону.
В других вариантах осуществления изобретения, экспрессию представляющего интерес биомаркера детектируют на уровне нуклеиновой кислоты. Методы оценки экспрессии на основе нуклеиновых кислот хорошо известны из уровня техники и включают, например, определение уровня биомаркерной мРНК в образце из организма. Во многих методах детектирования экспрессии используется выделенная РНК. При использовании в настоящей заявке, термин "РНК" включает тотальную РНК, а также мРНК. Любой метод выделения РНК, который не идет вразрез с выделением мРНК, может применяться для очистки РНК из клеток крови (смотрите, например, Ausubel et al., ed., (1987-1999) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York). Дополнительно, большие количества образцов ткани могут легко процессироваться с использованием методов, хорошо известных специалистам в данной области, таких как, описанные в US Пат. No. 4843155.
Термин "зонд" обозначает любую молекулу, которая способна к селективному связыванию с предназначенной для этого определенной молекулой-мишенью, например, с нуклеотидным транскриптом или белком, кодируемым геном ОА-биомаркера или соответствующим 0А-биомаркеру. Зонды могут быть синтезированы специалистом в данной области или могут быть выделены из подходящих биологических препаратов. Зонды для мечения могут быть сконструированы определенным образом. Примеры молекул, которые могут применяться в качестве зондов, включают, но не ограничены ими, РНК, ДНК, белки, антитела и органические молекулы.
Выделенная мРНК может быть использована в анализах гибридизации или амплификации, которые включают, но не ограничены ими, анализ по Саузерну и Нозерн-анализ, полимеразные цепные реакции и микрочипы с использованием зондов. Один метод детектирования мРНК включает в себя контактирование выделенной мРНК с молекулой нуклеиновой кислоты (зондом), которая может гибридизоваться с мРНК, кодируемой детектируемым геном. Зонд в виде нуклеиновой кислоты может представлять собой, например, полноразмерную кДНК или ее участок, такой как олигонуклеотид, содержащий, по меньшей мере, 7, 15, 30, 50, 100, 250 или 500 нуклеотидов, и достаточный для гибридизации в жестких условиях с мРНК или геномной ДНК, кодирующими биомаркер по настоящему изобретению. Гибридизация мРНК с зондом выявляет экспрессию рассматриваемого биомаркера.
В одном варианте осуществления изобретения, мРНк иммобилизована на твердой подложке и контактирует с зондом, например, после проведения электрофореза выделенной мРНК в агарозном геле и переноса мРНК из геля на мембрану, такую как нитроцеллюлозная мембрана. Специалист в данной области может легко адаптировать известные методы детектирования мРНК для применения в детектировании уровня мРНК, кодируемой биомаркерами по настоящему изобретению.
В альтернативном варианте осуществления изобретения, зонд(ы) для OA-биомаркера иммобилизованы на твердой подложке, и мРНк контатирует с зондом(ами). В настоящей заявке предусмотрено, что в способах по настоящему изобретению среди возможных аналитических платформ могут применяться генные чипы (например, олигонуклеотидные биочипы высокой плотности), микрочипы (например, кДНК-биочипы или олигонуклеотидные биочипы на стеклянных пластинках), макрочипы, (например, PVDF-мембраны, на которых гены нанесены с помощью печати) и биочипы на основе гранул (например, микрочипы на основе гранул Illumina). Таким образом, в одном варианте осуществления изобретения, микрочипы используются для детектирования экспрессии биомаркера, и такие способы применимы для детектирования уровня экспрессии ряда различных генов. Методы с использованием микрочипов, например, такие, как коммерчески доступные от компании Affymetrix, хорошо известны специалисту в данной области. В настоящей заявке предусмотрено, что микрочипы или "чипы", сконструированные для детектирования экспрессии ОА-биомаркеров, раскрытых в настоящей заявке, могут быть созданы для применения в способах по настоящему изобретению. При использовании в настоящей заявке, подразумевается, что термин "микрочип" включает все методы на платформе биочипов, которые могут включать, например, генные чипы или биочипы на основе гранул, и могут включать пептиды или нуклеиновые кислоты, например, РНК, ДНК, кДНК, ПЦР-продукты или EST-фрагменты на гранулах, гелях, полимерных поверхностях, волокнах, таких как волоконная оптика, стекло или любой другой подходящий субстрат.
Альтернативный метод определения уровня биомаркерной мРНК в образце включает в себя процесс амплификации нуклеиновой кислоты или олигонуклеотида, например, с помощью РВ-ПЦР, включающей количественную реакцию или кРВ-ПЦР (qRT-PCR), лигазную цепную реакцию (Вагапу (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193), самоподдерживающуюся репликацию последовательностей (Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), систему транскрипционной амплификации (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177), использование Q-Бета Репликазы (Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6: 1-197), репликацию no типу "катящегося кольца" или любой другой метод амплификации нуклеиновой кислоты с последующим детектированием амплифицированных молекул с использованием методов, хорошо известных специалисту в данной области. Эти схемы детектирования конкретно применимы для детектирования молекул нуклеиновой кислоты, если молекулы присутствуют в очень низких количествах. В конкретных аспектах изобретения, экспрессию биомаркера оценивают с помощью количественной реакции РВ-ПЦР.
Уровень экспрессии РНК биомаркера может отслеживаться с использованием стандартных методов, например, с помощью мембраны-блота (такой, какая используется при гибридизационном анализе, таком как Нозерн-анализ, анализ по Саузерну, дот-анализ и тому подобное), или с помощью микролунок, микропробирок, гелей, гранул или волокон (или любой твердой подложки, содержащей связанные нуклеиновые кислоты). Детектирование экспрессии биомаркера также может включать использование в растворе зондов в виде нуклеиновых кислот.
В настоящей заявке также предусмотрены наборы реагентов для практического применения способов по изобретению. С помощью термина "набор реагентов" обозначается любой продукт (например, упаковка или контейнер), содержащий компоненты, необходимые для детектирования экспрессии ОА-биомаркера у животного семейства кошачьих. Указанные наборы реагентов содержат, например, по меньшей мере, один реагент, например, антитело, зонд в виде нуклеиновой кислоты и т.д., для специфичного детектирования экспрессии биомаркера по настоящему изобретению. В настоящей заявке предусмотрено, что наборы реагентов по настоящему изобретению могут фокусироваться на диагностическом применении одного типа компонентов (например, таких реагентов, как антитела или зонды в виде нуклеиновой кислоты), или могут содержать различные типы компонентов, и относительные количества каждого из них могут варьироваться таким образом, что большая часть компонентов может быть одного или другого типа, или реагенты могут быть представлены в равных количествах. Набор реагентов по настоящему изобретению также может содержать микрочип, содержащий одну или более нуклеиновых кислот, специфичных для ОА-биомаркеров по настоящему изобретению или для групп указанных биомаркеров. Набор реагентов может продвигаться, распределяться и продаваться в качестве средства для осуществления способов по настоящему изобретению. Дополнительно, наборы реагентов могут содержать листовку-вкладыш в упаковке, описывающую набор реагентов и способы его применения.
В конкретном варианте осуществления изобретения предлагаются наборы реагентов для практического применения иммуногистохимических способов по изобретению. Такие наборы реагентов совместимы одновременно с автоматизированными и с ручными иммуногистохимическими методами (например, такими как окрашивание клеток). Эти наборы реагентов содержат, по меньшей мере, одно антитело, направленное к представляющему интерес биомаркеру, химические вещества для детектирования связывания антитела с биомаркером, и контрастный краситель. Любые химические вещества, которые детектируют связывание антиген-антитело, могут использоваться при практическом применении изобретении. В некоторых вариантах осуществления изобретения, детектирующие химические вещества содержат меченый полимер, конъюгированный со вторичным антителом. Например, может предлагаться вторичное антитело, которое конъюгировано с ферментом, который катализирует проявление хромогена в сайте связывания антиген-антитело. В области техники также известны такие ферменты и методы их использования в детектировании связывания антитела.
В другом варианте осуществления изобретения, наборы реагентов по изобретению дополнительно содержат, по меньшей мере, два или более реагентов, например, антител, для специфичного детектирования экспрессии различных биомаркеров в количестве, по меньшей мере, двух или более. Каждое антитело может быть представлено в наборе реагентов в виде индивидуального реагента или, альтернативно, в виде коктейля антител, направленных к различным представляющим интерес биомаркерам. Более того, любой реагент или все реагенты из набора реагентов может быть представлен внутри контейнеров, таких как герметичные контейнеры, которые защищают реагенты от внешней среды.
Позитивные и/или негативные контроли могут быть включены в наборы реагентов для подтверждения активности и корректного использования реагентов, применяемых согласно изобретению. Контроли могут включать образцы, такие как срезы ткани, клетки, фиксированные на стеклянных пластинках и т.д., о которых известно, что являются или позитивными или негативными контролями присутствия представляющего интерес биомаркера. Конструкция и применение контролей являются стандартными и обычными для профессиональной квалификации специалистов в данной области.
В других вариантах осуществления изобретения, предлагаются наборы реагентов для идентификации OA у животного семейства кошачьих, включающие детектирование дифференциальной экспрессии биомаркера на уровне нуклеиновой кислоты. Такие наборы реагентов содержат, например, по меньшей мере, один зонд в виде нуклеиновой кислоты, который специфично связывается с нуклеиновой кислотой биомаркера или ее фрагментом. В конкретных вариантах осуществления изобретения, наборы реагентов содержат, по меньшей мере, два или более зондов в виде нуклеиновых кислот, которые гибридизуются с отличными нуклеиновыми кислотами биомаркеров, и могут дополнительно содержать микрочип, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую ОА-биомаркеры.
Предусмотрено, что изобретение, описанное в настоящей заявке, не ограничивается конкретными методологией, протоколами, и описанными реагентами, поскольку они могут варьироваться. Также следует понимать, что терминология, используемая в настоящей заявке, предназначена только для целей описания конкретных вариантов осуществления изобретения, и не предназначена для какого-либо ограничения настоящего изобретения.
До тех пор, пока не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящей заявке, имеют те же значения, какие понятны специалисту в данной области, к которой принадлежит настоящее изобретение. Хотя на практике или при тестировании настоящего изобретения могут использоваться любые методы и материалы, подобные или эквивалентные тем, что описаны в настоящей заявке, в данной работе описаны предпочтительные методы, средства и материалы. Все публикации, упомянутые в настоящей заявке, введены с помощью ссылки в целях описания и раскрытия материалов и методологий, о которых сообщается в публикации и которые могут использоваться в связи с изобретением.
При практическом применении настоящего изобретения, могут быть использованы многие стандартные методы молекулярной биологии. Эти методы хорошо известны и объяснены, например, в книгах Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I, II и III, 1997 (F.M. Ausubel ed.); Sambrook et al, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.
При использовании в настоящей заявке и в прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа "a", "an", и "the" включают ссылку на множественное число до тех пор, пока по контексту четко не определено иначе. Таким образом, например, ссылка на "антитело" является ссылкой на одно или более антител и эквивалентов, известных специалистам в данной области, и так далее.
Следующие примеры предложены в качестве иллюстрации, а не в качестве ограничения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Экспрессия генов у кошек, страдающих остеоартритом по сравнению с контрольными кошками
Исследования проводят с использованием кошек, не страдающих артритом, и кошек, страдающих остеоартритом (OA), для определения лежащих в основе этого различий экспрессии генов у кошек, не страдающих артритом, и кошек, страдающих OA. В одном исследовании, исходное сравнение осуществляют между двумя группами для определения лежащих в основе этого различий экспрессии генов у кошек, не страдающих артритом, и кошек, страдающих OA. Во втором исследовании используют другую группу кошек, не страдающих артритом, и кошек, страдающих OA, однако дополнительно к исходному сравнению всех нормальных животных и всех животных, страдающих OA, в течение всего времени тестируют питание на предмет способности тормозить прогрессию заболевания. Также осуществляют исследования с проведением количественной реакции ПЦР в режиме реального времени с использованием образцов, полученных во втором исследовании.
Что касается исследований, представленных в настоящей заявке, кошек, страдающих OA, разделяют на группы согласно ранее опубликованному методу, т.е., всем кошкам, не страдающим артритом, присваивается "балл 0", указывая на то, что сустав, по-видимому, является нормальным, кошкам, страдающим OA, присваиваются баллы или 1 (присутствуют небольшие энтесопатии или небольшие остеофиты) или 2 (более выделяющиеся энтесопатии или остеофиты). Кошки с тяжелым проявлением OA (балл 3) не включены в данное исследование.
В исследованиях, представленных в настоящей заявке, от кошек получают цельную кровь с использованием пробирок PAXgene™ RNA tube, и выделяют тотальную РНК из образцов цельной крови с использованием набора реагентов PAXgene™ Blood RNA Kit согласно методам, подробно описанным ниже.
Выделение РНК из крови с помощью PAXgene™ Blood RNA Kit: пробирки для забора крови PAXgene™ Blood RNA tube и набор реагентов PAXgene™ Blood RNA Kit (Qiagen) используют вместе для выделения и очистки внутриклеточной РНК из цельной крови, полученной от животных семейства кошачьих, как представлено ниже (смотрите также руководство для PAXgene™ Blood RNA Kit, PreAnalytix, июнь 2005). Вкратце, кровь забирают с использованием иглы Vacutainer непосредственно в пробирку PAXgene™ Blood RNA tube и затем подвергают нескольким раундам центрифугирования, стадиям промывки и очистки, которые в конечном счете приводят к получению РНК высокого качества. РНК затем проходит стадию контроля качества и затем используется в будущем в анализах количественной реакции ПЦР в реальном времени и/или с использованием микрочипа, использующего специально разработанный запатентованный чип генов животного семейства кошачьих на платформе Affymetrix.
Подготовка анализа: Пробирки PAXgene™ (содержащие кровь) инкубируют в течение минимум 2 часов при комнатной температуре перед началом анализа. Если пробирки заморожены, и не инкубировались в течение 2 часов перед замораживанием, то их необходимо оставить при комнатной температуре для размораживания в течение дополнительных 2 часов. Каждую пробирку PAXgene™ переворачивают 8-10 раз перед первым центрифугированием. Если используют буфер BR4 (буферы включены в набор реагентов PAXgene™ Blood RNA Kit) в первый раз, то добавляют 4 объема 96-100% этанола к концентрированному буферу для получения рабочего раствора. Предварительно нагревают два нагревательных блока перед началом анализа до -65°С и 55°С.Готовят концентрированный раствор ДНК-азы I (свободный от РНК-азы комплект ДНК-азы включен в набор реагентов PAXgene™ Blood RNA Kit). Растворяют твердый фермент ДНК-азу I в 550 мкл свободной от РНК-азы воды, предоставляемой в наборе реагентов. Необходимо убедиться, что ДНК-аза I не потеряна при удалении крышки. Аккуратно перемешивают путем переворачивания пробирки. Не встряхивают и не центрифугируют.Смешивают фермент ДНК-азу I и буфер RDD (компонент набора реагентов) (в достаточном объеме для количества процессируемых образцов на партию). Каждому образцу требуется 7 0 мкл буфера RDD и 10 мкл ДНК-азы I (т.е. 20 образцам требуется коктейль, включающий 1,4 мл буфера RDD и 2 00 мкл ДНК-азы I). Коктейль следует хранить при 2-8°C до момента использования. Восстановленный фермент годен в течение срока до 6 недель при 2-8°C.
Хранение образца: пробирки PAXgene™ (которые содержат кровь) могут храниться при комнатной температуре в течение срока до 3 дней перед процессированием. Согласно листу-вкладышу с информацией о продукте, предоставляемому вместе с пробирками PAXgene™ Blood RNA tubes, структура клеточной РНК стабильна при этих условиях в течение срока до 3 дней. Однако этот срок может варьироваться в зависимости от образца. Пробирки PAXgene™ также могут храниться при 4°C в течение срока до 5 дней. Если требуется продолжительное хранение, пробирки PAXgene™ могут храниться при -20°C или -70°C в течение срока до 6 месяцев. Пробирки следует замораживать в нежестком штативе в вертикальном положении. Если пробирки хранятся при -70°C, то рекомендуется сначала замораживать при -20°C и затем переносить пробирки на -70°C. При удалении пробирок из морозильника, их следует разморозить при комнатной температуре (температура не должна превышать 22°C). Каждую пробирку следует переворачивать 10 раз перед проведением анализа.
Выделение РНК из цельной крови: Центрифугируют пробирки PAXgene™ Blood RNA tubes при 4000×g в течение 10 минут. Удаляют супернатант путем слива и выбрасывания. Промокают избыток супернатанта, оставшегося на краях пробирки PAXgene™ tube. Добавляют к осадку 4 мл свободной от РНК-азы воды и закрывают с помощью новой крышки Hemogard. Ресуспендируют осадок с помощью встряхивания и затем центрифугируют при 4000х×g в течение 10 минут.Удаляют супернатант путем слива и выбрасывания. Промокают избыток супернатанта, оставшегося на краях пробирки PAXgene™. Добавляют 360 мкл буфера BR1 (компонент из набора реагентов) к осадку и мягко перемешивают с помощью пипетки до полного ресуспендирования осадка. Переносят образец в стерильную пробирку 1,5 мл для микроцентрифуги и добавляют 3 00 мкл буфера BR2 (компонент из набора реагентов) и 40 мкл протеиназы К (буфер BR2 и протеиназу К не смешивают перед добавлением к образцу). Тщательно перемешивают каждую пробирку путем встряхивания и помещают в предварительно нагретый до 55°C термомиксер. Инкубируют/встряхивают пробирки в течение 10 минут при 1400 об./мин. Переносят лизат с помощью пипетки в центрифужную колонку QIAshredder, помещенную в пробирку для сбора образцов объемом 2 мл. Центрифугируют при 14000 об./мин. в течение 3 минут. Переносят супернатант проточной фракции в стерильную пробирку объемом 1,5 мл для микроцентрифуги. Добавляют 350 мкл 96-100% этанола и мягко перемешивают с помощью пипетки. Добавляют 7 00 мкл образца к центрифужной колонке PAXgene™, помещенную в пробирку для сбора образцов объемом 2 мл и центрифугируют при 14000 об./мин. в течение 1 минуты. Переносят центрифужную колонку PAXgene™ в новую пробирку для сбора образцов объемом 2 мл и выбрасывают элюат и старую пробирку для сбора образцов. Добавляют оставшийся объем образца к центрифужной колонке PAXgene™. Центрифугируют при 14000об./мин. в течение 1 минуты.
Выбрасывают старую пробирку и элюат из процесса центрифугирования центрифужной колонки, описанной непосредственно перед этим. Помещают центрифужную колонку PAXgene™ в новую пробирку для сбора образцов объемом 2 мл. Добавляют 350 мкл буфера BR3 (компонент набора реагентов) к центрифужной колонке PAXgene™ и центрифугируют при 14000об./мин. в течение 1 минуты. Выбрасывают элюат и пробирку для сбора образцов. Помещают колонку в новую пробирку для сбора образцов объемом 2 мл и добавляют 80 мкл коктейля ДНК-азы l/буфера RDD (смотрите "подготовку анализа") непосредственно на мембрану колонки и инкубируют в течение 15 минут при комнатной температуре. Добавляют еще 350 мкл буфера BR3 к центрифужной колонке PAXgene™. Центрифугируют при 14000об./мин. в течение 1 минуты. Переносят центрифужную колонку PAXgene™ в новую пробирку для сбора образцов объемом 2 мл и выбрасывают старую пробирку для сбора образцов и элюат.
Добавляют 500 мкл буфера BR4 (компонент набора реагентов) к центрифужной колонке PAXgene™. Центрифугируют при 14000об./мин. в течение 1 минуты. Переносят центрифужную колонку PAXgene™ в новую пробирку для сбора образцов объемом 2 мл и выбрасывают старую пробирку для сбора образцов и элюат.Добавляют еще 500 мкл буфера BR4 к центрифужной колонке PAXgene™. Центрифугируют при 14000 об./мин. в течение 3 минут для высушивания мембраны центрифужной колонки. Выбрасывают пробирку для сбора образцов и элюат и переносят колонки в другую пробирку для сбора образцов объемом 2 мл. Снова центрифугируют образцы при 14000 об./мин. в течение дополнительной минуты для дополнительного высушивания мембраны колонки. Выбрасывают элюат и пробирку для сбора образцов. Переносят центрифужную колонку PAXgene™ в пробирку объемом 1,5 мл для элюции. Добавляют 4 0 мкл буфера BR5 (компонент набора реагентов) непосредственно на мембрану центрифужной колонки PAXgene™. Центрифугируют при 14000об./мин. в течение 1 минуты. Удаляют центрифужную колонку PAXgene™ и переносят с помощью пипетки элюат в пробирку объемом 1,5 мл на туже центрифужную колонку PAXgene. Возвращают центрифужную колонку PAXgene™ в ту же пробирку для элюции объемом 1,5 мл и центрифугируют при 14000об./мин. в течение 1 минуты. Инкубируют конечный элюат при 65°C в течение 5 минут и немедленно охлаждают на льду. Хранят конечный продукт образца РНК при -80°C для дальнейшего использования.
Пример 2
Анализы с использованием генного чипа
Запатентованный выполненный по специальному заказу генный чип (Affymetrix) используют для оценки исходной экспрессии генов у кошек, страдающих и не страдающих OA (10 нормальных, 10, страдающих артритом, животных). Как представлено выше, анализы с использованием генного чипа проводят с использованием стандартных методов и согласно инструкциям производителя с целью получения исходного сравнения между двумя группами для определения лежащих в основе различий генной экспрессии у кошек, страдающих OA, и у кошек, не страдающих OA.
Предварительные данные, полученные с использованием генного чипа, нормализуют с использованием алгоритма нормализации Устойчивого к ошибкам Среднего в Мультичипах (Robust Multiarray Average) (RMA) (Irizarry, et al., Biostatistics 2003 Vol 4, Page 249-264), и затем подвергают статистическому анализу с использованием алгоритма метода опорных векторов (Support Vector Machine) (SVM) (Partek Genomic Suite, Version 6) для определения различий экспрессии генов, которая может отличаться у животных, страдающих артритом, и у животных, не страдающих артритом. Гены, идентифицирующие ОА-биомаркеры, выбирают на основе величины р и кратного изменения (FC) согласно следующим данным: гены с величиной p<0,001 и демонстрирующие кратное изменение, составляющее или >2, >1,5 или >1,3; и гены с величиной p<0,01 и демонстрирующие кратное изменение, составляющее или >2, >1,5 или >1,3. Списки ОА-биомаркеров животного семейства кошачьих представлен в настоящей заявке в таблицах 1-3.
Результаты этих исследований выявляют, что экспрессия генов может использоваться для различия между нормальными кошками и кошками, страдающими OA. Списки дифференциально экспрессирующихся генов включают последовательности, которые функционируют в качестве маркеров клеточной поверхности, рецепторов и других сигнальных молекул.
Пример 3
Эффект питания на экспрессию генов при артрите у животного семейства кошачьих
В этом исследовании, количественный анализ ПЦР в реальном времени проводят с использованием РНК, выделенной из образцов нормальной и страдающей артритом кошки. Дополнительно к исходному сравнению между животными, страдающими артритом, и нормальными животными, также измеряют эффект питания. Конкретно, проводят следующие процедуры тестирования питания для животных, хорошо известные специалисту в данной области, кошек, страдающих артритом, и нормальных кошек кормят тестируемым питанием, содержащим компоненты, которые по сообщениям, используют для противодействия воспалительному заболеванию, компоненты включают полиненасыщенные жирные кислоты, такие как омега-3 жирные кислоты, такие как представленные в патентах WO 2007/002837 А2 ("j/d") и WO 2006/074089 А2 ("senior"), и затем анализируют изменения экспрессии генов у животных с использованием кРВ-ПЦР (qRT-PCR). Сывороточные OA-маркеры также анализируют с использованием стандартных методов (ELISA).
Что касается кРВ-ПЦР, то используют метод Taqman-зонда, и все анализы проводят с использованием ПЦР-прибора Applied Biosysterns 7 500 для проведения ПЦР в реальном времени. Данные анализируют с использованием предоставленного производителем пакета программ версии 1.2.2. для детектирования последовательностей.
С применением исходного сравнения нормальных и страдающих артритом животных с использованием кРВ-ПЦР детектируют ОА-биомаркерные гены, ассоциированные с протеазами и деградацией хряща, такие как: Каспаза 1, Каспаза 3, ММР2, ММР16, Ингибитор ММР1, Ингибитор ММР2, Ингибитор ММРЗ, Цистеиновая протеаза, PUMP-I и Прогестерон-зависимый белок, и гены, ассоциированные с воспалением: IFN-гамма; TGF-бета; MIP-I альфа: IL-I альфа; IL-I бета; IL-2; IL-6 и IL-10. Данные также выявляют, что уровень IL-I и TGF-бета существенно отличается у животных, страдающих артритом, и ц животных, не страдающих артритом (смотрите фиг.1 и 2). Известно, что IL-I индуцирует у экспериментальных животных поражения, связанные с артритом. Этот результат подтвержден с помощью анализа с использованием генного чипа (данные не показаны).
Также с использованием стандартных методов elisa, у животных измеряют уровень пептида коллагена типа i в крови (ntx, смотрите фиг.3) и коллагена ii (ctx-ii, смотрите фиг.4), и данные выявляют, что кошки, которых кормили питанием, содержащим высокий уровень ера и dha, демонстрируют заметное уменьшение уровня этих оа-маркеров в циркуляции крови.
Клинические данные, полученные из исследования питания, включающего в себя описанных выше животных, страдающих артритом, и животных, не страдающих артритом, выявляют, что воздействие с помощью питания может влиять на экспрессию некоторых оа-биомаркеров. конкретно, питание, содержащее высокий уровень n-3 жирных кислот DHA (0,3%) или DHA и ЕРА (0,3% и 0,46%, соответственно), может вызывать уменьшение уровня сывороточных оа-маркеров, коллагена i (ntx) и фрагмента коллагена ii (ctx-ii), но не влияют на уровень TGF-бета. что касается TGF-бета, то отсутствие изменения является желательным, поскольку этот белок может выполнять защитную функцию при артрите. Кроме того, количественный анализ ПЦР в реальном времени обнаружил, что экспрессия IL-I также существенно уменьшается у животных, которые получали питание, содержащее DHA и ЕРА, что является желательным, поскольку этот белок представляет собой известную артрогенную молекулу. Таким образом, демонстрируется, что кормление питанием, богатым п-З жирными кислотами ЕРА и DHA (на основе tg-масла), может вызывать уменьшение экспрессии IL-I, NTX и CTX-ii.
Таблица 7
Анализ кРВ-ПЦР (qRT-PCR) ОА-биомаркеров животных семейства кошачьих
Название гена
Аббревиатура названия гена
Номер гена в базе данных
Номер белка в базе данных
Кратное изменение относительногоколичества в день 0 исследования питания (NS=незначительно)
Каспаза 1
CASP1
AF135968
AAF64389.1
NS
Каспаза 3
CASP3
АВ090246
ВАС 10589.1
NS
Матриксная металлопротеиназа 2
ММР2
AY250767
AAR03978.1
NS
Матриксная металлопротеиназа 16
ММР16
AY250763
AAR03975
NS
Ингибитор матриксной металлопротеиназы 1
Ингибитор ММР1
AY250764
AAR03976
NS
Ингибитор матриксной металлопротеиназы 2
Ингибитор ММР2
AY250765
данные отсутствуют
NS
Ингибитор матриксной металлопротеиназы 3
Ингибитор ММР3
AY250766
AAR03977
NS
Цистеиновая протеаза
AJO12326
САВ59816
NS
Неявная (предполагаемая) металлопротеиназа
PUMP-1
U04444
ААА18222.1
NS
Прогестерон-зависимый белок
PDP
М31652
ААА30816
NS
Интерферон-гамма
IFN-гамма
NM 001009873
NP 001009873
NS
Трансформирующий фактор роста бета
TGF-бета
AY425617
AAQ99152
1,4
Интерлейкин-1 альфа
IL-1 альфа
NM 001009351
NP 001009351
2,2
Интерлейкин-1 бета
IL-1 бета
NM 001077414
NP 001070882
NS
Интерлейкин-2
IL-2
NM 001043337
NP 001036802
NS
Интерлейкин-6
IL-6
NM 001009211
NP 001009211
NS
Интерлейкин-10
IL-10
NM 001009209
NP001009209
NS