УСТРОЙСТВО ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИММУНОАНАЛИЗА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

Полезная модель относится к области аналитической биохимии и касается устройства для проведения иммуноанализа биологически активных соединений различной природы, которое может быть использовано, например, для выявления возбудителей вирусных, бактериальных и грибковых инфекционных заболеваний человека, животных и растений, гормонов, пестицидов, антибиотиков, микотоксинов и т.д.
Известено устройство для проведения иммуноанализа биологически активных соединений, состоящее из полистироловой подложки, подложки для образца, мембраны для высвобождения конъюгата с коллоидным золотом, нитроцеллюлозной мембраны с аналитической и контрольной зонами, адсорбирующей подложки и устройства для регистрации результатов анализа по интенсивности образующегося окраски в контрольной области нитроцеллюлозной мембраны (Проблемы аналитической химии / Отделение химии и наук о материалах РАН. - М.: Наука, 2010. - Т.12: Биохимические методы анализа / Под ред. Б.Б.Дзантиева; Ин-т биохимии им. А.Н.Баха РАН. - 2010. - с.321-322).
Известено устройство для проведения иммуноанализа биологически активных соединений, состоящее из двух поляризаторов, высокочувствительного детектора и устройства для регистрации результатов анализа по составляющей флуоресценции при двух плоскостях ориентации второго поляризатора, параллельной и вертикальной относительно плоскости поляризации первого поляризатора (Проблемы аналитической химии / Отделение химии и наук о материалах РАН. - М.: Наука, 2010. - Т.12: Биохимические методы анализа / Под ред. Б.Б.Дзантиева; Ин-т биохимии им. А.Н.Баха РАН. - 2010. - с.373-374).
Наиболее близким к заявляемому является известное устройство для проведения иммуноанализа биологически активных соединений, состоящее из ячейки с электродами и устройства, позволяющего подавать на электроды электрический сигнал и измерять электрические свойства ячейки (Интернет - ссылка И.Н.Курочкин Нанобиоаналитические системы, Биосенсоры. http://nano.msu.ru/files/basics/lecture18__Kurochkin.pdf, с.1-98, см. с.8, 16) - прототип. В данном устройстве на поверхности одного из электродов содержатся иммобилизованные антитела, специфичные к определяемому биологически активному соединению, и иммуноанализ осуществляют путем проведения реакции антиген-антитело.
Недостатком известного устройств является то, что данное устройство не позволяет проводить иммуноанализ с высокой скоростью, что обусловлено гетерогенностью осуществляемой в данном устройстве иммунохимической реакции, что увеличивает продолжительность иммуноанализа.
Задача полезной модели заключается в создании нового устройства для проведения иммуноанализа биологически активных соединений, дающего возможность сократить продолжительность иммуноанализа, а также расширение арсенала технических средств, которые могут быть использованы для проведения иммуноанализа биологически активных соединений.
Указанный технический результат достигается тем, что в устройстве для проведения иммуноанализа биологически активных соединений, состоящем из ячейки с электродами и устройства, позволяющего подавать на электроды электрический сигнал и измерять электрические свойства ячейки, у ячейки, по крайней мере, дно обладает диэлектрическими свойствами, а устройство способно подавать, по крайней мере, на два электрода переменный электрический сигнал произвольной формы с различной частотой и осуществлять диэлектрическую спектроскопию ячейки.
Предлагаемое устройство является новым и не описано в научно-технической литературе.
Данное устройство может быть использовано для проведения иммуноанализа широкого спектра биологически активных соединений.
В предлагаемом устройстве ячейка может быть изготовлена как из электропроводящего материала, например, такого, как металл, так и из диэлектрика, например, из полимера, не обладающего электропроводностью. При этом у ячейки, по крайней мере, дно обязательно должно обладать диэлектрическими свойствами, поэтому при использовании для изготовления ячейки электропроводящих материалов, например, металла, на рабочую внутреннюю поверхность ячейки обязательно должен быть нанесен слой диэлектрика. В случае отсутствия поверхностных диэлектрических свойств у дна ячейки предлагаемый способ становится неработоспособным.
Ячейка может иметь плоское или неплоское внутреннее основание, например, содержать одну или несколько лунок или реакционных зон, разделенных гидрофобным барьером, причем стенки ячейки могут быть созданы с использованием барьера из гидрофобного материала.
Геометрические размеры ячейки принципиального значения не имеют и могут варьироваться в зависимости от числа электродов на дне ячейки и решаемой экспериментальной задачи. Ячейка может быть как съемной так и не съемной, а также при необходимости она может содержать крышку.
Кроме того, ячейка обязательно должна содержать не менее двух электродов, обеспечивающих создание электрического поля в ячейке. Электроды могут быть изготовлены из любого электропроводящего материала, например, из металла, электропроводящего полимера, например, полианилина, электропроводящего композита, например, из полипропилена, наполненного углеродными нанотрубками, сочетания подобных материалов и т.д. Размеры каждого из электродов могут отличаться друг от друга и могут варьироваться в широких пределах. В случае изготовления ячейки из электропроводящего материала электроды должны быть изолированы от стенок и дна ячейки.
Количество электродов обязательно должно быть не менее двух и может быть как четным, так и нечетным. Если ячейка будет содержать только один электрод, то устройство функционировать не будет. При этом электроды могут располагаться как на дне ячейки, так и на некотором расстоянии от дна ячейки.
Форма и геометрические размеры электродов могут варьироваться в зависимости от решаемой экспериментальной задачи. Обычно иммуноанализ проводят в объеме, не превышающем 1 миллилитр (мл). Кроме того, на электроды целесообразно подавать напряжение, не превышающее 10 вольт (В), поэтому расстояние между электродами может варьироваться в широких пределах, например, от 3 микрон (мкм) до 10 миллиметров (мм). Возможно использование встречно-штырьевой системы электродов.
В предлагаемом устройстве на каждый, по крайней мере, из двух электродов необходимо подавать переменный электрический сигнал произвольной формы с различной частотой.
При подаче переменного электрического сигнала форма и частота сигнала могут варьироваться в широких пределах. В качестве устройства для подачи такого сигнала можно использовать традиционные устройства для диэлектрической спектроскопии или импедансометрии (синоним-измеритель иммитанса). В данном техническом решении каждый из электродов должен быть соединен с устройством, позволяющим не только подавать электрический сигнал, но и иметь возможность осуществлять диэлектрическую спектроскопию ячейки, т.е. измерять электрическую емкость и/или диэлектрические потери в помещенной в ячейку реакционной системе по ходу процесса. Одновременное измерение электрической емкости и диэлектрических потерь дает возможность получать дополнительную информацию. Приподаче на электроды постоянного электрического сигнала или переменного электрического сигнала с различной частотой устройство утрачивает работоспособность.
Количественный и качественный иммуноанализ биологически активных соединений с помощью предложенного устройства осуществляют следующим образом.
В отдельной пробирке готовят раствор антител. Затем в пробирку добавляют раствор исследуемого антигена, после чего содержимое пробирки перемешивают. После этого требуемый объем смеси помещают в ячейку предлагаемого устройства и с помощью устройства подают на электроды переменный электрический сигнал. Одновременно осуществляют диэлектрическую спектроскопию ячейки. Результаты измерения поступают в компьютер, который обрабатывает их по специальной программе и на основе полученных данных дает ответ о присутствии или отсутствии определяемого соединения в исследуемом биологическом материале. Таким образом удается провести индикацию исследуемого соединения. В случае отсутствия искомого биологически активного соединения проводят аналогичный эксперимент или серию экспериментов с растворами гетерологичных антител. Предварительно проводят положительный и отрицательный контрольные эксперименты, позволяющие получить специфический диэлектрический спектр комплекса антител с определяемым биологически активным соединением.
При проведении количественного анализа предварительно проводят измерения регистрируемого сигнала для стандартных матричных растворов с известной концентрацией определяемого соединения. После чего строят калибровочную кривую зависимости регистрируемого сигнала от концентрации определяемого соединения. С помощью полученной зависимости проводят количественное определение концентрации исследуемого соединения.
При проведении количественного анализа предварительно проводят измерения регистрируемого сигнала для стандартных матричных растворов с известной концентрацией определяемого соединения. После чего строят калибровочную кривую зависимости регистрируемого сигнала от концентрации определяемого соединения. С помощью полученной зависимости проводят количественное определение концентрации исследуемого соединения в исследуемой системе.
Предлагаемое устройство конструктивно несложно и позволяет быстро проводить иммуноанализ широкого круга биологически активных соединений.
Преимущества предложенной полезной модели иллюстрируют следующие примеры.
Пример 1.
Опыт проводят с устройством, содержащим круглую плоскую ячейку, изготовленную из диэлектрика полипропилена, с внутренним радиусом 2 мм. Данная ячейка имеет на дне два электрода с расстоянием 20 мкм между ними, изготовленных из проводящего углерода и нанесенных методом контактной печати. В отдельной пробирке готовят 0,1 мл реакционной смеси, состоящей из водного буферного раствора (0,01М калий-фосфатный буфер, с 0,1М NaCl, 0,1% неионный детергент тритон Х-100, pH 7,4), содержащего специфические антитела к Х-вирусу картофеля.
Затем в пробирку добавляют 0,1 мл раствора, содержащего Х-вирус картофеля с концентрацией 1 микрограмм (мкг)/мл, и содержимое пробирки перемешивают. После этого 0,05 мл смеси помещают между электродами, соединенными с помощью проводников со стандартным устройством для осуществления диэлектрической спектроскопии. Затем с помощью устройства подают на электроды непериодические прямоугольные импульсы с амплитудой от 1 до 5 В длительностью 10 микросекунд (мкс) с различными промежутками от 1 мкс до 1 милисекунды (мс) и записывают диэлектрический спектр в виде изменения электрической емкости ячейки в память компьютера, совмещенного с устройством. Компьютер обрабатывает полученные данные по специальной программе и записывает диэлектрический спектр ячейки, содержащей продукт иммунохимической реакции. Кроме того, по аналогичной схеме проводят отрицательные контрольные эксперименты не со смесью антител с определяемым антигеном, а с отдельными составляющими вышеуказанной смеси. Данные спектры используют в качестве эталонов при тестировании растворов на предмет содержания в них Х-вируса картофеля.
В отдельной пробирке готовят 0,1 мл реакционной смеси, состоящей из водного буферного раствора (0,01М калий-фосфатный буфер, с 0,1М NaCl, 0,1% неионный детергент тритон Х-100, pH 7,4), содержащего специфические антитела к Х-вирусу картофеля. Затем в пробирку добавляют 0,1 мл тестируемого раствора, проверяемого на содержание Х-вируса картофеля, и содержимое пробирки перемешивают. После этого 0,05 мл смеси помещают в вышеописанную ячейку и проводят измерения по вышеописанной схеме. Компьютер обрабатывает полученные данные по специальной программе и сравнивает полученный диэлектрический спектр с ранее полученным контрольным диэлектрическим спектром. Таким образом удается провести идентификацию Х-вируса картофеля в исследуемом образце. Чувствительность анализа Х-вируса картофеля составляет 1 нанограмм (нг)/мл, продолжительность иммуноанализа равна 3 мин.
Пример 2 (контрольный, с неспецифичными к Х-вирусу картофеля антителами).
Опыт проводят аналогично примеру 1, однако берут антитела к У-вирусу картофеля (неспецифичные к Х-вирусу картофеля). Обработка полученных результатов с помощью компьютера свидетельствует о том, что Х-вирус картофеля данным методом определить не удается. Продолжительность иммуноанализа равна 3 мин.
Пример 3 (контрольный, со специфичными к Х-вирусу картофеля антителами и вирусом табачной мозаики).
Опыт проводят аналогично примеру 1, однако берут в качестве, определяемого соединения вирус табачной мозаики. Обработка полученных результатов с помощью компьютера свидетельствует о том, что вирус табачной мозаики данным методом определить не удается. Продолжительность иммуноанализа составляет 3 мин.
Пример 4 (контрольный, без Х-вируса картофеля).
Опыт проводят аналогично примеру 1, однако вместо раствора, содержащего Х-вирус картофеля, в реакционную систему вносят буферный раствор, не содержащий Х-вирус картофеля. Обработка полученных результатов с помощью компьютера свидетельствует о том, что Х-вирус картофеля в исследуемом образце отсутствует. Продолжительность иммуноанализа составляет 3 мин.
Пример 5
Опыт проводят с использованием квадратной ячейки размером 10×10 мм, изготовленной из пластины алюминия, верхняя поверхность которой покрыта слоем диэлектрика оксида кремния. Ячейка содержит три медных электрода гребенчатой формы с входящими навстречу друг другу гребнями, изготовленными методом фотолитографии. Ячейка содержит две независимые реакционные зоны круглой формы радиусом 1 мм, ограниченные слоем напыленного гидрофобного полимера политетрафторэтилена. Реакционные зоны в ячейке располагают так, что в каждой из них находятся входящие друг в друга гребни соседних электродов. Такое строение ячейки позволяет сразу анализировать две реакционные системы. Предварительно аналогично примеру 1 получают эталонные спектры для У-вируса картофеля и антител к свиному инсулину.
В одной из пробирок готовят 0,05 мл реакционной смеси, состоящей из водного буферного раствора (0,01М калий-фосфатный буфер, с 0,1М NaCl, 0,1% тритон Х-100, pH 7,4), содержащего инсулин свиньи. Затем в пробирку добавляют 0,05 мл раствора, содержащего антитела к инсулину свиньи с концентрацией 1 мкг/мл, содержимое пробирки перемешивают и инкубируют в течение 30 мин.
В другой отдельной пробирке готовят 0,05 мл реакционной смеси, состоящей из водного буферного раствора (0,01М калий-фосфатный буфер, с 0,1М NaCl, 0,1% тритон Х-100, pH 7,4), содержащего специфические антитела к У-вирусу картофеля. Затем в пробирку добавляют 0,05 мл раствора У-вируса картофеля с концентрацией 1 мкг/мл, содержимое пробирки перемешивают и инкубируют в течение 30 мин.
После этого в разные реакционные зоны ячейки вносят по 0,05 мл смеси из первой и из второй пробирки. Электроды с помощью проводников подсоединяют к стандартному устройству для проведения диэлектрической спектроскопии, затем на электроды подают пилообразное напряжение с амплитудой от 0,3 до 10 В с промежутками между пиками от 2 мкс до 20 мкс таким образом, чтобы соседние электроды имели противоположную полярность. Одновременно записывают диэлектрические потери в каждой реакционной зоне в память компьютера, совмещенного с устройством.
Компьютер обрабатывает полученные данные по специальной программе и на их основе дает ответ о присутствии антител, специфичных к инсулину свиньи и У-вируса картофеля в исследуемых биологических материалах. Таким образом удается провести идентификацию антител к инсулину свиньи в одной реакционной зоне и У-вируса картофеля в другой. Полное время анализа составляет 4 мин, при этом чувствительность измерений для У-вируса картофеля составляет 2 нг/мл и для антител к инсулину свиньи 0,1 нг/мл.
Пример 6
Опыт проводят аналогично примеру 5, однако, используют ячейку, содержащую 8 электродов и 4 реакционные зоны. Готовят 4 реакционные смеси. Первая смесь содержит антитела к вирусу табачной мозаики и тестируемый раствор неизвестной природы, вторая - антитела к инсулину свиньи и тестируемый раствор неизвестной природы, третья - антитела к пероксидазе хрена и тестируемый раствор неизвестной природы, четвертая - антитела к Х-вирусу картофеля и анализируемый раствор неизвестной природы. Предварительно аналогично примеру 1 получают положительные и отрицательные эталонные спектры для антител в вирусу табачной мозаики, антител к инсулину свиньи, антител к пероксидазе хрена и антител к Х-вирусу картофеля при исользовании переменного электрического сигнала синусоидальной формы с амплитудой 5 В и частотой от 10 Гц до 1 МГц.
В каждую из реакционных зон ячейки помещают свою реакционную смесь. Электроды ячейки с помощью проводников подсоединяют к стандартному устройству для проведения диэлектрической спектроскопии, затем на электроды подают вышеописанный переменный электрический сигнал. Одновременно записывают диэлектрические потери в каждой реакционной зоне в память компьютера, совмещенного с устройством. Компьютер обрабатывает полученные данные по специальной программе и на их основе дает ответ о присутствии Х-вируса картофеля в исследуемом биологическом материале неизвестной природы. Продолжительность иммуноанализа составляет 5 мин, чувствительность детекции Х-вируса картофеля равна 1 нг/мл.
Пример 7
Опыт проводят аналогично примеру 1, однако используют специфические антитела к У-вирусу картофеля и тестируемый раствор, содержащий У-вирус картофеля. При этом опыт проводят в ячейке, содержащей между электродами круглую лунку, расположенную между электродами, края которой отстоят от электродов на расстояние 10 мкм. Реакционную систему помещают в эту лунку и затем на электроды подают переменный синусообразный электрический сигнал с амплитудой 3 В и частотой от 100 Гц до 1 МГц. Предварительно получают положительный и отрицательный эталонные спектры при использованиии данного электрического сигнала. В итоге удается провести идентификацию У-вируса картофеля. Продолжительность анализа составляет 3 мин, чувствительность детекции У-вируса картофеля равна 1 нг/мл.
Пример 8
Опыт проводят аналогично примеру 6, однако исползуют калибровочные растворы, содержащие различные известные концентрации Х-вируса картофеля от 1 нг/мл до 100 нг/мл. После чего строят калибровочную кривую зависимости регистрируемого сигнала от концентрации определяемого соединения. После этого количественное определение Х-вируса картофеля в тестируемом образце с неизвестной концентрацией вируса проводят аналогично примеру 1. С помощью полученной калибровочной зависимости проводят количественное определение концентрации Х-вируса картофеля в исследуемом образце с неизвестной концентрацией, которая оказалась равной 10 нг/мл. Продолжительность количественного иммуноанализа составляет 10 мин.
Были проведены эксперименты, которые показали, что полезная модель будет неработоспособной, если она будет содержать только ячейку с электродами и устройство, позволяющее только подавать на электроды переменный электрический сигнал произвольной формы с различной частотой или только осуществлять диэлектрическую спектроскопию ячейки. Полезная модель также утрачивает работоспособность, если устроство будет давать возможность подавать переменный электрический сигнал и осуществлять диэлектрическую спектроскопию, но не будет содержать ячейку с электродами или будет содержать ячейку, у которой, по крайней мере, дно не будет обладать диэлектрическими свойствами. Полезная модель также становится неработоспособной, если, по крайней мере, на два электрода устройство будет подавать переменный электрический сигнал произвольной формы с одной частотой или постоянный электрический сигнал.
Таким образом, из приведенных примеров видно, что предлагаемая полезная модель конструктивно проста, сокращает продолжительность иммуноанализа с 1 ч (прототип) до 3-10 мин и расширяет арсенал технических средств, которые могут быть использованы для проведения иммуноанализа биологически активных соединений.