ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ МУТАЦИИ В ГЕНЕ BTPKD СОБАКИ ДОМАШНЕЙ (CANIS LUPUS FAMILIARIS), ВЫЗЫВАЮЩЕЙ ПОЛИКИСТОЗ ПОЧЕК
TEST SYSTEM FOR IDENTIFYING A MUTATION IN THE BTPKD GENE OF THE DOMESTIC DOG (CANIS LUPUS FAMILIARIS), CAUSING POLYCYSTIC KIDNEY DISEASE

Изобретение относится к области ветеринарной генетики и биотехнологии.
Известна мутация в гене BTPKD (SNP: 6:38856816; NC_006588.3:g.38856816G>A) собаки домашней (Canis lupus familiaris), вызывающая поликистоз почек.
Однако для детекции этой мутации необходимо создание тест-ситемы на определение собак-носителей данной мутации или собак, больных поликистозом.
Техническим результатом является обеспечение достоверной диагностики поликистоза почек у собак, вызванной мутацией в гене BTPKD.
Технический результат достигается тем, что в тест-системе для выявления мутации в гене BTPKD, вызывающей поликистоз почек у собак включающую амплификационную смесь для проведения полимеразной цепной реакции, состоящую из 1х буфера с сульфатом аммония, Taq-полимеразы, смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ), магния хлорида используют разработанные праймеры, Taqman зонды диагностируемой аллели, а также олигонуклеотид-«заглушку» для другой аллели, имеющими следующие последовательности:
Праймер F - CCTCAAGCCTGTCCATCTGT
Праймер R - GGAGAGCCAGATGTGCTTGT
Зонд mut - FAM-TCCTCGTGGCCAAGCTGCAG-BHQ1
2
Заглушка wt - CCTCGTGGCCGAGCTGCAG-NH
Зонд wt - FAM - CCTCGTGGCCGAGCTGCAG-BHQ1
2
Заглушка mut - TCCTCGTGGCCAAGCTGCAG-NH,
а также контрольные образцы на дикотипный и мутантный вариант фрагмента гена BTPKD.
В качестве контролей созданы две генетические конструкции - плазмиды, содержащие дикотипный и мутантный вариант фрагмента гена BTPKD. Положительный контроль для дикотипных диагностических систем получили путем амплификации фрагмента гена, полученный из ДНК здоровой собаки и его клонирования в вектор pJet1.2, мутантный вариант изготовили путем синтеза синтетической последовательности ДНК с последующим клонированием ее в вектор pJet1.2. ДНК гетерозиготы по мутации имитирована путем эквимолярного смешивания плазмид обоих типов после измерения их концентрации на электрофорезе в агарозном геле.
В качестве матрицы использовали 1 мкл разбавленного раствора контрольной плазмиды (исходная плазмида 50 гн/мкл разбавлялась 1:10000) с фрагментом гена дикого типа, с фрагментом мутантной аллели гена или их смеси, имитирующей гетерозиготу. «Преимущества клонирования ПЦР-продукта в вектор» заключается в устойчивом долговременном хранении контрольных матриц в виде плазмиды внутри бактериального штамма, с неограниченной возможностью копирования и наработки.
Реакционная смесь для ПЦР-РВ в варианте с «заглушками» разделена на два объема, каждый из которых содержит: Праймер прямой (F), Праймер обратный (R), Зонд, комплементарный одной из аллелей (wt - дикий тип, mut - мутантная аллель), Олигонуклеотид - заглушку, комплементарный другой аллели. В качестве контроля используют 2 вида матриц: для дикой аллели, для мутантной аллели. Детекция продуктов амплификации осуществляется с использованием принципа выщепления флуоресцентной метки на 5' конце олигонуклеотидного зонда. Применение «заглушек» и раздельная детекция аллелей в двух независимых реакционных объемах дает возможность достижения наилучшего баланса между специфичностью и эффективностью системы и точной подстройки специфичности с помощью изменения соотношения концентраций зонда и «заглушки». Такая постановка ПЦР-РВ позволяет быстро установить в изучаемых образцах ДНК наличие трех вариантов генотипов, и, следовательно, выявить наличие или отсутствие мутантной аллели и определить наличие, отсутствие патологии или носительство.
Использование разных видов контроля в виде матриц, специфических праймеров, зондов и «звглушек» к разным вариантам генома (на мутантную и дикую аллели) позволяет контролировать корректное прохождение реакции в каждой пробирке.
При конструировании праймеров, зондов и заглушек выполнены требования: высокая степень гомологии с исследуемыми вариантами мутации гена, отсутствие участков отжигающихся «сами на себя», отсутствие «шпилек», что подтверждено результататами програмной проверки специфичности связывания праймеров и гибридизационных зондов, программной проверки олигонуклеотидов на возможность образования шпилек и димеров.
Конструирование специфических праймеров, зондов и «заглушек» осуществляли с помощью компьютерных программ на основании анализа нуклеотидных последовательностей, опубликованный на ресурсе GeneBank и подбора условий для проведения РВ-ПЦР с применением разработанных праймеров, зондов, несущих флуорохром и гаситель флуоресценции и «заглушек» комплементарных части амплифицируемого фрагмента.
Признаки, отличающие заявляемое техническое решение направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательный уровень».
Сущность изобретения поясняется фиг. 1 «Результаты ПЦР-РВ для детекции мутантной аллели BTPKD (3:1)» и фиг. 2 «Результаты ПЦР-РВ для детекции дикотипной аллели BTPKD (3:1)», где представлен скриншот результатов ПЦР-РВ в виде графиков, отражающих варианты детекции дикотипной, мутантной аллели и варианта гетерозиготного генотипа.
Пример конкретного использования тест-системы для выявления мутации в гене BTPKD у собак.
Исследование состоит из трех этапов:
1. Выделение ДНК из биоматериала (соскобов энетеробуккального эпителия).
2. Проведение ПЦР-РВ.
3. Интерпретация полученных результатов.
1. Для исследования у собак берут пробу энтеробуккального эпителия. Выделение тотальной ДНК собаки домашней производилось методом, с применением бромида цетилтриметиламмония (ЦТАБ).
Состав буфера: 1,4 М NaCl, 0,02 М ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), 0,1М Трис - HCl с рН=8,0 (гидроксиметиламинометана гидрохлорид), дистиллированная вода.
Материал (соскоб буккального эпителия) переносили в пробирку типа Eppendorf объемом 1,5 мл, с добавлением 1 мл экстрагирующего буфера. После чего образец инкубировали на +56°C в течение 40 минут, с периодическим перемешиванием содержимого. После инкубации в пробирку добавляли 0,5 мл хлороформа, выдерживали 40 минут при комнатной температуре, содержимое пробирки постоянно перемешивали. Центрифугировали в течение 5 минут при 10000 об/мин. Верхнюю фазу переносили в чистую пробирку типа Eppendorf объемом 1,5 мл, добавляли 2/3 объема изопропилового спирта, перемешивали. Далее выдерживали при комнатной температуре 30 минут для преципитации ДНК. Центрифугировали 10 минут при 10000 об/мин. Супернатант сливали и промывали осадок 80% этанолом. Повторно центрифугировали 10 минут при 10000 об/мин. После удаления супернатанта, осадок нуклеиновой кислоты высушивали при комнатной температуре, затем растворяли его в 60 мкл стерильной деионизированной воды, хранили полученный образец ДНК при -20°C.
2. Апробацию диагностической системы производили в ПЦР-РВ анализаторе нуклеиновых кислот АНК-16 (Сертификат соответствия № РОСС RU.ME01. Н00423, Институт аналитического приборостроения РАН, Россия). Реакцию проводили в объеме 20 мкл. Амплификационная смесь содержит: 2 мкл 10 х буфер с сульфатом аммония для Taq-полимеразы, 0,125 мМ смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ), 0,25 мкМ праймер прямой, 0,25 мкМ праймер обратный, 0,125е.а/мкл Taq-полимераза, 2,5 мМ магния хлорид, 0,125 мкМ Taqman зонда диагностируемой аллели, а также олигонуклеотид-«заглушку» для другой аллели в объеме 0,250 мкМ. Все используемые реактивы производства ООО «Бигль», Россия. В качестве матрицы в смесь добавляли 1 мкл разбавленного раствора контрольной плазмиды (с фрагментом гена дикого типа, с фрагментом мутантной аллели гена или их смеси, имитирующей гетерозиготу. После первоначальной денатурации при 94°C в течение 200 с 40 циклов амплификации проводили в следующем температурно-временном режиме: денатурация - 94°C, 18 с, отжиг праймеров - 60°C, 40 с, элонгация - 72°C, 40 с.
Тест-система позволяет специфически амплифицировать фрагмент гена BTPKD, для установления генотипа собаки в мультиплексной полимеразной цепной реакции.
Система состоит из комплекта реагентов для проведения мультиплексной ПЦР и комплекта контрольных образов.
Отбирают необходимое количество одноразовых пробирок пробирку типа Eppendorf объемом 1,5 мл, включая пробирки с матрицами и отрицательным контролем. Во все пробирки вносят реакционную смесь и добавляют исследуемые образцы ДНК в количестве 1 мкл, в отдельные пробироки вносят 1 мкл матрицы - разбавленного раствора контрольной плазмиды с фрагментом гена дикого типа, с фрагментом мутантной аллели гена. В пробирку для отрицательного контроля вносят 1 мл дистиллированной воды.
3. Интерпретация результатов анализа.
Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала - анализируются с помощью программного обеспечения используемого генетического анализатора для проведения ПЦР-РВ АНК-16, согласно прилагаемой инструкции производителя.
В таблице 1 представлены данные, по которым можно установить существенную разницу в эффективности специфической и неспецифической реакции. Эффективность рассчитана ПО прибора АНК-16.
Таким образом, для выявления собак-носителей (генотип GA) мутации в гене BTPKD(SNP: 6:38856816; NC_006588.3:g.38856816G>A), а также животных, больных поликистозом (гнотип АА) можно использовать разработанную тест систему. При наличии генотипа дикого типа (GG), т.е. животное здоровое на графике фиг. 2 результат будет отображаться в виде графика wt/wt. Если собака является носителем мутантной аллели (генотип GA), то результат детекции будет соответствовать графику mut/wt, представленном на фиг. 1 и фиг. 2. При наличии мутации в гомозиготном состоянии (поликистоз, генотип АА), график будет соответствовать, представленному на фиг. 1 и фиг. 2 как mut/ mut.
Заявляемую тест-систему рекомендовано использовать в ветеринарной генетике, а именно к средствам выявления носительства или диагностики заболевания поликистоз почек, вызванный мутацией в гене BTPKD у собак породы английский бультерьер, керн-терьер, вест-хайленд-вайт терьер или малинуа, что соответствует уровню «промышленная применимость».