СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ БУЦИНДОЛОЛОМ, ОСНОВАННЫЙ НА ОПРЕДЕЛЕНИИ ГЕНОТИПА
METHOD FOR TREATMENT WITH BUCINDOLOL BASED ON GENOTYPE DEFINITION

Предшествующий уровень техники
В настоящей заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке на патент США 60/609689, поданной 14 сентября 2004, и предварительной заявке на патент США 60/610706, поданной 17 сентября 2004 г., которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
Правительство может иметь право собственности на настоящее изобретение в соответствии с грантами HL052318, HL07071609, ES06096, HL071118 и HL48013, выданными Национальным институтом здравоохранения.
Область, к которой относится изобретение
1.
1
1
2с
2c
Настоящее изобретение относится к фармакологии и кардиологии. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способам индивидуального лечения сердечной недостаточности с применением буциндолола, основанного на генотипе пациента с полиморфизмом в генах адренергических рецепторов, включая ген β-адренергического рецептора (βAR) и α-адренергического рецептора (αAR).
Описание прототипов
2.
По оценкам Американской ассоциации кардиологов (АНА) примерно 62 миллиона американцев страдают определенными формами сердечно-сосудистых заболеваний, которые могут включать в себя высокое кровяное давление, ишемическую болезнь сердца (сердечные приступы и боли в груди), инсульт, врожденные пороки сердца и кровеносных сосудов и застойную сердечную недостаточность, и от этих заболеваний ежегодно умирает примерно миллион человек. В ежегодном отчете AHA также сообщается, что в Америке от сердечно-сосудистых заболеваний умирает больше людей, чем от семи других основных причин смертности, вместе взятых, включая рак. Неожиданно было обнаружено, что в целом сердечно-сосудистыми заболеваниями чаще страдают женщины, чем мужчины. В 1999 г. в США смертность от сердечно-сосудистых заболеваний составила 40% от всех летальных исходов. В последнее время, несмотря на значительный прогресс в лечении указанных заболеваний, смертность от сердечной недостаточности только за 5 лет составила приблизительно 50%.
Только в Соединенных Штатах приблизительно шесть миллионов человек, то есть примерно 1,5% всего населения, страдает хронической сердечной недостаточностью (СН), и каждый год диагностируется 550000 новых случаев заболевания. Хотя за последнее время был достигнут значительный прогресс в консервативном лечении СН, однако уровень заболеваемости и смертности от этих заболеваний все еще остается очень высоким (Mann et al., 2005). Современное стандартное лечение СН предусматривает использование ингибиторов (ингибиторов ACE, ARB и/или антагонистов альдостероновых рецепторов) системы “ренин-ангиотензин-альдостерон” (RAAS) и β-блокаторов, которые конкурентно ингибируют β-адренергические рецепторы на миоцитах сердца. β-Блокаторы являются эффективными с точки зрения снижения смертности, и из всех классов лекарственных средств они считаются наиболее эффективными средствами для лечения СН, однако такая эффективность наблюдается лишь у 50-60% всех пациентов, подвергаемых лечению. Кроме того, по результатам испытаний, проводимых для оценки смертности пациентов в США, клинические данные об эффективности разрешенных к применению β-блокаторов являются не слишком впечатляющими, при этом опубликованные данные, полученные в одном широкомасштабном исследовании, проводимом для оценки смертности в зависимости от назначенного лечения с использованием плацебо в качестве контроля, свидетельствует об увеличении смертности пациентов в США.
В соответствии с этим необходимость в разработке терапии СН, которая была бы более эффективной, имела бы более высокий показатель отклика, лучше переносилась бы пациентом и была бы приемлемой для группы людей с другими заболеваниями, такими как диабет, остается крайне актуальной. Однако разработка новых лекарственных средств на фоне базового терапевтического уровня столкнулась с серьезными трудностями. Из 13 испытаний в фазе III, проведенных с 2001 года, только три испытания дали положительный результат. Два из этих “положительных” испытаний были проведены с использованием ARB (кандесартана) (McMurray et al., 2003; Granger et al., 2003). Третье “положительное” испытание A-HeFT проводилось с использованием BiDil (комбинация динитрат изосорбида и гидралазина) с участием группы пациентов (афроамериканцев), в которой лишь 12% составляли американцы, страдающие СН (Taylor et al., 2004). Поэтому необходимость в разработке лекарственных средств следующего поколения для лечения СН совершенно очевидна.
1
Хотя агонисты β применяются для лечения резкого ухудшения клинического состояния пациентов с недостаточностью вентрикулярной функции, однако пролонгированное воздействие вводимых агонистов на сердце или увеличение уровня агонистов катехоламина, продуцируемых в организме, приводит к обострению сердечной недостаточности. В противоположность этому антагонисты β-адренергических рецепторов (называемые β-блокаторами) используются как основное средство для лечения хронической сердечной недостаточности.
В начале 1990-х годов группа ученых США, проводившая исследование на эффективность β-блокаторов в лечении сердечной недостаточности, пришла к заключению, что для подтверждения этой пока еще спорной терапии требуются испытания по оценке смертности. Группой исследователей США был разработан протокол исследований и подана заявка на получение гранта, на основании которой были затем выделены средства на осуществление совместной Программы клинических исследований VA и NHLBI. В утвержденном протоколе не указывалось конкретное лекарственное средство, а было лишь указано, что оптимальный β-блокатор должен быть выбран исходя из вероятности достижения успеха и надежности данных испытаний в фазе II. Рассматриваемыми лекарственными средствами были карведилол, тартрат метопролола, сукцинат метопролола CR/XL и буциндолол. В испытании MDC тартрат метопролола был отвергнут из-за его малообещающих эффектов с точки зрения его влияния на смертность (Waagstein et al., 1993); сукцинат метопролола CR/XL также не был выбран из-за отсутствия данных о его эффективности и переносимости при лечении сердечной недостаточности, а карведилол не был выбран частично из-за его плохой переносимости при запущенной сердечной недостаточности (Krum et al., 1995). Буциндолол был единодушно выбран Специальным комитетом благодаря его прекрасной переносимости (Eichhorn et al., 1997; Gilbert et al., 1990; Bristow et al., 1994; Pollock et al., 1990), эффективности (Gilbert et al., 1990; Bristow et al., 1994; Pollock et al., 1990; Eichhorn et al., 1990) и повышенному интересу к нему спонсоров. Таким образом, буциндолол стал объектом испытания по оценке бета-блокаторов (BEST), первого запланированного и начатого испытания по выживаемости при СН.
Испытания BEST были начаты в 1995 и закончены в 1999 году. После испытания BEST были запланированы и начаты три других испытания для оценки смертности, а именно испытание MERIT-HF с использованием сукцината метопролола CR/XL (MERIT-HF Study Group, 1999), испытание CIBIS-II с использованием бизопролола (CIBIS-II Investigators, 1999) и испытание COPERNICUS с использованием карведилола (Packer et al., 2002). Благодаря более быстрому и менее ограниченному набору участников для этих испытаний испытания CIBIS-II и MERIT-HF были завершены еще до окончания испытания BEST, и оба эти испытания дали положительные результаты.
Испытания BEST были завершены в 1999 г. раньше намеченного срока, что было отчасти обусловлено потерей у исследователей уверенности в необходимости продолжения данных испытаний и ускоренным темпом открытия новых торговых марок β-блокаторов на основе информации, полученной из двух других положительных испытаний (BEST Trial Investigators, 2001; Domanski et al., 2003). Спонсором было принято решение не продолжать промышленное производство буциндолола на основании данных, имеющихся на время прекращении испытаний. Хотя в испытании BEST, в котором не участвовали афроамериканцы, исследователи наблюдали благоприятный эффект при заболеваниях класса III, который был аналогичен положительным результатам, полученным шестью месяцами ранее в испытаниях CIBIS II и MERIT-HF, однако исследователи получили плохие результаты для заболеваний класса IV и в испытании с участием пациентов афроамериканцев. Более того, испытание BEST не достигло своей главной цели, т.е. на время завершения испытания не были получены оценки смертности по всем нозологическим формам заболеваний (снижение на 10%, p=0,10) (BEST Trial Investigators, 2001). Исследователями было высказано предположение, что различия между результатами, полученными для других β-блокаторов и буцинидола, могут быть обусловлены “уникальными фармакологическими свойствами буциндолола” (BEST Trial Investigators, 2001), на что указывают выявленные различия химических и функциональных свойств соединений этого отличающегося класса.
Кроме того, хотя большинство испытаний β-блокаторов указывало на ряд положительных эффектов в лечении сердечной недостаточности, однако значительная вариабельность результатов, полученных для различных индивидуумов, не может быть объяснена основными клиническими характеристиками (CIBIS-II Investigators, 1999). Вариабельность в ответах на фармакологическую терапию наблюдалась фактически для всех лекарственных средств. В таких случаях, как лечение хронической сердечной недостаточности β-блокаторами, при которой наблюдается высокая заболеваемость и смертность, алгоритм титрования является сложным, а вариабельность между отдельными индивидуумами достаточна высока, и при этом существует выбор дополнительных курсов лечения, - оценка вероятности благоприятного (или неблагоприятного) длительного ответа на терапию лекарственными средствами может иметь важное значение при принятии решения. Приблизительно 50%-ная смертность пациентов с сердечной недостаточностью за 5 лет послужила стимулом для проведения более интенсивных исследований, посвященных выбору способа лечения, и привела к разработке курсов лечения с применением ряда лекарственных средств, обычно включающего в себя β-блокатор, ингибитор ангиотензин-конвертирующего фермента (антагонист рецептора ангиотензина), диуретики и дигоксин. Терапию β-блокаторами начинают у относительно стабильных пациентов при низких дозах (т.е. примерно 10 мг), а затем эту дозу постепенно увеличивают в течение месяцев до получения нужной дозы или дозы, переносимой пациентом. Коррекция дозы других лекарственных средств или начало введения дополнительных лекарственных средств не является такой уж необычной процедурой в процессе позитивного титрования. Таким образом, лечение сердечной недостаточности β-блокаторами должно быть проведено отдельно для каждого пациента. Действительно, утверждение “введение дозы должно быть индивидуальным и подвергнуто тщательному мониторингу” имеется в инструкции по применению двух препаратов β-блокаторов, разрешенных для лечения сердечной недостаточности в США. Кроме того, исследования, проводимые на животных моделях и с участием человека, позволяют предположить, что для стимулируемой β-блокаторами отмены клеточного и глобального ремоделирования сердца при сердечной недостаточности могут потребоваться месяцы стабильной терапии (Lowes et al., 2002). При этом была отмечена значительная вариабельность в ответах пациентов на β-блокаторы, включая изменения фракции выброса крови левым желудочком (LVEF) (van Campen et al., 1998), толерантность к физической нагрузке (Bolger, 2003) и выживаемость (Packe et al., 2001). Тем не менее, исходя из преобладающего числа данных, терапия с применением β-блокаторов должна назначаться большинству пациентов с хронической сердечной недостаточностью с учетом противопоказаний, таких как перегрузка объемом, состояние, требующее инотропной инфузии, брадикардия, гемодинамическая нестабильность и астма.
Следовательно, у пациентов наблюдаются не только заметные различия в действии различных β-блокаторов, в частности буциндолола, по сравнению с действием других β-блокаторов, но также и различия в способности этих пациентов к положительной реакции в ответ на терапию конкретным β-блокатором. Поэтому необходимо получить данные о терапевтическом индексе буциндолола, в частности данные, которые позволили бы объяснить такие различия между индивидуумами.
Описание сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к способам индивидуального лечения сердечно-сосудистых заболеваний, основанным на идентификации полиморфизма в адренергических рецепторах, влияющего на восприимчивость индивидуума к буциндололу. В некоторых вариантах настоящее изобретение относится к индивидуальному лечению пациентов с сердечной недостаточностью.
1
2c
В некоторых своих вариантах настоящее изобретение относится к способам оценки эффективности лечения пациента буциндололом, включая получение данных о последовательности, относящихся по меньшей мере к одному полиморфизму в гене адренергического рецептора у пациента, где полученные данные являются показателем эффективности буциндолола для пациента. Такими данными о последовательности могут быть данные о последовательности нуклеиновой кислоты и/или данные об аминокислотной последовательности. В конкретных вариантах изобретения геном адренергического рецептора является βAR или αAR. В некоторых случаях получают данные о последовательности, относящиеся к полиморфизму в обоих генах.
1
1
2c
Кроме того, указанный полиморфизм включает в себя полиморфизм в одном случае в положении нуклеотида 1165 в гене β-адренергических рецепторов (βAR), который соответствует аминокислотному положению 389 кодируемого белка, и полиморфизм в других нуклеотидных положениях 964-975 гена αAR, которые соответствуют аминокислотным положениям 322-325 кодируемого белка.
1
2c
Настоящее изобретение основано на обнаружении авторами того факта, что гомозиготность по гену βAR, кодирующему аргинин в положении 389 генного продукта, сообщает пациенту физиологические свойства, позволяющие проводить лечение буциндололом. Кроме того, настоящее изобретение основано на установлении того факта, что делеция в гене αAR, которая приводит к делеции аминокислот 322-325 в генном продукте, оказывает негативное влияние на лечение более поздних стадий сердечной недостаточности с применением буциндолола. Под термином “лечение”, в отличие от профилактических мер, подразумевается терапия, проводимая пациенту с диагностированным сердечно-сосудистым заболеванием или с симптомами сердечно-сосудистого заболевания.
Следует отметить, что полиморфизм обычно возникает в генных последовательностях, однако в случае, когда полиморфизм влияет на кодируемый генный продукт, термин “полиморфизм” может также означать модификацию в таком генном продукте.
Способы согласно изобретению заключаются в оценке возможности назначения или введения буциндолола пациенту с сердечно-сосудистым заболеванием и эти способы включают в себя получение данных о пациенте, относящихся к наличию у него полиморфизма в генах адренергического рецептора и/или в кодируемых этим геном продуктах, которые влияют на восприимчивость этого пациента к буциндололу.
1
2c
1
2c
1
2c
1
2c
Поэтому настоящее изобретение относится к получению данных о полиморфизме в белках βAR и/или αAR прямым способом или путем определения нуклеотидной последовательности в положении 1165 в гене βAR и/или в положениях 964-975 в гене αAR и к назначению или введению буциндолола исходя из полученных данных. При этом следует отметить, что когнатными нуклеиновыми кислотами для белка βAR или αAR является мРНК-транскрипт, кодирующий указанный белок, обе цепи любой кДНК, генерируемой из указанного мРНК-транскрипта, и обе цепи геномной ДНК для гена βAR или αAR.
1
2c
Данные о том, какой полиморфизм имеется в генной последовательности пациента с сердечно-сосудистым заболеванием в положении 389 βAR и/или в положениях 322-325 αAR, могут быть взяты за основу при оценке возможности введения или назначения буциндолола данному пациенту.
Настоящее изобретение также относится к идентификации пациентов с сердечной недостаточностью, которые будут давать положительный ответ на лечение с использованием β-блокаторов, в частности буциндолола.
Настоящее изобретение также относится к устройствам и композициям для доставки β-блокаторов, в частности буциндолола, индивидууму, нуждающемуся в такой терапии.
1
1
1
Способ согласно изобретению включает в себя определение у пациента с сердечной недостаточностью генотипа в отдельном гене βAR, где у указанного пациента, вероятно, будет продуцироваться положительный ответ на стандартную дозу буциндолола, если данный пациент не является носителем βGly389 (т.е. имеет один или два аллеля Gly389). В одном из вариантов изобретения буциндолол прописывают пациенту с сердечной недостаточностью, который является гомозиготным по βArg389.
1
1
1
Способ согласно изобретению также предусматривает назначение или введение стандартной дозы буциндолола пациенту, нуждающемуся в такой терапии, исходя из данных, указывающих на то, что данный пациент является “гомозиготным по βArg389", что означает, что оба гена βAR у данного пациента кодируют в генных продуктах аргинин в положении 389. Способы согласно изобретению включают в себя назначение или введение буциндолола пациентам, которые являются “гомозиготными по βArg389", независимо от способа определения такого генотипа у пациента.
2c
2c
2c
2c
2c
2c
В других вариантах изобретения способ согласно изобретению включает в себя определение генотипа пациента с сердечной недостаточностью по гену αAR, где указанный пациент может давать положительный ответ на стандартную дозу буциндолола, если данный пациент не является носителем αDel322-325. В некоторых вариантах изобретения буциндолол прописывают пациенту с сердечной недостаточностью, у которого имеется гомозиготность дикого типа по α в положениях аминокислот 322-325 (т.е. указанные аминокислоты не являются делетированными). Способ согласно изобретению также предусматривает назначение или введение стандартной дозы буциндолола пациенту, нуждающемуся в такой терапии, на основе данных, указывающих на то, что указанный пациент имеет гомозиготность дикого типа по αAR, что означает, что у данного пациента отсутствует делеция в последовательности гена αAR, которая кодирует аминокислоты 322-325 в αAR. Способы согласно изобретению заключаются в назначении или введении буциндолола пациентам, которые имеют гомозиготность дикого типа по делеции (не являются носителями делеции), независимо от способа определения такого генотипа у пациента.
1
2c
1
2c
В некоторых случаях предусматривается, что генотип пациента может быть определен по одному из этих полиморфизмов, а затем может быть определен другой полиморфизм; в этой ситуации оценивают два различных образца. Альтернативно может быть получен один образец и этот образец может быть оценен на предмет наличия двух отдельных полиморфизмов. В другом варианте изобретения буциндолол прописывают пациенту с сердечной недостаточностью, который имеет диплотип гомозиготного βArg389 и гомозиготного αAR дикого типа. Способ согласно изобретению также предусматривает назначение или введение стандартной дозы буциндолола пациенту, нуждающемуся в такой терапии, на основе данных, указывающих на то, что указанный пациент является гомозиготным по βArg389 или по αAR дикого типа, или по комбинации-диплотипу.
1
2c
2c
Способ согласно изобретению также включает в себя определение того, какова вероятность наличия у индивидуумов, имеющих аналогичные патофизиологические состояния, такие как, без ограничения ими, застойная кардиомиопатия, ишемическая кардиомиопатия, ишемическая болезнь сердца (стенокардия, инфаркт миокарда), феохромоцитома, мигрень, сердечные аритмии, гипертензия и различные тревожные состояния, положительного ответа на лечение стандартной дозой буциндолола, назначенное на основе определения того, является ли данный индивидуум гомозиготным по Arg389 в гене βAR (и не является носителем 389Gly) и/или данный индивидуум имеет гомозиготность дикого типа по гену αAR и не является носителем αDel322-325.
1
1
В некоторых своих вариантах настоящее изобретение относится к способам оценки возможности лечения пациента буциндололом, включающим в себя определение либо (i) нуклеотида в положении 1165 одной или обеих кодирующих последовательностей генов βAR у данного пациента, либо (ii) аминокислоты в положении 389 белков βAR данного пациента, где указанному индивидууму предположительно может быть назначено лечение буциндололом.
2c
2c
В других своих вариантах настоящее изобретение относится к способам оценки возможности лечения пациента буциндололом, включающим в себя установление наличия делеции либо (i) в последовательности в положениях нуклеотидов 964-975 одного или обоих аллелей αAR данного пациента, либо (ii) в аминокислотах в положениях 322-325 белков αAR данного пациента, где указанному индивидууму может быть назначено лечение буциндололом.
Следует отметить, что не все белки данного пациента могут быть оценены в любом варианте согласно изобретению, но при этом может быть получен образец, в котором могут быть определены последовательности некоторых белков.
1
2c
Следует также отметить, что здесь термин “определение” используется в его обычном и всем понятном смысле и означает получение конкретной информации. Следует отметить, что обычно практический врач может установить необходимость назначения или введения пациенту буциндолола, для этого необходимо проведение одного или нескольких тестов для определения одного или обоих аллелей βAR у данного пациента или кодируемых ими белков и/или одного или обоих аллелей αAR у данного пациента или кодируемых ими белков. Что касается обсуждаемого здесь полиморфизма, то используемые здесь термины “аллель” и “ген” являются взаимозаменяемыми.
1
1
1
Другие аспекты настоящего изобретения относятся к способам лечения пациента с болезнью сердца, которые могут включать в себя введение или назначение пациенту эффективного количества буциндолола, где у указанных пациентов не обнаруживаются детектируемые уровни белка βAR, содержащего глицин в положении 389, или где указанный пациент является гомозиготным по цитозину в положении 1165 кодирующей нуклеотидной последовательности обоих аллелей βAR. В любом случае доктор или другой практический врач может прописать или назначить введение буциндолола, если ему известно, что буциндолол является лекарственным средством, приемлемым для данного пациента, на что указывает тот факт, что у данного пациента имеется полиморфизм Arg389/Arg389 в гене βAR.
2c
2c
2c
Альтернативно или дополнительно способы лечения пациента с болезнью сердца могут включать в себя введение или назначение пациенту эффективного количества буциндолола, где у указанного пациента не обнаруживаются детектируемые уровни белка αAR с делецией аминокислот 322-325 или где указанный пациент является гомозиготным по нуклеотидам 964-975 ("с отсутствием делеции") в кодирующей последовательности обоих аллелей αAR. В любом случае доктор или другой практический врач может прописать или назначить введение буциндолола, если ему известно, что буциндолол является лекарственным средством, приемлемым для данного пациента, на что указывает тот факт, что данный пациент не является носителем полиморфизма Del322-325 в гене αAR, т.е. он не является гетерозиготным или гомозиготным по данной делеции.
1
1
Другие способы предусматривают обследование данного пациента с сердечной недостаточностью, с тем чтобы определить, будет ли этот пациент давать положительный ответ на лечение буциндололом, где указанные способы включают в себя а) получение данных, указывающих (i) на наличие полиморфизма в кодирующем положении 1165 кодирующей последовательности одного или обоих генов βAR у данного пациента или (ii) на наличие полиморфизма в положении аминокислоты 389 белка βAR и b) назначение или введение буциндолола.
1
1
1
1
Кроме того, другие способы, охватываемые настоящим изобретением, предусматривают лечение пациента буциндололом и включают в себя а) получение данных, указывающих (i) на наличие полиморфизма в кодирующем положении 1165 кодирующей последовательности одного или обоих аллелей βAR у данного пациента, или (ii) на наличие полиморфизма в положении аминокислоты 389 белка βAR и b) либо назначение пациенту терапии буциндололом, где генотип данного пациента указывает на то, что он является гомозиготным по Arg389 в белке βAR, либо отказ от лечения пациента буциндололом, где генотип данного пациента указывает на то, что данный пациент не имеет гомозиготности по Arg389 в белке βAR.
1
Кроме того, следует отметить, что настоящее изобретение относится к применению буциндолола в целях приготовления лекарственного средства для лечения болезни сердца у пациентов с полиморфизмом Arg389/Arg389 в генах βAR. Варианты, обсуждаемые в связи с описанными способами, могут предусматривать применение буциндолола для получения лекарственного средства.
1
1
1
1
Кроме того, настоящее изобретение относится к взятию биологического образца у пациента, который предположительно должен быть подвергнут лечению буциндололом, и проведение анализа этого образца на полиморфизм по Arg389 путем определения либо (i) нуклеотида в положении 1165 одной или обеих кодирующих последовательностей генов βAR данного пациента, либо (ii) аминокислоты в положении 389 белков βAR у данного пациента. При этом следует отметить, что если оценивают белки βAR, то можно определить, содержит ли данный образец какие-либо белки βAR, имеющие глицин в положении 389.
2c
2c
2c
2c
Другие способы предусматривают обследование пациента с сердечной недостаточностью, с тем чтобы определить, будет ли этот пациент давать положительный ответ на лечение буциндололом, где указанные способы включают в себя а) получение данных, указывающих на то, (i) является ли нуклеотидная последовательность в положениях 964-975 делетированной в одном или обоих аллелях αAR у данного пациента или (ii) является ли аминокислотная последовательность в положениях 322-325 делетированной в белках αAR у данного пациента, и b) назначение или введение этому пациенту буциндолола. При этом следует отметить, что если оценивают белки αAR, то можно определить, содержит ли взятый образец какие-либо белки αAR, имеющие соответствующую делецию.
2c
2c
2c
2c
Кроме того, другие способы, охватываемые настоящим изобретением, предусматривают лечение пациента буциндололом и включают в себя а) получение данных, указывающих на то, (i) является ли нуклеотидная последовательность в положениях 964-975 делетированной в одном или обоих аллелях αAR у данного пациента или (ii) является ли аминокислотная последовательность в положениях 322-325 делетированной в белках αAR у данного пациента, и b) либо назначение пациенту терапии буциндололом, где генотип данного пациента указывает на то, что он имеет гомозиготность дикого типа по аллелям αAR, либо отказ от лечения пациента буциндололом, где генотип данного пациента указывает на то, что указанный пациент не имеет гомозиготности по белку αAR.
2c
Кроме того, следует отметить, что настоящее изобретение относится к применению буциндолола в целях приготовления лекарственного средства для лечения болезни сердца у пациентов с гомозиготностью дикого типа по полиморфизму в положениях 322-325 в их аллелях αAR. Варианты, обсуждаемые в связи с описанными способами, могут предусматривать применение буциндолола для получения лекарственного средства.
1
2c
1
1
2c
2c
Кроме того, настоящее изобретение относится к взятию биологического образца у пациента, который предположительно должен быть подвергнут лечению буциндололом, и анализу этого образца на полиморфизм по Arg389 в белке βAR и/или на полиморфизм Del322-325 в белке αAR путем определения (i) нуклеотида в положении 1165 одной или обеих кодирующих последовательностей аллелей βAR данного пациента или (ii) аминокислоты в положении 389 белков βAR данного пациента; либо установления (iii) наличия делеции по нуклеотидам 964-975 кодирующей последовательности одного или обоих аллелей αAR; и/или (iv) наличия делеции аминокислот в положениях 322-325 белков αAR у данного пациента.
1
Для осуществления этих способов доктор, практический врач или их консультанты могут взять биологический образец для анализа. Этот образец может быть проанализирован практическим врачом или его сотрудником либо он может быть отправлен в другое медицинское учреждение или в независимую лабораторию. Практический врач может самостоятельно установить, дает ли этот тест информацию о генах или аллелях βAR данного пациента, отличающихся от кодируемых белков, либо практический врач может знать только то, что этот тест прямо или косвенно указывает на то, что генотип данного пациента характеризуется фенотипом Gly389/Gly389 (последовательность, “гомозиготная по Gly”), фенотипом Arg389/Gly389 (“гетерозиготная” последовательность) или фенотипом Arg389/Arg389 (последовательность, “гомозиготная по Arg”, или “гомозиготная последовательность дикого типа”).
2c
Аналогичным образом практический врач может сам установить, дает ли этот тест информацию о генах или аллелях αAR у данного пациента, отличающихся от кодируемых белков, либо практический врач может знать только то, что этот тест прямо или косвенно указывает на то, что генотип данного пациента имеет гомозиготную последовательность дикого типа (с отсутствием делеции в любом из аллелей), фенотип гетерозиготности по Del322-325 (“гетерозиготную” последовательность) или фенотип Del322-325/Del322-325 (“последовательность, гомозиготную по делеции”).
1
2c
В некоторых вариантах, обсуждаемых в примерах, пациент, имеющий последовательность, гетерозиготную или гомозиготную по Gly в гене βAR, называется “носителем Gly”. Аналогичным образом, пациент, имеющий последовательность, гетерозиготную или гомозиготную по делеции в гене αAR, называется “носителем Del322-325” или “носителем делеции”.
В любом из этих вариантов практический врач “владеет” соответствующей информацией, которая позволяет ему определить, является ли буциндолол подходящим лекарственным средством. При этом предусматривается, что тест, позволяющий определить генотип пациента, дающий соответствующую персональную информацию о данном пациенте, может быть проведен, например, в лаборатории. Эти данные могут быть отправлены практическому врачу с конкретным результатом проведенного теста, либо сотрудники лаборатории могут просто сообщить, что на основании лабораторных данных буциндолол является подходящим лекарственным средством.
1
1
1
В других вариантах изобретения генотип пациента в положении нуклеотида 1165 кодирующей последовательности одного или обоих аллелей βAR является известным. В соответствии с настоящим изобретением большое значение имеет факт присутствия или отсутствия гуанина или цитозина в положении 1165 кодирующей последовательности одного или обоих аллелей. Это означает, что необходимо знать, которая из аминокислот может присутствовать в положении 389 последовательности белка βAR. В положении 1165 кодирующей последовательности цитозин кодирует аргинин, а гуанин кодирует глицин. В конкретных вариантах изобретения последовательности в положении 1165 в обоих аллелях βAR у данного пациента являются известными. Таким образом, в обоих аллелях может присутствовать гуанин, в обоих аллелях может присутствовать цитозин либо в одном аллеле может присутствовать гуанин, а в другом аллеле может присутствовать цитозин.
2c
2c
2c
1
В некоторых вариантах изобретения генотип пациента, определяемый положениями нуклеотидов 964-975 кодирующей последовательности одного или обоих аллелей αAR, является известным. В соответствии с настоящим изобретением важное значение имеет тот факт, присутствует ли делеция в одном или обоих аллелях гена αAR. Это означает, что необходимо определить, присутствует ли делеция аминокислот в положениях 322-325 (аминокислоты 322, 323, 324 и 325) последовательности белка αAR. В конкретных вариантах изобретения наличие или отсутствие делеции в нуклеотидной последовательности, соответствующей положениям 964-975 в обоих аллелях βAR у данного пациента, является установленным фактом.
Для специалиста в данной области очевидно, что кодирующей последовательностью гена называется цепь гена, которая используется для транскрипции информационной РНК. Такая кодирующая последовательность комплементарна последовательности транскрибируемого транскрипта. Из-за комплементарности между кодирующей и некодирующей последовательностями, последовательность любой кодирующей последовательности может быть определена путем секвенирования транскрипта, некодирующей цепи или кодируемого белка. Нуклеиновая кислота в этом положении в одном или обоих аллелях может быть определена различными методами, известными специалистам. Такими методами являются, не ограничиваясь ими, секвенирование путем терминации цепи, гидролиз рестриктирующими ферментами, аллель-специфическая полимеразная реакция, анализ на одноцепочечный конформационный полиморфизм, анализ генетической информации, гель-электрофорез в градиенте температур или лигазная цепная реакция.
1
1
1
1
2c
2c
Альтернативно может быть определена последовательность белка βAR. В некоторых вариантах изобретения аминокислота в положении 389 в одном или в нескольких белках βAR у указанного пациента является известной. При этом следует отметить, что любой образец, взятый у пациента, будет содержать множество белков βAR, которые могут быть проанализированы. Анализ этих белков позволяет определить, имеет ли данный пациент белки βAR, в которых в положении 389 присутствует только аргинин, только глицин или смесь того и другого. Аналогичным образом может быть определена последовательность белка αAR. В конкретных вариантах изобретения наличие или отсутствие делеции в аминокислотах 322-325 в одном или нескольких белках αAR у данного пациента является известным.
1
2c
1
2c
При этом предполагается, что любой образец, взятый у пациента, будет содержать множество белков βAR и αAR, которые могут быть проанализированы. Анализ этих белков позволяет определить, имеет ли данный пациент белки βAR, в которых в положении 389 присутствует только аргинин, только глицин или тот и другой. Аналогичным образом может быть определено, присутствуют ли у данного пациента белки αAR, имеющие только последовательность дикого типа в положениях аминокислот 322-325 (без делеции), или только делецию аминокислот, соответствующих аминокислотам 322-325, или то и другое.
Методы определения последовательности в конкретных положениях белка хорошо известны специалистам в данной области. Эти методы могут предусматривать применение антител, жидкостной хроматографии высокого давления или масс-спектроскопии.
1
2c
1
2c
Как обсуждалось выше, нуклеотид в конкретном положении последовательности гена или белка βAR и/или гена или белка αAR может быть известен. Некоторые способы настоящего изобретения включают в себя определение последовательности гена или белка βAR и/или последовательности гена или белка αAR.
Следовательно, подразумевается, что некоторые варианты изобретения могут включать в себя взятие биологического образца у пациента. Биологическим образцом является образец, содержащий биологический материал, такой как целый орган или его часть, ткань, клетки, нуклеиновые кислоты, белки или другие макромолекулы и вещества. Указанный образец может включать в себя мокроту, сыворотку, кровь, плазму, цереброспинальную жидкость, сперму, лимфатическую жидкость, мочу, кал, плевральные выпоты, асцитную жидкость, ткань, биоптат ткани, клеточный мазок или их комбинацию. В других вариантах изобретения образец может включать в себя клетки легких, кожи, мышц, печени, почек, толстой кишки, предстательной железы, молочной железы, головного мозга, мочевого пузыря, тонкой кишки, толстой кишки, шейки матки, желудка, поджелудочной железы, яичек, яичника, кости, костного мозга или позвоночника. В некоторых вариантах изобретения таким образцом является цельная кровь, плазма или сыворотка, а в других вариантах изобретения указанный образец получают в виде лаважа, мазка или тампона, взятых с поверхности или из внутренних участков организма пациента. В некоторых вариантах изобретения указанным биологическим образцом является проба крови.
1
2c
1
2c
1
1
2c
2c
В некоторых вариантах изобретения последовательность генов и/или белков βAR данного пациента и/или последовательность генов или белков αAR данного пациента могут быть уже проанализированы. Следует отметить, что этот анализ может быть проведен до назначения пациенту лечения буциндололом либо он может быть проведен во время общего обследования. Так, например, последовательность генов и/или белков βAR данного пациента, а также последовательность генов и/или белков αAR указанного пациента могут быть определены и введены в базу данных либо они могут быть включены в медицинскую карту истории болезни пациента. В этом случае лечащий врач может получить сведения о последовательности пациента, имеющейся в его медицинской карте, т.е. данные о последовательности (i) в положении 1165 в кодирующей последовательности одного или обоих аллелей βAR или (ii) в положении 389 в аминокислотной последовательности белка βAR; (iii) в положениях 964-975 в кодирующей последовательности одного или обоих аллелей αAR и/или (iv) в положениях 322-325 аминокислотной последовательности белка αAR.
1
2c
Настоящее изобретение относится также к получению данных о последовательности нуклеиновой кислоты или белка в соответствующем положении в аллелях или в белке βAR и/или в аллелях или в белке αAR. В некоторых вариантах изобретения такие способы включают в себя подготовку отчета, включающего результаты определения данных по пунктам (i), (ii), (iii) и/или (iv), описанным в предыдущем абзаце. В таком отчете должно быть указано имя пациента, номер его социальной страховки и/или другой идентификационный номер или квалификационный признак. Этот отчет может также содержать фактические данные, полученные в процессе определения или систематизации этих данных.
В некоторых вариантах изобретения такие способы включают в себя выявление пациента, который, возможно, нуждается в лечении буциндололом. Пациент, для которого было выбрано лечение буциндололом, может иметь симптомы патологического состояния или у него может быть диагностировано патологическое состояние, такое как сердечная недостаточность, застойная кардиомиопатия, ишемическая болезнь сердца, феохромоцитома, мигрень, сердечные аритмии, гипертензия или тревожное состояние. В некоторых вариантах изобретения у пациента имеются симптомы ишемической болезни сердца либо у него была диагностирована ишемическая болезнь сердца, которою может быть, в частности, стенокардия и/или инфаркт миокарда. В конкретных случаях у пациента имеются симптомы сердечной недостаточности либо у него была диагностирована сердечная недостаточность. Такой сердечной недостаточностью может быть запущенная сердечная недостаточность, хотя настоящее изобретение не ограничивается такими пациентами. Термин “прогрессирующая сердечная недостаточность” используется здесь в своем обычном значении, понятном специалистам-кардиологам. В некоторых вариантах изобретения у пациента, которому назначают буциндолол, может наблюдаться сердечная недостаточность класса III или класса IV в соответствии с системой Классификации сердечной недостаточности Нью-Йоркской ассоциации кардиологов (NYHA). Система классификации NYHA представляет собой одну из систем оценок, однако в этой связи следует отметить, что настоящее изобретение не ограничивается этой системой, и она упоминается здесь лишь в иллюстративном, но не ограничивающим смысле. Пациенты могут быть классифицированы по другой системе. Следует также отметить, что пациенты могут быть классифицированы и по другой методике, однако это не должно влиять на результаты настоящего изобретения.
1
В других вариантах изобретения у пациента могут наблюдаться признаки или симптомы сердечной недостаточности, но не прогрессирующей сердечной недостаточности. В этом случае данный пациент может иметь сердечную недостаточность либо он может быть охарактеризован как пациент с сердечной недостаточностью класса I или II в соответствии с системой классификации NYHA. В этих вариантах изобретения данный пациент может быть генотипирован по полиморфизму Arg389β, и в этом случае пациент с фенотипом Arg/Arg является кандидатом на лечение буциндололом. Следовательно, способы согласно изобретению могут включать в себя предупреждение сердечной недостаточности у пациента путем определения наличия или отсутствия у данного пациента полиморфизма Arg389/Arg389, и введения буциндолола, если такой полиморфизм имеется. Конкретными пациентами, которым может быть назначено такое лечение, являются, без ограничения ими, пациенты с симптомами сердечной недостаточности, с факторами риска развития сердечной недостаточности либо с наследственностью или предрасположенностью к данному заболеванию.
Кроме того, такие способы могут включать в себя введение или назначение других терапевтических средств или проведение хирургической операции или других радикальных мер для лечения данного пациента.
2c
2c
Способы в соответствии с настоящим изобретением могут также включать в себя назначение или введение буциндолола пациенту после установления наличия у данного пациента генотипа с полиморфизмом в положении 389, а именно Arg389/Arg389, также известного как генотип, гомозиготный по аргинину. Дополнительно или альтернативно буциндолол может быть прописан или введен пациенту после установления наличия у данного пациента гомозиготного полиморфизма дикого типа по αAR (т.е. отсутствие делеции нуклеотидов 964-975 в любом аллеле гена αAR). Кроме того, может быть также рассмотрен случай, когда пациенту, который не имеет одного из указанных генотипов или обоих этих генотипов, не назначают или не вводят буциндолол. Указанному пациенту может быть назначен или введен β-блокатор, который, в частности, не является буциндололом.
2c
2c
1
В других вариантах изобретения способы согласно изобретению могут включать в себя установление наличия или отсутствия делеции (iii) в положениях 964-975 в нуклеотидной кодирующей последовательности одного или обоих генов αAR у данного пациента или (iv) в аминокислотной последовательности в положениях 322-325 одного или нескольких белков αAR данного пациента. Это может быть определено помимо или независимо от генотипа данного пациента в гене βAR в положении 1165 (белок в положении 389).
2c
2c
Если пациент с прогрессирующей сердечной недостаточностью (т.е. класса III или IV по NYHA) имеет генотип с гомозиготностью по αAR Del322-325, но не имеет генотип Arg389/Arg389, то такому пациенту не назначают или не вводят буциндолол. В некоторых вариантах изобретения такой пациент идентифицируется как индивидуум, принадлежащий к негроидной расе. Альтернативно, если данный пациент не имеет генотип с гомозиготностью αAR Del322-325, то этому пациенту может быть назначен или введен буциндолол.
Для того чтобы определить, является ли буциндолол подходящим лекарственным средством для пациента, могут быть также использованы и другие данные. Такими данными могут быть раса, пол, возраст, перенесенные ранее хирургические операции, стадия сердечной недостаточности, история болезни, относящаяся к сердечно-сосудистым заболеваниям, наличие других заболеваний или состояний, риск возникновения других заболеваний или состояний, аллергии на лекарственные средства, токсичность лекарственного средства и/или применение другой лекарственной терапии.
1
2c
Поэтому настоящее изобретение также относится к проведению анализа на диплотип или к получению результатов анализа на диплотип. В конкретных вариантах изобретения анализ на диплотип включает в себя прямое или опосредованное выявление полиморфизма (1) в положении 389 βAR с тем, чтобы определить, имеется ли у пациента генотип Arg389/Arg389, и (2) в положениях 322-325 αAR с тем, чтобы определить, имеется ли у пациента генотип Del322-325/Del322-325. В гаплотипе может присутствовать и полиморфизм другого типа, в частности полиморфизм такого типа, на который оказывает влияние или который сам оказывает влияние на способность пациента давать положительный ответ на введение буциндолола, используемого в качестве терапевтического средства.
1
2c
1
2c
Любой вариант, обсуждаемый в соответствии с одним из аспектов изобретения, также может быть рассмотрен в других аспектах изобретения. Эти аспекты включают в себя варианты, обсуждаемые для каждого из βAR и αAR. В частности, любой вариант, в котором обсуждаются гены, аллели или белки βAR, может быть также осуществлен и для генов, аллелей или белков αAR, и наоборот.
Варианты, описанные в разделе “Примеры”, рассматриваются как варианты настоящего изобретения, которые могут быть осуществлены во всех аспектах изобретения.
Союз “или” используется в формуле изобретения как “и/или” и, если это не оговорено особо, означает только альтернативные варианты либо эти альтернативные варианты являются взаимоисключающими, хотя в описании изобретения допускается определение, которое означает только альтернативные варианты и “и/или”.
В настоящей заявке термин “примерно” используется для указания величины, которая включает в себя стандартное отклонение ошибки для данного устройства или метода, используемых для определения этой величины.
В соответствии с давно действующим патентным законом указание на признак в единственном числе в формуле изобретения или в описании изобретения, в сочетании со словом “включающий”, означает как единственное, так и множественное число, если это не оговорено особо.
Другие цели, отличительные признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из нижеследующего подробного описания. Однако следует отметить, что подробное описание и конкретные примеры с описанием конкретных вариантов изобретения приводятся лишь в целях иллюстрации, поскольку различные изменения и модификации, которые будут очевидны для специалиста в данной области исходя из подробного описания изобретения, также входят в объем и сущность настоящего изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА
Нижеследующий графический материал является частью настоящего описания и дополнительно иллюстрирует некоторые аспекты настоящего изобретения. Для лучшего понимания настоящего изобретения в нижеследующем описании приводятся ссылки на одну или несколько из указанных схем, таблиц и графиков в сочетании с подробным описанием представленных здесь конкретных вариантов изобретения.
На фиг.1 представлены химические структуры нескольких β-блокаторов, включая буциндолол.
На фиг.2 представлена схема сравнения различных антиадренергических агентов и способов лечения на основании данных клинических исследований сердечной недостаточности в фазе II или III или в экспериментальных разработках.
1
1
На фиг.3 проиллюстрированы аллель-специфические эффекты буциндолола в клетках, стабильно экспрессирующих βArg389 или βGly389. Данные приводятся как среднее (ср.кв.от. для 4 экспериментов).
1
1
1
1
На фиг.4 представлена гистограмма, иллюстрирующая ответ на β-блокаду у трансгенных мышей с направленной сверхэкспрессией Gly389 и Arg389 βAR в сердце. Результаты вестерн-блот-анализа даны как среднее (ср.кв.от.) для указанных белков сердца β-Arg389- и β-Gly389-мышей (n=3-4 в каждой группе). Данные были нормализованы по величинам, полученным для контроля (необработанных мышей). Общий ответ на лечение пропранололом наблюдался только в сердце β-Arg389-мышей (P<0,002, ANOVA).
1
На фиг.5 проиллюстрированы отношения рисков и 95% доверительные интервалы исходов сердечной недостаточности, стратифицированных по βAR-генотипу.
1
На фиг.6 представлена кривая выживаемости пациентов в испытаниях с применением буциндолола-плацебо, стратифицированных по способу лечения и βAR-генотипу.
1
На фиг.7 представлен график, иллюстрирующий вероятность осуществления конечных событий, а именно летального исхода или госпитализации по поводу сердечной недостаточности в испытаниях с применением буциндолола-плацебо, стратифицированных по способу лечения и βAR-генотипу.
На фиг.8 проиллюстрированы изменения уровней норэпинефрина (ср.кв.от. по сравнению с фоновыми уровнями через 3 и 12 месяцев для группы, подвергаемой лечению. На панелях А и В числа под гистограммами означают число пациентов в каждой группе, которым проводили измерения до испытания и через определенный указанный интервал времени; величины р даны для сравнения изменений для каждой группы обработки.
На фиг.9 представлен график отношений рисков относительно первого квартиля смертности по всем нозологическим формам заболевания, определяемого по квартилю базового уровня норэпинефрина. Разделяющими точками для норэпинефрина, определяющими квартили, являются: 1-й ≤304 пг/мл; 2-й 305 пг/мл - 436 пг/мг; 3-й 437 пг/мл - 635 пг/мл; 4-й ≥636 пг/мл. Число пациентов на квартиль составляет для группы, получавшей плацебо: 1-й 294; 2-й 255, 3-й 248, 4-й 264; для группы, получавшей буциндолол: 1-й 239; 2-й 274, 3-й 284, 4-й 267.
На фиг.10 представлен график отношений рисков относительно первого квартиля для общего конечного показателя “смертность по всем нозологическим формам заболевания+госпитализация по поводу ЗСН”, определяемого по квартилю фонового норэпинефрина.
На фиг.11 проиллюстрированы вероятностные анализы на изменение уровней норэпинефрина через 3 месяца для оценки смертности по всем нозологическим формам заболевания для групп, получавших плацебо и буциндолол.
1
На фиг.12 показано, что сократительная реакция ex vivo желудочков у человека с отсутствием сердечной недостаточности и с наличием сердечной недостаточности коррелирует с βAR-генотипом. Были использованы трабекулы правого желудочка, взятые из сердца человека, не имеющего и имеющего сердечную недостаточность, как описано в разделе “Методы”. Трабекулы, полученные от 11 сердец, исследовали для каждой из четырех групп. Все Arg-линии было получены от гомозиготных индивидуумов. Gly-носители состояли из 10 гетерозигот в группе, не имеющей сердечной недостаточности, и из 9 гетерозигот в группе, имеющей сердечную недостаточность, а остальные индивидуумы были гетерозиготными по Gly. Максимальный ответ, полученный из кривой “доза-ответ”, был выше для Arg389, как показали испытания с участием индивидуумов с отсутствием сердечной недостаточности (P=0,01) и индивидуумов с наличием сердечной недостаточности (P=0,008).
2
-5
-9
-6
-9
-6
На фиг.13A-D проиллюстрировано влияние увеличения доз буциндолола или ксамотерола на максимальную систолическую силу сокращения (систолы) (мН/мм) в выделеной трабекуле правого желудочка, взятой из сердца человека с сердечной недостаточностью. Кривые “доза-ответ” были построены без предварительной обработки (буциндолол, панель А; ксамотерол, панель С) и с предварительной обработкой (буциндолол, панель В; ксамотерол, панель D) 10 М форсколина для усиления трансдукции сигнала β-AR. В экспериментах с предварительной обработкой форсколином трабекулу, обработанную лишь одним форсколином, инкубировали в течение всего периода обработки, и любые эффекты, влияющие на силу сокращений, вычитали из величин, полученных для трабекул, обработанных буциндололом или ксамотеролом. *=p<0,05 по сравнению с исходным напряжением; † p<0,10 по сравнению с исходным напряжением; § p<0,05 по сравнению с углом наклона 0 для всей кривой; ¶ p<0,05 по сравнению с углом 0 для доз 10 M - 10 M; величины p в скобках даны для теста на взаимосвязь между наклонами кривых, где 1-е значение р дано для доз 10 M - 10 M; а 2-е значение дано для всей кривой.
1
На фиг.14 проиллюстрированы противоположные последствия непрерывной стимуляции β-адренергической стимуляции миокарда.
На фиг.15 описаны изменения уровней норэпинефрина в группах риска и у пациентов, принимавших буциндолол, в таблице приведены стандартные отклонения (ср.кв.от.).
На фиг.16 описаны дополнительные изменения уровней норэпинефрина в группах риска и у пациентов, принимавших буциндолол. В таблице приведены стандартные отклонения (ср.кв.от.).
2c
На фиг.17 проиллюстрирована корреляция между генотипом αAR и системными уровнями норэпинефрина у пациентов в испытаниях BEST.
2c
На фиг.18 проиллюстрирована корреляция между генотипом αAR и системным ответом на норэпинефрин (пг, ср.кв.от.) у пациентов в испытаниях BEST через три месяца.
2c
На фиг.19 проиллюстрирована корреляция между генотипом αAR, системным ответом пациентов на норэпинефрин (пг, ср.кв.от.) у пациентов через три месяца после начала испытаний BEST и выживаемостью BEST-пациентов в группе, подвергаемой лечению.
1
1
1
1
1
На фиг.20A-D проиллюстрировано влияние вариантов генов β-AR Arg/Gly 389 на реакцию человеческой трабекулы RV в ответ на изопротеренол. A. Ответ пациента с сердечной недостаточностью, гомозиготного по гену βAR Arg 389, на введение изопротеренола (Iso). B. Ответ пациента с сердечной недостаточностью, несущего βAR Gly 389, на введение Iso. C. Ответ пациента, не страдающего сердечной недостаточностью и гомозиготного по гену βAR Arg 389, на введение Iso. D. Ответ пациента, не страдающего сердечной недостаточностью и несущего βAR Gly 389, на Iso.
2c
1
На фиг.21 показаны варианты гена αAR и βAR: эффективность лечения в испытаниях BEST (смертность).
На фиг.22 проиллюстрированы испытания на выживаемость при лечении β-блокатором, проводимые с участием американцев; отношения рисков летального исхода с ±95% доверительным интервалом.
На фиг.23 проиллюстрировано влияние β-блокаторов на систолическую функцию в трабекуле правого желудочка индивидуума, не страдающего сердечной недостаточностью (NF hRV-трабекуле).
На фиг.24 проиллюстрировано влияние β-блокаторов на систолическую функцию в NF hRV-трабекуле с усилением передачи сигнала после лечения 10 мкМ форсколином (F).
На фиг.25 проиллюстрировано влияние β-блокаторов на систолическую функцию в трабекуле правого желудочка индивидуума, страдающего сердечной недостаточностью.
На фиг.26 проиллюстрировано влияние β-блокаторов на систолическую функцию в трабекуле правого желудочка индивидуума, страдающего сердечной недостаточностью, с усилением передачи сигнала после введения 10 мкМ форсколина (F).
На фиг.27. Протокол исследования I.
На фиг.28. Протокол исследования II.
На фиг.29. Протокол исследования III.
ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАТИВНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Исходя из некоторых критериев авторы настоящего изобретения выразили свое несогласие с тем, что буциндолол оказывает менее благоприятное терапевтическое действие на пациентов некоторых подгрупп и менее благоприятное действие, чем другие β-блокаторы. Авторы высказали предположение, что вариабельность ответов на введение буциндолола у пациентов с сердечной недостаточностью (СН) обусловлена генетической вариабельностью, которая лежит в основе оценки такого ответа. В соответствии с этим авторам настоящего изобретения удалось доказать терапевтическую ценность буциндолола и возможность его применения для лечения сердечной недостаточности у человека.
1
Была проанализирована генетическая вариабельность белка βAR в аминокислоте 389 (в нуклеиновой кислоте 1165 гена). Такой анализ был проведен исходя из свойств двух рецепторов, обозначенных здесь Arg389 и Gly389, в трансфицированных клетках, где активности базальной и стимулируемой агонистом аденилил-циклазы приблизительно в 3 раза превышают активность Arg-рецептора (Mason et al., 1999). Однако до проведения настоящих исследований не было точно известно, будет ли у пациентов с Arg389 или Gly389 вырабатываться наиболее благоприятный эффект на лечение буциндололом. Так, например, повышенная функция Arg389 может предотвращать действие буциндолола в качестве эффективного антагониста. Окончательная проверка этой гипотезы, целью которой была оценка на летальный исход, трансплантацию сердца или на госпитализацию по поводу СН (при обострении сердечной недостаточности у конкретного пациента, принимавшего плацебо или буциндолол), не была проведена.
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2+
Таким образом, авторами настоящего изобретения был поставлен вопрос, представляет ли аллель Arg (или Gly) 389 βAR фармакогенетический локус, который позволяет предсказать ответ на лечение сердечной недостаточности β-блокаторами с применением трехступенчатого метода, включающего исследования на трансфицированных клетках (см. пример 1, подробно описанный ниже), на трансгенных мышах (см. пример 2, подробно описанный ниже), и обширное многоцентровое плацебо-контролируемое клиническое исследование (см. пример 3, подробно описанный ниже). Такое клиническое исследование было названо BEST (исследование на выживаемость при лечении β-блокатором). Трансфицированные клетки оценивали на функциональное антагонистическое действие буциндолола на уровни стимулируемого норэпинефрином сАМР. Даже если рецептор Arg389 обнаруживал значительно более высокий уровень продуцирования сАМР, стимулируемого норэпинефрином, то буциндолол подавлял этот ответ. Абсолютное уменьшение уровня продуцирования сАМР было значительно выше в клетках, экспрессирующих Arg389, чем в клетках, экспрессирующих Gly389, что обусловлено высоким уровнем стимуляции Arg389 норэпинефрином и способностью буциндолола полностью подавлять такой ответ. Приблизительно 80%-ное ингибирование сАМР-ответа в Arg389 наблюдалось при концентрации 0,1 мкМ буциндолола, которая сравнима с концентрациями этого лекарственного средства в плазме, вводимого в дозах, используемых в испытании BEST (данные не опубликованы). Эти результаты дают основание предположить, что после лечения буциндололом у пациентов с генотипом β-Arg389 может наблюдаться большее изменение сердечной βAR-активности, чем у пациентов с генотипом β-Gly389, и это может приводить к более благоприятному клиническому ответу. В исследованиях на трансгенных мышах авторами настоящего изобретения была проведена оценка влияния 6-месячной β-блокады на экспрессию ключевого сигнала и Ca-траспортирующих белков. Что касается Gly389-мышей, то какого-либо влияния такой обработки на экспрессию этих белков не наблюдалось. С другой стороны, общий эффект обработки посредством β-блокады наблюдался у Arg389-мышей с изменениями, которые соответствовали реверсии ремоделирования на молекулярном уровне. Затем исходя из результатов, полученных для трансфицированных клеток и трансгенных мышей, использовали архивированную ДНК, полученную в исследовании BEST, которое позволяет проводить широкомасштабное фенотипирование, и соответствующую плацебо-группу; при этом авторами настоящего изобретения была высказана a priori гипотеза, что β-Arg389 должен представлять собой наиболее благоприятный генотип для выживаемости. В настоящей работе была предложена доминантная модель. Таким образом, были выбраны две генотипические группы: пациенты, гомозиготные по Arg389, и пациенты с одной или двумя аллелями Gly389 (т.е. гомозиготные по Gly или гетерозиготные; эта группа была названа "Gly389-носителями"). Клинические результаты по конечной цели исследований BEST не показали положительного эффекта лечения буциндололом в отношении летальных исходов, госпитализации по поводу сердечной недостаточности или летальных исходов + госпитализации по поводу сердечной недостаточности у пациентов, которые являются β-Gly389-носителями, но при этом наблюдалось клинически релевантное улучшение по всем трем результатам у β-Arg389-гомозиготных пациентов, принимавших буциндолол, по сравнению с пациентами, принимавшими плацебо. Базовые клинические параметры, включающие частоту сердечных сокращений, кровяное давление и фракцию выброса крови левым желудочком (LVEF), или этиология сердечной недостаточности, не являются прогностическими факторами в отношении ответа по указанным конечным событиям у всех пациентов, которые являются носителями всех вариантов генов βAR. Кроме того, какого-либо заметного влияния полиморфизма β-Gly49 на взаимосвязь этих параметров не наблюдалось. В целом, результаты этих исследований дают веские основания предполагать, что положение 389 варианта βAR является прогностическим фактором для ответа на лечение сердечной недостаточности буциндололом.
2c
2c
2c
2c
2c
2c
2c
2c
2c
2c
Кроме того, было также высказано предположение, что генетический вариант гена αAR играет определенную роль в предсказании эффективности буциндолола. Авторами настоящего изобретения было высказано предположение, что вариабельность между индивидуумами в ответах на лечение сердечной недостаточности буциндололом обусловлена генетической вариабельностью гена αAR. Таким образом, авторами настоящего изобретения был поставлен вопрос, представляет ли аллель Del322-325 αAR фармакогенетический локус, который позволяет предсказать ответ на лечение сердечной недостаточности буциндололом в испытании BEST, т.е. в обширном многоцентровом плацебо-контролируемом клиническом исследовании (см. примеры, подробно обсуждаемые ниже). Затем исходя из испытаний BEST, которое позволяет проводить широкомасштабное фенотипирование, использовали архивированную ДНК и соответствующую плацебо-группу. В настоящей работе была предложена доминантная модель. Таким образом были выбраны две генотипические группы: пациенты, гомозиготные по α (пациенты с отсутствием делеции в положениях 322-325 на любом из аллелей) и пациенты, гетерозиготные или гомозиготные по αDel322-325 (пациенты, имеющие делецию в одном или в обоих аллелях, называемые “αDel322-325-носителями”). Клинические результаты по конечной цели исследований BEST не показали положительного эффекта лечения буциндололом в отношении летальных исходов, госпитализации по поводу сердечной недостаточности или летальных исходов+госпитализации по поводу сердечной недостаточности у пациентов, которые являются αDel322-325-носителями, но при этом наблюдалось клинически релевантное улучшение по всем трем показателям у пациентов, гомозиготных по α дикого типа, и пациентов, принимавших буциндолол, по сравнению с пациентами, принимавшими плацебо. Базовые клинические параметры, включающие частоту сердечных сокращений, кровяное давление и фракцию выброса крови левым желудочком (LVEF), или этиология сердечной недостаточности, не являются прогностическими факторами в отношении ответа к конечным событиям у всех пациентов, которые являются носителями всех вариантов генов αAR. В целом, результаты этих исследований дают веские основания предполагать, что положение полиморфизма αDel322-325 является прогностическим фактором для ответа на лечение сердечной недостаточности буциндололом.
1
2c
Поэтому настоящее изобретение относится к способам, основанным на генетической взаимосвязи между полиморфизмом Arg389 βAR и терапией буциндололом и между полиморфизмом αAR Del322-325 и терапией буциндололом.
Адренергические рецепторы и β-блокаторы
I.
Лечение сердечной недостаточности основано на доставке адренергических рецепторов (AR). Существует по меньшей мере девять подтипов адренергических рецепторов (Dohlman et al., 1991; Liggett et al., 1993), из которых по меньшей мере три подтипа являются β-адренергическими рецепторами.
1
2c
Общими генетическими вариантами, которые могут играть определенную роль в восприимчивости к лечению, в прогрессировании заболевания и в ответе на его лечение, предположительно являются совокупность наследственных фенотипов, пониженная пенетрантность при врожденных кардиомиопатиях и заметная вариабельность между индивидуумами в прогрессировании заболевания и в исходах лечения. При идентификации полиморфизма в адренергических рецепторах нет необходимости исследовать данные пациентов, у которых была идентифицирована корреляция между любым полиморфизмом и клиническим ответом на терапевтическое средство. Настоящее изобретение относится к полиморфизму двух типов: 1) к полиморфизму, кодирующему аминокислоту в положении 389 в βAR, и 2) к полиморфизму, кодирующему аминокислоты в положениях 322-325 в αAR. Однако с использованием каких-либо клинических данных, полученных до появления настоящего изобретения, не была установлена какая-либо взаимосвязь между этими конкретными генетическими вариантами и любым исходом лечения, а также не была продемонстрирована какая-либо корреляция между ними с использованием буциндолола.
β
-Адренергический рецептор
1
А.
1
1
1
2
β-Адренергический рецептор (β-AR) представляет собой основной подтип, экспрессируемый на сердечных миоцитах. В человеческом сердце экспрессируются подтипы βAR и βAR (Bristow et al., 1986; Bristow et al., 1988). Каждый рецептор опосредует позитивные инотропные и хронотропные ответы на эндогенные катехоламины и экзогенно вводимые агонисты (Bristow et al., 1986; Brodde et al., 1986; Brodde et al., 1992).
1
1
1
1
1
1
Рецептор βAR при его активации стимулирует сократирельную реакцию сердца, аналогично ответной реакции на норэпинефрин. Кроме того, β-рецептор играет ключевую роль в прогрессировании кардиомиопатии и других патологических процессов. Повышенная активация этого рецептора и ассоциированные с ним миопатии и аритмии играют важную роль в природной этиологии сердечной недостаточности. После запуска кардиомиопатического процесса постоянная активация β-адренергических рецепторов ускоряет прогрессирование заболевания, поскольку при сердечной недостаточности существует тенденция к компенсации нарушенной сердечной функции посредством высвобождения норэпинефрина и увеличения уровня передачи сигнала β-рецептором. Теория блокады β-рецептора основана отчасти на подавлении этого кардиомиопатического пути путем блокады β-рецептора и снижения уровня норэпинефринового сигнала.
1
1
β-Адренергический рецептор был клонирован и секвенирован (Frielle et al., 1987). Его ген локализован на участке q24-q26 хромосомы 10 (Yang-Feng et al., 1990). Была выведена аминокислотная последовательность человеческого βAR, которая состоит из 477 аминокислот.
1
S
1
1
1
В человеческой популяции в положении кодирующего нуклеотида 1165 гена βAR присутствует либо цитозин, либо гуанин, в результате чего в положении аминокислоты 389 кодируется либо Arg, либо Gly (Mason et al., 1999). Это положение находится во внутриклеточном домене рецептора, который связывается со стимулирующим G-белком, G. В фибробластах, трансфицированных для экспрессии равных уровней указанных двух рецепторов, рецептор β-Arg389 обнаруживает гораздо большую стимуляцию аденилилциклазы, чем рецептор β-Gly389 (Mason et al., 1999). Был также идентифицирован менее распространенный полиморфизм βAR, а именно Gly49, но относительно его функциональной роли имеются противоречивые данные (Rathz et al., 2002; Levin et al., 2002).
1
1
1
Полиморфизм 389Arg/Arg β-AR является фактически наиболее преобладающей формой β-адренергического рецептора и присутствует примерно у 50% всего населения США (несколько реже у афроамериканцев). Другой вариант этого рецептора имеет глицин (Gly) в положении 389 и рассматривается как вариант дикого типа только потому, что он был клонирован первым. Структура рецептора, где в кодоне 389 присутствует аргинин (Arg), является предпочтительной (и только она) структурой у всех других известных животных, не являющихся человеком, а положение 389 присутствует в важном функциональном домене. 389Arg/Arg также имеет наиболее высокую функциональную вариабельность в данном рецепторе (Mason et al., 1999), а его эффективность в передаче сигнала в 3-4 раза превышает эффективность Gly-гетерозигот или Gly/Gly в положении 389 (см. примеры и работу Mason et al., 1999). Повышенная способность к передаче сигнала 389Arg/Arg β-AR используется для генерирования cAMP (Mason et al., 1999), сокращения отдельно сердечной мышцы человека (Mason et al., 1999) и для продуцирования кардиомиопатии у трансгенных мышей (Mialet Perez et al., 2003).
1
Некоторые β-блокаторы были оценены с точки зрения специфических генетических изменений с различными результатами. Sofowora и др. сообщали, что пациенты, гомозиготные по Gly389, являются менее восприимчивыми к воздействию атенолола, селективного β-адренергического рецептора, на что указывают гемодинамические ответы, и исходя из этого авторами было высказано предположение, что такая вариабельность может оказаться релевантной для поддержания стабильного кровяного давления. Johnson и др. (1993) сообщали, что гомозиготы по Arg389, вероятно, более восприимчивы к метопрололу, селективному β-блокатору, как было показано путем измерения кровяного давления. Perez и др. (2003) проанализировали варианты в положении 389 βAR с точки зрения их влияния на интактную сердечную функцию с применением направленного трансгенеза у мышей. У этих трансгенных мышей, сверхэкспрессирующих любые рецепторы, гомозиготные по Arg или Gly в положении 389, Arg/Arg-мыши обнаруживали значительную потерю восприимчивости к изопротеренолу, усиливающему функцию миокарда, и более высокую степень кардиомиопатии, оцениваемую по нарушению функции миокарда и степени ремоделирования сердечной полости, а также с помощью гистологического анализа. Этими авторами также сообщалось о значительном улучшении функции левого желудочка у пациентов, принимавших карведилол, т.е. неселективный β-блокатор, которое ассоциировалось с полиморфизмом Arg389 как у гомозиготных, так и гетерозиготных пациентов.
Liu и др. (2003) сообщали об обнаружении того факта, что больший ответ (с точки зрения изменения частоты сердечных сокращений) на введение метопролола ассоциировался с Arg389, но не с Gly389. Эти авторы также предостерегали против применения этих результатов для групп, не относящихся к группам обследуемых ими пациентов, которыми были молодые и здоровые мужчины китайцы, добровольно участвующие в эксперименте. Эти авторы указывают, что в этом исследовании не рассматривались какие-либо длительные эффекты метопролола в связи с полиморфизмом.
1
В обзорной статье, опубликованной в 2004 г. (Lohse, 2004), указывалось, что хотя полиморфизм Arg389 может оказаться релевантным фактором в отношении благоприятного эффекта лечения β-блокаторами, однако какого-либо исследования по влиянию полиморфизма β-адренергических рецепторов на восприимчивость к β-блокаторам при сердечной недостаточности не проводилось. В другой статье указывалось, что хотя некоторые исследования дают основание предполагать, что полиморфизм в адренергических рецепторах может приводить к изменению ответа на лечение β-блокаторами, однако пока нельзя сделать определенные выводы или дать рекомендации относительно лечения пациентов, поскольку в различных исследованиях участвовало небольшое число пациентов.
1
Кроме того, в некоторых работах не сообщается о какой-либо корреляции между полиморфизмом в положении 389 β-AR и ответом на лечение β-блокатором. Таким образом, существует и другая точка зрения, отличающаяся от той, которая высказывается в настоящем описании, несмотря на то, что в настоящей заявке имеются ссылки на работу White et al. (см. ниже, аргумент #1), в которой было проведено обследование пациентов с сердечной недостаточностью, принимавших метопролол, для оценки смертности или общего исхода, а именно смертности + госпитализации по поводу сердечной недостаточности, и в которой не было обнаружено вышеуказанной корреляции. O'Shaughnessy и др. (2000) сообщали, что не было выявлено каких-либо различий в кровяном давлении или в частоте сердечных сокращений в ответ на бета-блокаду (обоих антагонистов атенолола или бизопролола), которые были бы обусловлены полиморфизмом в 389. В другой работе, Joseph и др. (2004), также не наблюдалось различий в аффинности рецептора по отношению к β-блокаторам, которые были бы связаны с полиморфизмом в 389. Кроме того, в недавно проводимых исследованиях не было получено каких-либо данных о “фармацевтическом эффекте” лечения метопрололом, связанным с полиморфизмом Arg389 (White et al., Eur. J. Heart Fail. 5:463-8, 2003).
1
1
Поэтому какая-либо корреляция между эффективностью β-блокаторов как класса терапевтических средств и полиморфизмом в положении 389 β-AR не была установлена. Кроме того, не было установлено какой-либо корреляции, конкретно касающейся буциндолола, который по своим некоторым важным параметрам отличается от других β-блокаторов. Поскольку различия между разными β-блокаторами являются значимыми, то влияние вариантов βAR-389 на введение β-блокатора может зависеть от конкретного средства.
В настоящем описании приводятся данные BEST, которые при их оценке с точки зрения генотипа индивидуума, в частности полиморфизма Arg389, указывают на значительную терапевтическую эффективность буциндолола. Эти данные неожиданно показали, что в исследовании BEST число летальных исходов у всех обследованных индивидуумов было меньше, чем число летальных исходов, наблюдаемых при лечении другими β-блокаторами, такими как карведилол, метопролол CR/XL и бизопролол. Кроме того, приведенные здесь научные данные впервые продемонтрировали корреляцию между терапевтической эффективностью буциндолола и двух генетических вариантов.
1
2c
1
1
Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу, позволяющему определить, может ли быть прописан буциндолол пациенту, который был обследован на полиморфизм в нуклеотидном или аминокислотном сайте βAR и αAR, и на основании результатов этого диагностического теста установить, необходимо ли данному пациенту лечение буциндололом или нет. Аналогичным образом, на основании данных о генотипе, пациенту с неблагоприятным генотипом βAR может быть назначено другое лекарственное средство для усиления у него клинического ответа. В обоих случаях решение о назначении лечения лекарственным средством принимают исходя из βAR-генотипа пациента.
1
2c
1
2c
Таким образом, настоящее изобретение относится к способам назначения терапии буциндололом пациенту, в частности пациенту с сердечной недостаточностью, на основании наличия или отсутствия у данного индивидуума гомозиготности по Arg389 в гене βAR, гомозиготности по αAR дикого типа в положениях аминокислот 322-325 или того и другого. Альтернативно настоящее изобретение относится к способу, относящемуся к диплотипу βAR389Gly-носителя и αARDel322-325-носителя.
α
-Адренергический рецептор
2c
В.
2c
2c
2c
2c
α-AR локализуются на окончаниях симпатического нерва сердца и регулируют пресинаптическое высвобождение нейронов норэпинефрина в область синаптической щели. Связывание норэпинефрина с αAR вызывает симпатолитический ответ с отрицательной обратной связью, который также снижает уровень высвобождения нейронного норэпинефрина. В мышиных моделях с вырезанием генов присутствует α-AR, поскольку этот рецептор, главным образом, ответственен за регуляцию постоянного стационарного уровня высвобождения норэпинефрина (Hein et al., 1999). Таким образом, αAR играет “протективную” роль в сердце, направленную на нейтрализацию постоянно возрастающих уровней норэпинефрина, продуцирующихся в сердце человека с сердечной недостаточностью.
2c
2c
Был описан генетический полиморфизм для человеческо гена αAR, ADRA2C (Small et al., 2000). Потеря 12 нуклеотидов в ADRA2C приводит к делеции четырех смежных аминокислот (α20Del322-325) в третьей внутриклеточной петле рецептора. (Small et al., 2000). Этот делеционный полиморфизм чаще всего встречается у афроамериканцев с частотой аллелей 0,4, которая у не афроамериканцев составляет 0,04. Вообще говоря, такой полиморфизм присутствует примерно у 15% населения США.
2c
2c
В отличие от полиморфизма Arg389 полиморфизм 322-325Del α-адренергического рецептора является мало распространенным и низкофункциональным вариантом этого рецептора (Small et al., 2000). Потеря четырех остатков может указывать на снижение функции рецептора, что было подтверждено в экспериментах по трансфекции клеток, где рецепторная функция снижена на 50-85% (Small et al., 2000). α-Рецептор обычно тонически ингибирует пресинаптическое высвобождение норэпинефрина в адренергических нервных окончаниях (Hein et al., 1999).
2c
Делеция в положениях 322-325 в значительной степени нарушает функцию рецептора (Small et al., 2000) и приводит к высвобождению высоких уровней норэпинефрина и к адренергической активности (Neumister et al., 2005). Результатом снижения ингибирующего контроля является конститутивное увеличение степени высвобождения базального норэпинефрина, приводящее к повышению уровня симпатической активности (Hein et al., 1999). При сердечной недостаточности этот процесс представляет особый интерес, поскольку αDel322-325-рецепторы теряют свое “протективное” блокирующее действие, направленное против повышения симпатической активности.
2c
2c
2c
2c
1
Полиморфизм αDel322-325-рецептора, наблюдаемый в одном из исследований как гомозиготный генотип лишь у 7,4% людей белой расы и 52,6% людей негроидной расы с хронической сердечной недостаточностью, приводит к нарушению функции, на что указывало ингибирование стимуляции аденилилциклазы (Small et al., 2002). Такое функциональное нарушение влияет на функцию αAR и обозначается терминами “полиморфизм” и “мутация”, которые являются взаимозаменяемыми и определяют признаки, относительно часто встречающиеся у основной массы населения, и их сложные структурные/функциональные эффекты соответственно. В настоящей работе такой вариант называется, в основном, “полиморфизмом” и означает обычный вариант, присутствующий у многих индивидуумов с сердечной недостаточностью. Однако его важное значение обусловлено его функциональной активностью, направленной, главным образом, на снижение рецепторной активности. Исходя из эффектов элиминации генов у мышей дикого типа полноразмерный функциональный α-рецептор пресинаптически ингибирует высвобождение норэпинефрина, а поскольку у дефицитных по этому рецептору мышей такого ингибирования не происходит, то это приводит к повышению уровней норэпинефрина и к патологической гипертрофии (Hein et al., 1999). Клиническая ценность такого полиморфизма у людей была проиллюстрирована в исследовании, в котором был идентифицирован αDel322-325-генотип как фактор риска развития сердечной недостаточности, при этом у людей негроидной расы, гомозиготных по этому гену, нескорректированное отношение вероятностей заболевания сердечной недостаточностью составляет 5,54 (95% ДИ 2,68, 11,45; p<0,001) по сравнению с гетерозиготными индивидуумами и индивидуумами, не являющимися носителями этого полиморфизма (Small et al., 2002). В комбинации с βArg389-вариантом этот эффект более ярко выражен и характеризуется нескорректированным отношением вероятностей 12,67 (95% ДИ 2,70, 59,42; p=0,001). Однако в отличие от настоящего изобретения, в предшествующих работах не было каких-либо упоминаний о том, что этот полиморфизм имеет важное прогностическое значение для терапевтического лечения.
β-Блокаторы
С.
1
1
2
1
Хотя β-агонисты, такие как добутамин, используются для лечения пациентов с недостаточностью вентрикулярной функции, у которых наблюдается резкое ухудшение состояния, однако продолжительное воздействие на сердце вводимых агонистов или увеличение уровней эндогенных агонистов катехоламина, продуцируемых в организме, приводит к прогрессированию сердечной недостаточности. Действительно, при сердечной недостаточности βAR и βAR подвергаются десенситизации, что, очевидно, является механизмом самозащиты от продуцирования высоких уровней катехоламинов, присутствующих при сердечной недостаточности. Введение β-антагонистов может улучшать вентрикулярную функцию и положительно влиять на клинический исход лечения, что, предположительно, обусловлено блокадой этого негативного действия катехоламинов. Действительно, экспрессия и функция βAR в сердце усиливается в процессе лечения сердечной недостаточности посредством β-блокады. Подавляющее большинство негативных эффектов катехоламинов и успех терапии β-блокаторами связаны с вариантами подтипа βAR (Zhu et al., 2001; Bristow et al., 2003).
1
Антагонисты β-адренергических рецепторов (также называемые β-блокаторами) были разработаны как основное средство для лечения хронической сердечной недостаточности. Сначала эти средства рассматривались как противопоказания для лечения сердечной недостаточности, поскольку считалось, что повышенная адренергическая активность играет важную роль в поддержании состояния сердечной недостаточности. Действительно, в более ранних экспериментах, проведенных с использованием соединения 1-го поколения, т.е. пропранолола, введение его стандартных доз часто ассоциировалось с обострением сердечной недостаточности (Stephen, 1968). Однако было показано, что при введении низких исходных доз соединений 2-го поколения (селективных β-блокаторов) или 3-го поколения (неселективных β-блокаторов-вазодилататоров) и при медленном повышении этих доз указанные соединения способствуют восстановлению сократительной способности, а также устраняют структурное и молекулярное ремоделирование и снижают заболеваемость и смертность от сердечной недостаточности (Bristow, 2000; CIBIS-II Investigators and Committees). Испытание на стадии II проводили с использованием бизопролола для лечения сердечной недостаточности (CIBIS-II, 1999); MERIT-HF Study Group. Для оценки эффекта метопролола CR/XL при лечении хронической сердечной недостаточности проводили рандомизированное испытание метопролола CR/XL, используемого для инвазивного лечения застойной сердечной недостаточности (MERIT-HF, 1999; Packer et al. (2001); BEST Trial Investigators, (2001); Lowes et al., 2002). При этом считалось, что эти благоприятные эффекты частично обусловлены защитой сердца с недостаточной функцией, которое имеет ограниченные метаболические и физиологические резервы, от персистентных негативных биологических эффектов, опосредуемых повышенными уровнями норэпинефрина, характерными для такого синдрома (Bristow, 2000; Cohn et al., 1984; Liggett, 2001). Кроме того, было показано, что β-блокаторы частично восстанавливают молекулярный фенотип сердца с недостаточной функцией (Lowes et al., 2002), поэтому эти средства способны предупреждать и предотвращать прогрессирование недостаточности и ремоделирования миокарда (Eichhorn and Bristow, Circulation 1996).
1
1
Интересно отметить, что последние исследования показали, что у индивидуумов с нормальным давлением частота сердечных сокращений и/или кровяное давление, изменяющиеся в ответ на действие таких β-блокаторов, как метопролол и атенолол, выше у Arg389-индивидуумов, чем у Gly389-индивидуумов (Liu et al. 2003;  Sofowora et al., 2003). А при гипертензии увеличение кровяного давления в ответ на введение метопролола больше у Arg389-пациентов, чем у Gly389-пациентов (Johnson et al., 2003). Ни в одном из опубликованных исследований сердечной недостаточности не было выявлено какой-либо явной взаимосвязи или какой-либо тенденции к взаимосвязи между полиморфизмом βAR и совокупным ответом на лечение метопрололом по показателям госпитализации и летального исхода (White et al., 2003). Однако в этом исследовании не проводилось непосредственного сравнения пациентов, принимавших метопролол, и пациентов, принимавших плацебо, с точки зрения их генотипа, и в этом испытании приблизительно 45% пациентов имели слабую сердечную недостаточность (класса II по NYHA), а средний период наблюдения пациентов составлял только 12 месяцев. Такие различия могут быть объяснены возможным расхождением в диагнозе. Однако по своим фармакологическим свойствам буциндолол и метопролол имеют некоторые явные различия (Bristow, 2000; Bristow et al., 1997). В частности, буциндолол снижает уровни норэпинефрина, вызывает расширение периферических сосудов и более интенсивно блокирует человеческий β-адренергический рецептор.
1
1
Общее фармакологическое свойство всех β-блокирующих средств, которые были использованы для лечения СН, заключается в том, что они блокируют βAR, который в сердце человека с недостаточной функцией, как было оценено, является ответственным приблизительно за 90% патологической адренергической стимуляции (Zhu et al., 2001;  Bristow et al., 2003), однако имеющиеся β-блокаторы обладают рядом различных свойств, включая селективность по отношению к подтипу βAR, аффинность по отношению к αAR, частичную агонистическую активность, симпатолиз (Bristow et al., 2004) и вазодилатацию (Bristow, 2000; Bristow et al., 1997).
1
2
1
1
1
3
Химическая структура некоторых β-блокаторов представлена на фиг.1, где показано, что эти средства имеют значительные структурные различия. Кроме того, они обладают различными фармакологическими свойствами. Как показано на фиг.2, сравнение различных антиадренергических средств в испытаниях на стадии разработки или в клинических испытаниях фазы II или III подтвердило эти различия. Так, например, карведилол является эффективным βAR- и βAR-блокатором, а также αAR-блокатором. В противоположность этому буциндолол является слабым αAR-блокатором, а метопролол и бизопролол вообще не блокируют αAR. Важно отметить, что по своим симпатолитическим свойствам буциндолол является уникальным β-блокатором по сравнению с карведилолом, метопрололом и бизопрололом, которые вообще не обладают такими свойствами. Буциндолол, по сравнению с другими β-блокирующими средствами, имеет уникальную способность снижать системные уровни норэпинефрина (Lowes et al., 2000; Bristow et al., 1997; BEST NEJM, Bristow, 2004), и является абсолютным агонистом β-адренергического рецептора (Strosberg, 1997).
Буциндолол представляет собой β-блокатор-вазодилататор 3-го поколения, который имеет химическое название гидрохлорид (2-{2-гидрокси-3{{3-(3-индолил)-1,1-диметилэтил}амино}пропокси}бензонитрила. Это средство было сначала разработано для лечения гипертензии, а затем для лечения сердечной недостаточности. Поскольку буциндолол обладает слабыми свойствами как обратный агонист и вазодилататор, то его неселективная β-блокада относительно хорошо переносится пациентами с сердечной недостаточностью, и отчасти по этой причине в 1994 году буциндолол был выбран группой исследователей в соответствии с кооперативной программой клинических испытаний, проводимых Национальным институтом здравоохранения (NIH) и Министерством по делам ветеранов (VA), для проверки гипотезы о том, что β-блокатор может способствовать снижению показателей смертности при запущенной сердечной недостаточности. Для проверки этой гипотезы проводили испытание BEST, которое продолжалось с 31 мая 1995 года по 29 июля 1999 года.
Испытание для оценки выживаемости при лечении бета-блокаторами (BEST) было завершено раньше намеченного срока по рекомендации Комитета по мониторингу данных и безопасности (Data and Safety Monitoring Committee) во время, когда отношение рисков по первому показателю, которым является смертность по всем нозологическим формам, составляло 0,90 (доверительные интервалы (ДИ) 0,78-1,02) (BEST Investigators, 2001; Domanski et al., 2003). Однако результаты для всех пациентов, участвующих в испытании BEST, были положительными по второму показателю высокого порядка, т.е. смертности или госпитализации по поводу сердечной недостаточности, которые указывали на снижение смертности при применении буциндолола на 19% с величиной р<0,0001 (Domanski et al., 2003). Фактически, этот результат рассматривается, в большей мере, как предпочтительный для экспериментальных испытаний СН.
Причинами прекращения испытаний BEST были 1) подтверждение данных, полученных в испытании BEST для пациентов не негроидной расы с сердечной недостаточностью класса III, недавно опубликованными результатами, полученными в испытаниях CIBIS-II (CIBIS Investigators, 1999) и MERIT-HF (MERIT-HF Study Group, 1999), в которых пациенты с сердечной недостаточностью такого типа имели, в основном, хорошую выживаемость при приеме β-блокаторов, 2) все возрастающая потеря уверенности у исследователей в необходимости продолжения испытаний, которые считали, что эффективность β-блокады при сердечной недостаточности уже была достаточно продемонстрирована, и 3) неэффективность и тенденция к негативным эффектам у определенных подгрупп (с сердечной недостаточностью класса IV и у пациентов негроидной расы), которые ранее не участвовали в испытаниях по лечению β-блокаторами сердечной недостаточности. В результате было принято решение отказаться от дальнейших испытаний буциндолола, поскольку не было ясно, может ли буциндолол иметь коммерческий успех, даже если будет получено разрешение на его продажу.
Поэтому в широкомасштабном испытании на выживаемость, в котором конечной целью была оценка на общую выживаемость, клинические испытания BEST были завершены раньше намеченного срока, поскольку в других недавно проводимых исследованиях было получено подтверждение благоприятных эффектов буциндолола, но при этом был сделан вывод о неспособности буциндолола к эффективному воздействию на определенные подгруппы пациентов, которые ранее не были исследованы в широкомасштабных клинических испытаниях (BEST Investigators, 2001). К этому времени не наблюдалось какого-либо значимого различия по показателям смертности индивидуумов, принимавших буциндолол или плацебо. В противоположность результатам испытания BEST аналогичные исследования, проводимые с использованием антагонистов β-адренергических рецепторов, таких как бизопролол (называемые испытанием CIBIS-II), метопролол (испытание MERIT-HF) и карведилол (испытание COPERNICUS), выявили достаточно благоприятные различия (снижение смертности на 34-35%) между пациентами, принимавшими антагонисты, и пациентами, принимавшими плацебо. Исследователи, проводившие испытание BEST, высказали мнение, что одним из возможных объяснений различия этих результатов “могут быть уникальные фармакологические свойства буциндолола”.
Испытание CIBIS-II также было преждевременно прекращено, и это было обусловлено тем, у пациентов, принимавших бизопролол, показатели смертности были значительно ниже (CIBIS-II Investigators, 1999). Аналогичным образом испытание MERIT-HF с использованием метопролола также было преждевременно прекращено, поскольку предварительно определенный критерий был удовлетворительным и даже превзошел ожидания исследователей (MERIT-HF Study Group, 1999). Исследования COPERNICUS с применением карведилола были также завершены раньше намеченного срока, поскольку указанное лечение дало в высокой степени благоприятный эффект. Packer et al., 2001. Исследователи BEST сообщали, что в результате их испытаний возник вопрос об эквивалентности β-блокаторов.
Кроме того, в предшествующих испытаниях, которые не ставили свой целью оценку смертности и были проведены с использованием карведилола (Yancy et al., 2001), который имел другую специфичность, не наблюдалось какого-либо различия в ответах на лечение у чернокожих и не чернокожих индивидуумов, а также явного отличия ответа на использование буциндолола. В испытании BEST чернокожие пациенты с прогрессирующей сердечной недостаточностью обнаруживали худшие результаты, чем не чернокожие пациенты, Bristow, 1997.
В одном из отчетов различных испытаний утверждается, что “не может быть какого-либо ясного объяснения менее благоприятного эффекта буциндолола в испытании BEST”, Bouzamondo et al., 2001 (был сделан вывод, что если исключить испытание BEST, то полученные данные указывают на снижение риска, достигаемое при лечении β-блокатором). Хотя авторы считают, что проводимое ими исследование позволяет предположить, что различные подгруппы индивидуумов с сердечной недостаточностью дают различные ответы на терапию β-блокаторами, однако они не исключают возможности того, что такие различные β-блокаторы обладают различными свойствами, а также не считают, что причиной такого различия является полиморфизм. См. также Sallach et al., 2003. (“Некоторые известные специалисты высказывают предположение, что различия, наблюдаемые в испытании BEST, могут быть результатом обследования групп пациентов, а другие специалисты считают, что отсутствие снижения смертности обусловлено действием самого буциндолола”).
Таким образом, имеются терапевтические различия между действием буциндолола и других β-блокаторов и эти различия создают серьезное разногласие относительно терапевтической эффективности буциндолола в целом. Поэтому какая-либо взаимосвязь между действием буциндолола и конкретными генетическими вариантами пока не была установлена.
Положительный результат ретроспективного анализа, основанного на описанных здесь генетических данных, указывает на уникальные фармакологические свойства буциндолола, которые обеспечивают его эффективность при лечения пациентов с сердечной недостаточностью. Два из этих свойств являются также инструментальным средством во взаимодействии лекарственного средства с генными вариантами адренергических рецепторов.
2
1
1
2
3
1
Первым из этих признаков является симпатолиз или способность этого лекарственного средства к прямому снижению адренергической активности (снижению уровней норэпинефрина в крови и тканях). Как указывалось выше, среди β-блокаторов, которые были использованы для лечения сердечной недостаточности, буциндолол является уникальным с этой точки зрения (BEST Trial Investigators, 2001; Lowes et al., 2000; Bristow et al., 2004). Симпатолитические эффекты буциндолола, вероятно, обусловлены блокадой β-рецептора, наряду с недостаточной α-блокадой для активации адренергической активности, и его низкой активностью в качестве обратного агониста по отношению к β- и β-рецепторам, что приводит к минимизации адренергической активации, основанной на угнетении функции миокарда. Другими свойствами буциндолола, которые могут способствовать симпатолизу, являются продуцирование оксида азота и агонистическое действие, по отношению к β-рецептору (Strosberg, 1997). Эти последние два свойства в совокупности со слабой блокадой, или без блокады, α-рецептора, вероятно, объясняют слабую сосудорасширяющую способность буциндолола (Gilbert et al., 1990), который, в отличие от карведилола, не обладает активностью, достаточной для запуска рефлекторной адренергической активации.
Если симпатолиз присутствует в умеренных количествах (меньшее снижение уровней норэпинефрина), то он является благоприятным свойством, которое усиливает терапевтический антиадренергический эффект буциндолола. Такой симпатолиз, возможно, является основным механизмом действия, облегчающим β-блокаду, поскольку в данном случае из системы выводится избыток норэпинефрина. Норэпинефрин является токсичным для сердечной мышцы, а его избыток запускает различные механизмы, приводящие к болезням сердца. Однако при обострении болезни симпатолиз может оказывать вредное воздействие и приводить к повышению риска летального исхода (Bristow et al. 2004). Как обсуждается ниже, введение буциндолола, исходя из генетических признаков, позволяет использовать только благоприятные свойства буциндолола.
1
1
2
1
1
1
1
1
1
1
-6
Вторым фармакологическим свойством буциндолола, который взаимодействует с фармакокинетической мишенью, является его способность блокировать высокоаффинный β-рецептор (Hershberger et al., 1990; Asano et al., 2001). Буциндолол обладает высокой аффинностью к человеческим β-рецепторам, а также к β-рецепторам (Hershberger et al., 1990). Кроме того, посредством своего неагонистического воздействия на трансляцию или метаболизм белка буциндолол снижает плотность β-рецепторов (Asano et al., 2001). Поскольку буциндолол очень хорошо переносится пациентами, то он может быть введен в очень высоких β-блокирующих дозах, и каждое из этих свойств вносит свой вклад в его эффективное действие на высокоактивный вариант гена 389Arg/Arg человеческого β-рецептора (см., например, Mason et al., 1999). Хотя буциндолол обладает присущей ему симпатомиметической активностью (ISA) в миокарде крыс, однако при проникновении буциндолола в ткань человеческого сердца его симпатомиметическая активность значительно снижается (ISA) (Bristow et al., 1994; Sederberg et al., 2000; Bristow et al., 1998, пример 7). Это ясно видно на фиг.13, на панелях А и В, где у носителей генотипа βAR Arg/Arg или Gly не наблюдается значительного увеличения функции выделенной трабекулы правого желудочка человека с сердечной недостаточностью даже при усилении передачи сигнала дитерпеновым соединением форсколином. В противоположность этому, как показано на фиг.13, панели С, ксамотерол, используемый как ISA-соединение в качестве позитивного контроля, усиливает низкую и высокую активацию передачи сигнала у индивидуумов с βAR Arg/Arg-генотипом, но только в условиях высокой активации, сообщаемой предварительным введением форсколина Gly-носителям. И, наконец, как показано на фиг.13, в препаратах выделенного сердца человека буциндолол обладает уникальным воздействием на βAR Arg/Arg-рецептор, но не на Gly-рецептор. В условиях низких уровней передачи сигнала (низкая активация рецептора) при сердечной недостаточности (панель A) буциндолол функционирует как нейтральный антагонист (но не обладает активностью агониста или обратного агониста) в β-Arg/Arg-рецепторе человеческого миокарда, но если уровень передачи сигнала является высоким, как это наблюдается при прямой активации аденилилциклазы форсколином (панель B), то буциндолол функционирует как обратный агонист, инактивируя рецептор, на что указывает статистически значимый угол наклона кривой, соответствующий самой высокой концентрации в плазме, достигаемой при терапевтических дозах 10 M. Однако такой эффект не наблюдается в рецепторах Gly-носителей, у которых буциндолол действует как обратный агонист в условиях низкой активации и как нейтральный антагонист - в присутствии форсколина. Эти данные позволяют предположить, что буциндолол обладает уникальным антагонистическим действием на β389Arg/Arg-рецептор, находящийся в высокой степени активированном состоянии, т.е. на ту форму рецептора, которая, как предполагается, должна обладать кардиомиопатическими свойствами.
1
2c
Эти свойства, вероятно, могут служить объяснением неожиданных и непредвиденных результатов, которые были получены для генетического Arg389-варианта в βAR и для генетического Del322-325-варианта в αAR при лечении буциндололом.
Анализ полиморфизма
II.
1
Поскольку генетические варианты присутствуют в кодирующих областях генов β-AR и α-AR и влияют на кодируемые белки, то присутствие Arg389- или Del322-325-полиморфизма может быть определено из последовательности нуклеиновой кислоты или белка. Поэтому для этой цели могут быть применены различные методики.
Нуклеиновые кислоты
А.
В некоторых своих вариантах настоящее изобретение относится к различным нуклеиновым кислотам, включая праймеры амплификации, олигонуклеотидные зонды и другие элементы нуклеиновых кислот, применяемые в анализе геномной ДНК. В некоторых аспектах изобретения нуклеиновая кислота включает нуклеиновую кислоту дикого типа, мутант или полиморфную нуклеиновую кислоту.
1
1
1
1
Термины “полиморфизм β-адренергического рецептора” или “полиморфизм βAR” понятны специалистам и означают полиморфизм в последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности гена β-адренергического рецептора или его генного продукта. Примерами Gly- и Arg-389-форм генной последовательности гена β-адренергического рецептора, которые приводятся лишь в качестве иллюстрации, могут служить следующие последовательности, имеющиеся в GenBank под рег.No. J03019 (Gly389) и AF169007 (Arg389) (которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки).
2c
2c
2c
Кроме того, термины “полиморфизм α-адренергического рецептора” или “полиморфизм αAR” понятны специалистам и означают полиморфизм в последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности гена α-адренергического рецептора или его генного продукта. В качестве примера можно привести последовательность, имеющуюся в GenBank под рег. No. NM00683 и соответствующую последовательность дикого типа (без делеции), а также последовательность, имеющуюся в GenBank под рег. No. AF280400, и соответствующую последовательность с делецией (которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки).
1
2c
Для идентификации локализации полиморфизма первый нуклеотид старт-кодона кодирующей области (аденин ATG в молекуле ДНК и аденин AUG в молекуле РНК) гена βAR или αAR рассматривается как нуклеотид “1”, и последующая нумерация идет по кодирующей последовательности. Аналогичным образом первая аминокислота транслируемого белка (метионин) рассматривается как аминокислота “1”.
Термин “нуклеиновая кислота” хорошо известен специалистам. Используемый здесь термин “нуклеиновая кислота”, по существу, означает молекулу (т.е. цепь) ДНК или РНК, содержащую нуклеотидное основание. Нуклеотидными основаниями являются, например, природное пуриновое или пиримидиновое основание, присутствующее в ДНК (например, аденин А, гуанин G, тимин Т или цитозин С) или РНК (например, А, G, урацил U или С). Термин “нуклеиновая кислота” включает термины “олигонуклеотид” и “полинуклеотид”, каждый из которых является подвидом “нуклеиновой кислоты”. Термин “олигонуклеотид” означает молекулу, имеющую длину примерно от 3 до 100 нуклеотидных оснований. Термин “полинуклеотид” означает по меньшей мере одну молекулу, имеющую длину более чем 100 нуклеотидных оснований. Термин “ген” означает кодирующую последовательность генного продукта, а также интроны и промотор указанного генного продукта.
1
2c
В некоторых вариантах изобретения нуклеиновые кислоты согласно изобретению включают (или являются комплементарными им) все нуклеотиды или 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1100, 1165, 1200, 1300, 1400, 1500 или более смежных нуклеотидов, или любую их область, человеческой последовательности кДНК βAR, имеющей цитозин или гуанин в положении 1165 в последовательности кДНК либо в последовательности кДНК αAR, в которой присутствуют или отсутствуют нуклеотиды 964-975. Специалистам в данной области известны способы конструирования и применения праймеров и зондов для гибридизации и амплификации последовательностей, включая ограничения гомологии, необходимые для конструирования праймеров и зондов.
Эти термины, по существу, означают одноцепочечную молекулу, а в конкретных вариантах изобретения они также включают дополнительную цепь, которая частично, по большей части или полностью комплементарна этой одноцепочечной молекуле. Таким образом, термин нуклеиновая кислота может охватывать двухцепочечную молекулу или трехцепочечную молекулу, которая содержит одну или несколько комплементарных цепей или “комплементов” конкретной последовательности, составляющей молекулу. Используемая здесь одноцепочечная нуклеиновая кислота может иметь префикс “оц”, двухцепочечная нуклеиновая кислота - префикс “дц”, а трехцепочечная нуклеиновая кислота - префикс “тц”.
В конкретных аспектах изобретения нуклеиновая кислота кодирует белок, полипептид или пептид. В некоторых своих вариантах настоящее изобретение относится к новым композициям, содержащим по меньшей мере одну белковую молекулу. Используемые здесь термины “белковая молекула”, “белковая композиция”, “белковое соединение”, “белковая цепь” или “белковый материал”, по существу, означают, но не ограничиваются ими, белок, имеющий примерно более чем 200 аминокислот или полноразмерную эндогенную последовательность, транслируемую из гена; полипептид, имеющий примерно более чем 100 аминокислот, и/или пептид, имеющий примерно от 3 до 100 аминокислот. Все описанные выше термины, относящиеся к “белковым соединениям”, могут быть взаимозаменяемыми.
Получение нуклеиновых кислот
1.
,
Нуклеиновая кислота может быть получена любым методом, известным среднему специалисту в данной области, таким как, например, химический синтез, ферментативное продуцирование или биологическое продуцирование. Неограничивающими примерами синтетических нуклеиновых кислот (например, синтетических олигонуклеотидов) являются нуклеиновые кислоты, полученные путем химического синтеза in vitro методами с использованием фосфотриэфира, фосфита или фосфорамидита и методами твердофазного синтеза, такими как методы, описанные в европейском патенте 266032, который вводится в настоящее описание посредством ссылки, либо методами с использованием дезоксинуклеозид-Н-фосфонатных промежуточных соединений, описанных в публикации Froehler et al., 1986 и в патенте США 5705629, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки. В способах согласно изобретению могут быть использованы один или несколько олигонуклеотидов. Различные другие механизмы синтеза олигонуклеотидов описаны, например, в патентах США 4659774, 4816571, 5141813, 5264566, 4959463, 5428148, 5554744, 5574146, 5602244, каждый из которых вводится в настоящее описание посредством ссылки.
ТМ
Неограничивающим примером ферментативно продуцируемой нуклеиновой кислоты является нуклеиновая кислота, продуцируемая с помощью ферментов в реакциях амплификации, таких как ПЦР (см., например, патент США 4683202 и патент США 4682195, каждый из которых вводится в настоящее описание посредством ссылки), или путем олигонуклеотидного синтеза, описанного в патенте США 5645897, который вводится в настоящее описание посредством ссылки. Неограничивающим примером биологически продуцируемой нуклеиновой кислоты является рекомбинантная нуклеиновая кислота, продуцируемая (т.е. реплицируемая) в живой клетке, такая как рекомбинантный ДНК-вектор, реплицируемый в бактериях (см., например, руководство Sambrook et al., 2001, которое вводится в настоящее описание посредством ссылки).
Очистка нуклеиновых кислот
2.
,
Нуклеиновая кислота может быть очищена на полиакриламидных гелях путем центрифугирования в градиенте хлорида цезия, на хроматографических колонках или любыми другими методами, известными среднему специалисту в данной области (см., например, руководство Sambrook et al. 2001, которое вводится в настоящее описание посредством ссылки). В некоторых аспектах изобретения нуклеиновой кислотой является фармакологически приемлемая нуклеиновая кислота. Фармакологически приемлемые композиции известны специалистам и описаны в настоящей заявке.
В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, которая представляет собой “выделенную нуклеиновую кислоту”. Используемый здесь термин “выделенная нуклеиновая кислота” означает молекулу нуклеиновой кислоты (например, молекулу РНК или ДНК), которая была изолирована или как-либо иначе отделена от всей массы геномных и транскрибируемых нуклеиновых кислот одной или нескольких клеток. В некоторых вариантах изобретения термин “выделенная нуклеиновая кислота” означает нуклеиновую кислоту, которая была изолирована или как-либо иначе отделена от всей массы клеточных компонентов или компонентов реакции in vitro, таких как, например, макромолекулы, например липиды или белки, небольшие биологические молекулы и т.п.
Сегменты нуклеиновых кислот
3.
1
1
2c
В некоторых вариантах изобретения указанной нуклеиновой кислотой является сегмент нуклеиновой кислоты. Используемый здесь термин “сегмент нуклеиновой кислоты” означает фрагменты нуклеиновой кислоты, такие как, но не ограничивающиеся ими, фрагменты, кодирующие только часть локуса гена βAR или последовательности гена βAR, или часть локуса или последовательности гена αAR. Таким образом, термин “сегмент нуклеиновой кислоты” может включать любую часть генной последовательности, включая последовательность, содержащую примерно от 2 нуклеотидов до полноразмерного гена, включая промоторные области, простирающиеся вплоть до сигнала полиаденилирования, и имеющую любую длину, включающую всю кодирующую область.
Различные сегменты нуклеиновых кислот могут быть сконструированы на основе конкретной последовательности нуклеиновой кислоты и могут иметь любую длину. При присваивании данной последовательности номера, например, первому остатку - номера 1, второму остатку - номера 2 и т.п.может быть получен алгоритм, определяющий все сегменты нуклеиновой кислоты:
n→n+y,
где n равно целому числу от 1 до последнего цифрового значения последовательности, а у означает длину сегмента нуклеиновой кислоты минус 1 и где n+y не превышает номер последнего остатка последовательности. Таким образом, для 10-мера сегменты нуклеиновой кислоты соответствуют основаниям 1-10, 2-11, 3-12… и т.д. Для 15-мера сегменты нуклеиновой кислоты соответствуют основаниям 1-15, 2-16, 3-17… и т.д. Для 20-мера, сегменты нуклеиновой кислоты соответствуют основаниям 1-20, 2-21, 3-22… и т.д. В некоторых вариантах изобретения сегментом нуклеиновой кислоты может быть зонд или праймер. Используемый здесь термин “зонд”, по существу, означает нуклеиновую кислоту, используемую в методе детекции, или ее композицию. Используемый здесь термин “праймер”, по существу, означает нуклеиновую кислоту, используемую в методах удлинения или амплификации или в композициях.
Комплементы нуклеиновой кислоты
4.
Настоящее изобретение также охватывает нуклеиновую кислоту, комплементарную нуклеиновой кислоте. Нуклеиновая кислота является “комплементом” другой нуклеиновой кислоты или “является комплементарной” другой нуклеиновой кислоте, если ее основания способны спариваться с основаниями другой нуклеиновой кислоты в соответствии со стандартными правилами спаривания комплементарных оснований Уотсона-Крика, Хугстена или обратного комплементарного спаривания. Используемый здесь термин “другая нуклеиновая кислота” может означать отдельную молекулу или пространственно отдаленную последовательность той же самой молекулы. В предпочтительных вариантах изобретения комплементом является зонд для гибридизации или праймер для амплификации, применяемые для детекции полиморфизма нуклеиновых кислот.
Используемый здесь термин “комплементарный” или “комплемент” также означает нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность из смежных нуклеотидных оснований или полусмежных нуклеотидных оснований (например, когда одно или несколько нуклеотидных оснований отсутствуют в данной молекуле) и способную гибридизоваться с цепью или дуплексом другой нуклеиновой кислоты, даже если не все нуклеотидные основания образуют пару с соответствующим нуклеотидным основанием партнера. Однако в некоторых вариантах настоящего изобретения, относящихся к диагностике или детекции, предпочтительными являются полностью комплементарные нуклеиновые кислоты.
Детекция и оценка нуклеиновых кислот
5.
Генотипирование обычно осуществляют методами, подробно описанными ранее в публикации Small et al. (2002), которая вводится в настоящее описание посредством ссылки. При этом для каждого специалиста в данной области очевидно, что существуют и другие стандартные методы генотипирования, и для этих целей могут быть применены любые методы. Общие методы детекции нуклеиновых кислот описаны ниже со ссылками на конкретные примеры и применяются для идентификации полиморфизма, включая полиморфизм в одном нуклеотиде (SNP).
1
1
2c
1
2c
Конкретный метод генотипирования, применяемый для определения генотипа индивидуума, нуждающегося в терапии β-блокаторами, не является частью настоящего изобретения, а короче, включает взятие у индивидуума смеси нуклеиновых кислот, содержащей две копии гена βAR или его фрагменты, присутствующие у данного индивидуума, и определение идентичности пары нуклеотидов в положении 1165 в βAR, либо выявление делеции нуклеотидов 964-975 в гене αAR. Предпочтительные полиморфизмы и полиморфные сайты в генах βAR и αAR представлены в таблице 1.
<u>Таблица 1</u>
Полиморфизм β<sub>1</sub>-адренергического рецептора
Положение нуклеотида
Нуклеотид
Положение аминокислоты
Аминокислота
Обозначения
1165
G или С
389
Gly или Arg
Gly389, Arg389
<u>Полиморфизм α</u><sub>2c</sub><u>-адренергического рецептора</u>
Положение нуклеотида
Нуклеотид
Положение аминокислоты
Аминокислота
Обозначения
964-975
Делеция
322-325
Делеция
α<sub>2c</sub>Del322-325
1
1
2c
Эти типы полиморфизма были описаны ранее. Нуклеотидные последовательности βAR дикого типа обычно содержат гуанин в положении нуклеотида 1165. Последовательности белка βAR дикого типа обычно содержат глицин в положении аминокислоты 389. Термин “нуклеотидные последовательности αAR дикого типа”, по существу, означает нуклеотидную последовательность, в которой отсутствуют делеции в положениях нуклеотидов 964-975, а поэтому отсутствуют делеции в положениях аминокислот 322-325.
Совершенно очевидно, что молекулами нуклеиновых кислот могут быть двухцепочечные молекулы, а термин “конкретный сайт на одной цепи” также означает соответствующий сайт на комплементарной цепи. Таким образом, при определении “полиморфного сайта” указание на аденин, тимин (уридин), цитозин или гуанин в конкретном сайте на плюс-цепи (смысловой или кодирующей цепи) молекулы нуклеиновой кислоты также означает, что в соответствующем сайте на минус-цепи (антисмысловой или некодирующей цепи) комплементарной цепи молекулы нуклеиновой кислоты присутствуют тимин (уридин), аденин, гуанин или цитозин (соответственно). Таким образом, может быть упомянута любая цепь, содержащая тот же самый полиморфный сайт и олигонуклеотид, который может быть сконструирован для гибридизации с любой из этих цепей. В описании настоящего изобретения при идентификации полиморфного сайта для удобства может быть упомянута лишь смысловая цепь.
1
1
Обычно смесь нуклеиновых кислот выделяют из биологического образца, такого как проба крови или образец ткани, взятые у индивидуума стандартными методами, такими как методы, описанные в публикации Jones (1963), которая вводится в настоящее описание посредством ссылки. Подходящими образцами ткани являются цельная кровь, сперма, слюна, слезы, моча, кал, пот, щечный препарат, кожа и волосы. Указанная смесь нуклеиновых кислот может состоять из геномной ДНК, мРНК или кДНК, а в последних двух случаях биологический образец должен быть получен из органа, в котором экспрессируется ген βAR. Кроме того, для специалиста в данной области очевидно, что препараты мРНК или кДНК не могут быть использованы для детекции полиморфизма, имеющегося в интронах или в 5'- и в 3'-нетранскрибируемых областях. Если фрагмент гена βAR является выделенным, то он должен содержать полиморфный(е) сайт(ы), который(е) подлежит(ат) генотипированию.
Возможность прогнозировать ответ пациента на лечение β-агонистом является важным фактором, позволяющим врачам принять решение о выборе способа лечения пациента с сердечной недостаточностью. Пациент, генотип которого указывает на то, что у него может наблюдаться положительный ответ на лечение агонистом, может иметь больше шансов на благоприятное лечение β-блокаторами, чем пациент, у которого, вероятно, будет наблюдаться промежуточный ответ или вообще не будет наблюдаться какого-либо ответа на такое лечение, и врач может с меньшими усилиями и ошибками определить, которому из индивидуумов необходимо назначить альтернативную форму терапии.
1
2c
В методах генотипирования, применяемых в настоящем изобретении, идентичность нуклеотидов (или пары нуклеотидов) в полиморфном сайте может быть определена путем амплификации области(ей)-мишени(ей), содержащей(их) указанный(е) полиморфный(е) сайт(ы), непосредственно из одной или обеих копий гена βAR и/или гена αAR, присутствующих у индивидуума, и последовательности амплифицированной(ых) области(ей), определенной(ых) стандартными методами. Для каждого специалиста в данной области очевидно, что в полиморфном сайте у индивидуумов, являющихся гомозиготными по этому сайту, может быть детектирован только один нуклеотид, тогда как у индивидуумов, являющихся гетерозиготными по этому сайту, могут быть детектированы два различных нуклеотида. Полиморфизм может быть идентифицирован прямым методом, известным как идентификация позитивного типа, или путем выведения по аналогии, называемого идентификацией негативного типа. Так, например, если известно, что в сравниваемой популяции полиморфизм (SNP) имеется в положении гуанина и цитозина, то сайт может быть позитивно определен как сайт, содержащий либо гуанин, либо цитозин, если индивидуум является гомозиготным по этому сайту, или как сайт, содержащий и гуанин, и цитозин, если ндивидуум является гетерозиготным по этому сайту. Альтернативно такой сайт может быть негативно определен как сайт, не содержащий гуанин (т.е. содержащий цитозин/цитозин) или не содержащий цитозин (т.е. содержащий гуанин/гуанин).
Указанная(ые) область(и)-мишень(и) может (могут) быть амплифицирована(ы) любым методом олигонуклеотид-направленной амплификации, включая, но не ограничиваясь ими, методы полимеразной цепной реакции (ПЦР) (патент США №4965188), лигазной цепной реакции (ЛЦР) (Barany et al., 1991; WO 90/01069) и анализ путем лигирования олигонуклеотидов (OLA) (Landegren et al., 1988). Олигонуклеотиды, используемые в таких методах в качестве праймеров или зондов, должны специфически гибридизоваться с областью нуклеиновой кислоты, содержащей полиморфный сайт, или смежной с указанным полиморфным сайтом. Обычно олигонуклеотиды имеют длину от 10 до 35 нуклеотидов, а предпочтительно от 15 до 30 нуклеотидов. Наиболее предпочтительно такие олигонуклеотиды имеют длину 20-25 нуклеотидов. Точная длина олигонуклеотида зависит от многих факторов, которые обычно известны и учитываются специалистами.
Для амплификации области-мишени могут быть использованы и другие известные процедуры амплификации нуклеиновых кислот, включая системы амплификации на основе транскрипции (патент США No. 5130238; EP 329822; патент США No. 5169766; WO 89/06700) и изотермические методы (Walker et al., 1992).
Полиморфизм в области-мишени может быть также проанализирован до или после амплификации с применением одного из ряда методов гибридизации, известных специалистам. Обычно для осуществления таких методов используются аллель-специфические олигонуклеотиды. Аллель-специфические олигонуклеотиды могут быть использованы в качестве различно меченых пар зондов, где один член этой пары указывает на точное соответствие одному варианту последовательности-мишени, а другой член указывает на точное соответствие другому варианту. В некоторых вариантах изобретения за один раз могут быть детектированы более чем один полиморфный сайт с использованием серии аллель-специфических олигонуклеотидов или олигонуклеотидных пар.
Гибридизация аллель-специфического олигонуклеотида с полинуклеотидом-мишенью может быть осуществлена с использованием обеих молекул в растворе либо такая гибридизация может быть осуществлена путем ковалентного или нековалентного связывания указанного олигонуклеотида или полинуклеотида-мишени с твердым носителем. Такое связывание может быть опосредовано, например, взаимодействием “антитело-антиген”, поли-L-лизином, стрептавидином или взаимодействием “авидин-биотин”, солевыми мостиками, гидрофобными взаимодействиями, химическими связями, лигированием посредством УФ-сшивания и т.п. Аллель-специфические олигонуклеотиды могут быть синтезированы непосредственно на твердом носителе либо перед синтезом они могут быть иммобилизованы на твердом носителе. Твердыми носителями, подходящими для использования в способах детекции согласно изобретению, являются субстраты, полученные из кремния, стекла, пластика, бумаги и т.п., которые могут быть сформованы, например, с получением лунок (как в 96-луночных планшетах), предметных стекол, пластин, мембран, волокон, чипов, чашек и сфер. Для облегчения иммобилизации аллель-специфического олигонуклеотида или нуклеиновой кислоты-мишени такой твердый носитель может быть обработан, покрыт или дериватизирован соответствующим материалом.
1
Генотип для одного или нескольких полиморфных сайтов в гене βAR индивидуума может быть также определен путем гибридизации одной или нескольких копий данного гена или его фрагмента с массивами и субмассивами нуклеиновых кислот, описанными, например, в WO 95/11995. Эти массивы должны содержать ряд аллель-специфических олигонуклеотидов, представляющих каждый из полиморфных сайтов, которые могут быть включены в данный генотип или гаплотип.
Идентичность полиморфизмов может быть также определена методом детекции ошибочного спаривания оснований, включая, но не ограничиваясь ими, метод защиты от РНКазы с использованием рибозондов (Winter et al., 1985; Meyers et al., 1985) и белков, которые распознают ошибочное спаривание нуклеотидов, например, таких белков, как белок mutS E.coli (Modrich, 1991). Альтернативно аллели вариантов могут быть идентифицированы с помощью анализа одноцепочечного конформационного полиморфизма (SSCP) (Orita et al., 1989; Humphries et al., 1996) или электрофореза в градиентном денатурирующем геле (DGGE) (Wartell et al., 1990; Sheffield et al., 1989).
Для идентификации полиморфизма(ов) может быть также использован метод опосредуемого полимеразой удлинения праймера. Некоторые такие методы описаны в патентной и научной литературе. Удлиненные праймеры, содержащие полиморфизм, могут быть детектированы с помощью масс-спектрометрии, как описано в патенте США No. 5605798. Другим методом удлинения праймеров является аллель-специфическая ПЦР (Ruano et al., 1989; Ruano et al., 1991; WO 93/22456; Turki et al., 1995).
1
1
Полиморфная вариабельность в положении нуклеотида 1165 человеческого гена βAR может быть также детектирована посредством дифференциального гидролиза ДНК некоторыми рестриктирующими ферментами (Small et al., 2002) или любым другим методом идентификации нуклеотида в положении 1165 гена βAR.
Гибридизация
а.
Использование зонда или праймера длиной в 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 нуклеотидов, а предпочтительно от 17 до 100 нуклеотидов, либо, в некоторых аспектах изобретения, длиной до 1-2 т.п.н. или более, позволяет получить информацию о дуплексной молекуле, которая является стабильной и селективной. Для повышения стабильности и/или селективности полученных гибридных молекул обычно предпочтительными являются молекулы, имеющие комплементарные последовательности, состоящие из смежных фрагментов длиной более чем 20 нуклеотидов. Для гибридизации обычно предпочтительно получить молекулы нуклеиновой кислоты, имеющие одну или несколько комплементарных последовательностей в 20-30 нуклеотидов или даже более, если это необходимо. Такие фрагменты могут быть легко получены, например, путем прямого химического синтеза указанного фрагмента или путем введения выбранных последовательностей в рекомбинантные векторы для продуцирования рекомбинантных ДНК.
В соответствии с этим нуклеотидные последовательности согласно изобретению могут быть использованы благодаря их способности селективно образовывать дуплексные молекулы с комплементарными фрагментами ДНК и/или РНК или образовывать праймеры для амплификации ДНК или РНК из образцов. В зависимости от применения в целях достижения различных степеней селективности зонда или праймеров для последовательности-мишени желательно использовать различные условия гибридизации.
4
Для применения, требующего высокой селективности, обычно желательно использовать условия относительно высокой жесткости для образования гибридов. Так, например, такие условия предусматривают использование относительно низких концентраций соли и/или высоких температур, таких как примерно 0,02 M - 0,10 M NaCl при температурах примерно 50°С-70°С. Такие условия высокой жесткости допускают незначительные, если они вообще присутствуют, ошибочные спаривания зондов или праймеров с матрицей или цепью-мишенью, и могут быть особенно подходящими для выделения специфических генов или для детекции конкретного полиморфизма. Известно, что условия могут быть сделаны более жесткими путем добавления возрастающих количеств формамида. Так, например, в условиях высокой жесткости гибридизация с ДНК, связанной с фильтром, может быть осуществлена в 0,5 M NaHPO, 7% додецилсульфате натрия (ДСН), 1 мМ EDTA при 65°С с промывкой в 0,1×SSC/0,1% ДСН при 68°С (Ausubel et al., 1989).
Условия могут быть сделаны менее жесткими путем добавления возрастающей концентрации соли и/или путем снижения температуры. Так, например, условия умеренной жесткости могут быть достигнуты с использованием примерно 0,1-0,25 M NaCl при температуре примерно 37°С-55°С, а условия низкой жесткости могут быть достигнуты с использованием примерно 0,15-0,9 M соли при температуре примерно 20°С-55°С. В условиях низкой жесткости, например в условиях умеренной жесткости, промывка может быть осуществлена, например, в 0,2×SSC/0,1% ДСН при 42°С (Ausubel et al., 1989). Условия гибридизациии могут быть легко изменены в зависимости от нужных результатов.
2
2
В других вариантах изобретения гибридизация может быть осуществлена, например, в условиях, предусматривающих использование 50 мМ Tris-HCl (pH 8,3), 75 мМ KCl, 3 мМ MgCl, 1,0 мМ дитиотреитола, при температурах примерно 20°С-37°С. Другие условия гибридизации предусматривают использование приблизительно 10 мМ Tris-HCl (pH 8,3), 50 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl, при температурах примерно 40°С-72°С.
В некоторых вариантах изобретения для детекции гибридизации предпочтительно использовать нуклеиновые кислоты с определенными последовательностями согласно изобретению в комбинации с соответствующими средствами, такими как метка. Специалистам известен широкий ряд подходящих идентифицирующих средств, включая флуоресцентные, радиоактивные, ферментативные или другие лиганды, такие как авидин/биотин, которые могут быть детектированы. В предпочтительных вариантах изобретения вместо радиоактивных или других нежелательных с экологической точки зрения реагентов может оказаться предпочтительным использовать флуоресцентную метку или ферментативную метку, такую как уреаза, щелочная фосфатаза или пероксидаза. В случае ферментативных меток для идентификации специфической гибридизации с образцами, содержащими комплементарную нуклеиновую кислоту, могут быть использованы известные колориметрические субстраты-индикаторы, представляющие собой средства для детекции, которые могут быть детектированы визуально или спектрофотометрически. В других аспектах изобретения может быть использован конкретный сайт расщепления нуклеазой, а детекция конкретной нуклеотидной последовательности может быть определена по наличию или отсутствию расщепления нуклеиновой кислоты.
Обычно предусматривается, что описанные здесь зонды или праймеры могут быть использованы в качестве реагентов для гибридизации в растворе, например, как при ПЦР, для детекции экспрессии или определения генотипа соответствующих генов, а в некоторых вариантах может быть также проведен твердофазный анализ. В вариантах изобретения с применением твердой фазы тестируемую ДНК (или РНК) адсорбируют или как-либо иначе иммобилизуют на выбранной матрице или поверхности. Затем эту фиксированную одноцепочечную нуклеиновую кислоту подвергают гибридизации с выбранными зондами в нужных условиях. Выбор условий зависит от конкретных факторов (например, от содержания G+C, типа нуклеиновой кислоты-мишени, источника нуклеиновой кислоты, размера зонда для гибридизации и т.п.). Оптимизация условий гибридизации для конкретного представляющего интерес применения хорошо известна специалистам. После промывки гибридизованных молекул для удаления неспецифически связанных молекул зондов гибридизацию детектируют и/или количественно оценивают путем определения количества связанной метки. Репрезентативные методы твердофазной гибридизации описаны в патентах США 5843663, 5900481 и 5919626. Другие методы гибридизации, которые могут быть применены в настоящем изобретении, описаны в патентах США 5849481, 5849486 и 5851772. Соответствующие части этих и других работ, цитируемых в данном разделе описания изобретения, вводятся в настоящее изобретение посредством ссылки.
Амплификация нуклеиновых кислот
b.
Нуклеиновые кислоты, используемые в качестве матрицы для амплификации, могут быть выделены из клеток, тканей или других образцов в соответствии со стандартной методикой (Sambrook et al., 2001). В некоторых вариантах изобретения анализ осуществляют на целых клетках или тканевых гомогенатах, или на образцах биологической жидкости с тщательной или без тщательной очистки матричной нуклеиновой кислоты. Такой нуклеиновой кислотой может быть геномная ДНК, либо фрагментированная или полноразмерная клеточная РНК. При использовании РНК может оказаться желательным сначала преобразовать РНК в комплементарную ДНК.
Используемый здесь термин “праймер” означает любую нуклеиновую кислоту, способную инициировать синтез растущей нуклеиновой кислоты в способе синтеза на матрице. Обычно такими праймерами являются олигонуклеотиды длиной от десяти до двадцати и/или тридцати пар нуклеотидов, но могут быть использованы и более длинные последовательности. Праймеры могут быть получены в двухцепочечной и/или в одноцепочечной форме, хотя предпочтительной является одноцепочечная форма.
1
Пары праймеров, сконструированных для селективной гибридизации с нуклеиновыми кислотами, соответствующими локусу гена βAR, или их вариантами и фрагментами, подвергают контакту с матричной нуклеиновой кислотой в условиях, позволяющих осуществлять селективную гибридизацию. В зависимости от целей применения могут быть выбраны условия гибридизации высокой жесткости, которые позволяют осуществлять гибридизацию только с последовательностями, полностью комплементарными указанным праймерам. В других вариантах изобретения гибридизация может быть осуществлена в условиях пониженной жесткости, позволяющих амплифицировать нуклеиновые кислоты, содержащие одно или несколько ошибочных спариваний с последовательностями праймеров. После гибридизации комплекс “матрица-праймер” подвергают контакту с одним или несколькими ферментами, которые облегчают синтез нуклеиновой кислоты на матрице. Множество раундов амплификации, также называемых “циклами”, проводят до тех пор, пока не будет продуцировано достаточное количество амплифицированного продукта.
Продукт амплификации может быть детектирован, проанализирован или количественно оценен. В некоторых вариантах изобретения детекция может быть осуществлена визуально. В некоторых вариантах изобретения детекция может быть проведена путем непрямой идентификации продукта посредством хемилюминесценции или радиоизотопной сцинтиграфии включенной радиоактивной метки или флуоресцентной метки, или даже системы с использованием электрических и/или тепловых импульсных сигналов (Affymax technology; Bellus, 1994).
Для амплификации олигонуклеотидных последовательностей, присутствующих в данном образце матрицы, могут быть применены различные существующие методы синтеза на матрице. Одним из наиболее известных методов амплификации является полимеразная цепная реакция (называемая ПЦР™), подробно описанная в патентах США 4683195, 4683202 и 4800159 и в работе Innis et al., 1988, которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
Другим методом амплификации является лигазная цепная реакция (ЛЦР), описанная в заявке на европейский патент No. 320308, которая во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки. В патенте США 4883750 описан метод, аналогичный ЛЦР и проводимый для связывания пар зондов с последовательностью-мишенью. Могут быть также применены метод на основе ПЦР™ и олигонуклеотидный лигазный анализ (ОЛГ) (более подробно описанный ниже), описанный в патенте США 5912148.
Альтернативные методы амплификации последовательностей нуклеиновой кислоты-мишени, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, описаны в патентах США 5843650, 5846709, 5846783, 5849546, 5849497, 5849547, 5858652, 5866366, 5916776, 5922574, 5928905, 5928906, 5932451, 5935825, 5939291 и 5942391, в заявке на патент Великобритании 2202328 и в заявке PCT/US 89/01025, которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки. В качестве средства для амплификации согласно изобретению может быть также использована репликаза Qbeta, описанная в заявке PCT/US 87/00880.
Для амплификации нуклеиновых кислот согласно изобретению может быть также применен метод изотермической амплификации, в котором используются рестриктирующие эндонуклеазы и лигазы в целях достижения амплификации молекул-мишеней, содержащих нуклеотид 5'-[альфа-тио]трифосфаты в одной цепи рестрикционного сайта (Walker et al., 1992). Другим методом осуществления изотермической амплификации нуклеиновых кислот, который включает множество раундов замещения и синтеза цепи, т.е. ник-трансляции, является амплификация с замещением цепи (SDA), описанная в патенте США 5916779.
Другими методами амплификации нуклеиновых кислот являются системы амплификации на основе транскрипции (TAS), включая амплификацию на основе последовательности нуклеиновой кислоты (NASBA) и 3SR (Kwoh et al., 1989; заявка PCT WO 88/10315, которая во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки). В европейской заявке 329822 описан метод амплификации нуклеиновой кислоты, включающий циклический синтез одноцепочечной РНК (оцРНК), оцДНК и двухцепочечной ДНК (дцДНК), которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением.
В заявке РСТ WO 89/06700 (которая во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки) описана схема амплификации последовательности нуклеиновой кислоты, основанной на гибридизации последовательности промоторной области/праймера с одноцепочечной ДНК-мишенью (дцДНК) с последующей транскрипцией множества РНК-копий данной последовательности. Эта схема не является циклической, т.е. из полученных РНК-транскриптов не продуцируются новые матрицы. Другими методами амплификации являются RACE и односторонняя ПЦР (Frohman, 1990; Ohara et al., 1989).
Детекция нуклеиновых кислот
c.
После проведения любой амплификации может оказаться желательным отделить продукт амплификации от матрицы и/или избытка праймера. В одном из вариантов изобретения продукты амплификации разделяют с помощью электрофореза в агарозном геле, в агарозном-акриламидном геле или в полиакриламидном геле стандартными методами (Sambrook et al., 2001). Выделенные продукты амплификации могут быть вырезаны и элюированы из геля для проведения последующих манипуляций. С использованием агарозных низкоплавких гелей выделенная полоса может быть удалена путем нагревания геля с последующей экстракцией нуклеиновой кислоты.
Выделение нуклеиновых кислот может быть также осуществлено на центрифужных колонках и/или хроматографическими методами, известными специалистам. Существует множество видов хроматографий, которые могут быть применены в настоящем изобретении, включая адсорбционную хроматографию, разделительную хроматографию, ионообменную хроматографию, хроматографию на гидроксиапатитах, хроматографию на молекулярных ситах, обращенно-фазовую хроматографию, колоночную хроматографию, хроматографию на бумаге, тонкослойную хроматографию и газовую хроматографию, а также ВЭЖХ.
В некоторых вариантах изобретения продукты амплификации визуализируют с выделением или без выделения. Типичный метод визуализации включает окрашивание геля этидийбромидом и визуализацию полос путем УФ-облучения. Альтернативно, если продукты амплификации совокупно помечены радиоактивно или флуориметрически мечеными нуклеотидами, то выделенные продукты амплификации могут быть экспонированы с рентгеновской пленкой или визуализированы в виде соответствующих спектров возбуждения.
В одном из вариантов изобретения после выделения продуктов амплификации меченый нуклеиновокислотный зонд подвергают контакту с амплифицированной маркерной последовательностью. Этот зонд предпочтительно конъюгируют с хромофором, но он может быть также помечен радиоактивной меткой. В другом варианте изобретения зонд конъюгируют с партнером по связыванию, таким как антитело или биотин, или с другим партнером по связыванию, содержащим детектируемую молекулу.
В конкретных вариантах изобретения детекцию осуществляют с помощью Саузерн-блот-анализа и гибридизации с меченым зондом. Методы Саузерн-блоттинга хорошо известны специалистам (см. Sambrook et al., 2001). Один из вышеупомянутых примеров описан в патенте США 5279721, который вводится в настоящее описание посредством ссылки и в котором описано устройство и метод автоматизированного электрофореза и переноса нуклеиновых кислот. Такое устройство позволяет проводить электрофорез и блоттинг без дополнительных модификаций геля и идеально подходит для осуществления способов согласно изобретению.
Другие методы детекции нуклеиновой кислоты, которые могут быть использованы для осуществления настоящего изобретения, описаны в патентах США 5840873, 5843640, 5843651, 5846708, 5846717, 5846726, 5846729, 5849487, 5853990, 5853992, 5853993, 5856092, 5861244, 5863732, 5863753, 5866331, 5905024, 5910407, 5912124, 5912145, 5919630, 5925517, 5928862, 5928869, 5929227, 5932413 и 5935791, каждый из которых вводится в настоящее описание посредством ссылки.
Другие анализы
d.
Для детекции мутаций в образцах геномной ДНК, кДНК и/или РНК могут быть использованы, например, и другие методы генетического скрининга, входящие в объем настоящего изобретения. Методами, применяемыми для детекции точковых мутаций, являются электрофорез в градиенте денатурирующего геля (DGGE), анализ на полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (RFLP), методы химического или ферментативного расщепления, прямое секвенирование областей-мишеней, амплифицированных с помощью ПЦР (см. выше), анализ на одноцепочечный конформационный полиморфизм (SSCP) и другие методы, хорошо известные специалистам.
Другой метод скрининга точковых мутаций основан на расщеплении РНКазой ошибочных спариваний пар нуклеотидов в гетеродуплексах РНК/ДНК или РНК/РНК. Используемый здесь термин “ошибочное спаривание” определяют как область, состоящую из одного или нескольких неспаренных или ошибочно спаренных нуклеотидов в двухцепочечной молекуле РНК/РНК, РНК/ДНК или ДНК/ДНК. Таким образом, это определение включает ошибочное спаривание, обусловленное инсерционными/делеционными мутациями, а также мутациями в одном или в нескольких положениях нуклеотидов.
В патенте США 4946773 описан анализ методом расщепления ошибочного спаривания РНКазой А, который включает отжиг одноцепочечной ДНК или РНК в тест-образцах с РНК-зондом и последующую обработку дуплексов РНКазой А. Для детекции ошибочного спаривания одноцепочечные продукты обработки РНКазой А, которые были электрофоретически фракционированы по размерам, сравнивают с аналогичным образом обработанными дуплексами. Образцы, содержащие более мелкие фрагменты (продукты расщепления), не наблюдаемые в контрольном дуплексе, оценивались как позитивные.
Другими исследователями было описано использование РНКазы I в анализах на ошибочное спаривание. Использование РНКазы I для детекции ошибочного спаривания описано в литературе (Promega Biotech). Promega выпускает набор, содержащий РНКазу I, которая, как сообщалось, расщепляет три из четырех известных ошибочных спариваний. В других работах описано использование белка MutS или других ДНК-репарирующих ферментов для детекции ошибочных спариваний в одном основании.
Альтернативные методы детекции делеционных мутаций, инсерционных мутаций или мутаций в результате замены, которые могут быть использованы для осуществления настоящего изобретения, описаны в патентах США 5849483, 5851770, 5866337, 5925525 и 5928870, каждый из которых во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.
Конкретные примеры методов скрининга полиморфизма нуклеиновых кислот
е.
Спонтанные мутации, которые возникают в процессе эволюции в геномах организмов, часто не передаются непосредственно всем членам определенного вида, в результате чего образуются полиморфные аллели, которые совместно присутствуют в популяциях этого вида. Такой полиморфизм часто является причиной возникновения генетических заболеваний. Было идентифицировано несколько классов полиморфизмов. Так, например, полиморфизмы с варьирующимся числом нуклеотидов (VNTR) возникают в результате спонтанной тандемной дупликации ди- или тринуклеотидных повторяющихся мотивов нуклеотидов. Если такие вариации приводят к изменению длин фрагментов ДНК, генерируемых расщеплением рестриктирующей эндонуклеазой, то такие вариации называются полиморфизмами длин рестрикционных фрагментов (RFLP). RFLP широко используются в генетических анализах у человека и животных.
Полиморфизмы другого класса образуются в результате замены одного нуклеотида. Такой полиморфизм в одном нуклеотиде (SNP) изредка приводит к изменениям в сайте рестрикции эндонуклеазой. Таким образом, SNP представляют собой полиморфизм, редко детектируемый в анализе длин рестрикционных фрагментов. Полиморфизмы SNP представляют собой наиболее распространенные генетические изменения и возникают лишь с частотой один полиморфизм на каждые 100-300 оснований, причем были обнаружены некоторые SNP-мутации, которые влияют на один нуклеотид в белок-кодирующем гене на уровне, фактически, достаточном для возникновения генетического заболевания. Примерами SNP-заболеваний являются гемофилия, серповидно-клеточная анемия, наследственный гемохроматоз, поздняя болезнь Альцгеймера и т.п.
Для скрининга полиморфизма было разработано несколько методов и некоторые примеры таких методов перечислены ниже. В работах Kwok & Chen (2003) и Kwok (2001) дан обзор некоторых из этих методов, и обе эти работы вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
SNP, относящиеся к ABCC2, могут быть охарактеризованы путем применения любого из этих методов или подходящих их модификаций. Такими методами являются прямое или опосредованное секвенирование конкретного сайта, метод с использованием рестриктирующих ферментов, где соответствующие аллели этого сайта могут образовывать или разрушать рестрикционный сайт, метод с использованием зондов для аллель-специфической гибридизации, метод с использованием антител, которые являются специфичными для белков, кодируемых различными аллелями с полиморфизмом, или любые другие биохимические методы.
ДНК-секвенирование
i.
Наиболее часто используемым методом характеризации полиморфизма является прямое секвенирование ДНК генного локуса, который фланкирует и включает такой полиморфизм. Указанный анализ может быть проведен либо с применением “метода дидезокси-опосредуемой терминации цепи”, также известного как “метод Сэнгера” (Sanger et al., 1975) или “метода химической деградации”, также известного как “метод Максама-Джильберта” (Maxam et al., 1977). Секвенирование в комбинации с технологией амплификации на основе геномной последовательности, такой как полимеразная цепная реакция, может быть использовано для облегчения выделения нужных генов (Mullis et al., 1986; европейская патентная заявка 50424; европейская патентная заявка 84796, европейская патентная заявка 258017, европейская патентная заявка 237362; европейская патентная заявка 201184; патенты США 4683202; 4582788 и 4683194), которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
Резистентность к экзонуклеазе
ii.
В других методах, которые могут быть применены для определения идентичности нуклеотидов, присутствующих в полиморфном сайте, используется специализированное резистентное к экзонуклеазе нуклеотидное производное (патент США 4656127). Праймер, комплементарный аллельной последовательности, локализованной непосредственно со стороны 3'-конца от полиморфного сайта, гибридизуют с исследуемой ДНК. Если этот полиморфный сайт на ДНК содержит нуклеотид, комплементарный конкретному резистентному к экзонуклеазе нуклеотидному производному, то такое производное будет вводиться полимеразой в конец указанного гибридизованного праймера. Такое включение делает этот праймер резистентным к расщеплению экзонуклеазой и тем самым позволяет осуществлять его детекцию. Поскольку последовательность резистентного к экзонуклеазе нуклеотидного производного является известной, то может быть определен конкретный нуклеотид, присутствующий в полиморфном сайте данной ДНК.
Методы микросеквенирования
iii.
Были описаны и некоторые другие методы включения нуклеотидов с помощью праймеров, применяемые для анализа полиморфных сайтов в ДНК (Komher et al., 1989; Sokolov, 1990; Syvanen 1990; Kuppuswamy et al., 1991; Prezant et al., 1992; Ugozzoll et al., 1992; Nyren et al., 1993). Эти методы основаны на включении меченых дезоксинуклеотидов для определения различий между основаниями в полиморфном сайте. Поскольку сигнал пропорционален числу включенных дезоксинуклеотидов, то полиморфизм, который присутствует в последовательности одних и тех же нуклеотидов, дает сигнал, пропорциональный длине этой последовательности (Syvanen et al., 1990).
Удлинение в растворе
iv.
В патенте Франции 2650840 и в заявке PCT WO 91/02087 обсуждается метод определения идентичности нуклеотидов полиморфного сайта, осуществляемый в растворе. В этом методе используется праймер, комплементарный аллельным последовательностям, расположенным непосредственно у 3'-конца со стороны полиморфного сайта. Идентичность нуклеотидов в этом сайте определяют с использованием меченых дидезоксинуклеотидных производных, включенных на конце этого праймера, если он комплементарен нуклеотиду полиморфного сайта.
Анализ генетической информации или удлинение на твердой фазе
v.
В заявке РСТ WO 92/15712 описан способ, в котором используются смеси меченых терминаторов и праймера, комплементарного последовательности, локализованной со стороны 3'-конца от полиморфного сайта. Включенный меченый терминатор является комплементарным нуклеотиду, присутствующему в полиморфном сайте оцениваемой молекулы-мишени, а поэтому он может быть идентифицирован. В настоящем изобретении праймер или молекула-мишень иммобилизованы на твердой фазе.
Анализ путем лигирования олигонуклеотидов (OLA)
vi.
Этот анализ представляет собой другой твердофазный метод, в котором используются различные методики (Landegren et al., 1988). В этом анализе используются два олигонуклеотида, способных гибридизоваться с примыкающими последовательностями одной цепи ДНК-мишени. Один из этих олигонуклеотидов является биотинилированным, а другой имеет детектируемую метку. Если в последовательности-мишени присутствует полностью комплементарная последовательность, то эти олигонуклеотиды будут гибридизоваться так, что их концы будут присоединяться впритык и образовывать субстрат для лигирования. Лигирование позволяет выделять меченый олигонуклеотид с использованием авидина. Были также описаны и другие анализы детекции нуклеиновых кислот, основанные на этом методе и осуществляемые в комбинации с ПЦР (Nickerson et al., 1990). В данном случае ПЦР используют для достижения экспоненциальной амплификации ДНК-мишени, которую затем детектируют с помощью OLA.
Анализ генетической информации с помощью лигазы/полимеразы
vii.
В патенте США 5952174 описан способ, который также включает два праймера, способных гибридизоваться с примыкающими последовательностями молекулы-мишени. Гибридизованный продукт образуется на твердом носителе, на котором иммобилизована указанная мишень. В данном случае гибридизацию осуществляют так, чтобы праймеры были отделены друг от друга на один нуклеотид. Инкубирование этого гибридизованного продукта в присутствии смеси полимеразы, лигазы и нуклеозид-трифосфата, содержащей по меньшей мере один дезоксинуклеозид-трифосфат, позволяет осуществлять лигирование любой пары примыкающих друг к другу гибридизованных олигонуклеотидов. Добавление лигазы приводит к двум событиям, необходимым для генерирования сигнала, удлинению и лигированию. Этот метод обеспечивает более высокую специфичность и меньший уровень “фона”, чем методы, проводимые с применением только удлинения и лигирования, и, в отличие от анализов на основе полимеразы, этот метод, благодаря объединению этой стадии со второй стадией гибридизации и стадией лигирования, повышает специфичность полимеразной стадии в отношении сигнальной последовательности, присоединенной к твердой фазе.
Реакция инвазивного расщепления
viii.
Реакции инвазивного расщепления могут быть проведены для оценки клеточной ДНК на наличие конкретного полиморфизма. Такие реакции используются в технологии, называемой INVADER(R) (см., например, работы de Arruda et al., 2002; Stevens et al., 2003, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки). Обычно имеются три молекулы нуклеиновой кислоты: 1) олигонуклеотид, расположенный выше сайта-мишени (“вышерасположенный олигонуклеотид”), 2) олигонуклеотидный зонд, охватывающий указанный сайт-мишень (“зонд"), и 3) одноцепочечная ДНК с сайтом-мишенью (“мишень"). Вышерасположенный олигонуклеотид и зонд не перекрываются, но они содержат смежные последовательности. Зонд содержит донорный флуорофор, такой как флуоресцеин, и акцепторный краситель, такой как дабцил. Нуклеотид у 3'-конца вышерасположенного олигонуклеотида перекрывается с первой парой (“захватывает” первую пару) оснований дуплекса “зонд-мишень”. Затем зонд отщепляется под действием структуро-специфической 5'-нуклеазы, что приводит к отделению пары флуорофор/гаситель и к увеличению интенсивности флуоресценции, которая может быть детектирована. См., Lu et al., 2004.
В некоторых случаях такой анализ проводят на твердой поверхности или в формате массива.
Другие методы детекции SNP
ix.
1
Некоторые другие конкретные методы детекции и идентификации полиморфизма приводятся ниже и могут быть применены без всяких изменений или с соответствующими модификациями в сочетании с идентификацией полиморфизмов гена βAR согласно изобретению. Некоторые другие методы также описаны в Интернете на web-SNP-сайте NCBI www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP, который вводится в настоящее описание посредством ссылки.
В конкретном варианте изобретения удлиненные гаплотипы могут быть определены в любом из указанных локусов данной популяции, что позволяет точно установить, который из SNP является лишним, а который имеет важное значение для данных исследований. Последний называется “меткой SNP-гаплотипа (htSNP)', т.е. маркером, который позволяет обнаруживать гаплотипы гена или области неравновесия по сцеплению. См. публикации Johnson et al. (2001) и Ke and Cardon (2003), каждая из которых вводится в настоящее описание посредством ссылки.
VDA-анализ предусматривает применение геномных сегментов методами ПЦР-амплификации с удлинением с использованием реагентов TaKaRa LA Taq и других стандартных условий реакции. Такая амплификация с удлинением позволяет амплифицировать ДНК размером примерно 2000-12000 п.н. Гибридизация продуктов для получения массива детектируемых вариантов (VDA) может быть осуществлена в Центре по высокоэффективному скринингу Affymetrix (Affymetrix High Throughput Screening Center) и проанализирована с использованием компьютерных программ.
В методе, называемым анализом на чипах, применяется ПЦР-амплификация геномных сегментов в соответствии с протоколами стандартной ПЦР или ПЦР с удлинением. Продукты гибридизации анализируют с помощью VDA, см. публикацию Halushka et al. (1999), которая вводится в настоящее описание посредством ссылки. С помощью компьютерного анализа картины гибридизации SNP обычно классифицируют как “достоверные” полиморфизмы или “вероятные” полиморфизмы. В отличие от альтернативных методов детекции, таких как секвенирование нуклеотидов, в данном методе “достоверные” SNP были подтверждены на 100% за один раз, а “вероятные” SNP были подтверждены на 73% за один раз.
Другие методы включают просто ПЦР-амплификацию после гидролиза соответствующими рестриктирующими ферментами. Другие методы заключаются в секвенировании очищенных ПЦР-продуктов из известных геномных областей.
2
В еще одном методе ПЦР-амплификации подвергают отдельные экзоны или перекрывающиеся фрагменты больших экзонов. В этом методе конструируют праймеры из опубликованных последовательностей или последовательностей, взятых из баз данных, и ПЦР-амплификацию геномных ДНК осуществляют в условиях с использованием следующих реагентов: 200 нг ДНК-матрицы, 0,5 мкМ каждого праймера, 80 мкМ каждого из dCTP, dATP, dTTP и dGTP, 5% формамида, 1,5 мМ MgCl, 0,5 ед. полимеразы Taq и 0,1 объема буфера Taq. Затем осуществляют термоцикл и полученные ПЦР-продукты оценивают с помощью ПЦР-анализа на одноцепочечный конформационный полиморфизм (PCR-SSCP) в различных условиях, например в 5 или 10% полиакриламидном геле с 15% мочевиной в присутствии или в отсутствие 5% глицерина. Электрофорез проводят в течение ночи. ПЦР-продукты, которые указывают на изменение подвижности, подвергают повторной амплификации и секвенированию для идентификации нуклеотидных вариантов.
В методе, называемом CGAP-GAI (DEMIGLACE), в память вводят данные о последовательности и выравнивании последовательностей (из файла PHRAP.ace file), качественную оценку для запроса об основаниях последовательностей (из файла качества PHRED), данные о расстояниях (из программы PHYLIP dnadist и аналогичных программ) и запрашиваемые данные (PHRED “-d” switch). Последовательности выравнивают и каждый вертикальный фрагмент (“сектор”) полученной последовательности оценивают на расхождения. Любой такой сегмент рассматривают как кандидат SNP (DEMIGLACE). Для исключения секторов, которые, вероятно, не представляют собой истинные полиморфизмы, используют ряд фильтров DEMIGLACE. Такими фильтрами являются фильтры, которые (i) исключают последовательности в любом данном секторе из рассмотрения SNP, где оценки качества соседних последовательностей снижаются на 40% или более; (ii) из всех запросов для этого типа нуклеотидов исключают запросы, в которых максимальная амплитуда ниже 15-го процентиля; (iii) в вычислениях SNP не участвуют области последовательности, имеющие высокое число несоответствий с консенсусной последовательностью; (iv) из рассмотрения исключают запрос любого основания с альтернативным запросом, в котором пик составляет 25% или более от площади запрашиваемого пика; (v) исключают варианты, которые присутствуют только в одном направлении считывания. Оценки качества PHRED преобразуют в величины вероятности ошибки для каждого нуклеотида в данном секторе. Для вычисления апостериорной вероятности того, что имеется гетерогенность нуклеотидов в данном положении, используют стандартные байесовские методы.
В методе, называемом CU-RDF (RESEQ), ПЦР-амплификацию осуществляют из ДНК, выделенной из крови, с использованием специфических праймеров для каждого SNP, а после очистки в соответствии со стандартным протоколом для удаления неиспользованных праймеров и свободных нуклеотидов, проводят прямое секвенирование с использованием тех же самых или гнездовых праймеров.
В методе, называемом DEBNICK (METHOD-B), проводят сравнительный анализ кластеризованных последовательностей EST и эти последовательности подтверждают путем флуоресцентного секвенирования ДНК. В родственном методе, называемом DEBNICK (METHOD-С), проводят сравнительный анализ кластеризованных последовательностей EST, где оценка качества phred>20 в сайте ошибочного спаривания, средняя оценка качества phred ≥20 по 5 основаниям в 5'-FLANK и со стороны 3'-конца от SNP, т.е. в 5 основаниях со стороны 5'- и 3'-конца от SNP ошибочное спаривание отсутствует, а частота каждого аллеля равна по меньшей мере двум, и этот анализ подтверждают путем исследования кривых.
33
В методе, называемом ERO (RESEQ), для данных STS, имеющихся в электронных источниках, конструируют серию новых праймеров, которые используют для амплификации ДНК из 10 различных мышиных штаммов. Продукт амплификации от каждого штамма очищают в геле и секвенируют с использованием стандартного метода циклического секвенирования путем дидезокси-терминации цепи с использованием Р-меченых терминаторов. После этого на смежные дорожки секвенирующего геля загружают все ddATP-терминированные реакционные смеси, а затем все ddGTP-терминированные реакционные смеси и т.д. SNP идентифицируют путем визуального сканирования рентгенограмм.
В другом методе, называемом ERO (RESEQ-HT), для мышиных последовательностей ДНК, имеющихся в электронных источниках, конструируют серию новых праймеров, которые используют для амплификации ДНК из 10 различных мышиных штаммов. Продукт амплификации получают для каждого штамма и секвенируют путем обработки экзонуклеазой I и щелочной фосфатазой креветок. Секвенирование проводят с использованием готового набора для реакции секвенирования путем терминации красителем, ABI Prism Big Dye Terminator Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer), и образцы последовательностей подвергают электрофорезу на анализаторе ДНК 3700 (96-каппиллярный секвенатор).
2
FGU-CBT (SCA2-SNP) представляет собой метод, в котором область, содержащую SNP, подвергают ПЦР-амплификации с использованием праймеров SCA2-FP3 и SCA2-RP3. Примерно 100 нг геномной ДНК амплифицируют в 50 мл реакционного объема, содержащего конечную концентрацию 5 мМ Трис, 25 мМ KCl, 0,75 мМ MgCl, 0,05% желатина, 20 пмоль каждого праймера и 0,5 ед. ДНК-полимеразы Taq. Образцы денатурируют, отжигают и удлиняют, а затем ПЦР-продукт выделяют из полосы, вырезанной из агарозного геля с использованием, например, набора для гель-экстракции QIAquick (Qiagen) и секвенируют химическим методом терминации красителем на автоматическом секвенаторе ДНК ABI Prism 377 с использованием ПЦР-праймеров.
В методе, называемом JBLACK (SEQ/RESTRICT), осуществляют две независимых ПЦР-реакции с использованием геномной ДНК. Продукты первой реакции анализируют путем секвенирования, в результате чего обнаруживают уникальный рестрикционный FspI-сайт. Мутацию подтверждают в продукте второй ПЦР-реакции путем гидролиза ферментом FspI.
В методе, описанном как KWOK(1), SNP идентифицируют путем сравнения данных для геномных последовательностей высокого качества, полученных от четырех произвольно выбранных индивидуумов, путем прямого ДНК-секвенирования ПЦР-продуктов химическим методом терминации красителем (см. Kwok et al., 1996). В родственном методе, называемом KWOK(2), SNP идентифицируют путем сравнения данных для геномных последовательностей высокого качества, полученных от перекрывающихся клонов с крупными вставками, таких как бактериальные искусственные хромосомы (BAC) или искусственные хромосомы на основе P1 (PAC). Затем выявляют данные STS, содержащие эти SNP, и присутствие SNP в различных популяциях подтверждают путем секвенирования ДНК-пула (см. Taillon-Miller et al., 1998). В другом аналогичном методе, названном KWOK(3), SNP идентифицируют путем сравнения данных для геномных последовательностей высокого качества, полученных от перекрывающихся клонов с крупными вставками, таких как BAC или PAC. SNP, обнаруженные этим методом, представляют собой варианты последовательностей ДНК, локализованные между двумя донорными хромосомами, однако частота аллелей в общей популяции пока еще не была определена. В методе KWOK(5), SNP идентифицируют путем сравнения данных для геномных последовательностей высокого качества, полученных из образца гомозиготной ДНК и одного или нескольких образцов объединенных ДНК, посредством прямого ДНК-секвенирования ПЦР-продуктов химическим методом терминации красителем. Используемые STS были взяты из данных последовательностей, имеющихся в общедоступных базах данных. В частности, эти STS амлифицируют с помощью ПЦР из полноразмерной хорионаденомы (CHM), которая, как было показано, является гомозиготной по всем локусам, и из пула ДНК-образцов от 80 исходных образцов, полученных из CEPH (Центра по изучению полиморфизма у человека) (см. Kwok et al., 1994).
В другом таком методе KWOK (OverlapSnpDetectionWithPolyBayes), SNP детектируют с помощью автоматизированного компьютерного анализа перекрывающихся областей последовательностей человеческого геномного клона с крупными вставками. Для сбора данных последовательности клона получают непосредственно из Центров по крупномасштабному секвенированию. Это необходимо, поскольку последовательности с “качественными” основаниями отсутствуют/недоступны в Genbank. Обработка исходных данных включает анализ последовательности клонов и дает основную качественную информацию о соответствии. Конечным последовательностям (с “идеальным основанием”, частота появления ошибки ниже чем 1 на 10000 п.н.), которые не соответствуют последовательностям с “качественными” основаниями, дают стандартную оценку качества 40 (частота появления ошибки 1 на 10000 п.н.). “Черновые” последовательности, не имеющие соответствующих величин качества, отбрасывают. Обработанные последовательности вводят в локальную базу данных. Вариант каждой последовательности с известными маскированными человеческими повторами, также сохраняют. Маскировку повторов осуществляют с помощью программы MASKERAID. Детекцию предполагаемых перекрываний осуществляют с помощью программы WUBLAST. Для удаления результатов детекции с ложным перекрыванием, т.е. со сходством между парами последовательности клонов, образующихся в результате дупликации последовательностей, в отличие от истинного перекрывания, проводят несколько стадий фильтрации. При общей длине перекрывания и общем проценте сходства, число расхождений между нуклеотидами с высоким “качеством” оцениваются как “несоответствия высокого качества”. Результаты также сравнивают с данными рестрикционного картирования геномных клонов в Центре по геномному секвенированию при Вашингтонском Университете, с данными окончательных отчетов о перекрываниях и с данным, полученными при попытках сконструировать контиг последовательности в NCBI. Детекцию SNP осуществляют путем анализа перекрывания пар последовательностей клонов для выявления SNP-сайтов-кандидатов с использованием программ детекции SNP POLYBAYES. Различия в последовательностях между парами последовательностей оценивают на вероятность присутствия истинных вариантов последовательностей по отношению к ошибкам секвенирования. Этот способ требует оценок качества оснований для обеих последовательностей. При этом отбирают кандидаты с высокой оценкой. Это исследование ограничено вариантами пар оснований с одной модификацией типа замены. Оценку доверительного уровня SNP-кандидата осуществляют с помощью компьютерной программы POLYBAYES.
В методе, названном KWOK (анализ TaqMan), для определения генотипов у 90 произвольно отобранных индивидуумов используют анализ TaqMan. В методе, названном KYUGEN(Q1), ДНК-образцы, взятые у указанной группы индивидуумов, объединяют и анализируют с помощью PLACE-SSCP. Высоту пиков для каждого аллеля в анализе пулов корректируют по пикам в гетерозиготе, а затем используют для вычисления частоты аллелей. Этот метод позволяет с высокой степенью достоверности определить частоту аллелей выше 10%. Если частота аллелей равна 0 (нулю), то это означает, что такой аллель присутствует у индивидуумов, но при оценке пула соответствующий пик не наблюдается. Если частота аллелей равна 0-0,1, то это указывает на то, что в данном пуле детектируются минорные аллели, но их пики являются слишком низкими для их достоверной количественной оценки.
2
В еще одном методе, названном KYUGEN (Метод 1), ПЦР-продукты подвергают последующему мечению флуоресцентным красителем и анализируют с помощью автоматизированной системы капиллярного электрофореза в условиях SSCP (PLACE-SSCP). В серии экспериментов было проанализировано четыре или более отдельных ДНК с двумя объединенными ДНК или без них (Японский пул и исходный пул CEPH). Аллели идентифицировали путем визуального исследования. Отдельные ДНК с различными генотипами секвенировали и идентифицировали SNP. Частоту аллелей оценивали по высоте пиков в объединенных образцах после коррекции изменения сигнала с использованием высоты пиков для гетерозигот. Для использования в ПЦР праймеры метили так, чтобы на их концах присутствовали 5'-ATT или 5'-GTT для последующего мечения обеих цепей. Образцы ДНК (10 нг/мкл) амплифицировали в реакционных смесях, содержащих буфер (10 мМ Трис-HCl, pH 8,3 или 9,3, 50 мМ KCl, 2,0 мМ MgCl), 0,25 мкМ каждого праймера, 200 мкМ каждого dNTP и 0,025 единиц/мкл ДНК-полимеразы Taq, предварительно смешанной с анти-Taq антителом. Две цепи ПЦР-продуктов подвергали дифференциальному мечению нуклеотидами, модифицированными Rl10 и R6G, путем проведения реакции обмена фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I. Реакцию прекращали путем добавления EDTA и невключенные нуклеотиды дефосфорилировали путем добавления щелочной кишечной фосфатазы теленка. Для SSCP аликвоту флуоресцентно меченых ПЦР-продуктов и TAMRA-меченых внутренних маркеров добавляли к деионизованному формамиду и денатурировали. Капиллярный электрофорез проводят с использованием генетического анализатора ABI Prism 310 Genetic Analyzer. Для сбора и обработки данных использовали компьютерные программы (P-E Biosystems). ДНК индивидуумов (от двух до одиннадцати), включая ДНК, которые, как было обнаружено, имеют различные SSCP-генотипы, подвергали прямому секвенированию на секвенаторах ABI Prism 310 химическим методом терминации красителем Big-Dye. Трассировочные файлы множества последовательностей, полученных от ABI Prism 310, обрабатывали и выравнивали с помощью Phred/Phrap, а затем визуализировали с использованием программы просмотра Consed. SNP идентифицировали с помощью компьютерной программы PolyPhred и визуально оценивали.
В еще одном методе, названном KYUGEN (Method 2), индивидуумов с различными генотипами обследуют с помощью денатурирующей ВЭЖХ (DHPLC) или PLACE-SSCP (Inazuka et al., 1997) и определяют их последовательности для идентификации SNP. ПЦР осуществляют с использованием праймеров с 5'-ATT или 5'-GTT на их концах для последующего мечения обеих цепей. DHPLC-анализ осуществляют с использованием системы анализа фрагментов ДНК WAVE (Transgenomic). ПЦР-продукты вводят в колонку DNASep и разделяют в условиях, определенных с использованием программы WAVEMaker (Transgenomic). Две цепи ПЦР-продуктов подвергают дифференциальному мечению нуклеотидами, модифицированными Rl10 и R6G, путем проведения реакции обмена фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I. Реакцию прекращают добавлением EDTA и невключенные нуклеотиды дефосфорилируют добавлением щелочной фосфатазы кишечника теленка. Для выявления SSCP осуществляют капиллярный электрофорез с использованием генетического анализатора ABI Prism 310 Genetic Analyzer. [Для сбора и обработки данных используют] компьютерные программы Genescan (P-E Biosystems). ДНК индивидуумов, включая ДНК, которые, как было обнаружено, имеют различные генотипы, подвергают DHPLC, либо SSCP выявляют путем прямого секвенирования на секвенаторе ABI Prism 310 химическим методом терминации красителем Big-Dye. Трассировочные файлы множества последовательностей, полученных от ABI Prism 310, обрабатывают и выравнивают с помощью Phred/Phrap, а затем визуализируют с использованием программы просмотра Consed. SNP идентифицируют с помощью компьютерной программы PolyPhred и визуально оценивают. Данные хроматограммы EST-последовательностей в Unigene обрабатывают с помощью PHRED. Для идентификации предполагаемых SNP ошибочное спаривание в одном основании выявляют путем сравнения множества последовательностей, полученных с помощью программ PHRAP, BRO и POA для кластера Unigene. Программа BRO позволяет корректировать возможные ошибочно выявленные ориентации EST, а программа POA позволяет идентифицировать и анализировать нелинейные выравниваемые структуры, характерные для генных смесей/химер, которые могут продуцировать ложные SNP. Байесовская оценка используется для взвешивания истинного полиморфизма по отношению к ошибке секвенирования, ошибке выравнивания или неоднозначности, ошибке кластеризации или химерных EST-последовательностей, к оценке данных, таких как высота исходной хроматограммы, четкость, перекрывание и число пробелов; частота ошибок секвенирования; чувствительность к определенным условиям; происхождение кДНК-библиотек и т.п.
В методе, названном MARSHFIELD (Метод-B), перекрывание последовательностей человеческой ДНК, содержащих предполагаемый инсерционный/делеционный полиморфизм, идентифицируют путем поиска в общедоступных базах данных. ПЦР-праймеры, фланкирующие каждый полиморфный сайт, отбирают из консенсусных последовательностей. Для амплификации отдельных или объединенных геномных ДНК человека используют праймеры. Полученные ПЦР-продукты разделяют в денатурирующем полиакриламидном геле, а для оценки частоты аллелей в ДНК-пулах используют компьютерную программу PhosphorImager.
Неравновесное сцепление
f.
1
Полиморфизм при неравновесном сцеплении вместе с другим полиморфизмом, при котором идентификация одного полиморфизма является прогностическим фактором идентичности связанного с ним другого полиморфизма. Термин “неравновесное сцепление” (обозначенный здесь LD, хотя в литературе он также обозначается LED) означает ситуацию, при которой конкретная комбинация аллелей (т.е. вариант данного гена) или полиморфизм в двух локусах встречается чаще, чем это ожидается при случайном событии. Термин “значимый", используемый по отношению к неравновесному сцеплению, определяется специалистами как статистическая величина p или α, которая может составлять 0,25 или 0,1 и может быть равна 0,1, 0,05, 0,001, 0,00001 или менее. Полиморфизм в положении 389 белка βAR может быть определен путем оценки последовательности нуклеиновой кислоты с полиморфизмом при неравновесном сцеплении в положении 389. Таким образом, настоящее изобретение может быть осуществлено в отношении одного или нескольких полиморфизмов для проведения анализа гаплотипа. Термин “гаплотип” используется в своем обычном значении, понятном специалистам в данной области. Этот термин означает общий генотип для двух или более аллелей или полиморфизмов по одной из гомологичных хромосом.
Оценка белка
В.
1
1
Альтернативно полиморфный вариант может быть определен любым методом, который позволяет детектировать аминокислотную модификацию в положении 389 белка βAR. Настоящее изобретение не ограничивается любым конкретным методом, используемым для достижения этой цели. Так, например, у индивидуума может быть взят образец жидкости или ткани, а затем может быть определена аминокислота в положении 389 белка βAR. Такая детекция может быть осуществлена различными методами, включая анализы с использованием антител (Вестерн-блот-анализы, ELISA), либо может быть проведен аминокислотный анализ (жидкостная хроматография высокого давления или масс-спектроскопия), который позволяет определить, присутствует ли в данном белке Arg или Gly.
1
1
Поэтому в некоторых своих вариантах настоящее изобретение относится к композиции, содержащей по меньшей мере одну белковую молекулу, такую как белок βAR или белок, который связывается с белком βAR, такой как антитело. Используемые здесь термины “белковая молекула”, “белковая композиция”, “белковое соединение”, “белковая цепь” или “белковый материал”, по существу, означают, но не ограничиваются ими, белок, имеющий примерно более чем 200 аминокислот или полноразмерную эндогенную последовательность, транслируемую из гена; полипептид, имеющий примерно более чем 100 аминокислот, и/или пептид, имеющий примерно от 3 до 100 аминокислот. Все описанные выше термины, относящиеся к “белковым соединениям”, являются взаимозаменяемыми.
Белковые композиции могут быть получены любым методом, известным специалистам, включая экспрессию белка, полипептидов или пептидов, осуществляемую стандартными методами молекулярной биологии, выделение белковых соединений из природных источников или химический синтез белковых материалов. Нуклеотидные последовательности, белки, полипептидные и пептидные последовательности для различных генов были описаны ранее и могут быть найдены в компьютерных базах данных, известных среднему специалисту в данной области. Одна из таких баз данных имеется в банке данных Национального Центра биотехнологической информации и в базах данных (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Кодирующие области этих известных генов могут быть амплифицированы и/или экспрессированы описанными здесь методами или методами, известными среднему специалисту в данной области. Альтернативно специалистам в данной области известны различные коммерческие препараты белков, полипептидов и пептидов.
Очистка белков
1.
1
1
Может оказаться желательным выделить βAR из образца или выделить белок, который связывается с βAR, такой как антитело. Такие методы имеют широкое применение, и настоящее изобретение не ограничивается очисткой белка. Методы очистки белка хорошо известны специалистам. Такие методы, на первой стадии, включают первичное фракционирование клеточной среды с получением полипептидной и неполипептидной фракции. Для отделения полипептидной фракции от других белков представляющий интерес полипептид может быть затем очищен хроматографическими и электрофоретическими методами в целях осуществления частичной или полной очистки (или очистки до гомогенности). Аналитическими методами, особенно подходящими для получения чистого пептида, являются ионообменная хроматография, эксклюзионная хроматография, электрофорез в полиакриламидном геле и изоэлектрическое фокусирование. Особенно эффективным методом очистки белка является жидкостная экспресс-хроматография белков или даже ВЭЖХ.
В некоторых своих аспектах настоящее изобретение может относиться к очистке, а в конкретных вариантах изобретения - к тщательной очистке кодируемого белка или пептида. Используемый здесь термин “очищенный белок или пептид” означает композицию, выделяемую из других компонентов, где указанный белок или пептид очищают до любой степени по сравнению с его природным состоянием. Поэтому термин “очищенный белок или пептид” также означает белок или пептид, выделенный из среды, в которой он обычно присутствует в природе.
Вообще говоря, термин “очищенный” относится к композиции белков или пептидов, которая была подвергнута фракционированию для удаления различных других компонентов и которая, по существу, сохраняет свою выраженную биологическую активность. Если используется термин “по существу, очищенный”, то он относится к композиции, в которой указанный белок или пептид составляет основной компонент, т.е. составляет примерно 50%, примерно 60%, примерно 70%, примерно 80%, примерно 90%, примерно 95% или более от всех белков данной композиции.
Различные методы количественной оценки степени очистки белка или пептида будут очевидны из настоящего описания. Такими методами являются, например, определение специфической активности активной фракции или оценка количества полипептидов во фракции, проводимая с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ. Предпочтительным методом оценки чистоты фракции является вычисление специфической активности фракции, ее сравнение со специфической активностью исходного экстракта и, таким образом, вычисление степени чистоты, оцениваемой здесь как “относительная степень очистки”. Совершенно очевидно, что фактические единицы, используемые для обозначения количества активности, будут зависеть от конкретно выбранного способа очистки и от наличия или отсутствия детектируемой активности у экспрессируемого белка или пептида.
Специалистам в данной области известен ряд методов, подходящих для очистки белка. Такими методами являются, например, осаждение сульфатом аммония, полиэтиленгликолем (ПЭГ), или антителами и т.п., или путем тепловой денатурации с последующим центрифугированием; хроматографические стадии, такие как ионообменная хроматография, гель-фильтрация, обращенно-фазовая хроматография, хроматография на гидроксиапатитах и аффинная хроматография; изоэлектрическое фокусирование; гель-электрофорез и комбинации этих и других методов. Как, в основном, известно и очевидно специалистам, порядок проведения различных стадий очистки может быть изменен либо некоторые стадии могут быть исключены, в результате чего может быть осуществлен подходящий метод получения, по существу, очищенного белка или пептида.
Вообще говоря, необязательно, чтобы белок или пептид всегда имели наивысшую степень очистки. Действительно, в некоторых вариантах изобретения могут быть использованы продукты, имеющие меньшую степень очистки. Неполная очистка может быть проведена с использованием меньшего числа стадий очистки в данной комбинации либо с использованием различных форм одной и той же общей схемы очистки. Так, например, следует отметить, что катионообменная колоночная хроматография, осуществляемая с использованием ВЭЖХ-устройства, обычно дает большую “степень” очистки, чем тот же самый метод, в котором применяется хроматографическая система низкого давления. Методы, дающие более низкую степень относительной очистки, могут иметь преимущества для полного выделения белкового продукта или для сохранения активности экспрессируемого белка.
Известно, что миграция полипептида может варьироваться, и иногда значительно, в зависимости от условий проведения электрофореза в ДСН-ПААГ (Capaldi et al., 1977). Поэтому следует отметить, что кажущиеся молекулярные массы очищенных или частично очищенных продуктов экспрессии могут варьироваться в зависимости от условий проведения электрофореза.
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) характеризуется очень быстрым разделением с очень высоким разрешением пиков. Это достигается путем использования очень мелких частиц и высокого давления для поддержания адекватной скорости потока. Разделение может быть осуществлено за минуты либо максимум за час. Кроме того, в данном случае требуется лишь очень небольшой объем образца, поскольку эти частицы настолько малы и плотно упакованы, что фракция объема пустот составляет очень небольшую часть от объема слоя. Кроме того, не требуется очень большой концентрации образца, поскольку полосы являются настолько узкими, что образец приготавливают в очень небольшом разведении.
Гель-хроматография или хроматография на молекулярных ситах представляет собой специальный тип распределительной хроматографии, основанной на размерах молекул. Не претендуя на конкретную теорию, можно лишь отметить, что гель-хроматографию осуществляют на колонке, которую упаковывают мелкими частицами инертного вещества, содержащего небольшие поры, а затем более крупные молекулы отделяют от менее крупных молекул, поскольку они проходят через поры или не проникают в поры (обходят поры) в зависимости от их размера. Поскольку материал, из которого сделаны эти частицы, не адсорбирует молекулы, то единственным фактором, определяющим скорость потока, является размер. Следовательно, из колонки элюируются молекулы с уменьшающимся размером при условии, что их форма является относительно постоянной. Гель-хроматография является особенно ценным методом разделения молекул различных размеров, поскольку такое разделение не зависит от всех других факторов, таких как рН, ионная сила, температура и т.п. Кроме того, в данном случае фактически отсутствует адсорбция, а небольшое расширение зоны и объем элюции соответствуют молекулярной массе простого вещества.
Аффинная хроматография представляет собой хроматографическую процедуру, основанную на конкретной аффинности между выделяемым веществом и молекулой, которая может специфически связываться с этим веществом. Такое взаимодействие называется взаимодействие типа “рецептор-лиганд”. Колоночный материал синтезируется посредством ковалентного присоединения одного из партнеров по связыванию с нерастворимой матрицей. После чего этот колоночный материал может специфически адсорбировать данное вещество из раствора. Элюирование проводят благодаря изменению данных условий на условия, при которых не происходит связывания (например, при изменении рН, ионной силы и температуры).
Конкретным типом аффинной хроматографии, используемой для очистки углеводсодержащих соединений, является аффинная хроматография на лектине. Лектины представляют собой класс соединений, которые связываются с различными полисахаридами и гликопротеинами. Обычно лектины связываются с агарозой посредством бромциана. Конконавалин А, связанный с агарозой, является главным материалом такого типа и широко используется для выделения полисахаридов и гликопротеинов других лектинов, которыми являются лектин чечевицы, агглютинин проростков пшеницы, используемый для очистки N-ацетилглюкозаминиловых остатков, и лектин Helix pomatia. Сами лектины очищают посредством аффинной хроматографии с использованием углеводных лигандов. Лактозу используют для очистки лектинов из бобов клещевины и арахиса; мальтозу используют для экстракции лектинов из бобов чечевицы и коновалии мечевидной; N-ацетил-D-галактозамин используют для очистки лектинов из бобов сои; при этом N-ацетилглюкозаминил связывается с лектинами, происходящими от проростков пшеницы; D-галактозамин используют для получения лектинов из моллюсков, а L-фукоза связывается с лектинами лотоса.
Матрицей должно быть вещество, которое само не адсорбирует молекулы до какой-либо значительной степени и которое обладает химической стабильностью, физической стабильностью и термостабильностью. Указанный лиганд должен быть связан так, чтобы это не влияло на его связывающие свойства. Кроме того, этот лиганд должен обладать способностью к относительно прочному связыванию. Кроме того, должна быть обеспечена возможность элюировать данное вещество без разрушения образца или лиганда. Одной из наиболее распространенных форм аффинной хроматографии является иммуноаффинная хроматография. Получение антител, подходящих для использования в соответствии с настоящим изобретением, обсуждается ниже.
Антитела
2.
1
1
1
1
1
Другим вариантом настоящего изобретения являются антитела, а в некоторых случаях человеческое моноклональное антитело, которое является иммунореактивным по отношению к полипептидной последовательности человеческого βAR. Следует отметить, что антитела могут быть использованы для детекции βAR, в частности βAR, который имеет конкретный полиморфизм. При этом предусматривается, что антителами, особенно подходящими для осуществления настоящего изобретения, являются антитела, которые специфически связываются с белком βAR, имеющим Gly389, но не с белком βAR, имеющим Arg389, что позволяет различать эти две популяции.
Используемый здесь термин “антитело”, в своем широком смысле, означает любой иммунологически связывающийся агент, такой как IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. В общих чертах, IgG и/или IgM являются предпочтительными, поскольку они представляют собой наиболее распространенные антитела, присутствующие в организмах, и они могут быть очень легко продуцированы в лабораторных условиях.
2
Используемый здесь термин “антитело" означает любую антитело-подобную молекулу, имеющую антиген-связывающую область, и включает фрагменты антител, такие как Fab', Fab, F(ab'), однодоменные антитела (DAB), Fv, scFv (одноцепочечный Fv) и т.п. Методы получения и использования различных конструкций на основе антител и их фрагментов хорошо известны специалистам. Методы получения и характеризация антител также хорошо известны специалистам (см., например, публикацию Harlow et al., 1988, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки).
Продуцирование антител
а.
В некоторых своих вариантах настоящее изобретение относится к антителам. Так, например, целое моноклональное антитело или его часть могут быть использованы для определения аминокислоты в положении 389. Как подробно описано выше, помимо антител, продуцируемых против полноразмерных белков, могут быть также продуцированы антитела против менее крупных конструкций, содержащих эпитопные коровые области, включая эпитопы дикого типа и мутантные эпитопы. Методы получения и использования различных конструкций на основе антител и их фрагментов хорошо известны специалистам. Методы получения и характеризация антител также хорошо известны специалистам (см., например, публикацию Harlow & Lane, 1988, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки).
Известно, что моноклональные антитела (mAb) имеют некоторые преимущества, заключающиеся, например, в их репродуцируемости и в возможности их крупномасштабного продуцирования, и использование таких антител обычно является предпочтительным. Настоящее изобретение также относится к моноклональным антителам человека, мыши, обезьяны, крысы, хомячка, кролика и даже кур.
В методах генерирования моноклональных антител (mAb) обычно используются такие же линии, как и для получения поликлональных антител. Вкратце, поликлональное антитело может быть получено путем иммунизации животного иммуногенной полипептидной композицией согласно изобретению и сбора антисыворотки у указанного иммунизованного животного. Альтернативно в некоторых вариантах изобретения сыворотку берут у индивидуумов, которые могут быть подвергнуты контакту с конкретным антигеном. Контакт с конкретным антигеном может происходить в производственной среде, а именно в такой среде, в которой эти индивидуумы по роду своей деятельности подвергаются контакту с конкретным антигеном, и у которых вырабатываются поликлональные антитела на пептид, полипептид или белок. В некоторых вариантах изобретения поликлональная антисыворотка, взятая у индивидуумов, которые в силу своей профессии подвергаются контакту с антигеном, используется для идентификации антигенных областей в токсине гелонине методами иммунодетекции.
Для продуцирования антисыворотки могут быть использованы животные различных видов. Типичными животными, используемыми для продуцирования антисыворотки, являются кролики, мыши, крысы, хомячки, морские свинки или козы. Поскольку кролики имеют относительно большой объем крови, то они являются особенно предпочтительными для продуцирования поликлональных антител.
Как хорошо известно специалистам, данная композиция может варьироваться по своей иммуногенности. Поэтому иммунную систему хозяина часто необходимо стимулировать, и это может быть достигнуто путем связывания пептидного или полипептидного иммуногена с носителем. Репрезентативными и предпочтительными носителями являются гемоцианин лимфы улитки (KLH) и альбумин бычьей сыворотки (BSA). В качестве носителей могут быть также использованы и другие альбумины, такие как овальбумин, альбумин мышиной сыворотки или альбумин кроличьей сыворотки. Средства для конъюгирования полипептида с белком-носителем хорошо известны специалистам, и ими являются глутаральдегид, м-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимидоэфир, карбодиимид и бис-биазотированный бензидин.
Кроме того, как хорошо известно специалистам, иммуногенность конкретной иммуногенной композиции может быть усилена с использованием неспецифических стимуляторов иммунного ответа, известных как адъюванты. Подходящими молекулами-адъювантами являются все приемлемые иммуностимулирующие соединения, такие как цитокины, токсины или синтетические композиции.
Адъювантами, которые могут быть использованы, являются IL-1, IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, γ-интерферон, GMCSP, BCG, гидроксид алюминия, соединения MDP, такие как тур-MDP и нор-MDP, CGP (MTP-PE), липид A и монофосфориллипид A (MPL). Также рассматривается RIBI, который содержит три компонента, экстрагированные из бактерий, MPL, трегалозо-димиколат (TDM) и скелет клеточной стенки (CWS) в эмульсии, содержащей 2% сквален/твин 80. Могут быть также использованы антигены MHC. Репрезентативными и наиболее предпочтительными адъювантами являются полный адъювант Фрейнда (неспецифический стимулятор иммунного ответа, содержащий инактивированную Mycobacterium tuberculosis), неполный адъювант Фрейнда и адъювант гидроксид алюминия.
2
Помимо адъювантов может также оказаться желательным совместное введение модификаторов биологического ответа (BRM), которые, как было показано, стимулируют Т-клеточный иммунный ответ или ингибируют супрессорную клеточную активность. Такими BRM являются, но не ограничиваются ими, циметидин (CIM; 1200 мг/д) (Smith/Kline, PA); низкая доза циклофосфамида (CYP; 300 мг/м) (Johnson/Mead, NJ), цитокины, такие как γ-интерферон, IL-2 или IL-12, или гены, кодирующие белки, участвующие в иммунных функциях хелперных клеток, таких как B-7.
Количество иммуногенной композиции, используемой для продуцирования поликлональных антител, варьируется в зависимости от природы иммуногена, а также от вида животного, используемого для иммунизации. Иммуноген может быть введен различными путями (подкожно, внутримышечно, чрескожно, внутривенно и внутрибрюшинно). Мониторинг продуцирования поликлональных антител может быть проведен путем взятия проб крови у иммунизованного животного в различные периоды времени после иммунизации.
Может быть также введена вторая бустер-инъекция. Процесс введения бустер-дозы и титрования повторяют до тех пор, пока не будет получен подходящий титр. При достижении нужного уровня иммуногенности у иммунизованного животного может быть взята кровь и сыворотка, которые могут быть помещены на хранение, и/или указанное животное может быть использовано для продуцирования у него mAb.
mAb могут быть легко получены хорошо известными методами, такими как методы, описанные в патенте США 4196265, который вводится в настоящее описание посредством ссылки. Обычно такие методы включают иммунизацию подходящего животного выбранной иммуногенной композицией, например очищенным или частично очищенным полипептидом, пептидом или доменом, независимо от того, является ли она композицией дикого типа или мутантной композицией. Указанную иммунизующую композицию вводят способом, эффективным для стимуляции антитело-продуцирующих клеток.
mAb могут быть также очищены, если это необходимо, методами фильтрации, центрифугирования и различными хроматографическими методами, такими как ВЭЖХ или аффинная хроматография. Фрагменты моноклональных антител согласно изобретению могут быть получены из моноклональных антител, продуцируемых методами, включающими гидролиз ферментами, такими как пепсин или папаин, и/или расщепление дисульфидных связей путем химического восстановления. Альтернативно фрагменты моноклональных антител, входящие в объем настоящего изобретения, могут быть синтезированы на автоматическом пептидном синтезаторе.
4
Также предусматривается, что для генерирования mAb может быть применен метод молекулярного клонирования. Для этого из РНК, выделенной из селезенки иммунизованного животного, получают комбинаторные библиотеки иммуноглобулиновых фагмид, и эти фагмиды, экспрессирующие соответствующие антитела, отбирают путем пэннинга с использованием клеток, экспрессирующих антиген, и контрольных клеток. Преимущества этого метода, по сравнению со стандартными гибридомными методами, заключаются в том, что за один раунд может быть продуцировано и скринировано приблизительно в 10 раз большее число антител, а также в том, что при объединении Н- и L-цепей генерируются новые специфичности, которые еще больше повышают шанс обнаружения соответствующих антител.
Способы иммунодетекции
b.
Как обсуждается в настоящей заявке, в некоторых своих вариантах настоящее изобретение относится к способам иммунодетекции, применяемым для связывания, очистки, удаления, определения и/или какой-либо другой детекции биологических компонентов, таких как антигенные области на полипептидах и пептидах. Способы иммунодетекции согласно изобретению могут применяться для идентификации антигенных областей пептида, полипептида или белка, имеющих терапевтическое применение, в частности для снижения иммуногенности или антигенности указанного пептида, полипептида или белка у данного индивидуума.
Способами иммунодетекции являются иммуноферментный твердофазный анализ (ELISA), радиоиммуноанализ (РИА), иммунорадиометрический анализ, флуориметрический иммуноанализ, хемилюминесцентный анализ, биолюминесцентный анализ и Вестерн-блот-анализ, а также некоторые другие анализы, хорошо известные среднему специалисту в данной области. Стадии различных подходящих способов иммунодетекции описаны в научной литературе, такой как публикации, например, Doolittle et al., 1999; Gulbis et al., 1993; De Jager et al., 1993, и Nakamura et al., 1987, каждая из которых вводится в настоящее описание посредством ссылки.
В общих чертах, способы иммунного связывания включают взятие образца, предположительно содержащего нужный белок, полипептид и/или пептид, и контактирование указанного образца с первым моноклональным или поликлональным антителом согласно изобретению, а в данном случае - в условиях, эффективных для образования иммунокомплексов.
Такими способами являются способы очистки белка, полипептида и/или пептида из органеллы, клетки, ткани или образцов, взятых из организма. В этих случаях антитело используют для удаления антигенных белковых, полипептидных и/или пептидных компонентов из образца. Указанное антитело предпочтительно присоединяют к твердому носителю, такому как матрица колонки, и образец, предположительно содержащий указанный белковый, полипептидный и/или пептидный антигенный компонент, будет присоединяться к иммобилизованному антителу. Нежелательные компоненты вымывают из колонки, в результате чего остается антиген, образующий иммунный комплекс с элюируемым иммобилизованным антителом.
Способами иммунного связывания также являются способы детекции и количественной оценки антигенного компонента в образце и способы детекции и количественной оценки любых иммунных комплексов, образующихся в процессе связывания. В данном случае получают образец, который, как предполагается, содержит антиген или антигенный домен, и этот образец подвергают контакту с антителом против указанного антигена или антигенного домена, а затем осуществляют детекцию и количественную оценку иммунных комплексов, образующихся в конкретных условиях.
Что касается детекции антигенов, то анализируемым биологическим образцом может быть любой образец, который, как предполагается, содержит антиген или антигенный домен, например такой образец, как срез или препарат ткани, гомогенизированный экстракт ткани, клетка, органелла, выделенные и/или очищенные формы любой из вышеуказанных антигенсодержащих композиций или даже любая биологическая жидкость, которая вступает в контакт с указанной клеткой или тканью, включая кровь и/или сыворотку.
Контактирование выбранного биологического образца с антителом в эффективных условиях и в течение периода времени, достаточного для образования иммунных комплексов (первичных иммунных комплексов), обычно осуществляют просто путем добавления композиции антитела к образцу и инкубирования указанной смеси в течение периода времени, достаточного для образования иммунных комплексов с антителами, т.е. для связывания с любыми присутствующими антигенами. По истечении этого времени композицию “образец - антитело”, такую как срез ткани, ELISA-планшет, дот-блот или вестерн-блот, обычно промывают для удаления всех неспецифически связанных молекул антитела, что позволяет детектировать только специфически связанные антитела в первичных иммунных комплексах.
В общих чертах, детекция образования иммунокомплексов хорошо известна специалистам и может быть осуществлена многими методами. Эти методы, по существу, основаны на детекции метки или маркера, таких как любые радиоактивные, флуоресцентные, биологические и ферментативные метки. Патентами США, в которых описано использование таких меток, являются патенты 3817837; 3850752; 3939350; 3996345; 4277437; 4275149 и 4366241, каждый из которых вводится в настоящее описание посредством ссылки. При этом совершенно очевидно, что использование “второго” связывающего лиганда, такого как “второе” антитело и/или биотин/авидиновый комплекс, связывающийся с лигандом, известные специалистам, может дать дополнительные преимущества.
Антитело, используемое для детекции, может быть само связано с детектируемой меткой, которая может быть затем очень легко детектирована, что позволит определить количество первичных иммунных комплексов в данной композиции. Альтернативно, “первое” антитело, которое становится связанным с первичными иммунными комплексами, может быть детектировано с помощью “второго” связывающего лиганда, который обладает аффинностью связывания с антителом. В этих случаях к указанному “второму” связывающему лиганду может быть присоединена детектируемая метка. Этот “второй” связывающий лиганд часто сам является антителом, которое, таким образом, может быть названо “вторым” антителом. Первичные иммунные комплексы подвергают контакту с меченым “вторым” связывающим лигандом или антителом в эффективных условиях и в течение периода времени, достаточного для образования вторичных иммунных комплексов. Затем вторичные иммунные комплексы обычно промывают для удаления любых неспецифически связанных меченых “вторых” антител или лигандов, после чего метку, оставшуюся во вторичных иммунных комплексах, детектируют.
Другие методы включают детекцию первичных иммунных комплексов, проводимую в две стадии. Для образования вторичных иммунных комплексов, описанных выше, используют “второй” связывающий лиганд, такой как антитело, которое обладает аффинностью связывания с антителом. После промывки вторичные иммунные комплексы подвергают контакту с “третьим” связывающим лигандом или с антителом, которое обладает аффинностью связывания со “вторым” антителом, также в эффективных условиях и в течение периода времени, достаточного для образования иммунных комплексов (третичных иммунных комплексов). Этот “третий” лиганд или “третье” антитело связывают с детектируемой меткой, что позволяет детектировать полученные таким образом третичные иммунные комплексы. Эта система, если это необходимо, может обеспечивать амплификацию сигнала.
В одном из методов иммунодетекции, разработанном Чарльзом Кантором, используются два различных антитела. Биотинилированное, моноклональное или поликлональное антитело первой стадии используют для детекции антигена(ов)-мишени(ей), а затем антитело второй стадии используется для детекции биотина, связанного с биотиновым комплексом. В этом методе тестируемый образец сначала инкубируют в растворе, содержащем антитело первой стадии. Если присутствует антиген-мишень, то некоторые антитела связываются с антигеном с образованием комплекса “биотинилированное антитело/антиген”. Затем указанный комплекс “антитело/антиген” амплифицируют путем последовательного инкубирования в растворах стрептавидина (или авидина), биотинилированной ДНК и/или комплементарной биотинилированной ДНК, при этом в каждой стадии к указанному комплексу антитело/антиген присоединяют дополнительные биотиновые сайты. Стадии амплификации повторяют до тех пор, пока не будет достигнут соответствующий уровень амплификации, после чего образец инкубируют в растворе, содержащем антитело второй стадии против биотина. Это антитело второй стадии метят, например, ферментом, который может быть использован для детекции присутствия комплекса антитело/антиген, гистоэнзимологическим методом с использованием хромогенного субстрата. С помощью соответствующей амплификации может быть получен конъюгат, который может быть исследован визуально.
В другом известном методе иммунодетекции используется технология иммуно-ПЦР (полимеразной цепной реакции). Этот ПЦР-метод аналогичен методу Кантора до стадии инкубирования с биотинилированной ДНК, однако вместо проведения множества раундов инкубирования со стрептавидином и биотинилированной ДНК, комплекс ДНК/биотин/стрептавидин/антитело промывают буфером с низким рН и высокой концентрацией соли, в результате чего высвобождается антитело. Полученный промывочный раствор затем используют для проведения ПЦР с подходящими праймерами и соответствующим контролем. По меньшей мере, теоретически, чрезвычайно высокая эффективность амплификации и специфичность ПЦР-реакции позволяет ее использовать для детекции одной молекулы антигена.
ELISA
i.
Как подробно описано выше, иммуноанализы, в их самом простом и/или прямом смысле, представляют собой анализы на связывание. Некоторыми предпочтительными иммуноанализами являются различные типы иммуноферментных твердофазных анализов (ELISA) и/или радиоиммуноанализов (РИА), известных специалистам. В частности, подходящей также является иммуногистохимическая детекция с использованием срезов тканей. Однако совершенно очевидно, что детекция не ограничивается указанными методами и/или могут быть также использованы вестерн-блот-анализ, дот-блот-анализ, анализы FACS и/или т.п.
В одном из репрезентативных ELISA антитела иммобилизуют на выбранной поверхности, обладающей аффинностью к белку, такой как лунка в полистироловом микротитрационном планшете. Затем в лунки добавляют тестируемую композицию, предположительно содержащую антиген, такую как клинический образец. После связывания и/или промывки для удаления неспецифически связанных иммунных комплексов может быть детектирован связанный антиген. Детекцию обычно проводят путем добавления второго антитела, которое связывается с детектируемой меткой. ELISA такого типа называется просто “сэндвич-ELISA”. Детекция может быть также осуществлена путем добавления “второго” антитела, а затем “третьего” антитела, которое обладает аффинностью связывания со “вторым” антителом, где указанное “третье” антитело связано с детектируемой меткой. ELISA может быть основан на специфическом связывании антитела с белком, имеющим Arg389, но не Gly389.
В другом репрезентативном ELISA образцы, предположительно содержащие антиген, иммобилизуют на поверхности лунок и/или затем подвергают контакту с антителами. После связывания и/или промывки для удаления неспецифически связанных иммунных комплексов детектируют связанные анти-антитела. Если исходные антитела связаны с детектируемой меткой, то иммунные комплексы могут быть детектированы прямым методом. И в этом случае иммунные комплексы могут быть детектированы с использованием “второго” антитела, которое обладает аффинностью связывания с “первым” антителом, где указанное “второе” антитело связано с детектируемой меткой.
Другой ELISA, в котором антигены являются иммобилизованными, предусматривает использование для детекции анализа на конкурентное связывание антител. В этом ELISA меченые антитела против антигена добавляют в лунки, где эти антитела связываются и/или детектируются посредством их метки. Затем количество антигена в неизвестном образце определяют путем смешивания данного образца с мечеными антителами против антигена в процессе инкубирования с покрытыми лунками. Присутствие антигена в образце приводит к снижению количества антитела против антигена, доступного для связывания с лункой, и тем самым к снижению конечного сигнала. Этот метод является также подходящим для детекции антител против антигена в неизвестном образце, где немеченые антитела связываются с покрытыми антигеном лунками и также снижают количество антигена, доступного для связывания с мечеными антителами.
Независимо от используемого формата все ELISA имеют некоторые общие стадии, такие как покрытие, инкубирование и связывание, промывка для удаления неспецифически связанных молекул и детекция связанных иммунных комплексов. Эти стадии описаны ниже.
При покрытии планшета антигеном или антителом обычно лунки планшета инкубируют с раствором антигена или антитела либо в течение ночи, либо в течение определенного периода времени, например в течение нескольких часов. Затем лунки планшета промывают для удаления неполностью адсорбированного материала. Затем все остальные доступные поверхности лунок “покрывают” неспецифическим белком, который является антигенно нейтральным по отношению к тестируемой антисыворотке. Такими белками являются альбумин бычьей сыворотки (BSA), казеин или растворы сухого молока. Такое покрытие осуществляют для блокирования сайтов неспецифической адсорбции на иммобилизующей поверхности и тем самым для снижения фонового уровня, обусловленного неспецифическим связыванием антисыворотки с поверхностью.
При проведении ELISA для детекции чаще всего применяют не прямой метод детекции, а метод с использованием “второго” или “третьего” реагента. Таким образом, после связывания белка или антитела с лункой, покрытия нереакционноспособным материалом для снижения фона и промывки для удаления несвязанного материала иммобилизующую поверхность подвергают контакту с тестируемым биологическим образцом в условиях, эффективных для образования иммунного комплекса (антиген/антитело). Затем для детекции иммунного комплекса необходимо использование меченого “второго” связывающего лиганда или антитела, и “второго” связывающего лиганда или антитела в комбинации с меченым “третьим” антителом или с “третьим” связывающим лигандом.
Выражение “условия, эффективные для образования иммунного комплекса (антиген/антитело)” означает условия, которые предпочтительно предусматривают разведение антигенов и/или антител растворами, такими как BSA, бычий гамма-глобулин (BGG) или забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS)/твин. Эти добавленные агенты также способствуют снижению неспецифического фона.
Термин “подходящие” условия также означает условия инкубирования при температуре или в течение периода времени, достаточных для эффективного связывания. Стадии инкубирования обычно проводят примерно в течение от 1-2 до 4 часов или более при температуре предпочтительно порядка 25°С-27°С или, возможно, в течение ночи примерно при 4°С или т.п.
После проведения всех стадий инкубирования в ELISA контактируемую поверхность промывают для удаления материала, не образовавшего комплекс. Примером процедуры промывки является промывка раствором, таким как PBS/твин или боратный буфер. После образования специфических иммунных комплексов между тестируемым образцом и первоначально связанным материалом и последующей промывки может быть установлено присутствие даже небольших количеств иммунных комплексов.
2
2
Для проведения детекции ко “второму” или “третьему” антителу присоединяют метку, облегчающую детекцию. Такой меткой может быть фермент, обеспечивающий проявление окраски после инкубирования с соответствующим хромогенным субстратом. Так, например, может оказаться желательным контактирование или инкубирование “первого” и “второго” иммунного комплекса с антителом, конъюгированным с уреазой, глюкозооксидазой, щелочной фосфатазой или с HO-пероксидазой, в течение периода времени и в условиях, благоприятствующих образованию нового иммунного комплекса (например, инкубирования в течение 2 часов при комнатной температуре в PBS-содержащем растворе, таком как PBS-твин).
2
2
После инкубирования с меченым антителом и последующей промывки для удаления несвязанного материала, проводят количественную оценку метки, например, путем инкубирования с хромогенным субстратом, таким как мочевина или бромкрезоловый пурпуровый, или с 2,2'-азино-ди-(3-этил-бензтиазолин)-6-сульфоновой кислотой (ABTS), или с HO, если в качестве ферментной метки используется пероксидаза. Затем проводят количественную оценку путем измерения интенсивности продуцируемой окраски, например, с использованием спектрофотометра в видимом диапазоне спектра.
Иммуногистохимический анализ
ii.
Антитела согласно изобретению могут быть также использованы в комбинации со свежезамороженными и/или фиксированными в формалине и залитыми в парафин тканевыми блоками, полученными для иммуногистохимического анализа (IHC). Так, например, иммуногистохимический анализ может быть проведен для характеризации фортилина или оценки количества фортилина в клетках. Метод приготовления тканевых блоков из этих макропрепаратов успешно применялся в ранее проводимых IHC-исследованиях различных прогностических факторов и/или хорошо известен специалистам в данной области (Brown et al., 1990; Abbondanzo et al., 1990; Allred et al., 1990).
Вкратце, замороженные срезы могут быть получены путем регидратации 50 мг замороженной “измельченной” ткани при комнатной температуре в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) в небольших пластиковых капсулах; осаждения частиц путем центрифугирования; ресуспендирования этих частиц в вязкой заливочной среде (OCT); переворачивания этих капсул и/или повторного осаждения путем центрифугирования; мгновенного замораживания в изопентане при -70°С; разрезания пластиковой капсулы и/или удаления замороженного цилиндра ткани; сохранения этого тканевого цилиндра в микротомном зажиме криостата и/или разрезания этого цилиндра на 25-50 серийных срезов.
Фиксированные срезы могут быть получены аналогичным методом, включающим регидратацию 50 мг образца в пластиковой центрифужной пробирке; осаждение; ресуспендирование в 10% формалине в течение 4-часовой фиксации; промывание/осаждение; ресуспендирование в теплом 2,5% агаре; осаждение; охлаждение в ледяной воде для отверждения агара; удаление тканевого/агарового блока из пробирки; инфильтрацию и/или заливку блока в парафин; и/или разрезание на 50 серийных фиксированных срезов.
Терапия
III.
1
1
После определения генотипа или последовательности белка βAR индивидуума курс терапевтического лечения может быть индивидуализирован. В предпочтительном варианте данного способа представляющим интерес признаком является клинический ответ, обнаруживаемый у пациента при проведении определенного терапевтического лечения, например ответ на лекарственное средство, такое как, но не ограничивающееся им, β-блокатор, например буциндолол, действие которого направлено на βAR, или ответ на терапевтическое лечение патологического состояния. Используемый здесь термин “патологическое состояние” включает, но не ограничивается ими, любое состояние или заболевание, проявляющееся одним или несколькими физическими и/или психологическими симптомами, для которых показано такое лечение, и включает уже известные и недавно идентифицированные заболевания и другие расстройства, при которых наблюдаются сходные патофизиологические состояния, такие как, но не ограничивающиеся ими, сердечная недостаточность, феохромоцитома, мигрени, сердечные аритмии, гипертензия, застойная кардиомиопатия, ишемическая болезнь сердца (кардиомиопатия, стенокардия, инфаркт миокарда) и различные тревожные состояния. Используемый здесь термин “клинический ответ” означает любые или все нижеследующие признаки, такие как количественный показатель эффективности или действенности терапии и нежелательных последствий (т.е. побочных эффектов).
1
Индивидуумы, гомозиготные по βArg389 и имеющие патологическое состояние, могут быть подвергнуты терапии, которая предусматривает введение β-блокаторов, таких как, но не ограничивающихся ими, буциндолол. β-Блокатор может быть введен отдельно или в комбинации, по меньшей мере, с одним другим средством, таким как стабилизирующее соединение. β-Блокатор, который был ранее противопоказан при таком патологическом состоянии, может быть также введен в комбинации с медицинским устройством, которое необходимо при указанном состоянии. Так, например, обычно пациенту с сердечной недостаточностью и брадикардией не проводят лечение β-блокатором. Но если данный индивидуум имеет Arg389-генотип (благоприятный генотип), то перед назначением буциндолола ему может быть имплантирован электрокардиостимулятор.
Способы введения
А.
Введение β-блокатора может быть осуществлено любыми способами, включая, но не ограничиваясь ими, пероральное, внутривенное, внутримышечное, внутриартериальное, интрамедуллярное, интратекальное, интравентрикулярное, чрескожное, внутритрахеальное, интравезикулярное, внутриглазное, трансдермальное, подкожное, внутрибрюшинное, интраназальное, энтеральное, местное, подъязычное или ректальное введение. Более подробное описание методов приготовления и введения препаратов можно найти в самом последнем издании руководства Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, Pa.). В некоторых вариантах изобретения буциндолол приготавливают для перорального введения.
Лекарственные препараты
B.
Фармацевтические композиции, если они используются в клинических целях, могут быть приготовлены в форме, подходящей для осуществления таких целей. Обычно для этого требуется получение, в основном, апирогенных композиций, которые также не содержат других примесей, оказывающих вредное воздействие на человека или животных.
Обычно желательно использовать подходящие соли и буферы для стабилизации векторов для доставки и для их поглощения клетками-мишенями. Если пациенту вводят рекомбинантные клетки, то могут быть также использованы буферы. Водные композиции согласно изобретению содержат эффективное количество вектора или клеток, растворенных или диспергированных в фармацевтически приемлемом носителе или в фармацевтически приемлемой водной среде. Термин “фармацевтически или фармакологически приемлемый” относится к молекулярным частицам и композициям, которые, при их введении животному или человеку, не вызывают побочных, аллергических или других нежелательных реакций. Используемый здесь термин “фармацевтически приемлемый носитель” включает растворители, буферы, растворы, среды для диспергирования, материалы для покрытий, антибактериальные и противогрибковые средства, агенты, придающие изотоничность, и агенты, замедляющие абсорбцию, и т.п., подходящие для получения фармацевтических препаратов, таких как фармацевтические препараты, подходящие для введения человеку. Использование таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно специалистам. В настоящем изобретении рассматривается использование этих сред в терапевтических композициях, за исключением любых стандартных сред или агентов, которые являются несовместимыми с активными ингредиентами согласно изобретению. В указанные композиции могут быть также введены дополнительные активные ингредиенты при условии, что они не будут дезактивировать векторы или клетки в данных композициях.
Активные композиции согласно изобретению могут представлять собой классические фармацевтические препараты. Введение этих композиций согласно изобретению может быть осуществлено любым стандартным способом при условии, что такой способ введения применим для данной ткани-мишени. Такое введение может быть пероральным, интраназальным или трансбуккальным. Альтернативно таким введением может быть чрескожная, подкожная, внутримышечная, внутрибрюшинная или внутривенная инъекция либо инъекция непосредственно в сердечную ткань. Указанные композиции обычно вводят в виде фармацевтически приемлемых композиций, как описано выше.
Активные соединения могут быть также введены парентерально или внутрибрюшинно. Так, например, растворы активных соединений в форме свободного основания или фармакологически приемлемых солей могут быть приготовлены в воде, соответствующим образом смешанной с поверхностно-активным веществом, таким как гидроксипропилцеллюлоза. Дисперсии могут быть также получены в глицерине, жидких полиэтиленгликолях и в их смесях, а также в масле. Препараты, предназначенные для хранения и применения в стандартных условиях, обычно содержат консерванты для предупреждения роста микроорганизмов.
Фармацевтическими формами, подходящими для инъекций, являются, например, стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных растворов или дисперсий для немедленного инъецирования. Обычно такие препараты являются стерильными и жидкими настолько, чтобы их можно было легко вводить путем инъекции. Препараты должны быть стабильными в условиях их приготовления и хранения и должны быть защищены от контаминирующего воздействия микроорганизмов, таких как бактерии и грибки. Подходящие растворители или дисперсионные среды могут содержать, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), подходящие их смеси и растительные масла. Подходящая текучесть может поддерживаться, например, за счет покрытий, таких как лецитин, поддержания нужного размера частиц в случае дисперсии и использования поверхностно-активных веществ. Предохранение от воздействия микроорганизмов может быть достигнуто с использованием различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например парабенов, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты, тимерозала и т.п. Во многих случаях предпочтительно включать изотонические агенты, например сахара или хлорид натрия. Пролонгированная абсорбция инъецируемых композиций может быть достигнута путем включения в композицию веществ, замедляющих абсорбцию, например моностеарата алюминия и желатина.
Согласно изобретению полипептиды могут быть введены вместе с наполнителями и использованы в форме непроглатываемой жидкости для полоскания рта или средства для чистки зубов. Жидкость для полоскания рта может быть приготовлена с использованием нужного количества активного ингредиента в соответствующем растворителе, таком как раствор бората натрия (раствор Добелля). Альтернативно активный ингредиент может быть введен в антисептическую промывку, содержащую борат натрия, глицерин и бикарбонат калия. Активный ингредиент может быть также диспергирован в средствах для чистки зубов, включая гели, пасты, порошки и взвеси. Активный ингредиент может быть добавлен в терапевтически эффективном количестве в зубную пасту, и такими ингредиентами могут быть вода, связующие агенты, абразивы, ароматизаторы, пенообразователи и увлажнители.
Композиции согласно изобретению, по существу, могут быть получены в нейтральной или солевой форме. Фармацевтически приемлемыми солями являются, например, кислотно-аддитивные соли (образованные свободными аминогруппами белка), полученные из неорганических кислот (например, соляной или фосфорной кислоты) или из органических кислот (например, из уксусной, щавелевой, винной, миндальной кислоты и т.п.). Соли, образованные свободными карбоксильными группами белка, могут быть также получены из неорганических оснований (например, из гидроксидов натрия, калия, аммония, кальция или железа) или из органических оснований (например, из изопропиламина, триметиламина, гистидина, прокаина и т.п.).
После приготовления растворы предпочтительно вводят способом, совместимым с данной лекарственной формой, и в терапевтически эффективном количестве. Такие препараты могут быть легко введены в различных лекарственных формах, таких как растворы для инъекций, капсулы, содержащие лекарственные средства, и т.п. Так, например, для парентерального введения в водном растворе указанный раствор обычно соответствующим образом забуферивают, но сначала ему придают изотоничность путем добавления жидкого разбавителя с достаточным количеством физиологического раствора или глюкозы. Такие водные растворы могут быть использованы, например, для внутривенного, внутримышечного, подкожного и внутрибрюшинного введения. Как известно специалистам, в частности, как описано в настоящей заявке, предпочтительно используют стерильные водные среды. Так, например, одна доза может быть растворена в 1 мл изотонического раствора NaCl, а затем ее либо добавляют в 1000 мл жидкости для введения в подкожную клетчатку, либо вводят путем инъекции в нужный участок инфузии (см., например, руководство “Remington's Pharmaceutical Sciences", 15-е издание, стр.1035-1038 и 1570-1580). В зависимости от состояния индивидуума, подвергаемого лечению, допускаются некоторые изменения доз. В любом случае подходящую дозу для конкретного индивидуума назначает врач, проводящий лечение. Кроме того, препараты, предназначенные для введения человеку, должны удовлетворять стандартам стерильности, апирогенности, общей безопасности чистоты, в соответствии с требованиями Департамента по биологическим стандартам Управления по контролю за качеством продуктов питания и лекарственных средств (FDA).
Введение лекарственных средств с регулируемым/медленным/ длительным/пролонгированным высвобождением лекарственного средства
1.
l
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения пациентов с сердечной недостаточностью путем введения β-блокатора пациенту, имеющему генотип, гомозиготный по βArg389, в виде препарата с регулируемым высвобождением. Используемые здесь термины “регулируемое”, “медленное”, “длительное” или “пролонгированное” высвобождение композиций согласно изобретению, в целом, означают “регулируемое высвобождение” и включают непрерывное или дискретное и равномерное или неравномерное высвобождение композиции согласно изобретению. Такое регулируемое высвобождение β-блокаторов из лекарственного препарата имеет множество преимуществ.
Таблетки
a.
Таблетка с регулируемым высвобождением, подходящая для осуществления настоящего изобретения, описана в патенте США No. 5126145, который вводится в настоящее описание посредством ссылки. Такая таблетка содержит в смеси примерно 5-30% высоковязкой гидроксипропилметилцеллюлозы, примерно 2-15% водорастворимого фармацевтического связывающего агента, примерно 2-20% гидрофобного компонента, такого как восковидное вещество, например жирная кислота, и примерно 30-90% активного ингредиента.
Пленки
b.
l
Настоящее изобретение также относится к профилактике или к способу лечения пациента, имеющего генотип, гомозиготный по βArg389, проводимого с помощью инвазивной процедуры на сердце, включающей введение пациенту биологически разлагаемой, биологически совместимой полимерной пленки, содержащей β-блокатор, такой как буциндолол. Эти полимерные пленки являются тонкими по сравнению с их длиной и шириной. Такие пленки обычно имеют одинаковую толщину примерно от 60 мкм до 5 мм. Пленки толщиной примерно от 600 мкм до 1 мм и примерно от 1 мм до 5 мм, а также пленки толщиной примерно от 60 мкм до 1000 мкм и примерно от 60 до 300 мкм могут быть использованы для изготовления терапевтических имплантатов, вводимых в организм пациента. Такие пленки могут быть введены пациенту методами, аналогичными методам, применяемым в адгезионной хирургии. Так, например, пленочный препарат, содержащий β-блокатор, такой как буциндолол, может быть нанесен на участок сердечной ткани или артерии во время хирургической операции путем распыления или в виде капель либо на выбранный участок ткани может быть нанесена уже образованная пленка. В альтернативном варианте изобретения эта пленка может быть нанесена в качестве покрытия с регулируемым высвобождением на медицинское устройство, такое как стент, как будет более подробно обсуждаться ниже.
Для изготовления имплантатов, в которых β-блокатор равномерно распределен по полимерной матрице, могут быть использованы биологически разлагаемые или неразлагаемые полимеры. Специалистам известны различные биологически разлагаемые полимеры, используемые для изготовления биологически разлагаемых пленок согласно изобретению, включая полиангидриды и алифатические полиэфиры, а предпочтительно полимолочную кислоту (PLA), полигликолевую кислоту (PGA) и их смеси и сополимеры, более предпочтительно сополимеры PLA:PGA=50:50, а наиболее предпочтительно сополимеры PLA:PGA=75:25. Могут быть также использованы энантиомеры PLA, а предпочтительно L-PLA, взятые отдельно или в комбинации с PGA. Для изготовления имплантатов согласно изобретению могут быть также использованы поликарбонаты, полифумараты и капролактоны.
β-Блокатор, такой как буциндолол, может быть введен в полимерные пленки согласно изобретению в количестве, эффективном для достижения заметного эффекта в лечении заболеваний с аналогичным патофизиологическим статусом, таких как, но не ограничивающиеся ими, сердечная недостаточность, феохромоцитома, мигрени, сердечные аритмии, гипертензия, ишемия, кардиомиопатия и различные тревожные состояния. Композиция согласно изобретению может быть введена в пленку различными методами, например, в виде раствора, суспензии или путем формования.
Пластыри для чрескожного введения
c.
Чрескожное введение предусматривает доставку терапевтического средства через кожу для его последующего распределения в организме через кровоток. Чрескожная доставка может быть сравнима с непрерывной регулируемой внутривенной доставкой лекарственного средства, где вместо иглы для внутривенных инъекций функцию входного канала выполняет кожа. Терапевтическое средство проходит через внешние слои кожи, диффундирует в капилляры небольших кровеносных сосудов кожи, а затем поступает в основную систему кровообращения.
1
Приспособления для чрескожной доставки типа пластырей, которые обеспечивают регулируемое непрерывное введение терапевтического средства через кожу, хорошо известны специалистам. Такие приспособления описаны, например, в патентах США 4627429; 4784857; 5662925; 5788983 и 6113940, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки. Обычно эти приспособления содержат лекарственное средство, которое не проникает через подложку, образующую внешнюю поверхность данного приспособления, и проникает через кожу, прилегающую к мембранному слою, такому как адгезивный слой, плотно прилегающий к пограничному слою так, чтобы между ними создавался резервуар, в который помещают терапевтическое средство. В одном из вариантов изобретения препарат β-блокатора вводят в указанный резервуар чрескожного пластыря и назначают для лечения пациента, который является гомозиготным по Arg389 в генах βAR.
Медицинские устройства
d.
В других вариантах изобретения рассматривается введение β-блокатора, такого как буциндолол, в медицинское устройство, которое затем помещают в нужный участок в организме, после чего β-блокатор высвобождается из данного медицинского устройства. Используемый здесь термин “медицинское устройство” означает устройство, которое вводят млекопитающему на короткое или на длительное время для профилактики или терапии патологического состояния. Такими устройствами являются любое устройство, которое вводят подкожно, чрескожно или хирургически в орган, ткань или просвет. Такими медицинскими устройствами являются, но не ограничиваются ими, стенты, синтетические трансплантаты, искусственные сердечные клапаны, искусственное сердце и зажимы для соединения протезируемого органа с сосудистой системой, венозные клапаны, трансплантаты для устранения аневризмы брюшной аорты (ААА), фильтры, устанавливаемые в нижнюю часть полой вены, катетеры, включая катетеры для непрерывного вливания лекарственного средства, эмболические спирали, эмболические материалы, используемые при васкулярной эмболизации (например, ПВА-пены), материалы для репарации отверстий, ортопедические металлические пластины, стержни и винты для прочного соединения частей сосудов и сосудистые швы.
В одном из вариантов изобретения медицинские устройства, такие как стент или трансплантат, покрывают матриксом. Матрикс, используемый для покрытия стента или трансплантата согласно изобретению, может быть получен из различных материалов. Главное требование к такому матриксу заключается в том, чтобы он был достаточно эластичным и гибким для предохранения открытых поверхностей стента или синтетического трансплантата от повреждения.
Дозы
С.
Количество буциндолола, вводимое или назначенное для введения пациенту, может составлять, по меньшей мере или по большей мере, примерно 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500 мг или варьироваться в любом из интервалов этих значений. Альтернативно вводимое или назначенное для введения количество буциндолола может составлять, по меньшей мере или по большей мере, примерно 0,001, 0,002, 0,003, 0,004, 0,005, 0,006, 0,007, 0,008, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0 мг или варьироваться в любом из интервалов этих значений.
При использовании дискретных количеств каждый прием буциндолола может рассматриваться как доза. Лечащий врач может назначить или ввести несколько доз буциндолола в течение конкретного курса лечения (схемы лечения) или неограниченное число доз. При этом предусматривается, что буциндолол может быть введен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 раз или более или промежуточное число раз в пределах указанных значений. Кроме того, предусматривается, что указанное лекарственное средство может быть введено в течение неопределенного периода времени или в период времени, в течение которого у пациента будут наблюдаться симптомы патологического состояния, для лечения которого был назначен или введен буциндолол. Кроме того, данное лекарственное средство может быть введено через каждые 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 минут, или через каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 часа, или через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 дней, или через 1, 2, 3, 4, 5 недель, или через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 месяцев или более, или через любые промежутки времени в пределах указанных значений. Альтернативно это лекарственное средство может быть введено систематически или в любой из указанных периодов времени и такое введение может продолжаться более года.
Другие варианты терапии
D.
++
1
2c
В некоторых вариантах изобретения применяемые способы могут включать введение β-блокатора, которым не является буциндолол, или которым является ионотроп, диуретик, АСЕ-I, антагонист AII, BNP, Ca-блокатор или ингибитор HDAC. Эти средства могут быть назначены или введены вместо или помимо буциндолола после выявления полиморфизмов βAR и/или αAR.
В качестве второго курса терапевтического лечения такое средство может быть введено пациенту, либо пациент может принимать это лекарственное средство одновременно с буциндололом, либо до или после приема буциндолола. Такое лечение может устранять один или несколько симптомов патологической гипертрофии сердца или сердечной недостаточности, например повышать способность переносить повышенную физическую нагрузку, увеличивать объем сердечного выброса крови, снижать конечное диастолическое давление в левом желудочке, снижать давление внутрикапиллярного заклинивания в легочной артерии, увеличивать сердечный выброс или сердечный индекс, снижать давление в легочной артерии, снижать конечные систолическое и диастолические параметры левого желудочка, снижать напряжение стенок левого и правого желудочков, снижать напряжение и толщину стенок, повышать качества жизни и снижать заболеваемость и смертность от таких патологий.
В других вариантах изобретения предусматривается использование буциндолола в комбинации с другими терапевтическими средствами. Таким образом, помимо вышеописанной терапии пациенту могут быть также назначены и более “традиционные” фармацевтические средства, применяемые для лечения болезней сердца. Примерами таких терапевтических средств являются, но не ограничиваются ими, другие β-блокаторы, антигипертензивные средства, кардиотонические средства, антитромботические средства, вазодилататоры, антагонисты гормонов, ионотропные средства, диуретики, антагонисты эндотелина, блокаторы кальциевых каналов, ингибиторы фосфодиэстеразы, ингибиторы АСЕ, антагонисты ангиотензина типа 2 и блокаторы/ингибиторы цитокинов и ингибиторы HDAC.
Такие комбинации могут быть получены путем контактирования клеток сердца с одной композицией или с фармакологическим препаратом, содержащим оба этих средства, либо путем одновременного контактирования указанных клеток с двумя различными композициями или препаратами, где одна композиция включает экспрессионную конструкцию, а другая композиция включает указанное средство. Альтернативно терапия буциндололом может быть проведена до или после введения другого(их) средства(средств) с интервалами от нескольких минут до нескольких недель. В тех вариантах изобретения, в которых указанное другое средство и указанную экспрессионную конструкцию вводят в клетки отдельно, между введениями не должно проходить значительное количество времени, для того чтобы данное средство и экспрессионная конструкция оказывали на клетку положительное аддитивное действие. В таких случаях предусматривается, что клетки должны, по существу, контактировать с обоими средствами в течение примерно 12-24 часов, а более предпочтительно в течение примерно 6-12 часов, при этом наиболее предпочтительно, чтобы время задержки составляло лишь примерно 12 часов. В некоторых случаях может оказаться желательным значительно увеличить период лечения, однако промежуток времени между соответствующими введениями составляет от нескольких дней (2, 3, 4, 5, 6 или 7) до нескольких недель (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8).
Также очевидно, что может оказаться желательным более чем одно введение буциндолола или другого средства. В этой связи могут быть использованы различные комбинации. Так, например, если буциндолол обозначить “А”, а другое средство “В”, то репрезентативными 3 и 4 введениями являются введение в следующем порядке:
A/B/A B/A/B B/B/A А/А/В В/А/А А/В/В B/B/B/A В/В/А/В
А/А/В/В А/В/А/В А/В/В/А В/В/А/А В/А/В/А В/А/А/В B/B/B/A
А/А/А/В В/А/А/А А/В/А/А А/А/В/А А/В/В/В В/А/В/В В/В/А/В.
Аналогичным образом, могут рассматриваться и другие комбинации.
Фармакологические терапевтические средства
1.
Фармакологические терапевтические средства и способы введения, дозы и т.п. хорошо известны специалистам (см., например, публикации "Physicians Desk Reference", Klaassen's "The Pharmacological Basis of Therapeutics", "Remington's Pharmaceutical Sciences", и "The Merck Index, Eleventh Edition", которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки в соответствующих частях) и могут быть объединены с терапевтическими средствами согласно изобретению в соответствии с приведенным здесь описанием. В зависимости от состояния индивидуума, подвергаемого лечению, допускаются некоторые изменения доз. В любом случае подходящую дозу для конкретного индивидуума назначает врач, проводящий лечение, и такой индивидуальный подход может быть осуществлен любым средним специалистом в данной области.
Неограничивающими примерами фармакологических терапевтических средств, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются средство против гиперлипопротеинемии, средство против артериосклероза, антитромботическое/фибринолитическое средство, средство, способствующее свертыванию крови, антиаритмическое средство, антигипертензивное средство, сосудосуживающее средство, средство для лечения застойной сердечной недостаточности, средство против стенокардии, антибактериальное средство или их комбинация.
Кроме того, следует отметить, что любое из нижеследующих средств может быть использовано для выявления новых наборов генов-мишеней, на которые направлена сердечно-сосудистая терапия, например, такие средства, как β-блокаторы, которые используются в примерах, приведенных в настоящей заявке (см. ниже). При этом предполагается, что многие из этих генов могут перекрываться, а поэтому, вероятно, могут быть выявлены новые гены-мишени.
Средства против гиперлипопротеинемии
а.
В некоторых вариантах изобретения введение средств, снижающих концентрацию одного или нескольких липидов и/или липопротеинов в крови и называемых здесь “средствами против гиперлипопротеинемии”, может быть объединено с терапией сердечно-сосудистого заболевания согласно изобретению, в частности с лечением атеросклероза и загущения или блокадой тканей сосудов. В некоторых аспектах настоящего изобретения гиполипопротеинемическое средство может содержать производное арилоксиалкановой/фибриновой кислоты, секвестрант полимерной/желчной кислоты, ингибитор HMG-CoA-редуктазы, производное никотиновой кислоты, тиреотропный гормон или аналог тиреотропного гормона, смешанные средства или их комбинацию.
Производные арилоксиалкановой кислоты/фибриновой кислоты
i.
Неограничивающими примерами производных арилоксиалкановой кислоты/фибриновой кислоты являются беклобрат, энзафибрат, бинифибрат, ципрофибрат, клинофибрат, клофибрат (атромид-S), клофибриновая кислота, этофибрат, фенофибрат, гемфиброзил (лобид), никофибрат, пирифибрат, ронифибрат, симфибрат и теофибрат.
Секвестранты полимерных/желчных кислот
ii.
Неограничивающими примерами секвестрантов полимерных/желчных кислот являются холестирамин (холибар, квестран), колестипол (колестид) и полидексид.
Ингибиторы HMG-CoA-редуктазы
iii.
Неограничивающими примерами ингибиторов HMG-CoA-редуктазы являются ловестатин (мевакор), правастатин (правохол) или симвастатин (зокор).
Производные никотиновой кислоты
iv.
Неограничивающими примерами производных никотиновой кислоты являются никотинат, ацепимокс, ницеритрол, никоклонат, никомол и оксиниациновая кислота.
Тиреотропные гормоны и аналоги тиреотропных гормонов
v.
Неограничивающими примерами тиреотропных гормонов и их аналогов являются этороксат, тиропропиновая кислота и тироксин.
Смешанные антигиперлипопротеинемические средства
vi.
Неограничивающими примерами смешанных гиполипопротеинемических средств являются ацифран, азакостерол, бенфлуорекс, β-бензалбутирамид, карнитин, сульфат хондроитина, кломестрон, детаксатран, натрий декстрансульфат, 5,8,11,14,17-эйкозапентаеновая кислота, эритаденин, фуразабол, меглутол, мелинамид, митатриендиол, орнитин, γ-оризанол, пантетин, тетраацетат пентаэритритола, α-фенилбутирамид, пирозадил, пробукол (лорелко), β-ситостирол, пиперазиновая соль сульфокремниевой кислоты, тиаденол, трипаранол и ксенбуцин.
Средства против артериосклероза
b.
Неограничивающим примером средства против артериосклероза является карбамат пиридинола.
Антитромботические/фибринолитические средства
с.
В некоторых вариантах изобретения введение средства, которое способствует удалению или предотвращению свертывания крови, может быть объединено с введением модулятора, в частности, для лечения атеросклероза и устранения блокады сердечно-сосудистой системы (например, артериальной). Неограничивающими примерами антитромботических и/или фибринолитических средств являются антикоагулянты, антагонисты антикоагулянтов, антитромбоцитарные средства, тромболитические средства, антагонисты тромболитических средств или их комбинации.
В некоторых аспектах изобретения предпочтительными являются антитромботические средства, которые могут быть введены перорально, такие как, например, аспирин и вафарин (кумадин).
Антикоагулянты
i.
Неограничивающими примерами антикоагулянтов являются аценокумарол, анкрод, анизиндион, броминдион, клориндион, куметарол, циклокумарол, натрий декстрансульфат, дикумарол, дифенадион, этилбискумацетат, этилидендикумарол, флуиндион, гепарин, гирудин, лиаполат натрия, оксазидион, полисульфат пентозана, фениндион, фенпрокумон, фосвитин, пикотамид, тиокломарол и варфарин.
Антитромбоцитарные средства
ii.
Неограничивающими примерами антитромбоцитарных средств являются аспирин, декстран, дипиридамол (персантин), гепарин, сульфинпиранон (антуран) и тиклопидин (тиклид).
Тромболитические средства
iii.
Неограничивающими примерами тромболитических средств являются тканевый активатор плазминогена (активаза), плазмин, проурокиназа, урокиназа (аббокиназа), стрептокиназа (стрептаза), анистреплаза/APSAC (эминаза).
Средства, способствующие свертыванию крови
d.
В некоторых вариантах изобретения, где указанный пациент страдает геморрагией или имеет повышенную предрасположенность к развитию геморрагии, может быть использовано средство, способствующее свертыванию крови. Неограничивающими примерами средств, способствующих свертыванию крови, являются антагонисты тромболитических средств и антагонисты антикоагулянтов.
Антагонисты антикоагулянтов
i.
Неограничивающими примерами антагонистов антикоагулянтов являются протамин и витамин К1.
Антагонисты тромболитических средств и антитромботические средства
ii.
Неограничивающими примерами антагонистов тромболитических средств являются амиокапроновая кислота (амикар) и транексаминовая кислота (амстат). Неограничивающими примерами антитромботических средств являются анагрелид, аргатробан, клистазол, далтробан, дефибротид, эноксапарин, фраксипарин, индобуфен, ламопаран, озагрел, пикотамид, плафибрид, теделпарин, тиклопидин и трифлузал.
Антиаритмические средства
е.
Неограничивающими примерами антиаритмических средств являются антиаритмические средства класса I (блокаторы натриевых каналов), антиаритмические средства класса II (бета-адренергические блокаторы), антиаритмические средства класса III (лекарственные средства, пролонгирующие реполяризацию), антиаритмические средства класса IV (блокаторы кальциевых каналов) и смешанные антиаритмические средства.
Блокаторы натриевых каналов
i.
Неограничивающими примерами блокаторов натриевых каналов являются антиаритмические средства класса IA, класса IB и класса IC. Неограничивающими примерами антиаритмических средств класса IA являются диспирамид (норпак), прокаинамид (пронестил) и хинидин (хинидекс). Неограничивающими примерами антиаритмических средств класса IB являются лидокаин (ксилокаин), токаинид (тонокард) и мексилетин (мекситил). Неограничивающими примерами антиаритмических средств класса IC являются энкаинид (энкаид) и флекаинид (тамбокор).
Бета-блокаторы
ii.
Неограничивающими примерами бета-блокаторов, также известных как β-адренергический блокатор, антагонист β-адренергических рецепторов или антиаритмическое средство класса II, являются ацебутолол (сектрал), альпренолол, амосулалол, аротинолол, атенолол, бефунолол, бетаксолол, бевантолол, бизопролол, бопиндолол, букумолол, буфетолол, буфуралол, бунитролол, бупранолол, гидрохлорид бутиридина, бутофилолол, каразолол, картеолол, карведилол, целипролол, цетамолол, клоранолол, дилевалол, эпанолол, эсмолол (бревиблок), инденолол, лабеталол, левобунолол, мепиндолол, метипранолол, метопролол, мопролол, надолол, надоксолол, нифеналол, нипрадилол, окспренолол, пенбутолол, пиндолол, практолол, пронеталол, пропанолол (индерал), соталол (бетапак), сульфиналол, талинолол, тертатолол, тимолол, толипролол и ксибинолол. В некоторых аспектах изобретения бета-блокатор содержит производное арилоксипропанололамина. Неограничивающими примерами производных арилоксипропаноламина являются ацебутолол, альпренолол, аротинолол, атенолол, бетаксолол, бевантолол, бизопролол, бопиндолол, бунитролол, бутофилолол, каразолол, картеолол, карведилол, целипролол, цетамолол, эпанолол, инденолол, мепиндолол, метипранолол, метопролол, мопролол, надолол, нипрадилол, окспренолол, пенбутолол, пиндолол, пропанолол, талинолол, тертатолол, тимолол и толипролол.
Средства, пролонгирующие реполяризацию
iii.
Неограничивающими примерами средств, пролонгирующих реполяризацию и также известных как антиаритмическое средство класса III, являются амиодарон (кордарон) и соталол (бетапак).
Блокаторы/антагонисты кальциевых каналов
iv.
Неограничивающими примерами блокаторов кальциевых каналов, также известных как антиаритмическое средство класса IV, являются арилалкиламин (например, бепридил, дилтиазем, фендилин, галлопамил, прениламин, теродилин, верапамил), производное дигидропиридина (фелодипин, израдипин, никардипин, нифедипин, нимодипин, низолдипин, нитрендипин), производное пиперазинида (например, циннаризин, флунаризин, лидофлазин) или смешанный блокатор кальциевых каналов, такой как бенциклан, этафенон, магний, мибефрадил или пергексилин. В некоторых вариантах изобретения блокатор кальциевых каналов включает дигидропиридиновый антагонист кальциевых каналов (типа нифедипина) пролонгированного действия.
Смешанные антиаритмические средства
v.
Неограничивающими примерами смешанных антиаритмических средств являются аденозин (аденокард), дигоксин (ланоксин), ацекаинид, аймалин, амопроксан, априндин, тозилат бретилия, бунафтин, бутобендин, капобеновая кислота, цифенлин, дизопиранид, гидрохинидин, индекаинид, бромид ипатропия, лидокаин, лораймин, лоркаинид, меобентин, морицизин, пирменол, праймалин, пропафенон, пиринолин, полигалактуронат хинидина, сульфат хинидина и виквидил.
Антигипертензивные средства
f.
Неограничивающими примерами антигипертензивных средств являются симпатолитические средства, альфа-/бета-блокаторы, альфа-блокаторы, средства против ангиотензина II, бета-блокаторы, блокаторы кальциевых каналов, сосудорасширяющие средства и смешанные антигипертензивные средства.
Альфа-блокаторы
i.
Неограничивающими примерами альфа-блокаторов, также известных как α-адренергический блокатор или антагонист α-адренергических рецепторов, являются амосулалол, аротинолол, дапипразол, доксазозин, мезилаты эрголоида, фенспирид, индорамин, лабеталол, ницерголин, празозин, теразозин, толазолин, тримазозин и ехимбин. В некоторых вариантах изобретения альфа-блокатор может включать производное хиназолина. Неограничивающими примерами производных хиназолина являются альфузозин, буназозин, доксазозин, празозин, теразозин и тримазозин.
Альфа-бета-блокаторы
ii.
В некоторых вариантах изобретения антигипертензивным средством являются альфа- и бета-адренергические антагонисты. Неограничивающими примерами альфа-бета-блокаторов являются лабеталол (нормодин, трандат).
Средства против ангиотензина II
iii.
Неограничивающими примерами средств против ангиотензина II являются ингибиторы ангиотензин-конвертирующих ферментов и антагонисты рецептора ангиотензина II. Неограничивающими примерами ингибиторов ангиотензин-конвертирующих ферментов (ингибиторов ACE) являются алацеприл, эналаприл (вазотек), каптоприл, цилазаприл, делаприл, эналаприлат, фозиноприл, лизиноприл, мовелтоприл, периндоприл, хинаприл и рамиприл. Неограничивающими примерами блокаторов рецептора ангиотензина II, также известных как антагонист рецептора ангиотензина II, блокатор рецептора ANG или блокатор рецептора ANG-II типа 1 (ARBS), являются ангиокандесартан, эпросартан, ирбесартан, лозартан и валсартан.
Симпатолитические средства
iv.
Неограничивающими примерами симпатолитических средств являются симпатолитические средства, действующие на центральную нервную систему, или симпатолитические средства, действующие на периферические органы. Неограничивающими примерами симпатолитических средств, действующих на центральную нервную систему и также известных как симпатолитическое средство, действующее на органы центральной нервной системы (ЦНС), являются клонидин (катапрес), гуанабенз (витензин), гуанфацин (тенекс) и метилдопа (альдомет). Неограничивающими примерами симпатолитических средств, действующих на периферические органы, являются средство, блокирующее ганглий, адренергическое нейрон-блокирующее средство, средство, блокирующее β-адренергический рецептор, или средство, блокирующее альфа-адренергический рецептор. Неограничивающими примерами средств, блокирующих ганглий, являются мекамиламин (инверсин) и триметафан (арфонад). Неограничивающими примерами адренергических нейрон-блокирующих средств являются гуанетидин (исмелин) и резерпин (серпазил). Неограничивающими примерами β-адренергических блокаторов являются аценитолол (сектрал), атенолол (тенормин), бетаксолол (керлон), картеолол (картрол), лабеталол (нормодин, трандат), метопролол (лопрессор), наданол (коргард), пенбутолол (леватол), пиндолол (вискен), пропранолол (индерал) и тимолол (блокадрен). Неограничивающими примерами альфа1-адренергических блокаторов являются празозин (минипресс), доксазоцин (кардура) и теразозин (гитрин).
Сосудорасширяющие средства
v.
В некоторых вариантах изобретения терапевтическое средство для лечения сердечно-сосудистых заболеваний может включать сосудорасширяющее средство (например, церебральный вазодилататор, коронарный вазодилататор или периферический вазодилататор). В некоторых предпочтительных вариантах изобретения вазодилататор включает коронарный вазодилататор. Неограничивающими примерами коронарных вазодилататоров являются амотрифен, бендазол, гемисукцинат бенфуродила, бензиодарон, хлорацизин, хромонар, клобенфурол, клонитрат, дилазеп, дипиридамол, дропрениламин, эфлоксат, эритритилтетранитран, этафенон, фендилин, флоредил, ганглефен, бис-β-диэтиламиноэтиловый эфир герестрола, гексобендин, тозилат итрамина, кхеллин, лидофланин, гексанитрат маннита, медибазин, никорглицерин, тетранитрат пентаэритритола, пентринитрол, пергексилин, пимефиллин, трапидил, трикромил, триметазидин, фосфат тролнитрата и виснадин.
В некоторых аспектах изобретения вазодилататор может включать вазодилататор для непрерывной терапии или гипертензивный вазодилататор неотложной помощи. Неограничивающими примерами вазодилататоров для непрерывной терапии являются гидралазин (апрезолин) и миноксидил (лонитен). Неограничивающими примерами гипертензивных вазодилататоров неотложной помощи являются нитропруссид (ниприд), диазоксид (гиперстат IV), гидралазин (апрезолин), миноксидил (лонитен) и верапамил.
Смешанные антигипертензивные средства
vi.
Неограничивающими примерами смешанных антигипертензивных средств являются аймалин, γ-аминомасляная кислота, буфениод, циклетаинин, циклозидомин, таннат криптенамина, фенолдопам, флозехинан, кетансерин, мебутамат, мекамиламин, метилдопа, метил-4-пиридилкетонтиосемикарбазон, музолимин, паргилин, пемпидин, пинацидил, пипероксан, примаперон, протовератрин, раубазин, ресциметол, рилмениден, саралазин, нитроруссид натрия, тикринафен, камзилат триметафана, тирозиназа и урапидил.
В некоторых аспектах изобретения антигипертензивное средство может включать производное арилэтаноламина, производное бензотиадиазина, производное N-карбоксиалкил(пептида/лактама), производное дигидропиридина, производное гуанидина, гидразин/фталазин, производное имидазола, соединение четвертичного аммония, производное резерпина или производное сульфонамида.
Производные арилэтаноламина
. Неограничивающими примерами производных арилэтаноламина являются амосулалол, буфуралол, дилевалол, лабеталол, пронеталол, соталол и сульфиналол.
Производные бензотиадиазина
. Неограничивающими примерами производных бензотиадиазина являются алтизид, бендрофлуметиазид, бензтиазид, бензилгидрохлортиазид, бутиазид, хлортиазид, хлорталидон, циклопентиазид, циклотиазид, диазоксид, эпитиазид, этиазид, фенхизон, гидрохлортизид, гидрофлуметизид, метилклотиазид, метикран, метолазон, парафлутизид, политизид, тетрахлорметиазид и трихлорметиазид.
Производные N-карбоксиалкил(пептида/лактама)
. Неограничивающими примерами производных N-карбоксиалкил(пептида/лактама) являются алацеприл, каптоприл, цилазаприл, делаприл, эналаприл, эналаприлат, фозиноприл, лизиноприл, мовелтиприл, периндоприл, хинаприл и рамиприл.
Производные дигидропиридина
. Неограничивающими примерами производных дигидропиридина являются амлодипин, фелодипин, исрадипин, никардипин, нифедипин, нилвадипин, низолдипин и нитрендипин.
Производные гуанидина
. Неограничивающими примерами производных гуанидина являются бетанидин, дебризохин, гуанабенз, гуанаклин, гуанадрел, гуаназодин, гуантидин, гуанфацин, гуанохлор, гуаноксабенз и гуаноксан.
Гидразины/фталазины
. Неограничивающими примерами гидразинов/фталазинов являются будралазин, кадралазин, дигидралазин, эндралазин, гидракарбазин, гидралазин, фенипразин, пилдралазин и тодралазин.
Производные имидазола
. Неограничивающими примерами производных имидазола являются клонидин, лофексидин, фентоламин, тиаменидин и толонидин.
Соединения четвертичного аммония
. Неограничивающими примерами соединений четвертичного аммония являются бромид азаметония, хлорид хоризондамина, гексаметоний, бисметилсульфат пентациния, бромид пентаметония, тартрат пентолиния, хлорид фенактропиния и метосульфат триметидиния.
Производные резерпина
. Неограничивающими примерами производных резерпина являются биетазерпин, десерпидин, ресциннамин, резерпин и сиросингопин.
Производные сульфонамида
. Неограничивающими примерами производных сульфонамида являются амбузид, клопамид, фуросемид, индапамид, хинетазон, трипамид и ксипамид.
Сосудосуживающие средства
vii.
Сосудосуживающие средства обычно используются для повышения кровяного давления при шоке, который может произойти во время хирургической операции. Неограничивающими примерами сосудосуживающих средств, также известных как гипертензивные средства, являются метилсульфат амезиния, амид ангиотензина, диметофрин, допамин, этифелмин, этилефрин, гепефрин, метараминол, мидодрин, норэпинефрин, фоледрин и синефрин.
Средства для лечения застойной сердечной недостаточности
g.
Неограничивающими примерами средств для лечения застойной сердечной недостаточности являются средства против ангиотензина II, лекарственные средства, уменьшающие постнагрузку-преднагрузку на сердце, диуретики и инотропные средства.
Лекарственные средства, уменьшающие постнагрузку-преднагрузку на сердце
i.
В некоторых вариантах изобретения животное, которое не переносит лечения антагонистом ангиотензина, может быть подвергнуто комбинированной терапии. Такая терапия может объединять введение гидралазина (апресолина) и динитрата изосорбида (изордила, сорбитрата).
Диуретики
ii.
Неограничивающими примерами диуретиков являются производное тиазида или бензотиадиазина (например, алтиазид, бендрофлуметазид, бензтиазид, бензилгидрохлортиазид, бутиазид, хлортиазид, хлорталидон, циклопентиазид, эпитиазид, этиазид, фенхизон, гидрохлортиазид, гидрофлуметазид, метилклотиазид, метикран, метолазон, парафлутизид, политизид, тетрахлорметиазид, трихлорметиазид), ртутьорганические соединения (например, хлормеродрин, мераллурид, меркамфамид, натрий меракптомерин, меркумаллиловая кислота, меркуматиллиндодий, хлорид ртути, мерсалил), птеридин (например, фуртерен, триамтерен), пурины (например, ацефиллин, 7-морфолинометилтеофиллин, памобром, протеобромин, теобромин), стероиды, включая антагонисты альдостерона (например, канренон, олеандрин, спиронолактон), производное сульфонамида (например, ацетазоламид, амбузид, азосемид, буметанид, бутазоламид, хлораминофенамид, клофенамид, клопамид, клорексолон, дифенилметан-4,4'-дисульфонамид, дисульфамид, этоксзоламид, фуросемид, индапамид, мефрузид, метазоламид, пиретанид, хинетазон, торасемид, трипамид, ксипамид), производное урацила (например, аминометрадин, амизометрадин), калий-истощающий антагонист (например, амилорид, триамтерен) или смешанные диуретики, такие как аминозин, арбутин, хлоразанил, этакриновая кислота, этозолин, гидракарбазин, изосорбид, маннит, метохалькон, музолимин, пергексилин, тикорнафен и мочевина.
Инотропные средства
iii.
Неограничивающими примерами позитивных ионотропных средств, также известных как кардиотонические средства, являются ацефиллин, ацетилдигитоксин, 2-амино-4-пиколин, амринон, гемисукцинат бенфуродила, букладезин, церберозин, камфотамид, конваллотоксин, цимарин, денопамин, десланозид, дигиталин, алкалоид наперстянки, дигитоксин, дигоксин, добутамин, допамин, допексамин, эноксимон, эритрофлеин, феналкомин, гиталин, гитоксин, гликоциамин, гептаминол, гидрастинин, ибопамин, ланатозид, метамивам, милринон, нерифолин, олеандрин, оубаин, оксифедрин, преналтерол, просцилларидин, резибуфогенин, сцилларен, сцилларенин, строфантин, сулмазол, теобромин и ксамотерол.
В конкретных аспектах изобретения инотропными средствами являются сердечный гликозид, бета-адренергический агонист или ингибитор фосфодиэстеразы. Неограничивающими примерами сердечных гликозидов являются дигоксин (ланоксин) и дигитоксин (кристодигин). Неограничивающими примерами β-адренергических агонистов являются альбутерол, бамбутерол, битолтерол, карбутерол, кленбутерол, клорпреналин, денопамин, диоксетедрин, добутамин (добутрекс), допамин (интропин), допексамин, эфедрин, этафедрин, этилнорэпинефрин, фенотерол, формотерол, гексопреналин, ибопамин, изоэтарин, изопротеренол, мабутерол, метапротеренол, метоксифенамин, оксифедрин, пирбутерол, прокатерол, протокилол, репротерол, римитерол, ритодрин, сотеренол, тербуталин, третохинол, тулобутерол и ксамотерол. Неограничивающим примером ингибитора фосфодиэстеразы является амринон (инокор).
Средства против стенокардии
iv.
Средства против стенокардии могут включать органические нитраты, блокаторы кальциевых каналов, бета-блокаторы и их комбинации.
Неограничивающими примерами органических нитратов, также известных как нитросоединения, обладающие сосудорасширяющими свойствами, являются нитроглицерин (нитробид, нитростат), динитрат изосорбида (изордил, сорбитрат) и амилнитрат (аспирол, вапорол).
Хирургические терапевтические средства
2.
В некоторых вариантах изобретения второе терапевтическое средство может включать некоторые типы хирургического вмешательства, которыми являются, например, превентивная хирургия, диагностическая хирургия или хирургическое стадирование, а также радикальная и паллиативная хирургия. Хирургия, в частности радикальная хирургия, может применяться в сочетании с другими методами терапии, такими как терапия согласно изобретению и терапия с использованием одного или нескольких других средств.
Такие хирургические терапевтические средства, применяемые для лечения сосудистых и сердечно-сосудистых заболеваний и расстройств, хорошо известны специалистам и могут включать, не ограничиваются ими, проведение хирургической операции, проведение механического сердечно-сосудистого протезирования, ангиопластику, реперфузию коронарной артерии, удаление катетера, введение индивидууму имлантируемого кардиовертер-дефибриллятора, механическое поддержание кровообращения или их комбинации. Неограничивающие примеры механического поддержания кровообращения, которое может применяться в настоящем изобретении, включают внутриаортальную баллонную контрпульсацию, использование левожелудочкового аппарата вспомогательного кровообращения или их комбинацию.
Примеры
IV.
Для иллюстрации предпочтительных вариантов осуществления изобретения приводятся нижеследующие примеры. При этом следует отметить, что приведенные в примерах способы проиллюстрированы авторами настоящего изобретения как способы, подходящие для осуществления настоящего изобретения, а поэтому они могут рассматриваться как предпочтительные варианты осуществления изобретения. Однако из описания изобретения очевидно, что в конкретные варианты изобретения может быть внесено множество изменений, которые описаны в настоящей заявке и дают аналогичные или сходные результаты, не выходящие за рамки существа и объема изобретения.
ПРИМЕР 1
ТРАНСФИЦИРОВАННЫЕ КЛЕТКИ
Методы
А.
3
Фибробласты китайского хомячка (клетки CHW) стабильно трансфицировали человеческими Arg389- и Gly389-кДНК, как было ранее описано в литературе (Mason et al., 1999). Линии с эквивалентными уровнями экспрессии, определенными с помощью анализа на связывание с радиоактивным лигандом, исследовали для того, чтобы определить, оказывает ли буциндолол антагонистическое действие на стимулируемую норэпинефрином аккумуляцию cAMP. Клетки в монослоях обрабатывали 10 мкМ норэпинефрина в отсутствие и в присутствии различных концентраций буциндолола в течение 20 минут при 37°С, а [Н]cAMP выделяли колоночной хроматографией (Salomon, 1991).
Результаты: ответ на введение буциндолола в трансфицированные клетки
В.
1
50
Уровни экспрессии рецепторов в клетках CHW, измеряемые в исследованиях на функциональный антагонизм, составляли 123±19 и 137±16 фмоль/мг для Arg389- и Gly389-содержащих клеточных линий соответственно. Клетки обрабатывали 10 мкМ агониста норэпинефрина в отсутствие или в присутствии различных концентраций буциндолола и определяли уровни cAMP. Как показано на фиг.3, Arg389-рецепторы обнаруживали более высокую стимуляцию cAMP норэпинефрином в отсутствие буциндолола по сравнению с Gly389-рецептором, который представляет собой исходный фенотип этих двух рецепторов (Mason et al., 1999). Несмотря на значительно более высокую степень опосредованной норэпинефрином стимуляции Arg389-рецептора, буциндолол эффективно ингибировал этот ответ. Различие в абсолютном снижении уровня продуцирования cAMP, вызываемом буциндололом, было выше для клеток, экспрессирующих β-Arg389, т.е. буциндолол вызывал максимальное снижение уровня cAMP в Arg389-клетках, который составлял 435±80 фмоль/мл, по сравнению со значением cAMP в Gly389-клетках, которое составляло 115±23 фмоль/мл (P<0,008, N=4). При этом для таких ответов, какого-либо отличия в эффективности буциндолола не наблюдалось (ED=46±4,5 и 35±11 нМ соответственно, P=0,94, N=4). В дополнительных экспериментах введение одного буциндолола при концентрациях до 10 мкМ не вызывало стимуляцию cAMP в клетках, экспрессирующих любой вариант рецептора (данные не приводятся). Таким образом, эти результаты показали, что Arg389-рецептор может обеспечивать лучший клинический ответ на введение буциндолола при лечении сердечной недостаточности.
ПРИМЕР 2
ОТВЕТ НА β-БЛОКАДУ У ТРАНСГЕННЫХ МЫШЕЙ
1
Для оценки аллель-специфических ответов на непрерывное введение β-блокатора пропранолола использовали трансгенных мышей с направленной вентрикулярной экспрессией человеческого βAR (Arg389- или Gly389-форм), которым был введен промотор тяжелой цепи α-миозина. Уровни экспрессии двух рецепторов были эквивалентными. Выведение этих мышей и их неполные характеристики были недавно подробно описаны в работе Perez et al., 2003. Для проведения данных исследований 3-месячным мышам с обоими генотипами, а также нетрансгенным мышам непрерывно в течение 6 месяцев давали пропранолол (0,5 мг/мл), содержащийся в питьевой воде, либо им давали воду без пропранолола (контроль). Затем сердце удаляли и приготавливали вентрикулярные белковые экстракты. Эти экстракты подвергали вестерн-блоттингу для оценки экспрессии нижеследующих белков описанными ранее методами (Perez et al., 2003): Gαs, Gαi2, сопряженного с G-белком рецептора-2, обладающего киназной активностью (GRK2), аденилилциклазы типа 5 (AC5), общего фосфоламбана (T-PLN), фосфорилированного фосфоламбана (P-PLN) и фермента кальций-АТФаза-2A саркоплазматического, эндоплазматического ретикулума (SERCA). Терапевтический эффект оценивали путем сравнения уровней экспрессии белков у необработанных мышей и у обработанных пропранололом мышей, в соответствии с их генотипом, с помощью анализа ANOVA. На эти исследования было получено разрешение Комитета по содержанию и уходу за животными при Университете в Цинциннати.
1
1
1
1
1
1
++
Как недавно сообщалось в публикации Perez et al., 2003, у трансгенных мышей с направленной экспрессией βGly389 или βArg389 за период наблюдения (с 6-месячного возраста), в сердце обнаруживались многочисленные изменения уровня экспрессии некоторых сигналов и Ca-регулирующих белков. Для оценки эффективности генотип-специфического ответа на длительную β-блокаду 3-месячным мышам, экспрессирующим каждый βAR-генотип давали плацебо или β-блокатор пропранолол в течение шести месяцев, а затем желудочки удаляли и приготавливали экстракты белка. Для количественной оценки экспрессии указанных белков путем сравнения изменений уровней экспрессии после обработки животных в группах с βAR-генотипом использовали вестерн-блот-анализ. Как показано на фиг.4, обработка пропранололом не влияла (P=0,67) на экспрессию указанных белков в сердце Gly389-мышей. В противоположность этому, общий ответ на обработку (увеличение или снижение уровня экспрессии) наблюдался в сердце Arg389-мышей, обработанных пропранололом (P<0,002). Общие тенденции эффектов, индуцируемых β-блокаторами, которые включают увеличение экспрессии в Gαs, P-PLN и T-PLN, и снижение экспрессии Gαi и GRK2, рассматриваются как восстановительные биохимические ответы при гипертрофии сердца/сердечной недостаточности (Liggett, 2001). В целом, полученные профили экспрессии белка, ассоциированные с продолжительной β-блокадой у этих трансгенных мышей-моделей, дают основание предположить, что более благоприятный ответ на введение β-блокатора буциндолола может ожидаться у βArg389-пациентов с сердечной недостаточностью, но не у пациентов с βGly389-генотипом.
ПРИМЕР 3
КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БУЦИНДОЛОЛА И ПЛАЦЕБО
Материалы и методы
А.
Группа пациентов
1.
1
Пациентов, участвующих в испытаниях, целью которых является оценка выживаемости при приеме β-блокаторов (BEST) (Lowes et al., 2002), и пациентов, которые дали свое согласие на субисследование ДНК, подвергали генотипическому исследованию на наличие полиморфизма в кодирующих сайтах βAR. Регистрацию участников испытания BEST проводили с 31 мая 1995 до 31 декабря 1998; протокол исследования подробно описан в публикациях (BEST Trial Investigators, 2001, и Lowes et al., 2002). Вкратце, это исследование представляло собой рандомизированное, мультицентровое, плацебо-контролируемое испытание лекарственного средства 3-го поколения, неселективного сосудорасширяющего β-блокатора буциндолола (Bristow, 2000), проводимое с участием 2708 пациентов с сердечной недостаточностью класса III/IV (BEST Trial Investigators, 2001). Пациентам, получавшим активное лекарственное средство, вводили 3 мг буциндолола два раза в день в течение первой недели с последующим увеличением дозы, если они обнаруживали толерантность к этому средству, до 50 мг два раза в день в течение недели (или 100 мг два раза в день для пациентов, вес которых превышал 75 кг). Из 2708 пациентов 1040 пациентов, давших свое согласие на участие в субисследованиях, имели адекватную ДНК, полученную из пробы крови. Разрешение на эти исследования было получено Комитетом по ДНК-исследованиям BEST и Институционным контрольным советом при Университете Цинциннати (BEST DNA Oversight Committee and the University of Cincinnati Institutional Review Board).
Генотипирование
2.
1
ДНК экстрагировали из цельной крови стандартными методами (Jones, 1963). Определение генотипа осуществляли методами, которые были подробно описаны ранее (Small et al., 2002). Для βAR модификации в положениях кодирующих нуклеотидов 145 и 1165, которые соответствовали аминокислотам 49 и 389, подвергали трансдифференцировке. Эти аллели были обозначены β1-Ser49, β1-Gly49 и βl-Arg389, βl-Gly389. Все ДНК-образцы были затем генотипированы в локусе βlAR-389, а 1030 образцов были генотипированы в локусе βIAR-49.
Статистический анализ
3.
Главными конечными целями испытаний были оценка смертности по всем нозологическим формам заболевания, госпитализация по поводу сердечной недостаточности, решение о которой принималось Комиссией по испытаниям (BEST Trial Investigators, 2001), и оценка общего показателя “смертность или госпитализация по поводу сердечной недостаточности”. Варианты в аминокислотном положении 389 β1AR (Arg и Gly) рассматривались как главные генотипы, которые, как предполагается, влияют на эффективность β-блокатора. Непрерывные клинические показатели выражали как среднее (ср.кв.от.), и сравнения проводили с помощью т-критерия или критериев суммы рангов Уилкоксона. Категорийные признаки выражали в виде относительных величин, а сравнения проводили с помощью точного критерия хи-квадрат или точных критериев Фишера. Интегральные кривые выживаемости строили методами Каплана-Мейера (Kaplan et al., 1958) и с помощью патентованной компьютерной программы SAS (r) (версия 6.12. Cary, NC: SAS Institute, 1996). Для оценки эффектов лечения, стратифицированного по указанному генотипу, использовали регрессионную модель относительных рисков Кокса. В результаты были внесены поправки на возраст, пол, расу и, как уже указывалось, на β1-Gly49-полиморфизм. Из-за ограниченного числа сравнений и в соответствии с априорной гипотезой, высказанной исходя из исследований клеток, трансгенных животных и других исследований с участием человека (Kaplan et al., 1958), и с помощью патентованной компьютерной программы SAS (r) (версия 6.12. Cary, NC: SAS Institute, 1996; Perez et al., 2003; Wagoner et al., 2002), величины P<0,05 рассматривались как значимые, без поправок на множество сравнений.
Результаты
В.
Результаты, полученные для трансфицированных клеток и трансгенных мышей, послужили основанием для выявления генотипов пациентов путем проведения испытания BEST, а именно испытаний на эффективность β-блокатора буциндолола при лечении сердечной недостаточности класса III-IV, которое включает группу контроля, получавшую плацебо (BEST Trial Investigators, 2001). Самые высокие демографические и фоновые клинические показатели у пациентов, участвовавших в субисследованиях ДНК, по сравнению с пациентами, не участвовавшими в таких исследованиях, не имели значимого отличия. Следует особо отметить, что возраст, пол, класс по NYHA и этиология сердечной недостаточности у этих пациентов были примерно одинаковыми. При этом у участников субисследований по ДНК и у пациентов, не участвующих в этих исследованиях, наблюдались небольшие и клинически незначимые различия в фоновой частоте сердечных сокращений (-1,3 ударов/минуту), в систолическом кровяном давлении (+1,7 мм рт.ст.), в массе тела (+1,9 кг), во LVEF (фракции выброса крови левым желудочком) (+0,9%) и в проценте пациентов, не принадлежащих к индоевропейской расе (-5%). Общая чистота аллелей с Arg389 составляла 67%, что, по сообщенным данным, соответствовало частоте аллелей с этим полиморфизмом у нормальных людей (Mason et al., 1999) и у людей с сердечной недостаточностью (Small et al., 2002).
1
Данные пациентов, разделенных на группы по генотипам (βAR-389), положенных в основу исходной гипотезы, и группы, проходящие лечение, представлены в таблице 2. При этом пациенты, распределенные по группам, принимавшим плацебо, по группам, проходящим лечение буциндололом, или по группам, выбранным на основе генотипов, не отличались по возрасту, полу, расе, этиологии сердечной недостаточности, классу по NYHA или базовой фракции выброса крови левым желудочком (LVEF). Как можно видеть из таблицы, число индивидуумов, гомозиготных по Gly389, является относительно небольшим (52 пациента, принимавших плацебо, 42 пациента, принимавших буциндолол). Поэтому гомозиготы по Arg сравнивали с Gly-носителями (пациентами, имеющими один или два Gly-аллеля). Каждая из четырех групп, классифицированных как группы, получающие лечение и обследуемые на генотип, состояла из более чем 200 индивидуумов (таблица 2).
<u>Таблица 2</u>
Базовые показатели для пациентов, участвующих в испытаниях BEST и стратифицированных по лечению и генотипу. Данные представлены как среднее (ср.кв.от.)
Группа, принимавшая плацебоN=525
Группа, принимавшая буциндололN=515
Гомозиготный по Arg N=236
Гетерозиготный по Arg/Gly N=237
Гомозиготный по Gly N=52
Gly-носители N=289
Гомозиготный по ArgN=257
Гетерозиготный по Arg/Gly N=216
Гомозиготный по GlyN=42
Gly-носителиN=258
Возраст - среднее (стд.от.)
60,5 (11,8)
60,3 (12,4)
59,6 (13,2)
60,2 (12,5)
59,8 (11,8)
61,6 (12,0)
56,6 (14,2)
60,8 (12,5)
Пол - N(%)МужскойЖенский
187(79%) 49 (21%)
183 (77%) 54 (23%)
42(81%)10 (19%)
225 (78%) 64 (22%)
206 (80%) 51 (20%)
173 (80%) 43 (20%)
34(81%)8 (19%)
207 (80%) 51 (20%)
Раса - N(%)Не негроиднаяНегроидная
212(90%) 24 (10%)
182(77%) 55 (23%)
33 (63%) 19 (37%)
215 (74%) 74 (26%)
215 (84%) 42 (16%)
165 (76%) 51 (24%)
26 (62%) 16(38%)
191 (74%) 67 (26%)
Этиология - N(%)ИшемияОтсутствие ишемии
145 (61%) 91 (39%)
137 (58%) 100 (42%)
34 (65%) 18 (35%)
171 (59%) 118(41%)
138 (54%) 119(46%)
129 (60%) 87 (40%)
23 (55%) 19 (45%)
152 (59%) 106 (41%)
Функциональный класс по NYHA - N(%)IIIIV
223(94%)13 (6%)
217 (92%)20 (8%)
48 (92%)4 (8%)
265 (92%)24 (8%)
242 (94%)15 (6%)
194 (90%)22 (10%)
36 (86%)6 (14%)
230 (89%)28(11%)
LVEF % - среднее (стд.от.)
23,3 (7,0)
24,2(7,1)
23,6 (6,8)
24,1 (7,0)
23,4 (7,2)
23,7 (7,1)
22,6 (6,9)
23,5 (7,1)
1
1
Выживаемость пациентов, принимавших плацебо и буциндолол и стратифицированных по βAR-389-генотипу, представлена на фиг.5 и 6. Сравнения индивидуумов, скорректированные по их возрасту, полу и расе, выявили, что гомозиготные по Arg389 пациенты, проходившие лечение буциндололом, имели более высокие показатели выживаемости по сравнению с Arg389-пациентами, принимавшими плацебо (отношение рисков = 0,62, 95% ДИ=0,40-0,96, P=0,03). Таким образом, у Arg389-пациентов, принимавших буциндолол, наблюдалось улучшение показателей выживаемости на 38% по сравнению с пациентами, принимавшими плацебо. Аналогичное сравнение у Gly-носителей не выявило какого-либо различия на кривых выживаемости (отношение рисков = 0,90, 95% ДИ=0,62-1,30, P=0,57), что указывало на отсутствие ответа на лечение буциндололом. В отношении госпитализации по поводу сердечной недостаточности также наблюдалось явное влияние βAR-генотипа на ответ, индуцируемый при лечении буциндололом (фиг.5). У гомозиготных по Arg389 пациентов, принимавших буциндолол, наблюдалось снижение числа случаев госпитализации по сравнению с пациентами с таким же генотипом, но принимавшими плацебо (отношение рисков = 0,64, 95% ДИ=0,46-0,88, P=0,006). С точки зрения госпитализации у Gly-носителей не наблюдалось благоприятного эффекта при введении лекарственного средства по сравнению с введением плацебо (отношение рисков = 0,86, 95% ДИ=0,64-1,15, P=0,298). Что касается общего исхода, а именно госпитализации по поводу сердечной недостаточности или смерти от сердечной недостаточности, то благоприятный эффект, ассоциированный с введением буциндолола (фиг.5 и 7), был очевиден для Arg389-пациентов по сравнению с пациентами, принимавшими плацебо (отношение рисков = 0,66, 95% ДИ=0,50-0,88, P=0,004), но он был не очевиден у Gly389-носителей, проходивших лечение буциндололом, по сравнению с пациентами, принимавшими плацебо (отношение рисков = 0,87, 95% ДИ=0,67-1,11, P=0,250). Поправка на варианты в положении 49 (β1-Ser49, β1-Gly49) не оказывала какого-либо значимого влияния на любой из вышеуказанных результатов. С такой поправкой (включая возраст, пол и расу) отношение рисков выживаемости для β1-Arg389-гомозиготов составляло 0,62, 95% ДИ=0,40-0,97, P=0,035, а для βl-Gly389-носителей какого-либо явного эффекта лечения не наблюдалось (отношение рисков = 0,89, 95% ДИ=0,61-1,30, P=0,56). Аналогичным образом, поправка на варианты в положении 49 не оказывала какого-либо значимого влияния на отношение рисков с точки зрения госпитализации: для Arg389-гомозиготов отношение рисков = 0,63, 95% ДИ=0,45-0,86, P=0,007, а для Gly389-носителей отношение рисков = 0,85, 95% ДИ=0,63-1,14, P=0,54. Результаты по общим показателям, а именно по смертности и госпитализации, стратифицированных по β1-389-генотипу, также не изменялись в зависимости от β1-49-генотипов.
ПРИМЕР 4
РИСК ЛЕТАЛЬНОГО ИСХОДА, АССОЦИИРОВАННЫЙ С СИМПАТОЛИЗОМ У НЕКОТОРЫХ ПАЦИЕНТОВ, УЧАСТВУЮЩИХ В ИСПЫТАНИЯХ BEST
Измерения системных венозных уровней норэпинефрина в процессе испытаний BEST в соответствии с основным протоколом служат самым значимым базовым прогностическим фактором смертности, при этом Ln (натуральный логарифм) уровней норэпинефрина ассоциируются с 1,8-1,6-кратным увеличением риска летального исхода, на что указывали одномерные и многомерные анализы соответственно. Как показано ниже, неожиданно было обнаружено, что изменение в уровнях норэпинефрина за 3 месяца имело сложную взаимосвязь со смертностью, которая зависела от группы, подвергавшейся конкретному лечению. У значительного числа пациентов (18% от общего числа индивидуумов) в группе, принимавшей буциндолол, но не в группе, принимавшей плацебо, наблюдалось снижение уровней норэпинефрина, которые ассоциировались с 1,7-кратным повышением риска последующего летального исхода.
Большинство, но не все, исследования показали, что адренергическая активность является главным показателем исхода хронической сердечной недостаточности (ХСН) (Cohn et al., 1984; Kaye et al., 1995; Isnard et al., 2000; Rockman et al., 1989). Кроме того, адренергическая активность сердца является первым нейрогормональным показателем, который повышается у индивидуумов с дисфункцией левого желудочка (Runquist et al., 1997). Эти наблюдения были положены в основу способа проведения терапии сердечной недостаточности β-блокаторами (Bristow, 2000).
С другой стороны, адренергический носитель является важным компенсирующим механизмом при сердечной недостаточности, служащим для поддержания функции покоя миокарда на относительно нормальном уровне (Port et al., 2001). Если адренергическая активность у индивидуумов с хронической сердечной недостаточностью быстро снижается, то функция миокарда может ухудшаться (Gaffney et al., 1963), а лечение, которое, по существу, приводит к снижению адренергической активности, может приводить к повышению вероятности возникновения серьезных побочных эффектов, включая летальный исход (Cohn et al., 2003; Swedberg et al., 2002). Исходя из этих наблюдений очевидно, что “симпатолитическое” фармакологическое снижение адренергической активности может негативно влиять на сердечную недостаточность, патогенез которой совершенно отличается от β-блокады.
Хотя базовая адренергическая активность была оценена в различных исследованиях исходов ХСН, а также в клинических испытаниях (Benedict et al., 1996; Swedberg et al., 1996; Francis et al., 1993; Anand et al., 2003), однако до настоящего времени в этих исследованиях принимало участие лишь относительно небольшое число человек (обычно сотни человек) (Anand et al., 2003). Кроме того, взаимосвязь временной динамики уровней норэпинефрина как потенциальный показатель патогенеза оценивали только в двух других испытаниях (Swedberg et al., 1990; Anand et al., 2003) и никогда не оценивали на больших группах пациентов с ХНС в плацебо-контролируемых испытаниях с использованием сильного антиадренергического средства. Поэтому в испытаниях BEST было оценено влияние базовых уровней и изменений адренергической активности на клинический исход, а также было оценено влияние буциндолола, β-блокатора с симпатолитическими свойствами, на клинический исход.
Методы
А.
Протокол клинических испытаний
1.
Протокол испытаний BEST и основные результаты этих испытаний были описаны ранее (Mason et al., 1999; Small et al., 2002). Из-за задержек на начальном этапе проведения процедур сбор образцов для определения уровней норэпинефрина у произвольно отобранных пациентов начинали через 6 месяцев после начала испытаний. В результате этого у 2126 из 2708 произвольно отобранных индивидуумов, участвующих в BEST, которые имели по меньшей мере базовые уровни норэпинефрина, брали образцы и проводили их оценку.
Сбор образцов и измерение уровней норэпинефрина
2.
Пробы, взятые из периферических вен, для определения норэпинефрина (NE) брали до начала испытаний и через 3 и 12 месяцев путем введения в плечевую вену иглы-бабочки калибра 21 и индивидуума оставляли на 30 минут в лежачем положении в звукоизолированном помещении. Начальные 3 мл крови отбрасывали, а затем брали 5 мл крови и сразу переносили в предварительно охлажденные 5-миллилитровые пробирки, содержащие EDTA. Через 30 минут плазму отделяли и замораживали при -70°С. Образцы из места их приготовления отправляли на сухом льду в Центральную лабораторию (LabCorp, Raritan, NJ) через каждые 3 месяца, где образцы оставляли на хранение при -85°С и анализировали в течение 3 недель. Уровни NE измеряли путем ВЭЖХ-электрохимической детекции ВЭЖХ-методом Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories Hercules, CA). Контроль качества включал повторные измерения всех образцов с исходными значениями <200 пг/мл или >2000 пг/мл, из 2-ой пробирки, оставленной на хранение, и рутинные измерения (каждые 20 проб) известных количеств.
Методы статистического анализа
3.
Представлены средние и стандартные отклонения (SD) для непрерывных данных и соотношения для категорийных данных. Т-критерии или критерии суммы рангов Уилкоксона были использованы для непрерывных данных, а точные критерии хи-квадрат или точные критерии Фишера были использованы для категорийных данных. Для определения статистической значимости использовали альфа-уровень 0,5 (2-сторонний нескорректированный критерий).
Уровни норэпинефрина до начала испытаний или изменения уровней норэпинефрина через 3 месяца использовали для предсказания выживаемости и общего исхода, а именно смертности и госпитализации по поводу ХСН. Сначала анализировали абсолютные и логарифмические данные. Из-за несоответствия полученных уровней норэпинефрина данные, преобразованные в натуральные логарифмы (Ln), использовали в многомерных регрессионных моделях относительных рисков Кокса.
Для оценки категорийных изменений уровней норэпинефрина для 3 групп, проводимой в целях предсказаний событий летальных исходов или общих событий летальных исходов + госпитализации по поводу ХСН, применяли метод максимального правдоподобия (Kalbfleisch et al., 1980). Этот метод разбиения позволяет определить оптимальное расщепление значений уровней норэпинефрина, которое максимизирует вероятность полученной модели относительных рисков Кокса. Кроме того, для определения формы и уровня значимости взаимосвязи 3-месячных изменений уровней норэпинефрина с выживаемостью проводили анализ с использованием гибкого кубического сплайна (Green et al., 1994).
Результаты
В.
Группы, участвующие в исследовании
1.
Исходные демографические и описательные данные о индивидуумах, которые имели, по меньшей мере, базовые уровни норэпинефрина, не отличались от всех индивидуумов, участвующих в исследовании (BEST Trial Investigators, 2001).
Данные об уровнях норэпинефрина
2.
Исходные средние уровни норэпинефрина в плацебо-группе составляли 501±316 пг/мл (n=1061), а в группе, принимавшей буциндолол, они составляли 529±370 пг/мл (n=1065, p=0,061 по сравнению с плацебо). Анализ, проводимый с использованием т-критерия, показал, что через 3 месяца (p=0,0085) и 12 месяцев у плацебо-группы (p=0,0002) наблюдалось статистически значимое увеличение уровней норэпинефрина, тогда как у группы, принимавшей буциндолол, через 3 месяца наблюдалось статистически значимое снижение уровней норэпинефрина (p=0,0001), и такое снижение продолжалось (p=0,067) в течение 12 месяцев (фиг.8). Межгрупповые изменения в уровнях норэпинефрина были в высокой степени значимыми через 3 месяца (p<0,0001) и через 12 месяцев (p<0,0001). Снижение уровней норэпинефрина в группе, принимавшей буциндолол, по сравнению с плацебо-группой, через 3 и 12 месяцев составляло 19% и 13% соответственно.
Исходные уровни норэпинефрина как прогностические показатели смертности или общего исхода, а именно “смертности + госпитализации по поводу ХСН”
3.
На фиг.9 представлен график отношений рисков общих показателей смертности, определяемых по базовым величинам уровней норэпинефрина и выраженных в квартилях по отношению к первому квартилю, для которого отношение рисков (HR) было принято равным 1,0. Для всех участников испытаний и для каждой группы, проходившей лечение, увеличение риска летального исхода возрастало с возрастанием квартиля. Аналогичные результаты были получены для объединенных событий “летальный исход + госпитализация по поводу ХСН” (фиг.10).
В таблице 3 представлены одномерный и многомерный анализы исходных уровней норэпинефрина и других потенциальных модификаторов смертности, предварительно определенных в протоколе. В одномерном анализе логарифм (Ln) отношения рисков HR (95% доверительные интервалы (ДИ)) составляло 1,82 (1,58-2,09), p<0,001. В многомерном анализе среди других прогностических факторов Ln уровней норэпинефрина был самым мощным прогностическим показателем летального исхода.
Изменение уровней норэпинефрина как прогностический показатель смертности или общего исхода “смертности + госпитализации по поводу ХСН”
4.
Взаимосвязь изменения квартилей по уровням норэпинефрина через 3 месяца с последующим летальным исходом или летальным исходом + госпитализацией по поводу ХСН проиллюстрирована в таблице 4, где изменение HR (отношения рисков) вычисляли относительно 1-го квартиля. Анализ с использованием квартилей проводили для того, чтобы определить сохраняются ли изменения уровней/квартилей норэпинефрина у плацебо-групп и групп, принимавших буциндолол, при этом разделяющие точки были получены для всей популяции. Это приводило к получению 2 квартилей, соответствующих снижению уровней норэпинефрина (1-й и 2-й) и 2 квартилей, соответствующих увеличению уровней норэпинефрина (3-й и 4-й). Абсолютные изменения уровней норэпинефрина в пг/мл и процент изменения базовых величин представлены в таблице 4. Из-за симпатолитического эффекта буциндолола в 1-ом квартиле было больше пациентов, принимавших буциндолол, а в 4-ом квартиле было больше пациентов, принимавших плацебо.
Что касается взаимосвязи абсолютного изменения уровней норэпинефрина и смертности, то как видно из таблицы 4, у плацебо-группы наблюдался повышенный риск летального исхода в 4/1-квартиле, где HR составляло 1,38 (p=0,099), и не наблюдалось какого-либо различия по смертности во 2-м или 3-м квартилях по отношению к 1-му квартилю. Что касается общих событий “летальный исход + госпитализация по поводу ХСН”, то в плацебо-группе 4-й квартиль по отношению к 1-му квартилю имел значимое HR, которое составляло 1,46 (p=0,011). В противоположность этому, у группы, принимавшей буциндолол, не наблюдалось тенденции к увеличению риска в 4-м:1-м квартилях для любого клинического исхода, тогда как в 3-м квартиле по отношению к 1-му квартилю наблюдалось снижение риска летального исхода (HR=0,66, p=0,046), а также наблюдалась тенденция к снижению риска (p=0,22) летального исхода + госпитализации по поводу ХСН в 3-м:1-м квартилях.
Что касается % изменения уровней норэпинефрина, то увеличение или тенденция к увеличению риска как летального исхода, так и летального исхода + госпитализации по поводу ХСН наблюдалось в 3-м:1-м квартилях и 4-м:1-м квартилях для плацебо-группы. В противоположность этому у группы, принимавшей буциндолол, не наблюдалось такой тенденции в увеличении HR в 3-м или 4-ом квартиле по отношению к 1-му квартилю по любому клиническому событию и, аналогично изменениям абсолютного уровня эпинефрина, наблюдалась тенденция к снижению HR (0,77) в 3-м:1-м квартилях (p=0,21).
В таблице 4 также приводятся отношения рисков (HR) в группе, принимавшей буциндолол, которые выражены как отношения буциндолол:плацебо для каждого квартиля уровней норэпинефрина по абсолютным изменениям и по % изменений. В отношении летального исхода HR было значимо меньше единицы (снижение смертности для групп буциндолола по сравнению с плацебо-группой) в 3-х квартилях по изменению абсолютного уровня (HR=0,63) и % изменения (HR=0,56) уровней норэпинефрина. В отношении летального исхода + госпитализации по поводу ХСН наблюдалась аналогичная картина, за исключением того, что HR в 4-х квартилях также заметно снижалось. В противоположность показателям по смертности показатели по летальному исходу + госпитализации по поводу ХСН во 2-м квартиле давали почти значимое (p=0,067) увеличение HR для буциндолол:плацебо в отношении абсолютного изменения (p=0,021) и значимое увеличение (HR=1,39) в отношении % изменения.
Для дополнительного исследования по связанному с лечением дифференциальному риску летального исхода, ассоциированному с изменением уровней норэпинефрина, был применен вероятностный метод (Bristow, 1984). Как показано на фиг.11, отдельно проведенный вероятностный анализ показал, что 11 индивидуумов в каждой подвергавшейся лечению группе и 153 индивидуумов в каждой принимавшей буциндолол группе, которые имели соответствующие более высокие риски (HR 3,31, p=0,004; HR=1,69, p=0,002) последующего летального исхода, обнаруживали снижение уровней норэпинефрина через 3 месяца. Такое снижение уровней норэпинефрина в этих группах риска составляло ≥783 пг/мл в плацебо-группе и ≥244,5 пг/мл в группе, принимавшей буциндолол. На фиг.11 также показано, что подгруппы с увеличением уровней норэпинефрина через 3 месяца были идентифицированы как группы повышенного риска летального исхода, в обеих экспериментальных группах.
Вследствие того, что указанный вероятностный метод дает максимальную оптимизацию разделяющих точек изменения уровней норэпинефрина, которые являются прогностическими показателями повышенного риска летального исхода, то авторами настоящего изобретения был проведен менее дискриминационный подбор с построением кривой гибкого кубического сплайна (Fowler and Bristow, 1985). Наилучшее соответствие, достигнутое этим методом, давала U-образная нелинейная кривая с 5 узлами и 3 степенями свободы, при этом соответствующие величины хи-квадрат для группы, принимавшей буциндолол, плацебо-группы и всех участников испытаний составляли 13,2 (p=0,0042), 11,1 (p=0,011) и 32,5 (p<0,0001).
Характеристики индивидуумов с повышенными или пониженными уровнями норэпинефрина, ассоциированными с повышенным риском летального исхода
5.
Характеристики подгрупп пациентов с высоким риском летального исхода, идентифицированных по спектрам изменения уровней норэпинефрина с помощью вероятностного анализа, по сравнению с соответствующими группами с промежуточными изменениями, служащими в качестве контроля, представлены в таблице 5. 153 индивидуума в подгруппе, принимавшей буциндолол, идентифицированной как группа с повышенным риском летального исхода со снижением уровней норэпинафрина, имела высокие базовые уровни норэпинефрина и ее среднее снижение уровней норэпинефрина через 3 месяца составляло 529 пг/мл. У этих индивидуумов также наблюдались более низкие LVEF и RVEF и более высокая частота сердечных сокращений по сравнению с контрольной группой с промежуточными изменениями, которая имела небольшие изменения или вообще не обнаруживала изменений уровня норэпинефрина (~44 пг/мл). Среди указанных 153 индивидуумов, принимавших буциндолол и имеющих заметное снижение уровней норэпинефриана, также был более высокий процент индивидуумов с заболеванием IV класса и большее число (p=0,088) индивидуумов негроидной расы, чем индивидуумов не негроидной расы по сравнению с группой, идентифицированной как группа с промежуточными изменениями. Из 52 случаев летального исхода, зарегистрированных в этой подгруппе из 153 пациентов, 79% были классифицированы как летальные исходы от сердечно-сосудистого заболевания, а причинами 63%, 27% и 2% случаев летального исхода были внезапная смерть от коронарной недостаточности, смерть от застойной сердечной недостаточности и смерть от инфаркта миокарда соответственно. В противоположность этому, подгруппа, принимавшая буциндолол и подверженная повышенному риску летального исхода, ассоциированного с увеличением уровней норэпинефрина (n=137), имела более низкие базовые RVEF, а также базовые LVEF и значительно меньшее увеличение LVEF через 3 месяца по сравнению с группой с промежуточными изменениями. В этой подгруппе распределение по % индивидуумов с заболеванием класса IV и распределение индивидуумов не негроидной/негроидной расы не отличалось от указанного распределения в промежуточной группе. В этой подгруппе 35 из 43 случаев летального исхода были зарегистрированы как смерть от сердечно-сосудистых заболеваний и меньшая часть из этих случаев была зарегистрирована как внезапная смерть (34%), смерть от застойной сердечной недостаточности (51%) и смерть от инфаркта миокарда (6%).
Обсуждение
С.
Данные базовых уровней норэпинефрина, полученные в испытании BEST и из расширенных отчетов предшествующих испытаний, подтвердили прямую взаимосвязь между уровнем адренергической активации и неблагоприятными клиническими исходами. Данные о базовых уровнях норэпинефрина свидетельствуют о том, что этот параметр является мощным прогностическим показателем клинических исходов, как это было проиллюстрировано для группы индивидуумов с ХСН. В испытаниях BEST неожиданно было обнаружено, что повышенный риск, сообщаемый более высокими базовыми уровнями норэпинефрина, в основном, не уменьшался при проведении антиадренергической терапии, поскольку отношения рисков летального исхода или летального исхода + госпитализации по поводу ХСН пропорционально увеличиваются с увеличением квартиля уровней норэпинефрина в группах, принимавших буциндолол и плацебо. Одним из объяснений такого отсутствия протективного эффекта буциндолола в квартилях более высоких базовых уровней норэпинефрина является симпатолитический эффект, наблюдаемый у индивидуумов с наиболее запущенной ХСН и с наибольшей степенью нарушения функции миокарда.
С другой стороны, буциндолол сообщает клинически протективный эффект в квартилях пациентов, у которых наблюдалось увеличение адренергической активности через 3 месяца. В квартилях снижения уровня норэпинефрина не наблюдалось какого-либо снижения неблагоприятных конечных клинических исходов. Фактически, что касается летального исхода+госпитализации по поводу ХСН, то снижение 2-го квартиля уровней норэпинефрина указывало на повышенный риск у пациентов, принимавших буциндолол. Кроме того, если квартили изменений уровней норэпинефрина через 3 месяца были сравнимы с 1-м квартилем (который имел наибольшую степень снижения), то отношение квартилей 3:1 указывает на повышение смертности в 1-м квартиле для группы, принимавшей буциндолол, но не для группы, принимавшей плацебо. Такие предположения о негативном эффекте буциндолола у пациентов, у которых наблюдалось снижение уровней норэпинефрина через 3 месяца, послужили стимулом для проведения дополнительных анализов симпатолитических эффектов этого уникального β-блокирующего средства.
По сравнению с плацебо буциндолол способствовал снижению уровней эпинефрина за 3 месяца на 19%. Такое снижение уровня эпинефрина было сравнимо с относительным снижением уровня норэпинефрина за 3 месяца, вызываемым центральным симпатолитическим средством моксонидином, которое составляло 24%, как было показало в испытании MOXCON (Cohn et al., 2003). Как и в испытании MOXCON, симпатолитические эффекты буциндолола, очевидно, ассоциируются с повышенным риском негативных клинических исходов, в частности внезапной смерти. Помимо данных о снижении квартилей норэпинефрина, обсуждаемых выше, вероятностный анализ указывал на заметное снижение уровней норэпринефрина (на >224 пг/мл) у 18% индивидуумов в группе, принимавшей буциндолол, которая имела в 1,65 раз более высокий риск летального исхода, тогда как в плацебо-группе, которая была идентифицирована как группа с повышенным риском летального исхода и с заметным снижением уровней норэпинефрина, такое снижение наблюдалось лишь у 1% пациентов. Этот анализ также выявил повышенный риск летального исхода у пациентов с повышенным уровнем норэпинефрина и у аналогичного числа пациентов, принимавших буциндолол и плацебо. Повышенный риск летального исхода по обоим конечным событиям спектра изменения уровней норэпинефрина через 3 месяца был подтвержден путем построения кривой гибкого кубического сплайна, в результате чего получали статистически значимую U-образную кривую для групп, принимавших буциндолол и плацебо.
Подгруппа принимавших буциндолол индивидуумов с пониженным уровнем норэпинефрина, идентифицированная с помощью вероятностного анализа как группа с повышенным риском летального исхода, состояла из пациентов с более запущенной сердечной недостаточностью (класса IV, но не класса III), с более высокими базовыми уровнями норэпинефрина, с более пониженной функцией ЛЖ и ПЖ и с более высоким соотношением пациентов негроидной расы по сравнению с пациентами не негроидной расы. Таким образом, симпатолитические эффекты буциндолола, вероятно, приводят к неблагоприятному исходу в подгруппе пациентов с серьезными нарушениями функции миокарда, и этот исход, вероятно, зависит от адренергической активности, необходимой для поддержания функции сердца, но такой механизм не был подтвержден данными, полученными авторами настоящего изобретения, но возможно существуют и другие объяснения таких эффектов.
Лишь предварительно опубликованные данные клинических испытаний, посвященных взаимосвязи между изменениями в системной адренергической активности и исходами заболеваний, были получены из испытания CONSENSUS (Swedberg et al., 1990), где у 239 индивидуумов нейрогормональные изменения в течение 6 недель не соответствовали исходам заболевания, и из Val-HeFT (Anand et al., 2003), где у 4301 пациентов абсолютные изменения (но не % изменений) уровней норэпинефрина через 4 месяца позволяли прогнозировать различия в показателях летальных исходов у групп, принимавших плацебо и валсартан. Однако в отличие от Val-HeFT в настоящем исследовании наблюдалась прямая взаимосвязь между возрастающими абсолютными уровнями норэпинефрина и возрастающим риском летального исхода или летального исхода + госпитализации по поводу ХСН. Главным новым результатом настоящего исследования явилось то, что снижение и увеличение адренергической активности может быть ассоциировано с негативными клиническими исходами у пациентов с хронической сердечной недостаточностью. Эффект буциндолола, приводящий к снижению указанных рисков, показал, что в отличие от рисков, сообщаемых базовыми уровнями норэпинефрина, измеренными до проведения терапии, негативные эффекты повышения уровня норэпинефрина могут быть предотвращены путем одновременного проведения антиадренергической терапии.
В целом, всестороннее исследование системной адренергической активности, определенной по уровням норэпинефрина в периферических венах, измеренным в испытании BEST, показало, что при прогрессирующей ХСН (1) базовый норэпинефрин является прогностическим фактором неблагоприятных клинических исходов, но не терапевтического ответа, (2) как повышение, так и снижение уровня норэпинефрина через 3 месяца является прогностическим фактором неблагоприятного исхода и (3) буциндолол уменьшает риск повышения уровней норэпинефрина, но из-за его симпатолитических свойств у пациентов некоторых групп клинический риск от снижения уровня норэпинефрина повышается.
<u>Таблица 3</u>
Многомерный анализ базового норэпинефрина NE
Ковариация
Отношение рисков(95% ДИ)
Величина Р
Ln NE, вычисленный в одномерном анализе
1,82(1,58-2,09)
<0,001
Многомерный анализ
Ln NE
1,61(1,40-1,85)
<0,001
ИБС (ИБС vs. не-ИБС)
1,68(1,42-2,01)
<0,001
LVEF (20% vs.>20%)
1,46(0,25-1,71)
<0,001
Раса (негры vs. не негры)
1,26(1,04-1,50)
0,016
Пол (мужской vs. женский)
1,04(0,84-1,28)
0,724
NYHA (IV, III)
1,61(1,28-2,01)
<0,001
<u>Таблица 4</u>
Влияние изменения уровней норэпинефрина (NE) за 3 месяца на последующий летальный исход (М) или летальный исход+госпитализацию по поводу ХСН (М+Н) в группах, принимавших плацебо и буциндолол, и эффективность лечения буциндололом, по сравнению с плацебо-группой, определяемая по квартилю изменений уровней норэпинефрина, по отношению рисков и 95% доверительным интервалам
Изменение уровня NE
Отношение рисков летального исхода по квартилю изменения уровня NE по отношению к 1-му квартилю
Общая летальность (%) и отношение рисков для групп “буциндолол/плацебо” по квартилю изменений уровней NE
Абсолютное, пг/мл
2-й/1-й
3-й/1-й
4-й/1-й
1-й
2-й
3-й
4-й
Плацебо (Р)М
0,98(0,65-1,48)
1,01(0,68-1,51)
1,38(0,94-2,03)
24,5
27,2
27,5
37,5
М+Н
1,21(0,89-1,64)
1,11(0,82-1,50)
1,46(1,09-1,96)
Буциндолол (В)М
0,99(0,70-1,41)
0,66(0,43-0,99)
1,15(0,80-1,65)
26,1
25,7
17,7*
28,6
М+Н
1,00(0,75-1,32)
0,83(0,61-1,12)
1,10(0,82-1,47)
В/РМ
-
-
-
0,96(0,65-1,43)
0,98(0,68-1,43)
0,63(0,41-0,96)
0,80(0,57-1,14)
М+Н
1,19(0,88-1,61)
1,30(0,98-1,72)
0,58(0,43-0,78)
0,74(0,56-0,98)
% изменения
Плацебо (Р)М
1,21(0,80-1,84)
1,42(0,96-2,10)
1,37(0,92-2,04)
23,1
27,3
32,1
29,2
М+Н
1,27(0,93-1,72)
1,33(0,99-1,78)
1,35(1,00-1,81)
Буциндолол (В)М
1,14(0,80-1,62)
0,77(0,51-1,16)
1,19(0,83-1,71)
25,2
26,0
18,8
29,1
М+Н
1,18(0,89-1,56)
0,91(0,67-1,24)
1,18(0,88-1,58)
В/РМ
-
-
-
1,03(0,69-1,54)
0,98(0,68-1,42)
0,56(0,38-0,84)
0,90(0,63-1,29)
М+Н
1,14(0,84-1,54)
1,39(1,05-1,85)
0,65(0,48-0,88)
0,66(0,50-0,88)
Квартили: абсолютное изменение NE в пг/мл, 1-й<-144 (плацебо, n=155, буциндолол, n=268); 2-й от -144 до<-9 (плацебо, n=206, буциндолол, n=214), 3-й от -9 до 111 (плацебо, n=236, буциндолол, n=186), 4-й>111 (плацебо, n=248, буциндолол, n=173); % изменения уровней NE, 1-й<-30,2 (плацебо, n=160, буциндолол n=262), 2-й от -30,2 до<-2,5 (плацебо, n=198, буциндолол, n=223), 3-й от -2,5 до 31,1 (плацебо, n=240, буциндолол, n=181), 4-й>31,1 (плацебо, n=247, буциндолол, n=175). *, p<0,05 по отношению к 1-му квартилю, точный критерий Фишера.
<u>Таблица 5</u>
Определенные вероятностым методом демографические показатели для подгрупп с повышенным риском, ассоциированным с изменениями (Δ) уровней норэпинефрина (NE, в пг/мл), т.е. со снижением (Redxn) или увеличением (Incr) уровней NE по сравнению с подгруппами с промежуточными изменениями (Inter) уровней NE. NE представлен в пг/мл; данные приводятся как среднее (ср. кв.от.(SD)); * p<0,05 по отношению к Inter; # p<0,10 по отношению к Inter
Плацебо
Буциндолол
Параметр
Redxn(∆NE≤-783)
Inter(∆NE>-783, ≤362)
Incr(∆NE>362)
Redxn(∆NE≤-244,5)
Inter(∆NE -244,5 ≤+145)
Incr(∆NE>145)
Число индивидуумов
n=11
n=762
n=72
n=153
n=551
n=137
Базовый уровень NE, пг/мл
1500*±405
464±245
514±328
932*±544
422±189
409±199
Изменение уровней NE через 3 мес., пг/мл
-1024*±220
-16±188
642*±335
-529*±458
-44±103
326*±244
Изменение уровней NE через 12 мес., пг/мл
-667*±528
45±268
297*±560
-349*±347
17,5±216
161*±246
Число летальных исходов (%)
6(55%)*
200(26%)
34(47%)*
52(34%)*
114(21%)
43(31%)*
Возраст (годы)
63,6±9,8
60,3±11,9
64,7*±10,8
60,1±12,2
60,7±12,1
62,0±12,7
Пол (%М/Ж)
64/36
80/20
82/18
79/21
81/19
82/18
Раса (% индивидуумов не негроидной/негроидной расы)
73/27
80/20
82/18
74/26<sup>#</sup>
80/20
77/23
Класс по NYHA (% III/IV)
82/18
92/8
83/17*
86/14*
93/7
93/7
Продолжительность ХСН, месяцы, медиана
73,0<sup>#</sup>
39,0
36,0
36,0
36,0
31,0
Этиология (%, неишемическая/ишемическая)
45/55
42/58
29/71*
46/54
42/58
31/69*
Базальная частота сердечных сокращений (HR, ударов в минуту (ВРМ))
79,2±12,4
81,6±12,8
78,3*±12,3
85,5*±13,8
81,0±13,0
80,6±13,7
Изменение HR через 3 мес.
-5,5±17,0
-2,3±12,5
1,0*±13,3
-13,6*±14,8
-9,7±12,4
-7,1*±12,8
Изменение HR через 12 мес.
-10,7<sup>#</sup>±13,2
-2,6±13,5
-1,8±13,5
-12,6*±14,4
-7,9±13,5
-8,1±14,6
Систолическое кровяное давление (КД)(СКД, мм рт.ст.)
111±20
118±18
116±19
116±19
118±18
120±18,2
Изменение СКД через 3 мес.
4,7±13,8
0,015,4
-0,1±18,1
-0,7±18,2
-0,5±15,7
-4,7*±16,4
Изменение СКД через 12 мес.
5,6±19,5
0,7±18,1
1,9±21,0
2,7±20,1
0,7±18,0
-0,9±16,8
Фракция выброса крови левым желудочком (LVEF), Фракция выброса (EF, единицы) (EFU)(%)
22,8±6,6
23,1±7,2
23,3±7,6
20,1*±8,0
24,1±7,0
23,3±6,7
Изменения LVEF через 3 мес., EFU
0,2±6,4
2,3±6,6
0,6*±7,2
7,0<sup>#</sup>±8,4
5,7±7,9
4,2*±7,0
Изменения LVEF через 12 мес., EFU
5,7±11,9
3,3±8,7
1,4±7,6
8,8±9,2
7,3±10,4
7,1±8,8
ПРИМЕР 5
2C
ЧАСТОТА ВСТРЕЧАЕМОСТИ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ВАРИАНТОВ α-АДРЕНЕРГИЧЕСКОГО РЕЦЕПТОРА В ИСПЫТАНИИ BEST
2c
2c
2c
В нижеследующей таблице 6 проиллюстрирована частота встречаемости (%) генетических вариантов α-адренергических рецепторов (WT/WT = гомозиготы дикого типа, WT/DEL = гетерозиготы, DEL/DEL = гомозиготы по αDel322-325) в BEST, по сравнению с исходными данными, сообщенными Liggett и сотрудниками (Small et al., 2002). Образцы, полученные в испытании BEST, оценивали с использованием праймеров для ПЦР-амплификации области последовательности αAR, которая охватывает делецию, а затем проводили реакцию амплификации на геле, которая позволяла выявлять различия длин последовательностей из 12 пар оснований в продуктах с делецией или без делеции.
<u>Таблица 6</u>
Исследования
Индивидуумы не негроидной расы
Индивидуумы негроидной расы
Все индивидуумы
WT/WT
WT/DEL
DEL/DEL
WT/WT
WT/DEL
DEL/DEL
WT/WT
WT/DEL
DEL/DEL
BEST
91,6
8,2
0,2
33,8
47,8
18,4
80,0
16,1
3,9
Small et al.,ХСН
86,4
6,2
7,4
29,5
17,9
52,6
58,5
11,9
29,6
Small, контроль
94,3
3,8
1,9
34,5
48,8
16,6
67,7
23,8
8,5
2c
2c
Как видно из вышеприведенной таблицы 6, в испытании BEST частота аллеля αDel322-325 у индивидуумов негроидной расы (0,423) значительно превышает частоту аллеля у индивидуумов не негроидной расы (0,043, p<0,0001). Кроме того, в испытании BEST у индивидуумов негроидной расы частота аллеля αDel322-325 не превышает частоту аллеля у пациентов негроидной расы с ХСН (Small et al.) (0,615, p<0,0001), но аналогична частоте аллелей у индивидуумов негроидной расы, взятых в качестве контроля (Small et al.) (0,411, p=0,85). Такие различия, вероятно, обусловлены относительно небольшим размером образцов, используемых в работе Small et al. (n=78 пациентов негроидной расы с ХСН, 84 индивидуума негроидной расы в качестве контроля), и в испытании BEST (n=207 пациентов негроидной расы в субисследовании ДНК).
2c
О повышении у людей адренергической активности, ассоциированной с полиморфизмом αDel322-325, имеются лишь предположения и никаких специальных исследований для их подтверждения не проводилось.
2c
2c
Одним из возможных объяснений небольшого различия в базовых уровнях норэпинефрина у αDel322-325-гомозиготов и у контрольных индивидуумов с α дикого типа, которое дается непосредственно в данном описании, является то, что системный венозный норэпинефрин не является хорошим суррогатным индикатором сердечной адренергической активности, и при хронической сердечной недостаточности изменения сердечной адренергической активности могут возникать и при отсутствии изменений уровня системного норэпинефрина.
2c
Данные базовых уровней и изменения уровней норэпинефрина через 3 месяца под действием рецептора α-типа представлены в таблице 7.
<u>Таблица 7</u>
Уровни норэпинефрина (NE), среднее (ср.кв.от. и изменения уровней (n) в испытании BEST под действием α<sub>2c</sub>-рецептора; * p<0,05 по сравнению с изменениями в плацебо-группе
α<sub>2c</sub>-рецептор
Базовый NE, пг/мл
Изменения уровня NE (пг/мл) через 3 месяца
Плацебо
Буциндолол
Все группы
α<sub>2c</sub> дикого типа, гомозиготы или гетерозиготы
479±264(710)
12±274(305)
-50*±227(304)
-19±254(609)
α<sub>2c</sub>Del322-325-гомозиготы
521±350(161)
51±323(60)
-153*±468(67)
-57±417(127)
2c
2c
2c
2c
Как видно из таблицы 7, базовые уровни или изменения уровней системного венозного NE в испытании BEST со всей очевидностью подтверждают вышеупомянутые гипотезы относительно влияния варианта αDel322-325-рецептора на базальную адренергическую активность; при этом через 3 месяца наблюдалась лишь незначительная тенденция к увеличению базовых уровней норэпинефрина у αDel322-325-гомозиготов. С другой стороны, как очевидно из таблицы 7, снижение уровней норэпинефрина при лечении буциндололом гораздо выше у αDel322-325-гомозиготов, чем у гомозиготов по α дикого типа или гетерозиготов.
ПРИМЕР 6
ДОПОЛНЕНИЕ К ПРИМЕРАМ 3 и 4
Материалы и методы
А.
Исследования человеческого желудочка ex vivo
1.
2
2
50
-6
2
Сердца с отсутствием сердечной недостаточности были взяты от доноров с локально потенциальными органами, которым не были трансплантированы сердца из-за физической несовместимости или несовместимости по группам АВО. Сердца с сердечной недостаточностью были взяты у пациентов, которые страдали сердечной недостаточностью конечной стадии, вызванной ишемическими или не ишемическими застойными кардиомиопатиями, и которые были подвергнуты операции по трансплантации сердца. Демографические показатели этих сердец приводятся в разделе “Результаты”. Сократительную реакцию выделенных и стимулированных электрическим полем человеческих трабекул оценивали, как было описано ранее {1755; a-c}. Трабекулы одного и того же размера (1-2×6-8 мм) помещали в 80-миллилитровые камеры-бани для мышц в растворе Тироде при рН 7,45, барботируемые 95% O - 5% CO при 36°С. После уравновешивания на каждую отдельную трабекулу подавали напряжение, составляющее 75% от Lmax. Затем проводили электростимуляцию путем подачи 5 мс-импульсов, которые на 10% превышали пороговые импульсы, и после полного уравновешивания строили интегральные кривые доза-ответ для изопротеренола, буциндолола или ксамотерола с использованием указанных концентраций и с введением возрастающих доз каждые 5 минут. В экспериментах, в которых для усиления передачи сигнала использовали форсколин {e,f}, в бани с тканями в течение 15-20 минут добавляли 10M указанного активатора аденилил-циклазы, после чего строили кривые доза-ответ и образцы оставляли до достижения стабильного ответа на подачу напряжения. Систолическое напряжение при каждой дозе вычисляли как стимулированное напряжение в мН/мм минус базальное напряжение. Максимальное напряжение, концентрация изопротеренола, которая дает 50% от максимально продуцируемого напряжения (EC), и наклон кривой вычисляли с помощью нелинейного ковариционного анализа повторных измерений. Статистически значимый отрицательный или положительный наклон кривой по группированным данным был использован для идентификации негативных или позитивных инотропных эффектов соответственно, а различия в наклонах кривой у генотипированных групп были детектированы с помощью теста на их взаимосвязь. Статистические методы применялись, как описано в примерах 3 и 4.
Трансфицированные клетки, связывание с радиоактивным лигандом, анализы на cAMP
2.
1
1
1
125
125
3
Фибробласты китайского хомячка стабильно трансфицировали с использованием описанных ранее конструкций для отдельной экспрессии человеческих β-Arg389- или β-Gly389-рецепторов. Экспрессию βAR и аффинность к буциндололу определяли в исследованиях по связыванию с радиоактивным лигандом, а именно с I-цианопиндололом (I-CYP), с использованием 1 мкМ пропранолола для определения неспецифического связывания, как описано ранее. Исследования по аккумуляции cAMP в целых клетках проводили с использованием [Н]-аденина в двух линиях с эквивалентными уровнями экспрессии двух рецепторов, как указывалось выше. Связанные клетки обрабатывали носителем (базальным), 10 мкМ норэпинефрина или 10 мМ норэпинефрина с указанными концентрациями буциндолола в течение 15 минут при 37°С.
Результаты
В.
Корреляция сократительных ответов человеческого желудочка ex vivo с β
AR-генотипом
1
1.
1
1
1
1
1
2
2
2
В этих исследованиях трабекулы правого желудочка, выделенные из сердца человека, использовали для определения влияния генотипа на сократительную способность релевантной ткани в условиях эндогенной экспрессии в отсутствие и при наличии вентрикулярной недостаточности. Фракция выброса крови предварительно эксплантированным левым желудочком у группы индивидуумов с отсутствием недостаточности составляла 0,61+0,13 для Arg и 0,53+0,15 для Gly, а у группы индивидуумов с недостаточностью она составляла 0,21+0,11 для Arg и 0,17+0,07 для Gly. Пять из 11 Arg-пациентов с сердечной недостаточностью и шесть из 11 Gly-пациентов с сердечной недостаточностью имели ишемическую застойную кардиомиопатию, а все остальные пациенты с сердечной недостаточностью имели неишемическую застойную кардиомиопатию. Возраст пациентов с отсутствием сердечной недостаточности составлял для Arg 39±16 лет, а для Gly 43±20 лет (p=0,64). Возраст пациентов с сердечной недостаточностью составлял для Arg 48±15 лет, для Gly 54±8 лет (p=0,26). Распределение по полу Arg-пациентов с отсутствием сердечной недостаточности составляло 3 мужчин и 8 женщин, а Gly-пациентов 5 мужчин и 6 женщин. Распределение по полу Arg-пациентов с сердечной недостаточностью составляло 8 мужчин и 3 женщин, а для Gly-пациентов 2 мужчин и 9 женщин. На фиг.12 проиллюстрированы ответы в виде систолического давления на введение изопротеренола в трабекулы правых желудочков, удаленных из сердец пациентов с отсутствием сердечной недостаточности и сердечной недостаточностью, где указанные ответы были стратифицированы по βAR-389-генотипу. В сердце пациентов с отсутствием сердечной недостаточности ответы для различных генотипов отличались, при этом максимальное давление было выше у β-Arg389-гомозиготов (13±2,5), чем у β-Gly389-носителей (5,2±1,4 мН/мм)(P=0,01). Важно отметить, что в трабекуле пациента с сердечной недостаточностью наблюдается такой же фенотип, даже с еще большим относительным аллель-специфическим различием: максимальное напряжение, стимулированное изопротеренолом, составляло 9,4±1,9 мН/мм для βAR-Arg389 и 2,4±0,60 мН/мм для β-Gly389 (P=0,008).
1
Вторую группу из 23 пациентов с сердечной недостаточностью брали для оценки инотропных эффектов буциндолола, βAR-селективного неполного агониста ксамотерола {d} и изопротеренола в выделенной трабекуле правого желудочка. LVEF у индивидуумов этой группы составляли 0,18±0,09, причем из них 10 индивидуумов имели не ишемическую застойную кардиомиопатию, а 13 имели ишемическую застойную кардиомиопатию. Средний возраст индивидуумов составлял 52±11 лет, причем в этой группе было 20 мужчин и 3 женщины. Тринадцать из 23 сердец были гомозиготными по Arg389, а 10 были Gly-носителями (все гетерозиготы). Какого-либо различия между Arg-гомозиготами и Gly-носителями с точки зрения LVEF, возраста, этиологии кардиомиопатии и пола не наблюдалось. В экспериментах с использованием буциндолола и ксамотерола использовали 8 из 23 сердец, а для остальных 15 сердец строили кривые доза-ответ с использованием либо только ксамотерола, либо только буциндолола. Для всех 23 сердец строили интегральные кривые “доза изопротеренола - ответ”.
-8
-7
Результаты, полученные по кривым “доза изопротеренола - ответ” для двух генотипических групп, были абсолютно аналогичны результам, представленным на фиг.12. В данных, которые не приводятся, имеются явные различия в зависимости доза-ответ в пользу Arg/Arg-генотипа, при этом наблюдаются в высокой степени значимые (р<0,001) различия в наклоне кривой, выявленные в тесте на взаимосвязь, и различия в максимуме (Arg, xxxx; Gly, yyyy, p<0,05). Как можно видеть на фиг.3, буциндолол, взятый отдельно, продуцировал негативный инотропный эффект у обеих генотипических групп (отрицательный наклон у обеих групп, обе величины р<0,01, критерий незначимости для взаимосвязи между наклонами кривых). При предварительной обработке форсколином для Arg-сердец сохранялся отрицательный наклон кривой (P<0,05), но наклон кривой доза-ответ для Gly не был отличным от 0 (p=0,25). В отсутствие форсколина (фиг.13C) ксамотерол продуцировал позитивный инотропный эффект в Arg-сердцах, но негативный инотропный эффект в Gly-трабекулах (в обеих кривых величины p<0,05). Ксамотерол при предварительной обработке форсколином продуцировал позитивный инотропный эффект у обеих генотипических групп (положительные наклоны кривой у обеих генотипов, p≤0,05), при этом Arg/Arg-сердца обнаруживали более высокий инотропный эффект, который достигал значимой величины по сравнению с базальным эффектом при введении ксамотерола в дозах 3·10M и 10M.
Функциональный антагонизм
-стимулированного cAMP в трансфицированных клетках
2. NE
1
1
50
1
i
1
i
1
125
В этих исследованиях использовали клетки, экспрессирующие эквивалентные уровни (фмоль/мг, n=4) Arg389 (123±19) и Gly389 (137±16) человеческих βAR. Базальные уровни cAMP составляли 72±8,5 и 59±9,1 фмоль/мг. Предварительные эксперименты по аккумуляции cAMP в присутствии буциндолола в концентрации до 10 мкМ не выявили какой-либо присущей ему симпатомиметической активности (ISA) в любом рецепторе. Для оценки функционального антагонизма клетки обрабатывали 10 мкМ агониста норэпинефрина в отсутствие или в присутствии различных концентраций буциндолола и определяли уровни cAMP. Как показано на фиг.13, Arg389 обнаруживал более высокую стимуляцию cAMP в ответ на введение агониста в отсутствие буциндолола, по сравнению с Gly389, который представляет исходные фенотипы двух рецепторов, как было указано ранее {998}. Несмотря на значительно более высокую степень NE-опосредуемой стимуляции Arg389-рецептора, буциндолол эффективно подавлял такой ответ. Различие в абсолютном снижении уровня продуцирования cAMP под действием буциндолола было выше для клеток, экспрессирующих β-Arg389, при этом буциндолол вызывал максимальное снижение уровня cAMP в Arg389-клетках, который составлял 435±80 фмоль/мл, по сравнению с уровнем cAMP в Gly389-клетках, который составлял 115±23 фмоль/мл (P=0,008, N=4). При этом для данных ответов какого-либо различия в эффективности буциндолола не наблюдалось (EC=46±4,5 и 35±11 нМ соответственно, P=0,94, N=4). Кроме того, в исследованиях по конкурентному связыванию с I-CYP аффинности к буциндололу у β-Arg389 (pK=9,6±0,04) и β-Gly389-рецепторов (pK=9,6±0,11, n=3) не отличались. Эти данные свидетельствуют о том, что буциндолол обладает способностью ингибировать повышенный ответ β-Arg389.
Механизм терапевтического преимущества Arg389-генотипа
3.
1
1
Повышенная адренергическая активность, обычно идентифицированная по повышенным системным уровням венозного норэпинефрина, поддерживает нарушенную функцию миокарда у пациентов с сердечной недостаточностью, но способствует прогрессированию сердечной недостаточности {h}. Эта сложная взаимосвязь между адренергической активностью и исходами заболевания наблюдалась в испытании BEST, где повышение базового уровня норэпинефрина независимо ассоциировалось с неблагоприятными исходами, а заметное снижение адренергической активности ассоциировалось с повышением смертности {i}. В отличие от других β-блокаторов, которые были использованы для лечения сердечной недостаточности, буциндолол обладал сильными симпатолитическими свойствами, а в испытании BEST у 18% пациентов, принимавших буциндолол, наблюдалось ускоренное снижение уровня норэпинефрина через три месяца, ассоциированное с 1,7-кратным увеличением риска последующего летального исхода {i}, что напоминало повышенную смертность пациентов в испытаниях MOXCON, в которых проводили лечение чистым симпатолитическим средством моксонидином {j}. Хотя повышенный риск летального исхода в результате усиления симпатолиза еще полностью не изучен, однако вероятно, что его причина заключается в потере адренергически опосредуемой сократимости, поддерживающей сердце с недостаточной функцией. Поэтому пациенты, которые являются гомозиготными по Arg, должны лучше переносить потерю способности к передаче норэпинефринового сигнала, чем Gly-носители, поскольку, как показано на фиг.12 и 13, у Arg-гомозиготных индивидуумов, даже низкие уровни агониста катехоламина способствуют усилению продуцирования такого сигнала. Другой механизм, благодаря которому у Arg-гомозиготных индивидуумов может вырабатываться терапевтическая предпочтительность к лечению буциндололом, должен в значительной степени подавлять возникновение побочных сигналов βAR, как показано на фиг.3. Для того чтобы определить, какой из этих механизмов может быть ответственным за более благоприятный терапевтический эффект буциндолола у Arg-гомозиготов по сравнению с Gly-носителями, авторы настоящего изобретения провели сравнение летальных исходов по базальному норэпинефрину и по изменению уровня норэпинефрина через 3 месяца (таблица 8). Как можно видеть из таблицы 8, отношения рисков летального исхода у Arg-гомозиготов и у Gly-носителей уменьшается с увеличением базального норэпинефрина, что дает основание предположить о возможности возрастания преимущества лечения буциндололом у Arg-гомозиготных индивидуумов с увеличением адренергической активности. Что касается анализа на изменение уровня норэпинефрина, то авторами настоящего изобретения были проведены сравнения смертности среди Arg-гомозиготных индивидуумов со смертностью среди Gly-носителей в группах, предварительно идентифицированных как группа с повышенным риском летальных исходов, ассоциированных с заметным снижением уровня норэпинефрина (на>244 пг/мл после трехмесячной терапии), контрольная группа с небольшим уровнем норэпинефрина или с отсутствием изменений уровня норэпинефрина (от -244 до 145 г/мл) и с отсутствием повышенного риска летальных исходов и группа с повышенным риском летальных исходов из-за повышения уровня норэпинефрина (на >145 пг/мл). Как можно видеть из таблицы 8, какого-либо преимущества у Arg-гомозиготных индивидуумов в подгруппе с повышенным риском летальных исходов, ассоциированных с усилением симпатолиза (группа 1), не наблюдалось; причем у этой группы отношение рисков, равное 1,07, указывает на незначительное преимущество Gly-носителей. С другой стороны, как и в случае базального норэпинефрина, снижение отношения рисков с увеличением уровней норэпинефрина через 3 месяца указывает на то, что в группе с повышенным уровнем норэпинефрина преимущество Arg-гомозиготов заключается в относительно большем снижении смертности, т.е. на 64% (p=0,08). Такое изменение уровней норэпинефрина и исходные данные указывают на то, что предпочтительность терапевтического лечения буциндололом для пациентов с Arg-гомозиготным βAR непосредственно ассоциируется со степенью адренергической активности, но не с защитой от симпатолиза.
<u>Таблица 8</u>
Субисследования ДНК в испытании BEST с участием принимавших буциндолол пациентов с измерениями уровня норэпинефрина (NE) (пг/мл, n=439)
Группа NE
Отношение рисков летального исхода, Arg/Arg:Gly-носитель
95% ДИ
Величина р Кокса
# События
BSL NE (n)
64-356 (146)
0,90
0,37; 2,22
0,82
19
358-545 (144)
0,74
0,37; 1,51
0,41
31
546-2571 (149)
0,68
0,32; 1,47
0,33
29
*Изменение NE через 3 мес.(n)
Группа 1,<-244 (70)
1,07
0,41; 2,78
0,89
17
Группа 2, от -244 до 145 (248)
0,82
0,43; 1,59
0,56
36
Группа 3,>145 (54)
0,36
0,11; 1,15
0,08
14
1
BSL = базовая линия. *Изменение уровня NE у группы, принимавшей буциндолол, через 3 месяца, ассоциировано с благоприятным исходом; разделяющие точки получены из ранее опубликованного вероятностного анализа для всех групп. В этом анализе, проводимом по сравнению с группой 2, в этой группе наблюдалось 1,69-кратное (p<0,05) увеличение смертности, а в группе 3 наблюдалось 1,65-кратное (p<0,05) увеличение смертности.
ПРИМЕР 7
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ДАННЫХ, ПОЛУЧЕННЫХ В ИСПЫТАНИИ BEST
При хронической сердечной недостаточности активация адренергической нервной системы имеет двойственные и на первый взгляд противоположные эффекты (фиг.14). С одной стороны, имеющаяся адренергическая активация является важным фактором в сохранении функции сердца при сердечной недостаточности, и фармакологическое устранение такого эффекта под действием симпатолитических средств приводит к увеличению смертности (Bristow et al., 2004; Cohn et al., 2003). С другой стороны, хроническая β-адренергическая стимуляция приводит к кардиомиопатии, а блокада β-адренергических рецепторов может приводить к улучшению фенотипа застойной кардиомиопатии и к увеличению числа благоприятных клинических исходов. Целью антиадренергической терапии является не значительное воздействие на адренергическую активность, а устранение побочных эффектов. Стратегия терапии с введением сначала низких доз обратимых β-блокирующих средств широкого действия/конкурентных β-блокирующих средств имела большой успех в поддержании такого хрупкого равновесия эффектов, в частности, в достижении меньшего прогрессирования сердечной недостаточности у пациентов.
Очевидно, что трудности, возникающие при испытании BEST с использованием буциндолола, связаны с компенсирующим уравновешиванием эффектов антиадренергической терапии путем устранения избыточной адренергической активности у пациентов с сердечной недостаточностью класса IV (Anderson et al., 2003). У пациентов с сердечной недостаточностью класса IV, подвергаемых лечению буциндололом, наблюдалось статистически значимое 1,7-кратное увеличение общих показателей летального исхода или госпитализации по поводу сердечной недостаточности в течение первых 6 месяцев лечения, тогда как у пациентов с сердечной недостаточностью класса III такого раннего негативного эффекта не наблюдалось, и все они обнаруживали в высокой степени значимое (p=0,0001) 22%-ное снижение частоты указанного события. Подгруппа пациентов с высоким уровнем симпатолитического ответа на введение буциндолола, как и ожидалось, была в высокой степени представительной в группе пациентов с заболеванием класса IV, поскольку эта подгруппа имела очень высокие базальные уровни норэпинефрина (фиг.15). Подгруппа пациентов с высоким уровнем симпатолитического ответа на введение буциндолола, как и следовало ожидать, также обнаруживала худшие функции левого и правого желудочков (фиг.16).
2c
1
2c
1
В подгруппе BEST (18% от всех проходивших лечение пациентов), которая была подвержена сильному симпатолизу (снижение уровня норэпинефрина на >244,5 пг/мл), наблюдалось 1,7-кратное увеличение случаев летального исхода. Результат, полученный для этой подгруппы, аналогичен результату, полученному в испытании MOXCON для пациентов, которые принимали “чистое” симпатолитическое средство моксонидин (Cohn et al., 2003). Очевидно, что эти два фармакогенетических пути, благодаря которым пациенты могут быть защищены от указанного побочного эффекта, обусловлены 1) присутствием варианта α-рецептора дикого типа, который является одним из показателей высвобождения норэпинефрина (Bristow 2000); 2) присутствием высокофункционального варианта β-рецептора, который предположительно позволяет этому рецептору устранять потерю способности к передаче норэпинефринового сигнала. Таким образом, предварительный скрининг на присутствие либо αAR дикого типа, либо βAR-389Arg/Arg позволяет идентифицировать группу пациентов, у которых уменьшение числа летальных исходов, если они имеются, составляет соответственно 29% (p=0,031) или 38% (p=0,030).
2c
2c
2
2c
2c
2c
2c
2c
У подгруппы пациентов негроидной расы наблюдался специфический фармакогенетический профиль, имеющийся у значительного числа пациентов, который при лечении буциндололом делает его неэффективным и повышает тенденцию к неблагоприятному исходу. Индивидуумы негроидной расы имеют значительно более высокую (приблизительно в 10 раз) частоту аллелей, что приводит к потере функционального варианта α-рецептора, включая делецию аминокислот 322-325 в 3-ей интрацитоплазматической петле рецептороного белка (Small et al., 2000). Такая потеря функции в αAR, как и ожидалось, приводит к увеличению адренергической активности, поскольку в этом случае нарушается нормальное пресинаптическое адренергическое ингибирующее действие α-рецепторов (Brum et al., 2002). У индивидуумов в испытании BEST, в частности у индивидуумов негроидной расы, которые были гетерозиготными или гомозиготными по этому генному варианту (αARDel322-325-носители), наблюдалась тенденция к увеличению системного норэпинефрина на базальном уровне и наблюдался значительно больший симпатолитический ответ на буциндолол (фиг.17). Действительно, приблизительно 61% индивидуумов негроидной расы в испытании BEST были αARDel322-325-носителями в отличие от αARDel322-325-носителей не негроидной расы, которые составляли 8% (фиг.18). У индивидуумов, которые были αARDel322-325-носителями, наблюдалось 10% увеличение случаев летальных исходов в группе, принимавшей буциндолол, тогда как у индивидуумов, которые имели αAR дикого типа, наблюдалось 29% снижение случаев летальных исходов (p=0,031) (фиг.19).
1
1
1
2c
1
1
Другой механизм защиты от симпатолитического эффекта буциндолола заключается в присутствии в высокой степени функционального 389Arg/Arg-варианта βAR (фиг.15) (Mason et al., 1999), имеющегося у 47% индивидуумов, участвовавших в BEST. Как показано на фиг.20 и в примере 4, наличие у индивидуума 389Arg/Arg- (Arg-гомозиготного варианта) или 389Gly-βAR, вероятно, является главным показателем ответа на β-агонисты, даже более главным, чем наличие или отсутствие сердечной недостаточности. При этом предполагается, что индивидуумы, имеющие βAR-389Arg/Arg, должны быть относительно резистентными к негативному действию симпатолиза, поскольку даже пониженные уровни норэпинефрина будут продуцировать относительно стойкий инотропный ответ (фиг.20). Это действительно очевидно для случаев выживаемости, как показано на фиг.19. На фиг.21 показано, что у пациентов, которые являются αARDel322-325-носителями, присутствие βAR-389Arg/Arg-рецептора приводит к снижению случаев летальных исходов у βAR-389Gly-носителей с 36% до 18%.
1
1
1
βAR-389Arg/Arg-генотип, помимо защиты от снижения функции миокарда в результате симпатолиза, сообщает более высокий ответ, т.е. “гиперответ” на буциндолол (фиг.5-7). Это, вероятно, обусловлено тем, что высокофункциональный βAR-389Arg/Arg-вариант сообщает более высокую степень кардиомиопатии. Поскольку этот вариант имеет повышенную функцию, то абсолютная степень ингибирования передачи сигнала буциндололом значительно увеличивается, что влечет за собой повышение вероятности благоприятного исхода лечения пациентов с βAR-389Arg/Arg-генотипом.
2c
1
2c
1
2c
1
Как показано на фиг.21 и фиг.20, у пациентов, имеющих 389Arg/Arg-вариант рецептора, наблюдалось гораздо большее снижение числа летальных исходов в ответ на буциндолол во всех группах (38% снижения случаев летального исхода (p=0,030), по сравнению с незначимым 10%-ным снижением у Gly-носителей наблюдалось) и в группах пациентов, имеющих αAR дикого типа (40% снижение смертности, (p=0,037), по сравнению с незначимым 20%-ным снижением у Gly-носителей). Поэтому наличие или отсутствие βAR-389Arg/Arg-генотипа, который является маркером гиперотвечаемости, служит основным показателем ответа на буциндолол у пациентов с запущенной сердечной недостаточностью. На фиг.22 проиллюстрировано повышение степени снижения числа летальных исходов в испытании BEST с использованием генных вариантов для уточнения субпопуляций. Для сравнения, на фиг.7 графически представлены результаты испытаний MERIT-HF, в которых участвовало относительно большое число (>500) пациентов США и которые проводились с использованием только одного другого β-блокатора для оценки смертности от сердечной недостаточности. Как можно видеть, снижение смертности в испытании BEST возрастало от статистически незначимых 10% для всех групп до 29% у 80% пациентов, которые имели αAR дикого типа, до 38% у 47% пациентов, которые имели βAR-389Arg/Arg, и до 40% у 40% пациентов, которые имели как αAR дикого типа, так и βAR-389Arg/Arg. Для сравнения, отношение рисков для метопролола CR/XL у пациентов в США, участвовавших в испытании MERIT-HF, составляло 1,05 (Wedel et al., 2001).
1
1
1
2c
1
2c
1
2c
1
Хотя возможно, что βAR-389-генотип-специфические данные, полученные в испытании BEST, по существу, действительны для всех β-блокаторов, однако имеются веские основания утверждать, что такие данные могут быть применимы только для буциндолола. Во-первых, как обсуждалось выше, у βAR-389Arg/Arg-генотипа исключены побочные эффекты симпатолиза, и в отличие от других β-блокаторов, используемых для лечения сердечной недостаточности, такой симпатолиз присущ лишь буциндололу. Во-вторых, для максимального ингибирования передачи сигнала под действием высокофункционального βAR-389Arg/Arg-рецептора может фактически оказаться полезным снижение уровня норэпинефрина и блокирование рецептора, т.е. использование комбинации свойств, которыми обладает только буциндолол. И, наконец, данные для генетических вариантов, полученные в испытании BEST с использованием буциндолола, могут рассматриваться как эффективные только в отношении запущенной сердечной недостаточности класса III-IV. Было бы желательно, если бы при менее запущенной сердечной недостаточности (класса I-II по NYHA) буциндолол стал препаратом выбора для пациентов с комбинацией αARDel322-325-варианта+βAR-389Arg/Arg-варианта, поскольку симпатолиз и потеря функции миокарда должны быть меньше у пациентов этой группы и у индивидуумов с гаплотипом αAR-Del/Del+βAR-389Arg/Arg, у которых наблюдается 10-кратное увеличение риска развития сердечной недостаточности (Small et al., 2002). Буциндолол может служить решающим терапевтическим средством для лечения указанных пациентов, поскольку он снижает уровни норэпинефрина (и тем самым устраняет эффект αARDel322-325-аллеля) и блокирует βAR.
1
В литературе имеются значительные расхождения во мнениях насчет того, имеет ли буциндолол присущую ему симпатомиметическую активность (ISA) в сердце человека, т.е. свойство, которое может служить объяснением результатов испытаний BEST с использованием буциндолола. Хотя ясно, что буциндолол обладает ISA в миокарде грызунов, однако интенсивные исследования, проводимые авторами настоящего изобретения, показали, что буциндолол обладает крайне низкой активностью в качестве обратного агониста и не обладает какой-либо ISA в функционирующем миокарде человеческого желудочка. Как показано в публикации Bristow et al., 1998, буциндолол не повышает частоту сердечных сокращений в ночное время в соответствии с мониторингом Холтера, и считается, что он является наиболее чувствительным индикатором ISA в сердце человека и критерием, который позволяет легко идентифицировать ISA ксамотерола или целипролола (Xameterol Study Group, 1990; Silke et al., 1997). Кроме того, интенсивные исследования, проводимые авторами настоящего изобретения на препаратах выделенного человеческого сердца, показали, что буциндолол не обнаруживал каких-либо признаков ISA ни у пациентов, не страдающих сердечной недостаточностью (фиг.23 и 24), ни у пациентов с сердечной недостаточностью (фиг.25 и 26). Фактически, при сердечной недостаточности карведилол дает более позитивный инотропный сигнал, чем буциндолол, в препаратах с предварительной обработкой форсколином (необходимой для усиления передачи сигнала в целях облегчения детекции слабой ISA) (фиг.26). В испытании BEST более благоприятный ответ на буциндолол в высокофункциональном βAR-Arg/Arg-варианте также свидетельствует против наличия ISA у буциндолола в миокарде человеческого желудочка.
ПРИМЕР 8
ПОВТОРНОЕ ОБСУЖДЕНИЕ ИСПЫТАНИЯ BEST
2c
2c
2c
2c
2c
2c
2c
2c
1
Исследование, осуществляемое в рамках испытания BEST с использованием подгруппы пациентов с оценкой их ДНК, проводили с участием 1040 пациентов в целях проверки предварительно высказанной гипотезы, касающейся двух полиморфизмов адренергических рецепторов, которые, исходя из результатов, полученных с использованием систем-моделей (Mialet et al., 2003), или полученных в эпидемиологических исследованиях сердечной недостаточности (Small et al., 2002), возможно, являются прогностическим показателем для эффекта лечения буциндололом. В испытании BEST было обнаружено, что эти два генных варианта адренергического рецептора, которые имеют различную частоту аллелей у индивидуумов негроидной расы и индивидуумов не негроидной расы, оказывают заметное влияние на исходы лечения. Первым вариантом является полиморфизм αDel322-325, который сообщает этому генному варианту потерю функции, приводящую к увеличению адренергической активности и к повышению вероятности усиления симпатолитического эффекта буциндолола. У пациентов, являющихся αDel322-325-носителями и подвергаемых лечению буциндололом, наблюдалось среднее снижение уровня норэпинефрина через 3 месяца до 153±57 (ср.кв.от.) пг/мл, а у пациентов с α WT/WT наблюдалось снижение уровня норэпинефрина до 50±13 пг/мл (p=0,008). В испытании BEST такие усиленные симпатолитические ответы были ассоциированы со статистически значимым 1,7-кратным увеличением смертности (Bristow et al., 2004). В испытании BEST участвовали две клинические или демографические подгруппы пациентов, у которых наблюдалась предрасположенность к значительному симпатолизу, т.е. у пациентов с сердечной недостаточностью класса IV и у пациентов негроидной расы, при этом только эти две подгруппы пациентов имели отношение рисков летального исхода, составляющее >1,0 (BEST Writing Committee, 2001). Частота аллелей αDel322-325 у чернокожих пациентов составляла 0,42, а у не чернокожих пациентов - 0,04 (p<0,0001). Как показано в столбце 3 таблицы 9, у пациентов в испытании BEST, которые были гомозиготными по α-адренергическому рецептору дикого типа (WT/WT), наблюдалось 30% снижение числа летальных исходов по всем нозологическим формам (p=0,031) и 41% снижение числа летальных исходов от сердечно-сосудистых заболеваний (p=0,004), тогда как у пациентов, являющихся носителями полиморфизма DEL 322-325, наблюдалось 9% увеличение числа летальных исходов по всем нозологическим формам заболевания (p=NS) и 3% увеличение числа летальных исходов от сердечно-сосудистых заболеваний (p=NS). В целом, 80% пациентов, участвовавших в испытаниях BEST, из которых 24% составляли пациенты негроидной расы, имели α WT/WT, включая 34% пациентов не негроидной расы. Таким образом, простой скрининг на наличие полиморфизма DEL 322-325 и лечение только 85% пациентов США, которые были гомозиготными по α-адренергическому рецептору дикого типа, позволяют предотвращать повышенный симпатолиз/риск летального исхода у пациентов с запущенной сердечной недостаточностью, проходивших лечение буциндололом, и улучшать его терапевтический профиль. Как обсуждается ниже, пациенты, которые являются носителями αDel322-325, могут быть подвергнуты лечению буциндололом, если они имеют β-389Arg/Arg-генотип (который в испытании BEST преобладал с частотой 0,32 у чернокожих пациентов и с частотой 0,51 у не чернокожих пациентов), а поэтому пациенты, которым показано лечение буциндололом, составляли 85%+6%=91% от всех больных с сердечной недостаточностью в США, из которых 12% были чернокожими, а 88% - не чернокожими. Кроме того, свыше 50% чернокожих пациентов (34%+21%=55%) могли быть подвергнуты лечению буциндололом путем отбора по их генотипу.
1
1
1
1
1
Другим полиморфизмом адренергического рецептора, который, как было обнаружено, влияет на эффект лечения буциндололом в испытании BEST, был SNP β389Arg/Gly, где более высокофункциональный Arg/Arg-вариант, по сравнению с Gly-аллелем (“Gly-носители, столбец 6, таблица 9), сообщал способность буциндололу вызывать “гиперответ” (таблица 9, столбец 5). Сообщение о том, что 389Arg/Arg-вариант обладает большей способностью к передаче сигнала, чем Gly-носитель, было представлено в информационном пакете на конференции, проходившей 03.28.05, а сообщение о том, что 389Arg-аллель обладает большими кардиомиопатическими свойствами, чем 389Gly, было опубликовано Dr. Liggett и группой сотрудников (Mialet et al., 2003). Как видно в таблице 9, в испытании BEST у пациентов, принимавших буциндолол, которые имели 389Arg/Arg-вариант, наблюдалось 38% снижение (p=0,030) смертности по всем нозологическим формам заболевания и 46% снижение (p=0,015) смертности от сердечно-сосудистых заболеваний, по сравнению со снижением смертности у 389Gly-носителей, у которых наблюдалось снижение смертности на 10% и 22% соответственно (в обоих случаях p=NS). Поскольку не было никаких сообщений о том, что карведилол (Small et al., 2002) или метопролол CR/XL (White et al., 2003) дают заметно отличающиеся терапевтические ответы у β-389Arg/Arg и β-389Gly-носителей, то вероятно, что благоприятный эффект буциндолола у пациентов с вариантом гена β-389Arg/Arg-рецептора обусловлен комбинацией эффектов снижения уровня передачи сигнала норэпинефрина и конкурентным антагонистическим действием рецептора. В этой связи следует отметить, что Dr. Bristow и сотрудники представили информацию, основанную на физиологических и молекулярных/биомаркерных данных, свидетельствующих о том, что у пациентов с сердечной недостаточностью, принимавших полные терапевтические дозы β-блокаторов, наблюдалась непрерывная передача адренергического сигнала в миокарде (Lowes et al., 2001), а поэтому снижение уровней норэпинефрина у пациентов с высокофункциональным β-389Arg/Arg-вариантом рецептора может давать дополнительный благоприятный эффект.
1
2c
2c
1
2c
1
2c
1
Кроме того, у пациентов, имеющих β-389Arg/Arg и α-WT/WT (столбец 8, таблица 9), наблюдалось 40% снижение смертности по всем нозологическим формам (p=0,037), 47% снижение смертности от сердечно-сосудистых заболеваний (p=0,020) и 39% снижение по показателям смертности+госпитализации по поводу сердечной недостаточности (p=0,002) либо у них наблюдались терапевтические ответы, которые значительно превышали ответы у всех пациентов в испытании BEST или у когнатных диплотипов с противоположными аллелями. В этой связи в столбце 11 таблицы 9 показано, что у пациентов в BEST, имеющих αDel322-325 и у β-389Gly-носителей, наблюдалось 35% увеличение смертности по всем нозологическим формам и 36% увеличение смертности от сердечно-сосудистых заболеваний. Объяснение таких неблагоприятных ответов, очевидно, заключается в том, что пациенты с запущенной сердечной недостаточностью, которые имеют низкофункциональный 389Gly-вариант β-адренергического рецептора, не способны переносить повышенный симпатолитический ответ, ассоциированный с наличием αDel-варианта. В противоположность этому у пациентов с высокофункциональным (389Arg/Arg)-вариантом β-рецептора, которые отличаются устойчивыми ответами на низкие концентрации катехоламинов, не наблюдалось такого неблагоприятного влияния на общую смертность или на смертность от сердечно-сосудистых заболеваний (таблица 9, столбец 9). Хотя относительно небольшое число пациентов и событий не дают статистически значимых результатов для любого конечного показателя смертности в подгруппе {α-DEL322-325- и β-389Gly-носителей}, однако соответствие этих результатов по симпатолитическим данным и данным молекулярной фармакологии на основе полиморфизма адренергических рецепторов подтверждает их научную и клиническую важность с точки зрения безопасности для пациента.
1
2c
1
В испытании BEST частота β-389Arg/Arg-аллеля у не чернокожих пациентов составляла 0,72, а у чернокожих пациентов составляла только 0,57 (p<0,0001). Таким образом, в испытании BEST у чернокожих индивидуумов наблюдалась более высокая частота аллелей, которая может приводить к увеличению смертности (αDel322-325), и более низкая частота β-389Arg/Arg-аллелей, ответственных за “гиперответ”. Оба этих генетических различия у афроамериканцев, вероятно, вносят свой вклад в тенденцию неблагоприятного исхода у этой демографической группы (BEST Writing Committee, 2001).
В основу фармакогенетических субисследований BEST были положены высказанные гипотезы о предполагаемой фармакологической взаимосвязи действия буциндолола с конкретным полиморфизмом адренергических рецепторов, которые были ранее тщательно исследованы на системах-моделях и у человека. В соответствии с этим, очевидно, что эти фармакогенетические гипотезы являются более обоснованными, чем традиционные мнения, высказываемые ранее исходя из анализов соответствующих подгрупп.
2c
1
Фармакогенетические данные, проанализированные в испытании BEST, приводятся ниже. Группа индивидуумов, которая дала свое согласие на участие в проведении субисследования по ДНК и фармакогенетического анализа, не отличалась по своим базовым параметрам от всех остальных групп. Кроме того, не было получено каких-либо данных о влиянии дозы гена на любой полиморфизм; при этом эффекты у гетерозиготных индивидуумов были аналогичны эффектам или превышали эффекты, наблюдаемые у гомозиготных индивидуумов. Исходя из этого было высказано предположение, что αDel322-325 и β-389Gly-аллели действуют по негативному доминантному типу.
<u>Таблица 9</u>
Конечное событие
BEST, все группы, буциндолол (n=2708), средняя продолжительность исследования 2,0 года
BEST,α<sub>2c</sub> WT/WT буциндолол (n=829/1036), средняя продолжительность исследования 2,0 года
BEST,α<sub>2c</sub>Del-носитель буциндолол (n=207/1036), средняя продолжительность исследования 2,0 года
BEST,β<sub>1</sub>-389Arg/Arg буциндолол (n=493/1040), средняя продолжительность исследования 2,0 года
BEST,β<sub>1</sub>-389Gly-носитель, буциндолол (n=547/1040), средняя продолжительность исследования 2,0 года
Смертность
0,90; 860 Ev(0,78, 1,02)p=0,10
0,70; 155 Ev(0,51,0,97)p=0,031
1,09; 37 Ev(0,57, 2,08)p=0,79
0,62; 82 Ev(0,40, 0,96)p=0,030
0,90; 111 Ev(0,62, 1,30)p=0,57
Смертность от ССЗ
0,86;731 Ev(0,74, 0,99)p=0,040
0,59; 130 Ev(0,42, 0,85)p=0,004
1,03; 32 Ev(0,52, 2,07)p=0,92
0,54; 66 Ev(0,33, 0,89)p=0,015
0,78; 97 Ev(0,52, 1,18)p=0,24
Смертность+госпитализация по поводу СН
0,81; 1421 Ev(0,73, 0,90)p<0,0001
0,72; 341 Ev(0,59, 0,90)p=0,003
0,89; 84 Ev(0,58, 1,37)p=0,60
0,66; 190 Ev(0,50, 0,88)p=0,004
0,87; 236 Ev(0,62,1,30)p=0,25
Госпитализация по поводу СН
0,78; 1045 Ev(0,69, 0,88);p<0,001
0,74; 267 Ev(0,58, 0,95)p=0,016
0,76; 67 Ev(0,47, 1,24)p=0,27
0,64; 154(0,48, 0,90)p=0,006
0,86; 181 Ev(0,64, 1,15)p=0,30
Конечное событие
BEST,β<sub>1</sub>-389Arg/Arg+α<sub>2c</sub> WT/WT, буциндолол (n=418/1036), средняя продолжительность исследования 2,0 года
BEST,β<sub>1</sub>-389Arg/Arg+α<sub>2c</sub>Del-носители, буциндолол (n=73/1036), средняя продолжительность исследования 2,0 года
BEST,β<sub>1</sub>-389Gly-носители+α<sub>2c</sub> WT/WT, буциндолол (n=411/1036), средняя продолжительность исследования 2,0 года
BEST,β<sub>1</sub>-389Gly-носители+DEL-носители, буциндолол (n=134/1036), средняя продолжительность исследования 2,0 года
MERIT-HF, пац. США, метопролол CR/XL (n=1071/3991), средняя продолжительность исследования 1 год
Смертность
0,60; 69 Ev(0,38, 0,97)p=0,037
0,71; 13 Ev(0,24,2,11)p=0,53
0,82; 86 Ev(0,54, 1,26)p=0,37
1,35; 24 Ev(0,61,3,02)p=0,46
1,05; 100 Ev0,71,1,56p=NS
Смертность от ССЗ
0,53; 56 Ev(0,31, 0,90)p=0,020
0,58; 73 Ev(0,17, 2,02)p=0,39
0,67; 411 Ev(0,42, 1,07)p=0,09
1,36; 22 Ev(0,59,3,15)p=0,47
~0,96; 90 Evp=NS
Смертность+госпитализация по поводу СН
0,61; 156 Ev(0,44, 0,84)p=0,002
0,85; 34 Ev(0,43, 1,69)p=0,64
0,86; 185 Ev(0,64, 1,16)p=0,32
0,81; 50 Ev(0,46, 1,43)p=0,47
~0,84; 200 Ev(0,61, 1,12)p=NS
Госпитализация по поводу СН
0,59; 126 Ev(0,41, 0,84)p=0,004
0,81; 73 Ev(0,38, 1,72p=0,59
0,93; 411 Ev(0,67, 1,29)p=0,66
0,62; 134 Ev(0,32, 1,21)p=0,16
NA
Эффекты β-блокаторов по сравнению с плацебо только в доступных/опубликованных данных, полученных в испытаниях по оценке смертности в зависимости от назначенного лечения, проводимых с участием пациентов США, страдающих сердечной недостаточностью.Ev=события; NA - нет данных
ПРИМЕР 9
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ: ПРОТОКОЛ I
1
1
Из этических соображений продолжение плацебо-контролируемых испытаний по эффективности β-блокаторов у пациентов с сердечной недостаточностью, вызываемой первичной или вторичной застойной кардиомиопатией, не представлялось возможным. Остается лишь выбор между проведением исследования в целях подтверждения того, что эффективность данного препарата лучше (superiority) или не хуже (non-inferiority), чем эффективность активного β-блокатора, используемого в качестве контроля, или альтернативным сравнением ответов на буциндолол для различных генных вариантов. Исследование, целью которого является определение того факта, что этот препарат не хуже стандартного, следует исключить из-за отсутствия данных о варианте гена рецептора, которые могли бы быть использованы для оценки любого другого средства (среди других испытаний фазы III, только в испытании MERIT-HF проводилось фармакогенетическое субисследование (Small et al., 2002), но этого совершенно недостаточно для получения каких-либо значимых результатов). Как показано на фиг.27, протокол исследования I представляет собой возможную схему исследования, которая предусматривает сравнение комбинации терапии буциндололом, основанной на генотипе, с неприцельной терапией метопрололом CR/XL, где первой целью данного исследования является время, прошедшее до летального исхода или госпитализации по поводу сердечной недостаточности. В протоколе I произвольно отобранные для лечения буциндололом пациенты, которые являются β-AR389Gly-носителями, не были включены в это исследование, поскольку, исходя из данных BEST, ответ на буциндолол у этих пациентов был недостаточным для проведения дальнейших исследований. Взамен этого эти пациенты должны быть внесены в регистр данных, в который должен быть включен минимум, вероятно, ограниченной информации об основных показателях состояния организма, которая когда-либо была получена лечащим врачом этого пациента. Предварительное сравнение в протоколе I должно быть проведено между β-AR389Arg/Arg-пациентами, проходившими лечение буциндололом, и пациентами со всеми другими генотипами, подвергнутыми терапии метопрололом CR/XL (TOPROL XL), т.е. неприцельной терапии. Общий размер случайной выборки для протокола I должен составлять 900 индивидуумов, из которых 662 пациента должны участвовать в предварительном сравнении результатов лечения.
ПРИМЕР 10
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ: ПРОТОКОЛ II
2c
2c
В протоколе исследования II (фиг.28), т.е. для дополнительного исследования, пациенты с симптоматической и запущенной сердечной недостаточностью (пациенты, у которых в истории болезни имеется указание о их госпитализации по поводу сердечной недостаточности, а поэтому пациенты, которые на время обследования имели сердечную недостаточность класса II, также были включены в испытание) и пациенты с LVEF ≤0,35 (общее описание пациентов, включенных в испытание BEST) проходили предварительное обследование на отсутствие полиморфизма αDel322-325 у носителей (гетерозиготного или гомозиготного). Это ограничение позволяет устранить многие из неблагоприятных эффектов симпатолиза, вызываемого буциндололом, главным проявлением которых является тенденция к увеличению смертности в испытаниях BEST (отношение рисков 1,09, столбец 4, таблица 9) и MOXCON, при этом предполагается, что у остальных проходивших лечение пациентов, имеющих фенотип чистых гомозиготов по α-адренергическому рецептору дикого типа (WT/WT), буциндолол должен иметь небольшое преимущество по сравнению с метопрололом CR/XL.
2c
2c
2c
2c
2c
1
2
Главной конечной целью данного испытания является показать, что данное лекарственное средство не хуже метопролола CR/XL (TOPROL-XL), с использованием 95% верхнего доверительного предела (ВДП) для отношения рисков в период до наступления летального исхода + госпитализации по поводу сердечной недостаточности, которое было измерено в испытании MERIT-HF (Hjalmarson et al., 2000). Хотя испытание MERIT-HF включало все генотипы, однако в нем только 208 (5,2%) из 3991 участвующих пациентов были чернокожими. α-322-325DEL-носители очень часто встречаются среди индивидуумов негроидной расы (в испытании BEST, у чернокожих пациентов, частота α 322-325DEL-аллеля составляла 0,423, а у не чернокожих пациентов, она составляла 0,043, тогда как DEL-носители преобладали среди чернокожих пациентов, где они составляли 66%, в отличие от не чернокожих пациентов, составляющих 8%). Поэтому очевидно, что в испытании MERIT-HF, участвовало приблизительно 90% пациентов с α дикого типа или пациентов, которые были генотипически сравнимыми с пациентами в планируемом исследовании по протоколу II. Кроме того, поскольку метопролол CR/XL не обладает симпатолитическими эффектами, то нет оснований ожидать, что у носителей α дикого типа будет наблюдаться другой ответ на метопролол CR/XL, чем у DEL-носителей. 95% верхний доверительный предел (ВДП) для отношений рисков при лечении буциндололом:метопрололом CR/XL (“предел “не худшего" эффекта) был определен из формулы (Hasselblad et al., 2001) {(ВДП буциндолола:метопролола CR/XL) х (ВДП метопролола CR/XL:плацебо) ≤1,0}, причем для всей группы индивидуумов в MERIT-HF ВДП=0,80 для буциндолола:метопролола давал х·0,80 ≤1,0, или предел “не худшего" эффекта х≤1,25. Затем величину 1,25 снижали до 1,16 для обеспечения большей достоверности в отношении “не худжего" эффекта. Конечный ВДП=1,16 также представляет собой величину, полученную при масштабировании отношения рисков/ВДП в MERIT-HF от значений 0,69/0,80 до значения отношения рисков 1,0. Затем оценка эффективности 85% с использованием 2-стороннего критерия с уровнем значимости (≤0,05 была определена исходя из ожидаемого отношения рисков 0,90 (небольшое преимущество буциндолола у пациентов с α WT/WT было обусловлено тем, что буциндолол лучше ингибирует блокаду β-389Arg/Arg и/или его β-рецептора в миокарде).
2c
2c
2c
Подтверждение преимущества буциндолола по сравнению с метопрололом CR/XL было получено для пациентов США, участвующих в MERIT-HF (таблица 9), у которых в том случае, если они проходили лечение метопролом CR/XL, наблюдалось увеличение числа летальных исходов на 5% и снижение числа случаев летального исхода+госпитализации по поводу СН на 16%. В противоположность этому у всех пациентов, участвующих в испытании BEST, наблюдалось снижение числа случаев летального исхода на 10% (p=0,10) и снижение числа случаев летального исхода + госпитализации по поводу сердечной недостаточности на 19% (p<0,0001), а у пациентов с α дикого типа наблюдалось снижение числа случаев летального исхода на 30% (p=0,031) и снижение числа случаев летального исхода + госпитализации по поводу СН на 28% (p=0,003). Деление отношений рисков (0,72/0,84) дает ожидаемое отношение рисков 0,86 и величину эффективности буциндолола по отношению к метопрололу CR/XL, равную 1,00-0,86 или 0,14. Таким образом, нет каких-либо оснований ожидать 10%-ного преимущества буциндолола по сравнению с метопрололом CR/XL у пациентов США с α WT/WT. В соответствии с критерием, предложенным на фиг.28, если ВДП составляет <1,16, независимо от отношений рисков для буциндолола/метопролола, то можно сделать вывод, что буциндолол не хуже метопролола CR/XL с точки зрения его эффективности в отношении продолжительности жизни или периода времени до госпитализации по поводу СН у пациентов с запущенной СН, которые имели 100%-ную гомозиготность по α-адренергическому рецептору дикого типа.
1
2c
1
2c
1
2c
1
2c
1
1
1
1
Вторая часть протокола данного испытания ставит своей целью получение дополнительных данных, свидетельствующих о том, что фармакогенетически специфический буциндолол дает лучшие результаты по сравнению с неспецифическим метопрололом CR/XL в отношении второго конечного события. Рассматриваемые здесь пациенты, принимавшие буциндолол, являются индивидуумами с β-389Arg/Arg, а также индивидуумами с α дикого типа. В испытании BEST 47% из всей группы пациентов имели β-389Arg/Arg, а 50% пациентов имели α дикого типа. Как показано в таблице 9, у пациентов с диплотипом β-389 Arg/Arg+α дикого типа наблюдалось 40%-ное снижение числа летальных исходов (p=0,037), 39%-ное снижение числа летальных исходов+случаев госпитализации по поводу СН (p=0,002) и 41%-ное снижение числа случаев госпитализации по поводу СН (p=0,004). Ожидаемое отношение рисков летального исхода + госпитализации по поводу СН у пациентов, принимавших буциндолол:метопролол CR/XL (данные испытания MERIT, США), должно составлять 0,61/0,84 или 0,73. Величина эффективности 27% у пациентов, принимавших буциндолол и имеющих диплотип β-389 Arg/Arg+α дикого типа, по сравнению с пациентами, принимавшими метопролол CR/XL, дает при расчетах статистическую мощность 81%. Таким образом, в планируемом испытании, представленном на фиг.28, “допустимый предел “не худшего” эффекта” по первому оцениваемому клиническому исходу традиционно основан на результатах, полученных для всех индивидуумов, участвовавших в испытании MERIT-HF, тогда как вычисления статистической мощности для первого и второго клинического исхода включают оценку ожидаемого преимущества буциндолола для выбранных генотипов исходя из фактических данных для пациентов США, принимавших буциндолол и метопролол CR/XL. Обоснованность такого сравнения подтверждается в субисследовании ДНК в испытании BEST, где у β-389Arg/Arg-пациентов, принимавших плацебо, частота указанных событий была идентична частоте таких событий у пациентов-носителей β-389Gly, принимавших плацебо (фиг.6 и 7). Другими словами, как показано на фиг.7, частота более благоприятных событий у β-389 Arg/Arg-пациентов, принимавших буциндолол, объясняется только эффектом лечения, а не лучшим естественным здоровьем пациентов с β-389Arg/Arg-генотипом. Это второе оцениваемое конечное событие 1-го порядка будет давать врачу-клиницисту дополнительное подтверждение того, что генотипически направленное введение буциндолола дает лучшие клинические результаты, чем неспецифическая терапия стандартным β-блокатором, разрешенным для лечения сердечной недостаточности.
1
2c
1
2c
1
2c
1
2c
В протоколе испытаний, проиллюстрированном на фиг.28, пациенты, принимавшие буциндолол, являются индивидуумами с β-389Arg/Arg, а также индивидуумами с α дикого типа. В испытании BEST 47% из всей группы пациентов имели β-389Arg/Arg, а 50% пациентов имели α дикого типа. Как показано в таблице 9, у пациентов с диплотипом β-389 Arg/Arg+α дикого типа наблюдалось 40%-ное снижение числа летальных исходов (p=0,037), 39%-ное снижение числа летальных исходов + случаев госпитализации по поводу СН (p=0,002) и 41%-ное снижение числа случаев госпитализации по поводу СН (p=0,004). Ожидаемое отношение рисков летального исхода+госпитализации по поводу СН у пациентов, принимавших буциндолол:метопролол CR/XL (данные испытания MERIT, США), должно составлять 0,61/0,84 или 0,73. Величина эффективности 27% у пациентов, принимавших буциндолол и имеющих диплотип β-389 Arg/Arg+α дикого типа, по сравнению с пациентами, принимавшими метопролол CR/XL, дает при расчетах статистическую мощность 81%. Таким образом, в планируемом испытании, представленном на фиг.28, “допустимый предел “не худшего” эффекта” по первому оцениваемому клиническому исходу традиционно основан на результатах, полученных для всех индивидуумов, участвовавших в испытании MERIT-HF, тогда как вычисления статистической мощности для первого и второго клинического исхода включают оценку ожидаемого преимущества буциндолола для выбранных генотипов исходя из фактических данных для пациентов США, принимавших буциндолол и метопролол CR/XL.
ПРИМЕР 11
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ: ПРОТОКОЛ III
1
1
1
В случае если “допустимый предел “не худшего” эффекта” составляет 1,16, что обеспечивает 36%-ное преимущество эффекта лечения метопрололом CR/XL по сравнению с плацебо, то, очевидно, этот предел недостаточен для демонстрации эффективности, а поэтому был предложен другой протокол исследования. ВДП, равный 1,14, который должен обеспечивать 50%-ное преимущество лечения метопрололом CR/XL по сравнению с плацебо, дает 90% статистическую мощность, что считается приемлемым показателем. Поэтому для достижения этой цели протокол, представленный на фиг.28, был скорректирован для получения статистической мощности 90% (фиг.29). Увеличение статистической мощности, необходимое для уменьшения ВДП, было достигнуто путем увеличения размера выборки с 1300 до 1600 и, в меньшей степени, путем преобразования рандомизации 2:1 в 1:1 для буциндолола и метопролола CR/XL. Кроме того, исходя из ответа пациентов на лечение авторами настоящего изобретения было проведено дополнительное исследование β-389Arg/Arg-пациентов, принимавших буциндолол, и β-389Arg/Arg-пациентов, принимавших метопролол, по другому второму конечному событию. Оценка статистической мощности для этого второго конечного события, проводимая исходя из ожидаемого уровня эффекта, составляющего 25%, равна 71%, а оценка статистической мощности для другого второго конечного события, проводимая исходя из ожидаемого уровня эффекта, составляющего 27%, равна 88%. Уровень первого эффекта в 25% трудно поддается оценке из-за ограниченных данных, полученных для β-389Arg/Arg-пациентов, принимавших метопролол CR/XL и лишь имеющиеся данные позволяют сделать предположение о незначительном эффекте лечения метопрололом CR/XL или вообще об отсутствии такого эффекта по сравнению с плацебо (White et al., 2003). Уровень эффекта в 27% для другого второго конечного события был получен исходя из данных испытания MERIT-HF, США, обсуждаемого выше.
В представленном выше описании проиллюстрированы лишь основные принципы изобретения. Кроме того, поскольку многочисленные модификации и изменения, которые могут быть внесены в настоящее изобретение, совершенно очевидны специалистам в данной области, то не следует ограничивать изобретение точным описанием конструирования и способов, описанных выше. В соответствии с этим в объем настоящего изобретения могут быть внесены все подходящие модификации и эквиваленты, определенные в формуле изобретения, прилагаемой ниже. Термины “содержит”, “содержащий”, “включать”, “включающий” и “включает”, используемые в описании изобретения и в нижеследующей формуле изобретения, означают наличие конкретных указанных признаков, величин, компонентов или стадий, но не исключают наличия или добавления одного или нескольких других признаков, величин, компонентов, стадий или их групп.
Источники иинформации
Нижеследующие работы вводятся в настоящее описание посредством ссылки в той степени, в которой они иллюстрируют процедуры или другие подробно описанные признаки помимо признаков, описанных в настоящем изобретении.
U.S. Patent 3817837
U.S. Patent 3850752
U.S. Patent 3939350
U.S. Patent 3996345
U.S. Patent 4196265
U.S. Patent 4275149
U.S. Patent 4277437
U.S. Patent 4366241
U.S. Patent 4582788
U.S. Patent 4627429
U.S. Patent 4659774
U.S. Patent 4683194
U.S. Patent 4683195
U.S. Patent 4683202
U.S. Patent 4683202
U.S. Patent 4683202
U.S. Patent 4784857
U.S. Patent 4800159
U.S. Patent 4816571
U.S. Patent 4883750
U.S. Patent 4946773
U.S. Patent 4959463
U.S. Patent 4965188
U.S. Patent 5126145
U.S. Patent 5130238
U.S. Patent 5141813
U.S. Patent 5169766
U.S. Patent 5264566
U.S. Patent 5279721
U.S. Patent 5428148
U.S. Patent 5554744
U.S. Patent 5574146
U.S. Patent 5602244
U.S. Patent 5605798
U.S. Patent 5645897
U.S. Patent 5662925
U.S. Patent 5705629
U.S. Patent 5788983
U.S. Patent 5840873
U.S. Patent 5843640
U.S. Patent 5843650
U.S. Patent 5843651
U.S. Patent 5843663
U.S. Patent 5846708
U.S. Patent 5846709
U.S. Patent 5846717
U.S. Patent 5846726
U.S. Patent 5846729
U.S. Patent 5846783
U.S. Patent 5849481
U.S. Patent 5849483
U.S. Patent 5849486
U.S. Patent 5849487
U.S. Patent 5849497
U.S. Patent 5849546
U.S. Patent 5849547
U.S. Patent 5851770
U.S. Patent 5851772
U.S. Patent 5853990
U.S. Patent 5853992
U.S. Patent 5853993
U.S. Patent 5856092
U.S. Patent 5858652
U.S. Patent 5861244
U.S. Patent 5863732
U.S. Patent 5863753
U.S. Patent 5866331
U.S. Patent 5866337
U.S. Patent 5866366
U.S. Patent 5900481
U.S. Patent 5905024
U.S. Patent 5910407
U.S. Patent 5912124
U.S. Patent 5912145
U.S. Patent 5912148
U.S. Patent 5916776
U.S. Patent 5916779
U.S. Patent 5919626
U.S. Patent 5919630
U.S. Patent 5922574
U.S. Patent 5925517
U.S. Patent 5925525
U.S. Patent 5928862
U.S. Patent 5928869
U.S. Patent 5928870
U.S. Patent 5928905
U.S. Patent 5928906
U.S. Patent 5929227
U.S. Patent 5932413
U.S. Patent 5932451
U.S. Patent 5935791
U.S. Patent 5935825
U.S. Patent 5939291
U.S. Patent 5942391
U.S. Patent 5952174
U.S. Patent 6113940
U.S. Patent 4656127
U.S. Patent 4682195
Abbondanzo et al., Breast Cancer Res. Treat, 16:182(151), 1990.
Allred et al., Arch. Surg., 125(1): 107-113, 1990.
Anand et al., Circulation, 107(9): 1278-1283, 2003.
Anderson et al., J. Card. Fail, 9:266-277, 2003.
Asano et al., J. Cardiovasc. Pharmacol, 37:678-691, 2001.
Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology, John, Wiley & Sons, Inc, New York, 1989.
Barany et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:189-193, 1991.
Bellus, J. Macromol. Sci. Pure Appl. Chem., A31(1): 1355-1376, 1994.
Benedict et al., Circulation, 94(4):690-697, 1996.
BEST Trial Investigators, N. Engl. J. Med., 344(22):1659-1667, 2001.
Bolger, Int J. Cardiol, 92(1):1-8, 2003.
Bouzamondo et al., Fund. Clin. Pharmacol., 15:95-109, 2001.
Bristow et al., Circ. Res., 59(3):297-309, 1986.
Bristow et al., Cardiovasc/Drugs Ther., 11:291-296, 1997.
Bristow et al., Circulation, 110:1437-1442,2004.
Bristow et al., Circulation, 89(4): 1632-1642, 1994.
Bristow et al., Clin. Cardiol., 21(12 Suppl 1):I3-13, 1998.
Bristow et al., J. Card Fail., 9(6):444-53, 2003.
Bristow et al., Mol. Pharmacol., 35:296-303, 1988.
Bristow, Circulation, 101:558-569, 2000.
Brodde et al., J. Cardiovasc., Pharmacol., 8:1235-1242, 1986.
Brodde et al., Z. Kardiol., 81:71-78, 1992.
Brown et al., Immunol Ser, 53:69-82, 1990.
Brum et al., Am. J. Physiol Heart Circ. Physiol., 283:H1838-18345, 2002.
Capaldi et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 74(2):425-433, 1977.
CEBIS-II Investigators, Lancet, 353:9-13, 1999.
Cohn et al., Eur. J. Heart Fail, 5:659-667, 2003.
Cohn et al., N. Engl. J. Med., 311:819-823, 1984.
de Arruda et al., Expert Rev. Mol. Diagn., 2(5):487-496, 2002.
De Jager et al., Semin. Nucl. Med., 23(2):165-179, 1993.
Dohlman et al., Annu. Rev. Biochem., 60:653-688, 1991.
Domanski et al., J. Am. Coll Cardiol., 42:914-922, 2003.
Doolittle et al., Methods Mol Biol., 109:215-237, 1999.
Eichhorn et al., Am. J. Cardiol., 79:794-798, 1997.
Epstein et al., Ann. Inn. Med., 65:20-7, 1968.
European Appln. 201,184
European Appln. 237,362
European Appln. 258,017
European Appln. 266,032
European Appln. 320 308
European Appln. 329,822
European Appln. 50,424
European Appln. 84,796
Fowler and Bristow, Am. J. Cardiol., 55(10)D120-D124, 1985.
Francis el al., Circulation, 87(6 Suppl). VI40-8, 1933.
French Appln. 2650840.
Frielle et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 84:7920-7924, 1987.
Froehler et al., Nucleic Acids Res., 14(13):5399-5407, 1986.
Frohman, In: PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications, Academic Press, N.Y., 1990.
Gaffney et al., Circ Res., 12:264-268, 1963.
Gilbert et al., Amer. J. Med., 88:223-229, 1990.
Granger et al., Lancet., 362:772-776, 2003.
Great Britain Appln 2202328.
Green et al., 1994.
Gulbis and Galand, Hum. Pathol., 24(12):1271-1285, 1993.
Halushka et al., Nat. Genet., 22(3):239-247, 1999.
Harlow and Lane, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.
Hasselblad et al., Drug Information J., 35:435-449, 2001.
Hein et al., Nature, 402:181-184, 1999.
Hershberger et al., J. Cardiovasc. Pharm., 15:959-967, 1990.
Hjalmarson et al., J. Am. Med. Assoc., 283:1295-1302, 2000.
Humphries et al., In: Molecular Diagnosis of Genetic Diseases, Elles (Ed.), 321-340, 1996.
Innis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85(24):9436-9440, 1988.
Isnard et al., Am. J. Cardiol., 86(4):417-421, 2000.
Johnson et al., Clin. Pharmacol. Ther., 73:366-71, 2003.
Johnson et al., Clin. Pharmacol. Ther., 74(1):44-52, 2003.
Jones, Nature, 199:280-282, 1963.
Joseph et al., Br. J. Pharm. 142:51-56, 2004.
Kalbfleisch et al., 1980.
Kaplan et al., J. Amer. Statistical Assoc., 53:457-481, 1958.
Kaye et al., J. Am. Coll. Cardiol., 26(5):1257-1263 1995.
Ke and Cardon Bioinformatics, 19(2):287-288, 2003.
Klaassen, In: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman and Gilman, Eds., Pergamon Press, 8th Ed., pp.49-61, 1990.
Krum et al., Circulation, 92:1499-1506, 1995.
Kuppuswamy et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 88:1143-1147, 1991.
Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:1173, 1989.
Kwok and Chen, Curr Issues Mol. Biol., Apr, 5(2):43-60, 2003.
Kwok et al., Genomics, 23(1): 138-144, 1994.
Kwok, Annu. Rev. Genomics Hum. Genet., 2:235-258, 2001.
Landegren et al., Science 241:1077-1080, 1988.
Landegren et al., Science, 241:1077-1080, 1988.
Levin et al., J. Biol Chem., 277(34):30429-30435, 2002.
Liggett et al., In: Catecholamines, Bouloux (Ed.), W.B. Sounders, London, 1993.
Liggett, J. Glin. Invest., 107:947-948, 2001.
Liu et al., Clin. Pharmacol. Ther., 74:372-9, 2003.
Lohse, Trends Mol. Med., 10:55-58, 2004.
Lowes et al., Circulation, 102:II-628, 2000.
Lowes et al., Circulation, 104:II-436, 2001.
Lowes et al., N. Engl. J. Med., 346:1357-1365, 2002.
Mann et al., Circulation, 111(21):2837-2849, 2005.
Mason et al., J. Biol. Chem., 274:12670-12674, 1999.
Maxam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:560, 1977.
McMurray et al., Lancet, 362:767-771, 2003.
MERIT-HF Study Group, Lancet, 353:2001-2007, 1999.
Meyers et al., Science, 230:1242, 1985.
Mialet et al., Nat. Med., 9:1300-1305, 2003.
Modrich, Ann. Rev. Genet., 25:229-253, 1991.
Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-273, 1986.
th
Nakamura et al., In: Handbook of Experimental Immunology (4 Ed.), Weir et al., (eds). 1:27, Blackwell Scientific Publ., Oxford, 1987.
Neumister et al., Pharmacogenet. Genomics, 15:143-149, 2005.
Nickerson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:8923-8927, 1990.
Nyren et al., Anal Biochem. 208:171-175, 1993.
O'Shaughnessy et al, Clin. Sci., 99:233-238, 2000.
Ohara et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:5673-5677, 1989.
Orita et al., Genomics, 5:874-879, 1989.
Packer et al., Circulation, 106(17):2194-2199, 2002.
Packer et al., N. Engl. J. Med., 344:1651-1658, 2001.
PCT Appln. PCT/US 87/00880
PCT Appln. PCT/US 89/01025
PCT Appln. WO 88/10315
PCT Appln. WO 89/06700
PCT Appln. WO 93/22456
PCT Appln. WO 95/11995
PCT Appln. WO 89/06700
PCT Appln. WO 90/01069
PCT Appln. WO 91/02087
PCT Appln. WO 92/15712
Perez et al., Nature Med., 9:1300-1305, 2003.
"Physicians Desk Reference"
Pollock et al., Am. J. Cardiol, 66:603-607, 1990.
Port et al., Mol Pharmacol, 60(4):629-631, 2001.
Prezant et al., Hum. Mutat., 1:159-164, 1992.
Rathz et al., J. Cardiovasc. Pharmacol., 39:155-160, 2002.
"Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580.
Rockman et al., Am. J. Cardiol., 64(19):1344-1348, 1989.
Ruano et al., Nucl. Acids Res., 19:6877-6882, 1991.
Ruano et al., Nucl. Acids Res., 17:8392, 1989.
Sallach et al., Ann. Med, 35:259-266, 2003.
Salomon, Methods Enzymol., 195:22-28, 1991.
Sambrook et al., In: Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001.
Sanger et al., J. Molec. Biol., 94:441, 1975.
SAS (r) proprietary software, release 6.12. Cary, NC: SAS Institute, 1996.
Sederberg et al., J. Am. Coll. Cardiol. 35(2) 207A:147, 2000.
Sheffield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:232-236, 1989.
Silke et al., J. Cardiovasc. Pharmacol., 30(6):817-823, 1997.
Small et al., J. Biol Chem., 275:23059-23064, 2000.
Small et al., N. Engl. J. Med., 347:1135-1142, 2002.
Sofowora et al., Clin Pharmacol Ther., 73:366-71, 2003.
Sokolov, Nucl. Acids Res. 18:3671, 1990.
Stephen, Am. J. Cardiol., 18:463-472, 1966.
Stevens et al., Biotechniques, 34:198-203, 2003.
Strosberg, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 37:421-450, 1997.
Swedberg et al., Circulation, 105(15):1797-803, 2002.
Swedberg et al., Circulation, 82(5): 1730-1736, 1990.
Swedberg et al., Eur. Heart J., 17(9):1306-1311, 1996.
Taillon-Miller et al., Genome Res, 8(7):748-754; 1998.
Taylor et al., Cong. Heart Failure, 10:281-288, 2004.
The Merck Index, Eleventh Edition.
Trial Investigators, 2001.
Turki et al., J. Clin. Invest, 95:1635-1641, 1995.
Ugozzoll et al., GATA 9:107-112, 1992.
van Campen et al., J. Cardiovasc. Pharmacol., 32 Suppl 1:S31-S35, 1998.
Waagstein et al., Lancet, 342:1441-1446, 1993.
Wagoner et al., Am. Heart J., 144(5):840-846, 2002.
Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:392-396, 1992.
Wartell et al., Nucl. Acids Res., 18:2699-2706, 1990.
Wedel et al., Am. Heart J., 142:502-511, 2001.
White et al., Eur. J. Heart Fail., 5:463-468, 2003.
Winter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:7575, 1985.
Xameterol Study Group, 1990.
Yancy et al., J. Am. Coll Cardiol., 29:284A, 1997.
Yancy et al., N. Engl. J. Med., 344(18): 1358-1365, 2001.
Yang-Feng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:1516-1520, 1990.
Zhu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(4): 1607-12, 2001.