Влияние долговременного внесения сахарозы и эктомикоризных корней на функционирование микробных комплексов дерново-подзолистой почвы

УДК 631. 4

ВЛИЯНИЕ ДОЛГОВРЕМЕННОГО ВНЕСЕНИЯ САХАРОЗЫ И ЭКТОМИКОРИЗНЫХ КОРНЕЙ НА ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ МИКРОБНЫХ КОМПЛЕКСОВ ДЕРНОВО-ПОДЗОЛИСТОЙ ПОЧВЫ1

Т.Г. Добровольская, М.В. Горленко, А.Л. Степанов, С.А. Нестеров, А.В. Тиунов

В полевом эксперименте показано, что при длительном внесении легко доступного углерода (сахарозы) в почву резко сокращается численность целлюлозоразрушающих бактерий, но увеличивается общее функциональное разнообразие микробного сообщества, возрастает эмиссия углекислого газа и интенсивность процессов азотфиксации и денитрификации. Удаление эктомикоризных корней ели не оказало воздействия на численность бактерий гидролитического комплекса, а способствовало усилению активности процесса азотфиксации. Удаление корней снижало интенсивность базального дыхания и денитрифицирующую активность почвы.

Ключевые слова: микробные комплексы почв, функциональное разнообразие, биологическая активность, катаболитная репрессия, эктомикоризные корни, бактерии-гидролитики, деструкция растительных остатков, почвенное дыхание.

Введение

Повышение концентрации диоксида углерода в атмосфере, наблюдаемое уже в течение полувека, сопровождается интенсификацией фотосинтеза и поступления углерода в почву [18]. Как это отразится на скорости деструкции органического вещества и структуре микробных комплексов почв, осуществляющих деструкцию, — один из важнейших вопросов почвенной микробиологии и экологии, на который предстоит ответить [24]. Несмотря на большое количество экспериментальных исследований, появившихся в последнее время, однозначного ответа на этот вопрос нет. В работах одних исследователей [13, 21, 23, 25] показано, что внесение в почву легкодоступного углерода значительно увеличивает микробную активность и скорость разложения органического вещества почв. В других работах [4, 8, 10, 12, 25] были получены противоположные результаты — внесение в почву простых соединений углерода либо не оказало влияния, либо ингибировало процесс деструкции растительных остатков.

Одним из основных каналов поступления легкодоступного углерода в почву являются корневые выделения, причем в лесных экосистемах основная часть его потока проходит через симбиотическую эктомикоризу [17]. В полевом эксперименте было показано замедление деструкции растительного опада в присутствии микоризных корней [16], что может быть связано с конкуренцией микоризных и сапротрофных грибов за питательные вещества. Внесение доступного углерода дает конкурентные преимущества сапротрофным микромицетам и бактериям, являющимися менее активными деструкторами, чем эктомикоризные базидиомицеты [9, 11]. Отрицательное влияние эктомикоризы на процессы деструкции может объясняться и другими механизмами, в частности снижением влажности почвы в

присутствии эктомикоризных корней [20]. Однако в ряде экспериментов было продемонстрировано, что наличие эктомикоризных корней, наоборот, усиливает деструкцию опада [14, 15]. Такой эффект авторы связывают с увеличением доступности углерода в ризомикосфере, что стимулирует активность сапротрофных микроорганизмов, дефицитных по углероду. Меньше экспериментов было посвящено исследованию влияния эктомикоризы на активность сапротрофных почвенных бактерий [22], хотя известно, что в микосфере может быть выше доля денитрифицирующих и аммонифицирующих бактерий, но ниже содержание бактерий-гидролитиков [14]. Цель данной работы — изучение влияния микоризных корней и повышения доступности углерода на функциональную структуру сапротрофного бактериального сообщества почвы.

Объекты и методы исследования

Полевой опыт проводили на территории биогео-ценологической станции Института проблем экологии и эволюции РАН «Малинки» (Московская обл.) в сентябре 2003 г. В мертвопокровном 50-летнем ельнике на дерново-подзолистой почве были заложены 28 экспериментальных площадок размером 40x60 см, в почву которых разместили газовые мешочки с разными видами растительного опада. Результаты опыта по его деструкции приведены в работе [8].

Подрезку корней по краям и снизу каждой второй площадки провели при закладке опыта и повторяли раз в месяц (кроме зимы). Сахар добавляли каждые две недели из расчета 25 г С (углерода) на 1 м2 в неделю. Сахарозу в виде 10%-го водного раствора также вносили каждые две недели (с 1 мая по 15 ноября). 14 площадок поливали раствором сахарозы, 14 остальных (контроль) — чистой водой. Годовое внесение сахарозы — 650 гС/м2 • год, что примерно в четыре раза превышает общее поступление углерода в дан-

1 Работа выполнена при частичном финансировании Гранта Президента РФ поддержки ведущих научных школ НШ-2227.2008.4

и Программы президиума РАН «Биоразнообразие».

ном лесу с растительным опадом. Таким образом, было заложено четыре варианта опыта: 1-й — минус сахар, минус корни, 2-й — плюс сахар, плюс корни, 3-й — минус сахар, плюс корни, 4-й — плюс сахар, минус корни. Через два года — в октябре 2005 — отбирали образцы почвы с глубины ~2 см. Численность и таксономический состав бактериального комплекса гидролитиков определяли методом посева с помощью репликаторов [19]. Из каждого варианта почвенных образцов брали среднюю пробу массой 1 г. Навески помещали в колбы со 100 мл стерильной водопроводной воды и обрабатывали на ультразвуковом дис-пергаторе УЗДН-1 (22 КГц; 0,44 А; 2 мин.). Почвенные суспензии высевали обыкновенным чашечным методом в 3-кратной повторности в трех разведениях на трех средах: 1) с пектином; 2) с карбоксиметил-целлюлозой; 3) с крахмалом.

Для ингибирования грибов на 300 мл среды добавляли 0,5 г нистатина. Данные по общей численности бактерий, полученные методом посева, выражали в КОЕ/г (колониеобразующих единиц на 1 г сухого образца). Бактерии идентифицировали до рода на основании морфологических и культуральных признаков, используя [7] и [5].

Функциональное разнообразие почвенных микробных сообществ определяли в двух повторностях методом мультисубстратного тестирования (МСТ) [1, 2, 3]. Он основан на оценке функционального биоразнообразия микробного сообщества по спектру потребляемых им субстратов. Технологически реализован в виде одноразовых тест-систем на основе стандартного 96-луночного планшета для иммуноферментного анализа, ячейки которого содержат набор тест-субстратов (сахара, аминокислоты, соли органических кислот, полимеры и др.). Количественное фотометрическое определение потребляемых субстратов осуществляли с помощью тетразолиевого красителя, который придает тем ячейкам с субстратами, на которых происходит рост микроорганизмов, окраску. Интенсивность ее пропорциональна потреблению данного субстрата. Таким образом, получали 47-мерный массив данных, являющийся своеобразным метаболическим «отпечатком пальца сообщества». Данные спектры подвергали анализу по уникальной запатентованной технологии [2], предусматривающей обсчет как с помощью стандартных подходов к описанию биоразнообразия и моделей ранговых распределений (модель Ципфа), так и с помощью новой модели рангового распределения Горленко [3]. Коэффициенты этой модели являются показателями устойчивости системы и ее биоразнообразия. Использование этих коэффициентов позволяет количественно сравнивать благополучие микробных систем различного генезиса. При этом благополучными считаются системы, обладающие большей устойчивостью, разнообразием и метаболической работой.

Интенсивность субстрат-индуцированных процессов дыхания, азотфиксации и денитрификации

определяли общепринятыми газохроматографически-ми методами [6].

Результаты и их обсуждение

Численность и состав бактерий гидролитического комплекса. В результате определения численности бактерий методом посева было установлено, что внесение сахарозы отрицательно повлияло на численность целлюлозоразрушающих бактерий. В контрольной почве численность бактерий составляла 1,8 млн КОЕ/г почвы. При внесении сахарозы она уменьшилась в 30 раз и составила 60 тыс. КОЕ/г почвы. Это связано, по-видимому, с проявлением эффекта катаболитной репрессии [4]. Внесение сахара в почву не повлияло на количество пектинолитиче-ских и амилолитических бактерий. Оно колебалось в разных вариантах опыта от 8 до 11 млн КОЕ/г на среде с пектином и от 5 до 12 млн КОЕ/г на среде с крахмалом. Наличие или отсутствие эктомикоризных корней ели на численность бактерий гидролитического комплекса не влияло.

Определение таксономического состава бактерий на средах с разными источниками углерода показало, что на таковых с крахмалом и пектином бактерии были представлены преимущественно ак-тиномицетами и бациллами (Bacillus, Streptomyces). На среде с карбоксиметилцеллюлозой спектр родов бактерий гидролитического блока был значительно шире и включал роды Cytophaga, Promicromonospora, Cellulomonas, Nocardia, Bacillus и Streptomyces.

Функциональное разнообразие микробных сообществ. Результат кластерного анализа спектров потребления субстратов показал четкое отличие бактериальных сообществ участков, в которые вносили сахар и присутствовали корни ели, от остальных вариантов опыта (рис. 1). По числу потребляемых субстратов, отражающему функциональное разнообразие микробных сообществ, и данных о суммарной метаболической работе можно сделать вывод, что наиболее благоприятные условия для функционирования микробных сообществ складываются в вариантах опыта с присутствием микоризных корней и внесе-

0 2Е6 4Е6 6Е6 8Е6 1Е7 1,2Е7 1,4Е7 1,6Е71,8Е7 2Е7 Таксономическое расстояние

Рис. 1. Результаты кластеризации образцов по Варду (квадрат евклидова расстояния): с — сахар, к — корни, +/— — наличие/ отсутствие, >1 и >2 — повторности

нием сахара. В вариантах без корней и без внесения сахара индексы биоразнообразия были существенно ниже. Вывод об изменении функционального разнообразия микробных сообществ следует также из результатов анализа коэффициентов ранговых распределений, на основании которых можно судить о благополучии системы в целом [1]. Параметры ранговых распределений Горленко и Ципфа указывают на относительное благополучие системы в варианте «сахар+корни», в то время как вариант с внесением сахарозы при удалении корней оказал стрессовое воздействие на систему (рис. 2).

формированием в почве с корнями более глубоких анаэробных условий (необходимых для осуществления процесса денитрификации) за счет поглощения О2 как корнями, так и эктомикоризными грибами. Вторым фактором, стимулирующим денитрифика-цию, может служить поступление в почву углерода, выделяемого эктомикоризой. В почве без корней внесение сахарозы также приводило к увеличению денитрифицирующей активности.

На эмиссию СО2 из почвы оказывали влияние как присутствие эктомикоризных корней, так и внесение сахарозы (рис. 4). Максимальное выделение СО2 из почвы зафиксировано в варианте с ее внесением. В вариантах без внесения сахарозы дыхание почвы с эктомикоризными корнями было существенно выше, чем без корней.

Рис. 2. Определение благополучия системы по разделению образцов в пространстве параметров ранговых распределений Горленко Ь) и Ципфа ^ф. Правый нижний дальний угол пространства соответствует наихудшим условиям и наоборот

Биологическая активность исследуемой почвы в разных вариантах опыта. Активность азотфиксации на участках колебалась в пределах от 7 до 23 нм ^/г • ч, положительно откликаясь на внесение сахарозы. Следует отметить также повышенную азотфик-сирующую активность почвы в варианте с удалением корней. Вероятно, это связано с замещением грибов прокариотами, большинство представителей которых обладают нитрогеназной активностью.

Максимальная денитрифицирующая активность, наоборот, наблюдалась в вариантах с присутствием корней (рис. 3). Это явление можно объяснить

Рис. 3. Денитрифицирующая активность почв

Рис. 4. Эмиссия СО2 в разных вариантах опыта

Заключение

Таким образом, в полевом эксперименте было выявлено влияние эктомикоризных корней и длительного внесения в почву легкодоступного углерода на функционирование микробных комплексов почв. Внесение раствора сахарозы оказало положительное влияние на функциональное разнообразие микробного сообщества и его активность (метаболическая работа), эмиссию углекислого газа и интенсивность процесса азотфиксации и денитрификации. Однако, судя по резкому сокращению численности целлюлозоразрушающих бактерий, при добавлении сахара в почву замедляется процесс бактериальной деструкции целлюлозы в исследуемой почве, что связано, вероятно, с явлением катаболитной репрессии. Действительно, скорость деструкции разных видов растительного опада существенно снижалась при внесении в почву доступного углерода [8].

Наличие в почве эктомикоризных корней способствовало увеличению интенсивности почвенного дыхания, денитрифицирующей активности, суммарной метаболической работы микробного сообщества, но при этом тормозился процесс азотфиксации. Удаление корней никак не сказалось на численности бактерий гидролитического блока и не оказало отрицательного воздействия на бактериальную деструкцию растительных остатков.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Горленко М.В., Кожевин П.А. Мультисубстратное тестирование природных микробных сообществ. М., 2005.

2. Горленко М.В., Кожевин П.А., Терехов А.С. Способ мультисубстратного тестирования микробных сообществ и его применение. Патент на изобретение № 2335543 (Государственный реестр изобретений Российской Федерации 10.10.2008. Бюл. 28).

3. Горленко М.В., Терехов А. С., Марченко С.А. и др. Индикация загрязнения почвы полициклическими ароматическими углеводородами по функциональной реакции почвенного микробного комплекса // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 17. Почвоведение. 2003. № 1.

4. Гузев В.С., Бызов Б.А. Катаболитная репрессия как один из механизмов микробостазиса почвы // Эксперим. анабиоз. Рига, 1984.

5. Лысак Л.В., Добровольская Т.Г., Скворцова И.Н. Методы оценки бактериального разнообразия почв и идентификации почвенных бактерий. М., 2003.

6. Методы почвенной микробиологии и биохимии. М., 1991.

7. Определитель бактерий Берджи (В 2-х т.). М., 1997.

8. Чигинева Н.И., Александрова А.В., Сидорова И.И., Тиунов А.В. Влияние легкодоступного углерода на состав сообщества микромицетов и скорость деструкции растительного опада в почве // Микология и фитопатология. 2007. Т. 41, № 5.

9. Baar J., Stanton N.L. Ectomycorrhizal fungi challenged by saprotrophic basidiomycetes and soil microfungi under different ammonium regimes in vitro // Mycol. Res. 2000. Vol. 104.

10. Boer W. de, Folman L.B., Summerbell R.C., Boddy L. Living in a fungal world: impact of fungi on soil bacterial niche development // FEMS Microbiol. Rev. 2005. Vol. 29.

11. Cairney J.W.G., MehargA.A. Interactions between ecto-mycorrhizal fungi and soil saprotrophs: implications for decomposition of organic matter in soils and degradation of organic pollutants in the rhizosphere // Can. J. Bot. 2002. Vol. 80.

12. Dalenberg J.W., Jager G. Priming effect of some organic additions to 14C-labeled soil // Soil Biol. Biochem. 1989. Vol. 21.

13. Daufresne T., Loreau M. Ecological stoichiometry, primary producer-decomposer interactions, and ecological persistence // Ecology. 2001. Vol. 82.

14. Dighton J., Thomas E.D., Latter P.M. Interaction between tree roots, mycorrhizas, a saprotroph and the decomposition of organic substrates in a microcosm // Biology and fertility of soils. 1987. N 4.

15. Entry J.A., Rose C.L., Cromack K.Jr. Litter decomposition and nutrient release in ectomycorrhizal mat soils of a Dougas-fir ecosystem // Soil Biol. Biochem. 1991. Vol. 23.

16. Gadgil R.L., Gadgil P.D. Mycorrhizal and litter decomposition // Nature. 1971. Vol. 233.

17. Godbold D.L., Hoosbeek M.R., Lukac M. et al. Mycor-rhizal hyphal turnover as a dominant process for carbon input into soil organic matter // Plant and Soil. 2006. Vol. 281.

18. Iverson C.M., Ledford J., Norby R.J. CO2 enrichment increases carbon and nitrogen input from fine roots in a deciduous forest // New Phytol. 2008. Vol. 179.

19. Kauri T. Seasonal fluctuations in numbers of aerobic bacteria and their spores in four horizons of a beech forest soil // Soil Biol. Biochem. 1982. Vol. 14.

20. Koide R.T., Wu T. Ectomycorrhizas and retarded decomposition in a Pinus resinosa plantation // New Phytol. 2003. Vol. 158.

21. Kuzyakov Y., Friedei J.K., Stahr K. Review of mechanisms and quantification of priming effect // Soil Biol. Biochem. 2000. Vol. 32. P. 1485-1498.

22. LevalR.Y. de. A microbiological study of the rhizosphere of poplar // Plant and Soil. 1969. Vol. 1.

23. Nobili M., Contin M., Mondini C. et al. Soil microbial biomass is trigged into activity by trace amounts of substrate // Soil Biol. Biochem. 2001. Vol. 33.

24. Paterson E., Midwood A.J., Millard P. Through the eye of the needle: a review of isotope approaches to quantify mi-crobial processes mediating soil carbon balance // New Phytol. 2009. Vol. 184.

25. Wu J., Brookes P.C., Jenkinson D.S. Formation and destruction of microbial biomass during the decomposition of glucose and ryegrass in soil // Soil Biol. Biochem. 1993. Vol. 25.

Поступила в редакцию 30.10.2009

IMPACT OF THE LONG-TERM SUCROSE ADDITION AND ECTOMYCORRHIZAL ROOTS ON THE FUNCTIONING OF MICROBIAL COMMUNITIES IN SODDY-PODZOLIC SOILS

T.G. Dobrovolskaya, M.V. Gorlenko, A.L. Stepanov, S.A. Nesterov, A.V. Tiunov

A long-term field experiment demonstrated that chronic sugar addition into soil led to a sharp reduction in the number of cellulose-degrading bacteria but general functional diversity of the soil microbial community increased, along with the increase in soil respiration, nitrogen fixation and denitrification. The exclusion of ectomycorrhizal spruce roots stimulated nitrogen fixation, decreased soil respiration and denitrification, but did not affect the density of hydrolytic bacteria.

Key words: soil microbial complex, functional diversity, biological activity, catabolic repression, ectomycorrhizal roots, hydrolytic bacteria, decomposition, soil respiration.

Сведения об авторах. Добровольская Татьяна Глебовна, канд. биол. наук, вед. науч. сотр. каф. биологии почв ф-та почвоведения МГУ; тел.: 939-43-15, e-mail: dobrtata@mail.ru. Горленко Михаил Владимирович, канд. биол. наук, науч. сотр. каф. биологии почв ф-та почвоведения МГУ; тел.: 939-35-98, e-mail: gorlenko@soil.msu.ru. Степанов Алексей Львович, докт. биол. наук, профессор каф. биологии почв ф-та почвоведения МГУ; тел.: 939-34-05, e-mail: stepanov@msu. ru. Тиунов Алексей Владимирович, докт. биол. наук, вед. науч. сотр. лаборатории почвенной зоологии и общей энтомологии Института проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова; тел.: 958-14-49, e-mail: tiunov@sevin.ru. Нестеров Сергей Александрович, студент каф. биологии почв ф-та почвоведения МГУ.