Ингибирование протеолитических и сахаролитических ферментов Pseudomonas aeruginosa под действием экстракта шунгита

РГПУ-186 - устраняют циклофосфановую депрессию (р2<0,05), но уровень антиэритроцитарных антител остается ниже (на 30%) значений в 1-ой контрольной группе (р1>0,05). Химическое соединение РГПУ-190 статистически значимого влияния на процесс образования антител не оказывает (р2>0,05).

Таблица

Влияние баклофена и его производных на показатели иммунологической реактивности при ЦФА-иммуносупрессии

Статистические показатели относительно контроля 1 (11 и р1 ) и контроля 2 (12

Как видно из представленных в табл. результатов, бак-лофен, а также изучаемые химические соединения РГПУ-184, РГПУ-185, РГПУ-186 и РГПУ-190 в условиях иммуносупрессии не только статистически достоверно восстанавливают (от р2<0,05 до р2<0,001) клеточную реакцию иммунного ответа, но и стимулируют (р1<0,05) процесс образования клона анти-генспецифических Т-лимфоцитов, что проявляется увеличением индекса РГЗТ. Производное баклофена под лабораторным шифром РГПУ-188 также устраняет супрессивное действие циклофосфамида на формирование РГЗТ (р2<0,05), но стимулирующего действия не проявляет (р1<0,05).

Баклофен и все изучаемые производные в используемых дозах устраняют ингибирующее влияние циклофосфамида на лимфопролиферативные процессы в органах иммунной системы: показатели массы селезенки (более чем на 30%) и тимуса (более чем на 20%) статистически достоверно превышают таковые у мышей с моделью иммунодепрессии (р2<0,05). Производные баклофена под шифрами РГПУ-186, РГПУ-188 и РГПУ-190 проявляют в отношении массы селезенки также значимый стимулирующий эффект, что выражается в достоверном увеличении показателя по сравнению с 1-й контрольной группой (р1<0,05). Следует отметить, что действие баклофена и всех изучаемых в данной работе производных на фоне циклофосфа-мидных нарушений направлено на стимуляцию процессов формирования ядросодержащих клеток в лимфоидных органах, что проявляется в статистически достоверном увеличении тимоцитов (более чем на 40%) и спленоцитов (более чем на 30%) в сравнении с контролем (от р1<0,05 до р1<0,001).

Как показал анализ полученных в ходе эксперимента результатов, применение баклофена и его производных под лабораторными шифрами РГПУ-184, РГПУ-185, РГПУ-186, РГПУ-188 и РГПУ-190, способствует устранению фармако-индуцированной иммунологической недостаточности, что свидетельствует о наличии у изучаемых соединений иммунокорригирующих свойств, которые, вероятно, обусловлены

(учитывая механизм действия оригинального препарата) воздействием на ГАМКБ-рецепторы иммунокомпетентных органов и активацией ГАМК-ергической системы.

Литература

1.Девойно Л. и др. // Нейроиммунол.- 2005.- №1.— С.1-8.

2.Идова Г.В. Механизмы нейроиммуномодуляции серото-нинергической, допаминергической и ГАМК-ергической системами: Дис. ... д.б.н.— Новосибирск, 1993.

3.Калуев А.В. // Нейронауки.— 2006.— №2 (4).— С. 29—42.

4.Насонова В.А. и др. // Вест. РАН.— 1994.— № 1.— С. 4—7.

5.Полетаев А.Б. и др.Регуляторная метасистема (иммуно-нейроэндокринная регуляция гомеостаза).— М.:Медицина, 2002.

6.Семъянов А.В. // Нейрофизиол.— 2002.— № 1.— С. 82—92.

7.Турищев В.Е. Влияние циклофосфана и глицифона на кинетику первичного иммунного ответа: Дис. к.м.н.— Казань, 1987.

8.Хаитов РМ. и др. // Рук-во по экспериментальному доклиническому изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Р.У. Хабриева.— М., 2005.— С. 501—514.

УДК 616.157

ИНГИБИРОВАНИЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ И САХАРОЛИТИЧЕ-СКИХ ФЕРМЕНТОВ PSEUDOMONAS AERUGINOSA ПОД ДЕЙСТВИЕМ ЭКСТРАКТА ШУНГИТА

Н. В. СЕРЕГИНА, Т. В. ЧЕСТНОВА*

В настоящее время происходят качественные изменения этиологической структуры инфекционных заболеваний, заключающиеся в превалировании условнопатогенных микроорганизмов, среди которых доминируют бактерии, представители семейства Pseudomonadaceae. Из них особенно актуальна Pseudomonas aeruginosa, которая выделяется при гнойновоспалительных процессах различной локализации. Механизмы патогенетического действия условнопатогенных бактерий разнообразны и до конца не ясны [1]. Проблема патогенности всегда была в центре интересов микробиологов. С современной науке устарел принцип, выделяющий один фактор патогенности Pseudomonas aeruginosa, определяющий явление однозначно. Число «основных факторов» часто насчитывает более десяти [1]. Практика показывает, что необходимо выделять группу факторов патогенности, создающих условия для протекания и развития инфекционного процесса. В других работах, посвященных этой проблеме, представлен материал о таких факторах патогенности, как адгезины, гемолизины и секреторные ферменты. Было доказано бактерицидное действие гетероциклических соединений, входящих в состав ацетонового экстракта.

Цель работы - изучение протеазной активности и сахаро-литических свойств Pseudomonas aeruginosa, определение влияния ацетонового экстракта органической массы шунгитовой породы (ОМШП) на ферментативные свойства бактерии.

Протеолитические и сахаролитические ферменты играют важную роль в патогенезе синегнойной инфекции. Расщепляя белковые молекулы и сахара на низкомолекулярные продукты, эти ферменты обеспечивают микробным клеткам питательные вещества, необходимые для роста и размножения. Ферменты не обладающие достаточно высокой токсической активностью, вызывают лишь местные поражения в тканях, однако именно эти поражения способствуют проникновению Pseudomonas aeruginosa в макроорганизм, его колонизации и развитию инфекционного процесса [2]. По типу катализируемых реакций протеазы относят к классу гидролаз. Гидролитические ферменты являются модельными объектами для изучения взаимосвязи между структурой белка и функцией фермента, гидролизующего его.

Материалы и методы. Изучены 20 клинических штаммов Pseudomonas aeruginosa, выделенных из ран, больных гнойновоспалительными заболеваниями (16) и от больных с воспалительными процессами мочевыводящих путей (4). Протеолитиче-ские свойства изучались на примере желатиназы. Мы использовали классический метод определения желатиназы - разжижение желатина. Производили посев уколом в столбик застывшего при

ИР ГЗТ, M±m, % Титр антител в РГПА, M m, lg Масса селезенки, М±m, мг Кол-во ЯСК в 1 мг селезенки, М±m,x105 Масса тимуса, М±m, мг Кол-во ЯСК в 1 мг тимуса, М±:ш,х104

ё а ио 11,4±0,5 1,2±0,06 102,3±3,2 2,7±0,2 38,5±1,0 3,5±0,2

ЦФА 872±076 ti=4,2 Pi<0,05 0,5±0,03 ti=10,4 Pi<0,001 84,8±3,4 ti=3,7 Pi<0,05 2±0,2 ti=2,5 Pi<0,05 31±1,4 ti=4,4 Pi<0,01 2,8±0,2 ti=2,5 Pi<0,05

баклофен +ЦФА 19,1±3,1 ti=2,5 Pi<0,05 t2=3,5 P2<0,05 1,05±0,16 ti=0,6 Pi>0,05 npi>0,05 t2=3,4 P2<0,05 118,3±13,4 ti=1,2 Pi>0,05 t2=2,4 Pi<0,05 4,3±0,6 ti=2,5 Pi<0,05 t2=3,7 P2<0,05 44,7±3,8 t1=1,6 Pi>0,05 t2=3,4 P2<0,05 14,4±3,9 ti=2,8 P2<0,05 t2=3,0 P2<0,05

РГПУ- 184 +ЦФА 25,8±3,0 ti=4,7 Pi<0,01 t2=5,7 p,<0,00i 0,83±0,12 ti=2,8 Pi<0,05 t2=2,8 P2<0,05 123±11,0 ti=1,8 Pi>0,05 t2=3,3 p?<0,05 6,3±0,9 ti=4,0 Pi<0,01 t2=4,6 p?<0,01 43,7±3,3 t1=1,5 Pi>0,05 t2=3,5 P2<0,05 7±0,6 ti=5,6 Pi>0,001 t2=6,7 p,<0,001

РГПУ- 185 +ЦФА 26,5±4,4 ti=3,4 Pi<0,05 t2=4,2 P2<0,01 1,2±0,03 ti=0 t2=17,5 P2<0,001 124,6±11,0 ti=1,95 Pi>0,05 t2=3,5 P2<0,05 5,8±0,7 ti=4,4 Pi<0,01 t2=5,4 P2<0,001 41,1±3,2 t1=0,8 Pi>0,05 t2=3,0 P2<0,05 6,1±0,9 ti=2,9 Pi>0,05 t2=3,7 P2<0,05

РГПУ- 186 +ЦФА 31,7±2,4 ti=8,5 Pi<0,001 t2=9,8 p,<0,001 0,87±0,13 ti=2,4 Pi>0,05 t2=2,8 P2<0,05 149,3±8,4 ti=5,3 Pi<0,001 t2=7,2 p,<0,001 9,0±0,9 t1=7,0 Pi<0,00i t2=10 P2<0,001 42,3±2,7 t1=1,3 Pi>0,05 t2=3,8 P2<0,05 9,4±1,0 ti=5,9 Pi>0,001 t2=6,6 p,<0,001

РГПУ- 188 +ЦФА 17,2±2,9 ti=2,0 Pi>0,05 t2=3,1 P2<0,05 1,1±0,06 ti=1,25 Pi>0,05 t2=8,9 P2<0,001 140,7±10,6 ti=3,5 Pi<0,05 t2=5,1 P2<0,00i 5,9±0,8 t1=4 Pi<0,05 t2=4,9 P2<0,01 32,6±2,3 ti=2,4 Pi>0,05 t2=0,6 P2>0,05 4,8±0,6 ti=2,0 Pi>0,05 t2=4,4 P2<0,01

РГПУ- 190 +ЦФА 18,1±1,8 ti=3,6 Pi<0,05 t2=5,2 p,<0,001 0,75±0,12 ti=3,5 Pi<0,05 t2=2,1 p?>0,05 129±10,0 ti=2,5 Pi>0,05 t2=4,2 p?<0,01 7±1,0 t1=4,3 Pi<0,01 t2=5,0 p,<0,00i 39,5±2,0 ti=0,5 Pi>0,05 t2=3,7 p?<0,05 8±0,8 ti=5,5 Pi<0,001 t2=6,3 p,<0,001

комнатной температуре 10% желатина в пептонной воде. Инкубация происходила при температуре 20-220С в течение нескольких дней. Pseudomonas aeruginosa, как строгий аэроб, способна развиваться преимущественно на поверхности питательных сред, где обеспечен широкий доступ кислорода. Для того, чтобы биохимические процессы осуществлялись не только на поверхности, но и распространялись в глубинные слои среды, мы встряхивали пробирки для равномерного распределения посевного материала. Для изучения сахаролитических свойств мы использовали набор ID 32 GN, предназначенный для автоматической идентификации грамотрицательных палочек. В состав одного из микротестов входил гликоген (GLYCOGENE). Это дегидрированный субстрат. Чтение стрипа осуществлялось автоматически через 24 часа на приборе ATB ExPression bio Merieux фотометрическим методом.

Результаты. В ходе эксперимента было установлено, что все испытуемые бактерии обладают высокой протеолитической активностью. Все штаммы Pseudomonas aeruginosa в течение 2 суток при температуре 20-220С разжижают желатин in vitro.

При добавлении к питательной среде с желатином 0,5 мл 1 и 3% ацетонового экстракта, протеолитические свойства существенно меняются. Заслуживает внимание тот факт, что при добавлении 1% ацетонового экстракта ОМШП 31,25% штаммов деградируют желатин с помощью фермента желатиназы лишь на 2 и 3 сутки. Остальные 68,75% штаммов в этих условиях желатиназу не образуют. 3% ацетоновый экстракт оказывает бактерицидное действие на Pseudomonas aeruginosa и соответственно полностью ингибирует ферментативную активность бактерий. Преобразование гликогена в нормальных условиях характерно лишь для 12,5% штаммов. Под влиянием 1 и 3% раствора экстракта ОМШП разложение гликогена не происходило.

Результаты исследования представлены в табл.

Таблица

Результаты изучения биохимической активности Pseudomonas aeruginosa, выделенных от больных с различными формами течения инфекционного процесса

Кол-во Количество штаммов, деградирующих

В обычных условиях После обработки 1% ацетоновым экстрактом

желатин гликоген желатин гликоген

Раны 16 15(93,75%)-I 1(6,25%)-II 2(12,5%)-I (-) -II 4(25%)- II 1(6,25%)-Ш В течение 7 сут. разложения не произошло 100% штаммов не разложили гликоген

Моча 4 4(100%)-I (-) -I и II 2(50%)- III В течение 7 сут. разложения не произошло 100% штаммов не разложили. гликоген

Всего: 20 (100%) После обработки 3% ацетоновым экстрактом

Рост и разжижение веществ отсутствует

Условные обозначения: I - первые сутки инкубации, II - вторые сутки, (-) -отрицательная реакция.

Гликоген является резервным полисахаридом всех живых организмов. Имеются данные, свидетельствующие о том, что по крайней мере в ряде тканей (мышцы кролика, человека, сетчатка глаз быка) полисахаридные цепи гликогена ковалентно соединены с белком, то есть гликоген является протеогликаном.

Очищенный гликоген содержит 1,5-2,0 мг белка на 100 мг глюкозы, причем отделить белковый компонент от полисахаридного не удается даже в сильно диссоциирующих условиях [2]. Гликоген подвергается гидролитическому расщеплению под действием ферментов амилаз, активными продуцентами которых являются некоторые бактерии рода Pseudomonas.

Протеолитические ферменты микробного происхождения при нарастании их количества образуют целый ряд медиаторов воспаления, ведущих к активации биохимических систем и мик-роэкологическим сдвигам. Способность к продукции ферментов патогенности является тем условием, которое обеспечивает существование бактерий на слизистых поверхностях [3, 4].

Исследуемые нами клинические штаммы Pseudomonas aeruginosa показали достаточно высокую частоту обнаружения ряда ферментов, коррелирующих с условной патогенностью, а при действии 1 и 3% ацетоноого экстракта продукция ферментов по сравнению с контролем существенно изменяется.

Результаты проведенного исследования позволяют сделать вывод о возможном участии выявленных ферментов патогенно-

сти в развитии гнойно-воспалительных процессов, хронического течения инфекции и целесообразности изучения природных веществ, влияющих на свойства штаммов Pseudomonas aeruginosa.

Литература

1. Бондаренко В.М.П Ж. микробиол..- 1999.- №5.- С. 34-39.

2. Мороз А. Ф. Синегнойная инфекция.-М.: Медици-на,1988.- С.45.

3. Мавзютов А.Р. и др.// Ж. микробиол.- 2002.- №6.- С.5-9.

4. Агапова О.В., Бандаренко В М. // Ж. микробиол.- 1998.-№2.- С.121-125.

УДК 616.157

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ АЦЕТОНОВОГО ЭКСТРАКТА ОРГАНИЧЕСКОЙ МАССЫ ШУНГИТОВОЙ ПОРОДЫ НА АДГЕЗИВНЫЕ СВОЙСТВА ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ

Н.В. СЕРЕГИНА, Т.В.ЧЕСТНОВА*

Появляются данные, касающиеся характеристики факторов вирулентности и оценке их роли в осуществлении определенных фаз развития инфекционного процесса. Инфекционный процесс одна из форм взаимодействия между микробами и макроорганизмом, сложившаяся в ходе эволюции. Адгезия является пусковым, наиболее важным этапом инфекционного процесса. Это свойство бактерий фиксироваться и размножаться, колонизируя поверхности различной природы [1, 2, 3]. Предотвращение микробной адгезии на чувствительных клетках макроорганизма является непременным условием блокирования инфекционного процесса на раннем этапе его развития, что в настоящее время учитывается при разработке специфических профилактических препаратов. Факторы адгезии к эритроцитам хорошо известны у энтеробактерий. Адгезины Escherichia coli и Klebsiella Pneumo-niae/ pneumoniae представлены фимбриями белковой природы.

Цель работы - оценка влияния ацетонового экстракта ОМШП на адгезивность энтеробактерий, вызывающих гнойновоспалительные заболевания.

Материалы и методы. В работе использовалась клиническая методология исследования, включающая микроскопические, бактериологические и математические методы. Для определения адгезивной активности в работе были использованы следующие виды энтеробактерий: Escherichia coli (20 штаммов) и Klebsiella Pneumoniae/ Pneumoniae (20 штаммов). Все бактерии были выделены из клинического материала, который обрабатывали 3% ацетоновым экстрактом ОМШП. Для изучения адгезивного процесса бактерий использованы методические рекомендации №286/7 «Выявление гемолитических, адгезивных и энтеротоксиген-ных свойств энтеробактерий» [4] и доступная и более информативная методика В.И. Брилиса, Т.А. Брилене, Х.П. Ленцнера [5]. Схема исследования адгезивности включала два метода. Экспресс-метод предназначен для визуального определения адгезивной активности (качественный метод). Методика В.И. Брилиса, Т.А. Брилене, Х.П. Ленцнера более точна и является количественным способом изучения адгезии с помощью показателей:

1) СПА (средний показатель адгезии) - это среднее количество микробов, прикрепившихся к одному эритроциту при подсчете не менее 25 эритроцитов, учитывая не более 5 эритроцитов в одном поле зрения. Средний показатель адгезии составляет: нулевая - 0-1,0, низкая - 1,01-2,0, средняя - 2,01-4,0, высокая -свыше 4

2) К (коэффициент участия эритроцитов в адгезивном процессе) - это процент эритроцитов, имеющих на своей поверхности адгезированные микробы.

3) ИАМ (индекс адгезивности микроорганизма) - это среднее количество микробных клеток на одном участвующем в адгезивном процессе эритроците, исчисляется по формуле:

CnA -100

И AM -

К

Бактерия считается неадгезивной при ИАМ < 1,75; низкоадгезивной от 1,76-2,5; среднеадгезивной при 2,51-4,0; высокоадгезивной при ИАМ выше 4,0. Клеточным субстратом служили