СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММЫ ФЛАВОНОИДОВ В ТРАВЕ МОНАРДЫ ДУДЧАТОЙ
METHOD FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF SUM OF FLAVONOIDS IN WILD BERGAMOT HERB

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в центрах контроля качества лекарственных средств и контрольно-аналитических лабораториях при проведении количественного определения суммы флавоноидов в траве монарды дудчатой (Monarda fistulosa L.).
Действующая система контроля качества лекарственных препаратов требует постоянного усовершенствования подходов к стандартизации биологически активных соединений (БАС) с использованием современных методов анализа и актуальных данных об их физико-химических, спектральных и фармакологических свойствах, позволяющих объективно и селективно определять содержание целевых веществ (1).
Трава монарды дудчатой (Monarda fistulosa L.) является перспективным источником БАС, обладающим антимикробным, противовоспалительным, фунгицидным, антигельминтным, спазмолитическим, антисеборейным действием. Однако проблема стандартизации данного вида сырья остается не решенной (2).
Известен способ количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин в траве монарды дудчатой с использованием дифференциальной спектрофотометрии (3). Данная методика включает такие стадии, как трехкратную экстракцию сырья 70% этиловым спиртом, реакцию комплексообразования с хлоридом алюминия, измерение оптической плотности электронного спектра испытуемого раствора при аналитической длине волны 390 нм и расчет содержания суммы флавоноидов на основе значений оптической плотности комплекса государственного стандартного образца рутина с алюминием хлоридом.
Данный метод взят нами в качестве прототипа. Недостатками этого метода являются низкая специфичность, неполнота экстракции (экстрагент выбран не оптимальный), трудоемкость методики (трехкратная экстракция сырья) и невозможность определения в анализируемом сырье суммы флавоноидов в пересчете на вещество, специфическое для травы монарды дудчатой, так рутин в данных условиях спектрофотометрии имеет максимум поглощения в области 412-415 нм.
Таким образом, целью изобретения является разработка способа количественного определения суммы флавоноидов в траве монарды дудчатой, обладающего более высокой специфичностью и точностью.
Техническим результатом является создание способа количественного определения суммы флавоноидов в траве монарды дудчатой в пересчете на цинарозид.
Технический результат достигается тем, что экстракцию сырья осуществляют однократно, в качестве экстрагента используют этиловый спирт в концентрации 60% в соотношении «сырье-экстрагент» - 1:50, количественное определение суммы флавоноидов в траве монарды дудчатой проводят при длине волны 394 нм в пересчете на цинарозид; содержание суммы флавоноидов (X в процентах) в пересчете на цинарозид и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:
где D - оптическая плотность испытуемого раствора;
o
D - оптическая плотность раствора Государственного стандартного образца цинарозида;
m - масса сырья, г;
o
m - масса Государственного стандартного образца цинарозида, г;
W - потеря в массе при высушивании, %.
В случае отсутствия стандартного образца цинарозида для расчета целесообразно использовать теоретическое значение его удельного показателя поглощения, равное 350:
где D - оптическая плотность испытуемого раствора;
m - масса сырья, г;
350 - удельный показатель поглощения ( - оптическая плотность раствора вещества с концентрацией 1 г/100 мл в кювете с толщиной слоя 1 см) Государственного стандартного образца цинарозида при длине волны 394 нм;
W - потеря в массе при высушивании, %.
При изучении спектральных характеристик было выявлено, что именно цинарозид определяет характер кривой поглощения водно-спиртового извлечения из травы монарды дудчатой. Определено, что в УФ-спектре водно-спиртового извлечения монарды дудчатой наблюдается батохромный сдвиг длинноволновой полосы флавоноидов Фигура 1, как и в случае цинарозида Фигура 2, где кривая 1 на фигуре 1 и фигуре 2 демонстрирует исходный раствор водно-спиртового извлечения из травы монарды дудчатой или исходный раствор цинарозида соответственно, а кривая 2 - раствор водно-спиртового извлечения из травы монарды дудчатой в присутствии алюминия хлорида или раствор цинарозида в присутствии алюминия хлорида соответственно.
Изучение УФ-спектров фигуры 2 (где кривая 1 - раствор цинарозида, а кривая 2 - раствор цинарозида с добавлением алюминия хлорида) показало, что раствор ГСО цинарозида в присутствии алюминия хлорида имеет максимум поглощения при длине волны 394 нм. В УФ-спектре водно-спиртового извлечения из травы монарды дудчатой в дифференциальном варианте на фигуре 3 так же обнаруживается при длине волны 394 нм максимум поглощения, который соответствует максимуму спиртового раствора цинарозида.
Данный факт позволяет проводить спектрофотометрическое определение суммы флавоноидов в траве монарды дудчатой при аналитической длине волны 394 нм.
Также нами было изучено влияние экстрагента на процесс экстракции. В таблице 1 представлена зависимость выхода флавоноидов травы монарды дудчатой от концентрации экстрагента. В результате эксперимента в качестве оптимального экстрагента нами был выбран 60% этиловый спирт, так как выход действующих веществ из сырья при его использовании максимален.
Далее нами был изучен вопрос относительно продолжительности экстракции на кипящей водяной бане, в таблице 2 представлена зависимость выхода флавоноидов травы монарды дудчатой от времени экстракции на кипящей водяной бане, при этом было выбрано время экстракции 60 минут.
В таблице 3 представлена зависимость выхода флавоноидов травы монарды дудчатой от соотношения «сырье-экстрагент». Из таблицы видно, что максимальный выход действующих веществ наблюдается при соотношении «сырье-экстрагент» 1:50, по этой причине данное соотношение было выбрано нами в качестве оптимального.
Учитывая, что увеличение числа операций на стадии пробоподготовки ведет к возрастанию ошибки, выбор сделан в пользу одностадийного процесса экстракции с подтверждением требуемой точности количественного определения.
Таким образом, было определено, что оптимальными параметрами экстракции являются: однократное извлечение 60% этиловым спиртом на кипящей водяной бане в течение 60 минут в соотношении «сырье-экстрагент» - 1:50.
Принимая по внимание тот факт, что специфическим для травы монарды дудчатой является цинарозид, а максимумы поглощения раствора цинарозида и водно-спиртового извлечения травы монарды дудчатой находятся в области 394 нм, целесообразным является определение содержания суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид при длине волны 394 нм.
Способ реализуется следующим образом.
Аналитическую пробу сырья травы монарды дудчатой измельчают до размера частиц 1 мм. Около 1 г точная навеска измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл 60% этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарирных весах с точностью до ±0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 60 минут. Затем колбу охлаждают в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через фильтр с красной полосой (извлечения из травы).
Испытуемый раствор для анализа суммы флавоноидов готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки 96% этиловым спиртом (испытуемый раствор).
Раствор сравнения готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу на 50 мл, доводят объем раствора до метки 96% этиловым спиртом (раствор сравнения).
Для расчета содержания суммы флавоноидов готовят раствор стандартного образца цинарозида, добавляют к нему 3% спиртовой раствор алюминия хлорида, измеряют оптическую плотность окрашенного комплекса при аналитической длине волны 394 нм и определенное значение оптической плотности используют в формуле расчета.
Приготовление раствора стандартного образца цинарозида
Около 0,0025 г точная навеска цинарозида помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 30 мл 70% этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимого колбы до комнатной температуры доводят объем раствора 70% этиловым спиртом до метки (раствор А цинарозида). После чего 5 мл раствора А цинарозида помещают в мерную колбу на 25 мл, добавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96% (испытуемый раствор Б цинарозида). Раствор сравнения готовят следующим образом: 5 мл полученного раствора помещают в мерную колбу на 25 мл, доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96%.
Измерение оптической плотности проводят при длине волны 394 нм через 40 минут после приготовления всех растворов.
Содержание суммы флавоноидов (X в процентах) в пересчете на цинарозид и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:
где:
D - оптическая плотность испытуемого раствора;
o
D - оптическая плотность раствора Государственного стандартного образца цинарозида;
m - масса сырья, г;
o
m - масса Государственного стандартного образца цинарозида, г;
W - потеря в массе при высушивании, %.
В случае отсутствия стандартного образца цинарозида для расчета целесообразно использовать теоретическое значение его удельного показателя поглощения, равное 350:
где:
D - оптическая плотность испытуемого раствора;
m - масса сырья, г;
350 - удельный показатель поглощения ( - оптическая плотность раствора вещества с концентрацией 1 г/100 мл в кювете с толщиной слоя 1 см) Государственного стандартного образца цинарозида при длине волны 394 нм;
W - потеря в массе при высушивании, %.
Предлагаемый способ поясняется следующими примерами.
Пример 1.
Аналитическую пробу сырья монарды дудчатой измельчают до размера частиц 1 мм (заготовлено в г. Самаре, Ботанический сад, июль 2017 г.). 0,9976 г измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл 60% этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарирных весах с точностью до ±0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 60 минут. Затем колбу охлаждают в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр (красная полоса).
Испытуемый раствор для анализа суммы флавоноидов готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96% (испытуемый раствор).
Раствор сравнения готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу на 50 мл, доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96% (раствор сравнения).
Для расчета содержания суммы флавоноидов готовят раствор стандартного образца цинарозида, добавляют к нему 3% спиртовой раствор хлорида алюминия, измеряют оптическую плотность окрашенного комплекса при длине волны 394 нм и определенное значение оптической плотности используют в формуле расчета.
Приготовление раствора стандартного образца цинарозида.
0,0026 г цинарозида помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в 15 мл 70% этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимого колбы до комнатной температуры доводят объем раствора 70% этиловым спиртом до метки (раствор А цинарозида). После чего 5 мл раствора А цинарозида помещают в мерную колбу на 25 мл, добавляют 1 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида, затем доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96%. Раствор сравнения готовят следующим образом: 5 мл полученного раствора помещают в мерную колбу на 25 мл, доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96%.
Измерение оптической плотности проводят при длине волны 394 нм через 40 минут после приготовления всех растворов.
Содержание суммы флавоноидов (X в процентах) в пересчете на цинарозид и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:
где:
0,567 - оптическая плотность испытуемого раствора;
0,7812 - оптическая плотность раствора стандартного образца цинарозида;
0,9976 - масса сырья, г;
0,0026 - масса стандартного образца цинарозида, г.
5 - потеря в массе при высушивании, %.
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид = 4,27%.
Пример 2.
При необходимости определения суммы флавоноидов в траве монарды дудчатой в отсутствии стандартного образца цинарозида, необходимо провести все действия из примера 1 до приготовления раствора стандартного образца цинарозида.
После измерения оптической плотности извлечения из травы монарды дудчатой при длине волны 394 нм, содержание суммы флавоноидов (X в процентах) в пересчете на цинарозид и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле, используя теоретическое значение удельного показателя поглощения цинарозда, равное 350:
где:
0,567 - оптическая плотность испытуемого раствора;
0,9976 - масса сырья, г;
350 - удельный показатель поглощения ( - оптическая плотность раствора вещества с концентрацией 1 г/100 мл в кювете с толщиной слоя 1 см) Государственного стандартного образца цинарозида при длине волны 394 нм;
5 - потеря в массе при высушивании, %.
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на цинарозида = 4,27%, что совпадает со значением, полученном в примере 1.
Все результаты были статистически обработаны. Ошибка единичного количественного определения составила ±1,57%.
Таким образом, предлагаемый способ количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид в траве монарды дудчатой с использованием дифференциальной спектрофотометрии разработан впервые для данного вида сырья и обладает следующими преимуществами:
1. Разработанный метод является более специфичным и селективным, а также позволяет проводить экстракцию сырья однократно, поскольку в качестве экстрагента используется 60% этиловый спирт, позволяющий исчерпывающе извлекать целевые вещества (флавоноиды).
2. Пересчет суммы флавоноидов идет на специфическое для травы монарды дудчатой вещество - цинарозид.
3. Ошибка единичного определения предлагаемого способа составляет ±1,57% (в прототипе данное значение составляет ±2,14%), что свидетельствует об объективности разработанного способа и более высокой точности.
Этот способ можно применять в центрах контроля качества лекарственных средств, на фармацевтических предприятиях и контрольно-аналитических лабораториях при проведении количественного анализа травы монарды дудчатой (Monarda fistulosa L.).
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Куркин В.А. Фармакогнозия. Учебник для студентов фармацевтических вузов (факультетов). - 3-е изд., перераб. и доп. - Самара: ООО «Офорт»; ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России, 2016. - 1279 с.
2. Куркин В.А. Основы фитотерапии: учебное пособие. - Самара: ООО «Офорт»; ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава», 2009. - 963 с.
3. Саргсян Е.Э., Никитина А.С., Степанюк С.Н. Изучение флавоноидов травы монарды дудчатой (Monarda fistulosa L.). В сборнике: Беликовские чтения материалы IV Всероссийской научно-практической конференции. 2015. - 128-129 с.