Фотоактивированное химическое обесцвечивание красителей

1. Способ зондирования многочисленных мишеней в биологическом образце, включающий:
(а) связывание по меньшей мере одного зонда с одной или более мишенями, присутствующими в биологическом образце, содержащем многочисленные мишени;
(б) обнаружение сигнала по меньшей мере от одного зонда, связанного на стадии (а);
(в) приведение образца, содержащего связанный зонд со стадии (а), в контакт с реагентом переноса электронов и добавкой, которая препятствует модификации мишени на стадии (г) ниже;
(г) облучение образца со стадии (в);
(д) связывание по меньшей мере одного зонда с одной или более мишенями, присутствующей в образце со стадии (г); и
(е) обнаружение сигнала от зонда, связанного на стадии (д).
2. Способ по п. 1, где зонд на стадии (а) содержит генератор оптического сигнала и сигнал, обнаруживаемый на стадии (б), представляет собой оптический сигнал.
3. Способ по п. 2, где зонд на стадии (а) содержит генератор флуоресцентного сигнала и сигнал, обнаруживаемый на стадии (б), представляет собой флуоресцентный сигнал.
4. Способ по п. 1, где облучение образца на стадии (г) осуществляют в присутствии буфера при pH 5-9.
5. Способ по п. 1, где облучение образца на стадии (г) осуществляют посредством воздействия на образец света с длиной волны 350 нм -1,3 мкм.
6. Способ по п. 5, где облучение образца на стадии (г) осуществляют путем воздействия света с длиной волны 400-700 нм на образец.
7. Способ по п. 1, где реагент переноса электронов представляет собой боратную соль, представленную следующей структурной формулой:
1
2
3
1
4
1
4
1
4
где каждый из R, R и R независимо представляет собой алкил, алкенил, алкинил, арил или гетероарил, где указанный алкил, алкенил, алкинил, арил или гетероарил возможно замещен одним или более заместителями, выбранным из группы, состоящей из (С-С)алкила, (С-С)алкокси, (С-С)алкиламино, амино, гидроксила, циано, галогена или нитро;
4
1
4
1
4
1
4
R представляет собой алкил, алкенил или алкинил, где указанный алкил, алкенил или алкинил возможно замещен одним или более заместителями, выбранным из группы, состоящей из (С-С)алкила, (С-С)алкокси, (С-С)алкиламино, амино, гидроксила, циано, галогена или нитро; и
+
М выбран из группы, состоящей из органических и неорганических катионов.
1
2
3
4
8. Способ по п. 7, где каждый из R, R и R представляет собой возможно замещенный арил, и R представляет собой возможно замещенный алкил.
1
2
3
4
9. Способ по п. 8, где каждый из R, R и R представляет собой незамещенный фенил, и R представляет собой незамещенный бутил, и боратная соль представляет собой трифенилбутилборатную соль.
10. Способ по п. 1, где указанный зонд представляет собой морфологический краситель.
11. Способ по п. 3, где реагент переноса электронов представляет собой боратную соль с высокой растворимостью в воде.
12. Способ по п. 11, где боратная соль с высокой растворимостью в воде представляет собой тетра-н-бутилборатную соль, фенил-трис-2-(4-метоксиPEG(10)метилфенил)этилборатную соль или дифенил-бис-2-(4-(метоксиPEG(10)метил)фенил)этилборатную соль.
13. Способ по п. 1, где стадии (в)-(е) повторяют один раз или более.
14. Способ по п. 1, где стадии (в) и (г) осуществляют в течение от примерно 100 мс до примерно 15 мин.
15. Способ по п. 1, дополнительно включающий, после стадии (г), промывку образца промывным раствором, который эффективно удаляет остаточные реагенты переноса электронов из образца.
16. Способ по п. 15, где указанный промывной раствор содержит активизатор.
17. Способ по п. 1, где каждый из зонда на стадии (а) и зонда на стадии (д) содержит генератор сигнала, где генератор сигнала на стадии (а) отличается от генератора сигнала на стадии (д).
18. Способ по п. 1, где облучение образца на стадии (г) инициирует фотореакцию, которая, по существу, инактивирует генератор сигнала посредством фотоактивируемого химического обесцвечивания.
19. Способ по п. 1, где после стадии (г) детектируемый сигнал не наблюдается.
20. Способ по п. 1, где добавка, которая препятствует модификации мишени, представляет собой акцептор свободных радикалов.
21. Способ по п. 20, где акцептор свободных радикалов выбран из группы, состоящей из аскорбиновой кислоты, н-пропилгаллата, меркаптоэтанола, цистеина гидрохлорида, трет-бутилгидрокситолуола, циклогептатриена, диоктилфталата, 1,4-дигидро-орто-толуамида, α-токоферола и тролокса.
22. Способ по п. 1, где добавка, которая препятствует модификации мишени, представляет собой гаситель синглетного кислорода.
23. Способ по п. 22, где гаситель синглетного кислорода выбран из группы, состоящей из аскорбиновой кислоты, α-токоферола, куркумина и DABCO.
24. Способ зондирования многочисленных мишеней в биологическом образце, включающий:
(а) связывание многочисленных зондов с многочисленными мишенями, присутствующими в биологическом образце, где многочисленные зонды включают первую группу зондов и вторую группа зондов;
(б) обнаружение первой группы сигналов от первой группы зондов, связанных на стадии (а);
(в) приведение образца, содержащего связанный зонд со стадии (а), в контакт с реагентом переноса электронов и добавкой, которая препятствует модификации мишени на стадии (г) ниже;
(г) облучение образца со стадии (в);
(д) генерирование второй группы сигналов от второй группы зондов, связанных на стадии (а);
(е) обнаружение второй группы сигналов.
25. Способ высокопроизводительного мультиплексного анализа биологического образца, включающий:
процесс циклизации сигнала, где в каждом цикле после окрашивания и визуализации следует применение реагента переноса электронов и добавки, которая препятствует модификации мишени, и облучение биологического образца.
26. Способ по п. 25, обеспечивающий быструю циклизацию сигнала без значительной модификации компонентов биологического образца, отличных от зонда.
27. Ряд из по меньшей мере двух изображений, демонстрирующих оптически меченные биологические мишени, где:
эти изображения получены в процессе зондирования многочисленных мишеней в биологическом образце и где этот процесс включает:
(а) связывание по меньшей мере одного оптического зонда с одной или более мишенями, присутствующими в биологическом образце, содержащем многочисленные мишени;
(б) обнаружение сигнала от оптического зонда, связанного на стадии (а);
(в) приведение образца, содержащего связанный оптический зонд со стадии (а), в контакт с реагентом переноса электронов и добавкой, которая препятствует модификации мишени на стадии (г) ниже;
(г) облучение образца со стадии (в);
(д) связывание по меньшей мере одного оптического зонда с одной или более мишенями, присутствующими в образце со стадии (г); и
(е) обнаружение сигнала от оптического зонда, связанного на стадии (д).
28. Способ по п. 1, где связующий агент и генератор сигнала воплощены в одной группировке.
29. Способ по п. 28, где одна группировка представляет собой зонд, имеющий малую молекулу.
30. Способ по п. 29, где зонд, имеющий малую молекулу, представляет собой органический краситель.
31. Способ по п. 30, где органических краситель связывается с конкретными структурами или белками в образце.
32. Набор для обесцвечивания сигнала для зондирования многочисленных мишеней в биологическом образце, содержащий:
реагент переноса электронов, который при контакте с генератором сигнала способен обесцвечивать генератор сигнала при облучении; и
добавку, которая препятствует модификации мишени во время фотоактивированного химического обесцвечивания генератора сигнала.
33. Способ использования набора по п. 32 для гашения сигнала, чтобы сделать возможным процесс циклизации сигнала для зондирования многочисленных мишеней в биологическом образце, включающий: после обнаружения сигнала от по меньшей мере одного зонда, связанного с одной или более мишенями, присутствующими в биологическом образце, приведение образца в контакт с реагентом переноса электронов и добавкой, которая препятствует модификации мишени; и облучение образца.
34. Автоматизированный способ фотоактивированного химического обесцвечивания биологического образца, загруженного/захваченного в устройство с проточной кюветой, включающий следующие автоматизированные стадии:
(а) связывание по меньшей мере одного зонда с одной или более мишенями, присутствующими в биологическом образце;
(б) обнаружение сигнала от по меньшей мере одного зонда, связанного на стадии (а);
(в) заполнение проточной кюветы реагентом переноса электронов и возможно добавкой, которая препятствует модификации мишени во время последующего облучения образца;
(г) облучение образца путем воздействия света для инактивирования сигналов от зонда;
(д) возможно вымывание реагента переноса электронов и добавки и
(е) повторение стадий (а) и (б) по меньшей мере с одним другим зондом во время другого раунда визуализации.
35. Автоматизированный способ фотоактивированного химического обесцвечивания по п. 34, где облучения образца осуществляют путем воздействия света на конкретные участки образца с использованием оптических фильтров, объектива микроскопа и продольного стола.
36. Автоматизированный способ фотоактивированного химического обесцвечивания по п. 34, где облучения образца осуществляют путем воздействия света сразу на весь образец.