Мультиплексный электрохимический биочип для выявления опухолеассоциированных белков-биомаркеров рака легкого

Полезная модель относится к области биотехнологии, а именно к электрохимическим чипам для выявления белков-биомаркеров рака легкого в плазме больных.
Известен биочип для мультиплексного анализа (RU 142470 U1 G01N 33/53 27.06.2014), содержащий прозрачную подложку, выполненную из стекла с нанесенным на его поверхность полилизином, на которой размещены тестовые участки с иммобилизованными антителами, специфичными к антигенам клеток, что тестовые участки разделены пластиковыми стенками на 9 герметичных ячеек, снабжены флуоресцентными антителами к рецепторам эстрогена, прогестерона, СА-125, РЭА, СК-7, СК-20, Ber-EP4, TTF1 и WT1, закрытые сверху гидрофобной пленкой из полисилоксана, фиксированной к верхнему краю пластиковых стенок, создающих герметичные ячейки. Биочип позволяет исследовать серозную жидкость пациента для определения характера асцита (реактивный или онкологический), и первичного очага, который имеет опухоль продуцирующая асцит. Считывание и анализ результата осуществляется с использованием флуоресцентного микроскопа.
С помощью описанного биочипа с использованием флуоресцентной микроскопии невозможно проводить точную количественную оценку аналитов, связавшихся с антителами. Кроме того, используемые антитела являются дорогостоящими и требуют специальных условий хранения.
Известен также биочип, используемый в способе анализа транслокаций EML4-ALK, ассоциированных с чувствительностью рака легкого к противоопухолевой таргетной терапии, амплифицированных с помощью набора специфичных праймеров, представляющий собой пластиковую подложку с гелевыми ячейками, содержащими набор иммобилизованных зондов, комплементарных анализируемым участкам гена EML4-ALK (RU 2509153 C1 C12N 15/00, C12Q 1/68, 10.03.2014).
Недостатком описанного биочипа является трудоемкость и временные затраты, требующиеся для проведения анализа.
На сегодняшний день существуют также электрохимические чипы для выявления мишеней в исследуемом образце, позволяющие получить результаты в течение нескольких минут.
Известны трехэлектродные биочипы, позволяющие путем измерения электрохимического сигнала выявлять белки-мишени.
Так известно устройство для реализации способа детекции специфических последовательностей нуклеиновых кислот электрохимическим методом (RU 2509157 С2; C12Q 1/68 В82В 3/00 (2006.01) G01N 27/28, 10.03.2014 Бюл. №7), представляющее собой электрохимический анализатор, состоящий из трехэлектродной электрохимической ячейки, электроды которой соединены с регистрирующим устройством, содержащим источник питания, например потенциостатом, отличающееся тем, что рабочий электрод выполнен из электропроводящей кремниевой или металлической подложки с выращенными на ней вертикально ориентированными углеродными нанотрубками, по всей поверхности которых нековалентно иммобилизован олигонуклеотидный зонд, комплементарный участку определяемой НК, или модифицированный олигонуклеотидный зонд, комплементарный участку определяемой НК; между рабочим и вспомогательным электродами расположен сепаратор.
С помощью данного электрохимического анализатора можно определять только один образец нуклеиновой кислоты, комплиментарный олигонуклеотидному зонду, которым модифицирован рабочий электрод. Это усложняет процедуру количественного выявления нескольких аналитов в образце.
Известен также биосенсор, используемый в способе электрохимической детекции последовательностей нуклеиновых кислот (RU 2470938 С2 C07F 15/00; C12Q 1/68 27.12.2012), разработанный УНИВЕРСИДАД АУТОНОМА ДЕ МАДРИД (ES). Биосенсор представляет собой набор олигонуклеотидов, иммобилизованных на твердой подложке. Содержит золотой электрод, который подготавливали посредством иммобилизации последовательности ДНК-зонда прямой адсорбцией, вспомогательный платиновый электрод и каломельный электрод - электрод сравнения.
Известный биосенсор также не позволяет проводить одновременную количественную оценку нескольких аналитов в образце.
Известен также электрохимический чип DRP-220AT (DropSens, Испания, dropsens.com © 2016 All Rights Reserved DropSens), представляющий собой керамическую подложку (3,4×1,0×0,05 см) с нанесенными на нее тремя электродами. Рабочий электрод - золотой; вспомогательный электрод - золотой; электрод сравнения - серебряный. Поверхность рабочего электрода модифицируют с помощью определенных лигандов-антител или аптамеров, специфичных к желаемому аналиту. После этого наносят исследуемый образец на поверхность рабочего электрода и проводят измерения с помощью потенциостата. Для оценки результата определяют изменение электрохимического сигнала на рабочем электроде до и после связывания мишени с модифицированной поверхностью рабочего электрода. Таким образом, выявляют заданный белок-биомаркер в плазме онкологического больного. Известный электрохимический чип принят за ближайший аналог к заявленной полезной модели
В электрохимическом чипе DRP-220AT, состоящим из трех электродов рабочий электрод модифицируют только одним лигандом, что позволяет выявлять наличие только одной мишени в образце. Количество выявляемых аналитов может быть увеличено за счет модификации рабочего электрода несколькими лигандами, однако в этом случае при определении аналитов невозможно будет дать ни качественную, ни количественную характеристику присутствия каждого конкретного аналита в образце.
Задачей заявленной полезной модели является увеличение числа одновременно выявленных белков-биомаркеров в плазме больных раком легкого и повышение тем самым, точности диагностики.
Поставленная задача решается за счет того, что мультиплексный электрохимический биочип для выявления опухолеассоциированных белков-биомаркеров рака легкого, содержащий подложку с нанесенными на нее электродами, один из которых вспомогательный электрод и один электрод сравнения, согласно заявленной полезной модели содержит шесть измерительных электродов, на рабочую поверхность каждого из измерительных электродов нанесен ДНК-аптамер, специфичный к одному заданному белку-биомаркеру плазмы больных раком легкого.
Каждый измерительный электрод, нанесенный на подложку мультиплексного электрохимического биочипа может быть выполнен трехслойным, состоящим из медного, никелевого и золотого слоев, с нанесением ДНК-аптамера, специфичного к заданному белку-биомаркеру плазмы больных раком легкого, на рабочую поверхность золотого слоя каждого из измерительных электродов.
Подложка мультиплексного электрохимического биочипа может быть выполнена из текстолита.
Технический результат полезной модели выражается в повышении точности диагностики рака легкого.
Заявляемая полезная модель поясняется чертежом, на котором представлена схема мультиплексного электрохимического биочипа для выявления опухолеассоциированных белков-биомаркеров рака легкого.
Мультиплексный электрохимический биочип для выявления опухолеассоциированных белков-биомаркеров рака легкого содержит положку 1, шесть измерительных электродов 2, электрод сравнения 3 и вспомогательный электрод 4, проводники 5, соединяющие электроды с концевыми печатными контактами 6, поле для надписей 7, ориентирующий паз 8.
Мультиплексный электрохимический биочип для выявления опухолеассоциированных белков-биомаркеров представляет собой систему трехслойных электродов на основе меди, никеля, золота с линейными размерами около 11×35 мм, нанесенных с помощью плоттера на поверхность из текстолита. Рабочая поверхность каждого измерительного электрода модифицирована биологически функциональным слоем, представляющим собой определенный ДНК-аптамер. На одном измерительном электроде закреплен один аптамер, специфичный к своему белку-онкомаркеру. ДНК-аптамер иммобилизуются (химически закрепляются) на золотой поверхности с применением тиоловых групп. На вспомогательный электрод и электрод сравнения не наносят аптамеров, данные электроды остаются чистыми. Система их использует при анализе. В заявляемом электрохимическом биочипе строение электрода сравнения и вспомогательного электрода такое же, как и у измерительных электродов.
При изготовлении мультиплексных электрохимических биочипов применяют технологию изготовления печатных плат. Функция тонкой золотой пленки, наносимой химическим путем поверх подслоя никеля, заключается в обеспечении защиты никеля от окисления. Никель служит барьером, предотвращающим взаимную диффузию золота и меди. Сверху, за исключением рабочих поверхностей электродов, контактирующих с исследуемой биопробой, все покрывают электроизолирующим слоем лака. Перед нанесением аптамеров золотую поверхность восстанавливают. Для этого на измерительные электроды наносят смесь, состоящую из 3-х частей концентрированной серной кислоты и 1 части концентрированной перекиси водорода, после чего поверхность электрода тщательно промывают дистиллированной водой и высушивают в потоке азота. После этого на поверхность измерительных электродов наносят аптамеры, каждый из которых специфичен к определенному белку-биомаркеру плазмы рака легкого, модифицированные тиоловой группой и инкубируют 12 часов при температуре 4°С во влажной камере. Затем все электроды промывают дистиллированной водой, а на рабочие электроды наносят 2-меркаптоэтанол и инкубируют 15 минут при комнатной температуре, после чего промывают 40% этиловым спиртом и дистиллированной водой и наносят фосфатный буфер. В результате получают электроды, покрытые аптамерами, специфичными к белкам-биомаркерам рака легкого.
Мультиплексный электрохимический биочип для выявления опухолеассоциированных белков-биомаркеров рака легкого работает следующим образом. Мультиплексный электрохимический биочип устанавливают в адаптер потенциостата и погружают в буфер для измерений, содержащий соли железосинеродистого калия и железистосинеродистого калия, и измеряют электрохимические сигналы на электродах. Далее биочип извлекают, промывают и наносят на рабочую поверхность измерительных электродов плазму больных раком легкого, предварительно проинкубированную с дрожжевой РНК, выдерживают плазму крови на рабочей поверхности электродов 30 минут, смывают дистиллированной водой и вновь измеряют электрохимические сигналы на электродах. Вспомогательный электрод необходим для обеспечения возникновение тока на измерительных электродах. Электрод сравнения нужен для построения базовой линии. По изменению электрохимического сигнала судят о наличии искомых белков-биомаркеров в плазме крови больного. Каждый ДНК-аптамер, нанесенный на отдельный измерительный электрод позволяет выявить определенный белок-биомаркер. По сочетанию выявленных белков-биомаркеров диагностируют рак легкого.
Таким образом, заявляемый мультиплексный электрохимический биочип позволяет выявить не один белок-биомаркер, а одновременно несколько белков-биомаркеров рака легкого, анализ сочетания которых и позволяет повысить точность диагностики.