ДЕТЕКЦИЯ НУКЛЕОТИДНОЙ ВАРИАЦИИ В НУКЛЕИНОВОКИСЛОТНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ-МИШЕНИ В АНАЛИЗЕ С РАСЩЕПЛЕНИЕМ И УДЛИНЕНИЕМ ЗОНДИРУЮЩЕГО И МЕТЯЩЕГО ОЛИГОНУКЛЕОТИДА (РТО)

1. Способ детекции нуклеотидной вариации в нуклеиновокислотной последовательности-мишени в анализе с РТОСЕ (расщеплением и удлинением РТО), включающий:
(a) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с располагающимся "вверх по течению" олигонуклеотидом и PTO-NV (зондирующим и метящим олигонуклеотидом для нуклеотидной вариации); при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид содержит гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; PTO-NV содержит (1) 3′-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, (2) 5′-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (3) сайт распознавания нуклеотидной вариации, содержащий последовательность, комплементарную последовательности с нуклеотидной вариацией в нуклеиновой кислоте-мишени, расположенный в 5′-концевой части 3′-концевого узнающего мишень участка; при этом 3′-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5′-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно PTO-NV; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление PTO-NV ферментом, обладающим 5′-нуклеазной активностью;
(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5′-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления PTO-NV; при этом, когда PTO-NV гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой комплементарна сайту распознавания данной нуклеотидной вариации, и 5′-концевая часть 3′-концевого узнающего мишень участка образует двойную цепь с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, индуцируя расщепление, начиная с первого начального сайта расщепления, тогда высвобождается первый фрагмент; при этом, когда PTO-NV гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой не комплементарна сайту распознавания данной
нуклеотидной вариации, и 5′-концевая часть 3′-концевого узнающего мишень участка не образует двойной цепи с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, индуцируя расщепление, начиная со второго начального сайта расщепления, расположенного "вниз по течению" относительно первого начального сайта расщепления, тогда высвобождается второй фрагмент; при этом второй фрагмент содержит дополнительный 3′-концевой участок, позволяющий отличить второй фрагмент от первого фрагмента;
(c) гибридизацию фрагмента, высвободившегося из PTO-NV, с СТО (захватывающим и матричным олигонуклеотидом); при этом СТО содержит в направлении 3′→5′ (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5′-концевому тегирующему участку или части 5′-концевого тегирующего участка PTO-NV, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, некомплементарную 5′-концевому тегирующему участку и 3′-концевому узнающему мишень участку PTO-NV; при этом первый фрагмент или второй фрагмент, высвободившийся из PTO-NV, гибридизуется с захватывающим участком СТО;
(d) осуществление реакции удлинения с использованием продукта со стадии (с) и матричной полимеразы нуклеиновых кислот; при этом, когда первый фрагмент гибридизуется с захватывающим участком СТО, он удлиняется с образованием удлиненной цепи, содержащей удлиненную последовательность, комплементарную матричному участку СТО; при этом, когда второй фрагмент гибридизуется с захватывающим участком СТО, он не удлиняется; и
(e) детекцию присутствия удлиненной цепи; тем самым присутствие удлиненной цепи указывает на присутствие нуклеотидной вариации, последовательность которой комплементарна сайту распознавания данного нуклеотида в PTO-NV.
2. Способ по п. 1, где СТО имеет последовательность, выбранную такой, что СТО не гибридизуется с дополнительным 3′-концевым участком второго фрагмента, предотвращая удлинение второго фрагмента при его гибридизации с захватывающим участком СТО.
3. Способ по п. 1, где сайт распознавания нуклеотидной вариации локализован на расстоянии 10 нуклеотидов от 5′-конца 3′-концевого узнающего мишень участка в PTO-NV.
4. Способ по п. 1, где 5′-концевая часть 3′-концевого узнающего мишень участка в PTO-NV содержит группировку, не подходящую для спаривания оснований, локализованную на расстоянии 1-5 нуклеотидов от сайта
распознавания нуклеотидной вариации; при этом группировка, не подходящая для спаривания оснований, способствует установлению различий между первым начальным сайтом расщепления и вторым начальным сайтом расщепления.
5. Способ по п. 4, где присутствие группировки, не подходящей для спаривания оснований, увеличивает расстояние между первым начальным сайтом расщепления и вторым начальным сайтом расщепления.
6. Способ по п. 4, где группировка, не подходящая для спаривания оснований, представляет собой (1) нуклеотид, содержащий искусственное некомплементарное основание, основание, не подходящее для спаривания оснований, модифицированное таким образом, что оно не способно образовывать пару оснований, или универсальное основание, (2) нуклеотид, не подходящий для спаривания оснований, модифицированный таким образом, что он не способен образовывать пару оснований, или (3) химическое соединение, не подходящее для спаривания оснований.
7. Способ по п. 4, где группировка, не подходящая для спаривания оснований, содержит 1-5 группировок.
8. Способ по п. 7, где группировка, не подходящая для спаривания оснований, содержит 2-5 следующих друг за другом группировок.
9. Способ по п. 4, где сайт распознавания нуклеотидной вариации и группировка, не подходящая для спаривания оснований, локализованы в PTO-NV на расстоянии 10 нуклеотидов от 5′-конца 3′-концевого узнающего мишень участка.
10. Способ по п. 9, где сайт распознавания нуклеотидной вариации и группировка, не подходящая для спаривания оснований, локализованы в PTO-NV на расстоянии 7 нуклеотидов от 5′-конца 3′-концевого узнающего мишень участка.
11. Способ по п. 9, где сайт распознавания нуклеотидной вариации и группировка, не подходящая для спаривания оснований, локализованы в PTO-NV на расстоянии 5 нуклеотидов от 5′-конца 3′-концевого узнающего мишень участка.
12. Способ по п. 1, где нуклеотидная вариация представляет собой вариацию типа замены, вариацию типа делеции или вариацию типа вставки.
пл
13. Способ по п. 1, где удлиненная цепь первого фрагмента и СТО образуют удлиненный дуплекс на стадии (d); причем удлиненный дуплекс имеет величину Т, регулируемую (1) последовательностью и/или длиной первого фрагмента, (2) последовательностью и/или длиной СТО либо (3) последовательностью и/или длиной первого фрагмента и последовательностью и/или длиной СТО; при этом удлиненный дуплекс обеспечивает получение сигнала от мишени посредством (1) по меньшей мере одной метки, соединенной с первым
фрагментом и/или СТО, (2) метки, встраиваемой в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, (3) по меньшей мере одной метки, соединенной с первым фрагментом и/или СТО, и метки, встраиваемой в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, или (4) интеркалирующей метки; и при этом детекцию присутствия удлиненной цепи осуществляют посредством измерения сигнала от мишени, поступающего от удлиненного дуплекса, в соответствии с анализом плавления или анализом гибридизации для удлиненного дуплекса.
пл
14. Способ по п. 1, где удлиненная цепь первого фрагмента и СТО образуют удлиненный дуплекс на стадии (d); причем удлиненный дуплекс имеет величину Т, регулируемую (1) последовательностью и/или длиной первого фрагмента, (2) последовательностью и/или длиной СТО либо (3) последовательностью и/или длиной первого фрагмента и последовательностью и/или длиной СТО; при этом удлиненный дуплекс обеспечивает получение сигнала от мишени посредством (1) по меньшей мере одной метки, соединенной с первым фрагментом и/или СТО, (2) метки, встраиваемой в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, (3) по меньшей мере одной метки, соединенной с первым фрагментом и/или СТО, и метки, встраиваемой в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, или (4) интеркалирующей метки; и при этом детекцию присутствия удлиненной цепи осуществляют посредством измерения сигнала от мишени, поступающего от удлиненного дуплекса, при предварительно заданной температуре, достаточной для поддержания двойной цепи удлиненного дуплекса.
15. Способ по п. 1, где PTO-NV и/или СТО блокирован по его 3′-концу, чтобы не допустить его удлинения.
16. Способ по п. 1, где располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид представляет собой располагающийся "вверх по течению" праймер или располагающийся "вверх по течению" зонд.
17. Способ по п. 1, где располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован вблизи PTO-NV таким образом, что этот располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид индуцирует расщепление PTO-NV ферментом, обладающим 5′-нуклеазной активностью.
18. Способ по п. 16, где располагающийся "вверх по течению" праймер индуцирует посредством своей удлиненной цепи расщепление PTO-NV ферментом, обладающим 5′-нуклеазной активностью.
19. Способ по п. 1, дополнительно включающий повторение всех или некоторых из стадий (а)-(е) с денатурацией между повторяющимися циклами.
20. Способ по п. 1, который осуществляют для детекции по меньшей
мере двух типов нуклеотидных вариаций; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид содержит по меньшей мере два типа олигонуклеотидов, и PTO-NV содержит по меньшей мере два типа PTO-NV.
21. Способ по п. 1, где располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид представляет собой располагающийся "вверх по течению" праймер, и на стадии (b) для удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера используют матричную полимеразу нуклеиновых кислот; при этом матричная полимераза нуклеиновых кислот идентична ферменту, обладающему 5′-нуклеазной активностью.
22. Способ по п. 1, где располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид представляет собой располагающийся "вверх по течению" праймер, и на стадии (b) для удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера используют матричную полимеразу нуклеиновых кислот; при этом матричная полимераза нуклеиновых кислот отличается от фермента, обладающего 5′-нуклеазной активностью.
23. Способ по п. 1, где фермент, обладающий 5′-нуклеазной активностью, представляет собой термостабильную ДНК-полимеразу, обладающую 5′-нуклеазной активностью, или нуклеазу FEN.
24. Способ по одному из пп. 1-23, который осуществляют в присутствии располагающегося "вниз по течению" праймера.
25. Способ детекции нуклеотидной вариации в нуклеиновокислотной последовательности-мишени в анализе с РТОСЕ (расщеплением и удлинением РТО), включающий:
(а) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с PTO-NV (зондирующим и метящим олигонуклеотидом для нуклеотидной вариации); при этом PTO-NV содержит (1) 3′-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, (2) 5′-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (3) сайт распознавания нуклеотидной вариации, содержащий последовательность, комплементарную последовательности с нуклеотидной вариацией в нуклеиновой кислоте-Мишени, расположенный в 5′-концевой части 3′-концевого узнающего мишень участка; при этом 3′-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5′-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью;
(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5′-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления PTO-NV; при этом, когда PTO-NV гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой комплементарна сайту распознавания данной нуклеотидной вариации, и 5′-концевая часть 3′-концевого узнающего мишень участка образует двойную цепь с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, индуцируя расщепление, начиная с первого начального сайта расщепления, тогда высвобождается первый фрагмент; при этом, когда PTO-NV гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой не комплементарна сайту распознавания данной нуклеотидной вариации, и 5′-концевая часть 3′-концевого узнающего мишень участка не образует двойной цепи с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, индуцируя расщепление, начиная со второго начального сайта расщепления, расположенного "вниз по течению" относительно первого начального сайта расщепления, тогда высвобождается второй фрагмент; при этом второй фрагмент содержит дополнительный 3′-концевой участок, позволяющий отличить второй фрагмент от первого фрагмента;
(c) гибридизацию фрагмента, высвободившегося из PTO-NV, с СТО (захватывающим и матричным олигонуклеотидом); при этом СТО содержит в направлении 3′→5′ (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5′-концевому тегирующему участку или части 5′-концевого тегирующего участка PTO-NV, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, некомплементарную 5′-концевому тегирующему участку и 3′-концевому узнающему мишень участку PTO-NV; при этом первый фрагмент или второй фрагмент, высвободившийся из PTO-NV, гибридизуется с захватывающим участком СТО;
(d) осуществление реакции удлинения с использованием продукта со стадии (с) и матричной полимеразы нуклеиновых кислот; при этом, когда первый фрагмент гибридизуется с захватывающим участком СТО, он удлиняется с образованием удлиненной цепи, содержащей удлиненную последовательность, комплементарную матричному участку СТО; при этом, когда второй фрагмент гибридизуется с захватывающим участком СТО, он не удлиняется; и
(e) детекцию присутствия удлиненной цепи; тем самым присутствие удлиненной цепи указывает на присутствие нуклеотидной вариации, последовательность которой комплементарна сайту распознавания нуклеотида в
PTO-NV.
26. Набор для детекции нуклеотидной вариации в нуклеиновокислотной последовательности-мишени в анализе с РТОСЕ (расщеплением и удлинением РТО), содержащий:
(a) PTO-NV (зондирующий и метящий олигонуклеотид для нуклеотидной вариации); при этом PTO-NV содержит (1) 3′-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, (2) 5′-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (3) сайт распознавания нуклеотидной вариации, содержащий последовательность, комплементарную последовательности с нуклеотидной вариацией в нуклеиновой кислоте-мишени, расположенный в 5′-концевой части 3′-концевого узнающего мишень участка; при этом 3′-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5′-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью;
(b) располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид содержит гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно PTO-NV; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление PTO-NV ферментом, обладающим 5′-нуклеазной активностью; и
(c) СТО (захватывающий и матричный олигонуклеотид); при этом СТО содержит в направлении 3′→5′ (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5′-концевому тегирующему участку или части 5′-концевого тегирующего участка PTO-NV, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, некомплементарную 5′-концевому тегирующему участку и 3′-концевому узнающему мишень участку PTO-NV;
при этом, когда PTO-NV гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой комплементарна сайту распознавания данной нуклеотидной вариации, и 5′-концевая часть 3′-концевого узнающего мишень участка образует двойную цепь с нуклеиновокислотной последовательностью-
мишенью, индуцируя расщепление, начиная с первого начального сайта расщепления, тогда высвобождается первый фрагмент;
при этом, когда PTO-NV гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой не комплементарна сайту распознавания данной нуклеотидной вариации, и 5′-концевая часть 3′-концевого узнающего мишень участка не образует двойной цепи с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, индуцируя расщепление, начиная со второго начального сайта расщепления, расположенного "вниз по течению" относительно первого начального сайта расщепления, тогда высвобождается второй фрагмент; при этом второй фрагмент содержит дополнительный 3′-концевой участок, позволяющий отличить второй фрагмент от первого фрагмента; при этом первый фрагмент или второй фрагмент, высвободившийся из PTO-NV, гибридизуется с захватывающим участком СТО.
27. Набор по п. 26, дополнительно содержащий фермент, обладающий 5′-нуклеазной активностью, матричную полимеразу нуклеиновых кислот или их комбинацию; при этом, когда первый фрагмент гибридизуется с захватывающим участком СТО, он удлиняется с образованием удлиненной цепи, содержащей удлиненную последовательность, комплементарную матричному участку СТО; при этом, когда второй фрагмент гибридизуется с захватывающим участком СТО, он не удлиняется.
28. Набор по п. 26, где СТО имеет последовательность, выбранную такой, что СТО не гибридизуется с дополнительным 3′-концевым участком второго фрагмента, предотвращая удлинение второго фрагмента при его гибридизации с захватывающим участком СТО.
29. Набор по п. 26, где сайт распознавания нуклеотидной вариации локализован на расстоянии 10 нуклеотидов от 5′-конца 3′-концевого узнающего мишень участка в PTO-NV.
30. Набор по п. 26, где 5′-концевая часть 3′-концевого узнающего мишень участка в PTO-NV содержит группировку, не подходящую для спаривания оснований, локализованную на расстоянии 1-5 нуклеотидов от сайта распознавания нуклеотидной вариации; при этом группировка, не подходящая для спаривания оснований, способствует установлению различий между первым начальным сайтом расщепления и вторым начальным сайтом расщепления.
31. Набор по п. 30, где присутствие группировки, не подходящей для спаривания оснований, увеличивает расстояние между первым начальным сайтом
расщепления и вторым начальным сайтом расщепления.
32. Набор по п. 30, где группировка, не подходящая для спаривания оснований, представляет собой (1) нуклеотид, содержащий искусственное некомплементарное основание, основание, не подходящее для спаривания оснований, модифицированное таким образом, что оно не способно образовывать пару оснований, или универсальное основание, (2) нуклеотид, не подходящий для спаривания оснований, модифицированный таким образом, что он не способен образовывать пару оснований, или (3) химическое соединение, не подходящее для спаривания оснований.
33. Набор по п. 30, где группировка, не подходящая для спаривания оснований, содержит 1-5 группировок.
34. Набор по п. 33, где группировка, не подходящая для спаривания оснований, содержит 2-5 следующих друг за другом группировок.
35. Набор по п. 30, где сайт распознавания нуклеотидной вариации и группировка, не подходящая для спаривания оснований, локализованы в PTO-NV на расстоянии 10 нуклеотидов от 5′-конца 3′-концевого узнающего мишень участка.
36. Набор по п. 35, где сайт распознавания нуклеотидной вариации и группировка, не подходящая для спаривания оснований, локализованы в PTO-NV на расстоянии 7 нуклеотидов от 5′-конца 3′-концевого узнающего мишень участка.
37. Набор по п. 35, где сайт распознавания нуклеотидной вариации и группировка, не подходящая для спаривания оснований, локализованы в PTO-NV на расстоянии 5 нуклеотидов от 5′-конца 3′-концевого узнающего мишень участка.
38. Набор по п. 26, где нуклеотидная вариация представляет собой вариацию типа замены, вариацию типа делеции или вариацию типа вставки.
пл
39. Набор по п. 26, где удлиненная цепь первого фрагмента и СТО образуют удлиненный дуплекс; причем удлиненный дуплекс имеет величину Т, регулируемую (1) последовательностью и/или длиной первого фрагмента, (2) последовательностью и/или длиной СТО либо (3) последовательностью и/или длиной первого фрагмента и последовательностью и/или длиной СТО; при этом удлиненный дуплекс обеспечивает получение сигнала от мишени посредством (1) по меньшей мере одной метки, соединенной с первым фрагментом и/или СТО, (2) метки, встраиваемой в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, (3) по меньшей мере одной метки, соединенной с первым фрагментом и/или СТО, и метки, встраиваемой в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, или (4) интеркалирующей метки.
40. Набор по п. 26, где PTO-NV и/или СТО блокирован по его 3′-концу,
чтобы не допустить его удлинения.
41. Набор по п. 26, где располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид представляет собой располагающийся "вверх по течению" праймер или располагающийся "вверх по течению" зонд.
42. Набор по п. 26, который используют для детекции по меньшей мере двух типов нуклеотидных вариаций; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид содержит по меньшей мере два типа олигонуклеотидов, и PTO-NV содержит по меньшей мере два типа PTO-NV.
43. Набор по п. 27, где фермент, обладающий 5′-нуклеазной активностью, представляет собой термостабильную ДНК-полимеразу, обладающую 5′-нуклеазной активностью, или нуклеазу FEN.
44. Набор по любому из пп. 26-43, дополнительно содержащий расположенный "вниз по течению" праймер.
45. Набор для детекции нуклеотидной вариации в нуклеиновокислотной последовательности-мишени в анализе с РТОСЕ (расщеплением и удлинением РТО), содержащий:
(a) PTO-NV (зондирующий и метящий олигонуклеотид для нуклеотидной вариации); при этом PTO-NV содержит (1) 3′-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, (2) 5′-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (3) сайт распознавания нуклеотидной вариации, содержащий последовательность, комплементарную последовательности с нуклеотидной вариацией в нуклеиновой кислоте-мишени, расположенный в 5′-концевой части 3′-концевого узнающего мишень участка; при этом 3′-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5′-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью;
(b) СТО (захватывающий и матричный олигонуклеотид); при этом СТО содержит в направлении 3′→5′ (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5′-концевому тегирующему участку или части 5′-концевого тегирующего участка PTO-NV, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, некомплементарную 5′-концевому тегирующему участку и 3′-концевому узнающему мишень участку PTO-NV;
при этом, когда PTO-NV гибридизуется с нуклеиновокислотной
последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой комплементарна сайту распознавания данной нуклеотидной вариации, и 5′-концевая часть 3′-концевого узнающего мишень участка образует двойную цепь с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, индуцируя расщепление, начиная с первого начального сайта расщепления, тогда высвобождается первый фрагмент;
при этом, когда PTO-NV гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой не комплементарна сайту распознавания данной нуклеотидной вариации, и 5′-концевая часть 3′-концевого узнающего мишень участка не образует двойной цепи с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, индуцируя расщепление, начиная со второго начального сайта расщепления, расположенного "вниз по течению" относительно первого начального сайта расщепления, тогда высвобождается второй фрагмент; при этом второй фрагмент содержит дополнительный 3′-концевой участок, позволяющий отличить второй фрагмент от первого фрагмента; при этом первый фрагмент или второй фрагмент, высвободившийся из PTO-NV, гибридизуется с захватывающим участком СТО.