The value of the expression of TLR-receptors for the selection of pharmacological correction of pathology of the cervix and endometrium

КЛИНИЧЕСКИЙ ОПЫТ

Значение экспрессии TLR- рецепторов

для выбора фармакологической коррекции патологии

шейки матки и эндометрия

С.Н. Прошин1, Р.И. Гпушаков 3, П.Д. Шабанов 1, Л.А. Сайковская 2, И.В. Семёнова 3, Н.И. Тапипьская3

1 Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург

2 ООО «НПО Фармэк», Москва

3 Санкт-Петербургская Государственная педиатрическая медицинская академия, Санкт-Петербург

The Value of the Expression of TLR-Receptors for the Selection of Pharmacological Correction of Pathology of the Cervix and Endometrium

S.N. Proshin 1, R.I. Glushakov3, P.D. Shabanov1, L.A. Saikovskaya2,1.V. Semenova 3, N.I. Tapilskaya 3

1 Military Medical Academy, Saint-Petersburg

2 Live-stock company «Farmek», Moscow

3 State Pediatric Medical Academy, Saint-Petersburg

В работе проведено иммуноцитохимическое исследование клеточного материала, полученного методом жидкостной цитологии из эктоцервикса, эндоцервикса у пациенток с персистирующей папилломавирусной инфекцией, инфицированных вирусами, относящимися к высокой группе онкогенного риска, и из эндометрия женщин, страдающих бесплодием до и после лечения нуклеосперматом натрия (нукпеоспермат-Ns). Иммуноцитохимическое исследование материала проводилось с использованием моноклональных антител к CD20, CD56 и Toll-like рецепторам. После лечения нуклеосперматом натрия было зарегистрировано снижение частоты CD20 и CD56-позитивных клеток и повышение частоты клеток, экспрессирующих Toll-like рецепторы 4-го и 9-го типов в исследуемом материале, а также снижение количества вируса папилломы человека высокого онкогенного риска. Полученные результаты указывают на перспективность использования нуклеоспермата натрия в лечении бесплодия, ассоциированного с хроническим аутоиммунным эндометритом, что убедительно подтверждено иммуноцитохимическим исследованием.

Ключевые слова: TLR-рецепторы, CD20, CD56, эндометрий, эндоцервикс, эктоцервикс, нуклеоспермат-Na.

The immunocytochemistry has been performed on cells from ecto/endocervix and endometrium. The monoclonal antibodies raised against CD20, CD56 and TLR have been used in immunocytochemistry. The frequency of immunocytochemically positive cells was estimated before and after nucleospermat— Na treatment course of women suffered from infertility. The real-time PCR for HPV of high oncogenic risk was also elaborated. It was elucidated that after course of treatment the frequency of CD20 and especially CD56 positive cells had been decreasing. It was determined the concomitant going down the HPV of high oncogenic risk quantity by Real-time PCR. Otherwise the frequency of TLR4 and TLR9 positive cells had elevated. The data presented here proved the suggestion that nucleospermat-Na actively induces innate immune response and eliminated factors bursting inflammation of endometrium.

Key words: TLR, CD20, CD56, endometrium, cervix of uteri, nucleospermat-Na.

Введение

Слизистые оболочки репродуктивной системы являются частью мукозального отдела иммунной системы [1]. Как и все слизистые оболочки, они обладают комплексом факторов неспецифической и иммунной защиты, обеспечивающих в большинстве случаев надежный барьер на пути проникновения патогенов. Иммунная защита слизистых оболочек обеспечивается многими гуморальными и клеточными факторами. В эпителии слизистой оболочки имеются клетки, способные к презентации антигенов. К числу этих клеток относятся антиген-презентирующие дендритные клетки (ДК) и клетки эпителиоциты, осуществляющие транспорт неизмененного или про-цессированного антигена с поверхности эпителиального пласта.

e-mail: psnjsn@rambler.ru

Врожденный иммунитет — это первая линия защиты от первичного инфицирования и (или) рецидивирующего заболевания [2, 3]. Достоверно установлено, что немедленный ответ врожденной системы иммунитета млекопитающих в ответ на вторжение патогена, главным образом, опосредован через семейство рецепторов, которые получили название TLR-рецепторы или Toll-like рецепторы, что в переводе с немецкого означает «удивительные» рецепторы. Эти рецепторы экспрессируются на макрофагах, ней-трофилах, естественных киллерах, дендритных клетках и распознают высоко консервативные типовые молекулы, свойственные целым группам микроорганизмов, так называемые «патоген-ассоциированные молекулярные образцы» (PAMP-pathogen-associated microbial patterns). Примерами таких структур могут

служить компоненты бактериальных стенок: липопо-лисахариды грамотрицательных бактерий, пептидо-гликаны и липотейхоевые кислоты грамположительных бактерий, флагеллин, вирусные нуклеиновые кислоты [4-8].

К настоящему времени уже клонировано 11 типов данного семейства рецепторов. При этом разные типы рецепторов преимущественно связываются с разными лигандами (антигенами). Однако, несмотря на весьма большое разнообразие рецепторов этого семейства, обнаружилось, что рецепторы 1, 2, 4, 5 и 6 типов TLR связываются преимущественно с бактериальными антигенами, тогда как рецепторы 3, 7, 8 и 9 типов TLR предпочтительно связываются с нуклеотидными последовательностями РНК и (или] ДНК [9-12].

Клинические наблюдения указывают, что самые разнообразные вирусы (вирус простого герпеса, вирус папилломы человека, вирус гепатита В и С, цитомегалавирус, вирус иммунодефицита человека и т.д.) могут инфицировать женский генитальный тракт. В связи с этим особую роль приобретают данные, которые вскрывают механизм формирования немедленного ответа иммунной системы, опосредованный Toll-like рецепторами 3, 7, 8 и 9 типов на вирусную инфекцию. Так, например, считается доказанным, что TLR3 распознает двухцепочечную РНК. Следует отметить, что двухцепочечная РНК (дц-РНК) может возникать из различных источников [13-15]. Геном вириона, инфицирующего организм хозяина, может сам по себе представлять дц-РНК и напоминать, не являясь таким по существу, природный РНК вирус. Однако даже образцы одноцепочечных РНК вирусов часто содержат дефективные частицы, которые первично содержат дефективные двухцепочечные геномы. Внутриклеточная вирусная двухцепочечная РНК (дц-РНК) может быть генерирована различными способами. В случае одноцепочечных вирусов (оц-РНК) образование промежуточных продуктов репликации в виде дц-РНК обязательный этап вирусной продукции. В случае ДНК вирусов комплементарная матричная РНК часто продуцируется таким образом, что синтезируется частично перекрывающимися генами, расположенными на противоположных цепочках генома вируса (двухцепочечного). Длинная вирусная полицистронная матричная РНК часто содержит в избыточном количестве стабильные двухцепочечные «стебельки». Такого рода наблюдения, собранные воедино, указывают, что все вирусные инфекции проходят через стадию двухцепочечной РНК в момент репликации вирусного генома [16]. Недавно было показано, что матричная РНК, поступающая из гибнущих или погибших клеток самого организма-хозяина, активирует TLR3, предполагая, что активация врожденного иммунного ответа через Toll-like рецепторы может встречаться в разнообразных ситуациях [17]. Также было убедительно продемонстрировано, что вторичная структура, формирующая петлю типа «стебель» внутри матричной РНК, ответственна за активацию тех Toll-like рецепторов, лигандами которых являются нуклеиновые кислоты. Было обнаружено, что, например, TLR3 улавливает двухцепочечную нуклеиновую кислоту от Schistosoma mansoni и вовлечен в иммунный ответ против паразитов [18]. К настоящему времени в целом установлено, что ДНК и РНК из разных источников, могут вызывать немедленный

иммунный ответ через определенные типы Toll-like рецепторов. Более того, Toll-like рецепторы могут представлять собой мишени для так называемой таргетной терапии. Так вирус папилломы человека в процессе эволюции приобрел феномен «ускользания» от иммунологической защиты человеческого организма. Показано, что 16 тип ВПЧ ингибирует экспрессию Toll-like рецепторов 9 типа на эпителио-цитах и дентритных клетках. В результате созданы лечебные вакцины, нагруженные адъювантами, способными активировать Toll-like рецепторы, экспрессирующиеся на поверхности дентритных клеток. В связи с этим представляет интерес изучение лекарственных средств, вступающих во взаимодействие с TLR. На роль кандидатов, выступающих модуляторами Toll-like рецепторов претендуют, в частности, различные иммуномодуляторы.

В связи с этим целью исследования являлось охарактеризовать уровень экспрессии Toll-like рецепторов в многослойном плоском и цилиндрическом эпителии шейки матки и ткани эндометрия при хроническом эндометрите до и после лечения иммуномодулятором нуклеосперматом-Na.

Материал и методы

Материал, взятый с поверхности эктоцервикса, эн-доцервикса и аспират из полости матки, наносился на стекло и немедленно подвергался влажной фиксации с помощью фиксатора «BioFix» (Дания). Зафиксированные таким образом препараты сохранялись в сухом, темном месте в течение нескольких недель до постановки иммуноцитохимической реакции.

Перед началом иммуноцитохимической реакции препараты инкубировались в 50% этаноле в течение 10 мин для того, чтобы удалить фиксатор. Затем дважды промывались в дистиллированной воде и помещались в цитратный буфер (рН 6.0) (Diagnostic BioSystem, K 035, Дания), в котором в дальнейшем проводили термическую демаскировку искомых антигенов. Избыточное количество эндогенной пероксидазы блокировали в течение 1 0 мин с использованием коммерческого состава «Peroxidase Block», который входит в набор «PolyVue HRP/DAB Detection System» (Diagnostic BioSystem, Дания). По окончании инкубации препараты проводили через отмывочный буфер и наносили первые антитела в следующем формате: для верификации клеток, экспрессирующих антигены, известные как CD20 и NCAM/CD56, были использованы мышиные моноклональные антитела — mouse monoclonal anti B cell, CD20 (clone L26) и mouse monoclonal anti CD56 (clone 123C3.D5), соответственно. Оба продукта были получены от компании «Diagnostic BioSystem» (Дания). Для верификации клеток, экспрессирующих рецепторы TLR4 (Toll-like receptor 4) и TLR9 (Toll-like receptor 9), были использованы мышиные моноклональные антитела к антигенам человека — клон 76В357.1 и клон 26С593.2, соответственно. Оба продукта были получены от компании «Lifespan, Biosciences». Разведения всех первых антител оптимизировались в индивидуальном формате. Инкубация препаратов с первыми антителами проводилась во влажной камере при температуре 37°С в течение получаса. По окончании инкубации препараты трижды промывали в отмывочном буфере и на 10 мин (при комнатной температуре) наносили реагент «Polymer Penetration Enhancer» (Diagnostic BioSystem, Дания), который

затем смывали в буфере. Для дальнейшей стадии иммуноцитохимической реакции использовали полимерную систему, направленную против первых антител (Anti-Mouse/Rabbit PolyVue HRP Label из набора «PolyVue HRP/DAB Detection System» (Diagnostic BioSystem, Дания). Препараты инкубировали в течение получаса при комнатной температуре. По окончании инкубации препараты отмывали и визуализировали продукт иммуноцитохимической реакции с помощью хромогена - диаминобензидина (DAB/plus chromogen). Далее препараты тщательно отмывали от раствора хромогена дистиллированной водой и подкрашивали гематоксилином Карраци. Ввиду того, что исследовались цитологические препараты, частота клеток, позитивно меченых моноклональными антителами, выражалась в процентах, а не по системе «Histoscore».

Документирование иммуноцитохимического исследования проводили на микроскопе MD125 Leica

(Германия) в лаборатории функциональной морфологии центральной и периферической нервной систем (рук. лаборатории д.м.н. Д.М. Коржевский] Института экспериментальной медицины РАМН (Санкт-Петербург].

Для оценки вирусной нагрузки по ВПЧ (вирус папилломы человека], взятый у пациенток до и после лечения нуклеосперматом-Na материал, исследовали по общепринятому в мировой практике методу — «полимеразная цепная реакция в режиме реального времени» («Real-time PCR») [19].

Результаты

Клетки, позитивные по искомым антигенам, окрашивались в коричневые тона хромогеном диамино-бензидином (рис. 1А). Распределение окрашивания в клетках, как правило, неравномерно. В ряде случаев область цитоплазмы, на которую проецируется ядро, также интенсивно окрашивается (рис. 1Б).

Рис. 1. Результат иммуноцитохимической реакции с антителами к 0й20; препарат аспирата из полости матки пациентки с хроническим эндометритом. Продукт реакции коричневого цвета; докраска гематоксилином. Ув. х1000

Частота клеток в цитологических препаратах эндометрия, экспрессирующих антигены CD20 и CD56 существенно варьирует, что, по-видимому, объясняется разной степенью реакции иммунной системы на вирус папилломы человека (рис. 2А, 2Б). Следует отметить, что в цитологическом препарате, зачастую, клетки могут быть разобщены искусственно, однако, это не снижает ценность иммуноцитохимического исследования слизистой эндометрия.

Иммуноцитохимическое исследование материала эндометрия с использованием моноклональных антител на антиген CD56, NK-клетки могут образовывать скопления, что, по-видимому, указывает на высокую степень инфильтрации эндометрия при хроническом эндометрите (рис. 3). После проведенного лечения нуклеосперматом-Na отмечено снижение инфильтрации слизистой эндометрия клетками, экспрессирующими CD56 антиген (рис. 4). Вместе с тем следует отметить, чтобы достичь более точной оценки частоты позитивно-меченых моноклональными антителами клеток необходимо исследование как можно большего количества полей зрения (а значит большего количества клеток), поскольку при воспалении материал, полученный из эндометрия,

зачастую содержит слизь и обеднен клеточным материалом (рис. 5).

У некоторых пациенток клетки, экспрессирующие антиген CD20 можно было обнаружить в цитологическом материале, полученном из цервикального канала. Выявление CD20- и CD56-позитивных клеток в слизистой эндоцервикса не является ординарным случаем. Однако следует отметить, что, часть этих клеток механически (с секретом) поступает из полости матки в нижние отделы генитального тракта.

Иммуноцитохимическое исследование клеток, экспрессирующих Toll-like рецепторы 4 и 9 типов, выявило следующие различия: в материале слизистой эктоцервикса, полученном от пациенток с определяемой высокой вирусной нагрузкой в случае персистенции вирусной инфекции, частота клеток, экспрессирующих оба типа рецепторов, регистрировалась с весьма низкой частотой и составляла менее 1%. В эндоцервиксе частота клеток, экспрессирующих Toll-like рецепторы 4 типа, была заметно выше и превышала 50%. Исследование слизистой эндометрия у пациенток с отсутсивем пизнаков хронического эндометрита показывает высокую частоту экспрессии Toll—like рецепторов 4 типа (рис. 6).

А

у î&L V

*

Рис. 2. Результат иммуноцитохимической реакции с антителами к 0020 (А) и 0056 (Б); препарат аспирата из полости матки пациентки с хроническим эндометритом. Продукт реакции коричневого цвета; докраска гематоксилином. Ув. х1000

Рис. 3. Результат иммуноцитохимической реакции с антителами к 0056; препарат аспирата из полости матки пациентки с хроническим эндометритом. Продукт реакции коричневого цвета; докраска гематоксилином. Ув. х1000

Рис. 4. Результат иммуноцитохимической реакции с антителами к 0056; препарат аспирата из полости матки пациентки с хроническим эндометритом. Продукт реакции коричневого цвета; докраска гематоксилином. Ув. х1000

Рис. 5. Результат иммуноцитохимической реакции с антителами к CD56; препарат аспирата из полости матки пациентки с хроническим эндометритом. Продукт реакции коричневого цвета; докраска гематоксилином. Ув. х1000

Рис. 6. Результат иммуноцитохимической реакции с антителами к TLR4; препарат аспирата из полости матки пациентки с хроническим эндометритом. Продукт реакции коричневого цвета; докраска гематоксилином. Ув. х1000

При иммуноцитохимическом исследовании клеток, экспрессирующих Toll-like рецепторы, главным образом рецепторы 9 типа, сигнал в клетке распределяется диффузно (рис. 7). Как известно, TLR, лигандами для которых являются нуклеиновые кислоты, экспрессируются на внутриклеточных (эндо-сомальных) мембранах [1, 10]. Следовательно, при иммуноцитохимической реакции моноклональные антитела не «задерживаются» на антигенах, которые экспрессируются на плазматической мембране, а проникают внутриклеточно и затем уже связываются с TLR, экспрессирующихся на внутриклеточных мембранах эндосом.

Интересно отметить, что повышение экспрессии TLR9 в эпителии женской репродуктивной системы, надежно верифицированного с помощью проведенного нами иммуноцитохимического теста, было ассоциировано со снижением вирусной нагрузки вируса папилломы человека.

Обсуждение

Как показали ранее проведенные исследования, Toll-like рецепторы (TLR) являются ключевым компонентом врожденного иммунитета [1]. Тот факт, что к настоящему времени клонировано, по крайней мере,

11 типов TLR у млекопитающих подчеркивает эволюционное значение этого типа рецепторов в защите организма (его внутренней среды) от разнообразных патогенов. Экспрессия определенных типов Toll-like рецепторов в нижних и верхних отделах женского репродуктивного тракта различается. Так, с высокой степенью достоверности было обнаружено, что регулярная экспрессия TLR 1-го и 6-го типов, независимо от фазы цикла, регистрируется в эпителии слизистой как верхних, так и нижних отделов репродуктивного тракта: фаллопиевы трубы, эндометрий, эндо- и эктоцервикс и влагалище [4, 20-22]. Интересно отметить, что экспрессия TLR1 (Toll-like рецептора 1-го типа) регистрировалась на NK-клетках и эндотелиальных клетках сосудов эндометрия матки, тогда как экспрессию TLR6 можно было выявить не

только, например, на NK-клетках, инфильтрирующих строму матки, но и на фибробластах подслизистой влагалища [21]. Регулярная экспрессия TLR2 (Tolllike рецепторов 2-го типа) регистрируется в клетках слизистой и стромы всех отделов репродуктивного тракта. При этом в стромальных клетках эндометрия экспрессия TLR2 выше по сравнению с клетками однослойного цилиндрического эпителия. Пик экспрессии TLR2 регистрируется в секреторную фазу менструального цикла [22—24]. Одним из ключевых типов TLR в защите от микроорганизмов, несомненно, является Toll—like рецепторы 4-го типа. Лигандом для TLR4 является липид А или эндотоксин, который связан с олигосахаридной цепочкой и О-антигеном. Данные компоненты в комплексе представляют ли-пополисахарид, который является неотъемлемой частью клеточной стенки грамм-отрицательных бактерий (например, Helicobacter pylori). Кроме того, хорошо документированными лигандами для TLR4 также являются Heat-shock белок с молекулярной массой 60 Да, гликосфинголипиды протозоа и ряд белков (антигенов) вирусных капсидов. Однако наиболее важно то, что связывание Toll-like рецептора 4-го типа с молекулами MD-2 и CD14 приводит к мобилизации фактора MyD88. Это, в свою очередь, приводит к фосфорилированию киназы, ассоциированной с рецептором к интерлейкину 1-го типа, олигомеризации фактора 6, ассоциированного с рецептором к фактору некроза опухоли и следующей за данным молекулярным каскадом деградацией молекулы IkB [25, 26]. На клеточном и тканевом уровне связывание TLR4 с молекулами MD-2 и CD14 приводит к активации транскрипции генов, кодирующих различные провоспалительные цитокины, хемокины и ассоциированные с ними факторы, также необходимые для развития дальнейшего иммунного ответа. В контексте клинических данных следует сказать, что применительно к микроорганизмам лигандами для TLR4 является липополисахарид N. gonorrhoeae, липополисахарид и heat-shock белок микроорганизма C. Trachomatis и углевод маннан микроорганизма C. albicans [27—30]. Неудивительно, что TLR4, как рецептор, для которого лигандами являются клинически значимые факторы, экспрессируется клетками слизистой как нижнего, так и верхнего репродуктивного тракта. В нашем исследовании была зарегистрирована экспрессия TLR4 клетками слизистой эндо- и эктоцервикса (см. результаты). При этом мы обнаружили, что в материале, взятом из эндоцервикса, частота клеток, экспрессирующих TLR4 была выше, чем в эпителии слизистой эктоцервикса. Однако наиболее высокую частоту TLR4-экспрессирующих клеток мы обнаружили в эндометрии. Вместе с тем следует отметить, что частота клеток слизистой эндометрия, положительных по иммуноцитохимической реакции на TLR4, варьировала у разных пациенток в широком диапазоне. Были выявлены пациентки, в слизистой эндометрия которых частота TLR4 экспрессирующих клеток составила не менее 80%, и также были выявлены пациентки, в слизистой эндометрия которых частота TLR4 экспрессирующих клеток составляла не более 15%. Действительно, ряд авторов, хотя с этим соглашаются не все исследователи, обнаружили, что «градиент» экспрессии Toll-like рецепторов 4-го типа выше в клетках слизистой верхних отделов репродуктивного тракта и наименьший в клетках слизистой и стромальных элементах влагалища

Рис. 7. Результат иммуноцитохимической реакции с антителами к ИЙ9; препарат аспирата из полости матки пациентки с хроническим эндометритом. Продукт реакции коричневого цвета; докраска гематоксилином. Ув. х1000

[ЭЗ]. Определенные разногласия относительно локализации клеток, экспрессирующих TLR4 и выраженности экспрессии Toll-like рецепторов 4-го типа могут быть связаны с тем, в какую фазу менструального цикла подвергали исследованию забранный материал репродуктивного тракта. К настоящему времени получены весьма убедительные данные, свидетельствующие, что наиболее выраженная экспрессия Toll-like рецепторов 4-го типа в эндометрии регистрируется в секреторную фазу менструального цикла [ЗЗ, ЗЇ].

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что, как правило, в материале эктоцервикса у пациенток с персистирующей папилломовирусной инфекцией не выявлялись клетки, экспрессирующие TLRG. В редких случаях (1G%) — в материале эктоцервикса регистрируются клетки, экспрессирующие TLRG. Если до лечения в эндометрии частота клеток, экспрессирующих TLRG, не превышала З%, то после курса лечения нуклеосперматом натрия частота клеток позитивных в иммуноцитохимической реакции с моноклональными антителами на Toll-like рецепторы G-го типа возрастала и составила более 1G% (т.е. более, чем в три раза). Известно, что TLRG связываются с нуклеиновыми кислотами, содержащими CpG-островки (не подвергшимися метилированию) [ЇЇ, ЗЗ], которые также выявлены в геноме вируса простого герпеса [ЗЗ—З4]. Экспрессия TLRG была зарегистрирована в клетках фаллопиевых труб, эндометрия и шейки матки. При этом следует отметить, что в эндометрии экспрессия TLRG не ограничивается эпителиальными клетками, но также регистрируется в стромальных элементах [З4, З5, 36]. Следствием активации TLRG может быть повышение количества ряда цитокинов, включая IL-В, на что убедительно указывают экспериментальные данные. Так, неметилированные CpG олигонуклеотиды, которые являются агонистами Toll-like рецепторов

ЛИТЕРАТУРА:

1. Medzhitov R., Preston-Hurlburt P., Kopp E. MyD88 is an adaptor protein in the hToll/IL-1 receptor family signasling pathways. Mol. Cell. 1998; 2(2): 253-58.

2. Ярилин А.А. Основы иммунологии. М.: Медицина 1999.

3. Lee J., Chuang T-H., Redecke V. et al. Molecular basis for the immunostimulatory activity of guanine nucleoside analogs: activation of Toll-like receptor 7. PNAS USA 2003; 100(11): 6646-51.

4. Herbst-Kralovetz M.M., Quayle A.J., Ficarra M. et al. Quantification and comparison of Toll-like receptor expression and responsiveness in primary and immortalized human female lower genital tract epithelia. Am. J. Reprod. Immun. 2008; 59(3): 212-24.

5. Ковальчук Л.В., Хорева М.В., Варивода А.С. Врожденные компоненты иммунитета: Toll-подобные рецепторы в норме и патологии. ЖМЭИ 2005; 4: 96-104.

6. Кокряков В.Н. Очерки о врожденном иммунитете. СПб.: Наука 2006: 261.

7. Matsumoto M., Kikkawa S., Kohase M., Miyake K., Seya T. Establishment of a monoclonal antibody against human Toll-like receptor 3 that blocks double-stranded RNA-mediated signaling. BBRC. 2002; 293(5): 1364-69.

8. Abrahams V.M., Bole-Aldo P., Kim Y.M. et al. Divergent trophoblast responses to bacterial products mediated by Toll-like receptors. J. Immunol. 2004; 173: 4286-96.

9. Andersen J.M., Ak-khairy D., Ingalls R.R. Innate immunity at the mucosal surface: role of Toll-like receptor 3 and Toll-like receptor 9 in cervical epithelial cell responses to microbial pathogens. Biol.ogy of reprod.uction 2006; 74(5): 824-31.

10. Häcker H., Vabulas R.M., Takeuchi O., Hoshino K., Akira S., Wagner H. Immune cell activation by bacterial CpG-DNA through myeloid differentiation marker 88 and tumor necrosis factor receptor-associated factor (TRAF)6. J. Exp. Med. 2000; 192(4): 595-600.

11. Hemmi H, Kaisho T, Takeuchi O. et al. Small-antiviral compounds activate immune cells via the TLR7 MyD88-dependent signaling pathway. Nature Immunol. 2002; 3(2):196-200.

9-го типа, индуцируют продукцию IL-8 первичными клетками, изолированными из ткани фаллопиевых труб и шейки матки [9, 37]. В связи с данным наблюдением интересно отметить, что CpG олигонуклеотиды также ингибируют персистенцию цито-мегаловируса и вируса Эпштейн - Барр в эпителии слизистой влагалища. Одним из цитокинов, ингибирующих продукцию данных патогенных вирусов является интерферон-р [38-39]. Значение контаминации репродуктивной системы человека вирусом Эпштейн - Барр в воспалении и невозможности зачатия не изучено и требует полномасштабного исследования в связи с функцией Toll-like рецепторов 9-го типа, обеспечивающих немедленный противовирусный иммунный ответ.

Лечение патологии шейки матки, ассоциированной с вирусом папилломы человека высокой степени онкогенного риска, представляет значительные трудности в виду отсутствия специфической этиотропной терапии, что диктует необходимость поиска новых иммуномодуляторов, способных воздействовать на специфические мишени, в частности, на Toll-like рецепторы. Хронический аутоиммунный эндометрит является наиболее частой причиной бесплодия, невынашивания беременности, неудачных попыток экстракорпорального оплодотворения. Полученные нами данные убедительно свидетельствуют о возможности проведения патогенетически обоснованной терапии патологии шейки матки и эндометрия с помощью иммуномодулятора нуклеоспермата натрия.

Авторы выражают признательность руководителю лаборатории функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы Института экспериментальной медицины доктору медицинских наук Дмитрию Эдуардовичу Коржевскому за ценные замечания при обсуждении рукописи.

12. Diebold S.S., Kaisho T., Hemmi H., Akira S., Reis E., Sousa C. Innate antiviral responses by means of TLR7-mediated recognition of single-stranded RNA. Science 2004; 303(5663): 1529—31.

13. Lien E., Sellati T.J., Yoshimura A. et al. Toll-like receptor 2 functions as a pattern recognition receptor for diverse bacterial products. J. Biol. Chem. 1999; 274(47): 33419-25.

14. Kirschning C.J., Schumann R.R. TLR2: cellular sensor for microbial and endogenous molecular patterns. Cur. Topics in Microbiol & Immunol. 2002; 270: 121-44.

15. Sen G.C., Sarkar S.N. Transcriptional signaling by doublestranded RNA: role of TLR3. Cytokine and Growth Factor Rev.iews 2005; 16(1): 1-14.

16. Jacobs B.L., Langland J.Q. When two strands are better than one: the mediators and modulators of the cellular responses to doublestranded RNA. Vir. 1996; 219(2): 339-49.

17. Kariko K., Ni H., Capodici J., Lamphier M., Weissman D. mRNA is an endogenous ligand for Toll-like receptor 3. J. Biol. Chem. 2004; 279(13): 12542-50

18. Aksoy E., Zouain C.S., Vanhoutte F. et al. Double-stranded RNAs from the helminth parasite Schistosoma activate TLR3 in dendritic cells. J. Biol. Chem. 2005; 280(1): 277-83.

19. Ramanakumar A.V., Goncalves O., Richardson H. yE fl, Tellier P., Ferenczy A., Coutlee F., Franco E.L. Human papillomavirus (HPV) types 16, 18, 31, 45 DNA loads and HPV-16 integration in persistent and transient infection in young women. BMS Infection Disease. 2010; 10: 326-31.

20. Schaefer T.M., Desouza K., Fahey J.V., Beagley K.W., Wira C.R. Toll-like receptor (TLR) expression and TLR-mediated cytokine/ chemokine production by human uterine epithelial cells. Immunol. 2004; 112(3): 428-36.

21. Fazeli A., Bruce C., Anumba D.O. Characterization of Toll-like receptors in the female reproductive tract in humans. Hum. Reprod. 2005; 20(5): 1372-78.

22. Lin Z., Xu J., Jin X., Zhang X., Ge F. Modulation of expression of Toll-like receptors in the human endometrium. Am. J. Reprod. Immun. 2009; 61(5): 338-45.

23. Pioli P.A., Amiel E., Schaefer T.M., Connolly J.E., Wira C.R., Guyre P.M. Differential expression of Toll-like receptors 2 and 4 in tissues of the human female reproductive tract. Infect. & Immun. 2004; 72(10): 5799-5806.

24. Aflatoonian R., Tuckerman E., Elliott S.L., et al. Menstrual cycle-dependent changes of Toll-like receptors in endometrium. Hum. Reprod. 2007; 22(2): 586-93.

25. Ulevitch R.J. Immunology: Toll gates for pathogen selection. Nature. 1999; 401(6755): 755-56.

26. Nagai Y., Akashi S., Nagafuku M. et al. Essential role of MD-2 in LPS responsiveness and TLR4 distribution. Nature Immun. 2002; 3(7): 667-72.

27. Gregg C.R., Melly M.A., Hellerqvist C.G., Coniglio J.G., McGee Z.A. Toxic activity of purified lipopolysaccharide of Neisseria gonorrhoeae for human Fallopian tube mucosa. J. Infect. Diseases. 1981; 143(3): 432-39.

28. Naumann M., Weßler S., Bartsch C., Wieland B., Meyer T.F. Neisseria gonorrhoeae epithelial cell interaction leads to the activation of the transcription factors nuclear factor kB and activator protein 1 and the induction of inflammatory cytokines. J. Exp. Med. 1997; 186(2): 247-58.

29. Ohashi K., Burkart V., Flohe S., Kolb H. Cutting edge: heat shock protein 60 is a putative endogenous ligand of the Toll-like receptor-4 complex. J. Immun. 2000; 164(2): 558-61.

30. Netea M.G., Van Der Graaf C., Van Der Meer J.W.M., Kullberg B.J. Recognition of fungal pathogens by Toll-like receptors. Europ. J. Clin. Microbiol.& Infect. Diseases. 2004; 23(9): 672-76.

31. Doyle S.E., Vaidya S.A., O'Connell R. et al. IRF3 mediates a TLR3/TLR4-specific antiviral gene program. Immunity. 2002; 17(3): 251-63.

32. Hemmi H., Tekeuchi O., Kawai T. et al. A Toll-like receptors recognizes bacterial DNA. Nature. 2000; 408(6813): 740-45.

33. Tabeta K, Georgel P, Janssen E. et al. Toll-like receptors 9 and 3 as essential components of innate immune defense against mouse cytomegalovirus infection. PNAS USA. 2004; 101(10): 3516-21.

34. Krug A., Luker G.D., Barchet W., Leib D.A., Akira S., Colonna M. Herpes simplex virus type 1 activates murine natural interferon-producing cells through Toll-like receptor 9. Blood. 2004; 103(4): 1433-37.

35. Hirata T., Osuga Y., Hamasaki K. et al. Expression of Tolllike receptors 2, 3, 4, and 9 genes in the human endometrium during the menstrual cycle. J. Reprod. Immunol. 2007; 72(1-2): 53-60.

36. Hart K.M., Murphy A.J., Barrett K.T., Wira C.R., Guyre P.M., Pioli P.A. Functional expression of pattern recognition receptors in tissues of the human female reproductive tract. J. Reprod. Immunol.2009; 80(1-2): 33-40.

37. Ghosh M., Schaefer T.M., Fahey J.V., Wright J.A., Wira C.R. Antiviral responses of human Fallopian tube epithelial cells to Tolllike receptor 3 agonist poly(I:C). Fertility and Sterility. 2008; 89(5, supplement 1): 1497-1506.

38. Harwani S.C., Lurain N.S., Zariffard M.R., Spear G.T. Differential inhibition of human cytomegalovirus (HCMV) by Toll-like receptor ligands by interferon-beta in human foreskin fibroblasts and cervical tissue. Virology Journal. 2007; 4: Article 133.

39. Askra S., Kalla M., Delecluse H.-J., Hammerschmidt W., Moosmann A. Toll-like receptor agonist synergistically increase proliferation and activation of B cells by Epstein - Barr virus. J. Virology. 2010; 84(7): 3612-23.

Поступила 13.01.2011