СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЯИЧНОГО ЖЕЛТКА С ВЫСОКИМ СОДЕРЖАНИЕМ AF-16
METHOD FOR PRODUCTION OF EGG YOLK WITH HIGH CONTENT OF AF-16

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к способу получения яичного желтка с очень высоким содержанием белков антисекреторного фактора (AF), в частности, с очень высоким содержанием фрагмента белка AF, состоящего по существу из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ.ID.NO. 1 (AF-16) и/или в SEQ.ID.NO. 2 (AF-8), указанный способ включает в себя кормление в течение по меньшей мере 12 недель сельскохозяйственных птиц, таких как куры, индуцирующим AF-16 гранулированным кормом для сельскохозяйственных птиц, содержащим по меньшей мере 0,14% свободного триптофана, или по меньшей мере 1-2 г триптофана/кг корма, и затем сбор яиц от указанных сельскохозяйственных птиц, отделение яичного желтка от яичного белка, и альтернативно распылительную сушку, сушку в псевдоожиженном слое, измельчение, промывку, экстракцию, упаривание, мембранную фильтрацию и/или сублимационную сушку указанного яичного желтка.
Настоящее изобретение дополнительно относится к указанному яичному желтку с очень высоким содержанием белков антисекреторного фактора (AF) и их фрагментов, полученному согласно описанному в настоящем документе способу, и к его применению для получения функциональных пищевых продуктов и фармацевтических продуктов для лечения и профилактики патологических физиологических состояний, вызванных, например, исключительно высокими уровнями выделения жидких сред организма. Изобретение также относится к пищевым продуктам и фармацевтическим продуктам, полученным таким образом.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Белки представляют собой биологические макромолекулы, составленные из аминокислотных остатков, связанных вместе пептидными связями. Белки, как линейные полимеры аминокислот, также называют полипептидами. Обычно, белки имеют 50-800 аминокислотных остатков и, следовательно, имеют молекулярные массы в интервале от около 6000 до около нескольких сотен тысяч Дальтонов или более. Небольшие белки называют пептидами, полипептидами или олигопептидами. Термины ʺбелокʺ, ʺполипептидʺ, ʺолигопептидʺ и ʺпептидʺ могут использоваться взаимозаменяемо в контексте настоящего описания. Пептиды могут иметь лишь несколько аминокислотных остатков, как, например, в интервале 2-50 аминокислотных остатков (aa).
ʺФармацевтическая композицияʺ в контексте настоящего описания, относится к композиции, содержащей терапевтически активное количество белка антисекреторного фактора (AF), необязательно в комбинации с фармацевтически активным эксципиентом, таким как носитель или несущая среда. Указанную фармацевтическую композицию составляют для соответствующего пути введения, который может варьировать в зависимости от состояния пациента, а также от других факторов, таких как возраст, или который может быть предметом предпочтительного выбора. Фармацевтическая композиция, содержащая белок антисекреторного фактора (AF) может служить в качестве системы доставки лекарственного средства. Фармацевтическая композиция при введении представляет активное вещество в организм человека или животного. Указанная фармацевтическая композиция может находиться в форме, например, таблеток, пилюль, пастилок, капсул, пилюль для регуляции стула, гелей, растворов и т.д., но не ограничивается ими.
Термин ʺфармацевтически активная сольʺ, относится к соли белка антисекреторного фактора (AF), пептида или полипептида, или их гомолога и/или фрагмента, которая может представлять собой любую соль, являющуюся производной от них, на основании так называемого ряда Гофмейстера. Другие примеры фармацевтически активных солей включают трифторацетат, ацетат, сульфат и хлорид, причем изобретение ими не ограничивается.
Термин ʺантисекреторныйʺ в контексте настоящего описания относится к ингибированию или уменьшению секреции и/или переноса жидкой среды. Следовательно, термин ʺбелок антисекреторного фактора (AF)ʺ относится к классу белков, способных к ингибированию или уменьшению или модулированию иным образом переноса жидкой среды, а также секреции в организме.
В контексте настоящего описания, ʺэквивалентная активностьʺ относится к биологическому эффекту белка антисекреторного фактора (AF), пептида или полипептида или гомолога, их производного и/или фрагмента, т.е. их способности для улучшения терапии и/или применения при лечении глиобластомы. Стандартизированные примеры для тестирования и/или измерения такой способности являются хорошо известными в данной области техники.
В контексте настоящего описания, термины ʺбелок антисекреторного фактораʺ, ʺбелок антисекреторного фактора (AF)ʺ, ʺAF-белокʺ, AF, или их гомолог, производное или фрагмент, могут использоваться взаимозаменяемо с терминами ʺантисекреторные факторыʺ или ʺбелки антисекреторного фактораʺ, определенными в WO 97/08202, и относятся к белку антисекреторного фактора (AF) или пептиду или гомологу, их производному и/или фрагменту, имеющим антисекреторную и/или эквивалентную функциональную и/или аналогичную активность, или к их модификации, не изменяющей функцию полипептида. Следовательно, следует понимать, что термины ʺантисекреторный факторʺ, ʺбелок антисекреторного фактораʺ, ʺантисекреторный пептидʺ, ʺантисекреторный фрагментʺ или ʺбелок антисекреторного фактора (AF)ʺ в контексте настоящего описания также могут относиться к их производному, гомологу или фрагменту. Все эти термины могут использоваться взаимозаменяемо в контексте настоящего изобретения. Кроме того, в контексте настоящего описания, термин ʺантисекреторный факторʺ может сокращенно обозначаться как ʺAFʺ. Белок антисекреторного фактора (AF) в контексте настоящего описания также относится к белку с антисекреторными свойства, определенному прежде в WO 97/08202 и WO 00/38535. Антисекреторные факторы также были раскрыты, например, в WO 05/030246. Также термин антисекреторный фактор предназначен для обозначения нативных и/или природных антисекреторных факторов в яичном желтке, обогащенном антисекреторными факторами, раскрытыми в SE 900028-2 и WO 00/38535, как дополнительно описано ниже.
Ниже по тексту, термин "NASP" будет применяться для обозначения "природного антисекреторного белка".
Термин "ASP" будет применяться для обозначения "антисекреторного белка", содержащегося в природном антисекреторном белке.
Термин "функциональный пищевой продукт" обозначает, в контексте настоящего описания, пищевой продукт, обладающий благоприятной для здоровья функцией, т.е. имеющий благоприятное воздействие на здоровье человека или животного.
PBS: забуференный фосфатом физраствор;
AF: антисекреторный фактор,
Непроцессированный белок AF (показанный в SEQ ID NO: 1)
AF-6: гексапептид CHSKTR (показанный в SEQ ID NO: 2);
AF-16: пептид, составленный из аминокислот VCHSKTRSNPENNVGL (показанный в SEQ ID NO: 3);
AF-8: септапептид VCHSKTR (показанный в SEQ ID NO: 4);
Октапептид IVCHSKTR (показанный в SEQ ID NO: 5);
Пентапептид HSKTR (показанный в SEQ ID NO: 6).
SPC: Специально обработанные зерновые культуры
RTT: Способ измерения стандартизированного ответа секреции в тонком кишечнике крыс, как опубликовано в SE 9000028-2 (номер публикации 466331), для измерения содержания AF (ASP).
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
WO 98/21978 раскрывает применение продуктов, имеющих ферментативную активность, для производства пищи, которые индуцируют образование белков антисекреторного фактора (AF). WO 00/038535 дополнительно раскрывает пищевые продукты, обогащенные нативными белками антисекреторного фактора (AF), как таковыми.
Из патента Швеции SE 9000028-2 (публикация № 466331) известно, что образование антисекреторного фактора или антисекреторного белка (ASP: также именуемого FIL) может стимулироваться добавлением к корму для животных некоторых сахаров, аминокислот и амидов. Виды и количества этих веществ для применения для образования интересующего количества ASP определены способом, раскрытым в патенте. Вкратце, этот способ включает измерение стандартизированного секреционного ответа в тонком кишечнике крыс. Из патента становится очевидным, что индуцированные образованные ASP направляют секрецию жидкой среды организма в тонкий кишечник. В указанном патенте, содержание или количество природных антисекреторных белков определяется его эффектом на секрецию жидкой среды в тонком кишечнике лабораторных крыс, стимулируемых холерным токсином. Одна единица ASP (единица FIL) соответствует 50% уменьшению потока жидкости в кишечнике в сравнении с контролем без ASP. Антисекреторные белки является активными в крайне малых количествах и, следовательно, проще их определять по их эффекту, чем по их массе.
Из заявки PCT PCT/SE96/01049 известны структуры некоторых антисекреторных белков, и их активные части охарактеризованы. Было показано, что синтетические ASP, полученные рекомбинантной генетической инженерией или посредством твердофазной технологии, и имеющие определенные структуры, имеют общее управляющее влияние на поток жидкой среды организма через мембраны живых клеток.
Из заявки PCT PCT/SE97/01918 (WO 98/21978) известно, что образование ASP может индуцироваться в организме посредством потребления некоторого вида пищи, имеющего ферментативную активность. Эффект индукции и, вследствие этого, образование ASP варьирует в соответствии с индивидуумом и его симптомами и происходит с пока что непредсказуемыми мощностью и периодом индукции. Однако их можно измерить затем, а необходимые коррективы могут быть сделаны с использованием руководства по указанным измерениям.
Во время продолжительной работы авторов изобретения по составлению корма для стимуляции образования антисекреторных белков согласно Патенту Швеции, SE 9000028-2, стало известно, что способность к синтезу и концентрированию образованных природных антисекреторных белков наиболее неравномерно распределены в организме. Очень высокие уровни NASP были обнаружены в некоторых органах, частях тела или жидких средах организма, и, в частности, в желтке птичьих яиц. В WO 008535 этот факт был раскрыт и, следовательно, раскрыто применение яичного желтка, обогащенного NASP. WO008535 в целом раскрывает получение обогащенных NASP пищевых продуктов и фармацевтических продуктов для лечения и профилактики патологических физиологических состояний, вызываемых экстремальным выделением жидких сред организма.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В отличие от яичного желтка, прежде описанного, например, в WO008535, настоящее изобретение впервые описывает яичный желток с гораздо более высоким содержанием белков антисекреторного фактора (AF) и, в частности, с постоянным и высоким содержанием фрагмента белка фактора (AF) с аминокислотной последовательностью, раскрытой в SEQ.ID.NO.1 (AF-16) и/или в SEQ.ID.NO.2 (AF-8). Яичный желток, раскрытый в настоящем описании, содержит по меньшей мере 0,05 нг/мл фрагмента белка антисекреторного фактора (AF) с аминокислотной последовательностью, раскрытой в SEQ.ID.NO.1 и/или в SEQ.ID.NO.2 (AF-8). Яичный желток может находиться в жидком виде, или альтернативно, может быть высушен с распылением, или высушен в псевдоожиженном слое, и дополнительно характеризуется индуцированием по меньшей мере 0,5 AF-Единиц у нуждающегося пациента в интервале 60-120 мин после приема внутрь по меньшей мере 4 граммов указанного сублимированного яичного желтка, что по меньшей мере вдвое больше, чем может быть индуцировано яичным желтком, описанным в WO008535.
Яичный желток согласно настоящему изобретению может в основном происходить из яиц сельскохозяйственных птиц, таких как птицы отряда куриных, таких как куры.
Яичный желток согласно настоящему изобретению получают способом получения яичного желтка с очень высоким содержанием белков антисекреторного фактора (AF), в частности, с очень высоким содержанием фрагмента белка AF, показанного в SEQ.ID.NO. 1 (AF-16), указанный способ включает в себя кормление в течение по меньшей мере 12-недель сельскохозяйственных птиц, таких как куры, индуцирующим AF-16 гранулированным кормом для сельскохозяйственных птиц, содержащим по меньшей мере 0,4% свободного триптофана, и затем сбор яиц от указанных сельскохозяйственных птиц, отделение яичного желтка от яичного белка, и альтернативно распылительную сушку, сушку в псевдоожиженном слое, измельчение, промывку, экстракцию, упаривание, мембранную фильтрацию, и/или сублимационную сушку указанного яичного желтка.
В одном варианте осуществления, яичный желток согласно настоящему изобретению получают способом получения яичного желтка с очень высоким содержанием белков антисекреторного фактора (AF), в частности, с очень высоким содержанием фрагмента белка AF, показанного в SEQ.ID.NO. 2 (AF-8), причем указанный способ включает в себя кормление в течение по меньшей мере 12 недель сельскохозяйственных птиц, таких как куры, индуцирующим AF-8 гранулированным кормом для сельскохозяйственных птиц, содержащим по меньшей мере 0,4% свободного триптофана, и затем сбор яиц от указанных сельскохозяйственных птиц, отделение яичного желтка от яичного белка, и альтернативно распылительную сушку, сушку в псевдоожиженном слое, измельчение, промывку, экстракцию, упаривание, мембранную фильтрацию, и/или сублимационную сушку указанного яичного желтка.
Яичный желток согласно настоящему изобретению получают способом получения яичного желтка с очень высоким содержанием белков антисекреторного фактора (AF), в частности, с очень высоким содержанием фрагмента белка AF, показанного в SEQ.ID.NO. 1 (AF-16) и/или в SEQ.ID.NO.2 (AF-8), причем указанный способ включает в себя кормление в течение по меньшей мере 12 недель сельскохозяйственных птиц, таких как куры, индуцирующим AF-16 и/или AF-8 гранулированным кормом для сельскохозяйственных птиц, содержащим по меньшей мере 0,4% свободного триптофана, и затем сбор яиц от указанных сельскохозяйственных птиц, отделение яичного желтка от яичного белка, и альтернативно распылительную сушку, сушку в псевдоожиженном слое, измельчение, промывку, экстракцию, упаривание, мембранную фильтрацию и/или сублимационную сушку указанного яичного желтка.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, яичный желток, полученный способом согласно настоящему изобретению, применяют в медицине. В предпочтительном в настоящее время варианте осуществления, указанный яичный желток применяют при лечении и профилактике болезненных состояний, вызываемых экстремальным выделением жидких сред организма, выбранных из группы заболеваний, но не ограниченных этой группой, состоящей из диареи, воспалительных заболеваний, отеков, аутоиммунных заболеваний, злокачественного новообразования, опухолей, лейкемии, диабета, сахарного диабета, глиобластомы, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, энцефалита и болезни Меньера.
В равнозначно предпочтительном в настоящее время варианте осуществления, указанный яичный желток применяют для использования при оптимизации компартментного и/или клеточного поглощения лекарственного средства, для нейропротекции.
Настоящее изобретение также направлено на применение яичного желтка, полученного способом согласно настоящему изобретению, для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики болезненных состояний, вызываемых экстремальным выделением жидких сред организма, диареи, воспалительных заболеваний, злокачественного новообразования, глиобластомы, AD и/или PD. Настоящее изобретение также направлено на применение яичного желтка, полученного способом согласно настоящему изобретению для получения лекарственного средства для оптимизации компартментного и/или клеточного поглощения лекарственного средства и/или для нейропротекции.
Настоящее изобретение также направлено на способ лечения и/или профилактики болезненных состояний, вызываемых экстремальным выделением жидких сред организма, диареи, воспалительных заболеваний, злокачественного новообразования, глиобластомы, AD и/или PD, причем указанный способ включает в себя введение фармацевтически эффективного количества яичного желтка, полученного способом согласно настоящему изобретению, нуждающемуся субъекту. Настоящее изобретение также направлено на способ оптимизации компартментного и/или клеточного поглощения лекарственного средства и/или нейропротекции, причем указанный способ, включает в себя введение фармацевтически эффективного количества яичного желтка, полученного способом согласно настоящему изобретению, нуждающемуся субъекту.
Яичный желток согласно настоящему изобретению может применяться для получения обогащенных белком антисекреторного фактора (AF) функциональных пищевых продуктов, таких как корм, пища и/или пищевые добавки. Следовательно, указанные пища, корм и/или пищевая добавка, содержащие яичный желток согласно настоящему изобретению, раскрыты в равной степени. Такая пища, содержащая яичный желток согласно настоящему изобретению, может быть выбрана из группы, состоящей из блинчиков, омлета, мороженого, яиц, сваренных вкрутую или всмятку, и безалкогольных напитков, йогурта, пищевых батончиков и т.д.
Один другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей яичный желток согласно настоящему изобретению и подходящий фармацевтический носитель. Обычно, подходящий фармацевтический носитель выбирают из группы, состоящей из воды, PBS и т.д.
Один конкретный вариант осуществления относится к фармацевтической композиции, содержащей яичный желток согласно настоящему изобретению, содержащей 0,00005 нг/мл фрагмента белка антисекреторного фактора (AF) с аминокислотной последовательностью, раскрытой в SEQ.ID.NO.1., которая дополнительно характеризуется индуцированием по меньшей мере 0,5 AF-Единиц у нуждающегося пациента.
Настоящее изобретение относится к способу получения яичного желтка с очень высоким содержанием белков антисекреторного фактора (AF), в частности, с очень высоким содержанием фрагмента белка AF, состоящего по существу из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ.ID.NO.1 (AF-16) и/или в SEQ.ID.NO. 2 (AF-8), причем указанный способ, включает в себя кормление в течение по меньшей мере 12 недель сельскохозяйственных птиц, таких как куры, индуцирующим AF-16 и/или AF-8 гранулированным кормом для сельскохозяйственных птиц, содержащим по меньшей мере 0,14% свободного триптофана, и затем сбор яиц от указанных сельскохозяйственных птиц, отделение яичного желтка от яичного белка, и альтернативно распылительную сушку, измельчение, промывку, экстракцию, упаривание, мембранную фильтрацию, сушку в псевдоожиженном слое и/или сублимационную сушку указанного яичного желтка. Указанные сельскохозяйственные птицы обычно представляют собой птиц из отряда куриных, таких как куры.
Способ получения яичного желтка согласно настоящему изобретению может альтернативно включать в себя кормление сельскохозяйственных птиц индуцирующим AF-16 и/или AF-8 кормом в течение по меньшей мере 13 или 14 недель, таким, например, как в течение по меньшей мере 15, 16, 17 или 18 недель.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к индуцирующему AF-16 и/или AF-8 корму для сельскохозяйственных птиц, применяемом в способе, описанном в настоящем документе, где указанный корм может дополнительно содержать аминокислоты, сахара и амиды, и/или осоложенное зерно в таких количествах и соотношениях, что образование AF-16 и/или AF-8 стимулируется у сельскохозяйственных птиц после потребления указанного корма.
,
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, указанный индуцирующий AF-16 и/или AF-8 корм для сельскохозяйственных птиц содержит по меньшей мере 0,14-1% свободного триптофана, таким образом, как по меньшей мере 0,7% или по меньшей мере 0,1% свободного триптофана, и находится в гранулированной форме. Яичный желток, полученный согласно описанному в настоящем документе способу, в предпочтительном в настоящее время варианте осуществления дополнительно отличается тем, что он содержит по меньшей мере 0,05 нг/мл фрагмента белка антисекреторного фактора (AF) с аминокислотной последовательностью, раскрытой в SEQ.ID.NO.1. В одном другом варианте осуществленияяичный желток, полученный согласно описанному в настоящем документе способу, дополнительно отличается тем, что он содержит по меньшей мере 0,05 нг/мл фрагмента белка антисекреторного фактора (AF) с аминокислотной последовательностью, раскрытой в SEQ.ID.NO.2.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Яичный желток
Яичный желток, полученный согласно описанному в настоящем документе способу, в предпочтительном в настоящее время варианте осуществления дополнительно отличается тем, что он содержит по меньшей мере 0,05 нг/мл фрагмента белка антисекреторного фактора (AF) с аминокислотной последовательностью, раскрытой в SEQ.ID.NO.1 и/или в SEQ.ID.NO.2.
Пища и пищевые добавки
Настоящее изобретение в целом относится к применению яичного желтка для получения белка антисекреторного фактора (AF), таким образом, как в конкретных обогащенных AF-16 функциональных пищевых продуктах и фармацевтических продуктах для лечения и профилактики патологических физиологических состояний, вызываемых экстремальным выделением жидких сред организма.
Согласно одному другому аспекту изобретение относится к такому применению для получения продовольствия для конкретных целей питания и фармацевтических продуктов, содержащих белки антисекреторного фактора (AF), такие как, в частности, AF-16 и/или AF-8.
Выражение "пищевой продукт" предназначено, в контексте настоящего описания, для обозначения пищи для приема внутрь людьми, а также корма для приема внутрь животными. Пища может представлять собой изделия в форме продуктов, получение которых включает яичный желток, таких как блинчики, омлет, мороженое и различные виды хлеба. Яичный желток также может потребляться в форме напитка из взбитых яиц или яиц, сваренных вкрутую или всмятку. Пища может также иметь форму хлеба, бисквитов, пасты, зерновых продуктов и хлопьев, каши или жидкой каши или смешана в различных композициях напитков с электролитами или без них, или использоваться при приготовлении пищи, содержащей мясо и мясные продукты, жир и жировые продукты или молоко и молочные продукты, обогащенные белком антисекреторного фактора (AF), таким как, в частности, AF-16 и/или AF-8. Белок антисекреторного фактора (AF), такой как, в частности, AF-16 и/или AF-8 может быть замешан в пищевой продукт в более или менее очищенной форме. Приготовление пищи может осуществляться с большой свободой с использованием знаний, известных квалифицированному специалисту, чтобы соответствовать требованиям питательности и разнообразия питания.
Яичный желток типично происходит из птичьих яиц, которые могут применяться для потребления животными и людьми, и которые включают очень высокое содержание белка антисекреторного фактора (AF), такого как, в частности, AF-16 и/или AF-8. Яйца предпочтительно получают от кур-несушек, но они также могут быть получены от, например, уток, индеек, перепелок и страусов.
Пища или корм с очень высоким содержанием белка антисекреторного фактора (AF), такого как, в частности, AF-16 и/или AF-8, содержит указанный белок или фрагмент белка в такой концентрации, что при потреблении пищевого продукта, он обеспечивает желательное значительное воздействие на здоровье.
В одном варианте осуществления, потребление по меньшей мере 4 г яичного желтка, полученного согласно раскрытому в настоящее время способу, индуцирует у нуждающегося пациента по меньшей мере 0,5 AF-Единиц в крови указанного пациента, т.е. уровень FIL-единиц/мл крови превышает 0,5 FIL-единиц/мл крови. Здоровые люди обычно имеют уровни AF-Единиц в крови между 0 и 0,5 FIL Единиц/мл крови.
При стимуляции выработки белка антисекреторного фактора (AF), такого как, в частности, AF-16 и/или AF-8, было удивительным образом и неожиданно показано, что крайне высокие уровни белка антисекреторного фактора (AF), включая его фрагменты, такого как, в частности, AF-16 и/или AF-8, могут быть индуцированы в птичьих яйцах.
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ
Белок антисекреторного фактора (AF), и его фрагменты, такие как, в частности, AF-16 и/или AF-8, продуцируемые в яичном желтке, могут быть сконцентрированы, например, на особой адсорбционной колонке, элюированы, извлечены и/или сконцентрированы и могут затем вводиться животному или людям, смешаны с кормом или пищей, соответственно, или как более или менее выделенные продукты, получены и составлены в виде фармацевтических средств или других продуктов для здоровья. Такие фармацевтические продукты получают способом, известным квалифицированному специалисту, с использованием принятых эксципиентов, включающих носители и разбавители, и составляют в виде твердых или жидких форм в зависимости от предназначенного пути введения.
Фармацевтические композиции, предусмотренные в настоящем описании, предпочтительно составляют для перорального приема внутрь и вводят перорально.
Согласно одному другому варианту осуществления применения в соответствии с изобретением, для получения белка антисекреторного фактора (AF) и/или его фрагментов, таких как, в частности, обогащенных AF-16 и/или AF-8 пищевых продуктов, осуществляют применение яичного желтка самого по себе или полного яйца, возможно в обработанном виде, для смешивания с пищей или кормом. Любая обработка может включать измельчение, промывку, экстракцию, испарение, ультрафильтрацию, сушку и другие стандартные операции, чтобы получить белок антисекреторного фактора (AF), такой как, в частности, обогащенный AF-16 и/или AF-8 продукт яичного желтка, подходящий для практических целей, для смешивания с пищей или кормом.
Типовым образом, белок антисекреторного фактора (AF), такой как, в частности, AF-16 и/или AF-8, вводят в дозах 4 г - 8 г высушенного распылением порошка яичного желтка один раз или два раза ежедневно.
Для некоторых состояний могут требоваться даже более высокие дозы белка антисекреторного фактора (AF), такого как, в частности, AF-16 и/или AF-8. В таких случаях, белок антисекреторного фактора (AF), такой как, в частности, AF-16 и/или AF-8, выделенный из яичного желтка может, быть добавлен к любому пищевому продукту, или выделенный белок антисекреторного фактора (AF), такой как, в частности, AF-16 и/или AF-8, может быть получен для приема внутрь в форме таблеток или суспензий.
Особенно предпочтительный вариант осуществления включает в себя получение порошка яичного желтка посредством распылительной сушки. Такой продукт особенно хорошо подходит для промышленной переработки различных пищевых продуктов, где желательно достичь благоприятного эффекта белка антисекреторного фактора (AF), такого как, в частности, AF-16 и/или AF-8, при приеме внутрь рассматриваемого пищевого продукта. Порошок яичного желтка позволяет хорошо замешивать его в такие сильно различающиеся продукты, как колбаса и мороженое, вследствие чего будет возможно достичь широко распространенной вариации по характеру пищи.
Порошок яичного желтка также является наиболее подходящим в качестве промежуточного продукта в том случае, когда желательно получить обогащенный или концентрированный белок антисекреторного фактора (AF), такой как, в частности, продукт AF-16 и/или AF-8, посредством промывки или экстракции для дальнейшего получения, например, фармацевтических средств.
Благодаря своей относительно низкой молекулярной массе, белок антисекреторного фактора (AF), и, в частности, его фрагменты, такие как AF-16 и/или AF-8, являются сравнительно термостойкими, и могут, следовательно, содержаться в пище уже перед ее приготовлением для потребления.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, фармацевтическая композиция согласно изобретению дополнительно содержит фармацевтически приемлемый эксципиент. Выбор фармацевтически приемлемого эксципиента и его оптимальная концентрация для применения согласно настоящему изобретению могут легко быть определены квалифицированным специалистом посредством проведения экспериментов. Фармацевтически приемлемые эксципиенты для применения согласно настоящему изобретению включают растворители, буферные средства, консерванты, хелатирующие агенты, антиоксиданты и стабилизаторы, эмульгирующие средства, суспендирующие средства и/или разбавители. Фармацевтические композиции изобретения могут быть составлены в соответствии с общепринятой фармацевтической практикой, например, в соответствии с ʺRemington: science and practice of pharmacyʺ, 21st edition, ISBN 0-7817-4673-6 или ʺEncyclopedia of pharmaceutical technologyʺ, 2nd edition, ed. Swarbrick J., ISBN: 0-8247-2152-7. Фармацевтически приемлемый эксципиент представляет собой вещество, которое по существу является безвредным для индивидуума, которому будет вводиться композиция. Такой эксципиент обычно соответствует требованиям, предъявляемым национальными органами здравоохранения. В официально принятых фармакопеях, таких как, например, фармакопея Великобритании, фармакопея Соединенных Штатов Америки и Европейская фармакопея, установлены стандарты для фармацевтически приемлемых эксципиентов.
Следующий далее раздел является обзором соответствующих композиций для необязательного применения в фармацевтической композиции согласно изобретению. Обзор основан на конкретном пути введения. Однако следует понимать, что в тех случаях, где фармацевтически приемлемый эксципиент может использоваться в различных дозированных формах или композициях, применение конкретного фармацевтически приемлемого эксципиента не ограничивается конкретной дозированной формой или конкретной функцией эксципиента. Следует особо отметить, что изобретение не ограничивается применением композиций, указанных в дальнейшем.
Парентеральные композиции:
Для системного применения, композиции согласно изобретению могут содержать общепринятые нетоксичные фармацевтически приемлемые носители и эксципиенты, включающие микросферы и липосомы.
Композиции для применения согласно изобретению могут включать все виды твердых, полутвердых и жидких композиций.
Фармацевтически приемлемые эксципиенты могут включать растворители, буферные средства, консерванты, хелатирующие агенты, антиоксиданты и стабилизаторы, эмульгирующие средства, суспендирующие средства и/или разбавители.
Фармацевтическая композиция согласно изобретению в одном контексте может вводиться местно или посредством внутривенной периферической инфузии или посредством внутримышечной или подкожной инъекции пациенту или через буккальный, легочный, назальный, кожный или пероральный пути. Кроме того, также возможно вводить фармацевтическую композицию через введенный хирургическим путем шунт в желудочек мозга пациента.
В одном варианте осуществления, фармацевтическую композицию, применяемую согласно настоящему изобретению, составляют для внутриглазного, местного, интраназального, перорального, подкожного и/или системного введения. Выбранный путь введения будет варьировать в зависимости от состояния пациента, подлежащего лечению и возраста и пола пациента и т.д.
В предпочтительном варианте осуществления, композицию согласно изобретению вводят посредством применения в виде суспензии или, даже более предпочтительно, порошка для ингаляции с использованием спрея, аэрозоля, ингалятора или распылителя через нос и/или в дыхательные пути.
Введение порошка, содержащего антисекреторные факторы, имеет дополнительные преимущества с позиций стабильности и дозировки. Фармацевтическая композиция согласно изобретению может также применяться местно, через глаза, через нос, перорально, подкожно и/или системно вводиться через кровеносные сосуды. В предпочтительном варианте осуществления, фармацевтическую композицию составляют для внутривенного, внутримышечного, местного, перорального или назального введения.Обычно, при использовании для местного применения внутрь глаз, применяемая концентрация в композиции изобретения составляет от 1 мкг до 1 мг на применение, предпочтительно 50-500 мкг, либо в виде единичной дозы в день или повторной дозы несколько раз в день (множественных доз), но не ограничивается ими.
Системно вводимая в кровь доза находится в пределах интервала от 0,1 мкг до 10 мг на применение и кг массы тела, таким образом, как от 0,1 мкг до 1 мг на применение и кг массы тела, предпочтительно 1-500, таким образом, как 1-1000 мкг/кг массы тела. Когда яичный желток, обогащенный антисекреторными факторами, применяют согласно настоящему изобретению, эту лекарственную форму предпочтительно вводят перорально.
В одном варианте осуществления изобретения, указанная фармацевтическая композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый эксципиент. Такой эксципиент может представлять собой любой предпочтительный эксципиент, выбранный, чтобы соответствовать конкретной задаче.
АНТИСЕКРЕТОРНЫЙ ФАКТОР (AF)
Антисекреторный фактор представляет собой класс белков, которые присутствуют естественным образом в организме. Антисекреторный фактор (AF) представляет белок массой 41 кДа, который первоначально был описан, как обеспечивающий защиту против заболеваний, связанных с диареей, и воспаления кишечника (для обзора, см. Lange и Lönnroth, 2001). Белок антисекреторного фактора (AF) был секвенирован, а его кДНК была клонирована. Человеческий белок антисекреторного фактора AF представляет собой белок массой 41 кДа, содержащий 382-288 аминокислот при выделении из гипофиза. Активный участок, относящийся к благоприятному эффекту при лечении глиобластомы согласно настоящему изобретению, может быть локализован в белке в области, близкой к N-концу белка, в частности, локализованной по аминокислотам 1-163 из SEQ ID NO 4, более конкретно по положениям аминокислот 35-50 в последовательности белка антисекреторного фактора (AF). Биологический эффект AF проявляется под действием любого пептида или полипептида, содержащего по меньшей мере 6 аминокислот, SEQ ID NO: 3 (AF-6), из указанной консенсусной последовательности, или ее модификации, не изменяющей функцию полипептида и/или пептида.
Иммунохимические и иммуногистохимические исследования показали, что белок антисекреторного фактора (AF) присутствует, а также может синтезироваться в большинстве тканей и органов в организме. Синтетические пептиды, содержащие антидиарейную последовательность, были охарактеризованы ранее (WO 97/08202; WO 05/030246).
Авторы настоящего изобретения показали, что антисекреторный фактор в некоторой степени является гомологичным с белком S5a и Rpn10, который входит в состав субъединицы компонента, распространенного во всех клетках, протеасомы 26 S, более конкретно, кэпа 19 S/PA 700. В настоящем изобретении, белки антисекреторного фактора (AF) определяют как класс гомологичных белков, имеющих одинаковые функциональные свойства. Антисекреторный фактор также в высокой степени сходен с ангиоцидином, одной другой белковой изоформой, известной, как связывающейся с тромбоспондином-1, и ассоциированной с прогрессированием злокачественного новообразования.
Все гомологи, производные и фрагменты белков антисекреторного фактора (AF) и/или пептидов согласно настоящему изобретению имеют аналогичную биологическую активность. Гомологи, производные и фрагменты в контексте настоящего описания содержат по меньшей мере 6 аминокислот (показанных в SEQ ID NO: 2), соответствующих этим же аминокислотам из природного белка антисекреторного фактора (AF), которые могут быть дополнительно модифицированы посредством изменения одной или более аминокислот, чтобы оптимизировать биологическую активность антисекреторного фактора, без изменения существенной функции полипептида и/или пептида.
Под производным в контексте настоящего описания подразумевают белок, имеющий эквивалентную активность и/или функциональную эквивалентную активность с антисекреторным фактором, определенным в настоящем описании, являющийся производным от одного другого вещества либо непосредственно или посредством модификации или частичной замены, где одна или более аминокислот были заменены на одну другую аминокислоту, причем эта аминокислота может являться модифицированной или неприродной аминокислотой. Например, производные антисекреторного фактора согласно изобретению могут содержать N-концевую и/или C-концевую защитную группу. Один пример N-концевой защитной группы включает ацетил. Один пример C-концевой защитной группы включает амид.
Кроме того, любая аминокислотная последовательность, являющаяся по меньшей мере на 70% идентичной, таким образом, как на меньшей мере на 72%, 75%, 77%, 80%, 82%, 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной с аминокислотной последовательностью белка антисекреторного фактора (AF), пептида, гомолога, производного и/или фрагмента согласно изобретению, также считается включенной в объем настоящего изобретения.
Способы определения идентичности и сходства кодифицированы в общедоступных программах. Предпочтительные способы с использованием компьютерных программ для определения идентичности и сходства между двумя последовательностями включают, но не ограничиваются перечисленными, пакеты программ GCG (Devereux, J et al (1994)) BLASTP, BLASTN и FASTA (Altschul, S.F. et al (1990)). Программа BLASTX является общедоступной от NCBI и других источников (BLAST Manual, Altschul, S.F. et al, Altschul, S.F. et al (1990)). Каждая программа анализа последовательностей имеет матрицу замен по умолчанию и штрафы за делецию по умолчанию. Как правило, ожидается, что молекулярный биолог будет применять установки по умолчанию, установленные программным обеспечением.
Белки антисекреторного фактора (AF) или пептид или гомолог, их производные и/или фрагмент, имеющую эквивалентную активность, определенную в настоящем описании, могут содержать 6 аминокислот или более, как, например 6-16 аминокислот, как, например, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 аминокислот или более. В других предпочтительных вариантах осуществления антисекреторный фактор состоит из 42, 43, 45, 46, 51, 80, 128, 129 или 163 аминокислот. В предпочтительных вариантах осуществления белок антисекреторного фактора (AF), его гомолог, производное, пептид и/или фрагмент согласно настоящему изобретению, состоят из 6, 7, 8 или 16 аминокислот.
В частности, белок антисекреторного фактора (AF) представляет собой белок с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO:2, или его гомолог, производное и/или фрагмент, содержащий аминокислоты 37-42 из SEQ ID NO:2.
AF-16 представляет собой фрагмент белка антисекреторного фактора (AF) с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO:1, таким образом, содержащий аминокислоты 37-42 из SEQ ID NO:2.
МЕДИЦИНСКИЕ ПОКАЗАНИЯ
Было показано, что белок антисекреторного фактора (AF), такой как, в частности, AF-16, обладает в целом управляющим воздействием на поток жидких сред организма через мембраны живых клеток, вследствие которого могут быть смягчены, излечены или предотвращены не только диарейные состояния, но также дискомфорт вследствие физиологического дисбаланса или болезненные состояния, вызванные экстремальным выделением жидких сред организма, такие как воспаления, отек, артрит, глаукома и другие изменения в организме, такие как мигрени, ожоги и травматические повреждения в и на организме.
Пищевые продукты и фармацевтические продукты согласно изобретению могут применяться с этой целью.
Пищевые продукты и фармацевтические продукты согласно изобретению могут применяться в качестве вспомогательного средства для лечения глиобластомы и/или для оптимизации доставки и клеточного поглощения фармацевтического вещества и/или лекарственной формы, такой как лекарственного средства против злокачественного новообразования, для иммунотерапии, лучевой терапии или доставки гена к опухолевой клетке глиобластомы.
Ранее было раскрыто, что белки и пептиды антисекреторного фактора (AF) нормализуют патологический транспорт жидких сред и/или воспалительные реакции, такие как в кишечнике и хороидном сплетении в центральной нервной системе после стимуляции холерным токсином (WO 97/08202). Пищевые продукты и фармацевтические продукты согласно изобретению могут применяться с этой целью.
В WO 97/08202 предположили, что пища и корм со способностью либо индуцировать эндогенный синтез AF или поглощение добавленного AF являются применимыми для лечения отека, диареи, дегидратации и воспаления. Пищевые продукты и фармацевтические продукты согласно настоящему изобретению могут применяться с этой целью.
Также было показано, что белки антисекреторного фактора (AF) и их фрагменты улучшают репарацию нервной ткани и пролиферацию, апоптоз, дифференциацию и/или миграции стволовых клеток и клеток-предшественников и производных от них клеток при лечении состояний, ассоциированных с потерей и/или приобретением клеток (WO 05/030246), и в равной степени являются эффективными при лечении и/или предотвращении внутриглазной гипертензии (WO 07/126364), а также для лечения и/или предотвращения компартмент-синдрома (WO 07/126363). Пищевые продукты и фармацевтические продукты согласно настоящему изобретению могут применяться с этой целью.
К тому же, авторы настоящего изобретения недавно показали, что AF способен к мониторингу и/или благоприятному воздействию на структуру, распределение и многие функции липидных рафтов, рецепторов и/или кавеол в мембранах и таким образом мог бы применяться для лечения и/или предотвращения структурной дезорганизации и дисфункции липидных рафтов и/или кавеол в клеточных мембранах (WO 07/126365). Пищевые продукты и фармацевтические продукты согласно настоящему изобретению могут применяться с этой целью.
Авторы настоящего изобретения дополнительно смогли доказать, что такой же белок антисекреторного фактора (AF), его пептиды и фрагменты могут вмешиваться в биологическую активацию трансмембранных белков, например, NKCC1, через FAK и CAP, и, что они, таким образом, могут напрямую регулировать патологическую активность ионного канала в патологических и/или поврежденных клетках, эффективно нормализуя внутриклеточное давление и функцию трансмембранного белка в указанной клетке, и, таким образом, обеспечивая улучшенное поглощение лекарственных средств, применяемых, например, при терапии злокачественного новообразования (WO 2010/093324). Пищевые продукты и фармацевтические продукты согласно настоящему изобретению могут применяться с этой целью.
WO 2014/096384 раскрывает, что белки антисекреторного фактора (AF), пептиды, гомологи и/или их фрагменты могут дополнительно применяться как при симптоматических, излечивающих, так и паллиативных терапиях глиобластомы. В частности, они могут применяться в качестве вспомогательного средства и/или для оптимизации доставки лекарственного средства и гена, а также в химиотерапии, иммунотерапии и лучевой терапии при лечении глиобластомы. Пищевые продукты и фармацевтические продукты согласно настоящему изобретению могут применяться с этой целью.
СПОСОБ
Один аспект настоящего изобретения относится к способу обеспечения яичного желтка из птичьих яиц с очень высоким содержанием белков антисекреторного фактора (AF), в частности, с очень высоким содержанием фрагмента белка AF, состоящего по существу из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ.ID.NO.1 (AF-16) и/или в SEQ.ID.NO. 2 (AF-8), причем указанный способ включает в себя кормление в течение по меньшей мере 12 недель сельскохозяйственных птиц, таких как куры, индуцирующим AF-16 и/или AF-8, предпочтительно гранулированным, кормом для сельскохозяйственных птиц, содержащим по меньшей мере 0,14% свободного триптофан, как, например, по меньшей мере 0,4% свободного триптофана, и затем сбор яиц от указанных сельскохозяйственных птиц, отделение яичного желтка от яичного белка, и альтернативно распылительную сушку, сушку в псевдоожиженном слое, измельчение, промывку, экстракцию, упаривание, мембранную фильтрацию и/или сублимационную сушку указанного яичного желтка.
В частности, способ согласно изобретению является применимым при кормлении птиц отряда куриных индуцирующим AF-16 и/или AF-8 гранулированным кормом для сельскохозяйственных птиц, как впервые описано в данном документе, в течение по меньшей мере 12 недель, предпочтительно между 12-20 неделями, как, например, между 12-18 неделями, таким образом, как по меньшей мере в течение 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 недель. При обеспечении кур через корм, во время по меньшей мере 12 недель, различающимися комбинациями аминокислот, сахаров и амидов могут быть индуцированы очень высокие уровни белков антисекреторного фактора (AF), и, в частности AF-16 и/или AF-8, предпочтительно, в яичном желтке.
В одном другом варианте осуществления, способ согласно изобретению является применимым при кормлении птиц отряда куриных индуцирующим AF-16 и/или AF-8 гранулированным кормом для сельскохозяйственных птиц, как впервые описано в данном документе, в течение по меньшей мере 4 недель, как, например, по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 недель, таким образом, предпочтительно между 4-12 неделями. При обеспечении кур через корм, во время по меньшей мере 4 недель, различающимися комбинациями аминокислот, сахаров и амидов могут быть индуцированы очень высокие уровни белков антисекреторного фактора (AF), и, в частности AF-16 и/или AF-8, предпочтительно, в яичном желтке.
Достигнутые в данном описании очень высокие уровни белков антисекреторного фактора (AF), и, в частности, AF-16 и/или AF-8, являются беспрецедентными и удивительными.
Изобретение иллюстрируется ниже посредством следующих неограничивающих примеров.
Индуцирующий AF-16 и/или AF-8 гранулированный корм для сельскохозяйственных птиц
В настоящем документе описан способ обеспечения яичного желтка из птичьих яиц с очень высоким содержанием белков антисекреторного фактора (AF), в частности с очень высоким содержанием фрагмента белка AF, состоящего по существу из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ.ID.NO.1 (AF-16) и/или SEQ.ID.NO. 2 (AF-8), причем указанный способ включает в себя кормление сельскохозяйственных птиц, таких как куры, в течение по меньшей мере 4 недель, как например, по меньшей мере 12 недель, индуцирующим AF-16 и/или AF-8 гранулированным кормом для сельскохозяйственных птиц, содержащим по меньшей мере 0,14% свободного триптофана или 1-2 грамма триптофана/кг корма.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, указанный индуцирующий AF-16 и/или AF-8 корм для сельскохозяйственных птиц содержит по меньшей мере 0,14-1% свободного триптофана, как, например, по меньшей мере 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, или 1% свободного триптофана.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, указанный индуцирующий AF-16 и/или AF-8 корм для сельскохозяйственных птиц содержит по меньшей мере 0,5 грамма триптофана/кг корма, как, например, по меньшей мере 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 или 3% триптофана/кг корма.
Корм предпочтительно находится в гранулированной форме. Термин ʺгранулированный кормʺ в контексте настоящего описания применяют для описания концентрированных кормов, изготовленных в форме гранул. Гранулы имеют преимущества в виде простоты манипуляций, отсутствия пыли и отходов и представления стандартной композиции в виде гранул.
В контексте настоящего описания, термин ʺкормʺ применяют для описания веществ, имеющих питательную ценность для животных. Каждый вид имеет обычную диету, составленную из кормов или пищевых веществ, которые соответствуют типу его пищеварительного тракта, и, которые являются экономичными, а также являются питательными и приятными на вкус. Сельскохозяйственные животные на выпасе имеют диету, которая является очень изменчивой и подвержена природным дефицитам питательных компонентов.
Одним способом обеспечения свободным триптофаном и другими дополнительными компонентами, и добавками является приготовление смеси этих веществ, которую добавляют к основному рациону. Эти смеси называют концентратами или премиксами и, поскольку они обычно имеют высокое содержание зерен злаков, смеси, которые содержат только зерно, также называют концентратами. В контексте настоящего описания, такой премикс обычно содержит по меньшей мере 2,5% свободного триптофана, 70-75% сахара, такого как декстроза, и 25-30% субстрата на основе злаковых культур, например, пшеницы.
Раскрытый в настоящее время корм может дополнительно содержать грубые корма, такие как сено, силос, травяную сечку, т.е. любой корм с высоким содержанием целлюлозы относительно других питательных компонентов.
Раскрытый в настоящее время корм может дополнительно содержать кормовые зерновые культуры, такие как злаковые и другие зерновые и зернобобовые культуры, применяемые как корм для животных, включающие пшеницу, ячмень, овес, рожь, кукурузу, горох, рапс, рапсовое семя, муку из рапсовых семян, муку из соевых бобов и сорго.
Раскрытый в настоящее время корм может дополнительно содержать кормовые добавки, т.е. питательные вещества, которые сами по себе являются пищевыми веществами и которые добавляют к основной диете, такой как подножный корм, чтобы восполнить его дефициты, такие как минералы и ароматизаторы. Кормовые добавки обычно включают следовые элементы и макрокорма, такие как белковые добавки.
ССЫЛКИ
1. Lange S. A rat model for an in vivo assay of enterotoxic diarrhea. FEMS Microbiol Lett 1982;15:239-42.
2. Bjorck S, Bosaeus I, Ek E, Jennische E, Lonnroth I, Johansson E, Lange S. Food-induced stimulation of the antisecretory factor can improve symptoms in human inflammatory bowel disease: a study of a concept. Gut 2000;46:824-9.
3. Goransson L, Lange S, Lonnroth I. Postweaning diarrhea: focus on diet. Pigs News and Information 1995;16:89N-91N.
4. Lange S, Lonnroth I. The antisecretory factor:synthesis, anatomical and cellular distribution, and biological action in experimental and clinical studies. Int Rev Cytol 2001;210:39-75.
5. Zaman S, Aamir K, Lange S, Jennische E, Silferdal SA, Hanson LA. Antisecretory factor effectively and safely stops childhood diarrhoea:a placebo-controlled, randomized study. Acta Paediatr 2014;103:659-664.
6. Zaman S, Mannan J, Lange S, Lonnroth I, Hanson LA. B 221, a medical food containing antisecretory factor reduces child diarrhoea:a placebo controlled trial. Acta Paediatr 2007;96:1655-9.
7. Lange S, Lonnroth I, Martinsson K. Concentrations of antisecretory factor in eggs and in chicken blood plasma. Br Poult Sci 1994;35:615-620.
ЭКСПЕРИМЕНТЫ
Эксперимент 1
Обнаружение и относительная количественная оценка AF-16 в Salovum с использованием ELISA и MALDI-MS
Методы и материалы
Получение Salovum, технические аспекты
in vivo
Salovum
После соответствующего концентрирования, антисекреторную активность AF в яичном желтке определяли посредством анализа методом лигированной петли у крыс, яйца собирали и хранили при+4°C. Желток затем отделяли от белка, пастеризовали, затем хранили в стерильных камерах и затем сушили распылением в комнатных условиях с использованием фильтрованного воздуха. Весь процесс происходил в условиях, обеспечивающих исключение денатурации белка. В итоге высушенный распылением яичный желток упаковывали в пакетики, каждый из которых содержал 4 грамма порошка яичного желтка.  может легко растворяться при комнатной температуре в воде или соке, и предпочтительно может вводиться в ананасовом соке, который полностью устранял вкус яиц.
Получение яичного желтка-AF
Salovum
Яичный желток, после серийной индукции AF, а также яичный желток, полученный от контрольных кур с низким содержанием AF, растворяли (пул из четырех желтков) в забуференном фосфатом физрастворе (PBS), центрифугировали при 1000×g в течение 5 мин и собирали супернатант. AF очищали из яичного желтка, используя аффинную хроматографию (Bjorck et al, 2000). Вкратце, после пропускания супернатанта яичного желтка через колонку с агарозой объемом 3 мл (Sepharose 6B, GE Healthcare Bio-sciences AB) и промывки в PBS, абсорбированный на агарозе AF элюировали 1M метил-a-D-глюкозидом. Элюат диализовали против PBS в течение 24 ч при 4°C и затем хранили при -20°C до применения.
Определение
in vivo
AF-активности в яичном желтке
Активность AF фракции очищенного яичного желтка определяли у крыс методом лигированной петли, используя холерный токсин (CT) в качестве стимулятора секреции (1). Таким образом, препарату AF, опосредующему 50% ингибирование CT-индуцированной секреции жидкой среды в петле тощей кишки у крысы, было присвоено значение "AF-единиц", равное 0,5. Предшествующие исследования на людях (2) и животных (3) показали, что значения AF > 0,5 AF-единиц коррелируют с уменьшением диарейной секреции (2).
Антитело против AF-16
36
51
Первичные поликлональные антитела против AF-пептида, -VCHSKTRSNPENNVGL-, индуцировали у кроликов (aP8). Пептид получали посредством органического химического синтеза на твердой фазе и последующее продуцирование антисыворотки проводили в Innovagen AB (Lund, Sweden).
Тест ELISA иммуногенного AF-16
2
Содержание AF-16 в яичном желтке анализировали в фермент-связанном иммуносорбентном тесте (ELISA). Очищенные аффинным методом образцы яичного желтка титровали в микротитровальных планшетах Maxisorp (Nunc) и инкубировали в течение ночи при 4°C. После блокирования 0,2% альбумином бычьей сыворотки (BSA) в PBS в течение 45 мин при 37°C, планшеты промывали PBS+0,05% Tween 20 (PBS-T). Поликлональные антитела, индуцированные против пептида AF-16 из AF, aP8 (разбавленные 1/500 в PBS+0,05% Tween 20+0,2% BSA), добавляли и планшеты инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре (КТ). После промывки, конъюгированные с щелочной фосфатазой (AP) козьи антитела против кроличьего иммуноглобулина IgG (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.) добавляли в течение 1 ч при КТ. После промывки, субстрат, 4-нитрофенилфосфат (Sigma-Aldrich Sweden AB) в диэтаноламиновом буфере (pH 9,8) с 1 мМ MgC1 добавляли в планшеты, и связанный фермент проявляли посредством считывания поглощения при 405 нм. Кроличью неиммунную сыворотку применяли в качестве фона, и значения вычитали с получением чистого значения поглощения.
Обнаружение AF-16 методом MALDI-масс-спектрометрии
Относительную количественную оценку пептида AF-16 в образцах яичного желтка, очищенных аффинным методом, проводили тестированием посредством масс-спектрометрии с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (MALDI-MS). 2 различных метода AutoXecute с удовлетворительным показателем числа импульсов 30000 и 10000 применяли для сбора данных от каждого образца, осажденного на пластине из шлифованной стали для MALDI с 80% интенсивностью лазера и гексагональным растровым движением. HCCA применяли в качестве раствора для матрицы и интенсивности сигналов от AF-16 нормализовали к сигналу от матрицы, равному 568,2 (3HCCA+H). Для тестирования метода авторы изобретения добавляли AF-16 к образцам яичного желтка после аффинной хроматографии и применяли такой же метод со сбором 30000 удовлетворительных импульсов.
Результаты
Яичный желток, тестированный на биологическую активность
in vivo
Образцы очищенного яичного желтка тестировали на предмет AF-активности при анализе методом лигированной петли у крыс. Желток собирали из яиц каждую неделю во время поглощения курами диеты, стимулирующей высокую выработку эндогенного AF. Результаты в Таблице 1 демонстрируют увеличенную AF-активность в течение до 14-15 недель приема внутрь диеты, после чего никакого дополнительного увеличения AF-активности не могли зарегистрировать посредством тестирования . Яйца окончательно собирали после непрерывного приема внутрь в течение 18 недель приема AF-стимулирующего корма. В этих яйцах можно было определить значительную AF-активность в яичных желтках, разбавленных 1:1000 (Таблица 1).
Таблица 1.
AF-активность в образцах очищенного яичного желтка, собранного от кур через 2-3, 8-9 и 14-18 недель после приема внутрь AF-индуцирующей диеты. Значение > 0,5 AF-единиц коррелирует с значительно сниженным выбросом при диарее.
<b>Тестируемая группа</b>
<b>Недели приема AF-индуцирующей диеты</b>
<b>N</b>
<b>AF-единиц Средн ± SEM*</b>
<b>Разведение желтка в тесте</b>
A
2-3
6
0,2 ± 0,01
B
8-9
6
0,6 ± 0,02
14-18
8
0,5 ± 0,02
1:1000
в сравн. с
Значимость: A B, P=0,0025
в сравн. с
A C, P=0,0123
в сравн. с
B C, P=NS
Яичный желток, тестированный посредством ELISA
Чтобы оценить эффект индукции AF при различных временных отметках, содержание AF-16 определяли с использованием aP8. Как показано на ФИГ. 1, уровень был низким в образцах, полученных после 10 недель индукции при достижении более чем в два раза увеличенного уровня через 18 недель.
ФИГ. 1.
Уровень AF-16 в очищенном аффинным методом яичном желтке по данным тестирования посредством ELISA с использованием aP8. Образцы от объединенных (n=4) яичных желтков анализировали и определяли чистое поглощение.
Относительную количественную оценку пептида AF-16 в образцах яичного желтка, очищенных аффинным методом, выполняли с использованием MALDI-MS, как можно видеть на ФИГ. 2. Два различных метода сбора данных (30000 и 10000 удовлетворительных импульсов, собранных от каждого образца) давали сходные результаты и показали увеличенную нормализованную интенсивность сигналов от 3 до 5 недель, от 5 до 9 недель и от 9 до 12 недель, соответственно. Поскольку в качестве раствора для матрицы использовали HCCA, интенсивности сигналов от AF-16 нормализовали к сигналу матрицы, равному 568,2 (3HCCA+H). Приблизительно двухкратное увеличение сигналов AF-16 наблюдали в образцах от 3 до 12 недель.
ФИГ. 2.
30000 (красные) и 10000 (синие) удовлетворительные лазерные импульсы, собранные от каждого образца, показывающие среднюю нормализованную интенсивность сигналов от пептида AF-16 от образцов очищенного яичного желтка в интервале 3-12 недель.
Чтобы оценить относительное количество пептида AF-16 в яичном желтке серию разведений пептида AF-16 добавляли к очищенным методом аффинной хроматографии образцам яичного желтка и анализировали с помощью MALDI. Результаты можно видеть на ФИГ. 3. Результаты нормализовали к 3 различным внутренним массовым пикам, и авторы изобретения наблюдали, что нормализация к трем различным сигналам от матрицы давала сходные результаты.
ФИГ. 3.
Относительное количество пептида AF-16 в яичном желтке по результатам анализа с использованием MALDI. Результаты нормализовали к 3 различным внутренним массовым пикам. На основании нормализованной интенсивности сигналов в серии разведений авторы изобретения смогли оценить, что относительное количество пептида AF-16 в образцах яичного желтка находится в интервале от 0,05 нг/мл через 12 недель.
На основании нормализованной интенсивности сигналов в серии разведений авторы изобретения смогли оценить, что относительное количество пептида AF-16 в образцах яичного желтка находится в интервале от 0,05 нг/мл через 12 недель.
Эксперимент 2
Антисекреторный фактор останавливает диарею в пределах менее трех часов без побочных эффектов.
Антисекреторный фактор (AF) является частью врожденной иммунной защиты организма у человека и животных. AF действует в совокупности с протеасомами и протеасома-комплементными C3 комплексами, предотвращая гиперсекрецию и воспаление без побочных эффектов.
AF может быть предоставлен для перорального введения в виде порошка яичного желтка, Salovum©.
В Пакистане у детей, страдающих от острой диареи, лечение Salovum© ранее показало снижение количества стулов и улучшало их консистенцию в пределах 10 часов в сравнении с 18 часами для группы плацебо.
2
3
Была получена новая партия Salovum© (Новый Salovum) с 10/10-кратным более сильным антисекреторным эффектом, чем у предшествующего препарата, чтобы провести даже более эффективное лечение диареи. Эту партию применяли для лечения детей, страдающих от водянистой диареи и от умеренной до тяжелой дегидратации, выбранных в Амбулаторной Педиатрической Клинике, Детского Госпиталя, в Лахоре, Пакистан. Восемь пациентов получали один пакетик (Новый Salovum) (4 грамма, группа 1), в то время как другие восемь пациентов получали два пакетика (Новый Salovum) (8 граммов, группа 2).
Протокол контроля диареи оставался одинаковым для всех пациентов за исключением дозы (Нового Salovum). При включении в испытания, среднее количество стулов с утра было сходным в обеих группах с 15 ± 4,6 в группе 1 и 13 ± 4,5 в группе 2, p=0,429. После приема питья (Новый Salovum), в группе 1 регистрировали в среднем 4 стула во время последующих 3 часов (65% снижение, p < 0,001), в то время как в среднем 2,7 стула наблюдали в группе 2 (68% снижение, p < 0,000). Консистенция стула улучшалась аналогично в обеих группах от первоначально водянистой (8, т.е. 100%) до водянистой (2, т.е. 25%) или полутвердой (6, т.е. 75%). Ни один из пациентов в группе 2 не показал признаков дегидратации после приема внутрь (Нового Salovum), в то время как шесть пациентов (75%) в группе 1 проявляли некоторые признаки, а два пациента (25%) проявляли тяжелые признаки.
Снижение количества стулов и улучшенную консистенцию наблюдали в пределах 91 минуты после приема с питьем (Нового Salovum) в группе 1 и через 68 минут в группе 2 (p=0,3302). Не было отмечено никаких побочных эффектов.
Прием Нового Salovum вскоре после наступления диареи в кварталах бедноты мог бы быть обеспечен, например, сельскими медсестрами, предпочтительно, с началом вскоре после наступления заболевания. Это смогло бы снизить необходимость оказания более квалифицированной медицинской помощи. Лечение Новым Salovum детской диареи могло бы, таким образом, привести к улучшению здоровья детей, стимулируя рост и развитие, достигаемые при низких затратах и без риска побочных эффектов.
Таблица 2.
Доза-ответ при лечении Новым Salovum детей, страдающих от диарейного заболевания. Группа 1 получала по одному пакетику (4 граммов), а группа 2 получала два пакетика (8 граммов) при включении в испытания. Клинический ответ на лечение Новым Salovum регистрировали в конце первых 3 часов периода регистрации с изменениями, регистрируемыми в течение этого времени.
Таблица 2
<b>Переменные</b>
<b>Группа 1</b>
<b>Группа 2</b>
<b>p-значение</b>
Средний возраст(месяцев)±SD
14,4375±8,898
16,5±5,318
0,5816
<b>Частота стула:</b>
Стулы, прошедшиес утра (средн±SD)
15 ±4,62*
13 ±4,50**
0,4291
Стулы, прошедшиеза 3 часа(средн±SD)
4,75±2,91*
2,75±2,18**
0,1430
Процентное снижение:
64,47%
<b>(p< 0,0001)</b>
68,11%
<b>(p< 0000)</b>
<b>Консистенция при поступлении:</b>
Водянистая
8/8 100%
8/8 100%
<b>После лечения:</b>
Водянистая
2/8 (25%)
2/8 (25%)
0,0035
Полу/Твердая
6/8 (75%)
6/8 (75%)
<b>Дегидратация, клинические признаки при первичном обследовании</b>
Некоторые
4 (50%)
2 (25%)
Умеренные
1 (12,5%)
5 (62,5%)
Тяжелые
3 (37,5%)
1 (12,5%)
<b>Дегидратация, клинические признаки после лечения</b>
Отсутствуют
0
8 (100%)
Некоторые
6 (75%)
0
Умеренные
0
0
Тяжелые
2 (25%)
0
<b>Среднее время, необходимое для ответа снижением до отсутствия стулов и улучшениия консистенции:</b>
91 минута
68 минут
0,3302
Замечание: общая продолжительность лечения OPD не превышала 3 часов, во время которых все пациенты, отправленные домой, сообщили об отсутствии всех симптомов.
T-тест и Chisq-тесты проводили для сравнений между средними значениями и соотношениями.
* До и после сравнений среднее количество стулов в группе 1 было достоверным (p<0,0001)
** До и после сравнений среднее количество стулов в группе 2 было достоверным (p<0,0000)
Эксперимент 3
Способ оценки природных антисекреторных белков в яйцах
1,75 грамма порошка высушенного яичного желтка растворяют в 6,4 мл раствора фосфатного буфера (PBS), представляя 20% сухого вещества яичного желтка. 4 мл этого раствора добавляют к 6 мл PBS (50% исходного содержания NASP). Разбавленный образец центрифугируют при 2000 g в течение десяти минут; супернатант переносят на колонку с агарозой (Сефароза). Абсорбированный NASP элюируют, используя альфа-метилглюкозид, и 1 мл элюата, содержащего NASP, собирают и диализуют. (Выход 100%). Настоящая патентная заявка устанавливает:
Образец, полученный, как указано выше, перед тестированием на модели кишечника крысы разбавляют 500 или 1000 раз. Аликвоту объемом 1 мл разбавленного образца вводят посредством внутривенной инъекции перед стимуляцией кишечника холерным токсином. Количество FIL-единиц рассчитывают, исходя из массы кишечника на сантиметр в тестируемой и контрольной группе крыс.
Содержание NASP в яйцах уравнивает результат, как определено выше, и его умножают на обратную степень разведения.
Таким образом, анализируемое содержание NASP в образцах равно результату, умноженному на 1000 или 2000.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  ЛАНТМЕННЕН АС-ФАКТОР АБ
<120>  Способ получения яичного желтка с высоким содержанием AF-16
<130>  PS54728PC00
<140>  PCT/
<141>  2016-06-14
<150>  SE 1551018-3
<151>  2015-07-10
<160>  4
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220> Активный Пептид
<221> ВАРИАНТ
<222> 6
<223> может быть заменен на A
<221> ВАРИАНТ
<222> 3
<223> может быть заменен на R или K
<221> ВАРИАНТ
<222> 4
<223> может быть заменен на L
<221> ВАРИАНТ
<222> 2
<223> может быть заменен на S
<400> 1
Val Cys His Ser Lys Thr Arg Ser Asn Pro Glu Asn Asn Val Gly Leu
1               5                  10                  15
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220> Активный Пептид
<221> ВАРИАНТ
<222> 6
<223> может быть заменен на A
<221> ВАРИАНТ
<222> 3
<223> может быть заменен на R или K
<221> ВАРИАНТ
<222> 4
<223> может быть заменен на L
<221> ВАРИАНТ
<222> 2
<223> может быть заменен на S
<400> 2
Val Cys His Ser Lys Thr Arg
1               5
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220> Активный Пептид
<221> ВАРИАНТ
<222> 5
<223> может быть заменен на A
<221> ВАРИАНТ
<222> 2
<223> может быть заменен на R или K
<221> ВАРИАНТ
<222> 3
<223> может быть заменен на L
<221> ВАРИАНТ
<222> 1
<223> может быть заменен на S
<400> 3
Cys His Ser Lys Thr Arg
1               5
<210> 4
<211> 382
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 4
Met Val Leu Glu Ser Thr Met Val Cys Val Asp Asn Ser Glu Tyr Met
1               5                  10                  15
Arg Asn Gly Asp Phe Leu Pro Thr Arg Leu Gln Ala Gln Gln Asp Ala
20                  25                  30
Val Asn Ile Val Cys His Ser Lys Thr Arg Ser Asn Pro Glu Asn Asn
35                  40                  45
Val Gly Leu Ile Thr Leu Ala Asn Asp Cys Glu Val Leu Thr Thr Leu
50                  55                  60
Thr Pro Asp Thr Gly Arg Ile Leu Ser Lys Leu His Thr Val Gln Pro
65                  70                  75                  80
Lys Gly Lys Ile Thr Phe Cys Thr Gly Ile Arg Val Ala His Leu Ala
85                  90                  95
Leu Lys His Arg Gln Gly Lys Asn His Lys Met Arg Ile Ile Ala Phe
100                 105                 110
Val Gly Ser Pro Val Glu Asp Asn Glu Lys Asp Leu Val Lys Leu Ala
115                 120                 125
Lys Arg Leu Lys Lys Glu Lys Val Asn Val Asp Ile Ile Asn Phe Gly
130                 135                 140
Glu Glu Glu Val Asn Thr Glu Lys Leu Thr Ala Phe Val Asn Thr Leu
145                 150                 155                 160
Asn Gly Lys Asp Gly Thr Gly Ser His Leu Val Thr Val Pro Pro Gly
165                 170                 175
Pro Ser Leu Ala Asp Ala Leu Ile Ser Ser Pro Ile Leu Ala Gly Glu
180                 185                 190
Gly Gly Ala Met Leu Gly Leu Gly Ala Ser Asp Phe Glu Phe Gly Val
195                 200                 205
Asp Pro Ser Ala Asp Pro Glu Leu Ala Leu Ala Leu Arg Val Ser Met
210                 215                 220
Glu Glu Gln Arg His Ala Gly Gly Gly Ala Arg Arg Ala Ala Arg Ala
225                 230                 235                 240
Ser Ala Ala Glu Ala Gly Ile Ala Thr Thr Gly Thr Glu Asp Ser Asp
245                 250                 255
Asp Ala Leu Leu Lys Met Thr Ile Ser Gln Gln Glu Phe Gly Arg Thr
260                 265                 270
Gly Leu Pro Asp Leu Ser Ser Met Thr Glu Glu Glu Gln Ile Ala Tyr
275                 280                 285
Ala Met Gln Met Ser Leu Gln Gly Ala Glu Phe Gly Gln Ala Glu Ser
290                 295                 300
Ala Asp Ile Asp Ala Ser Ser Ala Met Asp Thr Ser Glu Pro Ala Lys
305                 310                 315                 320
Glu Glu Asp Asp Tyr Asp Val Met Gln Asp Pro Glu Phe Leu Gln Ser
325                 330                 335
Val Leu Glu Asn Leu Pro Gly Val Asp Pro Asn Asn Glu Ala Ile Arg
340                 345                 350
Asn Ala Met Gly Ser Leu Pro Pro Arg Pro Pro Arg Thr Ala Arg Arg
355                 360                 365
Thr Arg Arg Arg Lys Thr Arg Ser Glu Thr Gly Gly Lys Gly
370                 375                 380
<---