ПРОИЗВОДСТВО БЕЛКА КАНОЛЫ
CANOLA PROTEIN PRODUCTION

Ссылка на родственную заявку
Настоящая заявка претендует согласно 35 Своду законов США 119(е), на дату приоритета, указанную в предварительной патентной заявке США №60/695535 от 1 июля 2005 г.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к новым способам получения белка канолы 2S, практически не содержащего белков канолы 7S и 12S.
Предшествующий уровень техники
Изоляты белка канолы можно получать из муки из масличных семян канолы. В совместно рассматривающихся патентных заявках США №10/137391 с датой подачи 3 мая 2002 г. (публикация патентной заявки США №20030125526 А1), 10/476230 с датой подачи 9 июня 2004 г. (публикация патентной заявки США №20040254353 А1) и в соответствующей опубликованной Международной заявке № WO 02/089597, правопреемником по которым является автор настоящей заявки и которые включены в перечень ссылок, принятых во внимание при составлении настоящей заявки, описывается способ получения изолятов белка канолы из муки из масличных семян канолы, причем указанные изоляты имеют содержание белка, по меньшей мере, 100 мас.% (N×6,25). Способ представляет собой многостадийный процесс, включающий экстракцию муки из масличных семян канолы раствором соли; отделение полученного водного белкового раствора от остаточной муки из масличных семян; повышение концентрации белка в водном растворе, по меньшей мере, до примерно 200 г/л при поддержании ионной силы раствора, в основном, постоянной, с применением селективной мембранной технологии; разбавление полученного концентрированного белкового раствора охлажденной водой с тем, чтобы вызвать образование белковых мицелл; осаждение белковых мицелл отстаиванием с образованием аморфной, клейкой, студнеобразной как клейковина, белковой мицеллярной массы (РММ) и извлечение из супернатанта белковой мицеллярной массы, имеющей содержание белка, по меньшей мере, около 100 мас.%, при определении его по Кьельдалю (N×6,25). В контексте настоящего описания содержание белка указывается в пересчете на сухое вещество. Извлекаемую РММ можно подвергнуть сушке.
В одном из вариантов воплощения описанного выше способа супернатант на стадии осаждения РММ отстаиванием подвергается обработке с целью извлечения изолята белка, содержащего сухой белок из влажной РММ и супернатанта. Эта операция может осуществляться путем начального концентрирования супернатанта с использованием ультрафильтрационных мембран, смешивания концентрированного супернатанта с влажной РММ и сушки смеси. Полученный изолят белка канолы имеет высокую степень чистоты - по меньшей мере, примерно 90 мас.% белка (N×6,25), предпочтительно - по меньшей мере, около 100 мас.% белка ((N×6,25).
В другом варианте описанного выше способа супернатант на стадии осаждения РММ отстаиванием подвергается обработке с целью извлечения белка из супернатанта. Эта операция может осуществляться путем начального концентрирования супернатанта с использованием ультрафильтрационных мембран и сушки концентрата. Полученный изолят белка канолы имеет высокую степень чистоты - по меньшей мере, примерно 90 мас.% белка (N×6,25), предпочтительно - по меньшей мере, около 100 мас.% белка ((N×6,25).
Способы, описанные в вышеупомянутых патентных заявках США, являются преимущественно периодическими способами. В совместно рассматривающихся патентной заявке США №10/298 678 с датой подачи 19 ноября 2002 г. (публикация патентной заявки США №20040039174 А1) и соответствующей опубликованной Международной заявке № WO 03/043439, правопреемником по которым является автор настоящей заявки и которые включены в перечень ссылок, принятых во внимание при составлении настоящей заявки, описывается непрерывный способ получения изолятов белка канолы. В соответствии с этим способом мука из масличных семян канолы непрерывно смешивается с раствором соли; смесь транспортируется по трубопроводу при одновременном экстрагировании белка из муки из масличных семян канолы с образованием водного белкового раствора; водный белковый раствор непрерывно отделяется от остаточной муки из масличных семян канолы; водный белковый раствор непрерывно пропускается через операцию с селективной мембраной для повышения содержания белка в водном белковом растворе, по меньшей мере, до примерно 200 г/л при одновременном поддержании ионной силы раствора, в основном, постоянной; полученный концентрированный белковый раствор непрерывно смешивается с охлажденной водой с целью вызвать формирование белковых мицелл, и белковые мицеллы непрерывно осаждаются отстаиванием при одновременном непрерывном удалении супернатанта до тех пор, пока в резервуаре-отстойнике не накопится требуемое количество РММ. РММ выгружается из резервуара-отстойника и может подвергаться сушке. РММ имеет содержание белка, по меньшей мере, примерно 90 мас.% при определении его по Кьельдалю (N×6,25), предпочтительно - по меньшей мере, около 100 мас.% (N×6,25).
Как описано в вышеупомянутых патентных заявках США №10/137391 и 10/471230, сливаемый супернатант может подвергаться обработке с целью извлечения из него изолята белка канолы.
Известно, что семена канолы содержат примерно от 10 до 30 мас.% белков и несколько различных белковых компонентов уже идентифицированы. Эти белки отличаются разными коэффициентами седиментации (S). Эти известные и идентифицированные белки включают глобулин 12S, известный как круциферин, и запасной белок 2S, известный как напин.
Канола известна также как рапс или масличный рапс.
В совместно рассматривающихся патентных заявках США №10/413371 с датой подачи 25 августа 2003 г. (публикация патентной заявки США №20040034204) и 10/510766 с датой подачи 15 апреля 2003 г., а также в соответствующей опубликованной Международной заявке № WO 03/08876, правопреемником по которым является автор настоящей заявки и которые включены в перечень ссылок, принятых во внимание при составлении настоящей заявки, описывается состав изолята белка канолы, полученного из РММ, и изолята белка канолы, полученного из супернатанта. Изолят белка канолы, выделенный из супернатанта, содержит главным образом белок 2S, наряду с пониженным количеством белка 7S и следовым количеством белка 12S. Белок 2S представляет собой низкомолекулярный альбумин. Изолят белка канолы, полученный из РММ, содержит преимущественно белок 7S, наряду с присутствующими в относительно малых количествах белками 2S и 12S. Белки 7S и 12S представляют собой глобулины с более высокой молекулярной массой, причем молекула 7S составляет половину молекулы белка 12S.
Как описывается в вышеупомянутых заявках, изолят белка канолы, выделенный из супернатанта, имеет белковый профиль, который включает:
примерно от 60 до 95 мас.% белка 2S,
примерно от 5 до 40 мас.% белка 7S и
примерно от 0 до 5 мас.% белка 12S,
предпочтительно:
примерно от 70 до 95 мас.% белка 2S,
примерно от 5 до 30 мас.% белка 7S и
примерно от 0 до 2 мас.% белка 12S.
Изолят белка канолы, вьщеленный из РММ, имеет белковый профиль, который включает:
примерно от 60 до 98 мас.% белка 7S,
примерно от 1 до 15 мас.% белка 12S и
примерно от 0 до 25 мас.% белка 2S,
предпочтительно:
примерно от 88 до 98 мас.% белка 7S,
примерно от 1 до 10 мас.% белка 12S и
примерно от 0 до 6 мас.% белка 2S.
Установлено, что выделенный из супернатанта изолят белка канолы, состоящий преимущественно из белка 2S, проявляет более выраженные функциональные свойства при применении его в определенных областях, чем полученный из РММ изолят белка канолы, состоящий главным образом из белка 7S. В способах, описанных в вышеупомянутых заявках, для получения изолята белка канолы из супернатанта необходимо пройти через стадии образования РММ и обеспечения супернатанта, с тем чтобы фактически фракционировать белки канолы.
В патентной заявке США №11/038086 с датой подачи 21 июля 2005 г. (публикация патентной заявки США № US 2005-0181112А1), правопреемником по которой является автор настоящей заявки и которая включена в перечень ссылок (WO 2005/067729), принятых во внимание при составлении настоящей заявки, описывается способ, в котором супернатант от осаждения РММ после мембранной обработки подвергается тепловой обработке с целью осаждения белка 7S и получения белкового раствора, обогащенного белком 2S. Остаточный раствор может подвергаться распылительной сушке.
Белок 2S с минимальной относительной долей белков 7S и 12S имеет более высокую растворимость, чем необработанный белок 2S, при кислотных значениях pH и способен обеспечивать повышенную прозрачность в растворе и с безалкогольными напитками, давая прозрачные обогащенные белком напитки.
Краткое описание изобретения
Авторами настоящей заявки неожиданно было установлено, что в случае, если экстракцию муки из масличных семян канолы проводить при повышенной температуре, а не при температуре окружающей среды, то будет экстрагироваться преимущественно белок 2S, а не белки 7S и 12S, и что белок канолы в полученном растворе экстракта будет состоять преимущественно из белка 2S, который затем можно выделить в относительно чистом виде из экстракционного раствора.
Не желая останавливаться на какой-либо теории, авторы настоящей заявки выдвинули предположение, что возможность селективно экстрагировать белок канолы 2S вместо белков 7S и/или 12S при повышенной температуре экстракции обусловлена распадом и осаждением белков 7S и 12S в муке из масличных семян канолы в процессе стадии экстракции.
Таким образом, в одном аспекте настоящего изобретения обеспечивается способ производства изолята белка канолы, состоящего преимущественно из белка канолы 2S, который включает экстракцию муки из масличных семян канолы водным раствором соли при повышенной температуре с экстрагированием преимущественно белка 2S из муки из масличных семян канолы вместо белков 7S и 12S и получением раствора экстракта белка канолы, содержащего предпочтительно белок 2S; отделение раствора экстракта белка канолы от остаточной муки из масличных семян канолы и извлечение из раствора экстракта белка канолы изолята белка канолы, имеющего содержание белка, по меньшей мере, примерно 90 мас.% (N×6,25) и состоящего преимущественно из белка канолы 2S.
Также было установлено, что в случае, если проводить экстракцию муки из масличных семян канолы в две стадии, причем на первой стадии - водой, а на второй стадии - водным раствором соли, то на первой стадии экстракции можно получить водный раствор белка канолы, содержащий преимущественно белок 7S, а на второй стадии экстракции - водный раствор экстракта белка канолы, содержащий преимущественно белок 2S.
Начальная стадия экстракции муки из масличных семян канолы водой солюбилизирует значительное количество белков 7S и 12S, пониженное количество белка 2S и основную массу растворимых примесей. Вторая стадия экстракции водным раствором соли приводит к получению водного раствора белка канолы, содержащего большое количество белка 2S, минорные количества белков 7S и 12S и низкую концентрацию растворимых примесей.
Водный солевой экстракт белка канолы концентрируется, подвергается диафильтрации с целью снижения содержания соли, а затем подвергается тепловой обработке с целью осаждения остаточных белков 7S и 12S в соответствии со способом, описанным в вышеупомянутой патентной заявке США №11/038086.
Согласно следующему аспекту настоящего изобретения обеспечивается способ производства изолята белка канолы, состоящего преимущественно из белка канолы 2S, который включает экстракцию муки из масличных семян канолы водой с целью экстрагирования преимущественно белков канолы 7S и 12S и растворимых примесей вместо белка 2S с получением первого раствора экстракта белка канолы; отделение первого раствора экстракта белка канолы от остаточной муки из масличных семян; экстракцию остаточной муки из масличных семян водным раствором соли с целью растворения белков 2S, 7S и 12S из остаточной муки из масличных семян с получением второго раствора экстракта белков канолы и извлечение изолята белка канолы, имеющего содержание белка, по меньшей мере, примерно 90 мас.% (N×6,25) и состоящего преимущественно из белка канолы 2S из второго раствора экстракта белков канолы.
Также было установлено, что концентрированный раствор белка канолы на стадии концентрирования, описанной в вышеупомянутой патентной заявке США №10/137391, можно подвергнуть тепловой обработке способом, описанным в вышеупомянутой патентной заявке США №11/038586, для осаждения основной массы содержащихся в нем белков 7S и 12S и получения концентрированного водного раствора белка канолы, состоящего, в основном, из белка 2S.
Согласно этому аспекту настоящего изобретения обеспечивается способ производства изолята белка канолы, состоящего преимущественно из белка канолы 2S, который включает экстракцию муки из масличных семян канолы водным раствором соли для экстрагирования белков канолы из муки из масличных семян канолы и получения раствора белков канолы; отделение раствора белков канолы от остаточной муки из масличных семян; концентрирование указанного раствора белков канолы для обеспечения концентрированного белкового раствора в виде ретентата; тепловую обработку концентрированного белкового раствора для селективного осаждения белков канолы 7S и 12S из концентрированного раствора белков канолы вместо белка канолы 2S с получением подвергнутого тепловой обработке раствора белка канолы, содержащего преимущественно белок канолы 2S; отделение подвергнутого тепловой обработке раствора белка канолы от осажденных белков и извлечение изолята белка канолы, имеющего содержание белка, по меньшей мере, примерно 90 мас.% (N×6,25) и состоящего преимущественно из белка канолы 2S, из отделенного, подвергнутого тепловой обработке, раствора белка канолы.
Также было установлено, что водный раствор белков канолы, полученный экстракцией раствором соли муки из масличных семян канолы согласно способу, описанному в вышеупомянутой патентной заявке США №10/137391, можно подвергнуть тепловой обработке способом, описанным в вышеупомянутой патентной заявке США №11/038586, для осаждения большей части белков 7S и 12S, содержащихся в нем, и получения водного раствора белка канолы, состоящего преимущественно из белка 2S.
В соответствии с этим аспектом настоящего изобретения обеспечивается способ производства изолята белка канолы, состоящего преимущественно из белка канолы 2S, который включает экстракцию муки из масличных семян канолы водным раствором соли для экстрагирования белков канолы из муки из масличных семян канолы и получения раствора белков канолы; отделение раствора белков канолы от остаточной муки из масличных семян; тепловую обработку концентрированного белкового раствора для селективного осаждения белков канолы 7S и 12S, при удерживании белка канолы 2S в растворе, из раствора белков канолы с получением подвергнутого тепловой обработке раствора белка канолы, содержащего преимущественно белок 2S; отделение подвергнутого тепловой обработке раствора белков канолы от осажденных белков и извлечение изолята белка канолы, имеющего содержание белка, по меньшей мере, примерно 90 мас.% (N×6,25) и состоящего преимущественно из белка канолы 2S, из отделенного подвергнутого тепловой обработке раствора белка канолы.
Способы настоящего изобретения позволяют получать изолят белка канолы, состоящий преимущественно из белка канолы 2S, без необходимости проведения стадии РММ-осаждающего фракционирования, что значительно упрощает способ и обеспечивает более экономичное получение изолята белка канолы с преобладанием в нем белка 2S.
Изоляты белка канолы, полученные описываемыми здесь способами, могут применяться в традиционных областях применения белковых изолятов, например, для обогащения белком пищевых продуктов технологической обработки, для эмульгирования масел, в качестве структурообразователей в хлебопекарных изделиях и пенообразователей во взбитых продуктах. В дополнение к этому, изоляты белка канолы могут формироваться в белковые волокна, пригодные для использования в аналогах мяса, могут применяться в качестве заменителя яичного белка или удешевляющего стоимость продуктов наполнителя в тех пищевых продуктах, в которых яичный белок используется как связующее вещество. Изолят белка канолы может применяться в качестве питательных добавок. Другие сферы применения изолята белка канолы включают производство обогащенных белком напитков, кормов для домашних животных, кормов для сельскохозяйственного скота, промышленная переработка, производство косметических товаров и изделий для личной гигиены.
Подробное описание изобретения
Как описывалось выше, настоящее изобретение обеспечивает четыре варианта способа получения раствора белка канолы, состоящего преимущественно из белка 2S и практически не содержащего белков 7S и 12S.
(а) Высокотемпературная экстракции муки из масличных семян канолы
Начальная стадия способа производства изолятов белка канолы, согласно этому аспекту изобретения, включает солюбилизацию белкового материала из муки из масличных семян канолы. Белковый материал, извлекаемый из муки из масличных семян канолы, может быть нативным белком семян канолы или белковый материал может представлять собой генетически модифицированный белок, но обладающий характерными для нативного белка гидрофобными и полярными свойствами. Мука канолы может быть любой мукой канолы, полученной от удаления масла канолы из масличных семян канолы, с варьирующими уровнями неденатурированного белка, например, от способов экстракции горячим гексаном или холодной экструзии масла. Удаление масла канолы из муки из масличных семян канолы обычно осуществляется как отдельная операция описываемого здесь процесса извлечения изолята белка канолы.
Солюбилизация белка в одном аспекте настоящего изобретения наиболее эффективно осуществляется при использовании раствора соли пищевого качества, поскольку присутствие соли благоприятствует выделению растворимого белка из муки из масличных семян. Если изолят белка канолы предназначен для непищевого использования, то могут применяться химические реактивы непищевого качества. Соль обычно является хлоридом натрия, хотя могут использоваться и другие соли, например, хлорид калия. Раствор соли имеет ионную силу, по меньшей мере, примерно 0,05, предпочтительно - по меньшей мере, примерно 0,10, до примерно 0,2, что обеспечивает солюбилизацию значительных количеств извлекаемого белка. По мере увеличения ионной силы раствора соли степень солюбилизации белка в муке из масличных семян сначала повышается до тех пор, пока не достигнет максимального значения. Любое последующее увеличение ионной силы не приводит к увеличению солюбилизированного общего белка. Ионная сила раствора соли пищевого качества, которая вызывает максимальную солюбилизацию белка, варьирует в зависимости от используемой соли и выбранной муки из масличных семян канолы.
Экстракция муки из масличных семян канолы в данном аспекте настоящего изобретения проводится при повышенной температуре, в большинстве случаев при температуре примерно от 70°С до 100°С, предпочтительно - примерно от 80°С до 95°С, с тем чтобы обеспечить преимущественное экстрагирование белка канолы 2S из муки из масличных семян в раствор экстракта белка в противовес белкам 7S и 12S.
Водный раствор соли пищевого качества обычно имеет pH примерно от 5 до 6,8, предпочтительно - примерно от 5,3 до 6,2. pH раствора соли может устанавливаться на любом требуемом уровне в диапазоне примерно от 5 до 6,8 на стадии экстракции путем добавления при необходимости либо подходящей для этого кислоты, обычно соляной, либо щелочи, обычно гидроксида натрия.
Концентрация муки из масличных семян канолы в растворе соли пищевого качества в процессе стадии солюбилизации может варьировать в широких пределах. Типичные показатели концентрации составляют примерно от 5 до 15 мас.%/об.
Белковый раствор, полученный на стадии экстракции, в большинстве случаев имеет концентрацию белка примерно от 1 до 40 г/л, предпочтительно - примерно от 10 до 20 г/л.
Белковый раствор в большинстве случаев характеризуется белковым профилем, который включает:
примерно от 80 до 100 мас.% белка 2S,
примерно от 0 до 10 мас.% белка 7S и
примерно от 0 до 10 мас.% белка 12S;
предпочтительно:
примерно от 85 до 100 мас.% белка 2S,
от 0 до 15 мас.% белка 7S и
от 0 до 5 мас.% белка 12S.
Водный раствор соли может содержать антиоксидант. Антиоксидант может представлять собой любой, пригодный для данной цели антиоксидант, такой как сульфит натрия или аскорбиновая кислота. Количество используемого антиоксиданта может варьировать примерно от 0,01 до 1 мас.% раствора, предпочтительно - примерно 0,05 мас.%. Антиоксидант служит для ингибирования окисления фенольных соединений в белковом растворе.
Водную фазу на стадии экстракции можно отделить затем от остаточной муки канолы любым удобным способом, например, с применением центрифуги-декантатора с последующим центрифугированием в тарельчатой центрифуге и/или фильтрацией для удаления остаточной муки. Отделенную остаточную муку можно подвергнуть сушке для последующего использования.
Цвет готового изолята белка канолы можно улучшить в плане его осветления и придания менее интенсивного желтого оттенка путем смешивания активированного угля в порошке или другого адсорбирующего пигменты агента с отделенным водным белковым раствором и последующего удаления адсорбента, например, фильтрацией, с получением белкового раствора. Для удаления пигментов может применяться и диафильтрация.
Указанная стадия удаления пигментов может осуществляться в любых, пригодных для этого условиях, в большинстве случаев при температуре окружающей среды отделенного водного белкового раствора, содержащего пригодный для данной цели адсорбирующий пигменты агент. Активированный уголь в порошке используется в количестве примерно от 0,025% до 5 мас.%/об., предпочтительно - примерно от 0,05% до 2 мас.%/об.
Если мука из семян канолы содержит значительные количества жира, как описывается в патентах США №5844086 и 6005076, правопреемником по которым является автор настоящей заявки и которые включены в перечень ссылок к настоящей заявке, то раскрываемые в этих патентах стадии обезжиривания могут проводиться на отделенном водном белковом растворе и на концентрированном водном белковом растворе, что обсуждается ниже. Если проводится стадия улучшения цвета, то такая стадия может осуществляться после первой стадии обезжиривания.
Водный раствор белкового экстракта подвергается обработке с целью извлечения из него изолята белка канолы. Полученный таким путем изолят белка канолы имеет содержание белка, по меньшей мере, примерно 90 мас.% (N×6,25), предпочтительно - по меньшей мере, примерно 100 мас.%, и состоит преимущественно из белка 2S.
При указанной обработке раствор белкового экстракта может концентрироваться для повышения концентрации белка в нем. Такое концентрирование осуществляется с применением пригодной для этого селективной мембранной технологии, такой как ультрафильтрация, с использованием мембран с соответствующей пороговой проницаемостью по молекулярной массе, обеспечивающей прохождение через мембраны низкомолекулярных соединений, включая соль и другие небелковые низкомолекулярные материалы, экстрагируемые из белкового сырья, при одновременном удержании белка канолы в растворе. Для этой цели могут применяться ультрафильтрационные мембраны с пороговой проницаемостью по молекулярной массе примерно от 3000 до 100000 дальтон, предпочтительно - примерно от 5000 до 10000 дальтон, в зависимости от различных материалов, из которых изготовлены мембраны, и конфигурации последних. Концентрирование раствора белкового экстракта таким методом сокращает также объем жидкости, который необходимо удалить в процессе сушки с тем, чтобы извлечь белок. Раствор белкового экстракта концентрируется до концентрации белка, по меньшей мере, примерно 50 г/л, предпочтительно - примерно от 100 до 400 г/л, более предпочтительно - примерно от 200 до 300 г/л. Указанная операция концентрирования может осуществляться в периодическом режиме или в непрерывном режиме.
Как хорошо известно, ультрафильтрация и аналогичные ей селективные мембранные технологии обеспечивают прохождение через мембраны низкомолекулярных соединений при одновременном удержании на мембране соединений с более высокой молекулярной массой. Низкомолекулярные соединения включают не только ионные разновидности соли пищевого качества, но и низкомолекулярные материалы, экстрагируемые из исходного сырья, такие как углеводы, пигменты и антипитательные факторы. Выбор мембран обычно проводится по их пороговой проницаемости по молекулярной массе с тем, чтобы гарантировать удерживание значительного количества белка в растворе при одновременном пропускании мембранами загрязняющих веществ, в зависимости от различных материалов, из которых изготовлены мембраны, и конфигурации последних.
Концентрированный раствор белкового экстракта может подвергаться затем стадии диафильтрации с добавлением воды. Такая диафильтрация может проводиться с использованием примерно от 2 до 20 объемов диафильтрационного раствора, предпочтительно - примерно от 5 до 10 объемов диафильтрационного раствора. При операции диафильтрации из водного раствора белкового экстракта удаляются дополнительные количества загрязняющих веществ в результате прохождения их через мембрану вместе с пермеатом. Операция диафильтрации может осуществляться до тех пор, пока в пермеат не перейдут значительные дополнительные количества фенольных соединений и красящих соединений с видимой окраской. Указанная диафильтрация может осуществляться с применением той же мембраны, какая использовалась на стадии концентрирования. Однако при необходимости диафильтрация может проводиться с применением отдельной мембраны, например, мембраны с пороговой проницаемостью по молекулярной массе примерно от 3000 до 100000 дальтон, предпочтительно - примерно от 5000 до 10000 дальтон, в зависимости от различных материалов, из которых изготовлены мембраны, и конфигурации последних.
В диафильтрационной среде, по меньшей мере, на каком-то этапе стадии диафильтрации может присутствовать антиоксидант. В качестве антиоксиданта может использоваться любой подходящий антиоксидант, такой как сульфит натрия или аскорбиновая кислота. Количество антиоксиданта в диафильтрационной среде зависит от используемых материалов и может варьировать примерно от 0,01 до 1 мас.%, предпочтительно - около 0,05 мас.%. Антиоксидант служит для ингибирования окисления фенольных соединений, присутствующих в концентрированном растворе белкового экстракта.
Стадия концентрирования и стадия диафильтрации могут проводиться при любой подходящей температуре, в большинстве случаев при температуре примерно от 20°С до 60°С, предпочтительно - примерно от 20°С до 30°С, и в течение периода времени, достаточного для достижения требуемой степени концентрирования. Применяемые температурные и другие режимы зависят до некоторой степени от мембранного оборудования, используемого для осуществления концентрирования, и от требуемой концентрации белка в растворе.
Концентрированный и необязательно диафильтрованный белковый раствор может подвергаться дополнительной операции обезжиривания, если таковая требуется, как описывается в патентах США №5844086 и 6005076.
Концентрированный и необязательно диафильтрованный белковый раствор может подвергаться операции удаления цвета (окрашенных веществ), служащей альтернативой описанной выше операции удаления цвета. Для этой цели может использоваться активированный уголь в порошке, а также гранулированный активированный уголь (GAC). Другим материалом, который может применяться в качестве агента, абсорбирующего окрашенные вещества, является поливинилпирролидон.
Стадия обработки агентом, абсорбирующим окрашенные вещества, может проводиться в любых, пригодных для этого условиях, в большинстве случаев при температуре окружающей среды раствора белка канолы. Активированный уголь в порошке может использоваться в количестве примерно от 0,025% до 5 мас.%/об., предпочтительно - примерно от 0,05% до 2 мас.%/об. Если в качестве агента, абсорбирующего окрашенные вещества, применяется поливинилпирролидон, то его количество может составлять примерно от 0,5% до 5 мас.%/об., предпочтительно - примерно от 2% до 3 мас.%/об. Агент, абсорбирующий окрашенные вещества, может удаляться из раствора белка канолы любым удобным способом, например, фильтрацией.
При необходимости концентрированный и необязательно диафильтрованный водный белковый раствор может подвергаться стадии тепловой обработки для снижения количества белков 7S и 12S, присутствующих в растворе. Указанная тепловая обработка может проводиться с применением температурно-временного профиля, достаточного для снижения количественной доли белков 7S и 12S, присутствующих в растворе, предпочтительно для значительного снижения количественной доли белков 7S и 12S. В большинстве случаев содержание белков 7S и 12S в растворе снижается тепловой обработкой, по меньшей мере, примерно на 50 мас.%, предпочтительно - по меньшей мере, на 75 мас.%. В большинстве случаев тепловая обработка может проводиться при температуре примерно от 70°С до 100°С, предпочтительно - примерно от 75°С до 95°С, в течение примерно от 2 до 30 минут, предпочтительно - примерно от 5 до 15 минут. Осажденные белки 7S и 12S могут удаляться и извлекаться любым удобным способом, например, центрифугированием или фильтрацией.
Концентрированный и необязательно диафильтрованный и необязательно подвергнутый тепловой обработке водный белковый раствор может подвергаться сушке любым удобным способом, таким как распылительная сушка или сублимационная сушка, для получения в высушенном состоянии изолята белка канолы, который состоит преимущественно из белка канолы 2S и который имеет содержание белка, по меньшей мере, примерно 90 мас.% (N×6,25), предпочтительно - по меньшей мере, 100 мас.%.
(б) Многократные экстракции муки из масличных семян канолы
Начальная стадия способа производства изолятов белка канолы включает солюбилизацию белкового материала из муки из масличных семян канолы. Белковый материал, извлекаемый из муки из масличных семян канолы, может быть нативным белком семян канолы или белковый материал может представлять собой белок, модифицированный генетической манипуляцией, но обладающий характерными для нативного белка гидрофобными и полярными свойствами. Мука канолы может быть любой мукой канолы, полученной в результате удаления масла канолы из масличных семян канолы, с варьирующими уровнями неденатурированного белка, например, в результате способов экстракции горячим гексаном или холодной экструзии масла. Удаление масла канолы из муки из масличных семян канолы обычно осуществляется как отдельная операция описываемого здесь процесса извлечения изолята белка канолы.
Солюбилизация белка согласно данному аспекту настоящего изобретения осуществляется в несколько стадий. На первой стадии в качестве среды для экстракции используется вода, которая экстрагирует преимущественно белки канолы 7S и 12S из муки из масличных семян канолы вместо белка канолы 2S, наряду со значительными количествами растворимых примесей. Стадия экстракции водой может осуществляться как однократная экстракция водой муки из масличных семян канолы или как многократная экстракция водой муки из масличных семян канолы, например, в виде примерно от 2 до 25 экстракций, предпочтительно - примерно от 2 до 4 экстракций.
Водный раствор белков 7S и 12S может подвергаться обработке любым требуемым способом для извлечения из него белков 7S и 12S в виде изолята белка канолы. Например, водный белковый раствор после добавления раствора соли может подвергаться стадиям концентрирования и образования белковых мицелл, как описывается в вышеупомянутой патентной заявке США №10/137391.
Экстракция водой муки из масличных семян канолы может проводиться при температуре примерно от 10°С до 70°С, предпочтительно - примерно от 55°С до 65°С. Концентрация муки из масличных семян канолы в воде на стадии солюбилизации может варьировать в широких пределах. Типичные показатели концентрации составляют примерно от 5 до 15 мас.%/об.
Белковый раствор, полученный на стадии экстракции водой, в большинстве случаев имеет концентрацию белка примерно от 10 до 40 г/л, предпочтительно - примерно от 10 до 25 г/л.
На второй стадии солюбилизации остаточная мука из масличных семян канолы от экстракции (экстракций) водой экстрагируется водным раствором соли с получением водного раствора экстракта белков канолы, содержащего большую часть белка канолы 2S, минорные количества белков канолы 7S и 12S и низкий уровень примесей. Соль обычно является хлоридом натрия, хотя могут применяться и другие соли, например, хлорид калия. В большинстве случаев используется раствор соли пищевого качества, но, если изолят белка канолы предназначается для непищевых целей, то могут использоваться химические реактивы непищевого качества.
Водный раствор соли, используемый на второй стадии солюбилизации, в большинстве случаев имеет ионную силу, по меньшей мере, примерно 0,05, предпочтительно - по меньшей мере, примерно 0,1, обычно до примерно 0,5.
Водный раствор соли пищевого качества в большинстве случаев имеет pH примерно от 5 до 6,8, предпочтительно - примерно от 5,3 до 6,2; pH раствора соли может устанавливаться на стадии экстракции на любом требуемом уровне в диапазоне примерно от 5 до 6,8 путем добавления при необходимости любой подходящей для этого кислоты, обычно соляной, или щелочи, обычно гидроксида натрия,
Экстракция вышеупомянутой муки из масличных семян канолы раствором соли пищевого качества в большинстве случаев проводится при температуре примерно от 5°С до 65°С, предпочтительно - примерно от 20°С до 30°С. Концентрация муки из масличных семян канолы в растворе соли пищевого качества на стадии солюбилизации может варьировать в широких пределах, в большинстве случаев примерно от 5 до 15 мас.%/об.
Белковый раствор на стадии экстракции раствором соли обычно имеет концентрацию белка примерно от 1 до 40 г/л, предпочтительно - примерно от 5 до 20 г/л.
Водный белковый раствор на стадии солюбилизации муки из масличных семян раствором соли в большинстве случаев имеет белковый профиль, который включает:
примерно от 80 до 100 мас.% белка 2S,
примерно от 0 до 10 мас.% белка 7S и
примерно от 0 до 10 мас.% белка 12S;
предпочтительно:
примерно от 85 до 100 мас.% белка 2S,
от 0 до 15 мас.% белка 7S и
от 0 до 5 мас.% белка 12S.
Водный раствор соли может содержать антиоксидант. Антиоксидант может представлять собой любой, пригодный для данной цели антиоксидант, такой как сульфит натрия или аскорбиновая кислота. Количество используемого антиоксиданта может варьировать примерно от 0,01 до 1 мас.% раствора, предпочтительно - примерно 0,05 мас.% Антиоксидант служит для ингибирования окисления фенольных соединений в белковом растворе.
Водная фаза на стадии экстракции может отделяться затем от остаточной муки канолы любым удобным способом, например, с использованием центрифуги-декантатора с последующим центрифугированием в тарельчатой центрифуге и/или фильтрацией для удаления остаточной муки. Отделенная остаточная мука может подвергаться сушке для последующего использования.
Цвет готового изолята белка канолы можно улучшить в плане его осветления и придания менее интенсивного желтого оттенка путем смешивания активированного угля в порошке или другого адсорбирующего пигменты агента с отделенным водным белковым раствором и последующего удаления адсорбента, например, фильтрацией, для получения белкового раствора. Для удаления пигментов также может применяться диафильтрация.
Указанная стадия удаления пигментов может осуществляться в любых, пригодных для этого условиях, в большинстве случаев при температуре окружающей среды отделенного водного белкового раствора, содержащего пригодный для данной цели адсорбирующий пигменты агент. Активированный уголь в порошке используется в количестве примерно от 0,025% до 5 мас.%/об., предпочтительно - примерно от 0,05% до 2 мас.%/об.
Водный раствор белка канолы может подвергаться обработке с целью извлечения из него изолята белка канолы, имеющего концентрацию белка, по меньшей мере, примерно 90 мас.% (N×6,25), предпочтительно - по меньшей мере, примерно 100 мас.%, и состоящего преимущественно из белка 2S.
При указанной обработке раствор белкового экстракта может концентрироваться для повышения концентрации белка в нем. Такое концентрирование осуществляется с помощью пригодной для этого селективной мембранной технологии, такой как ультрафильтрация, с применением мембран с соответствующей пороговой проницаемостью по молекулярной массе, обеспечивающей прохождение через мембраны низкомолекулярных соединений, включая соль и другие небелковые низкомолекулярные материалы, экстрагируемые из исходного белкового сырья, при одновременном удержании белка канолы в растворе. Для этой цели могут использоваться ультрафильтрационные мембраны с пороговой проницаемостью по молекулярной массе примерно от 3000 до 100000 дальтон, предпочтительно - примерно от 5000 до 10000 дальтон, в зависимости от различных материалов, из которых изготовлены мембраны, и конфигурации последних. Концентрированно раствора белкового экстракта таким путем сокращает также объем жидкости, который необходимо удалить в процессе сушки с тем, чтобы извлечь белок. Раствор белкового экстракта в большинстве случаев концентрируется до концентрации белка, по меньшей мере, примерно 50 г/л, предпочтительно - примерно от 100 до 400 г/л, более предпочтительно - примерно от 200 до 300 г/л. Указанная операция концентрирования может осуществляться в периодическом режиме или в непрерывном режиме.
Концентрированный раствор белкового экстракта может подвергаться затем стадии диафильтрации с добавлением воды. Такая диафильтрация может проводиться с использованием примерно от 2 до 20 объемов диафильтрационного раствора, предпочтительно - примерно от 5 до 10 объемов диафильтрационного раствора. В процессе диафильтрации из водного раствора белкового экстракта удаляются дополнительные количества загрязняющих веществ, которые проходят через мембрану вместе с пермеатом. Операция диафильтрации может осуществляться до тех пор, пока в пермеат не перейдут значительные дополнительные количества фенольных соединений и окрашенных веществ с видимой окраской. Указанная диафильтрация может проводиться с применением той же мембраны, какая использовалась для стадии концентрирования. Однако при необходимости диафильтрация может проводиться с применением отдельной мембраны, например, мембраны с пороговой проницаемостью по молекулярной массе примерно от 3000 до 100000 дальтон, предпочтительно - примерно от 5000 до 10000 дальтон, в зависимости от различных материалов, из которых изготовлены мембраны, и конфигурации последних.
В диафильтрационной среде, по меньшей мере, на каком-то этапе стадии диафильтрации, может присутствовать антиоксидант. В качестве антиоксиданта может использоваться любой подходящий антиоксидант, такой как сульфит натрия или аскорбиновая кислота. Количество антиоксиданта в диафильтрационной среде зависит от используемых материалов и может варьировать примерно от 0,01 до 1 мас.%, предпочтительно - примерно 0,05 мас.%. Антиоксидант служит для ингибирования окисления фенольных соединений, присутствующих в концентрированном растворе белкового экстракта.
Стадия концентрирования и стадия диафильтрации могут проводиться при любой удобной для этого температуре, в большинстве случаев при температуре примерно от 20°С до 60°С, предпочтительно - примерно от 20°С до 30°С, и в течение периода времени, достаточного для достижения требуемой степени концентрирования. Применяемые температурные и другие режимы зависят до некоторой степени от мембранного оборудования, используемого для проведения концентрирования, и от требуемой концентрации белка в растворе.
Концентрированный и необязательно диафильтрованный белковый раствор может подвергаться дополнительной операции обезжиривания, если таковая требуется, как описывается в патентах США №5844086 и 6005076.
В случае необходимости концентрированный и необязательно диафильтрованный водный белковый раствор может подвергаться стадии тепловой обработки для снижения количества белков 7S и 12S, присутствующих в растворе. Указанная тепловая обработка может проводиться с применением температурно-временного профиля, достаточного для снижения количественной доли белков 7S и 12S, присутствующих в растворе, предпочтительно для значительного снижения количественной доли белка 7S. В большинстве случаев содержание белка 7S в растворе снижается тепловой обработкой, по меньшей мере, примерно на 50 мас.%, предпочтительно - по меньшей мере, на 75 мас.%. В большинстве случаев тепловая обработка может проводиться при температуре примерно от 70°С до 100°С, предпочтительно - примерно от 75°С до 95°С, в течение примерно от 2 до 30 минут, предпочтительно - примерно от 5 до 15 минут. Осажденные белки 7S и 12S могут удаляться любым удобным способом, например, центрифугированием или фильтрацией.
Концентрированный и необязательно диафильтрованный и необязательно подвергнутый тепловой обработке водный белковый раствор может подвергаться сушке любым удобным способом, таким как распылительная сушка или сублимационная сушка, для получения в высушенном состоянии изолята белка канолы, который состоит преимущественно из белка канолы 2S и который имеет содержание белка, по меньшей мере, примерно 90 мас.% (N×6,25), предпочтительно - по меньшей мере, примерно 100 мас.%.
(в) Тепловая обработка ретентата от ультрафильтрации
Начальная стадия способа производства изолятов белка канолы включает солюбилизацию белкового материала из муки из масличных семян канолы. Белковый материал, извлекаемый из муки из масличных семян канолы, может быть нативным белком семян канолы или белковый материал может представлять собой белок, модифицированный генетической манипуляцией, но обладающий характерными для нативного белка гидрофобными и полярными свойствами. Мука канолы может быть любой мукой канолы, полученной в результате удаления масла канолы из масличных семян канолы, с варьирующими уровнями неденатурированного белка, например, в результате способов экстракции горячим гексаном или холодной экструзии масла. Удаление масла канолы из муки из масличных семян канолы обычно осуществляется как отдельная операция описываемого здесь процесса извлечения изолята белка.
Солюбилизация белка наиболее эффективно осуществляется при использовании раствора соли пищевого качества, поскольку присутствие соли благоприятствует выделению растворимого белка из муки из масличных семян. Если изолят белка канолы предназначен для непищевого использования, то могут применяться химические реактивы непищевого качества. Соль обычно является хлоридом натрия, хотя могут использоваться и другие соли, например, хлорид калия. Раствор соли имеет ионную силу, по меньшей мере, примерно 0,05, предпочтительно - по меньшей мере, примерно 0,10, до примерно 0,2, что обеспечивает солюбилизацию значительных количеств извлекаемого белка. По мере увеличения ионной силы раствора соли степень солюбилизации белка в муке из масличных семян сначала повышается до тех пор, пока не достигнет максимального значения. Любое последующее увеличение ионной силы не приводит к увеличению солюбилизированного общего белка. Ионная сила раствора соли пищевого качества, которая вызывает максимальную солюбилизацию белка, варьирует в зависимости от используемой соли и выбранной муки из масличных семян.
В периодическом способе солюбилизация белка солью проводится при температуре, по меньшей мере, около 5°С и предпочтительно до примерно 35°С и сопровождается предпочтительно перемешиванием для сокращения времени солюбилизации, которое обычно составляет примерно от 10 до 60 минут. Проведение солюбилизации является предпочтительным, поскольку она позволяет экстрагировать, в основном, максимально достигаемое на практике количество белка из муки из масличных семян и обеспечивать высокий общий выход продукта.
Выбор пониженного температурного предела около 5°С объясняется тем, что при температуре ниже указанной солюбилизация практически замедляется, в то время как выбор верхнего предпочтительного температурного предела около 35°С объясняется тем, что при более высоких уровнях температуры процесс становится неэкономичным в периодическом режиме.
В непрерывном способе экстракция белка из муки из масличных семян канолы проводится любым методом, способным постоянно обеспечивать непрерывную экстракцию белка из муки из масличных семян канолы. В одном из вариантов воплощения мука из масличных семян канолы непрерывно смешивается с раствором соли, и смесь подается по трубопроводу такой длины и при такой скорости потока, которые способны обеспечить время пребывания в указанном трубопроводе, достаточное для достижения требуемой степени экстракции при описываемых здесь параметрах. В таком непрерывном способе стадия солюбилизации солью осуществляется довольно быстро - в течение примерно 10 минут; проведение солюбилизации предпочтительно способствует экстракции, в основном, максимально достигаемого на практике количества белка из муки из масличных семян канолы. Солюбилизация в непрерывном способе предпочтительно проводится при повышенных температурах - предпочтительно выше примерно 35°С, в большинстве случаев до примерно 65°С.
Водный раствор соли и мука из масличных семян канолы имеют естественный pH примерно от 5 до 6,8; значения pH примерно от 5,3 до 6,2 являются более предпочтительными.
pH раствора соли может устанавливаться на любом требуемом уровне в диапазоне примерно от 5 до 6,8 на стадии экстракции путем добавления при необходимости либо подходящей для этого кислоты, обычно соляной, либо щелочи, обычно гидроксида натрия. Если изолят белка канолы предназначен для непищевого использования, то в этом случае могут применяться химические реактивы непищевого качества.
Концентрация муки из масличных семян в растворе соли на стадии солюбилизации может варьировать в широких пределах. Типичные показатели концентрации составляют примерно от 5 до 15 мас.%/об.
Стадия экстрагирования белка водным раствором соли оказывает дополнительное воздействие на солюбилизацию жиров, которые могут присутствовать в муке канолы и переходить затем в водную фазу.
Белковый раствор, полученный на стадии экстракции, в большинстве случаев имеет концентрацию белка примерно от 5 до 40 г/л, предпочтительно - примерно от 10 до 30 г/л.
Водная фаза на стадии экстракции может отделяться затем от остаточной муки канолы любым удобным способом, например, с использованием центрифуги-декантатора с последующим центрифугированием в тарельчатой центрифуге и/или фильтрацией для удаления остаточной муки. Отделенная остаточная мука может подвергаться сушке для последующего использования.
Цвет готового изолята белка канолы можно улучшить в плане его осветления и уменьшения интенсивного желтого оттенка путем смешивания активированного угля в порошке или другого адсорбирующего пигменты агента с отделенным водным белковым раствором и последующего удаления адсорбента, удобнее всего фильтрацией, для получения белкового раствора. Для удаления пигментов может применяться и диафильтрация отделенного водного белкового раствора до или после его концентрирования, как описывается ниже.
Указанная стадия удаления пигментов может осуществляться в любых пригодных для этого условиях, в большинстве случаев при температуре окружающей среды отделенного водного белкового раствора, в котором присутствует пригодный для данной цели агент, адсорбирующий пигменты. Активированный уголь в порошке используется в количестве примерно от 0,025% до 5 мас.%/об., предпочтительно - примерно от 0,05% до 2 мас.%/об.
Если мука из семян канолы содержит значительные количества жира, как указывается в патентах США №5844086 и 6005076, правопреемником по которым является автор настоящей заявки и которые включены в перечень ссылок к настоящей заявке, то могут проводиться описанные в указанных патентах стадии обезжиривания отделенного водного белкового раствора и концентрированного водного белкового раствора, что обсуждается ниже. Если проводится стадия улучшения цвета, то такая стадия может осуществляться после первой стадии обезжиривания.
Альтернативой экстракции муки из масличных семян водным раствором соли может служить экстракция с применением одной воды, хотя использование только воды позволяет экстрагировать меньше белка из муки из масличных семян, чем при экстракции водным раствором соли. В случае осуществления такого альтернативного способа соль в указанных выше концентрациях может добавляться к белковому раствору после отделения остаточной муки из масличных семян с целью удержания белка в растворе в процессе стадии концентрирования, описываемой ниже. Если проводится стадия удаления окрашенных веществ (цвета) и/или первая стадия удаления жира, то соль в большинстве случаев добавляется после завершения этих стадий.
Раствор белкового экстракта концентрируется для повышения концентрации белка в нем. Такое концентрирование осуществляется с помощью пригодной для этого селективной мембранной технологии, такой как ультрафильтрация, с применением мембран с соответствующей пороговой проницаемостью по молекулярной массе, обеспечивающей прохождение через мембраны низкомолекулярных соединений, включая соль и другие небелковые низкомолекулярные материалы, экстрагируемые из белкового сырья, при одновременном удержании белка канолы в растворе. Для этой цели могут использоваться ультрафильтрационные мембраны с пороговой проницаемостью по молекулярной массе примерно от 3000 до 100000 дальтон, предпочтительно - примерно от 5000 до 10000 дальтон, в зависимости от различных материалов, из которых изготовлены мембраны, и конфигурации последних. Концентрирование раствора белкового экстракта таким способом сокращает также объем жидкости, который необходимо удалить в процессе сушки с тем, чтобы извлечь белок. Раствор белкового экстракта в большинстве случаев концентрируется до концентрации белка, по меньшей мере, примерно 50 г/л, предпочтительно - примерно от 100 до 400 г/л, более предпочтительно - примерно от 200 до 300 г/л. Указанная операция концентрирования может осуществляться в периодическом режиме или в непрерывном режиме.
Концентрированный раствор белкового экстракта может подвергаться затем стадии диафильтрации с добавлением воды. Такая диафильтрация может проводиться с использованием примерно от 2 до 20 объемов диафильтрационного раствора, предпочтительно - примерно от 5 до 10 объемов диафильтрационного раствора. В процессе диафильтрации из водного раствора белкового экстракта удаляются дополнительные количества загрязняющих веществ в результате прохождения их через мембрану вместе с пермеатом. Операция диафильтрации может осуществляться до тех пор, пока в пермеат не перейдут значительные дополнительные количества фенольных соединений и окрашенных веществ с видимой окраской. Указанная диафильтрация может осуществляться с применением той же мембраны, какая использовалась на стадии концентрирования. Однако при необходимости диафильтрация может проводиться с применением отдельной мембраны, например, мембраны с пороговой проницаемостью по молекулярной массе примерно от 3000 до 100000 дальтон, предпочтительно - примерно от 5000 до 10000 дальтон, в зависимости от различных материалов, из которых изготовлены мембраны, и конфигурации последних.
В диафильтрационной среде, по меньшей мере, на каком-то этапе стадии диафильтрации может присутствовать антиоксидант. В качестве антиоксиданта может использоваться любой подходящий антиоксидант, такой как сульфит натрия или аскорбиновая кислота. Количество антиоксиданта в диафильтрационной среде зависит от используемых материалов и может варьировать примерно от 0,01 до 1 мас.%, предпочтительно - примерно 0,05 мас.%. Антиоксидант служит для ингибирования окисления фенольных соединений, присутствующих в концентрированном растворе белкового экстракта.
Стадия концентрирования и стадия диафильтрации могут проводиться при любой удобной температуре, в большинстве случаев при температуре примерно от 20°С до 60°С, предпочтительно - примерно от 20°С до 30°С, и в течение периода времени, достаточного для достижения требуемой степени концентрирования. Применяемые температурные и другие режимы зависят до некоторой степени от мембранного оборудования, используемого для проведения концентрирования, и требуемой концентрации белка в растворе.
Концентрированный и необязательно диафильтрованный белковый раствор может подвергаться дополнительной операции обезжиривания, если таковая требуется, как описывается в патентах США №5844086 и 6005076.
В данном аспекте настоящего изобретения ультрафильтрованный и необязательно диафильтрованный раствор белка канолы подвергается тепловой обработке с целью осаждения из него белков 7S и 12S и получения раствора белка канолы, состоящего преимущественно из белка 2S. Указанная тепловая обработка может проводиться при режимах, описанных в вышеупомянутой патентной заявке США №11/038086.
Указанная тепловая обработка может осуществляться с применением температурно-временного профиля, достаточного для снижения количественной доли белков 7S и 12S, присутствующих в концентрированном растворе, предпочтительно для значительного снижения количественной доли белков 7S и 12S. В большинстве случаев содержание белков 7S и 12S в растворе снижается тепловой обработкой, по меньшей мере, примерно на 50 мас.%, предпочтительно - по меньшей мере, на 75 мас.%. В большинстве случаев тепловая обработка может проводиться при температуре примерно от 70°С до 100°С, предпочтительно - примерно от 75°С до 95°С, в течение примерно от 2 до 30 минут, предпочтительно - примерно от 5 до 15 минут. Осажденные белки 7S и 12S могут удаляться и извлекаться любым удобным способом, таким как центрифугирование или фильтрация.
Полученный раствор белка канолы может затем подвергаться обработке, имеющей целью извлечение изолята белка канолы с преобладающим в нем белком 2S.
Концентрированный подвергнутый тепловой обработке супернатант от удаления осажденных белков 7S и 12S, например, центрифугированием может подвергаться сушке для получения в высушенном состоянии изолята белка канолы, состоящего преимущественно из белка канолы 2S. Указанный изолят белка канолы имеет высокое содержание белка, превышающее примерно 90 мас.%, предпочтительно - по меньшей мере, примерно 100 мас.% (при расчете методом Кьельдаля N×6,25), и, в основном, неденатурированного (что подтвердила дифференциальная сканирующая калориметрия).
(г) Тепловая обработка водного раствора белка канолы
Начальная стадия способа производства изолятов белка канолы включает солюбилизацию белкового материала из муки из масличных семян канолы. Белковый материал, извлекаемый из муки из масличных семян канолы, может быть нативным белком семян канолы или белковый материал может представлять собой белок, модифицированный генетической манипуляцией, но обладающий характерными для нативного белка гидрофобными и полярными свойствами. Мука канолы может быть любой мукой канолы, полученной в результате удаления масла канолы из масличных семян канолы, с варьирующими уровнями неденатурированного белка, например, в результате способов экстракции горячим гексаном или холодной экструзии масла. Удаление масла канолы из муки из масличных семян канолы обычно осуществляется как отдельная операция описываемого здесь способа производства изолята белка.
Солюбилизация белка наиболее эффективно осуществляется при использовании раствора соли пищевого качества, поскольку присутствие соли благоприятствует извлечению растворимого белка из муки из масличных семян. Если изолят белка канолы предназначен для непищевого использования, то могут применяться химические реактивы непищевого качества. Соль обычно является хлоридом натрия, хотя могут использоваться и другие соли, например, хлорид калия. Раствор соли имеет ионную силу, по меньшей мере, примерно 0,05, предпочтительно - по меньшей мере, примерно 0,10, до примерно 0,2, что обеспечивает солюбилизацию значительных количеств извлекаемого белка. По мере увеличения ионной силы раствора соли степень солюбилизации белка в муке из масличных семян сначала повышается до тех пор, пока не достигнет максимального значения. Любое последующее увеличение ионной силы не приводит к увеличению солюбилизированного общего белка. Ионная сила раствора соли пищевого качества, которая вызывает максимальную солюбилизацию белка, варьирует в зависимости от используемой соли и выбранной муки из масличных семян.
В периодическом способе солюбилизация белка солью проводится при температуре, по меньшей мере, около 5°С и предпочтительно до примерно 35°С и сопровождается предпочтительно перемешиванием для сокращения времени солюбилизации, которое обычно составляет примерно от 10 до 60 минут. Проведение солюбилизации является предпочтительным, поскольку она позволяет экстрагировать, в основном, максимально достижимое на практике количество белка из муки из масличных семян и обеспечивает высокий общий выход продукта.
Выбор пониженного температурного предела около 5°С объясняется тем, что при температуре ниже указанной солюбилизация замедляется, что практически не выгодно, в то время как выбор верхнего предпочтительного температурного предела около 35°С объясняется тем, что при более высоких уровнях температуры процесс становится неэкономичным в периодическом режиме.
В непрерывном способе экстракция белка из муки из масличных семян канолы проводится любым методом, способным постоянно обеспечивать непрерывную экстракцию белка из муки из масличных семян канолы. В одном из вариантов воплощения способа мука из масличных семян канолы непрерывно смешивается с раствором соли, и смесь подается по трубопроводу такой длины и при такой скорости потока, которые способны обеспечить время пребывания смеси в указанном трубопроводе, достаточное для достижения требуемой степени экстракции при описанных здесь параметрах. В таком непрерывном способе стадия солюбилизации солью осуществляется довольно быстро - в течение примерно 10 минут; проведение солюбилизации предпочтительно способствует экстрагированию, по существу, максимально достижимого на практике количества белка из муки из масличных семян канолы. Солюбилизация в непрерывном способе предпочтительно проводится при повышенных температурах - предпочтительно выше примерно 35°С, в большинстве случаев до примерно 65°С.
Водный раствор соли и мука из масличных семян канолы имеют естественный pH примерно от 5 до 6,8; предпочтительными являются значения pH примерно от 5,3 до 6,2.
pH раствора соли может устанавливаться на любом требуемом уровне в диапазоне примерно от 5 до 6,8 на стадии экстракции путем добавления при необходимости либо подходящей для этого кислоты, обычно соляной, либо щелочи, обычно гидроксида натрия. Если изолят белка канолы предназначен для непищевого использования, то в этом случае могут применяться химические реактивы непищевого качества.
Концентрация муки из масличных семян в растворе соли в процессе стадии солюбилизации может варьировать в широких пределах. Типичные показатели концентрации составляют примерно от 5 до 15 мас.%/об.
Стадия экстракции белка водным раствором соли оказывает дополнительное воздействие на солюбилизацию жиров, которые могут присутствовать в муке канолы и переходить затем в водную фазу.
Белковый раствор, полученный на стадии экстракции, в большинстве случаев имеет концентрацию белка примерно от 5 до 40 г/л, предпочтительно - примерно от 10 до 30 г/л.
Водная фаза на стадии экстракции может отделяться затем от остаточной муки канолы любым удобным способом, например, с использованием центрифуги-декантатора с последующим центрифугированием в тарельчатой центрифуге и/или фильтрацией для удаления остаточной муки. Отделенная остаточная мука может подвергаться сушке для последующего использования.
Цвет готового изолята белка канолы можно улучшить в плане его осветления и уменьшения интенсивного желтого оттенка путем смешивания активированного угля в порошке или другого адсорбирующего пигменты агента с отделенным водным белковым раствором и последующего удаления адсорбента, удобнее всего фильтрацией, для получения белкового раствора. Для удаления пигментов может применяться и диафильтрация отделенного водного белкового раствора до или после его концентрирования, как описывается ниже.
Указанная стадия удаления пигментов может осуществляться в любых пригодных для этого условиях, в большинстве случаев при температуре окружающей среды отделенного водного белкового раствора, в котором присутствует пригодный для данной цели адсорбент пигментов. Активированный уголь в порошке используется в количестве примерно от 0,025% до 5%, предпочтительно - примерно от 0,05% до 2 мас.%/об.
Если мука из семян канолы содержит значительные количества жира, как указывается в патентах США №5844086 и 6005076, правопреемником по которым является автор настоящей заявки и которые включены в перечень ссылок к настоящей заявке, то могут проводиться описанные в указанных патентах стадии обезжиривания отделенного водного белкового раствора и концентрированного водного белкового раствора, что обсуждается ниже. Если проводится стадия улучшения цвета, то такая стадия может осуществляться после первой стадии обезжиривания.
Альтернативой экстракции муки из масличных семян водным раствором соли может служить экстракция с применением одной воды, хотя использование только воды позволяет экстрагировать меньше белка из муки из масличных семян, чем экстракция водным раствором соли. В случае осуществления такого альтернативного способа соль в указанных выше может добавляться к белковому раствору после отделения его от остаточной муки из масличных семян с целью удержания белка в растворе в процессе стадии концентрирования, описанной ниже. Если проводится стадия удаления пигментов и/или первая стадия удаления жира, то соль в большинстве случаев добавляется по завершении этих стадий.
Водный раствор белка канолы в соответствии с данным аспектом настоящего изобретения подвергается тепловой обработке с целью осаждения из него белков 7S и 12S и получения раствора белка канолы, состоящего преимущественно из белка 2S. Указанная тепловая обработка может проводиться при режимах, описанных в вышеупомянутой патентной заявке США №11/038086.
Указанная тепловая обработка может осуществляться с применением температурно-временного профиля, достаточного для снижения количественной доли белков 7S и 12S, присутствующих в концентрированном растворе, предпочтительно для значительного снижения количественной доли белков 7S и 12S. В большинстве случаев содержание белков 7S и 12S в растворе снижается тепловой обработкой, по меньшей мере, примерно на 50 мас.%, предпочтительно - по меньшей мере, на 75 мас.%. В большинстве случаев тепловая обработка может проводиться при температуре примерно от 70°С до 100°С, предпочтительно - примерно от 75°С до 95°С, в течение примерно от 2 до 30 минут, предпочтительно - примерно от 5 до 15 минут. Осажденные белки 7S и 12S могут удаляться и извлекаться любым удобным способом, таким как центрифугирование или фильтрация.
Подвергнутый тепловой обработке раствор белка канолы после удаления осажденных белков 7S и 12S, например, центрифугированием может подвергаться сушке любым удобным способом, таким как распылительная сушка или сублимационная сушка, для обеспечения в высушенном состоянии изолята белка канолы, состоящего преимущественно из белка канолы 2S.
Альтернативно подвергнутый тепловой обработке раствор белка канолы может подвергаться перед сушкой стадиям концентрирования, диафильтрации и удаления окрашенных веществ (цвета), описанным выше в аспекте (а).
Изолят белка канолы имеет высокое содержание белка, превышающее примерно 90 мас.%, предпочтительно - по меньшей мере, примерно 100 мас.% (при расчете по Кьельдалю N×6,25), и, в основном, неденатурированного (что подтвердила дифференциальная сканирующая калориметрия).
Обеспечиваемые изобретением изоляты белка канолы содержат высокую процентную долю белка 2S - предпочтительно, по меньшей мере, примерно 90 мас.%, более предпочтительно - по меньшей мере, примерно 95 мас.% белков канолы в изолятах, и не содержат, в основном, белки 7S и 12S.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Пример 1
Настоящий пример иллюстрирует влияние повышенной температуры экстрагирования белка из муки из масличных семян канолы на профиль белков канолы в растворе экстракта.
Образцы (15 г) муки из масличных семян канолы, из которой был удален под вакуумом растворитель, добавляли соответственно к образцам (150 мл) воды, обработанной методом обратного осмоса (RO), 0,1 М водного раствора NaCl, 0,15 М водного раствора NaCl, 0,2 М водного раствора NaCl, 0,25 М водного раствора NaCl и 0,5 М водного раствора NaCl при температуре 85°С. Смеси перемешивали в течение 5 минут при одновременном поддержании указанной температуры с помощью мешалки/горячей плиты.
Экстракты центрифугировали в течение 10 минут при 10000 об/мин, а затем фильтровали через рифленый бумажный фильтр 25 мкм. Фильтрат дополнительно фильтровали через фильтр-шприц 0,45 мкм.
Профильтрованные экстракты анализировали на содержание белка (с применением прибора для определения азота LECO FP528), цвет и белковый профиль (с использованием аналитической колонки HPLC SEC BioSep 2000 и S3000).
Эксперимент повторяли с проведением экстракции 0,1 М раствором NaCl при температуре окружающей среды в качестве контроля и для проведения сравнительной оценки. Полученные результаты приводятся в нижеследующих таблицах 1 и 2.
Таблица 1.
Сравнительная оценка мучных экстрактов, полученных при 85°С и при температуре окружающей среды
Экстракт
А330
А390
LECO Белок (%)
Видимая экстрагируемость (%)
85°С RO водный экстракт
89,9
4,34
0,48
12,93
85°С 0,1 М NaCl-экстракт
91,1
4,52
1,09
29,35
85°С 0,15 М NaCl-экстракт
94,8
4,51
1,11
29,88
85°С 0,2 М NaCl-экстракт
114,0
5,15
1,24
33,38
85°С 0,25 М NaCl-экстракт
110,7
5,51
1,26
33,92
85°С 0,5 М NaCl-экстракт
130,3
13,99
1,46
39,30
Контроль: экстракт, полученный экстракцией 0,1М раствором NaCl при температуре окружающей среды
96,7
5,25
1,83
49,00
Таблица 2.
Белковый профиль экстрактов
Образец
%2S
%7S
% 12S
85°С RO водный экстракт
83,8
12,5
3,8
85°С 0,1 М NaCl-экстракт
93,9
3,9
2,1
85°С 0,15 М NaCl-экстракт
98,2
0,9
0,9
85°С 0,2 М NaCl-экстракт
88,2
5,5
6,2
85°С 0,25 М NaCl-экстракт
86,9
7,2
5,9
85°С 0,5 М NaCl-экстракт
64,8
35,2
0,0
Экстракт, полученный при температуре окружающей среды
42,4
55,9
1,7
Из представленных в табл. 1 результатов можно видеть, что применение повышенной температуры экстракции не оказывало, по-видимому, никакого влияния на измерения при А330 (фенольные соединения) и А390 (цвет), что указывает на то, что при повышенных температурах не происходит дополнительного окисления фенольных соединений. Видимая экстрагируемость RO-водой при 85°С была значительно ниже, чем при экстракциях солью, что указывает на то, что присутствие соли в процессе стадии экстракции улучшает экстрагируемость даже при повышенных температурах.
Видимая экстрагируемость при экстракции раствором соли при повышенной температуре составила в среднем около 32%, т.е. меньше, чем при проведения экстракции при температуре окружающей среды, но, как можно видеть из табл.2, большую часть белка, экстрагированного при повышенной температуре, составил белок 2S.
Пример 2
Настоящий пример иллюстрирует различные варианты способа обработки муки из масличных семян канолы методом двойной экстракции. В этом примере экстракцию муки из масличных семян канолы сначала проводили водой, а затем водным раствором соли. Полученные результаты приводятся ниже.
(а) Испытание 1
[15 г муки из масличных семян канолы (партия А) при 60°С и 10 мас.%/об. экстрагировали водой в количестве 150 мл, предварительно нагретой до 65°С и добавленной к семенам. Полученный экстракт отделяли от остаточной муки путем центрифугирования при 10000 g в течение 10 минут и после отделения супернатанта определяли массу влажной муки (37 г) и связанной воды (22 г) в осадке. Затем добавляли достаточное количество (128 мл) 0,25 М раствора NaCl для доведения концентрации до первоначальных 10 мас.%/об. и вымешивали образец с помощью подвесной мешалки в течение 30 минут при 220 об/мин при комнатной температуре. Солевой экстракт отделяли от остаточной муки центрифугированием при 10000 g в течение 10 минут. Образцы осветленных водного и солевого экстрактов фильтровали через фильтр с размером пор 0,45 мкм и анализировали на содержание свободных фенольных соединений (А330), видимый цвет (А390), содержание белка (LECO) и белковый профиль (SEC HPLC). Белковый профиль водного экстракта анализировали повторно после хранения в течение ночи в холодильнике для осаждения белка 7S.
Хотя вторичный солевой экстракт содержал меньше белка, он был более прозрачным и менее окрашенным, чем первоначальный водный экстракт (табл.3).
Таблица 3.
Результаты анализа водного и солевого экстрактов
Образец
А330
А390
Белок, %
Площадь небелкового пика на HPLC-грамме, %
Водный экстракт, полученный при 60°С
133,9
5,51
1,79
80,47
Солевой экстракт
35,3
1,80
1,12
71,25
Начальная экстракция водой благоприятствовала солюбилизации белка 7S, в то время как вторичная экстракция солевым раствором способствовала солюбилизации большей части белка 2S (табл.4). Охлаждение водного экстракта в течение ночи приводило к осаждению значительной доли белков 7S и 12S.
Таблица 4.
Белковые профили различных образцов
Образец
Процентная доля площади белкового пика, соответствующая белку 12S (%)
Процентная доля площади белкового пика, соответствующая белку 7S(%)
Процентная доля площади белкового пика, соответствующая белку 2S (%)
Водный экстракт, полученный при 60°С
2,4
74,3
23,3
Солевой экстракт
2,9
32,3
65,0
Сильно охлажденный водный экстракт
1,5
42,1
56,4
(б) Испытание 2
150 г муки из масличных семян канолы (партия А) при 60°С и 10 мас.%/об. экстрагировали водой в количестве 1500 мл в течение 5 мин в условиях перемешивания подвесной мешалкой. Водный экстракт отделяли от остаточной муки центрифугированием при 7100 g в течение 10 мин и определяли массу влажной муки (392 г) и связанной воды (242 г) в осадке. Затем добавляли достаточное количество 0,2 М раствора NaCl (1258 мл) для доведения концентрации до первоначальных 10 мас.%/об. и образец вымешивали с помощью подвесной мешалки в течение 30 мин при комнатной температуре. Солевой экстракт отделяли от остаточной муки центрифугированием при 7100 g в течение 10 мин, а затем дважды фильтровали через фильтровальные насадки #3. После этого осветленный солевой экстракт обрабатывали с применением двух соединенных параллельно мембранных устройств (стабилизатор целлюлоза) Vivaflow HY с пороговой проницаемостью по молекулярной массе (MWCO) 10000. Экстракт концентрировали, а затем подвергали диафильтрации с 5 объемами воды, очищенной методом обратного осмоса (RO). Добавление воды при диафильтрации приводило к образованию осадка, который удаляли центрифугированием при 7100 g в течение 10 мин перед повторным концентрированном. Ретентат от диафильтрации подвергали тепловой обработке при 85°С в течение 10 мин для осаждения белков 7S и 12S, которые удаляли центрифугированием при 8000g в течение 15 мин. Затем концентрат высушивали сублимационной сушкой и обозначали как ′С200Н′.
Водный экстракт охлаждали в течение ночи при 4°С, после чего осадок собирали центрифугированием при 7100 g в течение 15 мин и 5°С. Собранную твердую фазу высушивали сублимационной сушкой.
Различные образцы анализировали на содержание свободных фенольных соединений (A330), видимый цвет (A390), содержание белка (LECO) и белковый профиль (SEC HPLC). Измерение цвета готовых продуктов в высушенном состоянии проводили колориметром Minolta, а также готовили растворы из них для измерения цвета во влажном состоянии. Порошок белка (0,7 г) смешивали с 0,1 М раствором NaCl или водой (10 мл) с помощью вихревой мешалки. Затем образец центрифугировали при 8000 g в течение 10 мин и определяли содержание белка в супернатанте методом LECO. Аликвотное количество (8 мл) супернатанта переносили в небольшой лабораторный стакан и добавляли в него достаточное количество раствора соли или воды для доведения содержания белка до 5%.
Как и в Испытании 1, вторичный солевой экстракт был прозрачнее и менее окрашенным, чем начальный водный экстракт (табл.5). Охлаждение начального водного экстракта приводило к осаждению более половины общего белка.
Таблица 5.
Результаты анализа водного и солевого экстрактов
Образец
А330
А390
Белок, %
Площадь небелкового пика на HPLC-грамме, %
Водный экстракт, полученный при 60°С
128,9
5,45
2,06
80,46
Солевой экстракт
21,3
1,24
0,90
70,84
Сильно охлажденный водный экстракт
136,0
4,66
1,02
91,30
И снова начальная экстракция водой благоприятствовала солюбилизации белка 7S, в то время как вторичная экстракция солевым раствором солюбилизировала большую часть белка 2S (табл.6). Эффективному удалению основной массы остаточных белков 7S и 12S способствовала тепловая обработка ретентата от диафильтрации (DF). Охлаждение водного экстракта в течение ночи приводило к осаждению значительной доли белков 7S и 12S.
Таблица 6.
Белковые профили различных образцов
Образец
Процентная доля площади белкового пика, соответствующая белку 12S (%)
Процентная доля площади белкового пика, соответствующая белку 7S (%)
Процентная доля площади белкового пика, соответствующая белку 2S (%)
Водный экстракт, полученный при 60°С
2,3
75.2
22,5
Солевой экстракт
1,2
30,8
68,0
Подвергнутый тепловой обработке ретентат от DF
0,8
1,5
97,7
Сильно охлажденный водный экстракт
1,4
43,5
55,1
Полученный в настоящем испытании образец ′С200Н′ имел хороший цвет в высушенном состоянии и приемлемый цвет во влажном состоянии (табл.7). Содержание белка в порошке (w.b. = в пересчете на массу.) составило 93,90 мас.%, подтвердив, что образец является изолятом. Охлажденный осадок 7S/12S представлял собой порошок темно-желтого цвета, однако, во влажном состоянии он имел приемлемый цвет. Несмотря на относительно темный цвет осажденного продукта 7S/12S, степень чистоты его была очень высокой при тестировании методом LECO. Содержание белка в указанном образце (w.b.) составило 103,49 мас.%. Хроматографический анализ образца осадка 7S/12S во влажном состоянии показал загрязнение белком 2S менее 4% площади белкового пика и около 25% площади небелкового пика. Такая относительно низкая концентрация загрязняющих веществ считается приемлемой, поэтому, помимо осаждения, никаких стадий очистки не предпринималось.
Таблица 7.
Цвет конечных продуктов Испытания 2 в высушенном состоянии
Образец
L
а
b
′С200Н′
88,52
-2,81
19,36
Охлажденный осадок 7S/12S
66,79
0,25
35,15
(в) Испытание 3
150 г муки из масличных семян канолы (партия А) экстрагировали при 10 мас.%/об. и температуре окружающей среды водой в количестве 1500 мл в течение 30 мин в условиях перемешивания подвесной мешалкой. Водный экстракт отделяли от остаточной муки центрифугированием при 7100 g в течение 10 мин и определяли массу влажной муки (366 г) и связанной воды (216 г). Затем добавляли достаточное количество 0,2 М раствора NaCl (1284 мл) для доведения концентрации до первоначальных 10 мас.%/об. и образец вымешивали подвесной мешалкой в течение 30 мин при комнатной температуре. Солевой экстракт отделяли от остаточной муки центрифугированием при 7100 g в течение 10 мин, а затем дважды фильтровали через фильтровальные насадки #3. После этого осветленный солевой экстракт обрабатывали с применением двух соединенных параллельно мембранных устройств Vivaflow HY с MWCO 10000. Экстракт концентрировали, а затем подвергали диафильтрации с 5 объемами воды, очищенной методом обратного осмоса (RO). Добавление воды при диафильтрации приводило к образованию осадка, который удаляли центрифугированием при 7100 g в течение 10 мин перед повторным концентрированном. Ретентат от диафильтрации подвергали тепловой обработке при 85°С в течение 10 мин для осаждения белков 7S и 12S, которые удаляли центрифугированием при 8000 g в течение 15 мин. Затем концентрат высушивали сублимационной сушкой и обозначали как ′С200Н′ - солевой′.
Водный экстракт охлаждали в течение ночи при 4°С, после чего осадок собирали центрифугированием при 7100 g в течение 15 мин и 5°С. Собранную твердую фазу высушивали сублимационной сушкой. Супернатант фильтровали через фильтровальные насадки #3 и потом обрабатывали с применением двух соединенных параллельно мембранных устройств Vivaflow HY с MWCO 10000. Экстракт концентрировали, а затем подвергали диафильтрации с 5 объемами воды, очищенной методом обратного осмоса (RO). Добавление воды при диафильтрации приводило к образованию осадка, который удаляли центрифугированием при 7100g в течение 10 мин перед повторным концентрированием. Ретентат от диафильтрации подвергали тепловой обработке при 85°С в течение 10 мин для осаждения белков 7S и 12S, которые удаляли центрифугированием при 8000 g в течение 15 мин. Затем концентрат высушивали сублимационной сушкой и обозначали как ′С200Н - водный′. Проводили анализ различных образцов, как подробно описано в Испытании 2.
Как и в предыдущем испытании, вторичный солевой экстракт был прозрачнее и менее окрашенным, чем начальный водный экстракт (табл. 8). Однако применение воды с температурой окружающей среды вместо горячей воды солюбилизировало меньше азота и несколько меньше загрязняющих веществ. Этот водный экстракт имел более интенсивный цвет, чем экстракты, полученные с горячей водой, по показателем, считанным при А390. Охлаждение водного экстракта приводило к осаждению меньшего количества белка, чем при охлаждении экстракта, полученного при 60°С в Испытании 2.
Таблица 8.
Результаты анализа водного и солевого экстрактов
Образец
А330
А390
Белок, %
Площадь небелкового пика на HPLC-грамме, %
Водный экстракт, полученный при температуре окружающей среды
123,3
6,00
1,66
80,18
Солевой экстракт
27,1
1,73
0,86
71,76
Сильно охлажденный водный экстракт
90,2
3,73
0,98
89,47
Экстракция муки водой с температурой окружающей среды солюбилизировала столько же много белка, сколько экстракция горячей водой. В результате этого в солевой экстракт перешло повышенное количество белков 7S и 12S (табл.9). Однако белки 7S и 12S были успешно удалены тепловой обработкой ретентата от диафильтрации. Охлаждение водного экстракта, полученного экстракцией водой с температурой окружающей среды, также способствовало осаждению белков 7S и 12S, но не в таком количестве, как охлаждение водного экстракта, полученного экстракцией горячей водой. Удивительно то, что тепловая обработка оказалась менее эффективной при удалении белков 7S и 12S из диафильтрованного ретентата, полученного из водного производственного потока.
Таблица 9.
Белковые профили различных образцов
Образец
Процентная доля площади белкового пика, соответствующая белку 12S (%)
Процентная доля площади белкового пика, соответствующая белку 7S (%)
Процентная доля площади белкового пика, соответствующая белку 2S (%)
Водный экстракт, полученный экстракцией водой с температурой окружающей среды
1,9
72,4
25,7
Солевой экстракт
2,4
78,1
59,5
Подвергнутый тепловой обработке ретентат от DF - солевой
0,8
0,7
98,5
Супернатант от охлажденного водного экстракта
1,3
48,3
50,4
Подвергнутый тепловой обработке ретентат от DF - водный
0,8
9,6
89,6
Цвет ′С200Н′, полученного из солевого потока, был только несколько светлее, чем цвет ′С200Н′, полученного из водного потока (табл.9). Ни один из образцов не имел приемлемого цвета при использовании горячей воды на стадии начальной экстракции (Испытание 2). Степень чистоты ′С200Н′, полученного из водного потока (72,78% белка w.b.), была намного ниже, чем ′С200Н′, полученного из солевого потока (96,68% белка w.b.). HPLC-грамма продукта из солевого потока (площадь небелкового пика 16,4%) также была чище, чем HPLC-грамма продукта из водного потока (площадь небелкового пика 27,9%). Уровень загрязняющих веществ в водном экстракте был выше, чем в солевом экстракте. Поэтому водный экстракт потребовал более интенсивной диафильтрации для очистки. Осажденные охлаждением белки 7S и 12S, полученные в этом испытании, были несколько светлее полученных в предыдущем испытании, по-видимому, по той причине, что экстракция водой с температурой окружающей среды солюбилизировала меньше примесей, чем экстракция горячей водой. Степень чистоты продукта вновь была очень высокой - содержание белка составило 102,72% (w.b.).
Таблица 10.
Цвет конечных продуктов испытания 3 в высушенном состоянии
Образец
L
а
b
′С200Н′ - солевой
86,04
-2,96
22,91
′С200Н′ - водный
85,89
-2,79
24,60
Охлажденный осадок 7S
68,92
-0,16
38,34
(г) Испытание 4
200 г муки из масличных семян канолы (партия В) экстрагировали при 10 мас.%/об. водой (2000 мл) при температуре окружающей среды в течение 30 мин в условиях перемешивания подвесной мешалкой. Водный экстракт отделяли от остаточной муки центрифугированием при 7100 g в течение 10 мин и определяли массу влажной муки (639 г) и связанной воды (439 г). Затем добавляли достаточное количество 0,25 М раствора NaCl (1561 мл) для доведения концентрации до первоначальных 10 мас.%/об. и образец вымешивали подвесной мешалкой в течение 30 мин при комнатной температуре. Солевой экстракт отделяли от остаточной муки центрифугированием при 7100 g в течение 10 мин, а затем дважды фильтровали через фильтровальные насадки #3. После этого осветленный солевой экстракт обрабатывали с применением двух соединенных параллельно мембранных устройств Vivaflow HY с MWCO 10000. Экстракт концентрировали, а затем подвергали диафильтрации с 5 объемами воды, очищенной методом обратного осмоса (RO). Добавление воды при диафильтрации приводило к образованию осадка, который удаляли центрифугированием при 7100 g в течение 10 мин перед повторным концентрированием. Ретентат от диафильтрации подвергали тепловой обработке при 85°С в течение 10 мин для осаждения белков 7S и 12S, которые удаляли центрифугированием при 8000 g в течение 15 мин. Затем концентрат делили на две порции, одну из которых перемешивали с 1 мас.% активированного угля в порошке в течение 30 мин, а вторую половину образца не обрабатывали углем. Обе порции центрифугировали при 8000 g в течение 10 мин, фильтровали через фильтр-шприц с размером пор 0,45 мкм, после чего высушивали сублимационной сушкой и обозначали как ′С200Н′ (без угля) и ′С200НС′ (обработанный углем). Первоначальный водный экстракт в настоящем испытании не обрабатывали. Различные образцы анализировали, как подробно описано в Испытании 2.
Как и в других испытаниях, вторичный солевой экстракт был чище и менее окрашен, чем первоначальный водный экстракт (табл.11).
Таблица 11.
Результаты анализа водного и солевого экстрактов
Образец
А330
А390
Белок, %
Площадь небелкового пика на HPLC-грамме, %
Водный экстракт, полученный при температуре окружающей среды
104,5
4,93
1,02
85,37
Солевой экстракт
32,1
1,35
0,72
69,32
И снова начальная экстракция водой благоприятствовала солюбилизации белка 7S, но вторичная экстракция солью солюбилизировала одинаковые пропорциональные доли обоих классов белков (табл.12). Экстракция водой не выделяла так много белка, как в других испытаниях, что, вероятно, обусловливается разными партиями муки. Тепловая обработка ретентата от диафильтрации успешно удаляла основную массу остаточных белков 7S и 12S. Обработка углем полученного концентрата не изменяла белковый профиль, но она всё же сокращала площадь небелкового пика на HPLC-грамме с 15,76% до 4,82%.
Таблица 12.
Белковые профили различных образцов
Образец
Процентная доля площади белкового пика, соответствующая белку 12S (%)
Процентная доля площади белкового пика, соответствующая белку 7S (%)
Процентная доля площади белкового пика, соответствующая белку 2S(%)
Водный экстракт, полученный экстракцией водой с температурой окружающей среды
2,0
77,9
20,1
Солевой экстракт
4,2
44,7
51,1
Подвергнутый тепловой обработке ретентат от DF
1.9
0,5
97,6
Подвергнутый тепловой обработке ретентат от DF - с углем
1,9
0,5
97,6
Обработка углем подвергнутого тепловой обработке ретентата от диафильтрации не улучшала цвета готового продукта (табл.13). Цвет ′С200НС′ был несколько светлее и заметно менее желтым, чем цвет ′С200Н′. Улучшение цвета было также заметно и в случае влажных образцов.
Таблица 13.
Цвет конечных продуктов испытания 4 в высушенном состоянии
Образец
L
а
b
′С200Н′
83,64
-1,61
22,69
′С200НС′
84,76
-1,64
17,64
(д) Испытание 5
200 г просеянной муки из масличных семян канолы (партия В) экстрагировали при 10 мас.%/об. водой (2000 мл) при температуре окружающей среды в течение 30 мин в условиях перемешивания подвесной мешалкой. Водный экстракт отделяли от остаточной муки центрифугированием при 7100 g в течение 10 мин и определяли массу влажной муки (648 г) и связанной воды (448 г). Затем добавляли достаточное количество 0,25 М раствора NaCl (1552 мл) с целью доведения концентрации до первоначальных 10 мас.%/об. и образец перемешивали с помощью подвесной мешалки в течение 30 мин при комнатной температуре. Солевой экстракт отделяли от остаточной муки центрифугированием при 7100 g в течение 10 мин, после чего фильтровали дважды через фильтровальные насадки #2 и #3. Осветленный солевой экстракт обрабатывали с применением соединенных параллельно мембранных устройств Vivaflow HY с MWCO 10 000. Экстракт концентрировали, а затем подвергали диафильтрации с 5 объемами воды, очищенной методом обратного осмоса (RO). Добавление воды при диафильтрации приводило к образованию осадка, который удаляли центрифугированием при 7100 g в течение 10 мин перед повторным концентрированием. Ретентат от диафильтрации подвергали тепловой обработке при 85°С в течение 10 мин для осаждения белков 7S и 12S, которые удаляли центрифугированием при 8000 g в течение 15 мин. Затем концентрат делили на две порции, одну из которых смешивали с 1% активированного угля в порошке в течение 30 мин, а вторую половину образца не обрабатывали углем. Оба образца центрифугировали при 8000 g в течение 10 мин, фильтровали через фильтр-шприц с размером пор 0,45 мкм, после чего высушивали сублимационной сушкой и обозначали 'С200Н' (без угля) и ′С200НС′ (обработанный углем). Начальный водный экстракт в этом испытании не обрабатывали. Различные образцы анализировали, как подробно описано в Испытании 2.
Как и в других испытаниях, вторичный солевой экстракт был чище и менее окрашен, чем начальный водный экстракт (табл.14). Применение просеянной муки вместо стандартной муки с повышенным содержанием зерновых оболочек приводило к экстрагированию большего количества белка, цвета и фенольных соединений.
Таблица 14.
Результаты анализа водного и солевого экстрактов
Образец
А330
А390
Белок, %
Площадь небелкового пика на HPLC-грамме, %
Водный экстракт, полученный при температуре окружающей среды
111,1
6,11
1,27
85,12
Солевой экстракт
41,1
1,74
0,89
70,59
И снова начальная экстракция водой пропорционально благоприятствовала солюбилизации белка 7S, но с ограниченной экстрагируемостью, а вторичная экстракция солью солюбилизировала одинаковые пропорциональные доли обоих белков (табл.15). Тепловая обработка ретентата от диафильтрации успешно удаляла основную массу остаточного белка 7S. Обработка углем полученного концентрата не изменяла белковый профиль, но она все же сокращала площадь небелкового пика на HPLC-грамме с 10,94% до 1,58%.
Таблица 15.
Белковые профили различных образцов
Образец
Процентная доля площади белкового пика, соответствующая белку 12S (%)
Процентная доля площади белкового пика, соответствующая белку 7S (%)
Процентная доля площади белкового пика, соответствующая белку 2S (%)
Водный экстракт, полученный при температуре окружающей среды
2,2
73,5
24,2
Солевой экстракт
4,7
42,3
53,0
Подвергнутый тепловой обработке ретентат от DF
1,1
0,5
98,4
Подвергнутый тепловой обработке ретентат от DF - с углем
1,1
0,5
98,4
Обработка углем подвергнутого тепловой обработке ретентата от диафильтрации не улучшала цвета готового продукта, но не в такой степени, как в предыдущем испытании (табл.16). В настоящем испытании цвет ′С200НС′ в высушенном состоянии был менее желтым, чем у 'С200Н', но обработанный углем продукт был несколько более красным и темнее, чем необработанный образец. Обработка углем улучшала цвет во влажном состоянии, однако более заметное улучшение цвета было отмечено в Испытании 4.
Таблица 16.
Цвет конечных продуктов Испытания 5 в высушенном состоянии
Образец
L
а
b
′С200Н′
84,31
-1,61
22,17
′С200НС′
83,29
-1,32
18,39
(е) Испытание 6
150 г муки из масличных семян канолы (партия В) экстрагировали при 10 мас.%/об. водой (1500 мл) при 60°С в течение 15 мин в условиях перемешивания подвесной мешалкой. Водный экстракт отделяли от остаточной муки центрифугированием при 5200 g в течение 10 мин и определяли массу влажной муки (458 г) и связанной воды (308 г). Затем добавляли достаточное количество 0,25 М раствора NaCl (1192 мл) для доведения концентрации до первоначальных 10 мас.%/об. и образец вымешивали подвесной мешалкой в течение 30 мин при комнатной температуре. Солевой экстракт отделяли от остаточной муки центрифугированием при 5200 g в течение 10 мин, после чего фильтровали дважды через фильтровальные насадки #3. Осветленный солевой экстракт обрабатывали с применением соединенных параллельно мембранных устройств Vivaflow HY с MWCO 10000. Экстракт концентрировали, а затем подвергали диафильтрации с 5 объемами воды, очищенной методом обратного осмоса (RO). Добавление воды при диафильтрации приводило к образованию осадка, который удаляли центрифугированием при 5200 g в течение 10 мин перед повторным концентрированием. Ретентат от диафильтрации подвергали тепловой обработке при 85°С в течение 10 мин для осаждения белков 7S и 12S, которые удаляли центрифугированием при 8000 g в течение 15 мин. Затем концентрат высушивали сублимационной сушкой и обозначали ′С200Н′. Начальный водный экстракт в настоящем испытании не обрабатывали. Различные образцы анализировали, как подробно описано в Испытании 2.
Как и в других испытаниях, вторичный солевой экстракт был чище и менее окрашен, чем начальный водный экстракт (табл.17). Более длительная экстракция водой при 60°С способна несколько улучшить качество солевого экстракта, но её эффект не является, вероятно, столь значительным.
Таблица 17.
Результаты анализа водного и солевого экстрактов
Образец
А330
А390
Белок, %
Площадьнебелкового пика на HPLC-грамме, %
Водный экстракт, полученный при 60°С
89,1
4,44
1,32
83,97
Солевой экстракт
19,1
1,07
0,75
70,57
Белковые профили различных образцов показаны в табл. 18. Из неё очевидно, что более длительная экстракция водой при 60°С солюбилизировала больше белков 7S и 12S, чем предыдущие экстракции той же партии муки. Такая экстракция крайне желательна, поскольку она снижает содержание 7S/12S в солевом экстракте, облегчая приготовление образца очищенного белка 2S.
Таблица 18.
Белковые профили различных образцов
Образец
Процентная доля площади белкового пика, соответствующая белку 12S (%)
Процентная доля площади белкового пика, соответствующая белку 7S (%)
Процентная доля площади белкового пика, соответствующая белку 2S (%)
Водный экстракт, полученный при 60°С
3,5
81,1
15,5
Солевой экстракт
2.0
27,7
70,3
Подвергнутый тепловой обработке ретентат от DF
1,5
0,4
98,1
Цвет указанного образца в высушенном состоянии был средним (табл.19), а во влажном состоянии был хорошим, но не настолько, как в образцах, обработанных углем.
Таблица 19.
Цвет конечных продуктов испытания 6 в высушенном состоянии
Образец
L
а
b
′С200Н′
83,32
-1,12
21,56
(ж) Испытание 7
160 г муки из масличных семян канолы (партия В) с 1 мас.% активированного угля в порошке (16 г) экстрагировали при 10 мас.%/об. водой (1600 мл) при 60°С в течение 5 мин в условиях перемешивания подвесной мешалкой. Водный экстракт отделяли от остаточной муки и угля центрифугированием при 7100 g в течение 10 мин и определяли массу влажной муки/угля (533 г) и связанной воды (357 г). Затем добавляли достаточное количество 0,2 М раствора NaCl (1243 мл) для доведения концентрации до первоначальных 10 мас.%/об. В систему добавляли также дополнительные 16 г свежего активированного угля в порошке и образец перемешивали подвесной мешалкой в течение 30 мин при комнатной температуре. Солевой экстракт отделяли от остаточной муки центрифугированием при 7100 g в течение 10 мин, после чего фильтровали через фильтровальные насадки #3. Осветленный солевой экстракт обрабатывали затем с применением соединенных параллельно мембранных устройств Vivaflow HY с MWCO 10000. Экстракт концентрировали, а затем подвергали диафильтрации с 5 объемами воды, очищенной методом обратного осмоса (RO). Добавление воды при диафильтрации приводило к образованию осадка, который удаляли центрифугированием при 7100 g в течение 10 мин перед повторным концентрированием. Ретентат от диафильтрации подвергали тепловой обработке при 85°С в течение 10 мин для осаждения белков 7S и 12S, которые удаляли центрифугированием при 8000 g в течение 15 мин. Затем концентрат высушивали сублимационной сушкой и обозначали 'C200H'. Начальный водный экстракт в настоящем испытании не обрабатывали. Различные образцы анализировали, как подробно описано в Испытании 2.
Введение угля на стадиях экстракции значительно уменьшало цвет и содержание примесей производственных потоков (табл.20).
Таблица 20.
Результаты анализа водного и солевого экстрактов
Образец
А330
А390
Белок, %
Площадь небелкового пика на HPLC-грамме,%
Водный экстракт, полученный при 60°С
7,86
0,55
1,07
45,18
Солевой экстракт
0,29
0,10
0,44
2,35
Белковые профили различных образцов показаны в табл. 21. Количество белков в водном экстракте было очень схоже с их количеством в Испытании 6. Однако количественное соотношение белков в солевом экстракте было намного более равномерным, чем в Испытании 6, в котором белок 2S заметно преобладал. Объяснением этому может служить пониженный уровень экстрагируемости белка водной фазой в настоящем испытании и, конечно, потери белка 2S с углем. Однако уголь не изменял белковый профиль, когда он использовался в испытаниях 4 и 5.
Таблица 21.
Белковые профили различных образцов
Образец
Процентная доля площади белкового пика, соответствующая белку 12S (%)
Процентная доля площади белкового пика, соответствующая белку 7S (%)
Процентная доля площади белкового пика, соответствующая белку 2S (%)
Водный экстракт, полученный при 60°С
3,5
83,0
13,5
Солевой экстракт
3.3
42,9
53,8
′С200Н′
3,2
0,1
96,7
Этот образец имел отличный цвет и в высушенном состоянии, и во влажном состоянии (табл.22). Результат анализа порошка ′С200Н′ методом LECO составил только 89,3% w.b., но в пересчете на сухое вещество образец, вероятно, представлял собой изолят. Концентрация небелковых примесей согласно HPLC готового продукта составил только 1,1%. Таким образом, большая часть небелковых соединений, присутствующих в образце, не абсорбировалась при 280 нм. Наиболее вероятным из таких соединений является соль. Для удаления этой соли и повышения содержания белка в готовом продукте можно использовать дополнительную диафильтрацию с добавлением воды.
Таблица 22.
Цвет конечных продуктов испытания 7 в высушенном состоянии
Образец
L
а
b
′С200Н′
83,32
-1,12
21,56
Результаты испытаний 1-7 показывают, что способ двойной экстракции применительно к муке из масличных семян канолы обеспечивает получение богатых белком 7S и богатых белком 12S потоков.
Пример 3
Настоящий пример иллюстрирует способ двойной экстракции примера 2, в котором перед экстракцией солью проводились множественные экстракции водой. Результаты указанной серии испытаний приводятся ниже. Следует отметить, что в промышленности экстракция муки из масличных семян водой может осуществляться в противоточном экстракторе. Действие таких способов обработки муки равноценно действию большого количества отдельных промывок.
Испытание 1
15 г муки из масличных семян канолы (партия В) экстрагировали водой (150 мл) при 60°С в течение 5 мин. Воду предварительно нагревали до 65°С, а затем смешивали с мукой во вращающемся шейкере при 220 об/мин. Экстракт отделяли от остаточной муки центрифугированием при 10000 g в течение 10 мин. Экстракт декантировали и извлекали влажную муку, взвешивали её и определяли объем вкрапленной воды. Затем к остаточной муке добавляли количество воды с температурой 65°С, достаточное для доведения объема до первоначальных 150 мл, и экстракцию повторяли, как подробно описано выше. Этот процесс повторяли до тех пор, пока не было выполнено четырех экстракций водой. После этого проводили пятую экстракцию 0,5 М раствором NaCl комнатной температуры. Добавляли количество соли, достаточное для доведения объема до первоначальных 150 мл, а затем проводили экстракцию путем встряхивания образца при 220 об/мин в течение 30 мин. при комнатной температуре. Табл.23 показывает объем воды или раствора соли, добавляемый для каждой экстракции. Следует заметить, что получение гранул со связанной структурой невозможно при проведении центрифугирования после второй и третьей экстракций. Таким образом, в процессе декантации образцов должно удерживаться больше растворителя с тем, чтобы предупредить потери муки. Теоретически количество экстрагируемых загрязняющих веществ могло быть выше, если бы можно было удалить максимально возможный объем остаточной воды и заменить его свежей водой.
Таблица 23.
Объем экстракционных фракций
Экстракция №
Масса муки (г)
Объем вкрапленной воды (мл)
Объем добавленного растворителя (мл)
1
15
0
150
2
40
25
125
3
57
42
108
4
78
63
87
5
40
25
125
Измеряли pH, электропроводность и содержание сухих веществ по Бриксу в образцах экстрактов, после чего образцы фильтровали с применением фильтр-шприца с размером пор 0,45 мкм и тестировали на содержание свободных фенольных соединений (A330), видимый цвет (А390), содержание белка (LECO) и белковый профиль (SEC HPLC).
В ходе успешных экстракций водой удалялись значительные количества белка и примесей (табл.24). Солевой экстракт, полученный в настоящем испытании, был намного чище, чем солевые экстракты, полученные однократной экстракцией водой в испытаниях примера 2. В испытаниях примера 2 солевой экстракт, как было установлено, показал на HPLC-грамме площадь небелкового пика примерно 70%. Однако солевой экстракт, полученный в указанных испытаниях путем однократной экстракции водой с последующей экстракцией солью, причем обработка углем проводилась на обеих стадиях экстракции, показал намного меньшие показатели А330 (0,29), А390 (0,10) и площадь небелкового пика на HPLC-грамме (2,34%), чем в настоящем испытании. Эти различия позволяют предположить, что многократные экстракции водой не могут дать достаточно чистый солевой экстракт, способный придать продукту требуемый цвет.
Таблица 24.
Результаты анализов экстрактов Испытания 1
Образец
pH
Электропроводность (мСм)
Содержание сухих веществ по Бриксу
А330
А390
Белок (%)
Площадь небелкового пика на HPLC-грамме (%)
Водный
5,86
2,50
3.3
106,6
4,73
1,21
84,42
экстракт #1
Водный
6,06
0,825
0,7
23,1
1,53
0,26
91,61
экстракт #2
Водный
6,16
0,415
0,4
9,80
0,811
0,08
91,73
экстракт #3
Водный
6,26
0,269
0,3
5,73
0,518
0,03
91,89
экстракт #4
0,5 М
NaCl-экстракт
6,01
33,5
7,37
0,513
0,62
23,62
Белок 7S экстрагировался более легко горячей водой, чем белок 2S (табл.25). Как и ожидалось, солевой экстракт был обогащен белком 2S. Согласно оценке, примерно 1/3 часть общего экстрагированного белка 2S перешла (была потеряна) в водный поток с более низкой степенью чистоты вместе с основной массой белков 7S/12S и примесями. В то время как желательно было бы удержать как можно больше белка 2S в потоке с высокой степенью чистоты. Предельная допустимость потерь белка 2S с водной фазой (которая была извлечена как продукт пониженного качества) и фактическое число экстракций в общем способе многократных экстракций зависят от качества и количества белка 2S, поступающего из солевого потока.
Таблица 25.
Белковые профили экстрактов Испытания 1
Образец
Процентная доля площади белкового пика, соответствующая белку 12S (%)
Процентная доля площади белкового пика, соответствующая белку 7S (%)
Процентная доля площади белкового пика, соответствующая белку 2S (%)
Водный экстракт #1
2,4
80,6
17,0
Водный экстракт #2
3,3
86,6
10,1
Водный экстракт #3
8,3
83,3
8,4
Водный экстракт #4
8,7
81,0
10,3
0,5 М NaCl-экстракт
5,1
20,0
74,9
Испытание 2
150 г муки из семян канолы (партия В) экстрагировали водой (1500 мл) при 60°С в течение 5 минут. Воду предварительно нагревали до 65°С, а затем смешивали с мукой с помощью подвесной мешалки. Экстракт отделяли от остаточной муки путем центрифугирования при 7100 g в течение 10 мин. Экстракт декантировали и извлекали влажную муку, взвешивали ее и рассчитывали объем вкрапленной воды. Затем к остаточной муке добавляли количество воды с температурой 65°С, достаточное для приведения объема к первоначальным 1500 мл, и повторяли экстракцию, как подробно описано выше. Этот процесс повторяли до тех пор, пока не было выполнено 4 экстракций водой. После этого проводили пятую экстракцию 0,2 М раствором NaCl при комнатной температуре. В настоящем испытании была выбрана более низкая концентрация соли, чем в Испытании 1, поскольку соль требовалось впоследствии удалить диафильтрацией и много времени ушло бы на обработку пяти объемов при диафильтрации. 0,2 М раствор NaCl добавляли в количестве, достаточном для приведения объема к первоначальным 1500 мл, после чего проводили экстракцию путем вымешивания образца подвесной мешалкой в течение 30 мин при комнатной температуре. Табл.26 показывает объем воды или соли, добавленный на каждой стадии экстракции.
Таблица 26.
Объем экстракционных фракций
Экстракция №
Масса муки (г)
Объем вкрапленной воды (мл)
Объем добавленного растворителя (мл)
1
150
0
1500
2
430
280
1220
3
459
309
1191
4
466
316
1184
5
426
276
1224
Солевой экстракт отделяли от остаточной муки центрифугированием при 7100 g в течение 10 мин, а затем фильтровали через фильтровальные насадки #3. Осветленный солевой экстракт обрабатывали с применением соединенных параллельно мембранных устройств Vivaflow HY с MWCO 10000. Экстракт концентрировали, после чего подвергали диафильтрации с 5 объемами воды, очищенной методом обратного осмоса (RO). Добавление воды при диафильтрации приводило к образованию осадка, который удаляли центрифугированием при 7100 g в течение 10 мин перед повторным концентрированием. Ретентат от диафильтрации подвергали тепловой обработке при 85°С в течение 10 мин для осаждения белков 7S и 12S, которые удаляли центрифугированием при 8000 g в течение 15 мин. Затем концентрат высушивали сублимационной сушкой и обозначали ′С200Н′. Различные образцы анализировали на содержание свободных фенольных соединений (А330), видимый цвет (А390), содержание белка (LECO) и белковый профиль (SEC HPLC). В готовых продуктах измеряли цвет в высушенном состоянии с помощью колориметра Minolta, а также готовили из них растворы для анализа цвета во влажном состоянии. Сухой белок (0,7 г) комбинировали с 0,1М раствором NaCl (10 мл) с помощью вихревой мешалки. Затем образец центрифугировали при 8000 g в течение 10 мин и определяли содержание белка в супернатанте методом LECO. Аликвотное количество (8 мл) супернатанта переносили в небольшой лабораторный стакан и добавляли к нему количество соли, достаточное для доведения содержания белка до 5%. Затем образцы фотографировали.
Экстракции водой в настоящем испытании, по-видимому, удаляли по приблизительным подсчетам такое же количество белка, цвета и примесей, что и в Испытании 1 (табл.27). Качество же солевого экстракта, полученного в настоящем испытании, несколько отличалось, как оказалось, меньшим количеством белка, свободных фенольных соединений, примесей и видимого цвета. Поскольку данные анализа водных экстрактов фактически одинаковы, различия между солевыми экстрактами, вероятно, можно объяснить разными концентрациями соли.
Таблица 27.
Результаты анализов экстрактов Испытания 2
Образец
pH
Электропроводность (мСм)
Содержание сухих веществ по Бриксу
А330
А390
Белок (%)
Площадь небелкового пика на HPLC-грамме (%)
Водный экстракт #1
6,02
2,53
3,2
97,7
4,96
1,11
84,36
Водный экстракт #2
6,24
0,906
1,0
22,8
1,63
0,22
91,12
Водный экстракт #3
6,39
0,400
0,4
9,48
0,756
0,14
90,27
Водный экстракт #4
6,49
0,222
0,2
4,36
0,437
0,12
84,19
0,5 М NaCl-экстракт
6,18
15,88
1,99
0,202
0,40
14,19
Белковые профили водных экстрактов в настоящем испытании (табл.28) были схожи с Испытанием 1, но солевые экстракты, как было установлено, отличались повышенной процентной долей белка 2S. Это было в некоторой степени удивительно, поскольку в настоящем испытании концентрация соли была меньше, а повышенный уровень соли, как предполагалось, более благоприятствует экстрагированию белка 2S, чем белка 7S.
Таблица 28.
Белковые профили экстрактов Испытания 2
Образец
Процентная доля площади белкового пика, соответствующая белку 12S (%)
Процентная доля площади белкового пика, соответствующая белку 7S (%)
Процентная доля площади белкового пика, соответствующая белку 2S (%)
Водный экстракт #1
2,2
81,5
16,3
Водный экстракт #2
4,6
86,3
9,1
Водный экстракт #3
11,7
83,4
4,9
Водный экстракт #4
18,9
73,1
8,0
0,2 М NaCl-экстракт
2,2
8,1
89,7
Мембранная обработка солевого экстракта с последующей его очисткой привела к тому, что % доля площади небелкового пика на HPLC-грамме для ретентата от диафильтрации составила только 2,3%, т.е. ниже, чем обычно наблюдалось в испытаниях с однократной экстракцией водой (см. пример 2).
Цвет образца ′С200Н′ в высушенном состоянии, полученного в настоящем испытании, показан в табл. 29. Он был весьма схож с цветом образцов, полученных в других испытаниях с двойной экстракцией такой же муки. Применение активированного угля в порошке вкупе с двойной экстракцией дало ′С200Н′ с показателем светлоты почти 90 и с менее выраженными красными и желтыми оттенками, чем в продукте настоящего испытания.
Таблица 29.
Цвет продукта Испытания 2 в высушенном состоянии
L
а
b
′С200Н′ - Испытание 2
83,53
-1,07
19,20
Цвет образца ′С200Н′ во влажном состоянии, полученного в Испытании 2, также был не лучше, чем в других испытаниях с двойной экстракцией (водой 60°С) без адсорбента, и определенно темнее, чем у образца, полученного с применением адсорбента.
Результаты настоящих испытаний по сравнению с испытаниями в примере 2 показывают, что многократные экстракции муки водой перед экстракцией солью удаляют, по-видимому, дополнительные количества примесей (в тех случаях, когда адсорбент не использовался), однако, не оказывают значительного влияния на качество готового продукта.
Пример 4
Настоящий пример иллюстрирует получение продукта - изолята белка 2S - из ретентата от ультрафильтрации.
40 кг муки канолы добавляли к 400 л 0,15 М раствора NaCl при температуре окружающей среды, перемешивали в течение 30 минут для получения водного белкового раствора. Остаточную муку канолы удаляли, а полученный белковый раствор осветляли центрифугированием и фильтрацией с получением 139 л фильтрованного белкового раствора, имеющего содержание белка 1,87 мас.%.
Аликвотное количество (139 л) раствора белкового экстракта сокращали в объеме до 8,9 л путем концентрирования на PVDF-мембране, способной пропускать соединения с молекулярной массой 30000 дальтон. Аликвотное количество (5 л) концентрированного белкового раствора подвергали затем диафильтрации с 24,8 л 0,15 М раствора NaCl через PES-мембрану, способной пропускать соединения с молекулярной массой 100000 дальтон. Ретентат от диафильтрации пастеризовали при 60°С в течение 10 минут.
Был получен образец подвергнутого диафильтрации и ультрафильтрации (UF1) пастеризованного ретентата. Содержание белка в этом ретентате составило 18,30 мас.%. Предполагалось, что высокая концентрация белка вкупе с высокой долей белка 7S, присутствующего в UF1 ретентате, приведет при тепловой обработке скорее к желированию, чем только к осаждению. Поэтому концентрация белка в образце перед тепловой обработкой была отрегулирована путем комбинирования 100 мл ретентата с 100 мл 0,1 М раствора NaCl.
Разбавленный образец подвергали тепловой обработке при 85°С в течение 10 минут с последующим быстрым охлаждением холодной водой с температурой ниже 30°С. Затем образец центрифугировали при 10200 g в течение 15 мин. После центрифугирования был получен осадок, а также взвесь с плавающими частицами осадка. Супернатант декантировали, а плавающие частицы удаляли фильтрацией через бумажный фильтр с размером пор 25 мкм. Извлеченный супернатант (120 мл) концентрировали на мембранной установке Vivaflow HY с MWCO 10000, а затем подвергали диафильтрации с 10 объемами воды, очищенной методом обратного осмоса (RO), для удаления соли. Ретентат от диафильтрации высушивали сублимационной сушкой и обозначали как ′С500Н′.
Различные образцы анализировали на содержание свободных фенольных соединений (А330), видимый цвет (А390), содержание белка (LECO) и белковый профиль (SEC HPLC). Готовый продукт анализировали на влагосодержание методом сушки в печи; цвет продукта в высушенном состоянии измеряли колориметром Minolta, а для анализа цвета во влажном состоянии готовили раствор продукта. Сухой белок (0,7 г) комбинировали с водой (10 мл) с помощью вихревой мешалки. Затем образец центрифугировали при 7800 g в течение 10 мин и определяли содержание белка в супернатанте методом LECO. Аликвотное количество (8 мл) супернатанта переносили в небольшой лабораторный стакан и добавляли к нему количество воды, достаточное для доведения содержания белка до 5%. Затем образец фотографировали.
Тепловая обработка UF1 ретентата эффективно удаляла из образца основную массу белков 7S и 12S. Процентные доли площади белковых пиков на HPLC-грамме начального ретентата, соответствующих белкам 7S и 12S, составили соответственно 61,4% и 2%. В супернатанте от подвергнутого тепловой обработке образца они снизились до 4,4% в случае белка 7S и до 0,4% в случае белка 12S. Полученный готовый продукт представлял собой изолят с содержанием белка (в пересчете на сырую массу) 90,32% и влагосодержанием 4,82%; в пересчете на сухие вещества содержание белка составило 94,89%. Цвет продукта в высушенном состоянии был несколько темнее, чем это характерно для продуктов С200Н (табл.30).
Таблица 30.
Цвет полученного из UF1 ретентата образца С500Н в высушенном состоянии
Образец
L
а
b
С500Н
80,84
-1,12
22,32
Цвет продукта во влажном состоянии был вполне приемлемым, хотя и несколько темнее, чем у образца С200Н. Образец был слегка мутным.
Как можно видеть из приведенных здесь результатов, изолят белка канолы, состоящий преимущественно из белка 2S, можно успехом получать из и UF1ретентата.
Пример 5
Настоящий пример иллюстрирует влияние тепловой обработки раствора экстракта белка канолы, полученного из муки из масличных семян канолы.
150 г муки из масличных семян канолы (SB062) экстрагировали 0,1 М раствором NaCl (1500 мл) в течение 30 минут при комнатной температуре в условиях перемешивания подвесной мешалкой. Смесь центрифугировали при 7100 g в течение 10 мин для отделения экстракта от остаточной муки. Собранный экстракт подвергали тепловой обработке при 85°С в течение 10 мин в варочном котле с двойной изоляционной рубашкой для осаждения белков 7S/12S. После тепловой обработки образец сразу же охлаждали до температуры ниже 30°С путем погружения в холодную водяную баню. Осажденные белки удаляли центрифугированием при 7100 g в течение 10 мин, а концентрат очищали с помощью фильтровальных насадок #3. Осветленный концентрат концентрировали в ультрафильтрационной установке Vivaflow HY с MWCO 10000 и подвергали диафильтрации с 10 объемами воды, очищенной методом обратного осмоса. Добавление воды при диафильтрации приводило к образованию небольшого количества осадка, который удаляли центрифугированием образца при 7100 g в течение 10 мин перед повторньм концентрированием. Ретентат от диафильтрации высушивали сублимационной сушкой с получением готового продукта.
Различные образцы анализировали на содержание свободных фенольных соединений (А330), видимый цвет (А390), содержание белка (LECO) и белковый профиль (SEC HPLC). Готовый продукт анализировали на влагосодержание методом сушки в печи; цвет продукта в высушенном состоянии измеряли колориметром Minolta, а для анализа цвета во влажном состоянии готовили раствор продукта. Сухой белок (0,8 г) комбинировали с водой (10 мл) с помощью вихревой мешалки. Затем образец центрифугировали при 7800 g в течение 10 мин и определяли содержание белка в супернатанте методом LECO. Аликвотное количество (8 мл) супернатанта переносили в небольшой лабораторный стакан и добавляли к нему количество воды, достаточное для доведения содержания белка до 5%. Затем образец фотографировали.
Тепловая обработка экстракта эффективно удаляла из образца основную массу белков 7S и 12S. Процентные доли площади белковых пиков на HPLC-грамме начального экстракта, соответствующие белкам 7S и 12S, составили соответственно 63,8% и 3,8%. В концентрате подвергнутого тепловой обработке образца они уменьшились до 2,0% в случае белка 7S и до 0,8% в случае белка 12S. Осадок, образовавшийся при тепловой обработке экстракта, легко удалялся центрифугированием. Полученный готовый продукт представлял собой изолят с содержанием белка (в пересчете на сырую массу) 84,15% и влагосодержанием 7,22%; в пересчете на сухие вещества содержание белка составило 90,70%. Цвет продукта в высушенном состоянии был несколько темнее и краснее, чем это характерно для большинства продуктов изолятов 2S (табл.31).
Таблица 31.
Цвет изолята 2S в высушенном состоянии, полученного из подвергнутого тепловой обработке экстракта
Образец
L
а
b
2S из подвергнутого тепловой обработке экстракта
80,60
-0,57
22,34
Аннотация изобретения
Если говорить кратко, то настоящее изобретение обеспечивает способы производства изолята белка канолы, состоящего преимущественно из белка канолы 2S и практически не содержащего белки 7S и 12S. Возможны модификации в масштабе изобретения.