Ассоциация микроорганизмов Acidithiobacillus thiooxidans, Acidiphilium cryptum, Leprospirillum ferriphillum, Ferroplasma acidiphilum для окисления сульфидного золотосодержащего концентрата
ASSOCIATION OF MICROORGANISMS ACIDITHIOBACILLUS THIOOXIDANS, ACIDIPHILIUM CRYPTUM, LEPROSPIRILLUM FERRIPHILLUM, FERROPLASMA ACIDIPHILUM FOR THE OXIDATION OF SULFIDE GOLD-BEARING CONCENTRATE

Изобретение относится к микробиологии и биогидрометаллургической технологии извлечения золота из упорных сульфидных концентратов, содержащих пирротин, арсенопирит, пирит, антимонит.
Известно использование Ассоциации умеренно термофильных и термотолерантных микроорганизмов для переработки золотомышьяковых сульфидных руд в ЮАР, Австралии, Гане, Китае и США.
Известен ряд ацидофильных ассоциаций умеренно термофильных микроорганизмов, выделенных из промышленных реакторов микробного окисления сульфидных концентратов.
Известна микробная ассоциация, осуществляющая процесс биоокисления пирит-арсенопиритных концентратов при температурах 40-45°С, которая включает представителей Acidithiobacillus caldus и Leptospirillum ferrooxidans [D.E. Rawlings, N.J. Coram, M.N. Garduer and S.M. Deane. Thiobacillus caldus and Lepto spirillum ferrooxidans are widely distributed in continuous flow biooxidation tanks used to treat variety of metal containing ores and concentrate. In: Biohydrometallurgy and the Environment toward the Mining of the 21 st century. (R. Amils, A. Ballester, Eds.), Part A. IBS, 1999, Elsevier, p. 777-786].
Известна железосульфоокисляющая ацидофильная ассоциация бактерий Thiobacillus ferrooxidans, Leptospirillium ferrooxidans, Sulfobacillus thermosulfidooxidans, Ferroplasma acidiphilum [Патент RU на изобретение №2256712, МПК C22B 11/00, опубл. 20.07.2005. Способ переработки первичных золотосульфидных руд].
Известна микробная ассоциация, осуществляющая процесс биоокисления кобальтового пиритного концентрата при температурах 35-46°С, включающая железо- и сероокисляющих микроорганизмов Leptospirillum ferriphilum, Acidithiobacillus caldus, Ferroplasma acidiphilum, Sulfobacillus benefaciens [D.H.R. Morin and P. d'Hugues, Bioleaching of a cobalt containing pyrite in stirred reactors: a case study from laboratory scale to industrial application. In: Biomining (D.E. Rawlings, B.D. Johnson, Eds.), 2007, Springer, p. 35-55].
Известны микробные ассоциации, выделенные из промышленных реакторов фабрик, расположенных в ЮАР и КНР, в которых осуществлялось биоокисление золотомышьковых концентратов при 45°С [van Hille R.P., van Wyk N., Harrison S.T.L. Review of microbial ecoclogy of BIOX reactors illustrates the dominance of the genus Ferroplasma in many commercial reactors. In: Proceed. 19th Int. Biohydrometallurgy Symp. (IBS 2011) (Guanzhou Q., Tao J., Wending Q., Xueduan L., Yu Y., Haidong W. Changsha, Eds.), Central South University Press, 2011. P. 1021].
Наиболее близким по сущности и достигаемому результату к заявленному изобретению является ассоциация микроорганизмов Sulfobacillus olympiadicus, Ferroplasma acidiphilum, Leptospirillum ferrooxidans, выделенная из рабочих промышленных реакторов золотоизвлекательной фабрики и предназначенная для окисления сульфидного золотосодержащего концентрата, содержащего пирротин, арсенопирит, пирит и антимонит [Патент на изобретение RU 2332455, МПК C12N 1/20, опубл. 27.08.2008 Ассоциация микроорганизмов Sulfobacillus olympiadicus, Ferroplasma acidiphilum, Leptospirillum ferrooxidans для окисления сульфидного золотосодержащего концентрата].
Недостатком известных ассоциаций микроорганизмов является их недостаточная активность и нестабильность их состава при флуктуациях технологических параметров при изменении состава окисляемых сульфидных концентратов.
Технической проблемой изобретения является выделение из промышленных реакторов ассоциации умеренно термофильных микроорганизмов, характеризующихся стабильностью и активностью при флуктуации технологических параметров в пульпе реакторов биоокисления.
Техническая проблема решается за счет выделения из промышленных реакторов естественной ассоциации бактерий Acidithiobacillus thiooxidans, Acidiphilium cryptum, Leprospirillum ferriphillum, и архей Ferroplasma acidiphilum. Микроорганизмы были депонированы в НБЦ ВКПМ НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика (далее ВКПМ). Acidithiobacillus thiooxidans справка о депонировании №13655 от 14.10.2020, Acidiphilium cryptum справка о депонировании №13776 от 14.10.2020, Leprospirillum ferriphillum справка о депонировании №13777 от 14.10.2020, Ferroplasma acidiphilum справка о депонировании №13654 от 14.10.2020.
Технический результат изобретения заключается в выделении из рабочих промышленных реакторов золотоизвлекательной фабрики, сформировавшейся в течение технологического процесса микробной ассоциации, состоящей из штаммов бактерий Acidithiobacillus thiooxidans, Acidiphilium cryptum, Leptospirillum ferriphilum, и архей Ferroplasma acidiphilum, которые за счет их железоокисляющих и сероокисляющих свойств способствуют повышению активности ассоциации.
Технический результат изобретения заключается в выделении из рабочих промышленных реакторов золотоизвлекательной фабрики, сформировавшейся в течение технологического процесса микробной ассоциации, состоящей из штаммов бактерий Acidithiobacillus thiooxidans, Acidiphilium cryptum, Leptospirillum ferriphilum, и архей Ferroplasma acidiphilum, что способствует повышению стабильности ассоциации при флуктуации технологических параметров в пульпе реакторов биоокисления. Изобретение осуществлено следующим способом.
4
2
4
4
2
Из промышленных реакторов биоокисления пирротинсодержащего пирит-арсенопиритного концентрата были отобраны образцы пульпы объемом 50 мл. Из полученных образцов пульп из реакторов выделяли ДНК для проведения секвенирования фрагментов гена 16S рРНК. Для выделения ДНК биомассу отделяли от твердой и жидкой части пульпы центрифугированием. Для этого образцы пульпы центрифугировали сначала при 1000 об./мин в течении 15 мин, чтобы отделить твердую часть пульпы. Супернатант использовали для осаждения биомассы путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 1 часа. Полученный осадок биомассы микроорганизмов промывали, центрифугируя при 3000 об/мин в течение 30 мин., раствором следующего минерального состава (г/л): (NH)SO - 1,0; аммофос - 0,4; KOH - 0,1; MgSO×7HO - 0,5 с рН 1.5 для удаления осадков соединений железа, а затем тем же раствором с нейтральным рН для удаления кислоты. Образец ресуспендировали в 300 мкл лизирующего буфера (0,15 М NaCl, 0,1 М Na2-EDTA, рН 8,0), содержащего 15 мг/мл лизоцима. До выделения ДНК буфер с лизированной биомассой хранили при -20°С в пластиковых пробирках с завинчивающимися крышками. ДНК выделяли фенол-хлороформным методом [Т. Maniatis, E.F. Fritsch, J. Sambrook, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, p. 545.]. Библиотеки для секвенирования были приготовлены в соответствии с ранее описанным протоколом [Fadrosh D.W., Ma В., Gajer P., Sengamalay N., Ott S., R.M. Brotman R.M., Ravel J. An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform, Microbiome. 2014. 2:6. DOI: 10.1186/2049-2618-2-6.]. В качестве универсальных использовались праймеры Pro341F (5'-CCTACGGGNBGCASCAG-3') и Pro805R (5'-GACTACNVGGGTATCTAATCC-3'), которые позволяют амплифицировать вариабельные участки генов 16S рРНК V3 и V4. Для дальнейшего секвенирования полученные ампликоны разделялись с помощью электрофореза в агарозном геле, вырезанные из геля ампликоны очищались с помощью набора для очистки ДНК из геля и реакционных смесей Cleanup Standard (Евроген, Россия). Секвенирование проводилось при помощи набора реагентов, обеспечивающего длину прочтения 300 нуклеотидов с каждого конца ампликона. Первичная обработка (фильтрация и демультиплексирование) полученных прочтений производилось при помощи ПО CLC Genomics Workbench 7.5 (Qiagen, США). Полученные данные были обработаны с помощью онлайн сервиса SILVAngs (https://www.arb-silva.de/ngs/). Для каждого образца было проанализировано около 10000 тыс. фрагментов средней длиной 486 нуклеотида. Было установлено, что в состав микробных ассоциаций всех исследованных реакторов входят бактерии Acidithiobacillus thiooxidans, Acidiphilium cryptum, Leptospirillum ferriphilum, a также архей Ferroplasma acidiphilum. Доля микроорганизмов варьировала в реакторах из-за флуктуаций технологических параметров, однако качественный состав ассоциации оставался постоянным. Количественные соотношения между микроорганизмами представлены в таблице 1.
Мониторинг присутствия в ассоциации бактерий Acidithiobacillus thiooxidans, Acidiphilium cryptum, Leptospirillum ferriphilum и архей Ferroplasma acidiphilum, а также количественного соотношения между штаммами был проведен с использованием метагеномного анализа фрагментов гена 16S рРНК с помощью высокопроизводительного секвенирования на платформе Illumina MiSeq.
Микроорганизмы ассоциации были выделены в чистые культуры, были определены их таксономический статус и основные характеристики.
Штамм Acidithiobacillus thiooxidans имеет следующие характеристики.
2
4
2
4
4
3
2
2
2
4
Штамм выделен методом предельных десятикратных разведений из пробы жидкой фазы пульпы промышленного реактора биоокисления пирротинсодержащего пирит-арсенопиритного концентрата на жидкой питательной модифицированной среде Сильвермана и Люндгрена 9К следующего состава (г/л): (NH4)SO - 3; KCl - 0,2; KHPO - 0,5; MgSO⋅7H2O - 0,5; Ca(NO) - 4HO - 0,01; элементарная сера - 10 г/л; HSO - 0,5 мл/л.
Морфологические признаки
Это грамотрицательная бактерия. Клетки палочковидные, с округлыми концами, размером 0.5-0.6×0.85-1.0 мкм. Размножаются делением.
Культуральные признаки
На жидкой среде с содержанием элементарной серы происходит окисление серы и рост бактерий, в результате чего происходит помутнение среды и снижение рН.
Физиологи-биохимические свойства
2
Хемолитоавтотроф, аэроб. В качестве источника энергии используют серу и ее восстановленные соединения. Источником углерода является СО атмосферы. Растет в диапазоне температур 20-38°С, оптимальная температура - 35°С. Рост наблюдается в диапазоне рН 0,5-5,2 с оптимумом 1.7-3.3.
Генотипические характеристики
Сходство последовательности гена 16S рРНК штамма с геном 16S рРНК типового штамма вида Acidithiobacillus thiooxidans DSM 14887 - 99.80%, что указывает на принадлежность к виду Acidithiobacillus thiooxidans.
Штамм Acidiphilium cryptum имеет следующие характеристики.
2
4
2
4
4
3
2
2
2
4
Штамм выделен методом предельных десятикратных разведений из пробы жидкой фазы пульпы промышленного реактора биоокисления пирротинсодержащего пирит-арсенопиритного концентрата на жидкой питательной среде следующего состава (г/л): (NH4)SO - 3; KCl - 0,2; KHPO - 0,5; MgSO ⋅ 7H2O - 0,5; Ca(NO) - 4HO - 0,01; HSO - 0,5 мл/л, дрожжевой экстракт 10% - 2 мл/л, раствор глюкозы 10% - 2 мл/л.
Морфологические признаки
Грамотрицательные бактерии. Клетки палочковидные, размером 0,5×1 мкм. Размножаются почкованием.
Культуральные признаки
На жидкой среде, содержащей дрожжевой экстракт и глюкозу штамм способен в процессе роста окислять элементарную серу, что сопровождается снижением рН. Физиологи-биохимические свойства.
Гетеротроф, аэроб. Источником энергии и углерода является органические вещества (дрожжевой экстракт, глюкоза). Способен окислять элементарную серу. Растет в диапазоне температур 30-45°С, оптимальная температура - 40°С. Рост наблюдается в диапазоне рН 0,5-2,0 с оптимумом 1.0.
Генотипические характеристики
Сходство последовательности гена 16S рРНК штамма с геном 16S рРНК типового штамма вида Acidiphilium cryptum DSM 2389 - 99.93%, что указывает на принадлежность к виду Acidiphilium cryptum.
Штамм Leptospirillum ferriphilum имеет следующие характеристики.
2
4
2
4
4
3
2
2
4
2
2
4
Штамм выделен методом предельных десятикратных разведений из пробы жидкой фазы пульпы промышленного реактора биоокисления пирротинсодержащего пирит-арсенопиритного концентрата на жидкой питательной модифицированной среде следующего состава (г/л): (NH4)SO - 3; KCl - 0,2; KHPO - 0,5; MgSO ⋅ 7H2O - 0,5; Ca(NO) - 4HO - 0,01; FeSO - 7HO - 44,2; HSO - 2,5 мл/л.
Морфологические признаки
Это грамотрицательная бактерия. Клетки обладают полиморфизмом, клетки имеют форму вибрионов размером и 0,5×1,5-1,2 мкм, спирилл 0,5×1,5-3,5 мкм и псевдококков диаметром 1,0 мкм. Размножаются делением.
Культуральные признаки
2+
3+
На жидкой среде с содержанием сульфата железа (II) (44,2 г/л) происходит окисление ионов железа Fe до Fe, в результате чего происходит побурение среды. Физиологи-биохимические свойства.
2
Хемолитоавтотроф, аэроб. В качестве источника энергии используют ионы двухвалентного железа и сульфидные минералы. Не окисляет серу и ее восстановленные соединения. Источником углерода является CO атмосферы. Растет в диапазоне температур 20-45°С, оптимальная температура - 37°С. Рост наблюдается в диапазоне рН 0,5-2,5 с оптимумом 1.0-1.2.
Генотипические характеристики
Сходство последовательности гена 16S рРНК штамма с геном 16S рРНК типового штамма вида Leptospirillum ferriphilum DSM 14647 - 98.46%, что указывает на принадлежность к виду Leptospirillum ferriphilum.
Штамм Ferroplasma acidiphilum имеет следующие характеристики.
4
4
2
4
2
4
4
2
2
4
Штамм выделен методом предельных десятикратных разведений из пробы жидкой фазы пульпы промышленного реактора биоокисления пирротинсодержащего пирит-арсенопиритного концентрата на жидкой питательной среде следующего состава (г/л): MgSO×7H2O - 0,4; (NH)SO - 0,2; KCl - 0,1; KHPO - 0,1; FeSO×7HO - 25; дрожжевой экстракт 10% - 2 мл/л, HSO - 6 мл/л.
Морфологические признаки
Археи, клетки которых лишены клеточной стенки. Клетки плеоморфные, 0,5-1 мкм. Размножаются делением.
Культуральные признаки
2+
3+
На жидкой среде с содержанием сульфата железа (II) (25 г/л) происходит окисление ионов железа Fe до Fe, в результате чего происходит побурение среды. Физиологи-биохимические свойства.
Хемолитогетеротроф, аэроб. В качестве источника энергии используют ионы двухвалентного железа и сульфидные минералы. Не окисляет серу и ее восстановленные соединения. Источником углерода является органические вещества (дрожжевой экстракт). Растет в диапазоне температур 30-45°С, оптимальная температура - 40°С. Рост наблюдается в диапазоне рН 0,5-2,0 с оптимумом 1.0.
Генотипические характеристики
Сходство последовательности гена 16S рРНК штамма с геном 16S рРНК типового штамма вида Ferroplasma acidiphilum Y (DSM 12658) - 99.85%, что указывает на принадлежность к виду Ferroplasma acidiphilum.
Эффект изобретения заключается в выделении ассоциации микроорганизмов, способных к биоокислению железа, серы и сульфидных минералов в различных условиях (температура, рН), что делает возможным ее применение для промышленного биоокисления сульфидных золотосодержащих концентратов в широком диапазоне условий.