АНТИОКСИДАНТНОЕ ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО НА ОСНОВЕ ЗЕРНОВОЙ ПОСЛЕСПИРТОВОЙ БАРДЫ
ANTIOXIDANT MEDICINAL AGENT BASED ON DISTILLERS SPENT GRAINS

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается получения из зерновой послеспиртовой барды лекарственного средства с выраженным антиоксидантным эффектом и может применяться при лечении и профилактике заболеваний, связанных с окислительным стрессом.
Основной причиной патологических процессов в организме человека, вызывающих преждевременное старение и развитие заболеваний, в том числе сердечно-сосудистых, онкологических, является избыточное накопление свободных радикалов кислорода, вследствие вредного воздействия которых происходит разрушение липидов, белков, ДНК, мембран клеток, называемое окислительным стрессом (Шанин Ю.Н., Парамонов Б.А., Зиновьев Е.В. Современные антиоксидантные препараты в клинической практике (Обзор). Бюл. эксперим. биологии и медицины, 2003, т.34, №11, с.11-28).
Токсичным эффектам свободных радикалов организм человека противостоит двумя механизмами защиты: ферментативным (супер-оксиддисмутаза, каталаза и др.) и неферментативным (биогенные элементы, витамины А, С, Е, ненасыщенные жирные кислоты, флавоноиды и др.) (Шанин Ю.Н., 2003). В норме эффективно реализуются оба механизма. При патологии необходимо усиление антиоксидантной защиты организма, например, путем использования экзогенных биоантиоксидантов, которые, как правило, назначаются в комплексе. Учитывая способность биоантиоксидантов к быстрому окислению, а также их потери при «доставке» к органам-мишеням, требуются специальные «носители» экзогенных биоантиоксидантов. Подобными «носителями» могут быть пектины или их фрагменты (олигогалактурониды), которые относительно слабо связывают антиоксиданты, обеспечивая последующее их высвобождение, и, кроме того, сами ингибируют процессы пероксидного окисления (Кайшева Н.Ш. Научные основы применения полиуронидов в фармации. Пятигорск, ПятГФА, 2003, 194 с.; Mill P.J., Cresswell М.А., Feinberg J.G. New Biologically Active Conjugates. / Pat. Brit. 1,174,854, Int. C1. С08b 19/00). Поскольку олигогалактурониды в сравнении с полигалактуронидами и пектинами имеют меньшую молярную массу, соответственно, и степень полимеризации, а также характеризуются высокой растворимостью в полярных растворителях, низкой константой устойчивости продуктов взаимодействия (Кайшева Н.Ш., 2003), то именно олигогалактурониды обеспечивают более высокую биологическую доступность связанных с ними компонентов.
2+
+
2+
2+
2+
3+
5+
4+
2+
2+
Известно применение комплексов олигогалактуронидов с ионами металлов в качестве антиоксидантных средств (Лакатош Б., Майзель Ю., Вардью М. Способ получения комплекса иона металла с олиго- или полигалактуроновыми кислотами. / Пат. СССР 886750, МКИ С 07 Н 23/00, опубл. 30.11.81). Данные средства получают путем синтеза олиго- или полигалактуронидов (со степенью полимеризации 10-145) с витаминами, солями или комплексами ионов биогенных металлов (Fe, K, Со, Mn, Zn, Cr, Мо, V, Mg, Ni), имеющими более низкую константу устойчивости, чем целевые продукты. Недостатками указанных аналогов являются: длительность (~10 ч) приготовления водных растворов пектинсодержащих порошков; необходимость и длительность выделения полигалактуронидов из пектинсодержащих порошков путем четырехкратного щелочного гидролиза в присутствии катализаторов и осаждения (~ по 10 ч); необходимость получения олигогалактуронидов из полигалактуронидов путем длительного щелочного гидролиза, кипячения и осаждения.
Известно антиоксидантное средство, содержащее водорастворимый лигнин, полученный путем обработки природного растительного материала водным диоксаном в присутствии соляной кислоты при температуре кипения с последующей обработкой диоксанлигнина раствором щелочи до полного растворения, настаиванием щелочного раствоpa с катеонитом до определенного значения рН; полученный продукт обладает высокой антиоксидантной активностью (Кочева Л.А., Борисенков М.Ф., Карманов А.П., Загирова С.В. Средство на основе лигнина, обладающее антиоксидантной активностью. / Пат. РФ 2292896 С2, МПК А61K 36/00, опубл. 10.02.2007). Данное средство, как выделенное из природного растительного материала, водорастворимое, безвредное и обладающее высокой антиоксидантной активностью, наиболее близко к заявляемому средству и выбрано в качестве прототипа.
Недостатком выбранного за прототип антиоксидантного средства является наличие в качестве активного компонента только лигнина, эффект которого обусловлен его рекомбинацией со свободными кислородными радикалами (Пат. РФ 2292896 С2). При этом известно, что механизм антиоксидантного действия многосторонен: наряду со связыванием свободных радикалов кислорода, он включает активирование пероксидазы, катализ метаболизма, сорбцию катионов тяжелых металлов, ингибирование пероксидного окисления (Шанин Ю.Н., 2003; Ivars К. et al. Hydroxyl radical scavenger, Пат. USA 5965615, 1999; Рогожин B.B. Автореф. дис.… докт. биол. наук, Иркутск, 2000, 59 с.). Для проявления подобного многостороннего эффекта, как правило, необходимы композиции различных соединений: флавоноидов и уронидов (Кретович В.Л. Биохимия растений, М.: ВШ, 1980, 445 с.; Кайшева Н.Ш., 2003; Nguyen Т.Т. Antioxidant grafted polysaccharides Пат. USA 5612321, 1997); ненасыщенных жирных кислот, флавоноидов, аскорбиновой кислоты, токоферолов (Кретович В.Л., 1980; Драчева Л.В. и др. Пищ. пром-сть, 2008, №4, с.28-29); флавоноидов и аскорбиновой кислоты (Куркин В.А. Фармакогнозия, Самара: Офорт, 2007, 1239 с.; Duffy J.A. Supersaturated ascorbic acid solutions. Пат.USA 6020367, 2000). Даже в низких концентрациях сочетание указанных соединений обусловливает синергизм и потенцирование антиоксидантного эффекта. Другими недостатками известного антиоксиданта - лигнина являются: необходимость использования «носителя» (например, уронидов) при доставке лигнина к органам-мишеням во избежание потерь вследствие быстрого окисления; возможно, низкая биологическая доступность лигнина как полимера.
Пожалуй, единственным объектом, одновременно содержащим весь комплекс выше перечисленных веществ антиоксидантного действия, является зерновая послеспиртовая барда, что делает ее уникальной для получения антиоксидантной биокомпозиции.
Цель изобретения - создание на основе зерновой послеспиртовой барды лекарственного средства с выраженным антиоксидантным действием.
Поставленная цель достигается тем, что лекарственное средство с выраженным антиоксидантным действием, содержащее олигогалактурониды, биогенные элементы, витамины А, С, Е, ненасыщенные жирные кислоты, флавоноиды, получают из зерновой послеспиртовой барды путем разделения ее на жидкую и твердую фракции, концентрирования жидкой фракции и обработки ее спиртом 95%, экстрагирования твердой фракции горячей водой методом вихревой экстракции с последующим выделением продукта аналогично выделению из жидкой фракции, смешивания выделенных из обеих фракций образцов.
Наряду с фенольными соединениями заявляемое средство в отличие от известного средства-прототипа содержит другие вещества, обусловливающие разносторонний и потенцированный антиоксидантный эффект. Кроме того, получение заявляемого средства является упрощенным: не требует предварительных стадий измельчения сырья, освобождения его от смолы (для средства-прототипа данная стадия протекает в течение 57 ч), последовательного получения нерастворимой и растворимой форм продукта, переосаждения, особого способа высушивания (лиофилизация). Помимо этого, заявляемое средство находится в устойчивой и точно дозируемой форме - твердом состоянии, в то время как известное средство выделяется в виде водного раствора, где под действием растворителя процессы окисления, разложения активного вещества значительно ускоряются, что позволяет предположить непродолжительность антиоксидантного эффекта известного средства.
Результаты анализа химического состава (Государственная фармакопея СССР, 10-е изд. М.: Медицина, 1968, 1080 с.; Лазурьевский Г.В., Терентьева И.В., Шамшурин А.А. Практические работы по химии природных соединений. М.: ВШ, 1966, 335 с.) заявляемого средства приведены в таблице 1. Данные таблицы 1 показывают, что предлагаемое средство содержит олигогалактурониды со степенью полимеризации 9, витамины А, Е, С, ненасыщенные жирные кислоты, флавоноиды, биогенные элементы.
Способ получения заявляемого антиоксидантного средства из зерновой послеспиртовой барды поясняется следующим конкретным примером.
Пример 1. Зерновую послеспиртовую барду объемом 100 мл разделяют на жидкую и твердую фракции путем декантации и процеживания через мешковину. Жидкую фракцию барды фильтруют через бумажный фильтр с зеленой полосой, остаток на фильтре объединяют с твердой фракцией барды. Жидкую фракцию (объем 72,5 мл, плотность 1,005 г/мл) упаривают на кипящей водяной бане до получения концентрата плотностью 1,480 г/мл, обрабатывают спиртом 95% в объемном соотношении концентрат:спирт 1:3. Выпавший осадок отфильтровывают через бумажный фильтр с зеленой полосой, высушивают при температуре 60±5°С и измельчают путем растирания в ступке до образования однородного порошка. Выход осадка составляет 2,3925 г или 3,3% к жидкой фракции барды.
Твердую фракцию барды (масса твердой фракции в пересчете на абсолютно сухое вещество составляет 14,0000 г) помещают в «Мель-экстрактор», приливают 140 мл воды, нагретой до 70°С и перемешивают в приборе при скорости вращения массы 8000 об/мин в течение 8 мин. Затем охлажденный до комнатной температуры экстракт последовательно фильтруют через мешковину и бумажный фильтр с зеленой полосой, упаривают до получения концентрата плотностью 1,480 г/мл и далее выделяют осадок аналогично выделению его из жидкой фракции барды. Выход осадка составляет 0,5162 г или 3,7% к твердой фракции барды.
Осадки, выделенные из обеих фракций, смешивают. Выход целевого продукта составляет 2,9087 г или 2,9% к барде.
Оценку биологических свойств целевого продукта осуществляли по тестам «острая токсичность», «гепатотоксичность», «антиоксидантная активность».
50
Изучение острой токсичности проведено методом Кербера (Доклинические исследования лекарственных средств: методич. рекомендации. Под ред. А.В.Стефанова. Киев: Авиценна, 2001, 528 с.) путем перорального однократного введения целевого продукта крысам линии Вистар массой 180-220 г в дозах 10, 100, 1000, 5000 мг/кг (количество животных в каждой серии опытов составляло 6). Установлено, что исследуемый целевой продукт имеет LD>5000 мг/кг, что доказывает его практическую нетоксичность.
Изучение гепатотоксичности целевого продукта по продолжительности сна крыс проведено по известной методике (Доклинические исследования лекарственных средств, 2001) путем перорального однократного введения целевого продукта в дозе 500 мг/кг с последующим однократным внутрибрюшинным введением животным пентабарбитала натрия в дозе 30 мг/кг. Контролем служила группа животных, получавшая пентабарбитал натрия в той же дозе. Каждая группа животных насчитывала по 6 крыс. Установлено, что продолжительность сна крыс в опытных группах уменьшилась на 29,5% (вероятность результатов различий сравниваемых групп животных менее 0,05), что свидетельствует об отсутствии гепатотоксичности целевого продукта.
Испытание антиоксидантной активности заявляемого средства проведено с использованием трех различных методов.
Метод аскорбатзависимого пероксидного окисления липидов (ПОЛ) основан на способности к окислению кислородом воздуха в разбавленных водных растворах остатков олеиновой кислоты в составе твина-80 в присутствии кофакторов окисления - ионов железа (II) и аскорбиновой кислоты. Антиоксидантную активность данным методом оценивали по степени уменьшения концентрации комплекса малонового диальдегида (продукта окисления) с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) (метод in vitro) (Определение антиокислительной активности химических соединений. / Благородов С.Г., Шепелев А.П., Дмитриева Н.А. и др. Химико-фармац. журн., 1987, т.XXI, №3, с.292-294). Контролем служили пробы без добавления исследуемых образцов, веществом сравнения - официнальный препарат «Силибор». Результаты опытов, обработанные методом вариационной статистики (n=6, t=3,97) (Государственная фармакопея СССР, 1968), приведены в таблице 2. Полученные статистически достоверные данные свидетельствуют о том, что под влиянием известного и заявляемого средств показатель экстинкции, отражающий максимальное накопление малонового диальдегида, снизился. Однако это снижение проявилось по-разному: если известное средство (прототип) на фоне вещества сравнения снизило показатель на 16,7%, то заявляемое средство - на 41,7%. Иначе говоря, антиоксидантная активность заявляемого средства в 1,4 раза выше активности средства-прототипа.
Методом хемилюминесценции (метод in situ) (Антиоксидантная активность некоторых растительных фенольных соединений. / Сыров В.Н., Хушбактова В.М., Гукасов В.М. и др. Химико-фармац. журн., 1987, т.XXI, №1, с.59-62) подтверждено влияние заявляемого целевого средства на скорость ПОЛ в системе, содержащей яичный желток и ионы железа (II). Пероксидное окисление липосом желтка индуцировали 6%-ным раствором пероксида водорода. Контролем служила смесь без добавления испытуемых веществ, веществом сравнения - свекловичный пектин. Результаты изучения антиоксидантных свойств известного и заявляемого средств, обработанные методом вариационной статистики (n=6, t=3,97) (Государственная фармакопея СССР, 1968), приведены в таблице 3. Полученные данные статистически достоверны и свидетельствуют о существенном ингибирующем влиянии известного и заявляемого средств на кинетику процесса ПОЛ в тестируемой системе. Однако это влияние значительно варьирует: если относительно вещества сравнения известное средство (прототип) снижает скорость реакции ПОЛ на 36,3%, то заявляемое средство - на 56,6%. В сравнении с известным средством (прототип) заявляемое средство в 1,5 раза активнее, что доказывает его выраженные антиоксидантные свойства.
Одним из наиболее важных патогенетических механизмов токсических гепатитов является активация процессов ПОЛ клеточных мембран гепатоцитов. Изучение динамики изменения содержания продуктов ПОЛ в сыворотке крови пораженных тетрахлорметаном животных отражает степень выраженности патологии и характер влияния лекарственных веществ на течение токсического гепатита. Поскольку в предыдущих опытах заявляемое средство проявило выраженный антиоксидантный эффект, необходимо более детальное изучение его влияния на процессы пероксидации у крыс, пораженных тетрахлорметаном.
Состояние процессов ПОЛ оценивали по уровню ТБК - активных продуктов в сыворотке крови крыс с гепатитом, вызванным тетрахлорметаном. Модель токсического гепатита была создана путем введения животным внутрь 2,5 мл 50%-ного раствора тетрахлорметана, один раз в день трехкратно через 1 день (Доклинические исследования лекарственных средств: методич. рекомендации, 2001). В эксперименте были использованы белые беспородные крысы - самцы массой 160-180 г. Животные были разделены на группы, каждая из которых включала 6 особей. Контрольной группой животных служили крысы, отравленные тетрахлорметаном и не получавшие лечения. Другим группам животных на фоне токсического гепатита ежедневно в течение 6 дней в дозе 50 мг/кг вводились вещества: официнальный препарат «Силибор» (вещество сравнения), средство, полученное по способу-прототипу, и заявляемое средство соответственно. Дозы исследуемых веществ выбраны, исходя из предварительных экспериментов на ограниченном числе животных и для сравнения в эквиваленте силибора. Содержание ТБК - активных продуктов анализировали на 7-й день от начала отравления животных тетрахлорметаном. Результаты, полученные при спектрофотометрировании на приборе СФ-25 в единицах оптической плотности, переводили в абсолютные единицы (мкмоль/л) с помощью коэффициента молярной экстинкции комплекса малоновый диальдегид - ТБК (таблица 4).
Результаты экспериментов показали, что в отличие от известного средства-прототипа заявляемое средство сильнее, чем препарат сравнения, препятствовало развитию процессов ПОЛ у животных с модельным токсическим гепатитом. Если под влиянием силибора снижение накопления продуктов ПОЛ составляло 21,9%, то под действием заявляемого средства - 28,4%, в то время как средство-прототип уступало и силибору, и заявляемому средству. Статистически достоверные различия между средством-прототипом и заявляемым средством показывают, что последнее активнее на 10,7%.
Итак, по показателю снижения ТБК - активных продуктов в крови крыс, отравленных тетрахлорметаном, изучаемые вещества распределились следующим образом: заявляемое средство > препарат сравнения > средство-прототип.
Таким образом, с использованием трех методов: аскорбатзависимого ПОЛ (метод in vitro), хемилюминесценции (метод in situ), тетрахлорметанового поражения животных (метод in vivo) доказано существенное ингибирующее влияние заявляемого средства на процессы ПОЛ. Во всех экспериментах заявляемое средство превосходило по антиоксидантной активности вещество сравнения и средство-прототип.
Таким образом, предложенное на основе зерновой послеспиртовой барды лекарственное средство обладает:
1) практической безвредностью как с точки зрения острой токсичности, так и гепатотоксичности;
2) выраженным антиоксидантным действием, превосходящим активность как известного средства, принятого за прототип, так и препаратов сравнения, что подтверждено тремя методами: in vitro, in situ, in vivo. Превышение активности заявляемого средства по сравнению с известным средством (прототип) и препаратом сравнения соответственно составило: 1,4 и 1,7 раз (метод аскорбатзависимого ПОЛ), 1,5 и 2,3 раза (метод хемилюминесценции), 1,12 и 1,1 раз (метод определения содержания ТБК - активных продуктов в сыворотке крови крыс). По-видимому, существенное ингибирующее влияние заявляемого средства объясняется комплексностью его состава: наличием олигогалактуронидов, биогенных элементов, витаминов А, Е, С, жирных ненасыщенных кислот, флавоноидов, ответственных за многосторонний и потенцированный антиоксидантный эффект. Рекомендуемая доза предлагаемого средства при терапии заболеваний, связанных с окислительным стрессом, составляет 50 мг/кг в день;
3) высокой биологической доступностью, обусловленной низкой молярной массой, низкой степенью полимеризации, хорошей растворимостью в воде с образованием истинного раствора, что может обеспечить хорошую всасываемость средства, в то время как известное средство, являясь полимером, возможно, биологически мало доступно;
4) устойчивой и точно дозируемой лекарственной формой (порошок);
5) возможностью применения как в виде самостоятельного лекарственного средства, так и в виде добавок к пищевым продуктам, что может обеспечить профилактику окислительных стрессов;
6) упрощенностью получения, исключающего измельчение сырья, трудоемкого удаления смолистых веществ, перевода нерастворимой формы в растворимую форму;
7) низкой себестоимостью, поскольку получение заявляемого средства предполагается из многотоннажных отходов.
Таблица 1
Результаты анализа химического состава заявляемого антиоксидантного средства
№
Показатели
Методы анализа
Результаты анализа
Заключение
1
2
3
4
5
1. Подлинность:
1.1
Галактурониды
Спектрофотометрия по реакции с карбазолом
Вишневое окрашивание раствора с максимумом поглощения при 530 нм
Наличие галактуронидов
Визуально по реакции с ацетатом свинца (II)
Белый осадок, постепенно окрашивающийся в розовый цвет
1.2
Витамины:
Наличие витаминов А, Е, С
витамин А
Визуально по реакции с хлоридом сурьмы (III)
Синее окрашивание раствора
витамин Е
Визуально по реакции с азотной кислотой
Красно-оранжевое окрашивание раствора
витамин С
Визуально с 2,6-дихлорфенолиндофенолом
Обесцвечивание синей окраски реагента
1.3
Ненасыщенные жирные кислоты
Бумажная хроматография эфирных растворов, растворитель 90% метанол, проявители - нитрат серебра, сульфид аммония
2 пятна с коэффициентами подвижности 0,80 (олеиновая кислота); 0,75 (линолевая кислота)
Наличие ненасыщенных; кислот
1.4
Флавоноиды
Визуально по реакции с хлоридом окисного железа
Темно-синее окрашивание раствора
Наличие флавоноидов (фенольных соединений)
2. Количественный анализ
2.1
Галактурониды:
содержание, мас.%
Гравиметрия по галактуронату кальция
22,7
содержание свободных карбоксильных групп, мас.%
Потенциометрическое кислотно-основное титрование
2,1
молярная масса, г/моль
Вискозиметрия
1590
степень полимеризации
Вискозиметрия
9
2.2
Элементный состав, мас.%:
Спектральный эмиссионный анализ
Обнаруженные элементы являются биогенными
Фосфор
>3,0
Марганец
0,9
Магний
0,22
Цинк
0,02
Железо
0,01
Медь
0,007
Кобальт
0,002
Молибден
0,001
Хром
0,002
Ванадий
0,005
Никель
0,005
2.3
Витамины, мас.%:
витамин А
УФ-спектрофотометрия
0,00115
витамин Е
Цериметрия
0,00342
витамин С
Йодометрия
0,00055
2.4
Ненасыщенные жирные кислоты, мас.%
Йодометрия
1,61
2.5
Флавоноиды, мас.%
УФ-спектрофотометрия
0,32
Таблица 2
Влияние заявляемого средства на скорость реакции ПОЛ (метод аскорбатзависимого ПОЛ)
Объекты
Показатель экс-тинкции
P<sub>1</sub>
P<sub>2</sub>
Р<sub>3</sub>
Изменение интенсивности свечения, %
к веществу сравнения
к известному средству
Контроль
0,25±0,006
Силибор (вещество сравнения)
0,12±0,007
<0,001
100
Известное средство (прототип)
0,10±0,003
<0,001
<0,05
-16,7
100
Заявляемое средство
0,07±0,005
<0,001
<0,01
<0,01
-41,7
-30,0
Примечание: P<sub>1</sub> - достоверность изменений по отношению к контролю;
Р<sub>2</sub> - достоверность изменений по отношению к веществу сравнения;
Р<sub>3</sub> - достоверность изменений по отношению к известному средству (прототип).
Таблица 3
Влияние заявляемого средства на скорость реакции ПОЛ (метод хемилюминесценции)
Объекты
Интенсивность свечения, мВ
P<sub>1</sub>
P<sub>2</sub>
Р<sub>3</sub>
Изменение интенсивности свечения, %
к веществу сравнения
к известному средству
Контроль
0,532±0,085
Свекловичный пектин (вещество сравнения)
0,256±0,019
<0,001
100
Известное средство (прототип)
0,163±0,013
<0,001
<0,01
-36,3
100
Заявляемое средство
0,111±0,018
<0,001
<0,01
<0,05
-56,6
-31,9
Примечание: P<sub>1</sub> - достоверность изменений по отношению к контролю;
Р<sub>2</sub> - достоверность изменений по отношению к веществу сравнения;
Р<sub>3</sub> - достоверность изменений по отношению к известному средству (прототип).
Таблица 4
Влияние заявляемого средства на содержание продуктов ПОЛ в сыворотке крови у крыс, пораженных тетрахлорметаном
Группы животных
Содержание ТБК-активных продуктов, мкмоль/л
P<sub>1</sub>
P<sub>2</sub>
Р<sub>3</sub>
Р<sub>4</sub>
Изменение содержания ТБК - активных продуктов, %
к веществу сравнения
к известному средству
Интактные
3,19±0,11
Пораженные тетрахлорметаном (контроль)
6,31±0,14
<0,001
Пораженные тетрахлорметаном и получавшие силибор (вещество сравнения)
4,93±0,18
<0,001
<0,001
100
Пораженные тетрахлорметаном и получавшие известное средство (прототип)
5,06±0,19
<0,001
<0,01
>0,05
+2,6
100
Пораженные тетрахлорметаном и получавшие заявляемое средство
4,52±0,15
<0,001
<0,001
>0,05
<0,05
-8,3
-10,7
Примечание: P<sub>1</sub> - достоверность различий по отношению к группе интактных животных;
Р<sub>2</sub> - достоверность различий по отношению к контролю;
Р<sub>3</sub> - достоверность различий по отношению к препарату сравнения;
Р<sub>4</sub> - достоверность различий по отношению к известному средству (прототип).