Характеристика взаимодействия специфических антител с Pgp в клетках Т-лимфобластного лейкоза линии Jurkat

Характеристика взаимодействия специфических антител с Pgp в клетках Т-лимфобластного лейкоза линии Jurkat

Т. А. БОГУШ, Е. А. ДУДКО, Е. А. БОГУШ, А. Ю. БАРЫШНИКОВ

Российский онкологический научный центр им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва

Parameters of Specific Antibody Interaction with Pgp in T-Cell Leukemia Jurkat Cells

T. A. BOGUSH, E. A. DUDKO, E. A. BOGUSH, A. YU. BARYSHNIKOV

Russian N. N. Blokhin Memorial Cancer Research Center Russian Academy of Medical Sciences, Moscow

Изучены методические особенности оценки экспрессии Pgp методом проточной цигофлуориметрии. В культуре клеток Т-лим-фобластного лейкоза человека линии Jurkat проанализирован характер взаимодействия моноклональных (клон17Е9) антител Becton Dickinson Pharmingen к внешнему эпитопу Pgp, меченных FITC, в зависимости от концентрации исследуемых клеток (от 400 тыс. до 3 млн клеток в мл) и концентрации специфических антител (5, 10 и 20 мкл раствора коммерческого препарата на 300 мкл клеточной суспензии). Результаты. 1. Оптимальное условие инкубации с антителами — после фиксации клеток 4% раствором формальдегида. 2. Характер увеличения средней интенсивности флуоресценции клеток совокупно по всей суспензии при увеличении концентрации специфических антител не зависит от количества клеток. 3. Абсолютные значения средней интенсивности специфической флуоресценции клеток и количество клеток за областью флуоресценции изотипического контроля зависят от соотношения количество клеток/концентрация моноклональных антител. Заключение. 1. Pgp экспрессирован практически во всех клетках Jurkat. 2. По уровню экспрессии Pgp культура клеток Jurkat достаточно однородна и стабильна в разных пассажах. 3. Клетки Jurkat могут быть использованы в качестве тест-культуры при оценке активности коммерческих антител. 4. При иммунофлуоресцентном анализе экспрессии Pgp в биопсийном материале опухолей человека необходимо использовать не менее трех концентраций специфических антител, не менее трех концентраций клеток в исследуемой суспензии с обязательным параллельным исследованием охарактеризованной клеточной тест-системы (в частности, для изученных моноклональных антител — культуру клеток линии Jurkat). Это позволит не только констатировать факт, но и выраженность экспрессии Pgp, то есть диагностировать тяжесть фенотипа множественной лекарственной резистентности.

Ключевые слова: линия клеток Т-лимфобластного лейкоза Jurkat, антитела к Pgp, множественная лекарственная резистентность.

Special features of Pgp expression evaluation by flow cytometry were investigated. Indexes of interaction of FITC-conjugated Becton Dickinson Pharmingen monoclonal antibodies to external Pgp epitope (clone 17F9) were analyzed depending on the cell concentration (400000 to 3000000 cells/ml) and the specific antibody concentration (5, 10 and 20 ^l of the market product solution per 300 p\ of the cell suspension). Results. 1. Optimal condition of incubation with the antibodies was revealed — after the cell fixation in 4% formaldehyde. 2. Character of the increase of the cell fluorescence average intensity in the suspension totally according to the concentration of the Pgp-specific antibodies did not depend on the number of the cells. 3. Both the absolute value of the average intensity of the cell specific fluorescence as well as cell number out of the isotypic control fluorescence region depended on the ratio of the cell number to monoclonal antibody concentration. Conclusion. 1. It was shown that Pgp was practically expressed in all Jurkat cells. 2. By the Pgp expression level, the Jurkat cell culture was sufficiently homogeneous and stable in various passages. 3. Jurkat cells could be used as test culture in estimation of the market antibody activity. 4. For immunofluorescent assay of the Pgp expression in human tumor biopsy specimens, it is necessary to use not less than three concentrations of the specific antibodies, not less than three concentrations of the cells in the suspension as well as concurrent assay of the cell culture characterized previously. In particular, for investigated Pgp monoclonal antibodies, it is possible to use Jurkat cell culture. It allows revealing not only the fact of the Pgp expression but the level of the expression as well, i. e. to estimate severity of multidrug resistance phenotype.

Key words: T-cell leukemia Jurkat cells, Pgp antibody, multidrug resistance.

Множественная лекарственная резистентность (MultiDrug Resistance — MDR), ассоциированная с выбросом препаратов из клеток, — это один из наиболее распространённых и универсальных меха-

© Коллектив авторов, 2009

Адрес для корреспонденции: 115478 Москва, Каширское шоссе, 24. Российский онкологический научный центр им. Н. Н. Блохина РАМН

низмов устойчивости к воздействию противоопухолевых препаратов. Процесс осуществляется представителями большой группы АТФ-зависимых транспортных белков семейства MDR-транспортеров. Из них идентифицированы P-гликопротеин (P-glycoprotein), некоторые представители группы белков MRP (Multidrug Resistance-Associated

Proteins), BCRP (Breast Cancer Resistance Protein) и LRP (Lung Resistance Protein).

Суть определения «множественная» означает, что устойчивость одновременно проявляется к большому числу (множеству) противоопухолевых препаратов, отличающихся по структуре и механизму действия. Это так называемые MDR-цитостатики, к которым относятся антрациклины, винкаалкалоиды, подофиллотоксины, таксаны, актиномицин Д, митоксантрон, камптотецины, то есть большинство широко применяемых в клинике противоопухолевых лекарств. В последние годы к группе MDR-цитостатиков присоединены и представители таргетных препаратов — ингибиторы тирозинкиназ [1, 2].

Признанными маркерами множественной лекарственной резистентности являются транспортные белки Pgp, MRP и LRP. Экспрессия этих белков или кодирующих их генов коррелирует с чувствительностью опухоли к химиотерапии и прогнозом заболевания. Однако часто не только такие корреляции, но и данные о частоте экспрессии фенотипа множественной лекарственной резистентности в солидных опухолях даже одной локализации крайне противоречивы.

Первая и самая очевидная причина этого кроется в неадекватности методов, используемых для выявления маркеров. Наиболее часто с этой целью используют методы обратной полимеразной цепной реакции и иммуногистохимии. Первый — фиксирует экспрессию в клетке мРНК гена, кодирующего MDR-транспортер, второй — идентифицирует белок.

Однако факт присутствия в клетке мРНК не означает, что с этой матрицы происходит трансляция белка. В частности, для Pgp продемонстрирована регуляция образования белка на уровне стабилизации мРНК и инициации трансляции [3]. В этой связи не выглядит неожиданностью тот факт, что в некоторых работах экспрессию мРНК выявляют в большем числе случаев, чем присутствие в клетке соответствующего транспортного белка [4, 5].

В случае же характеристики фенотипа множественной лекарственной резистентности методами иммуногистохимии по наличию в клетке транспортного белка возникают сложности из-за разной специфичности антител к различным белковым эпитопам, низкой специфичности антител и трудностей подбора адекватного положительного контроля. Наиболее подробно методические аспекты изучены в отношении Pgp, для выявления которого в каждой из исследуемой опухолей рекомендовано использовать не менее 2—3 антител к разным (внутренним и внешним) эпитопам Pgp, полученных от разных производителей [6, 7]. К сожалению, трудоёмкость такого, единственно правильного подхода, ограничивает его распространение в клинической практике и как следствие — продолжается противо-

речивость заключений о частоте экспрессии маркеров множественной лекарственной резистентности в солидных опухолях человека.

Мы считаем, что решить эту проблему можно, принципиально изменив методологию исследования, в частности, перейти на иммунофлуорес-центную оценку опухолевых маркеров методом проточной цитофлуориметрии. Такой подход значительно менее трудоёмкий, но методических неопределенностей также достаточно. Некоторые из них, касающиеся иммунофлуоресцентного выявления Pgp, исследованы в настоящей работе. В частности, на культуре клеток Т-лимфобластного лейкоза 1игка1 проанализирован характер взаимодействия специфических антител с Pgp в зависимости от числа исследуемых клеток и концентрации специфических антител.

Материал и методы

Работа проведена на суспензионной культуре клеток Т-лимфобластного лейкоза человека линии Тигка1 На первом этапе суспензию клеток центрифугировали в течение 10 мин при 1500 об/мин и осадок ресуспендировали в фосфатном буферном растворе pH 7,4. Количество клеток в полученной суспензии подсчитывали в камере Горяева и, в случае необходимости, центрифугировали и ресуспендировали в соответствующем объеме фосфатного буферного раствора до достижения конечной концентрации клеток 3 млн в мл. Для изучения влияния концентрации клеток на эффективность связывания изотипических и специфических к Pgp антител суспензию разводили фосфатным буфером до получения необходимого количества клеток в мл суспензии. Полученную суспензию делили на две части, одну из которых фиксировали 4% раствором формальдегида в фосфатном буферном растворе pH 7,4. Далее с суспензией фиксированных и живых клеток проводили следующие манипуляции.

Непосредственно перед проведением эксперимента готовили необходимые разведения коммерческих препаратов антител, используя раствор фосфатного буфера рН 7,4. В пластиковые пробирки для проточного цитофлуориметра к 100 мкл суспензии исследуемых клеток с определенной концентрацией добавляли соответствующие разведения антител и инкубировали на холоду при 4°С в течение 30 мин. После окончания инкубации для отмывания свободных (не связанных с Pgp) антител в каждую пробирку добавляли по 2 мл фосфатного буферного раствора pH 7,4 и центрифугировали при 1,5 тыс. об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость отбирали вакуумным насосом и процедуру отмывки проводили повторно. Осадок ранее фиксированных клеток ресуспендировали в 300 мкл фосфатного буферного раствора pH 7,4. При исследовании живых клеток осадок ресуспендировали в 300 мкл 1% раствора формальдегида в фосфатном буфере.

В работе использованы мышиные моноклональные антитела фирмы ВО Pharmingen, меченные ИТС, клон 17Б9. Данные антитела характеризуются специфичностью к внешнему эпитопу трансмембранного белка Pgp человека. В исследовании использованы три концентрации антител, выраженные в объемных единицах неразведённого раствора коммерческого препарата: 20, 10 и 5 мкл на 300 мкл клеточной суспензии. За максимальную принята концентрация 20 мкл, так как при дальнейшем увеличении количества антител происходило лишь незначительное изменение интенсивности флуоресценции и процента окрашенных клеток. Далее в тексте эти концентрации условно обозначены 1, 1/2 и 1/4 соответственно.

В качестве изотипического контроля использованы мышиные моноклональные антитела 1^02ь, к, меченные ИТС, в эквивалентных специфическим антителам концентрациях.

А Живые клетки Б Фиксированные клетки

/АТ 1/4

Рис. 1. Зависимость флуоресценции клеток Т-лимфобластного лейкоза человека линии Jurkat от метода окрашивания специфическими антителами к Pgp.

Представлены гистограммы распределения клеток в зависимости от интенсивности флуоресценции после инкубации с антителами к Рдр. По оси абсцисс - интенсивность флуоресценции (усл. ед.). По оси ординат - количество клеток.

Окрашенные гистограммы - изотипический контроль; прозрачные - при окраске специфическими антителами к Рдр.

Л - живые клетки - инкубация с антителами живых клеток; Б - фиксированные клетки - инкубация с антителами клеток, фиксированных 4% раствором формальдегида. АТ 1 и АТ 1/4 - соответствующие концентрации специфических антител.

Измерение флуоресценции проводили на проточном ци-

тофлуориметре FACSCalibur (Beckton Dickinson) при длине волны возбуждения, равной 488 нм, и длине волны испускания — 576 нм, при значении шторки lOO, со скоростью 200 кл/с. Число анализируемых событий — от 5 до l0 тысяч. Анализ гистограмм распределения клеток в соответствии с интенсивностью флуоресценции проводили с помощью программы WinMDI по показателям средней флуоресценции совокупно по всей суспензии клеток, раздельно — в области флуоресценции изотипического контроля (под маркером M2) и специфического связывания антител к Pgp (под маркером Ml), а также по количеству клеток под маркером Ml в области специфического связывания моноклональных антител.

Результаты и обсуждение

Первое, на что необходимо обратить внимание при работе с предлагаемой методикой — окраска клеток Jurkat моноклональными антителами фирмы BD к внешнему эпитопу Pgp должна проводиться после фиксации 4% раствором формальдегида, так как при окраске живых клеток может быть получен ложноотрицательный ответ. Данные, представленные на рис. l, показывают, что при инкубации фиксированных клеток с антителами к Pgp (рис. l А) выявляется высокая, зависимая от концентрации специфических антител, интенсивность флуоресценции клеток, что свидетельствует об экспрессии этого транспортного белка в клетках Т-лимфобласт-ного лейкоза линии Jurkat. При аналогичном исследовании живых клеток при обеих использованных концентрациях специфических к Pgp антител (максимальной и l/4 от максимальной) отмечено лишь незначительное превышение флуоресценции клеток относительно изотипического контроля (рис. l Б).

Еще одна особенность, выявленная при изучении экспрессии Pgp в клетках Т-лим-фобластного лейкоза линии 1игка1: обнаружен постоянно воспроизводимый феномен. Независимо от количества клеток в диапазоне от 400 тыс. до 3 млн. в мл значение средней интенсивности флуоресценции клеток при увеличении концентрации специфических антител в 2 раза увеличивается одинаково — в

1,5—1,7 раз (рис. 2 А—Г). В то же время абсолютные значения средней интенсивности флуоресценции клеток при обеих концентрациях антител приблизительно в 3 раза ниже при большем количестве клеток в суспензии в сравнении с меньшим. Так, в одинаковых условиях, при одинаковой настройке прибора средняя интенсивность флуоресценции клеток при концентрации антител, равной 1/4 от максимальной, составила 82—73 и 278—243 усл. ед. при количестве клеток в суспензии 3 млн и 400 тыс. клеток в мл соответственно (см. рис. 2 А, В). При концентрации антител, равной 1/2 от максимальной, средняя интенсивность флуоресценции при количестве клеток в суспензии 3 млн и 400 тыс в мл составила 129—117 и 485—360 усл. ед. соответственно (см. рис. 2, Б, Г).

Поскольку интенсивность окраски клеток специфическими антителами к Pgp используется в работах многих авторов в качестве показателя выраженности экспрессии фенотипа множественной лекарственной резистентности опухолевых клеток, в дальнейших экспериментах исследованы возможные причины этой «парадоксальной» зависимости и условия для получения адекватной информации.

Эффективность взаимодействия специфических антител с опухолевым маркером исследована при трех концентрациях антител — максимальной, 1/2 и 1/4 от максимальной, и при концентрациях клеток в суспензии — 400, 800 тыс, 1 и 3 млн в мл. Оценены характер изменения интенсивности флуоресценции клеток совокупно по всей суспензии, а также количество клеток и интенсивность специфической флуоресценции клеток за областью флуоресценции изотипического контроля. Примеры полученных результатов для трех

3 млн клеток в мл

82->129 73^117

400 тыс. клеток в мл

278->485 243^360

Рис. 2. Интенсивность флуоресценции клеток в зависимости от количества клеток и концентрации специфических антител к Pgp.

Флуоресценция клеток, окрашенных изотипическими антителами (усл.ед): Л- 23,1; Б — 24,4; В- 21,8; Г- 26,0.

Представлены гистограммы распределения клеток в зависимости от интенсивности флуоресценции после инкубации с антителами к Рдр. По оси абсцисс — интенсивность флуоресценции (усл. ед); по оси ординат — количество клеток.

Окрашенные гистограммы — концентрация специфических антител, равная 1/4 от максимально использованной; прозрачные — 1/2 от максимально использованной концентрации специфических антител к Рдр.

Цифры в нижнем правом углу на гистограммах — изменение абсолютных значений флуоресценции клеток при увеличении концентрации специфических антител от 1/4 до 1/2 от максимально использованной.

Ли Б — концентрация клеток 3 млн в мл суспензии.

Ви Г— концентрация клеток 400 тыс. в мл суспензии.

| — увеличение средней интенсивности флуоресценции клеток при увеличении концентрации специфических антител от 1/4 до 1/2 от максимально использованной.

концентраций клеток представлены на рис. З.

Видно, что характер изменения интенсивности флуоресценции клеток совокупно по всей суспензии в исследованном диапазоне концентраций антител к Pgp не зависит от количества клеток (рис. З А).

Во всех случаях при увеличении в 2 раза концентрации специфических антител (начиная с l/4 от максимальной) интенсивность окрашивания клеток увеличивается в

l,5—l,7 раза.

Характер изменения специфической флуоресценции клеток (за областью флуоресценции изотипического контроля) при использовании разных концентраций специфических антител к Pgp также не зависел от количества клеток в суспензии (рис. З Б). Во всех случаях при увеличении концентрации специфических антител в 2 раза, начиная с l/4 от максимальной, интенсивность окрашивания клеток увеличивается в l,4—l,8 раза.

Что касается количества клеток за областью флуоресценции изотипического контроля, то здесь видна строгая зависимость числа клеток, окрашенных специфическими антителами в разных концентрациях, от количества клеток в суспензии (рис. З В). При концентрации l млн и 500 тыс. клеток в мл специфическая флуоресценция (за областью изотипического контроля) более 90% клеток отмечается уже при использовании антител к Pgp в концентрации l/4 от рекомендованной.

В то же время при концентрации клеток З млн в мл этот показатель (более 90% клеток в области специфической флуоресценции) достигается только при рекомендованной концентрации антител.

Одно из наиболее очевидных обьяснений этого факта — при высокой концентрации клеток Jurkat (в данном случае — З млн клеток в мл суспензии) концентрация антител, равная l/2 от максимальной, является насыщающей. Это справедливо, но дополнительного пояснения требуют два экспериментальных факта. Во-первых, упомянутая выше меньшая интенсивность флуоресценции клеток при равных концентрациях специфических антител в случае высокой концентрации клеток в суспензии. Во-вторых, отмеченное в данном исследо-

вании повышение флуоресценции клеток в области изотипического контроля после взаимодействия антител с Pgp и выделения области специфической флуоресценции клеток. Иллюстрируют эти факты примеры реальных гистограмм распределения клеток в зависимости от интенсивности флуоресценции после воздействия специфических к Pgp антител (рис. 4).

Видно значительное увеличение интенсивности флуоресценции клеток при увеличении концентрации специфических антител при обеих исследо-

Рис. 3. Параметры взаимодействия специфических антител к Pgp с клетками Т-лимфобластного лейкоза линии Jurkat.

На рис. А, Би В по оси абсцисс - концентрация клеток в мл суспензии. На рис. А по оси ординат - отношение интенсивности флуоресценции клеток совокупно по всей суспензии при данной концентрации специфических антител к аналогичному показателю при концентрации специфических антител 1/4 от максимально использованной.

На рис. Б по оси ординат - отношение интенсивности флуоресценции клеток в области изотипического контроля при данной концентрации специфических антител к аналогичному показателю при концентрации специфических антител 1/4 от максимально использованной, принятой за единицу.

На рис. В - количество клеток в области специфического окрашивания за областью изотипического контроля к общему количеству исследованных клеток (в %).

ванных концентрациях клеток. Увеличение концентрации специфических антител от 1/4 до максимальной при количестве клеток 3 млн в мл сопровождается увеличением интенсивности флуоресценции клеток совокупно по всей суспензии от 154 до 274 усл. ед., то есть в 1, 8 раза, а при количестве клеток 800 тыс. в мл — от 297 до 703 усл. ед., то есть в 2, 4 раза. При этом количестве клеток за областью флуоресценции изотипического контроля регистрируется более 90% клеток уже при минимальной концентрации антител, тогда как при количестве клеток 3 млн в мл практически все клетки окрашиваются только при рекомендованной концентрации антител к Pgp.

В то же время интенсивность флуоресценции изотипического контроля не зависела от количества клеток и концентрации изотипических антител в исследованном диапазоне и составила около 20 усл. ед. при концентрации клеток 3 млн и 800 тыс. клеток. Важно, что во всех экспериментах независимо от количества клеток, в том числе и при 3 млн клеток в мл, при увеличении концентрации антител к Pgp интенсивность флуоресценции клеток в области неспецифической окраски увеличивалась. По нашему мнению, это является прямым указанием на то, что Pgp экспрессирован практически во всех клетках Jurkat, то есть по показателю экспрессии этого маркера множественной лекарственной резистентности культура однородна. Форма (ширина пика по оси абсцисс) гистограммы распределения клеток по интенсивности флуоресценции при окраске специфическими антителами и воспроизводимость результатов в многократно повторенных экспериментах, указывает также и на высокую однородность и стабильность культуры по уровню экспрессии Pgp. Это позволяет рекомендовать клетки Jurkat в качестве тест-культуры при оценке активности коммерческих препаратов антител к этому опухолевому маркеру. В том числе и при сравнительной оценке образцов препаратов антител, выпускаемых разными производителями.

Оценивая полученные результаты с точки зрения рекомендаций для проведения клинической оценки экспрессии Pgp в солидных опухолях человека, необходимо подчеркнуть следующее. Представленные данные показывают чрезвычайную важ-

Рис. 4. Флуоресценции клеток Т-лимфобластного лейкоза человека линии Jurkat в областях окрашивания специфическими к Pgp и изотипическими антителам.

Флуоресценция клеток, окрашенных изотипическими антителами (усл. ед): А — 18,3; Б— 22,5. Представлены гистограммы распределения клеток в зависимости от интенсивности флуоресценции после инкубации с антителами к Pgp. По оси абсцисс — интенсивность флуоресценции (усл. ед.); по оси ординат — количество клеток.

Окрашенные гистограммы — изотипический контроль; прозрачные — при окраске специфическими антителами к Pgp.

А — концентрация клеток 3 млн в мл суспензии. Б — концентрация клеток 800 тыс.в мл

суспензии.

Цифры на гистограммах — абсолютные значения флуоресценции клеток в областях изо-типической (под маркером М2) и специфической (под маркером М1) флуоресценции клеток (в скобках — количество клеток под маркером М1 и М2 в % к общему количеству клеток в суспензии).

В правом верхнем углу на рис. указаны концентрации специфических антител: АТ1/4, АТ1/2 — 1/4 и 1/2 от максимально использованной, АТ1 — максимальная.

стентности. Такая характеристика опухоли

ность точной постановки исследования, так как при произвольном выборе соотношения концентрации клеток и специфических антител высока вероятность неправильной трактовки результатов.

Рассмотрим это на примере исследованной культуры клеток 1игка1;, которая по совокупности проведенных исследований классифицирована как культура с высоким уровнем экспрессии Pgp практически в 100% клеток. Однако по результатам анализа суспензии клеток с 3 млн клеток в мл и с рекомендованной концентрацией специфических антител заключение могло быть противоположным: низкий уровень экспрессии Pgp в половине клеток. Полученные результаты показывают, что избежать этой ошибки можно при постановке исследования клинического материала опухолей человека с использованием нескольких концентраций специфических антител (не менее трех) и нескольких концентраций клеток в исследуемой суспензии (не менее трех).

Более того, при соблюдении такого алгоритма проведения анализа клинического материала солидных опухолей человека обязательно параллельное исследованием охарактеризованной тест-системы (в частности, клеток линии 1игка1). Это позволит не только констатировать факт экспрессии фенотипа множественной лекарственной резистентности. При такой постановке исследования возможно оценить и выраженность экспрессии в терминах большего или меньшего количества Pgp, а также числа клеток с экспрессией Pgp, то есть диагностировать тяжесть фенотипа множественной лекарственной рези-

прогностически (для предсказания чувствительности к химиотерапии) без сомнения является оптимальной и практически исключает ошибочное заключение о фенотипе множественной лекарственной резистентности. Последнее не только бессмысленно, но и вредно, так как искажает и без того сложную картину экспрессии и коэкспрессии молекулярных маркеров в опухоли. И это относится не только к Pgp, но и ко всем маркерам множественной лекарственной резистентности, неадекватная характеристика которых, к сожалению, еще

встречается во многих исследованиях и даже — в клинической практике.

Заключение

Роль MDR-транспортеров, в формировании фенотипа множественной лекарственной резистентности к большинству используемых в клинике противоопухолевых препаратов является строго доказанным научным фактом. Оценка молекулярных маркеров этого вида резистентности уже в настоящее время может быть, безусловно, полезной как один из важных ориентиров для рационального выбора схем и режимов противоопухолевой химиотерапии. Однако трудоёмкость адекватного исследования опухоли, а потому пренебрежение рядом необходимых условий и упрощение анализа, приводит к бесконтрольному искажению его результатов. Это, в частности, относится к иммуногистохимичес-кому исследованию фенотипа множественной лекарственной резистентности солидных опухолей с использованием лишь одного антитела к Pgp без параллельного контроля активности антител в охарактеризованных клеточных тест-системах. Вред таких рутинных клинических исследований очевиден.

Поэтому на сегодняшний день генеральной линией в развитии клинического использования данных об экспрессии молекулярных маркеров опухолей, безусловно, является повышение информативности методов их оценки, с одной стороны, и контроль за безусловным выполнением всех условий анализа, с другой.

В настоящем исследовании на примере клеток Т-лимфобластного лейкоза человека линии

ЛИТЕРАТУРА

1. Widmer N. Functional consequence of MDR1 expression on imatinib intracellular concentrations. Blood 2003; 102: 3: 1142—1144.

2. Nagashima S. BCRP/ABCG2 levels account for the resistance to topoi-somerase inhibitors and reversal effects by gefitinib in non-small-cell lung cancer. Cancer Chemother Pharmacol 2006; 58: 5: 594—600.

3. Yague E., Armesilla A., Harrison G. et al. P-Glycoprotein (MDR1) expression in leukemic cells is regulated at two distinct steps, mRNA stabilization and translational initiation. J Biol Chem 2003; 278: 12: 10344—10352.

4. Zhao Y, Yu L, Lou F. et al. The clinical significance of lung resistance-related protein gene (lrp), multidrug resistance-associated protein gene

1игка1 показана возможность повышения информативности иммунофлуоресцентного анализа с использованием метода проточной цито-флуориметрии. Линия характеризуется высокой экспрессией Pgp практически в 100% клеток и стабильна по исследуемому параметру. Окраска клеток моноклональными антителами к Pgp фирмы ВБ Pharmingen (клон17Р9), меченными ИТС, с использованием трех концентраций специфических антител (в объёмных единицах неразведённого раствора коммерческого препарата — 5, 10 и 20 мкл на 300 мкл клеточной суспензии) и трех концентраций клеток в исследуемой суспензии (от 400 тыс. до 3 млн в мл) позволяет не только констатировать факт наличия в клетке Pgp. Интенсивность флуоресценции и число флуоресцирующих клеток за областью изотипического контроля после взаимодействия с антителами к Pgp, позволяют диагностировать и тяжесть фенотипа множественной лекарственной резистентности, что наиболее важно для клиницистов.

Клетки Т-лимфобластного лейкоза человека линии 1игка1 рекомендовано использовать в качестве одной из тест-систем при оценке методом проточной цитофлуориметрии экспрессии в клетках солидных опухолей человека маркера множественной лекарственной резистентности Pgp с использованием моноклональных антител фирмы ВБ Pharmingen, меченных ИТС.

Исследования поддержаны Российским Фондом Фундаментальных исследований (грант №07-04-00082-а и №08-04-13647-офи_ц).

(mrp) and mdr-1/p170 expression in acute leukemia. Zhonghua Nei Ke Za Zhi 1999; 38: 11: 760-763.

5. Schwarzenbach H. A diagnostic tool for monitoring multidrug resistance expression in human tumor tissues. Anal Biochem 2002; 308: 1: 26—33.

6. Beck W., Grogan T., Willman C. et al. Methods to detect P-glycopro-tein-associated multidrug resistance in patients' tumors: consensus recommendations. Cancer Res 1996; 56: 13: 3010—3020.

7. Zhang H., Zhang W., Li F. Prognostic significance of MDR-1 P-glyco-protein expression in breast cancer. Journal of Nanjing Medical University 2008; 22: 3: 148—152.