СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ГЛЮКОЗЫ В КЛЕТКЕ КРОВИ
METHOD FOR BLOOD CELL ANALYSIS FOR GLUCOSE CONTENT

Изобретение относится к области биомедицинских технологий, в частности к лабораторной диагностике и определению содержания глюкозы в плазме цельной крови и в форменных образований крови на основе анализа изменения спектров комбинационного рассеяния глюкозы в отдельной живой клетке крови и в плазме с помощью конфокального лазерного томографа. Такой метод позволяет оценивать содержание глюкозы не только в крови, но и внутри отдельного эритроцита или лейкоцита, что особенно важно для диагностики и мониторинга сахарного диабета и степени влияния инсулина на проникновение глюкозы через плазматическую мембрану клетки.
0
1
0
0
1
0
1
0
1
Известен способ определения концентрации глюкозы в крови человека на основе измерения полного электрического сопротивления кожи или одну из составляющих полного электрического сопротивления кожи (см. патент РФ №2230485, МПК А61В 5/053). Способ обеспечивает повышение точности определения концентрации глюкозы в крови человека. Измеряют полное электрическое сопротивление кожи или одну из составляющих полного электрического сопротивления кожи, а концентрацию глюкозы в крови определяют из выражения:  где G(t) - определяемое значение концентрации глюкозы в крови в момент времени t; G - значение концентрации глюкозы в крови в начальный момент времени процесса измерения; q - величина, характеризующая способность организма человека к поддержанию гомеостаза по отношению к концентрации глюкозы в крови; G=G-q; a - коэффициент, характеризующий связь между значениями полного электрического сопротивления или значениями составляющих полного электрического сопротивления кожи и концентрацией глюкозы в крови конкретного человека; a - коэффициент, учитывающий изменчивость внешних факторов и особенностей организма конкретного человека; N(x) - нормированные измеренные значения полного электрического сопротивления кожи или составляющих полного электрического сопротивления кожи, при этом упомянутые величины q, a и a определяют на подготовительном этапе, при котором в течение времени Т. одновременно измеряют полное электрическое сопротивление кожи или составляющие полного электрического сопротивления кожи и концентрацию глюкозы инвазивным методом, а упомянутые величины q, a и a определяют путем аппроксимации зависимости концентрации глюкозы в крови, полученной инвазивным методом на упомянутую зависимость G{t), при этом время Т выбирают достаточным для того, чтобы можно было зафиксировать изменения концентрации глюкозы в крови, связанные с естественным суточным циклом ее изменения, или вызванные искусственно, например питанием, физической нагрузкой, инъекцией препаратов глюкозы или инсулина.
0
1
Данный способ потенциально обладает малой чувствительностью к определению концентрации глюкозы, так как косвенным, использует расчетную формулу, в которую входят трудно определяемые параметры q, а и a, которые учитывают связь концентрации глюкозы с электрическими параметрами кожи, которые сильно зависят от ионного состава жидкости и потоотделения, имеющие очень большой разброс в зондируемых индивидуумах. Кроме того, способ не позволяет измерить содержание глюкозы в клетках крови.
Известен способ определения концентрации глюкозы в крови человека и непрерывного мониторинга состояния концентрации глюкозы в крови человека (см. патент РФ №2342071, МПК А61В 5/053). Способ заключается в том, что измеряют электрические передаточные функции посредством двух пар четырехэлектродных датчиков, закрепленных на поверхности тела человека, причем первую пару закрепляют вдоль магистральных кровеносных сосудов, преимущественно конечностей, а вторую пару электродов закрепляют в том же месте ортогонально первой, непрерывно измеряют электрические передаточные функции не только поверхности кожи, но и подкожных тканей, затем обрабатывают измерения четырехэлектродных датчиков по предварительно откалиброванной математической модели, причем модель калибруется путем сравнения результатов предлагаемого способа определения глюкозы в крови человека и любого другого известного метода определения глюкозы в крови человека, после чего вычисляют концентрацию глюкозы в крови человека по полученной автором зависимости.
Способ должен обладать малой чувствительностью к определению концентрации глюкозы, так как глюкоза является электрически нейтральной. Ее концентрация в крови на три порядка меньше, чем электролитов в крови и в биотканях. Кроме того, способ не позволяет измерить содержание глюкозы в клетках крови.
Известен способ определения содержания глюкозы в цельной крови (см. патент РФ №2050545, МПК G01N 33/48). Сущность изобретения: проба цельной крови вводится в контакт с реагентом, который посредством химической реакции с глюкозой в пробе приводит к детектируемому изменению концентрации красителя, величина которого определяется как мера содержания глюкозы в пробе. Проба первоначально вводится неразбавленной в микрокювету, имеющую по крайней мере одну полость для приема пробы. Полость внутри предварительно обрабатывается реагентом в сухой форме и химическая реакция протекает в этой полости. Активные компоненты реагента содержат агент гемолиза для воздействия на глюкозу в клетках крови пробы, для возможности определения общего содержания глюкозы, а также агенты, принимающие участие в химической реакции и обеспечивающие изменение концентрации красителя в диапазоне длин волн вне диапазона абсорбции гемоглобина крови. Измерение абсорбции проводится в названном диапазоне длин волн непосредственно на пробе в кювете.
Данный метод обладает малой чувствительностью, так как характерный ИК спектр поглощения глюкозы, где не сказывается поглощение гемоглобина, соответствует области 1,5 микрон и перекрывается с резонансным пиком поглощения воды в области 1.45 микрон, при этом концентрация воды на три порядка больше. Кроме того, для измерения необходимо вызывать гемолиз клеток крови, чтобы измерить поглощения, и соответственно способ не позволяет измерить содержание глюкозы в клетках крови.
Известен способ определения концентрации глюкозы в крови человека (см. патент США №7,353,055, МПК А61В 5/00), основанный на интерферометрическом измерении сдвига фаз когерентных пучков при зондировании глюкозы в крови.
Однако данный способ обладает большой погрешностью, связанной малой концентрацией глюкозы в крови и соответственно небольшим изменением показателя преломления соответствующего сдвига фаз по сравнению с вкладом плазмы крови. Кроме того, эффекты динамического рассеяния на форменных образованиях крови будут приводить к значительным флуктуациям показателя преломления и зашумлению интерференционного сигнала.
Известен способ определения уровня глюкозы в крови на основе тест-полоски с реагентом (см. заявку на изобретение РФ №97105194, МПК G01N 33/66, G01N 33/52). Тест-полоска с реагентом для использования в устройстве для определения концентрации глюкозы в образце цельной крови, содержащем оптические средства детектирования интенсивности света на длинах волн около 635 нм и около 700 нм, отраженного от, по крайней мере, части матрицы, расположенной вблизи одного из краев полоски, отличающаяся тем, что эта матрица содержит (а) поверхность приема образца для приема образца цельной крови и прохождения его части в направлении поверхности тестирования, противоположной ей, поверхность тестирования, имеющую такой коэффициент отражения на длине волны примерно 700 нм, что, когда поверхность тестирования становится влажной, происходит изменение, которое по существу эквивалентно такому изменению, вызванному поглощением гемоглобина в крови, (b) структуру, которая селективно замедляет прохождение эритроцитов через матрицу и минимизирует разрушение клеток в матрице, отчего любая часть образца, которая является видимой с поверхности тестирования, не поглощает свет в какой-нибудь заметной степени на длине волны около 700 нм, и (с) реагент для индикации концентрации глюкозы путем создания на поверхности тестирования изменения коэффициента отражения на длине волны около 635 нм.
Однако данный метод не позволяет оценить содержание глюкозы в клетках крови.
Наиболее близким является неинвазивный способ определения концентрации глюкозы в крови человека (см. патент РФ №2295915, МПК А61В 5/1455). Способ осуществляют путем облучения лазерным лучом зоны максимального скопления кровеносных сосудов на слизистой оболочке, приема и аппаратурного преобразования, посредством выделения ориентации вектора поляризации и интенсивности отраженного излучения и расчета по ним концентрации вещества в крови. Для облучения используют лазерный луч с «нулевой поляризацией» и длиной волны в диапазоне 0,5 мкм - 2,1 мкм. Предварительно настраивают анализатор-поляроид на точки локального поглощения лазерного излучения в слизистой ткани определяемых веществ, фиксируют изменения ориентации вектора поляризации отраженного излучения в точках локального поглощения лазерного излучения по углу его поворота и судят о концентрации вещества по величине угла поворота вектора поляризации. Использование изобретения позволяет повысить точность измерения и расширить число определяемых веществ.
Однако данный способ обладает малой точностью, так как кровеносные сосуды, например, в дерме находятся на глубине порядка миллиметра от рогового слоя кожи. При распространении линейно-поляризованного света в поверхностных слоях кожи, обладающих анизотропией, сильно изменяющейся от пространственных областей зондирования, должно приводить к неоднозначной интерпретации результатов измерения при наличии или отсутствии крови, не говоря уже о влиянии глюкозы в крови, концентрация которой на три порядка меньше, например, гемоглобина.
Целью изобретения является возможность определения содержания глюкозы не только в плазме крови, но и неинвазивное измерение глюкозы внутри отдельно выбранной живой любой клетки крови, включая эритроциты, лимфоциты, моноциты, тромбоциты и другие клеточные форменные образования крови. Такой способ должен позволить определить эффективность проникновения глюкозы через плазматическую мембрану живой клетки под действием, например, гормона инсулина или различных лекарств и исследовать динамику изменения глюкозы в нормальных и патологических клетках крови.
-1
-1
Способ определения содержания глюкозы в плазме и клетках крови, включающий контактный забор пробы артериальной цельной крови пациента, неинвазивное зондирование пробы крови в кювете оптическим излучением видимого или ближнего ИК диапазона, измерение интенсивности отраженного назад оптического излучения, согласно решению в качестве оптического зондирующего излучения используют лазерный пучок, который пространственно фокусируют в отдельную выбранную клетку крови (эритроцит, лимфоцит, тромбоцит) или плазму крови, при этом длина волны излучения лазера выбирается в диапазоне 570-1100 нм, не попадающем в спектральную полосу поглощения гемоглобина и воды, измеряется спектр комбинационного рассеяния в спектральном диапазоне со стоксовым частотным сдвигом от 100 см до 3200 см из внутреннего фиксированного объема клеток крови или плазмы крови, определяемого конфокальным объемом, задаваемым диаметром сопряженных микродиафрагм, предварительно измеряют спектр комбинационного рассеяния глюкозы, гемоглобина и воды при концентрациях, типичных содержанию в плазме крови и внутри эритроцита, выбирают стоксовые спектральные компоненты в спектре комбинационного рассеяния, соответствующие характерным резонансным колебаниям молекул глюкозы, приходящиеся на минимум стоксовых спектральных компонент комбинационного рассеяния гемоглобина и воды, измеряют амплитуду стоксовых спектральных компонент глюкозы и по сравнению с амплитудами стоксовых спектральных компонент калибровочной кривой комбинационного рассеяния глюкозы, полученной при известной концентрации раствора глюкозы, определяют содержание глюкозы в плазме крови или отдельных клетках крови.
Для анализа используют микропробу цельной крови с объемом не более 10 мкл.
Основное преимущество предлагаемого неинвазивного способа определения глюкозы внутри живого эритроцита и лимфоцита или тромбоцита цельной крови это возможность исследования динамики проникновения глюкозы через плазматическую мембрану клетку под действием инсулина или других гормонов или лекарств.
Изобретение поясняется чертежами.
На фиг.1 представлена блок-схема устройства для реализации предлагаемого способа для определения содержания глюкозы в эритроцитах цельной крови.
Позициями на чертежах обозначены:
1 - клетка (эритроцит) в плазме цельной крови;
2 - покровное стекло на X-Y препаратоводителе;
3 - микрообъектив с фокусным расстоянием, перестраиваемым по глубине образца;
4 - делительное зеркало;
5, 9 - сопряженные микродиафрагмы;
6 - узкополосный резонансный оптический фильтр, поглощающий только лазерное излучение;
7, 10 - фокусирующие линзы;
8 - отражательная дифракционная решетка;
11 - ПЗС матрица или линейка фотодетекторов;
12 - персональный компьютер;
13 - лазер с определенной длиной волны, вызывающий комбинационное рассеяние в плазме или клетках крови.
3
-1
На фиг.2 представлен спектр комбинационного рассеяния (КР) глюкозы в физрастворе с концентрацией 1 мкг/мл, типичной для содержания глюкозы в плазме крови человека, измеренный с помощью установки, указанной на фиг.1 при использовании He-Ne лазера с длиной волны 633 нм. Масштаб по оси абсцисс (частотный сдвиг)·10 см, по оси ординат относительная интенсивность КР.
3
-1
На фиг.3 представлен спектр комбинационного рассеяния гемоглобина с концентрацией 130 мкг/мл. типичной для содержания гемоглибина в эритроцитах крови, измеренный с помощью установки, указанной на фиг.1, при использовании He-Ne лазера с длиной волны 633 нм. Масштаб по оси абсцисс (частотный сдвиг) 10 см, по оси ординат относительная интенсивность КР.
-1
На фиг.4 представлен спектр локального комбинационного рассеяния отдельного эритроцита из микрокапли (10 мкл) цельной капиллярной крови человека, измеренный с помощью установки, указанной на фиг.1 при использовании He-Ne лазера с длиной волны 633 нм при режиме неинвазивного зондирования (зондирующая лазерная мощность W=2 мВт, время измерения КР спектра τ=0.1 сек); Масштаб по оси абсцисс (частотный сдвиг)·103 см, по оси ординат относительная интенсивность КР.
Способ осуществляется следующим образом.
-1
В качестве возбуждающего комбинационное рассеяние в плазме цельной крови 1 и форменных образованиях (эритроцитах, лейкоцитах) используется лазерное излучение 13 с длиной волны из диапазона 570-1100 нм, не попадающее в полосу поглощения хромофоров клетки (гемоглобина) и воды. Лазерное излучение, прошедшее фокусирующую линзу 10, микродиафрагму 9 с помощью перестраиваемого микрообъектива 3 фокусируется на определенную глубину выбранного эритроцита или лейкоцита либо в плазму крови в капле цельной крови на покровном стекле, предварительно обработанном антикоагулянтом (трилон В, гепарин), а в поперечном сечении настройка осуществляется с помощью на X-Y препаратоводителя 2. Использование двух сопряженных микродиафрагм 5, 9 и делительного зеркала 4 позволяет измерить обратно-отраженное оптическое излучение из дифракционного микрообъема, меньшего объема клеток крови и определяемого диаметром сопряженных диафрагмам. С помощью узкополосного резонансного оптического фильтра 6 из отраженного назад оптического излучения селективно поглощается узкополосным резонансным фильтром только лазерное излучение, а рассеянное молекулами и сдвинутое по частоте относительно лазерной на величину, определяемую характерными частотами колебаний молекул и прошедшее узкополосный резонансный оптический фильтр 6, в виде оптического параллельного пучка, сформированного фокусирующей линзой 10, попадает на отражательную дифракционную решетку 8, с помощью которой происходит однозначное преобразование частотного спектра в угловой, а измерение спектра комбинационного рассеяния осуществляется с помощью ПЗС матрицы или линейки фотодетекторов 11 со встроенной АЦП и персонального компьютера 12. С помощью предлагаемого метода предварительно производится калибровка, включающая измерение спектра комбинационного рассеяния глюкозы в физрастворе с концентрацией, типичной для плазмы крови (1 мг/мл) (Фиг.2), измерение гемоглобина с типичной концентрацией его содержания в эритроцитах (130 мг/мл) (Фиг.3) и аналогично спектр КР для физраствора. В спектрах комбинационного рассеяния находят спектральные компоненты, соответствующие максимуму спектральных компонент глюкозы в диапазоне частот, соответствующих минимуму спектральных компонент от гемоглобина и воды (например, в спектральной области 1000-1200 см) и по амплитуде спектральных компонент КР глюкозы в плазме крови или клетках крови определяют ее концентрацию, сравнивая амплитуду соответствующих спектральных компонентов с КР глюкозы в физрастворе с известной концентрацией.
3
3
В заключении следует отметить потенциальные возможности апробированного метода. Известно, что средний объем эритроцита человека составляет 80-95 мкм с содержанием гемоглобина 25-34 пг, а анализируемый конфокальный объем при зондировании, например, на длине волны видимого диапазона составляет 0.5 мкм, поэтому становится возможным достижение степени внутриклеточной локальности более чем на два порядка.
3
-1
-1
На фиг.5 представлен спектр локального комбинационного рассеяния отдельного лейкоцита из микрокапли (10 мкл) цельной капиллярной крови человека, измеренный с помощью установки, указанной на фиг.1 при использовании He-Ne лазера с длиной волны 633 нм при режиме неинвазивного зондирования (зондирующая лазерная мощность W=2 мВт, время измерения КР спектра τ=0.1 сек); масштаб по оси абсцисс (частотный сдвиг) 10 см, по оси ординат относительная интенсивность КР. В отличие от эритроцитов КР спектр отдельного лейкоцита не содержит характерных резонансных пиков, обусловленных молекулами гемоглобина, но наблюдаются спектральные компоненты молекул воды. При этом в спектральной области 500-1500 см наблюдается минимальная амплитуда спектральных компонент от лейкоцита. Поэтому в этой области спектра можно обнаружить резонансные пики, связанные с молекулами глюкозы. В отличие от известных способов определения глюкозы в крови заявляемый способ позволяет исследовать содержание глюкозы в отдельной клетке крови и, потенциально, оценить динамику диффузии глюкозы через мембрану живой клетки под действием гормонов (инсулина или глюкагона), что крайне важно для разработки эффективных методов лечения диабета.