ОБРАБОТКА ТЕКУЧИХ СРЕД, СОДЕРЖАЩИХ МЕШАЮЩИЕ ЧАСТИЦЫ
PROCESSING OF FLUIDS CONTAINING INTERFERING PARTICLES

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к способу и обрабатывающему устройству для обработки текучей среды, содержащей частицы, которые препятствуют обработке.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В WO 2008/044214 Al раскрыт биодатчик для обнаружения целевых компонентов в образце текучей среды. Магнитные частицы обеспечивают в виде сухих реагентов в слое, поверх поверхности с антителами захвата. При добавлении образца текучей среды магнитные частицы быстро растворяются и распределяются внутри всей текучей среды так, что центры связывания на магнитных частицах могут связываться с целевыми компонентами образца. Магнитные частицы затем притягиваются под влиянием магнитных сил к антителам захвата, где происходит дополнительное связывание. Целевые компоненты, связанные с поверхностью, затем обнаруживаются, например, по нарушенному полному внутреннему отражению (frustrated total internal reflection, FTIR).
При обработке образца текучей среды, такого как цельная кровь, целевые компоненты часто представляют собой вещества кровяной плазмы, тогда как кровяные клетки представляют собой частицы, которые искажают процесс обнаружения. Следовательно, образцы, такие как кровь, обычно приходится подвергать фильтрованию перед обнаружением, для удаления вызывающих нарушение частиц.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Задачей настоящего изобретения является обеспечение средства, которое делает возможной простую и высокоэффективную обработку текучих сред, содержащих частицы, которые могут оказать влияние на намеченную обработку.
Эта задача достигаются при помощи способа по п. 1, обрабатывающего устройства по п. 3 и применения по п. 15. Предпочтительные варианты осуществления раскрыты в зависимых пунктах формулы изобретения.
Согласно первому аспекту изобретение относится к способу для обработки текучей среды, содержащей частицы. Поскольку предполагается, что упомянутые частицы некоторым образом вмешиваются в намеченную обработку текучей среды, они для справки будут в дальнейшем называться «мешающими частицами». Тогда как упомянутое вмешательство обычно бывает негативным (затрудняющим обработку), настоящее изобретение также содержит положительное вмешательство, при котором мешающие частицы могут поддерживать намеченную обработку или также могут быть объектом упомянутой обработки. Мешающие частицы могут, как правило, содержать одиночные атомы или молекулы. Однако они обычно будут представлять собой большие агрегаты атомов, имеющие диаметры от примерно нескольких нанометров до миллиметра (или более). Мешающие частицы могут иметь химически однородный состав или они могут представлять собой сложные агрегаты, такие как биологические клетки. Типичным примером текучей среды является цельная кровь, в которой обработка содержит обнаружение целевых компонентов в кровяной плазме, тогда как клетки (например, красные и белые кровяные клетки) образуют «мешающие частицы», которые искажают процесс обнаружения.
Способ согласно настоящему изобретению должен содержать следующие этапы:
a) обеспечение текучей среды, которая должна быть обработана в рабочей камере. Рабочая камера обычно представляет собой пустую полость или полость, заполненную некоторым веществом, таким как гель, который может поглощать вещество; она может представлять собой открытую полость, закрытую полость или полость, соединенную с другими полостями жидкостными соединительными каналами.
b) обеспечение магнитных частиц в вышеупомянутой рабочей камере. Термин «магнитные частицы» должен содержать как постоянно магнитные частицы, так и намагничиваемые частицы, например суперпарамагнитные гранулы. Размер магнитных частиц обычно находится в диапазоне между 3 нм и 50 мкм.
c) распределение вышеупомянутых магнитных частиц в (двух- или трехмерной) зоне, называемой «блокирующей зоной», в дальнейшем - внутри рабочей камеры так, что миграция мешающих частиц через блокирующую зону затрудняется, предпочтительно предотвращается.
Следует отметить, что вышеупомянутые этапы способа могут быть выполнены в перечисленном или в любом другом подходящем порядке. В частности, можно обеспечивать магнитные частицы до текучей среды или обеспечивать оба компонента одновременно. Магнитные частицы могут быть обеспечены в виде сухих реагентов или в виде влажных реагентов (т.е. растворенных в некоторой несущей текучей среде). Когда магнитные частицы распределены в блокирующей зоне, они обычно растворены в текучей среде, подлежащей обработке.
Термин «распределение магнитных частиц в блокирующей зоне» должен относиться к:
- возникновению расположения распределенных магнитных частиц (начиная с некоторого другого порядка расположения, например, в агрегированном состоянии в области хранения) и/или
- поддержанию такого расположения в течение продолжительного (возможно неопределенного) периода времени, в частности в ходе намеченного этапа (этапов) обработки.
Описанный способ обладает преимуществом, состоящим в том, что распределение мешающих частиц внутри рабочей камеры может быть регулируемым посредством блокирующей зоны, которая оказывает влияние на миграцию, а следовательно, на пространственное распределение мешающих частиц. Если мешающие частицы оказывают негативное влияние на намеченную обработку текучей среды, они, таким образом, могут, например, быть удержаны на удалении от области обработки. Если мешающие частицы оказывают положительное влияние на обработку или даже требуются для обработки, их концентрация, напротив, может быть повышена в области обработки. Таким образом, некоторого рода фильтрация текучей среды по отношению к мешающим частицам может быть достигнута за счет блокирующей зоны, без необходимости в дорогостоящих и занимающих пространство стандартных фильтрах.
Распределение магнитных частиц в блокирующей зоне может быть получено, например, за счет диффузии и/или силы тяжести. Это, в частности, возможно, если концентрация и количество магнитных частиц достаточно высокие (а магнитные частицы не слишком малы, вследствие чего они быстро диффундируют). Магнитные частицы затем будут рассеиваться с образованием облака, достаточно плотного, чтобы затруднить миграцию мешающих частиц, и которое существует достаточно длительное время для намеченной обработки. Если сила тяжести направляет магнитные частицы к одной поверхности рабочей камеры, это будет стабилизировать блокирующую зону перед этой поверхностью.
Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения генерируют магнитное поле, которое генерирует и/или поддерживает распределение магнитных частиц в блокирующей зоне. Магнитное поле делает возможным прямой и легкий контроль магнитных частиц и их распределение в блокирующей зоне. Более того, этот метод распределения частиц не зависит от диффузии и силы тяжести. Блокирующая зона перед некоторой поверхностью рабочей камеры, например, может затем быть поддержана, даже если сила тяжести направляет магнитные частицы (и мешающие частицы) от упомянутой поверхности.
Согласно второму аспекту изобретение относится к обрабатывающему устройству для обработки текучей среды, содержащей мешающие частицы, упомянутое обрабатывающее устройство содержит следующие компоненты:
- рабочую камеру, в которой могут быть обеспечены текучая среда и магнитные частицы;
- генератор магнитного поля для генерирования магнитного поля внутри рабочей камеры, которое распределяет магнитные частицы в блокирующей зоне в рабочей камере так, чтобы миграция мешающих частиц через блокирующую зону затруднялась. Генератор магнитного поля может, например, содержать постоянный магнит или электромагнит.
Способ и обрабатывающее устройство представляют собой различные реализации одной и той же идеи изобретения, т.е. контроля миграции мешающих частиц посредством блокирующей зоны магнитных частиц. Поэтому разъяснения и определения, представленные для одной из этих реализаций, пригодны также и для других реализаций.
В дальнейшем будут описаны различные предпочтительные варианты осуществления изобретения, которые относятся как к способу, так и к обрабатывающему устройству, определенному выше.
Блокирующая зона должна затруднять миграцию мешающих частиц по сравнению с их миграцией (т.е. под диффузией или силой тяжести) внутри остаточной текучей среды в рабочей камере. В количественных терминах, это означает, что скорость перехода (частицы в секунду) мешающих частиц через некоторую заданную область за пределами блокирующей зоны (но внутри рабочей камеры) должна быть больше, чем скорость перехода мешающих частиц через область того же размера и формы внутри блокирующей зоны. Скорость перехода внутри блокирующей зоны может составлять, например, менее чем примерно 90%, предпочтительно менее чем примерно 50% от «свободной» скорости перехода в текучей среде. Наиболее предпочтительным является, чтобы сопротивление было максимальным или близким к максимальному, в том смысле, что мешающие частицы совсем не могут мигрировать через блокирующую зону (тогда как другие компоненты текучей среды могут), в соответствии со скоростью перехода, равной нулю.
Как правило, миграция мешающих частиц может быть затруднена в блокирующей зоне посредством любого физического и/или химического эффекта. В предпочтительном варианте осуществления магнитные частицы действуют прямо как стандартный фильтр с порами, через которые мешающие частицы могут проходить или не проходить, в зависимости от их размера. Поскольку блокирующая зона обычно бывает непостоянной, статическое расположение магнитных частиц, размер пор стандартного фильтра соответствует среднему расстоянию между соседними магнитными частицами и/или кластерами (цепочками) магнитных частиц в блокирующей зоне. Является предпочтительным, чтобы среднее расстояние «Δ» между соседними магнитными частицами и/или кластерами магнитных частиц в блокирующей зоне было меньше чем пятикратный средний диаметр «d» мешающих частиц (в формуле: Δ≤5d), наиболее предпочтительно меньше чем d (Δ≤d). В этом контексте, среднее расстояние между соседними магнитными частицами и/или кластерами магнитных частиц в блокирующей зоне может быть определено, например, как наименьшее расстояние между соседними магнитными частицами/кластерами, предполагая однородное распределение всех магнитных частиц/кластеров по блокирующей зоне в простой кубической кристаллической структуре. Диаметр одиночной мешающей частицы может быть определен, например, как диаметр наибольшей сферы, которая полностью входит в мешающую частицу; «средний диаметр» представляет собой средний размер от всех этих отдельных диаметров частиц. Когда среднее расстояние Δ между соседними магнитными частицами/кластерами достаточно мало, блокирующая зона будет действовать как фильтр для мешающих частиц, почти полностью блокируя их переход. Для случая крови в качестве текучей среды, подлежащей обработке, и красных кровяных клеток в качестве «мешающих частиц», среднее расстояние Δ между магнитными частицами в блокирующей зоне должно, например, быть ниже чем примерно 2 мкм.
В рабочей камере может быть сделан любой вид обработки текучей среды, включая физическое и/или химическое преобразование или управление компонентами текучей среды в объеме. В предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере часть обработки может происходить в области, называемой «областью обработки», на поверхности рабочей камеры, причем эта область обработки может простираться по всей поверхности рабочей камеры или только по ограниченной области, которая может быть специально подготовлена.
В вышеупомянутом варианте осуществления с областью обработки блокирующая зона может быть расположена перед упомянутой областью обработки, воздействуя, таким образом, на миграцию мешающих частиц к области обработки или от нее (в зависимости от того, на какой стороне блокирующей зоны захватываются мешающие частицы). Таким образом, концентрация мешающих частиц в области обработки может быть регулируемой с помощью блокирующей зоны.
Является предпочтительным, чтобы упомянутая область обработки была расположена выше блокирующей зоны относительно силы тяжести. Седиментация мешающих частиц будет затем направлена от области обработки, поддерживая, таким образом, их отделение от упомянутой области. Гравитационные эффекты на магнитные частицы, которые могли бы смещать блокирующую зону от области обработки, могут быть скомпенсированы, например, магнитными силами.
Область обработки может содержать центры связывания для целевых компонентов текучей среды, подлежащей обработке. Компоненты, представляющие интерес, затем могут быть иммобилизованы в области обработки для дополнительных (специфичных для поверхности) этапов управления и/или обнаружения.
Обнаружение или восприятие параметров является одним важным примером для «обработки» текучей среды. Поэтому в предпочтительном варианте осуществления изобретения обрабатывающее устройство может содержать блок обнаружения для обнаружения целевых компонентов текучей среды. В сочетании с вышеприведенными вариантами осуществления, обнаружение может, в частности, проходить в области обработки на поверхности рабочей камеры, и оно может, в частности, относиться к целевым компонентам текучей среды, которые связываются с центрами связывания.
Необязательно, вышеупомянутый блок обнаружения может содержать оптический, магнитный, механический, акустический, термический и/или электрический датчик. Магнитный датчик может, в частности, содержать катушку, датчик Холла, планарный датчик Холла, магнитный датчик, СКВИД (SQUID, Superconducting Quantum Interference Device, сверхпроводящий квантовый интерференционный датчик), магниторезонансный датчик, магнитоограничительный датчик или магнитоограничительный датчик типа, описанного в WO 2005/010543 A1 или в WO 2005/010542 A2, особенно датчики супермагниторезистивности (GM, Giant Магнито Resistance), туннельной магниторезистивности (TMR, Tunnel Магнито Resistance) или анизотропной магниторезистивности (AMR, Anisotropic Магнито Resistance). Оптический датчик может быть, в частности, адаптирован для обнаружения изменений выходного пучка света, который возникает вследствие нарушенного полного внутреннего отражения (FTIR) из-за целевых частицам на чувствительной поверхности. Этот способ описан более подробно в WO 2008/155716 A1, WO 2009/016533 A2 или WO 2008/072156 A2.
Блокирующая зона может быть расположена во внутреннем пространстве рабочей камеры, оставляя, таким образом, свободные проходы (для мешающих частиц) на ее периферии. Такая негерметичная конфигурация является легкореализуемой и может быть достаточной для достижения требуемого неоднородного распределения мешающих частиц в течение ограниченного периода времени. Блокирующая зона может, например, образовать тип (крупный) зонтика перед (небольшой) областью обнаружения, вследствие чего она эффективно удерживает мешающие частицы далеко от области обработки при проведении требуемых этапов обработки.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения блокирующая зона простирается между стенками рабочей камеры так, что она делит рабочую камеру на два не соединенных объема (причем «не соединенный» означает, что не существует никакого соединительного пути, который проходит через рабочую камеру, не пересекая блокирующую зону). Таким образом, неоднородное распределение мешающих частиц между упомянутыми двумя объемами может быть поддержано с достаточной длительностью. Если один из объемов содержит, например, вышеупомянутую область обработки, можно постоянно удерживать мешающие частицы на удалении от него.
В одном варианте осуществления изобретения магнитные частицы могут быть размещены в виде сухих реагентов на поверхности рабочей камеры до того, как добавлена текучая среда, которая должна быть обработана. Этот подход, в частности, подходит, когда рабочая камера содержится некоторым предварительно изготовленным элементом, например одноразовым картриджем, используемым для исследования биологических образцов в некотором устройстве обнаружения. Пользователю затем приходится только добавлять имеющийся образец текучей среды в предварительно изготовленный картридж, и никакого отдельного этапа добавления магнитных частиц не требуется.
Если в вышеупомянутом варианте осуществления рабочая камера содержит область обработки на ее поверхности, магнитные частицы могут быть, в частности, размещены в виде сухих реагентов на упомянутой области обработки. Если текучую среду добавляют к этой конструкции, область обработки ограждается от нее до тех пор, пока не растворились магнитные частицы. Однако ограждение области обработки по отношению к мешающим частицам может быть поддержано, если растворяющиеся магнитные частицы немедленно распределяются в блокирующей зоне перед областью обработки.
В альтернативном варианте осуществления магнитные частицы могут быть размещены в виде сухих реагентов рядом с областью обработки. Текучая среда, добавленная к рабочей камере, будет затем способна контактировать с областью обработки, до тех пор, пока блокирующая зона магнитных частиц, возможно, не сможет дальше оказывать влияние на распределение мешающих частиц внутри рабочей камеры.
Блокирующая зона может быть установлена внутри рабочей камеры в стационарном положении. В качестве альтернативы, блокирующая зона может быть перемещаемой внутри рабочей камеры для генерирования некоторого требуемого распределения мешающих частиц. Как стационарное положение, так и требуемое перемещение блокирующей зоны может быть легко достигнуто путем регулирования магнитного поля в рабочей камере соответствующим образом.
Блокирующая зона, например, может быть использована для накопления и/или увеличения концентрации мешающих частиц в определенном подобъеме рабочей камеры. При исходном размещении магнитных частиц в виде сухих реагентов рядом с областью обработки блокирующая зона (которая образуется после добавления текучей среды и растворения магнитных частиц) может быть помещена перед областью обработки, с выдавливанием оттуда мешающих частиц.
В другом варианте осуществления изобретения блокирующую зону магнитных частиц создают в рабочей камере перед введением текучей среды, подлежащей обработке. Это требует, чтобы магнитные частицы были уже способны к перемещению в некоторый носитель или растворитель (например, поскольку они были обеспечены в качестве влажных реагентов и/или поскольку растворитель был добавлен в рабочую камеру, содержащую магнитные частицы в виде сухих реагентов). Заблаговременное генерирование блокирующей зоны магнитных частиц обладает преимуществом, состоящим в том, что распределение мешающих частиц может быть регулируемым с начального этапа, т.е. с момента добавления текучей среды.
В другом варианте осуществления изобретения обеспечивают магнитные меточные частицы, которые имеют центры связывания для целевых компонентов текучей среды, подлежащей обработке. Следовательно, упомянутые целевые компоненты могут специфическим образом связываться с магнитными меточными частицами, что дает возможность управлять ими посредством магнитных сил и/или обнаруживать с использованием свойств прикрепленных магнитных частиц. Магнитные меточные частицы могут быть (не обязательно) идентичны магнитным частицам, которые образуют блокирующую зону. В более общем смысле, это могут быть магнитные частицы, которые используют лишь для установления блокирующей зоны, и магнитные меточные частицы, которые используют для связывания целевых компонентов, причем для образования блокирующей зоны может быть дополнительно использовано несколько, все или ни одной из магнитных меточных частиц.
Текучая среда, которая должна быть обработана, может, в частности, содержать биологическую текучую среду, например слюну, кровь или мочу. Такие биологические текучие среды обычно содержат огромное количество компонентов, причем некоторые из этих компонентов представляют собой цели для испытания, которые искажаются под влиянием других компонентов. С помощью подхода согласно настоящему изобретению искажающие компоненты, т.е. «мешающие частицы», могут быть регулируемы таким образом, чтобы их искажающие эффекты были снижены.
Изобретение дополнительно относится к применению обрабатывающего устройства, описанного выше для молекулярной диагностики, анализа биологического образца, анализа химического образца, анализа пищи и/или криминалистического анализа. Молекулярная диагностика может быть выполнена, например, с помощью магнитных гранул или флуоресцентных частиц, которые непосредственно или косвенно прикреплены к целевым молекулам.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Эти и другие аспекты изобретения станут ясными и будут освещены со ссылками на варианты осуществления, описанные ниже.
НА ЧЕРТЕЖАХ:
Фиг. 1 схематически показывает обрабатывающее устройство для обнаружения целевых компонентов в образце посредством нарушенного полного внутреннего отражения;
Фиг. 2 схематически иллюстрирует генерирование блокирующей зоны из магнитных частиц, которые исходно осаждены на центрах связывания области обработки;
Фиг. 3 схематически иллюстрирует генерирование блокирующей зоны из магнитных частиц, которые исходно осаждены рядом с центрами связывания области обработки;
Фиг. 4 схематически иллюстрирует генерирование блокирующей зоны магнитных частиц, которая простирается между стенками рабочей камеры;
Фиг. 5 схематически иллюстрирует блокирующую зону магнитных частиц, которая ограждает область обработки;
Фиг. 6 схематически иллюстрирует применение магнитных частиц для создания блокирующей зоны и магнитных меточных частиц;
Фиг. 7 схематически иллюстрирует применение магнитных полей параллельно поверхности обнаружения и создание блокирующей зоны с кластерами из магнитных частиц;
Фиг. 8 показывает микроскопическое изображение магнитных частиц, связанных с областью связывания, после испытания в цельной крови;
Фиг. 9 показывает кривую доза - отклик, полученную в испытании для обнаружения целевых компонентов в образце.
Одинаковые номера ссылок на фигурах относятся к идентичным или сходным компонентам.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Многие биодатчики основаны на наночастицах-метках, в частности наночастицах (гранулах или шариках), которые могут быть приведены в действие с помощью электромагнитных полей. Обычно магнитные гранулы функционализируют антителами, которые могут связываться с определенной молекулой аналита. Гранулы притягиваются к поверхности датчика, где частицы могут косвенно (посредством захваченного аналита) или непосредственно связываться с зондами захвата (например, антителами), отпечатанными на поверхности. Количество связанных гранул прямо или обратно пропорционально количеству молекул аналита, присутствующих в образце. Гранулы могут быть затем обнаружены, с использованием любой технологии, которая более чувствительна к гранулам, которые ближе к поверхности. Например, технология обнаружения может быть основана на быстро исчезающих оптических полях, таких как нарушенное полное внутреннее отражение (FTIR), как в технологии Magnotech, разработанной заявителем. Другим примером является применение темнопольной микроскопии (dark field microscopy, DFM).
Фиг. 1 показывает схематический вид сбоку аппарата 100 биодатчика на основе FTIR, который может быть применен для проведения исследований крови. Обрабатывающее устройство или аппарат 100 датчика содержит считывающее устройство 150 и одноразовый картридж 110. Картридж 110 может быть изготовлен, например, из стекла или из прозрачного пластика, такого как полистирол. Он содержит рабочую камеру 111, в которой может быть обеспечен образец крови с целевыми компонентами, подлежащими обнаружению (например, кардиальным тропонином, наркотиками, антителами, ДНК, гормоном околощитовидной железы ПТГ(паратиреоидный гормон) и т.д.). Образец может дополнительно содержать магнитные частицы MP, например суперпарамагнитные гранулы, причем эти частицы обычно связываются в качестве меток с вышеупомянутыми целевыми компонентами.
Картридж 110 содержит крышку 112 и нижний блок 114, которые разделены слоем 113, например лентой. Картридж является прозрачным и имеет поверхности 115 обнаружения, которые (частично) ограничивают рабочую камеру 111. Множество областей обработки 117 (Фиг. 2-6) размещают на поверхности 115 обнаружения. Они содержат центры связывания 116, например антитела, которые могут специфическим образом связывать целевые компоненты.
Считывающее устройство 150 содержит источник 151 света для испускания «входного пучка света» L1, приемник света 152 для обнаружения и измерения «выходного пучка света» L2 и блок оценки (не показан) для оценки сигналов приемника света. Входной пучок L1 света, генерируемый источником 151 света, попадает на поверхность 115 обнаружения под углом большим, чем критический угол полного внутреннего отражения (TIR), и поэтому подвергается полному внутреннему отражению в виде выходного пучка L2 света. Выходной пучок L2 света покидает картридж 110 и обнаруживается приемником света, например светочувствительными пикселями фотокамеры 152.
Считывающее устройство 150 дополнительно содержит генератор магнитного поля, например электромагниты 153, 154 с катушкой и сердечником, размещенным на дне и/или наверху картриджа для регулируемого генерирования магнитного поля на поверхности 115 обнаружения и в соседнем пространстве рабочей камеры 111. Электромагниты 153, 154 соединены с контроллером 155, посредством которого они могут быть снабжены соответствующими токами. С помощью генерируемого магнитного поля магнитные частицами могут быть управляемыми, т.е. быть намагниченными и, в частности, быть перемещаемыми (если используются магнитные поля с градиентами). Таким образом, например, можно притягивать магнитные частицы к поверхности 115 обнаружения, чтобы ускорить связывание связанного целевого компонента с упомянутой поверхностью.
Типичное испытание с аппаратом 100 содержит следующие этапы: (1) магнитные гранулы, покрытые первичным антителом, направленным к целевому компоненту, диспергируют в жидкости образца и связывают с целевым компонентом; (2) верхняя и нижняя катушки приводят в действие магнитные частицы в импульсном режиме, что приводит к их связыванию с поверхностью датчика, где вторичное антитело может быть связано целевой молекулой; (3) несвязанные гранулы удаляют с поверхности датчика, а связанные гранулы обнаруживают с использованием быстро затухающего поля. Дополнительные детали этой процедуры можно найти в работе WO 2008/115723 Al, которая включена в настоящий текст в виде ссылки.
При исследовании образцов крови с помощью биодатчика вида, описанного выше, этап фильтрования, как правило, необходим для отделения кровяной плазмы, содержащей целевые компоненты, от кровяных клеток. Одноразовый картридж 110, в котором проводят испытания, может, например, содержать блок фильтра, который отделяет красные кровяные клетки от плазмы, которую перемещают к рабочей камере с магнитными частицами. Такой блок фильтра является относительно дорогостоящей частью картриджа, из-за множества материалов и процессов, требующихся для его сборки. Однако испытания не могут быть выполнены в присутствии красных кровяных клеток, поскольку i) магнитные частицы могут неспецифическим образом связываться с красными кровяными клетками и ii) красные кровяные клетки пространственно препятствуют магнитным частицам, замедляя движение частиц и их связывание с поверхностью датчика. Кроме того, процесс фильтрования, сопровождаемый капиллярным заполнением микрофлюидальных каналов и рабочих камер, является медленным процессом (он может занимать до одной минуты из всего времени испытания, составляющего пять минут), приводит к повышению погрешности (из-за изменения периодов заполнения и удержания молекул аналита) и является неэффективным (25 мкл входной крови дает только 2 мкл выходной плазмы).
Для решения вышеуказанных проблем было предложено использовать магнитные частицы в качестве фильтра, посредством чего избегая потребности в отдельном дорогостоящем блоке фильтра. Путем обеспечения слоя с высокой плотностью магнитных частиц (множество слоев из частиц), близких к области обнаружения, предотвращается достижение красными кровяными клетками или другими «мешающими частицами» области обнаружения, а следовательно, и замедление испытания.
Фиг. 2 содержит схематический чертеж магнитных частиц MP, функционирующих как фильтр. Магнитные частицы MP подают в сухой форме в плотном слое, поверх захваченных молекул 116 (слоя антитела), которые нанесены в «области обработки» или в «области связывания» 117 на поверхность датчика 115. При заполнении рабочей камеры цельной кровью магнитные частицы будут повторно подвергаться диспергированию.
Фиг. 2a) показывает рабочую камеру сразу после добавления текучей среды, подлежащей обработке, т.е. пробы крови. Проба крови содержит красные кровяные клетки C и целевые молекулы T в кровяной плазме.
Фиг. 2b) показывает ситуацию при повторном диспергировании магнитных частиц MP. Магнитные частицы распределяются в плотный слой магнитных частиц MP, называемый в дальнейшем «блокирующей зоной» BZ. Красные кровяные клетки C не могут проникать в эту блокирующую зону, тогда как плазма, содержащая целевую молекулу T, может. Затем магнитные частицы могут быть приведены в действие, во время которого самые верхние частицы предотвращают взаимодействие красных кровяных клеток с испытанием, проводимым с нижними частицами.
На Фиг. 2b) указан (средний) диаметр d мешающих частиц C, а также (среднее) расстояние Δ между соседними магнитными частицами MP в блокирующей зоне BZ. Если Δ≤d, т.е. если «поры» блокирующей зоны меньше, чем мешающие частицы, то можно полностью предотвратить прохождение мешающих частиц C через блокирующую зону.
Следует отметить, что магнитные гранулы обычно образуют цепочки (кластеры) во внешнем магнитном поле с определенным размером зазора между цепочками. Поэтому «магнитные частицы MP» (кружочки) на чертежах также могут быть заменены цепочками из нескольких отдельных магнитных частиц. Размер зазора между этими цепочками затем будет играть роль вышеупомянутого «расстояния Δ» (сравн. с Фиг. 7).
Тогда как Фиг. 2a) показывает применение магнитных частиц MP в виде слоя сухого реагента, также можно использовать влажные реагенты, в которых первую текучую среду, содержащую магнитные частицы, подают в рабочую камеру. Магнитные частицы затем магнитным способом вытягивают на поверхность, после чего кровь подают в рабочую камеру.
Магнитные частицы также могут быть сохранены в местоположениях, отличных от местоположения поверх зондов захвата в области связывания. Фиг. 3a) показывает случай, при котором их исходно подают в местоположение 118 рядом с областью связывания 117 с молекулами захвата. Когда во время повторного диспергирования магнитные частицы MP остаются в плотном слое (например, за счет приложения магнитного поля или с короткими периодами повторного диспергирования), результирующая «пробка» магнитных частиц или блокирующая зона BZ может быть смещена вбок к области обнаружения 117, содержащей зонды захвата, посредством чего выдавливая красные кровяные клетки из области обнаружения.
Фиг. 4a)-c) иллюстрируют метод увеличения объема образца текучей среды, которая может быть использована для испытания. Магнитные частицы MP, которые исходно (для примера) сохраняют на участках связывания области связывания, могут быть выдавлены (с помощью магнитного поля) в виде плотной блокирующей зоны BZ к слою красных кровяных клеток, посредством чего образуя большой объем, из которого красные кровяные клетки исключены (Фиг. 4b). Затем может быть проведено испытание (Фиг. 4c). Для предотвращения перемещения красных кровяных клеток под магнитные частицы эти работы лучше всего можно выполнять в ограниченной области (например, в небольшой камере), в которой нет никакого пустого пространства между магнитными частицами и стенками (пунктирные линии).
Другой вариант показан на Фиг. 5. Здесь размеры блокирующей зоны или слоя BZ магнитных частиц MP намного больше, чем размер слоя 117 зонда захвата, вследствие чего, даже если некоторые красные кровяные клетки C попадают под слой магнитных частиц BZ по его краю, то никаких красных кровяных клеток не будет присутствовать в центре, т.е. в области обнаружения 117 с зондами захвата.
Вместо использования тех же магнитных частиц в качестве фильтра и в качестве частиц захвата, которые могут связываться с поверхностью датчика, могут быть использованы два различных типа магнитных частиц. Это проиллюстрировано на Фиг. 6, согласно которой слой «магнитных меточных частиц» MP размещен под слоем (слоями) (не функционализированных) магнитных частиц MPB, которые образуют блокирующую зону BZ. Этот подход обладает преимуществом, согласно которому свойства верхних слоев магнитных частиц MP, близких к красным кровяным клеткам C, могут быть выбраны независимо, например количество частиц, размер частиц. Кроме того, эти магнитные частицы не надо функционализировать антителами и поэтому они не связываются с целевыми молекулами, что приводит к тому, что больше целевых молекул доступно для обнаружения.
Эти два слоя магнитных частиц MP, MPB могут быть нанесены в виде сухих реагентов, сначала первым осаждением слоя первых магнитных меточных частиц MP, а затем вторым осаждением слоя вторых магнитных частиц MPB. В качестве альтернативы, они могут быть нанесены в виде влажных реагентов, сначала притягивая первый комплект магнитных меточных частиц MP к поверхности, а затем добавляя и притягивая к поверхности второй комплект магнитных частиц MPB.
Фиг. 7 схематически иллюстрирует, что вышеуказанные принципы работают в равной мере с кластерами и цепочками магнитных частиц, вместо одиночных магнитных частиц (кластеры магнитных частиц будут наблюдаться фактически в большинстве случаев). Более того, предполагается, что приложенные магнитные поля B являются параллельными поверхности 115 обнаружения.
На Фиг. 7a) активен только нижний магнит 153. Предполагается, что это будет подковообразный магнит 153 (с его полюсами, лежащими друг за другом, перпендикулярно плоскости чертежа), который обеспечивает магнитное поле B, направленное параллельно поверхности 115 обнаружения (перпендикулярно плоскости чертежа). Это подразумевает, что магнитные гранулы MP будут образовывать цепочки CL, параллельные поверхности 115 обнаружения, когда магнитное поле B включено. На фигуре показаны цепочки CL в виде поперечного сечения. Одновременно генерируется магнитная сила, которая притягивает цепочки к поверхности 115.
Магнитные цепочки CL в своей основе будут иметь небольшие зазоры с шириной (средней) Δ между ними. Результирующая конфигурация имеет сходство с одномерной сеткой. До тех пор пока зазоры между цепочками являются меньшими, чем наименьший размер d мешающих частиц C, никакие частицы C пройти не могут.
На Фиг. 7b) нижний магнит 153 был отключен, а верхний магнит 154 был включен. Если бы верхний магнит мог представлять собой цилиндрический магнит, то могло получиться вертикальное расположение цепочек магнитных частиц, которое, как оказалось, является менее эффективным в блокировании мешающих частиц. Поэтому является предпочтительным использование подковообразного магнита, так же как и верхнего магнита 154. В этом случае поддерживается одномерная сетка гранулообразных кластеров, при том, что они могут быть перемещены наверх картриджа, «сжимая» мешающие частицы C. Таким образом, блокирующая зона BZ может быть эффективно перемещена.
Следует отметить, что описанные способы также могут быть использованы, чтобы предотвратить вмешательство других крупных твердых частиц (вместо красных кровяных клеток) в испытание с магнитными частицами. Более того, испытания могут выиграть от обратного геометрического порядка (переворачивания установок согласно Фиг. 1-7 сверху вниз относительно силы тяжести) таким образом, чтобы поверхность обнаружения находилась наверху и чтобы сила тяжести могла перемещать мешающие частицы (например, красные кровяные клетки), по существу, в сторону от поверхности обнаружения.
Изобретение может быть использовано, в частности, в лабораторных диагностических (иммуно-) испытаниях, например, с использованием технологии Philips Magnotech, для обнаружения биомаркеров в биологических образцах, например для обнаружения кардиального тропонина в крови для диагностики острого инфаркта миокарда.
В дальнейшем будет описан пример применительно к Фиг. 8 и 9. На поверхность пластикового картриджа были нанесены антитела на основе антикардиального тропонина I(cTnI), пригодные для использования с FTIR- или DFM-обнаружением, описанным выше. Поверх этих антител было нанесено большое количество магнитных частиц, функционализированных антителами анти-cTnI, и оставлены высыхать, с образованием посредством этого плотного слоя. Кровь с добавлением 10 пМ cTnI (или без cTnI, в качестве негативного контроля) была нанесена на картридж при поддержании частиц близко к поверхности с использованием магнитного поля. Магнитным частицам затем дали возможность захватывать молекулы cTnI и связываться с поверхностью. Этап магнитной промывки был использован для удаления несвязанных магнитных частиц от поверхности, и количество магнитных частиц, связанных с поверхностью, было подсчитано, с использованием технологии DFM-обнаружения (сравн. с WO 2011/036634 A1).
Фиг. 8 показывает пример DFM-обнаружения частиц, связанных с поверхностью после испытания с 10 пМ cTnI в цельной крови. Хотя многие частицы связываются также за пределами области, где отпечатаны антитела анти-cTnI (круглая область наверху), внешний сигнал (приведенный к области обнаружения) может быть вычтен из количества частиц внутри пятна захвата. Хотя испытание не было оптимизировано, 10 пМ cTnI может быть четко отличимым от фонового связывания с оценочным пределом обнаружения для 10 пМ cTnI.
Фиг. 9 показывает результирующую кривую доза - отклик, показывающую обнаруженное количество N частиц в образцах, содержащих 0 или 10 пМ cTnI. Верхние точки отображают прямой (нескорректированный) результат, нижние точки отображают данные, скорректированные для связывания внешней области с антителами на основе анти-cTnI.
Тогда как изобретение было проиллюстрировано и подробно описано на чертежах и в вышеприведенном описании, такую иллюстрацию и описание следует рассматривать как иллюстративные или примерные, а не ограничивающие; изобретение не ограничено раскрытыми вариантами осуществления. Другие разновидности раскрытых вариантов осуществления могут быть поняты и исполнены специалистами в данной области техники при реализации заявленного изобретения исходя из изучения чертежей, раскрытия и прилагаемой формулы изобретения. В формуле изобретения слово «содержит» не исключает наличия других элементов или этапов, а единственное число не исключает множественности. Сам факт, что определенные меры, перечисленные в отличных друг от друга зависимых пунктах формулы изобретения, не указывают на то, что сочетание этих мер не может быть успешно использовано. Никакие ссылочные обозначения в формуле изображения не следует рассматривать как ограничивающие объем изобретения.