Локализация и частота полиморфных позиций в гипервариабельном регионе 2 (73-340) митохондриальной ДНК

ваны для получения индивидуальных генетических паспортов производителей. Результаты первых работ вселяют надежду на возможность решения этих задач.

В заключение хотелось бы подчеркнуть, что одной из основных предпосылок получения адекватных результатов при проведении геномных исследований на осетровых рыбах, обитающих в Российских водоемах, является использование квалифицированно отобранных образцов, официально зарегистрированных в «Национальной генетической коллекции ДНК-содержащих образцов осетровых рыб», созданной на базе ВНИРО.

Литература

1. Parsons T.J., Coble M.D. // Croat Med. J. 2001. Vol. 42. P. 304-314.

2. Bär W. et al. II Int. J. Legal. Med. 2000. Vol. 113. P. 193-196.

3. Morley J.M. et al. I/ Int. J. Legal Med. 1999. Vol. 112. P. 241-248.

4. Pourkazemi M. et al. II J. Appl. Ichtyol. 1999. Vol.15. P. 23-28.

5. Birstein V. et al. II Conservation genetics. 2000. Vol. 1. P. 81-88.

6. Recoubratsky A. V. et al. II 4th International symposium on sturgeon. USA. 2001.

7. Schneider P. M. Methods in Molecular Biology. Totowa; NJ, 1998.

8. Leonard J. T. et al. II Biotechniques. 1998. Vol. 24. P. 314-317.

9. Sanger F. et al. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. Vol. 74. P. 5463-5467.

10. Mamett L J. II Carcinogenesis. 2000. Vol. 21. P. 361-370.

11. Ludwig A., May B. et al. Genetics. 2000. Vol. 156. P. 1933-1947.

12. Токарская O.H. и др. II Генетика. 2000. Т. 36. №11. С. 1520- 1530.

6 мая 2002 г.

Азовский НИИ рыбного хозяйства. Ростовский государственный университет

УДК 575.174:599.9

ЛОКАЛИЗАЦИЯ И ЧАСТОТА ПОЛИМОРФНЫХ ПОЗИЦИЙ В ГИПЕРВАРИАБЕЛЬНОМ РЕГИОНЕ 2 (73-340) МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК

© 2003 г. И.В. Корниенко, ЮЖ. Гаврилей, С.И. Браславская, Г.В. Афанасьева,

Е.В. Щербакова, JI.C. Михалкович, ПЛ. Иванов

In work the data on polymorphic sites of hypervariable region 2 (HV2) (73-340) of mitochondrial DNA (mtDNA) of 157 Russian slavs are given. At analysis of sequences of fragments of a locus HV2 it is revealed 74 mitotypes 49 of which were unique. Ten polymorphic positions on a field of 73-320 control regions of mtDNA of the slavs identified. The greatest number of mutations is localized in positions 73, 152, 195, 263, 309.1 and 315.1.

Нуклеотидная последовательность митохондриальной ДНК (мтДНК) практически идентична для матрилинейных родственников. Это обстоятельство используется в популяционной генетике, антропологических исследования, а также в судебной медицине для доказательства идентичности или отличия исследуемого генетического материала от образцов, взятых у заведомо известных матрилинейных родственников. Для анализа кровного родства, как правило, исследуют не всю молекулу мтДНК, а только ту ее часть, которая обладает наибольшим полиморфизмом [1]. Этот высокополиморфный участок мтДНК, называемый D-петлей, составляет не более 7 % от всего митохондриального генома (мтГ) человека. Тем не менее именно в нем сосредоточен наибольший массив индивидуализирующих признаков.

МтДНК человека представляет собой двухцепочечную кольцевую молекулу размером 16569 нуклеотидных пар (н.п.), первичная структура которой была расшифрована в 1981 г. [2]. Анализ первичной структуры мтДНК человека показал, что мтГ очень компактно организован и имеет единственную некодирующую область (контрольный регион), размером 1122 н.п., расположенную между генами, кодирую-

щими транспортные РНК пролина и фенилаланина. В этой некодирующей области расположены регуляторы репликации и транскрипции мтДНК [3]. Несмотря на большую функциональную значимость, в некодирующем регионе накапливается большое число мутаций, что делает его высокополиморфным по сравнению с другими участками мтДНК [4].

Вследствие высокой копийности мтГ, а также строгое наследование по материнской линии обусловило использование маркеров мтДНК в судебной медицине [5], антропологии [6], археологии [7] и популяционной генетике [8].

С использованием методов секвенирования нуклеотидных последовательностей гипервариабельных сегментов контрольного региона Б-петли мтДНК к настоящему времени накоплены многочисленные данные о вариабельности этих участков в различных этнических группах [9 - 13]. В литературе практически отсутствует информация о разнообразии гиперва-риабельного участка 2 (HV2) среди славян.

В настоящей работе мы изучили полиморфизм ги-первариабельного сегмента 2 О-петли мтДНК среди славян из различных регионов Российской Федерации.

Экспериментальная часть

В качестве биологического материала для типиро-вания по локусу HV2 использовали периферическую кровь, полученную от 157 человек, не являющихся кровными родственниками, из 55 регионов Российской Федерации.

Выделение ДНК из исследуемых образцов проводили с использованием ионообменной смолы Chelex 100 по методу [14]. Типирование локуса HV2 проводили, согласно [15], с использованием следующих праймеров: F15 (5’CACCCTATTAACCACTCACG3’) и R448 (5’TGAGATTAGTAGTATGGGAG 3’).

Разделение амплифицированных фрагментов мтДНК проводили в 4 %-м полиакриламидном дена-

турирующем геле на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 377. Идентификацию разделенных фрагментов — с помощью программного пакета «DNA Sequencing Analysis Software, version 3.1» (PE Applied Biosystems). Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей сегмента HV2 выполняли с помощью программы Sequence Navigator, version 1.0.1 (РЕ Applied Biosystems), построение табл. 1 полиморфизма - mDNAbase 2.10 (разработка НИИ нейрокибернетики им. А.Б.Когана РГУ и 124 Центральной лаборатории медико-криминалистической идентификации МО РФ). Полиморфизм нуклеотидной последовательности участка HV2 определяли по различию с референтной последовательностью Андерсона [2].

Таблица 1

№ Список обнаруженных митотипов Количество человек с данным митотипом

і 2 3

0011111111111112222222222222222222333333

7945558888899990000112233445667889001122

3360122568945890347472849290399255990506

12 1

CRS AATCCTCGCAACTCTAGTGATCGATCATACTTCC--T-CA

1 16

2 G. ...C..C.. 9

3 3

4 G. ...CC.C.. 5

5 G. CC.CT. 1

6 1

7 4

8 2

9 1

10 G. ...C..CT. 1

11 . . .С G. C. . 1

12 . . .С G. ...C..C.. 1

13 . . .С G. 1

14 . . .С G. ...CC.с.. 1 '

15 .. .с G. C. . 1

16 1

17 С. . . G. C. . 2 .

18 С. . . G. ...C..C.. 1

19 с.. . 1

20 2

21 1

22 . .А G. ...C..C.. 1

23 . .с G. ...C..C.. 1

24 . .с .. .с G. C. . 1

25 .G 2

26 .G G. ...C..C.. 3

27 .G....Т.. ...C..C.. 1

28 . GC ...C..C.. 1

29 G G. C. . 16

30 G G. ...C..C.. 9

31 G G. ...CC.с.. 1

32 ..AC..C.. 1

33 1

34 1

35 2

36 G ..TC..с.. 1

37 G. ...C..C.. 1

38 с..с. CG. C. . 1

39 С.АС. CG. ...C..C.. 1

40 G т G. C. . 1

Окончание табл. 1

№ Список обнаруженных митотипов Количество человек с данным митотипом

41 4

42 . . .С G. . . .С. с.. 2

43 . . .С G. . . . .СС с.. 3

44 ..-.G.. с.. 1

45 G. . . .С. ст. 1

46 G. . . .С. с.. 1

47 а . GTC СА . .с. с.. 1

48 О A G. . • Т. . с.. 1

49 G с.G 3

50 с.. 1

51 Ст. G А. G. . с.. 1

52 G G А. G. . с.. 2

53 4

54 с, С..С G. . . .с. с.. 2

55 1

56 1

57 о r .GTC А. . . . 1

58 О r -G.C G. . с.. 1

59 G . .TC ..-.G.. . .с. с.. 1

60 G ..-.G.. 2

61 G .T G. . с.. 1

62 G 3

63 G ,T С. . G. . . .с. .с.. 4

64 G . . -С G. . .с.. 1

65 G .. .с G. . . .с. с.. 1

66 1

67 G. С. ст. 2

68 G 1

69 G C. r. G. . 1

70 G c .с.. 2

71 G r. r ..-.G.. . .с. .с.. 1

72 G c. c G. . . G.C . .с. .ст. 1

73 74 GG. . r G. . с. 1 1

Результаты и обсуждение

Первичная последовательность гипервариабель-ных фрагментов HV2 контрольного региона мтДНК 157 славян, проживающих на территории Российской Федерации, была определена с использованием флуоресцентно меченных терминаторов, секвенирование легкой (L) и тяжелой (Н) цепей фрагмента HV2 - специфичных праймеров. Нуклеотидные последовательности, полученные для L-цепи и Н-цепи с помощью автоматического секвенатора и программного обеспечения DNA Sequencing Analysis Software, после сравнения между собой сравнивались с референтной последовательностью Anderson [2] на участке между 73 и 340 контрольного региона мтДНК.

Анализ нуклеотидных последовательностей ам-плифицированных фрагментов локуса HV2 показал наличие 74 митотипов, 49 из которых были уникальными. При этом ни один из выявленных митотипов не совпадал с референтной последовательностью [2]. При сравнении с референтной последовательностью легкой цепи мтДНК мы обнаружили 40 полиморфных позиций на участке 73-320 D-петли, причем в 10 позициях изменения были единичными.

Полиморфизм локуса HV2 представлен в основном транзициями и вставками (табл. 2). Наибольшее число замен локализовано в позициях 73, 152, 195 и 263, а вставок - в позициях 309.1 и 315.1 (табл. 3), что

согласуется с данными по нескольким Европейским популяциям [9-13]. Это определило существование четырех самых распространенных митотипов в российской популяции. Так, митотип 263 AJG, 315.1 С, также как и 73A/G, 263 A/G, 315.1 С, встречался у

10.2 % населения, а митотипы 263 A/G, 309.1 С, 315.1 С; 73A/G, 263 A/G, 309.1 С, 315.1 С и 263 A/G, 309.1 С, 309.2 С, 315.1 С - соответственно у 5,7 %, 5,7 % и

3.2 % населения Российской Федерации.

Анализ первичной последовательности показал, что HV2 является высокополиморфным регионом. Однако распределение полиморфных сайтов не носит случайный характер. Так, в области консенсусной нуклеотидной последовательности 1-го типа (CSB1) (210-234), которая ответственна за транскрипцию мтДНК [3], обнаружена только одна точечная мутация (транзиция G-А) в позиции 228, которая имела место у десяти человек, а также четыре единичные замены в позициях 214,217,222 и 234. Интересно, что наряду с заменой G на А в 228 положении в девяти случаях из десяти имели место транзиции в положениях 73 (A-G), 295 (С-T). Тринадцать из четырнадцати транзиций G-А в 185-м положении были ассоциированы с заменами в области 73-го нуклеотида. Наряду с этим 8 из 14 замен в 185-м положении, а также -все 7 обнаруженных замен А на G в положении 188 были ассоциированы с мутацией в 228-м положении.

Таблица 2

Распределение точечных замен, вставок и делеций в гипервариабелыюм регионе 2 легкой цепи мтДНК

Тип мутаций Число позиций, где имели место мутации Общее число мутаций

Транзиции:

С-Т 11 62

Т-С 11 83

А-й 9 273

й-А 4 28

Всего 35 446

Трансверсии: С-А 2 2

А-С ' 0 0

С-0 0 0

в-С 0 0

Т-в 0 0

в-т 0 0

А-Т 0 0

Т-А 0 0

Всего 2 2

Вставки: +А о 0

+С з 255

0 - 0

+Т о 0

Всего 3 255

Делеции:

-А 1 6

-С 0 0

-в 0 0

-Т 0 0

Всего 1 6

На основании результатов исследования митоти-

пов была определена величина генетического разнообразия (h=n(l-£%2)/(n-l), где п - объем выборки; %-частота встречаемости каждого митотипа), которая оказалась равной 0,97. Вероятность того, что два случайно выбранных из популяции индивида будут иметь идентичный митотип (Р= 1/2)> равна 3,66 %.

Литература

1. Parsons Т. J. et al. // Nature Genetics. 1997. Vol. 15.

P. 363-367.

2. Anderson S. et al. // Nature. 1981. Vol. 290. P. 457-464.

3. Shadel G.S., Clayton D.A. // Annu. Rev. Biochem. 1997. Vol. 66. P. 409-435.

4. Zischler H. II Methods and Tools in Biosciences and Medicine. DNA Profiling and DNA Fingerprinting / Ed. by J.T. Epplen andT. Lubjuhn. Basel/Switzerland, 1999. C. 117— 131.

5. Bär W. et al. II Int. J. Legal. Med. 2000. Vol. 113. P. 193— 196.

6. Macaulay V. et al. II Am. J. Hum. Genet. 1999. Vol. 64.

№ 1. P. 232-249.

7. De Benedetto G. et al. // Eur. J. Hum. Genet. 2000. Vol. 8. №9. P. 669-677.

Следует отметить, что анализ нуклеотидной последовательности региона HV2 мтДНК жителей Российской Федерации показал различия от референтной последовательности Anderson [2]. Практически у всех 157 человек была транзиция в позиции 263, а в области 309 и 315 нуклеотида имели место вставки С у 88 и 155 человек, соответственно.

Данные особенности строения контрольного региона мтДНК в области HV2 наблюдались у немцев [9], австрийцев [10], французов [11], швейцарцев [12], португальцев [13].

Таблица 3

Характер и количество точечных мутаций в гинерва-риабельном регионе 2 легкой цепи мтДНК

8. Mogentale-Profizi N. et al. II Ann. Hum. Genet. 2001. Vol. 65. P. 153-166.

9. Lutz S. et al. II Int. J. Legal Med. 1998. Vol. 111. P. 67-77.

10. Parson W. et al. II Int. J. Legal Med. 1998. Vol. 111.

P. 124-132.

11. Rousselet F., Mangin P. II Int. J. Legal Med. 1998.

Vol. 111. P. 292-298.

12. Dimo-Simonin N. et al. II Int. J. Legal Med. 2000. Vol. 113. P. 89-97.

13. Pereira L et al. // Ann. Hum. Genet. 2000. Vol. 64. № 6.

P. 491-506.

14. Walsh S.P. et al. // BioTechniques. 1991. Vol. 10. P. 506-513.

15. Pfeiffer H. et al. II Int. J. Legal Med. 1999. Vol. 112. P. 291-298.

Номер Точечная Кол-во Номер Точечная Кол-во

позиции мутация замен позиции мутация замен

согласно согласно

[21 [2]

1 3 3 4 5 6

73 A/G 73 217 Т/С 1

93 A/G 8 222 С/Т 1

146 Т/С 10 228 G/A 10

150 С/Т 14 234 A/G 1

151 С/Т 4 239 Т/С 6

152 Т/С 24 242 С/Т 3

182 С/Т 2 249 del. А 6

185 G/A 14 250 Т/С 2

186 С/А 1 263 A/G 157

188 A/G 7 269 С/Т 1

189 A/G 4 279 Т/С 1

194 С/Т 3 282 Т/С 1 •

195 Т/С 26 285 С/Т 1

198 С/Т 2 295 СП 16

199 Т/С 4 295 С/А 1

200 A/G 3 309.1 ins. С 88

203 G/A 1 309.2 ins. С 12

204 Т/С 6 310 Т/С 2

207 G/A 3 315.1 ins. С 155

214 A/G 1 320 С/Т 16

124-я Центральная лаборатория медико-криминалистической идентификации Министерства обороны РФ; НИИ нейрокибернетики им. А.Б. Когана Ростовского государственного университета, г. Ростов-на-Дону; Российский центр судебно-медицинской экспертизы Министерства здравоохранения Российской Федерации___________________________________________________________________________20 марта 2002 г.