Способ получения линии гуманизированных мышей, трансгенных по hACE2
METHOD FOR OBTAINING A LINE OF HUMANISED MICE, TRANSGENIC BY hACE2

Область техники
Изобретение относится к областям молекулярных биотехнологии и медицины и касается гуманизированной линии мышей, несущей человеческий ген hACE2. Изобретение может быть использовано для тестирования вакцин против COVID-19, а также для детального изучения механизмов проникновения вируса SARS-CoV-2.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства Науки и Высшего образования Российской Федерации в рамках Соглашения №075-15-2019-1661 от 31.10.2019.
Уровень техники
Пандемия COVID-19, вызванная вирусом SARS-CoV-2, началась в конце 2019 года и продолжает уносить жизни, нанося беспрецедентный для последних десятилетий ущерб мировой экономике. Даже если распространение вируса удастся остановить другими методами, риск возникновения новой вспышки будет сохраняться до тех пор, пока не будет создана вакцина против COVID-19.
Создание вакцины, однако, осложняется дефицитом адекватных животных моделей для тестирования. Тестирования на приматах подходят только для финальных этапов тестирования: они требуют специальных условий и дороги. Обычные мыши не могут использоваться для тестирования вакцин, поскольку вирус не способен инфицировать клетки мышей дикого типа. Для проникновения в клетки человека SARS-CoV-2 использует поверхностные белки АСЕ2, в норме катализирующие гидролиз ангиотензина II, приводящий к снижению артериального давления. Гомология человеческого и мышиного АСЕ2 недостаточна для проникновения вируса в мышиные клетки. Исходя из этого, можно предположить, что трансгенная мышь, экспрессирующая человеческий АСЕ2, будет адекватной моделью для ранних этапов разработки вакцин против COVID-19.
Известны трансгенные мыши (Linlin Bao, Wei Deng, Baoying Huang, Hong Gao et al, The Pathogenicity of 2019 Novel Coronavirus in hACE2 Transgenic Mice, Nature, 2020 May 7), конститутивно экспрессирующие hACE2 во всех тканях. Было показано, что вирус SARS-CoV-2 проникает в клетки таких мышей, и у них обнаруживаются симптомы COVID-19, вплоть до интерстициальной пневмонии с летальным исходом. Однако, такие мыши как модель заболевания COVID-19 имеют существенный недостаток: белок АСЕ2 присутствует у людей не во всех типах клеток, и это может в значительной мере определять характер протекания заболевания. В работе не проводилось гистологического исследования тканей кроме легких. Известны также трансгенные мыши (Paul В. МсСгау Jr., Lecia Pewe, Christine Wohlford-Lenane et al, Lethal Infection of K18-hACE2 Mice Infected with Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus, Journal of Virology, 2007 Jan; 81(2):813-21), в которых экспрессия гена hACE2 находится под контролем промотора К18 (кератин 18), экспрессирующегося на высоком уровне в легкий, эпителии бронхов, а также в печени, поджелудочной железе, предстательной железе, щитовидной железе и кардиомиоцитах. До сих пор не было опубликовано работ по исследованию инфекции SARS-CoV-2 с использованием этой линии мышей, однако, ряд ее недостатков был обнаружен еще во время исследования инфекции SARS-CoV. Во-первых, после заражения вирусом у трансгенных животных наблюдалась 100% летальность, а продолжительность жизни зависела, в основном, от числа встроившихся копий конструкции и составляла несколько дней. Во-вторых, у подопытных животных наблюдалась экспрессия гена hACE2 и, соответственно, воспалительный процесс в головном мозге, что нетипично для инфекции у человека. В-третьих, короткий промежуток времени между инфекцией и смертью делает затруднительным исследование вакцин на данной мышиной модели, так как этого времени может быть недостаточно для активации клеток памяти.
Кроме того, к недостаткам всех моделей с конститутивной экспрессией гена hACE2 можно отнести его экспрессию на этапе эмбрионального развития, что может приводить к непредсказуемым последствиям. Преимуществом животных с индуцируемой экспрессией гена КАСЕ2 также является их лучший профиль безопасности по сравнению с животными с конститутивной экспрессией: до проведения индукции животные не могут быть носителями вируса и не требуют особых условий содержания.
Раскрытие сущности изобретения
В данном изобретении индуцируемая экспрессия гена hACE2 обеспечивается использованием вектора NIF. Вектор NIF предназначен для случайного встраивания экспрессионной кассеты в геном животного. Он обладает рядом элементов для обеспечения эффективной экспрессии трансгена. Димер инсулятора HS4 обеспечивает независимость экспрессии трансгена от состояния хроматина в месте встраивания, препятствуя распространению репрессивного хроматина на встроившуюся конструкцию. Вектор также содержит эффективные терминаторы транскрипции, присутствие которых увеличивает уровень экспрессии трансгена, предотвращая подавление экспрессии путем РНК-интерференции (RU 2525712 C2). Наиболее важной для нас, однако, составной частью вектора NIF является STOP-кассета, фланкированная LoxP-сайтами, расположенная между конститутивным С AG-промотором и открытой рамкой считывания гена hACE2. Наличие STOP-кассеты делает экспрессию трансгена невозможной. STOP-кассета, однако, может быть удалена благодаря Cre-рекомбинации. Система LoxP/Cre-рекомбиназа происходит из бактериофага Р1. Последовательность ДНК, расположенная между двумя LoxP сайтами, может быть удалена при появлении в клетке белка Cre-рекомбиназы. Существуют линии трансгенных мышей, в клетках которых может происходить доксициклин-зависимая экспрессия Cre-рекомбиназы. Экспрессия Cre-рекомбиназы может происходить как во всех тканях организма, так и носить благодаря специфическим промоторам тканеспецифичный характер. После скрещивания трансгенных мышей, трансгенез которых осуществлялся с использованием вектора NIF, с трансгенными мышами, экспрессирующими Cre-рекомбиназу, возможна активация экспрессии трансгена, содержащегося в векторе NIF во всем организме или тканеспецифично путем доксициклиновой активации экспрессии Cre-рекомбиназы..
Задачей заявляемого изобретения является создание линии генетически модифицированных мышей, содержащих в своем геноме ген hACE2 в составе вектора NIF, позволяющего активировать экспрессию трансгена с помощью Cre-рекомбиназы.
Задача решается тем, что получена новая линия генетически модифицированных мышей, содержащих в геноме конструкцию NIF-hACE2, для чего:
1. Был получен линеаризованный вектор NIF, характеризующийся размером 11000 пар нуклеотидов, и способностью активировать экспрессию трансгена в ответ на воздействие Cre-рекомбиназы, в который по сайтам узнавания эндонуклеаз рестрикции BshTI - MluI вставлен фрагмент размером 2418 пары нуклеотидов SEQ ID NO: 1, содержащий полноразмерную кДНК hACE2.
2. Был разработан способ получения линеаризованного вектора NIF, характеризующийся следующими стадиями:
а) Клонирование открытой рамки считывания гена МСЕ2 в плазмиду NIF по сайтам рестрикции MluI и BshTI
б) Получение линеаризованного вектора NIF из кольцевой плазмиды путем рестрикции эндонуклеазой PvuI с удалением части бактериального остова длиной 1000 пар нуклеотидов.
3. Способ получения линии мышей, трансгенных по hACE2, характеризующийся следующими стадиями:
1
а) микроинъекция линеаризованного вектора NIF из п. 1 в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки мыши гибрида F(CBA×C57BL/6);
б) выявление жизнеспособных зигот;
в) пересадка выживших зигот из пункта (б) псевдобеременным самкам-реципиентам, имеющим копулятивную пробку после ссаживания с вазэктомированными самцами;
г) получение новорожденных мышей на 19 день после пересадки зигот из пункта (в);
д) проведение анализа наличия вектора NIF по п. 1 через 8-14 дней после рождения мышей (г), используя последовательности SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3;
е) отбор мышей, несущих вектор NIF по п. 1;
ж) проведение скрещивания мышей из пункта (е) с мышами дикого типа для получения гетерозигот, несущих вектор NIF, содержащий трансген.
з) проведение скрещивания гетерозиготных мышей из пункта (ж) для получения гомозиготных мышей и итоговой линии мышей, трансгенных по гену hACE2.
Технический результат изобретения: разработан способ получения линии трансгенных мышей, экспрессирующих ген hACE2 после воздействия Cre-рекомбиназы.
Изобретение иллюстрируется фигурой и перечнем использованных последовательностей.
Краткое описание чертежей
На фигуре представлена схема вектора NIF. Перед сайтом, предназначенным для клонирования гена интереса, расположена STOP-кассета, фланкированная LoxP-сайтами. До рекомбинации ген находится в выключенном состоянии. Тканеспецифичная активация Cre-рекомбиназы позволяет тканеспецифично активировать экспрессию целевого гена.
Осуществление изобретения
Способ осуществляется следующим образом:
1. Получение генетических конструкций. кДНК гена hACE2 получали на основе суммарной мРНК, полученной из материала биопсии почки человека, гомогенизированной на гомогенизаторе Precellys 24 и выделенной набором QIAGEN RNeasy Mini Kit.. Обратную транскрипцию осуществляли с использованием обратной транскриптазы Superscript II (Invitrogen) и неспецифического праймера d(T)i6 (SEQ ID NO: 4). Предварительную амплификацию кодирующей последовательности hACE2 осуществляли с использованием праймеров hACE_5_fwd (SEQ ID NO: 5) и hACE_3_rev (SEQ ID NO: 6) ДНК полимеразой Q5 (NEB). Амплификацию гена hACE2 осуществляли с использованием праймеров hACE2-F-BshTI (SEQ ID NO: 7) и hACE2-R-MluI (SEQ ID N0:8) и полимеразы Phire (Thermofisher Scientific). Амплифицированный фрагмент подвергали разрезанию эндонуклеазами рестрикции MluI-FD и BshTI-FD (Thermofisher Scientific) и лигировали в вектор, обработанный теми же рестриктазами. Лигазную смесь трансформировали в компетентные клетки DH5a, колонии скринировали, наращивали в ночной культуре, плазмидную ДНК из них выделяли и проверяли с помощью рестриктного анализа. Два образца секвенировали и проверяли, полностью ли последовательность соответствует предсказанной (SEQ ID NO: 1). Одну полностью проверенную плазмиду линеаризовали с использованием эндонуклеазы рестрикции PvuI, очищали в агарозном геле и выделяли с помощью набора QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen), и разводили до концентрации используемой при микроинъекциях - 1нг/мкл.
i
i
2. Получение яйцеклеток мышей. Яйцеклетки для микроинъекции получали методом индукции суперовуляции. Для этого неполовозрелым самкам гибридам F(CBA×C57BL/6) весом 12-13 г внутрибрюшинно вводили 8 ед. гонадотропина сыворотки жеребых кобыл (ГСЖК) и через 48 час - 8 ед. хорионического гонадотропина человека (ХгЧ). После такой обработки самок ссаживали с самцами-производителями F(CBA×C57BL/6). Факт спаривания констатировали на следующее утро по наличию копулятивной пробки.
Схема индукции суперовуляции: 12:00 - ГСЖК, через 48 часов - ХгЧ. В 17:00 этого же дня - подсадка к самцам-производителям. Отбор доноров производили на следующий день в 9:00. Световой режим в виварии был установлен с 7:00 до 19:00.
Отобранных самок-доноров умерщвляли, извлекали яйцеводы, затем вымывали яйцеклетки в среде HEPES-KSOM с добавлением гиалуронидазы. Процедуру проводили под бинокуляром (Zeiss Stemi DV4) с увеличением в 32 раза. Для вымывания яйцеклеток использовали стеклянные капилляры с внутренним диаметром примерно 100 мкм, изготовленные на пуллере Narishige PC-10 (Япония) и микрокузнице Narishige MF-900 (Япония).
2
3. Микроинъекции. Полученные зиготы культивировали в течение двух часов при t=37°C и 5% СО в капле среды KSOM под минеральным маслом (Sigma, США), затем помещали в микроинъекционную камеру. Микроинъекции проводили в среде HEPES-KSOM под микроскопом Zeiss Axiovert 200М при увеличении в 400-600 раз, используя микроманипуляторы Narishige. Для изготовления игл для микроинъекций использовали пуллер Sutter instrument Со Р-97 (США), для изготовления удерживающей пипетки использовали пуллер Narishige PC-10 и микрокузницу Narishige MF-900.
После окончания микроинъекций выжившие зиготы переносили в каплю среды KSOM под минеральное масло (Sigma) и культивировали в течение 1 часа для выявления жизнеспособных эмбрионов.
1
4. Получение самок-реципиентов. Самок-реципиентов яйцеклеток получали следующим образом: половозрелых самок F(CBA×C57BL/6) весом не менее 24 г ссаживали с вазэктомированными самцами той же линии. Через 18 часов псевдобеременных реципиентов отбирали по наличию копулятивных пробок. Выжившие после микроинъекции зиготы трансплантировали в яйцеводы псевдобеременной самки. Одной псевдобеременной самке пересаживали 6-10 эмбрионов. Операцию проводили под наркозом (смесь золетила и рометара, вводился внутрибрюшинно).
5. Операция вазэктомирования. Операцию вазэктомирования проводили заранее под наркозом (смесь золетила и рометара, вводился внутрибрюшинно). Через надрез в коже и брюшной стенке вытягивали из брюшной полости семенник, придатки семенника и семявыносящий проток, после чего раскаленным пинцетом разрушали семявыносящий проток. Органы возвращали в брюшную полость, и повторяли всю процедуру на другом семявыносящем протоке. На завершающем этапе на брюшную стенку и на кожу накладывали швы с последующей антисептической обработкой операционного поля.
6. Получение новорожденных мышей. На 19 день после пересадки микроинъецированных эмбрионов реципиента умерщвляли путем цервикальной дислокации и проводили кесарево сечение, после чего выживших детенышей помещали к заранее подготовленной кормилице. Через 8-14 дней после рождения у мышат брали образец ткани, выделяли ДНК и анализировали наличие трансгена методом ПЦР.
7. Анализ наличия трансгена в геноме мышей методом ПЦР. ДНК для ПЦР выделяли из тканей по стандартному протоколу. Амплификацию фрагментов ДНК проводили с помощью набора GenPak™ PCR Core (Isogene) в присутствии 10 пМ праймеров hACE-screen-forv (SEQ ID N0:2) и hACE-screen-rev (SEQ ID NO: 3) в следующих режимах: денатурация 95°С - 3 мин; далее следовало 35 циклов: 95°С - 40 сек, 58°С - 40 сек; 72°С - 40 сек; и последний синтез 72°С - 2 мин. Кроме того, проводили ПЦР с парой праймеров к STOP-кассете (StopC rt F, SEQ ID NO: 9 и StopC rt R, SEQ ID NO: 10) для повышения надежности результата.
Перечень последовательностей
<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт
биологии гена Российской академии наук (Institute of Gene Biology
Russian Academy of Sciences)
<120> Способ получения линии гуманизированных мышей, трансгенных по hACE2
<160> 10
<210> 1
<211> 2418
<212> последовательность гена hACE2 ДНК
<213> H.sapiens
<400> 1
atg tca agc tct tcc tgg ctc ctt ctc agc ctt gtt gct gta act gct gct cag tcc acc 60
att gag gaa cag gcc aag aca ttt ttg gac aag ttt aac cac gaa gcc gaa gac ctg ttc 120
tat caa agt tca ctt gct tct tgg aat tat aac acc aat att act gaa gag aat gtc caa 180
aac atg aat aat gct ggg gac aaa tgg tct gcc ttt tta aag gaa cag tcc aca ctt gcc 240
caa atg tat cca cta caa gaa att cag aat ctc aca gtc aag ctt cag ctg cag gct ctt 300
cag caa aat ggg tct tca gtg ctc tca gaa gac aag agc aaa cgg ttg aac aca att cta 360
aat aca atg agc acc atc tac agt act gga aaa gtt tgt aac cca gat aat cca caa gaa 420
tgc tta tta ctt gaa cca ggt ttg aat gaa ata atg gca aac agt tta gac tac aat gag 480
agg ctc tgg gct tgg gaa agc tgg aga tct gag gtc ggc aag cag ctg agg cca tta tat 540
gaa gag tat gtg gtc ttg aaa aat gag atg gca aga gca aat cat tat gag gac tat ggg 600
gat tat tgg aga gga gac tat gaa gta aat ggg gta gat ggc tat gac tac agc cgc ggc 660
cag ttg att gaa gat gtg gaa cat acc ttt gaa gag att aaa cca tta tat gaa cat ctt 720
cat gcc tat gtg agg gca aag ttg atg aat gcc tat cct tcc tat atc agt cca att gga 780
tgc ctc cct gct cat ttg ctt ggt gat atg tgg ggt aga ttt tgg aca aat ctg tac tct 840
ttg aca gtt ccc ttt gga cag aaa cca aac ata gat gtt act gat gca atg gtg gac cag 900
gcc tgg gat gca cag aga ata ttc aag gag gcc gag aag ttc ttt gta tct gtt ggt ctt 960
cct aat atg act caa gga ttc tgg gaa aat tcc atg cta acg gac cca gga aat gtt cag 1020
aaa gca gtc tgc cat ccc aca gct tgg gac ctg ggg aag ggc gac ttc agg atc ctt atg 1080
tgc aca aag gtg aca atg gac gac ttc ctg aca gct cat cat gag atg ggg cat atc cag 1140
tat gat atg gca tat gct gca caa cct ttt ctg cta aga aat gga gct aat gaa gga ttc 1200
cat gaa gct gtt ggg gaa atc atg tca ctt tct gca gcc aca cct aag cat tta aaa tcc 1260
att ggt ctt ctg tca ccc gat ttt caa gaa gac aat gaa aca gaa ata aac ttc ctg ctc 1320
aaa caa gca ctc acg att gtt ggg act ctg cca ttt act tac atg tta gag aag tgg agg 1380
tgg atg gtc ttt aaa ggg gaa att ccc aaa gac cag tgg atg aaa aag tgg tgg gag atg 1440
aag cga gag ata gtt ggg gtg gtg gaa cct gtg ccc cat gat gaa aca tac tgt gac ccc 1500
gca tct ctg ttc cat gtt tct aat gat tac tca ttc att cga tat tac aca agg acc ctt 1560
tac caa ttc cag ttt caa gaa gca ctt tgt caa gca gct aaa cat gaa ggc cct ctg cac 1620
aaa tgt gac atc tca aac tct aca gaa gct gga cag aaa ctg ttc aat atg ctg agg ctt 1680
gga aaa tca gaa ccc tgg acc cta gca ttg gaa aat gtt gta gga gca aag aac atg aat 1740
gta agg cca ctg ctc aac tac ttt gag ccc tta ttt acc tgg ctg aaa gac cag aac aag 1800
aat tct ttt gtg gga tgg agt acc gac tgg agt cca tat gca gac caa agc atc aaa gtg 1860
agg ata agc cta aaa tca gct ctt gga gat aaa gca tat gaa tgg aac gac aat gaa atg 1920
tac ctg ttc cga tca tct gtt gca tat gct atg agg cag tac ttt tta aaa gta aaa aat 1980
cag atg att ctt ttt ggg gag gag gat gtg cga gtg gct aat ttg aaa cca aga atc tcc 2040
ttt aat ttc ttt gtc act gca cct aaa aat gtg tct gat atc att cct aga act gaa gtt 2100
gaa aag gcc atc agg atg tcc cgg agc cgt atc aat gat gct ttc cgt ctg aat gac aac 2160
agc cta gag ttt ctg ggg ata cag cca aca ctt gga cct cct aac cag ccc cct gtt tcc 2220
ata tgg ctg att gtt ttt gga gtt gtg atg gga gtg ata gtg gtt ggc att gtc atc ctg 2280
atc ttc act ggg atc aga gat cgg aag aag aaa aat aaa gca aga agt gga gaa aat cct 2340
tat gcc tcc atc gat att agc aaa gga gaa aat aat cca gga ttc caa aac act gat gat 2400
gtt cag acc tcc ttt tag 2418
<210> 2
<211> 19
<212> ДНК
<213> artifficial sequence
<220> прямой праймер
<223> hACE-screen-forv праймер для поиска трансгенных мышей
<400> 2
ctggacccta gcattggaa 19
<210> 3
<211> 20
<212> ДНК
<213> artifficial sequence
<220> обратный праймер
<223> hACE-screen-rev праймер для поиска трансгенных мышей
<400> 3
gaaacagggg gctggttagg 20
<210> 4
<211> 22
<212> ДНК
<213> artifficial sequence
<220> обратный праймер
<223> d(T)16 праймер для синтеза кДНК гена hACE2 методом обратной
транскрипции
<400> 4
tttttttttt tttttt 16
<210> 5
<211> 27
<212> ДНК
<213> artifficial sequence
<220> прямой праймер
<223> hACE_5_fwd праймер для предварительной амплификации открытой рамки
считывания гена hACE2
<400> 5
agtctaggga aagtcattca gtggatg 27
<210> 6
<211> 25
<212> ДНК
<213> artifficial sequence
<220> обратный праймер
<223> hACE_3_rev праймер для предварительной амплификации открытой рамки
считывания гена hACE2
<400> 6
aatgaagatg ctctctcctt ggcca 25
<210> 7
<211> 29
<212> ДНК
<213> artifficial sequence
<220> прямой праймер
<223> hACE2-F-BshTI праймер для амплификации открытой рамки считывания
гена hACE2 и внесения рестриктного сайта BshTI для переноса в вектор NIF
<400> 7
attaaccggt atgtcaagct cttcctggc 29
<210> 8
<211> 33
<212> ДНК
<213> artifficial sequence
<220> обратный праймер
<223> hACE2-R-MluI праймер для амплификации открытой рамки считывания
гена hACE2 и внесения рестриктного сайта MluI для переноса в вектор NIF
<400> 8
attaacgcgt ctaaaaggag gtctgaacat cat 33
<210> 9
<211> 20
<212> ДНК
<213> artifficial sequence
<220> прямой праймер
<223> StopC rt F праймер к STOP-кассете для поиска трансгенных мышей
<400> 9
accgttgttt ccaccgaaga 20
<210> 10
<211> 20
<212> ДНК
<213> artifficial sequence
<220> обратный праймер
<223> StopC rt R праймер к STOP-кассете для поиска трансгенных мышей
<400> 10
caataacaac aacggcggct 20