ЦЕЛЕВАЯ ГЕННАЯ ИНТЕГРАЦИЯ ГЕНОВ-ИНГИБИТОРОВ NK ДЛЯ УЛУЧШЕННОЙ ИММУННОЙ КЛЕТОЧНОЙ ТЕРАПИИ

1. Способ получения сконструированных первичных иммунных клеток для клеточной иммунотерапии, включающий:
- получение популяции клеток, содержащей Т-клетки,
- интродукцию указанных Т-клеток в пропорции:
i) по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты, содержащей экзогенную полинуклеотидную последовательность, которая должна быть интегрирована в выбранный эндогенный локус для кодирования по меньшей мере одного ингибитора клеток NK,
ii) по меньшей мере одного специфического в отношении последовательности реагента, который специфически нацеливается на указанный выбранный эндогенный локус,
где указанную экзогенную полинуклеотидную последовательность инсертируют путем направленной генной интеграции в указанный эндогенный локус.
2. Способ по п. 1, в котором указанный специфический в отношении последовательности реагент является нуклеазой.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором указанную направленную генную интеграцию осуществляют посредством гомологичной рекомбинации или негомологичного соединения концов.
4. Способ по любому из пп. 1-3, в котором указанную экзогенную полинуклеотидную последовательность интегрируют под контроль транскрипции эндогенного промотора, присутствующего в указанном локусе.
5. Способ по п. 4, в котором указанный эндогенный локус является локусом, экспрессирующим компонент главного комплекса гистосовместимости I класса (ГКГ I), такого как β2m.
6. Способ по п. 5, в котором указанная инсерция указанной экзогенной последовательности инактивирует экспрессию β2m в указанном эндогенном локусе.
7. Способ по любому из пп. 1-4, в котором указанный эндогенный промотор выбран по активности во время активации иммунных клеток.
8. Способ по любому из пп. 1-7, в котором указанный эндогенный промотор в указанном эндогенном локусе является промотором, который отвечает за активацию Т-клеток, например одним из промоторов, перечисленных в табл. 6.
9. Способ по любому из пп. 1-8, в котором указанные Т-клетки наделены химерным антигенным рецептором (CAR).
10. Способ по п. 9, в котором экзогенные последовательности, кодирующие указанный химерный антигенный рецептор (CAR), интегрированы в локус TCR.
11. Способ по п. 10, в котором указанные экзогенные последовательности, кодирующие указанный химерный антигенный рецептор (CAR), предотвращают экспрессию эндогенных последовательностей TCR.
12. Способ по любому из пп. 9-11, в котором активность указанного эндогенного промотора в указанном эндогенном локусе отвечает за активацию Т-клеток через химерный антигенный рецептор (CAR).
13. Способ по любому из пп. 1-12, в котором указанный специфический эндонуклеазный реагент выбран из РНК- или ДНК-направляемой эндонуклеазы, например Cas9 или Cpf1, РНК-guide или ДНК-guide, TAL-эндонуклеазы, цинк-пальцевой нуклеазы, хоуминг-эндонуклеазы или какой-либо их комбинации.
14. Способ по любому из пп. 1-13, в котором в котором указанная экзогенная последовательность, кодирующая ингибиторы NK, предпочтительно содержит последовательности, кодирующие неполиморфные молекулы класса 1, например HLA-G или HLA-E, или их фрагмент/фрагменты, содержащий/содержащие эпитоп их тяжелой цепи.
15. Способ по любому из пп. 5-14, в котором указанная экзогенная последовательность при интеграции в эндогенный локус β2m приводит к экспрессии HLA-E или HLA-G или их фрагмента, слитого с фрагментами β2m.
16. Способ по п. 15, в котором указанное слияние HLA-E или HLA-G или их фрагмента с фрагментами β2m приводит к экспрессии димера или тримеров HLA-E или HLA-G.
17. Способ по любому из пп. 1-13, в котором указанная экзогенная последовательность, кодирующая ингибиторы NK, предпочтительно содержит последовательности, кодирующие вирусные эвазины или фрагмент/фрагменты, содержащий/содержащие их эпитоп, например из UL16 (также обозначаемый ULBP1 - Uniprot ref.:#Q9BZM6).
18. Способ по любому из пп. 1-17, в котором указанные Т-клетки являются первичными Т-клетками, предпочтительно первичными Т-клетками человека.
19. Сконструированные Т-клетки, получаемые способом по любому из пп. 1-18.
20. Сконструированные Т-клетки, которые содержат экзогенную последовательность, кодирующую ингибитор NK, которая была интегрирована под контроль промотора транскрипции эндогенного гена.
21. Сконструированные Т-клетки по любому из пп. 19 или 20, в которых указанный промотор эндогенного гена выбран в одном из локусов, перечисленных в таблице 6.
22. Сконструированные Т-клетки по любому из пп. 19-21, в которых указанная экзогенная последовательность, кодирующая ингибитор NK, интегрирована в локус β2m.
23. Сконструированные Т-клетки по любому из пп. 19-21, в которых указанные Т-клетки наделены химерным антигенным рецептором.
отрицательный
отрицательный
24. Сконструированные Т-клетки по п. 23, которые имеют генотип [TCR][β2m].
25. Сконструированные Т-клетки по п. 23 или 24, в которых экзогенная последовательность/последовательности, кодирующая/кодирующие указанный CAR, интегрированы в локус TCR.
26. Сконструированные Т-клетки по любому из пп. 19-25, в которых указанные Т-клетки являются первичными клетками.
27. Сконструированные Т-клетки по любому из пп. 19-26 для применения в лечении рака или инфекции.
28. Терапевтически эффективная популяция иммунных клеток, включающая по меньшей мере 30%, предпочтительно 50%, более предпочтительно 80% сконструированных Т-клеток по любому из пп. 19-27.
29. Терапевтически эффективная популяция иммунных клеток по п. 28, в которой по меньшей мере 30%, предпочтительно 50%, более предпочтительно 80% клеток происходят от донора, предпочтительно одного донора.
30. Популяция первичных иммунных клеток по п. 29, в которой более 50% указанных иммунных клеток являются TCR-отрицательными Т-клетками.
31. Популяция первичных иммунных клеток по любому из пп. 28-30, где более 50% указанных иммунных клеток являются CAR-положительными клетками.
32. Фармацевтическая композиция, содержащая популяцию сконструированных иммунных клеток по любому из пп. 28-31.
33. Способ лечения пациента, нуждающегося в таком лечении, включающий:
- получение популяции сконструированных первичных иммунных клеток по любому из пп. 28-32,
- необязательно очистку или сортировку указанных сконструированных первичных иммунных клеток,
- активацию указанной популяции сконструированных первичных иммунных клеток до или после инфузии указанных клеток указанному пациенту.
34. Способ по п. 33, в котором указанного пациента лечат от рака.
35. Способ по п. 33, в котором указанного пациента лечат от инфекции.
36. Способ идентификации соответствующей последовательности, кодирующей ингибитор NK, экспрессируемый в Т-клетке, включающий по меньшей мере следующие стадии:
- получения Т-клеток, в которых экспрессия как TCR, так и β2m репрессирована и/или инактивирована,
- включения последовательности-кандидата, кодирующей предполагаемый ингибитор NK, в эндогенный локус под контроль эндогенного промотора в указанной Т-клетке,
- культивирование полученных сконструированных Т-клеток в присутствии клеток NK.
37. Способ идентификации соответствующей последовательности, кодирующей ингибитор NK, экспрессируемый в Т-клетке, включающий по меньшей мере следующие стадии:
- получения Т-клеток, в которых экспрессия TCR репрессирована или инактивирована,
- инактивации экспрессии β2m в указанных Т-клетках путем включения последовательности-кандидата, кодирующей предполагаемый ингибитор NK в локусе β2m, причем экспрессия указанного предполагаемого ингибитора NK находится под контролем транскрипции эндогенного промотора указанного локуса β2m,
- культивирования полученных сконструированных Т-клеток в присутствии клеток NK.
38. Способ по п. 36 или 37, который дополнительно содержит стадию:
- наделения указанных Т-клеток химерным антигенным рецептором.
39. Способ по любому из пп. 36-38, который дополнительно содержит стадии:
- сравнения выживаемости указанных получаемых сконструированных Т-клеток с той же самой неэкспрессирующей указанной последовательностью-кандидатом,
- необязательно отбора и конструирования клеток, которые более устойчивы к клеткам NK.