Изучение противоопухолевой активности днк из молок лососевых рыб и некоторых ее механизмов в эксперименте

позиции отростка относят к противопоказаниям лапароскопической аппендэктомии. В хирургических клиниках 3-й городской и 11-й городской больниц за последние два года произведено 5 лапароскопических аппендзктомий при пятой позиции расположения червеобразного отростка. При аппендэктомии как открытым, так и закрытым способом обязательно требуется рассечение заднего листка париетальной брюшины и выведение червеобразного отростка в брюшную полость.

Литература

1. Абдишкуров A.A. и др. // Хирургия. 1999. № 12. С. 58.

2. Арсений А.К. Диагностика острого аппендицита. Кишенев, 1978. 123 с.

3. Глухов В.Н., Чекунова Е.В., Кожевников В.А. // Хирургия. 1987. №3. С. 35-37.

В литературе последних лет имеются публикации о противоопухолевой активности некоторых препаратов экзогенных дезоксирибонуклеиновых кислот природного происхождения, в основном полученных из молок осетровых рыб, как фармакопейных, так и выпускаемых в виде биологически активных добавок (БАД) к пище (деринат, "Биостим") [2, 3, 5,7, 8].

Противоопухолевая защита организма является многокомпонентной, в которой существенную роль играет система иммунитета, в основном Т- клеточное ее звено. Показано, что препараты нуклеиновых кислот, обладающие противоопухолевым действием, обеспечивают его преимущественно путем реализации своих иммуномодулирующих свойств [1, 3,5, 7,8].

На Дальнем Востоке широкое распространение получила ДНК из молок лососевых рыб, разработан-

4. Гурин А.И. // Хирургия. 1960. №4. С. 92-96.

5. Десков А.Н. // Труды Хаб. мединститута: Сб. IX. Хабаровск, 1948. С. 52-53.

6. Исаков Ю.Ф., Степанов Э.А., Дронов А.Ф. Острый аппендицит в детском возрасте. М., 1980. С. 189.

7. Ленушкин А.И., Ворохобов Л.А., Слуцкая С.Р. Острый аппендицит у детей. М.: Медицина, 1964. С. 202.

8. Муканов У.М. Острый аппендицит у лиц пожилого и старческого возраста: Автореф. дис. ...канд. мед. наук. Караганда, 1972. 20 с.

9. Резницкий М.И. Киев: Здоровья, 1966. С. 161-165.

10. Рычковский Г.Ф. Острый аппендицит у женщин: Автореф. дис.... канд. мед. наук. Челябинск, 1978. 15 с.

11. Савельев B.C. Рук-во по неотложной хирургии органов брюшной полости. М., 1986. С. 66-121.

пая учеными ТИНРО-центра и выпускаемая в виде биологически активной добавки к пище (БАД). БАД ДНК обладает многогранным положительным действием на организм человека, в том числе иммуномо-дулирующими свойствами [2, 4, 10]. В предыдущих работах нами было показано антиинфекционное, радиопротекторное, иммуноадъювантное действие БАД ДНК [2, 4, 10].

Целью настоящей работы явилось изучение противоопухолевых свойств БАД ДНК из молок лососевых рыб и некоторых механизмов его действия в эксперименте.

Известно, что противоопухолевая активность препаратов может быть обусловлена цитотоксической активностью изучаемого вещества (ЦТА), поэтому на первом этапе работы мы исключали ЦТА ДНК в экс-

УДК 612.06:557.19:639.211

Л.Н. Федянина, H.H. Беседнова, Д.Л. Аминин, Л.М. Эпштейн, Т.К. Каленик

ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ ДНК ИЗ МОЛОК ЛОСОСЕВЫХ РЫБ И НЕКОТОРЫХ

ЕЕ МЕХАНИЗМОВ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, г. Владивосток

перимснтах in vitro на штамме клеток мышиной ас-цитной карциномы Эрлиха. Па втором этане работы изучали противоопухолевую активность препарата in vivo на мышах с асцитной опухолью Эрлиха и возможные механизмы ее осуществления, в частности, влияние ДНК на Т- клеточное звено иммунитета, которое оценивали по наиболее показательным его критериям — реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ), гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), модуляции продукции цитокинов в суперна-тантах крови доноров.

Материалы и методы

БАЛ ДНК из молок лососевых рыб получена учеными ФГУГ1 "Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр" (ТИНРО-центр). В ее состав входит 79,02% ДНК, 7,8% белка, 2,1 % липи-дов и 10,68% воды. Молекулярная масса препарата составляет 270-500 кДа [4).

Исследование противоопухолевой активности препарата in vitro. В экспериментах использовали музейный тстраплоидный штамм клеток мышиной асцитной карциномы Эрлиха, полученный из Всесоюзного онкологического центра (ВОНЦ) РАМН. Клетки пассировали в брюшной полости белых беспородных мышей обоего пола весом 18-20 г [9] и отбирали на 7-10 день после инокуляции опухоли. Для этого мышей умерщвляли методом перивисцеральной дислокации и шприцем собирали асцитическую жидкость, содержащую опухолевые клетки. Клетки дважды отмывали от экссудата центрифугированием в растворе Дульбекко [11], а затем ресуспендировали в физиологическом растворе, не содержащем сыворотки. Подсчет количества клеток проводили в гемоци-тометрс фирмы "Sigma" (США). Жизнеспособность клеток оценивали при помощи раствора трипаново-го синего, под микроскопом подсчитывали количество погибших (окрашенных) и живых клеток (неокрашенных) и определяли процент жизнеспособных. Для экспериментов отбирали суспензию с содержанием живых клеток не менее 90%. Конечная концентрация клеток в инкубационной среде составляла 2,5-Зх 101' кл./мл. Для определения цитотоксичсской активности препарата использовали метод окрашивания мертвых клеток флуоресцентным красителем (бромистый этидий) с некоторыми модификациями [13]. Интенсивность флуоресценции бромистого эти-дия в погибших клетках измеряли с помощью флуоресцентного планшетного спектрофотометра "Fluoroscan Accent" (Финляндия). Все эксперименты повторяли трижды. Статистическую обработку результатов и построение графиков проводили с помощью программы "Sigma Plot 3.02" ("Jandel Scientific", США).

Исследование противоопухолевой активности препарата in vivo. Противоопухолевую активность изучали в экспериментах на неинбредных мышах, самцах, с асцитной формой карциномы Эрлиха, массой 18-20 г, в соответствии с рекомендациями ВОНЦ, выполняя все правила, предусмотренные Приказом Министерства здравоохранения № 755 от 12.08.1977.

В экспериментах использовали две дозы БАД ДНК — 10 и 100 мг/кг веса мыши. Противоопухоле-

Резюме

I

В статье представлены материалы по изучению противоопухолевой активности дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) из молок лососевых рыб в экспериментах на культуре клеток in vitro и на модели перевиваемой опухоли Эрлиха in vivo. Установлено, что ДНК увеличивает среднюю продолжительность жизни мышей с перевиваемой опухолью, но не обладает прямым цитоток-сическим влиянием на клетки. Показано, что действие препарата обусловлено влиянием на иммунную систему животных, в основном на Т- клеточное звено иммунитета. ДНК умеренно стимулирует реакцию бласттрансформации лимфоцитов, реакцию гиперчувствительности замедленного типа, модулирует уровень цитокинов.

L.N. Fedyanina, N.N. Besednova, D.L. Aminin, L.M. Epshtein, Т.К. Kalenik

ANTINEOPLASTIC ACTIVITY PROCESS

OF SALMON SOFT ROE DNA IN OPERATION

Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Russian Academy of Medical Sciences, Siberian Branch, Vladivostok

Research data by Antineoplastic activity of salmon soft i roe DNA basing on cell culture in vitro experiment and Er-lich's re-inoculated tumour in vivo are presented in the given article. DNA is found to prolong mice average life period with the re-inoculated tumour, however failed to have direct cytotoxic influence to the cells. The preparation effect is showed to be caused with the influence to animals' immune system, immunity of T-cell link mainly. DNA stimulates moderately lymphocytes blasttransformation process, j hypersensitivity of delayed type reaction and modulates cytokines level.

вую активность субстанции изучали в соответствии с двумя схемами введения препарата: профилактической (мышам за 7 дн. до инокуляции опухоли вводили ежедневно подкожно в бедро по 0,1 мл ДНК, на 7 день ипокулировали клетки опухоли) и лечебной (мышам инокулировали опухоль, а затем на протяжении семи дней таким же образом вводили ДНК). В каждой группе опытной и контрольной было 7 мышей в соответствии с рекомендациями ВОНЦ (7-15 животных) по работе с экспериментальной опухолью Эрлиха [9]. Контрольная группа мышей получала по 0,1 мл физиологического раствора. Клетки вводили внутрибрюшинно по 0,5 мл каждому животному. Конечная доза опухолевых клеток составляла 1-1,5x10е кл. Среднюю продолжительность жизни (СПЖ) мышей определяли общепринятым методом.

Клеточное звено иммунитета оценивали по реакциям ГЗТ [14] и бласттрансформации лимфоцитов [6]. Продукцию цитокинов изучали в супернатантах крови практически здоровых людей-доноров по методу твердофазного иммуноферментного анализа с помощью наборов "Duoset" ("Cambridge", USA). [12].

Полученные результаты обрабатывали статистически с применением компьютерной программы "Статистика 5".

Таблица 1

Влияние различных доз ДНК на спонтанную и митогениндуцированную пролиферацию лимфоцитов

Группа Включение 3Н-тимидина, имп/мин

Снонтанная пролиферация лимфоцитов ИС Митогениддуци-ровапная пролиферация лимфоцитов ИС

Контроль 878±95 - 9995±721 -

днк- 1 мг/мл 1230+125* 1,4 12350±750* 1,2

ДНК-10 мг/мл 1548±98*** 1,8 15525±1230*** 1,55

днк- 100 мг/мл 1590±102*** 1,8 18230+1150*** 1,8

Результаты и обсуждение

При определении прямого цитотоксического влияния препарата на суспензию клеток мышиной асцит-ной карциномы Эрлиха было установлено, что ДНК из молок лососевых рыб не обладает цитотоксичес-кой активностью в широком диапазоне концентраций 0,2-200 мкг/мл.

Однако при изучении противоопухолевых свойств ДНК in vivo было определено, что исследуемая субстанция увеличивает СПЖ мышей, инфицированных асцитной формой карциномы Эрлиха, которая составляет обычно 12-20 дн. [9]. В наших экспериментах в контрольной группе СПЖ мышей составила 10,00±0,6 дн. В опытных группах продолжительность жизни мышей-опухоленосителей зависела от дозы и схемы введения ДНК. Препарат, применяемый в соответствии с профилактической схемой в дозах 10 мг/кг и 100 мг/кг, достоверно (р<0,05) увеличивал продолжительность жизни мышей на 37,2% (13,7+1,2) дн. и 18,6% (11,8±0,3) дн. соответственно. При введении БАД ДНК в дозе 100 мг/кг по лечебной схеме, СПЖ достоверно увеличивалась на 18,6% (11,8±0,5), а в дозе 10 мг/кг наблюдалась тенденция к ее увеличению на 24,3% (р>0,05).

Таким образом, максимальный противоопухолевый эффект БАД ДНК (увеличение СПЖ на 37,2%) наблюдался при его введении по профилактической схеме в дозе 10 мг/кг. При введении препарата в дозе 100 мг/кг, как по лечебной, так и по профилактической схеме, СПЖ мышей увеличивалась, но в два раза меньше, чем в предыдущем случае (на 18,6%). Учитывая отсутствие цитотоксической активности ДНК, мы пришли к заключению, что ее действие обусловлено влиянием на иммунную систему, вероятнее всего, по данным литературы [ 1,3,7,8], на Т-клеточный иммунитет, что и проверяли в последующих экспериментах.

В реакции ГЗТ было установлено, что БАД в дозе 10 мг/кг оказывает более выраженное действие на индуктивную фазу реакции. При введении за 3 сут до сенсибилизации мышей прирост массы лапки составил 29,4+3,0%, по сравнению с данными контрольной группы, - 16,4±0,6 (р<0,001) и за сутки - 31,7+3,9 и 18,9±0,9% соответственно (р<0,01). Показатели прироста массы лапки в продуктивную фазу ГЗТ составили в опыте 26,5+2,9%, р<0,05, в контроле —

Таблица 2

Влияние ДНК на продукцию цитокинов клетками крови здоровых доноров, пг/мл

Исследуемые группы Дитокины

TNF IFN- IL-10

Группа с исходно низкими показателями Контроль 37,9 ±8,9 8,8 ±1,1 4,7 ±0,7

ДНК 95,9 + 17,6** 29,4 ±6,4** 8,7 ±1,3*

Группа с исходно средними показателями Контроль 200,8 ±35,5 18,5 ±1,1 24,2 ±4,6

ДНК 283,9 +56,7 19,3 ±3,3 27,8 ±13,4

Группа с исходно высокими показателями Контроль 1045,2 ±265,6 69,4 ±16,7 146,2 ±13,2

днк 504,6 +110,5* 40,2 ±11,3* 58,8 ±15,7*

Примечания. * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001.

19,4+1,1% (одновременное введение с сенсибилизирующей дозой) и 27,4±3,2 и 18,1±0,8 (р<0,05) соответственно (перед введением разрешающей дозы). Усиление реакции ГЗТ, наблюдаемое в 1 фазу клеточного иммунного ответа, вероятно, обусловлено влиянием БАД на процессы активации С04+-Т-кле-ток и дифференцировки их в Тх1.

При изучении влияния ДНК на РБТЛ было установлено, что ДН К дозозависимо, в основном — 10 и 100 мг/мл, умеренно стимулирует как спонтанную, так и митогениндуцированную РБТЛ (табл. 1).

На следующем этапе работы мы изучали способность клеток крови доноров продуцировать цитоки-ны: ТКТос, I РКу, 1Г-10. Оппозиционные пулы цитокинов 1ГИу и П.-10 рассматриваются как маркеры ТЬ 1 и ТЬ 2 типа лимфоцитов, первый их которых усиливает клеточно-опосредованный иммунный ответ, второй — гуморальный. [1,7,8,]. ТОТа обладает ярко выраженной плейотропностью, вовлечен как в эффекторное, так и в регуляторное звено организма человека. Доза ДНК, подобранная экспериментально, составляла 50 мкг/мл (табл. 2).

Интенсивность продукции цитокинов, вырабатываемых в контрольных культурах, отличалась заметной гетерогенностью у различных доноров, что соответствует литературным данным, и составила: 10 - от 0,1 до 199,96 пг/мл; ТЫБа - от 3,1 до 2223,44 пг/мл; 1РЫу — от 3,42 до 115,41 пг/мл. Для более объективной интерпретации результатов все показатели условно делили на 3 группы (ориентируясь на исходный уровень спонтанной секреции цитокинов): в 1 группу были включены доноры с исходно низкими показателями, во 2 группу — со средними, в 3 группу входили доноры с исходно высокими показателями. БАД ДНК оказывало модулирующее действие на способность всех клеток к продукции цитокинов: при исходно низких показателях обеспечивало повышение их продукции; в группах с высокой концентрацией цитокинов подавляло их; при средних значениях практически не меняло их уровня. Действие БАД на цитокининдуцирующуюактивность ТЫ (1БЫу ) и ТЬ2-клеток (1Ь-10) несколько различалось. В большей степени ДНК стимулировала продукцию 1РИу (ИС=2,6±0,7), нежели 1Б-10

(И02,0±0,2), что дает основание предполагать, что ДНК преимущественно модулирует иммунный ответ по Т-клеточиому типу.

Выводы

1. ДНК дозозависимо, в основном— 10и 100мг/мл, умеренно стимулирует как спонтанную, так и митоге-ниндуцировапиую РБТЛ.

2. ДНК оказывает стимулирующее влияние на реакцию гиперчувствителыюсти замедленного типа. Наибольшая эффективность исследуемого вещества наблюдалась при введении за 3 сут и сутки до сенсибилизации мышей в дозе 10 мг/кг.

3. ДНК модулирует продукцию цитокинов клетками крови доноров in vitro: исходно низкая продукция цитокинов усиливается, исходно высокая ослабляется. В большей степени ДНК стимул ирует продукцию IFNy(H02,6+0,7), нежели IL-10 (ИС=2,0±0,2), что даст основание предполагать, что препарат способствует развитию клеточного иммунного ответа.

4. Действие ДНК на Т-систсму иммунитета обеспечивает ее противоопухолевое действие в эксперименте при введении в соответствии с профилактической схемой в дозе 10 мг/кг и лечебной в дозе 100 мг/кг.

Литература

1. Барышников А.Ю. // Практическая онкология. 2004. №3. С. 127-130.

2. Беседнова Н.Н, ЭпштейнЛ.М. Дезоксирибонук-леиновая кислота (ДНК) из молок рыб: перспективы

Понятие "ожоговая болезнь" включает как местное поражение обожженной кожи, так и сложный комплекс вторичных общих преобразований. Очень важно, что изменения органов, вторичные по своему существу, часто приобретают самостоятельное значение, определяя течение и исход термического повреждения. Известно, что одним из наиболее тяжелых осложнений ожоговой травмы являются эрозивно-яз-венные поражения желудочно-кишечного тракта (язвы Курлинга), часто сопровождающиеся кровоте-

клинического применения (в помощь практическому врачу). Владивосток: ТИНРО-ценгр, 2002. 38 с.

3. Каилина Э.Н., Вайнберг Ю.П. Деринат - природный иммуномодулятор для детей и взрослых. М.: Научная книга, 2005. 216 с.

4. Касьяпенко Ю.И., Эпштейн Л.М., Гажа А.К. и др.// Изв. ТИНРО. 1999. Т. 125. С. 139-146.

5. Пашук Л.К., Апрышко Е.М., Трещалина. // Хим. фарм. жури. 1995. Т. 29, №6. С. 61-64.

6. Петров Р.В., Хаитов P.M., Манько В.М. и др. М.: Фармакол. комитет, 1984.

7. Рыкова ЕЛО., Лактионов П.П., Власов В.В. // Успехи современной биологии. 2001. Т. 121, №2. С. 160-171.

8. Серебрянная Н.Б., Новик A.A. // Медицинская иммунология. 2001. Т.З, № 1. С. 27-34.

9. Софьина З.П. // Вопр. онкологии. 1976. Т. 22, №4. С. 82-96.

10. Федянина Л.Н., Потапова В.В., Иванушко Л.А. и др. // Здоровье и образование: Мат-лы Междунар. науч.-практ. конф. Пермь, 2003. С. 281-283.

11. Фрешни Р. Культура животных клеток. Методы. М.: Мир, 1989. С. 319.

12. De Groote D., Zangerle P.P., Gevaert Y. et al. // Cytokine. 1992. Vol. 4. P. 239-248.

13. Haugland R.P. Handbook of fluorescence probes and research chemicals. Sixth edition. Ed. Spence M.T.Z. Molecular Probes, Inc. 1996. P. 307.

14. Lagrannge P.H., MackanessJ.B., Miller Т.Е.//Exp. Med. 1974.V. 139. P. 528-542.

чениями, приводящими к высокой летальности. Благодаря исследованиям Г. Селье (1953), была установлена патогенетическая общность поражений слизистой ЖКТ при различных травмах и операциях, и связано их происхождение с действием стресса различной природы [2].

Исходя из этого, необходима комплексная многокомпонентная терапия ожоговой болезни с включением препаратов, повышающих адаптационные возможности организма. С этой целью был использован

УДК 617.161 - 03 :616.33 - 08]: 615.038]: 616.092.9 E.H. Романова, Л.П. Малежик

ВЛИЯНИЕ ЭПИТАЛОНА НА ТЕЧЕНИЕ ОЖОГОВОЙ БОЛЕЗНИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Читинская государственная медицинская академия, г. Чита