АНТИ-SIRPα АНТИТЕЛА
ANTI-SIRPα ANTIBODIES

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к анти-SIRPα антителам и применению этих антител в лечении рака, необязательно в комбинации с другими противораковыми терапевтическими средствами.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
С конца 1990-х годов терапевтические антитела стали доступны для лечения рака. Эти терапевтические антитела могут воздействовать на злокачественные клетки различными путями. Сигнальные пути, запускаемые связыванием антитела со своей мишенью на злокачественных клетках, приводят к подавлению клеточной пролиферации или апоптозу. Fc-область терапевтического антитела может запускать комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC), антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) и антитело-зависимый клеточный фагоцитоз (ADCP). Однако терапевтические антитела, используемые в качестве монотерапии, часто оказываются недостаточно эффективными. Одним из вариантов улучшения эффективности терапевтических антител является усиление ADCC и/или ADCP. Это было сделано путем улучшения сродства Fc-области к рецепторам Fcγ, например, с помощью аминокислотных замен (Richards et al. Mol. Cancer Ther. 2008, 7(8), 2517-2527) или путем воздействия на гликозилирование Fc-области (Hayes et al. J. Inflamm. Res. 2016, 9, 209-219).
Другим способом усиления ADCC и/или ADCP терапевтического антитела является комбинирование терапевтического антитела с антагонистическим антителом к сигнальному регуляторному белку α (анти-SIRPα) или анти-CD47-антителом (WO2009/131453). Когда CD47 связывается с ингибирующим иммунорецептором SIRPα, экспрессируемым на моноцитах, макрофагах, дендритных клетках и нейтрофилах, SIRPα передает ингибирующий сигнал, который предотвращает разрушение раковых клеток путем фагоцитоза или посредством других зависимых от Fc-рецепторов механизмов разрушения иммунных эффекторных клеток.
Опухолевые клетки используют активацию CD47 в качестве механизма, позволяющего избежать противоопухолевого иммунного ответа, индуцированного терапевтическими антителами. Анти-CD47 или анти-SIRPα антитела блокируют передачу ингибирующих сигналов, генерируемых через ось CD47-SIRPα, что приводит к усилению ADCC и/или ADCP.
Большинство клинических исследований, имеющих отношение к взаимодействию CD47-SIRPα, было сосредоточено на анти-CD47 антителах, как в качестве монотерапии, так и в качестве терапии в комбинации с терапевтическим антителом (Weiskopf. Eur. J. Cancer 2017, 76, 100-109). Количество исследований, направленных на изучение анти-CD47 антитела в качестве противораковых лекарственных средств, растут, несмотря на то что CD47 также экспрессируется на поверхности клеток большинства нормальных тканей.
о
in vitro
1
4
4
4
Имеется небольшая работа по изучению противораковой монотерапии или комбинированной терапии с помощью анти-SIRPα антител. Бльшая часть этой работы по изучению анти-SIRPα антител, выполненная с использованием мышиных анти-SIRPα антител, представляет собой механистические исследования, касающиеся взаимодействия CD47-SIRPα; например, мышиные 12C4 и 1.23A увеличивали опосредованную нейтрофилами ADCC трастузумаба в опсонизированных клетках SKBR3 (Zhao et al. PNAS 2011, 108(45), 18342-18347). В WO 2015/138600 раскрыто мышиное антитело KWAR23 к человеческому SIRPα и его химерный Fab-фрагмент, который усиливал фагоцитоз , т.е. цетуксимаб. В WO2018/026600 раскрыто гуманизированное KWAR23 с Fc-частью человеческого IgG, содержащей мутацию N297A. В WO2013/056352 раскрыты 29AM4-5 IgG и другие человеческие анти-SIRPα антитела класса IgG. 29AM4-5 IgG, вводимое три раза в неделю в течение четырех недель в дозе 8 мг/кг, уменьшало приживление лейкемических клеток первичной AML человека, инъецированных в правое бедро NOD-scid-gamma мышей (NSG).
BIT
1
1
SIRPα является членом семейства сигнальных регуляторных белков (SIRP), трансмембранных гликопротеинов с внеклеточными Ig-подобными доменами, присутствующими на иммунных эффекторных клетках. Домен SIRPα, связывающий NH2-терминальный лиганд, является высоко полиморфным (Takenaka et al. Nature Immun. 2007, 8(12), 1313-1323). Однако этот полиморфизм не оказывает значительного влияния на связывание с CD47. SIRPα (v1) и SIRPα (v2) являются двумя наиболее распространенными и наиболее расходящимися (отличающимися друг от друга 13 остатками) полиморфами (Hatherley et al. J. Biol. Chem. 2014, 289(14), 10024-10028). Другими биохимически охарактеризованными членами человеческого семейства SIRP являются SIRPβ и SIRPγ.
1
1
1v1
1v2
1
1
1
in vitro
SIRPβ не связывается с CD47 (van Beek et al. J. Immunol. 2005, 175 (12), 7781-7787, 7788-7789), при этом известны по меньшей мере два полиморфных варианта SIRPβ: SIRPβ (ENSP00000371018) и SIRPβ (ENSP00000279477). Хотя природный лиганд SIRPβ пока неизвестен, исследования  с использованием антител, специфических к SIRPβ, показывают, что связывание SIRPβ способствует фагоцитозу в макрофагах путем индукции фосфорилирования тирозиновых остатков DAP12, Syk и SLP-76 и последующей активации MEK-MAPK-сигнального каскада киназы легких цепей миозина (Matozaki et al. J. Biol. Chem. 2004, 279(28), 29450-29460).
SIRPγ экспрессируется на Т-клетках и активированных NK-клетках и связывается с CD47 со сродством в 10 раз более низким, чем с SIRPα. Взаимодействие CD47-SIRPγ имеет место во время контакта между антигенпрезентирующими клетками и Т-клетками, костимуляции активации Т-клеток и способствует пролиферации Т-клеток (Piccio et al. Blood 2005, 105, 2421-2427). Кроме того, взаимодействия CD47-SIRPγ играют роль в трансэндотелиальной миграции Т-клеток (Stefanisakis et al. Blood 2008, 112, 1280-1289).
1
BIT
Анти-SIRPα антитела, известные в данной области техники, менее пригодны для использования в моно- или комбинированной терапии, направленной на SIRPα, поскольку они либо не являются специфическими к человеческому SIRPα, либо являются слишком специфическими. Антитела предшествующего уровня техники KWAR23, SE5A5, 29AM4-5 и 12C4 не являются специфическими, так как они также связываются с человеческим SIRPγ. Связывание с SIRPγ, который экспрессируется на Т-клетках, может оказывать негативное влияние на пролиферацию и рекрутирование Т-клеток. Другие анти- SIRPα антитела имеют слишком ограниченную специфичность, например, 1.23A mAb распознает только полиморфный вариант SIRPα человеческого SIRPα, и не распознает вариант SIRPα, который преобладает по меньшей мере в кавказской популяции (X.W. Zhao et al. PNAS 2011, 108(45), 18342-18347).
Помимо использования анти-SIRPα антител для усиления ADCC терапевтического антитела, эти антитела также могут быть использованы для нацеливания непосредственно на типы рака, экспрессирующие SIRPα. Анти-SIRPα антитела, содержащие человеческий Fc дикого типа, могут быть пригодны для лечения рака, экспрессирующего SIRPα, такого как почечно-клеточный рак и злокачественная меланома, поскольку мышиные анти-SIRPα антитела, имеющие функциональную Fc-область, замедляли образование опухоли у мышей, которым инъецировали клетки Ренка (Renca) и клетки меланомы B16BL6, экспрессирующие SIRPα (Yanagita et al. JCI Insight 2017, 2(1), e89140).
1
BIT
В заключение следует отметить, что остается потребность в анти-SIRPα антителах, которые имеют низкий уровень связывания с SIRPγ, которые специфически связываются с обоими полиморфными вариантами SIRPα и SIRPα и которые могли бы использоваться в противораковой терапии либо отдельно, либо в комбинации с терапевтическими антителами.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к анти-SIRPα антителам, которые подходят для применения в противораковой терапии. Изобретение также относится к применению антител для лечения солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований у человека.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
1
1
1
1
Фиг. 1. Сравнение ADCC, измеренной в % цитотоксичности только трастузумаба (Tmab), трастузумаба в комбинации с мышиным анти-SIRPα антителом 12C4 (mu12C4), трастузумаба в комбинации с антителом, в котором вариабельные области мышиного 12C4 привиты на константную область человеческого IgG (12C4huIgG), и трастузумаба в комбинации с антителом, в котором вариабельные области мышиного 12C4 привиты на константную область человеческого IgG, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A (12C4huIgGLALA), измеренные на HER2-позитивных раковых клетках молочной железы SKBR3 с использованием человеческих нейтрофилов в качестве эффекторных клеток.
1
1
1
BIT
1
Фиг. 2. Сравнение % ADCC, относительно трастузумаба (установленного на 100%), комбинаций трастузумаба с анти-SIRPα антителами 1-9, имеющими константную область человеческого IgG, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A, анти-SIRPα антителом 12C4huIgGLALA (12C4LALA) и анти-CD47 антителом B6H12huIgGLALA (B6H12LALA) на клетках SKBR3. Залитые квадраты () являются значениями, измеренными с помощью нейтрофилов, полученных от доноров, имеющих вариант SIRPα, незалитые круги, (○), являются значениями, измеренными с помощью нейтрофилов, полученных от доноров, имеющих вариант SIRPα. Столбцы являются средними значениями по всем донорам; планки погрешностей представляют стандартное отклонение.
1
1
BIT
Фиг.3. Сравнение % ADCC, относительно только трастузумаба, комбинаций трастузумаба с анти-SIRPα антителами 4, 7, 10, 14 в различных концентрациях (кривые доза-ответ), имеющими константную область человеческого IgG, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A, и анти-SIRPα антителом 12C4huIgGLALA (12C4LALA) на клетках SKBR3. Нейтрофилы, полученные от двух доноров (△, ○), имели вариант SIRPα. Столбцы представляют собой среднее значение для двух доноров.
1
1
BIT
1
Фиг.4. Сравнение % ADCC, относительно только трастузумаба, комбинаций трастузумаба с анти-SIRPα антителами 4, 7, 10, 13, 14, 15 и 16, имеющими константную область человеческого IgG, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A, и анти-SIRPα антителом 12C4huIgGLALA (12C4LALA) на клетках SKBR3. Использовали нейтрофилы, полученные от доноров, имеющих вариант SIRPα (△, ▽, ◇), вариант SIRPα (d, ◓), и нейтрофилы, полученные от донора, вариант которого не был определен (). Столбцы являются средними значениями для доноров.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Не существует апробированных терапевтических средств, направленных против SIRPα, хотя было показано, что эта мишень играет важную роль в механизмах уклонения опухоли от иммунной системы. Кроме того, SIRPα экспрессируется на различных злокачественных клетках, что делает его потенциальным антигеном, ассоциированным с опухолью.
BIT
1
Настоящее изобретение относится к антагонистическим анти-SIRPα антителам, которые имеют специфическое связывание с двумя преобладающими полиморфными вариантами SIRPα и SIRPα, которые не связываются с SIRPγ и которые увеличивают ADCC и/или ADCP терапевтических антител.
1
2
1
1
Термин «антитело», используемый в настоящем описании, относится к моноклональному антителу (mAb), содержащему две тяжелые цепи и две легкие цепи. Антитела могут иметь любой изотип, такой как антитела IgA, IgE, IgG или IgM. Предпочтительно антитело представляет собой антитело IgG, более предпочтительно антитело IgG или IgG. Антитела могут быть химерными, гуманизированными или человеческими. Предпочтительно антитела по изобретению являются гуманизированными. Еще более предпочтительно, антитело представляет собой гуманизированное или человеческое антитело IgG, наиболее предпочтительно гуманизированное или человеческое mAb IgG. Антитело может иметь κ (каппа) или λ (лямбда) легкие цепи, предпочтительно κ (каппа) легкие цепи, т.е. гуманизированное или человеческое антитело IgG-к. Антитела могут содержать сконструированную константную область, т.е. могут быть введены одна или более мутаций, например, для увеличения периода полураспада и/или усиления или ослабления эффекторной функции.
Используемый в настоящем описании термин «моноклональное антитело» или «mAb» может относиться к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е., отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Антитела могут быть получены путем иммунизации животных смесью пептидов, представляющих желаемый антиген. В-лимфоциты выделяют и сливают с клетками миеломы, или отдельные В-лимфоциты культивируют в течение нескольких дней в присутствии кондиционированной среды и питающих клеток. Супернатанты миеломы или В-лимфоцитов, содержащие продуцированные антитела, тестируют для отбора подходящих В-лимфоцитов или гибридом. Моноклональные антитела могут быть получены из подходящих гибридом методом гибридомы, впервые описанным Köhler et al. Nature 1975, 256, 495-497. Альтернативно, для получения РНК подходящие В-клетки или клетки лимфомы могут быть лизированы, РНК может быть выделена, подвергнута обратной транскрипции и секвенирована. Антитела могут быть получены методами рекомбинантной ДНК в бактериальных, эукариотических клетках животных или растений (см., например, патент США № 4816567). «Моноклональные антитела» также могут быть выделены из фаговых библиотек антител методами, описанными в данной области техники, например, в Clackson et al. Nature 1919, 352, 624-628 и Marks et al. J. Mol. Biol. 1991, 222, 581-597.
2
Термин «антигенсвязывающий фрагмент», используемый в настоящем описании, включает фрагмент Fab, Fab' или F(ab'), одноцепочечное (sc) антитело, scFv, однодоменное (sd) антитело, диатело или минитело.
В гуманизированных антителах антигенсвязывающие, определяющие комплементарность области (CDR) в вариабельных областях (VR) тяжелой цепи (HC) и легкой цепи (LC), получают из антител не относящегося к человеку вида, обычно мыши, крысы или кролика. Эти не являющиеся человеческими CDR объединяют с человеческими каркасными областями (FR1, FR2, FR3 и FR4) вариабельных областей HC и LC таким образом, чтобы были сохранены функциональные свойства антител, такие как сродство и специфичность связывания. Выбранные аминокислоты в человеческих FR могут быть заменены соответствующими исходными аминокислотами не относящегося к человеку вида для улучшения сродства связывания при сохранении низкой иммуногенности. Альтернативно, выбранные аминокислоты исходных FR не относящегося к человеку вида заменяют соответствующими им человеческими аминокислотами для уменьшения иммуногенности при сохранении сродства связывания антитела. Таким образом, гуманизированные вариабельные области объединяют с человеческими константными областями.
CDR могут быть определены с помощью подхода Кабат (см. Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD., NIH publication no. 91-3242, pp. 662, 680, 689 (1991)), Чотиа (Chothia et al., Nature 1989, 342, 877-883) или IMGT (Lefranc, The Immunologist 1999, 7, 132-136). В контексте настоящего изобретения для указания положений в константных областях тяжелой цепи и легкой цепи антитела используется нумерация Eu. Выражение «нумерация Eu» относится к индексу Eu, как указано в Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD., NIH publication no. 91-3242, pp. 662, 680, 689 (1991).
Антагонистические антитела имеют сродство к конкретному антигену, и связывание этого антитела со своим антигеном подавляет функцию агониста или обратного агониста в отношении рецепторов. В данном случае связывание антагонистического анти-SIRPα антитела с SIRPα будет либо предотвращать связывание CD47 с SIRPα, либо нарушать ингибирующий сигнал, который запускается связыванием CD47 с SIRPα.
Антагонистические анти-SIRPα антитела могут связываться с тем же участком, с которым связывается CD47, предотвращая лигирование SIRPα с помощью CD47 и, следовательно, ингибируя сигнальный каскад, который отрицательно регулирует зависимые от Fc-рецепторов функции иммунных эффекторных клеток. Антагонистические анти-SIRPα антитела также могут связываться с участком SIRPα, который отличается от CD47-связывающего участка, т.е. с аллостерическим участком, и подавлять передачу ингибирующих сигналов SIRPα без прямого вмешательства в физическое взаимодействие CD47-SIRPα, например, путем изменения пространственной формы SIRPα. Это изменение пространственной формы предотвращает (ниже расположенную) передачу сигналов при связывании с CD47. Когда SIRPα связывается на аллостерическом участке, CD47 может все еще быть связанным с SIRPα, что может уменьшить доступность CD47 для связывания с тромбоспондином-1 (TSP-1). Лигирование TSP-1 с CD47 является важным, например, при отрицательной регуляции активации Т-клеток (Soto-Pantoja et al. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 2015, 50(3), 212-230).
D
D
off
on
D
off
on
D
D
50
Термин «сродство связывания», используемый в настоящем описании, относится к константе диссоциации (K) конкретного взаимодействия антиген-антитело. K представляет собой отношение скорости диссоциации (k) к скорости ассоциации (k). Следовательно, K равно k/k и выражается в виде молярной концентрации (M). Отсюда следует, что чем меньше значение K, тем сильнее сродство связывания. Как правило, значения K определяют методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR), обычно с помощью биосенсорной системы (например, Biacore), используя методы, известные в данной области техники (например, ES Day et al. Anal. Biochem. 2013, 440, 96-107). Термин «сродство связывания» также может относиться к концентрации антитела, которая обеспечивает половину максимально достижимого уровня связывания (ЕС), определенного, например, с помощью анализа ELISA или с помощью проточной цитометрии.
D
–7
–8
–9
–10
–11
Термин «специфическое связывание», используемый в настоящем описании, относится к связыванию антитела со своим антигеном с K обычно менее 10 М, например 10 М, 10 М, 10 М, 10 М или даже менее, определенной методом SPR при 25°C.
50
Термин «низкое сродство», используемый в настоящем описании, используется взаимозаменяемо с фразами «не связывает» или «не связывается» и относится к сродству связывания между антителом и его антигеном со значением ЕС, превышающим 1500 нг/мл, определенным с помощью анализа ELISA, или к отсутствию обнаруживаемого специфического связывания между иммобилизованным антигеном и антителом согласно данным SPR.
D
–10
–11
Термин «высокое сродство», используемый в настоящем описании, относится к сродству связывания между антителом и его антигеном с K обычно менее 10 М, 10 М или даже менее, определенной етодом SPR при 25°C.
В частности, настоящее изобретение относится к анти-SIRPα антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему определяющие комплементарность области (CDR) вариабельных областей (VR) тяжелой цепи (HC) и легкой цепи (LC), выбранные из группы, состоящей из:
а. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 1, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 2;
b. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 3, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 4;
c. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 5, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 6;
d. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 7, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 8;
e. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 9, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 10;
f. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 11, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 12;
g. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 13, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 14;
h. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 15, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 16; и
i. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 17, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 18,
причем CDR определены согласно нумерации Кабат.
Предпочтительно, настоящее изобретение относится к анти-SIRPα антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему определяющие комплементарность области (CDR) вариабельных областей (VR) тяжелой цепи (HC) и легкой цепи (LC), выбранные из группы, состоящей из:
а. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 3, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 4;
b. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 5, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 6;
c. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 7, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 8;
d. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 9, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 10;
e. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 11, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 12;
f. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 13, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 14;
g. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 15, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 16; и
h. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 17, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 18,
причем CDR определены согласно нумерации Кабат.
Более предпочтительно, настоящее изобретение относится к анти-SIRPα антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему CDR HCVR и LCVR, выбранные из группы, состоящей из:
а. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 3, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 4;
b. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 5, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 6;
c. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 7, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 8;
d. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 9, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 10; и
e. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 13, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 14,
причем CDR определены согласно нумерации Кабат.
Еще более предпочтительно, настоящее изобретение относится к анти-SIRPα антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему CDR HCVR и LCVR, выбранные из группы, состоящей из:
а. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 5, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 6;
b. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 7, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 8; и
c. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 13, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 14,
причем CDR определены согласно нумерации Кабат.
Наиболее предпочтительно, настоящее изобретение относится к анти-SIRPα антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему CDR HCVR и LCVR, выбранные из группы, состоящей из:
а. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 7, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 8; и
b. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 13, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 14,
причем CDR определены согласно нумерации Кабат.
BIT
1
В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к определенному выше анти-SIRPα антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, причем антитело демонстрирует специфическое связывание как с SIRPα, так и с SIRPα, но не связывается с SIRPγ.
BIT
D
1
D
D
1
D
–9
–7
–8
В более предпочтительном варианте осуществления анти-SIRPα антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с SIRPα с K ниже 10 М и связывается с SIRPα с K ниже 10 М, причем K измеряют методом SPR при 25°С. Предпочтительно, анти-SIRPα антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с SIRPα с K ниже 10 М.
BIT
1
D
D
–9
В другом предпочтительном варианте осуществления анти-SIRPα антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с SIRPα и SIRPα с K ниже 10 М, причем K измеряют методом SPR при 25°С.
BIT
1
D
BIT
D
1
D
–10
–10
–11
В еще более предпочтительном варианте осуществления анти-SIRPα антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с SIRPα и SIRPα с K ниже 10 М. Предпочтительно, анти-SIRPα антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с SIRPα с K ниже 10 М и с SIRPα с K ниже 10 М. Как правило, анти-SIRPα антитело, определенное выше, представляет собой химерное, гуманизированное или человеческое антитело. Предпочтительно, анти-SIRPα антитело представляет собой гуманизированное или человеческое антитело. Более предпочтительно, анти-SIRPα антитело представляет собой гуманизированное антитело. В конкретном варианте осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит HCVR и LCVR, выбранные из группы, состоящей из:
а. аминокислотной последовательности HCVR, приведенной в SEQ ID NO: 30, и аминокислотной последовательности LCVR, приведенной в SEQ ID NO: 31;
b. аминокислотной последовательности HCVR, приведенной в SEQ ID NO: 32, и аминокислотной последовательности LCVR, приведенной в SEQ ID NO: 33;
c. аминокислотной последовательности HCVR, приведенной в SEQ ID NO: 34, и аминокислотной последовательности LCVR, приведенной в SEQ ID NO: 8;
d. аминокислотной последовательности HCVR, приведенной в SEQ ID NO: 35, и аминокислотной последовательности LCVR, приведенной в SEQ ID NO: 36;
e. аминокислотной последовательности HCVR, приведенной в SEQ ID NO: 35, и аминокислотной последовательности LCVR, приведенной в SEQ ID NO: 37;
f. аминокислотной последовательности HCVR, приведенной в SEQ ID NO: 13, и аминокислотной последовательности LCVR, приведенной в SEQ ID NO: 38; и
g. аминокислотной последовательности HCVR, приведенной в SEQ ID NO: 13, и аминокислотной последовательности LCVR, приведенной в SEQ ID NO: 37.
В предпочтительном варианте осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит аминокислотную последовательность HCVR, приведенную в SEQ ID NO: 30, и аминокислотную последовательность LCVR, приведенную в SEQ ID NO: 31.
В другом предпочтительном варианте осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит аминокислотную последовательность HCVR, приведенную в SEQ ID NO: 32, и аминокислотную последовательность LCVR, приведенную в SEQ ID NO: 33.
В другом предпочтительном варианте осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит аминокислотную последовательность HCVR, приведенную в SEQ ID NO: 34, и аминокислотную последовательность LCVR, приведенную в SEQ ID NO: 8.
В другом предпочтительном варианте осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит аминокислотную последовательность HCVR, приведенную в SEQ ID NO: 35, и аминокислотную последовательность LCVR, приведенную в SEQ ID NO: 36.
В другом предпочтительном варианте осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит аминокислотную последовательность HCVR, приведенную в SEQ ID NO: 35, и аминокислотную последовательность LCVR, приведенную в SEQ ID NO: 37.
В другом предпочтительном варианте осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит аминокислотную последовательность HCVR, приведенную в SEQ ID NO: 13, и аминокислотную последовательность LCVR, приведенную в SEQ ID NO: 38.
В другом предпочтительном варианте осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит аминокислотную последовательность HCVR, приведенную в SEQ ID NO: 13, и аминокислотную последовательность LCVR, приведенную в SEQ ID NO: 37.
BIT
1
in vivo
Помимо связывания как с человеческим (hu)SIRPα, так и человеческим (hu)SIRPα, антитела по изобретению также могут связываться с (cy)SIRPα яванского макака (cy), что позволяет проводить исследования  на соответствующей модели на животных.
Антитела по изобретению могут связываться с участком SIRPα, который отличается от CD47-связывающего участка, т.е. с аллостерическим участком, и подавлять передачу ингибирующих сигналов SIRPα без прямого вмешательства в физическое взаимодействие CD47-SIRPα. Альтернативно, антитела могут связываться с тем же участком, с которым связывается CD47, предотвращая лигирование SIRPα с помощью CD47 и, следовательно, ингибируя сигнальный каскад, который отрицательно регулирует зависимые от Fc-рецепторов функции иммунных эффекторных клеток
BIT
1
Анти-SIRPα антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные выше, являются более специфическими, чем известные анти-SIRPα антитела, и демонстрируют высокое сродство как по отношению к SIRPα, так и по отношению к SIRPα. К тому же, анти-SIRPα антитела по изобретению не связываются с SIRPγ.
1
2
3
4
В одном конкретном варианте осуществления анти-SIRPα антитело по изобретению содержит Fc-область, которая связывается с активирующими Fc-рецепторами, присутствующими на человеческих иммунных эффекторных клетках. Такое анти-SIRPα антитело является подходящим для монотерапии SIRPα-позитивных солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований у человека, поскольку оно может индуцировать ADCC и/или ADCP. Человеческие иммунные эффекторные клетки имеют множество различных активирующих Fc-рецепторов, которые при лигировании запускают фагоцитоз, высвобождение цитокинов, ADCC и/или ADCP и т.д. Примерами этих рецепторов являются рецепторы Fcγ, например FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32), FcγRIIIA (CD16a), FcγRIIIB (CD16b), FcγRIIC и Fcα-рецептор FcαRI (CD89). Различные природные изотипы антител связываются с этими рецепторами. Например, IgG связывается с FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIC, FcγRIIIA, FcγRIIIB; IgG связывается с FcγRIIA, FcγRIIC, FcγRIIIA; IgG связывается с FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIC, FcγRIIIA, FcγRIIIB; IgG связывается с FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIC, FcγRIIIA; и IgA связывается с FcαRI.
1
2
3
4
1
2
4
1
В предпочтительном варианте осуществления анти-SIRPα антитело по изобретению содержит Fc-область изотипа IgA или IgG. Более предпочтительным является анти-SIRPα антитело, содержащее Fc-область изотипа IgG, IgG, IgG или IgG; еще более предпочтительным изотип является IgG, IgG или IgG. Наиболее предпочтительным является анти-SIRPα антитело, содержащее Fc-область изотипа IgG.
in vitro
in vitro
1
Хотя анти-SIRPα антитела, содержащие Fc-область, которая связывается с активирующими Fc-рецепторами, присутствующими на человеческих иммунных эффекторных клетках, могут быть пригодными для лечения SIRPα-экспрессирующего рака, химерные анти-SIRPα антитела IgG1 изотипа не показали ожидаемых результатов при тестировании  в комбинации с другими антителами, которые содержат человеческую Fc-область, которая связывается с активирующими Fc-рецепторами, присутствующими на человеческих иммунных эффекторных клетках (т.е. как антитела, которые способны индуцировать ADCC и/или ADCP). Результаты анализов ADCC  показали, что химерное анти-SIRPα антитело IgG изотипа не увеличивает ADCC такого другого антитела в той степени, как это ожидалось, исходя из более ранних результатов с использованием мышиных антител.
Следовательно, изобретение относится к анти-SIRPα антителам, которые демонстрируют пониженное связывание или низкое сродство к активирующим Fc-рецепторам, присутствующим на человеческих иммунных эффекторных клетках. Такие анти-SIRPα антитела содержат модифицированную Fc-область, в которой одна или более аминокислот заменены другой аминокислотой(ами) по сравнению с аналогичной немодифицированной Fc-областью. Пониженное связывание означает, что сродство анти-SIRPα антитела, содержащего модифицированную Fc-область, к активирующим Fc-рецепторам ниже, чем сродство анти-SIRPα антитела с теми же вариабельными областями, содержащими аналогичную немодифицированную Fc-область. Сродство связывания антител к активирующим Fc-рецепторам обычно измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR) или проточной цитометрией, используя способы, известные в данной области, например, описанные у Harrison et al. в J. Pharm. Biomed. Anal. 2012, 63, 23-28. Антитела, проявляющие пониженное связывание или низкое сродство к человеческому Fcα- или Fcγ-рецептору в комбинации с терапевтическим антителом, являются особенно эффективными при клеточном разрушении раковых клеток за счет увеличения ADCC и/или ADCP эффекторных иммунных клеток. Как правило, Fc-область анти-SIRPα антитела по изобретению модифицируют для уменьшения связывания с активирующими Fc-рецепторами, присутствующими на человеческих иммунных эффекторных клетках.
1
1
2
1
3
4
1
Следовательно, анти-SIRPα антитело по изобретению содержит модифицированную Fc-область, которая проявляет пониженное связывание или низкое сродство к человеческому Fcα- или Fcγ-рецептору. Например, связывание IgG с рецептором Fcγ может быть уменьшено путем замены одной или более аминокислот в IgG, выбранных из группы, состоящей из L234, L235, G237, D265, D270, N297, A327, P328 и P329 (нумерация Eu); связывание IgG может быть уменьшено путем введения, например, одной или более из следующих аминокислотных замен: V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S и P331S; или H268Q, V309L, A330S и P331S (нумерация аналогична нумерации Eu в IgG) (Vafa et al. Methods 2014, 65, 114-126); связывание IgG может быть уменьшено путем введения, например, аминокислотных замен L234A и L235A или аминокислотных замен L234A, L235A и P331S (Leoh et al. Mol. Immunol. 2015, 67, 407-415); и связывание IgG может быть уменьшено путем введения, например, аминокислотных замен S228P, F234A и L235A (нумерация аналогична нумерации Eu в IgG) (Parekh et al. mAbs 2012, 4(3), 310-318). Связывание IgA с рецептором Fcα может быть уменьшено путем введения, например, одной или более аминокислотных замен L257R, P440A, A442R, F443R и P440R (последовательная нумерация, Pleass et al. J. Biol. Chem. 1999, 271(33), 23508-23514).
1
2
4
Предпочтительно, анти-SIRPα антитело по изобретению содержит модифицированную Fc-область, которая имеет пониженное связывание или низкое сродство к человеческому рецептору Fcγ. Более предпочтительно, модифицированная Fc-область представляет собой Fc-область изотипа IgG. Еще более предпочтительно, модифицированная Fc-область представляет собой Fc-область изотипа IgG, IgG или IgG.
1
В предпочтительном варианте осуществления анти-SIRPα антитело по изобретению содержит модифицированную человеческую Fc-область IgG, содержащую одну или более аминокислотных замен в одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из: L234, L235, G237, D265, D270, N297, A327, P328 и P329 (нумерация Eu).
1
1
Предпочтительно, анти-SIRPα антитело содержит модифицированную Fc-область IgG, которая не содержит ни аминокислотную замену N297A, ни N297G. Более предпочтительно, анти-SIRPα антитело содержит модифицированную Fc-область IgG, которая не содержит аминокислотную замену N297.
1
В одном из вариантов осуществления модифицированная человеческая Fc-область IgG содержит одну или более аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из L234A, L234E, L235A, G237A, D265A, D265E, D265N, D270A, D270E, D270N, N297A, N297G, A327Q, P328A, P329A и P329G. Предпочтительно, одну или более аминокислотных замен выбирают из группы, состоящей из L234A, L234E, L235A, G237A, D265A, D265E, D265N, N297A, P328A, P329A и P329G.
1
1
В одном из вариантов осуществления модифицированная человеческая Fc-область IgG содержит одну или более аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из L234A, L234E, L235A, G237A, D265A, D265E, D265N, D270A, D270E, D270N, A327Q, P328A, P329A и P329G. Предпочтительно, одну или более аминокислотных замен выбирают из группы, состоящей из L234A, L234E, L235A, G237A, D265A, D265E, D265N, P328A, P329A и P329G. Более предпочтительно, модифицированная Fc-область IgG не содержит ни аминокислотную замену N297A, ни N297G. Еще более предпочтительно, модифицированная Fc-область IgG1 не содержит аминокислотную замену в положении N297.
1
1
В предпочтительном варианте осуществления модифицированная человеческая Fc-область IgG содержит аминокислотные замены L234A и L235A, L234E и L235A, L234A, L235A и P329A или L234A, L235A и P329G. Предпочтительно, модифицированная Fc-область IgG не содержит ни аминокислотную замену N297A, ни N297G. Более предпочтительно, модифицированная Fc-область IgG1 не содержит аминокислотную замену в положении N297.
1
1
1
В другом предпочтительном варианте осуществления анти-SIRPα антитело по изобретению содержит модифицированную человеческую Fc-область IgG, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A или L234E и L235A, предпочтительно аминокислотные замены L234A и L235A. Более предпочтительно, модифицированная Fc-область IgG не содержит ни аминокислотную замену N297A, ни N297G. Еще более предпочтительно, модифицированная Fc-область IgG не содержит аминокислотную замену в положении N297.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей анти-SIRPα антитело, описанное выше, и один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов. Типичные фармацевтические составы терапевтических белков, таких как антитела, имеют форму лиофилизированной массы (лиофилизированных порошков), которые перед внутривенной инфузией должны быть растворены (в водной среде) (т.е. восстановлены), или форму замороженных (водных) растворов, которые перед использованием необходимо оттаять.
Как правило, фармацевтическая композиция предоставлена в форме лиофилизированной массы. Фармацевтически приемлемые эксципиенты, подходящие в соответствии с настоящим изобретением для включения в фармацевтическую композицию (перед сублимационной сушкой), включают буферные растворы (например, соли в воде, содержащие цитрат, гистидин или сукцинат), лиопротекторы (например, сахарозу, трегалозу), модификаторы тоничности (например, хлорид натрия), поверхностно-активные вещества (например, полисорбат) и формообразующие агенты (например, маннит, глицин). Эксципиенты, используемые для лиофилизированных белковых композиций, выбирают по их способности предотвращать денатурацию белка в процессе лиофилизации, а также во время хранения.
Настоящее изобретение также относится к анти-SIRPα антителу или фармацевтической композиции, как описано выше, для применения в качестве лекарственного средства.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к анти-SIRPα антителу или фармацевтической композиции, как описано выше, для применения при лечении солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований у человека. Анти-SIRPα антитела по изобретению могут быть использованы для лечения солидных опухолей, таких как рак молочной железы, рак почки или меланома, или гематологических злокачественных новообразований, таких как острый миелолейкоз (ОМЛ).
1
2
3
4
1
2
4
1
Во втором варианте осуществления изобретение относится к анти-SIRPα антителу, содержащему Fc-область, которая связывается с активирующими Fc-рецепторами, присутствующими на человеческих иммунных эффекторных клетках, для использования при лечении SIRPα-позитивных солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований у человека. Предпочтительно Fc-область, которая связывается с активирующими Fc-рецепторами, присутствующими на эффекторных иммунных клетках человека, имеет изотип IgA или IgG. Более предпочтительным является анти-SIRPα антитело, содержащее Fc-область изотипа IgG, IgG, IgG или IgG; изотип IgG, IgG или IgG является еще более предпочтительным. Наиболее предпочтительным для применения при лечении SIRPα-позитивных солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований у человека является анти-SIRPα антитело, содержащее Fc-область изотипа IgG.
В третьем варианте осуществления настоящее изобретение относится к анти-SIRPα антителу или фармацевтической композиции, как описано выше, для применения при лечении солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований у человека в комбинации с одним или более другими видами противораковой терапии. Подходящими видами противораковой терапии являются хирургия, химиотерапия, лучевая терапия, гормональная терапия, таргетная терапия и иммунотерапия. Анти-SIRPα антитело или фармацевтическую композицию, как описано выше, можно использовать для одновременного или последовательного применения при лечении солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований у человека в сочетании с одним или более другими видами противораковой терапии. В частности, анти-SIRPα антитело или фармацевтическую композицию, как описано выше, можно использовать для лечения солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований у человека после использования одного или более других видов противораковой терапии.
Предпочтительно, настоящее изобретение относится к анти-SIRPα антителу или фармацевтической композиции, как описано выше, для применения при лечении солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований у человека в комбинации с одним или более другими противораковыми терапевтическими средствами. В частности, анти-SIRPα антитело или фармацевтическую композицию, как описано выше, можно использовать для лечения солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований у человека после применения одного или более других противораковых терапевтических средств.
Подходящие противораковые терапевтические средства включают химиотерапию, лучевую терапию, гормональную терапию, таргетную терапию и иммунотерапевтические агенты. Подходящие химиотерапевтические средства включают алкилирующие агенты, такие как азотистые иприты, нитрозомочевины, тетразины и азиридины; анти-метаболиты, такие как антифолаты, фторпиримидины, аналоги дезоксинуклеозидов и тиопурины; антимикротрубочковые агенты, такие как алкалоиды барвинка и таксаны; ингибиторы топоизомеразы I и II; и цитотоксические антибиотики, такие как антрациклины и блеомицины.
131
32
223
89
153
Подходящие средства лучевой терапии включают радиоизотопы, такие как I-метайодбензилгуанидин (MIBG), P в виде фосфата натрия, хлорид Ra, хлорид Sr и тетраметиленфосфонат диамина Sm (EDTMP).
Подходящие агенты для использования в качестве гормональной терапии включают ингибиторы синтеза гормонов, такие как ингибиторы ароматазы и аналоги GnRH; и антагонисты рецепторов гормонов, такие как селективные модуляторы рецепторов эстрогена и антиандрогены.
Терапевтические средства направленного действия - это терапевтические средства, которые влияют на специфические белки, участвующие в онкогенезе и пролиферации, и могут быть низкомолекулярными лекарственными средствами; белками, такими как терапевтические антитела; пептидами и производными пептидов; или гибридами белка с малыми молекулами, такими как конъюгаты антитело-лекарственное средство. Примеры низкомолекулярных лекарственных средств направленного действия включают ингибиторы mTor, такие как эверолимус, темсиролимус и рапамицин; ингибиторы киназы, такие как иматиниб, дазатиниб и нилотиниб; ингибиторы VEGF, такие как сорафениб и регорафениб; и ингибиторы EGFR/HER2, такие как гефитиниб, лапатиниб и эрлотиниб. Примеры терапевтических средств направленного действия на основе пептидов или производных пептидов включают ингибиторы протеасом, такие как бортезомиб и карфилзомиб.
Иммунотерапевтические агенты включают агенты, которые индуцируют, усиливают или подавляют иммунный ответ, такие как цитокины (IL-2 и IFN-α); иммуномодулирующие препараты на основе имида, такие как талидомид, леналидомид и помалидомид; терапевтические противораковые вакцины, такие как талимоген лагерпарепвек; иммунотерапевтические агенты на основе клеток, такие как вакцины на основе дендритных клетках, адоптивных Т-клеток и модифицированных Т-клеток с химерными рецепторами антигена); и терапевтические антитела, которые могут запускать ADCC/ADCP или CDC через свою Fc-область при связывании с мембраносвязанными лигандами на раковой клетке.
Предпочтительно, изобретение относится к анти-SIRPα антителу или фармацевтической композиции, как описано выше, для применения при лечении солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований у человека в комбинации с одним или более другими противораковыми терапевтическими средствами, причем противораковое терапевтическое средство является терапевтическим агентом направленного действия или иммунотерапевтическим агентом. Предпочтительным терапевтическим агентом направленного действия в соответствии с изобретением является терапевтическое антитело или конъюгат антитело-лекарственное вещество (ADC). Наиболее предпочтительным терапевтическим агентом направленного действия является терапевтическое антитело.
Термин «терапевтическое антитело», используемый в настоящем описании, относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, как определено выше, которое является подходящим для терапии человека. Антитела, подходящие для терапии человека, имеют достаточное качество, безопасны и эффективны для лечения конкретных заболеваний человека. Качество можно оценивать с помощью установленных нормативов надлежащей практики; безопасность и эффективность, как правило, оценивают с помощью установленных нормативов регулирующих органов в сфере обращения лекарственных средств, например, Европейского агентства по лекарственным средствам (EMA) или Управления по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (FDA). Такие нормативы хорошо известны в данной области.
Предпочтительно терапевтическое антитело представляет собой антитело, одобренное регулирующим органом в сфере обращения лекарственных средств, таким как EMA или FDA. Для определения, одобрено ли какое-либо антитело, можно воспользоваться онлайн-базой данных большинства регулирующих органов.
Термин «ADC», используемый в настоящем описании, относится к цитотоксическому лекарственному средству, конъюгированному посредством линкера с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, как определено выше. Как правило, цитотоксические лекарственные вещества являются сильнодействующими, например, дуокармицин, калихеамицин, димер пирролобензодиазепина (ПБД), майтансиноид или производное ауристатина. Линкер может быть расщепляемым, например содержащим расщепляемый дипептид валин-цитруллин (vc) или валин-аланин (va), или нерасщепляемым, например сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилатом (SMCC).
Как правило, терапевтическое антитело для применения в комбинации с анти-SIRPα антителом по изобретению представляет собой моноспецифическое или биспецифическое антитело или фрагмент антитела, содержащий по меньшей мере одну HCVR и LCVR, которая связывается с мишенью, выбранной из группы, состоящей из аннексина A1, B7H3, B7H4, CA6, CA9, CA15-3, CA19-9, CA27-29, CA125, CA242, CCR2, CCR5, CD2, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD44, CD47, CD56, CD70, CD74, CD79, CD115, CD123, CD138, CD203c, CD303, CD333, CEA, CEACAM, CLCA-1, CLL-1, c-MET, Cripto, CTLA-4, DLL3, EGFL, EGFR, EPCAM, EPh (например, EphA2 или EPhB3), рецептора эндотелина B (ETBR), FAP, FcRL5 (CD307), FGF, FGFR (например, FGFR3), FOLR1, GCC, GPNMB, HER2, HMW-MAA, интегрина α (например, αvβ3 и αvβ5), IGF1R, TM4SF1 (или антигена L6), Lewis A-подобного углевода, Lewis X, Lewis Y, LIV1, мезотелина, MUC1, MUC16, NaPi2b, Nectin-4, PD-1, PD-L1, PSMA, PTK7, SLC44A4, STEAP-1, антигена 5T4 (или TPBG, гликопротеин трофобласта), TF (тканевого фактора), антигена Томсена-Фриденрейха (TF-Ag), Tag72, TNF, TNFR, TROP2, VEGF, VEGFR и VLA.
Предпочтительным является моноспецифическое терапевтическое антитело. Более предпочтительным является антитело к мембраносвязанной мишени на поверхности опухолевых клеток.
Подходящие терапевтические антитела для применения в комбинации с анти-SIRPα антителом по изобретению включают алемтузумаб, бевацизумаб, цетуксимаб, панитумумаб, ритуксимаб и трастузумаб.
Подходящие ADC для применения в комбинации с анти-SIRPα антителом по изобретению включают трастузумаб эмтанзин и брентуксимаб ведотин.
В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к анти-SIRPα антителу, описанному выше, для указанного выше применения в комбинации с терапевтическим антителом к мембраносвязанной мишени на поверхности опухолевых клеток, которое содержит человеческую Fc-область, которая связывается с активирующим Fc-рецепторами, присутствующими на человеческих иммунных эффекторных клетках.
Посредством связывания с этими активирующими Fc-рецепторами, описанными выше, терапевтическое антитело, содержащее человеческую Fc-область, которая связывается с активирующими Fc-рецепторами, присутствующими на человеческих иммунных эффекторных клетках, может индуцировать ADCC и/или ADCP. Терапевтические антитела человеческого изотипа IgG, IgE или IgA содержат человеческую Fc-область, которая связывается с активирующими Fc-рецепторами, присутствующими на человеческих иммунных эффекторных клетках.
1
2
3
4
1
2
1
Предпочтительным терапевтическим антителом для применения по изобретению является терапевтическое антитело изотипа IgG или IgA. Более предпочтительным является терапевтическое антитело изотипа IgG, такое как антитела IgG, IgG, IgG и IgG. Еще более предпочтительным является терапевтическое антитело изотипа IgG или IgG. Наиболее предпочтительным является терапевтическое антитело изотипа IgG.
Предпочтительно, настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-SIRPα антителу, содержащему CDR HCVR и LCVR, выбранные из группы, состоящей из:
а. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 1, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 2;
b. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 3, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 4;
c. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 5, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 6;
d. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 7, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 8;
e. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 9, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 10;
f. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 11, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 12;
g. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 13, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 14;
h. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 15, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 16; и
i. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 17, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 18
для применения при лечении солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований у человека в комбинации с применением терапевтического антитела к мембраносвязанной мишени на поверхности опухолевых клеток, которое содержит человеческую Fc-область, которая связывается с активирующими Fc-рецепторами, присутствующими на человеческих иммунных эффекторных клетках, причем анти-SIRPα антитело содержит модифицированную Fc-область, которая имеет пониженное связывание с человеческим рецептором Fcα или Fcγ по сравнению с тем же анти-SIRPα антителом, содержащим Fc-область дикого типа.
1
В предпочтительном варианте осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело для применения при лечении солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований у человека в комбинации с терапевтическим антителом содержит модифицированную человеческую Fc-область IgG, содержащую одну или более аминокислотных замен в одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из: L234, L235, G237, D265, D270, N297, A327, P328 и P329 (нумерация Eu).
1
1
Предпочтительно гуманизированное анти-SIRPα антитело для применения при лечении солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований у человека в комбинации с терапевтическим антителом содержит модифицированную область Fc IgG, которая не содержит аминокислотной замены ни N297A, ни N297G. Более предпочтительно, анти-SIRPα антитело содержит модифицированную Fc-область IgG, которая не содержит аминокислотную замену N297.
1
В одном из вариантов осуществления модифицированная человеческая Fc-область IgG содержит одну или более аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из L234A, L234E, L235A, G237A, D265A, D265E, D265N, D270A, D270E, D270N, N297A, N297G, A327Q, P328A, P329A и P329G.
1
1
1
В другом варианте осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело для применения при лечении солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований у человека в комбинации с терапевтическим антителом содержит модифицированную Fc-область IgG, содержащую одну или более аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из L234A, L234E, L235A, G237A, D265A, D265E, D265N, D270A, D270E, D270N, A327Q, P328A, P329A и P329G. Предпочтительно, одну или более аминокислотных замен выбирают из группы, состоящей из L234A, L234E, L235A, G237A, D265A, D265E, D265N, P328A, P329A и P329G. Более предпочтительно, модифицированная Fc-область IgG не содержит ни аминокислотную замену N297A, ни N297G. Еще более предпочтительно, модифицированная Fc-область IgG не содержит аминокислотную замену в положении N297.
1
1
1
В предпочтительном варианте осуществления модифицированная человеческая Fc-область IgG содержит аминокислотные замены L234A и L235A, L234E и L235A, L234A, L235A и P329A или L234A, L235A и P329G. Более предпочтительно, модифицированная Fc-область IgG не содержит ни аминокислотную замену N297A, ни N297G. Еще более предпочтительно, модифицированная Fc-область IgG не содержит аминокислотную замену в положении N297.
1
1
1
В другом предпочтительном варианте осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело для применения при лечении солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований у человека в комбинации с терапевтическим антителом содержит модифицированную человеческую Fc-область IgG, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A или L234E и L235A, предпочтительно аминокислотные замены L234A и L235A. Более предпочтительно, модифицированная Fc-область IgG не содержит ни аминокислотную замену N297A, ни N297G. Еще более предпочтительно, модифицированная Fc-область IgG не содержит аминокислотную замену в положении N297.
В предпочтительном варианте осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело для применения при лечении солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований у человека в комбинации с использованием терапевтического антитела к мембраносвязанной мишени на поверхности опухолевых клеток, которое содержит человеческую Fc-область, которая связывается с активирующими Fc-рецепторами, присутствующими на человеческих иммунных эффекторных клетках, включает Fc-область, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A, а также CDR HCVR и LCVR, выбранные из группы, состоящей из:
а. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 3, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 4;
b. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 5, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 6;
c. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 7, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 8;
d. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 9, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 10; и
e. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 13, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 14.
Во втором предпочтительном варианте осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело для использования, как определено выше, содержит Fc-область, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A, а также CDR HCVR и LCVR, выбранные из группы, состоящей из:
а. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 5, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 6;
b. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 7, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 8; и
c. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 13, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 14.
В третьем предпочтительном варианте осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело для использования, как определено выше, содержит Fc-область, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A, а также CDR HCVR и LCVR, выбранные из группы, состоящей из:
а. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 7, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 8; и
b. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 13, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 14.
В четвертом предпочтительном варианте осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело для использования, как определено выше, содержит Fc-область, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A, и
а. аминокислотную последовательность HCVR, приведенную в SEQ ID NO: 30, и аминокислотную последовательность LCVR, приведенную в SEQ ID NO: 31;
b. аминокислотную последовательность HCVR, приведенную в SEQ ID NO: 32, и аминокислотную последовательность LCVR, приведенную в SEQ ID NO: 33;
c. аминокислотную последовательность HCVR, приведенную в SEQ ID NO: 34, и аминокислотную последовательность LCVR, приведенную в SEQ ID NO: 8;
d. аминокислотную последовательность HCVR, приведенную в SEQ ID NO: 35, и аминокислотную последовательность LCVR, приведенную в SEQ ID NO: 36;
e. аминокислотную последовательность HCVR, приведенную в SEQ ID NO: 35, и аминокислотную последовательность LCVR, приведенную в SEQ ID NO: 37;
f. аминокислотную последовательность HCVR, приведенную в SEQ ID NO: 13, и аминокислотную последовательность LCVR, приведенную в SEQ ID NO: 38; или
g. аминокислотную последовательность HCVR, приведенную в SEQ ID NO: 13, и аминокислотную последовательность LCVR, приведенную в SEQ ID NO: 37.
1
1
В одном из предпочтительных вариантов осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело для использования, как определено выше, содержит Fc-область, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A и аминокислотную последовательность HCVR SEQ ID NO: 30 и аминокислотную последовательность LCVR SEQ ID NO: 31. Более предпочтительно, модифицированная Fc-область IgG не содержит ни аминокислотную замену N297A, ни N297G. Еще более предпочтительно, модифицированная Fc-область IgG не содержит аминокислотную замену в положении N297.
В другом предпочтительном варианте осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело для использования, как определено выше, содержит Fc-область, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A и аминокислотную последовательность HCVR SEQ ID NO: 32 и аминокислотную последовательность LCVR SEQ ID NO: 33.
В другом предпочтительном варианте осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело для использования, как определено выше, содержит Fc-область, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A и аминокислотную последовательность HCVR SEQ ID NO: 34 и аминокислотную последовательность LCVR SEQ ID NO: 8.
В другом предпочтительном варианте осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело для использования, как определено выше, содержит Fc-область, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A и аминокислотную последовательность HCVR SEQ ID NO: 35 и аминокислотную последовательность LCVR SEQ ID NO: 36.
В другом предпочтительном варианте осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело для использования, как определено выше, содержит Fc-область, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A и аминокислотную последовательность HCVR SEQ ID NO: 35 и аминокислотную последовательность LCVR SEQ ID NO: 37.
В другом предпочтительном варианте осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело для использования, как определено выше, содержит Fc-область, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A и аминокислотную последовательность HCVR SEQ ID NO: 13 и аминокислотную последовательность LCVR SEQ ID NO: 38.
В другом предпочтительном варианте осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело для использования, как определено выше, содержит Fc-область, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A и аминокислотную последовательность HCVR SEQ ID NO: 13 и аминокислотную последовательность LCVR SEQ ID NO: 37.
1
1
Более предпочтительно, определенные выше гуманизированные анти-SIRPα антитела для использования, как определено выше, содержат Fc-область, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A, причем модифицированная Fc-область IgG не содержит аминокислотную замену ни N297A, ни N297G. Еще более предпочтительно, модифицированная Fc-область IgG не содержит аминокислотную замену в положении N297.
in vitro
in vitro
in vitro
BIT
1
Анти-SIRPα антитела, содержащие модифицированную Fc-область, которая демонстрирует пониженное связывание с человеческим рецептором Fcα или Fcγ по сравнению с тем же анти-SIRPα антителом, содержащим Fc-область дикого типа, как описано выше, усиливают ADCC  терапевтического антитела при использовании нейтрофилов в качестве эффекторных клеток от разных доноров, гомозиготных по SIRPα или SIRPα. Все эти антитела усиливают ADCC  при использовании нейтрофилов большинства доноров, а предпочтительные антитела даже усиливают ADCC  при использовании нейтрофилов, полученных от любого донора.
ПРИМЕРЫ
Протокол иммунизации и отбора
BIT
1
BIT
1
BIT
1
1v1
1v2
BIT
1
Кроликов повторно иммунизировали смесью пептидов, представляющих область внеклеточного домена человеческого (hu)SIRPα, человеческого (hu)SIRPα и (cy)SIRPα яванского макака (cy). Забор крови осуществляли в разные моменты времени, которую обогащали лимфоцитами. Одиночные В-клетки помещали в отдельные лунки микротитровальных планшетов. Эти В-клетки культивировали в течение нескольких дней в присутствии кондиционированной среды и питающих клеток. В течение этого времени клетки продуцировали и высвобождали моноклональные антитела в среду культивирования (супернатанты B-клеток). Супернатанты этих отдельных B-клеток анализировали на продуцирование IgG; затем определяли специфическое связывание huSIRPα и huSIRPα, и cySIRPα с анти-Fc антителом. Подходящими супернатантами были те, которые связывались с обоими huSIRPα и huSIRPα и с cySIRPα. После этапа отбора по лункам измеряли связывание с мышиным (mu)SIRPα и huSIRPβ, huSIRPβ и huSIRPγ (в качестве анти-мишеней). Кроме того, определяли связывание с клетками СНО с повышенным уровнем экспрессии SIRPα и SIRPα. Связывание с родительскими клетками СНО использовали в анализе в качестве контроля.
1
Подходящие лизаты В-клеток отбирали для выделения РНК, обратной транскрипции и секвенирования. Уникальные вариабельные области легкой и тяжелой цепей антитела синтезировали и клонировали перед последовательностью константной области антитела (каппа LC с SEQ ID NO: 26 и человеческая HC-LALA IgG в формате SEQ ID NO: 27), соответственно.
1
BIT
1v1
1v2
1
BIT
Клетки HEK 293 временно трансфицировали плазмидой, содержащей последовательность антитела, с использованием автоматизированной процедуры на платформе Tecan Freedom Evo. Иммуноглобулины очищали от клеточного супернатанта с помощью аффинной очистки (белок A) в системе ВЭЖХ Dionex Ultimate 3000 с автоматическим забором проб из планшета. Полученные антитела тестировали в анализах типа ELISA (ELISA: huSIRPα, huSIRPα, cySIRPα, muSIRPα, huSIRPβ/β/γ; анализы связывания клеток: huSIRPα, huSIRPα).
Временная экспрессия антител
а) Получение конструкций кДНК и векторов экспрессии
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
К каждой аминокислотной последовательности HCVR антител на N-конце присоединяли лидерную последовательность (SEQ ID NO: 28 для антител 1-9, 15, 16; SEQ ID NO: 39 для антител 10-14), а на С-конце присоединяли константный домен человеческого LALA HC IgG с SEQ ID NO: 27. К каждой из аминокислотных последовательностей HCVR антител 12C4huIgGLALA, 12C4huIgG и 29AM4-5huIgGLALA на N-конце присоединяли лидерную последовательность HAVT20 (SEQ ID NO: 29), а на C-конце присоединяли константный домен человеческой LALA HC IgG с SEQ ID NO: 27 или человеческую HC IgG дикого типа (SEQ ID NO: 25). Полученные химерные аминокислотные последовательности подвергали обратной трансляции в последовательность кДНК, оптимизированную по кодонам, для экспрессии в человеческих клетках (Homo sapiens). Аналогичным образом получали химерную последовательность кДНК для LC данной конструкции путем присоединения лидерной последовательности (SEQ ID NO:28 для антител 1-9, 12; SEQ ID NO:40 для антител 10, 11, 13-16, SEQ ID NO:29 для 12C4huIgGLALA, 12C4huIgG и 29AM4-5huIgGLALA) к последовательностям LCVR антител 1-16, 12C4huIgGLALA и 12C4huIgG, и 29AM4-5huIgGLALA на N-конце, а на С-конце присоединяли константную область легкой цепи человеческого IgG (SEQ ID NO: 26). Последовательности HCVR и LCVR использовали в соответствии с таблицей 1.
Таблица 1. Последовательности HCVR и LCVR антител и эталонных антител
Антитело
HCVR
LCVR
1
SEQ ID NO:1
SEQ ID NO:2
2
SEQ ID NO:3
SEQ ID NO:4
3
SEQ ID NO:5
SEQ ID NO:6
4
SEQ ID NO:7
SEQ ID NO:8
5
SEQ ID NO:9
SEQ ID NO:10
6
SEQ ID NO:11
SEQ ID NO:12
7
SEQ ID NO:13
SEQ ID NO:14
8
SEQ ID NO:15
SEQ ID NO:16
9
SEQ ID NO:17
SEQ ID NO:18
29AM4-5huIgG<sub>1</sub>LALA
SEQ ID NO:19
SEQ ID NO:20
12C4huIgG<sub>1</sub>LALA
SEQ ID NO:21
SEQ ID NO:22
12C4huIgG<sub>1</sub>
SEQ ID NO:21
SEQ ID NO:22
KWAR23
SEQ ID NO:23
SEQ ID NO:24
10 гуманизированное
SEQ ID NO:30
SEQ ID NO:31
11 гуманизированное
SEQ ID NO:32
SEQ ID NO:33
12 гуманизированное
SEQ ID NO:34
SEQ ID NO:8
13 гуманизированное
SEQ ID NO:35
SEQ ID NO:36
14 гуманизированное
SEQ ID NO:35
SEQ ID NO:37
15 гуманизированное
SEQ ID NO:13
SEQ ID NO:38
16 гуманизированное
SEQ ID NO:13
SEQ ID NO:37
b) векторная конструкция и стратегия клонирования
E.coli
Для экспрессии цепей антител использовали вектор экспрессии млекопитающих, который содержал экспрессионную кассету CMV:BGHpA. Конечные векторы, содержащие экспрессионную кассету либо HC, либо LC (CMV:HC:BGHpA и CMV:LC-BGHpA, соответственно), трансфицировали и размножали в клетках NEB 5-альфа . Крупномасштабное производство конечных векторов экспрессии для трансфекции осуществляли с помощью наборов Maxi- или Megaprep (Qiagen).
с) Временная экспрессия в клетках млекопитающих
7
Коммерчески доступные клетки Expi293F (Thermo Fisher) трансфицировали векторами экспрессии с использованием агента для трансфекции ExpiFectamine в соответствии с инструкциями производителя следующим образом: 75×10 клеток высевали в 300 мл среды FortiCHO, 300 мкг вектора экспрессии объединяли с 800 мкл агента для трансфекции ExpiFectamine и добавляли в клетки. Через день после трансфекции к культуре добавляли 1,5 мл Enhancer 1 и 15 мл Enhancer 2. Через шесть дней после трансфекции супернатант клеточной культуры собирали центрифугированием при 4000 g в течение 15 минут и фильтровали осветленный сбор через фильтры PES bottle/MF 75 (Nalgene).
Связывание антител и специфичность
Эксперимент
ELISA-анализ
1
BIT
1v1
1v2
2
: Каждый из растворов huSIRPα, huSIRPα, huSIRPβ, huSIRPβ, huSIRPγ и cySIRPα в фосфатно-солевом буфере (PBS) добавляли в многолуночный черный полистирольный планшет для ELISA и оставляли на 1 час при комнатной температуре для осуществления адгезии. Несвязанный белок удаляли трехэтапной промывкой стандартным промывочным буфером. Затем в лунки добавляли блокирующий буфер. Через 1 ч инкубации при комнатной температуре лунки промывали три раза стандартным промывочным буфером. В лунки добавляли антитела в буфере в различных концентрациях и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Несвязанные антитела удаляли с помощью трехэтапной промывки стандартным промывочным буфером. Козий античеловеческий (Fab') IgG, конъюгированный с пероксидазой хрена (HRP), в буфере добавляли в лунки и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Добавляли 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМБ) и после развития окраски достаточной интенсивности добавляли HCl. Поглощение считывали при 450 нм/620 нм.
Анализ поверхностного плазмонного резонанса (SPR)
a
d
: Анализ сродства выполняли с помощью одноциклического кинетического анализа на приборе для поверхностного плазмонного резонанса (Biacore T200 system, GE Life Sciences) при 25°C. Биотинилированные антигены SIRP иммобилизовали на поверхность чипа, подходящего для биотинилированных молекул (Sensor Chip CAP, GE Life Sciences) путем инъецирования 5 мкг/мл антигена SIRP в рабочем буфере (10 мМ буфера HEPES при pH 7,4 с 150 мМ NaCl, 3 мМ ЭДТА и 0,005% об./об. полиоксиэтилен (20) сорбитанмонолаурата (сурфактант P20)) в течение 60 сек со скоростью 10 мкл/мин после инъецирования стрептавидинового конъюгата (20-кратный разбавленный реагент биотин-CAPture, GE Life Sciences) в течение 60 сек со скоростью 10 мкл/мин. Стабилизацию базовой линии устанавливали на 1 мин, после чего инъецировали пять увеличивающихся концентраций анти-SIRP антитела в рабочем буфере (10 мМ буфера HEPES при рН 7,4 с 150 мМ NaCl, 3 мМ ЭДТА и 0,005% об./об. полиоксиэтилен (20) сорбитанмонолаурата). Для каждого этапа использовали время ассоциации 150 секунд, а затем время диссоциации 1200 секунд только при самой высокой концентрации, все реакции выполняли при скорости потока 30 мкл/мин. Регенерацию осуществляли с помощью раствора, содержащего 6 М гуанидин-HCl, 0,25 М NaOH (60 сек при скорости потока 30 мкл/мин). Вычитание двойной холостой пробы выполняли на наблюдаемых сенсограммах, используя канал с потоком неиммобилизованного референсного анти-SIRP (холостая проба) и введением подвижного буфера. Сенсограммы подгоняли к модели Ленгмюра 1:1 для всех протестированных анти-SIRP антител. Кинетические параметры (k, k и KD) вычисляли с помощью программного обеспечения Biacore T200 (v3.1).
Проточная цитометрия
BIT
1
BIT
3
2
50
: Клетки U937, эндогенно экспрессирующие человеческий антиген SIRPα, и клетки, полученные из несконструированного субклона, который был подвергнут скринингу и выделен из клеток яичника китайского хомячка CHO-S (ExpiCHO-S), экспрессирующих антиген человеческого SIRPα, SIRPα или cySIRPα (100000 клеток/лунку в 96-луночный планшет) трижды промывали охлажденным на льду буфером FACS (1xPBS (LONZA), содержащим 0,2% мас./об. BSA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) и 0,02% мас./об. NaN (Sigma-Aldrich), с последующим добавлением каждого первичного mAb (50 мкл/лунку), разведенного в ледяном буфере FACS, в диапазоне концентраций. После инкубации в течение 30 мин при 4°С клетки трижды промывали охлажденным на льду буфером FACS и добавляли 50 мкл/лунку вторичного mAb (AffiniPure F(ab')-фрагмент антимышиного человеческого IgG-APC, разбавление 1:6000, Jackson Immuno Research). Через 30 мин при 4°С клетки дважды промывали и ресуспендировали в 150 мкл буфера FACS. Интенсивности флуоресценции определяли с помощью проточной цитометрии (BD FACSVerse, Franklin Lakes, NJ) и указывали в виде медианной интенсивности флуоресценции (MFI-Median) для клеток U937 и клеток ExpiCHO-S. Кривые подгоняли с помощью нелинейного регрессионного анализа, используя сигмоидальное уравнение доза-ответ с разным наклоном (четыре параметра) в GraphPad Prism (версия 7.02 для Windows, GraphPad, San Diego, CA). Значения EC вычисляли в виде концентрации в мкг/мл, которая дает половинный ответ между нижней и верхней частями кривой при подгонке к 4-параметрической логистической кривой.
Результаты
Анализ ELISA
50
1
BIT
1
1v2
1
BIT
1
1
1v1
1v2
1v1
1v1
1v2
1v2
: Значения ЕС для связывания с huSIRPα, huSIRPα, huSIRPβ, huSIRPβ, huSIRPγ, cySIRPα, полученные методом ELISA для антител 1-9 и эталонных антител, суммированы в таблице 2. Все антитела связываются с huSIRPα и huSIRPα. Антитела 29AM4-5huIgGLALA и 12C4huIgGLALA связываются с huSIRPβ, huSIRPβ и huSIRPγ. Антитела 2-6, 8 и 9 демонстрируют низкое сродство к huSIRPβ и к huSIRPγ. Антитело 7 связывается с huSIRPβ, но имеет низкое сродство к huSIRPβ и huSIRPγ. Антитело 1 связывается с huSIRPβ и huSIRPγ.
Таблица 2. Специфичность анти-SIRPα антител и эталонных антител
Антитело
huSIRPα<sub>1</sub>EC<sub>50</sub> (нг/мл)
huSIRPα<sub>BIT</sub>EC<sub>50</sub> (нг/мл)
huSIRPß<sub>1v1</sub>EC<sub>50</sub> (нг/мл)
huSIRPß<sub>1v2</sub>EC<sub>50</sub> (нг/мл)
huSIRPγEC<sub>50</sub> (нг/мл)
cySIRPαEC<sub>50</sub> (нг/мл)
1
39
21
100000
58
43
305
2
33
27
100000
28
100000
38
3
15
24
100000
89
5216
36
4
53
25
100000
92
100000
99
5
31
21
3518
110
100000
123
6
21
20
100000
24
100000
33
7
23
20
14
100000
100000
335
8
19
20
100000
19
100000
26
9
23
26
100000
47
100000
30
29AM4-5*
9
9
13
17
34
11
12C4*
7
5
8
6
6
5
1
*huIgGLALA
50
Значения EC> 100000 указаны как 100000.
Анализ SPR
D
1
BIT
1
1
BIT
: Значения K для связывания антител 4, 7, 10-14 с huSIRPα, huSIRPα и huSIRPγ в сравнении с эталонными антителами KWAR23, huIgG12C4LALA и SE5A5 (приобретенными у коммерческого поставщика) суммированы в таблице 3. Антитела 4, 7, 10-14 связываются как с huSIRPα, так и с huSIRPα и не связываются с huSIRPγ. Все эталонные антитела связываются с huSIRPγ.
Таблица 3. Данные SPR (кД в М)
Антитело
K<sub>D</sub> (huSIRPα<sub>BIT</sub>)
K<sub>D</sub> (huSIRPα<sub>1</sub>)
K<sub>D</sub> (huSIRPγ)
KWAR23 мышиного IgG2a
<1,0E–11<sup>1</sup>
<1.0E–11
<1,0E–11
KWAR23 huIgG<sub>1</sub>LALA
<1,0E–11<sup>1</sup>
1,1E–11
<1,0E–11
12C4huIgG<sub>1</sub>LALA
1,5E–11
8,7E–11
1,6E–11
SE5A5
2,6E–9
2,2E–9
4,9E–8
4
<1,0E–11
2,6E–11
N<sup>2</sup>
7
<1,0E–11
<1,0E–11
N
10 гуманизированное
<1,0E–11
3,2E–9
N
11 гуманизированное
1,4E–10
4,1E–8
N
12 гуманизированное
<1,0E–11
5,9E–11
N
13 гуманизированное
1,2E–11
<1,0E–11
N
14 гуманизированное
8,9E–11
<1,0E–11
N
1
D
<1,0E–11: K находится за пределами диапазона, что означает высокое сродство.
2
N: Специфическое связывание не обнаружено
Проточная цитометрия
1
BIT
50
1
BIT
: Связывание различных антител с huSIRPα, huSIRPα и/или cySIRPα, экспрессируемых клетками, определяли проточной цитометрией. Связывание указано в значениях EC, которые приведены в таблице 4. Антитела 2, 4, 5, 7, 8, 10-14 связываются с huSIRPα, huSIRPα и cySIRPα. Антитела 2, 4, 5, 7, 8, 10-14 связываются с cySIRPα в диапазоне низких значений, выраженных в мкг/мл.
Таблица 4. Данные проточной цитометрии
Антитело
Клетки U937 (SIRPα<sub>BIT</sub>)EC<sub>50</sub> (мкг/мл)
ExpiCHO–S (huSIRPα<sub>1</sub>) EC<sub>50</sub> (мкг/мл)
ExpiCHO–S (huSIRPα<sub>BIT</sub>) EC<sub>50</sub> (мкг/мл)
ExpiCHO–S (cySIRPα) EC<sub>50</sub> (мкг/мл)
1
–
–
–
–
2
0,14
0,19
0,27
0,16
3
0,22
–
–
–
4
0,12
0,41
0,23
0,18
5
0,16
0,27
0,22
0,26
6
–
–
–
–
7
0,17
0,23
0,21
0,07
8
0,12
0,22
0,18
0,15
9
0,11
–
–
–
29AM4–5 huIgG<sub>1</sub>LALA
0,25
–
–
–
12C4huIgG<sub>1</sub>LALA
0,19
–
–
–
KWAR23 huIgG<sub>1</sub>LALA
0,09
–
–
–
10
0,17
0,38
0,2
0,27
11
0,13
1,05
0,3
0,32
12
0,2
0,1
0,46
0,17
13
0,14
0,36
0,23
0,44
14
0,22
0,37
0,29
0,38
15
0,16
–
–
–
16
0,23
–
–
–
«-» - значение не определено
Блокирование антителами связыванием CD47-SIRPα
Эксперимент
1
BIT
1
1
Клетки CHO, трансфицированные либо SIRPα, либо SIRPα, либо родительские клетки CHO, использованные в качестве контроля, высевали в 20 мкл клеточной среды в лунки с прозрачным дном и инкубировали в течение ночи. Антитела 1-9, референсные антитела 29AM4-5huIgGLALA или 12C4huIgGLALA вместе со смесью His tag CD47 и анти-His tag антитела для детектирования флуоресценции добавляли в лунки и инкубировали в течение 2 часов. После инкубации клетки промывали буфером для промывки клеток. Флуоресценцию определяли с помощью системы для скрининга (CellInsight, Thermo Scientific) и определяли общую флуоресценцию на лунку.
Результаты
1
1
1
BIT
1
BIT
Антитела 29AM4-5huIgGLALA, 12C4huIgGLALA, 3 и 7 полностью блокируют связывание CD47 как с клетками CHO, экспрессирующими huSIRPα, так и клетками СНО, экспрессирующими huSIRPα, антитела 1, 2, 4-6, 8 и 9 не блокируют связывание CD47 ни с клетками CHO, экспрессирующими huSIRPα, ни с клетками СНО, экспрессирующим huSIRPα.
Анализ ADCC
1
BIT
2
51
51
3
Нейтрофилы доноров, гомозиготных по SIRPα или SIRPα, выделяли и культивировали в соответствии с методом, описанным в Chao et al. PNAS 2011, 108(45), 18342-18347. ADCC определяли с помощью анализа высвобождения Cr или анализа цитотоксичности с помощью комплекса нерадиоактивный европий–TDA (EuTDA) (DELFIA, PerkinElmer). Клетки SKBR3 использовали в качестве клеток-мишеней и метили 100 мкКи Cr (Perkin-Elmer) в течение 90 мин при 37°С или бис(ацетоксиметил)2,2': 6',2"-терпиридин-6,6"-дикарбоксилатом (реагент BATDA Delfia) в течение 5 мин при 37°С. После 2 промывок PBS 5×10 клеток-мишеней на лунку инкубировали в культуральной среде IMDM с добавлением 10% (об./об.) фетальной сыворотки теленка (FCS) в течение 4 часов при 37°C и 5% CO в 96-луночном планшете с U-дном вместе с нейтрофилами в отношении эффектора к клетке-мишени 50:1 в присутствии соответствующих антител. После инкубации супернатант собирали и анализировали на радиоактивность в гамма-счетчике (Wallac) или добавляли к раствору европия (DELFIA, PerkinElmer) и определяли флуоресценцию комплекса европий-2,2':6',2"-терпиридин-6,6"-дикарбоновая кислота (EuTDA) с помощью спектрофлуориметра (Envision, PerkinElmer). Процент цитотоксичности вычисляли следующим образом: [(высвобождение в эксперименте - спонтанное высвобождение)/(общее высвобождение - спонтанное высвобождение)]х100%. Все условия измеряли в двух и/или в трех эксзмплярах.
Данные ADCC для 12C4huIgG
LALA относительно 12C4IgG
1
1
1
1
1
1
1
1
1
На фиг. 1 показаны результаты анализа ADCC в виде цитотоксичности, выраженной в %. % цитотоксичности, измеренный для клеток SKBR3 с помощью нейтрофилов в качестве эффекторных клеток и одного трастузумаба, был меньше, чем % цитотоксичности трастузумаба в комбинации с мышиным антителом 12C4 (mu12C4). Трастузумаб в комбинации с антителом, в котором вариабельные области 12C4 привиты на константную область человеческого IgG (12C4huIgG), имеет аналогичный % цитотоксичности по сравнению с одним только трастузумабом при низких концентрациях 12C4huIgG. При более высоких концентрациях 12C4huIgG наблюдается снижение % цитотоксичности. Трастузумаб в комбинации с антителом, в котором вариабельные области 12C4 привиты на константную область человеческого IgG, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A (12C4huIgGLALA), демонстрируют повышенный % цитотоксичности по сравнению с % цитотоксичности одного трастузумаба и повышенный % цитотоксичности по сравнению с комбинацией 12C4huIgG с трастузумабом.
Данные ADCC
1
1
1
1
BIT
BIT
1
1
1
1
На фиг. 2 приведено сравнение % ADCC с использованием человеческих нейтрофилов, относительно трастузумаба (установлен на 100%), в присутствии антитела 1-9, имеющего константную область человеческого IgG, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A (LALA), в комбинации с трастузумабом, по сравнению с 12C4huIgGLALA. B6H12IgGLALA, имеющий VR мышиного анти-CD47 антитела и константную область человеческого IgG, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A, и несущую среду (без трастузумаба), использовали в качестве положительного и отрицательного контроля, соответственно. Залитые квадраты, (), являются значениями, измеренными с помощью нейтрофилов от доноров, имеющих вариант SIRPα (гомозиготных по SIRPα), незалитые круги, (○), являются значениями, измеренными с нейтрофилами от доноров, имеющих вариант SIRPα) (гомозиготных по SIRPα). Для всех антител среднее значение ADCC было выше по сравнению с таковым для одного трастузумаба. Для антител 1, 2, 4, 5, 7 и 8 среднее увеличение ADCC было даже больше, чем увеличение ADCC, вызванное 12C4huIgGLALA. При сравнении увеличения ADCC у каждого донора на каждое антитело, антитела 1, 3-6, 8 и 9 показали более низкое изменение в % увеличения ADCC, чем 12C4huIgGLALA.
1
1
BIT
На фиг.3 приведено сравнение % ADCC с использованием человеческих нейтрофилов в присутствии различных концентраций химерных антител 4 и 7 и гуманизированных антител 10 и 14, имеющих константную область человеческого IgG, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A (LALA), в комбинации с трастузумабом, с одним трастузумабом и с комбинацией трастузумаба с 12C4huIgGLALA, взятом в различных концентрациях. Использовали нейтрофилы двух доноров, гомозиготных по SIRPα. Даже при низких концентрациях антитела 4, 7, 10 и 14 увеличивают ADCC. Увеличение ADCC зависит от концентрации.
1
1
На фиг. 4 приведено сравнение % ADCC с использованием человеческих нейтрофилов в присутствии антител 4, 7, 10, 13, 14, 15 и 16 в комбинации с трастузумабом (Tmab) с % ADCC одного трастузумаба и 12C4huIgGLALA. Все антитела увеличивают ADCC по сравнению с одним трастузумабом. Увеличение ADCC нейтрофилами большинства доноров в присутствии антител 4, 7, 10, 13, 14, 15 и 16 в комбинации с трастузумабом аналогично или превышает таковое по сравнению с комбинацией 12C4huIgGLALA с трастузумабом.
Списки последовательностей с подчеркнутыми аминокислотными последовательностями CDR1, CDR2 и CDR3 в аминокислотных последовательностях вариабельных областей (VR) тяжелой цепи (HC) и легкой цепи (LC) (определенные по методу Кабата).
SEQ ID NO:1 (HC VR 1)
YAMS
II
1 QSVEESGGRL VTPGTPLTLT CTVSGIDLSS WVRQAP GKGLEWIG
SSGGITYYAS
WAKG
SLWAAS
51 RFTISK TSTTVDLKIP SPTTEDTATY FCAR
NYYMAL
101 WGPG TLVTVSS
SEQ ID NO:2 (LC VR 1)
QASEDIE
SYLA
R
1 AIKMTQTPAS VSAAVGGTVS INCWYQQKP GQPPKLLIY
ASTLAS
LG
DYYSSSGDTG
51 GVSS RFKGSGSGTQ FTLTISDLES ADAATYYC
A
101 FGGGTEVVV K
SEQ ID NO:3 (HC VR 2)
YAMH
II
1 QSVEESGGRL VTPGTPLTLT CTVSGFSLSN WVRQAP GKGLEWIG
YTGGATSYAT
WAKG
GDRDGY
51 QFTISK TSTTVDLKIT SPTTEDTATY FCAR
AYFNI
101 WGPGT LVTVSL
SEQ ID NO:4 (LC VR 2)
QASHNIG
SWLA
D
1 QIVMTQTPFS VSAVVGGTVT IKCWYQQKP GQRPKLLIY
ASTLAS
QQ
GYGISYVHNV
51 GVSS RFKGSGSGTE FTLTISGVES ADAATYYC
101 FGGGTEVVVK
SEQ ID NO:5 (HC VR 3)
YYIS
II
1 QSVEESGGRL VTPGTPLTLA CTVSGFSLIS WVRQAP EKGLEYIG
NIGGGASYAS
WAKG
SYGMDT
51 RFTISK TSTTVDLKIT SPTPEDTATY FCAM
GAFNI
101 WGPGT LVTVSL
SEQ ID NO:6 (LC VR 3)
QSSESVY
KNNFLS
1 AQVLTQTPAS VSAAVGGTVT ISCWYQQ KPGKPPKLLI
GASTLAS
QGGYRTDIYP
51 YGV PSRFKGSGSG TQFTLTISDL ESDDAATYFC
101 FGGGTEVVVK
SEQ ID NO:7 (HC VR 4)
YVMG
II
1 QSVEESGGRL GTPGTPLTLT CTVSGFSLSS WFRQAP GKGLEYIG
SSSGSPYYAS
WVNGR
VGPLGV
51 FTISK TSTTMDLKMN SPTTEDTATY FCAR
DYFNI
101 WGPGT LVTVSL
SEQ ID NO:8 (LC VR 4)
QAGQSIN
SYLA
Y
1 DIVMTQTPSS VEAAVGGTVT IKCWYQQKP GQRPKLLIY
ASTLES
QS
WHYISRSYA
51 GVPS RFKGSGSGTD YTLTISDLES ADAATYYCF
101 GGGTEVVVK
SEQ ID NO:9 (HC VR 5)
YVMG
YI
1 QSVEESGGRL VTPGTPLTLT CTVSGFSLSS WFRQAA GKGLEYIG
NADGSPYYAT
WVNG
VGPLGV
51 RFTISK TPTTMDLKIN SPTTEDTATY FCAR
DYFNI
101 WGPGT LVTVSL
SEQ ID NO:10 (LC VR 5)
QASQSIN
RYLT
Y
1 DIVMTQTPAS VEAAVGGTVT IKCWYQQKP GQRPKLLIY
ASTLES
QS
YYYISRTYA
51 GVPS RFEGSGSGTD YTLTISDLES ADAATYYCF
101 GGGTEV VVK
SEQ ID NO:11 (HC VR 6)
YTMT
II
1 QSVEESGGRL VTPGTPLTLT CTVSGIDLSS WVRQAP GKGLEWIG
YAGGSTAYAS
WAKG
SSSDGY
51 RFTISK TSTTVDLKIT SPTTEDTATY FCAR
DYFNI
101 WGPGT LVTVS L
SEQ ID NO:12 (LC VR 6)
QASQSIG
SWLA
Q
1 GVVMTQTPSS VSAAVGGTVT INCWYQQKP GQPPKLLIY
ASKLAS
QQ
TVTAASNVDNA
51 GVPS RFSGRGSGTH FTLTISDVQS DDAATYYC
101 FGGGTEVVVK
SEQ ID NO:13 (HC VR 7)
HGIS
TI
1 RSVEESGGRL VTPGTPLTLT CTVSGFSLSS WVRQAP GKGLEYIG
GTGVITYFAS
WAKGR
GSAWND
51 FTGSK TSTTVDLKIT SPTTEDTATY FCAR
PFDP
101 WGPGTL VTVSS
SEQ ID NO:14 (LC VR 7)
QASQSVY
GNNDLA
1 ALVMTQTPAS VSAAVGGTVT TKCWYQH KPGQPPKLLI
LASTLAT
LGGGDDEADN
51 YGV PSRFSGSGSG TQFTLTITGV QSDDAATYYC
V
101 FGGGTEVVV K
SEQ ID NO:15 (HC VR 8)
YAMG
II
1 QSLEESGGRL VTPGTPLTLT CTASGVDLSN WVRQAP GKGLEWIG
YAGGSTSYAT
WAKG
HRSDGY
51 RFTISK TSTTMDLKMT SPTTEDTATY FCAR
DYFHL
101 WGPGT LVTVSL
SEQ ID NO:16 (LC VR 8)
QASQSIS
SWLA
D
1 AIDMTQTPAS VSEPVGGTVT IKCWYQQKP GQRPKLLIY
ASKLAS
QQ
GYAVSYVENI
51 GVPS RFSGSGSGTE FTLTISGVQS DDAAAYYC
101 FGGGTEVVVK
SEQ ID NO:17 (HC VR 9)
YGVS
II
1 QSMEESGGRL VTPGTPLTLT CTASGFSLSN WVRQAP GKGLEWIG
YGGSDITAYA
SWAKG
SYTNG
51 RFTIS KTSTTVDLTI TSPTTEDTAT YFCAK
MDYYNI
101 WGPG TLVTVSL
SEQ ID NO:18 (LC VR 9)
QASQSIS
SYLA
S
1 AFDLTQTPSS VEAPVGGTVI IKCWYQQKP GQPPKLLIY
ASTLAS
QS
YYGSRSNV
51 GVSS RFKGSGSETQ FPLTISDLES ADAATYYCFG
101 GGTEVVVK
SEQ ID NO:19 (HC VR 29AM4-5)
YYFIH
S
1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIS WVRQA PGKGLEWVA
VYSSFGYTYY
ADSVKGRFT
RFT
51 I SADTSKNTAY LQMNSLRAED TAVYYCA
FPGLFDGFFG
AYLGSLDY
101 WG QGTLVTVSS
SEQ ID NO:20 (LC VR 29AM4-5)
RASQSVS
SAVA
S
1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCWYQQKP GKAPKLLIY
ASSLYS
QQ
AVNWVGALVT
51 GVPS RFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC
101 FGQGTKVEIK
SEQ ID NO:21 (HC VR 12C4)
NYWMN
E
1 EVKLEESGGG LMQPGGSMKL SCVASGFTFS WVRQS PEKGLEWVA
IRLKSNNYAT
HYAESV
R
51 KGRF TISRDDSKSS VYLQMNNLRA EDTGIYYCI
DYDYDAYFDY
101  WGQGTTLTVS S
SEQ ID NO:22 (LC VR 12C4)
RASKSVS
TSGYNYMY
1 DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCWY QQKPGQPPKL
LASNLES
G
QHSGELPY
51 LIYVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDAATY YC
T
101 FGGGTKLEI K
SEQ ID NO:23 (HC VR KWAR23)
GFNIK
DYYIH
R
1 EVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCTASWVQQR TEQGLEWIG
IDPEDGETKY
APKFQD
WG
51 KATI TADTSSNTAY LHLSSLTSED TAVYYCAR
AY
101 WGQGTLVT VSS
SEQ ID NO:24 (LC VR KWAR23)
SASSSVS
SSYLY
1 QIVLTQSPAI MSASPGEKVT LTCWYQQK PGSSPKLWIY
STSNLAS
H
QWSSYPRT
51 GVP ARFSGSGSGT SYSLTISSME AEDAASYFCFG
101 AGTKLELK
1
SEQ ID NO:25 (константная область HC антитела человеческого IgG)
1 ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
51 HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP
101 KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS
151 HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK
201 EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC
251 LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW
301 QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
1
SEQ ID NO:26 (константная область κ LC антитела человеческого IgG)
1 RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG
51 NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK
101 SFNRGEC
1
SEQ ID NO:27 (мутантный вариант LALA константной области HC антитела человеческого IgG) (мутации подчеркнуты underlined)
1 ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
51 HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP
AA
101 KSCDKTHTCP PCPAPEGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS
151 HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK
201 EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC
251 LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW
301 QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
SEQ ID NO:28 (лидерная последовательность HC 1-9, 15+16, LC 1-9+12)
1 MGWSCIILFL VATATGVHS
SEQ ID NO:29 (лидерная последовательность HAVT20)
MACPGFLWAL VISTCLEFSMA
SEQ ID NO:30 (HC VR 10)
1 KVEESGGGLV QPGGSLRLSC AASGFSLSSY VMGWVRQAPG KGLEWVSIIS
51 SSGSPYYASW VNGRFTISKD NSEGMVYLQM NSLRAEDTAV YYCARVGPLG
101 VDYFNIWGQG TTVTVSS
SEQ ID NO:31 (LC VR 10)
1 DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCQAGQSIN SYLAWYQQKP GQPPKLLIYY
51 ASTLESGVPD RFSGSGSGTD FTLTISSLQA EDVAVYYCQS WHYISRSYAF
101 GGGTKLEIK
SEQ ID NO:32 (HC VR 11)
1 EVKVEESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFSLS SYVMGWVRQA PGKGLEWVSI
51 ISSSGSPYYA SWVNGRFTIS KTSTTMDLQM NSLRAEDTAV YYCARVGPLG
101 VDYFNIWGQG TTVTVSS
SEQ ID NO:33 (LC VR 11)
1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCQAGQSIN SYLAWYQQKP GKVPKLLIYY
51 ASTLESGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCQS WHYISRSYAF
101 GQGTKVEIK
SEQ ID NO:34 (HC VR 12)
1 VQLVESGGRL VQPGTPLTLS CTVSGFSLSS YVMGWFRQAP GKGLEYIGII
51 SSSGSPYYAS WVNGRFTISK TSTTMDLKMN SLRSEDTATY FCARVGPLGV
101 DYFNIWGPGT LVTVSS
SEQ ID NO:35 (HC VR 13+14)
1 RQLVESGGGL VQPGGSLRLS CTASGFSLSS HGISWVRQAP GKGLEYIGTI
51 GTGVITYFAS WAKGRFTGSK TSSTAYMELS SLRSEDTAVY FCARGSAWND
101 PFDPWGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:36 (LC VR 13)
1 AIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCQASQSVY GNNDLAWYQQ KPGKAPKLLI
51 YLASTLATGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC LGGGDDEADN
101 VFGGGTKVEI K
SEQ ID NO:37 (LC VR 14+16)
1 DIEMTQSPSS VSASVGDRVT LTCQASQSVY GNNDLAWYQQ KPGQAPKLLI
51 YLASTLATGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC LGGGDDEADN
101 VFGGGTKVEI K
SEQ ID NO:38 (LC VR 15)
1 ELVMTQSPSS LSASVGDRVT ITCQASQSVY GNNDLAWYQQ KPGEAPKLLI
51 YLASTLATGV PSRFSGSGSG TDFTLTISGL QSEDFATYYC LGGGDDEADN
101 VFGQGTKVEI K
SEQ ID NO:39 (лидерная последовательность тяжелых цепей 10-14)
1 MGWTLVFLFL LSVTAGVHS
SEQ ID NO:40 (лидерная последовательность легких цепей 10, 11, 13-16)
1 MVSSAQFLGL LLLCFQGTRC
--->
СПИСКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Synthon Biopharmaceuticals B.V.
VERHEIJDEN Gijsbertus Franciscus Maria
ROUWENDAL Gerard Johan Adolph
ARENDS Roland Jan
BERG, VAN DEN Timo Kars
MATLUNG Hanke Lottie
SZILAGYI Katarina
<120> АНТИ-SIRPальфа АНТИТЕЛА С МУТАЦИЕЙ LALA
<130> P1703PC00/PB-078
<140> PCT/EP2018/062473
<141> 2018-05-15
<160> 40
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 117
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SEQ ID NO:1 (HC VR 1)
<400> 1
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1               5                   10                  15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Tyr Ala
20                  25                  30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35                  40                  45
Ile Ile Ser Ser Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50                  55                  60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Pro
65                  70                  75                  80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Leu
85                  90                  95
Trp Ala Ala Ser Asn Tyr Tyr Met Ala Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 111
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SEQ ID NO:2 (LC VR 1)
<400> 2
Ala Ile Lys Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Ser Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Glu Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Ser
65                  70                  75                  80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Asp Tyr Tyr Ser Ser Ser
85                  90                  95
Gly Asp Thr Gly Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100                 105                 110
<210> 3
<211> 116
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SEQ ID NO:3 (HC VR 2)
<400> 3
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1               5                   10                  15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr Ala
20                  25                  30
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35                  40                  45
Ile Ile Tyr Thr Gly Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly
50                  55                  60
Gln Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr
65                  70                  75                  80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Asp
85                  90                  95
Arg Asp Gly Tyr Ala Tyr Phe Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Leu
115
<210> 4
<211> 110
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SEQ ID NO:4 (LC VR 2)
<400> 4
Gln Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Phe Ser Val Ser Ala Val Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser His Asn Ile Gly Ser Trp
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu Ser
65                  70                  75                  80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Gly Ile Ser Tyr
85                  90                  95
Val His Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100                 105                 110
<210> 5
<211> 116
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SEQ ID NO:5 (HC VR 3)
<400> 5
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1               5                   10                  15
Leu Thr Leu Ala Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ile Ser Tyr Tyr
20                  25                  30
Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
35                  40                  45
Ile Ile Asn Ile Gly Gly Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50                  55                  60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr
65                  70                  75                  80
Ser Pro Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Met Ser Tyr
85                  90                  95
Gly Met Asp Thr Gly Ala Phe Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Leu
115
<210> 6
<211> 110
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SEQ ID NO:6 (LC VR 3)
<400> 6
Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Glu Ser Val Tyr Lys Asn
20                  25                  30
Asn Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu
35                  40                  45
Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50                  55                  60
Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu
65                  70                  75                  80
Glu Ser Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gly Gly Tyr Arg Thr
85                  90                  95
Asp Ile Tyr Pro Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100                 105                 110
<210> 7
<211> 116
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SEQ ID NO:7 (HC VR 4)
<400> 7
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Gly Thr Pro Gly Thr Pro
1               5                   10                  15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Val
20                  25                  30
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
35                  40                  45
Ile Ile Ser Ser Ser Gly Ser Pro Tyr Tyr Ala Ser Trp Val Asn Gly
50                  55                  60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Met Asp Leu Lys Met Asn
65                  70                  75                  80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Val Gly
85                  90                  95
Pro Leu Gly Val Asp Tyr Phe Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Leu
115
<210> 8
<211> 109
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SEQ ID NO:8 (LC VR 4)
<400> 8
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Glu Ala Ala Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Gly Gln Ser Ile Asn Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Ser
65                  70                  75                  80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Trp His Tyr Ile Ser Arg
85                  90                  95
Ser Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100                 105
<210> 9
<211> 116
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SEQ ID NO:9 (HC VR 5)
<400> 9
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1               5                   10                  15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Val
20                  25                  30
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Ala Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
35                  40                  45
Tyr Ile Asn Ala Asp Gly Ser Pro Tyr Tyr Ala Thr Trp Val Asn Gly
50                  55                  60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Pro Thr Thr Met Asp Leu Lys Ile Asn
65                  70                  75                  80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Val Gly
85                  90                  95
Pro Leu Gly Val Asp Tyr Phe Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Leu
115
<210> 10
<211> 109
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SEQ ID NO:10 (LC VR 5)
<400> 10
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Arg Tyr
20                  25                  30
Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Glu Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Ser
65                  70                  75                  80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Tyr Tyr Ile Ser Arg
85                  90                  95
Thr Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100                 105
<210> 11
<211> 116
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SEQ ID NO:11 (HC VR 6)
<400> 11
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1               5                   10                  15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Tyr Thr
20                  25                  30
Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35                  40                  45
Ile Ile Tyr Ala Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50                  55                  60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr
65                  70                  75                  80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Ser
85                  90                  95
Ser Asp Gly Tyr Asp Tyr Phe Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Leu
115
<210> 12
<211> 111
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SEQ ID NO:12 (LC VR 6)
<400> 12
Gly Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Trp
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Arg Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val Gln Ser
65                  70                  75                  80
Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Val Thr Ala Ala Ser
85                  90                  95
Asn Val Asp Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100                 105                 110
<210> 13
<211> 115
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SEQ ID NO:13 (HC VR 7)
<400> 13
Arg Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1               5                   10                  15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser His Gly
20                  25                  30
Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
35                  40                  45
Thr Ile Gly Thr Gly Val Ile Thr Tyr Phe Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50                  55                  60
Arg Phe Thr Gly Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr
65                  70                  75                  80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Ser
85                  90                  95
Ala Trp Asn Asp Pro Phe Asp Pro Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser
115
<210> 14
<211> 111
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SEQ ID NO:14 (LC VR 7)
<400> 14
Ala Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Thr Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Gly Asn
20                  25                  30
Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35                  40                  45
Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val
65                  70                  75                  80
Gln Ser Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Gly Asp Asp
85                  90                  95
Glu Ala Asp Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100                 105                 110
<210> 15
<211> 116
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SEQ ID NO:15 (HC VR 8)
<400> 15
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1               5                   10                  15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Val Asp Leu Ser Asn Tyr Ala
20                  25                  30
Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35                  40                  45
Ile Ile Tyr Ala Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly
50                  55                  60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Met Asp Leu Lys Met Thr
65                  70                  75                  80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg His Arg
85                  90                  95
Ser Asp Gly Tyr Asp Tyr Phe His Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Leu
115
<210> 16
<211> 110
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SEQ ID NO:16 (LC VR 8)
<400> 16
Ala Ile Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ser
65                  70                  75                  80
Asp Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ala Val Ser Tyr
85                  90                  95
Val Glu Asn Ile Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100                 105                 110
<210> 17
<211> 117
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SEQ ID NO:17 (HC VR 9)
<400> 17
Gln Ser Met Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1               5                   10                  15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr Gly
20                  25                  30
Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35                  40                  45
Ile Ile Tyr Gly Gly Ser Asp Ile Thr Ala Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Thr Ile
65                  70                  75                  80
Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Lys Ser
85                  90                  95
Tyr Thr Asn Gly Met Asp Tyr Tyr Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Leu
115
<210> 18
<211> 108
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SEQ ID NO:18 (LC VR 9)
<400> 18
Ala Phe Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Glu Ala Pro Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Ile Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Glu Thr Gln Phe Pro Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Ser
65                  70                  75                  80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Tyr Gly Ser Arg Ser
85                  90                  95
Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100                 105
<210> 19
<211> 129
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SEQ ID NO:19 (HC VR 29AM4-5))
<400> 19
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Tyr
20                  25                  30
Phe Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Ser Val Tyr Ser Ser Phe Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Phe Thr Phe Pro Gly Leu Phe Asp Gly Phe Phe Gly Ala Tyr
100                 105                 110
Leu Gly Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ser
<210> 20
<211> 110
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SEQ ID NO:20 (LC VR 29AM4-5)
<400> 20
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Val Asn Trp Val Gly
85                  90                  95
Ala Leu Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210> 21
<211> 121
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SEQ ID NO:21 (HC VR 12C4)
<400> 21
Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Met Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu
50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser
65                  70                  75                  80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr
85                  90                  95
Tyr Cys Ile Arg Asp Tyr Asp Tyr Asp Ala Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115                 120
<210> 22
<211> 111
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SEQ ID NO:22 (LC VR 12C4)
<400> 22
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20                  25                  30
Gly Tyr Asn Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65                  70                  75                  80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Gly
85                  90                  95
Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210> 23
<211> 113
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SEQ ID NO:23 (HC KWAR23 )
<400> 23
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Gln Gln Arg Thr Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe
50                  55                  60
Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Trp Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100                 105                 110
Ser
<210> 24
<211> 108
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SEQ ID NO:24 (LC VR KWAR23)
<400> 24
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20                  25                  30
Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp
35                  40                  45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu
65                  70                  75                  80
Ala Glu Asp Ala Ala Ser Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro
85                  90                  95
Arg Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100                 105
<210> 25
<211> 330
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SEQ ID NO 25: (константная область HC человеческого антитела IgG1)
<400> 25
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225                 230                 235                 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325                 330
<210> 26
<211> 107
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SEQ ID NO 26: (константная область LC человеческого антитела IgG)
<400> 26
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1               5                   10                  15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20                  25                  30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35                  40                  45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50                  55                  60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65                  70                  75                  80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85                  90                  95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100                 105
<210> 27
<211> 330
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SEQ ID NO 27: (мутантный вариант LALA константной области HC
человеческого антитела IgG1
(мутации подчеркнуты)
<400> 27
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225                 230                 235                 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325                 330
<210> 28
<211> 19
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SEQ ID NO:28 (лидерная последовательность антител 1-9)
<400> 28
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1               5                   10                  15
Val His Ser
<210> 29
<211> 21
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SEQ ID NO:29 (HAVT20 лидерная последовательность)
<400> 29
Met Ala Cys Pro Gly Phe Leu Trp Ala Leu Val Ile Ser Thr Cys Leu
1               5                   10                  15
Glu Phe Ser Met Ala
20
<210> 30
<211> 117
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SEQ ID NO:30 (HC10
<400> 30
Lys Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
1               5                   10                  15
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Val Met
20                  25                  30
Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ile
35                  40                  45
Ile Ser Ser Ser Gly Ser Pro Tyr Tyr Ala Ser Trp Val Asn Gly Arg
50                  55                  60
Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Glu Gly Met Val Tyr Leu Gln Met
65                  70                  75                  80
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val
85                  90                  95
Gly Pro Leu Gly Val Asp Tyr Phe Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 31
<211> 109
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SEQ ID NO:31 (LC 10)
<400> 31
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Gln Ala Gly Gln Ser Ile Asn Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Ser Trp His Tyr Ile Ser Arg
85                  90                  95
Ser Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210> 32
<211> 117
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SEQ ID NO:32 (HC VR 11)
<400> 32
Glu Val Lys Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Val Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ile Ile Ser Ser Ser Gly Ser Pro Tyr Tyr Ala Ser Trp Val Asn
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Met Asp Leu Gln Met
65                  70                  75                  80
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val
85                  90                  95
Gly Pro Leu Gly Val Asp Tyr Phe Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 33
<211> 109
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SEQ ID NO:33 (LC VR 11)
<400> 33
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Gly Gln Ser Ile Asn Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Trp His Tyr Ile Ser Arg
85                  90                  95
Ser Tyr Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210> 34
<211> 116
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SEQ ID NO:34 (HC VR 12)
<400> 34
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Gln Pro Gly Thr Pro
1               5                   10                  15
Leu Thr Leu Ser Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Val
20                  25                  30
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
35                  40                  45
Ile Ile Ser Ser Ser Gly Ser Pro Tyr Tyr Ala Ser Trp Val Asn Gly
50                  55                  60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Met Asp Leu Lys Met Asn
65                  70                  75                  80
Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Val Gly
85                  90                  95
Pro Leu Gly Val Asp Tyr Phe Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 35
<211> 116
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SEQ ID NO:34 (HC VR 12)
<400> 35
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Gln Pro Gly Thr Pro
1               5                   10                  15
Leu Thr Leu Ser Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Val
20                  25                  30
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
35                  40                  45
Ile Ile Ser Ser Ser Gly Ser Pro Tyr Tyr Ala Ser Trp Val Asn Gly
50                  55                  60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Met Asp Leu Lys Met Asn
65                  70                  75                  80
Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Val Gly
85                  90                  95
Pro Leu Gly Val Asp Tyr Phe Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 36
<211> 111
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SEQ ID NO:36 (LC VR 13)
<400> 36
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Gly Asn
20                  25                  30
Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35                  40                  45
Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Gly Asp Asp
85                  90                  95
Glu Ala Asp Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210> 37
<211> 111
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SEQ ID NO:37 (LC VR 14 +16)
<400> 37
Asp Ile Glu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Gly Asn
20                  25                  30
Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu
35                  40                  45
Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Gly Asp Asp
85                  90                  95
Glu Ala Asp Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210> 38
<211> 111
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SEQ ID NO:38 (LC VR 15)
<400> 38
Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Gly Asn
20                  25                  30
Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu
35                  40                  45
Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ser Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Gly Asp Asp
85                  90                  95
Glu Ala Asp Asn Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210> 39
<211> 19
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SEQ ID NO:39 (лидерная последовательность тяжелых цепей 10-14)
<400> 39
Met Gly Trp Thr Leu Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1               5                   10                  15
Val His Ser
<210> 40
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SEQ ID NO:40 (лидерная последовательность легких цепей 10, 11, 13-16)
<400> 40
Met Val Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly Thr Arg Cys
20
<---