СИСТЕМЫ И СПОСОБЫ ДЛЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
SYSTEMS AND METHODS FOR BIOLOGICAL ANALYSIS

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0001] Настоящее изобретение в целом касается систем, устройств и способов наблюдения, испытания и/или анализа одного или нескольких биологических проб, более конкретно - систем, устройств и способов наблюдения, испытания и/или анализа множества биологических проб.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] В целом существует потребность во все большей автоматизации систем биологического анализа для повышения эффективности. Например, прогресс в области приборов для автоматизированной обработки биологических проб позволяет быстрее и эффективнее анализировать пробы.
[0003] Также возрастает потребность в обеспечении систем биологического анализа, спроектированных для удовлетворения потребностей пользователей, таких, как легкость в установке, легкость в использовании, минимальное необходимое пространство лаборатории.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0004] В варианте осуществления настоящего изобретения обеспечивается система для биологического анализа. Система содержит узел блока пробоподготовки, содержащий блок пробоподготовки, выполненный с возможностью вмещения держателя проб, держатель проб, выполнен с возможностью приема множества проб. Система также может содержать систему управления, выполненную с возможностью реверсивного циклирования множества проб по ряду температур, и лоток, выполнен с возможностью подвижного перемещения узла блока пробоподготовки из закрытой в открытую позицию и в обратном направлении для обеспечения доступа пользователя к множеству держателей проб.
[0005] В другом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа. Система содержит блочный узел, содержащий блок пробоподготовки, который имеет множество лунок, блок пробоподготовки, выполненный с возможностью вмещения держателя проб, держатель проб, выполнен с возможностью приема множества проб. Система также может содержать систему управления, выполненную с возможностью циклирования множества проб по ряду температур, и оптическую систему, выполненную с возможностью доставки возбуждающего света на множество проб и обнаружения уровня флуоресценции, излучаемой каждым из множества проб. Система также может содержать нагревательную крышку, содержащую нижнюю пластину, нагреватель и верхнюю пластину, имеющую множество отверстий верхней пластины. Нижняя пластина может иметь сопрягаемую поверхность для сопряжения с верхней поверхностью держателя пробы, причем сопрягаемая поверхность имеет множество отверстий нижней пластины, каждое из которых совмещается и связывается с одним из множества лунок блока, таким образом, чтобы возбуждающий свет мог проходить к лункам блока.
[0006] В еще одном варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа. Система содержит множество модулей системы, причем это множество модулей содержит детекторный модуль, эмиссионный модуль, возбуждающий модуль и базовый модуль. Множество модулей системы может быть выполнено с возможностью реверсивного соединения с возможностью разъединения для изготовления устройства первого типа для биологического анализа.
[0007] В другом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа. Система содержит прибор и систему калибровки для калибровки прибора. Прибор может содержать блочный узел, содержащий блок пробоподготовки, выполненный с возможностью вмещения держателя проб и который имеет множество реакционных зон, и оптическую систему, способную визуализировать флуоресцентное излучение из множества реакционных зон. Система калибровки может содержать калибратор исследуемой области (ROI), выполнен с возможностью определения позиций реакционной зоны в изображении. Система калибровки также может содержать калибратор чистого красителя, выполнен с возможностью определения доли флуоресцентного красителя, используемого в каждой реакционной зоне, путем сравнения необработанного спектра флуоресцентного красителя с калибровочными данными чистого спектра флуоресцентного красителя. Система калибровки также может содержать калибратор нормализации прибора, выполнен с возможностью определения коэффициента нормализации фильтра. Система калибровки также может содержать P-валидатор РНКазы, выполненный с возможностью подтверждения способности прибора к распознаванию между двумя разными значениями количества пробы. Система калибровки также может содержать дисплейное устройство, выполненное с возможностью демонстрации результатов калибровки.
[0008] Дополнительные аспекты, особенности и преимущества настоящего изобретения изложены в представленном далее описании и формуле изобретения, в частности, при рассмотрении в сочетании с прилагаемыми фигурами, на которых одинаковые детали обозначаются одинаковыми условными номерами.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
[0009] ФИГ. 1 представляет блок-диаграмму, которая иллюстрирует типичную систему прибора, на примере которой могут осуществляться варианты осуществления настоящего изобретения.
[0010] ФИГ. 2 представляет блок-диаграмму, которая иллюстрирует компьютерную систему, на примере которой могут осуществляться варианты осуществления настоящего изобретения.
[0011] ФИГ. 3 иллюстрирует типичную систему распределенной сети в соответствии с различными описываемыми авторами вариантами осуществления.
[0012] ФИГ. 4 иллюстрирует систему термоциклера с корпусом в соответствии с различными описываемыми авторами вариантами осуществления.
[0013] ФИГ. 5 иллюстрирует систему термоциклера с ФИГ. 4 с подвижным лотком в открытой позиции в соответствии с различными описываемыми авторами вариантами осуществления.
[0014] ФИГ. 6 иллюстрирует модульную систему прибора в соответствии с различными описываемыми авторами вариантами осуществления.
[0015] ФИГ. 7 является схематическим представлением системы в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.
[0016] ФИГ. 8 является графиком нормализованного спектра различных источников света, включая источник света в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.
[0017] ФИГ. 9 является графиком спектральной интеграции в различных диапазонах длины волны для спектров источника света, показанных на ФИГ. 8.
[0018] ФИГ. 10 представляет объемную модель оптической системы и системы обработки проб в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.
[0019] ФИГ. 11 представляет увеличенную объемную модель оптической системы, показанной на ФИГ. 7.
[0020] ФИГ. 12 является видом в разрезе части оптической системы, показанной на ФИГ. 10.
[0021] ФИГ. 13 является перспективным видом сверху блока визуализации в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.
[0022] ФИГ. 14 является видом в разрезе блока визуализации, показанного на ФИГ. 13.
[0023] ФИГ. 15 и 16 являются перспективными видами снизу блока визуализации, показанного на ФИГ. 13.
[0024] ФИГ. 17-19 являются увеличенными видами частей блока визуализации, показанных на ФИГ. 13.
[0025] ФИГ. 20 является видом в разрезе системы, показанной на ФИГ. 11.
[0026] ФИГ. 21 иллюстрирует последовательность операций калибровки для биологического прибора в соответствии с различными описываемыми авторами вариантами осуществления.
[0027] ФИГ. 22 иллюстрирует последовательность этапов, применяемую при калибровке приборов для количественной ПЦР.
[0028] ФИГ. 23 иллюстрирует исследуемые области для 96-луночного контейнера для проб.
[0029] ФИГ. 24 является изображением калибровочного планшета с красителем FAM, занимающим каждую лунку 96-луночного калибровочного планшета.
[0030] ФИГ. 25 и 26 представляют пример последовательности операций в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.
[0031] ФИГ. 27A иллюстрирует калибровочные планшеты в шахматной конфигурации в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.
[0032] ФИГ. 27B является изображением 96-луночного калибровочного планшета в шахматной конфигурации с четырьмя красителями: FAM, VIC, ROX и SYBR в такой же конфигурации, как показано на примере планшета 3100 на ФИГ. 11.
[0033] ФИГ. 28A иллюстрирует смеси красителей, применяемые в различных вариантах осуществления настоящего изобретения.
[0034] ФИГ. 28B иллюстрирует чистые красители и комбинации фильтров главного канала для различных вариантов осуществления настоящего изобретения.
[0035] ФИГ. 29 иллюстрирует % отклонения смеси красителей перед нормализацией в соответствии с различными вариантами осуществления настоящего изобретения.
[0036] ФИГ. 30 иллюстрирует % отклонения смеси красителей после нормализации в соответствии с различными вариантами осуществления настоящего изобретения.
[0037] ФИГ. 31 иллюстрирует в укрупненном виде % отклонения смеси красителей после нормализации в соответствии с различными вариантами осуществления настоящего изобретения.
[0038] ФИГ. 32 является блок-схемой, показывающей процесс нормализации в соответствии с различными вариантами осуществления настоящего изобретения.
[0039] ФИГ. 33 иллюстрирует типичный способ проверки прибора в соответствии с различными описываемыми авторами вариантами осуществления.
[0040] ФИГ. 34 иллюстрирует еще один типичный способ проверки прибора в соответствии с различными описываемыми авторами вариантами осуществления.
[0041] ФИГ. 35 иллюстрирует определение множества порогов флуоресценции на основе данных амплификации в соответствии с различными описываемыми авторами вариантами осуществления.
[0042] ФИГ. 36 иллюстрирует систему для проверки прибора в соответствии с различными описываемыми авторами вариантами осуществления.
[0043] ФИГ. 37 иллюстрирует систему для калибровки прибора в соответствии с различными описываемыми авторами вариантами осуществления.
[0044] ФИГ. 38 иллюстрирует подвижный узел в соответствии с различными описываемыми авторами вариантами осуществления.
[0045] ФИГ. 39 иллюстрирует подвижный узел с ФИГ. 38 со снятым узлом блока пробоподготовки в соответствии с различными описываемыми авторами вариантами осуществления.
[0046] ФИГ. 40 является боковой проекцией варианта осуществления с ФИГ. 38 в соответствии с различными описываемыми авторами вариантами осуществления.
[0047] ФИГ. 41A, 41B и 41C представляют разные виды оптических датчиков подвижного узла в соответствии с различными описываемыми авторами вариантами осуществления.
[0048] ФИГ. 42A и 42B представляют разные виды оптических датчиков подвижного узла в соответствии с различными описываемыми авторами вариантами осуществления.
[0049] ФИГ. 43 иллюстрирует вариант осуществления узла блока пробоподготовки в соответствии с различными описываемыми авторами вариантами осуществления.
[0050] ФИГ. 44A иллюстрирует нагревательную крышку в соответствии с различными описываемыми авторами вариантами осуществления.
[0051] ФИГ. 44B и 44C представляют виды сверху прижимной пластины в соответствии с различными описываемыми авторами вариантами осуществления.
[0052] ФИГ. 45 иллюстрирует систему блока нагревательной крышки в соответствии с различными описываемыми авторами вариантами осуществления.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0053] Ниже в описании представлены варианты осуществления настоящего изобретения, которые в целом касаются систем, устройств и способов подготовки, наблюдения, испытания и/или анализа множества биологических проб. Это описание не ограничивает объем настоящего изобретения, а лишь представляет описание вариантов его осуществления.
ОБЗОР СИСТЕМЫ
[0054] Для подготовки, наблюдения, испытания и/или анализа множества биологических проб одним из примеров может быть прибор, который может применяться в соответствии с различными вариантами осуществления, является термоциклер, например, прибор для полимеразной цепной реакции (ПЦР) конечной точки или прибор для количественной ПЦР или ПЦР в реальном времени. ФИГ. 1 представляет блок-диаграмму, которая иллюстрирует систему термоциклера 100, на примере которой могут осуществляться варианты осуществления настоящего изобретения. Система термоциклера 100 может содержать нагревательную крышку 110, которая подробнее обсуждается ниже и располагается над блоком пробоподготовки 114 с множеством зон реакции или лунок блока пробоподготовки, которые выполнены с возможностью загрузки множества проб 112 на держателе пробы (не показан), которые также подробнее обсуждаются ниже.
[0055] В разных вариантах осуществления держателя проб может иметь множество зон для проб или лунок, выполненных с возможностью приема множества проб, причем лунки могут быть герметично закрыты в пределах держателя пробы крышкой, колпачком, герметизирующей пленкой или любым другим средством герметизации между лунками и нагревательной крышкой 110. Некоторыми примерами держателя пробы могут быть, помимо прочих, любого размера многолуночный планшет, карта или решетка, включая, помимо прочих, 24-луночный микротитровальный планшет, 48-луночный микротитровальный планшет, 96-луночный микротитровальный планшет, 384-луночный микротитровальный планшет, микрокарту, решетку со сквозными отверстиями, или по сути плоский держатель, такой, как стеклянная или пластиковая предметная пластинка. Лунки в разных вариантах осуществления держателя пробы могут представлять собой углубления, выемки, борозды и их комбинации, расположенные в правильном или неправильном порядке и образуемые на поверхности подложки держателя пробы. пробы или реакционные объемы также могут находиться в пределах лунок или выемок, образуемых в подложке, капель раствора, распределенных по поверхности подложки, или других типов реакционных камер, или в других форматах, например, пробы или растворы, находящиеся в пределах зон или объемов для испытания микрофлюидных систем или в пределах малых гранул или сфер или на них.
[0056] В другом варианте осуществления исходная проба или раствор могут разделяться на сотни, тысячи, десятки тысяч, сотни тысяч или даже миллионы реакционных зон, каждая из которых имеет объем, например, несколько нанолитров, около одного нанолитра или менее одного нанолитра (например, десятков или сотен пиколитров или меньше).
[0057] Система термоциклера 100 также может содержать блок пробоподготовки 114, элементы для нагрева и охлаждения 116, теплообменник 118, систему управления 120 и пользовательский интерфейс 122, причем компоненты 114, 116 и 118 могут быть включены в термический блочный узел. Более подробно термический блочный узел обсуждается ниже.
[0058] В одном варианте осуществления элементы для нагрева и охлаждения 116 могут быть термоэлектрическими устройствами, такими, как, например, Устройства Пельтье. Количество применяемых термоэлектрических устройств, применяемых в термическом блочном узле может зависеть от многих факторов, включая, помимо прочих, стоимость, количество необходимых независимых зон и размер держателя пробы. Например, блок пробоподготовки для держания 48-луночного микротитровального планшета может иметь размер, позволяющий вмещать одно термоэлектрическое устройство, тогда как блоки пробоподготовки, сконфигурированные для планшетов, имеющих большее количество лунок, могут вмещать более одного термоэлектрического устройства, например, четыре термоэлектрических устройства. Кроме того, если требуется контроль над многими зонами на блоке пробоподготовки, количество термоэлектрических устройств может колебаться от одного термоэлектрического устройства до, например, одного термоэлектрического устройства на каждую зону для пробы (например, лунку, сквозное отверстие, реакционную зону и т. п.) на блоке пробоподготовки. Например, блок пробоподготовки может быть разделен, например, 6 подблоков 16-луночного формата вместе образуют 96-луночную решетку, которая может вмещать 96-луночный микротитровальный планшет. Может быть необходимым независимый зонный контроль для каждого из подблоков, что обеспечивает 6 термоэлектрических устройств, каждое из которых соответствует связанному с ним подблоку.
[0059] В альтернативном варианте осуществления система термоциклера 100 может иметь двусторонний термический узел, в котором элементы для нагрева и охлаждения 116 и теплообменник 118 могут быть предусмотрены над (верхняя сторона) и под (нижняя сторона) блоком пробоподготовки 114. В таком варианте осуществления верхняя сторона двустороннего термического узла, предусмотренная над блоком пробоподготовки 114, может заменять нагревательную крышку 110. Такая конфигурация может обеспечивать более равномерный нагрев сверху и снизу проб. Для термоциклера в реальном времени верхняя сторона может иметь части прозрачной конструкции, обеспечивающие прохождение источника возбуждающего света и излучаемой флуоресценции. Такие части могут быть выполнены из любого прозрачного материала, включая, например, пластик и стекло.
[0060] Система термоциклера 100 также может иметь оптическую систему 124. Как показано на ФИГ. 1, оптическая система 124 может иметь источник освещения (не показан), излучающий электромагнитную энергию, оптический датчик, детектор или формирователь изображений (не показан) для получения электромагнитной энергии от проб 112 в держателе пробы и оптику, применяемую для направления электромагнитной энергии от каждой пробы ДНК до формирователя изображений. Оптическая система более подробно обсуждается ниже.
[0061] систему управления 120 применяют для контроля над функциями оптической системы 124, нагревательной крышки 110 и термического блочного узла, который может содержать блок пробоподготовки 114, нагревательные и охлаждающие элементы 116 и теплообменник 118. система управления 120 может быть доступна конечному пользователю через пользовательский интерфейс 122 системы термоциклера 100 на ФИГ. 1. система управления 120 может применяться для контроля калибровки системы термоциклера 100, как более подробно обсуждается ниже.
КОМПЬЮТЕРИЗИРОВАННАЯ СИСТЕМА
[0062] Способы в соответствии с описанными авторами вариантами осуществления могут быть реализованы в компьютерной системе.
[0063] Специалисты в данной области техники признают, что операции в разных вариантах осуществления могут выполняться с применением аппаратных средств, программного обеспечения, программно-аппаратных средств или их комбинаций в соответствующих случаях. Например, некоторые процессы могут выполняться с применением процессоров или других цифровых схем под контролем программ, программно-аппаратных средств или жестко смонтированных логических схем. (Термин "логическая" в данном случае относится к фиксированным аппаратным средствам, программируемым логическим схемам и/или их соответствующей комбинации, как станет понятно специалисту в данной области техники при выполнении указанных функций.) Аппаратные средства и программно-аппаратные средства могут храниться на энергонезависимых машиночитаемых носителях. Некоторые другие процессы могут осуществляться с применением аналоговой схемы, как хорошо известно специалистам в данной области техники. Кроме того, в вариантах осуществления изобретения могут быть реализованы запоминающее устройство или другое средство хранения информации, а также компоненты связи.
[0064] ФИГ. 2 представляет блок-диаграмму, которая иллюстрирует компьютерную систему 200, которая может быть реализована для выполнения функции обработки в соответствии с различными вариантами осуществления. Приборы для выполнения экспериментов могут быть соединены с типовой вычислительной системой 200. В соответствии с различными вариантами осуществления, к приборам, которые могут применяться, относятся, например, система термоциклера 100 с ФИГ. 1. Вычислительная система 200 может содержать один или несколько процессоров, таких, как процессор 204. Процессор 204 может быть реализован с применением устройства обработки информации общего или специального назначения, например, микропроцессора, контроллера или другой управляющей логической схемы. Процессор 204 может быть соединен с шиной 202 или другим средством связи.
[0065] Как показано на ФИГ. 2, компьютерная система 200 может обеспечивать контроль над функцией системы термоциклера 100 на ФИГ. 1, а также функцией пользовательского интерфейса. Кроме того, компьютерная система 200 с ФИГ. 2 может обеспечивать функции обработки данных, отображения и формирования отчетов. Все эти контрольные функции прибора могут иметь локальное предназначение для прибора для ПЦР. Как таковая, компьютерная система 200 может служить в качестве контрольной системы 120, представленной на ФИГ. 1. Компьютерная система 200 с ФИГ. 2 также может обеспечивать частичный или полный дистанционный контроль над функциями контроля, анализа и генерации отчетов, как более подробно обсуждается ниже.
[0066] Вычислительная система 200 с ФИГ. 2 также может быть реализована в любой из множества форм, таких, как смонтированный на стойке компьютер, базовый компьютер, сверхмощный компьютер, сервер, клиент, настольный компьютер, переносной персональный компьютер, планшет, портативное вычислительное устройство (например, персональный цифровой секретарь (PDA), сотовый телефон, смартфон, карманный компьютер и т. п.), кластерная решетка, нетбук, встроенные системы или любой другой тип вычислительного устройства специального или общего назначения, которое может быть желательным или подходящим для данного применения или в данных условиях. Кроме того, вычислительная система 200 может содержать традиционную сетевую систему, содержащую клиент-серверную среду и один или несколько серверов баз данных, или объединение с инфраструктурой LIS/LIMS. Специалистам в данной области техники известно множество традиционных сетевых систем, включая локальную вычислительную сеть (LAN) или территориальную вычислительную сеть (WAN), и включая беспроводные и/или проводные компоненты. Кроме того, клиент-серверные среды, серверы баз данных и сети являются широко известными в данной области техники и документально подтвержденными. В соответствии с различными описываемыми авторами вариантами осуществления, вычислительная система 200 может быть выполнена с возможностью соединения с одним или несколькими серверами в распределенной сети. Вычислительная система 200 может принимать информацию или обновляемые данные из распределенной сети. Вычислительная система 200 также может передавать информацию для хранения в пределах распределенной сети, которая может быть доступна другим клиентам, соединенным с распределенной сетью.
[0067] Вычислительная система 200 с ФИГ. 2 дополнительно содержит запоминающее устройство 206, которое может быть запоминающим устройством с произвольным доступом (RAM) или другим динамическим запоминающим устройством, соединенным с шиной 202 для хранения команд, выполняемых процессором 204. Запоминающее устройство 206 также может использоваться для хранения временных переменных или другой промежуточной информации во время выполнения команд процессором 204.
[0068] Вычислительная система 200 дополнительно содержит постоянное запоминающее устройство (ROM) 208 или другое статическое запоминающее устройство, соединенное с шиной 202 для хранения статической информации и команд для процессора 204.
[0069] Вычислительная система 200 также может содержать устройство хранения информации 210, такое, как магнитный диск, оптический диск или твердотельный накопитель (SSD), соединенный с шиной 202 для хранения информации и команд. Устройство хранения информации 210 может содержать медиа-накопитель и сменный интерфейс хранения. Медиа-накопитель может содержать дисковод или другой механизм для поддержки фиксированного или съемного накопителя, такой, как дисковод для жестких дисков, дисковод для гибких дисков, накопитель на магнитной ленте, дисковод для оптических дисков, дисковод для CD или DVD (R или RW), флэш-накопитель или другой съемный или фиксированный медиа-накопитель. Как показывают эти примеры, накопитель может содержать машиночитаемый носитель данных, который имеет определенные хранящиеся на нем компьютерную программу, команды или данные.
[0070] В альтернативных вариантах осуществления устройство хранения информации 210 может содержать другие подобные технические средства, позволяющие загружать компьютерные программы или другие команды или данные в вычислительную систему 200. К таким техническим средствам относятся, например, съемное запоминающее устройство и интерфейс, например, программный картридж и интерфейс картриджа, съемная память (например, флэш-память или другой съемный модуль памяти) и слот памяти, а также другие съемные запоминающие устройства и интерфейсы, позволяющие передавать программы и данные с устройства хранения информации 210 на вычислительную систему 200.
[0071] Вычислительная система 200 с ФИГ. 2 также может содержать коммуникационный интерфейс 218. Коммуникационный интерфейс 218 применяют для обеспечения возможности передачи программ и данных между вычислительной системой 200 и внешними устройствами. Примерами коммуникационного интерфейса 218 могут быть модем, сетевой интерфейс (такой, как Ethernet или другой сетевой адаптер), коммуникационный порт (например, USB-порт, последовательный порт RS-232C), гнездо и плата PCMCIA, Bluetooth и т. п. Программы и данные, передаваемые через коммуникационный интерфейс 218, предусмотрены в форме сигналов, которые могут быть электронными, электромагнитными, оптическими или другими сигналами, которые могут быть приняты коммуникационным интерфейсом 218. Эти сигналы могут передаваться и приниматься коммуникационным интерфейсом 218 по каналу, например, в беспроводной среде, по проводу или по кабелю, по оптоволоконному кабелю, или в другой коммуникационной среде. Примерами каналов могут быть телефонная линия, линия сотовой связи, радиочастотная связь, сетевой интерфейс, местная или территориальная вычислительная сет и другие каналы связи.
[0072] Вычислительная система 200 может быть связана через шину 202 с дисплеем 212, таким, как электронно-лучевая трубка (CRT) или жидкокристаллический дисплей (LCD), для показа информации пользователю компьютера. Устройство ввода 214, содержащее буквенно-цифровые и другие клавиши, соединяется с шиной 202 для сообщения информации и выбранных команд, например, на процессор 204. Устройством ввода также может быть дисплей, такой, как LCD-дисплей, сконфигурированный с возможностью ввода через сенсорный экран. Другим типом пользовательского устройства ввода является средство управления курсором 216, такое, как мышь, шаровой манипулятор или клавиши управления курсором для сообщения информации о направлении или выбранных команд на процессор 204 и для контроля перемещения курсора на дисплее 212. Это устройство ввода, как правило, имеет две степени свободы по двум осям - первой оси (например, x) и второй оси (например, y), что позволяет устройству указывать позиции на плоскости. Вычислительная система 200 обеспечивает обработку данных и предусматривает доверительный уровень для таких данных. Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения, обработка данных и уровни достоверности обеспечиваются вычислительной системой 200 в ответ на выполнение процессором 204 одной или нескольких последовательностей одной или нескольких команд, содержащихся в запоминающем устройстве 206. Такие команды могут считываться в запоминающее устройство 206 с другого машиночитаемого носителя, такого, как устройство хранения информации 210. Выполнение последовательностей команд, содержащихся в запоминающем устройстве 206, вызывает выполнение процессором 204 описываемых авторами состояний процесса. В альтернативном варианте может применяться жесткопроводная схема вместо программных команд или в комбинации с ними для реализации вариантов осуществления настоящего изобретения. Таким образом, варианты осуществления настоящего изобретения не ограничиваются конкретной комбинацией аппаратной схемы и программы.
[0073] Термины "машиночитаемый носитель" и "компьютерный программный продукт" в контексте данного описания в целом касаются любого носителя, применяемого для передачи одной или нескольких последовательностей или одной или нескольких команд процессор 204 для их выполнения. Такие команды, в целом называемые "компьютерным программным кодом" (который может быть сгруппирован в форме компьютерных программ или других групп), при выполнении позволяют вычислительной системе 200 выполнять особенности или функции согласно вариантам осуществления настоящего изобретения. Эти и другие формы энергонезависимых машиночитаемых носителей могут приобретать многие формы, включая, помимо прочих, энергонезависимые среды, энергозависимые среды и среды передачи данных. К энергонезависимым средам относятся, например, твердотельные, оптические или магнитные диски, такие, как устройство хранения информации 210. К энергозависимым средам относятся динамическое запоминающее устройство, такое, как запоминающее устройство 206. К средам передачи данных относятся коаксиальные кабели, медный провод и оптоволоконный кабель, включая провода, содержащие шину 202.
[0074] К традиционным формам машиночитаемых носителей относятся, например, дискета, гибкий диск, жесткий диск, магнитная лента или любой другой магнитный носитель, CD-ROM или любой другой оптический носитель, перфокарты, бумажная перфолента, любой другой физический носитель со схемами расположения отверстий, RAM, PROM и EPROM, FLASH-EPROM, любая другая интегральная схема памяти или картридж памяти, несущая волна, как описывается ниже, или любой другой носитель, с которого может считывать компьютер.
[0075] Могут применяться разные формы машиночитаемых носителей для передачи одной или нескольких последовательностей одной или нескольких команд на процессор 204 для выполнения. Например, команды сначала могут находиться на магнитном диске удаленного компьютера. Удаленный компьютер может загружать команды в его динамическое запоминающее устройство и отправлять команды по телефонной линии с использованием модема. Модем по месту вычислительной системы 200 может принимать данные по телефонной линии и использовать инфракрасный передатчик для преобразования данных в инфракрасный сигнал. Инфракрасный детектор, соединенный с шиной 202, может принимать данные, переносимые в инфракрасном сигнале, и помещать данные на шину 202. Шина 202 переносит данные на запоминающее устройство 206, с которого процессор 204 получает команды и выполняет их. Команды, принятые запоминающим устройством 206, необязательно могут храниться в устройстве хранения информации 210 до или после выполнения процессором 204.
[0076] Следует понимать, что для ясности в представленном выше описании описаны варианты осуществления изобретения со ссылкой на разные функциональные блоки и процессоры. Однако очевидным является то, что может применяться любое подходящее распределение функций между различными функциональными блоками, процессорами и доменами без отклонения от сути изобретения. Например, функция, представленная как выполняемая отдельными процессорами или контроллерами, может выполняться одним и тем же процессором или контроллером. Таким образом, ссылки на конкретные функциональные блоки следует воспринимать лишь как ссылки на соответствующие средства обеспечения необходимой функции, а не указание на четко определенную логическую или физическую структуру или организацию.
РАСПРЕДЕЛЕННАЯ СИСТЕМА
[0077] Некоторые из элементов типичной сетевой конфигурации Интернет 2500 показаны на ФИГ. 5, на которой несколько клиентских машин 2502, возможно, в отдаленном местном офисе, показаны как соединенные со шлюзом / концентратором / туннельным сервером и т. п. 2510, который, в свою очередь, соединяется с сетью Интернет 2508 через обеспечиваемое каким-либо поставщиком услуг Интернет (ISP) соединение 2510. Также показаны другие возможные клиенты 2512, подобным образом соединенные с сетью Интернет 2508 через ISP-соединение 2514, причем эти единицы соединяются, возможно, с центральной лабораторией или офисом, например, через ISP-соединение 2516 со шлюзом / туннельным сервером 2518, который соединяется 2520 с различными серверами корпоративных приложений 2522, которые могут соединяться через другой концентратор / маршрутизатор 2526 с различными местными клиентами 2530. Любой из этих серверов 2522 может функционировать как сервер разработки для анализа потенциального управления контентом и принятия проектных решений, как описывается согласно настоящему изобретению, о чем подробнее сказано ниже.
МОДУЛЬНАЯ СИСТЕМА
[0078] ФИГ. 4 иллюстрирует осуществление системы термоциклера 100 с корпусом 140, содержащим многие элементы системы 100, обсуждавшиеся выше. В этом варианте осуществления пользовательский интерфейс 122 предусмотрен на передней стороне системы 100, с лицевой стороной 150 лотка, находящейся под интерфейсом 122. Корпус 140 может быть произвольно выполнен как цельная деталь или из нескольких деталей.
[0079] ФИГ. 5 иллюстрирует вариант осуществления с ФИГ. 4 с подвижным лотком 160 в открытой позиции. Подвижный лоток 160 может содержать блок пробоподготовки 114, как показано. В открытой позиции блок пробоподготовки 114 доступен для загрузки проб. Помимо блока пробоподготовки 114, подвижный лоток 160 может содержать другие компоненты, которые выталкиваются, когда подвижный лоток 160 находится в открытой позиции. Например, подвижный лоток 160 может содержать нагревательные и охлаждающие элементы, связанные с блоком пробоподготовки 114. Кроме того, подвижный лоток 160 может содержать связанный с ним теплообменник или поглотитель тепла. Подвижный лоток 160 может перемещаться вручную или механически. Например, может быть предусмотрена ручка или захватное приспособление, если лоток 160 перемещается вручную. Если он перемещается механически, может быть предусмотрена система двигателя в системе 100, как подробно обсуждается ниже.
[0080] ФИГ. 6 иллюстрирует вариант осуществления системы термоциклера 100, в котором система 100 построена из модульных компонентов. При использовании модульной конструкции модули могут быть построены таким образом, чтобы быть подходящими для многих систем прибора. Например, оптический модуль может быть выполнен с возможностью применения в разных типах приборов. Кроме того, модульная конструкция обеспечивает возможность легкого построения путем обеспечения уже построенных частей прибора, и не требует построения всего прибора заново. Также модульная конструкция обеспечивает легкость в обслуживании. При том, что достаточно лишь соединить несколько модулей для сборки полного прибора, требуется лишь произвести этот процесс в реверсивном порядке для получения доступа до конкретных модулей для обслуживания.
[0081] Как показано на ФИГ. 6, система 100 содержит детекторный модуль 405 (плата датчика / плата детектора, связан с детектором и PSB), эмиссионный модуль 410 (колесо с эмиссионным фильтром, камера), возбуждающий модуль 415 (источник возбуждения и колесо с фильтром возбуждения), базовый модуль 420 (расщепитель луча, складываемое зеркало) и лицевую пластину 425.
[0082] Детекторный модуль 405 может содержать, например, датчик эмиссии, детектор эмиссии, печатную монтажную плату датчика и печатную монтажную плату детектора, связанную с оптической системой 124. Эмиссионный модуль 410 может содержать, например, камеру и колесо с эмиссионным фильтром, связанное с оптической системой 124. Возбуждающий модуль 415 может содержать, например, источник возбуждения, компоненты охлаждения источника и колесо с фильтром возбуждения, связанное с оптической системой 124. Базовый модуль 420 может содержать, например, расщепитель луча и складываемое зеркало, связанное с оптической системой 124, а также, например, блок пробоподготовки, элементы нагрева / охлаждения блока, теплообменник / поглотитель тепла, систему управления и нагревательную крышку. И наконец, лицевая пластина 425 может служить, например, для накрывания зеркальных компонентов базового модуля 420, содействия соединения базового модуля 420 с эмиссионным модулем 410 и/или обеспечения плоской грани для приема пользовательского интерфейса 122. Перечисленные выше компоненты подробнее обсуждаются ниже. Кроме того, компоненты, включенные в конкретные обсуждавшиеся выше модули, приводятся лишь для примера и могут быть при необходимости заменены. Кроме того, количество модулей при необходимости может быть увеличено или уменьшено. Например, детекторный модуль 405 и эмиссионный модуль 410 могут быть скомбинированы в один модуль. С другой стороны, базовый модуль 420 может быть разделен на множество меньших модулей.
[0083] Один или несколько модулей 405, 410, 415 и 420 также могут использоваться в качестве модулей для различных типов приборов. Такая гибкость обеспечивает возможность более эффективного производства, поскольку общие модули позволяют собирать приборы разных типов. Например, обсуждавшиеся выше модули могут соединяться для сборки прибора для количественной ПЦР 96-луночного формата. Один или несколько модулей также могут применяться, например, для сборки прибора для количественной ПЦР 384-луночного формата, формата со сквозными отверстиями, формата плоского блока и т. д. Один или несколько модулей также могут использоваться, например, для сборки прибора для ПЦР с анализом по конечной точке. Один или несколько модулей также могут использоваться, например, для сборки прибора для количественной ПЦР с различными оптическими системами, включая, например, 4-цветные или 6-цветные оптические системы. Один или несколько модулей также могут использоваться, например, для сборки прибора для капиллярного электрофореза. Один или несколько модулей также могут использоваться, например, для сборки прибора для цифровой ПЦР. Один или несколько модулей также могут использоваться, например, для сборки оптического считывающего устройства.
ОПТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА
[0084] Как изложено выше и показано на ФИГ. 1, система термоциклера 100 может содержать оптическую систему 124.
[0085] В контексте данного описания термины "излучение" или "электромагнитное излучение" означают лучистую энергию, вырабатываемую при определенных электромагнитных процессах, которая может содержать один или несколько видов излучения видимого света (например, лучистую энергию, характеризующуюся одним или несколькими значениями длины волны от 400 нанометров до 700 нанометров или от 380 нанометров до 800 нанометров) или невидимые электромагнитные излучения (например, инфракрасное, ближнее инфракрасное, ультрафиолетов (УФ), рентгеновское или гамма-излучение).
[0086] В контексте данного описания источник возбуждения означает источник электромагнитного излучения, который может быть направлен на по меньшей мере одну пробу, содержащую одно или несколько химических соединений, таким образом, чтобы электромагнитное излучение взаимодействовало с по меньшей мере одной пробой для создания электромагнитного излучения, указывающего на состояние по меньшей мере одной пробы. Источник возбуждения может содержать источник света. В контексте данного описания термин "источник света" означает источник электромагнитного излучения, содержащего электромагнитный спектр, который имеет пиковый или максимальный выход (например, мощности, энергии или интенсивности) в пределах видимого диапазона длины волн электромагнитного спектра (например, электромагнитное излучение в диапазоне длины волн от 400 нанометров до 700 нанометров или от 380 нанометров до 800 нанометров). В дополнительном или альтернативном варианте источник возбуждения может содержать электромагнитное излучение по меньшей мере в пределах части инфракрасного (ближнего инфракрасного, среднего инфракрасного и/или дальнего инфракрасного) или ультрафиолетового (ближнего ультрафиолетового и/или крайнего ультрафиолетового) диапазонов электромагнитного спектра. В дополнительном или альтернативном варианте источник возбуждения может содержать электромагнитное излучение в других диапазонах длины волн электромагнитного спектра, например, в рентгеновском и/или радиодиапазоне волн электромагнитного спектра. Источник возбуждения может содержать один источник света, например, лампу накаливания, газоразрядную лампу (например, галогеновую лампу, ксеноновую лампу, аргоновую лампу, криптоновую лампу и т. п.), светоизлучающий диод (LED), органический светодиод (OLED), лазер или другой подобный источник. Источник возбуждения может содержать множество отдельных источников света (например, множество LED или лазеров). Источник возбуждения также может содержать один или несколько фильтров возбуждения, таких, как фильтр высоких частот, фильтр низких частот или полосовой фильтр. Например, фильтр возбуждения может содержать цветной фильтр и/или дихроичный фильтр. Источник возбуждения содержит один луч или множество лучей, разделенных в пространстве и/или во времени.
[0087] В контексте данного описания "эмиссия" означает электромагнитное излучение, возникающее в результате взаимодействия излучения от источника возбуждения с одним или несколькими пробами, содержащими, или предполагаемыми как содержащие, одну или несколько нужных химических и/или биологических молекул или соединений. Эмиссия может происходить вследствие отражения, преломления, поляризации, поглощения и/или другого оптического воздействия пробы на излучение от источника возбуждения. Например, эмиссия может содержать люминесценцию или флуоресценцию, вызываемую поглощением возбуждающего электромагнитного излучения одним или несколькими пробами. В контексте данного описания "эмиссионный свет" означает эмиссию, содержащую электромагнитный спектр, который имеет пиковый или максимальный выход (например, мощности, энергии или интенсивности) в пределах видимого диапазона электромагнитного спектра (например, электромагнитное излучение в диапазоне длины волн от 420 нанометров до 700 нанометров).
[0088] В контексте данного описания линза означает оптический элемент, выполнен с возможностью направления или фокусирования падающего электромагнитного излучения таким образом, чтобы сводить или разводит такие лучи, например, для создания реального или виртуального изображения, на определенном расстоянии или оптической бесконечности. Линза может содержать один оптический элемент, который имеет оптическую мощность, обеспечиваемую преломлением, отражением и/или дифракцией падающего электромагнитного излучения. В альтернативном варианте линза может содержать составную систему, содержащую множество оптических элементов, включая, помимо прочих, например, ахроматическую линзу, двухлинзовый объектив, трехлинзовый объектив или объектив камеры. Линза может хотя бы частично находиться или хотя бы частично быть заключенной в корпус или оправу.
[0089] В контексте данного описания термин "оптическая мощность" означает способность линзы или оптики к сведению или разведению лучей света для обеспечения фокуса (реального или виртуального) при расположении на открытом воздухе. В контексте данного описания термин "фокусное расстояние" означает величину, обратную оптической мощности. В контексте данного описания термин "дифракционная мощность" или "дифракционная оптическая мощность" означает мощность линзы или оптики или ее части, обусловленная дифракцией падающего света на один или несколько порядков дифракции. За исключением случаев, когда указывается иное, оптическая мощность линзы, оптики или оптического элемента измеряется от опорной плоскости, связанной с линзой или оптикой (например, главной плоскости оптики).
[0090] В контексте данного описания термин "биологическая проба" означает пробу или раствор, содержащий любого типа биохимикат или компонент и/или любую целевую молекулу, представляющую интерес для пользователя, производителя или распространителя разных вариантов осуществления настоящего изобретения, описываемых или предполагаемых авторами, а также любая проба или раствор, содержащий соответствующие химикаты или соединения, применяемые с целью проведения биологического анализа, эксперимента или испытания. К этим биохимикатам, компонентам или целевым молекулам могут относиться, помимо прочих, последовательности ДНК (включая бесклеточные ДНК), последовательности РНК, гены, олигонуклеотиды, молекулы, белки, биомаркеры, клетки (например, циркулирующие опухолевые клетки) или любые другие подходящие целевые биомолекулы. биологическая проба может содержать одну или несколько из по меньшей мере одной целевой нуклеиновокислотной последовательности, по меньшей мере один праймер, по меньшей мере один буфер, по меньшей мере один нуклеотид, по меньшей мере один фермент, по меньшей мере один детергент, по меньшей мере один блокирующий агент или по меньшей мере один краситель, маркер и/или зонд, подходящий для обнаружения целевой или контрольной нуклеиновокислотной последовательности. В разных вариантах осуществления такие биологические компоненты могут применяться в связи с одним или несколькими способами и системами ПЦР в таких сферах применения, как эмбриональная диагностика, мультиплексная цПЦР, обнаружение вирусов и стандарты количественного анализа, генотипирование, анализ путем секвенирования, эксперименты или протоколы, подтверждение секвенирования, обнаружение мутации, обнаружение генетически модифицированных организмов, обнаружение редких аллелей и/или вариация числа копий.
[0091] Согласно вариантам осуществления настоящего изобретения, один или несколько проб или растворов, содержащий по меньшей мере одну нужную биологическую мишень, может содержаться, распределяться или быть разделенным среди множества малых объемов пробы или зон реакции (например, объемов или участков, не превышающих 10 нанолитров, не превышающих 1 нанолитра или не превышающих 100 пиколитров). Описываемые авторами зоны реакции в целом показаны как содержащиеся в лунках, находящихся в материале подложки; однако другие формы зон реакции согласно вариантам осуществления настоящего изобретения могут содержать зоны реакции, находящиеся в сквозных отверстиях или выемках, образуемых в подложке, каплях раствора, распределенных по поверхности подложки, пробах или растворах, находящихся в пределах зон или объемов для испытания капиллярной или микрофлюидной системы или в/на множестве микрогранул или микросфер.
[0092] Хотя устройства, приборы, системы и способы согласно вариантам осуществления настоящего изобретения в целом предназначены для лПЦР и количественной ПЦР, варианты осуществления настоящего изобретения могут применяться для любых процессов, экспериментов, анализов или протоколов ПЦР, в которых много зон реакции подвергают обработке, наблюдению и/или измерению. В анализе или эксперименте цПЦР согласно вариантам осуществления настоящего изобретения разведенный раствор, содержащий по меньшей мере одну целевую полинуклеотидную или нуклеотидную последовательность, разделяют на множество зон реакции, таким образом, чтобы по меньшей мере некоторые из этих зон реакции содержали одну молекулу целевой нуклеотидной последовательности или не содержали целевой нуклеотидной последовательности. Когда зоны реакции впоследствии подвергают термическому циклированию согласно протоколу, процедуре, анализу, процессу или эксперименту с применением ПЦР, зоны реакции, содержащие одну или несколько молекул целевой нуклеотидной последовательности, в значительной степени амплифицируются и дают положительный, обнаружимый сигнал, а те, которые не содержат целевых нуклеотидных последовательностей, не амплифицируются и не дают обнаружимого сигнала или дают сигнал ниже заданного порогового значения или уровня шума. С применением статистики Пуассона определяют корреляцию целевых нуклеотидных последовательностей в первоначальном растворе, распределенном между зонами реакции, с количеством зон реакции, дающих положительный сигнал обнаружения. В некоторых вариантах осуществления обнаруженный сигнал используют для определения количества или пределов количества целевых молекул, содержащихся в первоначальном растворе. Например, система обнаружения может быть выполнена с возможностью проведения различия между зонами реакции, содержащими одну целевую молекулу, и зонами реакции, содержащими две или по меньшей мере две целевых молекулы. В дополнительном или альтернативном варианте система обнаружения может быть сконфигурирована таким образом, чтобы проводить различие между зонами реакции, содержащими количество целевых молекул, не превышающее заданное количество, и зонами реакции, содержащими более, чем заданное количество. В некоторых вариантах осуществления процессы, анализы или протоколы количественной ПЦР и цПЦР осуществляют с применением одинаковых устройств, приборов или систем и способов.
[0093] Как показано на ФИГ. 7, система 100 может содержать один или несколько компонентов, к которым относятся компьютерная система, электронный процессор или контроллер 200, блок пробоподготовки 114, выполнен с возможностью получения и/или обработки биологического или биохимического пробы, и/или оптическая система 124. Без ограничения для объема настоящего изобретения система 100 может содержать секвенирующий прибор, прибор для полимеразной цепной реакции (ПЦР) (например, прибор для ПЦР в реальном времени (количественной ПЦР) и/или прибор для цифровой ПЦР (цПЦР)), прибор для капиллярного электрофореза, прибор для обеспечения информации о генотипировании или другой подобный прибор.
[0094] Компьютерная система 200 сконфигурирована для контроля, наблюдения и/или получения данных от оптической системы 124 и/или блока пробоподготовки 114. Компьютерная система 200 может быть физически интегрирована в оптическую систему 124 и/или блок пробоподготовки 114. В дополнительном или альтернативном варианте компьютерная система 200 может быть отдельной от оптической системы 124 и блока пробоподготовки 114, например, внешнего настольного компьютера, переносного персонального компьютера, электронной записной книжки, планшета и т. п. Связь между компьютерной системой 200 и оптической системой 124 и/или блоком пробоподготовки 114 может осуществляться прямо, через физическое соединение, например, USB-кабель или другой подобный соединитель, и/или косвенно, через беспроводное или сетевое соединение (например, через Wi-Fi, локальную вычислительную сеть, Интернет, облачное соединение или другое подобное соединение). Компьютерная система 200 может содержать электронное запоминающее устройство, содержащее команды, программы, алгоритмы, параметры испытания и/или конфигурации, испытательные и/или экспериментальные данные или другую подобную информацию. Компьютерная система 200 может быть сконфигурирована, например, для функционирования различных компонентов оптической системы 124 или для получения и/или обработки данных, обеспечиваемых блоком пробоподготовки 114. Например, компьютерная система 200 может применяться для получения и/или обработки оптических данных, обеспечиваемых одним или несколькими фотодетекторами оптической системы 124.
[0095] В некоторых вариантах осуществления компьютерная система 200 может быть интегрирована в оптическую систему 124 и/или блок пробоподготовки 114. Компьютерная система 200 может быть связана с внешним компьютером и/или может передавать данные на внешний компьютер для дальнейшей обработки, например, с использованием проводного соединения, локальной вычислительной сети, Интернет-соединения, облачной вычислительной системы или других подобных средств. Внешний компьютер может быть физическим компьютером, таким, как настольный компьютер, переносной персональный компьютер, электронная записная книжка, планшет, или другой подобный компьютер, расположенный в системе 100 или поблизости от нее. В дополнительном или альтернативном варианте любой или оба из компонентов, к которым относятся внешний компьютер и компьютерная система 200, могут содержать виртуальное устройство или систему, например, облачную систему вычисления или хранения данных. Данные могут передаваться между ними через беспроводное соединение, облачную систему хранения данных или вычисления или другое подобное средство. В дополнительном или альтернативном варианте данные от компьютерной системы 200 (например, от оптической системы 124 и/или блока пробоподготовки 114) могут передаваться на внешнее устройство хранения информации, например, внешний жесткий диск, USB-модуль памяти, систему облачного хранилища данных или другое подобное средство.
[0096] В некоторых вариантах осуществления блок пробоподготовки 114 выполнен с возможностью приема держателя пробы 305. держатель проб 305 может содержать множество или массив пространственно разделенных зон реакции, центров или мест 308 проведения реакции для содержания соответствующего множества или массива биологических или биохимических проб 114. Зоны реакции 308 могут содержать любое множество объемов или мест, изолирующих или выполненных с возможностью изоляции множества биологических или биохимических проб 114. Например, зоны реакции 308 могут содержать множество сквозных отверстий или лунок в подложке или узле (например, лунки для проб в стандартном микротитровальном планшете), множество гранул, микрогранул или микросфер пробы в канале или камере, множество отдельных мест в проточной кювете, множество капель с пробой на поверхности подложки или множество лунок или отверстий, выполненных с возможностью приема держателя пробы (например, полости в узле блока пробоподготовки, сконфигурированного для приема микротитровального планшета).
[0097] Блок пробоподготовки 114 может содержать держатель проб 305. По меньшей мере некоторые из зон реакции 308 могут содержать один или несколько биологических проб 114. Биологические или биохимические пробы 114 могут содержать одну или несколько из по меньшей мере одной целевой нуклеиновокислотной последовательности, по меньшей мере один праймер, по меньшей мере один буфер, по меньшей мере один нуклеотид, по меньшей мере один фермент, по меньшей мере один детергент, по меньшей мере один блокирующий агент или по меньшей мере один краситель, маркер и/или зонд, подходящий для обнаружения целевой или контрольной нуклеиновокислотной последовательности. держатель проб 305 может быть выполнен с возможностью выполнения по меньшей мере одного анализа, к которым относятся ПЦР-анализ, анализ путем секвенирования или капиллярный электрофорез, блоттинг. В некоторых вариантах осуществления держателя проб 305 может содержать один или несколько микротитровальных планшетом, подложку, содержащую множество лунок или сквозных отверстий, подложку, содержащую один или несколько каналов, или камеру, содержащую множество гранул или сфер, содержащих один или несколько биологических проб. Зоны реакции 308 могут содержать одну или несколько из множества лунок, множество сквозных отверстий в подложке, множество отдельных мест на подложке или в пределах канала, множество микрогранул или микросфер в пределах реакционного объема и т. п. держатель проб 305 может содержать, например, микротитровальный планшет, причем зоны реакции 308 могут содержать по меньшей мере 96 лунок, по меньшей мере 384 или по меньшей мере 1536 лунок.
[0098] В некоторых вариантах осуществления держателя проб 305 может содержать подложку, содержащую первую поверхность, противоположную вторую поверхность и множество сквозных отверстий, расположенных между поверхностями, причем множество сквозных отверстий сконфигурировано таким образом, чтобы содержать один или несколько биологических проб, например, как обсуждается в опубликованных патентных заявках под номерами US 2014-0242596 и WO 2013/138706, которые включены в данное описание путем ссылки в полном объеме. В этих вариантах осуществления подложка может содержать по меньшей мере 3096 сквозных отверстий или по меньшей мере 20000 сквозных отверстий. В некоторых вариантах осуществления держателя проб 305 может содержать массив капилляров, выполненных с возможностью пропускания одной или нескольких целевых молекул или последовательности молекул.
[0099] В некоторых вариантах осуществления система 100 может содержать нагревательную крышку 110, которая может находиться над держателем пробы 305 и/или блоком пробоподготовки 114. Нагревательную крышку 110 используют, например, для предотвращения конденсации над пробами, содержащимися в держателе пробы 305, что помогает поддерживать оптический доступ к биологическим пробам 114.
[00100] В некоторых вариантах осуществления оптическая система 124 содержит источник возбуждения, источник освещения, источник излучения или источник света 1402, создающий по меньшей мере первый возбуждающий луч 1405a, характеризующийся первой длиной волны, и второй возбуждающий луч 1405b, характеризующийся второй длиной волны, отличающейся от первой длины волны. Оптическая система 124 дополнительно содержит оптический датчик или оптический детектор 1408, выполнен с возможностью приема эмиссии или излучения от одного или нескольких биологических проб в ответ на источник возбуждения 1410 и/или на один или несколько возбуждающих лучей 1405a, 1405b. Оптическая система 124 дополнительно содержит возбуждающую оптическую систему 1410, расположенную вдоль возбуждающего оптического пути 1412 между источником возбуждения 1402 и одним или несколькими биологическими пробами, подлежащими освещению. Оптическая система 124 дополнительно содержит эмиссионную оптическую систему 1415, расположенную вдоль эмиссионного оптического пути 1417 между освещенной(ыми) пробой(ами) и оптическим датчиком 1408. В некоторых вариантах осуществления оптическая система 124 может содержать расщепитель луча 1420. Оптическая система 124 необязательно может содержать поглотитель луча или отражатель излучения 1422, выполнен с возможностью уменьшения или предотвращения отражения излучения в эмиссионный оптический путь 1417 от источника возбуждения 1402, который сталкивается с расщепителем луча 1420.
[00101] В варианте осуществления, который поясняется на ФИГ. 7, а также в других описываемых авторами вариантах осуществления изобретения, источник возбуждения 1402 содержит источник излучения 1425. Источник излучения 1425 может содержать один или несколько из источников, которыми могут быть по меньшей мере одна лампа накаливания, по меньшей мере одна газоразрядная лампа, по меньшей мере один светоизлучающий диод, по меньшей мере один органический светоизлучающий диод и/или по меньшей мере один лазер. Например, источник излучения 1425 может содержать по меньшей мере одну галогеновую лампу, ксеноновую лампу, аргоновую лампу, криптоновую лампу, диодный лазер, аргоновый лазер, ксеноновый лазер, эксимерный лазер, твердотельный лазер, гелиево-неоновый лазер, лазер на красителе или их комбинации. Источник излучения 1425 может содержать источник света, характеризующийся максимальной или центральной длиной волны в видимом диапазоне электромагнитного спектра. В дополнительном или альтернативном варианте источник излучения 1425 может содержать ультрафиолетовый, инфракрасный или ближний инфракрасный источник с соответствующей максимальной или центральной длиной волны в пределах одного из диапазонов длины волн электромагнитного спектра. Источник излучения 1425 может быть широкополосным источником, например, имеющим спектральную ширину полосы по меньшей мере 100 нанометров, по меньшей мере 200 нанометров или по меньшей мере 300 нанометров, причем ширина полосы определяется как диапазон, в котором выход интенсивности, энергии или мощности является большим, чем заданная величина (например, в случае, если заданная величина равняется или приблизительно составляет 1 %, 5 % или 10 % от максимальной или центральной длины волны источника излучения). Источник возбуждения 1402 дополнительно может содержать линзу источника 1428, выполненную с возможностью регулирования эмиссии от источника излучения 1425, например, для увеличения значения возбуждающего излучения, принимаемого на держателе пробы 305 и/или в биологические пробы 114. Линза источника 1428 может содержать простую линзу или может быть сочетанием линз, содержащим два или более элементов.
[00102] В некоторых вариантах осуществления источник возбуждения 1402 дополнительно содержит два или более фильтров возбуждения 1430, которые перемещаются в направлении входа и выхода из возбуждающего оптического пути 1412, например, используются в комбинации с широкополосным источником возбуждения 1402. В этих вариантах осуществления могут применяться различные фильтры возбуждения 1430 для выбора разных диапазонов длины волн или каналов возбуждения, подходящих для индукции флуоресценции от соответствующего красителя или маркера в биологических пробах 114. Один или несколько фильтров возбуждения 1430 могут иметь ширину диапазона длины волн по меньшей мере ±10 нанометров или по меньшей мере ±15 нанометров. Фильтры возбуждения 1430 могут содержать множество фильтров, которые вместе обеспечивают множество полос пропускания, подходящих для флуоресцирования одного или нескольких красителей или зондов, таких, как краситель или зонд SYBR, краситель или зонд FAMTM>, краситель или зонд VIC, краситель или зонд ROXTM или краситель или зонд TAMRATM. Фильтры возбуждения 1430 могут располагаться во вращающемся диске с фильтрами (не показан) или другом подходящем устройстве или приборе, обеспечивающим различные каналы возбуждения с применением источника возбуждения 1402. В некоторых вариантах осуществления фильтры возбуждения 1430 содержат по меньшей мере 5 фильтров или по меньшей мере 6 фильтров.
[00103] В некоторых вариантах осуществления источник возбуждения 1402 может содержать множество отдельных источников возбуждения, которые могут комбинироваться с применением дополнительных расщепителей луча или устройств сведения лучей, таким образом, чтобы излучение от каждого отдельного источника возбуждения передавалось по общему оптическому пути, например, по возбуждающему оптическому пути 1412, показанному на ФИГ. 7. В альтернативном варианте по меньшей мере некоторые из отдельных источников возбуждения могут быть расположены таким образом, чтобы обеспечивать возбуждающие лучи, распространяющиеся по разным, не перекрывающимся оптическим путям, например, для освещения разных зон реакции из множества зон реакции 308. Каждый из отдельных источников возбуждения может быть задействован, активирован или выбран для освещения зон реакции 308, например, по отдельности или в группах, или все одновременно. В некоторых вариантах осуществления отдельные источники возбуждения могут располагаться в одномерном или двумерном массиве, в котором один или несколько отдельных источников возбуждения характеризуется максимальной или центральной длиной волны, отличающейся от значения по меньшей мере одного из других отдельных источников возбуждения в массиве.
[00104] В некоторых вариантах осуществления первый возбуждающий луч 1405a содержит первый диапазон длины волн, в котором интенсивность, мощность или энергия первого возбуждающего луча 1405a превышает первое заданное значение, а второй возбуждающий луч 1405b содержит второй диапазон длины волн, в котором интенсивность, мощность или энергия второго возбуждающего луча 1405b превышает второе заданное значение. Характерной длиной волны возбуждающих лучей 1405a, 1405b может быть центральная длина волны соответствующего диапазона длины волн или длина волны максимальной электромагнитной интенсивности, мощности или энергии в соответствующем диапазоне длины волн. Центральная длина волны по меньшей мере одного из возбуждающих лучей 1405 может быть средней длина волны по соответствующему диапазону длины волн. Для каждого возбуждающего луча 1405 (например, возбуждающих лучей 1405a, 1405b) заданное значение может быть меньшим, чем 20 % соответствующей максимальной интенсивности, мощности или энергии; меньшим, чем 10 % соответствующей максимальной интенсивности, мощности или энергии; меньшим, чем 5 % соответствующей максимальной интенсивности, мощности или энергии; или меньшим, чем 1 % соответствующей максимальной интенсивности, мощности или энергии. Заданные значения могут быть одинаковыми для всех возбуждающих лучей 1405 (например, для обоих возбуждающих лучей 1405a, 1405b), или же заданные значения могут отличаться друг от друга. В некоторых вариантах осуществления диапазоны длины волн первого и второго возбуждающих лучей 1405a, 1405b не перекрываются, тогда как в других вариантах осуществления по меньшей мере один из диапазонов длины волн по меньшей мере частично накладывается на другой. В некоторых вариантах осуществления первое и второе значения центральной длины волны разделяются интервалом по меньшей мере 20 нанометров. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из первого и второго диапазонов длины волн имеет значение по меньшей мере 20 нанометров или по меньшей мере 30 нанометров.
[00105] Возбуждающая оптическая система 1410 сконфигурирована для направления возбуждающих лучей 1405a, 1405b на один или несколько биологических проб. В соответствующих случаях ссылки на возбуждающие лучи 1405a, 1405b касаются варианта осуществления, содержащего более двух возбуждающих лучей 1405. Например, источник возбуждения 1402 может быть выполнен с возможностью направления по меньшей мере пяти или шести возбуждающих лучей 1405. Возбуждающие лучи 1405a, 1405b могут образовываться или обеспечиваться одновременно, могут быть разделены по времени и/или могут быть разделены в пространстве (например, в случаях, когда возбуждающий луч 1405a направлен на одну зону реакции 308, а возбуждающий луч 1405b направлен на другую зону реакции 308). Возбуждающие лучи 1405 могут образовываться последовательно, например, путем последовательного включения и выключения разноцветных отдельных источников излучения 1425, характеризующихся разными значениями длина волн, или путем последовательного помещения разных цветных фильтров перед одним источником излучения 1425. В альтернативном варианте возбуждающие лучи 1405a, 1405b могут образовываться одновременно, например, путем применения многодиапазонного фильтра, расщепителя луча или зеркала, или путем сочетания различных отдельных источников излучения 1425, таких, как разноцветные светоизлучающие диоды (LED). В некоторых вариантах осуществления источник возбуждения 1402 создает более двух возбуждающих лучей 1405, причем возбуждающая оптическая система 1410 направляет каждый из возбуждающих лучей на один или несколько биологических проб 114.
[00106] Как показано на ФИГ. 8-9, спектральное распределение источника излучения 1425 может быть выбрано неявным способом для обеспечения возможности использования по меньшей мере пяти возбуждающих лучей 1405 разных цветов или каналов возбуждения с одним общим расщепителем луча 1420 при одновременном сохранении приемлемой или заданной скорости обработки данных для всех каналов возбуждения, например, во время каждого цикла анализа путем количественной ПЦР. В контексте данного описания термин "канал возбуждения" означает каждый из нескольких отдельных диапазонов длины электромагнитных волн, обеспечиваемых источником возбуждения (например, источником возбуждения 1402), который выполнен с возможностью освещения одного или нескольких биологических проб. В контексте данного описания термин "эмиссионный канал" означает каждый из нескольких отдельных диапазонов длины волны излучения, в котором электромагнитное излучение может проходить на оптический датчик или детектор (например, оптический датчик 1408).
[00107] ФИГ. 8 показывает относительное распределение энергии по спектру длины волны для трех разных источников излучения. Штриховая линия представляет спектр галогеновой лампы (указывается как "Источник 1"), характеризующийся относительно низким уровнем энергии в синем диапазоне длины волн видимого спектра и повышением энергии до пика приблизительно 670 нанометров. Штрих-пунктирный график представляет светодиодный источник света серийного производства (указывается как "Источник 2"), который имеет пиковую энергию приблизительно 450 нанометров и нижний пик от приблизительно 530 нанометров до приблизительно 580 нанометров, с последующим снижением энергии в красный диапазон длины волн видимого спектра. Сплошная линия представляет спектр другого светодиодного источника света (указывается как "Источник 3") в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения (например, типичный спектр для источника возбуждения 402). ФИГ. 9 показывает суммарную энергию в разных диапазонах спектра для каждого из трех источников, показанных на ФИГ. 8, где представлены спектры типичного фильтра возбуждения, применяемого в области количественной ПЦР. Диапазоны длины волн и обозначения фильтров возбуждения показаны ниже в Таблице 1.
<b>Фильтра возбуждения </b><b>Канал </b>
<b>Диапазон длины волн (нанометров)</b>
X1
455 - 485
X2
510 - 530
X3
540 - 560
X4
570,5 - 589,5
X5
630,5 - 649,5
X6
650 - 674
Таблица 1. Спектральная ширина полосы фильтров возбуждения, применяемых согласно ФИГ. 9.
[00108] В области количественной ПЦР важным рабочим параметром является общее время для получения данных эмиссии для проб, содержащих многоцелевые красители. Например, в некоторых случаях желательным является получение данных эмиссии по 5 или 6 красителям или каналам фильтра (например, X1-X5 / M1-M5 или X1-X6 / M1-M6, где "M" означает номер эмиссионного канала для соответствующего номера канала X (возбуждения)). Авторами изобретения было обнаружено, что при использовании Источника 2 в системе, имеющей один широкополосный расщепитель луча для шести каналов фильтра EX/EM (например, каналов возбуждения X1-X6 и соответствующих эмиссионных каналов M1-M6), время для получения данных для канала 5 и/или канала 6 может быть неприемлемо долгим в некоторых случаях применения. Чтобы исправить эту ситуацию, можно использовать один или несколько узкополосных дихроических расщепителей луча для каналов возбуждения 1 и/или 2 для увеличения количества возбуждающего света, получаемого пробой(ами), и количества эмиссионного света, получаемого датчиком (таким образом, чтобы общая оптическая эффективность повышалась благодаря использованию дихроического расщепителя луча, как в данном случае). Однако это препятствует использованию конструкции с единым расщепителем луча, как показано на ФИГ. 7 и соответствующих преимуществ конфигурации с единым расщепителем луча (например, уменьшения размера, снижения затрат, упрощения). Было найдено лучшее решение, согласно которому источник света, такой, как Источник 3, применяют в комбинации с единым расщепителем луча (например, широкополосным расщепителем луча, таким, как расщепитель луча 50/50). Было обнаружено, что относительная энергия в каналах возбуждения X1, X5 и/или X6 может использоваться для распознавания источника возбуждения 402, подходящего для применения в варианте осуществления с единым расщепителем луча. На примерах Источника 2 и Источника 3 следующие данные, показанные ниже в Таблице 2, могут быть выведены из данных, показанных на ФИГ. 8 и 9.
<b>Соотношение</b>
<b>Источник 2</b>
<b>Источник 3</b>
X1/X2
2,02
3,00
X2/X2
1,00
1,00
X3/X2
1,20
0,98
X4/X2
1,09
0,89
X5/X2
0,49
0,90
X6/X2
0,38
0,90
Таблица 2. Нормализованная интенсивность светодиода каждого канала фильтра с нормализацией по каналу 2.
[00109] На основе этих данных авторами изобретения было обнаружено, что в некоторых вариантах осуществления можно добиться улучшенных характеристик (например, сокращения времени интеграции Канала 1), если соотношение X1/X2 превышает 2,5 (например, является большим или равняется 3). В других, дополнительных или альтернативных вариантах осуществления улучшение характеристик (например, сокращения времени интеграции Канала 1) может быть достигнуто, если соотношение X5/X2 превышает 0,7 (например, является большим или равняется 0,9), и/или если соотношение X6/X2 превышает 0,7 (например, является большим или равняется 0,9).
[00110] Как показано на ФИГ. 7, во время работы возбуждающие лучи 1405 направляются по возбуждающему оптическому пути 1412 в направлении блок пробоподготовки 114 пробы, например, в направлении зон реакции 308 в присутствии держателя пробы 305. При его наличии линза источника 1428 конфигурируется для кондиционирования возбуждающих лучей 1405, например, для захвата и направления большой части испускаемого излучения от источника возбуждения 1402. В некоторых вариантах осуществления может быть включено одно или несколько зеркал 1432 (например, поворотных зеркал) вдоль возбуждающего оптического пути 1412, например, для придания оптической системе 124 большей компактности и/или приспособления под заданные размеры места. ФИГ. 7 показывает одно зеркало 1432; при этом могут использоваться и дополнительные зеркала, например, для соответствия проектным ограничениям для упаковки. Как подробнее обсуждается ниже, поблизости от держателя пробы 305 могут находиться дополнительные линзы, например, с целью дополнительного кондиционирования возбуждающих лучей 1405 и/или соответствующей эмиссии от биологических проб, содержащихся в одной или нескольких зонах реакции.
[00111] Эмиссионная оптическая система 1415 сконфигурирована для направления эмиссии от одного или нескольких биологических проб на оптический датчик 1408. По меньшей мере некоторые их видов эмиссии могут содержать флуоресцентную эмиссию из по меньшей мере некоторых биологических проб в ответ на по меньшей мере один из возбуждающих лучей 1405. В дополнительном или альтернативном варианте по меньшей мере некоторые их видов эмиссии содержат излучение от по меньшей мере одного из возбуждающих лучей 1405, которое отражается, преломляется, отклоняется, рассеивается или поляризируется по меньшей мере некоторыми из биологических проб. В некоторых вариантах осуществления эмиссионная оптическая система 1415 содержит один или несколько эмиссионных фильтров 1435, выполненных, например, для блокирования возбуждающего излучения, отражаемого или рассеиваемого в эмиссионный оптический путь 1417. В некоторых вариантах осуществления предусмотрен соответствующий эмиссионный фильтр 1435 для каждого фильтра возбуждения 1430.
[00112] В некоторых вариантах осуществления эмиссионная оптическая система 1415 содержит сенсорную линзу 1438, выполненную с возможностью прямой эмиссии от по меньшей мере некоторых из биологических проб на оптический датчик 1408. Оптический датчик 1408 может содержать единый сенсорный элемент, например, фотодиодный детектор или электронный фотоумножитель, или другой подобный элемент. В дополнительном или альтернативном варианте оптический датчик 1408 может содержать матричный датчик, содержащий массив датчиков или пикселей. Матричный датчик 1408 может содержать один или несколько комплементарных датчиков металл-оксид-полупроводник (CMOS), датчик в форме устройства с зарядовой связью (CCD), a множество фотодиодных детекторов, множество электронных фотоумножителей и т. п. Сенсорная линза 1438 может быть, сконфигурирована для создания изображения на основе эмиссии от одного или нескольких из множества биологических проб 114. В некоторых вариантах осуществления оптический датчик 1408 содержит два или более матричных датчиков 1408, например, при создании двух или более изображений на основе эмиссии от одного или нескольких из множества биологических проб 114. В этих вариантах осуществления эмиссия от одного или нескольких из множества биологических проб 114 может расщепляться для обеспечения двух сигналов одного или нескольких из множества биологических проб 114. В некоторых вариантах осуществления оптический датчик содержит по меньшей мере два матричных датчика.
[00113] Расщепитель луча 1420 располагается как на возбуждающем, так и на эмиссионном оптических путях 1412, 1417 и выполнен с возможностью приема во время работы как первого, так и второго возбуждающих лучей 1405a, 1405b. В варианте осуществления, который поясняется на ФИГ. 7, расщепитель луча 1420 выполнен с возможностью передачи возбуждающих лучей 1405 и для отражения эмиссии от биологических проб 114. В альтернативном варианте расщепитель луча 1420 может быть выполнен с возможностью отражения возбуждающих лучей и для передачи эмиссии от биологических проб 114. В некоторых вариантах осуществления расщепитель луча 1420 содержит широкополосный расщепитель луча, который имеет такую же или приблизительно такую же отражающую способность для всех или большинства возбуждающих лучей 1405, обеспечиваемых источником возбуждения 1402 и направленных на зоны реакции 308 (например, возбуждающих лучей 1405a, 1405b в показанном варианте осуществления). Например, расщепитель луча 1420 может быть широкополосным расщепителем луча, характеризующимся отражающей способностью, которая является постоянной или почти постоянной в диапазоне длины волн по меньшей мере 100 нанометров, в диапазоне длины волн по меньшей мере 200 нанометров или в видимом диапазоне длины волн электромагнитного спектра, в видимом и ближнем инфракрасном диапазоне длины волн электромагнитного спектра или в диапазоне длины волн от 450 нанометров до 680 нанометров. В некоторых вариантах осуществления расщепитель луча 1420 представляет собой нейтральный фильтр, например, фильтр, который имеет отражающую способность, составляющую или приблизительно составляющую 20%, 50% или 80% в видимом диапазоне длины волн электромагнитного спектра. В некоторых вариантах осуществления расщепитель луча 1420 представляет собой дихроический расщепитель луча, пропускающий или отражающий в одном или нескольких выбранных диапазонах длины волн, например, многодиапазонный расщепитель луча, пропускающий и/или отражающий более, чем в одном диапазоне центральной длины волны при пиковой или приближенной к пиковой длине волны возбуждающих лучей 1405.
[00114] В некоторых вариантах осуществления расщепитель луча 1420 представляет собой единый расщепитель луча, выполнен с возможностью приема некоторых или всех из множества возбуждающих лучей 1405 (например, возбуждающих лучей 1405a, 1405b), отдельно или в комбинации с единым поглотителем 1422 луча. Каждый возбуждающий луч может определяться как канал возбуждения, который может использоваться отдельно или в комбинации для возбуждения разных флуоресцентных красителей или молекул-зондов в одном или нескольких из биологических проб 114. Для сравнения, во многих системах и приборах существующего уровня техники, например, в области количественной ПЦР, обеспечивается множество возбуждающих лучей путем применения отдельного расщепителя луча и/или поглотителя луча для каждого канала возбуждения и/или каждого эмиссионного канала системы или прибора. В таких системах или приборах существующего уровня техники, как правило, хроматически селективные дихроичные фильтры применяют по меньшей мере в некоторых из каналов возбуждения для увеличения количества излучения, принимаемого на пробах. К недостаткам систем и приборов с применением разных расщепителей луча и/или поглотителей луча для каждого канала относятся увеличение размера, высокая стоимость, сложность и длительное время реакции (например, вследствие увеличения массы, которая должна перемещаться или вращаться при смене между каналами возбуждения и/или эмиссии). Авторами изобретения было обнаружено, что существует возможность замены эти множественные расщепители луча и/или поглотители луча на единый расщепитель луча 1420 и/или единый поглотитель 1422 луча с обеспечением при этом приемлемой или заданной эффективности системы или прибора, например, путем надлежащего выбора спектрального распределения источника возбуждения 1402 и/или путем конфигурации систем или приборов для уменьшения количества паразитного или нежелательного излучения, получаемого оптическим датчиком 408 (как обсуждается далее). Таким образом, варианты осуществления настоящего изобретения могут применяться для обеспечения систем и приборов, имеющих уменьшенный размер, более низкую стоимость, меньшую сложность и сокращенное время реакции по сравнению с системами и приборами существующего уровня техники.
[00115] Как показано на ФИГ. 10-11, в некоторых вариантах осуществления оптическая система 124 также может содержать линзу 1440 и/или набор линз 1442, который может содержать множество линз, соответствующих каждой из зон реакции 308 держателя пробы 305. Линза 1440 может быть объективом, который может быть выполнен с возможностью обеспечения телецентрической оптической системы для как минимум одного из компонентов, к которым относятся держатель проб 305, зона реакции 308, набор линз 1442 или оптический датчик 1408. Как представлено в варианте осуществления, показанном на ФИГ. 10, линза 1440 может содержать линзу Френеля.
[00116] Как дополнительно показано на ФИГ. 12-16, в некоторых вариантах осуществления оптическая система 124 содержит блок визуализации 1445, содержащий монтажную плату 1448 оптического датчика, сенсорную линзу 1438 (которая может быть составной линзой, как показано на ФИГ. 12), внутреннюю оправу линзы 1449, внешнюю оправу линзы 1450, резьбовой корпус 1452 и фокусирующую шестерню 1455. Монтажная плата 1448 оптического датчика, резьбовой корпус 1452 и сенсорная линза 1438 вместе могут образовывать полость 1458, которая охватывает или вмещает оптический датчик 1408 и может быть сконфигурирована для блокирования любого внешнего света от создающего помеху оптического датчика 1408, который не поступает через сенсорную линзу 1438. Внешняя оправа линзы 1450 содержит внешнюю поверхность, содержащую зубья 1460 шестерни, которые могут в подвижном или подвижном режиме зацепляться с зубьями фокусирующей шестерни 1455 через упругий элемент (не показан), такой, как пружина. В некоторых вариантах осуществления фокусирующая шестерня 1455 перемещается или скользит вдоль прорези 1462 пластины 1465, как показано на ФИГ. 16. Внутренняя оправа линзы 1449 содержит резьбовую часть 1468, которая зацепляется или сопрягается с резьбовой частью резьбового корпуса 1452.
[00117] Внутренняя оправа линзы 1449 может быть жестко прикреплена к внешней оправе линзы 1450, тогда как резьбовой корпус 1452 жестко закреплен относительно монтажной платы 1448 оптического датчика. Внутренняя оправа линзы 1449 в подвижном или вращательном режиме прикрепляется к резьбовому корпусу 1452. Таким образом, фокусирующая шестерня 1455 и внешняя оправа линзы 1450 могут зацепляться, таким образом, чтобы вращение фокусирующей шестерни 1455 также вращало внешнюю оправу линзы 1450. Это, в свою очередь, вызывает перемещение внутренней оправы линзы 1449 и сенсорной линзы 1438 вдоль оптической оси сенсорной линзы 1438 через резьбу во внутренней оправе линзы 1449 и резьбовом корпусе 1452. Таким образом, фокус сенсорной линзы 1438 может регулироваться без прямого контакта с сенсорной линзой 1438 или ее оправами 1449, 1450, заделанными в очень компактную оптическую систему 124. Зацепление с фокусирующими шестернями 1455 может производиться вручную или автоматически, например, с применением двигателя (не показан), такого, как шаговый двигатель или двигатель постоянного тока.
[00118] Как показано на ФИГ. 13 и 15-19, в некоторых вариантах осуществления блок визуализации 1445 дополнительно содержит фиксирующее устройство или механизм 1470. Фиксирующее устройство 1470 содержит край или зуб 1472, который может в подвижном режиме зацепляться между двумя зубьями фокусирующей шестерни 1455 (см. ФИГ. 17-19). Как показано на ФИГ. 17 и 18, фиксирующее устройство 1470 может иметь первую позицию (ФИГ. 17), в которой фокусирующая шестерня 1455 может свободно вращаться и регулировать фокус сенсорной линзы 1438, и вторую позицию (ФИГ. 18), в которой фокусирующая шестерня 1455 является зафиксированной в своей позиции, что блокирует или предотвращает вращение. Таким образом, фокус сенсорной линзы 1438 может быть зафиксирован, и при этом выгодным является то, что избегается прямой контакт с резьбой 1468 внутренней оправы линзы 1449, который мог бы повредить резьбу и воспрепятствовать дальнейшей перефокусировке сенсорной линзы 1438 после фиксации в позиции. Фиксирующее устройство 1470 может функционировать в ручном или автоматическом режиме. В некоторых вариантах осуществления фиксирующий механизм 1470 дополнительно содержит упругий элемент (не показан), причем вращение фокусирующей шестерни 1455 может производиться путем преодоления порогового усилия, создаваемого упругим элементом.
[00119] Как показано на ФИГ. 20, оптическая система 124 также может содержать корпус 1477 для оптики. В некоторых вариантах осуществления оптическая система 124 содержит защиту 1475 от излучения, содержащую сенсорную апертуру 1478, расположенную на эмиссионном оптическом пути 1417, и по меньшей мере одну блокирующую конструкцию 1480, расположенную таким образом, чтобы взаимодействовать с сенсорной апертурой 1478, таким образом, чтобы единственным излучением от возбуждающих лучей 1405, отражаемым от освещенного участка 1482 для прохождения через сенсорную апертуру 1478, было излучение, которое также было отражено от по меньшей мере одной другой поверхности корпуса 1477 для оптики или в его пределах. Другими словами, защита 1475 от излучения сконфигурирована таким образом, чтобы блокировалось прямое прохождение излучения от возбуждающих лучей 1405, отраженных от освещенного участка 1482, через апертуру 1478 и, таким образом, его прохождение в сенсорную линзу 1438 и на оптический детектор 1408. В некоторых вариантах осуществления освещенный участок 1482 содержит область, определяемую всеми апертурами 1483 нагревательной крышки 110, которые соответствуют множеству зон реакции 308.
[00120] В показанном на ФИГ. 20 варианте осуществления блокирующая конструкция 1480 содержит полку 1480. Штриховые линии или лучи 1484a и 1484b могут использоваться для пояснения эффективности блокирующей конструкции 1480 в предотвращении прохождении света, прямо отраженного от освещенного участка 1482, через сенсорную апертуру 1478 и на сенсорную линзу 1438 и/или оптический датчик 1408. Луч 1484a отходит от края освещенного участка 1482 и проходит лишь через полку 1480, но не проходит через сенсорную апертуру 1478. Луч 1484b представляет собой другой луч, отходящий от того же края освещенного участка 1482 и блокируется полкой 1480. Как можно увидеть, этот луч приходил бы через сенсорную апертуру 1478, если бы не присутствие полки 1480.
[00121] На ФИГ. 20 также показано, что некоторых вариантах осуществления оптическая система 124 также может содержать устройство обнаружения энергии или мощности, содержащее датчики 1490 мощности или энергии, оптически соединенные с концом световода 1492. Противоположный конец 1493 световода 1492 выполнен с возможностью освещаться возбуждающими лучами 1405. Конец 1493 световода может быть освещен либо непосредственно излучением, содержащимся в возбуждающих лучах 1405, либо опосредованно, например, излучением, рассеиваемым диффузно отражающей поверхностью. В некоторых вариантах осуществления датчик 1490 находится за пределами возбуждающего оптического пути 1412 от источника возбуждения 1402. В дополнительном или альтернативном варианте датчик 1490 находится за пределами корпуса 1477 для оптики и/или находится в отдаленном месте за пределами корпус 105 прибора. В варианте осуществления, который поясняется на ФИГ. 20, конец 1493 световода располагается в близкой или смежной позиции с зеркалом 1432 и может быть ориентирован таким образом, чтобы лицевая сторона световода была перпендикулярной или почти перпендикулярной поверхности зеркала 1432, которая отражает возбуждающие лучи 1405. Авторами изобретения было обнаружено, что малое количество энергии или мощности, перехватываемой световодом 1492 при такой ориентации, является достаточным для отслеживания энергии или мощности возбуждающих лучей 1405. Преимущество состоит в том, что при размещении датчика 1490 за пределами оптического пути возбуждающих лучей может обеспечиваться более компактная оптическая система 124.
[00122] В некоторых вариантах осуществления световод 1492 содержит отдельное волокно или волоконный жгут. В дополнительном или альтернативном варианте световод 1492 может содержать стержень, выполненный из прозрачного или светопроводящего материала, такого, как стекло, плексиглас, материал на полимерной основе, например, акрил и т. п.
[00123] Другие аспекты оптической системы 124 также могут быть описаны следующим образом.
[00124] В альтернативном варианте осуществления 1 обеспечивается прибор для биологического анализа, содержащий: основание, выполненное с возможностью приема держателя пробы, содержащего множество пространственно разделенных зон реакции для обработки одного или нескольких биологических проб, причем основание содержит термоциклер, выполнен с возможностью выполнения анализа путем полимеразной цепной реакции на отдельных биологических пробах; источник возбуждения, выполнен с возможностью образования первого возбуждающего луча, характеризующегося первой длиной волны, и второго возбуждающего луча, характеризующегося второй длиной волны, отличающейся от первой длины волны; оптический датчик, выполнен с возможностью приема эмиссии от биологических проб в ответ на источник возбуждения; возбуждающую оптическую систему, расположенную на возбуждающем оптическом пути между источником возбуждения и держателем пробы, возбуждающую оптическую систему, содержащую линзу для пробы, расположенную таким образом, чтобы направлять возбуждающие лучи на держатель проб; эмиссионную оптическую систему, расположенную на эмиссионном оптическом пути между держателем пробы и оптическим датчиком, причем эмиссионная оптическая система сконфигурирована для направления эмиссии от биологических проб на оптический датчик; расщепитель луча, расположенный на возбуждающем оптическом пути и на эмиссионном оптическом пути, причем расщепитель луча располагается таким образом, чтобы принимать первый возбуждающий луч и принимать второй возбуждающий луч, линзу для пробы, расположенную на возбуждающем оптическом пути между расщепителем луча и основанием; поглотитель луча, выполнен с возможностью приема излучения возбуждающего луча от расщепителя луча и обратного отражения менее 10 % излучения возбуждающего луча в направлении расщепителя луча; блок визуализации, содержащий: нижнюю поверхность и противоположную верхнюю поверхность, содержащую монтажную плату оптического датчика; сенсорную линзу, по меньшей мере частично заключенную в корпус линзы, нижняя поверхность содержит поверхность сенсорной линзы; и фокусирующий механизм, содержащий шестерню, зацепляющуюся с корпусом линзы, причем фокусирующий механизм доступен из-за пределов экрана для регулирования фокуса сенсорной линзы; освещенную поверхность, расположенную на возбуждающем оптическом пути между расщепителем луча и основанием, причем освещенная поверхность сконфигурирована для создания во время использования отраженного излучения, содержащего излучение от источника возбуждения, которое отражается освещенной поверхностью; защиту от излучения, содержащую: сенсорную апертуру, расположенную на эмиссионном оптическом пути между расщепителем луча и сенсорной линзой; и блокирующую конструкцию, расположенную таким образом, чтобы взаимодействовать с сенсорной апертурой во время использования, таким образом, чтобы полностью исключить прием оптическим датчиком отраженного излучения, которое также не отражается от другой поверхности прибора; устройство обнаружения энергии или мощности, содержащее: датчик энергии или мощности, находящийся за пределами оптического пути; и световод, расположенный по соседству с расщепителем луча и выполнен с возможностью передачи излучение от расщепителя луча до датчика энергии; источник позиции, выполнен с возможностью испускания излучения, и соответствующий датчик позиции, выполнен с возможностью приема излучения от источника позиции, причем источник позиции и датчик позиции выполнены с возможностью создания сигнала позиции, указывающего позицию оптического элемента, который располагается по меньшей мере на одном из оптических путей; защиту от излучения, выполненную с возможностью блокирования по меньшей мере части излучения от источника позиции; оптический экран, охватывающий оптические пути, причем экран содержит уплотнение для отдельных проводов, выполненное с возможностью прохождения проводов или кабеля между местом за пределами экрана и местом в пределах экрана с одновременным блокированием поступления света из-за пределов экрана на экран; крышку отверстия для линзы, выполненную с возможностью обеспечения возможности трехмерного регулирования сенсорной линзы с одновременным блокированием поступления света из-за пределов экрана на экран; причем оптический датчик представляет собой комплементарный датчик металл-оксид-полупроводник.
[00125] В альтернативном варианте осуществления 2 обеспечивается прибор согласно пункту 1, в котором блокирующая конструкция расположена таким образом, чтобы взаимодействовать с сенсорной апертурой во время использования, таким образом, чтобы исключалось попадание на сенсорную линзу отраженного излучения, которое также не отражается от другой поверхности прибора.
[00126] В альтернативном варианте осуществления 3 обеспечивается прибор для биологического анализа, содержащий: основание, выполненное с возможностью приема держателя пробы, содержащего множество пространственно разделенных зон реакции для обработки одного или нескольких биологических проб; источник возбуждения, выполнен с возможностью образования первого возбуждающего луча, характеризующегося первой длиной волны, и второго возбуждающего луча, характеризующегося второй длиной волны, отличающейся от первой длины волны; оптический датчик, выполнен с возможностью приема эмиссии от биологических проб в ответ на источник возбуждения; возбуждающую оптическую систему, расположенную на возбуждающем оптическом пути между источником возбуждения и держателем пробы; эмиссионную оптическую систему, расположенную на эмиссионном оптическом пути между держателем пробы и оптическим датчиком, причем эмиссионная оптическая система сконфигурирована для направления эмиссии от биологических проб на оптический датчик; блок визуализации, содержащий: нижнюю поверхность и противоположную верхнюю поверхность, содержащую монтажную плату оптического датчика; сенсорную линзу, по меньшей мере частично заключенную в корпус линзы, нижняя поверхность содержит поверхность сенсорной линзы; и фокусирующий механизм, содержащий шестерню, зацепляющуюся с корпусом линзы, причем фокусирующий механизм доступен из-за пределов экрана для регулирования фокуса сенсорной линзы.
[00127] В альтернативном варианте осуществления 4 обеспечивается прибор для биологического анализа, содержащий: основание, выполненное с возможностью приема держателя пробы, содержащего множество пространственно разделенных зон реакции для обработки одного или нескольких биологических проб; термический контроллер, выполнен с возможностью контроля температуры по меньшей мере одного основания, держателя проб или отдельных биологических проб; источник возбуждения, выполнен с возможностью образования первого возбуждающего луча, характеризующегося первой длиной волны, и второго возбуждающего луча, характеризующегося второй длиной волны, отличающейся от первой длины волны; оптический датчик, выполнен с возможностью приема эмиссии от биологических проб в ответ на источник возбуждения; возбуждающую оптическую систему, расположенную на возбуждающем оптическом пути между источником возбуждения и держателем пробы; эмиссионную оптическую систему, расположенную на эмиссионном оптическом пути между держателем пробы и оптическим датчиком, причем эмиссионная оптическая система сконфигурирована для направления эмиссии от биологических проб на оптический датчик; сенсорную линзу, выполненную с возможностью направления эмиссии от по меньшей мере части биологической пробы на оптический датчик; освещенную поверхность, расположенную на возбуждающем оптическом пути между расщепителем луча и основанием, причем освещенная поверхность сконфигурирована для создания во время использования отраженного излучения, содержащего излучение от источника возбуждения, которое отражается освещенной поверхностью; защиту от излучения, содержащую: сенсорную апертуру, расположенную на эмиссионном оптическом пути между расщепителем луча и сенсорной линзой; и блокирующую конструкцию, расположенную таким образом, чтобы взаимодействовать с сенсорной апертурой во время использования, таким образом, чтобы полностью исключить прием оптическим датчиком отраженного излучения, которое также не отражается от другой поверхности прибора.
[00128] В альтернативном варианте осуществления 5 обеспечивается прибор для биологического анализа, содержащий: основание, выполненное с возможностью приема держателя пробы, содержащего множество пространственно разделенных зон реакции для обработки одного или нескольких биологических проб; источник возбуждения, выполнен с возможностью образования первого возбуждающего луча, характеризующегося первой длиной волны, и второго возбуждающего луча, характеризующегося второй длиной волны, отличающейся от первой длины волны; оптический датчик, выполнен с возможностью приема эмиссии от биологических проб в ответ на источник возбуждения; возбуждающую оптическую систему, расположенную на возбуждающем оптическом пути между источником возбуждения и держателем пробы; эмиссионную оптическую систему, расположенную на эмиссионном оптическом пути между держателем пробы и оптическим датчиком, причем эмиссионная оптическая система сконфигурирована для направления эмиссии от биологических проб на оптический датчик; устройство обнаружения энергии или мощности, содержащее: датчик энергии или мощности, находящийся за пределами оптического пути; и световод, расположенный по соседству с расщепителем луча и выполнен с возможностью передачи излучение от расщепителя луча до датчика энергии.
[00129] В альтернативном варианте осуществления 6 обеспечивается прибор для биологического анализа, содержащий: основание, выполненное с возможностью приема держателя пробы, содержащего множество пространственно разделенных зон реакции для обработки одного или нескольких биологических проб; источник возбуждения, выполнен с возможностью образования первого возбуждающего луча, характеризующегося первой длиной волны, и второго возбуждающего луча, характеризующегося второй длиной волны, отличающейся от первой длины волны; оптический датчик, выполнен с возможностью приема эмиссии от биологических проб в ответ на источник возбуждения; возбуждающую оптическую систему, расположенную на возбуждающем оптическом пути между источником возбуждения и держателем пробы; эмиссионную оптическую систему, расположенную на эмиссионном оптическом пути между держателем пробы и оптическим датчиком, причем эмиссионная оптическая система сконфигурирована для направления эмиссии от биологических проб на оптический датчик; источник позиции, выполнен с возможностью испускания излучения, и соответствующий датчик позиции, выполнен с возможностью приема излучения от источника позиции, причем источник позиции и датчик позиции выполнены с возможностью создания сигнала позиции, указывающего позицию оптического элемента, который располагается по меньшей мере на одном из оптических путей; защиту от излучения, выполненную с возможностью блокирования по меньшей мере части излучения от источника позиции.
[00130] В альтернативном варианте осуществления 7 обеспечивается прибор для биологического анализа, содержащий: основание, выполненное с возможностью приема держателя пробы, содержащего множество пространственно разделенных зон реакции для обработки одного или нескольких биологических проб; источник возбуждения, выполнен с возможностью образования первого возбуждающего луча, характеризующегося первой длиной волны, и второго возбуждающего луча, характеризующегося второй длиной волны, отличающейся от первой длины волны; оптический датчик, выполнен с возможностью приема эмиссии от биологических проб в ответ на источник возбуждения; возбуждающую оптическую систему, расположенную на возбуждающем оптическом пути между источником возбуждения и держателем пробы; эмиссионную оптическую систему, расположенную на эмиссионном оптическом пути между держателем пробы и оптическим датчиком, причем эмиссионная оптическая система сконфигурирована для направления эмиссии от биологических проб на оптический датчик; расщепитель луча, расположенный на возбуждающем оптическом пути и на эмиссионном оптическом пути, причем расщепитель луча располагается таким образом, чтобы принимать первый возбуждающий луч и принимать второй возбуждающий луч, оптический экран, охватывающий оптические пути, причем экран содержит a уплотнение для отдельных проводов, выполненное с возможностью прохождения проводов или кабеля между местом за пределами экрана и местом в пределах экрана с одновременным блокированием поступления света из-за пределов экрана на экран; крышку отверстия для линзы, выполненную с возможностью обеспечения возможности трехмерного регулирования сенсорной линзы с одновременным блокированием поступления света из-за пределов экрана на экран.
[00131] В альтернативном варианте осуществления 8 обеспечивается прибор для биологического анализа, содержащий: основание, выполненное с возможностью приема держателя пробы, содержащего множество пространственно разделенных зон реакции для обработки одного или нескольких биологических проб; источник возбуждения, выполнен с возможностью образования первого возбуждающего луча, характеризующегося первой длиной волны, и второго возбуждающего луча, характеризующегося второй длиной волны, отличающейся от первой длины волны; оптический датчик, выполнен с возможностью приема эмиссии от биологических проб в ответ на источник возбуждения; возбуждающую оптическую систему, расположенную на возбуждающем оптическом пути между источником возбуждения и держателем пробы; эмиссионную оптическую систему, расположенную на эмиссионном оптическом пути между держателем пробы и оптическим датчиком, причем эмиссионная оптическая система сконфигурирована для направления эмиссии от биологических проб на оптический датчик; расщепитель луча, расположенный на возбуждающем оптическом пути и на эмиссионном оптическом пути, причем расщепитель луча располагается таким образом, чтобы принимать первый возбуждающий луч и принимать второй возбуждающий луч, причем оптический датчик представляет собой комплементарный датчик металл-оксид-полупроводник.
[00132] В альтернативном варианте осуществления 9 обеспечивается прибор согласно любому из вариантов осуществления 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129] или [00130], который дополнительно содержит один или несколько эмиссионных фильтров, расположенных на эмиссионном оптическом пути.
[00133] В альтернативном варианте осуществления 10 обеспечивается прибор согласно любому из вариантов осуществления 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129] или [00130], причем по меньшей мере некоторые их видов эмиссии содержат флуоресцентную эмиссию по меньшей мере от некоторых биологических проб в ответ на по меньшей мере один из возбуждающих лучей.
[00134] В альтернативном варианте осуществления 11 обеспечивается прибор согласно любому из вариантов осуществления 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129] или [00130], причем по меньшей мере некоторые их видов эмиссии содержат флуоресцентную эмиссию по меньшей мере от некоторых биологических проб в ответ на по меньшей мере один из возбуждающих лучей.
[00135] В альтернативном варианте осуществления 12 обеспечивается прибор согласно любому из вариантов осуществления 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129] или [00130], причем по меньшей мере некоторые их видов эмиссии содержат излучение от по меньшей мере одного из возбуждающих лучей, которое отражается, преломляется, отклоняется, рассеивается или поляризируется по меньшей мере некоторыми из биологических проб.
[00136] В альтернативном варианте осуществления 13 обеспечивается прибор согласно любому из вариантов осуществления 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129] или [00130], который дополнительно содержит терморегулируемую крышку, расположенную на возбуждающем оптическом пути между основанием и расщепителем луча.
[00137] В альтернативном варианте осуществления 14 обеспечивается прибор согласно варианту осуществления [00135], который дополнительно содержит зеркало, расположенное на возбуждающем оптическом пути между основанием и расщепителем луча.
[00138] В альтернативном варианте осуществления 15 обеспечивается прибор согласно любому из вариантов осуществления 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129] или [00130], который дополнительно содержит зеркало, расположенное на возбуждающем оптическом пути между основанием и расщепителем луча.
[00139] В альтернативном варианте осуществления 16 обеспечивается прибор согласно любому из вариантов осуществления 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129] или [00130], причем основание содержит узел блока пробоподготовки, выполнен с возможностью контроля температуры держателя пробы или биологических проб.
[00140] В альтернативном варианте осуществления 17 обеспечивается прибор согласно варианту осуществления [00138], причем узел блока пробоподготовки содержит один или несколько компонентов, к которым относятся блок пробоподготовки, устройство Пельтье или поглотитель тепла.
[00141] В альтернативном варианте осуществления 18 обеспечивается прибор согласно любому из вариантов осуществления [00125], [00127], [00127], [00128], [00129] или [00130], причем основание содержит термоциклер, выполненное с возможностью выполнения анализа путем ПЦР.
[00142] В альтернативном варианте осуществления 19 обеспечивается прибор согласно любому из вариантов осуществления 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129] или [00130], причем прибор содержит держатель проб.
[00143] В альтернативном варианте осуществления 20 обеспечивается прибор согласно варианту осуществления [00141], причем держатель проб содержит один или несколько компонентов, к которым относятся микротитровальный планшет, подложка, содержащая множество лунок или сквозные отверстия, подложка, содержащая один или несколько каналов, или камера, содержащая множество гранул или сфер, содержащих один или несколько биологических проб.
[00144] В альтернативном варианте осуществления 21 обеспечивается прибор согласно варианту осуществления [00141], причем множество пространственно разделенных зон реакции содержат одну или несколько разновидностей, к которым относятся множество лунок, множество сквозных отверстий в подложке, множество отдельных мест на подложка или в пределах канала или множество гранул или сфер в пределах реакционного объема.
[00145] В альтернативном варианте осуществления 22 обеспечивается прибор согласно варианту осуществления [00141], причем по меньшей мере некоторые из пространственно разделенных зон реакции содержат один или несколько биологических проб.
[00146] В альтернативном варианте осуществления 23 обеспечивается прибор согласно варианту осуществления [00144], причем один или несколько биологических проб содержат один или несколько примеров, к которым относятся по меньшей мере одна целевая нуклеиновокислотная последовательность, по меньшей мере один праймер, по меньшей мере один буфер, по меньшей мере один нуклеотид, по меньшей мере один фермент, по меньшей мере один детергент, по меньшей мере один блокирующий агент или по меньшей мере один краситель, маркер и/или зонд, подходящий для обнаружения целевой или контрольной нуклеиновокислотной последовательности.
[00147] В альтернативном варианте осуществления 24 обеспечивается прибор согласно варианту осуществления [00141], причем держатель проб содержит микротитровальный планшет, и зоны реакции содержат по меньшей мере 96 лунок, по меньшей мере 384 или по меньшей мере 1536 лунок.
[00148] В альтернативном варианте осуществления 25 обеспечивается прибор согласно варианту осуществления [00141], причем держатель проб содержит подложку, содержащую первую поверхность, противоположную вторую поверхность и множество сквозных отверстий, расположенных между поверхностями, причем множество сквозных отверстий выполнено с возможностью содержания одного или нескольких биологических проб.
[00149] В альтернативном варианте осуществления 26 обеспечивается прибор согласно варианту осуществления [00147], причем подложка содержит по меньшей мере 3096 сквозных отверстий или по меньшей мере 20000 сквозных отверстий.
[00150] В альтернативном варианте осуществления 27 обеспечивается прибор согласно варианту осуществления [00141], причем держатель проб содержит множество капилляров, выполненных с возможностью прохождения одной или нескольких целевых молекул или последовательности молекул.
[00151] В альтернативном варианте осуществления 28 обеспечивается прибор согласно варианту осуществления [00141], причем держатель проб выполнен с возможностью выполнения по меньшей мере одного из анализов, к которым относятся полимеразная цепная реакция, анализ путем секвенирования или анализ путем капиллярного электрофореза или блоттинг.
[00152] В альтернативном варианте осуществления 29 обеспечивается прибор согласно любому из вариантов осуществления [00125], [00127], [00127], [00128], [00129] или [00130], причем возбуждающая оптическая система, содержащая линзу для пробы выполнена с возможностью направления возбуждающих лучей на основание.
[00153] В альтернативном варианте осуществления 30 обеспечивается прибор согласно любому из вариантов осуществления 1 или [00151], причем линза для пробы содержит объектив, охватывающий во время использования множество пространственно разделенных участков.
[00154] В альтернативном варианте осуществления 31 обеспечивается прибор согласно любому из вариантов осуществления 1 или [00151], причем линза для пробы содержит по меньшей мере одно из устройств, к которым относятся объектив, охватывающий во время использования множество пространственно разделенных участков, или множество линз, причем каждая из множества линз во время использования располагается над соответствующей одной из множества зон реакции.
[00155] В альтернативном варианте осуществления 32 обеспечивается прибор согласно любому из вариантов осуществления 1 или [00151], причем линза для пробы содержит по меньшей мере одно из устройств, к которым относятся составная линза, криволинейное зеркало, дифракционный оптический элемент или голографический оптический элемент.
[00156] В альтернативном варианте осуществления 33 обеспечивается прибор согласно варианту осуществления 1, причем, во время использования линза для пробы обеспечивает телецентрическую оптическую систему для по меньшей мере одного из компонентов, к которым относятся держатель проб, пространственно разделенные зоны реакции или оптический датчик.
[00157] В альтернативном варианте осуществления 34 обеспечивается прибор согласно варианту осуществления [00151], причем во время использования линза для пробы обеспечивает телецентрическую оптическую систему для по меньшей мере одного из компонентов, к которым относятся держатель проб, пространственно разделенные зоны реакции или оптический датчик.
[00158] В альтернативном варианте осуществления 35 обеспечивается прибор согласно любому из вариантов осуществления 1 или [00151], причем линза для пробы содержит линзу Френеля.
[00159] В альтернативном варианте осуществления 36 обеспечивается прибор согласно любому из вариантов осуществления 1 или [00151], причем линза для пробы содержит множество линз, соответствующих множеству зон реакции.
[00160] В альтернативном варианте осуществления 37 обеспечивается прибор согласно любому из вариантов осуществления 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129] или [00130], причем расщепитель луча выполнен с возможностью передачи возбуждающих лучей во время использования или выполнен с возможностью отражения возбуждающих лучей во время использования.
[00161] В альтернативном варианте осуществления 38 обеспечивается прибор согласно любому из вариантов осуществления 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129] или [00130], причем расщепитель луча содержит широкополосный расщепитель луча, характеризующийся отражающей способностью, которая является постоянной в диапазоне длины волн по меньшей мере 100 нанометров.
[00162] В альтернативном варианте осуществления 39 обеспечивается прибор согласно любому из вариантов осуществления 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129] или [00130], причем расщепитель луча характеризуется отражающей способностью, которая является постоянной в диапазоне длины волн от 450 нанометров до 680 нанометров.
[00163] В альтернативном варианте осуществления 40 обеспечивается прибор согласно любому из вариантов осуществления 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129] или [00130], причем расщепитель луча характеризуется отражающей способностью, которая является постоянной в видимом диапазоне длины волн электромагнитного спектра.
[00164] В альтернативном варианте осуществления 41 обеспечивается прибор согласно любому из вариантов осуществления 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129] или [00130], причем расщепитель луча содержит нейтральный фильтр.
[00165] В альтернативном варианте осуществления 42 обеспечивается прибор согласно любому из вариантов осуществления 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129] или [00130], причем расщепитель луча содержит расщепитель луча 50/50.
[00166] В альтернативном варианте осуществления 43 обеспечивается прибор согласно любому из вариантов осуществления 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129] или [00130], причем расщепитель луча содержит дихроический расщепитель луча.
[00167] В альтернативном варианте осуществления 44 обеспечивается прибор согласно любому из вариантов осуществления 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129] или [00130], причем расщепитель луча содержит многодиапазонный расщепитель луча.
[00168] В альтернативном варианте осуществления 45 обеспечивается прибор согласно любому из вариантов осуществления 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129] или [00130], причем первый возбуждающий луч и второй возбуждающий луч разделены во времени и/или в пространстве.
[00169] В альтернативном варианте осуществления 46 обеспечивается прибор согласно любому из вариантов осуществления 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129] или [00130], причем первый возбуждающий луч и второй возбуждающий луч образуются одновременно.
[00170] В альтернативном варианте осуществления 47 обеспечивается прибор согласно любому из вариантов осуществления 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129] или [00130], причем источник возбуждающего света содержит один или несколько источников, к которым относятся по меньшей мере одна лампа накаливания, по меньшей мере одна газоразрядная лампа, по меньшей мере один светоизлучающий диод, по меньшей мере один органический светоизлучающий диод или по меньшей мере один лазер.
[00171] В альтернативном варианте осуществления 48 обеспечивается прибор согласно варианту осуществления [00169], причем по меньшей мере одна газоразрядная лампа содержит один или несколько компонентов, к которым относятся галогеновая лампа, ксеноновая лампа, аргоновая лампа или криптоновая лампа.
[00172] В альтернативном варианте осуществления 49 обеспечивается прибор согласно варианту осуществления [00169], причем по меньшей мере один лазер содержит один или несколько компонентов, к которым относятся диодный лазер, аргоновый лазер, ксеноновый лазер, эксимерный лазер, твердотельный лазер, гелиево-неоновый лазер или лазер на красителе.
[00173] В альтернативном варианте осуществления 50 обеспечивается прибор согласно любому из вариантов осуществления 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129] или [00130], причем первый возбуждающий луч содержит первый диапазон длины волн, в котором интенсивность, мощность или энергия первого возбуждающего луча превышает первое заданное значение, второй возбуждающий луч содержит второй диапазон длины волн, в котором интенсивность, мощность или энергия второго возбуждающего луча превышает второе заданное значение, первая длина волны является по меньшей мере одной из величин, к которым относятся (1) центральная длина волны первого диапазона длины волн или (2) длина волны максимальной электромагнитной интенсивности, мощности или энергии в первом диапазоне длины волн, а вторая длина волны является по меньшей мере одной из величин, к которым относятся (1) центральная длина волны второго диапазона длины волн или (2) длина волны максимальной электромагнитной интенсивности, мощности или энергии во втором диапазоне длины волн.
[00174] В альтернативном варианте осуществления 51 обеспечивается прибор согласно варианту осуществления [00172], причем по меньшей мере одно из значений центральной длины волн является средней длиной волны в соответствующем диапазоне длины волн.
[00175] В альтернативном варианте осуществления 52 обеспечивается прибор согласно варианту осуществления [00172], причем по меньшей мере одно из заданных значений является меньшим, чем 20 % от соответствующей максимальной интенсивности, мощности или энергии в соответствующем диапазоне длины волн.
[00176] В альтернативном варианте осуществления 53 обеспечивается прибор согласно варианту осуществления [00172], причем второе заданное значение равняется первому заданному значению.
[00177] В альтернативном варианте осуществления 54 обеспечивается прибор согласно варианту осуществления [00172], причем первый диапазон длины волн не перекрывается со вторым диапазоном длины волн, или первый диапазон длины волн лишь частично перекрывается со вторым диапазоном длины волн.
[00178] В альтернативном варианте осуществления 55 обеспечивается прибор согласно варианту осуществления [00172], причем вторая длина волны отличается от первой длины волны по меньшей мере на 20 нанометров.
[00179] В альтернативном варианте осуществления 56 обеспечивается прибор согласно варианту осуществления [00172], причем по меньшей мере один из первого и второго диапазонов длины волн имеет значение по меньшей мере 20 нанометров.
[00180] В альтернативном варианте осуществления 57 обеспечивается прибор согласно любому из вариантов осуществления 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129] или [00130], причем вторая длина волны отличается от первой длины волны по меньшей мере на 20 нанометров.
[00181] В альтернативном варианте осуществления 58 обеспечивается прибор согласно любому из вариантов осуществления 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129] или [00130], причем источник возбуждения содержит источник света, и первая длина волны и вторая длина волны находятся в видимом диапазоне электромагнитного спектра.
[00182] В альтернативном варианте осуществления 59 обеспечивается прибор согласно любому из вариантов осуществления 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129] или [00130], причем источник возбуждения содержит источник света, который имеет ширину полосы по меньшей мере 100 нанометров.
[00183] В альтернативном варианте осуществления 60 обеспечивается прибор согласно любому из вариантов осуществления 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129] или [00130], причем источник возбуждения содержит множество фильтров возбуждения, которые перемещаются в направлении входа и выхода из возбуждающего оптического пути.
[00184] В альтернативном варианте осуществления 61 обеспечивается прибор согласно варианту осуществления [00182], причем по меньшей мере один из фильтров возбуждения имеет диапазон длины волны по меньшей мере ±10 нанометров.
[00185] В альтернативном варианте осуществления 62 обеспечивается прибор согласно варианту осуществления [00182], причем фильтры возбуждения содержат по меньшей мере 5 фильтров возбуждения.
[00186] В альтернативном варианте осуществления 63 обеспечивается прибор согласно варианту осуществления [00182], причем фильтры возбуждения содержат множество фильтров, вместе обеспечивающих множество полос пропускания, подходящих для флуоресцирования одного или нескольких красителей или зондов, таких, как краситель или зонд SYBR, краситель или зонд FAMTM краситель или зонд VIC, краситель или зонд ROXTM или краситель или зонд TAMRATM.
[00187] В альтернативном варианте осуществления 64 обеспечивается прибор согласно варианту осуществления [00182], причем фильтры возбуждения закреплены на вращающемся диске с фильтрами, сконфигурированном для перемещения каждого из фильтров в направлении входа и выхода из пути возбуждающего луча.
[00188] В альтернативном варианте осуществления 65 обеспечивается прибор согласно любому из вариантов осуществления 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129] или [00130], причем источник возбуждения содержит множество отдельных источников возбуждения.
[00189] В альтернативном варианте осуществления 66 обеспечивается прибор согласно варианту осуществления [00187], причем множество отдельных источников возбуждения образует двумерный массив отдельных источников возбуждения.
[00190] В альтернативном варианте осуществления 67 обеспечивается прибор согласно любому из вариантов осуществления 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129] или [00130], причем оптический датчик содержит матричный датчик.
[00191] В альтернативном варианте осуществления 68 обеспечивается прибор согласно варианту осуществления [00189], причем матричный датчик содержит по меньшей мере один из датчиков, к которым относятся комплементарный датчик металл-оксид-полупроводник или устройство с зарядовой связью.
[00192] В альтернативном варианте осуществления 69 обеспечивается прибор согласно любому из вариантов осуществления 1, [00125], [00127], [00127], [00128], [00129] или [00130], причем оптический датчик содержит по меньшей мере два матричных датчика.
[00193] В альтернативном варианте осуществления 70 обеспечивается прибор согласно любому из вариантов осуществления [00127], [00127], [00128] или [00130] обеспечивается, который дополнительно содержит сенсорную линзу, выполненную с возможностью направления эмиссии от по меньшей мере части биологической пробы на оптический датчик.
[00194] В альтернативном варианте осуществления 71 обеспечивается прибор согласно любому из вариантов осуществления [00125], [00127], [00127], [00128], [00129] или [00130], причем оптический датчик представляет собой комплементарный датчик металл-оксид-полупроводник.
[00195] В альтернативном варианте осуществления 72 обеспечивается прибор согласно варианту осуществления [00127], в котором блокирующая конструкция расположена таким образом, чтобы взаимодействовать с сенсорной апертурой во время использования, таким образом, чтобы исключалось попадание на сенсорную линзу отраженного излучения, которое также не отражается от другой поверхности прибора.
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ОПЕРАЦИЙ КАЛИБРОВКИ
[00196] Прогресс в области калибровки приборов для биологического анализа позволяет снижать уровень ошибки оператора, вмешательство оператора и сокращать время, необходимое для калибровки прибора для биологического анализа и разных его компонентов и обеспечивать его надлежащую и эффективную установку.
[00197] Таким образом, в соответствии с различными вариантами осуществления настоящего изобретения, обеспечивается возможность внедрения экспертных знаний в автоматизированную систему калибровки и проверки, предусматривающую статус пригодности / непригодности и обратную связь по вопросам устранения неисправностей в случае их выявления. Если прибор не проходит процесс калибровки, может быть вызван инженер по эксплуатации. Представленная идея позволяет минимизировать расход средств и времени, необходимых для выполнения процедур установки и калибровки.
Общая последовательность операций калибровки
[00198] На биологические приборы часто возлагаются задачи по обеспечению точных и надежных данных для экспериментов. Регулярная калибровка и техническое обслуживание биологических приборов гарантируют надлежащую и оптимальную работу прибора, что позволяет максимально повысить производительность, свести к минимуму затраты на ремонт путем распознавания потенциальных проблем еще до их проявления и повысить качество результатов.
[00199] В соответствии с различными вариантами осуществления настоящего изобретения способы калибровки, описанные в этом документе, могут выполняться по отдельности или вместе, в любой комбинации. Кроме того, описываемые авторами способы калибровки могут выполняться после изготовления прибора для первоначальной калибровки или в любое время после начальной установки и использования. Описываемые авторами способы калибровки могут выполняться, например, еженедельно, ежемесячно, раз в полгода, раз в год или по необходимости.
[00200] В соответствии с представленными в данном описании различными вариантами осуществления применяют такие способы калибровки, как калибровка исследуемой области (ROI), фоновая калибровка, калибровка однородности, калибровка чистыми красителями, нормализация прибора, для определения места и интенсивности флуоресцентных сигналов при каждом считывании, красителя, связанного с каждым флуоресцентным сигналом, и значимости сигнала. Кроме того, в соответствии с различными вариантами осуществления, выполняют автоматическую коррекцию красителя, автоматическую фоновую калибровку и анодное детектирование для еще более точного обнаружения и считывания красителя и обнаружения ошибок. Системой также может автоматически выполняться проверка надлежащего функционирования прибора с применением РНКазы P.
[00201] ФИГ. 21 иллюстрирует типичную последовательность операций калибровки 2100, которая может выполняться на приборе в соответствии с различными описываемыми авторами вариантами осуществления. Следует отметить, что последовательность операций калибровки 2100 представлена в качестве примера, и описываемые авторами способы калибровки могут выполняться по отдельности или подгруппой, в любой комбинации и в любом порядке.
[00202] На этапе 2102 выполняют ROI-калибровку. В целом ROI-калибровка обеспечивает информацию, определяющую позиции лунок в поле зрения детектора. Представленная авторами идея позволяет автоматизировать ROI-калибровку путем минимизации или устранения взаимодействия с пользователем. Различные варианты осуществления позволяют автоматизировать процесс путем обеспечения способов и систем, определяющих оптимальное время воздействия для каждого фильтра с применением анализа гистограмм режима двоичного поиска. ROI-калибровка в соответствии с различными описываемыми авторами вариантами осуществления распознает лунки на изображении точнее и с меньшим количеством ошибок по сравнению с предыдущими способами. Способы и системы ROI-калибровки в соответствии с различными вариантами осуществления подробнее описываются ниже.
[00203] На этапе 2104 выполняют фоновую калибровку. Часто детектор считывает определенное количество сигнала даже в отсутствие пробы, испускающего обнаружимый сигнал. Учет этого фонового сигнала может быть важен, поскольку фоновый сигнал может вычитаться из считываемого сигнала пробы с целью получения более точного измерения сигнала пробы. Фоновую калибровку выполняют, используя планшет с водой для определения фонового сигнала прибора для каждой комбинации фильтра/лунки. Этот этап может быть автоматизирован для минимизации или устранения взаимодействия с пользователем. Может быть предусмотрена автоматизация, позволяющая проверить, правильный ли был выбран планшет для фоновой калибровки. Например, на этапе 2104 смотрят на уровень сигнала и устраняют возможность использования ненадлежащего тестового планшета, такого, как испускающий сильный сигнал тестовый планшет, применяемый при ROI-калибровке. Если уровень сигнала сильно превышает ожидаемый уровень фона, пользователь может быть предупрежден о том, что необходимо вставить надлежащий тестовый планшет. Также на этой стадии может быть проведено испытание на загрязнение одной или нескольких лунок в тестовом планшете путем проверки на широкую дивергенцию уровня сигнала, а при ее обнаружении включено предупреждение, указывающее на возможное существование загрязненных или содержащих примеси лунок. Такие лунки могут вести к ненадлежащему фоновому уровню сигнала, который вычитается из уровня сигнала пробы.
[00204] На этапе 2106 выполняют калибровку однородности.В некоторых случаях изменения геометрической формы планшета (деформация, толщина) могут вызывать изменчивость показателей интенсивности в разных частях планшета, несмотря на присутствие одинакового количества флуоресцентного красителя в каждой лунке. Калибровка однородности позволяет откалибровать прибор с применением планшета с разными красителями, таким образом, чтобы обеспечивалась возможность коррекции изменчивости интенсивности из-за различий планшетов. Этап 2106 может быть автоматизирован для уменьшения или устранения взаимодействия с пользователем. Часть такой автоматизации может содержать обнаружение использования неправильного калибровочного планшета и выявление и исправление при наличии пустых или загрязненных лунок в калибровочном планшете.
[00205] На этапе 2108 выполняют калибровку чистыми красителями. Калибровочные флуоресцентные красители, применяемые в приборе для количественной ПЦР, позволяют программе прибора использовать калибровочные данные, собранные для стандартов красителя, для характеризации и различения доли каждого отдельного красителя в полных данных флуоресценции, собранных прибором. В соответствии с различными вариантами осуществления настоящего изобретения, после прогона пробы программа прибора получает данные от сигнала необработанного спектра для каждого считанного показателя. Программа определяет долю каждого из флуоресцентных красителей, применяемых в каждой реакционной зоне, путем сравнения необработанных спектров, привносимых каждым красителем в калибровочные данные чистых спектров. Когда пользователь сохраняет данные эксперимента после анализа, программа прибора хранит чистые спектры вместе с собранными данными флуоресценции для этого эксперимента, а также долю каждого флуоресцентного красителя на лунку. Способ подробнее описывается ниже. Применение калибровки чистыми красителями в соответствии с различными вариантами осуществления настоящего изобретения позволяет использовать меньшее количество калибровочных планшетов, что позволяет экономить средства пользователя и устранять источники ошибок при калибровке.
[00206] На этапе 2110 выполняют калибровку для нормализации прибора. Трудность, с которой обычно приходится сталкиваться исследователям, состоит в невозможности легкого сравнения результатов экспериментов, проводимых на нескольких приборах. Физические колебания параметров компонентов, таких, как источники света, оптические элементы и детекторы флуоресценции, например, могут приводить, например, к изменчивости результатов анализов, проводимых на идентичных биологических пробах. Таким образом, по-прежнему существует потребность в способах и в приборах, способствующих минимизации изменчивости в компонентах.
[00207] При количественной ПЦР кривые амплификации часто определяют путем нормализации сигнала репортерного красителя относительно пассивного контрольного красителя в том же растворе. Эта нормализация может указываться как нормализованные значения флуоресценции, обозначаемые как "Rn". Нормализация по пассивному стандарту обеспечивает устойчивые значения Rn, даже если на общий уровень сигнала влияет объем жидкости или общая интенсивность освещения. Однако нормализация по пассивному стандарту не может надлежащим образом работать, если меняется соотношение сигнала между репортерным красителем и контрольным краситель, например, при различиях между приборами в спектре освещения. В соответствии с различными описываемыми авторами вариантами осуществления, калибровочная нормализация прибора содержит считывание флуоресценции от смеси красителей для получения "коэффициента нормализации" для регулирования значений Rn, что требует дополнительных расходов.
[00208] На этапе 2112 выполняют проверку с применением РНКазы P. Выполнение проверочного теста позволяет проверить, надлежащим ли образом функционирует прибор. Например, проверка с применением РНКазы P определяет, способен ли прибор точно различать два разных количества пробы. Раньше проверку с применением РНКазы P выполняли вручную с использованием стандартной кривой, и пользователь производил статистические расчеты для проверки прибора. В соответствии с различными вариантами осуществления, описанными согласно представленной авторами идее, проверка с применением РНКазы P может выполняться системой автоматически без использования стандартной кривой. Различные варианты осуществления проверки с применением РНКазы P подробнее описываются ниже.
[00209] ФИГ. 37 иллюстрирует систему 4100 для калибровки прибора в соответствии с различными описываемыми авторами вариантами осуществления. Система 4100 содержит ROI-калибратор 4102, калибратор чистого красителя 4104, калибратор нормализации прибора 4108, валидатор 4110 с применением РНКазы P и дисплейное устройство / GUI 4106. ROI-калибратор 4102 выполнен с возможностью определения позиций реакционной зоны в изображении. Калибратор чистого красителя 4104 выполнен с возможностью определения доли флуоресцентного красителя, используемого в каждой реакционной зоне, путем сравнения необработанного спектра флуоресцентного красителя с калибровочными данными чистого спектра флуоресцентного красителя. Калибратор нормализации прибора 4108 выполнен с возможностью определения коэффициента нормализации фильтра. Валидатор 4110 с применением РНКазы P выполнен с возможностью подтверждения способности прибора к распознаванию между двумя разными значениями количества пробы. Дисплейное устройство 4106 выполнено с возможностью демонстрации результатов калибровки.
[00210] Представленная авторами идея описывается со ссылкой на приборы для полимеразной цепной реакции в реальном времени (RT-ПЦР). В частности, вариант представленной авторами идеи осуществлен для приборов для ПЦР в реальном времени с применением оптической визуализации планшетов с лунками. Такие приборы могут быть способны одновременно измерять сигналы от множества проб или капель для аналитических целей и часто требуют калибровки, включая, помимо прочих, процессы, содержащие: распознавание ROI (исследуемых областей), определение фонового сигнала, спектральную калибровку однородными и чистыми красителями для многокомпонентного анализа. Калибровка также может содержать проверочную реакцию RT-ПЦР с применением планшета с известной пробой с ожидаемым результатом. Специалисту в данной области техники станет понятным, что хотя представленная авторами идея была описана на примерах, касающихся приборов для ПЦР в реальном времени, их принципы широко применимы и для других форм лабораторных приборов, которые могут требовать калибровки и проверки с целью обеспечения точности и/или оптимальности результатов.
Калибровка по исследуемой области (ROI)
[00211] Как указано выше, представленная авторами идея описывается со ссылкой на приборы для полимеразной цепной реакции в реальном времени (RT-ПЦР). В частности, вариант представленной авторами идеи осуществлен для приборов для ПЦР в реальном времени с применением оптической визуализации планшетов с лунками. Такие приборы способны одновременно измерять сигналы от множества проб или капель для аналитических целей и часто требуют калибровки. Примером процесса, который может требовать калибровки, является распознавание ROI или исследуемых областей.
[00212] Как правило, ROI-калибровку выполняют с применением планшета с сильной эмиссией в каждой ячейке, соответствующей всем фильтрам. Она может быть полезной, поскольку ROI могут не быть идентичными для каждого фильтра. Различия в ROI между фильтрами могут быть вызваны небольшими угловыми расхождениями в фильтрах и других спектральных характеристиках фильтров. Таким образом, в различных вариантах осуществления выполняют (PFPR)-ROI-калибровку для каждого фильтра / для каждой лунки. Эти варианты PFPR-ROI-калибровки применяют для определения места лунок в 96-луночном планшете для каждого фильтра. ROI-калибровку выполняют с применением такого способа, описанного как Adaptive Mask Making в Патенте США № 6,518,068 B1.
[00213] Представленная авторами идея позволяет автоматизировать ROI-калибровку путем минимизации или устранения взаимодействия с пользователем. Различные варианты осуществления позволяют автоматизировать процесс путем обеспечения программы, определяющей оптимальное время воздействия для каждого фильтра с применением анализа гистограмм и режима двоичного поиска. Время воздействия - это количество времени, требуемое для захвата изображения планшета. Опять же, это значение может колебаться согласно спектральным характеристикам фильтра. В целом ROI-калибровка обеспечивает информацию, определяющую позиции лунок в поле зрения детектора. Эта информация может храниться как файлы масок в 2304 с глобальной маской или множеством масок, соответствующих разным фильтрам.
[00214] В процессе калибровки, таком, как описано выше, часто применяют проекции столбцов и строк и профили интенсивности. В результате определения ROI могут быть чувствительными к артефактам и насыщению внутри лунок, вращению решетки, изменчивости коэффициентов увеличения и оптической радиальной дисторсии. Таким образом, преимуществом является более надежное определение ROI для минимизации такой чувствительности и устранения дисторсий и другого нежелательного фонового шума в обнаруженных данных эмиссии.
[00215] Фоновый шум может быть связан с собственным шумом системы, а также другими нежелательными сигналами. Например, определенный фоновый шум в данных может быть обусловлен физическими источниками на подложке, такими, как частицы пыли или царапины. Другим примером физического источника, который может создавать фоновый шум, является держатель или корпус, содержащий или окружающую пробу. Другой фоновый шум в данных может быть обусловлен естественным излучением от поверхностей в приборе, таким, как отражение и природная флуоресценция. Другой фоновый шум также может быть результатом обнаружения оптической системой, например, данных эмиссии или источника света.
[00216] Биологический прибор может обнаруживать от нескольких сотен до нескольких тысяч проб, все из которых могут иметь очень малый объем, например, меньше одного нанолитра. Таким образом, другие способы устранения фонового шума могут применяться отдельно или в комбинации со способами калибровки, описанными в этом документе в соответствии с различными вариантами осуществления, для обеспечения возможности обнаружения и анализа данных эмиссии от объемов пробы. В некоторых вариантах осуществления может быть точнее определено местонахождение объемов проб в пределах подложки для осуществления более точного анализа. Например, при анализах путем цифровой ПЦР возможность более точного распознавания реакций в объемах проб по сравнению отсутствием реакций может давать более точные результаты. Кроме того, в соответствии с различными описываемыми авторами вариантами осуществления, пустые лунки или сквозные отверстия могут быть отличены от объемов проб в лунках или сквозных отверстий, которые не реагируют, которые также могут быть отличены от объемов проб в лунках или сквозных отверстиях, которые прореагировали.
[00217] В соответствии с различными описываемыми авторами вариантами осуществления, устранение фонового шума может содержать анализ и обработку данных изображения. Способ может содержать анализ значений интенсивности данных изображения для интерполяции фонового шума, который может быть удален из изображения подложки. Таким образом также можно определить местоположение исследуемых областей в пределах изображения. Удаление фонового шума также может содержать интерполяцию данных из зон изображения, которые наверняка содержат исследуемые области. После определения фонового шума на изображении фоновый шум может быть вычтен из данных изображения.
[00218] ФИГ. 22 показывает типичный in silico способ 2600 в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения. In silico способ 2600 содержит множество установленных подпрограмм последовательности операций в машиночитаемом формате, который может содержать подпрограммы для биотехнологического процесса. ФИГ. 22 представляет лишь пример способа, и специалисту в данной области техники по ознакомлении с этим описанием станет понятно, что фактическое количество подпрограмм может быть разным, от по меньшей мере приблизительно 2-х подпрограмм до многих (например, 2-10, 2-20, 2-30, 2-n (где n может быть любым числом подпрограмм, 3-100, 3-1000 и т. д.)). Каждая установленная подпрограмма 310 - 370 может содержать один этап или задачу, или необязательно может содержать более одного этапа или задачи, также в машиночитаемом формате, и каждый этап также может содержать дополнительные необязательные индивидуально настраиваемые этапы или задачи. Каждый из необязательных / индивидуально настраиваемых этапов или задач может иметь один или несколько необязательных параметров (опций) которые могут просматриваться, пересматриваться, устанавливаться или адаптироваться пользователем. В некоторых вариантах осуществления in silico способ согласно изобретению содержит выбор пользователем по меньшей мере одного параметра для каждого необязательного/индивидуально настраиваемого этапа биотехнологического процесса с применением графического пользовательского интерфейса (GUI) для выбора по меньшей мере одного параметра для каждого необязательного/индивидуально настраиваемого этапа. В некоторых вариантах осуществления каждый этап и каждый параметр подпрограммы последовательности операций могут просматриваться и, необязательно, редактироваться пользователем. В программах биоинформатики, как правило, некоторые из этих параметров и/или этапов скрыты от пользователей, что вызывает неудовлетворенность и неэффективность для пользователя, в особенности в случаях, когда результат разработанного in silico эксперимента отличается от ожидаемого пользователем результата.
[00219] Типичный способ согласно изобретению, который в целом поясняется на ФИГ. 22, может осуществляться (выполняться) путем создания по меньшей мере одного файла способа в компьютерной системе (как показано на ФИГ. 2), причем файл способа содержит машиночитаемые команды для множества подпрограмм (10, 20, 30…) индивидуально настраиваемых этапов (A, B, C), каждый из которых может иметь один или несколько параметров, которые поддаются просмотру, выбору, изменению или вводу; и выполнения биотехнологического процесса in silico, который содержит выполнение компьютерной системой по меньшей мере одного содержащего машиночитаемые команды файла способа, для получения по меньшей мере одного биотехнологического продукта.
[00220] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один индивидуально настраиваемый / необязательный параметр выбирают из параметра по умолчанию, причем параметр по умолчанию хранится в компоненте компьютерной системы (таком, как запоминающее устройство, база данных и т. п.).
[00221] Как показано на ФИГ. 22, первый этап расчета местоположения ROI состоит в оценке первоначальных центров ROI по порогу флуоресценции на этапе 2610. Предусматривается планшет с пробой, выполненный с возможностью содержать множество биологических проб, который вставляется в аналитический прибор, способный анализировать биологические пробы при помощи процесса ПЦР. Каждый биологическая проба содержится в лунке для пробы и может быть возбужден источником света и в ответ на возбуждение может флуоресцировать с заданной длиной волны, которая может обнаруживаться детектором флуоресценции. Как представлено выше со ссылкой на ФИГ. 7, источником света 1402 может быть лазер, светодиод или другого типа источник возбуждения, способный излучать спектр, который взаимодействует со спектральными разновидностями, поддающимися обнаружению компьютерной системой 200. Кроме того, биологические пробы могут содержать спектрально отличимые красители, такие, как один или несколько из FAM, SYBR Green, VIC, JOE, TAMRA, NED, CY-3, Texas Red, CY-5, ROX (пассивный контроль) или любые другие флуорохромы, издающие обнаружимый сигнал.
[00222] Перед возбуждением биологических проб устанавливают параметры ввода и параметры алгоритма для обеспечения исходной точки для определения ROI. Параметры ввода могут содержать размер лунки, расстояние между центрами лунок, число оптических пикселей на миллиметр и схема планшета. Схема планшета может содержать общее количество лунок и конфигурацию лунок с пробами. Часто применяемой конфигурацией может быть прямоугольный массив, содержащий множество рядов и множество колонок. Однако специалисту в данной области техники станет понятно, что конфигурация допускает любую геометрическую форму, подходящую для применяемого прибора. Кроме того, общее количество лунок может быть разным. Специалистам в данной области техники известны конфигурации с общим количеством от 1 лунки до тысяч лунок в одном планшете с пробой или конструкции, содержащей образец. Параметры алгоритма поиска ROI могут устанавливать приемлемые пределы для размера лунки, расстояния между центрами лунок и минимальной круглости. Круглость является расчетной величиной и может представлять собой соотношение периметра с площадью.
[00223] Сразу после определения параметров ввода и параметров алгоритма множество проб возбуждают энергией от соответствующего источника света и собирают изображения флуоресценции, излучаемой от каждой лунки с пробой в планшете с пробами. Изображения флуоресценции планшета с пробами подвергают дальнейшему анализу для отбора подходящих ROI на основе параметров ввода и параметров алгоритма. Подходящие ROI, удовлетворяющие параметрам, сохраняют для дальнейшего анализа и размер и круглость каждой лунки определяют на этапе 2620. Подходящие ROI, не удовлетворяющие параметрам, отбраковываются вместе с любыми местами, которые не флуоресцируют. Оставшиеся подходящие ROI подвергают дальнейшей оценке для определения расстояния между ROI на основе параметра интервала между лунками и параметра допустимого диапазона для интервала между лунками. ROI, имеющие центры, находящиеся в непосредственной близости друг от друга на основе параметров интервала между лунками, могут считаться лунками с одинаковыми пробами, и ту, которая обладает наилучшей круглостью, выбирают как ROI для этой лунки. Сразу после определения подходящей ROI рассчитывают средний размер лунки, среднее значение присваивают ROI каждой лунки с пробой на этапе 2630 и получившие первоначальную оценку ROI сохраняют.
[00224] Ожидаемые точки расположения лунок располагают в виде сетки, определяемой на основе параметра схемы планшета. Этот параметр может содержать количество лунок, количество колонок и количество рядов, причем каждая лунка имеет ожидаемый набор координат XY на основе параметра схемы планшета. Затем может быть начат дальнейший анализ на основе получивших первоначальную оценку ROI для лучшего определения местоположения каждой первоначальной ROI, называемого глобальным гридингом. Первый этап глобального гридинга состоит в анализе центров получивших первоначальную оценку ROI для нахождения смежных ROI. Такое определение может производиться путем сравнения расстояния между центрами ROI с координатами сетки на основе схемы планшета. Координаты XY сетки затем могут определяться для каждой из получивших первоначальную оценку ROI на основе пространственного соотношения между ROI.
[00225] Для улучшения точности определения местоположения ROI следует соотнести координаты между центрами ROI с координатами сетки схемы планшета. Это осуществляется путем определения и применения функций отображения. Функции отображения представляют собой пару двухмерных квадратичных полиномиальных функций. Эти функции рассчитывают для отображения координат на сетке X (или Y) в центральные точки ROI в направлении X (или Y). Сразу после определения функций отображения они могут быть нанесены на ожидаемые координаты сетки, что обеспечивает два преимущества. Во-первых, может быть улучшена точность местоположения центра ROI; во-вторых, появляется возможность восстановления ROI, потерянных во время первоначального поиска ROI.
[00226] Дальнейшее регулирование ROI может обеспечивать дополнительные преимущества для оптических характеристик. Авторами изобретения было обнаружено, что существует связь между размером ROI и соотношением сигнал-шум (SNR) оптической системы. Специалистам в данной области техники должно быть известно, что существует несколько уравнений для расчета SNR электрических и оптических систем. SNR может характеризоваться, например, Уравнением 1:
SNR =
[00227] где: SNR= соотношение сигнал-шум
S dye plate= сумма всех значений пиксельной интенсивности в пределах ROI от окрашенных изображений
BG
S = сумма всех значений пиксельной интенсивности в пределах ROI от фоновых изображений
S dye = сумма всех значений пиксельной интенсивности в пределах ROI от красителя
N = количество пикселей в пределах ROI
offset = смещение камеры
G = увеличение камеры
δ2R,y = красный шум
[00228] Эксперимент проводили с применением оптической системы, включавшей шесть пар фильтров. Каждая пара фильтров включала фильтр возбуждения (Xn) и эмиссионный фильтр (Mn). Каждый фильтр был чувствительным к узкому диапазону длины волн, что соответствует частоте возбуждения и частоте эмиссии красителя, выполненной с возможностью совместимости с процессом ПЦР. Кроме того, ROI оптимизировали в соответствии с указаниями, представленными в этом документе. Для исследования влияния размера ROI на соотношение сигнал-шум определяли флуоресценцию от 96-луночного планшета с пробами с применением 6 пар фильтров. Радиус каждой ROI постепенно увеличивали на 1 пиксель. Уравнение 1 использовали для расчета SNR для каждой из 6 пар фильтров и каждого пиксельного приращения. Результаты эксперимента представлены ниже в Таблице 3:
ТАБЛИЦА 3
SNR
X1M1
X2M2
X3M3
X4M4
X5M5
X6M6
ΔR=0
1709,5
2502,7
1840,3
1613,8
1632,4
475,5
ΔR=1
1808,2
2642,0
1942,7
1706,3
1709,2
<b>496,8</b>
ΔR=2
<b>1826,6</b>
2677,8
<b>1964,2</b>
<b>1722,7</b>
<b>1718,8</b>
491,2
ΔR=3
1818,7
<b>2678,7</b>
1958,4
1714,4
1708,2
479,0
ΔR=4
1802,5
2667,3
1943,1
1697,6
1690,8
464,7
[00229] Жирным шрифтом обозначены наивысшие SNR для каждой из 6 пар фильтров, а увеличение радиуса на 2 пикселя обеспечивает общее улучшение SNR приблизительно на 6 % для всех 6 пар фильтров.
[00230] ФИГ. 23 показывает изображение планшета с пробами с 96 лунками 2710. Каждая из лунок 2710 давала флуоресцентное изображение. После применения идеи согласно этому документу ROI были оптимизированы, и синие круги обозначают ROI для позиции каждой лунки.
Калибровка чистыми красителями
[00231] Как описано выше, существует возрастающая потребность в упрощении установки и настройки систем для биологического анализ, таким образом, чтобы операторы могли быстрее и эффективнее применять системы для биологического анализ по их назначению. Эта потребность очевидна, например, при калибровке прибора для биологического анализа и связанных с ним компонентов. Примером калибровки может быть калибровка флуоресцентных красителей, используемых для обнаружения флуоресценции в системах для биологического анализа, таких, как, например, системы для количественной ПЦР.
[00232] Калибровка флуоресцентных красителей, используемых в приборе для количественной ПЦР, позволяет программе прибора использовать калибровочные данные, полученные от стандартных красителей, для характеризации и различения отдельной доли каждого красителя в общей флуоресценции, собранной прибором. После прогона пробы программа прибора получает данные в форме сигнала необработанного спектра для каждого считанного показателя. Программа определяет долю каждого из флуоресцентных красителей, применяемых в каждой реакционной зоне, путем сравнения необработанных спектров, привносимых каждым красителем в калибровочные данные чистых спектров. Когда пользователь сохраняет данные эксперимента после анализа, программа прибора хранит чистые спектры вместе с собранными данными флуоресценции для этого эксперимента, а также долю каждого флуоресцентного красителя на лунку.
[00233] Продукт калибровки красителя в приборе для количественной ПЦР, например, представляет собой набор спектральных профилей, представляющих сигнатуру флуоресценции каждого стандартного красителя для каждой реакционной зоны. Каждый профиль состоит из набора спектров, соответствующих показателям флуоресценции, собранным из реакционных зон, таких, как лунки, держателя пробы, такого, как, например, калибровочный планшет или матричная карта. После калибровки каждого красителя программа прибора "извлекает" спектральный профиль для каждого красителя в каждой реакционной зоне. Программа строит на основе полученных в результате данных для каждого профиля график флуоресценции в зависимости от фильтра. Когда программа извлекает калибровочные данные красителя, она оценивает сигнал флуоресценции, генерируемый каждой лункой, с учетом совокупных спектров для всего калибровочного планшета или матричной карты. Спектры красителя в целом являются приемлемыми, если они достигают пика в пределах одного фильтра как группа, но слегка расходятся в других значениях длины волны.
[00234] При проведении калибровки красителя на держателе пробы, таком, как калибровочный планшет, реакционные зоны (например, лунки) в целом содержат идентичную концентрацию красителя, что позволяет генерировать значения чистого спектра в каждой лунке планшета. ФИГ. 24 представляет изображение калибровочного планшета с одним красителем (в данном случае красителем FAM), занимающим каждую лунку 96-луночного калибровочного планшета. Это позволяет сравнивать сигнал флуоресценции, генерируемый каждой лункой в данной партии, с чистыми спектрами, считываемыми для этой лунки. При использовании одного красителя для каждой лунки калибровочного планшета получаемые в результате сигналы для лунок должны быть подобными. Отклонения в спектральной позиции и позиции пика могут быть вызваны, например, небольшими различиями в оптических свойствах и энергии возбуждения между отдельными лунками. Учет таких отклонений при калибровке красителя теоретически обеспечивает более точную калибровку красителя.
[00235] Однако использование одного красителя для одного калибровочного планшета может быть занимающей много времени сложной процедурой, в частности, при калибровке множества красителей. Неограничивающими примерами флуоресцентных красителей могут быть FAM, VIC, ROX, SYBR, MP, ABY, JUN, NED, TAMRA и CY5. Таким образом, существует потребность в упрощении процесса калибровки красителя и сокращении времени, требуемого для калибровки, при сохранении неизменного качества результатов калибровки красителя.
[00236] ФИГ. 25 и 26 представляют технологическую схему, показывающую типичный способ 900 калибровки флуоресцентного(ых) красителя(ей) согласно описываемым авторами вариантам осуществления. Этапы способа 2900 могут осуществляться процессором 204, как показано на ФИГ. 2. Кроме того, команды для выполнения способа процессором 204 могут храниться в запоминающем устройстве 206.
[00237] Как показано на ФИГ. 25, на этапе 2902 калибровочные планшеты подготавливают путем загрузки красителей в реакционные зоны подложки для обработки. Подложка в этом случае представляет собой 96-луночный планшет, хотя могут использоваться и другие подложки, включая, например, 384-луночный планшет. В разных вариантах осуществления подложкой может быть стеклянная или пластиковая предметная пластинка с множеством зон для проб. Примерами подложки могут быть, помимо прочих, многолуночный планшет, такой, как стандартный микротитровальный 96-луночный планшет, 384-луночный планшет или микрокарта, по сути плоская подложка, такая, как стеклянная или пластиковая предметная пластинка, или любой другой тип матрицы или микроматрицы. Реакционными зонами в разных вариантах осуществления подложки могут быть лунки, углубления, выемки, борозды и их комбинации, расположенные в правильном или неправильном порядке и образуемые на поверхности подложки. В данном случае ссылка на лунки или планшеты делается лишь для примера и никоим образом не ограничивает тип реакционной зоны или держателя пробы, которые могут применяться согласно изобретению.
[00238] Калибровочные планшеты могут располагаться в шахматном порядке, как показано на ФИГ. 27A. ак показано на примере калибровочных планшетов 3100, 3120 и 3140, сами планшеты могут иметь 96-луночный формат, хотя количество лунок на калибровочном планшете может быть разным, в зависимости, например, от количества красителей, требующих калибровки, блока пробоподготовки 114 (см. ФИГ. 1) формата, приемлемого для калибровочного планшета, или способности прибора (например, прибора для ПЦР 100) к визуализации планшетов с разной плотностью лунок.
[00239] Шахматный порядок распределения красителей позволяет калибровать множество красителей в одном калибровочном планшете. В отличие от калибровки одного красителя на калибровочный планшет, шахматный порядок выгоден тем, что позволяет пользователю использовать меньшее количество планшетов для калибровки набора красителей, таким образом, сокращая время и уменьшая количество этапов процесса, необходимых для калибровки красителя.
[00240] В варианте осуществления, показанном на ФИГ. 27A, применяют три планшета для калибровки десяти отдельных красителей. Каждый калибровочный планшет 3100/3120/3140 выполнен с возможностью вмещать четыре разных красителя в повторяющемся порядке чередующихся красителей вдоль лунок в каждом ряду планшета, таким образом, чтобы каждая лунка представляла конкретный краситель в повторяющемся порядке (лунки, представляющие краситель). Например, планшет 3100 содержит красители FAM, VIC, ROX и SYBR в чередующихся лунках, примерами которых являются лунки 3102 (FAM), 3104 (VIC), 3106 (ROX) и 3108 (SYBR); планшет 3120 содержит буфер, краситель MP, краситель ABY и краситель JUN в чередующихся лунках, примерами которых являются лунки 3122 (буфер), 3124 (MP), 3126 (ABY) и 3128 (JUN); и планшет 3140 содержит краситель NED, краситель TAMRA, краситель CY5 и буфер в чередующихся лунках, примерами которых являются лунки 3142 (NED), 3144 (TAMRA), 3146 (CY5) и 3148 (буфер). В этом варианте осуществления, поскольку калибруют лишь десять красителей, в планшетах 3120 и 3140 используют буферы в качестве наполнителей для лунок, не содержащих красителя, подлежащего калибровке.
[00241] Следует заметить, что вариант осуществления, представленный на ФИГ. 27A и 27B, является лишь примером, и количество всех подвергаемых калибровке красителей, количество красителей на планшет и количество планшетов, может быть разным в зависимости, например, от потребности пользователя в калибровке, количества лунок на планшете и производительности прибора, производящего калибровку. Например, если в варианте осуществления, показанном на ФИГ. 27A, калибруют 12 красителей, буфер в планшетах 3120 и 3140 не нужен, поскольку четыре красителя могут калиброваться в каждом из трех калибровочных планшетов 3100/3120/3140 для общего количества, составляющего 12 красителей.
[00242] Кроме того, количество красителей на планшет может равняться двум или более, причем максимальное количество красителей на планшет зависит, например, от количества лунок на калибровочном планшете, производительности прибора, применяемого для надлежащего моделирования полного планшета (более подробное объяснение см. ниже) и производительности визуализирующей системы для получения нужных данных флуоресценции от выбранного планшета. Например, вместо использования 96-луночного планшета, как показано на ФИГ. 27A, можно использовать достаточно надежный прибор и связанную с ним визуализирующую систему, позволяющие использовать 384-луночный калибровочный планшет. При обеспечиваемой дополнительной плотности лунок существует возможность калибровки большего количества красителей на планшет, например, 16 красителей на планшет, при получении неизменного количества точек замера (т. е., лунок, представляющих краситель) на каждый краситель (например, 24), которые необходимы для получения достаточной глобальной модели (более подробно обсуждаемой ниже). Например, при 384-луночном планшете 10 красителей могут калиброваться с применением двух планшетов и пяти красителей на планшет.
[00243] На возможное число красителей влияют даже тип держателя пробы и тип реакционной зоны. Как указано выше, для калибровки могут применяться другие типу держателей проб и реакционных зон.
[00244] Как показано на ФИГ. 25, на этапе 2904, подготовленные калибровочные планшеты в шахматном порядке загружают в прибор. Количество планшетов, которые могут быть загружены в прибор за один раз, зависит от возможностей и производительности применяемого прибора. Например, стандартный термоциклер для количественной ПЦР с 96-луночным блоком принимает лишь один калибровочный планшет за раз. Однако многоблочные термоциклеры могут обеспечивать множество блоков, каждый из которых способен принимать калибровочный планшет. Кроме того, если калибровочный планшет не используется, в зависимости от формата применяемого держателя пробы (например, микроматрицы или матрицы микрочипов), множество держателей проб могут приниматься в один прибор с использованием, например, загрузочного узла, вставляемого в прибор.
[00245] На этапе 2906 с ФИГ. 25 прибор, в котором применяется соответствующая оптическая визуализирующая система (см., например, ФИГУРУ 3), получает изображения загруженного калибровочного планшета или планшетов, последовательно или параллельно. Полученные изображения и связанные с ними данные могут храниться, например, в запоминающем устройстве 206 или устройстве хранения информации 210 вычислительной системы 200 с ФИГ. 2. Оптическая визуализирующая система может получать изображения каждого планшета в каждом оптическом канале. Количество каналов зависит от количества фильтров возбуждения и эмиссионных фильтров, предусмотренных в визуализирующей системе. Например, для оптической визуализирующей системы, имеющей 6 фильтров возбуждения (X фильтров) и 6 эмиссионных фильтров (M фильтров), общее количество каналов составляет 21 канал, которые представлены следующими комбинациями фильтров: X1M1, X1M2, X1M3, X1M4, X1M5, X1M6, X2M2, X2M3, X2M4, X2M5, X2M6, X3M3, X3M4, X3M5, X3M6, X4M4, X4M5, X4M6, X5M5, X5M6 и X6M6. Количество изображений или экспозиций, получаемых на каждом канале, может быть разным. Количество изображений или экспозиций, получаемых на каждом канале, может быть разным. Количество полученных изображений или экспозиций зависит от потребностей пользователя, поскольку получение меньшего количества изображений или экспозиций на каждый канал может сокращать время, необходимое для получения изображений или экспозиций, тогда как получение большего количества изображений или экспозиций на каждый канал повышает вероятность получения качественных данных.
[00246] На этапе 2908 с ФИГ. 25 прибор, использующий данные, собранные для изображений или экспозиций, полученных оптической визуализирующей системой (см., например, ФИГ. 7), распознает пиковый канал для каждого красителя на калибровочном планшете. Этот пиковый канал для каждой реакционной зоны является каналом, на котором конкретный анализируемый краситель демонстрирует наибольшую флуоресценцию для этой реакционной зоны. Идентификация пикового канала может происходить, например, в случае, когда 95 % или более площади реакционных зон заняты красителем, и в этом случае допускается не более 5 % выбросов реакционных зон во время калибровки. Процент допустимых выбросов может быть разным. Выбросы реакционных зон затем исключаются из последующих расчетов и анализа. Выбросы могут возникать, например, при загрузке неправильных красителей, при загрузке красителей в неправильной конфигурации, при неправильной загрузке красителей или при загрязнении оптических компонентов (например, при наличии частиц пыли). Пиковый канал для каждого красителя на калибровочном планшете может идентифицироваться, например, процессором 204 вычислительной системы 200 с использованием данных, хранящихся в запоминающем устройстве 206. Результаты идентификации могут храниться, например, в запоминающем устройстве 206 или устройстве хранения информации 210 вычислительной системы 200.
[00247] В альтернативном варианте собранные данные флуоресценции, собранные для изображений или экспозиций, полученных оптической визуализирующей системой для каждой комбинации фильтров в каждой реакционной зоне, могут корректироваться путем фоновой коррекции и коррекции однородности перед идентификацией пикового канала с использованием фонового компонента и коэффициентов однородности, определяемых с применением способов фоновой калибровки и калибровки однородности, известных специалистам в данной области техники.
[00248] На этапе 2910 с ФИГ. 25 прибор, использующий данные, собранные для изображений или экспозиций, полученных оптической визуализирующей системой (см., например, ФИГ. 7), нормализует каждый канал относительно идентифицированного пикового канала с этапа 2908 для всех представляющих краситель лунок. Каждый канал может быть нормализован относительно идентифицированного пикового канала, например, процессором 204 вычислительной системы 200 с использованием данных, хранящихся в запоминающем устройстве 206. Результаты нормализации могут храниться, например, в запоминающем устройстве 206 или устройстве хранения информации 210 вычислительной системы 200.
[00249] Всем представляющим краситель лункам присваивается базовое количественное значение, на основе которого производят нормализацию. Как правило, чем больше количественное значение, тем больше обнаруживаемая флуоресценция. Таким образом, идентифицированный пиковый канал для данного красителя должен иметь наибольшее количественное значение для этого красителя в представляющих краситель лунках, за исключением выбросов пикового канала. Независимо от количественного значения в этом пиковом канале, для нормализации это количественное значение в этом канале переустанавливают на единицу. Оставшиеся количественные значения для этого же красителя в других каналах затем регулируют в соответствии с переустановленным на единицу значением для пикового канала. Например, если для красителя X пиковый канал A имел количественное значение 100 в лунках, а другой канал B имел количественное значение 40 в лунках, после нормализации пиковый канал A устанавливается на 1,0, а канал B устанавливается на 0,40. Это нормализованное значение также может указываться как калибровочный коэффициент, причем калибровочный коэффициент для пикового канала устанавливается на 1,0, как обсуждалось выше.
[00250] В варианте осуществления, показанном на ФИГ. 27A и 27B, в котором четыре красителей равномерно распределены по лункам 96-луночного планшета, количество представляющих краситель лунок на каждый краситель составляет 24. Количество представляющих краситель лунок может колебаться по причинам, обсуждавшимся выше, например, в зависимости от количества реакционных зон (например, лунок) на держателе пробы (например, калибровочном планшете), количества красителей, распределенных по держателю пробы. Например, на 96-луночном планшете, если распределено три красителя, количество представляющих краситель лунок составляет 32 на каждый краситель. При наличии шести красителей, распределенных по 96-луночному планшету, будет 16 представляющих краситель лунок на каждый краситель.
[00251] Как показано на ФИГ. 26, на этапе 2912 прибор выполняет глобальное моделирование для всех лунок каждого красителя. Для калибровки красителя для всех лунок формата держателя пробы прибор может использовать данные от представляющих краситель лунок для конкретного красителя для моделирования всех лунок, включая те, в которых конкретный краситель отсутствует. Глобальное моделирование может выполняться, например, процессором 2404 вычислительной системы 2400, путем использования данных от представляющих краситель лунок для конкретного красителя для моделирования всех лунок. Полученная в результате модель может храниться, например, в запоминающем устройстве 2406 или устройстве хранения информации 2410. Как показано на ФИГ. 27A, для красителя FAM, присутствующего в 24 лунках 3102 планшета 3100, остальные 312 лунок на этом планшете будут не представляющими краситель FAM. Такое же распределение 24 представляющих / 72 представляющих действует для каждого красителя на ФИГ. 27A. Количество не представляющих краситель лунок зависит от количества представляющих краситель лунок, которое, как обсуждалось выше, может зависеть от разных причин. Во всяком случае, сумма представляющих краситель и не представляющих краситель лунок для данного планшета равняется количеству лунок на этом планшете. ФИГ. 27B является изображением 96-луночного калибровочного планшета в шахматной конфигурации с четырьмя красителями: FAM, VIC, ROX и SYBR в такой же конфигурации, как показано на примере планшета 3100 на ФИГ. 27A.
[00252] В альтернативном варианте осуществления прибор выполняет глобальное моделирование для всех каналов или каналов, имеющих нормализованное значение, например, большее, чем 0,01, или 1 % идентифицированного пикового канала. Для каналов с показателем, меньшим, чем этот порог, прибор выполняет локальное моделирование (см. этап 2922 на ФИГ. 26) вместо выполнения глобального моделирования. Глобальное моделирование может стать излишним на таких низких уровнях на определенных каналах, поскольку обнаруживаемая флуоресценция главным образом является результатом, например, шума или других помех, а не обусловлена фактическим красителем, подвергаемым калибровке.
[00253] Алгоритм глобального моделирования может функционировать при калибровке красителя для вывода модели коэффициентов калибровки красителя для каждого канала фильтра для каждого красителя в зависимости от измеренных калибровочных коэффициентов красителя конкретных представляющих краситель лунок. Например, если 24 лунки на 96-луночном планшете в шахматном порядке представляют конкретный краситель, при глобальном моделировании используют калибровочные коэффициенты красителя этих 24 лунок для вывода калибровочных коэффициентов для всех лунок, включая другие 72 лунки, определяемые как не представляющие краситель, и, таким образом, получения модели для всего планшета на каждый канал на каждый краситель.
[00254] Двумерная (2D) квадратичная полиномиальная функция является примером функции, которая может применяться в качестве глобальной модели для калибровочных коэффициентов красителя. Могут применяться и другие функции глобального моделирования, известные специалистам в данной области техники. Может применяться нелинейный алгоритм наименьших квадратов для вывода 2D квадратичной полиномиальной функции из измеренных калибровочных коэффициентов красителя на представляющих конкретный краситель лунках путем минимизации остаточных погрешностей моделирования (разницы между значениями, рассчитанными по модели и измеренными калибровочными коэффициентами красителя). Алгоритм доверительной области Левенберга-Марквардта применяют в качестве алгоритма оптимизации для этого решения. Хотя согласно изобретению могут применяться многие другие алгоритмы оптимизации, еще одним примером может быть метод ломаных линий, основная идея которого состоит в применении способов Гаусса-Ньютона и Cauthy для расчета этапа оптимизации с целью оптимизации нелинейной цели. Этот подход предполагает аппроксимацию целевой функции с применением модельной функции (часто квадратичной) по подмножеству области поиска, известной как доверительная область. Если модельная функция успешно минимизирует точную целевую функцию, доверительная область расширяется. И наоборот, если аппроксимация неудачна, эта область сужается, и модельную функцию применяют снова. Также может применяться, например, функция потерь для снижения влияния высоких остаточных погрешностей (наибольшей разницы между расчетными и измеренными калибровочными коэффициентами). Эти высокие остаточные погрешности обычно представляют собой выбросы при оптимизации.
[00255] На этапе 2914 с ФИГ. 26 после моделирования всех лунок для данного красителя или красителей прибор выполняет проверку критерия согласия (GOF). Она может гарантировать достаточную надежность этапа глобального моделирования. Проверка GOF может выполняться, например, процессором 204 вычислительной системы 200 с сохранением результатов, например, в запоминающем устройстве 206 или устройстве хранения информации 210. Мера критерия согласия обычно формулируется как расхождение между наблюдаемыми значениями и значениями, ожидаемыми согласно данной модели. GOF может определять многими способами, включая, например, значения коэффициента детерминации R-квадрат и среднеквадратичной погрешности (RMSE). Коэффициент R-квадрат, например, представляет статистический метод, дающий определенную информацию о критерии согласия модели. При регрессии коэффициент детерминации R-квадрат является статистической мерой приближения линии регрессии к реальным точкам замера. Коэффициент R-квадрат 1 указывает на то, что линия регрессии идеально соответствует данным. RMSE представляет собой квадратный корень из среднего квадрата разностей или остатков между наблюдаемыми значениями и значениями, ожидаемыми согласно рассматриваемой модели. RMSE является надежной мерой точности прогнозирования модели. RMSE 0 указывает на то, что значения, ожидаемые согласно этой модели, полностью соответствуют наблюдаемым значениям.
[00256] На этапе 2916 с ФИГ. 26 в случае точного соответствия прибор выдает матрицу красителя на этапе 2918 с ФИГ. 26. Статистически точное соответствие при анализе с использованием коэффициента R-квадрат может обеспечиваться, например, в случае, если значения коэффициента R-квадрат, например, являются большими или равняются 0,85, или значения RMSE, например, не превышают 0,01, как поясняется на ФИГ. 9. Матрица красителя может быть создана, например, процессором 204 вычислительной системы 200 и выведена на дисплей 212.
[00257] На этапе 2920 с ФИГ. 26 в случае слабого соответствия прибор выполняет локальное моделирование на этапе 2922 с ФИГ. 26. Это может быть необходимым, например, в случае, если расчетное значение R для проверки GOF является, например, меньшим, чем 0,85, и значения RMSE являются, например, большими, чем 0,01. Локальное моделирование может выполняться, например, процессором 204 вычислительной системы 200 путем использования данных от представляющих краситель лунок для конкретного красителя с целью моделирования остальных не представляющих краситель лунок. Полученная в результате модель может храниться, например, в запоминающем устройстве 206 или устройстве хранения информации 210.
[00258] Способ локального моделирования может содержать, например, использование калибровочных коэффициентов от окружающих представляющих краситель лунок для того же красителя на планшете. Например, для определения значения калибровочного коэффициента в не представляющей краситель лунке для конкретного красителя в локальной модели берут медианное значение всех конкретных представляющих краситель лунок с одним и тем же красителем, находящихся в пределах локального окна 5x5 окружающих лунок, или со всего планшета. Это медианное значение определяют до завершения полного моделирования планшета. Выход локального моделирования затем может заменить выход глобального моделирования.
[00259] По результатам локального моделирования матрица красителя является достаточной, и, таким образом, прибор выводит матрицу красителя на этапе 2918 с ФИГ. 26. Эта матрица красителя служит в качестве профиля сигнатуры флуоресценции каждого калиброванного красителя. После каждого прогона прибор получает данные в форме сигнала необработанного спектра для каждого считанного показателя. Прибор определяет долю флуоресцентных красителей, используемых в каждой реакции, путем сравнения необработанных спектров в калибровочных данных чистых спектров матрицы красителя. Прибор использует собранные калибровочные данные стандартов красителей (т. е., матрицу красителя) для характеризации и различения доли каждого отдельного красителя в общей флуоресценции, собранной прибором.
Калибровка для нормализации прибора
[00260] В настоящее время геномный анализ, включая анализ приблизительно 30000 генов человека, является основным объектом внимания фундаментальных и прикладных исследований в области биохимии и фармацевтики. Такой анализ может способствовать развитию диагностики, медицины и терапии при самых различных заболеваниях. Однако сложность генома человека и взаимосвязанных функций генов часто затрудняют эту задачу. Трудность, с которой обычно приходится сталкиваться исследователям, состоит в невозможности легкого сравнения результатов экспериментов, проводимых на нескольких приборах. Физические колебания параметров компонентов, таких, как источники света, оптические элементы и детекторы флуоресценции, например, могут приводить, например, к изменчивости результатов анализов, проводимых на идентичных биологических пробах. Таким образом, по-прежнему существует потребность в способах и в приборах, способствующих минимизации изменчивости в компонентах.
[00261] При количественной ПЦР кривые амплификации часто определяют путем нормализации сигнала репортерного красителя относительно пассивного контрольного красителя в том же растворе. Примерами репортерных красителей могут быть, помимо прочих, FAM, SYBR Green, VIC, JOE, TAMRA, NED CY-3, Texas Red, CY-5. Примером пассивного контроля, помимо прочих, может быть ROX. Эта нормализация может указываться как нормализованные значения флуоресценции, обозначаемые как "Rn". Нормализация по пассивному стандарту обеспечивает устойчивые значения Rn, даже если на общий уровень сигнала влияет объем жидкости или общая интенсивность освещения. Однако нормализация по пассивному стандарту не может надлежащим образом работать, если меняется соотношение сигнала между репортерным красителем и контрольным краситель, например, при различиях между приборами в спектре освещения. Для их компенсации могут производиться нормализующие растворы, предназначенные для нормализации соотношения репортера с пассивным контролем. Примером такого нормализующего раствора может быть смесь 50:50 FAM и ROX, которая может называться нормализующим раствором "FAM/ROX".
[00262] Этот существующий способ нормализации прибора, содержащий считывание флуоресценции от смеси красителей для получения "коэффициента нормализации" для регулирования значений Rn, требует дополнительных затрат. Как правило, он может требовать приготовления нормализующих растворов и нормализующих планшетов, а также времени для проведения дополнительных калибровок. Кроме того, этот способ действует только для смесей красителей, которые калибруются с применением стандартного набора парных фильтров. Набор парных фильтров может представлять собой комбинацию фильтра возбуждения и эмиссионного фильтра. Специалисту в данной области техники станет понятно, что добавление дополнительного красителя потребует другого нормализующего раствора и калибровки.
[00263] Производственные процессы для получения нормализующих растворов также способствуют колебаниям в реакции со стороны красителей. Было обнаружено, что возникают трудности с контролем концентрации красителей из-за отсутствия абсолютного стандарта флуоресценции. Для минимизации этих погрешностей и колебаний желательно придерживаться пропорции красителя в растворе в пределах +/-15 % требуемой смеси или в пределах +/-10 % требуемой смеси с производственного процесса. Производственный процесс обычно не контролируется в достаточной мере для того, чтобы просто приготовить смесь красителей 50:50 и соответствовать этим техническими требованиям, поэтому необходим дополнительный этап процесса для регулирования смеси красителей при помощи флуорометра.
t
t
t
t
[00264] Вышеупомянутые приемлемые процентные колебания определяли путем исследования связи между изменчивостью смеси красителей и Cs. C - общая аббревиатура для "порогового цикла". Количественная ПЦР (кПЦР) может обеспечивать способ определения количества целевой последовательности или гена, присутствующего в образце. Во время ПЦР биологическую пробу подвергают серии из 35 или 40 температурных циклов. Цикл может содержать разные температуры. Для каждого температурного цикла количество целевой последовательности теоретически может удвоиться и зависит от многих факторов, в данном описании не представленных. Поскольку целевая последовательность содержит флуоресцентный краситель, с возрастанием количества целевой последовательности, т. е. при амплификации в течение 35 или 40 температурных циклов раствор пробы флуоресцирует все ярче с каждым термическим циклом. Величина флуоресценции, которая требует измерения детектором флуоресценции, часто называется "пороговой", а номер цикла, в котором обнаруживается флуоресценция, называется "пороговым циклом" или C. Таким образом, зная степень эффективности амплификации и C, можно определить количество целевой последовательности в первоначальной пробе
t
t
[00265] Описанное выше допустимое процентное колебание также может быть связано со стандартным отклонением сдвига C в приборе. Было определено, что колебание +/- 15 % в смеси красителей в результате может привести к стандартному отклонению 0,2 Cs, что может составлять 2 стандартных отклонения.
[00266] Как представлено выше, существует потребность в надежном сравнении экспериментальных результатов от нескольких приборов, и проблему часто создает изменчивость от прибора к прибору. Эта изменчивость может быть вызвана двумя источниками: изменчивостью компонентов в пределах приборов, например, ламп и фильтров, и изменчивостью во времени, например, старением лампы и фильтра. Существует потребность во внедрении процесса, благодаря которому экспериментальные результаты, полученные от множества приборов, можно было бы сравнивать надежно, легко и с низкими затратами. Изложенная авторами идея раскрывает такой процесс.
[00267] Величина флуоресцентного сигнала пробы в оптической системе может зависеть от нескольких факторов. К некоторым из факторов могут относиться, помимо прочих, длина волны флуоресцентного света, эффективность детектора при этой длине волны флуоресцентного света, эффективность эмиссионного фильтра, эффективность фильтра возбуждения и эффективность красителя. Согласно представленной авторами идее, изменчивость от прибора к прибору может быть сведена к минимуму, если могут быть нормализованы физические оптические элементы приборов.
[00268] В одном варианте осуществления коэффициенты нормализации могут быть получены от спектров чистых красителей, а не смеси красителей. Чистые красители могут быть более легки в производстве, чем смеси красителей, поскольку нет необходимости в точной концентрации, и предусмотрен лишь один флуоресцентный компонент. Эта идея была испытана путем нормализации двух наборов фильтров на приборе с использованием 10 чистых красителей и сравнения результатов с показателями нормализации, полученными от использования смеси красителей. Нормализацию осуществляли путем определения коэффициента коррекции для каждого фильтра возбуждения и эмиссионного фильтра. Полученные в результате коэффициенты коррекции могут использоваться для нормализации любой комбинации красителей, даже от разных приборов.
[00269] В другом варианте осуществления вышеупомянутую нормализацию применяли для нескольких приборов разных типов. Приготавливали восемь растворов смесей красителей и 10 растворов чистых красителей. Каждый раствор пипеткой помещали в 8 лунок трех 96-луночных планшетов. Потенциальное пространственное взаимовлияние минимизировали путем пипетирования в каждую вторую лунку. Используемые смеси красителей показаны на ФИГ. 28 A, а используемые чистые красители показаны на ФИГ. 28B. Кроме того, применяемые приборы включали 6 наборов фильтров. ФИГ. 28B также показывает пары фильтров для главного оптического канала для каждого чистого красителя. Фильтр возбуждения обозначается как "X", а эмиссионный фильтр обозначается как "M".
[00270] С целью количественного определения эффективности процесса нормализации пропорции красителей измеряли до и после нормализации. ФИГ. 29 показывает процент отклонения смеси красителей от среднего соотношения для 17 испытанных приборов. Приборы указаны по оси X, а процент отклонения указан по оси Y. Специалист в данной области техники отметит, что отклонения по приборам часто превышают обсуждавшийся выше желательный показатель +/-15 %. Таким образом, эти данные указывают на необходимость в усовершенствованном процессе нормализации, таком, как описывается авторами изобретения.
[00271] Идея данного изобретения была применена ко всем 17 приборам. Способ нормализации определяет коэффициент коррекции для каждого отдельного фильтра, а не для каждой пропорции красителя. Поскольку в приборах предусмотрено 6 фильтров возбуждения и 6 эмиссионных фильтров, определяли 12 факторов. Процесс показан на ФИГ. 32 как технологическая схема 3600. На этапе 3605 генерировали спектры калибровки для красителей по множеству комбинаций фильтров. Для нормализуемых приборов было предусмотрено 10 чистых красителей и 21 комбинация фильтров. На этапе 3610 спектры были нормализованы, поэтому максимальный сигнал составляет 1. На этапе 3615 спектры красителей усредняют для множества лунок. Это усреднение в результате дает один спектр на один краситель. Вместе спектры красителей могут указываться как матрица красителя "M", содержащая комбинации красителя и фильтра. В этот момент идентифицируется контрольный прибор. Контрольный прибор является эталонным прибором или группой приборов, по которым нормализуют испытуемые приборы. Такой же набор спектров красителей, как и используемый в испытуемом приборе, может быть получен от контрольного(ых) прибора(ов). В некоторых вариантах осуществления эталоном может быть группа приборов. В таком варианте осуществления спектры для красителя могут быть усреднены по группе. Этот этап представлен на технологической схеме 3600 как этап 3620. В качестве примера контрольные спектры могут быть указаны как матрица “Mref”.
[00272] На этапе 3625 каждый из 12 фильтров имеет корректирующий коэффициент, первоначально установленный на 1. Требуется умножить корректирующие коэффициенты на матрицу "M" при периодическом изменении корректирующих коэффициентов между 0 и 1, предпочтительно между 0,04 и 1, пока разница между матрицей "M" и матрицей “Mref” не достигнет минимума, как показано на этапе 3630. На этапе 3635 рассчитывают коэффициенты коррекции каждой пары фильтров. Коэффициент коррекции для каждой пары фильтров представляет собой произведение коэффициента эмиссионного фильтра, умноженного на коэффициент фильтра возбуждения. Пары фильтров главного канала показаны на ФИГ. 28B. Сразу после определения коэффициентов коррекции для каждой пары фильтров коэффициент каждой пары фильтров может быть умножен на данные флуоресценции для испытуемого прибора, а также для спектров чистых красителей. Скорректированные спектры чистых красителей затем могут быть повторно нормализованы относительно максимального значения 1, как показано на этапе 3645. Конечный этап процесса на этапе 3650 состоит в генерации многокомпонентных данных. Специалисту в данной области техники станет понятной процедура многокомпонентности как произведение данных флуоресценции и псевдообращения матрицы красителя. Многокомпонентные значения уже являются нормализованными, поэтому нет необходимости в специальных поправках для конкретных красителей, поскольку данные были нормализованы на уровне фильтра.
[00273] При завершении нормализации % отклонений смеси красителей от среднего соотношения рассчитывали по всем 17 приборам. Результаты показаны на ФИГ. 30. Эти результаты значительно улучшены по сравнению с данными на ФИГ. 29 до нормализации. В укрупненном виде нормализованные данные показаны на ФИГ. 31, где отклонения после нормализации были уменьшены до +/- 8 %, что значительно ниже целевого значения +/-15 %, как было представлено ранее.
Проверка с применением РНКазы P
[00274] Как было упомянуто выше, важной является проверка прибора, чтобы убедиться в его надлежащей работе, в частности, после его первой установки или после нескольких раз использования. Таким образом, пользователь может быть уверен в точности и надежности экспериментальных результатов и анализов. Ранее проверочный анализ проводился на приборе пользователем, и пользователь вручную выполнял анализ данных на основе данных амплификации по результатам контрольного анализа для проверки прибора. Поскольку анализ данных выполнялся пользователем вручную, процесс проверки был подвержен ошибкам и занимал значительное время.
[00275] В соответствии с различными вариантами осуществления настоящего изобретения обеспечиваются автоматизированные способы и системы для проверки. Примером проверочного анализа может быть анализ РНКазы P. Однако в контексте данного описания проверочный анализ может быть любым анализом, обладающим известными и надежными свойствами, который может применяться для проверки прибора.
[00276] После установки и после нескольких раз применения важно проверить надлежащую работу прибора. Часто пользователь вручную производит известный анализ для проверки прибора, такой, как анализ РНКазы P. Ген РНКазы P является однокопийным геном, кодирующим РНК-компонент фермента РНКазы P. Его часто используют для проверочного анализа благодаря его известным свойствам и характеристикам.
TM
[00277] Проверочный планшет предварительно загружают реагентами, необходимыми для обнаружения и количественного определения геномных копий пробы. Например, в планшете для проверки с применением РНКазы P каждая лунка содержит мастер-микс для ПЦР, праймеры РНКазы P, меченный красителем FAM зонд и шаблона геномной ДНК человека в известной концентрации.
t
[00278] В примере традиционного анализа РНКазы P строят стандартную кривую на основе значений C (порогового цикла), полученных от набора реплицированных стандартов (1250, 2500, 5000, 10000 и 20000 копий). Затем используют стандартную кривую для определения количества копий для двух наборов неизвестных шаблонов (5000 и 10000 реплицированных популяций). Прибор проверяют, может ли он демонстрировать способность к различению между 5000 и 10000 геномными эквивалентами с доверительным уровнем 99,7% для последующего прогона пробы в одной лунке.
[00279] Чтобы пройти установку, приборы должны продемонстрировать способность к различению между 5000 и 10000 геномными эквивалентами с доверительным уровнем 99,7% для последующего прогона пробы в одной лунке.
[00280] В соответствии с различными вариантами осуществления, представленная авторами идея может содержать экспертные знания в автоматизированную систему калибровки и проверки, предусматривающую статус пригодности / непригодности и обратную связь по вопросам устранения неисправностей в случае их выявления. Если прибор не проходит процесс проверки, пользователь знает, что можно вызвать, например, инженера по эксплуатации. Представленная идея позволяет минимизировать расход средств и времени, необходимых для выполнения процедур установки и калибровки.
[00281] Как указано выше, в соответствии с различными описываемыми авторами вариантами осуществления, цель проверочного анализа состоит в подтверждении достаточной способности прибора к различению двух количеств одного и того же пробы. Таким образом, может быть проверена функциональность прибора.
t
t
[00282] В соответствии с различными вариантами осуществления настоящего изобретения, обеспечиваются автоматизированные способы и системы для проверки. Значения порогового цикла (Cs) проверочного анализа анализируются и сравниваются системой для определения достаточной способности прибора к различению двух количеств пробы. Примером проверочного анализа является анализ РНКазы P. В этом примере система определяет значения C, генерируемые пробами РНКазы P 5000 и 10000 геномных копий для определения достаточной различимости данных 5000 и 10000 геномных копий. Достаточная различимость, согласно описанным авторами вариантам осуществления, означает по меньшей мере 3 стандартных отклонения (3σ) (~99,7 %), разделяющих данные амплификации двух количеств. В этом примере два количества составляют 5000 и 10000 геномных копий. Способ в соответствии с различными вариантами осуществления описывается ниже со ссылкой на ФИГ. 33 и 34.
[00283] ФИГ. 33 иллюстрирует типичный способ проверки прибора в соответствии с различными описываемыми авторами вариантами осуществления. В целом он начинается на этапе 3702 получением данных амплификации от планшета для проверочного анализа для построения множества кривых амплификации, каждая из которых соответствует лунке на планшете.
[00284] Планшеты содержат множество лунок. В некоторых примерах планшет содержит 96 лунок. В других примерах планшет содержит 384 лунки. Часть лунок планшета может содержать пробу в первом количестве, а другая часть лунок планшета может содержать пробу во втором количестве. Первое количество и второе количество отличаются. В разных описанных авторами вариантах осуществления второе количество является большим, чем первое количество. В некоторых вариантах осуществления второе количество может в 1,5 раза отличаться от первого количества. В других вариантах осуществления второе количество может в 2 раза отличаться от первого количества. В соответствии с различными описываемыми авторами вариантами осуществления второе количество может с любой кратностью отличаться от первого количества. В некоторых вариантах осуществления первое количество может составлять 5000 геномных копий на лунку, а второе количество может составлять 10000 геномных копий на лунку.
[00285] Как показано на ФИГ. 33, на этапе 3704 множество порогов флуоресценции определяют на основе множества сгенерированных кривых амплификации. Экспоненциальные участки множества кривых амплификации сравнивают для определения диапазона значений флуоресценции, при которых экспоненциальные участки снижаются. Например, определяют диапазон значений флуоресценции от самого низкого значения флуоресценции нижней части экспоненциального участка до самого высокого значения флуоресценции верхней части экспоненциального участка множества кривых амплификации. Диапазон значений флуоресценции используют при автоматизированном анализе множества кривых амплификации для проверки прибора в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
[00286] На ФИГ. 35 показано множество кривых амплификации и определение диапазона значений флуоресценции и соответствующего порогового цикла. Каждая из множества кривых амплификации содержит экспоненциальный участок кривой. Ось 3902 указывает значения флуоресценции. Ось 3904 показывает номера циклов. Диапазон флуоресценции 3906 показывает диапазон значений флуоресценции от самого низкого значения флуоресценции определенной нижней части экспоненциального участка из множества экспоненциальных участков до самого высокого значения флуоресценции определенной верхней части экспоненциального участка из множества экспоненциальных участков. В соответствии с различными вариантами осуществления диапазон значений флуоресценции поровну делится на заданное число для генерации ряда значений флуоресценции для автоматизированного анализа со стороны системы. В одном примере диапазон значений флуоресценции 3906 делится на 100 для определения 100 значений флуоресценции для ряда порогов флуоресценции. В некоторых вариантах осуществления верхние 5 значений флуоресценции и нижние 5 значений флуоресценции отбрасывают, и, таким образом, анализ производят с набором из 90 порогов флуоресценции.
t
t
[00287] Как показано на ФИГ. 33, на этапе 3706 для каждого значения флуоресценции из набора значений флуоресценции определяют пороговый цикл (C) для каждой из множества кривых амплификации, полученных от лунок, содержащих первое количество пробы. Подобным образом для каждого значения флуоресценции из набора значений флуоресценции определяют пороговый цикл (C) для каждой из множества кривых амплификации, полученных от лунок, содержащих второе количество пробы.
t
[00288] На этапе 3708, используя значения C для первого и второго количества для каждого из значений флуоресценции из набора определяют, достаточно ли различимы первое и второе количества. Достаточно различимые в соответствии с различными вариантами осуществления означает, что применение уравнения (1) дает положительный результат для по меньшей мере одного из значений флуоресценции из набора:
tquant1
tquant1
tquant2
tquant2
((µC - 3σC) - (µC - 3σC))  (1)
t
[00289] Уравнение 1 определяет, достаточно ли различимы первое и второе количества, где quant2 является большим, чем quant1, согласно описанным авторами вариантам осуществления. Достаточно различимые означает по меньшей мере 3 стандартных отклонения (3σ) (~99,7 %), разделяющие значения C первого и второго количеств. Если обнаруживается, что эти количества достаточно различимы, пользователь извещается о том, что прибор прошел проверку. Эта информация для пользователя может демонстрироваться на экране дисплея.
[00290] ФИГ. 34 иллюстрирует еще один типичный способ проверки прибора в соответствии с различными описываемыми авторами вариантами осуществления. На этапе 3802 данные амплификации получают от множества проб, содержащихся в лунках проверочного планшета. Часть лунок в проверочном планшете содержат пробу в первом количестве. Другая часть лунок проверочного планшета содержит пробу во втором количестве. Первое количество и второе количество отличаются. В разных описанных авторами вариантах осуществления второе количество является большим, чем первое количество. В некоторых вариантах осуществления второе количество может в 1,5 раза отличаться от первого количества. В других вариантах осуществления второе количество может в 2 раза отличаться от первого количества. В соответствии с различными описываемыми авторами вариантами осуществления второе количество может с любой кратностью отличаться от первого количества. В некоторых вариантах осуществления первое количество может составлять 5000 геномных копий на лунку, а второе количество может составлять 10000 геномных копий на лунку.
[00291] На этапе 3804 определяют первый набор порогов флуоресценции на основе множества сгенерированных кривых амплификации. Экспоненциальные участки множества кривых амплификации сравнивают для определения диапазона значений флуоресценции, при которых экспоненциальные участки снижаются. Например, определяют диапазон значений флуоресценции от самого низкого значения флуоресценции нижней части экспоненциального участка до самого высокого значения флуоресценции верхней части экспоненциального участка множества кривых амплификации. Диапазон значений флуоресценции используют при автоматизированном анализе множества кривых амплификации для проверки прибора в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
[00292] В соответствии с различными вариантами осуществления диапазон значений флуоресценции поровну делится на заданное число для генерации ряда значений флуоресценции для автоматизированного анализа со стороны системы. В одном примере диапазон значений флуоресценции 3906 делится на 100 для определения 100 значений флуоресценции для ряда порогов флуоресценции. В некоторых вариантах осуществления верхние 5 значений флуоресценции и нижние 5 значений флуоресценции отбрасывают, и, таким образом, анализ производят с набором из 90 порогов флуоресценции.
t
t
[00293] На этапе 3806 для каждого порога флуоресценции из набора определяют первый набор значений C для кривых амплификации, соответствующих первому количеству. Подобным образом для каждого порога флуоресценции из набора определяют второй набор значений C для кривых амплификации, соответствующих первому количеству. Эту процедуру повторяют для каждого порога флуоресценции в наборе.
t
t
t
t
t
t
t
[00294] В некоторых вариантах осуществления заданное количество выбросов значений C удаляют из каждого набора значений C перед выполнением дальнейших расчетов. Например, в некоторых вариантах осуществления, если используется 96-луночный планшет, 6 выбросов удаляют из каждого набора значений C. Выбросами являются значения C, наиболее удаленные от среднего значения из набора значений C. В другом примере, если применяется 364-луночный планшет, 10 выбросов удаляют из каждого набора значений C. После удаления выбросов оставшиеся значения C из каждого набора используют на остальных этапах способа.
t
t
t
[00295] На этапе 3808 для каждого набора значений Cрассчитывают среднее значение. Другими словами, первое среднее значение C рассчитывают для первого количества кривых амплификации, а второе среднее значение Cрассчитывают для второго количества кривых амплификации для каждого порога флуоресценции набора, определенного на этапе 3804.
t
[00296] Подобно этапу 3808, на этапе 3810 рассчитывают 3 стандартных отклонения каждого набора значений C. Другими словами, первые 3 стандартных отклонения рассчитывают для кривых амплификации первого количества, а вторые 3 стандартных отклонения рассчитывают для кривых амплификации второго количества для каждого порога флуоресценции набора, определенного на этапе 3804.
t
t
[00297] Чтобы определить, достаточно ли различимы значения C первого количества и второго количества, сравнивают значения C при значении флуоресценции в соответствии с различными вариантами осуществления. В соответствии с различными вариантами осуществления для сравнения применяют уравнение (1).
tquant1
tquant1
tquant2
tquant2
((µC - 3σC) - (µC - 3σC))  (1)
t
[00298] Уравнение 2 определяет, достаточно ли различимы первое и второе количества, где quant2 является большим, чем quant1, согласно описанным авторами вариантам осуществления. Достаточно различимые означает по меньшей мере 3 стандартных отклонения (3σ) (~99,7 %), разделяющие значения C первого и второго количеств.
[00299] На этапе 3814 результаты уравнения (2) для всех порогов флуоресценции набора сравнивают для определения максимального значения. Если максимальное значение является положительным числом, прибор может в достаточной мере проводить различие между первым и вторым количествами, и пользователь извещается о том, что прибор прошел проверку, на этапе 3816. Если максимальное значение является отрицательным числом, прибор не может в достаточной мере провести различие между первым и вторым количествами, и пользователь извещается о том, что прибор не прошел проверку, на этапе 3818.
t
t
[00300] ФИГ. 36 поясняет систему 4000 для проверки прибора в соответствии с различными описываемыми авторами вариантами осуществления. Система 4000 содержит интерфейс 4002 прибора для ПЦР, базу данных C 4004, дисплейное устройство/GUI 4006, калькулятор C 4008 и валидатор 4010.
[00301] Интерфейс 4002 прибора для ПЦР принимает данные амплификации от прибора для ПЦР для генерации кривых амплификации. Как описано выше, прибор для ПЦР амплифицирует пробы, содержащиеся в проверочном планшете. Проверочный планшет содержит часть лунок, содержащую пробу в первом количестве, и другую часть лунок, содержащую пробу во втором количестве. Данные флуоресценции, полученные от амплификации проб, принимаются интерфейсом 4002 прибора для ПЦР.
t
t
t
t
t
[00302] После определения набора порогов флуоресценции на этапах 1704 и 1804, как показано на ФИГ. 33 и 34, соответственно, калькулятор C 4006 рассчитывает первый и второй наборы значений C, соответствующие кривым амплификации, получаемые для проб в первом количестве и втором количестве, соответственно. Первый и второй наборы значений C рассчитывают для каждого порога флуоресценции в наборе порогов флуоресценции. Множество наборов значений C хранится в базе данных C.
[00303] Валидатор 4010 определяет, достаточно ли различимы первое и второе количества как описывается на этапе 3708 с ФИГ. 33 и этапах 3810 и 3812 с ФИГ. 34.
[00304] Дисплейное устройство / GUI показывает пользователю множество кривых амплификации. Кроме того, после того, как валидатор 4010 определяет, достаточно ли различимы первое и второе количества, дисплейное устройство / GUI 4006 извещает пользователя, прошел ли прибор проверку.
Автоматическая коррекция красителя
t
[00305] В соответствии с различными вариантами осуществления настоящего изобретения могут применяться способы автоматической коррекции красителя для выполнения спектральной калибровки многокомпонентных данных в реальном времени. Автоматическая коррекция красителя может выполняться в реальном времени или после сбора данных амплификации и выполнения вторичного анализа. В алгоритме автоматической коррекции красителя генерируется многокомпонентная матрица корреляции. В соответствии с различными вариантами осуществления алгоритм автоматической коррекции красителя регулирует элементы матрицы красителя таким образом, чтобы минимизировать недиагональные величины в многокомпонентной матрице корреляции. Таким образом, минимизируются ошибки в определении C.
Автоматическая поправка на фон
[00306] В соответствии с различными вариантами осуществления настоящего изобретения выполняют автоматическую фоновую калибровку для уменьшения потребности в планшете для фоновой калибровки и улучшения общей эффективности поправки на фон.
[00307] Физические загрязнители в блоке (частицы или химикаты), которые встречаются вследствие использования прибора, могут отрицательно повлиять на результаты анализа системы путем искусственного завышения определенных спектральных компонентов анализируемых лунок, которые подвергаются воздействию загрязнения. Эту проблему помогает решить повторная калибровка. Однако для продления периодов между необходимыми калибровками описывается способ автоматического расчета / компенсации фоновых изменений после фоновой калибровки. Для выполнения автоматической фоновой калибровки способ выполняют с применением пустого / незанятого блока. Эффективное проступание сигнала для расходных материалов известно (эмпирически определено), и наклоны и сдвиги эффективной фоновой калибровки могут приблизительно определяться с использованием коэффициентов масштабирования, связанных с эффективным проступанием сигнала.
Анодное детектирование
[00308] В соответствии с различными описываемыми авторами вариантами осуществления выполняют способы анодного детектирования, позволяющие распознавать ошибки в размещении планшетов в приборе.
[00309] Во время использования прибора оптику системы располагают либо на верхней границе (во время периодов простоя) или на нижней границе (во время работы) перемещения. Способность к считыванию позиции оптики в промежуточном положении между границами перемещения не предусмотрена в аппаратных средствах; таким образом, нельзя полагаться на значение позиции двигателя, чтобы определить присутствие или отсутствие планшета или пробирки (когда разница в позиции оптики может быть вызвана дополнительной толщиной материала из-за присутствия пробирки или планшета). Без необходимости в дополнительном компоненте для обнаружения планшета или пробирки (такого, как переключатель углубления или позиционный датчик) для обнаружения проб в системе применяют камеру обнаружения. Однако, поскольку захватывается лишь малая часть участка блока при использовании набора линз для отдельных и изолированных лунок (каждая линза в массиве фокусируется и собирает свет с одной и только с одной лунки), традиционное "фото" плоскости расходного материала с захватом всего участка блока не может быть получено для обработки изображения. Поскольку лишь сфокусированный свет от каждой лунки собирается и проявляется на детекторе как круговое яркое пятно, в обнаруженном изображении отсутствует пространственный или динамический диапазон. Однако, если оптику передвинуть в промежуточную позицию, позволяющую сфокусироваться на пробке или крышке вместилища, эта находящаяся в фокусе точка может быть захвачена как отраженное изображение (с флуоресцентным контрастом, что является нормальным сигналом, получаемым системой) и использована для обнаружения планшета / пробирки. Место фокуса должно быть меньшим, чем лунка, и оно проявляется в захваченном изображении как небольшой яркий участок относительно размера лунки (известный как исследуемый участок, ROI). Если учитывать, что находящиеся в фокусе места дают яркие пиксели, а все другие участки дают более темные пиксели, численный анализ информации на пиксельном уровне может обеспечивать определение присутствия / отсутствия в соответствии с различными описываемыми авторами вариантами осуществления.
Нормализация прибора с использованием отражающего материала
[00310] В соответствии с различными вариантами осуществления настоящего изобретения нормализация прибора с использованием отражающего материала, такого, как фотодиод, может применяться для автоматической калибровки прибора после любых первоначальных калибровок, осуществляемых после изготовления или установки.
[00311] В соответствии с различными вариантами осуществления устойчивый отражающий материал измеряют во время производства как эталон. Отражающий материал может быть помещен над нагревательной крышкой. Затем устойчивый отражающий материал может измеряться во всех каналах для обнаружения любых изменений или колебаний. Любые изменения или колебания могут использоваться для регулирования коэффициентов цветового баланса, как описано выше для способа калибровки для нормализации прибора с целью повторной нормализации с учетом изменений в возбуждающем свете.
ЛОТОК ТЕРМОБЛОКА
[00312] Как сформулировано выше и показано на ФИГ. 1, система термоциклера 100 может содержать крышку 114 для пробы, нагревающие / охлаждающие элементы 116 и теплообменник 118.
[00313] Приборы для анализа биологических проб часто обеспечивают для исследователя возможность ручного или автоматического помещения биологических проб в зону загрузки пробы прибора для анализа. В некоторых вариантах осуществления крышка может быть поднята, и контейнер, который может содержать биологическая проба, может быть помещен в зону прибора для загрузки проб. В других вариантах осуществления может открываться дверца для вставки контейнера, способного вмещать биологическую пробу в зону прибора для загрузки пробы.
[00314] В другом варианте осуществления выдвижной ящик или лоток может в подвижном режиме выдвигаться из прибора для обеспечения возможности вставки контейнера, способного вмещать биологическая проба, в зону прибора для загрузки пробы, причем контейнер вставляют в прибор после закрытия выдвижного ящика. В другом варианте осуществления контейнер, способный вмещать биологическая проба, может быть вставлен в прибор путем использования, например, пружин, защелок, ручек и рычагов. В других вариантах осуществления доступ к зоне прибора для загрузки пробы может быть автоматизированным. Это часто делается для приборов, в которых применяется робототехника в условиях высокой пропускной способности. Крышки, дверцы и выдвижные ящики могут быть автоматизированы путем использования двигателей. Автоматизированные варианты осуществления также возможны в ориентированных на пользователя приборах для содействия исследователю в загрузке биологических проб в прибор для анализа. Автоматизация может контролироваться через взаимодействие прибора с компьютерной системой, запрограммированной для обеспечения перемещения с целью облегчения загрузки биологических проб.
[00315] ФИГ. 5, обсуждавшаяся выше, показывает вариант осуществления системы термоциклера 100 с подвижным выдвижным ящиком или лотком 160 в открытой позиции. ФИГ. 38 иллюстрирует вариант осуществления для автоматизированного выдвижного ящика или лотка с предусмотренным в нем узлом блока пробоподготовки. Как обсуждается ниже, узел блока пробоподготовки может содержать компоненты, содействующие контролю температуры блока пробоподготовки. Блок пробоподготовки 114 может применяться для содержания контейнера с биологическими пробами. Блок пробоподготовки 114 также может обеспечивать нагрев и охлаждение для изменения температуры биологических проб. Специалистам в данной области техники известно изменение температуры биологических проб во время анализа при выполнении полимеразной цепной реакции, также известной как ПЦР. Электронные средства 128 могут взаимодействовать с блоком пробоподготовки через систему проводов и соединителей, например, для контроля температуры блока пробоподготовки. узел с ФИГ. 38 может представлять собой несколько узлов, составляющих прибор для анализа. К дополнительным узлам в приборе, помимо прочих, относятся источники питания, средства оптического возбуждения, оптической эмиссии, обмена данными и пользовательский интерфейс. Все из упомянутых узлов также могут быть связаны с компьютером для контроля сбора данных и хронометража прибора.
[00316] ФИГ. 39 показывает узел с ФИГ. 38 со снятыми блочным узлом 114 и электронными средствами 128. ФИГ. 39 иллюстрирует пример автоматизированной системы, которая может обеспечивать пользователю доступ к зоне загрузки пробы, например, блочному узлу114 прибора. ФИГ. 39 показывает двигатель 500, соединитель 505, салазки 510 и опору блока 515. В такой конфигурации опора блока 515 может механически соединяться с салазками 510 любым количеством крепежных средств, известных специалистам в данной области техники. Примерами крепежных средств, помимо прочих, могут быть винты, болты, заклепки и любые другие крепежные детали, подходящие для надежного прикрепления опоры блока 515 к салазкам 510. Благодаря надежному прикреплению опоры блока 515 к салазкам 510, опора блока может перемещаться в направлении, указанном стрелкой 520. Легкости перемещения опоры блока может способствовать использование подшипников или подвижных поверхностей, например, тефлоновых (не показаны). ФИГ. 39 также показывает двигатель 500. Двигатель 500 может быть любым подходящим двигателем, известным специалистам в данной области техники, например, двигатель постоянного тока, двигателем переменного тока или шаговым двигателем и т. п. В любом случае двигатель 500 может быть связан с представленными выше электронными средствами для обеспечения вращательного движения вала двигателя. Двигатель 500 также может быть связан с компьютерной системой, запрограммированной для точного регулирования направления и скорости двигателя в случае необходимости. Как было представлено выше, двигатель 500 может обеспечивать вращательное движение, которое может быть преобразовано в линейное движение, как показано стрелкой 520. Преобразование вращательного движения в линейное движение может выполняться через соединитель 505 и один или несколько ходовых винтов (не показаны). Таким образом, такая конфигурация может обеспечивать контролируемое автоматическое движение опоры блока. Соединитель 505 дополнительно может обеспечивать компенсацию любого отклонения между двигателем 500 и ходовым винтом (не показан).
[00317] На ФИГ. 40 представлена боковая проекция узла. Показаны блок пробоподготовки 114, двигатель 500 и соединитель 505. Дополнительно показаны подшипники 530. Подшипники 530, как было представлено ранее, могут способствовать обеспечению плавного поступательного движения блочного узла. Размер и тип подшипников 530 зависят от нагрузки, которую должны выдерживать подшипники. Дополнительные детали подшипников 530 представлены ниже.
[00318] Специалисту в данной области техники станет понятно, что автоматизированные системы часто содержат определенный тип позиционной обратной связи с контроллером движения. Обратная связь может быть точной или грубой или комбинированной, в зависимости от контролируемой системы. Например, шаговые двигатели могут обеспечивать точное позиционирование на основе размера и количества шагов, совершаемых двигателем. Для систем шаговых двигателей компьютер может быть запрограммирован на подсчет шагов с целью определения местоположения устройства, совершающего вращательные или линейные движения. ФИГ. 41A показывает вид сверху блочного узла 114 и электронных средств 128, как представлено выше. Как обсуждалось выше, блочный узел 114 и электронные средства 128 закреплены на рейке 510 с ФИГ. 39 и соединяются с двигателем 500 с ФИГ. 39 для обеспечения движения в соответствии со стрелкой 570 с ФИГ. 41A. Стрелка 570 используется для представления движения блочного узла 114 и электронных средств 128 в направлении "входа" и "выхода" из прибора. Как показано на ФИГ. 41A, узел находится в приборе, о чем свидетельствует участок 560, увеличенное изображение которого представлено на ФИГ. 41B, и как описывается ниже.
[00319] ФИГ. 41B показывает 2 оптических датчика 575 и 580. Оптические датчики постоянно излучают и обнаруживают инфракрасный свет, проходящий через зазор. Одна сторона зазора является эмиттером, а другая сторона является ресивером. Пока на устройство подается энергия, эмиттер постоянно излучает инфракрасный свет, а ресивер постоянно обнаруживает этот свет. Если в зазор попадает непрозрачный объект, эмиттер продолжает излучать инфракрасный свет, но этот свет блокируется, не достигая ресивера. Разница между принятым светом и не принятым светом может быть обнаружена и распознана компьютером, запрограммированным на обнаружение этой разницы. В результате компьютер может выявлять, блокируется ли свет. В автоматизированных системах может использоваться этот эффект путем закрепления или помещения непрозрачного объекта, связанного с движущимся объектом, чтобы определить, находится ли движущийся объект в месте оптического переключателя, и должен ли быть выключен двигатель 500.
[00320] На ФИГ. 41B контуром показана пластинка 540. Пластинку 540 также можно увидеть на ФИГ. 40, и она представляет собой непрозрачную пластинку воздуховода 550. Как можно увидеть, пластинка 540 находится в зазоре оптического переключателя 575 и как таковая представляет "входную" позицию блочного узла и электронных средств. Специалисту в данной области техники станет понятно, что электрические компоненты могут прийти в неисправность. Неисправный "входной" переключатель не сможет обнаружить "входное" состояние, и двигатель 500 не должен отключаться. Во избежание повреждения узла предусмотрен жесткий упор 585 в задней части салазок 510. Он показан на ФИГ. 41C.
[00321] ФИГ. 41B также показан оптический переключатель 580, который может быть сконфигурирован, чтобы обнаруживать, когда узел полностью находится в "выходной" позиции. Оптический переключатель 580 работает, как описано выше для оптического переключателя 575, то есть, излучает и обнаруживает инфракрасный свет, проходящий через зазор. Если непрозрачный объект вставлен в зазор, запрограммированный компьютер может обнаружить, заблокирован ли путь светового луча. Для "выходного" состояния предусмотрена пластинка 590 на задней части рейки 510, как показано на ФИГ. 41C.
[00322] ФИГ. 42A иллюстрирует узел, находящийся в "выходной" позиции. Она явствует из того, что двигатель 500, соединитель 505 и ходовой винт 594 являются видимыми. Во "входной" позиции с ФИГ. 41A эти компоненты являются невидимыми. Обнаружение "выходной" позиции показано на участке 592, увеличенное изображение которого представлено на ФИГ. 42B. ФИГ. 42B показывает включенный оптический переключатель 575, обсуждавшийся выше. Кроме того, контуром показана непрозрачная пластинка 590, прикрепленная к рейке 510 и расположенная в зазоре оптического переключателя 580. Запрограммированный компьютер, как обсуждалось выше, может обнаруживать, находится ли пластинка 590 в зазоре, и, таким образом, может "знать", когда узел полностью находится в "выходной" позиции.
ТЕРМИЧЕСКИЙ БЛОК
[00323] Как сформулировано выше и показано на ФИГ. 1, система термоциклера 100 может содержать блок пробоподготовки 114, нагревающие/охлаждающие элементы 116 и теплообменник 118. Вместе эти элементы могут называться узлом блока пробоподготовки. ФИГ. 43 иллюстрирует вариант осуществления узла блока пробоподготовки 600 в соответствии с различными описываемыми авторами вариантами осуществления. узел 600 может содержать блок пробоподготовки (или несколько блоков) 605, термоэлектрический охладитель (TEC) (или несколько TEC) 610 и соответствующую рамку 630 и поглотитель тепла 615. Рамка 630 предназначена для приема и выравнивания TEC 610 относительно блока 605 и поглотителя тепла 615.
[00324] Хотя блок пробоподготовки 605 может быть одним, единым блоком, на ФИГ. 43 показаны несколько блоков, которые вместе составляют блок пробоподготовки 605, с уплотнителем 620, вставленным в промежутки между несколькими блоками, и контактной пленкой 625 под блоком 605. Кроме того, в зависимости от конструкции блока 605 (один блок или несколько блоков), пленка 625 может быть либо одной пленкой, имеющей по сути те же размеры, что и у блока 605, или может представлять собой несколько пленок, имеющих по сути те же размеры, что и у отдельных блоков многоблочной конструкции. Подобным образом пленка 625 может повторять количество и размеры применяемых TEC 610. Пленка 625 может быть выполнена, например, из алюминиевой фольги.
[00325] Блок 605 может быть зафиксирован или прикреплен к другим компонентам блочного узла, такого, как, например, поглотитель тепла 615. В альтернативном варианте блок 605 может быть свободным. Свободный блок 605 может не удерживаться, или полностью не удерживаться, винтами и/или другими крепежными средствами. Свободный блок 605 может быть посажен на предусмотренную плоскую поверхность или поверхности, таким образом, чтобы блок 605 по сути совмещался с другими компонентами блочного узла. Однако свободный блок 605 может совершать боковые перемещения во все стороны. Как правило, такие движения ограничиваются во избежание смещения блока 605, например, относительно нагревательной крышки, поглотителя тепла и/или TEC. узел может обеспечивать, например, упор, ограничивающий боковое перемещение. Перемещение может быть ограничено, например, до 1 мм во все стороны. Благодаря возможности такого ограниченного бокового перемещения, свободный блок может приспосабливаться к любым допустимым отклонениям и смещениям при укладывании компонентов друг на друга, которые блок может иметь относительно нагревательной крышки вследствие автоматических входных и выходных перемещений подвижной рейки, как обсуждалось выше.
[00326] Узел 600 с ФИГ. 43 дополнительно содержит зажимы 635, располагающиеся по большей части длины блока 605 и прикрепляющие TEC 610 к блоку 605. Также в узле 600 предусмотрен свободный нагреватель 640, который может располагаться вдоль внешней периферийной планки блока 605, причем планка находится в нижней части блока, ближе всего к основанию лунок на блоке. Нагреватель 640 может быть, например, каптоновым нагревателем, одна сторона которого покрыта алюминиевой фольгой и может использоваться для компенсации низких температур по периферийным лункам по сравнению с расположенными ближе к центру лунками.
[00327] Вторая контактная пленка 645 может быть предусмотрена между TEC 610 и поглотителем тепла 615. Размеры пленки 645, так же, как и пленки 625, могут повторять количество и размеры используемых TEC 610. Также может быть предусмотрен один кусок пленки по всей площади поверхности TEC 610. Пленка 645 может быть выполнена, например, из алюминиевой фольги.
[00328] Уплотнитель 650 может быть предусмотрен на верхней поверхности поглотителя тепла 615. Этот уплотнитель может контактировать, например, с каплесборником, расположенным по периметру блока пробоподготовки 605. Уплотнитель между блоком пробоподготовки и поглотителем тепла препятствует проникновению влаги в эту герметичную камеру и нарушению функциональности TEC.
НАГРЕВАТЕЛЬНАЯ КРЫШКА
[00329] Как сформулировано выше и показано на ФИГ. 1, система термоциклера 100 может содержать нагревательную крышку 110.
[00330] Во многих приборах для ПЦР пробирки или микротитровальные чашки с пробами вставляются в лунки для проб на термическом блочном узле. Для выполнения процесса ПЦР температуру термического блочного узла циклируют в соответствии с предписанными значениями температуры и времени, которые указываются пользователем в файле протокола ПЦК. Циклирование может контролироваться вычислительной системой и соответствующими электронными средствами. Когда термический блочный узел меняет температуру, в идеале пробы в разных пробирках или чашках подвергаются таким же изменениям температуры. Однако могут существовать различные факторы, которые могут влиять на эффективность теплопередачи от термического блока до проб, а также на эффективность реакции пробы. Примерами разных факторов могут быть степень контакта пробирки с пробой с лункой для пробы на термическом блочном узле и количество конденсации или испарения в пределах пробирки или чашки с пробой при нагревании и охлаждении пробы. Хотя бы из этих соображений приборы часто также содержат нагревательную крышку, которая может находиться на пробирке или чашке с пробой в контакте с ней. Представленная нагревательная крышка может обеспечивать направленное вниз усилие, действующее на пробирку или чашку для улучшения термического контакта между узлом термического блока и пробой, а также обеспечивает тепло для верхней части пробирки или чашки для минимизации конденсации и испарения.
[00331] Пример такой нагревательной крышки показан на ФИГ. 44A. узел нагревательной крышки узел 700 описывается в соответствии с представленной авторами идеей. Нижняя пластина 720 обеспечивает поверхность, которая может сопрягаться с верхними поверхностями пробирок или чашек с пробами. В одном варианте осуществления нижняя пластина 720 может содержать плоскую непрерывную сопрягаемую поверхность. В другом варианте осуществления нижняя пластина 720 может содержать углубления. В другом варианте осуществления углубления могут быть сквозными апертурами. Сквозные апертуры могут быть желательны в некоторых приборах для обеспечения возможности оптического обнаружения проб, содержащихся в сосудах для проб. В другом варианте осуществления количество сквозных апертур может составлять 96 апертур. В другом варианте осуществления количество апертур может составлять 384. В другом варианте осуществления количество сквозных апертур может равняться количеству сосудов с пробами. Как представлено выше, одно из преимуществ нагревательной крышки состоит в обеспечении достаточного тепла для верхней части сосудов с пробами с целью минимизации конденсации и испарения пробы. Нижняя пластина 720 как таковая может подвергаться нагреву. Как показано на ФИГ. 44A, нагрев нижней пластины 720 может обеспечиваться нагревателем 715. Нагреватель 715 может быть представлен любым из многих типов, известных специалистам в данной области техники. Нагреватель 715 также может быть прикреплен к нижней пластине 715 любым из многих способов, известных специалистам в данной области техники, таких, как, например, вулканизация, клей, отверждающийся под давлением, эпоксидная смола и склеивающая лента. Нагреватель 715 может регулироваться запрограммированным компьютером для обеспечения количества тепла, необходимого для предотвращения конденсации и испарения. В некоторых вариантах осуществления нагреватель 715 может нагреваться до 95°C. В другом варианте осуществления нагреватель 715 может нагреваться до температуры от 95°C до 105°C. В другом варианте осуществления нагреватель 715 может нагреваться до температуры более 105°C.
[00332] узел нагревательной крышки 700 дополнительно содержит верхнюю пластину 725. Верхняя пластина 725 показана с углублениями в верхней поверхности. Углубления могут совпадать с углублениями нижней пластины 720, как описано выше. В одном варианте осуществления углубления в верхней пластине 725 могут быть сквозными апертурами. В другом варианте осуществления сквозные апертуры могут позволять выполнять оптическое обнаружение проб, содержащихся в лунках для проб. В другом варианте осуществления количество сквозных апертур может составлять 96 апертур. В другом варианте осуществления количество апертур может составлять 384. В другом варианте осуществления количество сквозных апертур может равняться количеству сосудов с пробами. В другом варианте осуществления сквозные апертуры могут быть круглыми. В другом варианте осуществления сквозные апертуры могут быть прямоугольными. В другом варианте осуществления сквозные апертуры могут быть квадратными. В еще одном варианте осуществления квадратные апертуры могут обеспечивать оптический доступ к пробам для 96-луночного и 384-луночного форматов. ФИГ. 44B иллюстрирует, каким образом квадратные апертуры могут совпадать с 96 лунками с пробами в термическом блочном узле. Как показано, каждая квадратная апертура совпадает с 1 лункой с пробой. ФИГ. 44C иллюстрирует, каким образом квадратные апертуры могут совпадать с 384 лунками с пробами в термическом блочном узле. Как показано, каждая квадратная апертура совпадает с 4 лунками с пробами. Такая конфигурация может расширить пригодность компонентов нагревательной крышки на много приборов и может снизить затраты на каждый компонент.
[00333] Вторая функция нагревательной крышки 700 состоит в обеспечении направленного вниз усилия, действующего на верхнюю часть сосудов с пробами, для прочного контакта сосудов с пробами с лунками для проб с целью минимизации термического сопротивления между лунками для проб и пробами. Величина необходимого усилия может зависеть от типа материала или материалов, применяемых для формирования сосудов с пробами. В одном варианте осуществления величина усилия может составлять 90 фунтов. В другом варианте осуществления усилие может составлять от 90 фунтов до 150 фунтов. В еще одном варианте осуществления усилие может быть большим, чем 150 фунтов. Крышка 700 может вертикально перемещаться для контакта сосудами для проб с целью обеспечения необходимого усилия. Крышка 700 может перемещаться путем использования кулачков, рычагов, поршней, соленоидов или двигателей. Специалисту в данной области техники станет понятно, что эти элементы не являются единственными механизмами, способными обеспечивать необходимое перемещение, и что может применяться любой механизм, способный обеспечивать перемещение. Один такой механизм показан на ФИГ. 45.
[00334] Рисунок на ФИГ. 45 показывает автоматизированную систему 800 для перемещения нагревательной крышки 700 между позицией, которая не контактирует с сосудами для проб, и позицией контакта с сосудами для проб. Система 800 может содержать двигатель 815, ремень 810, шкив 806, шкивы 830 и ходовой винт 820. Второй ходовой винт (не показан) также включен, и шкив 805 также находится в том же месте, что и ходовой винт 820. Каждый ходовой винт и связанный с ним шкив находится на каждой стороне нагретой крышки 700. Система 800 может быть модифицирована для обеспечения любой скорости и силы, необходимых для данного случая применения. Специалисту в данной области техники станет понятно, что и размер двигателя, и передаточное соотношение шкивов, и технические требования для ходовых винтов влияют на определение потенциальной силы, которая может обеспечиваться. Таким образом, система, описанная на ФИГ. 45, может быть сконструирована для обеспечения 150 фунтов силы, прилагаемой к верхней части сосудов для проб. Такая сила должна распределяться по всей системе и концентрироваться на сосудах с пробами. Распределению силы может способствовать включение подшипников 825, расположенных вокруг 2 ходовых винтов. Сила, прилагаемая к узлу блока пробоподготовки, также может распределяться через опорные кронштейны (не показаны), способствующие передаче силы на рейку 510, показанную на ФИГ. 39. Таким образом, рейка 510 должна выдерживать это усилие не в ущерб плавному перемещению блока 114 и электронных средств 128 с ФИГ. 38.
[00335] На ФИГ. 44A показан оптический датчик 710. Оптические датчики постоянно излучают и обнаруживают инфракрасный свет, проходящий через зазор. Одна сторона зазора является эмиттером, а другая сторона является ресивером. Пока на устройство подается энергия, эмиттер постоянно излучает инфракрасный свет, а ресивер постоянно обнаруживает этот свет. Если в зазор попадает непрозрачный объект, эмиттер продолжает излучать инфракрасный свет, но этот свет блокируется, не достигая ресивера. Разница между принятым светом и не принятым светом может быть обнаружена и распознана компьютером, запрограммированным на обнаружение этой разницы. В результате компьютер может выявлять, блокируется ли свет. В автоматизированных системах может использоваться этот эффект путем закрепления или помещения непрозрачного объекта, связанного с движущимся объектом, чтобы определить, находится ли движущийся объект в месте оптического переключателя, и должен ли быть выключен двигатель 500.
[00336] Как представлено выше, нагревательная крышка 700 и система 800 вместе обеспечивают по меньшей мере 150 фунтов силы, прилагаемой к верхней части сосудов для проб. Также желательно, чтобы усилие могло прилагаться стабильно, независимо от размеров сосудов для проб. комплект пружин 730 и оптический переключатель 710 включены для обеспечения необходимого усилия для всех сосудов с пробами. комплект пружин может быть предусмотрен для реагирования на необходимое усилие для системы. комплект пружин 730 дополнительно содержит непрозрачную пластинку 735, расположенную в зазоре оптического переключателя 710. Когда крышка 700 опускается входит в контакт с сосудами для проб прилагаемое усилие возрастает с опусканием крышки 700. С возрастанием усилия комплект пружин 730 реагирует и движется в направлении вверх. При приложении необходимого усилия комплект пружин 730 должен переместиться вверх настолько, чтобы пластинка 735 заблокировала путь светового луча оптического переключателя 710. Заблокированный путь светового луча может быть обнаружен запрограммированным компьютером, как описано выше, и двигатель 815 может быть выключен.
[00337] В приборе с автоматизированными особенностями, таком, как описанный согласно представленной авторами идее, желательно не допускать открытия блока пробоподготовки до поднятия нагревательной крышки. Защита от такого развития событий обеспечивается оптическим переключателем 835 и непрозрачной пластинкой 840, как показано на ФИГ. 45. Оптический переключатель 835 может быть закреплен таким образом, чтобы накрывать основу 845 в фиксированной позиции. Непрозрачная пластинка 840 может находиться на крышке 700 и совпадать с зазором оптического переключателя 835. При выполнении ПЦР нагревательная крышка и непрозрачная пластинка 840 могут подниматься, пока непрозрачная пластинка 840 не входит в зазор оптического переключателя 835. Когда непрозрачная пластинка 840 поднимается достаточно для того, чтобы заблокировать путь светового луча оптического переключателя 835, запрограммированный компьютер может определить позицию крышки как полностью поднятую, и двигатель 815 может быть выключен.
[00338] В первом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа, содержащая узел блока пробоподготовки, который содержит блок пробоподготовки, выполненный с возможностью вмещения держателя проб, держатель проб, выполнен с возможностью приема множества проб; систему управления, выполненную с возможностью циклирования множества проб по ряду температур; и лоток, выполнен с возможностью подвижного перемещения узла блока пробоподготовки из закрытой в открытую позицию и в реверсивном направлении для обеспечения доступа пользователя к множеству держателей проб.
[00339] Во втором варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно первому варианту осуществления, причем лоток представляет собой автоматизированную систему.
[00340] В третьем варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно второму варианту осуществления, причем лоток содержит подвижный узел, выполнен с возможностью двустороннего скольжения узла блока пробоподготовки.
[00341] В четвертом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно третьему варианту осуществления, причем подвижный узел является цельноштампованным элементом.
[00342] В пятом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно предыдущим вариантам осуществления, причем лоток дополнительно содержит позиционный датчик, выполнен с возможностью определения момента, когда автоматизированный лоток достигает определенной закрытой позиции и определенной открытой позиции.
[00343] В шестом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно пятому варианту осуществления, причем позиционный датчик представляет собой оптический датчик.
[00344] В седьмом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно пятому и шестому вариантам осуществления, причем позиционный датчик представляет собой оптический переключатель.
[00345] В восьмом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно пятому и седьмому вариантам осуществления, которая дополнительно содержит нагревательную крышку, причем позиционный датчик выполнен с возможностью определения момента, когда автоматизированный лоток достигает определенной закрытой позиции, таким образом, чтобы блок пробоподготовки совмещался с нагревательной крышкой.
[00346] В девятом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно шестому и седьмому вариантам осуществления, причем лоток или узел блока пробоподготовки дополнительно содержит пластинку, выполненную с возможностью блокирования света излучаемого от позиционного датчика.
[00347] В десятом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа, содержащая блочный узел, содержащий блок пробоподготовки, который имеет множество лунок, причем блок пробоподготовки выполнен с возможностью вмещать держателя проб, держатель проб, выполнен с возможностью приема множества проб; систему управления, выполненную с возможностью циклирования множества проб по ряду температур; оптическую систему, выполненную с возможностью доставки возбуждающего света на множество проб и обнаружения уровня флуоресценции, излучаемой каждым из множества проб; и нагревательную крышку, содержащую нижнюю пластину, имеющую сопрягаемую поверхность для сопряжения с верхней поверхностью держателя пробы, причем сопрягаемая поверхность имеет множество отверстий нижней пластины, каждое из которых совмещается и связывается с одним из множества лунок блока, таким образом, чтобы возбуждающий свет мог проходить к лункам блока; нагреватель; и верхнюю пластину, имеющую множество отверстий верхней пластины.
[00348] В одиннадцатом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно десятому варианту осуществления, причем блок пробоподготовки имеет 96 лунок.
[00349] В двенадцатом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно десятому варианту осуществления, причем блок пробоподготовки имеет 384 лунок.
[00350] В тринадцатом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно десятому варианту осуществления, причем нижняя пластина имеет 96 апертур нижней пластины.
[00351] В четырнадцатом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно десятому варианту осуществления, причем нижняя пластина имеет 384 апертур нижней пластины.
[00352] В пятнадцатом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно вариантам осуществления с десятого по четырнадцатый, причем количество апертур верхней пластины равняется количеству лунок блока пробоподготовки.
[00353] В шестнадцатом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно вариантам осуществления с десятого по четырнадцатый, причем обеспечивается одна верхняя пластина, имеющая апертуры верхней пластины, предусмотренные для пропускания эмиссионного света лишь до одного из выбранных луночных форматов блока пробоподготовки.
[00354] В семнадцатом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно шестнадцатому варианту осуществления, причем луночный формат блока пробоподготовки представляет собой 96-луночный формат или 384-луночный формат.
[00355] В восемнадцатом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно вариантам осуществления с десятого по семнадцатый, причем нагревательная крышка дополнительно содержит датчик позиции, выполнен с возможностью определения момента, когда нагревательной крышкой оказано заданное давление на верхнюю поверхность держателя пробы.
[00356] В девятнадцатом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно восемнадцатому варианту осуществления, причем верхняя поверхность держателя пробы является верхней поверхностью множества лунок с пробами, предусмотренных на держателе пробы.
[00357] В двадцатом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно восемнадцатому и девятнадцатому вариантам осуществления, причем датчик позиции является оптическим датчиком.
[00358] В двадцать первом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно восемнадцатому и девятнадцатому вариантам осуществления, причем нагревательная крышка дополнительно содержит комплект пружин, причем комплект пружин содержит пластинку, комплект пружин выполнен с возможностью контакта с верхней поверхностью держателя пробы, когда нагревательная крышка опускается вниз на держатель проб, причем пластинка выполнена с возможностью блокирования света излучаемого от датчика позиции для остановки направленного вниз движения нагревательной крышки.
[00359] В двадцать втором варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа, содержащая множество модулей системы, причем это множество модулей содержит детекторный модуль; эмиссионный модуль; возбуждающий модуль; и базовый модуль; множество модулей системы выполнены с возможностью соединения с возможностью разъединения для изготовления устройства первого типа для биологического анализа.
[00360] В двадцать третьем варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно двадцать второму варианту осуществления, которая дополнительно содержит лицевую пластину.
[00361] В двадцать четвертом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно двадцать второму и двадцать третьему вариантам осуществления, причем по меньшей мере один из модулей является модулем для устройства второго типа для биологического анализа.
[00362] В двадцать пятом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно вариантам осуществления с двадцать второго по двадцать четвертый, причем детекторный модуль содержит датчик эмиссии.
[00363] В двадцать шестом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно любому из вариантов осуществления с двадцать второго по двадцать четвертый, причем детекторный модуль содержит детектор эмиссии.
[00364] В двадцать седьмом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно любому из вариантов осуществления с двадцать второго по двадцать четвертый, причем эмиссионный модуль содержит камеру.
[00365] В двадцать восьмом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно любому из вариантов осуществления с двадцать второго по двадцать четвертый, причем эмиссионный модуль содержит колесо с эмиссионным фильтром.
[00366] В двадцать девятом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно любому из вариантов осуществления с двадцать второго по двадцать четвертый, причем возбуждающий модуль содержит источник возбуждения.
[00367] В тридцатом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно любому из вариантов осуществления с двадцать второго по двадцать четвертый, причем возбуждающий модуль содержит колесо с фильтром возбуждения.
[00368] В тридцать первом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно любому из вариантов осуществления с двадцать второго по двадцать четвертый, причем возбуждающий модуль содержит расщепитель луча.
[00369] В тридцать втором варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно любому из вариантов осуществления с двадцать второго по двадцать четвертый, причем возбуждающий модуль содержит складываемое зеркало.
[00370] В тридцать третьем варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно любому из вариантов осуществления с двадцать второго по двадцать четвертый, причем базовый модуль содержит блок пробоподготовки.
[00371] В тридцать четвертом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно любому из вариантов осуществления с двадцать второго по двадцать четвертый, причем базовый модуль содержит нагревательные и охлаждающие элементы блока.
[00372] В тридцать пятом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно любому из вариантов осуществления с двадцать второго по двадцать четвертый, причем базовый модуль содержит расщепитель луча.
[00373] В тридцать шестом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно любому из вариантов осуществления с двадцать второго по двадцать четвертый, причем базовый модуль содержит складываемое зеркало.
[00374] В тридцать седьмом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно любому из вариантов осуществления с двадцать второго по двадцать четвертый, причем базовый модуль содержит нагревательную крышку.
[00375] В тридцать восьмом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно любому из вариантов осуществления с двадцать второго по двадцать четвертый, причем базовый модуль содержит поглотитель тепла.
[00376] В тридцать девятом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно любому из вариантов осуществления с двадцать второго по двадцать четвертый, причем базовый модуль содержит систему управления.
[00377] В сороковом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа, содержащая прибор, который содержит блочный узел, содержащий блок пробоподготовки, выполненный с возможностью вмещения держатель проб и который имеет множество реакционных зон; и оптическую систему, способную визуализировать флуоресцентное излучение из множества реакционных зон; и систему калибровки для калибровки прибора, причем система калибровки содержит калибратор исследуемой области (ROI), выполнен с возможностью определения позиций реакционной зоны в изображении; калибратор чистого красителя, выполнен с возможностью определения доли флуоресцентного красителя, используемого в каждой реакционной зоне, путем сравнения необработанного спектра флуоресцентного красителя с калибровочными данными чистого спектра флуоресцентного красителя; калибратор нормализации прибора, выполнен с возможностью определения коэффициента нормализации фильтра; валидатор РНКазы P, выполнен с возможностью подтверждения способности прибора к распознаванию между двумя разными значениями количества пробы; и дисплейное устройство, выполненное с возможностью демонстрации результатов калибровки.
[00378] В сорок первом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно сороковому варианту осуществления, причем ROI-калибратор выполнен с возможностью оценки первоначальной исследуемой области (ROI) на основе порогов флуоресценции от каждой лунки с пробой; оценки местоположения центра каждой ROI; оценки размера каждой ROI; определения среднего размера ROI для множества реакционных зон; вывода моделей глобального гридинга; применения моделей глобального гридинга к ROI, причем применение моделей глобального гридинга улучшает точность определения местоположения центра ROI; восстановления недостающих ROI; и регулирования радиуса ROI, причем регулирование улучшает соотношение сигнал-шум оптической системы.
[00379] В сорок втором варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно любому из вариантов осуществления с сорокового по сорок первый, причем ROI-калибратор снижает погрешности определения реакционной зоны путем минимизации по меньшей мере одной из следующих групп: насыщенности красителя в пределах множества реакционных зон, вращения решетки, изменчивости коэффициентов увеличения и оптической радиальной дисторсии.
[00380] В сорок третьем варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно любому из вариантов осуществления с сорокового по сорок второй, причем калибратор чистого красителя выполнен с возможностью визуализации держателя пробы, загруженного в прибор, по более, чем одному каналу, причем держатель проб содержит множество реакционных зон и более одного типа красителя, причем каждый краситель занимает более одной реакционной зоны; идентификации пикового канала для каждого красителя на держателе пробы; нормализации каждого канала относительно пикового канала для каждого красителя; и создания матрицы красителей, содержащей набор контрольных значений красителей.
[00381] В сорок четвертом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно сорок третьему варианту осуществления, причем калибратор выполнен с возможностью четырехкратной визуализации держателя пробы для визуализации четырех разных держателей пробы.
[00382] В сорок пятом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно любому из вариантов осуществления с сорокового по сорок четвертый, причем оптическая система содержит множество фильтров возбуждения и множество эмиссионных фильтров, и калибратор нормализации прибора выполнен с возможностью определения первого коэффициента коррекции для каждого из фильтров возбуждения и эмиссионных фильтров; расчета второго коэффициента коррекции для пары фильтров, причем каждая пара фильтров содержит один фильтр возбуждения и один эмиссионный фильтр; и применения вторых коэффициентов коррекции к данным фильтра.
[00383] В сорок шестом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно любому из вариантов осуществления с сорокового по сорок пятый, причем коэффициент нормализации фильтра позволяет сравнивать данные от прибора с данными от второго прибора.
t
t
t
[00384] В сорок седьмом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно любому из вариантов осуществления с сорокового по сорок шестой, причем валидатор РНКазы P выполнен с возможностью приема данных амплификации от проверочного планшета для генерации множества кривых амплификации, причем проверочный планшет содержит пробу в первом количестве и втором количестве, и каждая кривая амплификации содержит экспоненциальный участок; определения набора порогов флуоресценции на основе экспоненциальных участков множества кривых амплификации; определения для каждого порога флуоресценции из набора первого набора значений порогового цикла (C) кривых амплификации, сгенерированных на основе проб первого количества, и второго набора значений C кривых амплификации, сгенерированных на основе проб второго количества; и расчета для определения достаточности различимости первого и второго количеств на основе значений C при каждом из множества порогов флуоресценции.
[00385] В сорок восьмом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно любому из вариантов осуществления с сорокового по сорок седьмой, причем валидатор РНКазы P также выполнен с возможностью демонстрации прохождения или непрохождения прибором проверки на дисплейном устройстве.
[00386] В сорок девятом варианте осуществления обеспечивается система для биологического анализа согласно любому из вариантов осуществления с сорокового по сорок восьмой, которая дополнительно содержит автоматический корректор красителя, выполнен с возможностью выполнения спектральной калибровки многокомпонентных данных в реальном времени; детектор планшетов, выполнен с возможностью определения наличия ошибки загрузки планшета; автоматический калибратор фона, выполнен с возможностью компенсации фоновых изменений; и нормализатор прибора, выполнен с возможностью использования отражающего материала с целью обнаружения любых изменений или колебаний в флуоресцентной эмиссии.