ОПТИМИЗАЦИЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ GL-2045 - МУЛЬТИМЕРИЗУЮЩЕГОСЯ СТРАДОМЕРА
OPTIMIZATION OF MANUFACTURE OF GL-2045 MULTIMERIZED STRADOMER

Ссылка на родственные заявки
[001] Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США № 62/432402, поданной 9 декабря 2016 г., содержание которой полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.
Описание текстового файла, поданного в электронной форме
[002] Содержание файла в текстовом формате, поданного в электронной форме с настоящим документом, полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки: копия перечня последовательностей в машиночитаемом формате (название файла: GLIK_017_01WO_ST25.txt; дата регистрации: 8 декабря 2017 г.; размер файла 15 Кб).
Область техники
[003] Настоящее изобретение в целом относится к областям иммунологии, аутоиммунитета, воспаления и иммунологии опухолей. В частности, настоящее изобретение относится к оптимизированным способам изготовления GL-2045. Настоящее изобретение также относится к новым композициям, содержащим такой оптимально изготовленный GL-2045, а также к способам применения композиций GL-2045. Настоящее изобретение также относится к лечению или предотвращению патологических состояний, таких как аутоиммунные заболевания и воспалительные заболевания.
Уровень техники
[004] Объединенный внутривенный иммуноглобулин человека (ВВИГ) применяют с начала 1950-х годов для лечения иммунодефицитных нарушений и, в последние десятилетия, аутоиммунных и воспалительных заболеваний. ВВИГ опосредует толерогенные иммунные эффекты за счет нескольких механизмов, включающих связывание агрегатов ВВИГ с компонентом комплемента C1q и рецепторами Fc-гамма (FcγR) и сшивку этих рецепторов на иммунных клетках, таких как NK-клетки (например, FcγRIIIa), макрофаги (например, FcγRIIa), B-клетки (например, FcγRIIb), моноциты и клетки моноцитарного происхождения, включая дендритные клетки. ВВИГ представляет собой состав из стерильных очищенных продуктов иммуноглобулина G (IgG), изготовленных из объединенной плазмы крови человека, которая, как правило, содержит более 90% немодифицированного IgG с незначительным и варьирующимся количеством мультимерных иммуноглобулинов, IgA или IgM (Rutter A et al., J Am Acad Dermatol, 2001, Jun; 44(6): 1010-1024).
[005] Большая доля опубликованных данных свидетельствует о том, что незначительная фракция агрегированного IgG в ВВИГ человека, в частности, часть Fc этих агрегатов, в непропорциональной мере эффективна в лечении определенных заболеваний, опосредуемых патологическими иммунными комплексами. Обнаружено, что следовые количества (1-5%) IgG присутствуют в ВВИГ в виде мультимерных форм, и что димеры IgG могут составлять 5-15% от ВВИГ человека. Были описаны альтернативные варианты терапии ВВИГ, основанные на применении полученных рекомбинантными способами мультимеров Fc, которые авидно связывают рецепторы Fc и компонент комплемента C1q, сходно с агрегатами ВВИГ (см. публикации заявок на патент США 2010/0239633, US 2013/0156765, US 2015/0218236 и РСТ публикацию WO 2015/132364).
[006] Один из таких мультимеров Fc, GL-2045, был раскрыт ранее (публикация заявки на патент США № 2013/0156765). GL-2045 представляет собой общий мультимеризующийся страдомер, который является рекомбинантным миметиком ВВИГ. GL-2045 связывает большинство или все лиганды, с которыми связывается Fc иммуноглобулина IgG1. Кроме того, GL-2045 связывается с высокой аффинностью и авидностью со всеми каноническими рецепторами и компонентом комплемента C1q и имеет в 10-1000 раз более высокую эффективность в условиях in vitro по сравнению с ВВИГ. Помимо этого GL-2045, или его мышиный эквивалент, является эффективным в многочисленных моделях аутоиммунных заболеваний на животных, включая индуцированный коллагеном артрит, экспериментальную аутоиммунную нейропатию, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру и экспериментальную аутоиммунную миастению гравис. Соответственно, GL-2045 также имеет потенциальное клиническое применение при лечении широкого спектра аутоиммунных заболеваний, включая, но не ограничиваясь указанными, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, хроническую воспалительную полинейропатию, мультифокальную моторную нейропатию, миастению гравис, трансплантацию органа и ревматоидный артрит.
[007] В дополнение к предпочтительной активности и эффективности GL-2045 в сравнении с ВВИГ, GL-2045 обладает несколькими преимуществами в способе изготовления. ВВИГ представляет собой объединенный продукт крови человека, это означает, что он получен из крови десятков тысяч доноров, сыворотку которых затем смешивают и впоследствии очищают для удаления вирусов и других инфекционных агентов, а также агрегированного IgG. Соответственно, доступ и поставки ограничены, а затраты на изготовление высоки. Помимо этого между партиями ВВИГ существует значительная степень изменчивости. Напротив, GL-2045 получают рекомбинантными способами, что позволяет устранить трудности с поставками и затратами на изготовление, обеспечивая при этом больший контроль способа изготовления.
[008] Гомодимер GL-2045 аффинно связывается с лигандами Fc, включая рецепторы Fc-гамма и компонент комплемента C1q, но без значительной авидности. Он также естественным образом образует мультимеры более высокого порядка, способные авидно связываться с каноническими рецепторами. Именно эти мультимеры GL-2045 более высокого порядка имитируют повышенную эффективность мультимерных фракций ВВИГ. Однако стандартные условия культивирования клеток приводят к получению разных уровней жизнеспособности клеток, степени мультимеризации белков и титров белков. Соответственно, в данной области техники существует потребность в способах изготовления GL-2045, которые позволяют получать определенный мультимерный профиль, и, в частности, в способе, который позволяет увеличивать процентное содержание мультимеров более высокого порядка одновременно с оптимизацией жизнеспособности клеток и титра белка.
Краткое описание
[009] Согласно настоящему изобретению предложены все три из улучшенной жизнеспособности клеток, улучшенного высокого титра белка и неожиданного и существенного увеличения процентного содержания мультимеров более высокого порядка по сравнению со стандартными методиками изготовления. Соответственно, этот оптимизированный способ изготовления обеспечивает оптимально изготовленные композиции GL-2045 с повышенной эффективностью для лечения воспалительных заболеваний по сравнению с композициями GL-2045, изготовленными неоптимальными способами. Оптимизированное изготовление GL-2045 включает оптимизированные начальные способы изготовления и, в некоторых вариантах реализации, оптимизированные последующие способы изготовления. Оптимизированные начальные способы изготовления позволяют: a) получать высокие титры белка, b) поддерживать высокую жизнеспособность клеток, чтобы уменьшить до минимума остатки погибших клеток, и c) сохранять как высокоупорядоченные мультимеры гомодимера, которые имеют существенное значение для функционирования GL-2045, так и гомодимер, при необходимости. Оптимизированные последующие способы изготовления включают различные методики очистки, которые применяют намеренно для поддержания выбранного мультимерного профиля GL-2045. Соответственно, согласно некоторым вариантам реализации предложены композиции GL-2045 с определенным мультимерным профилем.
[0010] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ получения GL-2045, включающий культивирование клеток яичника китайского хомяка (СНО), которые были стабильно трансфицированы вектором экспрессии, кодирующим GL-2045, при 37°C±1°C до тех пор, пока клетки СНО не достигнут плотности клеток от приблизительно 5 до приблизительно 30 миллионов клеток/мл; изменение температуры выращивания с 37°C±1°C до 32,5°C±1°C; и сбор GL-2045 из культуральных сред. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки выращивают до плотности от приблизительно 10 до приблизительно 25 миллионов клеток/мл перед изменением температуры выращивания. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки выращивают до плотности от приблизительно 10 до приблизительно 15 миллионов клеток/мл перед изменением температуры выращивания. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки выращивают до плотности от приблизительно 15 до приблизительно 20 миллионов клеток/мл перед изменением температуры выращивания. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения применяют двойное изменение температуры с 37°C±1°C до 34°C±1°C приблизительно на 3 день со вторым изменением температуры с 34°C±1°C до 31°C±1°C приблизительно на 7 день выращивания культуры в биореакторе.
[0011] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки линии CHO культивируют в основных культуральных средах ActiCHO P. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения во время культивирования клеток линии CHO вносят добавки к питательной среде ActiCHO Feed A и ActiCHO Feed B. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения добавки к питательной среде клеток СНО вносят через день. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вектор экспрессии, кодирующий GL-2045, содержит лидерный пептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вектор экспрессии, кодирующий GL-2045, дополнительно содержит последовательность распознавания транспозазы piggyBac и трансфицируется с вектором, кодирующим транспозазу piggyBac. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вектор экспрессии, кодирующий GL-2045, приводит менее чем к 20 геномным вставкам.
[0012] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен GL-2045, полученный рекомбинантными способами, описанными в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен вектор экспрессии, кодирующий GL-2045, содержащий кассету экспрессии GL-2045, причем кассета экспрессии GL-2045 фланкирована минимальными инвертированными повторяющимися элементами piggyBac.
[0013]Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ получения GL-2045, включающий трансфекцию клеток линии CHO вектором экспрессии, описанным в настоящем документе, культивирование клеток СНО в биореакторе со средами ActiCHO P при температуре выращивания 37°C±1°C, ежедневное внесение добавок Acti CHO Feed A и Acti CHO Feed B в питательные среды клеток СНО при температуре выращивания 37°C±1°C до тех пор, пока культуры не достигнут плотности клеток от приблизительно 10 миллионов до приблизительно 15 миллионов клеток/мл, изменение температуры выращивания с 37°C±1°C до 32,5°C±1°C, и сбор GL-2045 из культуральных сред, причем указанные способы позволяют получать жизнеспособность клеток >80% на 21 день и конечный титр белка >9000 мг/мл, в котором >70% GL-2045 присутствует в виде мультимера, при этом >30% мультимеров представляют собой мультимеры GL-2045 более высокого порядка. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения жизнеспособность клеток превышает 95% на 18 день культивирования. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения процентное содержание мультимеров превышает 80%.
[0014] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ очистки GL-2045, полученного способами, описанными в настоящем документе, включающий очистку GL-2045 от культурального супернатанта с помощью аффинной хроматографии и заключительную очистку GL-2045 с помощью одной или более из катионообменной хроматографии, анионообменной хроматографии и хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC).
[0015] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения перед аффинной хроматографией применяют глубинную фильтрацию. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения глубинный фильтр представляет собой X0HC (Millipore). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения блок глубинной фильтрации удаляет высокий процент ДНК из супернатанта. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения блок глубинной фильтрации представляет собой гибридный очиститель Emphaze™ AEX (3M).
[0016] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения для аффинной хроматографии применяют колонку с белком A. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения колонка с белком A содержит устойчивую к NaOH смолу. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения смола с белком A представляет собой смолу MabSelect SuRe. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения очистка с помощью аффинной хроматографии включает применение одного из трех различных промывочных буферов для оптимизации условий очистки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения очистка с помощью аффинной хроматографии включает элюирование GL-2045 из колонки для аффинной хроматографии. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения элюирование GL-2045 включает элюирование с градиентом рН. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения элюирование GL-2045 включает элюирование без градиента рН. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения элюирование проводят с применением глицинового буфера. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения элюирование проводят с применением ацетатного буфера. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения колонку для аффинной хроматографии регенерируют для удаления связанного GL-2045. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения колонку для аффинной хроматографии регенерируют чаще, чем предложено производителем. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения колонку для аффинной хроматографии регенерируют перед каждым циклом очистки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения колонку для аффинной хроматографии регенерируют 0,5 М NaOH-буфером.
[0017] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения заключительная очистка GL-2045 включает анионообменную хроматографию в проточном режиме. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения анионообменная хроматография в проточном режиме включает применение колонки Q Sepharose Fast Flow. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения заключительная очистка GL-2045 включает катионообменную хроматографию. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения катионообменная хроматография включает применение колонки POROS XS. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения катионообменная хроматография включает применение элюирующего буфера с ацетатом натрия. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения элюирующий буфер дополнительно содержит 36,5-39,0% 1 М NaCl-буфера. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения способ элюирования представляет собой ступенчатое элюирование, и согласно другому варианту реализации настоящего изобретения элюирование представляет собой градиентное элюирование. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения заключительная очистка GL-2045 включает хроматографию гидрофобного взаимодействия. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения хроматография гидрофобного взаимодействия включает применение смолы бутил-FF. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения хроматография гидрофобного взаимодействия включает применение смолы фенил-HP. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения хроматография гидрофобного взаимодействия («HIC») включает применение смолы фенил-сефароза 6 Fast Flow High Sub. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения способ HIC применяют в проточном режиме, и согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способ HIC применяют в режиме связывания. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения смола HIC позволяет выделять гомодимер GL-2045. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения хроматография гидрофобного взаимодействия включает применение смолы октил-FF. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения колонка позволяет удалять неупорядоченные агрегаты GL-2045.
[0018] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ очистки GL-2045, включающий очистку GL-2045 от культурального супернатанта с помощью аффинной хроматографии с белком A, при котором в колонке с белком A применяют устойчивую к щелочам среду, такую как среда MabSelect SuRe, при этом очистку выполняют с по меньшей мере двумя циклами промывки, причем процедуры очистки на месте (CIP) выполняют после каждого цикла очистки с применением этапа регенерации высокой концентрацией NaOH, например, 0,5 М NaOH-буфером.
[0019] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ очистки GL-2045, включающий заключительную очистку GL-2045 с помощью катионообменной хроматографии, причем катионообменная колонка содержит высокоемкую смолу с высоким разрешением, такую как POROS XS, и при этом элюирующий буфер представляет собой буфер на основе ацетата натрия, содержащий 36,5-39,0% 1 М NaCl-буфера. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ очистки GL-2045 дополнительно включает заключительную очистку GL-2045 с помощью анионообменной хроматографии, причем анионообменная колонка содержит сильную анионообменную среду, которая обладает высокой химической стабильностью, позволяет осуществлять протоколы очистки на месте и обеззараживания, такую как среда Q Sepharose Fast Flow. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ очистки GL-2045 дополнительно включает заключительную очистку GL-2045 с помощью хроматографии гидрофобного взаимодействия, причем среда для гидрофобного взаимодействия представляет собой смолу бутил-FF, фенил-HP или октил-FF и выбрана для выделения или удаления конкретной фракции GL-2045 в дополнение к заключительной очистке. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ очистки и/или заключительной очистки GL-2045 приводит к получению конечного титра белка GL-2045 >4 г/л после всех этапов фильтрации и хроматографии (т.е. готового лекарственного вещества). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения готовая белковая композиция GL-2045 содержит >70% мультимеров. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения >28% мультимеров являются мультимерами более высокого порядка, согласно результатам исследования с помощью аналитической эксклюзионной ВЭЖХ.
[0020] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен очищенный GL-2045, полученный способами, описанными в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения очищенный GL-2045, полученный способами, описанными в настоящем документе, имеет определенный мультимерный профиль, который уменьшает до минимума процентное содержание гомодимеров и/или димеров гомодимеров или иным образом сохраняет баланс процентного содержания гомодимеров, мультимеров более низкого порядка, мультимеров более высокого порядка и мультимеров высшего порядка. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ лечения или предотвращения воспалительного, аутоиммунного или инфекционного заболевания или нарушения у субъекта, нуждающегося в этом, с применением полученного рекомбинантными способами, очищенного GL-2045, описанного в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения заболевание или нарушение выбрано из идиопатической тромбоцитопенической пурпуры, хронической воспалительной полинейропатии, мультифокальной моторной нейропатии, миастении гравис, трансплантации органов и ревматоидного артрита. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения GL-2045 вводят внутривенно, подкожно, перорально, внутрибрюшинно, сублингвально, буккально, трансдермально, через подкожный имплантат или внутримышечно.
[0021] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена композиция GL-2045, полученная рекомбинантными способами, в которой гомодимерная фракция композиции GL-2045 составляет менее приблизительно 20% от всей композиции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гомодимерная фракция составляет 12-19% от всей композиции. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения гомодимерная фракция составляет 14-19% от всей композиции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гомодимерная фракция составляет 15,5-17,5% от всей композиции. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения гомодимерная фракция составляет приблизительно 16,2% от всей композиции.
[0022] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена композиция GL-2045, полученная рекомбинантными способами, в которой димер гомодимерной фракции композиции GL-2045 составляет от приблизительно 7% до приблизительно 12% от всей композиции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения димер гомодимерной фракции составляет от приблизительно 9% до приблизительно 11% от всей композиции. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения димер гомодимерной фракции составляет приблизительно 10% от всей композиции.
[0023] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена композиция GL-2045, полученная рекомбинантными способами, в которой тример гомодимерной фракции композиции GL-2045 составляет от приблизительно 5,5% до приблизительно 11% от всей композиции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения тример гомодимерной фракции составляет от приблизительно 6,5% до приблизительно 8% от всей композиции. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения тример гомодимерной фракции составляет приблизительно 7% от всей композиции.
[0024] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена композиция GL-2045, полученная рекомбинантными способами, в которой тетрамер гомодимерной фракции композиции GL-2045 составляет от приблизительно 10% до приблизительно 16% от всей композиции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения тетрамер гомодимерной фракции составляет от приблизительно 13% до приблизительно 15% от всей композиции. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения тетрамер гомодимерной фракции составляет приблизительно 14% от всей композиции.
[0025] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена композиция GL-2045, полученная рекомбинантными способами, в которой пентамер гомодимерной фракции композиции GL-2045 составляет от приблизительно 6% до приблизительно 9% от всей композиции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения пентамер гомодимерной фракции составляет от приблизительно 7% до приблизительно 8% от всей композиции. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения пентамер гомодимерной фракции составляет приблизительно 7% от всей композиции.
[0026] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена композиция GL-2045, полученная рекомбинантными способами, в которой гексамер гомодимерной фракции композиции GL-2045 составляет от приблизительно 10% до приблизительно 14% от всей композиции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гексамер гомодимерной фракции составляет от приблизительно 12% до приблизительно 13% от всей композиции. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения гексамер гомодимерной фракции составляет приблизительно 12,7% от всей композиции.
[0027] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена композиция GL-2045, полученная рекомбинантными способами, в которой мультимеры высшего порядка (т.е. те, которые входят во фракцию 7-членного и выше гомодимера) составляют по меньшей мере приблизительно 28% от всей композиции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения мультимеры высшего порядка составляют не более 35% от всей композиции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фракции мультимеров высшего порядка составляют от приблизительно 30% до приблизительно 34% от всей композиции. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения фракции мультимеров высшего порядка составляют приблизительно 31,4% от всей композиции.
[0028] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена композиция GL-2045, полученная рекомбинантными способами, в которой:
(a). гомодимерная фракция составляет менее приблизительно 20% от всей композиции;
(b). фракции мультимеров высшего порядка составляют по меньшей мере приблизительно 28% от всей композиции;
(c). димер гомодимерной фракции составляет от приблизительно 7% до приблизительно 12,5% от всей композиции;
(d). тример гомодимерной фракции составляет от приблизительно 5,5% до приблизительно 11% от всей композиции;
(e). тетрамер гомодимерной фракции составляет от приблизительно 10% до приблизительно 16% от всей композиции;
(f). пентамер гомодимерной фракции составляет от приблизительно 6% до приблизительно 10% от всей композиции;
(g). гексамер гомодимерной фракции составляет от приблизительно 10% до приблизительно 14% от всей фракции;
(h). фракция, содержащая мультимеры от димера гомодимера до гексамера гомодимера, составляет от приблизительно 40% до приблизительно 60% от всей композиции;
(i). фракция, содержащая мультимеры от тримера гомодимера до гексамера гомодимера, составляет от приблизительно 32% до приблизительно 50% от всей композиции;
(j). фракция, содержащая мультимеры от тетрамера гомодимера до гексамера гомодимера, составляет от приблизительно 26% до приблизительно 39% от всей композиции;
(k) фракция, содержащая мультимеры от пентамера гомодимера до гексамера гомодимера, составляет от приблизительно 18% до приблизительно 23% от всей композиции; или
(l) присутствует любая комбинация (a)-(k).
[0029] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена композиция GL-2045, полученная рекомбинантными способами, в которой приблизительно 80% от всей композиции составляют мультимеры более высокого порядка, это означает димер гомодимера и выше (т.е. полоса 2 и выше). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения приблизительно 60-80% всей композиции GL-2045, полученной рекомбинантными способами, составляет тример гомодимера и выше (т.е. полоса 3 и выше). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения приблизительно 54-72% от всей композиции GL-2045, полученной рекомбинантными способами, составляет тетрамер и выше (т.е. полоса 4 и выше). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен GL-2045, в котором приблизительно 44-57% от всей композиции составляет пентамер и выше (т.е. полоса 5 и выше). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения приблизительно 38-51% от всей композиции GL-2045, полученной рекомбинантными способами, составляет гексамер и выше (т.е. полоса 6 и выше).
[0030] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен GL-2045, полученный рекомбинантными способами, причем полосы 2-6 композиции (т.е. фракция, содержащая мультимеры от димера гомодимера до гексамера гомодимера) составляют приблизительно 39-61% композиции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен GL-2045, полученный рекомбинантными способами, причем полосы 3-6 композиции (т.е. фракция, содержащая мультимеры от тримера гомодимера до гексамера гомодимера) составляют приблизительно 32-50% композиции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен GL-2045, полученный рекомбинантными способами, причем полосы 4-6 композиции (т.е. фракция, содержащая мультимеры от тетрамера гомодимера до гексамера гомодимера) составляют приблизительно 26-39% композиции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен GL-2045, полученный рекомбинантными способами, причем полосы 5-6 композиции (т.е. фракция, содержащая мультимеры от пентамера гомодимера до гексамера гомодимера) составляют приблизительно 16-23% композиции.
Краткое описание чертежей
[0031] ФИГ. 1A-ФИГ. 1B иллюстрируют фракционирование GL-2045 методом эксклюзионной хроматографии (ФИГ. 1A) и исследование полученных фракций методом гель-электрофореза в невосстанавливающих условиях (ФИГ. 1B).
[0032] ФИГ. 2 иллюстрирует исследование фракций GL-2045 методом интерферометрии биослоев.
[0033] ФИГ. 3A-ФИГ. 3B иллюстрируют результаты исследования GL-2045 методом гель-электрофореза (ФИГ. 3A) и фракционирования методом эксклюзионной хроматографии (ФИГ. 3B).
[0034] ФИГ. 4A-ФИГ. 4D иллюстрируют эффекты фракций GL-2045 в количественном исследовании комплементзависимого лизиса клеток.
[0035] ФИГ. 5A-ФИГ. 5C иллюстрируют хроматограмму элюирования (ФИГ. 5A) и результаты электрофореза в ДСН-ПААГ GL-2045 для применения в количественном исследовании связывания FcγRIIIa (ФИГ. 5В и 5С).
[0036] ФИГ. 6A-ФИГ. 6B иллюстрируют связывание элюированных фракций, показанных на ФИГ. 5, с FcγRIIIa (ФИГ. 6A) и кривую наилучшей аппроксимации (ФИГ. 6C).
[0037] ФИГ. 7 иллюстрирует результаты исследования анионообменных фракций методом электрофореза в ДСН-ПААГ: GL-GLM-01=рекомбинантная нефракционированная область Fc (G001), GL-GLM-02=нефракционированный GL-2045, GL-GLM-05=фракционированный GL-2045 при pH=6,0, GL-GLM-06=фракционированный GL-2045 при рН=6,5, GL-GLM-07=фракционированный GL-2045 при рН=7,0, GL-GLM-08=фракционированный GL-2045 при рН=7,5.
[0038] ФИГ. 8 иллюстрирует результаты количественного исследования хемотаксиса нейтрофилов с C5a в качестве хемоаттрактанта в присутствии нефракционированного или фракционированного GL-2045: GL-GLM-01=рекомбинантная, нефракционированная область Fc (G001), GL-GLM-02=нефракционированный GL-2045, GL-GLM-05=фракционированный GL-2045 при pH=6,0, GL-GLM-06=фракционированный GL-2045 при pH=6,5, GL-GLM-07=фракционированный GL-2045 при pH=7,0, GL-GLM-08=фракционированный GL-2045 при рН=7,5.
[0039] ФИГ. 9 иллюстрирует плотность (в миллионах/мл) клеток СНО, выращенных на панели разных сред, на 4, 8 и 10 дни культивирования.
[0040] ФИГ. 10 иллюстрирует жизнеспособность (%) клеток СНО, выращенных на панели разных сред, на 4, 8 и 10 дни культивирования.
[0041] ФИГ. 11 иллюстрирует титр белка (мг/мл) клеток СНО, выращенных на панели разных сред, на 10 день культивирования.
[0042] ФИГ. 12А-ФИГ. 12B иллюстрируют результаты исследования методом электрофореза белка GL-2045, полученного из клеток линии CHO, выращенных на панели сред, проиллюстрированных на ФИГ. 9-11.
[0043] ФИГ. 13А-ФИГ. 13B иллюстрируют графики подачи добавок к питательным средам PowerCHO3 CD, ADCF-Mab Hyclone и ActiCHO P (ФИГ. 13A), а также графики подачи для питательных сред Cellvento, BalanCD CHO Growth A, CD FortiCHO Life и CD4MCHO Hyclone (ФИГ. 13B).
6
[0044] ФИГ. 14 иллюстрирует плотность (×10 клеток/мл) клеток СНО, выращенных на панели из комбинаций разных сред + добавка к питательной среде, на 0-11 дни культивирования.
[0045] ФИГ. 15 иллюстрирует жизнеспособность (%) клеток СНО, выращенных на панели из комбинаций разных сред + добавка к питательной среде, на 0-11 дни культивирования.
[0046] ФИГ. 16 иллюстрирует титр белка (мг/мл) GL-2045 из клеток СНО, выращенных на панели комбинаций различных сред + добавка к питательной среде, на 0-11 дни культивирования.
[0047] ФИГ. 17 иллюстрирует результаты исследования методом электрофореза в ДСН-ПААГ эффектов комбинаций среды + добавка к питательной среде и графики, проиллюстрированные на ФИГ. 13А-13В, в отношении мультимеризации GL-2045.
[0048] ФИГ. 18А-ФИГ. 18D иллюстрируют эффекты сред ActiCHO-P + ежедневное внесение добавки к питательной среде (красный) и сред ActiCHO-P + внесение добавки к питательной среде через день (синий) на плотность клеток (ФИГ. 18A), жизнеспособность клеток (ФИГ. 18B), рН культуры (ФИГ. 18C) и титр белка GL-2045 (ФИГ. 18D).
[0049] ФИГ. 19 иллюстрирует влияние сред ActiCHO-P + ежедневное внесение добавки к питательной среде (красный) и сред ActiCHO-P + внесение добавки к питательной среде каждые 3 дня (синий) на титры белка GL-2045.
[0050] ФИГ. 20А-ФИГ. 20B иллюстрируют эффекты комбинирования ActiCHO Feed A с основными средами PowerCHO2 (красный) на жизнеспособность клеток (ФИГ. 20A) и титр белка GL-2045 (ФИГ. 20B) по сравнению с применением ActiCHO Feed A с основными средами ActiCHO-P (синий).
[0051] ФИГ. 21А-ФИГ. 21C иллюстрируют эффекты оптимизированных условий во встряхиваемой колбе на плотность клеток (ФИГ. 21A), жизнеспособность клеток (ФИГ. 21B) и титр белка GL-2045 (ФИГ. 21C).
[0052] ФИГ. 22 иллюстрирует результаты исследования GL-2045, очищенного на белке A, методом электрофореза в ДСН-ПААГ.
[0053] ФИГ. 23А-ФИГ. 23B иллюстрируют профиль элюирования из колонки с белком A после элюирования GL-2045 градиентом pH (ФИГ. 23A) и результаты исследования выделенных фракций методом электрофореза в ДСН-ПААГ (ФИГ. 23B).
[0054] ФИГ. 24 иллюстрирует хроматограмму элюирования и результаты исследования методом электрофореза в ДСН-ПААГ в невосстанавливающих условиях.
[0055] ФИГ. 25 иллюстрирует хроматограмму элюирования и результаты исследования методом электрофореза в ДСН-ПААГ в невосстанавливающих условиях.
[0056] ФИГ. 26 иллюстрирует хроматограмму элюирования цикла С1-С3.
[0057] ФИГ. 27 иллюстрирует результаты исследования пиков элюции 38-39% из цикла С1-С3 методом электрофореза в ДСН-ПААГ в невосстанавливающих условиях.
[0058] ФИГ. 28 иллюстрирует результаты денситометрического анализа GL-2045, очищенного методом ионной хроматографии.
[0059] ФИГ. 29А-ФИГ. 29B иллюстрируют профили элюирования из колонок для HIC (верхние панели) и результаты исследования элюатов и проточных фракций (FT) методом электрофореза в ДСН-ПААГ (нижние панели).
[0060] ФИГ. 30 иллюстрирует профиль элюирования при заключительной очистке M045 на колонке для HIC (правая панель) и результаты электрофореза на гелях NuPAGE™ (правая панель).
[0061] ФИГ. 31 иллюстрирует профиль элюирования при заключительной очистке M045 на колонке для HIC.
[0062] ФИГ. 32 иллюстрирует профиль элюирования при заключительной очистке M045 на колонке для HIC и результаты исследования методом электрофореза в ДСН-ПААГ.
[0063] ФИГ. 33 иллюстрирует установленный мультимерный профиль оптимально изготовленной композиции GL-2045.
Подробное описание изобретения
[0064] Подход к получению оптимизированного рекомбинантного GL-2045, описанный в настоящем документе, включает оптимизированные начальные способы изготовления, которые приводят к повышенной мультимеризации GL-2045 при оптимизации жизнеспособности клеток и титра белка. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения оптимизированное состояние придают лекарственному веществу за счет оптимизированных последующих способов изготовления. Кроме того, настоящее изобретение относится к композициям, содержащим GL-2045 с определенным мультимерным профилем. Композиции согласно настоящему изобретению можно применять для лечения аутоиммунного заболевания, воспалительного заболевания, аллергии, опосредуемого антителами заболевания и опосредуемого комплементом заболевания.
[0065] В настоящем документе термин «лекарственное вещество» относится к готовой лекарственной форме GL-2045, продаваемой производителем.
[0066] В настоящем документе термин, обозначающий элемент в единственном числе (соотв. «а» или «an» в исходном тексте на английском языке), при использовании в сочетании с термином «содержащий» в формуле изобретения и/или описании, может означать «один», но также согласуется со значением «один или более», «по меньшей мере один» и «один или более чем один».
[0067] В настоящем документе термины «биомиметик», «биомиметическая молекула», «биомиметическое соединение» и родственные термины относятся к соединению, созданному человеком, которое имитирует функцию другого соединения, такого как объединенный внутривенный иммуноглобулин человека («чВВИГ»), моноклональное антитело или фрагмент Fc антитела. «Биологически активные» биомиметики представляют собой соединения, которые обладают видами биологической активности, которые аналогичны или сходны с таковыми у природных аналогов. Под «природной» подразумевается молекула или ее часть, которая обычно обнаруживается в организме. Под «природный» также подразумевается по существу природный. «Иммунологически активные» биомиметики представляют собой биомиметики, которые проявляют иммунологическую активность, которая аналогична или сходна с таковой у природных иммунологически активных молекул, таких как антитела, цитокины, интерлейкины и другие иммунологические молекулы, известные в данной области техники. Согласно предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения биомиметики согласно настоящему изобретению представляют собой оптимизированные мультимеризованные страдомеры, определенные в настоящем документе (например, оптимально изготовленный GL-2045).
[0068] Под «непосредственно соединенный» подразумевают две последовательности, соединенные друг с другом без промежуточных или посторонних последовательностей, например, аминокислотные последовательности, полученные путем вставки сайтов распознавания ферментов рестрикции в ДНК или клонируемые фрагменты. Обычный специалист в данной области техники поймет, что «непосредственно соединенный» включает добавление или удаление аминокислот, при условии, что способность к мультимеризации по существу не изменяется.
[0069] Под «гомологичный» подразумевают идентичность всей последовательности конкретной нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности. Например, «80% гомологичность» означает, что конкретная последовательность имеет приблизительно 80% идентичность с заявленной последовательностью и может включать вставки, делеции, замены и сдвиги рамки считывания. Обычный специалист в данной области техники поймет, что для учета вставок и делеций для определения идентичности по всей длине последовательности можно осуществлять выравнивания последовательностей.
[0070] Было описано, что чВВИГ связывается и полностью насыщает неонатальный рецептор Fc (FcRn) и что такое конкурентное ингибирование FcRn может играть важную роль в биологической активности чВВИГ (например, F. Jin et al., Human Immunology, 2005, 66(4)403-410). Поскольку иммуноглобулины, которые прочно связываются с рецепторами Fcγ, также связываются по меньшей мере в некоторой степени с FcRn, специалист в данной области техники поймет, что страдомеры, способные связываться с более чем одним рецептором Fcγ, также будут связываться с FcRn и могут полностью насыщать его.
[0071] У человека существуют две полиморфные формы IgG1, называемые полиморфные формы DEL и EEM. Полиморфная форма DEL содержит D в положении 356 и L в положении 358; полиморфная форма EEM содержит E в положении 356 и M в положении 358 (нумерация по Kabat, SEQ ID NO: 2 и 3, полиморфные формы EEM и DEL, соответственно). Страдомеры согласно настоящему изобретению могут содержать как полиморфную форму DEL, так и EEM IgG1. Соответственно, даже если предложение для конкретного мутанта явно относится к полиморфизму DEL, специалист в данной области техники поймет, что те же самые мутации могут быть внесены в полиморфную форму EEM для получения аналогичных результатов.
[0072] В US 2010/0239633 раскрыто применение соединенного домена Fc иммуноглобулина для создания биомиметиков чВВИГ на основе упорядоченного мультимеризованного Fc иммуноглобулина (биологически активные упорядоченные мультимеры, известные как страдомеры), которые содержат короткие последовательности, включая сайты рестрикции и аффинные метки между отдельными компонентами страдомера, для лечения патологических состояний, включая аутоиммунные заболевания и другие воспалительные состояния. См. US 2010/0239633, который включен в настоящий документ посредством ссылки. В US 2013/0156765 раскрыты страдомеры, в которых отдельные компоненты соединены непосредственно, а не разделены сайтами рестрикции или аффинными метками. В US 2013/0156765 также конкретно раскрыт мультимеризующийся страдомер (GL-2045), содержащий домен Fc IgG1 с доменом мультимеризации шарнира IgG2, непосредственно соединенным с его С-концом, который проявляет повышенную мультимеризацию и связывание комплемента в сравнении с N-соединенной конструкцией (например, GL-2019, описанный в US 2010/0239633). См. US 2013/0156765, полностью включенный посредством ссылки. GL-2045 имеет следующую структуру: шарнир IgG1 - CH2 IgG1 CH3 IgG1 - шарнир IgG2, и GL-2045 представлен как SEQ ID NO: 4 и 5 (полиморфные формы EEM и DEL, соответственно).
Мономер страдомерного блока
[0073] В настоящем документе термин «мономер страдомерного блока» относится к отдельной непрерывной пептидной молекуле, которая при связывании с по меньшей мере вторым мономером страдомерного блока образует гомодимерный «страдомерный блок», содержащий по меньшей мере один домен Fc, и, в случае GL-2045, домен мультимеризации шарнира IgG2. Согласно предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения страдомерные блоки GL-2045 состоят из двух связанных мономеров страдомерного блока. Однако страдомер GL-2045 также может содержать три или более мономеров страдомерного блока.
[0074] Оптимально изготовленный страдомер согласно настоящему изобретению, (оптимально изготовленный GL-2045) содержит непосредственную связь между N-концом мономера Fc IgG1 и С-концом лидерного пептида (SEQ ID NO: 1) и С-концом Fc IgG1 и N-концом домена мультимеризации шарнира IgG2 (SEQ ID NO: 6).
[0075] В качестве разъясняющего примера, специалист в данной области техники поймет, что оптимально изготовленные молекулы страдомеров согласно настоящему изобретению могут быть сконструированы путем получения полинуклеотидной молекулы, которая кодирует мономер домена Fc и область мультимеризации. Такая полинуклеотидная молекула может быть вставлена в вектор экспрессии, который можно применять для трансформации популяции бактерий или трансфекции популяции клеток млекопитающих. Мономеры страдомерных блоков затем могут быть получены путем культивирования трансформированных бактерий или трансфицированных клеток млекопитающих при соответствующих условиях культивирования. Например, клональная клеточная линия, продолжающая пул стабильно трансфицированных клеток, может быть получена путем отбора клеток с применением генетецина/G418. Согласно другому варианту клетки могут быть кратковременно трансфицированы ДНК, кодирующей оптимально изготовленный страдомер согласно настоящему изобретению (например, ДНК, кодирующей страдомер в соответствии с SEQ ID NO: 4 или 5), под контролем промотора ЦМВ. Экспрессированные мономеры страдомерных блоков затем могут образовывать функциональные страдомерные блоки и страдомеры как при самоагрегации мономеров или блоков страдомеров, так и при ассоциации мономеров страдомеров с использованием связей между страдомерами. Экспрессированные страдомеры затем могут быть очищены от среды для культивирования клеток с помощью начальных способов изготовления, описанных в настоящем документе (например, аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии и/или хроматографии гидрофобного взаимодействия). Специалист в данной области техники поймет, что лидерный пептид, включенный в конструкцию нуклеиновой кислоты, используется только для того чтобы облегчить получение пептидов мономеров страдомерных блоков и отщепляется при экспрессии зрелого белка. Соответственно, биологически активные биомиметики согласно настоящему изобретению не содержат лидерный пептид.
Кластерный страдомер
[0076] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения оптимально изготовленный GL-2045, полученный в соответствии с настоящим раскрытием, представляет собой кластерный страдомер. «Кластерный страдомер» представляет собой биомиметик, который имеет радиальную форму с центральным фрагментом «головки» и двумя или более «ножками», причем каждая ножка содержит один или более доменов Fc, которые способны связывать по меньшей мере один рецептор Fc-гамма и/или комплемент. Кластерный страдомер также известен как «мультимеризующийся страдомер» благодаря присутствию домена мультимеризации, который приводит к мультимеризации страдомера. Соответственно, серийные страдомеры, которые содержат множество доменов Fc на одной молекуле мономера страдомера, все еще могут быть классифицированы как кластерный страдомер или мультимеризующийся страдомер, при условии, что молекула также содержит по меньшей мере один домен мультимеризации. Каждый кластерный страдомер состоит из более чем одного гомодимерного белка, каждый из которых называется «блок кластерного страдомера». Каждый блок кластерного страдомера состоит из по меньшей мере одной области, которая мультимеризуется, и области «ножки», которая содержит по меньшей мере один функциональный домен Fc. Область мультимеризации создает «головку» кластерного страдомера при мультимеризации с другим блоком кластерного страдомера. Область ножки может быть способна связывать столько же молекул комплемента, сколько содержится доменов Fc в каждой области ножки. Например, область ножки может связывать столько же молекул C1q, сколько содержится доменов Fc в каждой области ножки. Соответственно, кластерный страдомер представляет собой биомиметическое соединение, способное связывать две или более молекул C1q, что предотвращает опосредуемый комплементом лизис, также известный как комплементзависимая цитотоксичность (КЗЦ).
[0077] Область мультимеризации, содержащаяся в оптимально изготовленном страдомере согласно настоящему изобретению, представляет собой шарнирную область IgG2. Как известно в данной области техники, шарнирная область IgG2 человека может образовывать ковалентные димеры (Yoo, E.M. et al. J. Immunol. 170, 3134-3138 (2003); Salfeld Nature Biotech. 25, 1369-1372 (2007)). Образование димера IgG2 потенциально опосредуется шарнирной структурой IgG2 за счет связей C-C (Yoo et al 2003), это свидетельствует о том, что шарнирная структура по отдельности может опосредовать образование димера. Однако количество димеров IgG2, обнаруженных в сыворотке крови человека, ограничено. По оценкам количество IgG2, существующего в виде димера гомодимера, составляет менее 10% от общего IgG2 (Yoo et al. 2003). Кроме того, отсутствуют количественные доказательства мультимеризации IgG2, за исключением димера гомодимера. (Yoo et al. 2003). То есть не было обнаружено, что нативный IgG2 образует мультимеры более высокого порядка в сыворотке человека. Страдомеры, содержащие шарнир IgG2 (например, оптимально изготовленный GL-2045), присутствуют в виде мультимеров более высокого порядка и, в отличие от нативного IgG2 в сыворотке крови человека, в котором взаимодействия шарнира IgG2 являются изменчивыми и динамическими, было продемонстрировано, что GL-2045 образует высокостабильные мультимеры, о чем свидетельствуют результаты исследования методом электрофореза в ДСН-ПААГ в невосстанавливающих условиях, аналитического ультрацентрифугирования и 3-месячных исследований стабильности при 100% влажности и 37°C. Кроме того, неожиданным фактом явилось то, что количество мультимеров в препаратах страдомеров, содержащих шарнир IgG2, значительно выше, чем приблизительно 10% димеров и отсутствие мультимеров, которое наблюдали для IgG2 в сыворотке крови человека. Например, процентное содержание страдомеров, которые являются мультимерами, включая димеры, тримеры, тетрамеры и мультимеры гомодимера более высокого порядка, превышает 20% и может превышать 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или даже 90%. Согласно особенно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения процентное содержание GL-2045, присутствующего в виде гомодимера, составляет от 10 до 20%, и соответствующее процентное содержание GL-2045, присутствующего в виде высокоупорядоченных мультимеров гомодимера, составляет более 70%.
[0078] Аминокислотная последовательность GL-2045 описана в SEQ ID NO: 4 и 5.
[0079] В настоящем документе термин «выделенный» полипептид или пептид относится к полипептиду или пептиду, который либо не имеет природного аналога, либо был отделен или очищен от компонентов, которые сопровождают его в природе, например, в тканях, таких как поджелудочная железа, печень, селезенка, яичник, яичко, мышца, суставная ткань, нервная ткань, ткань желудочно-кишечного тракта или ткань молочной железы или опухолевая ткань (например, ткань рака молочной железы), или в жидкостях организма, таких как кровь, сыворотка или моча. Как правило, полипептид или пептид считается «выделенным», если он по меньшей мере на 70% по массе сухого вещества не содержит белки и другие природные органические молекулы, с которыми он связан естественным образом. Предпочтительно полипептид (или пептид) согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% по массе сухого вещества полипептида (пептида) согласно настоящему изобретению. Поскольку полипептид или пептид, который синтезирован химически, исходно отделен от компонентов, которые сопровождают его естественным образом, синтетический полипептид или пептид является «выделенным».
[0080] Выделенный полипептид (или пептид) согласно настоящему изобретению может быть получен, например, путем экспрессии рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид или пептид, или с помощью химического синтеза. Полипептид или пептид, который вырабатывается в клеточной системе, отличной от источника, из которого он происходит естественным образом, является «выделенным», поскольку он обязательно не будет содержать компоненты, которые его сопровождают естественным образом. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения выделенный полипептид согласно настоящему изобретению содержит только последовательности, соответствующие мономеру Fc IgG1 и домену мультимеризации шарнира IgG2 (SEQ ID NO: 6), и не содержит другие последовательности, которые могут облегчить клонирование или очистку белка (например, введенные сайты распознавания ферментов рестрикции или метки для очистки). Степень выделения или чистота может быть измерена любым подходящим способом, например, с помощью колоночной хроматографии, электрофореза в полиакриламидном геле или ВЭЖХ.
Способы изготовления
[0081] GL-2045 образует упорядоченные мультимеры гомодимера и активен в виде гомодимерной фракции и всех мультимерных фракций. Для функции GL-2045 крайне важно, чтобы способы изготовления приводили к оптимизированному мультимерному профилю. В настоящем документе термин «оптимизированный мультимерный профиль» или «оптимизированный профиль мультимеризации» относится к комбинации гомодимеров и высокоупорядоченных мультимеров GL-2045, что приводит к желательному биологическому результату для GL-2045 в качестве миметика ВВИГ (например, повышенному связыванию с C1q с начальной активацией системы комплемента и/или последующим ингибированием активации комплемента и предотвращением КЗЦ, например, безотносительно к какой-либо теории, на уровне C3/C3b). Специалист в данной области техники поймет, что выделение различных мультимерных фракций из оптимально изготовленного GL-2045 в виде отдельного продукта, как по отдельности, так и в комбинации с другими элементами, в том числе для других терапевтических целей, может обеспечить преимущества. Например, как показано в примерах, фракции более крупных мультимеров GL-2045 более активны, чем фракции более мелких мультимеров при связывании с C1q и модулировании последующей эффекторной функции, опосредуемой комплементом, а также при связывании низкоаффинных FcγR. Соответственно, способы согласно настоящему изобретению направлены не только на композиции GL-2045, имеющие оптимизированный мультимерный профиль, но также на композиции GL-2045, содержащие только отобранные мультимеры, исходя из желательной эффекторной функции. Согласно таким вариантам реализации настоящего изобретения оптимизированный мультимерный профиль GL-2045, который приводит к одному желательному биологическому результату, может отличаться от оптимизированного мультимерного профиля, который приводит к другому желательному биологическому результату.
[0082] Безотносительно к какой-либо теории, полагают, что гомодимер служит в качестве буфера рецептора и лиганда, сходно с неагрегированным IgG1. Мультимеры более высокого порядка связываются с повышающейся авидностью с низкоаффинными рецепторами Fcγ и факторами комплемента (например, C1q, который является гексамерным) и, как описано в настоящем документе, демонстрируют повышенную биологическую эффективность по сравнению с гомодимерами или мультимерами более низкого порядка (например, димерами, тримерами и/или тетрамерами гомодимера GL-2045). Соответственно, степень мультимеризации является важнейшим фактором начальных и последующих способов изготовления, который необходимо учитывать при получении клинически эффективного GL-2045. Соответственно, желательно не только поддерживать оптимальную жизнеспособность клеток, высокий титр белка и оптимальные профили мультимеризации GL-2045 с помощью оптимизированных начальных способов изготовления, но также поддерживать и/или улучшать оптимальные профили мультимеризации GL-2045 с помощью оптимизированных последующих способов изготовления.
[0083] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения оптимизированные способы изготовления, описанные в настоящем документе, позволяют получать композицию белка GL-2045, в которой по меньшей мере 70% или по меньшей мере 80% GL-2045 присутствует в виде негомодимеров (например, димеров гомодимера, тримеров гомодимера и т.д.). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения более 70% или более 80% GL-2045 присутствует в виде негомодимеров. Например, оптимизированные способы изготовления могут привести к получению композиции белка GL-2045, в которой 80%, 85%, 90%, 95% или более GL-2045 присутствует в виде негомодимеров. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения белковая композиция содержит по меньшей мере 28% или по меньшей мере 30% GL-2045, присутствующего в виде мультимеров высшего порядка (т.е. 7-членных мультимеров гомодимера и выше). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения белковая композиция содержит не более 35% GL-2045, присутствующего в виде мультимеров высшего порядка. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения белковая композиция содержит по меньшей мере приблизительно 35% GL-2045, присутствующего в виде тетрамеров, пентамеров, гексамеров и 7-членных мультимеров (т.е. по меньшей мере 35% от всей композиции GL-2045 состоит из фракций 4-6). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере приблизительно 35% GL-2045 присутствует в виде тримеров гомодимера и выше (т.е. по меньшей мере 35% от всей композиции GL-2045 составляет фракция 3 и выше). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере приблизительно 35% GL-2045 присутствует в виде тримеров, тетрамеров, пентамеров или гексамеров гомодимера (т.е. по меньшей мере 35% от всей композиции GL-2045 составляет фракция 3-6). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере приблизительно 35% GL-2045 присутствует в виде тетрамеров гомодимера и выше (т.е. по меньшей мере 35% от всей композиции GL-2045 составляет фракция 4 и выше). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере приблизительно 35% GL-2045 присутствует в виде тетрамеров и пентамеров гомодимера (т.е. по меньшей мере 35% от всей композиции GL-2045 составляют фракции 4 и 5). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере приблизительно 35% GL-2045 присутствует в виде пентамеров гомодимера и выше (т.е. по меньшей мере 35% от всей композиции GL-2045 составляет фракция 5 и выше). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере приблизительно 35% GL-2045 присутствует в виде пентамеров и гексамеров гомодимера (т.е. по меньшей мере 35% от всей композиции GL-2045 составляют фракции 5 и 6). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере приблизительно 35% GL-2045 присутствует в виде гексамеров гомодимера и выше (т.е. по меньшей мере 35% от всей композиции GL-2045 составляет фракция 6 и выше). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере приблизительно 35% GL-2045 присутствует в виде 7-членного мультимера гомодимера и выше (т.е. по меньшей мере 35% от всей композиции GL-2045 составляет фракция 7 и выше). Например, оптимизированные способы изготовления, описанные в настоящем документе, могут привести к получению композиции белка GL-2045, в которой 40%, 45%, 50%, 55% или более GL-2045 присутствует в виде пентамеров гомодимера и выше. Современные способы изготовления Fc-содержащих терапевтических средств (например, моноклональных антител) были сосредоточены на увеличении титра белка и выхода за счет последующих этапов фильтрации. Эти способы обычно не учитывают влияние способа изготовления на мультимеризацию Fc-содержащего белка и, что существенно отличается от способов, описанных в настоящем документе, направлены на сведение к минимуму агрегации и мультимеризации белка. Удивительным фактом является то, что условия культивирования, которые приводят к самым высоким значениям выхода белка GL-2045, не обязательно приводят к наивысшему проценту GL-2045, присутствующего в виде мультимеров. Соответственно, данные, описанные в настоящем документе, демонстрируют, что производственные переменные, которые влияют на общий титр белка, по меньшей мере частично, независимы от переменных, влияющих на профили мультимеризации. Следовательно, специалист в данной области техники не сможет предсказать, основываясь на современном уровне техники, какие начальные условия изготовления будут влиять на мультимеризацию GL-2045.
[0084] Например, общепринятые протоколы для получения рекомбинантного белка с применением линии клеток яичника китайского хомяка (CHO) обеспечивают изменение температуры с 37°C до 31°C на определенный день культивирования (Ouguchi et al, Cytotechnology, 52(3), pp. 199-207, (2006); Masterson and Smales, Pharmaceutical Bioprocessing, 2(1), pp. 49-61, (2014)). Однако авторы настоящего изобретения обнаружили, что, в отличие от того, что было описано в Ouguchi, et al., изменение температуры с 37°C до 32,5°C приводило к поддержанию плотности клеток и высокой жизнеспособности клеток при оптимизации титра белка. Авторы настоящего изобретения также обнаружили, что изменение температуры на основании плотности клеток, а не на определенный день культивирования, как описано ранее, приводило к повышению титров белка GL-2045 почти до 10 г/л.
[0085] Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что поддержание оптимизированного профиля мультимеризации, являющегося результатом оптимизированных начальных способов изготовления, частично основано на оптимизированных последующих способах изготовления (таких как аффинная хроматография и/или ионообменная хроматография). Методики фильтрации и очистки моноклональных антител (МАТ) и гибридных белков Fc широко описаны и повсеместно используются. Однако при применении в отношении GL-2045 эти методики приводят к непредсказуемым модификациям профиля мультимеризации GL-2045. Например, авторы настоящего изобретения обнаружили неожиданный факт, что большинство колонок с белком A не подходят для очистки GL-2045, несмотря на их обычное применение при очистке МАТ и гибридных белков Fc, как продемонстрировано в примере 8. Белок A является чрезвычайно дорогим реагентом, стоимость которого исчисляется миллионами долларов при применении в соответствии с требованиями Надлежащей производственной практики (GMP) для очистки одного лекарственного препарата и требует повторного использования не менее 100 и более раз, чтобы обеспечить экономическую целесообразность. Сходно с МАТ и гибридными белками Fc, GL-2045 связывает белок A; однако, в отличие от МАТ и гибридных белков Fc, GL-2045 не полностью диссоциирует от белка A во время нормальных этапов элюирования из-за авидного связывания GL-2045 с белком A. Авторы настоящего изобретения обнаружили неожиданный факт, что применение колонок с белком A для очистки GL-2045, при которой поддерживается оптимальный профиль мультимеризации, требует более частого графика очистки колонки.
[0086] Авторы настоящего изобретения также обнаружили, что процедуры очистки колонки с белком A на месте (CIP), обычно используемые в данной области техники, неожиданно приводят к изменению профиля мультимеризации GL-2045. Обычные процедуры CIP влекут за собой очистку колонки в конце цикла очистки, что может включать многочисленные циклы прохождения супернатанта белка через колонку. Однако авторы настоящего изобретения обнаружили, что высокая авидность GL-2045 приводит к отсутствию диссоциации GL-2045 от белка A. Следовательно, сайты связывания белка A остаются занятыми, что предотвращает связывание GL-2045 в последующих циклах и приводит к потере гомодимера. Соответственно, в отличие от протоколов, используемых с МАТ или гибридным белком Fc, авторы настоящего изобретения обнаружили неожиданный факт, что в случае GL-2045 очистка на месте колонок с белком A должна проводиться чаще, чем в случае моноклонального антитела или гибридного белка Fc, и с очень жестким буфером для регенерации, таким как 0,5 М NaOH.
[0087] Градиенты рН для элюирования обычно применяют с колонками с белком A для оптимизации выхода белка во время очистки. Авторы настоящего изобретения обнаружили неожиданный факт, что градиенты pH для элюирования, используемые в данной области техники для оптимизации выхода моноклональных антител или гибридных белков Fc из колонки с белком A, могут вызывать нежелательную потерю гомодимера или мультимерных компонентов GL-2045 более высокого порядка, что изменяет профиль мультимеризации GL-2045 (продемонстрировано в примере 10). Соответственно, авторы настоящего изобретения также определили способ применения методики градиентного элюирования, чтобы оптимизировать комбинацию выхода и мультимеризации GL-2045. Помимо этого авторы настоящего изобретения обнаружили неожиданный факт, что градиент рН для элюирования можно применять на колонке с белком A для новой цели, а именно для отделения самых больших, высокоупорядоченных мультимеров GL-2045 от агрегатов гомодимеров (как показано в примере 11).
[0088] Авторы настоящего изобретения также обнаружили, что при применении ионообменных колонок, обычно используемых в данной области техники для очистки моноклональных антител и гибридных белков Fc, таких как анионный обмен и катионный обмен, изменения pH и/или соли могут изменять профиль мультимеризации GL-2045, как продемонстрировано в примере 12. Это существенно отличается от ситуации с моноклональным антителом или гибридным белком Fc, когда изменения соли или pH могут привести к потере небольшого количества белка, но не вызвать изменения композиции лекарственного препарата. Помимо этого авторы настоящего изобретения обнаружили неожиданный факт, что корректировки соли и/или pH можно применять для новой цели, чтобы отделить самые большие высокоупорядоченные мультимеры GL-2045 от агрегатов гомодимера, которые могут иметь сходную молекулярную массу. Как показано в примере 13, авторы настоящего изобретения применяют функциональное количественное исследование, чтобы доказать, что удаление неупорядоченных агрегатов из мультимерных фракций высшего порядка связано с более высокой эффективностью и более высокоочищенным продуктом GL-2045.
[0089] Колонки для хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC) обычно используют в данной области техники для очистки моноклональных антител и гибридных белков Fc с помощью различных механизмов, включая захват с высоким выходом, заключительную очистку моноклональных антител, удаление усеченных молекул из полноразмерных форм, отделение активных форм от неактивных форм и очистку от вирусов. Однако применительно к GL-2045 авторы настоящего изобретения обнаружили, что стандартные колонки для HIC имеют не поддающиеся прогнозированию свойства. Как показано в примере 14, 7 колонок для HIC, содержащих разные матриксы, ассоциированы с сильно различающимися показателями захвата, варьирующимися от 16% до 62%, несмотря на применение одного и того же супернатанта и одного и того же буфера во всех колонках.
[0090] Кроме того, авторы настоящего изобретения предсказывают, что изменения в буфере могут изменить профиль мультимеризации GL-2045. Это существенно отличается от ситуации с моноклональным антителом или гибридным белком Fc, где изменения в буфере могут привести к потере небольшого количества белка или менее тщательной заключительной очистке, но без изменения основной композиции лекарственного препарата.
[0091] Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что, поскольку гомодимер GL-2045 состоит из Fc IgG1 и мультимеризующегося домена, который вызывает образование высокоупорядоченных мультимеров, GL-2045 авидно связывается со всеми или почти всеми многими лигандами и мишенями, которые неавидно связываются с нативным гомодимером Fc IgG1. Это включает, что не является неожиданным, все низкоаффинные рецепторы Fc и компонент комплемента C1q, а также белок A и белок G, обычно используемые в колонках для очистки. Однако такое авидное связывание также приводит к менее желательному связыванию с потенциальной мишенью, например, эндотоксином. По этой причине авторы настоящего изобретения определили, что желательным является многоэтапный способ очистки, включающий очистку GL-2045 с помощью белка A и заключительную очистку GL-2045, очищенного с помощью белка A, с применением по меньшей мере одного или более из катионообменной хроматографии, анионообменной хроматографии в проточном режиме и хроматографии гидрофобного взаимодействия. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения желательным является четырехэтапный способ очистки, включающий очистку GL-2045 с помощью белка A и заключительную очистку GL-2045, очищенного с помощью белка A, с применением всех трех из катионообменной хроматографии в режиме связывания, анионного обмена в проточном режиме и колонок для хроматографии гидрофобного взаимодействия как в режиме связывания, так и в проточном режиме. Этот четырехэтапный способ очистки описан в примере 15. Специалист в данной области техники легко поймет, что дополнительные этапы фильтрации, включая этапы глубинной фильтрации и ультрафильтрации, могут быть добавлены в любой временной точке, до, во время или после способа, описанного в примере 15, для дополнительной очистки композиции GL-2045.
Начальные способы изготовления
2
[0092] В общих чертах начальные способы изготовления представляют собой способы, при которых биологические материалы инокулируют и выращивают в культуре в контролируемых условиях для изготовления определенных типов биологических белковых продуктов (например, GL-2045). В настоящем документе термин «начальные способы изготовления» конкретно относится к способам рекомбинантного получения белка без ссылки на последующие этапы очистки и фильтрации, которые обычно классифицируют как последующие способы изготовления. Начальные способы изготовления с исправлениями или изменениями, нацеленными на оптимизацию конкретных характеристик белка (например, эффективности мультимеризации), называются в настоящем документе «оптимизированные начальные способы изготовления». Некоторые аспекты начальных способов изготовления белков могут быть оптимизированы (например, изменены или исправлены для достижения желательного результата), чтобы получить готовый белковый продукт с конкретными характеристиками. Аспекты начальных способов получения рекомбинантного белка, которые могут быть оптимизированы, могут включать, но не ограничиваются указанными, композицию вектора экспрессии, кодирующего белок, тип клеток, основные среды, добавки к средам, включая добавки к питательной среде, график подачи добавок к питательным средам, график пассирования, температуру культивирования, изменение температуры, влажность, степень аэрации, pH, плотность высеваемых клеток, уровень CO и/или уровень кислорода. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения оптимизированные начальные способы изготовления, описанные в настоящем документе, позволяют получать высокий титр GL-2045 с повышенным процентным содержанием мультимеров более высокого порядка по сравнению с GL-2045, полученным с помощью неоптимизированных начальных способов изготовления.
[0093] Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения клетки яичника китайского хомяка (СНО) трансфицируют вектором экспрессии, кодирующим GL-2045. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения вставка кассеты экспрессии GL-2045 в геном опосредуется транспозоном piggyBac, при этом кассета экспрессии GL-2045 фланкирована минимальными инвертированными повторяющимися элементами piggyBac. Совместная экспрессия указанного вектора экспрессии GL-2045 с вектором, кодирующим транспозазу piggyBac, опосредует интеграцию генов в области генома, которые активно транскрибируются, что приводит к образованию линий клеток со стабильной и повышенной экспрессией генов по сравнению со стандартными способами трансфекции (см. US 2010/0311116 и Matasci et al, Biotechnol. Bioeng. V. 108, pp 2141-2140, (2011), включенные в настоящий документ посредством ссылки). Система piggyBac обычно увеличивает выработку белка, по меньшей мере частично, за счет большого количества интегрированных трансгенов. Однако авторы настоящего изобретения отобрали клональную клеточную линию с высоким титром и высокой жизнеспособностью, в которой частота вставки трансгена была относительно низкой (например, приблизительно 11 копий, согласно результатам определения методом УФ-спектрофотометрии); однако специалист в данной области техники поймет, что применение давления селективным антибиотиком также позволяет использовать частоту вставки трансгена более приблизительно 50 вставленных копий или более приблизительно 100 вставленных копий. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения вектор экспрессии содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую лидерный пептид (например, SEQ ID NO: 1). Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения вектор экспрессии дополнительно содержит ген устойчивости к антибиотику, чтобы обеспечить отбор успешно трансфицированных клеток СНО. Согласно некоторому аспекту настоящего изобретения успешно трансфицированные клетки СНО получают без отбора с применением антибиотика (см. US 2010/0311116). Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения вектор экспрессии дополнительно содержит транскрипционный промотор, чтобы стимулировать высокий уровень экспрессии GL-2045 (например, промотор ЦМВ).
[0094] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки СНО, трансфицированные вектором экспрессии GL-2045, культивируют в биореакторе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клеточную линию СНО, которая имеет множество вариантов, подвергают тщательному отбору так, чтобы обеспечить однократную стабильную трансфекцию с применением вектора экспрессии GL-2045, используя методики, которые вызывают вставку преимущественно в транскрипционно активные сайты. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения условия культивирования, применяемые к указанной трансфицированной отобранной линии клеток СНО, обеспечивают более длительное применение протокола культивирования без нежелательного влияния на жизнеспособность клеток, чем с помощью стандартных способов изготовления. Стандартные способы изготовления могут обеспечивать в среднем 12-дневное культивирование в биореакторе, после чего происходит снижение жизнеспособности клеток из-за увеличения количества остатков погибших клеток, присутствующих в культуре. Помимо того, что остатки погибших клеток связаны с потерей жизнеспособности клеток, они значительно увеличивают проблемы, связанные с фильтрацией и очисткой. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки высевают в биореактор с заранее определенной плотностью клеток и культивируют в течение >12 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки культивируют в биореакторе с приемлемой плотностью жизнеспособных клеток в течение 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или более дней.

[0095] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения ActiCHO P применяют в качестве основных сред для оптимизированных начальных способов изготовления оптимально изготовленного GL-2045. Термины «ActiCHO P» и «оптимизированные среды», используемые в настоящем документе взаимозаменяемо, относятся к коммерчески доступным основным средам ActiCHO («ActiCHO P», GE Healthcare), по существу любым их копиям, или средам, которые содержат по существу те же компоненты в по существу аналогичных количествах, как и ActiCHO P. ActiCHO P также недавно была выпущена GE на рынок как Hyclone «ActiPro», продукт, практически идентичный ActiCHO P, и который является эквивалентным реагентом для целей настоящего изобретения. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в дополнение к основным средам применяют ActiCHO Feed A и Feed B (также недавно выпущенные GE на рынок как «Cell Boost 7a» и Hyclone «Cell Boost 7b», которые являются продуктами, идентичными ActiCHO Feed A и Feed B, и являются эквивалентными реагентами для целей настоящего изобретения). Термины «ActiCHO Feed A» или «оптимизированный Feed A», используемые в настоящем документе взаимозаменяемо, и «ActiCHO Feed B» или «оптимизированный Feed B», используемые в настоящем документе взаимозаменяемо, относятся к коммерчески доступным добавкам к питательным средам ActiCHO (GE Healthcare), по существу их копиям, или добавкам к питательным средам, которые содержат по существу аналогичные компоненты в по существу тех же количествах, как и ActiCHO Feed A и/или ActiCHO Feed B. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения клетки линии CHO, трансфицированные вектором экспрессии GL-2045, обеспечивают ActiCHO Feed A и Feed B каждый день. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения клетки СНО, трансфицированные вектором экспрессии GL-2045, обеспечивают ActiCHO Feed A и Feed B через день. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения клетки СНО, трансфицированные вектором экспрессии GL-2045, обеспечивают ActiCHO Feed A и Feed B за счет непрерывной подачи добавки к питательной среде.
[0096] Согласно некоторым вариантам реализации оптимизированных начальных способов изготовления клетки СНО, трансфицированные вектором экспрессии GL-2045, выращивают до конкретной плотности клеток перед изменением температуры. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения клетки СНО выращивают до плотности приблизительно 5-30 миллионов клеток/мл перед изменением температуры. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения клетки выращивают до плотности приблизительно 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или приблизительно 30 миллионов клеток/мл перед изменением температуры. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения клетки СНО выращивают до плотности приблизительно 10-25 миллионов клеток/мл перед изменением температуры. Согласно некоторым аспектам оптимизированных начальных способов изготовления клетки СНО выращивают до плотности приблизительно 10-15 миллионов клеток/мл перед изменением температуры.
[0097] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки СНО, трансфицированные вектором экспрессии GL-2045, культивируют при 37°C±1°C до достижения заранее определенной плотности клеток. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения температуру изменяют до 32,5°C±1°C после достижения заранее определенной плотности клеток. Этот аспект отличается от ранее описанных способов культивирования для получения рекомбинантных белков, в которых клетки культивировали при 37°C в течение заранее определенного количества дней и затем изменяли температуру до 31°C (Ouguchi et al, Cytotechnology, 52(3), pp. 199-207, (2006); Masterson and Smales, Pharmaceutical Bioprocessing, 2(1), pp. 49-61, (2014)). Авторы настоящего изобретения установили, что изменение температуры с 37°C±1°C до 32,5°C±1°C на основе плотности клеток, а не времени культивирования, неожиданно обеспечивает комбинацию повышенной жизнеспособности, улучшенной плотности клеток и значительного увеличения титра белка по сравнению со стандартными начальными способами изготовления. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки СНО, трансфицированные вектором экспрессии GL-2045, подвергают двойному изменению температуры. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения трансфицированные клетки СНО культивируют при 37°C±1°C и изменяют температуру до 34°C±1°C до достижения пиковой плотности жизнеспособных клеток. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения это изменение температуры происходит, пока клетки СНО остаются в фазе логарифмического роста. Согласно особенно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения первоначальное изменение температуры происходит на 3 или 4 день культивирования. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения трансфицированные клетки СНО культивируют при 37°C±1°C до достижения заранее определенной плотности клеток и в этот момент времени температуру изменяют до 34°C±1°C. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения плотность клеток составляет от 5 до 20 миллионов клеток/мл при первом изменении температуры. Согласно особенно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения плотность клеток составляет от 8 до 15 миллионов клеток/мл при первом изменении температуры. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второе изменение температуры происходит на 7 день 1 день. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения температуру затем дополнительно изменяют до 31°C. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второе изменение температуры выполняют приблизительно на 4 день после первоначального изменения температуры.
Последующие способы изготовления
[0098] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения сбор GL-2045 осуществляют с помощью последующих способов изготовления. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения последующие способы изготовления применяют в комбинации с оптимизированными начальными способами изготовления, описанными в настоящем документе, для удаления или выделения конкретной белковой фракции (например, удаления неупорядоченных высокомолекулярных агрегатов гомодимера GL-2045). В настоящей заявке «последующие способы изготовления» представляют собой этапы очистки и фильтрации белка, выполняемые на супернатантах белка для получения белковой композиции желательной чистоты и/или концентрации. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения последующие способы изготовления были оптимизированы для очистки и фильтрации GL-2045, чтобы обеспечить и/или поддержать конкретный профиль мультимеризации GL-2045, и называются в настоящем документе «оптимизированные последующие способы изготовления».
[0099] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения GL-2045 очищают с помощью аффинной хроматографии. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения GL-2045 очищают с применением колонок с белком A. Как описано выше, колонки с белком A очень дорогие и повторно используются значительное количество раз, чтобы стать экономически целесообразными. Повторное использование колонок с белком A требует «регенерации» колонки с белком A для поддержания способности связывать белок. В настоящей заявке «регенерирование» или «регенерировать» относится к удалению связанного белка, который не был удален во время процесса элюирования, из колонки с белком A. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения во время очистки GL-2045 колонку с белком A необходимо регенерировать чаще, чем указано в инструкциях производителя, или чаще, чем обычно в данной области техники для очистки моноклональных антител или гибридных белков Fc. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения колонку с белком A необходимо регенерировать по меньшей мере в два раза чаще, чем рекомендовано производителем. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения колонку с белком A необходимо регенерировать в перерывах между каждым последующим циклом прохождения супернатанта GL-2045 через колонку. В таких вариантах реализации очистка GL-2045 с помощью аффинной колонки с белком A требует применения очень жесткого буфера для регенерации, чтобы удалить авидно связанные мультимеры GL-2045 из колонки с белком A и восстановить полную связывающую способность колонки с белком A. Согласно предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения очень жесткий буфер для регенерации не вызывает ухудшение качественных характеристик колонки с белком A или связан с их незначительным ухудшением. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения очень жесткий буфер для регенерации содержит растворимое основание. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения основание представляет собой гидроксид натрия (NaOH). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения буфер для регенерации содержит NaOH в концентрации более 0,3 М NaOH. Например, очень жесткий буфер для регенерации может содержать более 0,35 М, 0,4 М, 0,5 М, 0,6 М, 0,7 М, 0,8 М, 0,9 М, 1,0 М или более NaOH. Согласно конкретным вариантам реализации настоящего изобретения концентрация NaOH в буфере для регенерации составляет 0,5 М NaOH.
[00100] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения элюирование GL-2045 из аффинной колонки с белком A оптимизировано для удаления или уменьшения количества неупорядоченных высокомолекулярных агрегатов GL-2045 из лекарственного вещества. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения GL-2045 элюируют из колонки с белком A с помощью градиентного элюирования (например, элюирования градиентом pH).
[00101] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения оптимизированные последующие способы изготовления GL-2045 включают многоэтапный способ очистки, включающий очистку с помощью аффинной хроматографии (например, аффинной хроматографии с белком A) и по меньшей мере один или более этапов заключительной очистки, выбранных из катионообменной хроматографии, анионообменной хроматографии и колонок для хроматографии гидрофобного взаимодействия. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вместо двух- или трехэтапного способа очистки, обычно применяемого в данной области техники, применяют четырехэтапный способ очистки GL-2045, включающий очистку с помощью аффинной хроматографии (например, аффинной хроматографии с белком A) и заключительную очистку с применением любой из катионообменной хроматографии, анионообменной хроматографии и колонок для хроматографии гидрофобного взаимодействия. Термин «заключительная очистка» обычно относится к удалению примесей, оставшихся после очистки с применением белка A, включая агрегаты, эндотоксин, ДНК и/или вирусы. Помимо этого, в отношении GL-2045, «заключительная очистка» дополнительно означает контроль процентного содержания гомодимера и конкретных мультимеров более высокого порядка, например, за счет применения тех же самых хроматографических методик.
[00102] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения заключительную очистку GL-2045 выполняют с помощью ионообменной хроматографии (например, катионного или анионного обмена). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения заключительную очистку GL-2045 с помощью ионообменной хроматографии выполняют с применением элюирующего буфера, который уменьшает и/или уменьшает до минимума количество неупорядоченных высокомолекулярных агрегатов гомодимера GL-2045, которые сохраняются после способа очистки с применением белка A. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения для элюирования GL-2045 из колонки с белком A выполняют ступенчатое элюирование. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения для элюирования GL-2045 из колонки с белком A выполняют градиентное элюирование. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения элюирующий буфер представляет собой буфер на основе ацетата натрия. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения концентрация ацетата натрия в элюирующем буфере составляет по меньшей мере 25 мМ. Например, концентрация ацетата натрия в элюирующем буфере может составлять по меньшей мере 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 100 мМ или более ацетата натрия. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения элюирующий буфер представляет собой 50 мМ ацетат натрия. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения элюирующий буфер представляет собой 50 мМ ацетат натрия с добавлением различных количеств дополнительного солевого буфера (например, буфера на основе NaCl). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения дополнительный буфер представляет собой буфер на основе 1 М NaCl, рН=5 («буфер B»). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения элюирующий буфер содержит по меньшей мере 30% буфера B. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения элюирующий буфер содержит от 30% до 40% буфера B. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения элюирующий буфер содержит от 35% до 40% буфера B. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения элюирующий буфер содержит от 37% до 39% буфера B. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения элюирующий буфер содержит 38%±0,5% буфера B.
[00103] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения заключительную очистку GL-2045 осуществляют с применением хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения колонка для HIC выбрана для удаления высокомолекулярных неупорядоченных агрегатов GL-2045 (например, колонка октил-FF HIC). Очистку GL-2045 можно выполнять с применением колонки для HIC как в проточном режиме, так и в режиме связывания. Специалист в данной области техники поймет, что корректируемые переменные, такие как pH и солевые условия, будут определять, связывается ли GL-2045 со смолой HIC или протекает через колонку. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения колонка для HIC выбрана для очистки конкретной фракции GL-2045, такой как гомодимер и/или мультимеры более высокого порядка (например, колонка бутил-HP и/или фенил-HP). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения желательным может быть выделение конкретной фракции GL-2045 для лечения конкретного патологического показания. Например, колонки для HIC можно применять для получения лекарственных веществ, которые по существу состоят из конкретной фракции GL-2045 (например, лекарственного вещества, которое преимущественно состоит из гомодимеров GL-2045, лекарственного вещества, которое преимущественно состоит из димеров гомодимеров, лекарственного вещества, которое преимущественно состоит из высокоупорядоченного мультимера GL-2045 и т.д.). Разделение фракций GL-2045 на отдельные продукты может быть благоприятным для определенных патологических показаний. Например, гомодимер GL-2045 связывается с FсγRI, однако по существу не связывается с другими FcR. Соответственно, гомодимер GL-2045 может быть особенно подходящим в лечении заболеваний, опосредуемых, по меньшей мере частично, передачей сигналов с участием FγRI, например, перитонита (Heller et al., J. Immunol, V. 162, 1992) или острого поражения легких (Xie et al. J. Immunol., V 188, 2012). Аналогичным образом, тример GL-2045 и, возможно, димер и тетрамер могут быть особенно подходящими для лечения аутоиммунных заболеваний (см. WO 2015/168643). Поскольку C1q является гексамерным, то пентамер, гексамер и гептамеры могут быть особенно подходящими в лечении опосредуемых комплементом заболеваний. Специалист в данной области техники поймет, что это лишь некоторые из путей, за счет которых фракции GL-2045 могут быть благоприятными для лечения определенных заболеваний.
[00104] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения оптимизированные последующие способы изготовления, описанные в настоящем документе, могут представлять собой комбинацию отдельных методик очистки и/или фильтрации. Например, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения оптимизированные последующие способы могут включать очистку GL-2045 с помощью аффинной хроматографии (например, очистку с помощью оптимизированных способов для колонок с белком A) с последующей дополнительной заключительной очисткой с помощью способов ионообменной хроматографии (например, заключительная очистка с помощью оптимизированных катионообменных способов) и/или колонок для хроматографии гидрофобного взаимодействия. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения оптимизированные последующие способы, описанные в настоящем документе, включают четырехэтапный способ очистки, включающий очистку с помощью белка A, катионного обмена, анионного обмена в проточном режиме и колонок для хроматографии гидрофобного взаимодействия. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения также можно применять дополнительные этапы глубинной фильтрации и/или ультрафильтрации.
[00105] Соответственно, термины «оптимальные способы изготовления» или «оптимизированные способы изготовления», используемые в настоящем документе взаимозаменяемо, могут относиться к оптимизированным начальным и/или оптимизированным последующим способам изготовления. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения оптимизированные способы изготовления включают оптимизированные начальные способы и последующие способы. Соответственно, в настоящем документе термины «оптимально изготовленный страдомер» или «оптимально изготовленный GL-2045» относятся к композициям GL-2045 с высоким титром и преимущественно мультимерами высокого порядка, полученным в соответствии с оптимизированными начальными условиями изготовления и/или оптимизированными последующими способами изготовления. Несмотря на то, что композиция GL-2045, описанная в настоящем документе, может содержать полученный оптимальными способами GL-2045 (т.е. GL-2045, полученный способами, описанными в настоящем документе), специалист в данной области техники поймет, что композиции GL-2045, которые соответствуют определенным мультимерным профилям, описанным в настоящем документе, могут быть получены другими способами. Соответственно, «композиция GL-2045» или «композиция рекомбинантного GL-2045» или «очищенная композиция GL-2045» относится к композиции, содержащей GL-2045, включая лекарственное вещество GL-2045, независимо от того, была ли композиция получена с помощью оптимальных способов изготовления или без них. В настоящем документе термины «мультимерный профиль» или «профиль полос» или любой подобный термин используются взаимозаменяемо и относятся к профилю мультимеров, наблюдаемому в аналитическом количественном исследовании композиции GL-2045. Примерный мультимерный профиль представлен на ФИГ. 33.
[00106] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена композиция GL-2045, полученная рекомбинантными способами, с определенным мультимерным профилем. В настоящем документе термины «определенный мультимерный профиль» или «определенный профиль мультимеризации» или «определенный профиль полос» относятся к профилю мультимеризации GL-2045, который воспроизводим и может быть описан применительно к процентному содержанию GL-2045, который присутствует в виде гомодимеров, мультимеров более высокого порядка и/или мультимеров высшего порядка, от общего количества композиции. Специалист в данной области техники поймет, что абсолютное значение процентного содержания гомодимера и/или мультимера может варьироваться в зависимости от используемого аналитического метода. Например, цифровой программный анализ ДСН-ПААГ даст несколько иное процентное содержание мультимеров по сравнению с исследованием идентичной композиции с помощью эксклюзионной ВЭЖХ. Если в настоящем документе не указано иное, процентное содержание гомодимеров и мультимеров композиций GL-2045, описанных в настоящем документе, выражено как процентное содержание, измеренное с помощью аналитических методов эксклюзионной ВЭЖХ. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен GL-2045, полученный рекомбинантными способами, в котором по меньшей мере 80% GL-2045 присутствует в виде негомодимеров или «мультимеров» (например, димеров гомодимеров, тримеров гомодимеров и т.д.). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения более 80% GL-2045 присутствует в виде мультимеров. Например, оптимизированные способы изготовления, такие как те, которые описаны в настоящем документе, могут обеспечить получение композиции белка GL-2045, в которой 80%, 85%, 90%, 95% или более GL-2045 присутствует в виде мультимеров. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере 30% GL-2045 присутствует в виде «мультимеров высших порядков», определенных в настоящем документе как 7-членные мультимеры гомодимера и выше. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения не более 40% GL-2045, полученного рекомбинантными способами, присутствует в виде мультимеров высшего порядка. Специалист в данной области техники также поймет, что применительно к «полосам» или «фракциям», если не указано иное, число полосы обозначает порядок гомодимеров, присутствующих во фракции. Соответственно, например, полоса 2 содержит димер гомодимера, тогда как полоса 3 содержит тример гомодимера. Соответственно, например, полоса 2 содержит димер гомодимера, полоса 3 содержит тример гомодимера, полоса 4 содержит тетрамер гомодимера и т.д.
[00107] В настоящем документе термин «мультимеры более высокого порядка» относится к тримерам гомодимера и выше (т.е. мультимерам, присутствующим во фракции 3 и выше). В настоящем документе термин «мультимеры высшего порядка» относится к мультимерам во фракции 7 и выше или во фракциях, содержащих 7-членный мультимер гомодимера и выше.
[00108] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена композиция GL-2045, полученная рекомбинантными способами, в которой гомодимерная фракция составляет менее приблизительно 20% от всей композиции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гомодимерная фракция составляет от приблизительно 12% до приблизительно 19%, от приблизительно 14% до приблизительно 19%, от приблизительно 15,5% до приблизительно 17,5% или от приблизительно 14% до приблизительно 18,5% от всей белковой композиции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гомодимерная фракция составляет приблизительно 15,9% или приблизительно 16,2% от всей белковой композиции.
[00109] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена композиция GL-2045, полученная рекомбинантными способами, в которой димер гомодимерной фракции составляет от приблизительно 7% до приблизительно 13%, от приблизительно 7% до приблизительно 12,5%, от приблизительно 7% до приблизительно 12%, от приблизительно 9% до приблизительно 11% или от приблизительно 9,1% до приблизительно 11,7% от всей композиции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения димер гомодимерной фракции составляет приблизительно 10% или приблизительно 10,6% от всей белковой композиции.
[00110] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена композиция GL-2045, полученная рекомбинантными способами, в которой тример гомодимерной фракции составляет от приблизительно 5,5% до приблизительно 11%, от приблизительно 5,5% до приблизительно 10% или от приблизительно 6,5% до приблизительно 8% от всей композиции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения тример гомодимерной фракции составляет приблизительно 7% или приблизительно 7,3% от всей белковой композиции.
[00111] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена композиция GL-2045, полученная рекомбинантными способами, в которой тетрамер гомодимерной фракции составляет от приблизительно 10% до приблизительно 16%, от приблизительно 11% до приблизительно 16%, от приблизительно 13% до приблизительно 15% или от приблизительно 12,4% до приблизительно 15,1% от всей композиции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения тетрамер гомодимерной фракции составляет приблизительно 14% или приблизительно 14,3% от всей белковой композиции.
[00112] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена композиция GL-2045, полученная рекомбинантными способами, в которой пентамер гомодимерной фракции составляет от приблизительно 6% до приблизительно 9%, от приблизительно 7% до приблизительно 8% или от приблизительно 7,1% до приблизительно 8,2% от всей композиции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения димер пентамерной фракции составляет приблизительно 7% или приблизительно 7,5% от всей белковой композиции.
[00113] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена композиция GL-2045, полученная рекомбинантными способами, в которой гексамер гомодимерной фракции составляет от приблизительно 10% до приблизительно 14%, от приблизительно 12% до приблизительно 13% или от приблизительно 12,1% до приблизительно 13,2% от всей композиции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гексамер гомодимерной фракции составляет приблизительно 12,7% или приблизительно 12,6% от всей белковой композиции.
[00114] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена композиция GL-2045, полученная рекомбинантными способами, в которой фракция мультимеров высшего порядка составляет по меньшей мере приблизительно 28% от всей композиции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фракция мультимеров высшего порядка составляет не более приблизительно 35% от всей белковой композиции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фракция мультимеров высшего порядка составляет от приблизительно 30% до приблизительно 34% или от приблизительно 28,6% до приблизительно 35,1% от всей белковой композиции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фракция мультимеров высшего порядка составляет приблизительно 31,4% или приблизительно 31,9% от всей белковой композиции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена композиция GL-2045, полученная рекомбинантными способами, в которой гомодимерная фракция составляет менее приблизительно 20% от всей композиции; фракции мультимеров высшего порядка составляют по меньшей мере приблизительно 28% от всей композиции; димер гомодимерной фракции составляет от приблизительно 7% до приблизительно 13% от всей композиции; тример гомодимерной фракции составляет от приблизительно 5% до приблизительно 11% от всей композиции; тетрамер гомодимерной фракции составляет от приблизительно 10% до приблизительно 16% от всей композиции; пентамер гомодимерной фракции составляет от приблизительно 6% до приблизительно 10% от всей композиции; гексамер гомодимерной фракции составляет от приблизительно 10% до приблизительно 14% от всей фракции; фракция, содержащая мультимеры от димера гомодимера до гексамера гомодимера, составляет от приблизительно 40% до приблизительно 60% от всей композиции; фракция, содержащая мультимеры от тримера гомодимера до гексамера гомодимера, составляет от приблизительно 32% до приблизительно 50% от всей композиции; фракция, содержащая мультимеры от тетрамера гомодимера до гексамера гомодимера, составляет от приблизительно 30% до приблизительно 37% от всей композиции; фракция, содержащая мультимеры от пентамера гомодимера до гексамера гомодимера, составляет от приблизительно 18% до приблизительно 23% от всей композиции; или присутствует любая комбинация из указанных выше.
[00115] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена композиция GL-2045, полученная рекомбинантными способами, в которой приблизительно 80% от всей композиции GL-2045 составляет димер гомодимера и выше (т.е. полоса 2 и выше). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения приблизительно 60-80%, 62-80% или 60-78% от всей композиции GL-2045, полученной рекомбинантными способами, составляет тример гомодимера и выше (т.е. полосы 3 и выше). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения приблизительно 54-76%, приблизительно 54-72%, приблизительно 56-76% или приблизительно 54-67% от всей композиции GL-2045, полученной рекомбинантными способами, составляет тетрамер и выше (т.е. полосы 4 и выше). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена композиция GL-2045, в которой приблизительно 44-60%, 44-57% или 44-51% от всей композиции составляет пентамер и выше (т.е. полосы 5 и выше). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена композиция GL-2045, в которой приблизительно 38-51% от всей композиции составляет гексамер и выше (т.е. полосы 6 и выше).
[00116] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен GL-2045, полученный рекомбинантными способами, в котором полосы 2-6 композиции (т.е. от ди- до гексамера гомодимера) составляют приблизительно 39-61% или приблизительно 44-60% композиции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен GL-2045, полученный рекомбинантными способами, в котором полосы 3-6 композиции (т.е. от три- до гексамера гомодимера) составляют приблизительно 32-50% или приблизительно 35-48% композиции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен GL-2045, полученный рекомбинантными способами, в котором полосы 4-6 композиции (т.е. от тетра- до гексамера гомодимера) составляют приблизительно 26-39% или приблизительно 30-39% композиции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен GL-2045, полученный рекомбинантными способами, в котором полосы 5-6 композиции (т.е. от пента- до гексамера гомодимера) составляют приблизительно 16-23% или приблизительно 18-23% композиции.
[00117] Безотносительно к какой-либо теории, полагают, что наименее активными компонентами GL-2045 при связывании с низкоаффинными рецепторами Fc и C1q являются гомодимер и димер гомодимера. Специалист в данной области техники легко поймет, что для уменьшения количества гомодимера или гомодимера и димера в готовом продукте можно применять оптимизированные хроматографические способы, описанные в настоящем документе, или аналогичные методики очистки. Специалист в данной области техники будет осведомлен о том, что выполнение вышеуказанного приведет к изменению процентного содержания мультимеров, раскрытых в настоящем документе. В качестве примера и не ограничивая общий характер вышесказанного, если специалист в данной области техники должен был удалить 50% гомодимера в способе очистки, или гомодимера и димера, то процентное содержание каждого оставшегося мультимера (т.е., тримеров, тетрамеров, пентамеров, гексамеров, 7-членных мультимеров и т.д.), соответственно, будет повышено. Удаление 90% гомодимера и 50% димера приведет к уменьшению общего количества белка, присутствующего в готовом продукте, приблизительно на 20%±5% и, соответственно, увеличит процентное содержание тримера, тетрамера, пентамера, гексамера и 7-членного мультимера, представленное как процентное содержание от общего количества белка.
[00118] Более того, специалист в данной области техники также поймет, что современные методики хроматографии обычно не позволяют удалять или уменьшать одну мультимерную полосу, такую как мультимеры высшего порядка, без одновременного удаления, до некоторой степени, смежных полос, таких как гексамер и в меньшей степени пентамер. Следовательно, специалист в данной области техники будет осведомлен о том, что наблюдаемое компенсаторное увеличение процентного содержания любого конкретного мультимера или гомодимера в результате удаления или уменьшения количества мультимеров высшего порядка будет увеличиваться тем в большей степени, чем более конкретный мультимер отличается от удаленной фракции GL-2045 (например, процентное содержание гомодимера будет увеличиваться в большей степени, чем увеличенное процентное содержание, наблюдаемое для гексамеров, при удалении или уменьшении количества мультимеров высшего порядка). В любом случае кумулятивное увеличение процентного содержания оставшихся мультимеров должно быть равно процентному содержанию мультимеров для удаленных фракций с учетом некоторой изменчивости, связанной с аналитическим методом.
Фармацевтические композиции
[00119] Введение композиций GL-2045, описанных в настоящем документе, будет осуществляться любым обычным путем, перорально, парентерально или местно. Примерные пути включают, но не ограничиваются указанными, пероральный, назальный, буккальный, ректальный, вагинальный, офтальмологический, подкожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, внутриартериальный, внутриопухолевый, спинальный, интратекальный, внутрисуставной, внутриартериальный, субарахноидальный, подъязычный, через слизистую оболочку полости рта, бронхиальный, лимфатический, внутриматочный, подкожный, внутриопухолевый, путем встраивания на имплантируемое устройство, такое как шовный материал, или в имплантируемое устройство, такое как имплантируемый полимер, интрадуральный, внутрикортикальный или дермальный пути введения. Такие композиции обычно будут введены в виде фармацевтически приемлемых композиций, описанных в настоящем документе. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения оптимально изготовленный страдомер вводят внутривенно или подкожно.
[00120] В настоящем документе термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие всасывание агенты и т.п. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области техники. За исключением случаев, когда какие-либо обычные среды или агент несовместимы с векторами или клетками согласно настоящему изобретению, предусмотрено их применение в терапевтических композициях. В композиции также могут быть включены дополнительные активные ингредиенты.
[00121] Композиции GL-2045 согласно настоящему изобретению могут быть изготовлены в нейтральной или солевой форме. Фармацевтически приемлемые соли включают соли присоединения кислоты (образованные за счет свободных аминогрупп белка), которые образуются с неорганическими кислотами, такими как, например, соляная или фосфорная кислоты, или органическими кислотами, такими как уксусная, щавелевая, винная, миндальная и т.п. Соли, образованные со свободными карбоксильными группами, также могут быть получены из неорганических оснований, таких как, например, гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа (III), и органических оснований, таких как изопропиламин, триметиламин, гистидин, прокаин и т.п.
[00122] Стерильные растворы для инъекций получают путем включения оптимально изготовленного GL-2045 в необходимом количестве в соответствующем растворителе с различными другими ингредиентами, перечисленными выше, по мере необходимости, с последующей стерилизацией путем фильтрации. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения стерильные растворы для инъекций изготовлены для внутримышечного, подкожного или внутривенного введения. Обычно дисперсии получают путем включения различных стерилизованных активных ингредиентов в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из тех, которые перечислены выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций предпочтительными способами получения являются методики вакуумной сушки и лиофильной сушки, которые позволяют получать порошок активного ингредиента с любым желательным дополнительным ингредиентом из его раствора, предварительно стерилизованного путем фильтрации.
[00123] Кроме того, согласно одному варианту реализации предложена композиция GL-2045, подходящая для перорального введения, которая обеспечена в фармацевтически приемлемом носителе с инертным разбавителем или без него. Носитель должен быть усваиваемым или съедобным и включает жидкие, полутвердые (например, пасты) или твердые носители. За исключением случаев, когда любые обычные среды, агент, разбавитель или носитель являются вредными для реципиента или терапевтической эффективности препарата оптимально изготовленного страдомера, который в них содержится, их применение в оптимально изготовленной композиции страдомера, подходящей для перорального введения, является подходящим при реализации способов согласно настоящему изобретению. Примеры носителей или разбавителей включают жиры, масла, воду, солевые растворы, липиды, липосомы, смолы, связывающие вещества, наполнители и тому подобное или их комбинации. В настоящем документе термин «пероральное введение» включает пероральное, буккальное, энтеральное или внутрижелудочное введение.
[00124] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения композицию GL-2045 комбинируют с носителем любым удобным и целесообразным способом, т.е. путем растворения, суспендирования, эмульгирования, смешивания, инкапсулирования, микрокапсулирования, абсорбции и т.п. Такие процедуры являются обычными для специалистов в данной области техники.
[00125] Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения композицию GL-2045 в форме порошка комбинируют или тщательно смешивают с полутвердым или твердым носителем. Смешивание можно осуществлять любым удобным способом, таким как измельчение. Стабилизирующие агенты также могут быть добавлены в способе смешивания, чтобы защитить композицию от потери терапевтической активности (например, вследствие денатурации в желудке). Примеры стабилизаторов для применения в композиции для перорального введения включают буферы, антагонисты секреции желудочных кислот, аминокислоты, такие как глицин и лизин, углеводы, такие как декстроза, манноза, галактоза, фруктоза, лактоза, сахароза, мальтоза, сорбит, маннит, и т.д., ингибиторы протеолитических ферментов и т.п. Более предпочтительно стабилизатор для композиции для перорального введения также может включать антагонисты секреции желудочных кислот.
[00126] Кроме того, композиция GL-2045 для перорального введения, которую комбинируют с полутвердым или твердым носителем, может быть дополнительно изготовлена в виде желатиновых капсул с твердой или мягкой оболочкой, таблеток или пилюль. Более предпочтительно желатиновые капсулы, таблетки или пилюли имеют кишечнорастворимое покрытие. Кишечнорастворимые покрытия предотвращают денатурацию композиции в желудке или верхней части кишечника, где pH является кислым. См., патент США № 5629001. При достижении тонкого кишечника покрытие растворяется при основном рН, и композиция высвобождается для взаимодействия с клетками кишечника, например, с М-клетками Пейеровых бляшек.
[00127] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения композицию GL-2045 в форме порошка комбинируют или тщательно смешивают с материалами, которые создают наночастицу, инкапсулирующую иммунологически активный биомиметик, или к которой прикреплен иммунологически активный биомиметик. Размер каждой наночастицы будет менее или равен 100 мкм. Наночастица может иметь мукоадгезивные свойства, которые обеспечивают всасывание иммунологически активного биомиметика в желудочно-кишечном тракте, который в противном случае не обладал бы биодоступностью при пероральном введении.
[00128] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения порошкообразную композицию комбинируют с жидким носителем, таким как вода или солевой раствор, со стабилизирующим агентом или без него.
[00129] Конкретный состав GL-2045, который можно применять, представляет собой раствор иммунологически активного биомиметического белка в гипотоническом фосфатном буфере, не содержащем калий, при этом состав буфера является следующим: 6 мМ моногидрата одноосновного фосфата натрия, 9 мМ гептагидрата двухосновного фосфата натрия, 50 мМ хлорида натрия, рН=7,0±0,1. Концентрация иммунологически активного биомиметического белка в гипотоническом буфере может находиться в пределах диапазона от 10 мкг/мл до 100 мг/мл. Этот состав может быть введен любым путем, например, но не ограничиваясь указанным, внутривенным путем.
[00130] Кроме того, композиция GL-2045 для местного применения, которую комбинируют с полутвердым носителем, может быть дополнительно изготовлена в виде кремовой или гелевой мази. Предпочтительным носителем для получения гелевой мази является гелевый полимер. Предпочтительные полимеры, которые применяют для изготовления гелевой композиции согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются указанными, карбопол, карбоксиметилцеллюлозу и плюроновые полимеры. В частности, порошкообразную композицию мультимерной области Fc комбинируют с водным гелем, содержащим полимеризующий агент, такой как карбопол 980 в концентрации от 0,5% до 5% масс./об. для нанесения на кожу для лечения заболеваний на коже или под ней. В настоящем документе термин «местное введение» включает нанесение на дермальные, эпидермальные, подкожные поверхности или поверхность слизистой оболочки.
[00131] Кроме того, композиция GL-2045 может быть включена в полимер для подкожной или субдермальной имплантации. Предпочтительным составом для имплантируемого полимера, несущего лекарственный препарат, является агент, обычно считающийся безопасным, и он может включать, например, сшитый декстран (Samantha Hart, Master of Science Thesis, «Elution of Antibiotics from a Novel Cross-Linked Dextran Gel: Quantification» Virginia Polytechnic Institute and State University, June 8, 2009), декстран-тирамин (Jin, et al. (2010) Tissue Eng. Part A. 16(8):2429-40), декстран-полиэтиленгликоль (Jukes, et al. (2010) Tissue Eng. Part A., 16(2):565-73) или декстран-глутаровый альдегид (Brondsted, et al. (1998) J. Controlled Release, 53:7-13). Специалист в данной области техники будет осведомлен о том, что многие подобные полимеры и гидрогели могут быть получены за счет включения страдомера, закрепленного в полимере или гидрогеле, и контроля размера пор до желательного диаметра.
[00132] После изготовления растворы вводят способом, совместимым с лекарственной формой, и в таком количестве, которое является терапевтически эффективным для улучшения или устранения симптомов. Составы могут быть легко введены в виде различных лекарственных форм, таких как растворы для приема внутрь, капсулы для высвобождения лекарственного препарата и т.п. Дозировка может быть незначительно изменена в зависимости от состояния субъекта, которого лечат. Лицо, ответственное за введение, может в любом случае определить соответствующую дозу для отдельного субъекта. Более того, для введения человеку, препараты соответствуют стандартам стерильности, общей безопасности и чистоты согласно требованиям стандартов Центра оценки и изучения биологических препаратов Управления по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA).
[00133] Путь введения закономерно будет изменяться в зависимости от места и характера заболевания, которое лечат, и может включать, например, внутридермальное, трансдермальное, субдермальное, парентеральное, назальное, внутривенное, внутримышечное, интраназальное, подкожное, чрескожное, внутритрахеальное, внутрибрюшинное, внутриопухолевое, перфузионное введение, введение с помощью лаважа, введение путем непосредственной инъекции, интраректальное и пероральное введение.
[00134] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения композицию GL-2045 вводят внутривенно, подкожно, перорально, внутрибрюшинно, сублингвально, буккально, трансдермально, ректально, с помощью субдермального имплантата или внутримышечно. Согласно конкретным вариантам реализации настоящего изобретения оптимально изготовленный страдомер вводят внутривенно, подкожно или внутримышечно. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения оптимально изготовленный страдомер вводят в дозе от приблизительно 0,005 мг/кг до приблизительно 1000 мг/кг. Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения оптимально изготовленный страдомер вводят в дозе от приблизительно 0,01 мг/кг до приблизительно 100 мг/кг. Согласно другому дополнительному варианту реализации настоящего изобретения оптимально изготовленный страдомер вводят в дозе от приблизительно 0,1 мг/кг до приблизительно 20 мг/кг. Согласно другому дополнительному варианту реализации настоящего изобретения оптимально изготовленный страдомер вводят в дозе от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг. Согласно другому дополнительному варианту реализации настоящего изобретения оптимально изготовленный страдомер вводят в дозе от приблизительно 2 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг. Оптимально изготовленный страдомер можно вводить по меньшей мере один раз в сутки, один раз в неделю, один раз в две недели, ежемесячно и иногда с более длительными интервалами. Можно применять двухфазный режим дозирования, в котором первая фаза дозирования содержит от приблизительно 0,1% до приблизительно 300% от второй фазы дозирования.
131
[00135] Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения композицию GL-2045 вводят до, во время или после введения одного или более дополнительных фармацевтических и/или терапевтических агентов. Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения дополнительный фармацевтически активный агент включает стероид; биологический антиаутоиммунный лекарственный препарат, такой как моноклональное антитело, гибридный белок или антицитокин; небиологический антиаутоиммунный лекарственный препарат; иммуносупрессор; антибиотик; и противовирусный агент; цитокин; или агент, способный действовать как иммуномодулятор иным способом. Согласно другому дополнительному варианту реализации настоящего изобретения стероид представляет собой преднизон, преднизолон, кортизон, дексаметазон, мометазон, тестостерон, эстроген, оксандролон, флутиказон, будесонид, бекламетазон, албутерол или левалбутерол. Согласно другому дополнительному варианту реализации настоящего изобретения моноклональное антитело представляет собой экулизумаб, окрелизумаб, инфликсимаб, адалимумаб, ритуксимаб, тоцилизумаб, голимумаб, офатумумаб, LY2127399, белимумаб, велтузумаб, меполизумаб, нецитумумаб, ниволумаб, динутуксимаб, секукинумаб, эволокумаб, блинатумомаб, пембролизумаб, рамуцирумаб, ведолизумаб, силтуксимаб, обинутузумаб, адотрастузумаб, раксибакумаб, пертузумаб, брентуксимаб, ипилумумаб, деносумаб, канакинумаб, устекинумаб, катумаксомаб, ранибизумаб, панитумумаб, натализумаб, бевацизумаб, цетуксимаб, эфализумаб, омализумаб, тоитумомаб-I, алемтузумаб, гемтузумаб, трастузумаб, паливизумаб, базиликсумаб, даклизумаб, абциксимаб, муронономаб, ведотин, ибритумомаб, тиуксетан, мотавизумаб или цертолизумаб. Согласно другому дополнительному варианту реализации настоящего изобретения гибридный белок представляет собой этанерцепт или абатацепт. Согласно другому дополнительному варианту реализации настоящего изобретения антицитокиновое биологическое средство представляет собой анакинру. Согласно другому дополнительному варианту реализации настоящего изобретения антиревматический небиологический лекарственный препарат представляет собой циклофосфамид, метотрексат, азатиоприн, гидроксихлорохин, лефлуномид, миноциклин, органические соединения золота, фостаматиниб, тофацитиниб, эторикоксиб или сульфасалазин. Согласно другому дополнительному варианту реализации настоящего изобретения иммуносупрессор представляет собой циклоспорин А, такролимус, сиролимус, микофенолята мофетил, эверолимус, ОКТ3, антитимоцитарный глобулин, базиликсимаб, даклизумумаб или алемтузумаб. Согласно другому дополнительному варианту реализации настоящего изобретения оптимально изготовленный страдомер вводят до, во время или после введения химиотерапевтического агента. Согласно другому дополнительному варианту реализации настоящего изобретения оптимально изготовленный страдомер и дополнительный терапевтический агент проявляют терапевтическую синергию при совместном введении. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения оптимально изготовленный страдомер вводят до введения дополнительного терапевтического агента. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения оптимально изготовленный страдомер вводят одновременно с введением дополнительного терапевтического агента. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения оптимально изготовленный страдомер вводят после введения дополнительного терапевтического агента.
[00136] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения композицию GL-2045 вводят как ковалентно прикрепленную к имплантируемому устройству. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения оптимально изготовленный страдомер прикреплен к шовному материалу. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения оптимально изготовленный страдомер прикреплен к трансплантату или стенту. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения оптимально изготовленный страдомер прикреплен к сердечному клапану, ортопедическому протезу сустава или имплантированному электронному проводу. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения оптимально изготовленный страдомер прикреплен к имплантируемому матриксу или встроен в него. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения оптимально изготовленный страдомер прикреплен к имплантируемому гидрогелю и встроен в него. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения гидрогель состоит из декстрана, поливинилового спирта, полиакрилата натрия или акрилатных полимеров. Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения оптимально изготовленный страдомер вводят как прикрепленный на гидрогеле с достаточно большими размерами пор, чтобы обеспечить проникновение иммунных клеток для взаимодействия с прикрепленным страдомером и затем их возвращение к кровоток. Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения размер пор гидрогеля составляет от 5 до 50 микрон. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения размер пор гидрогеля составляет 25-30 микрон.
[00137] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения композицию GL-2045 вводят для лечения человека, приматов, отличных от человека (например, обезьян, бабуинов и шимпанзе), мышей, крыс, крупного рогатого скота, лошадей, кошек, собак, свиней, кроликов, коз, оленей, овец, хорьков, грызунов, морских свинок, хомяков, летучих мышей, птиц (например, кур, индеек и уток), рыб и рептилий с применением видоспецифичных или химерных молекул страдомеров. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения человек представляет собой взрослого или ребенка. Согласно другому дополнительному варианту реализации настоящего изобретения оптимально изготовленный страдомер вводят для предотвращения опосредуемого комплементом заболевания. Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения страдомер вводят для предотвращения аутоиммунных состояний, связанных с вакциной, у домашних животных и домашнего скота.
[00138] В настоящем документе термин «парентеральное введение» включает любую форму введения, при которой соединение всасывается у субъекта без вовлечения всасывания через кишечник. Примеры парентерального введения, которые применяют в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются указанными, подкожное, внутримышечное, внутривенное, внутрибрюшинное, внутриопухолевое, внутриглазное, назальное или внутрисуставное введение.
[00139] Помимо этого композиция GL-2045 согласно настоящему изобретению необязательно может быть введена до, во время или после другого фармацевтического агента.
[00140] Ниже приведены конкретные примеры различных категорий фармацевтических составов и предпочтительных путей введения, как указано, для конкретных типичных заболеваний:
[00141] Растворимая буккальная или подъязычная таблетка: стенокардия, узелковый полиартериит.
[00142] Внутривенное, внутримышечное или подкожное: миастения гравис, гемолитический уремический синдром (ГУС), атипичный гемолитический уремический синдром (аГУС), пароксизмальная ночная гемоглобинурия (ПНГ), мембранная нефропатия, нейромиелит зрительного нерва, опосредуемое антителами отторжение аллотрансплантатов, волчаночный нефрит, мембранопролиферативный гломерулонефрит (MPGN), идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, миозит телец включения, IgM-парапротеинемическая демиелинизирующая полинейропатия, некротизирующий фасциит, пузырчатка, гангрена, дерматомиозит, гранулема, лимфома, сепсис, апластическая анемия, полиорганная недостаточность, множественная миелома, моноклональная гаммопатия неизвестного значения, хроническая воспалительная демиелинизирующая полирадикулонейропатия, воспалительные миопатии, тромботическая тромбоцитопеническая пурпура, миозит, анемия, неоплазия, гемолитическая анемия, энцефалит, миелит, миелопатия, в частности, связанная с Т-лимфотропным вирусом человека 1, лейкоз, рассеянный склероз и неврит зрительного нерва, астма, эпидермальный некролиз, миастенический синдром Ламберта-Итона, нейропатия, увеит, синдром Гийена-Барре, заболевание «трансплантат против хозяина», синдром мышечной скованности, паранеопластическая дегенерация мозжечка с антителами к Yo, паранеопластический энцефаломиелит и сенсорная нейропатия с антителами к Hu, системный васкулит, системная красная волчанка, аутоиммунная диабетическая нейропатия, острая идиопатическая дисавтономная нейропатия, синдром Вогта-Коянаги-Харада, мультифокальная моторная нейропатия, синдром нижних двигательных нейронов, связанный с антителами к GM1, демиелинизация, мембранопролиферативный гломерулонефрит, кардиомиопатия, болезнь Кавасаки, ревматоидный артрит и синдром Эвана, CIDP, РС, дерматомиозит, мышечная дистрофия. В настоящем документе термин «внутривенное введение» включает все методики доставки соединения или композиции согласно настоящему изобретению в системный кровоток путем внутривенной инъекции или инфузии.
[00143] Дермальный гель, лосьон, крем или пластырь: витилиго, опоясывающий лишай, акне, хелит.
[00144] Ректальный суппозиторий, гель или инфузия: язвенный колит, геморроидальное воспаление.
[00145] Перорально в виде пилюли, троше, инкапсулированных или с кишечнорастворимой оболочкой: болезнь Крона, целиакия, синдром раздраженного кишечника, воспалительное заболевание печени, пищевод Барретта.
[00146] Интракортикально: эпилепсия, болезнь Альцгеймера, рассеянный склероз, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона.
[00147] Внутрибрюшная инфузия или имплантат: эндометриоз.
[00148] Медицинские устройства: покрытие стента коронарной артерии, протезов суставов.
Варианты терапевтического применения оптимально изготовленного GL-2045
[00149] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен способ лечения или предотвращения заболевания или состояния, такого как аутоиммунное заболевание, воспалительное заболевание или опосредуемое комплементом заболевание или состояние.
[00150] Основываясь на рациональном дизайне и подтверждениях в условиях in vitro и in vivo, оптимально изготовленный GL-2045 согласно настоящему изобретению будет являться важным биофармацевтическим средством для лечения воспалительных заболеваний и нарушений, а также для изменения иммунной функции в ряде других случаев, таких как биоиммунная терапия аллергий, рака, аутоиммунных заболеваний, инфекционных заболеваний и воспалительных заболеваний. Патологические состояния, подходящие для лечения иммунологически активным оптимально изготовленным GL-2045, описанным в настоящем документе, включают любое заболевание, вызванное или связанное с активацией комплемента или эффекторными функциями, опосредуемыми комплементом, включая повышенную или нефизиологическую активность комплемента. Такие патологические состояния включают те, которые лечат в настоящее время или ранее лечили с применением связывающих комплемент лекарственных препаратов, таких как экулизумаб. Экулизумаб связывается с белком комплемента С5 (белок комплемента, который участвует в реакциях после С1 и С1q в классическом пути комплемента), ингибируя его расщепление и последующий опосредуемый комплементом лизис клеток. Биомиметики согласно настоящему изобретению обеспечивают безопасную и эффективную альтернативу другим связывающим комплемент лекарственным препаратам, известным в данной области техники. Например, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения биомиметики согласно настоящему изобретению связывают C1q, который представляет собой первую субъединицу в комплексе C1 классического пути комплемента. Патологические состояния, подходящие для лечения иммунологически активными оптимально изготовленными страдомерами, включают, но не ограничиваются указанными, миастению гравис, гемолитический уремический синдром (ГУС), атипичный гемолитический уремический синдром (аГУС), пароксизмальную ночную гемоглобинурию (ПНГ), мембранную нефропатию, нейромиелит зрительного нерва, опосредуемое антителами отторжение аллотрансплантатов, волчаночный нефрит, дегенерацию желтого пятна, серповидно-клеточную анемию и мембранопролиферативный гломерулонефрит (MPGN). Дополнительные патологические состояния, подходящие для лечения иммунологически активным оптимально изготовленным GL-2045, описанным в настоящем документе, включают те, которые в настоящее время обычно лечат с применением разных видов широко иммуносупрессивной терапии, включая чВВИГ, или при которых было обнаружено, что чВВИГ является клинически полезным, например, аутоиммунные цитопении, хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию, синдром Гийена-Барре, миастению гравис, аутоиммунное заболевание, направленное против фактора VIII, дерматомиозит, васкулит и увит (см. F. G. van der Meche et al., N. Engl. J. Med. 326, 1123 (1992); P. Gajdos et al, Lancet i, 406 (1984); Y. Sultan, M. et al, Lancet ii, 765 (1984); M. C. Dalakas et al., N. Engl. J. Med. 329, 1993 (1993); D. R. Jayne et al., Lancet 337, 1137 (1991); P. LeHoang, et al., Ocul. Immunol. Inflamm. 8, 49 (2000)), и те виды рака или воспалительных заболеваний, при которых моноклональное антитело можно применять или оно уже применяется в клинической практике. Состояния, включенные в число тех, которые можно эффективно лечить соединениями, являющимися объектом настоящего изобретения, включают воспалительное заболевание с дисбалансом цитокиновых сетей, аутоиммунное нарушение, опосредуемое патогенными аутоантителами или аутоагрессивными Т-клетками, или острую или хроническую фазу хронического рецидивирующего аутоиммунного, воспалительного или инфекционного заболевания или процесса.
[00151] Помимо этого лечение с применением композиции GL-2045 будет благоприятным в отношении других патологических состояний, имеющих воспалительный компонент с вовлечением комплемента, таких как астма, красная волчанка, гломерулонефрит, гломерулярная нефропатия, артрит, опосредуемые аутоантителами заболевания, включая аутоиммунную гемолитическую анемию и аутоиммунную болезнь сердца, рассеянный склероз, боковой амиотрофический склероз, болезнь Хантингтона, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, воспалительное заболевание кишечника, пароксизмальную ночную гемоглобинурию, атипичный гемолитический уремический синдром, повреждения, вызванные реперфузией при ишемии, включая, например, инфаркт миокарда, повреждение спинного мозга и инсульт, отторжение трансплантированных органов или крови, воспаление, связанное с вирусом гепатита B, вирусом гепатита C, вирусом иммунодефицита человека, адренолейкодистрофию и эпилептические нарушения, в частности, те, которые, как полагают, связаны с поствирусным энцефалитом, включая синдром Расмуссена, западный синдром и синдром Леннокса-Гасто.
[00152] Общий подход к терапии с применением композиции GL-2045, описанной в настоящем документе, заключается во введении субъекту, имеющему заболевание или состояние, терапевтически эффективного количества композиции GL-2045 для осуществления лечения. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения заболевания или состояния могут быть широко классифицированы как воспалительные заболевания с дисбалансом цитокиновых сетей, аутоиммунное нарушение, опосредуемое патогенными аутоантителами или аутоагрессивными Т-клетками, или острая или хроническая фаза хронического рецидивирующего заболевания или процесса.
[00153] В настоящем документе термины «лечить» и «лечение» относятся к введению субъекту терапевтически эффективного количества оптимально изготовленного страдомера согласно настоящему изобретению так, что субъект имеет улучшение заболевания или состояния или симптома заболевания или состояния. Улучшение представляет собой любое улучшение или устранение заболевания или состояния или симптома заболевания или состояния. Улучшение представляет собой наблюдаемое или измеримое улучшение или может представлять собой улучшение общего хорошего самочувствия субъекта. Соответственно, специалист в данной области техники поймет, что лечение может улучшить патологическое состояние, но может не привести к полному излечению заболевания. В частности, улучшения у субъектов могут включать одно или более из: уменьшения воспаления; уменьшения лабораторных маркеров воспаления, таких как С-реактивный белок; уменьшения аутоиммунитета, о чем свидетельствует одно или более из улучшения аутоиммунных маркеров, таких как аутоантитела, или количества тромбоцитов, количества лейкоцитов или эритроцитов, уменьшения сыпи или пурпуры, уменьшения слабости, онемения или покалывания, повышения уровня глюкозы у пациентов с гипергликемией, уменьшения боли, воспаления, отека или разрушения в суставах, уменьшения судорог и частоты и объема диареи, уменьшения стенокардии, уменьшения воспаления тканей или уменьшения частоты приступов; уменьшения опухолевой нагрузки, увеличения времени до начала прогрессирования опухоли, уменьшения боли при раке, увеличения выживаемости или улучшения качества жизни; или задержки прогрессирования или улучшения остеопороза.
[00154] В настоящем документе термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству, которое приводит к улучшению или устранению симптомов заболевания или состояния. Специалист в данной области техники поймет, что терапевтически эффективное количество GL-2045, полученного согласно настоящему изобретению, может варьироваться в зависимости от готового лекарственного вещества. Соответственно, например, если были устранены все мультимеры более низкого порядка, вполне возможно, что может потребоваться уменьшенная доза полученных в результате мультимеров более высокого порядка. Соответственно, существует более одной «терапевтически эффективной дозы» GL-2045.
[00155] В настоящем документе термин «профилактика» может означать полное предотвращение симптомов заболевания, задержку появления симптомов заболевания или уменьшение степени тяжести развившихся впоследствии симптомов заболевания.
[00156] В настоящем документе термин «субъект» означает любого субъекта-млекопитающего, которому вводят оптимально изготовленные страдомеры согласно настоящему изобретению в соответствии со способами, описанными в настоящем документе. Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению применяют для лечения субъекта-человека. Способы согласно настоящему изобретению также можно применять для лечения приматов, отличных от человека (например, обезьян, бабуинов и шимпанзе), мышей, крыс, крупного рогатого скота, лошадей, кошек, собак, свиней, кроликов, коз, оленей, овец, хорьков, грызунов, морских свинок, хомяков, летучих мышей, птиц (например, кур, индеек и уток), рыб и рептилий, чтобы получить видоспецифичные или химерные молекулы страдомеров.
2
[00157] Было продемонстрировано, что ингибирование комплемента уменьшает опосредуемые антителами заболевания (см., например, Stegall et al., American Journal of Transplantation 2011 Nov; 11(1):2405-2413-Epub 2011 Sept 22). Оптимально изготовленные страдомеры согласно настоящему изобретению также можно применять для лечения заболевания или состояния, которое опосредуется антителами. Аутоантитела опосредуют многие известные аутоиммунные заболевания и, вероятно, играют роль в других многочисленных аутоиммунных заболеваниях. Признанные опосредуемые антителами заболевания, при которых можно применять оптимально изготовленные страдомеры согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются указанными, нефрит, опосредуемый антителами к базальной мембране гломерул, включая синдром Гудпасчера; антидонорные антитела (донор-специфичные аллоантителa) при трансплантации плотных органов; антитела к аквапорину 4 при нейромиелите зрительного нерва; антитело к VGKC при нейромиотонии, лимбическом энцефалите и синдроме Морвана; антитела к никотиновым рецепторам ацетилхолина и антитела к MuSK при миастении гравис; антитела к VGCC при миастеническом синдроме Ламберта-Итона; антитела к AMPAR и к GABA(B)R при лимбическом энцефалите, часто связанном с опухолями; антитела к GlyR при синдроме ригидности или гиперэкплексии; антитела к фосфолипидам, антитела к кардиолипину и антитела к β-гликопротеину I при рецидивирующем спонтанном аборте, синдроме Хьюза и системной красной волчанке; антитела к глутаматдекарбоксилазе при синдроме мышечной скованности, аутоиммунной мозжечковой атаксии или лимбическом энцефалите; антитела к рецепторам NMDA при недавно описанном синдроме, включающем как лимбические, так и подкорковые признаки с выраженными двигательными нарушениями часто у молодых взрослых и детей, которые часто связаны с тератомой яичника, но могут быть непаранеопластическими; антитела к двухцепочечной ДНК, к одноцепочечной ДНК, к РНК, к SM и к C1q при системной красной волчанке; антиядерные и антиядрышковые антитела при заболеваниях соединительной ткани, включая склеродермию, синдром Шегрена и полимиозит, включая антитела к Ro, антитела к La, антитела к Scl 70, антитела к Jo-1; антитела к ревматоидному фактору при ревматоидном артрите; антитела к поверхностному антигену вируса гепатита B при узелковом полиартериите; антитела к центромерам при синдроме CREST; антистрептококковые антитела при эндокардите или в качестве фактора риска его возникновения; антитела к тиреоглобулину, антитела к тиреоидной пероксидазе и антитела к рецептору TSH при тиреоидите Хашимото; антитела к U1 RNP при смешанных заболеваниях соединительной ткани и системной красной волчанке; и антитела к десмоглеину и кератиноцитам при пузырчатке.
[00158] Композицию GL-2045 согласно настоящему изобретению можно применять для лечения состояний, включая, но не ограничиваясь указанными, застойную сердечную недостаточность (ЗСН), васкулит, розацеа, акне, экзему, миокардит и другие состояния миокарда, системную красную волчанку, диабет, спондилопатии, синовиальные фибробласты и строму костного мозга; потерю костной массы; болезнь Педжета, остеокластому; множественную миелому; рак молочной железы; иммобилизационную остеопению; недоедание, пародонтоз, болезнь Гоше, гистиоцитоз клеток Лангерганса, повреждение спинного мозга, острый септический артрит, остеомаляцию, синдром Кушинга, моноостозную фиброзную дисплазию, полиостозную фиброзную дисплазию, периодонтальную реконструкцию и переломы костей; саркоидоз; остеолитический рак костей, рак легких, рак почек и рак прямой кишки; метастазы в костную ткань, контроль боли в костях и гуморальную злокачественную гиперкальциемию, анкилозирующий спондилит и другие спондилоартропатии; отторжение трансплантата, вирусные инфекции, гематологические новообразования и сходные с неопластическими состояния, например, лимфому Ходжкина; неходжкинскую лимфому (лимфому Беркитта, мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому/хронический лимфолейкоз, грибовидный микоз, лимфому из клеток мантийной зоны, фолликулярную лимфому, диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому, лимфому из клеток маргинальной зоны, лейкоз ворсистых клеток и лимфоплазмоцитарный лейкоз), опухоли из клеток-предшественников лимфоцитов, включая острый В-клеточный лимфобластный лейкоз/лимфому и острый Т-клеточный лимфобластный лейкоз/лимфому, тимому, опухоли из зрелых Т- и NK-клеток, включая периферические Т-клеточные лейкозы, T-клеточный лейкоз/Т-клеточные лимфомы взрослых и лейкоз из больших зернистых лимфоцитов, гистиоцитоз клеток Лангерганса, миелоидные неоплазии, такие как острые миелобластные лейкозы, включая ОМЛ с созреванием, ОМЛ без дифференциации, острый промиелоцитарный лейкоз, острый миеломоноцитарный лейкоз и острый моноцитарный лейкоз, миелодиспластические синдромы, а также хронические миелопролиферативные нарушения, включая хронический миелолейкоз, опухоли центральной нервной системы, например, опухоли головного мозга (глиому, нейробластому, астроцитому, медуллобластому, эпендимому и ретинобластому), плотные опухоли (рак носоглотки, базальноклеточный рак, рак поджелудочной железы, рак желчных протоков, саркому Капоши, рак яичек, рак матки, рак влагалища или рак шейки матки, рак яичников, первичный рак печени или рак эндометрия, опухоли сосудистой системы (ангиосаркому и гемангиоперицитому) или другой рак.
[00159] Композицию GL-2045 согласно настоящему изобретению можно применять для лечения аутоиммунных заболеваний. В настоящем документе термин «аутоиммунное заболевание» относится к разнообразной группе более чем из 80 заболеваний и состояний. При всех этих заболеваниях и состояниях первопричинная проблема заключается в том, что иммунная система организма атакует сам организм. Аутоиммунные заболевания поражают все основные системы организма, включая соединительную ткань, нервы, мышцы, эндокринную систему, кожу, кровь, а также дыхательную и желудочно-кишечную системы. Аутоиммунные заболевания включают, например, хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию, мультифокальную моторную нейропатию, системную красную волчанку, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, миастению гравис и сахарный диабет 1 типа.
[00160] Заболевание или состояние, которое можно лечить с применением композиций и способов согласно настоящему изобретению, может представлять собой гематоиммунологический процесс, включая, но не ограничиваясь ими, серповидно-клеточную анемию, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, аллоиммунную/аутоиммунную тромбоцитопению, приобретенную иммунную тромбоцитопению, аутоиммунную нейтропению, аутоиммунную гемолитическую анемию, аплазию эритроцитов, связанную с парвовирусом В19, приобретенный аутоиммунитет к фактору VIII, приобретенную болезнь Виллебранда, множественную миелому и моноклональную гаммопатию неизвестного значения, сепсис, апластическую анемию, истинную эритроцитарную аплазию, анемию Даймонда-Блэкфана, гемолитическую болезнь новорожденных, опосредуемую иммунной системой нейтропению, рефрактерность к переливанию тромбоцитов, неонатальную посттрансфузионную пурпуру, гемолитический уремический синдром, системный васкулит, тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру или синдром Эвана.
[00161] Заболевание или состояние также может представлять собой иммунологический процесс, включая, но не ограничиваясь ими, синдром Гийена-Барре, хроническую воспалительную демиелинизирующую полирадикулонейропатию, IgM-парапротеинемическую демиелинизирующую полинейропатию, миастенический синдром Ламберта-Итона, миастению гравис, мультифокальную моторную нейропатию, синдром нижних двигательных нейронов, ассоциированный с антителами к GM1, демиелинизацию, рассеянный склероз и нейрит зрительного нерва, синдром мышечной скованности, паранеопластическую дегенерацию мозжечка с антителами к Yo, паранеопластический энцефаломиелит, сенсорную нейропатию с антителами к Hu, эпилепсию, энцефалит, миелит, миелопатию, в частности, связанную с Т-лимфотропным вирусом человека 1, аутоиммунную диабетическую нейропатию, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона или острую идиопатическую дисавтономную нейропатию.
[00162] Заболевание или состояние также может представлять собой воспаление или аутоиммунную реакцию, связанные с потерей слуха или потерей зрения. Например, заболевание или состояние может представлять собой связанную с аутоиммунной реакцией потерю слуха, такую как индуцированная шумом потеря слуха или связанная с возрастом потеря слуха, или может быть связано с имплантацией устройств, таких как слуховые аппараты (например, кохлеарные имплантаты). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения композиции согласно настоящему изобретению могут быть введены субъекту до, одновременно или после имплантации устройства.
[00163] Заболевание или состояние также может представлять собой ревматический патологический процесс, включая, но не ограничиваясь ими, болезнь Кавасаки, ревматоидный артрит, синдром Фелти, ANCA-положительный васкулит, спонтанный полимиозит, дерматомиозит, антифосфолипидные синдромы, рецидивирующие спонтанные аборты, системную красную волчанку, ювенильный идиопатический артрит, синдром Рейно, синдром CREST или увеит.
[00164] Заболевание или состояние также может представлять собой дерматоиммунологический патологический процесс, включая, но не ограничиваясь ими, токсический эпидермальный некролиз, гангрену, гранулему, аутоиммунные кожные волдыри, включая обыкновенную пузырчатку, буллезный пемфигоид, эксфолиативную пузырчатку, витилиго, синдром стрептококкового токсического шока, склеродермию, системный склероз, включая диффузный системный склероз и системный склероз с ограниченным поражением кожи, или атопический дерматит (в частности, стероидозависимый).
[00165] Заболевание или состояние также может представлять собой костно-мышечный иммунологический патологический процесс, включая, но не ограничиваясь ими, миозит с тельцами включения, некротический фасциит, воспалительные миопатии, миозит, миопатию с антителами к декорину (BJ-антиген), паранеопластическую некротическую миопатию, X-сцепленную вакуолизированную миопатию, пеницилламин-индуцированный полимиозит, атеросклероз, ишемическую болезнь сердца или кардиомиопатию.
[00166] Заболевание или состояние также может представлять собой желудочно-кишечный иммунологический патологический процесс, включая, но не ограничиваясь ими, пернициозную анемию, аутоиммунный хронический активный гепатит, первичный билиарный цирроз, целиакию, герпетиформный дерматит, криптогенный цирроз, реактивный артрит, болезнь Крона, болезнь Уиппла, язвенный колит или склерозирующий холангит.
[00167] Заболевание или состояние также может представлять собой реакцию «трансплантат против хозяина», опосредуемое антителами отторжение трансплантата, отторжение трансплантата костного мозга, постинфекционное воспаление, лимфому, лейкоз, неоплазию, астму, сахарный диабет типа 1 с антителами к бета-клеткам, синдром Шегрена, смешанное заболевание соединительной ткани, болезнь Аддисона, синдром Вогта-Коянаги-Харада, мембранопролиферативный гломерулонефрит, синдром Гудпасчера, болезнь Грейвса, тиреоидит Хашимото, гранулематоз Вегенера, микрополиартериит, синдром Черджа-Стросса, узелковый полиартериит или полиорганную недостаточность.
[00168] В настоящем документе термин «аллергия» включает все иммунные реакции, опосредуемые IgE, а также те реакции, которые имитируют IgE-опосредуемые реакции. Аллергия индуцируется аллергенами, включая белки, пептиды, углеводы и их комбинации, которые запускают иммунный ответ IgE или IgE-подобный иммунный ответ. Примерные типы аллергии включают аллергии на орехи, аллергии на пыльцу и аллергии на укусы насекомых. Примерные аллергены включают урушиол в ядовитом плюще и дубе; антиген домашней пыли; компоненты пыльцы березы Bet v 1 и Bet v 2; антиген 15 кДа в сельдерее; антиген яблок Mal d 1; антиген персика Pru p3; аллерген пыльцы тимофеевки Phl p 1; антигены плевела Lol p 3, Lol p I или Lol p V; антиген бермудской травы Cyn d 1; аллергены пылевого клеща Der p1, Der p2 или Der f1; эпитопы α-глиадина и γ-глиадина в глютене; фосфолипазу А2 пчелиного яда; эпитопы Ara h 1, Ara h 2 и Ara h 3 в арахисе.
[00169] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения композицию GL-2045, описанную в настоящем документе, можно применять в системе прайминга, в которой у пациента отбирают кровь и приводят в кратковременный контакт с оптимально изготовленным (и) страдомером (ами) в течение периода времени от приблизительно получаса до приблизительно трех часов перед обратным введением пациенту. В этой форме клеточной терапии собственные эффекторные клетки пациента подвергают воздействию оптимально изготовленного страдомера, который закреплен на матриксе в условиях ex vivo, чтобы модулировать эффекторные клетки за счет воздействия на эффекторные клетки оптимально изготовленного страдомера. Кровь, включая модулированные эффекторные клетки, затем вводят пациенту обратно путем инфузии. Такая система прайминга может иметь многочисленные варианты клинического и терапевтического применения.
[00170] Композицию GL-2045, раскрытую в настоящем документе, также можно легко применять для изменения ответов иммунной системы в различных случаях, чтобы влиять на конкретные изменения в профилях иммунного ответа. Изменение или модуляция иммунного ответа у субъекта относится к увеличению, снижению или изменению соотношения или компонентов иммунного ответа. Например, уровни выработки или секреции цитокинов могут быть увеличены или снижены по желанию путем нацеливания на комплемент вместе с соответствующей комбинацией FcR страдомеров, сконструированных для связывания комплемента и взаимодействия с этими рецепторами. Выработка антител также может быть увеличена или снижена; соотношение двух или более цитокинов или рецепторов иммунных клеток может быть изменено; или может быть вызвана выработка дополнительных типов цитокинов или антител.
[00171] Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения субъект с аутоиммунным или воспалительным заболеванием имеет измененный иммунный ответ, включающий этап введения субъекту терапевтически эффективного количества композиции GL-2045, описанной в настоящем документе, при этом терапевтически эффективное количество композиции GL-2045 изменяет иммунный ответ у субъекта. В наилучшем случае это вмешательство лечит заболевание или состояние у субъекта. Измененный иммунный ответ может представлять собой увеличенный или сниженный ответ и может включать измененные уровни цитокинов, включая уровни любого из ИЛ-1RA и других членов семейства ИЛ-1, рецепторов ИЛ-10, ИЛ-8, ИЛ-23, ИЛ-7, ИЛ-4, ИЛ-12, ИЛ-13, ИЛ-17 и ИЛ-1, ФНО-α, других членов семейства ФНО и рецепторов ФНО, ИФН-α, других членов семейства интерферонов и уровни рецепторов интерферона или хемокинов, включая уровни любого из членов семейства хемокинов CCL, CXC, XC и FAM19. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения уровни ИЛ-6 или ИЛ-8 снижаются в ответ на терапию. Согласно особенно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения уровни ИЛ-6 и ИЛ-8 снижаются в ответ на терапию и/или уровни ИЛ-10 или ИЛ-1RA увеличиваются в ответ на терапию. Однако настоящее изобретение не ограничивается каким-либо конкретным механизмом действия описанных биомиметиков. Измененный иммунный ответ может представлять собой измененный уровень аутоантител у субъекта. Измененный иммунный ответ может представлять собой измененный уровень аутоагрессивных Т-клеток у субъекта.

[00172] Например, уменьшение количества вырабатываемого ФНО-альфа при аутоиммунных заболеваниях может иметь терапевтические эффекты. Это явление находит практическое применение в терапии антителами к ФНО-альфа (например, ремикейд (REMICADE)), клиническая эффективность которой доказана для лечения бляшечного псориаза, ревматоидного артрита, псориатического артрита, болезни Крона, язвенного колита и анкилозирующего спондилита. Эти аутоиммунные заболевания имеют различную этиологию, но имеют общие иммунологические компоненты патологических процессов, связанных с воспалением и активностью иммунных клеток. Страдомер, сконструированный для уменьшения выработки ФНО-альфа, также будет иметь сходную эффективность в отношении этих и многих других аутоиммунных заболеваний. Измененный профиль иммунного ответа также может представлять собой прямую или косвенную модуляцию, чтобы уменьшить выработку антител, например, аутоантител, нацеленных на собственные ткани субъекта, или изменить уровень аутоагрессивных Т-клеток у субъекта. Например, рассеянный склероз представляет собой аутоиммунное заболевание с участием аутореактивных Т-клеток, которое можно лечить с применением терапии на основе интерферона-бета. Смотри, например, Zafranskaya M, et al., Immunology 2007 May;121(l):29-39-Epub 2006 Dec 18. Оптимально изготовленный страдомер, сконструированный для снижения уровня аутореактивных Т-клеток, также будет иметь сходную эффективность при рассеянном склерозе и многих других аутоиммунных заболеваниях с участием аутореактивных Т-клеток.
[00173] Композицию GL-2045, описанную в настоящем документе, можно применять для модуляции экспрессии костимулирующих молекул иммунной клетки, включая дендритную клетку, макрофаг, остеокласт, моноцит или NK-клетку, или для ингибирования дифференцировки, созревания или секреции цитокинов, включая интерлейкин-12 (ИЛ-12), или увеличения секреции цитокинов, включая интерлейкин-10 (ИЛ-10), интерлейкин-6 (ИЛ-6), или ИЛ-1-RA, в этих клетках иммунной системы. Специалист в данной области техники также может подтвердить эффективность оптимизированного иммунологически активного биомиметика, воздействуя на иммунную клетку оптимизированным иммунологически активным биомиметиком и измеряя модуляцию функции иммунных клеток, причем иммунная клетка представляет собой дендритную клетку, макрофаг, остеокласт или моноцит. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения иммунную клетку подвергают воздействию оптимизированного иммунологически активного биомиметика в условиях in vitro с дополнительным этапом определения количества рецептора клеточной поверхности или выработки цитокина, причем изменение количества рецептора клеточной поверхности или выработки цитокинов указывает на модуляцию функции иммунных клеток. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения иммунную клетку подвергают воздействию оптимизированного иммунологически активного биомиметика в условиях in vivo в модели аутоиммунного заболевания на животных с дополнительным этапом оценки степени улучшения аутоиммунного заболевания.
[00174] Композицию GL-2045, описанную в настоящем документе, также можно применять в качестве компонента устройства. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения GL-2045 согласно настоящему изобретению может быть нанесен в виде покрытия на устройство, такое как медицинский имплантат. Например, оптимально изготовленные страдомеры могут быть нанесены в виде покрытия на коронарный стент или в качестве части терапии наночастицами для усиления проникновения и увеличения продолжительности высвобождения лекарственного препарата, например, для интраофтальмического применения при увеите или дегенерации желтого пятна. Оптимально изготовленные страдомеры, описанные в настоящем документе, также можно применять как компонент диагностики. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения специалист в данной области техники может индивидуально подобрать терапию, определяя, у каких пациентов применение страдомера может быть особенно благоприятным. Например, специалист в данной области техники может подвергнуть иммунные клетки пациента воздействию иммунологически активного биомиметика и измерить модуляцию активации иммунных клеток или созревания методом проточной цитометрии или измерить цитокиновый профиль для того чтобы выявить пациентов с повышенным ответом.
[00175] Все источники, цитируемые в настоящем документе, полностью включены посредством ссылки.
ПРИМЕРЫ
[00176] Различные подходы к способу изготовления применяли, чтобы оптимизировать комбинацию высокого титра белка, длительной жизнеспособности с сопутствующим низким содержанием остатков погибших клеток и получение мультимеров GL-2045 более высокого порядка. В частности, для определения оптимальных условий для продуктов GL-2045 с повышенной мультимеризацией варьировали следующие аспекты начального способа изготовления: основная среда, тип добавки к питательной среде, время подачи добавки к питательной среде, изменение температуры, аэрация и условия встряхивания колбы. В каждом случае для определения оптимальных условий исследовали плотность клеток, жизнеспособность, титр белка и мультимеризацию. Кроме того, аспекты последующего способа изготовления, включая буферы, протоколы промывки и выбор колонок, варьировали для определения оптимальных условий очистки и фильтрации GL-2045, при которых поддерживался оптимальный профиль мультимеризации GL-2045. Следующие примеры приведены только для иллюстрации и не являются ограничивающими.
Пример 1 - фракционный анализ и исследование методом интерферометрии биослоев GL-2045
[00177] Растворы GL-2045 фракционировали с применением колонки GE Hi-Load 26/60 Superdex 200 пг (GE, каталожный номер 17-1071-01) в буфере, содержащем 0,05 М трис-HCl + 0,15 М NaCl (рН=7,5). 3,2 мл раствора GL-2045 загружали при скорости потока 2,6 мл/мин. Шесть фракций (1-6) собирали в объеме 2,0 мл и определяли концентрацию белка с помощью УФ-спектрометрии при 280 нм (ФИГ. 1A). Оценивали мультимеризацию для каждой из фракций GL-2045. В общих чертах, образцы каждой фракции 1-6 загружали на 4-12% невосстанавливающие гели NuPAGE™ BT (Invitrogen, каталожный номер NP0322BOX). Образцы разделяли в течение приблизительно 3 часов при 150 вольт. Результаты представлены на ФИГ. 1В и демонстрируют отчетливые различия между фракциями 1-6 в присутствии мультимеров GL-2045 высшего порядка. Фракции 1-3 состоят из мультимеров более низкого порядка (например, полосы 1-4). Фракция 1 состоит почти исключительно из гомодимера, имеющего кажущуюся мол. массу 55 кДа (полоса 1, оценки мол. массы на основании данных электрофореза в ДСН-ПААГ в невосстанавливающих условиях). Фракция 2 состоит из приблизительно 97% димера гомодимера, имеющего мол. массу 110 кДа (полоса 2). Фракция 3 состоит в основном из полос 3 и 4, имеющих мол. массу 165 кДа и 220 кДа, соответственно, вместе с меньшими количествами полос 2, 5 (мол. масса=275 кДa), 6 (мол. масса=330 кДa) и 7 (мол. масса=385 кДа). Фракция 4 состоит преимущественно из полос 4, 5 и 6 вместе с меньшими количествами полос 3, 7, 8 (мол. масса=440 кДa) и полос более высокого порядка. Однако фракции 5 и 6 состоят преимущественно из мультимеров более высокого порядка (полосы 5+).
[00178] Связывание фракций GL-2045 с рецептором FcγRIIIA исследовали методом интерферометрии биослоев для оценки кинетики связывания. Интерферометрия биослоев позволяет детектировать связывание между лигандом, иммобилизованным на поверхности кончика биосенсора, и аналитом в растворе. Когда происходит связывание, это вызывает увеличение оптической толщины на кончике биосенсора, что приводит к сдвигу длины волны (детектируемому как единица ответа «RU»). Максимальный уровень связывания (RUmax) представляет собой максимально возможное количество образца, связывающегося в равновесном состоянии, которое насыщает количество лиганда на поверхности сенсора.
[00179] His-меченые рецепторные белки (5 мкг/мл) связывали с анти-His-сенсорным кончиком (Anti-Penta-His HIS1K, ForteBio, каталожный номер 18-5121) в 1× буфере для кинетического анализа от ForteBio (каталожный номер 18-1092) в течение 300 секунд. Нагруженный сенсор переносили в 1× кинетический буфер без меченых рецепторов или лигандов, чтобы получить измерения в начальных условиях в течение 60 секунд. После получения начальных данных скорость ассоциации рецептора/белка измеряли путем переноса кончика сенсора в 1× кинетический буфер, содержащий выбранный очищенный страдомер, на 60 секунд при концентрациях 50 мкг/мл, 25 мкг/мл и 12,5 мкг/мл. Скорость диссоциации измеряли в течение 300 секунд путем переноса кончика сенсора в 1× кинетический буфер, и значение RU, значение скорости ассоциации, скорости диссоциации и значение Kd рассчитывали с использованием программного обеспечения ForteBio.
[00180] Результаты для кривой связывания представлены на ФИГ. 2, и данные по кинетике связывания, рассчитанные с помощью программного обеспечения ForteBio Octet, представлены в таблице 2. Кривые связывания демонстрируют более высокую авидность при все более низкой скорости диссоциации для фракций, содержащих GL-2045 с более высокой молекулярной массой (например, фракций 3, 4, 5 и 6), чем наблюдается для фракций с более низкой молекулярной массой (например, фракций 1 и 2), и указывают на то, что фракции GL-2045 с высокой молекулярной массой связываются более авидно, чем фракции с более низкой молекулярной массой.
Таблица 2: обобщенные данные по кинетике связывания для фракций GL-2045
Пример 2 - количественное исследование комплементзависимого лизиса клеток (КЗЦ) с применением фракций GL-2045
[00181] Оценивали способность фракций GL-2045 ингибировать активацию комплемента. GL-2045 фракционировали с помощью эксклюзионной хроматографии на 6 фракций (ФИГ. 3A), мультимеризацию каждой из которых исследовали в невосстанавливающем геле (ФИГ. 3C). Чтобы определить влияние каждой фракции на активацию комплемента, клетки линии Will-2, экспрессирующие CD20, инкубировали с моноклональным антителом к CD20 в течение 20 минут, после этого клетки центрифугировали и ресуспендировали в свежих средах. Затем клетки инкубировали в 96-луночном планшете в средах, содержащих каждую из фракций 1-6, описанных в настоящем документе, а также нефракционированный GL-2045 для сравнения в одной из шести концентраций: 100 мкг/мл, 50 мкг/мл, 20 мкг/мл, 10 мкг/мл, 5 мкг/мл или 1 мкг/мл. Сыворотку добавляли к клеточным суспензиям, чтобы инициировать комплементзависимый лизис клеток, и планшет инкубировали при 37°C в течение 3 часов. Гибель клеток определяли количественно с помощью количественного исследования Promega Cytotox Glo. Реагент для количественного исследования Cytotox добавляли в каждую лунку планшета, и планшет инкубировали в темноте в течение 15 минут при комнатной температуре. Через 15 минут люминесценцию считывали на люминометре Promega GloMax и на основании этих показаний рассчитывали гибель клеток. Результаты представлены на ФИГ. 4A-4D и демонстрируют, что фракции 5 и 6 (содержащие мультимеры с более высокой молекулярной массой в полосах 5-13) более значительно ингибировали КЗЦ, чем мультимеры с меньшей молекулярной массой, присутствующие во фракциях 1-4. Также отмечено, что только фракции, которые составляли полосу 4 и выше, демонстрировали эффективное ингибирование КЗЦ, что согласуется с поливалентным связыванием области Fc мультимеров более высокого порядка с гексамерным C1q.
Пример 3 - связывание фракций GL-2045 с FcγRIIIa
[00182] Определяли связывание фракций GL-2045 с FcγRIIIa. Супернатант GL-2045 очищали с помощью аффинной хроматографии с белком A HiTrap MabSelect Sure (GE, каталожный номер 11-0034-95) и буфера для связывания, содержащего 20 мМ фосфата натрия, 0,15 М NaCl, рН=7,2, и элюировали 0,1 М глицином, рН=2,7 (ФИГ. 5A). GL-2045, очищенный с помощью аффинной хроматографии, хранили в 1× ФСБ, pH=7,2 (Quality Biological Inc., каталожный номер 119-069-101). Пул очищенного GL-2045 дополнительно подвергали диализу против 50 мМ ацетата натрия, рН=5,0 и заключительно очищали с помощью катионообменной хроматографии на колонке POROS CIEX (колонка GOPURE диаметром 1,2 см и длиной 10 см, Poros XS, Life Technologies, каталожный номер 4448885) с применением буфера для связывания, содержащего 50 мМ ацетата натрия, рН=5,0, и элюирующего градиента (от 0 до 100% элюирующего буфера), содержащего 50 мМ ацетата натрия, 1 М NaCl, рН=5,0. Этап заключительной очистки выполняли без устранения мультимеров высшего порядка и/или неупорядоченных агрегатов из конечных фракций. В качестве последнего этапа GL-2045 после заключительной очистки на CIEX концентрировали до объема ≤5 мл, и буфер заменяли рабочим буфером для гель-фильтрации и впрыскивали в колонку для гель-фильтрации (Hiload 26/60 Superdex 200 пг (GE, каталожный номер 17-1071-01)) с использованием 0,05 М трис-HCl + 0,15 М NaCl, pH=7,5 в качестве рабочего буфера (трис-HCl, pH=7,5, Teknova, каталожный номер T1075). Мультимеризацию фракций затем исследовали, анализируя гель (ФИГ. 5B и ФИГ. 5C).
50
50
50
[00183] Связывание фракционированного GL-2045 с FcγRIIIa определяли с помощью количественного исследования связывания FcγRIIIa методом ИФА. В общих чертах, 96-луночные планшеты покрывали рекомбинантным FcγRIIIa и обеспечивали время для взаимодействия с GL-2045. После промывки количество FcγRIIIa-связанного материала определяли с использованием МАТ для детектирования Fc в количественном исследовании на основе ИФА (ФИГ. 6A и ФИГ. 6B). Значения ЭК для каждой фракции представлены в таблице 3. Эти результаты демонстрируют, что мультимеры более высокого порядка (фракции 1C4, 1C5, 1C6, 1C7, 1C8, 1C9, 1C10 и 1C11) проявляют более авидное связывание с FcγRIIIa, отмеченное низким значением ЭК, чем мультимеры более низкого порядка (фракции 1D9, 1E4 и 1F7) и, неожиданно, более авидное связывание, чем мультимеры с наивысшей молекулярной массой (фракции 1C3, 1C2, 1C1, 1B12, 1B11). Предполагается, что фракции с наивысшей молекулярной массой содержат некоторые низкоактивные агрегированные фракции с высокой молекулярной массой вместе с высокофункциональными мультимерами высшего порядка (например, фракции 1B11, 1B12, 1C1, 1C2 и 1C3). Эти результаты очень неожиданно указывают на то, что не все высокомолекулярные фракции GL-2045 демонстрируют повышенное связывание с FγR, вероятно, из-за эффектов неупорядоченной агрегации гомодимера в противоположность образованию высокоупорядоченных мультимеров с высокой молекулярной массой. Эти данные указывают на то, что существует необходимость в оптимизированных последующих способах изготовления (включая оптимизированные условия для очистки на белке A, ионообменной хроматографии и хроматографии гидрофобного взаимодействия) в комбинации с оптимальными начальными способами изготовления для получения и удержания высокомолекулярных мультимеров более высокого порядка и устранения неупорядоченных высокомолекулярных агрегатов (например, 1B11 и 1B12), которые менее эффективно связывают целевые низкоаффинные рецепторы (см. значение ЭК для 1B11 и 1B12 в таблице 3).
50
Таблица 3: значения ЭК для фракций GL-2045, связывающихся с FcγRIIIa
Пример 4 - Исследование фракций GL-2045 с использованием C5a-индуцированного хемотаксиса
[00184] Клеточную культуру, экспрессирующую GL-2045, выращивали в средах PowerCHO2 (Lonza, каталожный номер U21-070) с L-глутамином (Lonza, каталожный номер 17-605E) и добавкой HT (Life Technologies, каталожный номер 11067-030). Супернатант GL-2045 очищали с помощью аффинной хроматографии с белком A HiTrap MabSelect Sure (GE, каталожный номер 11-0034-95), затем фракционировали с помощью AIEX HiScreen Q FF (GE, каталожный номер 28-9505-10) с использованием различных условий pH, чтобы отделить низкомолекулярные полосы от высокомолекулярных полос. Результаты представлены на ФИГ. 7 (GL-GLM-01=рекомбинантная нефракционированная область Fc (G001), GL-GLM-02=нефракционированный GL-2045, GL-GLM-05=фракционированный GL-2045 при pH=6,0, GL-GLM-06=фракционированный GL-2045 при рН=6,5, GL-GLM-07=фракционированный GL-2045 при рН=7,0, GL-GLM-08=фракционированный GL-2045 при рН=7,5). Наконец, различные фракции концентрировали и подвергали диализу против HBSS (Lonza, каталожный номер 10-527F).
[00185] Супернатант GL-2045 очищали с помощью аффинной хроматографии с белком A (pA) HiTrap MabSelect Sure (GE, каталожный номер 11-0034-95) с применением буфера для связывания, содержащего 20 мМ фосфата натрия, 0,15 М NaCl, рН=7,2. После первой промывки буфером для связывания и второй промывки буфером, содержащим 1 М NaCl, 5 мМ ЭДТА, 2 М мочевины, 50 мМ фосфата, рН=7,0, белок, связанный с рА, элюировали 0,1 М глицином, рН=2,7.
[00186] GL-2045, очищенный с помощью аффинной хроматографии, хранили в 1× ФСБ, pH=7,0 (Quality Biological Inc., каталожный номер 119-069-101). 4 партии очищенного GL-2045 дополнительно разбавляли (6×) 50 мМ Трис-HCl при рН=6,0, 6,5, 7,0 или 7,5 и очищали с помощью анионообменной хроматографии на колонке HiScreen Q FF с буфером для связывания, содержащим 50 мМ трис-HCl при рН=6,0, 6,5, 7,0 или 7,5, и элюировали с помощью градиентного элюирования (от 0 до 100% элюирующего буфера), содержащего 50 мМ трис-HCl + 1 М NaCl при рН=6,0, 6,5, 7,0, 7,5.
6
[00187] Эти очищенные фракции использовали для определения влияния фракций GL-2045 на хемотаксис нейтрофилов. В общих чертах, компонент комплемента C5a добавляли в качестве хемоаттрактанта в нижнюю лунку камеры Бойдена в концентрации 1 нМ. Перед внесением в камеру Бойдена нейтрофилы (конечная концентрация 2,25×10 клеток/мл, очищенные из МКПК из цельной крови) предварительно инкубировали с указанными фракциями GL-2045 (конечные концентрации 0,02-10 мкг/мл) или контрольной рекомбинантной областью Fc (GLM-001, G001) в течение 30 минут. Затем суспензии клеток добавляли в верхнюю лунку камеры Бойдена и инкубировали в течение 25 минут. После инкубационного периода оценивали мигрировавшие популяции, подсчитывая количество клеток в нижней камере для каждого условия и определяя процент хемотаксиса для каждого условия (ФИГ. 8). Хемотаксис не наблюдали для GL-GLM-001 (контрольная рекомбинантная область Fc, G001). Мультимеры более высокого порядка (фракции GL-GLM-002, GL-GLM-005, GL-GLM-006 и GL-GLM-007, содержащие полосы 5-13) продемонстрировали более авидное ингибирование С5а-индуцированного хемотаксиса, чем мультимеры более низкого порядка (фракция GL-GLM-008, содержащая полосы 1-4).
[00188] Данные, представленные в примерах 1-4, демонстрируют повышенную эффективность мультимеров GL-2045 более высокого порядка. На основании приведенных выше данных испытывали протоколы начальных способов изготовления, чтобы определить оптимальные условия для индивидуального получения мультимеров GL-2045 более высокого порядка (например, полосы 5+ на ФИГ. 1, 3, 5 и 7), чтобы достичь максимальной биологической эффективности.
Пример 5 - скрининг основных сред при получении GL-2045
[00189] Цель данного эксперимента заключалась в испытании эффекта панели основных сред на титр белка GL-2045, жизнеспособность клеток, плотность клеток и мультимеризацию GL-2045.
2
2
6
[00190] GL-2045 выращивали в средах ProCHO5 (Lonza, каталожный номер 12-766Q) с добавлением L-глутамина (Lonza, каталожный номер 17-605E), гипоксантина натрия и тимидина (HT, Gibco каталожный номер 11067-030) в инкубаторе со встряхиванием при температуре 37°C и 5% СО. После пассирования клетки промывали и высевали с двумя повторами в количестве 0,5×10 клеток/мл в отобранных средах (представлены в таблице 4) в пробирки для центрифугирования объемом 50 мл. Каждая пробирка содержала 10 мл культуры и была помещена в инкубатор со встряхиванием Maglev (Kuhner) при 37°C, 5% CO, 80% влажности и скорости вращения 180 об./мин. На 4, 8 и 10 день из каждой культуры отбирали по одному миллилитру образца для измерения плотности клеток, жизнеспособности клеток и уровня глюкозы. Образцы центрифугировали и супернатанты хранили при температуре +4°C. В отобранные среды, которые не содержали 4 мМ L-глутамина и 1× гипоксантина натрия и тимидина, добавляли L-глутамин и HT в качестве компонентов. Условия размножения для отобранных сред приведены в таблице 4.
Таблица 4: условия размножения для отобранных сред
[00191] В клеточных культурах, экспрессирующих GL-2045, выращенных в отобранных средах, оценивали плотность клеток, жизнеспособность клеток, титр белка и процентное содержание мультимеров более высокого порядка. Оценки плотности и жизнеспособности клеток осуществляли путем смешивания клеток с трипановым синим. Жизнеспособные и мертвые клетки подсчитывали, используя ручной счетчик клеток. Данные для 4 и 8 дня культивирования показаны для плотности клеток (ФИГ. 9, таблица 5) и жизнеспособности клеток (ФИГ. 10, таблица 6). Из 19 испытанных сред наибольшую плотность клеток на 4 день наблюдали при применении ActiCHO P, CHOMACS CD и CD FortiCHO. К 8 дню динамика плотности клеток была отрицательной для всех сред, за исключением ActiCHO P, BalanCD CHO, ExpiCHO, Cell Vento CHO 210 и Cell Vento CHO 210, по сравнению с 4 днем. Из 19 сред наибольшую испытанную жизнеспособность клеток на 8 день наблюдали при применении ActiCHO P, затем следовали ExpiCHO, Cell Vento CHO 110 и HYQ SFX-CHO LM. Единственная среда из 19 испытанных сред, которая имела положительную динамику жизнеспособности клеток с 4 день по 8 день, была ActiCHO P. Соответственно, единственной средой, которая обеспечивает высокую плотность клеток на 4 день и не имеет отрицательной динамики для плотности клеток на 8 день, является ActiCHO P.
[00192] Культуры осаждали на 10 день, фильтровали через фильтр с размером пор 0,2 мкм и хранили при 4°C до очистки с помощью аффинной колонки с белком A. Для очистки супернатанты культур очищали с помощью аффинной хроматографии на колонке с белком A объемом 1 мл HiTrap MabSelect SuRe (GE, каталожный номер 11-0034-93) с применением буфера для связывания, содержащего 20 мМ фосфата натрия, 0,15 М NaCl, рН=7,2. Связанный с колонкой белок промывали буфером для связывания с последующей второй промывкой 1 М NaCl, 5 мМ ЭДТА, 2 М мочевиной, 50 мМ фосфатом, рН=7,0. GL-2045, связанный с колонкой, элюировали 0,1 М глицином рН=2,7 и обессоливали в 1× ФСБ при рН=7,0 через колонку для обессоливания HiPrep 26/10 (GE, каталожный номер 17-5087-01). Все очищенные образцы хранили при 4°C. Измерения титров белка выполняли с помощью интерферометрии биослоев (Octet) (ФИГ. 11 и таблица 7). Из 19 испытанных основных сред наибольший титр белка на 10 день наблюдали при применении Cell Vento CHO 110, за которой следовали среда BalanCD CHO Growth A, ActiCHO P и ExpiCHO. В случае других сред произошло значительное снижение титра.
[00193] Чтобы определить процентное содержание мультимеров более высокого порядка, каждую очищенную культуру загружали (в невосстановленной форме) на ДСН-ПААГ (3-8% трис-ацетатный гель NuPAGE, Life Technologies, каталожный номер EA03752BOX). 2 мкг белка разводили в 3 мкл буфера для образца (NuPAGE, LDS (4×), Life Technologies, каталожный номер NP0007), 20 мкМ йодацетамида (Bio Rad, каталожный номер 163-2109) и вносили деионизированную (ДИ) воду до конечного объема 10 мкл. Образцы нагревали при 80°C в течение 10 минут, загружали на гель и анализировали при 150 В в течение 1 часа 25 минут с использованием рабочего буфера (трис-ацетат ДСН (20×) (Life Technologies, каталожный номер LA0041)). Гели промывали в деионизированной воде, окрашивали с помощью SimplyBlue Safe (Life Technologies, каталожный номер LC6060) и обесцвечивали в деионизированной воде. После полного обесцвечивания изображения получали с использованием системы G:BOX от Syngene, и профиль полос исследовали методом денситометрии с использованием программного обеспечения GeneTools, Syngene. Измеряли интенсивность каждой отдельной полосы в каждой дорожке (ФИГ. 12A и ФИГ. 12B).
[00194] Неожиданно было обнаружено, что наибольшее процентное содержание мультимеров более высокого порядка, более полосы 4, наблюдали при применении ActiCHO P, за которой следовали EX-CELL CD CHO и CH-S SFM2 (таблица 8), из 19 испытанных сред. Эти данные указывают на то, что увеличение процентного содержания мультимеров более высокого порядка является независимой переменной, которую необходимо контролировать, и оно не находится в прямой зависимости от увеличения титра общего белка. Применение ActiCHO P позволило получить третий по величине титр белка и наибольший уровень мультимеризации (45,9% белка присутствовало в полосах 5+), тогда как Cell Vento CHO 110 привела к наибольшему титру белка, но существенно более низкому уровню мультимеризации (32,6% белка присутствовало в полосах 5+).
Пример 6 - скрининг сред для GL-2045 с добавками к питательным средам
Рекомендуемые графики подачи добавок к питательным средам
[00195] На основании результатов экспериментов в примере 5, четыре основные среды, связанные с самыми высоким титрами белка GL-2045, и три основные среды, связанные с самыми низкими титрами белка GL-2045, являлись предметом повторного эксперимента, в котором во время культивирования подавали коммерчески доступные добавки к питательной среде. Cell Vento 110 и ExpiCHO, которые приводили к получению высоких титров, не были отобраны для эксперимента с подачей добавок к питательным средам, поскольку не было установлено ни одного типа добавки к питательной среде, рекомендованного производителем. Cell Vento CHO 110 представляет собой полноценную среду для применения для адаптации клеток без добавок к питательной среде, тогда как Cell Vento 210 используется для культивирования в комбинации с добавками к питательной среде. Комбинации сред и добавки к питательной среде, использованные в этом эксперименте, подробно описаны в таблице 9.
2
2
6
6
6
6
[00196] Клон 58 GL-2045 культивировали в средах «ProCHO5» (Lonza, каталожный номер 12-766Q) с L-глутамином (Lonza, каталожный номер 17-605E), гипоксантином натрия и тимидином (HT, Gibco каталожный номер 11067-030) в инкубаторе со встряхиванием при 37°C и 5% СО. После пассирования клетки промывали и высевали в количестве 0,5×10 клеток/мл, затем субкультивировали до достижения плотности от 1×10 до 3×10 клеток/мл и ≥80% жизнеспособности. Клон 58 GL-2045 адаптировали непосредственно к отобранным средам, подробно описанным в таблице 10. Адаптацию считали завершенной, когда клетки достигали стабильного времени удвоения (20-30 ч) и плотности жизнеспособных клеток (VCD) ≥90% в течение не менее 2-3 пассирований. Клетки высевали в количестве 0,5×10 клеток/мл в отобранные среды (d0) и инкубировали на стандартной встряхивающей платформе в инкубаторе при 150 об./мин, 37°C, 5% СО и высокой влажности. Для всех культур, кроме PowerCHO3 CD, подачу добавок к питательным средам начинали на 3 день (d3). Подачу добавок к питательным средам PowerCHO3 CD начинали на 1 день. Общий объем культуры составлял 120 мл. Культуры собирали, если жизнеспособность падала до 50%. Стабильную клеточную линию GL-2045 выращивали в каждой из 7 сред вместе с рекомендованной производителем добавкой к питательной среде в соответствии с рекомендованным протоколом. Стратегия и график подачи добавок к питательным средам для каждой из испытанных сред показаны на ФИГ. 13А и ФИГ. 13В.
[00197] Измерения плотности клеток, жизнеспособности клеток и титра белка GL-2045 проводили на протяжении всего исследования. Для определения титра белка образцы центрифугировали, чтобы осадить клетки, и измерение белка в клеточном супернатанте проводили с помощью интерферометрии биослоев (Octet) клеточного супернатанта, как описано в примере 6. Мультимеризацию GL-2045 оценивали по окончании каждой части исследования после очистки с применением белка A, как описано в примере 5. Культуры поддерживали до 14 дня или до тех пор, пока жизнеспособность не падала ниже 50%.
[00198] Неожиданным фактом явилось то, что GL-2045, выращенный в ActiCHO P с добавками к питательным средам, рекомендованными производителем, достиг гораздо более высокой пиковой плотности клеток, чем GL-2045, выращенный в любых других средах с добавками к питательным средам, рекомендованными производителем. Эта превосходящая плотность клеток была неожиданно выше в 3 раза или более по сравнению со всеми другими испытанными комбинациями среды/добавка к питательной среде, за исключением Cell Vento 210 (ФИГ. 14).
[00199] Кроме того, GL-2045, выращенный в ActiCHO P, CD FortiCHO или ADCF MAB с добавками к питательной среде, рекомендованными производителем, достиг гораздо лучшей (в 2-3 раза) жизнеспособности клеток на 10 день, чем GL-2045, выращенный в других испытанных средах с добавками к питательной среде, рекомендованными производителем. Это свидетельствует о том, что эти три среды обеспечивают превосходную жизнеспособность клеток по сравнению с несколькими другими испытанными комбинациями сред/добавок к питательным средам (ФИГ. 15).
[00200] Помимо этого стабильная линия клеток CHO GL-2045, выращенная в средах ActiCHO P с рекомендованными производителем ActiCHO Feed A и ActiCHO Feed B, приводила к получению существенно более высоких титров, чем любые другие испытанные среды и рекомендованные производителем добавки к питательной среде (ФИГ. 16). Титр, полученный из культуры ActiCHO P, был по меньшей мере в 4 раза выше, чем титр для любой из других испытанных сред, и достиг 2 г/л на 10 день во встряхиваемой колбе, по сравнению с менее чем 500 мг/л для Cell Vento CHO-210 на 12 день и даже ниже для других сред.
[00201] Мультимеризацию GL-2045, измеренную как процентное содержание мультимера в полосах 5 и выше (5+) в разных условиях культивирования, определяли, как описано в примере 5 (ФИГ. 17, таблица 10). Самый высокий показатель мультимеризации GL-2045, полученный при применении рекомендованных производителем основных сред и добавок к питательным средам, наблюдали для CD FortiCHO, за которой следовали ActiCHO и PowerCHO3. ADCF-Mab и BalanCD продемонстрировали значительно худшую мультимеризацию GL-2045 по сравнению с другими условиями культивирования.
Таблица 10: процентное содержание мультимеров для комбинаций среды + добавка к питательной среде
[00202] Подытоживая, среды ActiCHO P превосходят другие испытанные среды в отношении плотности клеток, их жизнеспособности и титра белка. Исследование методом денситометрии выявило, что среда CD FortiCHO + CD Efficient Feed C позволила получить самое высокое процентное содержание наиболее активных мультимеров (таблица 10, группы 5+), составившее 35,7%. Однако среда CD FortiCHO + CD Efficient Feed C позволила получить самое высокое процентное содержание высокомолекулярного материала, который не перемещается в гель, составившее 4,7% (как показано в верхней части геля на ФИГ. 17), это указывает на то, что эти среды также приводят к образованию большей фракции агрегированных неупорядоченных мультимеров с меньшим количеством высокоупорядоченных и более функциональных мультимеров, чем ActiCHO P. ActiCHO P + Feed A и B позволила получить второе самое высокое процентное содержание полос мультимеров более высокого порядка, выше полосы 4, составившее 30,1% с незначительным количеством неспецифично агрегированного высокомолекулярного материала, который не перемещается в гель. Соответственно, ActiCHO P, вероятно, имеет самое высокое процентное содержание полос полностью функциональных мультимеров более высокого порядка. Эти данные также неожиданно указывают на то, что начальные условия изготовления не только влияют на жизнеспособность клеток, плотность и общий титр белка, но также на получение клинически эффективных мультимеров GL-2045 более высокого порядка. Как продемонстрировано в примере 3, фракции с наибольшей молекулярной массой проявляли сниженное связывание с FcRγIIIa, это указывает на то, что фракции с самой высокой молекулярной массой (например, неупорядоченные агрегаты GL-2045) являются биологически менее активными, чем высокоупорядоченный мультимер GL-2045. Как показано в настоящем документе, очень неожиданным фактом явилось то, что из всех испытанных основных сред только ActiCHO-P продемонстрировала высокий титр общего белка GL-2045, высокую мультимеризацию, а также минимальные количества неупорядоченных высокомолекулярных агрегатов GL-2045.
Измененные протоколы подачи добавок к питательным средам
[00203] После определения того, что среды ActiCHO P + добавка к питательной среде позволили получить оптимальный титр белка и мультимеры более высокого порядка, испытывали измененные графики подачи добавок к питательным средам, чтобы определить, можно ли достичь сходных или оптимизированных результатов при подаче добавок к питательным средам через день. Как продемонстрировано на ФИГ. 18, подача добавок к питательным средам через день (синий цвет) не оказывала заметного влияния на плотность клеток (ФИГ. 18A), жизнеспособность клеток (ФИГ. 18B), рН культуры (ФИГ. 18C) или титр белка (ФИГ. 18D) по сравнению с ежедневной подачей добавок к питательным средам. Эти результаты неожиданно указывают на то, что сходные результаты могут быть получены при подаче добавок к питательным средам через день, и могут быть предпочтительными для поддержания стерильности и минимизации затрат на изготовление. Однако аналогичные эксперименты по подаче добавок к питательным средам каждый третий день показали, что жизнеспособность и выработка белка могут начать снижаться при подаче добавок к питательным средам реже, чем каждые 2 дня (ФИГ. 19).
6
[00204] Проводили дополнительные эксперименты для определения того, можно ли применять ActiCHO P Feed с другими основными средами, отличными от ActiCHO, чтобы достичь сходных результатов. В общих чертах, клон 58 GL-2045 культивировали в Power CHO-2 CD (Lonza, каталожный номер 12-771Q) + 4 мМ L-глутамина (Lonza, каталожный номер 17-605E) + 1× добавки HT (Gibco, каталожный номер 11067-030). После пассирования клетки промывали и высевали в количестве 0,3×10 клеток/мл в полные среды ActiCHO P + 6 мМ L-глутамина (Lonza, каталожный номер 17-605E) или полные среды Power CHO-2 CD и культивировали без изменения температуры. В культуры ActiCHO P PowerCHO добавки к питательной среде вносили каждый день с добавлением 1 мл ActiCHO Feed-A (РАА, каталожный номер U15-072) + 0,1 мл Feed-B (РАА, каталожный номер U05-034). На 9 день жизнеспособность клеток и титр белка определяли, как описано в примере 5, во всей культуре (ФИГ. 20). Результаты показывают, что при применении с ActiCHO Feed A и B в соответствии с рекомендациями производителя как PowerCHO2, так и ActiCHO P приводят к одинаковой жизнеспособности клеток и выходу белка GL-2045. Соответственно, если мультимерная композиция остается неизменной в сравнении с ActiCHO P + A + B, то ActiCHO Feed A и B можно применять с другими отобранными высокопроизводительными основными средами.
Пример 7 - оптимальное время и степень изменения температуры для получения GL-2045
[00205] Цель данного эксперимента заключалась в оценке оптимального времени и степени изменения температуры. Многие исследователи рассматривали влияние изменения температуры на клеточный цикл, апоптоз и метаболизм рекомбинантной линии клеток яичника китайского хомяка (СНО). Однако, несмотря на то, что обычно рассматривается влияние изменения температуры на плотность жизнеспособных клеток, мало внимания, если это вообще имело место, уделяли минимальной плотности клеток, необходимой для получения оптимальных результатов изменения температуры. Кроме того, минимальная плотность клеток, необходимая для успешного изменения температуры при получении мультимеризующихся страдомеров, не была рассмотрена.
[00206] Авторы настоящего изобретения обнаружили неожиданный факт, что для оптимальной экспрессии и максимального титра GL-2045 минимальная плотность жизнеспособных клеток должна составлять 10 миллионов клеток/мл в момент изменения температуры. Кроме того, это требование является более важным, чем день культивирования, на который происходит изменение температуры. Время изменения температуры неожиданно является наиболее успешным, когда плотность жизнеспособных клеток находится в логарифмической фазе роста, обычно, когда плотность жизнеспособных клеток составляет 10-15 миллионов клеток/мл. Как правило, это соответствует 4-5 дню культивирования в биореакторе в зависимости от начальной плотности посева.
[00207] Также в отличие от того, что описано в данной области техники, изменение температуры с 37 градусов по Цельсию (37°C) ±1,0°C до 32,5°C±1,0°C предпочтительнее, чем изменение температуры до 31°C±0,5°C, применительно к оптимальным начальным условиям для изготовления высоких титров GL-2045. Два отдельных пула супернатантов GL-2045 получали из стабильных клонов СНО с применением идентичных условий, за исключением характера изменения температуры. Клетки СНО культивировали в одноразовой биореакторной системе XDR-10 объемом 10 л (Xcellerex, GE) с изменением рН с 7,1 до 7,0 на 5 день. Для наработки культуры применяли 7 литров ActiCHO-P CD (каталожный номер U21-051) с внесением 280 мл PAA Feed A ежедневно (каталожный номер U15-053) и 28 мл PAA Feed B ежедневно (каталожный номер U15-054). PAA Feed A и B эквивалентны ActiCHO Feed A и Feed B. Каждое из изменения температуры до 32,5 градуса (A) и изменения температуры до 31,0 градуса (B) осуществляли на 5 день. Результаты представлены в таблице 11.
Пример 8 - Очистка GL-2045 на колонке с белком A требует более частых процедур CIP
[00208] GL-2045 очищали с помощью аффинной хроматографии (АХ) с применением колонки с белком A HiTrap MabSelect SuRe (GE, каталожный номер 11-0034-95) и буфера для связывания, содержащего 20 мМ фосфата натрия, 0,15 М NaCl, рН=7,2, и элюировали 0,1 М глицином, рН=2,7. АХ-очищенный GL-2045 хранили в 1× ФСБ, рН=7,0 (Quality Biological Inc., каталожный номер 119-069-101). Очистки GL-2045 методом аффинной хроматографии осуществляли без процедур очистки колонки на месте (CIP) в конце каждого цикла. Процедуры CIP, как правило, включают протекание разбавленного гидроксида натрия (0,1-0,5 М NaOH) через колонку между циклами очистки, чтобы гидролизовать отложения во время дезинфекции смолы с белком A, что восстанавливает, соответственно, связывающую способность колонки с белком A (Boulet-Audet et al, Scientific Reports, Vol. 6, 2016). GL-2045 очищали на 4 отдельных аффинных колонках с белком A (колонки 1-4, цикл 11.27.12). Затем те же самые аффинные колонки с белком A использовали для второго цикла аффинной очистки (цикл 11.28.12) после элюирования колонки 100% элюирующим буфером. Двойная очистка GL2045 с применением одной и той же колонки показала уменьшенное количество молекул с более низкой молекулярной массой, как гомодимера, так и димера гомодимера, после второго цикла очистки (ФИГ. 22). Как показано в таблице 12, исследование ДСН-ПААГ денситометрическим методом продемонстрировало значительную потерю гомодимерных и димерных полос, это указывает на то, что при связывании с аффинными колонками с белком A полосы с более низкой молекулярной массой вытесняются остаточным белком GL-2045, высокоавидным в отношении белка A, который полностью не удаляется из колонки с белком A при элюировании буфером для элюции.
[00209] Потеря полос с более низкой молекулярной массой указывает на то, что существует основанное на авидности связывание с аффинной колонкой, в результате чего высокомолекулярный мультимерный GL-2045 с несколькими сайтами связывания белка A вытесняет молекулы с низкой молекулярной массой, вызывая потерю молекул с более низкой молекулярной массой и эффективно изменяя композицию лекарственного препарата. Эти данные указывают на то, что более частые процедуры CIP и, следовательно, более частая регенерация колонки с белком A необходимы для оптимальной очистки GL-2045 при применении колонок с белком A для многократных циклов очистки. Эти результаты были неожиданными, поскольку, как описано выше, регенерация обычно требует использования NaOH, который ухудшает качественные характеристики колонок с белком A, наиболее часто применяемых в данной области техники. Соответственно, более частое применение такого буфера приведет к более быстрому ухудшению качественных характеристик колонки с белком A. Соответственно, чтобы поддержать оптимальный профиль интактного препарата GL-2045, для регенерации колонок с белком A, которые многократно применяются при очистке GL-2045, должна быть использована колонка с белком A, способная выдерживать частые процедуры CIP с применением очень жесткого NaOH-буфера, такого как 0,5 М NaOH.
Пример 9 - 0,5 М NaOH необходим для процедур CIP, чтобы регенерировать белок A для повторных циклов очистки GL-2045
[00210] Потеря молекул с низкой молекулярной массой в отсутствие процедур CIP, как показано в примере 8, также указывает на то, что существуют молекулы с высокой молекулярной массой, которые остаются связанными с аффинной колонкой с белком A после первого цикла прохождения через колонку, занимая тем самым сайты связывания и предотвращая связывание молекул с более низкой молекулярной массой в последующих циклах очистки. Эти данные указывают на то, что для поддержания мультимерного профиля GL-2045, очищенного на белке A, следует применять дополнительные процедуры CIP.
[00211] Авторы настоящего изобретения обнаружили с помощью регулярной ежедневной очистки с применением колонки HiTrap MabSelect (GE, каталожный номер 28-4082-58), что после приблизительно 6-7 циклов очистки композиция очищенного GL-2045 изменилась, о чем свидетельствовала незначительная потеря гомодимерных и димерных фракций. Квалифицированный специалист, проводящий очистку, например, моноклонального антитела, не предполагает изменение композиции очищенного продукта после 6-7 циклов очистки с применением белка A. Чтобы устранить эту проблему, для регенерации связывающей способности колонки с белком A выполняли процедуры CIP с применением 0,1 М NaOH согласно рекомендациям производителя. Процедуры CIP выполняли после каждого цикла очистки, т.е. чаще, чем используется в данной области техники. Применение частых процедур CIP привело к некоторому улучшению, но не устранило проблему потери молекул с более низкой молекулярной массой. Соответственно, авторы настоящего изобретения пришли к выводу, что для авидного связывания GL-2045 с белком A требуется более жесткая схема CIP, чем обычно применяет квалифицированный специалист, для полной регенерации колонки, чтобы облегчить удерживание гомодимера и димера.
[00212] Однако смолы, обычно используемые в колонках с белком A (например, МАТSelect), не являются устойчивыми к NaOH и поэтому могут быстро разрушаться при использовании более жесткого NaOH-буфера, при этом такое разрушение связано с уменьшением очищающей способности и с изменением композиции мультимеров GL-2045. Однако менее часто используемые среды с белком A (например, MabSelect SuRe (General Electric, каталожный номер 11-0034-95)) могут выдерживать усиленную очистку при 0,5 М NaOH. Соответственно, авторы настоящего изобретения применяли колонку MabSelect SuRe с ежедневными процедурами CIP с применением 0,5 М NaOH-буфера. После осуществления более частых и более жестких процедур CIP ежедневную очистку GL-2045 с применением белка A осуществляли без потери гомодимера или димера и без изменения композиции GL-2045.
[00213] Соответственно, авторы настоящего изобретения обнаружили, что CIP колонки с белком A для очистки GL-2045 требует более жестких и более частых процедур CIP, чем обычно применяет квалифицированный специалист, работающий с моноклональным антителом или гибридным белком Fc, чтобы удержать гомодимер и димер, и, соответственно, оптимальный профиль интактного лекарственного препарата GL-2045.
Пример 10 - градиенты pH для элюирования из колонки с белком A применяют для очистки GL-2045 от агрегатов гомодимеров, которые не являются высокоупорядоченными мультимерами
[00214] Градиенты pH для элюирования обычно применяют с колонками с белком A во время очистки белка для оптимизации общего выхода белка, но, как правило, не применяют для изменения композиции лекарственного препарата. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что такой градиент рН для элюирования из колонки с белком A можно применять для удаления неупорядоченных агрегатов GL-2045 из мультимеров более высокого порядка. Супернатант клеток СНО, экспрессирующих GL-2045, очищали с помощью аффинной хроматографии (АХ) с применением колонки с белком A HiTrap MabSelect SuRe (GE, каталожный номер 11-0034-95) и буфера для связывания, содержащего 20 мМ фосфата натрия, 0,15 М NaCl, рН=7,2, с последующей дополнительной промывкой буфером для связывания. GL-2045, связанный с белком A, элюировали с помощью элюирующего буфера, содержащего от 0 до 100% 0,1 М глицина, рН=2,7, что создает градиент рН для элюирования GL-2045 из аффинной колонки с белком A. Элюированные фракции собирали в 96-луночный планшет (Greiner bio-one, каталожный номер 780271) и нейтрализовали при рН=7,5, добавляя в каждую лунку трис-HCl с рН=9,0. Эквивалентные количества белка каждой из фракций затем исследовали на ДСН-ПААГ в невосстанавливающих условиях (4-12% бис-трис гель NuPAGE, Invitrogen каталожный номер NPO322BOX).
[00215] Исследование методом электрофореза в ДСН-ПААГ фракций, полученных с помощью элюирования градиентом pH из колонки с белком A, продемонстрировало, что молекулы с очень высокой молекулярной массой элюировались в последнюю очередь во фракции D6 и D7 (ФИГ. 23А и ФИГ. 23C). Неожиданным фактом явилось то, что самая первая фракция (D1) также содержала молекулы с высокой молекулярной массой. Соответственно, полученные результаты указывают на то, что высокомолекулярные фракции могут быть отделены от основных молекул GL-2045 (например, гомодимеров, димеров и мультимеров более высокого порядка) с помощью элюирования градиентом pH из аффинной колонки с белком A. Как показано в примерах 1-3, эти фракции могут представлять собой молекулы с более низкой активностью, о чем свидетельствует уменьшенное связывание с рецептором Fc и уменьшенное ингибирование КЗЦ.
[00216] На геле также показана (ФИГ. 23B, крайняя справа дорожка) фракция с очень высокой молекулярной массой, полученная за счет регенерации (CIP с применением 0,5 М NaOH и нейтрализации HCl). Эти результаты указывают на то, что на колонке с белком A после элюирования присутствуют молекулы с высокой молекулярной массой, что еще раз указывает на необходимость применения очень жесткого буфера NaOH во время процедур CIP для регенерации полной связывающей способности колонки.
[00217] Соответственно, несмотря на то, что элюирование градиентом pH обычно не применяют для этой цели, его можно применять для удаления отдельных неупорядоченных высокомолекулярных агрегатов GL-2045 из биологически активных мультимеров более низкого и более высокого порядка. Такое разделение можно применять для дальнейшей оптимизации или поддержания мультимерного профиля очищенного GL-2045. Согласно другому варианту ступенчатый элюирующий градиент можно применять для получения оптимизированной композиции GL-2045.
Пример 11 - солевые условия и условия рН ионообменной колонки модифицируют мультимерную композицию GL-2045
[00218] Важной целью для очистки GL-2045 является тщательный контроль мультимерной композиции готового очищенного продукта. Ионообменные колонки (например, катионный и анионный обмен) обычно используют для заключительной очистки моноклональных антител и гибридных белков Fc. Авторы настоящего изобретения испытали катионообменную среду, POROS CIEX (Invitrogen GoPure XS, каталожный номер 4448885), с элюирующими буферами, содержащими различные концентрации соли. GL-2045 сначала очищали с помощью аффинной хроматографии с белком A, затем объединяли и подвергали диализу в 50 мМ ацетате натрия, рН=5,0, перед загрузкой на колонку CIEX. 50 мМ ацетат натрия, рН=5, применяли в качестве уравновешивающего и промывочного буфера. Влияние содержания соли в элюирующем буфере (EB) на заключительную очистку GL-2045 испытывали с применением элюирующего буфера с 50 мМ ацетата натрия и различными количествами добавленного буфера B (1M NaCl, pH=5, результаты представлены в процентах (%) на ФИГ. 24). Хроматографические циклы выполняли на AktaAvant. В общих чертах, способ Avant включает уравновешивание колонки CIEX с применением 50 мМ ацетата натрия, рН=5, при скорости 2 мл/мин при общем объеме, составляющем 10 объемов колонки (cv). В колонку загружали 65-100 мг GL-2045, который предварительно подвергали диализу в 50 мМ ацетате натрия, pH=5. Колонку промывали 5 cv буфера для связывания при скорости потока 2 мл/мин. Затем GL-2045 элюировали с применением от 9 до 15 cv буферов с различным процентным содержанием NaCl (например, элюирующие буферы, содержащие 30-50% буфера B) при скорости потока 2 мл/мин.
[00219] Процент выделения (%) GL-2045 определяли для GL-2045, элюируемого с применением элюирующих буферов, содержащих 30% буфера B, 40% буфера B и 50% буфера B (30% EB, 40% EB и 50% EB, соответственно), чтобы определить оптимальный диапазон концентраций соли для элюирующих буферов (ФИГ. 24). Эти данные продемонстрировали, что изменения содержания соли в элюирующем буфере могут существенно изменить мультимерную композицию GL-2045.
[00220] Как показано в примере 11 и количественно описано в таблице 13, исследование методом электрофореза в ДСН-ПААГ показало значительные различия в разделении молекул GL-2045 с разной молекулярной массой при элюировании с применением 30% EB, 40% EB или 50% EB элюирующего буфера. 91,7% материала элюировали с применением элюирующего буфера, содержащего 30-40% буфера B, и материал, выделяемый при применении элюирующего буфера, содержащего 50% буфера B, представлял собой только высокомолекулярный материал. Эти данные демонстрируют, что изменения элюирующего буфера могут существенно модифицировать мультимерную композицию GL-2045. Соответственно, очевидно, что элюирующий буфер, отобранный для ионного обмена, можно применять для модификации мультимерной композиции GL-2045, что является новым вариантом применения этой технологии. В то же время авторы настоящего изобретения обнаружили, что если изменение композиции GL-2045 не является желательным на этапе заключительной ионообменной очистки, то при выборе концентрации соли элюирующего буфера для применения на этапах заключительной ионообменной очистки требуется уровень точности, который обычно не применяется квалифицированным специалистом.
Пример 12 - ионообменную хроматографию можно применять для уменьшения или удаления гомодимера или димера гомодимера
[00221] Поскольку 91,7% материала GL-2045 в примере 11 элюировали с применением элюирующего буфера, содержащего 30-40% буфера B, и материал, выделенный с применением элюирующих буферов, содержащих 50% буфера B, представлял собой только высокомолекулярный материал, для дальнейшего исследования отбирали элюирующие буферы, содержащие 30-40% буфера B. Применяемые способы были аналогичны тем, которые описаны в примере 11.
[00222] Результаты исследования методом электрофореза в ДСН-ПААГ демонстрируют значительные различия в разделении гомодимера GL-2045 при элюировании с применением элюирующих буферов, содержащих 35%, 36% или 37% или более буфера B (35% EB, 36% EB, 37% EB и т.д., соответственно). Следует отметить, что количества гомодимера и димера гомодимера, которые отчетливо видны при 35% EB, напротив, значительно снижаются при 36% EB и полностью устраняются при 37% EB и более (ФИГ. 25). Аналогичным образом, результаты исследования методом электрофореза в ДСН-ПААГ демонстрируют значительные различия в разделении мультимеров GL-2045 высшего порядка и больших неупорядоченных агрегатов при элюировании с применением 35% EB, 36% EB или 37% EB, или при элюировании с применением элюирующих буферов с более высокой концентрацией буфера B. Соответственно, очевидно, что элюирующий буфер, отобранный для ионного обмена, можно применять для модификации мультимерного профиля GL-2045, что является новым вариантом применения этой технологии. Также очевидно, что квалифицированный специалист может применять данные этого этапа элюирования для выбора одноэтапного или многоэтапного элюирования, чтобы получить желательный профиль GL-2045. Например, заключительная очистка GL-2045 с применением колонки POROS CIEX и элюирующего буфера, содержащего 36,5-38,5% буфера B, позволит сохранить все гомодимеры, димеры и мультимеры, в том числе до 10-членного мультимера, и приведет к вымыванию больших неупорядоченных агрегатов и мультимеров высшего порядка. Аналогичный пример с применением другой колонки представлен в примере 4.
Пример 13 - Ионообменную хроматографию можно применять для уменьшения или устранения больших агрегатов гомодимеров и мультимеров высшего порядка
[00223] Изготовление оптимальных композиций GL-2045 требует уменьшения до минимума количества мультимера GL-2045 высшего порядка (например, полос выше четко очерченной полосы 10, приблизительно 600 кДa) и устранения материала с массой выше 1000 кДа для удаления как больших агрегатов гомодимера, так и мультимеров высшего порядка, повышенная валентность которых повышает теоретический риск иммуногенности. GL-2045 элюировали с применением элюирующих буферов с различным процентным содержанием буфера B (38% EB (C1), 39% EB (C2) и 40% EB (C3)) (ФИГ. 26). Основные пики элюирования для GL-2045 наблюдали при 38% (C1), 39% (C2) и 40% (C3) (ФИГ. 26), за которыми следовали меньшие пики элюирования при 50% и 100% буфера B. Процент выделяемого GL-2045 (%) для каждого элюирующего буфера определяли и представляли в таблице 14.
Таблица 14: процентный выход GL-2045 при применении различных элюирующих буферов
[00224] Мультимерные профили элюированных фракций GL-2045 определяли с помощью визуального осмотра геля после электрофореза в ДСН-ПААГ (ФИГ. 27). Визуальный осмотр геля после электрофореза элюированных фракций в ДСН-ПААГ показал, что 38% элюирующий буфер приводил к выделению GL-2045 с наименьшим количеством остаточного высокомолекулярного материала.
[00225] Пики GL-2045 количественно определяли денситометрическим методом (ФИГ. 28, обобщенные данные представлены в таблице 15 как интенсивность полос ДСН-ПААГ в процентах). Пик 11 представляет гомодимер с наименьшей молекулярной массой, и пик 1 представляет материал с наивысшей молекулярной массой, который предпочтительно устраняется.
Таблица 15: обобщeнные данные денситометрии
[00226] Эти результаты демонстрируют, что протокол ступенчатого элюирования с применением ацетатного элюирующего буфера, содержащего 38% или 39% буфера B при рН=5, позволял получать приблизительно 85% предпочтительных фракций GL-2045 и уменьшенное количество высокомолекулярной фракции с массой более 600 кДа. Несмотря на то, что визуальный осмотр геля после электрофореза в ДСН-ПААГ показал, что количество высокомолекулярного материала было самым низким во фракции, элюированной с применением элюирующего буфера, содержащего 38% буфера B, исследование денситометрическим методом выявило, что самое низкое процентное содержание фракции с самой высокой молекулярной массой было получено при применении элюирующего буфера, содержащего 39% буфера B. Однако исследование денситометрическим методом продемонстрировало, что все из белковых композиций, очищенных на колонке CIEX, содержали меньшие количества высокомолекулярной фракции (полоса 1), по сравнению с материалом, очищенным с помощью только аффинной хроматографии. В целом, результаты исследования элюата указывают на то, что количество больших агрегатов и мультимеров высшего порядка можно контролировать путем применения контролируемых условий элюирования с колонкой POROS CIEX. Соответственно, очевидно, что элюирующий буфер, отобранный для ионного обмена, можно применять для модификации количества больших агрегатов и самых больших высокоупорядоченных мультимеров в композиции GL-2045, что является новым вариантом применения этой технологии. Аналогичный пример с применением другой колонки приведен в примере 4.
Пример 14 - модификация мультимерной композиции GL-2045 с применением колонок для хроматографии гидрофобного взаимодействия
[00227] GL-2045 получали из стабильной клеточной линии HEK 293F, которую выращивали в средах 293 Freestyle (Gibco, каталожный номер 12338-018) с добавлением Glutamax™ (Gibco, каталожный номер 35050-061) и генетицина (Gibco, каталожный номер 10131-027). Супернатанты собирали два раза в неделю и фильтровали через фильтр с размером пор 0,2 мкм в фильтровальную систему объемом 1 л (Corning, каталожный номер 431098). Супернатант GL-2045 затем очищали с применением колонки с белком A HiTrap MabSelect SuRe (GE, каталожный номер 11-0034-95) и буфера для связывания, содержащего 20 мМ фосфата натрия, 0,15 М NaCl, рН=7,2, и элюировали с применением элюирующего буфера с 0,1 М цитрата натрия, рН=3,0-3,6. GL-2045, очищенный с помощью АХ, хранили в 1× ФСБ, рН=7,0 (Quality Biological Inc., каталожный номер 119-069-101).
[00228] Затем GL-2045 очищали на 7 различных колонках для хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC) с использованием набора для отбора HiTrap HIC (GE, каталожный номер 28-4110-07). Колонки, включенные в этот набор, описаны в таблице 16.
Таблица 16: колонки для хроматографии гидрофобного взаимодействия
[00229] Колонки для HIC уравновешивали 50 мМ фосфатом натрия, 1,0 М сульфатом аммония, pH=7,0 (начальный буфер), и в каждую колонку загружали по 3,5 мг АХ-очищенного GL-2045 (разведенного в 4 объемах начального буфера). После промывки начальным буфером градиентное элюирование проводили с применением от 0% до 100% 50 мМ фосфата натрия, рН=7,0. Все фракционированные пики и фильтрат испытывали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ. Невосстановленные образцы загружали в 15% трис-HCl (Bio-Rad, каталожный номер 161-115). Окрашивание проводили с использованием набора Silver Stain (Invitrogen, каталожный номер LC6100).
[00230] Семь разных колонок для HIC демонстрировали разные мультимерные профили GL-2045. В качестве примера, колонка с бутил-HP позволяла отделить гомодимерную фракцию (фракция A10) от мультимерных молекул, обнаруженных в A12. Тот же эффект наблюдали при применении колонки с фенил-HP (фракция B11 по сравнению с фракцией B8). Только 16% загруженного материала выделяли в элюируемых фракциях при применении колонки октил-FF, это указывает на то, что она может быть пригодной для способа заключительной очистки GL-2045 в проточном режиме. Кроме того, элюированные фракции из колонки октил-FF содержали молекулы с более высокой молекулярной массой, это указывает на то, что колонка также может быть пригодной для удаления агрегированных молекул гомодимера с очень высокой молекулярной массой, которые имеют более низкую активность.
[00231] Аналогичный эксперимент проводили на мышином варианте GL-2045, известном как M045, M045 очищали с помощью аффинной хроматографии с белком A и затем дополнительно очищали на AKTA Avant (GE) с помощью HIC с применением высокопроизводительной колонки с фенил-сефарозой Hiload 26/10 (GE, каталожный номер 17-1086-01). Колонку для HIC уравновешивали 0,1 М фосфатом натрия, 1 М сульфатом аммония, рН=7,0 (начальный буфер), и M045 загружали в колонку с последующим этапом промывки начальным буфером, чтобы удалить все несвязанные материалы. M045 затем элюировали с применением элюирующего буфера, содержащего 0,1 М фосфата натрия, рН=7,0, в режиме градиентного элюирования (ФИГ. 30-31).
[00232] Фракции M045, очищенные с помощью HIC, исследовали методом электрофореза в ДСН-ПААГ, чтобы определить влияние заключительной очистки на колонке для HIC на мультимерный профиль M045. Эти результаты дополнительно продемонстрировали, что колонки для хроматографии гидрофобного взаимодействия можно применять для модификации мультимерной композиции M045, как отмечено на основании четкого разделения фракций гомодимера, димера, тримера и мультимера (ФИГ. 32).
Пример 15 - примерный протокол для GL-2045, полученного оптимальными способами
[00233] Данные, описанные в настоящем документе, демонстрируют оптимальные условия для нескольких переменных начальных и последующих способов изготовления GL-2045, что приводит к оптимизации (1) титра белка, (2) жизнеспособности клеток во время культивирования, (3) мультимеризации GL-2045, и (4) поддержанию мультимерного профиля в готовом лекарственном веществе GL-2045. Важно отметить, что уровень мультимеризации GL-2045 имеет решающее значение для клинической эффективности страдомера (см. примеры 1-4). Современные способы культивирования не обязательно направлены на оптимизированное получение конкретной фракции или усиление конкретного профиля мультимеризации. По существу, все начальные реагенты и условия культивирования, а также последующие среды и условия очистки, которые влияют на мультимеризацию, неизвестны и не могут быть предсказаны на основании современного уровня техники.
[00234] Данные, описанные в настоящем документе, привели к открытию следующих элементов протокола для получения оптимально изготовленного GL-2045:
[00235] (1) Оптимальными основными средами для получения оптимально изготовленного GL-2045 являются ActiCHO P.
[00236] Данные, описанные в настоящем документе, демонстрируют, что оптимальной основной средой была ActiCHO P. Клетки CHO, культивируемые в биореакторе в основных средах ActiCHO P, имели высокую плотность клеток и жизнеспособность клеток с оптимизированным увеличением титра белка, по сравнению с другими испытанными основными средами. Неожиданным фактом явилось то, что среды ActiCHO P привели к увеличению процентного содержания мультимеров GL-2045 более высокого порядка, присутствующих в конце протокола культивирования.
[00237] (2) Оптимальными добавками к питательной среде для получения оптимально изготовленного GL-2045 являются ActiCHO P, такие как ActiCHO Feed A и Feed B.
[00238] Данные, описанные в настоящем документе, дополнительно демонстрируют, что оптимальными добавками к питательной среде были ActiCHO P Feed A и Feed B, добавляемые в культуру каждый день или через день. ActiCHO P Feed A и Feed B поддерживали высокую плотность клеток и высокую жизнеспособность клеток, при этом титр белка был в 4 раза выше, чем при применении других испытанных комбинаций среды/добавка к питательной среде. Важно отметить неожиданный факт, что среды ActiCHO P с Feed A и Feed B привели к высокому уровню высокоупорядоченных мультимеров и, что важно, к снижению процентного содержания неупорядоченных высокомолекулярных агрегатов GL-2045 по сравнению с другими испытанными комбинациями среды/добавка к питательной среде. Эти данные указывают на то, что эта конкретная комбинация среды/добавка к питательной среде приводит к получению более высокого процентного содержания мультимеров GL-2045 с повышенной клинической эффективностью (например, более высокое процентное содержание высокоупорядоченных мультимеров GL-2045). Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили аналогичные результаты для добавления Feed A и Feed B через день, это указывает на то, что эту конкретную комбинацию среды/добавка к питательной среде можно применять для снижения затрат и снижения риска загрязнения, связанного с ежедневными манипуляциями с культурой.
[00239] Кроме того, среды ActiCHO P с Feed A и Feed B привели к выработке значительного процента GL-2045, существующего в виде мультимеров более высокого порядка, при снижении до минимума процентного содержания неупорядоченных высокомолекулярных агрегатов GL-2045. По существу эта конкретная комбинация среды/добавка к питательной среде неожиданно оптимизирована конкретно для биологически функциональных и клинически эффективных фракций высокоупорядоченного мультимеризованного GL-2045, что, соответственно, оптимизирует сохранение мультимерного профиля GL-2045, уменьшая при этом необходимость устранения агрегатов высокого порядка на последующих этапах очистки в проточном режиме.
[00240] (3) Оптимальным изменением температуры для получения оптимально изготовленного GL-2045 является изменение с 37°C до 32,5°C на основании плотности клеток.
6
[00241] Данные, описанные в настоящем документе, также демонстрируют, что изменение температуры с 37°C до 32,5°C на основании плотности клеток приводит к оптимальной плотности клеток, жизнеспособности и титру белка. Этот протокол изменения температуры отклоняется от установленных протоколов (Ouguchi et al, Cytotechnology, 52(3), pp. 199-207, (2006); Masterson and Smales, Pharmaceutical Bioprocessing, 2(1), pp. 49-61, (2014)), в которых описано изменение температуры с 37°C до 31°C на основании только дня культивирования. Авторы настоящего изобретения обнаружили неожиданный факт, что изменение температуры до 32,5°C после того, как клетки достигли плотности ~10-15×10 клеток/мл привело не только к поддержанию высокой плотности клеток и жизнеспособности клеток, но также к значительному увеличению титра белка по сравнению с ранее установленными протоколами.
[00242] Данные, продемонстрированные в настоящем документе, указывают на то, что конкретные последующие протоколы очистки приводят к получению композиций GL-2045 с оптимизированным профилем мультимеризации. При осуществлении этих способов очистки следует уделять особое внимание поддержанию желательного мультимерного профиля GL-2045 путем контроля условий для колонки и буферов. Это существенно отличается от протоколов для моноклонального антитела, гибридного белка Fc или сходного белка, полученного из СНО, при которых основные цели заключаются в чистоте и поддержании выхода.
[00243] (4) Оптимизированная очистка GL-2045 на белке A требует частых и жестких способов CIP.
[00244] GL-2045 авидно связывает белок A. Это авидное связывание приводило к тому, что GL-2045 оставался связанным со средами с белком A в колонке при применении процедур CIP, обычно используемых для очистки МАТ. В результате при повторных циклах использования колонки с белком A гомодимерные фракции GL-2045 не могли связываться с белком A и протекали через колонку. Это привело к существенному и функционально важному изменению мультимерного профиля готового продукта GL-2045, очищенного с помощью белка A. Соответственно, авидное связывание GL-2045 привело к необходимости более частых и более жестких (например, с применением промывочного буфера с 0,5 М NaOH) процедур CIP, чем обычно применяемые в данной области техники (например, во время очистки МАТ или гибридного белка Fc). Эти результаты были неожиданными, поскольку наиболее часто используемые колонки с белком A не способны выдержать жесткие промывки NaOH, необходимые для удаления мультимеров GL-2045 и полной регенерации колонки с белком A. Соответственно, только некоторые колонки с белком A, в частности, MabSelect SuRe, могут применяться для очистки GL-2045 и потребуют частых процедур CIP с применением приблизительно 0,5 М NaOH для поддержания желательного мультимерного профиля GL-2045.
[00245] (5) Элюирование градиентом рН или ступенчатое элюирование облегчает отделение фракций GL-2045 с наивысшей молекулярной массой от мультимеров более низкого и более высокого порядка.
[00246] Применение элюирования градиентом рН и очистки на белке A приводило к элюированию компонентов с наибольшей молекулярной массой в первой и последней элюируемых фракциях. Эти данные указывают на то, что градиент рН можно применять для отделения биологически активных фракций GL-2045 (например, гомодимера, димера и мультимеров более высокого порядка) от фракций, состоящих из неупорядоченных высокомолекулярных агрегатов, которые, как было показано ранее, снижают биологическую активность.
[00247] (6) Оптимальным элюирующим буфером для заключительной очистки GL-2045 с помощью ионообменной хроматографии является ацетатный буфер + 30-40% буфера B, в частности, 37,5% -39% ±0,5%.
[00248] Ионообменная хроматография обычно используется для заключительной очистки лекарственного препарата от примесей во время изготовления МАТ. Однако авторы настоящего изобретения применяли ионообменную хроматографию для удаления конкретных фракций GL-2045 (например, мультимеров высшего порядка и неупорядоченных высокомолекулярных агрегатов гомодимера) так, что был достигнут оптимальный профиль мультимеризации. В частности, авторы настоящего изобретения обнаружили, что элюирующий буфер с 30-40% буфера B снижает количество неупорядоченных высокомолекулярных агрегатов GL-2045. Еще более конкретно, элюирующий буфер с 38-39% буфера B конкретно поддерживал количество гомодимера, присутствующего в готовом продукте GL-2045 при оптимизированном уменьшении количества неупорядоченных агрегатов.
[00249] (7) Колонки для хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC) можно применять для достижения определенных профилей мультимеризации GL-2045.
[00250] Данные, описанные в настоящем документе, демонстрируют, что на этапах заключительной очистки GL-2045 можно применять разные колонки для HIC. Например, фильтрат колонки октил-FF в основном содержал молекулы с высокой молекулярной массой, это указывает на то, что эту колонку можно применять конкретно для удаления высокомолекулярных агрегатов GL-2045. Согласно другому варианту колонки бутил-HP можно применять для отделения гомодимерной фракции от мультимерных фракций для варианта применения, в котором одна из фракций может достигать более желательных результатов. Согласно другому варианту колонки для HIC можно применять в режиме связывания.
Оптимизированный протокол изготовления для GL-2045
[00251] В совокупности и с учетом всех параметров, обсуждавшихся выше, следующий протокол привел к самому высокому выходу белка GL-2045 при поддержании самого высокого процентного содержания мультимеров от всей популяции.
[00252] Клетки СНО трансфицировали двумя векторами с использованием запатентованной системы трансфекции ExcellGene SA (Monthey, Швейцария), один вектор экспрессии GL-2045 содержал кассету экспрессии GL-2045, фланкированную последовательностями, нацеливающими транспозазу piggyBac, и второй вектор содержал транспозазу piggyBac. Транспозон piggyBac преимущественную встраивается в активно транскрибируемые области генома и дополнительно содержит инвертированные концевые повторы, которые обеспечивают защиту от подавления генов. Трансфекция привела к интеграции кассеты экспрессии в активно транскрибируемые области генома с получением банка стабильно трансфицированных клеток СНО с менее чем 20 геномными вставками трансгена. Стабильно трансфицированные клетки СНО культивировали в биореакторе со средами ActiCHO P при температуре выращивания 37°C. Во время культивирования клетки ежедневно получали ActiCHO Feed A и Feed B при температуре выращивания 37°C до тех пор, пока культуры не достигли плотности клеток от приблизительно 10 миллионов до приблизительно 15 миллионов клеток/мл. После достижения такой плотности температуру выращивания изменяли с 37°C±1°C до 32,5°C±1°C, и оптимально изготовленный GL-2045 собирали из культуральных сред в последний день культивирования.
[00253] Этот протокол позволил получить жизнеспособность клеток более 95% на 18 день культивирования и более 80% на 21 день, при этом конечный титр общего белка составил более 9000 мг/мл, причем более 70% GL-2045 присутствовало в виде негомодимеров и более 30% присутствовало в виде мультимеров более высокого порядка, таких как 5-членные и более мультимеры.
[00254] GL-2045 собирали из культурального супернатанта с помощью системы фильтрации в тангенциальном потоке, которая не препятствует прохождению самых больших высокоупорядоченных мультимеров, что позволило сохранить гомодимерный и мультимерный профиль супернатанта. Затем применяли последующие способы изготовления для выделения GL-2045, удаления примесей и выделения конкретной фракции для того чтобы контролировать мультимерный профиль GL-2045 (например, удаление неупорядоченных высокомолекулярных агрегатов). GL-2045 очищали с помощью аффинной хроматографии с белком A, причем среда с белком A была выбрана так, чтобы выдерживать высокощелочную регенерацию. Кроме того, для обеспечения дополнительного контроля способа очистки применяли более одного промывочного буфера. Помимо этого процедуры CIP выполняли чаще, чем обычно, и с применением 0,5 М NaOH-буфера для удаления мультимеров GL-2045, которые авидно связывались с колонкой, чтобы полностью восстановить связывающую способность колонки с белком A, которая необходима для удержания гомодимера в готовой композиции GL-2045. GL-2045 элюировали из колонки с белком A с помощью элюирования градиентом pH или без него. После очистки с помощью аффинной хроматографии на колонке с белком A применяли дополнительные этапы заключительной очистки. Катионообменную хроматографию применяли для удаления высокомолекулярных неупорядоченных агрегатов GL-2045 с применением элюирующего буфера, содержащего 37-39%±0,5% буфера B, предпочтительно со смолой CIEX POROS XS. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения для дополнительной очистки GL-2045 применяли колонки для HIC. Для удаления высокомолекулярных неупорядоченных агрегатов GL-2045 применяли смолу октил-FF в качестве дополнительного этапа заключительной очистки. Согласно другому варианту колонки, содержащие бутил-HP, применяли для выделения конкретных фракций GL-2045 (например, выделения мультимеров более высокого порядка). Помимо этого анионообменные колонки, в частности, колонки Q Sepharose Fast Flow, применяли в качестве дополнительного этапа заключительной очистки, в частности, в проточном режиме.
[00255] Несмотря на то, что эти дополнительные этапы очистки можно применять по отдельности, предпочтительно очистку GL-2045 с помощью аффинной хроматографии с белком A применяли в комбинации со всеми тремя из анионообменной хроматографии, катионообменной хроматографии и хроматографии гидрофобного взаимодействия, чтобы получить готовое лекарственное вещество GL-2045, в котором конечный титр белка составил >4 г/л, из которых >70% GL-2045 присутствовало в виде мультимера, и >30% мультимеров представляли собой пентамерные мультимеры или выше.
Пример 16 - исследование оптимально полученного GL-2045
[00256] Чтобы дополнительно охарактеризовать оптимально полученный GL-2045, изготовленный способами, описанными в настоящем документе, GL-2045 получали в биореакторе в соответствии с начальными способами, описанными в настоящем документе, с применением основных сред ActiPRO, добавок к питательным средам и изменений температуры, описанных в настоящем документе. Полученный супернатант GL-2045 затем пропускали через глубинный фильтр Millipore X0HC с последующей фильтрацией через фильтр с размером пор 0,2 мкм и обрабатывали с применением нескольких последующих способов обработки. Профиль мультимеризации композиции GL-2045 оценивали после каждого этапа обработки и представили на ФИГ. 33. Профиль мультимеризации фильтрованного препарата GL-2045 показан красными точками на ФИГ. 33. Затем фильтрованный препарат GL-2045 подвергали аффинной хроматографии с белком A MabSelect Sure (GE, каталожный номер 11-0034-95) (профиль мультимеризации показан синими точками на ФИГ. 33), и затем очищали с помощью АОХ в проточном режиме с применением колонки Q Sepharose Fast Flow. Показатель pH в полученном GL-2045 затем доводили до pH=5,0±0,10 и фильтровали через фильтр с размером пор 0,2 мкм (профиль мультимеризации показан зелеными точками на ФИГ. 33). GL-2045 затем очищали с помощью катионообменной хроматографии с применением колонки POROS XS в режиме связывания с использованием ступенчатого элюирования буфером для элюции, содержащим 50 мМ ацетата натрия + 375 мМ NaCl, рН=5,0 (профиль мультимеризации показан желтыми точками на ФИГ. 33) перед проведением хроматографии гидрофобного взаимодействия (профиль мультимеризации показан оранжевыми точками на ФИГ. 33) и фильтрации (профиль мультимеризации показан фиолетовыми точками на ФИГ. 33), чтобы получить готовое лекарственное вещество (профиль мультимеризации показан черными точками на ФИГ. 33). Исходные данные для ФИГ. 33 представлены в таблице 17 ниже.
Таблица 17: процентное содержание мультимеров, определенное с помощью аналитической ВЭЖХ
[00257] Процентное содержание гомодимерной, димерной, тримерной, тетрамерной, пентамерной, гексамерной и 7+ членной фракций оценивали после каждого этапа с помощью аналитической ВЭЖХ. В общих чертах, супернатант GL-2045-экспрессирующих стабильно трансфицированных СНО получали в соответствии с начальными способами, описанными в настоящем документе. Затем GL-2045 очищали в соответствии с последующими способами, описанными в настоящем документе. Образцы получали на следующих последовательных этапах очистки: загрузка белка A MabSelect SuRe, пул белка A МАТSelect SuRe, пул анионного обмена, пул катионного обмена, пул HIC, пул UF/DF и лекарственное вещество. Образцы сравнивали с помощью аналитической эксклюзионной ВЭЖХ. В общих чертах, изократическое разделение проводили методом ВЭЖХ с применением двух колонок для эксклюзионной хроматографии (Agilent Bio SEC (300)) последовательно с УФ-детектированием при 280 нм в системе для высокоэффективной жидкостной хроматографии (система для ВЭЖХ Agilent 1100). Хроматографию выполняли при длительности цикла 60 минут и скорости потока 0,5 мл/мин. Рассчитывали относительный процент площади каждого пика.
[00258] Результаты представлены на ФИГ. 33. Как видно на ФИГ. 33, последующая обработка GL-2045 изменила уровни самых небольших фракций, гомодимера и димера гомодимера, а также самой большой фракции, 7-членной и более, в то время как фракции 3-6 оставались довольно стабильными. В отношении более мелких мультимеров последовательные последующие этапы изготовления, от загрузки колонки с белком A до готового лекарственного вещества, привели к увеличению выделения гомодимера и димера гомодимера. Однако последовательные последующие этапы обработки оказывали противоположное влияние на мультимеры высшего порядка, что привело к уменьшению их относительного процентного содержания.
Полученный лекарственный продукт GL-2045 имел определенный мультимерный профиль, который содержал, в процентном отношении от всей композиции, менее приблизительно 20% гомодимера и более приблизительно 28% 7-членного и более мультимера. Композиция также содержала приблизительно 7-12% димеров гомодимера, приблизительно 6-11% тримеров гомодимера, приблизительно 10-16% тетрамеров гомодимера, приблизительно 6-9% пентамеров гомодимера и приблизительно 10-14% гексамеров гомодимера.
--->
Перечень последовательностей
<110>  Гликник Инк.
Блок, Дэвид С
Олсен, Хенрик
Мерижеон, Эммануэль Й
<120>  Оптимизация изготовления GL-2045, мультимеризующегося страдомера
<130>  GLIK-017/01WO
<150>  US 62/432,402
<151>  2016-12-09
<160>  6
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  20
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтезированная лидерная последовательность
<400>  1
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1               5                   10                  15
Gly Ser Thr Gly
20
<210>  2
<211>  232
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  2
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
<210>  3
<211>  232
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  3
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
<210>  4
<211>  264
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  4
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1               5                   10                  15
Gly Ser Thr Gly Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
20                  25                  30
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
35                  40                  45
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
50                  55                  60
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
65                  70                  75                  80
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
85                  90                  95
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
100                 105                 110
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
115                 120                 125
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
130                 135                 140
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
145                 150                 155                 160
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
165                 170                 175
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
180                 185                 190
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
195                 200                 205
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
210                 215                 220
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
225                 230                 235                 240
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Glu Arg Lys Cys
245                 250                 255
Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
260
<210>  5
<211>  264
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  5
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1               5                   10                  15
Gly Ser Thr Gly Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
20                  25                  30
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
35                  40                  45
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
50                  55                  60
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
65                  70                  75                  80
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
85                  90                  95
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
100                 105                 110
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
115                 120                 125
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
130                 135                 140
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
145                 150                 155                 160
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
165                 170                 175
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
180                 185                 190
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
195                 200                 205
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
210                 215                 220
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
225                 230                 235                 240
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Glu Arg Lys Cys
245                 250                 255
Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
260
<210>  6
<211>  12
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  6
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
1               5                   10
<---