РЕКОМБИНАНТНЫЙ ВЕКТОР ДЛЯ СИНТЕЗА В КЛЕТКАХ РАСТЕНИЙ РЕЦЕПТОРНОЙ КИНАЗЫ K1, КОНТРОЛИРУЮЩЕЙ РАЗВИТИЕ СИМБИОЗА С КЛУБЕНЬКОВЫМИ БАКТЕРИЯМИ, И ШТАММ ДЛЯ РЕПЛИКАЦИИ ВЕКТОРА
RECOMBINANT VECTOR FOR SYNTHESIS IN PLANT CELLS OF RECEPTOR KINASE K1, CONTROLLING SYMBIOSIS DEVELOPMENT WITH NODULE BACTERIA, AND VECTOR REPLICATION STRAIN

Изобретение относится к области сельскохозяйственной микробиологии, а именно к биопрепаратам, направленным на совершенствование технологии выращивания бобовых растений.
Известно, что выращивание бобовых растений во многом определяется эффективностью их взаимодействия с клубеньковыми бактериями ризобиями. Для повышения эффективности взаимодействия создаются новые штаммы бактерий, совершенствуются способы введения в растения инокулянтов (RU 2654578, 2018; RU 2653751, 2018; RU 2561528, 2015; RU 1529487, 1994; https://agroserver.ru/b/inokulyant-dlya-gorokha-411199.htm).
Рецепторная киназа K1 - LysM-содержащий рецептор, контролирующий формирование симбиоза с клубеньковыми бактериями ризобиями и выход бактерий из инфекционных нитей в процессе развития симбиоза. K1 управляет этим процессом через регуляторы везикулярного транспорта семейства VAMP721. Кроме того, K1 может регулировать развитие защитных реакций при выходе бактерий. Нарушение функции K1 снижает устойчивость растений к патогенам. K1 может играть ключевую роль в формировании симбиотических структур при симбиозе и регулировать восприимчивость к заражению.
Другим перспективным направлением является создание генно-инженерных конструкций, позволяющих воздействовать на механизм взаимодействия растение-микроорганизм. В частности, в развитии бобово-ризобиального симбиоза основную роль играют Nod-факторы, выделяемые ризобиями, которые взаимодействуют с соответствующими рецепторами. Для гороха вероятными кандидатами на роль рецепторов являются LysM-содержащие рецепторные киназы Sym10, Sym37 и K1. При этом особое значение имеет киназа K1, необходимая для инициации симбиоза и влияющая на защитные свойства растения.
Бобовые растения способны вступать во взаимодействие как с полезными микроорганизмами - ризобиальными бактериями и грибами арбускулярной микоризы, а также эффективно различать патогенные микроорганизмы. При этом начальные этапы взаимодействия бобовых растений с симбиотическими и патогенными микроорганизмами имеют много общего. Так, и при патогенезе, и при развитии симбиоза происходит активация защитных систем растений. Однако при симбиозе эта активация носит кратковременный характер, что позволяет бактериям проникать в клетки растений. У растений в узнавание таких сигнальных молекул вовлечены белки - рецептор-подобные киназы, содержащие LysM домен во внеклеточном участке (LysM-РПК). У объекта наших исследований - гороха посевного (Pisum sativum L.), несколько LysM-РПК Sym10, Sym37, K1 контролируют процесс узнавания растением сигнальных молекул Nod-факторов. Кроме того, у гороха LysM-содержащая рецепторная киназа K1 контролирует выход бактерий из инфекционных нитей при симбиозе с ризобиями. K1 управляет этим процессом через регуляторы везикулярного транспорта семейства VAMP721. Кроме того, K1 может регулировать развитие защитных реакций при выходе бактерий из инфекционных нитей. Нарушение функции K1 снижает устойчивость растений к патогенам. K1 может играть ключевую роль в формировании симбиотических структур при симбиозе и регулировать восприимчивость к заражению.
В этой связи встает вопрос о разработке технологии, обеспечивающей эффективное взаимодействие растений с ризобиальными бактериями посредством рецепторной киназы K1. Предлагалось для клонирования полноразмерного гена K1 без стоп-кодона (1860 пар оснований, п.о.) использовать две пары праймеров для амплификации на матрице кДНК, полученной на основе суммарной РНК из клубеньков гороха сорта Finale (14 день после инокуляции). Для клонирования полноразмерного гена K1 без стоп-кодона использовали вектор pBIN19. Клонирование осуществляли под промотором CaMV35S вируса табачной мозаики. Полноразмерный ген K1 без стоп-кодона был слит в одну рамку считывания с последовательностью 3xFLAG. В качестве терминатора был использован терминатор нопалинсинтазы Tnos. Вставка гена полноразмерного K1 была проверена путем секвенирования. Проверенные конструкции переносили в штамм.
Наиболее близкими по технической сущности к заявляемому изобретению являются исследования, описанные в статье «Изучение биохимической функции рецептор-подобных киназ гороха SYM10, SYM37 И K1, необходимых для развития бобово-ризобиального симбиоза» (Экологическая генетика. - 2017. - Т. 15. - №4. - С. 4-12. 10.1781б/ееоееп1544-12), в рамках которой в бактериях E.coli С41 были созданы генетические конструкции в векторе pRSETa для экспрессии клонированных генов под контролем эффективного промотора Т7. В ходе проведенных авторами исследований были разработаны подходы для синтеза K1 в растворимом состоянии в бактериях Е. coli. Амплификацию фрагмента, кодирующего внеклеточный домен рецептора, проводили на матрице кДНК с помощью специфичных праймеров и высокоточной Phusion-полимеразы. Синтез кДНК был осуществлен на матрице РНК, выделенной из корней или клубеньков гороха сорта Finale с помощью обратной транскриптазы RevertAid Н- (Thermo Scientific, США) и олиго(дТ)праймеров (Sileks, Россия).
Для амплификации применяли следующие праймеры:
Для наработки белков-рецепторов рецепторных киназ Sym10, Sym37 и K1 последовательности, кодирующие внеклеточный домен K1 (а также LysM-РПК, Sym10, Sym 37), были клонированы в векторе pRSETa по сайтам BamHl и EcoRl. (Экологическая генетика. - 2017. - Т. 15. - №4. - С. 4-12. 10.1781б/ееоееп1544-12). Затем полученные конструкции использовали для синтеза внеклеточных доменов рецепторов в штамме Е. coli С41 (мутантный штамм, полученный на основе BL21 (DE3)).
Полученные конструкции были названы pRSETa/Sym10-ECD, pRSETa/ Sym37-ECD и pRSETa/K1-ECD, а образующиеся белки - Sym10-ECD, Sym37-ECD и K1-ECD соответственно.
-6
-12
-8
Оценку связывающей способности внеклеточных доменов рецепторов с Nod-факторами проводили на примере K1-ECD с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса на биосенсоре Proteon ХРР36, позволяющего работать с лигандом без меток. С этой целью белок-рецептор K1-ECD, содержащий HIS-метку, был иммобилизован на чипе HTG, а лиганд Nod-фактор использовали в поступающем растворе (10-2500 нМ). Уровень иммобилизации белка составлял в среднем 2500-3000 RU. Анализ связывающей способности K1-ECD с Nod-факторами с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса, что позволило выявить константу аффинности Kd=8,64 × 10±0,51 М, что было ниже, чем мы ожидали, на основании того, что реакция растения на Nod-факторы проявляется в диапазоне концентраций 10-10 М. Таким образом, для очищенного внеклеточного домена рецептора K1 гороха, синтезированного в бактериях, была показана способность связывать Nod-факторы, но при этом аффинность была невысокой. Таким образом, недостатком ближайшего аналога является низкая связывающая способность синтезируемого внеклеточного домена рецептора с лигандом, что не позволяет обеспечить достаточно эффективное взаимодействие между растением и ризобием.
Технической задачей являлось создание рекомбинантного вектора для синтеза в клетках растений рецепторной киназы K1, контролирующей развитие симбиоза с клубеньковыми бактериями, и штамм для репликации вектора.
Технический результат достигался за счет создания рекомбинантного вектора pBIN-K1-3xFLAG для синтеза в клетках растений рецепторной киназы K1 и штамма клеток Escherichia coli DH5α (pBIN-K1-3xFLAG), депонированного в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (RCAM) 05.12.2018 г. под номером RCAM05023. Созданный рекомбинантный вектор pBIN-K1-3xFLAG включает в себя последовательность вектора pBIN19; LR-последовательность для рекомбинации Т-ДНК в растения; р358-последовательность промотора CCaMV35S; K1-последовательность ДНК, кодирующая ген K1; FLAG-последовательность ДНК, кодирующая 3xFLAG (последовательность аминокислот, позволяющая выявлять синтезируемый белок с помощью антител анти-FLAG); Tnos -последовательность ДНК, являющаяся терминатором Tnos; HindIII, PstIи т.д. - сайты для рестрикционных ферментов, причем последовательность ДНК, кодирующая K1 размещена между последовательностями p35S и FLAG.
Для получения рекомбинантного вектора pBIN-K1-3xFLAG кодирующая полноразмерная последовательность гена K1 гороха Pisum sativum L. (без интронов) была амплифицирована на матрице кодирующей ДНК (кДНК), полученной на основе суммарной РНК из клубеньков гороха сорта Finale. Были использованы следующие праймеры для амплификации:
Для клонирования полноразмерного гена K1 без стоп-кодона (1860 пар оснований, п.о.) использовали вектор pBIN19. Клонирование осуществляли под промотором CaMV35S вируса табачной мозаики. Полноразмерный ген K1 без стоп-кодона был слит в одну рамку считывания с последовательностью 3xFLAG. В качестве терминатора был использован терминатор нопалинсинтазы Tnos.
3xFLAG - короткая последовательность аминокислот, позволяющая после синтеза белка в клетках растений проводить очистку белка на носителе с антителами к 3xFLAG и детектировать рекомбинантный белок K1.
3xFLAG в отличие от флуоресцентных меток YFP и RFP имеет ряд преимуществ, в частности, состоит из 22 аминокислот, обладает гидрофильными свойствами, а значит, не влияет на растворимость белка. Небольшие размеры последовательности 3xFLAG исключают возможность изменения свойств белка и закрытия его эпитопов для детекции с помощью антител. Наличие сайта для расщепления ферментом энтерокиназой позволяют получить рекомбинантный белок практически неотличимый по свойствам от нативного. Рекомбинантный вектор pBIN-K1-3xFLAG позволяет произвести синтез белка K1 в гетерологичной системе, например, в листьях табака, а наличие последовательности 3xFLAG позволяет детектировать K1 с помощью Вестерн-блот гибридизации с использованием aHTH-3xFLAG антител.
Штамм RCAM05023 характеризуется следующими признаками:
1. Наименование штамма: штамм Escherichia coli DH5α, содержащий рекомбинантный вектор pBIN-K1-3xFLAG.
2. Внутренний номер штамма в коллекции - 2-148.
3. Основания для депонирования: штамм содержит рекомбинантный вектор pBIN-K1-3xFLAG, несущий последовательность кДНК гена K1. Ген K1 кодирует LysM-содержащую рецепторную киназу, контролирующую развитие симбиоза с клубеньковыми бактериями. Последовательность гена K1 слита в одну рамку считывания с последовательностью, кодирующей маркерный белок 3xFLAG.
4. Культурально-морфологические особенности штамма: мелкие грамотрицательные палочки.
5. Физиолого-биохимические свойства штамма: температурный оптимум для роста - 37°С, рН 7.2-7.4, факультативный анаэроб, к составу питательной среды неприхотлив.
6. Условия культивирования: штамм культивируется сутки в среде LB с канамицином в концентрации 100 мкг/мл при температуре +37°С. При периодическом пересеве срок хранения - 2 недели.
7. Рекомендуемые способы и условия хранения: при криоконсервации культура выращивается сутки в жидкой среде LB с антибиотиком. Замораживается в 25% растворе глицерина в жидком азоте в течение 30 секунд и хранится на -80°С. Срок хранения не ограничен.
Сущность изобретения иллюстрируется следующими последовательностями и графическими материалами.
Список последовательностей включает в себя перечень нуклеотидов основных фрагментов, образующих рекомбинантный вектор
На Рис.1 показана схема экспрессионного вектора, использованного для создания конструкции pBIN-K1-3xFLAG и получения штамма RCAM05023.
При этом используются следующие обозначения: (1 - 9533) - последовательность вектора pBIN19; (6113-6137) LR - последовательность для рекомбинации Т-ДНК в растения (левый повтор); (6138 - 9533) - последовательность вектора pBIN19; (9534-10200) p35S - последовательность промотора CCaMV35S; (10201-12060) K1-последовательность ДНК, кодирующая ген K1; (12061-12144) FLAG- последовательность ДНК, кодирующая 3xFLAG (последовательность аминокиcлот, позволяющая выявлять синтезируемый белок с помощью антител анти-FLAG); (12145- 12436) Tnos-последовательность ДНК, являющаяся терминатором Tnos (12437 - 152750) последовательность вектора pBIN19; HindIII, PstI и т.д. - сайты для рестрикционных ферментов.