СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ КАТИОНОВ ЦИНКА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ С ОДНОВРЕМЕННЫМ ОПРЕДЕЛЕНИЕМ СООТНОШЕНИЯ КАТИОНОВ ЦИНКА И МЕДИ В ТОЙ ЖЕ ПРОБЕ
METHOD OF ZINC CATION CONCENTRATION DETERMINATION IN BLOOD SERUM TOGETHER WITH ZINC AND COPPER CATION RATIO DETERMINATION IN SAME SAMPLE

Настоящее изобретение относится к области медицинской биохимии и может быть использовано для клинической диагностики.
По современным представлениям цинк играет важную роль в метаболизме. Это связано с тем, что катионы цинка входят в состав более 150 ферментов, формируют распознающие нуклеотидные последовательности области факторов транскрипции, участвуют в проведении нервных импульсов и модулируют чувствительность нейронов к нейромедиаторам. Катионы цинка необходимы для нормального функционирования эндокринной системы, в частности, поджелудочной и щитовидной железы, защищают мембраны от окислительного повреждения (Mann U. The Role of Minerals and Vitamins in Mental Health. - 2000; Bettger W, O'Dell BA Critical physiological role of zinc in the structure and function of biomembranes. Life Sciences. - 1981. - v.28. - p.1425-1438). В связи с этим определение концентрации цинка в биологических жидкостях, в частности в крови, широко используется в современной медицинской практике, в частности, при диагностике онкологических, кожных заболеваний, нарушений репродуктивных функций, диагностике нарушений обоняния и вкуса и др.
Нормальные значения концентрации цинка в крови взрослого человека колеблются в пределах 10,7-18,4 мкмоль/л (Цинк в педиатрической практике. Учебное пособие. Под ред. Л.А. Щелягиной. М., 2001, 84 с.).
В тоже время по клиническим данным значение имеет не только абсолютное значение концентрации цинка, но и его соотношение с другим незаменимым микроэлементом - медью. По данным литературы в норме отношение молярного содержания цинка к содержанию меди в крови должно составлять 10:1-8:1 (Jacob RA, 1981. Zinc and copper. Clinics in Laboratory Medicine. - v.1. - p.743-750; O. Akinloyei, F.M. Abbiyesuku. The impact of blood and seminal plasma zinc and copper concentrations on spermogram and hormonal changes in infertile Nigerian men. Reproductive Biology. - v.11, N2. - 2011. - p.83-98).
Из существующего уровня техники известен способ колориметрического определения концентрации цинка в водных растворах. Метод основан на образовании окрашенного в красный цвет соединения цинка с дитизоном с дальнейшим извлечением дитизоната цинка в слой четыреххлористого углерода при pH=4,5-1,8 и колориметрированием в области 535 нм (Патент РФ 2125724, опубл. 27.01.1999).
Недостатками данного технического решения применительно к определению цинка в сыворотке крови является необходимость экстракции окрашенного продукта органическим растворителем, что существенно увеличивает время однократного определения концентрации цинка в пробе.
Известен способ определения цинка в водных растворах по реакции родамина С с ионами цинка с образованием окрашенного комплексного соединения, которое экстрагируют диэтиловым эфиром и измеряют светопоглощение образующегося коллоидного водного раствора (Лурье Ю.Ю. Аналитическая химия промышленных сточных вод. М.: Химия, 1984, С.164).
Недостатками способа являются высокая погрешность и длительность определения.
Известен способ определения цинка в водных растворах при его концентрациях, превышающих 0,1 мг/л, атомно-абсорбционной спектрометрией (Лурье Ю.Ю. Аналитическая химия промышленных сточных вод. М.: Химия, 1984, С.22).
Известен способ определения меди в водных растворах атомно-абсорбционной спектрометрией (Лурье Ю.Ю. Аналитическая химия промышленных сточных вод. М.: Химия, 1984, С.23).
Отношение концентраций цинка и меди при определении этим методом может быть получено вычислением полученных численных значений концентраций.
Недостатком способа атомно-абсорбционной спектрометрии является необходимость наличия дорогостоящего прибора, а также длительность и трудоемкость.
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому техническому решению является метод количественного определения катионов цинка в сыворотке крови человека, который разработан на основе качественного варианта дитизонового метода определения цинка (Ильина О.С. Изменение содержания цинка в крови человека при сахарном диабете типа I и особенности гипогликемического действия цинкосодержащего комплекса инсулин-хондроитинсульфат. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Уфа, 2012). К 2 мл пробы крови добавляли 0,1 мл 10% NaOH и 0,2 мл раствора 1% раствора дитизона в четыреххлористом углероде. В отрицательном контроле вместо сыворотки крови добавляли 2 мл дистиллированной воды, в положительном контроле - 2 мл 20 мкмоль раствора сульфата цинка (молярная концентрация стандартного раствора сульфата цинка). Пробы фотометрировали при 535 нм.
Zn
535
535
Расчет концентрации катионов цинка в пробе проводили по формуле: C=20 мкмоль × ОП Пробы/ОП Стандарта,
535
где ОП Пробы - оптическая плотность пробы, измеренная при 535 нм;
535
ОП Стандарта - оптическая плотность стандартного 20 микромолярного раствора сульфата цинка, измеренная при 535 нм.
Недостатком известного технического решения является определение только одного диагностического показателя, описывающего содержание микроэлемента в сыворотке крови.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является высокая чувствительность способа, расширение спектра определяемых диагностических показателей из одной пробы, описывающих содержание металлов, в частности при заболеваниях сахарным диабетом, а именно определение наряду с концентрацией катионов цинка в сыворотке крови также соотношения катионов цинка с катионами меди в той же пробе без применения дополнительных реактивов.
Данная задача решается за счет того, что полученные дитизонаты цинка и меди фотометрируют в областях спектра, соответствующих их максимумам поглощения. Реакция проводится в щелочной среде, в которой дитизон присутствует в водорастворимой енольной форме и диффундирует в водную фазу из четыреххлористого углерода. В водной фазе образуются дитизонат цинка, имеющий максимум поглощения 535 нм, и дитизонат меди, имеющий максимум поглощения 435 нм. Органическую фазу удаляют и фотометрируют образующийся коллоидный раствор дитизонатов цинка и меди при 535 нм и 435 нм соответственно с использованием в качестве стандарта растворов, содержащих 20 мкмоль/л сульфата цинка и 2 мкмоль/л сульфата меди.
Предлагаемый метод основан на образовании при щелочном значении pH окрашенного в красный цвет соединения цинка с дитизоном и окрашенного в желто-коричневый цвет соединения меди с дитизоном. Образовавшиеся коллоидные растворы дитизонатов цинка и меди фотометрируют при 535 нм и 435 нм соответственно. Полученные результаты сравнивают с оптической плотностью дитизонатов цинка и меди, образовавшихся в ходе реакции со стандартными растворами, содержащими 20 мкмоль/л сульфата цинка и 2 мкмоль/л сульфата меди.
Концентрацию катионов цинка рассчитывают по формуле:
Zn
станд.
535
535
C=С*ОП Пробы/ОП Стандарта,
станд.
где С - молярная концентрация стандартного раствора сульфата цинка;
535
ОП Пробы - оптическая плотность пробы сыворотки крови, измеренная при 535 нм;
535
ОП Стандарта - оптическая плотность стандартного раствора сульфата цинка, измеренная при 535 нм.
Отношение концентрации катионов цинка к концентрации катионов меди определяют по формуле:
<mrow><msub><mi>C</mi><mrow><mi>Z</mi><mi>n</mi><mo>/</mo></mrow></msub><msub><mi>C</mi><mrow><mi>C</mi><mi>u</mi></mrow></msub><mo>=</mo><mfrac><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>О</mi><msub><mi>П</mi><mrow><mn>535</mn></mrow></msub><mo>/</mo><mi>О</mi><msub><mi>П</mi><mrow><mn>435</mn></mrow></msub></mrow><mo>)</mo></mrow><mtext> </mtext><mi>П</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>б</mi><mi>ы</mi><mo>*</mo><msub><mi>С</mi><mrow><mi>с</mi><mi>т</mi><mi>а</mi><mi>н</mi><mi>д</mi><mo>.</mo><mi>Z</mi><mi>n</mi><mi>S</mi><mi>O</mi><mn>4</mn></mrow></msub></mrow><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>О</mi><msub><mi>П</mi><mrow><mn>535</mn></mrow></msub><mo>/</mo><mi>О</mi><msub><mi>П</mi><mrow><mn>435</mn></mrow></msub></mrow><mo>)</mo></mrow><mtext> </mtext><mi>С</mi><mi>т</mi><mi>а</mi><mi>н</mi><mi>д</mi><mi>а</mi><mi>р</mi><mi>т</mi><mi>а</mi><mo>*</mo><msub><mi>С</mi><mrow><mi>с</mi><mi>т</mi><mi>а</mi><mi>н</mi><mi>д</mi><mo>.</mo><mi>C</mi><mi>u</mi><mi>S</mi><mi>O</mi><mn>4</mn></mrow></msub></mrow></mfrac><mo>,</mo></mrow>
станд.ZnSО4
где С - молярная концентрация стандартного раствора сульфата цинка;
станд.CuSО4
С - молярная концентрация стандартного раствора сульфата меди;
535
435
(ОП/ОП) Пробы - отношение оптических плотностей пробы, измеренных при 535 нм и 435 нм;
535
435
(ОП/ОП) Стандарта - отношение оптических плотностей стандартных растворов сульфата цинка и сульфата меди, измеренных при 535 нм и 435 нм соответственно.
Техническим результатом, обеспечиваемым приведенной совокупностью признаков, является определение концентрации катионов цинка в сыворотке крови с параллельным определением соотношения катионов цинка и меди в той же пробе без применения дополнительных реактивов.
Пример 1
В пробирку с 2 мл сыворотки крови здорового донора добавляют 0,1 мл 10% NOH и 0,2 мл раствора 1% раствора дитизона в четыреххлористом углероде. В отрицательном контроле вместо сыворотки крови добавляют 2 мл физиологического раствора, в положительном контроле - 2 мл раствора, содержащего 20 мкмоль/л раствора сульфата цинка и 2 мкмоль/л сульфата меди (стандартные растворы). Пробы выдерживают при комнатной температуре 30 минут, органическую фазу удаляют. Пробы с коллоидными растворами дитизонатов цинка и меди фотометрируют при 535 и 435 нм.
535
Полученный результат: ОП Пробы = 0,230
535
ОП Стандарта = 0,255
435
ОП Пробы = 0,098
435
ОП Стандарта = 0,112
535
435
(ОП/ОП)Стандарта = 2,276
535
435
(ОП/ОП)Пробы = 2,346
Расчет концентрации катионов цинка проводят по формуле:
Zn
535
535
C=20 мкмоль/л * ОП Пробы/ОП Стандарта = 18,03 мкмоль/л
Отношение концентрации катионов цинка к концентрации катионов меди определяют по формуле:
<mrow><msub><mi>C</mi><mrow><mi>Z</mi><mi>n</mi><mo>/</mo></mrow></msub><msub><mi>C</mi><mrow><mi>C</mi><mi>u</mi></mrow></msub><mo>=</mo><mfrac><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>О</mi><msub><mi>П</mi><mrow><mn>535</mn></mrow></msub><mo>/</mo><mi>О</mi><msub><mi>П</mi><mrow><mn>435</mn></mrow></msub></mrow><mo>)</mo></mrow><mtext> </mtext><mi>П</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>б</mi><mi>ы</mi><mo>*</mo><mn>10</mn></mrow><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>О</mi><msub><mi>П</mi><mrow><mn>535</mn></mrow></msub><mo>/</mo><mi>О</mi><msub><mi>П</mi><mrow><mn>435</mn></mrow></msub></mrow><mo>)</mo></mrow><mtext> </mtext><mi>С</mi><mi>т</mi><mi>а</mi><mi>н</mi><mi>д</mi><mi>а</mi><mi>р</mi><mi>т</mi><mi>а</mi></mrow></mfrac><mo>=</mo><mn>2,346</mn><mo>/</mo><mn>2,276</mn><mo>*</mo><mn>10</mn><mo>=</mo><mn>10,031</mn></mrow>
Получено:
1. Концентрация цинка - 18,03 мкмоль/л;
2. Соотношение катионов цинка и меди - 10,031.
Пример 2
В пробирку с 2 мл сыворотки крови больного инсулинзависимым сахарным диабетом добавляют 0,1 мл 10% NOH и 0,2 мл раствора 1% раствора дитизона в четыреххлористом углероде. В отрицательном контроле вместо сыворотки крови добавляют 2 мл физиологического раствора, в положительном контроле - 2 мл раствора, содержащего 20 мкмоль/л раствора сульфата цинка и 2 мкмоль/л сульфата меди (стандартные растворы). Пробы выдерживают при комнатной температуре 30 минут, органическую фазу удаляют. Пробы фотометрируют при 535 и 435 нм.
Полученный результат:
535
ОП Пробы = 0,343
535
ОП Стандарта = 0,255
435
ОП Пробы = 0,243
435
ОП Стандарта = 0,112
535
435
(ОП/ОП)Пробы = 1,412
535
435
(ОП/ОП)Стандарта = 2,276
Расчет концентрации катионов цинка проводят по формуле:
Zn
535
535
C=20 мкмоль * ОП Пробы/ОП Стандарта = 26,9 мкмоль/л.
Отношение концентрации катионов цинка к концентрации катионов меди определяют по формуле:
<mrow><msub><mi>C</mi><mrow><mi>Z</mi><mi>n</mi><mo>/</mo></mrow></msub><msub><mi>C</mi><mrow><mi>C</mi><mi>u</mi></mrow></msub><mo>=</mo><mfrac><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>О</mi><msub><mi>П</mi><mrow><mn>535</mn></mrow></msub><mo>/</mo><mi>О</mi><msub><mi>П</mi><mrow><mn>435</mn></mrow></msub></mrow><mo>)</mo></mrow><mtext> </mtext><mi>П</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>б</mi><mi>ы</mi><mo>*</mo><mn>10</mn></mrow><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>О</mi><msub><mi>П</mi><mrow><mn>535</mn></mrow></msub><mo>/</mo><mi>О</mi><msub><mi>П</mi><mrow><mn>435</mn></mrow></msub></mrow><mo>)</mo></mrow><mtext> </mtext><mi>С</mi><mi>т</mi><mi>а</mi><mi>н</mi><mi>д</mi><mi>а</mi><mi>р</mi><mi>т</mi><mi>а</mi></mrow></mfrac><mo>=</mo><mn>1,412</mn><mo>/</mo><mn>2,276</mn><mo>*</mo><mn>10</mn><mo>=</mo><mn>6,20</mn></mrow>
Получено:
1. Концентрация катионов цинка - 26,9 мкмоль/л;
2. Соотношение катионов цинка и меди - 6,20.
Пример 3
С использованием приведенной методики обследовано 30 здоровых доноров 25-55 лет. Среднее значение общей концентрации катионов цинка в крови обследованных составило 23,6±1,32 мкмоль/л, среднее значение соотношения концентрации катионов цинка и меди - 9,4±0,6.
Пример 4
С использованием приведенной методики обследовано 30 больных с инсулинзависимым сахарным диабетом 25-55 лет. Среднее значение общей концентрации катионов цинка в крови обследованных составило 34,3±1,26 мкмоль/л, среднее значение соотношения концентрации катионов цинка и меди - 8,4±0,5.
Предлагаемый способ характеризуется высокой чувствительностью, достаточной для определения концентрации солей цинка и меди в диапазоне 1-100 мкмоль, что необходимо при исследовании проб крови.