СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ХИТОЗАНА В БЕССОЛЕВОЙ СРЕДЕ ПУТЕМ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ ДЕПОЛИМЕРИЗАЦИИ
METHOD OF PRODUCING LOW-MOLECULAR CHITOSAN IN SALT-FREE MEDIUM VIA ENZYMATIC POLYMERISATION

Изобретение относится к медицинской биотехнологии и может быть использовано в производстве биологически активных веществ с антибактериальными, антигрибными, антивирусными и иммуномодулирующими свойствами, а также в создании доставщиков ДНК и лекарственных средств на основе низкомолекулярного хитозана.
Хитозан - природный высокомолекулярный гетерополимер D-глюкозоамина и N-ацетил-D-глюкозоамина, соединенных 1,4-β-гликозидной связью. Хитозан обладает антибактериальными, антигрибными, антивирусными и иммуномодулирующими свойствами, может быть использован как адъювант, радиопротектор, компонент гелевых и мазевых композиций, как доставщик ДНК, лекарственных и других веществ, в качестве элиситора повышает устойчивость растений к бактериальным, грибным и вирусным заболеваниям [1, 2].
Исходный хитозан является биополимером с молекулярной массой 1000 кДа (и выше), что соответствует степени полимеризации, равной 5000, практическое использование которого затруднено из-за высокой вязкости его водных растворов даже при низкой концентрации (менее 0,01%), а также недостаточной растворимости при нейтральных значениях рН и, как следствие, низкой биологической активности. Для снижения вязкости, улучшения растворимости и усиления биологической активности высокомолекулярный хитозан подвергают химической или ферментативной деполимеризации. Полученный в процессе деполимеризации низкомолекулярный хитозан с молекулярной массой от 2 до 20 кДа обладает высокой биологической активностью и способен растворяться в растворах со значениями рН, близкими к нейтральным (рН 6,5-7,0) [3,4]. Ферментативную деполимеризацию высокомолекулярного хитозана обычно проводят в 0,2-0,3 М натрий-ацетатных или натрий-лактатных буферных системах при рН 4,5-6,5 [5, 6]. Наличие солевого буфера объясняется хорошей растворимостью хитозана только в присутствии избытка кислоты, что сопровождается необходимостью после полного растворения хитозана доводить сильнокислый раствор растворенного таким способом полимера (<4,0) до значений рН, оптимальных (4,5-6,5) для ферментов, использующихся для деполимеризации хитозана. Это приводит к наличию в конечном продукте значительных количеств солей, удаление которых в масштабах промышленного производства требует длительного диализа и сопровождается существенными потерями наиболее низкомолекулярных фракций хитозана.
Целью заявленного изобретения является разработка способа, позволяющего получить низкомолекулярный водорастворимый при рН 6,5-7,0 хитозан путем ферментативной деполимеризации в бессолевых условиях.
Поставленная задача достигается путем разработки способа получения низкомолекулярного хитозана, который предусматривает предварительное переосаждение исходного высокомолекулярного хитозана (в результате чего он приобретает способность растворяться при добавлении минимального количесва кислоты), для чего его растворяют в растворе кислоты, а после полного растворения осаждают добавлением раствора щелочи; отмывку переосажденного высокомолекулярного хитозана от образовавшейся соли и избытка щелочи с помощью крупнопористого фильтра (на этой стадии отмывка солей не сопровождается потерей целевого вещества за счет высокой молекулярной массы хитозана); растворение переосажденного хитозана в расчетном количестве кислоты (уксусной, молочной, соляной) до оптимального для ферментативной деполимеризации значения рН (4,5-6,5); добавление ферментного препарата; проведение процесса гидролиза при оптимальной температуре; остановку реакции после определенного промежутка времени.
В указанном выше диапазоне значений рН система хитозан-кислота представляет собой буферную систему, что подтверждается образованием плато на графике титрования растворенного в кислоте хитозана раствором щелочи (фиг.1), и, таким образом, не нуждается в использовании солевой буферной системы для поддержания необходимой кислотности среды. В процессе деполимеризации наблюдается небольшое повышение значения рН за счет улучшения доступности аминогрупп низкомолекулярного хитозана, которое происходит в ходе гидролиза (фиг.2). Таким образом, предлагаемая нами схема деполимеризации позволяет не использовать солевую буферную систему во время гидролиза, а следовательно избежать необходимости удалять соли из конечного продукта, и получать хитозан с заданным противоионом: ацетат, лактат, хлорид и другие.
Техническим результатом заявленного изобретения является разработка упрощенного и предотвращающего потери целевого вещества способа получения низкомолекулярного водорастворимого хитозана с молекулярной массой в диапазоне от 2 до 20 кДа с помощью ферментативной деполимеризации в бессолевых условиях, характеризующегося наличием в реакционной среде только целевого вещества (хитозана) и фермента (ферментного препарата), отсутствием в реакционной среде солей (хлорид натрия, ацетат натрия и т.п.), отсутствием необходимости удаления солей по причине отсутствия таковых в ферментной системе и целевом продукте методами, которые сопровождаются потерями целевого продукта.
Пример 1. Получение низкомолекулярного хитозана в бессолевой среде с помощью ферментативного препарата Целловиридин Г20х. Взвешивают 1 г высокомолекулярного крабового хитозана. Растворяют его в 100 мл 0,3%-ного раствора уксусной кислоты. Осаждают растворенный хитозан добавлением 2 мл 10%-ного раствора гидроксида натрия. Отмывают осажденный хитозан с помощью крупнопористого фильтра дистиллированной водой до тех пор, пока значение рН промывных вод не достигнет 5,5. К полученному осадку хитозана добавляют дистиллированную воду, доводя объем смеси до 100 мл. Затем, при постоянном перемешивании, добавляют в смесь 5%-ную уксусную кислоту, доводя рН раствора до 5,5. При таком значении рН переосажденный хитозан полностью растворяется. После установления заданного значения рН к раствору добавляют ферментный препарат Целловиридин Г20х, полученный из гриба Trichoderma viride, в количестве 0,0025 г, достигая фермент-субстратного соотношения 1:400 (фермент:субстрат). Реакцию гидролиза ведут при +55°С в течение 4 часов при перемешивании. Реакцию останавливают нагреванием гидролизата до +100°С в течение 10 минут. Результаты реакции оценивают по падению динамической вязкости раствора гидролизуемого хитозана и средневязкостной молекулярной массы хитозана. Полученные результаты приведены в таблице 1.
Пример 2. Получение низкомолекулярного хитозана в бессолевой среде проводят аналогично примеру 1, но в качестве кислоты для растворения используют не уксусную кислоту, а молочную, соляную или другие. Полученные результаты приведены в таблицах 2 и 3.
Пример 3. Получение низкомолекулярного хитозана в бессолевой среде проводят аналогично примеру 1, но реакцию гидролиза проводят при значениях рН в интервале от 4,5 до 6,5. Полученные результаты приведены в таблице 4.
Пример 4. Получение низкомолекулярного хитозана в бессолевой среде проводят аналогично примеру 1, но реакцию гидролиза проводят при значениях температуры в интервале от +45°С до +65°С. Полученные результаты приведены в таблице 5.
Пример 5. Получение низкомолекулярного хитозана в бессолевой среде проводят аналогично примеру 1, но реакцию гидролиза ведут различные промежутки времени - от 30 до 360 минут. Полученные результаты приведены в таблице 6.
Пример 6. Получение низкомолекулярного хитозана в бессолевой среде проводят аналогично примеру 1, но реакцию гидролиза ведут при различных фермент-субстратных соотношениях - от 1:10 до 1:1000. Полученные результаты приведены в таблице 7.
Таблица 1
Изменения динамической вязкости (сП) 1%-ного раствора хитозана и средневязкостной молекулярной массы (кДа) хитозана при ферментативном гидролизе в бессолевой среде с ацетат-ионом
Параметры
Исходный хитозан
Гидролизованный хитозан
динамическая вязкость
>1000
4,9
средневязкостная молекулярная масса
750
2,0
Таблица 2
Изменение динамической вязкости (сП) 1%-ного раствора хитозана при ферментативном гидролизе в бессолевой среде с различными противоионами
Кислота
Исходный хитозан
Гидролизованный хитозан
уксусная
>1000
4,9
молочная
>1000
5,9
HCl
>1000
7,5
Таблица 3
Изменение средневязкостной молекулярной массы (кДа) хитозана при ферментативном гидролизе в бессолевой среде с различными противоионами
Кислота
Исходный хитозан
Гидролизованный хитозан
уксусная
750
2
молочная
750
4
HCl
750
6
Таблица 4
Динамическая вязкость (сП) 1%-ного раствора хитозана и средневязкостная молекулярная масса (кДа) хитозана после ферментативного гидролиза в бессолевой среде при различных значениях рН
Параметры
Значения рН
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
динамическая вязкость
7,0
5,5
4,9
7,0
10,0
средневязкостная молекулярная масса
5
3
2
5
8
Таблица 5
Динамическая вязкость (сП) 1%-ного раствора хитозана и средневязкостная молекулярная масса (кДа) хитозана после ферментативного гидролиза в бессолевой среде при различных значениях температуры
Параметры
Значения температуры, °С
45
50
55
60
65
динамическая вязкость
10,0
6,2
4,9
5,5
7,0
средневязкостная молекулярная масса
8
4
2
3
5
Таблица 6
Динамическая вязкость (сП) 1%-ного раствора хитозана и средневязкостная молекулярная масса (кДа) хитозана после ферментативного гидролиза в бессолевой среде при различной продолжительности
Параметры
Продолжительность гидролиза, мин
0
30
60
120
240
300
360
динамическая вязкость
>1000
21,6
11,2
6,3
4,9
4,9
4,9
средневязкостная молекулярная масса
750
20
12
5
2
2
2
Таблица 7
Динамическая вязкость (сП) 1%-ного раствора хитозана и средневязкостная молекулярная масса (кДа) хитозана после ферментативного гидролиза в бессолевой среде при различных фермент-субстратных соотношениях
Параметры
ферментхубстрат, масса:масса
1:10
1:100
1:200
1:300
1:400
1:500
1:1000
динамическая вязкость
4,9
4,9
4,9
4,9
4,9
6,5
22,0
средневязкостная молекулярная масса
2
2
2
2
2
5
20
ЛИТЕРАТУРА
1. Куликов С.Н., Чирков С.Н., Ильина А.В., Лопатин С.А, Варламов В.П. Влияние молекулярной массы хитозана на его противовирусную активность в растениях. Прикладная биохимия и микробиология. 2006. Т.42. №2. С.224-228.
2. Хитин и хитозан: получение, свойства и применение. Под ред. К.Г.Скрябина, Г.А.Вихоревой, В.П. Варламова. Москва: Наука, 2002. 368 с.
3. RU 2188829 С1, 10.09.2002.
4. RU 2073016 С1, 10.02.1997.
5. Il'ina A.V., Tatarinova N.Yu., Varlamov V.P. The preparation of low-molecular-weight chitosan using chitinolytic complex from Streptomyces kurssanovii. Process Biochemistry. 1999. V.34. P.875-878.
6. Ильина A.B., Ткачева Ю.В., Варламов В.П. Деполимеризация высокомолекулярного хитозана ферментным препаратом целловиридин Г20х. Прикладная биохимия и микробиология. 2002. Т.38. №1. С.5-13.