Влияние циклогексимида на активность мышей линии Balb в условиях суок-теста и теста «Решетка»

ВЕСТНИК УДМУРТСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ

67

2014. Вып. 4

Физиологические исследования

УДК 612.825.1 Н.А.Худякова

ВЛИЯНИЕ ЦИКЛОГЕКСИМИДА НА АКТИВНОСТЬ МЫШЕЙ ЛИНИИ BALB В УСЛОВИЯХ СУОК-ТЕСТА И ТЕСТА «РЕШЕТКА»

На 36 взрослых белых мышах линии ВАЬВ проведено исследование параметров двигательного поведения в условиях поведенческих тестов (суок-тест и тест «решетка») через 2 и 4 недели после внутрикоркового введения блокатора синтеза белка циклогексимида. Поскольку циклогексимид малорастворим в воде и изотоническом растворе, то для его растворения использовали 20 %-ный раствор этанола в 0,9 %-ном хлориде натрия. Животным контрольной группы производили внутрикорковую инъекцию этого раствора. Внутрикорковые инъекции делали в область моторного неокортекса с координатами А = 1 мм, Ь = 1 мм, что соответствует двигательному представительству передней конечности. В результате проведенных экспериментов обнаружено достоверное (р < 0,05) снижение горизонтальной двигательной активности животных опытной группы на второй неделе эксперимента и компенсация этого параметра к четвертой неделе исследования. Исследовательская активность животных экспериментальной группы остается высокой на протяжении всего периода исследования. Таким образом, блокада синтеза белка при помощи циклогексимида в нейронах на две недели изменяет деятельность корковых двигательных представительств и сопровождается обратимыми изменениями параметров поведения.

Ключевые слова: циклогексимид, моторная кора, двигательная активность, суок-тест, тест «решетка», ВАЬВ.

В нашей предыдущей работе было показано значительное повышение амплитуды пороговых токов двигательных ответов лицевой и соматической мускулатуры после внутрикорковой инъекции циклогексимида у мышей линии ВАЬВ в условиях использования метода внутрикорковой микростимуляции (ВКМС), что может быть следствием уменьшения возбудимости моторной коры [1]. Этот факт согласуется с данными Клейма и др. [2], полученными в опытах с использованием ВКМС моторного неокортекса крыс. Клейм и его соавторы приходят к выводу, что функциональная организация моторной коры зависит от молекулярных процессов синтеза белка и после внутрикорковой инъекции блокатора синтеза белка циклогексимида на длительное время возбудимость моторной коры падает. Следствием процесса уменьшения возбудимости нейронов и возрастания амплитуды пороговых токов двигательных ответов может являться регрессия синапсов, также приводящая к исчезновению рисунка корковых двигательных представительств [2]. Процесс восстановления возбудимости моторной коры длительный и может занимать несколько суток. В качестве гипотезы можно предположить, что длительное понижение возбудимости моторного неокортекса под влиянием циклогекси-мида проявляется также нарушениями двигательного поведения. Как место инъекции циклогексими-да была выбрана область с координатами А = 1 мм, Ь = 1 мм, связанная с обнаружением двигательного представительства мышц передней конечности рядом с которым в левом полушарии находятся двигательные представительства мышц верхней губы и вибрисс [3]. Таким образом, целью нашей работы была оценка влияния однократной внутрикорковой инъекции циклогексимида в моторный не-окортекс в область расположения двигательного представительства мышц передней конечности на параметры двигательного поведения в тесте «решетка» и суок-тесте.

Материалы и методы исследований

Для решения поставленных задач были проведены исследования на 36 взрослых белых мышах линии ВАЬВ (половозрелые особи в возрасте свыше 30 дней) массой тела 20-30 г. Линейные животные были получены из питомника «Столбовая», содержались и разводились в условиях вивария Удмуртского госуниверситета. Животных содержали в стандартных условиях вивария (12-часовой световой день, постоянная температура воздуха 22 °С, свободный доступ к воде и пище). Наркотизировали животных нембуталом (70 мг/кг массы, внутрибрюшинно), скальпировали под местным наркозом (1 %-ный новокаин 0,2 мл подкожно), скальпелем делали надрез в теменной зоне головы. С помощью бормашины в теменной кости черепа в левом полушарии высверливали отверстие диаметром

2014. Вып. 4

БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ

2 мм, удаляли твердую мозговую оболочку и производили внутрикорковую инъекцию. Координаты центра области инъекции: А = 1 мм от брегмы; L = 1 мм латерально от сагиттального шва. В ходе эксперимента животные были разделены на 2 группы (контрольную и опытную). Животным контрольной группы (18 мышей: 9 самцов, 9 самок) проводились все оперативные процедуры, но вместо инъекции циклогексимида вводили эквивалентное количество растворителя (20 %-ный раствор этанола в 0,9 %-ном хлориде натрия). Опыт - группа мышей в количестве 18 животных (9 самцов и 9 самок), которым проводилось внутрикорковое введение 1 мкл раствора циклогексимида (Sigma, 40 мг/мл растворителя) с помощью шприца Гамильтона. Место инъекции соответствует области расположения двигательного представительства передней конечности, не исключена возможность распространения циклогексимида на соседние двигательные представительства лицевых мышц - верхнегубных и вибриссных [3]. Все процедуры обращения с экспериментальными животными соответствовали Приказу Минздрава России № 267 от 19.06.03 «Об утверждении правил лабораторной практики в Российской Федерации». Кожную рану на голове ушивали шелком. Затем мышей помещали в домашние клетки и в течение 14 дней не подвергали никаким исследованиям.

Поведенческие реакции изучались по комплексу тестов, характеризующих уровень эмоциональности, двигательную и ориентировочно-исследовательскую активность, а также интегральную активность поведения животных в условиях свободного поведения. Проводились поведенческие тесты: суок-тест, тест «решетка». Исследование поведенческих реакций у животных проводили по прошествии 2 и 4 недель после проведения внутрикорковых инъекционных процедур.

Суок-тест описывает поведение в условиях новизны. Большую роль играет баланс мотиваций -стремление исследовать новую обстановку (неофилия) и страх перед ней (неофобия, тревога) - в формировании поведения животного в данных условиях. Суок-тест основан на тестировании животного на приподнятом 2-метровом шесте (диаметром 2 см для мышей). Разделен на равные 10-см сектора (шест) и зафиксирован на высоте 20-25 см при помощи торцевых стенок. При тестировании животное помещается в центр шеста, который окружен сегментами слева и справа, формирующими условную «центральную» зону (20 см). Исследование двигательной активности мышей проводилось в течение 5 минут, движение мышей записывалось на видеокамеру. По видеоматериалам определялись следующие показатели: количество пересеченных сегментов (горизонтальная активность), в том числе и центральных, количество исследовательских заглядываний вниз, число соскальзываний лап, а также суммарная продолжительность периодов неподвижности (замирания) [4].

Тест «решетка» основан на тестировании животного на горизонтально расположенной решетке [5; 6]. Стандартный период тестирования составлял 5 минут, движение мышей записывалось на видеокамеру. Экспериментальная установка представляла собой жесткую пластиковую решетку с ячейками 2,5x2,5 см, перемычками шириной 0,5 см и размерами 30x30 см, которая устанавливалась на высоте 70 см от пола. Определялись следующие показатели: количество пересеченных ячеек решетки (горизонтальная активность), количество исследовательских заглядываний вниз, число соскальзываний лап, а также число вставаний на задние лапы (вертикальная активность).

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета программ MS Office и Statistica 6.0. Вычисляли среднее значение параметра и ошибку среднего. Для оценки статистической значимости полученных результатов использовали непараметрический критерий U - Уилкоксона-Манна-Уитни.

Результаты и их обсуждение

В условиях суок-теста у мышей опытной группы через две недели после инъекции циклогексимида горизонтальная двигательная активность составила 64,6±17,3 пересеченных секторов, что было достоверно (р < 0,05) меньше активности контрольной группы - 138,0 ± 22,3. К четвертой неделе восстановительного периода этот исследуемый параметр достоверно не различался у животных контрольной и опытной групп, причем у животных контрольной группы двигательная активность осталась прежней, а у животных, подвергшихся воздействию циклогексимида, горизонтальная двигательная активность значительно увеличилась и составила 102,3 ± 15,4 пересеченных секторов (рис. 1).

Контрольная и опытная группы животных не различались по параметрам количества актов соскальзывания лап ни на второй неделе, ни на четвертой неделе эксперимента в условиях суок-теста и теста «решетка». Также контрольные и опытные животные не различались по продолжительности периодов замирания на протяжении всего периода исследования в условиях суок-теста. Аналогичные

Влияние циклогексимида на активность мышей линии BALB...

69

БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ

2014. Вып. 4

показанным на рис. 1 изменения локомоторной активности, связанные с ее восстановлением к четвертой неделе эксперимента, были прослежены и в тесте «решетка» (рис. 2), где также можно видеть существенное увеличение (с 51,3 ± 7,4 пересеченных квадратов на второй неделе исследования до 83,3 ± 11,9 к четвертой неделе исследования) горизонтальной двигательной активности у животных опытной группы. Таким образом, можно отметить наличие существенных количественных изменений горизонтальной активности у линейных белых мышей на протяжении двух недель после внутрикорковой инъекции и компенсаторные изменения параметра к четвертой неделе исследования.

Рис. 1. Динамика горизонтальной активности в условиях суок-теста у мышей контрольной и опытной

групп.

Примечание. р < 0,05 - достоверные различия результатов опытной группы по сравнению с контролем

Рис.2. Динамика горизонтальной активности в условиях теста «решетка» у мышей контрольной

и опытной групп

Примечание. р < 0,05 - достоверные различия результатов опытной группы по сравнению с контролем

Существенные отличия в условиях суок-теста были замечены и в отношении параметров исследовательского поведения (рис. 3).

На второй неделе эксперимента исследовательская активность мышей контрольной группы составила 16,0 ± 1,4 актов заглядывания вниз и была достоверно (р < 0,001) ниже соответствующего значения параметра для опытной группы - 36,3 ± 2,7, что может быть связано с компенсаторными

2014. Вып. 4

БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ

перестройками поведения в связи с нарушением координации движений, проявлявшимся в снижении локомоторной активности у животных опытной группы (рис. 1 и 2). Аналогичное соотношение параметров исследовательской активности сохраняется вплоть до четвертой недели эксперимента -5,3 ± 1,2 заглядывания вниз у животных контрольной группы и 24,3 ± 7,5 у мышей опытной группы. Различия контроля и опыта по этому параметру поведения достоверны - р < 0,01 (рис. 3). Уменьшение исследовательской активности животных как опытной, так и контрольной групп к четвертой неделе эксперимента можно объяснить повторным предъявлением экспериментальной ситуации и привыканием к ней.

Рис. 3. Динамика исследовательской активности в суок-тесте у животных контрольной и опытной

групп.

Примечание. р < 0,001, р < 0,01- достоверные различия результатов опытной группы по сравнению

с контролем

Циклогексимид в использованных нами дозах способен вызывать торможение спонтанной активности нейронов и, следовательно, прямо влиять на их возбудимость [7]. Исходя из анализа имеющихся на этот счет точек зрения, мы считаем возможным выделение двух взаимосвязанных процессов воздействия циклогексимида на нейрон: первый (быстрый), который можно условно сравнить с развитием эксайтотоксичности, характеризуется массированным выбросом медиаторов, показанным на примере внутримозговой инъекции циклогексимида в амигдалу, где происходило увеличение выброса медиаторов дофамина, норадреналина и серотонина [8]. Вслед за этим следует развитие процесса угнетения нейронной активности. Этот процесс протекает неодинаково глубоко в разных отделах мозга, скорее всего, зависит от конкретного набора медиаторов нейронов, составляющих данную область мозга, но вследствие истощения запасов медиатора в синапсах дает повод говорить о прямом угнетении цик-логексимидом способности нервной сети к генерации электрических импульсов. Второй процесс (медленный) заключается в блокировке пептидильного центра 80S-рибосомы и блокаде биосинтеза белка в клетке, что приводит к регрессии синапсов [2] и нарушает процессы консолидации и реконсолидации памяти. Этот длительный процесс, надолго изменяющий деятельность корковых двигательных представительств, сопровождается обратимыми изменениями параметров поведения.

Выводы

1. Действие однократной внутрикорковой инъекции циклогексимида сопровождается у мышей линии BALB достоверным (р < 0,05) понижением горизонтальной двигательной активности в суок-тесте и тесте «решетка» на протяжении двухнедельного периода.

2. У мышей линии BALB наблюдается компенсация воздействия однократной внутрикорковой инъекции циклогексимида к четырехнедельному временному промежутку по параметрам горизонтальной двигательной, но не исследовательской активности в условиях суок-теста и теста «решетка».

Влияние циклогексимида на активность мышей линии BALB... 71

БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ 2014. Вып. 4

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Худякова Н.А. Влияние блокатора синтеза белка и ингибитора NO-синтазы на расположение корковых двигательных представительств // VI Междунар. конф. по когнитивной науке: тез. докл. Калининград, 2014. С. 608-609.

2. Kleim J.A., Bruneau R., Calder K., Pocock D., VandenBerg P.M., MacDonald E., Monfils M.H., Sutherland R.J. Functional organization of adult motor cortex is dependent upon continued protein synthesis // Neuron. 2003. Vol. 40. P. 167-176.

3. Проничев И.В., Ленков Д.Н. Межполушарная асимметрия моторного представительства лицевой мускулатуры в неокортексе белой мыши // Физиол. журн. СССР. 1986. Т. 72, № 10. С. 1357-1363.

4. Kalueff A.V., Tuohimaa P. The Suok ("ropewalking") murine test of anxiety // Brain Res. Brain Res. Protoc. 2005. No. 14(2). P. 87-99.

5. Hernandez T.D., Schallert T. Seizures and recovery from experimental brain damage // Exp. Neurol. 1988. Vol. 102. P. 318-324.

6. Zhang L., Schallert T., Zhang Z.G., Jiang Q., Arniego P., Li Q., Lu M., Chopp M. A test for detecting long-term sensorimotor dysfunction in the mouse after focal cerebral ischemia // Journal of Neuroscience Methods. 2002. Vol. 117. P. 207-214.

7. Gold P.E., Wrennb S.M. Cycloheximide impairs and enhances memory depending on dose and footshock intensity // Behav Brain Res. 2012. Vol. 233(2). P. 293-297.

8. Canal C.E., Chang Q., Gold P.E. Amnesia produced by altered release of neurotransmitters after intraamygdala injections of a protein synthesis inhibitor // PNAS. 2007. Vol. 104. No. 30. P. 12500-12505.

Поступила в редакцию 27.10.14

N.A. Khudyakova

INFLUENCE OF CYCLOHEXIMIDE ON THE ACTIVITY OF MICE OF BALB UNDER THE SUOK TEST AND TEST "GRID"

We have studied parameters of motor behavior in some behavioral tests (suok test and test «grid») in 2 and 4 weeks after intracortical injection of inhibitors of protein synthesis cycloheximide on 36 adult white mice of BALB. As far as cycloheximide is poorly soluble in water and isotonic solution, we used a 20% solution of ethanol in 0.9 % sodium chloride to dissolve it. Animals of control group received intracortical injection of this solution. The intracortical injection was done in the area of motor neocortex with coordinates A = 1 mm, L = 1 mm, which corresponds to the motor representation of the forelimb. As a result of the experiment we revealed a significant (p < 0.05) decrease in horizontal locomotor activity of animals of the experimental group on the 2nd week of the experiment; this parameter was compensated by the 4th week of our study. Exploratory activity of animals of the experimental group was high throughout the study period. Thus, the blockade of protein synthesis using cycloheximide in neurons modifies for 2 weeks the activity of cortical motor representations and is accompanied by reversible changes of behavior parameters.

Keywords: cycloheximide, motor cortex, motor activity, suok test, ropewalking test, grid walking task, foot fault task, BALB.

Худякова Нина Алексеевна,

кандидат биологических наук, доцент кафедры анатомии и физиологии человека и животных

ФГБОУ ВПО «Удмуртский государственный университет» 426034, Россия, г. Ижевск, ул. Университетская, 1 (корп.1) E-mail: whitemouse@udm.ru

Khudyakova N.A.,

Candidate of Biology, Associate Professor of Department of Human et Animal Anatomy et Physiology

Udmurt State University

Universitetskaya st., 1/1, Izhevsk, Russia, 426034 E-mail: whitemouse@udm.ru