СПОСОБЫ И СИСТЕМЫ ДЛЯ ОБРАБОТКИ МЕДИЦИНСКИХ УСТРОЙСТВ И ТЕКУЧИХ СРЕД
METHODS AND SYSTEMS FOR TREATING MEDICAL DEVICES AND FLUIDS

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способам и системам для уменьшения концентрации липополисахаридов на медицинских устройствах и в текучих средах, которые предназначены для контакта с человеческим телом или нахождения внутри человеческого тела.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Липополисахариды (ЛПС), также известные как липогликаны и эндотоксины, представляют собой большие молекулы, состоящие из липида и полисахарида. ЛПС является основным компонентом наружной мембраны грамотрицательных бактерий, который способствует структурной целостности бактерий и защищает мембрану от определенных видов химического воздействия. Он имеет первостепенное значение для грамотрицательных бактерий, которые погибают в случае мутации или удаления ЛПС.
ЛПС индуцирует сильный ответ нормальной иммунной системы животного, такой как человеческая иммунная система. Наличие эндотоксинов в крови называется эндотоксемией. При сильно выраженном иммунном ответе эндотоксемия может привести к септическому шоку. Допустимые концентрации эндотоксина на медицинских устройствах, воздействующих на систему кровообращения, нервную систему и глаза, жестко регулируются.
Некоторыми часто применяемыми методиками удаления загрязняющих веществ, представляющих собой эндотоксины, являются ультрафильтрация и ионообменная хроматография. Несмотря на то, что ультрафильтрация эффективна при удалении эндотоксинов из воды, она является неэффективным способом при наличии белков, которые могут быть повреждены физическими силами. Для адсорбции эндотоксинов широко применяются анионообменники, в которых как преимущество используется отрицательный результирующий заряд эндотоксинов. Тем не менее, при необходимости обеззараживания отрицательно заряженных белков они могут также адсорбироваться на матрице и приводить к значительной потере биологического материала. Кроме того, белки с положительным результирующим зарядом способны формировать комплексы с эндотоксинами. Предшествующие попытки удаления включали множество подходов, которые требуют дорогостоящего оборудования, трудоемких процессов и ограничены в сфере применения, так как предполагают использование неустойчивых и дорогостоящих фармацевтических и биологических препаратов.
В фармацевтической промышленности известно несколько альтернативных способов создания продуктов с низкими концентрациями эндотоксинов. Вместе с тем их разнообразие указывает на необходимость выбора способа удаления эндотоксинов. Для фармакологических белков были разработаны несколько процедур, в которых использовались характеристики способа производства, адаптированные в соответствии с конкретными требованиями к продукту. Таким образом, каждая процедура решает проблему совершенно иным путем; ни один из них не является широко применимым. Например, анионообменная хроматография потенциально может использоваться для обеззараживания положительно заряженных белков, таких как урокиназа. Однако обеззараживание отрицательно заряженных белков будет сопровождаться существенной потерей продукта в результате адсорбции. В случае небольших белков, таких как миоглобин (18 000 Да), ультрафильтрация может использоваться для удаления крупных агрегатов эндотоксинов. Для больших белков, таких как иммуноглобулины (150 000 Да), ультрафильтрация не будет иметь эффекта. Кроме того, ультрафильтрация будет неэффективной, если взаимодействия между эндотоксинами и белками приводят к проникновению через мембрану мономеров эндотоксинов вместе с белками. В настоящее время для удаления эндотоксинов не существует универсальных средств, предназначенных для применения в области фармацевтики и биологии, что привело к созданию ряда процедур в отношении окружающей среды, разработанных специально для конкретного продукта.
Эндотоксины являются термо- и рН-стабильными, что делает их удаление одной из наиболее трудных задач в процессах последующей обработки в ходе очистки белков. Два важных фактора, влияющих на эффективность любого подхода, представляют собой аффинность эндотоксина и белкового антигена к используемому хроматографическому носителю или среде и аффинность эндотоксина к белковому антигену. Третьим фактором является то, насколько аффинность эндотоксина к белку может быть изменена такими факторами, как температура, рН, моющие средства (поверхностно-активные вещества), растворители и денатурирующие агенты.
Как правило, процедуры, используемые для удаления эндотоксина, являются недостаточно эффективными в отношении селективности, способности к адсорбции и восстановления белка. При избирательном удалении эндотоксина из не содержащих белка растворов, эндотоксины могут быть легко удалены путем ультрафильтрации благодаря различным размерам эндотоксина и воды, или путем неселективной адсорбции гидрофобным адсорбентом или анионообменником.
Некоторыми часто применяемыми методиками удаления загрязняющих веществ, представляющих собой эндотоксины, являются ультрафильтрация и ионообменная хроматография. Несмотря на то, что ультрафильтрация эффективна при удалении эндотоксинов из воды, она является неэффективным способом при наличии белков, которые могут быть повреждены физическими силами. Для адсорбции эндотоксинов широко применяются анионообменники, в которых как преимущество используется отрицательный результирующий заряд эндотоксинов. Тем не менее, при необходимости обеззараживания отрицательно заряженных белков они могут также адсорбироваться на матрице и приводить к значительной потере биологического материала. Кроме того, белки с положительным результирующим зарядом из комплексов с эндотоксинами обуславливают перемещение эндотоксинов вместе с белками вдоль колонки и, следовательно, сводят к минимуму эффективность удаления эндотоксина.
Для удаления эндотоксина из препаратов рекомбинантного белка белковый раствор может быть пропущен через колонку, которая содержит полимиксин В, иммобилизованный на сефарозе 4 В, в надежде на то, что загрязняющий эндотоксин свяжется с гелем. Аналогичным образом, иммобилизованный на сефарозе 4 В гистидин также способен захватывать эндотоксин из белковых растворов. Аффинная хроматография с полимиксином В эффективно снижает количество эндотоксина в растворах. Полимиксин B, представляющий собой пептидный антибиотик, имеет очень высокую аффинность связывания с функциональной группой липида А большинства эндотоксинов. В статье Karplus et al., озаглавленной A new method for reduction of endotoxin contamination from protein solutions, J. Immunol. Methods 1987 Dec 24; 105(2): 211-20, сообщается об усовершенствованном способе аффинной хроматографии с полимиксином В, при которой эндотоксин может быть эффективно абсорбирован после отделения эндотоксина от белков с использованием неионного детергента октил-β-D-глюкопиранозида.
В статье, озаглавленной Endotoxin removal devices for the treatment of sepsis and septic shock авторов B Davies, J Cohen, Lancet Infect Dis 2011; 11: 65-71, описаны полимиксины, представляющие собой группу циклических катионных полипептидных антибиотиков. В дополнение к антимикробным свойствам полимиксины могут связываться с эндотоксинами и нейтрализовать их. В упомянутой статье обсуждается возможность использования полимиксина, связанного с твердофазным носителем, для специфической гемадсорбции у пациентов с сепсисом, что позволит сохранить липополисахарид-связывающие свойства и при этом свести к минимуму системные токсические эффекты. Эта система широко используется в Японии в течение многих лет, однако отсутствуют убедительные клинические данные об эффективности. В недавнем исследовании, проведенном в Италии, были получены некоторые многообещающие данные. Хотя полимиксин является главным агентом, используемым для изучения этого подхода, другие молекулы также обладают способностью связываться с эндотоксином, и некоторые из них в последнее время были предложены в качестве основы для других устройств для удаления эндотоксинов. Имеющиеся данные были проанализированы для оценки возможности использования таких устройств в клинической практике.
Упомянутые выше способы являются достаточно эффективными в отношении удаления эндотоксинов из белковых растворов с относительно высокими процентами восстановления белка. Тем не менее, эти фазы аффинности не могут быть очищены в стандартных условиях депирогенизации с концентрированным раствором гидроксида натрия в этаноле. Эти носители приводят к значительному снижению эффективности при наличии белков. Таким образом, по существу их нельзя использовать для решения вышеупомянутой проблемы.
Мембранная хроматография успешно используется для препаративного разделения, преимущественно для разделения белков. Тем не менее, повсеместного внедрения этой технологии не произошло, поскольку мембранная хроматография имеет ограниченную связывающую способность.
Стеарат кальция используется во множестве медицинских сфер применения, включая такие продукты, как шовные нити, фармацевтические препараты и катетеры. В фармацевтической и косметической промышленности стеарат кальция часто используется в качестве противослеживающей добавки для порошков и гранул и в качестве эксципиента для прессования таблеток. Стеараты являются «общепризнанными безопасными» (GRAS) веществами, встречаются у животных, и они широко используются в качестве эксципиентов.
6
В патенте США № 4,185,637 Coating composition for sutures описана мультифиламентная шовная нить с улучшенными свойствами завязывания, причем указанная шовная нить покрыта на от около 1% масс. до 5% масс. в пересчете на сухой остаток композицией, содержащей гель поливалентной металло-ионной соли жирной кислоты С или высшей жирной кислоты в летучем органическом растворителе. Соль жирной кислоты может представлять собой кальциевую, магниевую, бариевую, алюминиевую или цинковую соль. Соль жирной кислоты может дополнительно представлять собой кальциевую или магниевую соль, или соль жирной кислоты может представлять собой стеарат кальция.
6
30
6
30
В опубликованной заявке PCT WO 2013/092416 Drug-coated medical devices описаны медицинские устройства, несущие по меньшей мере на части своей поверхности по меньшей мере одно лекарственное средство и по меньшей мере одно липофильное смазывающее вещество в соотношении 0,1-500% масс. по меньшей мере одного липофильного смазывающего вещества по отношению к 100% масс. лекарственного средства, причем по меньшей мере одно лекарственное средство выбрано из паклитаксела, триоксида мышьяка, липофильных производных кортикоидов и сиролимуса, эверолимуса, зотаролимуса, биолимуса, темсиролимуса, и при этом по меньшей мере одно липофильное смазывающее вещество представляет собой соль монокарбоновой кислоты C-C, и при этом по меньшей мере одно лекарственное средство и по меньшей мере одно смазывающее вещество вносят одновременно в один и тот же растворитель или смесь растворителей, или покрытое лекарственным средством устройство покрывают дополнительным слоем по меньшей мере одного смазывающего вещества. В этой заявке дополнительно описано медицинское устройство, в котором соль C-C монокарбоновой кислоты выбрана из стеарата магния, стеарата кальция, стеарата цинка, пальмитата магния, пальмитата кальция, пальмитата цинка, миристата магния, миристата кальция, лаурата магния, лаурата кальция, каприната магния, каприната кальция, каприлата магния, каприлата кальция, олеата магния, олеата кальция, пальмитолеата магния или пальмитолеата кальция.
Существует необходимость замены других методик удаления ЛПС, таких как нанофильтрация или фильтрация с использованием заряженного фильтра, которые являются сложными, дорогостоящими или могут не работать с определенными компонентами, такими как биологические препараты.
ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Вкратце, настоящее изобретение относится к способам и системам для уменьшения концентрации липополисахаридов на медицинских устройствах и в текучих средах, которые предназначены для контакта с человеческим телом или нахождения внутри человеческого тела. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам обработки растворов, содержащих один или более эндотоксинов в обнаруживаемых концентрациях, путем добавления к указанному раствору суспензии стеарата, предпочтительно стеарата кальция, для снижения обнаруживаемых количеств указанных эндотоксинов; и необязательно удаления стеарата. Раствор представляет собой водный раствор или, более предпочтительно, воду или физиологический солевой раствор.
В альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам обработки медицинских устройств путем приведения в контакт устройств с суспензией стеарата в воде, солевом растворе или неводных растворителях для уменьшения обнаруживаемых количеств эндотоксинов на указанном медицинском устройстве. Устройство может представлять собой, например, шовную нить. Устройство предпочтительно контактирует с водой или солевым раствором, а стеарат представляет собой стеарат кальция.
В альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам обработки путем приведения в контакт поверхности ткани млекопитающего с суспензией стеарата для снижения обнаруживаемых количеств эндотоксинов на указанном млекопитающем. Стеарат предпочтительно представляет собой стеарат кальция. Суспензия стеарата может быть доставлена в комбинации с терапией антибиотиком. Суспензия стеарата может быть доставлена в желудочно-кишечный тракт млекопитающего, и при этом суспензия стеарата может быть доставлена в количестве, по меньшей мере равном количеству антибиотика. Суспензия стеарата, используемая для этих способов обработки, может содержать стеарат кальция, суспендированный в водном или солевом носителе.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Авторы изобретения обнаружили, что когда определенные стеараты, такие как стеарат кальция, приводят в прямой контакт с системами, устройствами или текучими средами (такими как вода), содержащими ЛПС, активность эндотоксина можно контролировать. Стеарат кальция, по существу представляющий собой соль, является соединением, содержащим две длинноцепочечные жирные кислоты и кальций, и является по существу нерастворимым в воде при комнатной температуре. Эти прямоцепочечные насыщенные одноосновные кислоты находятся в изобилии в животных жирах и в различных количествах в хлопковом, кукурузном, соевом, кокосовом и пальмовом маслах. В чистом состоянии эти кислоты являются тведокристаллическими, непрозрачными белыми материалами, воскообразными на ощупь. Они имеют множество сфер применения в виде стабилизатора или эмульгатора в различных производственных процессах, от изготовления смазывающих веществ до изготовления продуктов питания и лекарственных средств.
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения очистку жидкостей, таких как вода или водные растворы, включая любые биологические (например, белковые) растворы или суспензии, выполняют с использованием стеаратов, таких как стеарат кальция (CaSt). Влияние на обнаруживаемые ЛПС было зависимым от дозы стеарата, независимым от температуры и демонстрировало быстрое начало эффекта контроля ЛПС. Без ограничения какой-либо теорией, похоже, что стеараты, такие как стеарат кальция, инактивируют ЛПС таким образом, что липополисахариды не обнаруживаются даже при помощи стандартного анализа. Особенно предпочтительным количеством стеарата кальция является 0,2 г CaSt/5 мл жидкости. Тем не менее, в приведенных ниже примерах было показано снижение ЛПС даже при более низкой концентрации 0,007 г CaSt/5 мл жидкости.
В одном аспекте суспензию порошка стеарата кальция добавляют к обработанной жидкости при необязательном перемешивании. По истечении времени воздействия в диапазоне от нескольких секунд до нескольких часов жидкость по существу не содержит поддающихся измерению ЛПС. Необязательно, жидкость может быть отделена от порошка стеарата любым известным способом, таким как фильтрация, декантирование, осаждение, центрифугирование и т. п. или их комбинации, в результате того, что стеарат не растворяется в воде
В другом аспекте содержащие воду жидкости могут быть обработаны путем пропускания через стеараты или над стеаратами, которые поддерживаются или иммобилизованы на колонке или на фильтре. В еще одном аспекте такие жидкости могут быть обработаны путем пропускания через псевдоожиженный или уплотненный слой, заполненный частицами стеарата.
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения медицинские устройства, такие как шовные нити, иглы, сетки, шприцы, имплантаты, контактные линзы, контейнеры для хранения медицинских устройств и т. п., обрабатывают в водной суспензии, содержащей стеараты, такие как стеарат кальция, при необязательном перемешивании. Ожидается, что воздействие на медицинские устройства суспензией стеарата кальция в воде удалит ЛПС с поверхности медицинского устройства. В одном аспекте порошок стеарата кальция добавляют в воду с получением суспензии, и подлежащее обработке медицинское устройство погружают в суспензию при необязательном перемешивании.
1
6
Не всегда желательно подвергать медицинские устройства, в особенности рассасывающиеся медицинские устройства, воздействию воды или водных растворов. В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения медицинские устройства, в особенности рассасывающиеся медицинские устройства, такие как шовные нити, сетки и т. п., обрабатывают растворителем, содержащим суспензию или раствор стеарата, необязательно при перемешивании. В одном аспекте порошок стеарата кальция добавляют в содержащий органический растворитель раствор, а подлежащее обработке медицинское устройство погружают в растворитель при необязательном перемешивании. По истечении времени воздействия в диапазоне от нескольких секунд до нескольких часов устройство вынимают и, необязательно, высушивают или промывают. Примеры приемлемых органических растворителей включают ацетаты, такие как алкилацетат, в частности этилацетат, спирты, такие как спирты C-C, в частности низшие алкильные спирты, такие как пропанол, изопропанол и бутанол, и циклические алканы, такие как циклогексан.
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения биологические растворы могут быть обработаны суспензиями стеаратов. В одном аспекте суспензия порошка стеарата кальция может быть добавлена к обрабатываемой жидкости при необязательном перемешивании. По истечении времени воздействия в диапазоне от нескольких секунд до нескольких часов жидкость не содержит ЛПС и может использоваться. Необязательно, жидкость может быть отделена от порошка стеарата любым известным способом, таким как фильтрация, декантирование, осаждение, центрифугирование и т. п. или их комбинации.
В другом аспекте жидкости могут быть обработаны для удаления ЛПС путем пропускания через стеараты или над стеаратами, которые поддерживаются или иммобилизованы на колонке или на фильтре. В еще одном аспекте жидкости могут быть обработаны путем пропускания через псевдоожиженный или уплотненный слой, заполненный частицами стеарата.
В другом аспекте кровь или препараты или производные крови могут быть обработаны для удаления ЛПС путем пропускания через стеараты или над стеаратами, которые поддерживаются или иммобилизованы на колонке или на фильтре, или могут храниться под воздействием стеаратов в качестве суспензий, порошков или покрытий на резервуарах для хранения. В соответствии с данным аспектом время хранения крови и препаратов крови может быть увеличено. Предполагается, что влияние ЛПС на функцию тромбоцитов будет нейтрализовано стеаратом, таким как стеарат кальция. В настоящее время концентраты тромбоцитов перед введением выдерживают при комнатной температуре до пяти дней. Во время хранения продолжится пролиферация всех грамотрицательных бактерий, внедренных в тромбоциты во время сбора. Такая контаминация может привести к разрушению тромбоцитов, а также к развитию умеренной или выраженной реакции после введения данного жизненно необходимого препарата крови. При воздействии на тромбоциты стеарата кальция или эквивалентных соединений стоимость и эффективность будут значительно улучшаться.
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения млекопитающие, включая людей и животных, могут быть подвергнуты лечению связанных с ЛПС состояний, либо профилактическому, либо направленному на борьбу с острыми состояниями. Данное лечение может быть выполнено путем обработки крови, или обработки ЖКТ стеаратами в различных формах, включая суспензии и иммобилизованные стеараты. Предусмотрены лекарственные формы для перорального применения, содержащие стеараты в больших количествах. Предусмотрены стеараты в качестве добавок к лекарственным формам для перорального или местного применения, таким как антибиотики. Можно использовать любую форму стеаратов для введения, включая твердые лекарственные формы, порошки, суспензии и т. п.
В одном аспекте стеараты доставляют перед введением противомикробных агентов, например антибиотиков. В одном аспекте стеараты доставляют после введения противомикробных агентов, например антибиотиков. В одном аспекте стеараты доставляют одновременно с введением противомикробных агентов, например антибиотиков. В одном аспекте стеараты доставляют в любой комбинации из введения перед, одновременно или после введения противомикробных агентов, например антибиотиков.
В другом аспекте хирургическую промывочную жидкость можно наносить на любую часть тела млекопитающего, на рану или ткань, которая находится в пределах тела, прикреплена к телу или отделена от тела, причем промывочная жидкость содержит суспензию стеарата, такого как стеарат кальция. Хирургическую промывочную жидкость можно наносить перед, во время или после хирургического вмешательства, или в любой комбинации перед, во время или после хирургического вмешательства.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к уменьшению частоты возникновения сепсиса
посредством применения стеаратов или стеарата кальция в суспензии для промывания. При таком применении этого материала его помещают в пораженную область, а впоследствии удаляют путем аспирации. Любой эндотоксин, который связан с клетками, удаляют вместе с эндотоксином, который нейтрализован стеаратом кальция в промывочном растворе. Таким образом удаляются свободные эндотоксины, связанные с белком эндотоксины и связанные со стеаратом кальция эндотоксины, что значительно уменьшает взаимодействие с телом и ослабляет любой физиологический эффект.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к избирательному обеззараживанию внутрибрюшинной полости. Вслед за снижением нагрузки грамотрицательными бактериями [например, во внутрибрюшинной полости] будет происходить ослабление сепсиса и бактериемии. Это может быть достигнуто путем внесения стеарата кальция в хирургическую промывочную жидкость, находящуюся в пригодной для доставки форме. Для обеспечения эффективности требуются минимальные концентрации стеарата кальция, и его механизм действия позволяет быстро нейтрализовать эндотоксин.
В одном аспекте стеарат кальция вводят непосредственно в кровеносную систему. В другом аспекте стеарат кальция вводят опосредованно, как это требуется при экстракорпоральном удалении эндотоксина.
В другом аспекте стеарат, такой как стеарат кальция, тонко измельчают с образованием частиц, имеющих размер от около 1 нм до около 1 мм, например от 5 нм до 500 мкм, например около 10 нм, 100 нм, 1 мкм, 10 мкм, 50 мкм, 100 мкм, 300 мкм, 500 мкм или их комбинаций.
ПРИМЕР 1
Воду и водные растворы (содержащие ЛПС с различными источниками эндотоксина) подвергали воздействию стеарата кальция [CaSt] (в виде суспензии порошка) и демонстрировали снижение ЛПС или, альтернативно, отсутствие каких-либо поддающихся обнаружению ЛПС (данный эффект зависел от дозы CaSt). Порошок стеарата кальция (PMC BIOGENIX, <21,8 мкм, растительного происхождения) в различных количествах добавляли в стерильные пробирки. В каждую пробирку добавляли 5 мл водного раствора эндотоксина с известной концентрацией (полученного путем добавления водного раствора эндотоксина с известной концентрацией в не содержащую эндотоксина воду), интенсивно встряхивали (1 минуту) с использованием вихревого смесителя Fisher Scientific Digital Vortex Mixer, а впоследствии помещали в теплую водяную баню (37°C) на 1 час. Через 1 час пробирки вынимали из теплой водяной бани и интенсивно встряхивали (1 минуту). Для экстрагирования раствора без удаления стеарата кальция использовали стерильные шприцы с иглами. Впоследствии в этом растворе исследовали концентрации эндотоксина. Кинетический хромогенный метод количественного определения эндотоксина с использованием многокассетной системы Endosafe MCS от компании Charles River Laboratories, г. Чарлстон, штат Южная Каролина, США.
В таблице 1 показаны результаты исследования, в котором стеарат кальция добавляли в пробирки объемом 5 мл, содержащие 5 мл воды, с добавлением 200 мкл раствора, содержащего ЛПС. Общее количество ЛПС, добавленное в пробирки, составляло около 5 ЕЭ, причем обнаруженное количество ЛПС после обработки составляло от 3% до 8% от начальной концентрации. Данные показывают, что количество обнаруживаемых ЛПС значительно снизилось после добавления к 5 мл воды около 0,25 г стеарата кальция.
Таблица 1.
Обнаружение ЛПС после добавления стеарата кальция в пробирки, содержащие воду с добавленными ЛПС
Проба
Масса добавленного порошка CaSt (г)
Концентрация после добавления (ЕЭ/мл)
Объем добавки (мкл)
Добавленный эндотоксин (ЕЭ)
Обнаруженный эндотоксин (ЕЭ)
Процентное содержание обнаруженного эндотоксина по сравнению с исходной концентрацией
1
0,252
26,04
200
5,208
<0,15
<2,88%
2
0,258
26,04
200
5,208
<0,42
<8,06%
3
0,272
26,04
200
5,208
<0,15
<2,88%
4
0,267
26,04
200
5,208
<0,18
<3,46%
В таблице 2 показаны результаты схожего исследования, в котором стеарат кальция добавляли в пробирки объемом 5 мл, которые содержали 5 мл воды со 1000 мкл раствора, содержащего ЛПС, причем концентрация ЛПС была намного выше. Общее количество ЛПС, добавленное в пробирки, составляло около 14 400 ЕЭ, причем обнаруженное количество ЛПС после обработки составляло от 0,07% до 0,08% от начальной концентрации. Данные показывают, что количество обнаруживаемых ЛПС значительно снизилось после добавления к 5 мл воды около 0,25 г стеарата кальция.
Таблица 2.
Обнаружение ЛПС после добавления стеарата кальция в пробирки, содержащие воду с добавленными ЛПС
Проба
Масса добавленного порошка CaSt (г)
Концентрация после добавления (ЕЭ/мл)
Объем добавки (мкл)
Добавленный эндотоксин (ЕЭ)
Обнаруженный эндотоксин (ЕЭ)
Процентное содержание обнаруженного эндотоксина по сравнению с исходной концентрацией
1
0,254
14 400
1000
14 400
12,1
0,08%
2
0,2607
14 400
1000
14 400
10,3
0,07%
В таблице 3 показаны результаты схожего исследования, в котором стеарат кальция добавляли в пробирки объемом 5 мл, которые содержали 5 мл воды со 1000 мкл раствора, содержащего ЛПС, причем концентрация ЛПС была намного выше. Общее количество ЛПС, добавленное в пробирки, составляло около 14 400 ЕЭ, а обнаруженное количество ЛПС после обработки зависело от количества добавленного CaSt. Количество добавляемого CaSt различалось приблизительно в 100 раз и составляло от 0,0027 г до 0,25 г, при этом обнаруженное количество ЛПС после обработки находилось в диапазоне от 77% до 0,19% соответственно от исходной концентрации. Данные показывают, что при добавлении около 0,05-0,25 г стеарата кальция в 5 мл воды количество обнаруживаемых ЛПС снижалось до менее 1% от исходной концентрации, более конкретно до менее 0,2% от исходной концентрации. При более низких количествах CaSt количество ЛПС уменьшилось не так значительно, а именно добавление 0,01 г CaSt приводило к обнаружению 20% ЛПС после обработки, а добавление 0,0027 г CaSt приводило к обнаружению 77% ЛПС после обработки. Наблюдаемый ответ на концентрацию показывает, что при увеличении массы стеарата кальция обнаруженная активность эндотоксина приближается к нулю. Таким образом, существует три фактора, которые влияют на эффективность стеарата в отношении удаления/нейтрализации эндотоксинов. Эти три фактора, не обязательно перечисленные в порядке важности, представляют собой концентрацию, время воздействия и энергию в растворе на микроуровне.
Таблица 3
. Обнаружение ЛПС после добавления стеарата кальция в пробирки, содержащие воду с добавленными ЛПС
Проба
Масса добавленного порошка CaSt (г)
Концентрация после добавления (ЕЭ/мл)
Объем добавки (мкл)
Добавленный эндотоксин (ЕЭ)
Обнаруженный эндотоксин (ЕЭ)
Процентное содержание обнаруженного эндотоксина по сравнению с исходной концентрацией
1
0,2502
14 400
1000
14 400
26,7
0,19%
2
0,0518
14 400
1000
14 400
9,4
0,07%
3
0,0108
14 400
1000
14 400
2925
20,31%
4
0,0027
14 400
1000
14 400
11 055
76,77%
Данные показывают, что обработка воды стеаратом кальция приводит к значительному снижению ЛПС или обнаруживаемой активности эндотоксинов, при этом при добавлении более больших количеств CaSt концентрация ЛПС приближается к нулю.
ПРИМЕР 2. ИССЛЕДОВАНИЕ ШОВНОЙ НИТИ В ВОДНОЙ СУСПЕНЗИИ
Обработку шовных нитей в водных суспензиях CaSt проводили так, как описано ниже. Применяемая шовная нить представляла собой шовную нить VICRYL (полиглактин 910), изготовленную из сополимера, состоящего на 90% из гликолида и на 10% из L-лактида, размер 1, фрагменты по 69 сантиметров (27 дюймов). Используемые источники эндотоксина представляли собой нетекучую (или стоячую) дождевую воду (SRW), разбавленную LRW до получения концентрации (3980 ЕЭ/мл). Использовали воду для разведения LAL-реактива (LRW) Endosafe, изготовленную компанией Charles River Laboratories, г. Чарлстон, штат Южная Каролина, США. Используемый стеарат кальция представлял собой PMC BIOGENIX, <21,8 мкм, растительного происхождения).
Одновременно восемь волокон шовной нити помещали в пробирку с раствором ЛПС (эндотоксин) на 10 минут. Шовные нити высушивали в течение 20 минут, а впоследствии помещали в круглодонные пробирки. Получали суспензии 5% масс. CaSt в воде для разведения LAL-реактива. (0,5 г CaSt в 10 мл LRW). В каждую пробирку помещали по одной шовной нити и встряхивали в этом растворе в течение приблизительно 10 секунд. Шовные нити извлекали и позволяли им высохнуть в течение 20 минут, а впоследствии помещали в круглодонные пробирки. Эту процедуру выполняли для 3 шовных нитей. Три фрагмента шовной нити, которые служили для контроля, не погружали ни в какие растворы и помещали в пробирки. В каждую пробирку добавляли 3 мл воды для разведения LAL-реактивов, пробирки интенсивно встряхивали в течение 1 минуты, а впоследствии помещали в горячую водяную баню при температуре 37°C на 1 час. Впоследствии их извлекали, интенсивно встряхивали в течение 1 минуты, разбавляли и исследовали в системе MCS. Также исследовали воду, смешанную со стеаратом кальция. Две шовные нити погружали в LRW, которую смешивали с стеаратом кальция. LRW отделяли от стеарата кальция до погружения двух шовных нитей. Также выполняли исследование концентрации эндотоксина в MCS. Результаты представлены в таблицах 4-6.
Таблица 4.
Обнаружение ЛПС после добавления стеарата кальция в пробирки, содержащие воду с добавленными ЛПС
Образец шовной нити
Раствор для погружения
Обнаруженный эндотоксин (ЕЭ)
Среднее обнаруженное количество эндотоксина (ЕЭ)
Среднее изменение концентрации эндотоксина (%)
1
Нет
74,4
84
н/п
2
Нет
99
3
Нет
78,6
4
Вода для разведения LAL-реактива с 5%-м стеаратом кальция
5,16
3,27
-96,1%
5
Вода для разведения LAL-реактива с 5%-м стеаратом кальция
1,89
6
Вода для разведения LAL-реактива с 5%-м стеаратом кальция
2,76
7
Вода после удаления стеарата кальция
13,56
17,09
-79,7%
8
Вода после удаления стеарата кальция
20,61
Таблица 5.
Раствор стеарата кальция, исследованный после удаления шовной нити
Раствор
Обнаруженный эндотоксин (ЕЭ)
Вода с 5%-м стеаратом кальция - проба 4
<1,0
Вода с 5%-м стеаратом кальция - проба 5
<1,0
Вода с 5%-м стеаратом кальция - проба 6
<1,0
Таблица 6.
Добавленный стеарат кальция
Проба
Масса стеарата кальция (граммы)
5%-й стеарат кальция - проба 4
0,5139
5%-й стеарат кальция - проба 5
0,5137
5%-й стеарат кальция - проба 6
0,5181
5%-й стеарат кальция удален - проба 7
0,5120
5%-й стеарат кальция удален - проба 8
0,5221
На основании вышеприведенных результатов можно сделать вывод, что обработка в водной суспензии стеарата кальция приводит к значительному снижению ЛПС или активности эндотоксина, в том числе на медицинских устройствах и в растворах, контактирующих с медицинскими устройствами.
ПРИМЕР 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ШОВНОЙ НИТИ В ОРГАНИЧЕСКИХ РАСТВОРИТЕЛЯХ
Медицинское устройство (представленное в виде рассасывающейся шовной нити) загрязняли ЛПС и впоследствии подвергали воздействию CaSt в неводном растворителе, а затем исследовали на ЛПС, обнаружив значительное снижение концентрации ЛПС.
Рассасывающуюся шовную нить VICRYL (полиглактин 910) (размер 1, длина: 69 см (27 дюймов)), изготовленную из сополимера, состоящего на 90% из гликолида и на 10% из L-лактида, подвергали воздействию раствора, содержащего ЛПС (эндотоксин) (одновременно 9 волокон викриловой шовной нити погружали в пробирку с раствором эндотоксина (SRW, концентрация: 3980 ЕЭ/мл) на 10 минут при температуре окружающей среды. Шовные нити высушивали на воздухе в течение 20 минут в вентилируемом вытяжном шкафу, а впоследствии помещали в круглодонную пробирку и высушивали. После этого шовную нить погружали в этилацетат (EtAc), содержащий CaSt, быстро встряхивали в течение 10 секунд, высушивали в течение 20 минут в вентилируемом вытяжном шкафу и экстрагировали в не содержащей эндотоксин воде при температуре окружающей среды. Шовную нить, экстрагированную в не содержащей эндотоксин воде (LRW) впоследствии исследовали на ЛПС, используя кинетический хромогенный способ количественного определения эндотоксина, Charles Rivers Laboratories, г. Чарлстон, штат Южная Каролина, США.
В таблице 7 представлены результаты экспериментального обнаружения ЛПС после воздействия на шовную нить CaSt в EtAc.
Таблица 7.
Обнаружение ЛПС после воздействия на шовную нить CaSt в EtAc
Проба
Раствор для погружения
Обнаруженный эндотоксин (ЕЭ)
Среднее обнаруженное количество эндотоксина (ЕЭ)
1
Этилацетат
85,8
80,4
2
Этилацетат
72
3
Этилацетат
83,4
4
Этилацетат с 5%-м стеаратом кальция
23,4
23,6
5
Этилацетат с 5%-м стеаратом кальция
21,78
6
Этилацетат с 5%-м стеаратом кальция
25,62
7
Без погружения в растворитель
107,52
105,6
8
Без погружения в растворитель
96,9
9
Без погружения в растворитель
112,5
Пробы 1-3 подвергали воздействию EtAc, не содержащего CaSt, в качестве контроля. Как видно из таблицы 7, после обработки в растворителе было обнаружено около 80 ЕЭ ЛПС. Пробы 4-6 подвергали воздействию EtAc, содержащего 5%-й стеарат кальция. Возвращаясь к таблице 7, после обработки в растворителе было обнаружено около 23 ЕЭ ЛПС. Пробы 7-9 не подвергали какой-либо обработке растворителем в качестве дополнительного контроля, и без обработки в растворителе было обнаружено около 105 ЕЭ ЛПС. Наличие CaSt в растворителе приводило к значительному снижению ЛПС.
Аналогично описанному выше исследованию, рассасывающуюся шовную нить того же типа, таким же образом загрязненную, подвергли воздействию CaSt в трех растворителях (этанол, циклогексан, изопропанол). Впоследствии шовную нить исследовали на ЛПС. В таблице 8 представлены результаты экспериментального обнаружения ЛПС после воздействия на шовную нить CaSt в этих растворителях. Растворители сами по себе приводили к уменьшению обнаруженной активности ЛПС только приблизительно на 10%. В присутствии 1%-й суспензии стеарата кальция (CaSt может быть немного растворимым в растворителях) активность ЛПС снижалась на 75-95%.
Использованные шовные нити представляли собой фрагменты рассасывающихся шовных нитей из сополимера лактида и гликолида длиной 69 сантиметров (27 дюймов). Используемые источники эндотоксина представляли собой стоячую дождевую воду (SRW) и LRW (3980 ЕЭ/мл). Одновременно 7 волокон шовной нити помещали в пробирку с раствором эндотоксина на 10 минут. Шовные нити высушивали в течение 20 минут, а впоследствии помещали в круглодонные пробирки. Получали растворы 1% масс. стеарата кальция в различных растворителях (изопропанол, циклогексан и этанол). В каждую пробирку помещали по 1 шовной нити и встряхивали в этом растворе в течение приблизительно 10 секунд. Шовные нити извлекали и позволяли им высохнуть в течение 20 минут, а впоследствии помещали в круглодонные пробирки. Эту процедуру выполняли для 6 шовных нитей. 1 фрагмент шовной нити, который служил для контроля, не погружали ни в какие растворы и помещали в пробирки. В каждую пробирку добавляли 3 мл воды для разведения LAL-реактивов, пробирки интенсивно встряхивали, а впоследствии помещали в горячую водяную баню при температуре 37°C на 1 час. Впоследствии их извлекали, интенсивно встряхивали, разбавляли и исследовали в системе MCS.
Таблица 8
. Результат исследования в этаноле, циклогексане, изопропаноле
<b>Проба</b>
<b>Раствор для погружения</b>
<b>Обнаруженный эндотоксин (ЕЭ)</b>
<b>Изменение концентрации эндотоксина (%)</b>
Шовная нить 1
-
68,1
-
Шовная нить 2
Изопропанол
60
-11,9%
Шовная нить 3
Изопропанол с 1%-м стеаратом кальция (0,0841 г)
16,59
-75,6%
Шовная нить 4
Циклогексан
58,74
-13,7%
Шовная нить 5
Циклогексан с 1%-м стеаратом кальция (0,0858 г)
4,02
-94,1%
Шовная нить 6
Этанол
60,6
-11,0%
Шовная нить 7
Этанол с 1%-м стеаратом кальция (0,0827 г)
15,06
-77,9%
На основании вышеприведенных результатов можно заключить, что обработка в растворителе, содержащем CaSt, приводит к значительному снижению обнаруживаемых ЛПС или активности эндотоксина.
ПРИМЕР 4. ИССЛЕДОВАНИЕ РАНЕВОЙ ПОВЯЗКИ В РАСТВОРИТЕЛЕ
Раневую повязку, содержащую сухой фибриноген и сухой тромбин на рассасывающейся подложке, исследовали так, как описано ниже. На повязку наносили ЛПС, и впоследствии подвергали воздействию циклогексана, содержащего CaSt, для определения влияния на обнаруживаемую концентрацию ЛПС.
На три кусочка повязки размером 2,54×5 сантиметров (1×2 дюйма) наносили эндотоксин с получением концентрации 8,9 ЕЭ ЛПС. Кусочки оставляли высохнуть в течение 20 минут, впоследствии помещали в полипропиленовые конические пробирки объемом 50 мл. В пробирку 1 добавляли 7,5 мл воды для разведения LAL-реактива+2,5 мл 0,25 М буферного раствора трис. В пробирку 2 добавляли 10 мл циклогексана, содержащего 0,1 г CaSt. В пробирку 3 добавляли 10 мл циклогексана. Пробирки закрывали, а впоследствии помещали в устройство для вращения флаконов на 15 минут таким образом, чтобы пробирка могла непрерывно вращаться, а повязка постоянно находилась в контакте с жидкостью.
Впоследствии раствор из пробирки 1 разбавляли и исследовали на эндотоксин в системе MCS. Кусочки фибриновой повязки из пробирки 2 и пробирки 3 извлекали, помещали в новые пробирки и экстрагировали в 7,5 мл воды для разведения LAL-реактива+2,5 мл 0,25 М буферного раствора трис. Впоследствии растворы исследовали в системе MCS на эндотоксин (ЛПС). Результаты представлены в таблице 9.
Таблица 9.
Результаты исследования повязки в циклогексане, содержащем CaSt
Фибриновая повязка
Эндотоксин, обнаруженный на повязке (ЕЭ)
Обнаруженное содержание эндотоксина в процентах по сравнению с пробиркой 1
Пробирка 1 - без циклогексана
8,9
-
Пробирка 2 - обработка циклогексаном+стеарат кальция
1,8
20,2%
Пробирка 3 - обработка циклогексаном
6,0
67,4%
Полученные результаты показывают, что количество ЛПС уменьшалось с 9 ЕЭ до 6 ЕЭ после обработки чистым циклогексаном и уменьшалось с 9 ЕЭ до 2 ЕЭ после обработки циклогексаном+CaSt, что свидетельствует о том, что CaSt оказывает существенное влияние на снижение активности ЛПС на медицинском устройстве.
ПРИМЕР 5. ИССЛЕДОВАНИЕ С ХЕЛАТИРУЮЩИМИ АГЕНТАМИ И ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫМИ ВЕЩЕСТВАМИ
Дальнейшее исследование выполняли с добавлением реактивов ЭДТА и полисорбат 20 для подтверждения постоянного удаления ЛПС/активности эндотоксина, добавляя ЭДТА и полисорбат 20 в экстрагированные растворы для исследования потенциального восстановления активности эндотоксина при воздействии этих двух веществ.
Тестирование проводили в водных растворах, в которые были добавлены ЭДТА и полисорбат 20, при этом в некоторых растворах в переменных количествах присутствовал суспендированный CaSt. Стеарат кальция взвешивали и добавляли в 5 мл раствора эндотоксина. Пробирки встряхивали в течение 1 минуты и помещали в баню при 37°C на 1 час. Пробирки извлекали из бани и снова встряхивали в течение 1 минуты. Растворы разводили и исследовали на эндотоксин, используя кинетический хромогенный способ количественного определения эндотоксина, Charles Rivers Laboratories, г. Чарлстон, штат Южная Каролина, США. Для измерения влияния ЭДТА в экстрагированный раствор, содержащий стеарат кальция, добавляли 0,155 г 0,1 М соединения. Влияние полисорбата 20 измеряли путем добавления 4 мкл соединения в экстрагированный раствор, содержащий стеарат кальция и ЭДТА. Эти пробы интенсивно встряхивали и исследовали, используя кинетический хромогенный способ количественного определения эндотоксина, Charles Rivers Laboratories, г. Чарлстон, штат Южная Каролина, США. Неожиданно было обнаружено, что ЛПС/активность эндотоксина не восстанавливалась в присутствии ЭДТА и твин 20. Результаты представлены в таблице 10.
Таблица 10
. Обнаружение ЛПС в воде в присутствии CaSt, и ЭДТА, и твин 20
Проба
Масса стеарата кальция (г)
Добавленный эндотоксин (ЕЭ)
Обнаруженный эндотоксин (ЕЭ)
Обнаруженное содержание эндотоксина в процентах
Вода (контроль)
0
8330
8700
104,4%
0,1 M ЭДТА и 0,05% твин 20 (контроль)
0
8330
7450
89,4%
Суспензия стеарата кальция
0,007
8330
3995
48,0%
Суспензия стеарата кальция с 0,1 М ЭДТА и 0,05% твин 20
0,007
8330
5050
60,6%
Суспензия стеарата кальция
0,018
8330
1487,5
17,9%
Суспензия стеарата кальция с 0,1 М ЭДТА и 0,05% твин 20
0,018
8330
1545
18,5%
Суспензия стеарата кальция
0,028
8330
235
2,8%
Суспензия стеарата кальция с 0,1 М ЭДТА и 0,05% твин 20
0,028
8330
255
3,1%
Полученные результаты показывают, что даже в присутствии хелатирующего агента и поверхностно-активного вещества не наблюдалось значительного уменьшения или ослабления эффекта обработки ЛПС стеаратом кальция, в особенности при более высоких концентрациях 0,028 грамма и 0,018 грамма CaSt на мл.
ПРИМЕР 6. ИССЛЕДОВАНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ИСТОЧНИКОВ ЛПС
Полученный в лаборатории эндотоксин и природный эндотоксин существенно различаются. Таким образом, в отношении описанных выше способов исследовали активность эндотоксина, используя различные источники эндотоксина. Полученный в лаборатории эндотоксин является очищенным, а природный эндотоксин будет присутствовать вместе с другими веществами, такими как белки и фосфолипиды. Показано, что данный способ удаления активности эндотоксина с использованием стеарата кальция эффективно удаляет активность эндотоксина из различных источников природного эндотоксина.
Полученный в лаборатории эндотоксин, как правило, очищают посредством экстракции фенолом, подвергают диализу, обрабатывают уксусной кислотой/95% этанолом, обрабатывают рибонуклеазой/дезоксирибонуклеазой, а впоследствии снова подвергают диализу с водой. Полученный в лаборатории эндотоксин, используемый в данном эксперименте, поставлялся компанией Charles River Laboratories.
Природный эндотоксин захватывали из воздуха, используя электретный фильтр. Электретные фильтры изготавливают из диэлектрических полимерных волокон, которые при прохождении через них воздуха вырабатывают электрический заряд, захватывая эндотоксин вместе с другими частицами. Эндотоксин извлекали из фильтра, поместив фильтр в не содержащую эндотоксин воду на длительный период времени.
Два других природных источника эндотоксина получали из проб воды из окружающей среды. Одним из источников был водоем со стоячей дождевой водой, а другой представлял собой небольшую лужу на берегу реки Раритан. Стоячую дождевую воду (SRW) очищали посредством хлорирования и пропускания через фильтр 0,2 мкм. Воду из реки Раритан (RRW) не подвергали никакой обработке. Для всех источников эндотоксина проводили одну и ту же процедуру исследования. На основании приведенных ниже данных видно, что для всех источников наблюдаются очень схожие тенденции удаления активности эндотоксина при использовании способов настоящего изобретения.
Исследование выполняли, используя процедуры, аналогичные описанным в примере 1. Результаты представлены в таблице 11.
Таблица 11.
Обнаружение ЛПС после добавления стеарата кальция в пробирки, содержащие воду с добавленными ЛПС
Тип эндотоксина
Масса стеарата кальция (г)
Добавленный эндотоксин (ЕЭ)
Обнаруженный эндотоксин (ЕЭ)
Обнаруженное содержание эндотоксина в процентах
SRW
0
11 100
9200
82,9%
SRW
0,01
11 100
2780
25,0%
SRW
0,25
11 100
113
1,0%
Вода с эндотоксином, извлеченным из пылеуловителя
0
9280
12 350
133,1%
Вода с эндотоксином, извлеченным из пылеуловителя
0,01
9280
3440
37,1%
Вода с эндотоксином, извлеченным из пылеуловителя
0,25
9280
28,5
0,3%
RRW
0
4340
4970
114,5%
RRW
0,01
4340
960
22,1%
RRW
0,1
4340
165
3,8%
RRW
0,25
4340
70
1,6%
RRW
0,35
4340
115
2,6%
Стандарт компании Charles River
0
8330
8700
104,4%
Стандарт компании Charles River
0,007
8330
3995
48,0%
Стандарт компании Charles River
0,018
8330
1487,5
17,9%
Стандарт компании Charles River
0,028
8330
235
2,8%
Стандарт компании Charles River
0,05
8330
190,5
2,3%
Стандарт компании Charles River
0,15
8330
86,5
1,0%
Стандарт компании Charles River
0,25
8330
38,5
0,5%
Эти данные показывают, что по мере увеличения массы CaSt концентрация обнаруженного или восстановленного эндотоксина снижалась и приближалась к 0%. При содержании стеарата кальция 0,1 грамма и выше процентная доля восстановленного эндотоксина составляла менее 5% для всех источников эндотоксина (как для лабораторного стандарта, так и для 2 природных источников). Добавление стеарата кальция приводило к значительному снижению активности всех источников ЛПС.
ПРИМЕР 7. ДРУГИЕ РЕАГЕНТЫ
Другие реагенты, включая воски, парафины, исследовали в отношении удаления эндотоксина, а полученные результаты показаны в таблице 12.
Таблица 12.
Исследование воска и парафина
Источник воска
Масса используемого воска (г)
Добавленный эндотоксин (ЕЭ)
Обнаруженный эндотоксин (ЕЭ)
Обнаруженное содержание эндотоксина в процентах
Пчелиный воск
0,2654
7750
6450
83,2
Пчелиный воск
0,5328
7750
6300
81,3
Бальзам для губ компании Burts Bee's
0,2559
7750
6800
87,7
Парафиновые шарики
0,2516
7750
5580
72,0
Парафиновые шарики (дробленые)
0,2535
7750
6800
87,7
Парафиновый кубик
0,2625
7750
4840
62,5
Свечной парафин
0,2526
7750
4585
59,2
Как показано выше, авторы изобретения исследовали пчелиный воск и обнаружили, что он не был насколько же эффективным в отношении снижения активности ЛПС. Также исследовали другие стеараты и показали, что они обладают активностью в отношении снижения ЛПС, хотя и не такой выраженной, как стеарат кальция. Неожиданно было обнаружено, что CaSt является значительно более эффективным, чем другие исследованные реагенты, такие как воски, показанные в таблице 12.
ПРИМЕР 8. Использование сетчатого носителя, покрытого CaSt, для удаления ЛПС из воды
Экспериментальная процедура Покрытие полипропиленовой сетки для удаления эндотоксина из воды или растворов
Воск Ethasew (воск Ethasew™, который представляет собой смесь 50 процентов сорбитанмонопальмитата, 20 процентов сорбитантристеарата и 30 процентов сорбитантристеарата, содержащую 20 мольных процентов оксида этилена) смешивали в массовом соотношении 50/50 со стеаратом кальция, нагревали на горячей плите при 150°C, перемешивали, наносили на кусочек полипропиленовой сетки размером 5×2,54 сантиметра (2×1 дюйм) и позволяли остыть.
Другой кусочек сетки получали путем смешивания 10 мл этилацетата в чашке для взвешивания с 0,5 г стеарата кальция. Кусочек полипропиленовой сетки размером 10×5 сантиметров (4×2 дюйма) ненадолго погружали в смесь этилацетата и CaSt и извлекали для высушивания.
В нескольких пробирках пробы SRW и EVV, содержащие эндотоксин, приводили в контакт с вышеописанной обработанной сеткой, а также исследовали в качестве контролей. EVV представляет собой очищенный препарат эндотоксина в форме суспензии, полученный от компании Charles Rivers Laboratories. Впоследствии пробирки помещали на устройство для вращения пробирок на 15 минут при 10 об/мин, извлекали, разбавляли и исследовали на эндотоксин в Charles River MCS. Результаты представлены в таблице 13.
Таблица 13.
Исследование сетки, покрытой CaSt
<b>Изделие </b>
<b>Обнаруженный эндотоксин (ЕЭ/мл)</b>
<b>Процентное изменение (удаление эндотоксина)</b>
<b>SRW:</b> Раствор эндотоксина для добавления на исходном уровне
127 ЕЭ/мл
--
<b>EVV:</b> Раствор эндотоксина для добавления на исходном уровне
346 ЕЭ/мл
--
Контрольный EVV
315 ЕЭ/мл
-9%
EVV+покрытая CaSt сетка
73,9 ЕЭ/мл
-79%
EVV+сетка с воском Ethasew
239 ЕЭ/мл
-31%
Контрольный SRW
105,5 ЕЭ/мл
-17%
SRW+покрытая CaSt сетка
85,6 ЕЭ/мл
-33%
SRW+сетка с воском Ethasew
94,5 ЕЭ/мл
-26%
Как показано выше, сетчатый носитель эффективно удалял эндотоксин или ЛПС из воды, стеарат кальция оказался еще более эффективным, а другие формы стеарата также были в определенной степени эффективными в отношении уменьшения активности эндотоксина.
ПРИМЕР 9. Эффективность стеарата кальция (CaSt) при ультразвуковом перемешивания растворов
10 мл воды LRW (вода для разведения LAL-реактива, не содержит эндотоксина), содержащей 0,04 г суспензии стеарата кальция, обрабатывали ультразвуком, используя прибор Misonix Professional Sonicator, модель: S-4000, амплитуда: 30, время: 30 секунд, и впоследствии суспензию хранили в течение 1 месяца при температуре окружающей среды. Впоследствии 1 мл вышеописанной суспензии добавляли к 10 мл содержащей эндотоксин воды SRW, и полученные концентрации эндотоксина в комбинированном растворе измеряли через 15 минут и 30 мин, а результаты представили в таблице 14.
Таблица 14.
Влияние ультразвуковой обработки на эффективность CaSt при выполнении ультразвуковой обработки за 1 месяц до исследования на удаление эндотоксина
Тип раствора
Начальное содержание эндотоксина (ЕЭ/мл)
Содержание эндотоксина (ЕЭ/мл) (через 15 мин после добавления суспензии стеарата кальция)
Содержание эндотоксина (ЕЭ/мл) (через 30 мин после добавления суспензии стеарата кальция)
Процент удаления эндотоксина (15 мин/30 мин)
ИССЛЕДОВАНИЕ 1
732,5
372
384
49,2%/47,6%
ИССЛЕДОВАНИЕ 2
732,5
362
278
50,6%/62,0%
Как показано в таблице выше, даже через 1 месяц хранения суспензия стеарата кальция была эффективной в отношении удаления эндотоксина в концентрация от около 48% до около 62% после всего лишь 15 или 30 мин контакта.
ПРИМЕР 10. Влияние хранения на эффективность суспензии стеарата кальция
Исследовали эффективность предварительно смешанных суспензий стеарата кальция (обработанных ультразвуком и подвергнутых встряхиванию), сравнивая эффективность только что полученных суспензий с суспензиями, хранившимися или отстаивавшимися в течение 90 мин, 5 дней и 1 месяца перед контактом с содержащими эндотоксин растворами.
Исследование с немедленным перемешиванием
УЛЬТРАЗВУКОВАЯ ОБРАБОТКА. Стеарат кальция (CaSt)+обработанные ультразвуком пробы SRW: пробирки, содержащие 0,04 г CaSt и 0,02 г CaSt в 10 мл LRW, обрабатывали ультразвуком в течение 30 секунд с интенсивностью 30. Впоследствии 10 мл SRW помещали в обработанную ультразвуком смесь CaSt. Впоследствии ее встряхивали в течение 5 секунд для полного перемешивания обработанного ультразвуком CaSt. Впоследствии, через 15 минут взаимодействия, смесь исследовали для измерения процентного снижения содержания эндотоксина.
ОБРАБОТКА ВСТРЯХИВАНИЕМ. Стеарат кальция (CaSt)+подвергнутые встряхиванию пробы SRW: пробирки, содержащие 0,04 г CaSt и 0,02 г CaSt в 10 мл LRW, встряхивали. Впоследствии 10 мл SRW помещали в подвергнутую встряхиванию смесь CaSt. Впоследствии ее встряхивали в течение 5 секунд для полного перемешивания обработанного ультразвуком CaSt. Впоследствии, через 15 минут взаимодействия, смесь исследовали для измерения процентного снижения содержания эндотоксина.
Впоследствии, через 15 минут взаимодействия, эти смеси исследовали в Charles River MCS в разведении 1: 2000.
Исследование суспензий, хранившихся или отстаивавшихся в течение 90 мин, 5 дней и 1 месяца перед контактом с содержащими эндотоксин растворами.
Исследуемые пробы получали, как описано выше, обрабатывали ультразвуком и встряхивали, но подвергали хранению или отстаиванию в течение 90 мин, 5 дней и 1 месяца перед контактом с содержащими эндотоксин растворами (SRW). По истечении периода отстаивания, аналогично описанному выше исследованию с немедленным перемешиванием, 10 мл SRW впоследствии вносили в обработанную ультразвуком или подвергнутую встряхиванию смесь CaSt. Впоследствии ее встряхивали в течение 5 секунд для полного перемешивания обработанного ультразвуком CaSt. Впоследствии, через 15 минут взаимодействия, смесь исследовали для измерения процентного снижения содержания эндотоксина. Впоследствии, через 15 минут взаимодействия, эти смеси исследовали в Charles River MCS в разведении 1: 2000.
* Пробу, хранившуюся в течение 1 месяца, исследовали только с содержанием CaSt 0,04 г, и измеряли процент удаления через 15 минут взаимодействия, а также через 30 минут взаимодействия.
Результаты описанных выше исследований показаны в таблицах 15 и 16.
Таблица 15.
Влияние отстаивания или хранения на эффективность суспензий с содержанием стеарата кальция 0,04 г, полученных путем ультразвуковой обработки или встряхивания
(0,04 г CaSt)Предварительно смешанный стеарат кальция. Эффективность после хранения
Проба
ЕЭ до хранения
ЕЭ после хранения
Процент удаления эндотоксина
Среднее процентное изменение
Ультразвуковая обработка
Немедленное перемешивание
Обработанная ультразвуком суспензия стеарата кальция № 1
36 100
5320
85%
85%
Обработанная ультразвуком суспензия стеарата кальция № 2
36 100
5800
84%
Перемешивание через 90 мин отстаивания
Выдержанная обработанная ультразвуком суспензия стеарата кальция № 1
36 100
6168
83%
81%
Выдержанная обработанная ультразвуком суспензия стеарата кальция № 2
36 100
8000
78%
Перемешивание через 5 дней отстаивания
Выдержанная обработанная ультразвуком суспензия стеарата кальция № 3
37 800
5040
87%
85%
Выдержанная обработанная ультразвуком суспензия стеарата кальция № 4
37 800
6560
83%
Перемешивание через 1 месяц отстаивания
Выдержанная обработанная ультразвуком суспензия стеарата кальция № 1
14 650
7440
49,2%
50%
Выдержанная обработанная ультразвуком суспензия стеарата кальция № 2
14 650
7240
50,6%
Перемешано на встряхивателе
Немедленное перемешивание
Выдержанная подвергнутая встряхиванию суспензия стеарата кальция № 1
36 100
19 840
45%
44%
Выдержанная подвергнутая встряхиванию суспензия стеарата кальция № 2
36 100
20 480
43%
Перемешивание через 90 мин отстаивания
Выдержанная подвергнутая встряхиванию суспензия стеарата кальция № 1
36 100
17 120
53%
54%
Выдержанная подвергнутая встряхиванию суспензия стеарата кальция № 2
36 100
16 460
54%
Перемешивание через 5 дней отстаивания
Выдержанная подвергнутая встряхиванию суспензия стеарата кальция № 3
37 800
9080
76%
75%
Выдержанная подвергнутая встряхиванию суспензия стеарата кальция № 4
37 800
9760
74%
Таблица 16.
Влияние отстаивания или хранения на эффективность суспензий с содержанием стеарата кальция 0,02 г, полученных путем ультразвуковой обработки или встряхивания
Предварительно смешанный стеарат кальция. Эффективность хранения(0,02 г CaSt)
Проба
ЕЭ до хранения
ЕЭ после хранения
Процент удаления эндотоксина
Среднее процентное изменение
Ультразвуковая обработка
Немедленное перемешивание
Обработанная ультразвуком суспензия стеарата кальция № 1
36 100
8960
75%
74%
Обработанная ультразвуком суспензия стеарата кальция № 2
36 100
10 240
72%
90 мин
Выдержанная обработанная ультразвуком суспензия стеарата кальция № 1
36 100
15 120
58%
61%
Выдержанная обработанная ультразвуком суспензия стеарата кальция № 2
36 100
12 960
64%
5 день
Выдержанная обработанная ультразвуком суспензия стеарата кальция № 3
37 800
9200
76%
76%
Выдержанная обработанная ультразвуком суспензия стеарата кальция № 4
37 800
9200
76%
Перемешано на встряхивателе
Немедленное перемешивание
Выдержанная подвергнутая встряхиванию суспензия стеарата кальция № 1
36 100
29 200
20%
32%
Выдержанная подвергнутая встряхиванию суспензия стеарата кальция № 2
36 100
20 480
43%
90 мин
Выдержанная подвергнутая встряхиванию суспензия стеарата кальция № 1
36 100
22 400
38%
43%
Выдержанная подвергнутая встряхиванию суспензия стеарата кальция № 2
36 100
19 280
47%
5 день
Выдержанная подвергнутая встряхиванию суспензия стеарата кальция № 3
37 800
15 120
60%
64%
Выдержанная подвергнутая встряхиванию суспензия стеарата кальция № 4
37 800
12 160
68%
Данные показывают, что суспензии стеарата кальция были эффективными даже по истечении значительных периодов хранения после получения без существенного снижения эффективности.
ПРИМЕР 11. Кинетика удаления ЛПС при использовании различных способов перемешивания в присутствии различных солей стеарата: CaSt, MgSt, AlSt
В таблицах 17, 18, 19 представлены данные по кинетике удаления ЛПС при использовании различных способов перемешивания в присутствии CaSt, MgSt, AlSt.
Экспериментальная процедура. По 3 пробы для каждого типа стеарата (стеарат кальция, моностеарат алюминия и стеарат магния) взвешивали в пробирки. В каждую из пробирок добавляли 5 мл SRW. Каждый раствор исследовали на удаление эндотоксина после перемешивания путем ультразвуковой обработки, встряхивания или вращения пробирок. Пробы для ультразвуковой обработки обрабатывали ультразвуком в каждый указанный временной интервал в течение 30 секунд с интенсивностью 30. Пробы для встряхивания встряхивали в каждый указанный временной интервал в течение 30 секунд при 2500 об/мин. Пробы для вращения непрерывно вращали со скоростью 10 об/мин. Пробы исследовали в MCS на эндотоксин через 1 минуту, 20 минут, 40 минут, 60 минут и 80 минут.
Таблица 17.
CaSt: кинетика удаления ЛПС при использовании различных способов перемешивания
Стеарат кальция
Время (минуты)
Проба
Обнаруженный эндотоксин (ЕЭ)
Процент (%) удаления
SRW на исходном уровне
1502
Ультразвуковая обработка
1
Стеарат кальция
270
82%
20
Стеарат кальция
130
91,3%
40
Стеарат кальция
87,5
94,2%
60
Стеарат кальция
56,9
96,2%
80
Стеарат кальция
16,4
98,9%
Перемешивание на встряхивателе
1
Стеарат кальция
451
70%
20
Стеарат кальция
301
80%
40
Стеарат кальция
139
90,7%
60
Стеарат кальция
173
88,5%
80
Стеарат кальция
104
93,1%
Прокатывание
1
Стеарат кальция
1230
18,1%
20
Стеарат кальция
1050
30,1%
40
Стеарат кальция
630
58,1%
60
Стеарат кальция
637
57,6%
80
Стеарат кальция
451
70%
Таблица 18.
AlSt: кинетика удаления ЛПС при использовании различных способов перемешивания
Моностеарат алюминия
Время (минуты)
Проба
Обнаруженный эндотоксин (ЕЭ)
Процент (%) удаления
SRW на исходном уровне
1502
Ультразвуковая обработка
1
Моностеарат алюминия
626
58,3%
20
Моностеарат алюминия
406
73%
40
Моностеарат алюминия
375
75%
60
Моностеарат алюминия
434
71,1%
80
Моностеарат алюминия
291
80,6
Перемешивание на встряхивателе
1
Моностеарат алюминия
817
45,6%
20
Моностеарат алюминия
849
43,5%
40
Моностеарат алюминия
786
47,7%
60
Моностеарат алюминия
801
46,7%
80
Моностеарат алюминия
757
49,6%
Прокатывание
1
Моностеарат алюминия
221*
85,3%
20
Моностеарат алюминия
1260
16,1%
40
Моностеарат алюминия
1240
17,4%
60
Моностеарат алюминия
672
55,3%
80
Моностеарат алюминия
1220
18,8%
Таблица 19
. MgSt: кинетика удаления ЛПС при использовании различных способов перемешивания
Стеарат магния
Время (минуты)
Проба
Обнаруженный эндотоксин (ЕЭ)
Процент (%) удаления
SRW на исходном уровне
1502
Ультразвуковая обработка
1
Стеарат магния
743
50,5%
20
Стеарат магния
716
52,3%
40
Стеарат магния
824
45,1
60
Стеарат магния
884
41,1%
80
Стеарат магния
703
53,2%
Перемешивание на встряхивателе
1
Стеарат магния
884
41,1%
20
Стеарат магния
1000
33,4%
40
Стеарат магния
901
40%
60
Стеарат магния
958
36,2%
80
Стеарат магния
1060
29,4%
Прокатывание
1
Стеарат магния
1060
29,4%
20
Стеарат магния
1120
25,4%
40
Стеарат магния
1060
29,4%
60
Стеарат магния
1120
25,4%
80
Стеарат магния
1190
20,8%
Как видно, CaSt является более эффективным в отношении удаления ЛПС, достигая намного большего процента удаления и за более короткий период времени. Неожиданно было обнаружено, что стеарат кальция является более эффективным, чем другие формы соли. Ультразвуковая обработка была наиболее эффективной, затем перемешивание встряхиванием, а затем вращение пробирок.
ПРИМЕР 12. ВЛИЯНИЕ ПЕРЕМЕШИВАНИЯ В ОТСУТСТВИИ СТЕАРАТОВ
Выполнили контрольное исследование по оценке влияния встряхивания на ЛПС, а результаты представили в таблице 16. Исследование представляло собой контрольное исследование по измерению начальной концентрации пробы SRW и оценке влияния перемешивания без добавления какого-либо реагента. 5 мл SRW добавляли в 3 отдельные пробирки. «SRW для ультразвуковой обработки» обрабатывали ультразвуком в течение 30 секунд с интенсивностью 30, Misonix Inc. Ultrasonic Liquid Processor, г. Фармингдейл, штат Нью-Йорк, США. «SRW для встряхивания» встряхивали с использованием вихревого смесителя Fisher Scientific Digital Vortex Mixer в течение 30 секунд при 2500 об/мин, а «SRW для вращения» вращали на устройстве для вращения пробирок компании Thermo Scientific в течение 30 секунд при 10 об/мин. Экстракты из исследуемых проб немедленно разбавляли до 1: 4000 и исследовали, используя MCS. Исследуемые пробы разбавляли и снова исследовали через 120 минут для повторного измерения концентраций эндотоксина.
Результаты, представленные в таблице 20, свидетельствуют о минимальном влиянии перемешивания на обнаруженные количества эндотоксина в отсутствие каких-либо реагентов стеарата.
Таблица 20.
Влияние перемешивания на ЛПС в отсутствие каких-либо реагентов
<b>Контрольные пробы для оценки влияния обработки</b>
<b>Время (минуты)</b>
<b>Проба</b>
<b>Обнаруженный эндотоксин (ЕЭ)</b>
<b>Процент (%) удаления</b>
SRW на исходном уровне
1502
0
Контрольная проба, обработанная ультразвуком
1236
17,7%
120
Контрольная проба, обработанная ультразвуком
1296
13,7%
0
Контрольная проба, подвергнутая встряхиванию
1384
10,3%
120
Контрольная проба, подвергнутая встряхиванию
1252
16,6%
0
Контрольная проба, перемешанная вращением
1304
13,2%
120
Контрольная проба, перемешанная вращением
1252
16,6%
ПРИМЕР 13. Исследование на животных
Исследование на животных проводили на 30 самках крыс массой в диапазоне 250-300 г, подвергнутых акклиматизации в течение 5 дней. Всем крысам выполняли внутрибрюшинные инъекции, используя иглы 18 калибра. Крыс разбивали на 6 групп. В качестве отрицательного контроля (NC-1) брали 5 крыс, которым вводили 5 мл физиологического солевого раствора. В качестве отрицательного контроля (NC-2) брали 5 крыс, которым вводили 0,2 г стеарата кальция в 5 мл физиологического солевого раствора. В качестве положительного контроля (PC-1) брали 5 крыс, которым вводили 2,5 миллиона ЕЭ в 5 мл солевого раствора. В качестве второго положительного контроля (PC-2) брали 5 крыс, которым вводили 5 миллионов ЕЭ в 5 мл физиологического солевого раствора. Создавали две экспериментальные опытные группы. Крысам опытной группы (T-1), состоящей из 5 крыс, вводили смесь 2,5 миллиона ЕЭ и 0,2 г стеарата кальция в 5 мл физиологического солевого раствора. Крысам второй опытной группы (T-2), состоящей из 5 крыс, вводили смесь 5 миллиона ЕЭ и 0,2 г стеарата кальция в 5 мл физиологического солевого раствора.
За всеми животными наблюдали в течение 4 дней, за исключением животных из положительной контрольной группы, которые достигли соответствия критериям гуманности через 4 часа и впоследствии были исключены из исследования. Результаты, представленные в таблице 21, показывают отсутствие токсичности или нежелательных эффектов в пробах от животных из опытной группы стеарата кальция (Т-1 и Т-2), тогда как наблюдалась 100% тяжелая токсичность в положительных контрольных пробах от животных, которым вводили только эндотоксин. Это свидетельствует об эффективности стеарата кальция в качестве нейтрализующего эндотоксин агента. Отрицательные контрольные пробы также не оказывали токсического воздействия.
Таблица 21.
Результаты исследования на животных с введением CaSt
Название группы лечения
Число животных
Условие лечения (выполняется в виде отдельных доз)
Целевая доза активного компонента
Результаты
Отрицательный контроль 1 (NC-1)
5
5,0 мл физиологического солевого раствора
-
Токсичность отсутствует
Отрицательный контроль 2 (NC-2)
5
Стеарат кальция в физиологическом солевом растворе, доведенный до 5,0 мл, встряхивание 30 секунд перед введением
0,2 г стеарата кальция
Токсичность отсутствует
Положительный контроль 1 (PC-1)
5
Эндотоксин в однократном разведении, доведенный до 5,0 мл физиологическим солевым раствором, встряхивание 30 секунд перед введением
2 500 000 ЕЭ, внутрибрюшинное введение
Наблюдалась тяжелая токсичность (достигнута конечная точка гуманности)
Положительный контроль 2 (PC-2)
5
Эндотоксин в двукратном разведении, доведенный до 5,0 мл физиологическим солевым раствором, встряхивание 30 секунд перед введением
5 000 000 ЕЭ, внутрибрюшинное введение
Наблюдалась тяжелая токсичность (достигнута конечная точка гуманности)
Исследование 1 (T-1)
5
Эндотоксин в однократном разведении+стеарат кальция, доведенные до 5,0 мл физиологическим солевым раствором, встряхивание 30 секунд перед введением
2 500 000 ЕЭ+0,2 г стеарата кальция+физиологический солевой раствор, внутрибрюшинное введение
Токсичность отсутствует
Исследование 2 (T-2)
5
Эндотоксин в двукратном разведении+стеарат кальция, доведенные до 5,0 мл физиологическим солевым раствором, встряхивание 30 секунд перед введением
5 000 000 ЕЭ+0,2 г стеарата кальция+физиологический солевой раствор, внутрибрюшинное введение
Токсичность отсутствует