Способ оценки динамики неоадъювантной системной терапии рака молочной железы с гиперэкспрессией Her2/neu
METHOD FOR EVALUATING NEOADJUVANT SYSTEMIC THERAPY OF BREAST CANCER WITH HER2/NEU OVEREXPRESSION

Изобретение относится к области медицины, а именно к онкологии и может быть использовано для оценки динамики неоадъювантной системной терапии у больных раком молочной железы с гиперэкспрессией Her2/neu.
В настоящее время одной из наиболее изучаемых молекулярных мишеней по-прежнему остается рецептор эпидермального роста Her2/neu, гиперэкспрессия которого наиболее часто определяется на поверхности опухолевых клеток при раке молочной железы (15–20%) и характеризуется неблагоприятным прогнозом относительно безрецидивной и общей выживаемости [Slamon D.J., Clark G.M., Wong S.G. et.al. Human breast cancer: correlation of relapse a survival with amplification of the Her-2/neu oncogenes // Science. 1987. Vol. 235. P. 177–182]. Важным для пациентов с гиперэкспрессией Her2 является необходимость проведения системного лечения, чаще всего используемого в неоадъювантном режиме.
Основными методами лучевой диагностики для наблюдения за динамикой системной терапии у пациентов с раком молочной железы являются рентгеновская маммография и ультразвуковое исследование. Однако информативность указанных методов диагностики в известной степени ограничена. Так, например, чувствительность маммографии значительно ограничена у пациентов, имеющих рентгенологически плотную ткань молочной железы, наличие в анамнезе хирургических вмешательств, у носителей мутаций генов BRCA1/2 [Yaghjyan L et al. 2013]. Главным недостатком ультразвукового метода исследования является субъективный фактор, проявляющийся зависимостью от оператора и характеристик используемого УЗ-аппарата [E.A. Eisenhauera et al. 2009, NCCN 2017].
1/2
99m
В последние годы все большую популярность получают таргетные радионуклидные методы диагностики злокачественных заболеваний, использующие новые молекулярные структуры, получившие название «альтернативных каркасных белков» и отвечающие всем требованиям для оптимальной доставки радионуклида к опухолевым клеткам [Lindbo S., Garousi J., Mitran B. et.al. Radionuclide Tumor Targeting Using ADAPT Scaffold Proteins: Aspects of Label Positioning and Residualizing Properties of the Label // J. Nucl. Med. 2018. Vol. 59. № 1. P. 93-99]. Одним из представителей адресных молекул неиммуноглобулиновой природы является DARPin (Design Ankyrin Repeat Protein), к преимуществам которого относятся небольшой размер (14–20 кДа) [Plückthun A. Designed ankyrin repeat proteins (DARPins): binding proteins for research, diagnostics, and therapy // Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2015. Vol. 55. P. 489-511], стабильная структура, высокая специфичность и аффинность к антигену, а также значительно более низкая стоимость производства, обусловленная их экспрессией в бактериальных средах [Kramer L, Renko M, Završnik J, Turk D, Seeger MA, Vasiljeva O et.al Non-invasive in vivo imaging of tumour-associated cathepsin B by a highly selective inhibitory DARPin. Theranostics. 2017; 8: 2806-2821]. Наиболее часто используемым радионуклидом для проведения диагностических исследований как на территории Российской Федерации, так и в мире, остается короткоживущий (Т=6,02 ч) технеций-99м (Тс).
A61B6/03
A61K51/00
A61K103/10
A61P43/00
Известен способ диагностики рака молочной железы с гиперэкспрессией Her2/neu с использованием меченных технецием-99м DARPin9_29 [RU 2702294 С1, МПК  (2006.01),  (2006.01),  (2006.01),  (2006.01), опубл. 07.10.2019]. Однако отсутствуют сведения в отношении возможности указанного радиофармацевтического препарата (РФП) для оценки динамики неоадъювантной химиотерапии (НАХТ) у больных раком молочной железы с гиперэкспрессией Her2/neu.
Новый технический результат – разработка способа оценки динамики неоадъювантной системной терапии рака молочной железы с гиперэкспрессией Her2/neu, обладающего высокой  точностью, специфичностью, информативностью.
99m
4-
Для достижения нового технического результата в способе оценки динамики неоадъювантной системной терапии рака молочной железы с гиперэкспрессией Her2/neu, включающем диагностику до начала и на этапах проведения неоадъювантной химиотерапии (НАХТ), проводят радионуклидную диагностику с внутривенным введением радиофармацевтического препарата с последующим проведением однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ) до начала НАХТ и  после 2, 4 и 6 курсов, при этом пациентам вводят радиофармацевтический препарат на  основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPin9_29, который изготавливают непосредственно перед введением, для чего в асептических условиях 1 мл элюата TcO 7 ГБк с помощью шприца добавляют в набор для приготовления трикарбонильного технеция и инкубируют при температуре 100°C в  течение 30 минут, после инкубации 1000 мкл трикарбонила технеция добавляют к  334  мкл DARPin9_29 при концентрации раствора основного вещества 3,6 мг/л и  инкубируют при температуре 40°C в течение 60 минут, выполняют очистку полученного соединения от белковых примесей и не связавшихся с технецием молекул DARPin9_29 с использованием очистительных колонок, полученный после очищения препарат в дозе 500 МБк разбавляют в 10 мл физиологического раствора и через стерилизующий фильтр медленно вводят пациенту.  Через 4 часа после введения препарата пациенту выполняют однофотонную эмиссионную компьютерную томографию на двухдетекторной гамма-камере и оценивают первичную опухоль, а также соотношение опухоль/фон, уменьшение показателей которого на этапах диагностики свидетельствует о положительной динамике лечения.
На фиг. 1–3 показаны результаты однофотонной эмиссионной компьютерной томографии с РФП на основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPin9_29 согласно предлагаемому способу на этапах оценки эффекта проводимого лечения.
Способ осуществляют следующим образом.
99m
+
99m
4-
3
2
3
Радиофармацевтический препарат готовят непосредственно перед введением: в асептических условиях в набор «CRS Isolink» (Center for Radiopharmaceutical Science, Paul Scherrer Institute, Villigen, Швейцария) для приготовления трикарбонила технеция [Tc(CO)(HO)] добавляют с помощью шприца 1 мл (7 ГБк) элюата TcO и  инкубируют в течение 30 минут при температуре 100°C. После инкубации 1 мл трикарбонила технеция добавляют к 334 мкл (1200 мкг) DARPin9_29 при концентрации раствора основного вещества 3,6 мг/л и инкубируют при температуре 40°C в течение 60  минут (согласно лабораторному регламентуполучения РФП ЛР-02069303-0217 от 03.02.2017 г.). В дальнейшем выполняют очистку полученного соединения от белковых примесей и не связавшихся с технецием молекул DARPin9_29 с использованием очистительных колонок NAP-5 (GE Healthcare, Швеция). Радиохимические выход и  чистоту определяют с помощью тонкослойной радиохроматографии (ТСРХ). Анализ хроматограмм проводят с использованием хроматографа Hitachi Chromaster HPLC systems с радиоактивным детектором. Полученный после очищения препарат разбавляют в 10 мл физраствора и через стерилизующий фильтр медленно вводят пациенту в дозе 500 МБк. Через 4 часа после введения препарата пациенту выполняют однофотонную эмиссионную компьютерную томографию на двухдетекторной гамма-камере и оценивают полученные результаты. Исследование проводят до начала системного лечения, а также после 2, 4 и 6 курсов неоадъювантной системной терапии, причем оценивают первичную опухоль, а  также соотношение опухоль/фон, уменьшение показателей которого на этапах диагностики свидетельствует о положительной динамике лечения.
4
0-3
0-1
3
2
3
99m
+
99m
4-
Способ основан на анализе результатов экспериментальных и клинических исследований. Для подтверждения эффективности выявления злокачественных опухолей молочных желез с гиперэкспрессией Her2/neu и оценки динамики неоадъювантного системного лечения было проведено изучение особенностей накопления радиофармацевтического препарата на основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPin9_29. С этой целью была сформирована группа из 5 больных с  верифицированным диагнозом рака молочной железы TNM с гиперэкспрессией Her2/neu. Всем пациентам внутривенно вводили радиофармацевтический препарат на  основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPin9_29 в  дозе 500 МБк до начала лечения, после 2, 4 и 6 курсов неоадъювантного лечения. Радиофармацевтический препарат готовили непосредственно перед введением согласно разработанному авторами лабораторному регламенту: для приготовления набор «CRS  Isolink» (Center for Radiopharmaceutical Science, Paul Scherrer Institute, Villigen, Швейцария) для приготовления трикарбонила технеция [Tc(CO)(HO)] добавляли 1 мл (7 ГБк) элюата TcO и инкубировали в течение 30 минут при температуре 100°C. После инкубации 1 мл трикарбонила технеция добавляли к 1200 мкг (334 мкл) DARPin9_29 (концентрация раствора основного вещества 3,6 мг/л) и инкубировали при температуре 40°C в течение 60 минут (лабораторный регламентполучения РФП ЛР-02069303-0217 от 03.02.2017 г.). В дальнейшем выполняли очистку полученного соединения от белковых примесей и не связавшихся с технецием молекул DARPin9_29 с  использованием очистительных колонок NAP-5 (GE Healthcare, Швеция). Радиохимические выход и чистоту определяли с помощью тонкослойной радиохроматографии (ТСРХ). Анализ хроматограмм проводили с использованием хроматографа Hitachi Chromaster HPLC systems с радиоактивным детектором. Полученный после очищения препарат в дозе 500 МБк разбавляют в 10 мл физраствора и  через стерилизующий фильтр медленно вводили пациенту. Через 4 часа после введения препарата пациенту выполняли однофотонную эмиссионную компьютерную томографию на двухдетекторной гамма-камере E.CAM фирмы SIEMENS в стандартном режиме. Производили запись 64 проекций в матрицу 64х64 пикселя с применением низкоэнергетических коллиматоров с энергией 140 КэВ. Окно дифференциального дискриминатора настроено на 20%, аппаратное увеличение не использовали. Полученные при исследовании изображения (сцинтиграммы) подвергали постпроцессинговой обработке с использованием фирменного пакета программ E.Soft (SIEMENS, Германия).
На всех этапах производилось изучение основного опухолевого узла и расчет индекса «опухоль/фон», отражающий соотношение накопления препарата в опухолевой ткани и в здоровой ткани молочной железы. Результаты исследования проводимого до начала лечения, после 2, 4 и 6 курсов неоадъювантного лечения продемонстрировали, что во всех случаях наблюдения отмечалось снижение данного показателя, что было сопоставимо с результатами контрольных методов исследования (УЗИ МЖ и маммографии).
Клинический пример
Пациентка В., 45 лет: Ds.: Рак правой молочной железы IIA стадия (T2N0M0)
Гистологическое и иммуногистохимическое исследование: Инвазивная карцинома неспецифического типа 2 степени злокачественности. РЭ-, РП-, Her2/neu +. После этапа диагностики пациентке были назначены курсы неоадъювантной системной терапии. На этапах оценки эффекта проводимого лечения (после 2, 4 и 6 курсов) больной помимо стандартного обследования выполняли однофотонную эмиссионную компьютерную томографию с РФП на основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPin9_29 согласно предлагаемому способу (фиг. 1, 2, 3). По результатам исследования было выявлено последовательное снижение интенсивности накопления препарата в проекции опухоли, а также уменьшение индекса опухоль/фон (15.1<8.3<4.6), что соответствовало результатам УЗИ МЖ и маммографии и свидетельствовало о положительной динамике проводимого лечения.
99m
Фиг. 1 – ОФЭКТ с «Tc-DARPin9_29» у пациентки с диагнозом рак правой молочной железы, IIA стадия (T2N0M0) после 2 курса НАХТ визуализируется метаболическая гиперфиксация препарата в проекции опухоли в центральных отделах.
99m
Фиг. 2 – ОФЭКТ с «Tc-DARPin9_29» у пациентки с диагнозом рак правой молочной железы, IIA стадия (T2N0M0) после 4 курса НАХТ визуализируется метаболическая гиперфиксация препарата в проекции опухоли в центральных отделах (уменьшение интенсивности накопления и соотношения опухоль/фон по сравнению с предыдущим исследованием, что сопоставимо с результатами УЗИ молочной железы и маммографии).
99m
Фиг. 3 – ОФЭКТ с «Tc-DARPin9_29» у пациентки с диагнозом рак правой молочной железы, IIA стадия (T2N0M0) после 6 курса НАХТ визуализируется метаболическая гиперфиксация препарата в проекции опухоли в центральных отделах (уменьшение интенсивности накопления и соотношения опухоль/фон по сравнению с предыдущим исследованием, что сопоставимо с результатами УЗИ молочной железы и маммографии).
Таким образом, предлагаемый способ оценки диагностики неоадьювантной системной терапии у больных раком молочной железы с гиперэкспрессией Her2/neu с применением радиофармацевтического препарата на основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPin9_29 позволяет отчетливо визуализировать злокачественные опухоли молочных желез на метаболическом уровне и оценивать динамику опухолевого процесса на всех этапах системного лечения данной категории пациентов, что позволяет повысить точность, специфичность и доступность радионуклидной оценки динамики опухолевого процесса на фоне неоадъювантной системной терапии у больных раком молочной железы с гиперэкспрессией Her2/neu.