СПОСОБ УСКОРЕННОЙ ОЦЕНКИ УСТОЙЧИВОСТИ СОРТОВ ГОРОХА К Bruchus pisorum L.
METHOD OF ACCELERATED STABILITY ASSESSMENT OF PEA VARIETIES TO Bruchus pisorum L

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к ускоренной диагностике устойчивости гороха к Bruchus pisorum L. (гороховой зерновке).
Известен способ ускоренной оценки устойчивости сортов гороха к Bruchus pisorum L., заключающийся в оценке устойчивости гороха путем сравнения относительной величины одревеснения пергаментного слоя генеративного органа (створки боба) гороха в средней фазе десятого этапа органогенеза со шкалой повреждения семян (патент №2279210 С2, РФ, МПК А01Н 1/04). - [1]
Недостатком известного способа является то, что он требует навыков работы в области микроскопии у экспериментатора, а подготовка объектов исследования к анализу и собственно сам анализ характеризуются значительными трудозатратами (в указанной диссертации семенную кожуру зерна, перед тем как измельчить скальпелем, предварительно обесцвечивают петролейным эфиром или ацетоном).
Задачей изобретения является упрощение процесса оценки устойчивости гороха к Bruchus pisorum L., снижение трудозатрат и финансовых средств на проведение диагностики.
Поставленная задача решается благодаря тому, что в известном способе анализируют генеративные органы гороха в средней фазе десятого этапа органогенеза, согласно изобретению в качестве генеративных органов используют семенную кожуру зерна, в которой определяют сумму фенольных соединений и при их содержании в семенной кожуре зерна менее 724 мг% диагностируют восприимчивость гороха к Bruchus pisorum L., а при содержании фенольных соединений в количестве свыше 1165 мг% диагностируют устойчивость гороха к данному вредителю, при этом, если содержание суммы фенольных соединений в семенной кожуре зерна гороха варьирует в пределах от 724 мг% до 1165 мг%, то принадлежность исследуемого сорта к той или иной группе поврежденности определяют путем сравнения содержания суммы фенольных соединений в семенной кожуре зерна гороха с процентом поврежденности семян Bruchus pisorum L.: до 10% - устойчивые сорта, свыше 10% - восприимчивые сорта.
Эффективность способа проверена на растениях гороха.
Испытания проводили на 14 сортообразцах гороха, которые разбили на 2 группы по поврежденности семян: устойчивые - Pisum abissinicum, Tigra, M-93-94, Denica, Зарянка, 94-61, Atlas, 98-501 (процент поврежденности в пределах от 0% до 10%) и восприимчивые - Аксайский 129, Демон, Флагман 5, Спрут, Komet, Газырен (процент поврежденности в пределах от 10% до 100%).
Иммунологическая характеристика указанных сортов гороха соответствует показателям степени повреждения семян гороховой зерновкой в условиях полевого инвазионного фона (Энтомологическая оценка селекционного материала зерновых и зернобобовых культур. Харьков. 1980. Методические рекомендации по оценке устойчивости бобовых культур к вредителям, Л., 1984).
Таблица 1
Иммунологическая характеристика сортов гороха
Сортообразец
Повреждаемость семян, %
Иммунологическая характеристика
Аксайский 129
19,4
В
Демон
20,1
В
Флагман 5
22,1
В
Спрут
21,6
В
Komet
15,3
В
Газырен
19,1
В
Pisum abissinicum
0,3
У
Tigra
1,7
У
M-93-94
0,2
У
Denica
1,9
У
Зарянка
0,9
У
94-61
2,9
У
Atlas
4,3
У
98-501
1,4
У
Примечание: В - восприимчивый, У - устойчивый.
В годы аномальных климатических условий полной комплексной оценки устойчивости гороха к Bruchus pisorum L. провести невозможно, т.к. нередко наблюдается не сопряженность развития растений гороха и экологического цикла брухуса, и, как правило, это в итоге влияет на степень повреждения зерна гороха вредителем; также наблюдаются спады урожайности культуры. Испытания проводили в годы нормальных природно-климатических условий, так как в это время появляется возможность дать более полную оценку устойчивости селекционного материала гороха к вредителю, поскольку при сравнительной оценке сортов необходимо обязательно учитывать степень повреждения и численность насекомых, которые дополняются показателями урожайности.
Для осуществления способа используют семенную кожуру зерна гороха с третьего-четвертого ярусов растения в средней фазе десятого этапа органогенеза, когда наиболее продвинутые в развитии семена плода достигнут удлинения по отношению к семенам начала этапа. Семенную кожуру зерна измельчают скальпелем, взвешивают навеску 500 мг, растирают ее в ступке до состояния мелкой кашицы, заливают 6 мл горячего 70%-ного этанола и переносят в бюкс. Первый этап экстракции проводят в качалке в течение 1 часа.
Затем через складчатый фильтр отделяют надосадочный раствор, а к оставшемуся в бюксе материалу приливают 3 мл горячего 70%-ного этанола и вновь ставят на качалку. Второй этап экстракции продолжается 30 минут.
Раствор после экстракции отфильтровывают, объединяют с раствором после первого этапа экстракции и используют для определения содержания фенольных соединений.
В различных вариантах полученных экстрактов проводили определение суммы растворимых фенольных соединений по методу Фолина-Дениса.
Для этого берут мерную пробирку и наливают в нее 0,25 мл этанольного экстракта, добавляют 3 мл дистиллированной воды, перемешивают и прибавляют к полученному раствору 0, 25 мл реактива Фолина-Дениса. Вновь перемешивают и ровно через 3 минуты приливают 0,5 мл насыщенного раствора соды. Затем объем раствора доводят до 5 мл, добавляя 1 мл дистиллированной воды.
Приготовленный раствор вновь перемешивают и оставляют на 1 час, после чего раствор отфильтровывают и определяют оптическую плотность надосадочной жидкости при длине волны 725 нм на спектрофотометре Specol. В качестве контроля используют раствор, где экстракт заменяют 0,25 мл 70%-ного этанола (Запрометов М.Н. Фенольные соединения и их роль в жизни растения. 56-е Тимирязевское чтение. М.: Наука, 1996, - 45 с.). - [2]
В таблице 2 приведены данные по содержанию суммы фенольных соединений в семенной кожуре зерна разных сортов гороха в средней фазе десятого этапа органогенеза. При анализе данных таблицы 2 была выявлена следующая связь: незначительное содержание суммы фенольных соединений (502-724 мг%) в семенной кожуре зерна присуще восприимчивым к Bruchus pisorum L. сортам гороха, а высокие показатели содержания суммы фенольных соединений в семенной кожуре зерна (1165-2819 мг%) характерны для устойчивых сортов гороха к данному вредителю.
Таблица 2
Содержание суммы фенольных соединений (мг%) различных по устойчивости к гороховой зерновке сортов гороха
Сортообразец
Иммунологическая характеристика (% повреждения семян)
Сумма фенольных соединений в семенной кожуре зерна, мг%
Аксайский 129
В (19,4)
724
Демон
В (20,1)
502
Флагман 5
В (22,1)
632
Спрут
В (21,6)
723
Komet
В (15,3)
644
Газырен
В (19,1)
560
Pisum abissinicum
У (0,3)
1594
Tigra
У (1,7)
1261
М-93-94
У (0,2)
1278
Denica
У (1,9)
2819
Зарянка
У (0,9)
1813
94-61
У (2,9)
1893
Atlas
У (4,3)
1443
98-501
У (1,4)
1165
Исходя из представленных данных, можно сделать вывод о том, что устойчивость-восприимчивость растений гороха к гороховой зерновке можно диагностировать, проводя анализ содержания суммы фенольных соединений в семенной кожуре зерна в средней фазе десятого этапа органогенеза, т.е. можно установить коэффициент корреляции по всем сортообразцам (r=-0,62), который показывает, что чем больше сумма фенольных соединений в семенной кожуре зерна гороха, тем ниже повреждаемость семян. Высокий абсолютный показатель коэффициента корреляции (сила связи) дает возможность судить об устойчивости растений гороха к брухусу через анализ содержания суммы фенольных соединений в семенной кожуре зерна гороха на определенном этапе развития.
Таким образом, при значении содержания суммы фенольных соединений в семенной кожуре зерна менее 724 мг%, диагностируют восприимчивость данного сорта к Bruchus pisorum L., а при увеличении содержания фенолов свыше 1165 мг% диагностируют устойчивость данного сорта к этому вредителю, при этом, если содержание суммы фенольных соединений в семенной кожуре зерна гороха варьирует в пределах от 724 мг% до 1165 мг%, то принадлежность исследуемого сорта к той или иной группе поврежденности определяют путем сравнения содержание суммы фенольных соединений в семенной кожуре зерна гороха с процентом поврежденности семян: до 10% - устойчивые сорта, свыше 10% - восприимчивые сорта.
Использование предлагаемого способа позволяет:
- упростить выполнение диагностики, так как известный способ требует навыков работы в области микроскопии у экспериментатора, а именно в изготовлении микроскопических препаратов: минимально тонких с ровной поверхностью поперечных срезов створки боба;
- значительно увеличить чувствительность и точность диагностики, так как в известном способе нередко встречаются проблемы идентификации границы лигнина в пергаментном слое створки боба гороха;
- анализировать большое количество образцов за один раз;
- использовать фиксированный анализируемый материал (семенную кожуру зерна гороха), на который затрачено меньше времени, средств и опасных для здоровья химических веществ, благодаря тому, что фиксирование происходит проще, а именно: материал заливают 96%-ным горячим этанолом в соотношении 1:5 и плотно укупоривают, и этот материал в течение нескольких лет не претерпевает изменений;
- приступать к анализу не непосредственно после сборки материала (можно собранный материал поместить в холодильник или в морозильник и приступить к диагностике в любое удобное время), как этого требует известный способ, где любое промедление вызывает деформацию тканей, делает их хрупкими, что, в свою очередь, не позволяет для анализа приготовить качественный микроскопический препарат, то есть в известном способе экспериментатор должен работать предельно быстро.
Учитывая изложенное, можно сделать вывод о том, что предлагаемый способ найдет широкое применение в сельском хозяйстве при ускоренной оценке устойчивости сортов гороха к Bruchus pisorum L.