СРЕДСТВА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИИ ВИРУСА ГЕПАТИТА В (HBV) И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
AGENTS FOR TREATMENT OF HEPATITIS B VIRUS (HBV) INFECTION AND THEIR APPLICATION

Сведения о связанной заявке
Настоящая заявка заявляет приоритет предварительной заявки США № 62/332245, поданной 5 мая 2016 года, полное содержание которой включено в данное описание ссылкой.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к средствам РНК-интерференции (RNAi) для лечения инфекции, вызванной вирусом гепатита В (HBV), к композициям, содержащих эти средства, и их применению для лечения индивидуумов, инфицированных HBV.
Уровень техники
Гепатит В, вызванный HBV, представляет собой серьезное и распространенное инфекционное заболевание печени, поражающее миллионы людей во всем мире. HBV представляет собой гепатотропный ДНК-вирус, принадлежащий к семейству Hepadnaviridae. Полная длина генома вируса составляет приблизительно 3,2 т.п.о., и он имеет четыре открытых рамок считывания (ORF), включая поверхностный антиген ("ген S"), коровый антиген ("ген C"), ДНК-полимеразу ("ген P") и ген с неопределенной функцией под названием "ген X". В настоящее время более 2 миллиардов людей во всем мире были инфицированы HBV когда-либо в течение жизни, и из них приблизительно 350-400 миллионов остаются хронически инфицированными и становятся носителями вируса. Инфекция HBV может вызывать гепатит B острого и хронического типа и может, в конечном итоге, привести к развитию хронической недостаточности печени, цирроза и гепатоцеллюлярной карциномы. Кроме того, носители HBV могут передавать заболевание в течение многих лет. Люди с хронической инфекцией HBV, т.е. "носители", имеют по меньшей мере в 12 раз больший риск развития гепатоцеллюлярной карциномы чем у лиц, не являющимися носителями, и HBV является причиной развития первичных злокачественных опухолей печени в 60-80% случаев во всем мире. Как следствие, HBV является известным канцерогеном для человека, вторым по опасности после табака. Несмотря на то, что вакцины против HBV являются доступными, уровень инфицирования HBV в популяции остается высоким. Кроме того, современные способы лечения хронической инфекции HBV оказывают только ограниченные ингибирующие эффекты на экспрессию и репликацию вирусных генов у большинства хронически инфицированных пациентов. Другим ограничением существующих способов лечения хронической инфекции HBV является развитие резистентности вируса к лекарственным средствам.
По этим причинам остается потребность в новых терапевтических средствах для лечения инфекции HBV.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение частично основано на факте, что существующие вакцины и терапевтические средства для лечения и/или профилактики инфекции HBV ограничены по своей эффективности, например, когда необходимо длительное лечение, например, из-за развития резистентности вируса к терапии и/или изменению чувствительности к терапии между генотипами HBV. Настоящее изобретение относится к конструктам для направленной на ДНК РНК-интерференции (ddRNAi), экспрессирующим одну или несколько короткоцепочечных шпилечных РНК (shmiR), целенаправленно воздействующих на консервативные области транскриптов РНК, продуцируемых геном HBV, т.е. областей, консервативных для различных генотипов HBV. Примеры shmiR по изобретению включают эффекторные последовательности, способные ингибировать или снижать экспрессию транскриптов гена HBV в клетках HepG2.2.15, несущих активный HBV. Примеры shmiR по изобретению включают эффекторные последовательности, способные ингибировать или снижать экспрессию транскриптов гена HBV, уменьшать уровни внутриклеточной и внеклеточной ДНК HBV, и снижать восстановление ковалентно-замкнутой кольцевой ДНК HBV (cccDNA) у химерной мыши PXB, инфицированной HBV. Таким образом, авторы настоящего изобретения получили новые соединения, которые ингибируют или снижают экспрессию нуклеиновой кислоты и/или белка, экспрессируемого HBV, и предложили области применения таких соединений, например, для лечения инфекции HBV у субъектов.
Соответственно, настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, содержащей последовательность ДНК, которая кодирует короткоцепочечную шпилечную микро-РНК (shmiR), где указанная shmiR содержит:
эффекторную последовательность, длиной по меньшей мере из 17 нуклеотидов;
комплементарную последовательность эффектора;
последовательность структуры типа "стебель-петля"; и
каркас первичной микро-РНК (pri-miRNA);
где эффекторная последовательность по существу комплементарна транскрипту РНК, представленному в любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-10, 38, 40, 42, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131 и 133. Предпочтительно, когда эффекторная последовательность будет иметь длину из менее чем 30 нуклеотидов. Например, подходящая эффекторная последовательность может иметь длину в диапазоне 17-29 нуклеотидов. Предпочтительно, когда длина эффекторной последовательности составляет 20 нуклеотидов. Более предпочтительно, когда эффекторная последовательность будет иметь длину из 21 нуклеотида, а комплементарная последовательность эффектора будет иметь длину из 20 нуклеотидов.
Эффекторная последовательность может содержать 6 ошибок спаривания оснований по отношению к последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 1-10, 38, 40, 42, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131 и 133, где эффекторная последовательность является по существу комплементарной. В другом примере эффекторная последовательность содержит 5 ошибок спаривания оснований по отношению к последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 1-10, 38, 40, 42, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131 и 133, где эффекторная последовательность является по существу комплементарной. В другом примере эффекторная последовательность содержит 4 ошибки спаривания оснований по отношению к последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 1-10, 38, 40, 42, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131 и 133, где эффекторная последовательность является по существу комплементарной. В другом примере эффекторная последовательность содержит 3 ошибки спаривания оснований по отношению к последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 1-10, 38, 40, 42, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131 и 133, где эффекторная последовательность является по существу комплементарной. В другом примере эффекторная последовательность содержит 2 ошибки спаривания оснований по отношению к последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 1-10, 38, 40, 42, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131 и 133, где эффекторная последовательность является по существу комплементарной. В другом примере эффекторная последовательность содержит 1 ошибку спаривания оснований по отношению к последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 1-10, 38, 40, 42, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131 и 133, где эффекторная последовательность является по существу комплементарной. В еще одном примере эффекторная последовательность на 100% комплементарна области с эквивалентной длиной в последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 1-10, 38, 40, 42, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131 и 131. Когда присутствуют ошибки спаривания, то предпочтительно, чтобы они не располагались в пределах области, соответствующей области, из которой происходит shmiR, т.е. области, соответствующей нуклеотидам 2-8 в эффекторной последовательности.
В одном примере, нуклеиновая кислота по изобретению может содержать последовательность ДНК, кодирующую shmiR, выбранную из группы, состоящей из:
shmiR, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:12 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:12; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shmiR, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO: 14 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:14; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shmiR, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:16 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:16; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shmiR, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:18 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:18; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shmiR, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:20 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:20; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shmiR, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:22 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:22; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shmiR, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:24 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:24; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shmiR, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:26 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:26; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shmiR, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:28 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:28; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shmiR, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:30 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:30; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shmiR, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:32 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:32; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shmiR, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:34 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:34; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shmiR, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:36 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:36; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shmiR, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:38 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:38; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shmiR, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:40 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:40; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shmiR, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:42 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:42; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shmiR, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:111 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:111; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shmiR, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:113 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:113; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shmiR, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:115 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:115; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shmiR, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:117 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:117; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shmiR, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:119 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:119; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shmiR, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:121 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:121; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shmiR, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:123 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:123; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shmiR, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:125 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:125; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shmiR, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:127 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:127; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shmiR, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:129 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:129; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shmiR, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:131 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:131; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности; и
shmiR, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:133 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:133; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности.
В другом примере, нуклеиновая кислота по изобретению может содержать последовательность ДНК, кодирующую shmiR, выбранную из группы, состоящей из:
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:11 комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:11, и способна образовывать с ней дуплекс;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:13 комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:13, и способна образовывать с ней дуплекс;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:15 комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:15, и способна образовывать с ней дуплекс;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:17 комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:17, и способна образовывать с ней дуплекс;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:19 комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:19, и способна образовывать с ней дуплекс;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:21 комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:21, и способна образовывать с ней дуплекс;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:23 комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:23, и способна образовывать с ней дуплекс;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:25 комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:25, и способна образовывать с ней дуплекс;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:27 комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:27, и способна образовывать с ней дуплекс;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:29 комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:29, и способна образовывать с ней дуплекс;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:31 комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:31, и способна образовывать с ней дуплекс;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:33 комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:33, и способна образовывать с ней дуплекс;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:35 комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:35, и способна образовывать с ней дуплекс;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:37 комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:37, и способна образовывать с ней дуплекс;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:39 комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:39, и способна образовывать с ней дуплекс;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:41 комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:41, и способна образовывать с ней дуплекс;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:110 комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:110, и способна образовывать с ней дуплекс;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:112 комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:112, и способна образовывать с ней дуплекс;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:114 комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:114, и способна образовывать с ней дуплекс;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:116 комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:116, и способна образовывать с ней дуплекс;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:118 комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:118, и способна образовывать с ней дуплекс;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:120 комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:120, и способна образовывать с ней дуплекс;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:122 комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:122, и способна образовывать с ней дуплекс;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:124 комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:124, и способна образовывать с ней дуплекс;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:126 комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:126, и способна образовывать с ней дуплекс;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:128 комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:128, и способна образовывать с ней дуплекс;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:130 комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:130, и способна образовывать с ней дуплекс; и
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:132 комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:132, и способна образовывать с ней дуплекс.
Например, shmiR, кодируемая нуклеиновой кислотой по изобретению, может содержать комплементарную последовательность эффектора, содержащую 1, 2, 3 или 4 ошибок спаривания по отношению к соответствующей эффекторной последовательности, при условии, что последовательности когнатного эффектора и комплементарная последовательность эффектора способны образовывать дуплексную область.
В другом примере, нуклеиновая кислота по изобретению может содержать последовательность ДНК, кодирующую shmiR, выбранную из группы, состоящей из:
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:11, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:12;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:13, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:14;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:15, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:16;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:17, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:18;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:19, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO: 20;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:21, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:22;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:23, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:24;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:25, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:26;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:27, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:28;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:29, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:30;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:31, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:32;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:33, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:34;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:35, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:36;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:37, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:38;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:39, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:40; и
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:41, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:42;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:110, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:111;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:112, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:113;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:114, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:115;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:116, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:117;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:118, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:119;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:120, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:121;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:122, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:123;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:124, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:125;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:126, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:127;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:128, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:129;
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:130, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:131; и
shmiR, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:132, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:133.
shmiR, кодируемая нуклеиновой кислотой по изобретению, может содержать в направлении от 5' к 3':
5'-фланкирующую последовательность каркаса pri-miRNA;
комплементарную последовательность эффектора;
последовательность структуры типа "стебель-петля";
эффекторную последовательность; и
3'-фланкирующую последовательность каркаса pri-miRNA.
Подходящие последовательности структуры "петли" могут быть выбраны из числа известных в данной области. При этом иллюстративная последовательность "стебель-петля" представлена в SEQ ID NO:75.
Подходящие каркасы первичной микро-РНК (pri-miRNA или pri-R) для использования в структурах нуклеиновых кислот по изобретению, могут быть выбраны из числа известных в данной области. Например, каркасы pri-miRNA могут быть выбраны из каркаса pri-miR-30a, каркаса pri-miR-155, каркаса pri-miR-21 и каркаса pri-miR-136. Однако предпочтительно, когда каркас pri-miRNA представляет собой каркас pri-miR-30a. В соответствии с примером, в котором каркас pri-miRNA представляет собой каркас pri-miR-30a, 5'-фланкирующая последовательность каркаса pri-miRNA представлена в SEQ ID NO:76, и 3'-фланкирующая последовательность каркаса pri-miRNA представлена в SEQ ID NO:77.
В одном примере, нуклеиновая кислота по изобретению содержит последовательность ДНК, выбранную из последовательностей, представленных в любой из последовательностей SEQ ID NO: 59-74 и 146-157. В соответствии с этим примером, shmiR, кодируемая нуклеиновой кислотой по изобретению, может содержать последовательность, представленную в любой из последовательностей SEQ ID NO: 43-58 и 134-145.
Специалисту в данной области ясно, что нуклеиновую кислоту по изобретению можно объединить или использовать вместе с другим терапевтическим средством для лечения HBV. Соответственно, настоящее изобретение предоставляет нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую описанную здесь shmiR, в комбинации с одним или несколькими средствами для лечения HBV. В одном примере множество представленных нуклеиновых кислот содержат:
(a) по меньшей мере одну из описанных здесь нуклеиновых кислот; и
(b) по меньшей мере одну дополнительную нуклеиновую кислоту, выбранную из:
(i) нуклеиновую кислоту из числа описанных здесь; или
(ii) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую короткоцепочечную шпилечную РНК (shRNA), содержащую эффекторную последовательность длиной по меньшей мере из 17 нуклеотидов, и комплементарную эффекторную последовательность, где эффекторная последовательность по существу комплементарна последовательности РНК, представленной в любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-10, 38, 40, 42, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131 и 133;
где shmiR, кодируемая нуклеиновой кислотой, указанной в (a), и shmiR или shRNA кодируемая нуклеиновой кислотой, указанной в (b), содержат различные эффекторные последовательности.
Предпочтительно, когда эффекторная последовательность shmiR, указанная в (b)(ii), которая по существу комплементарна последовательности РНК, представленной в любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-10, 38, 40, 42, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131 и 133, будет иметь длину менее чем из 30 нуклеотидов. Например, подходящая длина эффекторной последовательности в shRNA может находиться в диапазоне из 17-29 нуклеотидов.
В соответствии с примером, в котором по меньшей мере одна из множества нуклеиновых кислот кодирует shRNA, shRNA может быть выбрана из группы, состоящей из:
shRNA, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:12 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:12; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shRNA, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:14 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:14; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shRNA, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:16 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:16; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shRNA, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:18 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:18; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shRNA, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:20 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:20; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shRNA, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:22 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:22; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shRNA, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:24 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:24; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shRNA, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:26 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:26; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shRNA, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:28 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:28; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shRNA, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:30 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:30; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shRNA, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:32 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:32; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shRNA, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:34 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:34; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shRNA, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:36 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:36; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shRNA, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:38 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:38; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shRNA, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:40 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:40; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shRNA, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:42 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:42; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shRNA, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:111 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:111; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shRNA, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:113 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:113; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shRNA, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:115 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:115; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shRNA, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:117 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:117; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shRNA, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:119 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:119; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shRNA, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:121 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:121; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shRNA, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:123 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:123; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shRNA, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:125 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:125; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shRNA, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:127 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:127; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shRNA, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:129 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:129; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности;
shRNA, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:131 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:131; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности; и
shRNA, содержащей: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:133 с исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:133; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности.
В соответствии с другим примером, в котором по меньшей мере одна из множества нуклеиновых кислот кодирует shRNA, shRNA может быть выбрана из группы, состоящей из:
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:11, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:11, и способна образовывать с ней дуплекс;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:13, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:13, и способна образовывать с ней дуплекс;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:15, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:15, и способна образовывать с ней дуплекс;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:17, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:17, и способна образовывать с ней дуплекс;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:19,и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:19, и способна образовывать с ней дуплекс;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:21, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:21, и способна образовывать с ней дуплекс;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:23, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:23, и способна образовывать с ней дуплекс;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:25, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:25, и способна образовывать с ней дуплекс;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:27, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:27, и способна образовывать с ней дуплекс;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:29, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:29, и способна образовывать с ней дуплекс;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:31, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:31, и способна образовывать с ней дуплекс;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:33, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:33, и способна образовывать с ней дуплекс;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:35, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:35, и способна образовывать с ней дуплекс;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:37, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:37, и способна образовывать с ней дуплекс;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:39, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:39, и способна образовывать с ней дуплекс;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:41, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:41, и способна образовывать с ней дуплекс;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:110, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:110, и способна образовывать с ней дуплекс;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:112, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:112, и способна образовывать с ней дуплекс;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:114, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:114, и способна образовывать с ней дуплекс;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:116, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:116, и способна образовывать с ней дуплекс;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:118, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:118, и способна образовывать с ней дуплекс;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:120, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:120, и способна образовывать с ней дуплекс;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:122, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:122, и способна образовывать с ней дуплекс;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:124, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:124, и способна образовывать с ней дуплекс;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:126, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:126, и способна образовывать с ней дуплекс;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:128, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:128, и способна образовывать с ней дуплекс;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:130, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:130, и способна образовывать с ней дуплекс; и
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:132, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:132, и способна образовывать с ней дуплекс.
Например, shRNA, кодируемая нуклеиновой кислотой из множества нуклеиновых кислот, описанных здесь, может содержать комплементарную последовательность эффектора, содержащую 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований с ошибочным спариванием по отношению к соответствующей эффекторной последовательности, при условии, что последовательности когнатного эффектора и комплементарная последовательность эффектора способны образовывать дуплексную область.
В другом примере, в котором по меньшей мере одна из множества нуклеиновых кислот кодирует shRNA, shRNA может быть выбрана из группы, состоящей из:
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:11, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:12;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:13, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:14;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:15, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:16;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:17, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:18;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:19, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO: 20;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:21, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:22;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:23, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:24;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:25, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:26;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:27, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:28;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:29, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:30;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:31, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:32;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:33, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:34;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:35, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:36;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:37, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:38;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:39, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:40;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:41, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:42;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:110, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:111;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:112, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:113;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:114, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:115;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:116, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:117;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:118, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:119;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:120, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:121;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:122, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:123;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:124, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:125;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:126, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:127;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:128, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:129;
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:130, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:131; и
shRNA, содержащей эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:132, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:133.
В соответствии с любым примером, в котором нуклеиновая кислота по изобретению кодирует shRNA, shRNA может содержать последовательность структуры "стебель-петля", расположенную между эффекторной последовательностью и комплементарной последовательности эффектора. Подходящие последовательности структуры "петли" могут быть выбраны из числа известных в данной области. Альтернативно, подходящая последовательность структуры "стебель-петля" может быть разработана de novo. В одном примере, нуклеиновая кислота из множества нуклеиновых кислот, описанных здесь, кодирующая shRNA, может содержать последовательность ДНК, кодирующую структуру "стебель-петля", расположенную между последовательностями ДНК, кодирующими эффекторную последовательность и комплементарную последовательность эффектора. Например, shRNA, кодируемая нуклеиновой кислотой по изобретению, может содержать последовательность, представленную в любой из последовательностей SEQ ID NO: 78-93. Таким образом, нуклеиновая кислота из множества нуклеиновых кислот, описанных здесь, может содержать или состоять из последовательности ДНК, представленной в любой из SEQ ID NO: 94-109.
Множество нуклеиновых кислот в соответствии с настоящим изобретением может содержать до 10 нуклеиновых кислот, каждая из которых кодирует shmiR, как описано здесь, например, две нуклеиновых кислоты, три нуклеиновых кислоты, четыре нуклеиновых кислоты, пять нуклеиновых кислот, шесть нуклеиновых кислот, семь нуклеиновых кислот, восемь нуклеиновых кислот, девять нуклеиновых кислот или десять нуклеиновых кислот. В одном примере множество нуклеиновых кислот включает две нуклеиновых кислоты по изобретению, каждая из которых кодирует shmiR, как описано здесь. В другом примере, множество нуклеиновых кислот включает три нуклеиновых кислоты по изобретению, каждая из которых кодирует shmiR, как описано здесь. В одном примере множество нуклеиновых кислот включает четыре нуклеиновых кислоты по изобретению, каждая из которых кодирует shmiR, как описано здесь. В одном примере множество нуклеиновых кислот включает пять нуклеиновых кислот по изобретению, каждая из которых кодирует shmiR, как описано здесь. В одном примере множество нуклеиновых кислот включает шесть нуклеиновых кислот по изобретению, каждая из которых кодирует shmiR, как описано здесь. В одном примере множество нуклеиновых кислот включает семь нуклеиновых кислот по изобретению, каждая из которых кодирует shmiR, как описано здесь. В одном примере множество нуклеиновых кислот включает восемь нуклеиновых кислот по изобретению, каждая из которых кодирует shmiR, как описано здесь. В одном примере множество нуклеиновых кислот включает девять нуклеиновых кислот по изобретению, каждая из которых кодирует shmiR, как описано здесь. В одном примере множество РНК включает десять нуклеиновых кислот по изобретению, каждая из которых кодирует shmiR, как описано здесь. В соответствии с любым примером, описанным здесь, одна или несколько нуклеиновых кислот из множества нуклеиновых кислот могут кодировать shRNA, как описано здесь.
В соответствии с примером, в котором предоставлено множество нуклеиновых кислот, две или более нуклеиновых кислот могут образовывать отдельные части одного полинуклеотида. В другом примере, две или более нуклеиновых кислот из множества нуклеиновых кислот образуют части различных полинуклеотидов, соответственно.
Нуклеиновая кислота или каждая нуклеиновая кислота из множества, в соответствии с настоящим изобретением, может содержать одну или несколько транскрипционных терминаторных последовательностей, или находиться в операбельной связи с одной или несколькими транскрипционными терминаторными последовательностями. Например, нуклеиновая кислота или каждая нуклеиновая кислота из множества может содержать транскрипционную терминаторную последовательность на 3'-конце последовательности, кодирующей shmiR или shRNA. Такие последовательности будут зависеть от выбора промотора, и они известны специалисту в данной области техники. Например, когда нуклеиновая кислота по изобретению находится в операбельной связи с промотором РНК pol III, транскрипционная терминаторная последовательность может включать бокс 'TTTTT' или 'TTTTTT'.
Альтернативно, или в дополнение, нуклеиновая кислота или каждая нуклеиновая кислота из множества, в соответствии с настоящим изобретением, может содержать последовательность инициатора транскрипции или находиться в операбельной связи с последовательностью инициатора транскрипции. Например, нуклеиновая кислота или каждая нуклеиновая кислота из множества может содержать последовательность инициатора транскрипции на 5'-конце последовательности, кодирующей shmiR или shRNA. Такие последовательности известны специалисту в данной области техники, и они могут включать бокс 'G'.
Альтернативно, или в дополнении, нуклеиновая кислота или каждая нуклеиновая кислота из множества, в соответствии с настоящим изобретением, может содержать один или несколько сайтов рестрикции, например, чтобы облегчить клонирование нуклеиновой кислоты (кислот) в клонирующих векторах или векторах экспрессии. Например, нуклеиновые кислоты, описанные здесь, могут включать сайт рестрикции в положении "апстрим" и/или в положении "даунстрим" последовательности, кодирующей shmiR или shRNA, по изобретению. Специалисту в данной области техники известны подходящие последовательности для распознавания рестрикционным ферментом. Однако, в качестве одного примера, нуклеиновая кислота (кислоты) по изобретению может включать сайт рестрикции BamHI (GGATCC) на 5'-конце, то есть в положении "апстрим" в последовательности, кодирующей shmiR или shRNA, и сайт рестрикции EcoRI (GAATTC) на 3'-конце, то есть, в положении "даунстрим" в последовательности, кодирующей shmiR или shRNA.
В соответствии с настоящим изобретением нуклеиновые кислоты можно также предоставить в форме конструкта для направленной на ДНК РНК-интерференции (ddRNAi) или включить их в конструкт для направленной на ДНК РНК-интерференции (ddRNAi), который способен экспрессировать одну или несколько shmiR, которая кодируется нуклеиновой кислотой (кислотами) настоящего изобретения. В этом отношении настоящее изобретение также предоставляет один или несколько конструктов ddRNAi, содержащих нуклеиновую кислоту по изобретению.
В другом примере предоставляется множество конструктов ddRNAi, каждый из которых содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, как описано здесь, где:
(a) по меньшей мере один из множества конструктов ddRNAi содержит первую нуклеиновую кислоту из множества нуклеиновых кислот, как описано здесь; и
(b) по меньшей мере один из множества конструктов ddRNAi содержит вторую нуклеиновую кислоту из множества нуклеиновых кислот, как описано здесь; и
где первая нуклеиновая кислота и вторая нуклеиновая кислота кодируют shmiR, которые отличаются друг от друга.
Множество конструктов ddRNAi, описанных здесь, может содержать до 10 конструктов ddRNAi, каждый из которых содержит одну или несколько нуклеиновых кислот, кодирующих shmiR, как описано здесь, например, такие как два конструкта ddRNAi, три конструкта ddRNAi, четыре конструкта ddRNAi, пять конструктов ddRNAi, шесть конструктов ddRNAi, семь конструктов ddRNAi, восемь конструктов ddRNAi, девять конструктов ddRNAi или десять ddRNAi конструктов по изобретению.
В еще одном примере конструкт ddRNAi по изобретению содержит множество нуклеиновых кислот, как описано здесь, и при этом конструкт ddRNAi кодирует множество shmiR, нацеленных на HBV, где каждая shmiR отличается друг от друга.
В одном примере, конструкт ddRNAi содержит по меньшей мере две нуклеиновых кислоты по изобретению, и при этом конструкт ddRNAi кодирует по меньшей мере две shmiR, нацеленных на HBV, каждая из которых отличается друг от друга.
Иллюстративный конструкт ddRNAi, содержащий по меньшей мере две нуклеиновые кислоты оп изобретению, может содержать:
(a) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48; и
(b) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:54.
В другом примере, конструкт ddRNAi по изобретению содержит по меньшей мере три нуклеиновых кислоты, описанных здесь, и при этом конструкт ddRNAi кодирует по меньшей мере три shmiR, нацеленных на HBV, каждая из которых отличается друг от друга.
Один пример конструкта ddRNAi по изобретению содержит:
(a) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48:
(b) нуклеиновую кислоту, кодирующую последовательность ДНК, которая кодирует shmiR или shRNA, как описано здесь; и
(c) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:54;
где нуклеиновая кислота, указанная в (b), кодирует shmiR или shRNA, имеющую эффекторную последовательность, которая отличается от последовательности, кодируемой shmiR, кодируемой нуклеиновой кислотой, указанной в (a) и (c).
В одном примере, конструкт ddRNAi по изобретению может содержать, предпочтительно в направлении от 5' к 3':
(a) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48:
(b) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:57; и
(c) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:54.
Например, конструкт ddRNAi по изобретению может содержать, предпочтительно в направлении от 5' к 3':
(a) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:64:
(b) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:73; и
(c) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:70.
В одном примере, конструкт ddRNAi по изобретению может содержать, предпочтительно в направлении от 5' к 3':
(a) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48:
(b) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:49; и
(c) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:54.
Например, конструкт ddRNAi по изобретению может содержать, предпочтительно в направлении от 5' к 3':
(a) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:64:
(b) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:65; и
(c) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:70.
В соответствии с другим примером, конструкт ddRNAi по изобретению кодирует три shmiR, при этом конструкт ddRNAi содержит:
(a) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48:
(b) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:137; и
(c) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:141. В одном примере, (a) - (c) представлены в направлении от 5' к 3'конструкта ddRNAi.
Например, конструкт ddRNAi по изобретению может содержать, предпочтительно в направлении от 5' к 3':
(a) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:64:
(b) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:149; и
(c) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:153.
В еще одном примере, конструкт ddRNAi по изобретению может содержать по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, как описано здесь, и по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую shRNA, нацеленную на HBV, как описано здесь, где shmiR и shRNA, кодируемые конструктом ddRNAi, содержат различные эффекторные последовательности. В сответствии с этим примером, конструкт ddRNAi по изобретению может содержать, предпочтительно в направлении от 5' к 3':
(a) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48;
(b) нуклеиновую кислоту, кодирующую shRNA, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 39, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO: 40; и
(c) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:54.
Например, конструкт ddRNAi по изобретению может содержать, предпочтительно в направлении от 5' к 3':
(a) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48:
(b) нуклеиновую кислоту, кодирующую shRNA, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 92; и
(c) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:54.
Например, конструкт ddRNAi по изобретению может содержать, предпочтительно в направлении от 5' к 3':
(a) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:64:
(b) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:108; и
(c) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:70.
В одном примере, конструкт ddRNAi, описанный здесь, содержит единственный промотор, который операбельно связан с нуклеиновой кислотой или с каждой нуклеиновой кислотой, кодирующих shmiR или shRNA по изобретению.
В другом примере, каждая нуклеиновая кислота, кодирующая shmiR или shRNA по изобретению, операбельно связана с отдельным промотором.
Например, промотор или промоторы расположены в положении "апстрим" по отношению к соответствующим нуклеиновой кислоте или кислотам, кодирующим shmiR или shRNA. В конструкте ddRNAi, содержащим несколько промоторов, эти промоторы могут быть одинаковыми или разными. Иллюстративными промоторами являются промоторы RNA pol III, например, такие как промоторы U6 и H1. Иллюстративными промоторами U6 являются промоторы U6-1, U6-8 и U6-9.
В одном примере, конструкт ddRNAi по изобретению содержит в направлении от 5' к 3':
(a) промотор U6-9 в положении "апстрим" к нуклеиновой кислоте, содержащей или состоящей из последовательности, представленной в SEQ ID NO:64:
(b) промотор U6-1 в положении "апстрим" к нуклеиновой кислоте, содержащей или состоящей из последовательности, представленной в SEQ ID NO:73; и
(c) промотор U6-8 в положении "апстрим" к нуклеиновой кислоте, содержащей или состоящей из последовательности, представленной в SEQ ID NO:70.
В другом примере, конструкт ddRNAi по изобретению содержит в направлении от 5' к 3':
(a) промотор U6-9 в положении "апстрим" к нуклеиновой кислоте, содержащей или состоящей из последовательности, представленной в SEQ ID NO:64:
(b) промотор U6-1 в положении "апстрим" к нуклеиновой кислоте, содержащей или состоящей из последовательности, представленной в SEQ ID NO:65; и
(c) промотор U6-8 в положении "апстрим" к нуклеиновой кислоте, содержащей или состоящей из последовательности, представленной в SEQ ID NO:70.
В другом примере, конструкт ddRNAi по изобретению содержит в направлении от 5' к 3':
(a) промотор U6-9 в положении "апстрим" к нуклеиновой кислоте, содержащей или состоящей из последовательности, представленной в SEQ ID NO:64:
(b) промотор U6-1 в положении "апстрим" к нуклеиновой кислоте, содержащей или состоящей из последовательности, представленной в SEQ ID NO:149; и
(c) промотор U6-8 в положении "апстрим" к нуклеиновой кислоте, содержащей или состоящей из последовательности, представленной в SEQ ID NO:153.
Настоящее изобретение также предоставляет вектор экспрессии, содержащий конструкт ddRNAi по изобретению.
Настоящее изобретение также предоставляет множество векторов экспрессии, каждый из которых содержит конструкт ddRNAi по изобретению. Например, одно или несколько множеств векторов экспрессии содержит множество конструктов ddRNAi, как описано здесь. В другом примере, каждое множество векторов экспрессии содержит множество конструктов ddRNAi, как описано здесь. В дополнительном примере, каждое множество векторов экспрессии содержит единственный конструкт ddRNAi, как описано здесь. В любом случае, как следует из этого абзаца, множество векторов экспрессии могут все вместе экспрессировать множество shmiR в соответствии с настоящим изобретением.
В одном примере, вектор экспрессии или каждый из них представляет собой плазмиду или микрокольцо.
В одном примере, плазмида, микрокольцо, вектор экспрессии или конструкт ddRNAi комплексно связан с катионным полимером, связывающим ДНК.
В другом примере, вектор экспрессии или каждый из векторов является вирусным вектором. Например, вирусный вектор может быть выбран из группы, состоящей из аденоассоциированного вирусного вектора (AAV), ретровирусного вектора, аденовирусного вектора (AdV) и лентивирусного вектора (LV).
Настоящее изобретение также предоставляет композицию, содержащую конструкт ddRNAi и/или множество конструктов ddRNAi и/или вектор экспрессии и/или множество векторов экспрессии, как описано здесь. В одном примере, композиция может также содержать один или несколько фармацевтически приемлемых носителей или разбавителей. В одном примере, композиция может дополнительно содержать другое терапевтическое средство, известное как средство для лечения инфекции HBV, т.е. как дополнительное терапевтическое средство. Например, другое терапевтическое средство, известное как средство для лечения инфекции HBV, может быть выбрано из энтекавира, тенофовира, ламивудина, адефовира и/или пэгилированного интерферона.
Настоящее изобретение также предоставляет способ лечения инфекции HBV у субъекта, где способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества нуклеиновой кислоты, множества нуклеиновых кислот, конструкта ddRNAi, множества конструктов ddRNAi, вектора экспрессии, множества векторов экспрессии и/или композиции, описанной здесь.
Настоящее изобретение также предоставляет способ снижения вирусной нагрузки HBV у пациента, инфицированного вирусом HBV, где способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества нуклеиновой кислоты, множества нуклеиновых кислот, конструкта ddRNAi, множества конструктов ddRNAi, вектора экспрессии, множества векторов экспрессии и/или композиции, описанных здесь.
Настоящее изобретение также предоставляет способ снижения тяжести одного или нескольких симптомов, связанных с инфекцией HBV у субъекта, страдающего от инфекции HBV, где способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества нуклеиновой кислоты, множества нуклеиновых кислот, конструкта ddRNAi, множества конструктов ddRNAi, вектора экспрессии, множества векторов экспрессии и/или композиции, описанных здесь.
Настоящее изобретение также предоставляет способ снижения инфекционности HBV у субъекта, инфицированного HBV, где способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества нуклеиновой кислоты, множества нуклеиновых кислот, конструкта ddRNAi, множества конструктов ddRNAi, вектора экспрессии, множества векторов экспрессии и/или композиции, описанных здесь.
Настоящее изобретение также предоставляет способ снижения у субъекта, страдающего от инфекции HBV, риска развития хронической печеночной недостаточности, цирроза и/или гепатоцеллюлярной карциномы, где способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества нуклеиновой кислоты, множества нуклеиновых кислот, конструкта ddRNAi, множества конструктов ddRNAi, вектора экспрессии, множества векторов экспрессии и/или композиции, описанных здесь.
В соответствии с любым из способов, описанных здесь, в качестве одного примера, субъект страдает от острой инфекции HBV. Альтернативно, в качестве другого примера, субъект страдает от хронической инфекции HBV.
В одном примере, способы, описанные здесь, включают ингибирование или снижение экспрессии одного или нескольких транскриптов, кодируемых геномом HBV, у субъекта.
В одном примере, субъект, которому вводят нуклеиновую кислоту, множество нуклеиновых кислот, конструкт ddRNAi, множество конструктов ddRNAi, вектор экспрессии, множество векторов экспрессии и/или композицию, которые описаны здесь, получил курс лечения другим терапевтическим средством для лечения инфекции HBV. Например, субъект и/или вирус HBV может быть невосприимчивым или устойчивым к лечению другими средствами, известными как средства для лечения инфекции HBV.
В другом примере, нуклеиновую кислоту, множество нуклеиновых кислот, конструкт ddRNAi, множество конструктов ddRNAi, вектор экспрессии, множество векторов экспрессии и/или композицию по изобретению вводят в комбинации с другим терапевтическим средством, известным как средство лечения инфекции HBV, т.е. как дополнительное терапевтическое средство. Например, другое терапевтическое средство, известное как средство для лечения инфекции HBV, может быть выбрано из энтекавира, тенофовира, ламивудина, адефовира и/или пэгилированного интерферона. Другое терапевтическое средство, известное как средство для лечения инфекции HBV, и нуклеиновая кислота, множество нуклеиновых кислот, конструкт ddRNAi, множество конструктов ddRNAi, вектор экспрессии, множество векторов экспрессии и/или композиция по изобретению могут вводиться по отдельности или вместе. В сответствии с одним из примеров, где введение осуществляют по отдельности, другое терапевтическое средство, известное как средство для лечения инфекции HBV, может вводиться одновременно с введением нуклеиновой кислоты, множества нуклеиновых кислот, конструкта ddRNAi, множества конструктов ddRNAi, вектора экспрессии, множества векторов экспрессии и/или композиции по изобретению. В соответствии с другим примером, в котором введение осуществляют по отдельности, другое терапевтическое средство, известное как средство для лечения инфекции HBV, может вводиться после введения нуклеиновой кислоты, множества нуклеиновых кислот, конструкта ddRNAi, множества конструктов ddRNAi, вектора экспрессии, множества векторов экспрессии и/или композиции по изобретению.
В одном примере, композиция по изобретению представлена в наборе. Например, композиция по изобретению упакована вместе с одним или несколькими другими терапевтическими средствами, известными как средства для лечения инфекции HBV. Такие другие терапевтические средства должны быть известны специалистам в данной области техники. Например, другое терапевтическое средство, известное как средство для лечения инфекции HBV, может быть выбрано из энтекавира, тенофовира, ламивудина, адефовира и/или пэгилированного интерферона. В другом примере, композиция по изобретению упакована вместе с инструкцией по применению в соответствии со способом настоящего изобретения.
Настоящее изобретение также раскрывает применение нуклеиновой кислоты, множества нуклеиновых кислот, конструкта ddRNAi, множества конструктов ddRNAi, вектора экспрессии, множества векторов экспрессии и/или композиции описанных здесь для изготовления лекарственного средства, например, для лечения инфекции HBV у субъекта и/или для способа, описанного здесь. В одном примере, субъект страдает от острой инфекции HBV. В качестве альтернативно примера, субъект страдает от хронической инфекции HBV.
Настоящее изобретение также предоставляет нуклеиновую кислоту, множество нуклеиновых кислот, конструкт ddRNAi, множество конструктов ddRNAi, вектор экспрессии, множество векторов экспрессии и/или композицию, которые описаны здесь, для применения в терапии. Например, нуклеиновая кислота, множество нуклеиновых кислот, конструкт ddRNAi, множество конструктов ddRNAi, вектор экспрессии, множество векторов экспрессии и/или композиция могут быть применены при лечении инфекции HBV у субъекта и/или в способе, описанном здесь. Субъект может страдать от острой инфекции HBV. В качестве альтернативно примера, субъект может страдать от хронической инфекции HBV.
Лечение инфекции HBV в соответствии с любым примером, представленным здесь, может включать одно или несколько из следующего: снижение вирусной нагрузки у субъекта с инфекцией HBV, снижение тяжести симптомов, связанных с инфекцией HBV и снижение инфекционности HBV у субъекта. В одном примере, лекарственное средство снижает уровень продуктов транскрипции гена HBV у субъекта, которому вводят это лекарственное средство.
Краткое описание фигур
Фигура 1
(A)
(B)-(D)
иллюстрирует ингибирующую активность shmiR, обозначенных как shmiR-6, shmiR-15 и shmiR-12, по отношению к их эквивалентным shRNA (shRNA-6, shRNA-15 и shRNA-12, соответственно) в анализах с люциферазным репортером:  иллюстрирует ингибирующую активность по предпочтению смысловых и антисмысловых цепей для shmiR, обозначенных как shmiR-6, shmiR-15 и shmiR-12, по отношению к их эквивалентным shRNA (shRNA-6, shRNA-15 и shRNA-12, соответственно) в анализе с люциферазным репортером; иллюстрируют и сравнивают способности shmiR-6, shmiR-15 и shmiR-12, соответственно, ингибировать экспрессию белка люциферазы в системе анализа с люциферазным репортером, зависимым от дозы образом, по отношению к их эквивалентным shRNA (shRNA-6, shRNA-15 и shRNA-12, соответственно) в эквивалентных дозах.
Фигура 2
(A)
(B)
иллюстрирует ингибирующую активность по предпочтению смысловых и антисмысловых цепей для вариантов shmiR-12 и shmiR-15 по отношению к соответствующей исходной shmiR (shmiR-12 и shmiR-15, соответственно) в анализе с люциферазным репортером:  показывает, что все шесть вариантов shmiR-12 имеют лучшее предпочтение цепей по отношению к родительскому shmiR; и  показывает, что четыре из шести вариантов shmiR-15, имеют лучшее предпочтение цепей по отношению к родительскому shmiR.
Фигура 3
(A)
(B)
иллюстрирует уровень экспрессии молекул эффектора RNAi, где экспрессия выражена как число копий на клетку, в клетках HepG2.2.15, трансдуцированных ddRNAi: показывает относительные уровни экспрессии эффекторных последовательностей для (i) shmiR-12, экспрессируемой как единственный конструкт, (ii) shRNA-12, экспрессируемой как единственный конструкт, и (iii) shRNA-12, экспрессируемой как часть HBV-shRNAx3-v1, в дни 3, 4, 5 и 6 после трансдукции; и показывает относительные уровни экспрессии эффекторных последовательностей для (i) shmiR-15, экспрессируемой как единственный конструкт, (ii) shRNA-15, экспрессируемой как единственный конструкт, и (iii) shRNA-15, экспрессируемой как часть HBV-shRNAx3-v1, в дни 3, 4, 5 и 6 после трансдукции.
Фигура 4
(A)
(B)
иллюстрирует уровень ингибирования транскриптов РНК HBV в областях, соответствующих антигенам HBV HBsAg, HBcAg и HbxAg, по отношению к уровням мРНК GAPDH, в клетках HepG2.2.15, трасдуцированных векторами AdV HBV (MOI=100), экспрессирующих  shmiR-12 или соответствующей shRNA как часть единичного или тройного конструкта, или  shmiR-15 или соответствующей shRNA как часть единичного или тройного конструкта, в дни 3-6 после трансдукции.
Фигура 5
предоставляет структуры конструктов ssAAV8-HBV-shRNAx3-v1, scAAV8-HBV-shRNAx3-v1 и ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1.
Фигура 6
in vivo
предоставляет схему операций для исследования эффективности в условиях , выполненное с использованием химерной модели на мышах PhoenixBio (PXB), с использованием ssAAV8-HBV-shRNAx3-v1, scAAV8-HBV-shRNAx3-v1 и ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1.
Фигура 7
иллюстрирует, что сывороточные уровни ДНК HBV были снижены у мышей, обработанных однократной дозой scAAV8-HBV-shRNAx3-v1 или ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1 в виде монотерапии или в комбинации с энтекавиром, тогда как вирусные титры у животных контроля, обработанных физиологическим солевым раствором, оставались практически постоянными в течение 91-дневного исследования.
Фигура 8
иллюстрирует, что сывороточные уровни антигена HBsAg были снижены у мышей, обработанных однократной дозой scAAV8-HBV-shRNAx3-v1 или ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1 в виде монотерапии или в комбинации с энтекавиром, тогда как сывороточные уровни антигена HBsAg у животных контроля, обработанных физиологическим солевым раствором, оставались практически постоянными в течение 91-дневного исследования.
Фигура 9
иллюстрирует, что сывороточные уровни антигена HBeAg были снижены у мышей, обработанных однократной дозой scAAV8-HBV-shRNAx3-v1 или ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1 в виде монотерапии или в комбинации с энтекавиром, тогда как животные, обработанные энтекавиром, показали только небольшое снижение уровня сывороточного антигена HBeAg (т.е. 0,37 log) и уровни антигена HBeAg у животных контроля, обработанных физиологическим солевым раствором, оставались практически постоянными в течение 91-дневного исследования.
Фигура 10
иллюстрирует, что сывороточные уровни ДНК HBV значительно снижены у мышей, обработанных однократной дозой scAAV8-HBV-shRNAx3-v1 или ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1 в виде монотерапии или в комбинации с пэгилированным интерфероном (где пэгилированный интерферон вводится два раза в день), тогда как сывороточные уровни ДНК HBV у животных контроля, обработанных физиологическим солевым раствором, оставались практически постоянными в течение 91-дневного исследования.
Фигура 11
(A)-(C)
иллюстрирует, что уровни РНК HBV снижены у мышей, обработанных пэгилированным интерфероном в виде монотерапии, или однократной дозой ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1 в виде монотерапии, или в комбинации с энтекавиром или пэгилированным интерфероном, тогда как при введении одного энтекавира уровни РНК HBV только незначительно снижены.  показывают уровни РНК HBV для транскрипта, соответствующего shmiR-6, shmiR-15 и shmiR-12, соответственно.
Фигура 12
иллюстрирует, что внутриклеточные уровни ДНК HBV и cccDNA в печени снижены у мышей, обработанных однократной дозой ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1 в виде монотерапии или в комбинации с энтекавиром или пэгилированным интерфероном.
Фигура 13
иллюстрирует уровень экспрессии молекул эффектора RNAi, где экспрессия выражена как число копий на клетку, в ткани печени полученной из мышей, обработанных ssAAV8-HBV-shRNAx3-v1, scAAV8-HBV-shRNAx3-v1 или ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1 в виде монотерапии или в комбинации с энтекавиром или пэгилированным интерфероном.
Фигура 14
иллюстрирует преимущественные виды эффекторной последовательности shRNA-6/shmiR-6 и их количества, получаемых из ssAAV8-HBV-shRNAx3-v1, scAAV8-HBV-shRNAx3-v1 и ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1, в ткани печени мышей PXB, определенные методом секвенирования следующего поколения (NGS).
Фигура 15
иллюстрирует преимущественные виды эффекторной последовательности shRNA-15/shmiR-15 и их количества, получаемых из ssAAV8-HBV-shRNAx3-v1, scAAV8-HBV-shRNAx3-v1 и ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1, в ткани печени мышей PXB, определенные методом секвенирования следующего поколения (NGS).
Фигура 16
иллюстрирует преимущественные виды эффекторной последовательности shRNA-12/shmiR-12 и их количества, получаемых из ssAAV8-HBV-shRNAx3-v1, scAAV8-HBV-shRNAx3-v1 и ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1, в ткани печени мышей PXB, определенные методом секвенирования следующего поколения (NGS).
Пояснения к списку последовательностей
SEQ ID NO: 1: Транскрипт РНК для целевой области 1 генома HBV.
SEQ ID NO: 2: Транскрипт РНК для целевой области 2 генома HBV.
SEQ ID NO: 3: Транскрипт РНК для целевой области 3 генома HBV.
SEQ ID NO: 4: Транскрипт РНК для целевой области 4 генома HBV.
SEQ ID NO: 5: Транскрипт РНК для целевой области 5 генома HBV.
SEQ ID NO: 6: Транскрипт РНК для целевой области 6 генома HBV.
SEQ ID NO: 7: Транскрипт РНК для целевой области 7 генома HBV.
SEQ ID NO: 8: Транскрипт РНК для целевой области 8 генома HBV.
SEQ ID NO: 9: Транскрипт РНК для целевой области 9 генома HBV.
SEQ ID NO: 10: Транскрипт РНК для целевой области 10 генома HBV.
SEQ ID NO: 11: Эффекторная последовательность РНК для shmiR-1.
SEQ ID NO: 12: Комплементарная последовательность эффектора РНК для shmiR-1.
SEQ ID NO: 13: Эффекторная последовательность РНК для shmiR-2.
SEQ ID NO: 14: Комплементарная последовательность эффектора РНК для shmiR-2.
SEQ ID NO: 15: Эффекторная последовательность РНК для shmiR-3.
SEQ ID NO: 16: Комплементарная последовательность эффектора РНК для shmiR-3.
SEQ ID NO: 17: Эффекторная последовательность РНК для shmiR-4.
SEQ ID NO: 18: Комплементарная последовательность эффектора РНК для shmiR-4.
SEQ ID NO: 19: Эффекторная последовательность РНК для shmiR-5.
SEQ ID NO: 20: Комплементарная последовательность эффектора РНК для shmiR-5.
SEQ ID NO: 21: Эффекторная последовательность РНК для shmiR-6.
SEQ ID NO: 22: Комплементарная последовательность эффектора РНК для shmiR-6.
SEQ ID NO: 23: Эффекторная последовательность РНК для shmiR-7.
SEQ ID NO: 24: Комплементарная последовательность эффектора РНК для shmiR-7.
SEQ ID NO: 25: Эффекторная последовательность РНК для shmiR-8.
SEQ ID NO: 26: Комплементарная последовательность эффектора РНК для shmiR-8.
SEQ ID NO: 27: Эффекторная последовательность РНК для shmiR-9.
SEQ ID NO: 28: Комплементарная последовательность эффектора РНК для shmiR-9.
SEQ ID NO: 29: Эффекторная последовательность РНК для shmiR-10.
SEQ ID NO: 30: Комплементарная последовательность эффектора РНК для shmiR-10.
SEQ ID NO: 31: Эффекторная последовательность РНК для shmiR-11.
SEQ ID NO: 32: Комплементарная последовательность эффектора РНК для shmiR-11.
SEQ ID NO: 33: Эффекторная последовательность РНК для shmiR-12
SEQ ID NO: 34: Комплементарная последовательность эффектора РНК для shmiR-12.
SEQ ID NO: 35: Эффекторная последовательность РНК для shmiR-13.
SEQ ID NO: 36: Комплементарная последовательность эффектора РНК для shmiR-13.
SEQ ID NO: 37: Эффекторная последовательность РНК для shmiR-14.
SEQ ID NO: 38: Комплементарная последовательность эффектора РНК для shmiR-14.
SEQ ID NO: 39: Эффекторная последовательность РНК для shmiR-15.
SEQ ID NO: 40: Комплементарная последовательность эффектора РНК для shmiR-15.
SEQ ID NO: 41: Эффекторная последовательность РНК для shmiR-16.
SEQ ID NO: 42: Комплементарная последовательность эффектора РНК для shmiR-16.
SEQ ID NO: 43: Последовательность РНК для shmiR-1.
SEQ ID NO: 44: Последовательность РНК для shmiR-2.
SEQ ID NO: 45: Последовательность РНК для shmiR-3.
SEQ ID NO: 46: Последовательность РНК для shmiR-4.
SEQ ID NO: 47: Последовательность РНК для shmiR-5.
SEQ ID NO: 48: Последовательность РНК для shmiR-6.
SEQ ID NO: 49: Последовательность РНК для shmiR-7.
SEQ ID NO: 50: Последовательность РНК для shmiR-8.
SEQ ID NO: 51: Последовательность РНК для shmiR-9.
SEQ ID NO: 52: Последовательность РНК для shmiR-10.
SEQ ID NO: 53: Последовательность РНК для shmiR-11.
SEQ ID NO: 54: Последовательность РНК для shmiR-12.
SEQ ID NO: 55: Последовательность РНК для shmiR-13.
SEQ ID NO: 56: Последовательность РНК для shmiR-14.
SEQ ID NO: 57: Последовательность РНК для shmiR-15.
SEQ ID NO: 58: Последовательность РНК для shmiR-16.
SEQ ID NO: 59: Кодирующая последовательность РНК для shmiR-1.
SEQ ID NO: 60: Кодирующая последовательность РНК для shmiR-2.
SEQ ID NO: 61: Кодирующая последовательность РНК для shmiR-3.
SEQ ID NO: 62: Кодирующая последовательность РНК для shmiR-4.
SEQ ID NO: 63: Кодирующая последовательность РНК для shmiR-5.
SEQ ID NO: 64: Кодирующая последовательность РНК для shmiR-6.
SEQ ID NO: 65: Кодирующая последовательность РНК для shmiR-7.
SEQ ID NO: 66: Кодирующая последовательность РНК для shmiR-8.
SEQ ID NO: 67: Кодирующая последовательность РНК для shmiR-9.
SEQ ID NO: 68: Кодирующая последовательность РНК для shmiR-10.
SEQ ID NO: 69: Кодирующая последовательность РНК для shmiR-11.
SEQ ID NO: 70: Кодирующая последовательность РНК для shmiR-12.
SEQ ID NO: 71: Кодирующая последовательность РНК для shmiR-13.
SEQ ID NO: 72: Кодирующая последовательность РНК для shmiR-14.
SEQ ID NO: 73: Кодирующая последовательность РНК для shmiR-15.
SEQ ID NO: 74: Кодирующая последовательность РНК для shmiR-16.
SEQ ID NO: 75: Последовательность РНК области "стебель-петля" для shmiR.
SEQ ID NO: 76: 5'-фланкирующая последовательность главной цепи pri-miR-30a.
SEQ ID NO: 77: 3'- фланкирующая последовательность главной цепи pri-miR-30a.
SEQ ID NO: 78: Последовательность РНК для shRNA, обозначенная как shRNA-1.
SEQ ID NO: 79: Последовательность РНК для shRNA, обозначенная как shRNA-2.
SEQ ID NO: 80: Последовательность РНК для shRNA, обозначенная как shRNA-3.
SEQ ID NO: 81: Последовательность РНК для shRNA, обозначенная как shRNA-4.
SEQ ID NO: 82: Последовательность РНК для shRNA, обозначенная как shRNA-5.
SEQ ID NO: 83: Последовательность РНК для shRNA, обозначенная как shRNA-6.
SEQ ID NO: 84: Последовательность РНК для shRNA, обозначенная как shRNA-7.
SEQ ID NO: 85: Последовательность РНК для shRNA, обозначенная как shRNA-8.
SEQ ID NO: 86: Последовательность РНК для shRNA, обозначенная как shRNA-9.
SEQ ID NO: 87: Последовательность РНК для shRNA, обозначенная как shRNA-10.
SEQ ID NO: 88: Последовательность РНК для shRNA, обозначенная как shRNA-11.
SEQ ID NO: 89: Последовательность РНК для shRNA, обозначенная как shRNA-12.
SEQ ID NO: 90: Последовательность РНК для shRNA, обозначенная как shRNA-13.
SEQ ID NO: 91: Последовательность РНК для shRNA, обозначенная как shRNA-14.
SEQ ID NO: 92: Последовательность РНК для shRNA, обозначенная как shRNA-15.
SEQ ID NO: 93: Последовательность РНК для shRNA, обозначенная как shRNA-16.
SEQ ID NO: 94: Кодирующая последовательность ДНК для shRNA, обозначенная как shRNA-1.
SEQ ID NO: 95: Кодирующая последовательность ДНК для shRNA, обозначенная как shRNA-2.
SEQ ID NO: 96: Кодирующая последовательность ДНК для shRNA, обозначенная как shRNA-3.
SEQ ID NO: 97: Кодирующая последовательность ДНК для shRNA, обозначенная как shRNA-4.
SEQ ID NO: 98: Кодирующая последовательность ДНК для shRNA, обозначенная как shRNA-5.
SEQ ID NO: 99: Кодирующая последовательность ДНК для shRNA, обозначенная как shRNA-6.
SEQ ID NO: 100: Кодирующая последовательность ДНК для shRNA, обозначенная как shRNA-7.
SEQ ID NO: 101: Кодирующая последовательность ДНК для shRNA, обозначенная как shRNA-8.
SEQ ID NO: 102: Кодирующая последовательность ДНК для shRNA, обозначенная как shRNA-9.
SEQ ID NO: 103: Кодирующая последовательность ДНК для shRNA, обозначенная как shRNA-10.
SEQ ID NO: 104: Кодирующая последовательность ДНК для shRNA, обозначенная как shRNA-11.
SEQ ID NO: 105: Кодирующая последовательность ДНК для shRNA, обозначенная как shRNA-12.
SEQ ID NO: 106: Кодирующая последовательность ДНК для shRNA, обозначенная как shRNA-13.
SEQ ID NO: 107: Кодирующая последовательность ДНК для shRNA, обозначенная как shRNA-14.
SEQ ID NO: 108: Кодирующая последовательность ДНК для shRNA, обозначенная как shRNA-15.
SEQ ID NO: 109: Кодирующая последовательность ДНК для shRNA, обозначенная как shRNA-16.
SEQ ID NO: 110: Эффекторная последовательность РНК для shmiR-17.
SEQ ID NO: 111: Комплементарная последовательность эффектора РНК для shmiR-17.
SEQ ID NO: 112: Эффекторная последовательность РНК для shmiR-18.
SEQ ID NO: 113: Комплементарная последовательность эффектора РНК для shmiR-18.
SEQ ID NO: 114: Эффекторная последовательность РНК для shmiR-19.
SEQ ID NO: 115: Комплементарная последовательность эффектора РНК для shmiR-19.
SEQ ID NO: 116: Эффекторная последовательность РНК для shmiR-20.
SEQ ID NO: 117: Комплементарная последовательность эффектора РНК для shmiR-20.
SEQ ID NO: 118: Эффекторная последовательность РНК для shmiR-21.
SEQ ID NO: 119: Комплементарная последовательность эффектора РНК для shmiR-21.
SEQ ID NO: 120: Эффекторная последовательность РНК для shmiR-22.
SEQ ID NO: 121: Комплементарная последовательность эффектора РНК для shmiR-22.
SEQ ID NO: 122: Эффекторная последовательность РНК для shmiR-23.
SEQ ID NO: 123: Комплементарная последовательность эффектора РНК для shmiR-23.
SEQ ID NO: 124: Эффекторная последовательность РНК для shmiR-24.
SEQ ID NO: 125: Комплементарная последовательность эффектора РНК для shmiR-24.
SEQ ID NO: 126: Эффекторная последовательность РНК для shmiR-25.
SEQ ID NO: 127: Комплементарная последовательность эффектора РНК для shmiR-25.
SEQ ID NO: 128: Эффекторная последовательность РНК для shmiR-26.
SEQ ID NO: 129: Комплементарная последовательность эффектора РНК для shmiR-26.
SEQ ID NO: 130: Эффекторная последовательность РНК для shmiR-27.
SEQ ID NO: 131: Комплементарная последовательность эффектора РНК для shmiR-27.
SEQ ID NO: 132: Эффекторная последовательность РНК для shmiR-28.
SEQ ID NO: 133: Комплементарная последовательность эффектора РНК для shmiR-28.
SEQ ID NO: 134: Последовательность РНК для shmiR-17.
SEQ ID NO: 135: Последовательность РНК для shmiR-18.
SEQ ID NO: 136: Последовательность РНК для shmiR-19.
SEQ ID NO: 137: Последовательность РНК для shmiR-20.
SEQ ID NO: 138: Последовательность РНК для shmiR-21.
SEQ ID NO: 139: Последовательность РНК для shmiR-22.
SEQ ID NO: 140: Последовательность РНК для shmiR-23.
SEQ ID NO: 141: Последовательность РНК для shmiR-24.
SEQ ID NO: 142: Последовательность РНК для shmiR-25.
SEQ ID NO: 143: Последовательность РНК для shmiR-26.
SEQ ID NO: 144: Последовательность РНК для shmiR-27.
SEQ ID NO: 145: Последовательность РНК для shmiR-28.
SEQ ID NO: 146: Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-17.
SEQ ID NO: 147: Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-18.
SEQ ID NO: 148: Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-19.
SEQ ID NO: 149: Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-20.
SEQ ID NO: 150: Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-21.
SEQ ID NO: 151: Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-22.
SEQ ID NO: 152: Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-23.
SEQ ID NO: 153: Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-24.
SEQ ID NO: 154: Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-25.
SEQ ID NO: 155: Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-26.
SEQ ID NO: 156: Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-27.
SEQ ID NO: 157: Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-28.
SEQ ID NO: 158: Последовательность ДНК прямого праймера для HBV.
SEQ ID NO: 159: Последовательность ДНК обратного праймера для HBV.
SEQ ID NO: 160: Последовательность ДНК зонда Taqman для HBV.
SEQ ID NO: 161: Последовательность ДНК прямого праймера для cccDNA HBV.
SEQ ID NO: 162: Последовательность ДНК обратного праймера для cccDNA HBV.
SEQ ID NO: 163: Последовательность ДНК зонда Taqman для cccDNA HBV.
SEQ ID NO: 164: Кодирующая последовательность ДНК для shRNA-6, включая фланкирующую последовательность.
SEQ ID NO: 165: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 1 shRNA-6.
SEQ ID NO: 166: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 2 shRNA-6.
SEQ ID NO: 167: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 3 shRNA-6.
SEQ ID NO: 168: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 4 shRNA-6.
SEQ ID NO: 169: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 5 shRNA-6.
SEQ ID NO: 170: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 6 shRNA-6.
SEQ ID NO: 171: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 7 shRNA-6.
SEQ ID NO: 172: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 8 shRNA-6.
SEQ ID NO: 173: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 9 shRNA-6.
SEQ ID NO: 174: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 10 shRNA-6.
SEQ ID NO: 175: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 11 shRNA-6.
SEQ ID NO: 176: Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-6, включая фланкирующую последовательность каркаса микро-РНК.
SEQ ID NO: 177: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 1 shmiR-6.
SEQ ID NO: 178: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 2 shmiR-6.
SEQ ID NO: 179: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 3 shmiR-6.
SEQ ID NO: 180: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 4 shmiR-6.
SEQ ID NO: 181: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 5 shmiR-6.
SEQ ID NO: 182: Кодирующая последовательность ДНК для shRNA-15, включая фланкирующую последовательность.
SEQ ID NO: 183: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 1 shRNA-15.
SEQ ID NO: 184: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 2 shRNA-15.
SEQ ID NO: 185: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 3 shRNA-15.
SEQ ID NO: 186: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 4 shRNA-15.
SEQ ID NO: 187: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 5 shRNA-15.
SEQ ID NO: 188: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 6 shRNA-15.
SEQ ID NO: 189: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 7 shRNA-15.
SEQ ID NO: 190: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 8 shRNA-15.
SEQ ID NO: 191: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 9 shRNA-15.
SEQ ID NO: 192: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 10 shRNA-15.
SEQ ID NO: 193: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 11 shRNA-15.
SEQ ID NO: 194: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 12 shRNA-15.
SEQ ID NO: 195: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 13 shRNA-15.
SEQ ID NO: 196: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 14 shRNA-15.
SEQ ID NO: 197: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 15 shRNA-15.
SEQ ID NO: 198: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 16 shRNA-15.
SEQ ID NO: 199: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 17 shRNA-15.
SEQ ID NO: 200: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 18 shRNA-15.
SEQ ID NO: 201: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 19 shRNA-15.
SEQ ID NO: 202: Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-15, включая фланкирующую последовательность каркаса микро-РНК.
SEQ ID NO: 203: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 1 shmiR-15.
SEQ ID NO: 204: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 2 shmiR-15.
SEQ ID NO: 205: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 3 shmiR-15.
SEQ ID NO: 206: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 4 shmiR-15.
SEQ ID NO: 207: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 5 shmiR-15.
SEQ ID NO: 208: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 6 shmiR-15.
SEQ ID NO: 209: Кодирующая последовательность ДНК для shRNA-12, включая фланкирующую последовательность.
SEQ ID NO: 210: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 1 shRNA-12.
SEQ ID NO: 211: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 2 shRNA-12.
SEQ ID NO: 212: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 3 shRNA-12.
SEQ ID NO: 213: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 4 shRNA-12.
SEQ ID NO: 214: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 5 shRNA-12.
SEQ ID NO: 215: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 6 shRNA-12.
SEQ ID NO: 216: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 7 shRNA-12.
SEQ ID NO: 217: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 8 shRNA-12.
SEQ ID NO: 218: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 9 shRNA-12.
SEQ ID NO: 219: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 10 shRNA-12.
SEQ ID NO: 220: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 11 shRNA-12.
SEQ ID NO: 221: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 12 shRNA-12.
SEQ ID NO: 222: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 13 shRNA-12.
SEQ ID NO: 223: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 14 shRNA-12.
SEQ ID NO: 224: Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-12, включая фланкирующую последовательность каркаса микро-РНК.
SEQ ID NO: 225: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 1 shmiR-12.
SEQ ID NO: 226: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 2 shmiR-12.
SEQ ID NO: 227: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 3 shmiR-12.
SEQ ID NO: 228: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 4 shmiR-12.
SEQ ID NO: 229: Последовательность ДНК, соответствующая эффектору 5 shmiR-12.
Подробное описание
Общие указания
В данном описании, если не указано иное или контекст не требует иного, ссылки на одну стадию, признак, состав соединения, или на группу стадий, группу признаков или составов соединений, должны пониматься, как охватывающие один и множество (т.е. один или более) этих стадий, признаков, составов соединений, групп стадий, групп признаков или групп составов соединений.
Специалистам в данной области техники понятно, что настоящее изобретение является чувствительным к изменениям и модификациям, иным, чем те, которые конкретно описаны. Следует понимать, что раскрытие включает все такие вариации и модификации. Изобретение также включает все стадии, признаки, составы соединений, которые указаны или упомянуты в данном описании, по-отдельности или в совокупности, а также любые и все комбинации из любых двух или более указанных стадий или признаков.
Настоящее изобретение не должно быть ограничено объемом конкретных примеров, представленных здесь, которые предназначены только для иллюстративных целей. Функционально-эквивалентные продукты, композиция и способы находятся в пределах объема настоящего изобретения.
Любой из примеров, представленных здесь, должны пониматься с учетом возможных изменений по отношению к любому другому примеру, если специально не указано иное.
Если специально не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, должны пониматься как имеющие значение, которое обычно понимается специалистом в данной области с обычной квалификацией (например, в области клеточных культур, молекулярной генетики, иммунологии, иммуногистохимии, химии белка и биохимии).
et al.
et al
et al
Если не указано иное, методы рекомбинантных ДНК, рекомбинантных белков, культивирования клеток, а также иммунологические методы, используемые в рамках настоящего изобретении, представляют собой стандартные процедуры, хорошо известные специалистам в данной области техники. Такие методики описаны и объяснены в литературе в источниках, таких как, J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook  Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), T.A. Brown (ред.), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (ред.), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), and F.M. Ausubel . (ред.), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, включая дополнения, выпущенные позднее), Ed Harlow and David Lane (ред.) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988), и J.E. Coligan . (ред.) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (включая дополнения, выпущенные позднее).
В данном описании, если контекст не требует иного, выражение «содержит» или его вариации, такие как «включающий» или «содержащий», подразумевает включение указанной стадии, признака или конкретного числа, или группы стадий, признаков или чисел, но не исключение какой-либо другой стадии, признака или числа, или группы стадий, признаков или чисел.
Термин «и/или», например, «Х и/или Y», следует понимать как означающий «X и Y» или «X или Y», и следует понимать, что этот термин охватывает оба значения или одно из них.
Отдельные определения
"РНК" обозначает молекулу, содержащую по меньшей мере один рибонуклеотидный остаток. "Рибонуклеотид" означает нуклеотид с гидроксильной группой в положении 2' в β-D-рибо-фуранозном фрагменте. Эти термины относятся к двухцепочечной РНК, одноцепочечной РНК, выделенной РНК, такой как частично очищенной РНК, по существу чистой РНК, синтетической РНК, РНК, полученный рекомбинантным методом, а также к измененной РНК, которая отличается от встречающихся в природе РНК за счет добавления, делеции, замены и/или изменения одного или нескольких нуклеотидов. Такие изменения могут включать добавление ненуклеотидного материала, например, на конец (концы) ми-РНК (siRNA) или внутри цепи, например, на одном или нескольких нуклеотидов в РНК. Нуклеотиды в молекулах РНК настоящего изобретения могут также включать нестандартные нуклеотиды, такие как не встречающихся в природе нуклеотиды или химически синтезированные нуклеотиды или дезоксинуклеотиды. Эти измененные РНК могут быть обозначены как аналоги или как аналоги природных РНК.
Выражение "РНК-интерференция" или "RNAi" в целом относится к РНК-зависимому процессу сайленсинга генов, который запускается молекулами двухцепочечной РНК (dsRNA) в цитоплазме клетки. Молекула dsRNA снижает или ингибирует продукт транскрипции целевой последовательности нуклеиновой кислоты, обеспечивая сайленсинг гена или снижение экспрессии этого гена.
Используемый здесь термин "двухцепочечная РНК" или "dsRNA" обозначает молекулу РНК, имеющую дуплексную структуру и содержащую эффекторную последовательность и комплементарную последовательность эффектора, которые имеют схожую длину по отношению к друг к другу. Эффекторная последовательность и комплементарная последовательность эффектора могут присутствовать в одной цепи РНК или в различных цепях РНК. "Эффекторная последовательность" (также часто называемая как "направляющая цепь") является по существу комплементарной к целевой последовательности (последовательности-мишени), которая в данном случае представляет собой область продукта транскрипции РНК генома HBV. "Эффекторную последовательность" также могут называть как "антисмысловая последовательность". "Комплементарная последовательность эффектора" будет иметь достаточную степень комплементарности к эффекторной последовательности при выравнивании ее с эффекторной последовательностью, чтобы образовывать дуплекс. В этой связи комплементарная последовательность эффектора будет по существу гомологична к области целевой последовательности. Специалисту в данной области ясно, что "комплементарная последовательность эффектора" может также называться как "комплемент к эффекторной последовательности" или смысловая последовательность.
Используемый здесь термин "дуплекс" относится к областям в двух комплементарных или по существу комплементарных нуклеиновых кислотах (например, РНК), или в двух комплементарных или по существу комплементарных областях одноцепочечной нуклеиновой кислоты (например, РНК), которые образуют пары оснований друг с другом, посредством спаривания оснований по Уотсону-Крику, либо любым другим способом, который позволяет получить стабилизированный дуплекс между нуклеотидными последовательностями, которые являются комплементарными или по существу комплементарными. Специалисту понятно, что в пределах дуплексной области не требуется 100% комплементарности; допустимо наличие комплементарности "по существу". Комплементарность "по существу" подразумевает комплементарность в 69% или более. Например, одна ошибка спаривания в дуплексной области, состоящей из 19 пар оснований (т.е. 18 пар оснований и одно несоответствие спаривания), приводит к комплементарности в 94,7%, и дуплексная область является по существу комплементарной. В другом примере, две ошибки спаривания в дуплексной области, состоящей из 19 пар оснований (т.е. 17 пар оснований и два несоответствия спариваний), приводит к комплементарности в 89,5%, и дуплексная область является по существу комплементарной. В еще одном примере, три ошибки спаривания в дуплексной области, состоящей из 19 пар оснований (т.е. 16 пар оснований и три несоответствия спаривания) приводит к комплементарности в 84,2%, и дуплексная область является по существу комплементарной, и так далее.
dsPHK может быть представлена в виде структуры типа "шпилька" или типа "стебель-петля", с дуплексной областью, содержащей эффекторную последовательность и комплементарная последовательность эффектора, связанные по меньшей мере 2 нуклеотидными последовательностями, которые находятся на концах структуры "стебель-петля". Когда dsPHK представлена в виде структуры типа "шпильки " или "стебель-петля", она может быть названа как "шпилечной РНК " или "короткоцепочечной шпилечной RNAi" или "shRNA".
Другие молекулы dsPHK, представленные здесь или следующие из настоящего раскрытия, имеют структуру, включающую транскрипты первичных микро-РНК (pri-miRNA) и предшественники микро-РНК (pre-miRNA). shRNA в виде pre-miRNA могут быть получены обычным путем из pri-miRNA под действием ферментов Drosha и Pasha, которые распознают и высвобождают области транскрипта первичной микро-РНКК, которые образуют структуру типа "стебель-петля". Альтернативно, транскрипт pri-miRNA может быть сконструирован для замены природной структуры типа "стебель-петля" на искусственную/рекомбинантную структуру типа "стебель-петля". Таким образом, можно вводить искусственную/рекомбинантную структуру типа "стебель-петля" или клонировать ее в основную последовательность pri-miRNA, в которой отсутствует природная структура типа "стебель-петля". В случае последовательностей "стебель-петля", сконструированных, чтобы экспрессироваться как часть молекулы pri-miRNA, ферменты Drosha и Pasha распознают и высвобождают искусственную shRNA. Молекулы dsRNA, продуцируемые с использованием этого подхода, известны как "shimiRNA", "shmiR" или "каркас микро-РНК для shRNA".
Как используется здесь, термин "комплементарный" в отношении последовательности относится к комплементу последовательности со спариванием оснований по Уотсону-Крику, в результате чего гуанин (G) спаривается с цитозином (C), и аденин (А) спаривается с урацилом (U) или тимином (Т). Последовательность может быть комплементарна к другой последовательности по всей длине, или она может быть комплементарна к конкретной части или длине другой последовательности. Специалисту в данной области техники понятно, что U может присутствовать в РНК, и что Т может присутствовать в ДНК. Таким образом, А в последовательностях РНК или ДНК может спариваться с U в последовательности РНК или с Т в последовательности ДНК.
Как используется здесь, термин "по существу комплементарный" служит для указания достаточной степени комплементарности или точного спаривания, таким образом, что происходит стабильное и специфическое связывание между последовательностями нуклеиновых кислот, например, между эффекторной последовательностью и комплементарной последовательности эффектора или между эффекторной последовательностью и целевой последовательностью мишени. Следует понимать, что последовательности нуклеиновой кислоты нет необходимости быть на 100% комплементарной по отношению мишени или комплемента. Этот термин охватывает последовательность, комплементарную другой последовательность, за исключением области "тупых концов". В некоторых случаях эта последовательность комплементарна другой последовательности, за исключением 1-2 несоответствий, связанных с ошибочным спариванием. В некоторых случаях, последовательности являются комплементарными за исключением 1 несоответствия, связанного с ошибочным спариванием. В некоторых случаях последовательности являются комплементарными за исключением 2 ошибочных спариваний. В других случаях, последовательности являются комплементарными за исключением 3 ошибочных спариваний. В других случаях, последовательности являются комплементарными за исключением 4 ошибочных спариваний.
Термин "кодируемый", используемый в контексте shrРНК или shmiR по изобретению, следует понимать, как shRNA или shmiR, которая способна транскрибироваться с матрицы ДНК. Соответственно, нуклеиновая кислота, которая кодирует shRNA или shmiR по изобретению, будет включать последовательность ДНК, которая служит в качестве матрицы для транскрипции соответствующей shRNA или shmiR.
Термин "конструкт для направленной на ДНК РНК-интерференции" или "конструкт ddRNAi" относится к нуклеиновой кислоте, содержащей последовательность ДНК, которая после транскрипции продуцирует молекулу shRNA или shmiR, которая вызывает РНК-интерференци. (RNAi). Конструкт ddRNAi может содержать нуклеиновую кислоту, которая транскрибируется в виде одной РНК, которая способна самоотжигаться в шпилечную структуру с дуплексной областью, связанной со структурой "стебель-петля" по меньшей мере двумя нуклеотидами, т.е. shRNA или shmiR, в виде одиночной РНК с множеством shRNA или shmiR, или в виде множества транскриптов РНК, каждый из которых способен складываться как одиночная shRNA или shmiR, соответственно. Конструкт ddRNAi может находиться в экспрессирующем векторе, т.е. в виде "экспрессирующего конструкта ddRNAi", например, операбельно связанного с промотором.
Как используется здесь, термин "операбельно связанный" или "операбельная связь" (или подобный) означает, что кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты связана с или находится в ассоциации с регуляторной последовательностью, например промотором, способом, который облегчает экспрессию кодирующей последовательности. Регуляторные последовательности включают промоторы, энхансеры и другие элементы управления и контроля экспрессии, которые известны в данной области, и которые выбраны для прямой экспрессии кодирующей последовательности.
Под "вектором" следует понимать носитель для введения нуклеиновой кислоты в клетку. Векторы включают, но без ограничений, плазмиды, фагмиды, вирусы, бактерии и носители, полученные из вирусных или бактериальных источников. "Плазмида" представляет собой кольцевую двухцепочечную молекулу ДНК. Полезным типом вектора для использования в рамках настоящего изобретения является вирусный вектор, где гетерологичные последовательности ДНК встраиваются в вирусный геном, который может быть модифицирован за счет удаления одного или более вирусных генов или их частей. Некоторые векторы способны автономно реплицироваться в клетке-хозяине (например, векторы, имеющие начало репликации, которое функционирует в клетке-хозяине). Другие векторы могут быть стабильно интегрированы в геном клетки хозяина и, таким образом, они реплицируются вместе с геномом хозяина. Как используется здесь, термин "вектор экспрессии" будет пониматься как вектор, способный экспрессировать молекулу РНК в соответствии с настоящим изобретением.
Используемые здесь термины "лечение" или "лечить" и их варианты, относятся к клиническому вмешательству, предназначенному для изменения течения естественного процесса у индивидуума или в клетках, подвергающегося лечению при клинической патологии. Желательные эффекты лечения включают снижение скорости прогрессирования заболевания, облегчение или ослабление болезненного состояния и ремиссию, или улучшенный прогноз. Следует отметить, что лечение инфекции HBV включает снижение вирусной нагрузки HBV у субъекта, инфицированного HBV, снижение тяжести симптомов, связанных с инфекцией HBV, и снижение инфекционности HBV у субъекта. Считается, что "лечение" индивидуума было успешным, если, например, достигнут один или несколько из указанных выше результатов лечения.
"Терапевтически эффективное количество" представляет собой по меньшей мере минимальную концентрацию или количество, необходимое для измеримого улучшения конкретного заболевания (например, инфекции HBV). Терапевтически эффективное количество может варьировать в зависимости от таких факторов, как тяжесть заболевания, возраст, пол и вес пациента, и способности shRNA или shmiR, нуклеиновой кислоты, кодирующей их, ddRNAi или экспрессирующего конструкта вызвать желаемый ответ у индивидуума. Терапевтически эффективное количество также является количеством, при котором терапевтически полезные эффекты превосходят любые токсические или вредные эффекты shRNA или shmiR, нуклеиновых кислот, кодирующих их, ddRNAi или экспрессирующего конструкта.
Как используется здесь, термин "субъект" или "пациент" может представлять собой человека или животное, не являющееся человеком, инфицированное HBV. "Животное, не являющееся человеком" может представлять собой примата, крупный рогатый скот (например, овцы, лошади, крупный рогатый скот, свиньи, ослы), домашних животных (например, домашние животные, такие как собаки и кошки) лабораторных экспериментальных животных (например, мыши, кролики, крысы, морские свинки), животных для спорта (например, спортивные лошади, верблюды, грейхаунды) или живущие в неволе дикие животные. В одном примере субъектом или пациентом является млекопитающее. В другом примере субъектом или пациентом является примат. В еще одном примере субъектом или пациентом является человек.
Термины "сниженная экспрессия", "снижение экспрессии" или подобные, подразумевают отсутствие или наблюдаемое снижение уровня белка и/или продукта мРНК из целевого гена-мишени, например гена pol HBV или другого гена HBV. Снижение не обязательно должно быть полным, оно может представлять собой частичное снижение, достаточное для обнаруживаемого или заметного изменения результата интерференции РНК, вызванной shmiR, кодируемой нуклеиновой кислотой по изобретению. Снижение может быть измерено путем определения снижения уровня мРНК и/или белкового продукта целевой нуклеиновой кислоты относительно клетки, на которую не воздействовали shmiR или shRNA, нуклеиновая кислота, кодирующая их, конструкт ddRNAi или экспрессионный конструкт, и оно может составлять всего 1%, 5% или 10%, или может быть полным, то есть достигать 100% ингибирования. Эффекты снижения могут быть определены путем исследования внешних проявлений и свойств, таких как количественный и/или качественный фенотип клетки или организма, и может также включать оценку вирусной нагрузки после введения конструкта ddRNAi в соответствии с настоящим изобретением.
Средства для RNAi
В одном из примеров в настоящем описании предложена нуклеиновая кислота, содержащая последовательность ДНК, которая кодирует короткоцепочечную шпилечную микро-РНК (shmiR), где указанная shmiR содержит:
эффекторную последовательность длиной по меньшей мере из 17 нуклеотидов;
комплементарная последовательность эффектора;
последовательность структуры типа "стебель-петля"; и
каркас первичной микро-РНК (pri-miRNA);
где эффекторная последовательность по существу комплементарна Транскрипту РНК, представленному в любой из последовательностей SEQ ID NO:1-10, 38, 40, 42, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131 и 133. Предпочтительно, когда эффекторная последовательность будет иметь длину из менее чем 30 нуклеотидов. Например, подходящая эффекторная последовательность может иметь длину в диапазоне 17-29 нуклеотидов. Предпочтительно, когда длина эффекторной последовательности составляет 20 нуклеотидов. Более предпочтительно, когда эффекторная последовательность будет иметь длину из 21 нуклеотида, а комплементарная последовательность эффектора будет иметь длину из 20 нуклеотидов.
В одном примере shmiR содержит эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:1. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, и содержать 6 оснований с ошибочным спариванием с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:1, и содержать 5 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу, комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:1, и содержать 4 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть, по существу, комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:1, и содержать 3 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть, по существу, комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:1, и содержать 2 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть, по существу, комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:1, и содержать 1 основание ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть на 100% комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:1.
В одном примере shmiR содержит эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:2. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной транскрипту РНК, содержащему последовательность, представленную в SEQ ID NO:2, и содержать 6 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:2, и содержать 5 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:2, и содержать 4 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:2, и содержать 3 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:2, и содержать 2 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:2, и содержать 1 основание ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть на 100% комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:2.
В одном примере shmiR содержит эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:3, и эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной транскрипту РНК, содержащему последовательность, представленную в SEQ ID NO:3, и содержать 6 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:3, и содержать 5 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:3, и содержать 4 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:3, и содержать 3 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:3, и содержать 2 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:3, и содержать 1 основание ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть на 100% комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:3.
В одном примере shmiR содержит эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:4, и эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной транскрипту РНК, содержащему последовательность, представленную в SEQ ID NO:4, и содержать 6 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:4, и содержать 5 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:4, и содержать 4 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:4, и содержать 3 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:4, и содержать 2 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:4, и содержать 1 основание ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть на 100% комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:4.
В одном примере shmiR содержит эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:5, и эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной транскрипту РНК, содержащему последовательность, представленную в SEQ ID NO:5, и содержать 6 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:5, и содержать 5 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:5, и содержать 4 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:5, и содержать 3 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:5, и содержать 2 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:5, и содержать 1 основание ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть на 100% комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:5.
В одном примере shmiR содержит эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:6. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной транскрипту РНК, содержащему последовательность, представленную в SEQ ID NO:6, и содержать 6 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:6, и содержать 5 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:6, и содержать 4 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:6, и содержать 3 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:6, и содержать 2 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:6, и содержать 1 ошибочно спаренное основание относительно него. Например, эффекторная последовательность может быть на 100% комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:6.
В одном примере shmiR содержит эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:7, и эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной транскрипту РНК, содержащему последовательность, представленную в SEQ ID NO:7, и содержать 6 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:7, и содержать 5 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:7, и содержать 4 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:7, и содержать 3 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:7, и содержать 2 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:7, и содержать 1 основание ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть на 100% комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:7.
В одном примере shmiR содержит эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:8. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной транскрипту РНК, содержащему последовательность, представленную в SEQ ID NO:8, и содержать 6 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:8, и содержать 5 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:8, и содержать 4 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:8, и содержать 3 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:8, и содержать 2 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:8, и содержать 1 основание ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть на 100% комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:8.
В одном примере shmiR содержит эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:9. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной транскрипту РНК, содержащему последовательность, представленную в SEQ ID NO:9, и содержать 6 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:9, и содержать 5 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:9, и содержать 4 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:9, и содержать 3 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:9, и содержать 2 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:9, и содержать 1 ошибочно спаренное основание относительно него. Например, эффекторная последовательность может быть на 100% комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:9.
В одном примере shmiR содержит эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:10. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной транскрипту РНК, содержащему последовательность, представленную в SEQ ID NO:10, и содержать 6 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:10, и содержать 5 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:10, и содержать 4 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:10, и содержать 3 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:10, и содержать 2 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:10, и содержать 1 основание ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть на 100% комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:10.
В одном примере shmiR содержит эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:38. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной транскрипту РНК, содержащему последовательность, представленную в SEQ ID NO:38, и содержать 6 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:38, и содержать 5 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:38, и содержать 4 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:38, и содержать 3 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:38, и содержать 2 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:38 и содержит 1 ошибочно спаренное основание относительно него. Например, эффекторная последовательность может быть на 100% комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:38.
В одном примере shmiR содержит эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:40. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной транскрипту РНК, содержащему последовательность, представленную в SEQ ID NO:40, и содержать 6 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:40, и содержать 5 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:40, и содержать 4 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:40, и содержать 3 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:40, и содержать 2 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:40, и содержать 1 основание ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть на 100% комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:40.
В одном примере shmiR содержит эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:42. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной транскрипту РНК, содержащему последовательность, представленную в SEQ ID NO:42, и содержать 6 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:42, и содержать 5 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:42, и содержать 4 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:42, и содержать 3 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:42, и содержать 2 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:42, и содержать 1 основание ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть на 100% комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:42.
В одном примере shmiR содержит эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:111. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной транскрипту РНК, содержащему последовательность, представленную в SEQ ID NO:111, и содержать 6 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:111, и содержать 5 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:111, и содержать 4 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:111, и содержать 3 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:111, и содержать 2 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:111, и содержать 1 основание ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть на 100% комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:11.
В одном примере shmiR содержит эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:113. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной транскрипту РНК, содержащему последовательность, представленную в SEQ ID NO:113, и содержать 6 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:113, и содержать 5 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:113, и содержать 4 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:113, и содержать 3 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:113, и содержать 2 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:113, и содержать 1 основание ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть на 100% комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:113.
В одном примере shmiR содержит эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:115. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной транскрипту РНК, содержащему последовательность, представленную в SEQ ID NO:115, и содержать 6 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:115, и содержать 5 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:115, и содержать 4 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:115, и содержать 3 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:115, и содержать 2 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:115, и содержать 1 основание ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть на 100% комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:115.
В одном примере shmiR содержит эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:117. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной транскрипту РНК, содержащему последовательность, представленную в SEQ ID NO:117, и содержать 6 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:117, и содержать 5 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:117, и содержать 4 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:117, и содержать 3 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:117, и содержать 2 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:117, и содержать 1 основание ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть на 100% комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:117.
В одном примере shmiR содержит эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:119. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной транскрипту РНК, содержащему последовательность, представленную в SEQ ID NO:119, и содержать 6 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:119, и содержать 5 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:119, и содержать 4 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:119, и содержать 3 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:119, и содержать 2 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:119, и содержать 1 ошибочно спаренное основание относительно него. Например, эффекторная последовательность может быть на 100% комплементарна транскрипту РНК, который содержит или состоит из последовательности, представленной в SEQ ID NO:119.
В одном примере shmiR содержит эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:121. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной транскрипту РНК, содержащему последовательность, представленную в SEQ ID NO:121, и содержать 6 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:121, и содержать 5 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:121, и содержать 4 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:121, и содержать 3 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:121, и содержать 2 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:121, и содержать 1 основание ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть на 100% комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:122.
В одном примере shmiR содержит эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:123. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной транскрипту РНК, содержащему последовательность, представленную в SEQ ID NO:123, и содержать 6 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:123, и содержать 5 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:123, и содержать 4 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:123, и содержать 3 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:123, и содержать 2 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:123, и содержать 1 основание ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть на 100% комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:123.
В одном примере shmiR содержит эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:125. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной транскрипту РНК, содержащему последовательность, представленную в SEQ ID NO:125, и содержать 6 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:125, и содержать 5 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:125, и содержать 4 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:125, и содержать 3 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:125, и содержать 2 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:125, и содержать 1 основание ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть на 100% комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:125.
В одном примере shmiR содержит эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:127. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной транскрипту РНК, содержащему последовательность, представленную в SEQ ID NO:127, и содержать 6 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:127, и содержать 5 оснований несовпадений. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:127, и содержать 4 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:127, и содержать 3 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:127, и содержать 2 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:127, и содержать 1 основание ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть на 100% комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:127.
В одном примере shmiR содержит эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:129. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной транскрипту РНК, содержащему последовательность, представленную в SEQ ID NO:129, и содержать 6 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:129, и содержать 5 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:129, и содержать 4 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:129, и содержать 3 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:129, и содержать 2 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:129, и содержать 1 основание ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть на 100% комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:129.
В одном примере shmiR содержит эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:131, например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной транскрипту РНК, содержащему последовательность, представленную в SEQ ID NO:131, и содержать 6 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:131, и содержать 5 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:131, и содержать 4 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:131, и содержать 3 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:131, и содержать 2 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:131, и содержать 1 основание ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть на 100% комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:131.
В одном примере shmiR содержит эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:133. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарной транскрипту РНК, содержащему последовательность, представленную в SEQ ID NO:133, и содержать 6 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:133, и содержать 5 оснований ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:133, и содержать 4 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:133, и содержать 3 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:133, и содержать 2 основания ошибочного спаривания с ним. Например, эффекторная последовательность может быть по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:133, и содержать 1 ошибочно спаренное основание относительно него. Например, эффекторная последовательность может быть на 100% комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:133.
В соответствии с примером, в котором эффекторная последовательность shmiR по изобретению по существу комплементарна транскрипту РНК HBV, описанному здесь, и содержит 1, 2, 3, 4, 5 или 6 оснований ошибочного спаривания с ним, при этом предпочтительно, чтобы ошибочное спаривание не находилось пределах области, соответствующей области, из которой происходит shmiR, т.е. области, соответствующей нуклеотидам 2-8 в эффекторной последовательности.
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, может содержать последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности, представленной в SEQ ID NO:12, за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:12; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shmiR, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:11 и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:11, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:11, может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:12. shmiR в соответствии с этим примером далее обозначена как "shmiR-1".
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, может содержать последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:14, за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:14; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shmiR, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:13, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:13, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:13, может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:14. shmiR в соответствии с этим примером далее обозначена как "shmiR-2".
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, может содержать последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:16, за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:16; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shmiR, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:15, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:15, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:15, может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:16. shmiR в соответствии с этим примером далее обозначена как "shmiR-3".
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, может содержать последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:18, за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:18; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shmiR, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:17, и эффекторную последовательностью комплемента, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:17, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:17, может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:18. shmiR в соответствии с этим примером далее обозначена как "shmiR-4".
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, может содержать последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:20, за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:20; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shmiR, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:19, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:19, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:19, может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:20. shmiR в соответствии с этим примером далее обозначена как "shmiR-5".
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, может содержать последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:22, за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:22; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shmiR, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:21, и эффекторную последовательностью комплемента, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:21, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:21, может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:22. shmiR в соответствии с этим примером далее обозначена как "shmiR-6".
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, может содержать последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:24, за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:24; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shmiR, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:23, и эффекторную последовательностью комплемента, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:23, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:23, может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:24. shmiR в соответствии с этим примером далее обозначена как "shmiR-7".
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, может содержать последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:26, за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:26; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shmiR, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:25, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:25, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:25, может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:26. shmiR в соответствии с этим примером далее обозначена как "shmiR-8".
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, может содержать последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:28, за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:28; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shmiR, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:27 и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:27, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:27, может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:28. shmiR в соответствии с этим примером далее обозначена как "shmiR-9".
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, может содержать последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:30, за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:30; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shmiR, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:29, и эффекторную последовательностью комплемента, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:29, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:29, может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:30. shmiR в соответствии с этим примером далее обозначена как "shmiR-10".
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, может содержать последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:32, за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:32; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shmiR, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:31, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:31, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:31, может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:32. shmiR в соответствии с этим примером далее обозначена как "shmiR-11".
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, может содержать последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:34, за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:34; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shmiR, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:33, и эффекторную последовательностью комплемента, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:33, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:33, может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:34. shmiR в соответствии с этим примером далее обозначена как "shmiR-12".
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, может содержать последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:36, за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:36; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shmiR, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:35, и эффекторную последовательностью комплемента, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:35, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:35, может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:36. shmiR в соответствии с этим примером далее обозначена как "shmiR-13".
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, может содержать последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:38, за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:38; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shmiR, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:37, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:37, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:37, может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:38. shmiR в соответствии с этим примером далее обозначена как "shmiR-14".
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, может содержать последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:40, за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:40; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shmiR, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:39, и эффекторную последовательностью комплемента, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:39, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:39, может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:40. shmiR в соответствии с этим примером далее обозначена как "shmiR-15".
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, может содержать последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:42, за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:42; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shmiR, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:41, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:41, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:41, может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:42. shmiR в соответствии с этим примером далее обозначена как "shmiR-16".
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, может содержать последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:111, за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:111; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shmiR, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:112, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:112, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:112 может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:111. shmiR в соответствии с этим примером далее обозначена как "shmiR-17".
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, может содержать последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:113, за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:113; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shmiR, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:114, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:114, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:114, может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:113. shmiR в соответствии с этим примером далее обозначена как "shmiR-18".
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, может содержать последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:115, за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:115; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shmiR, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:116, и эффекторную последовательностью комплемента, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:116, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:116, может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:115. shmiR в соответствии с этим примером далее обозначена как "shmiR-19".
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, может содержать последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:117, за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:117; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shmiR, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:118, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:118, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:118, может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:117. shmiR в соответствии с этим примером далее обозначена как "shmiR-20".
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, может содержать последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:119, за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:119; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shmiR, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:120, и эффекторную последовательностью комплемента, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:120, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:120, может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:119. shmiR в соответствии с этим примером далее обозначена как "shmiR-21".
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, может содержать последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:121, за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:121; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shmiR, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:122, и эффекторную последовательностью комплемента, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:122, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, приведенной в SEQ ID NO:122, может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO: 121. shmiR в соответствии с этим примером далее обозначена как "shmiR-22".
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, может содержать последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:123, за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:123; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shmiR, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:124, и эффекторную последовательностью комплемента, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:124, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:124, может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:123. shmiR в соответствии с этим примером далее обозначена как "shmiR-23".
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, может содержать последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:125, за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:125; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shmiR, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:126, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:126, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:126, может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:125. shmiR в соответствии с этим примером далее обозначена как "shmiR-24".
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, может содержать последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:127, за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:127; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shmiR, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:128, и эффекторную последовательностью комплемента, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:128, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:128, может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:127. shmiR в соответствии с этим примером далее обозначена как "shmiR-25".
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, может содержать последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:129, за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:129; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shmiR, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:130, и эффекторную последовательностью комплемента, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:130, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:130, может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:129. shmiR в соответствии с этим примером далее обозначена как "shmiR-26".
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, может содержать последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:131, за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:131; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shmiR, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:132, и эффекторной последовательности комплемента, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:132, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:132, может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:131. shmiR в соответствии с этим примером далее обозначена как "shmiR-27".
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, может содержать последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:133, за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:133; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shmiR, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:134, и эффекторную последовательностью комплемента, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:134, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:134, может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:133. shmiR в соответствии с этим примером далее обозначена как "shmiR-28".
shmiR, кодируемая нуклеиновой кислотой по изобретению, может содержать в направлении от 5' к 3':
5'-фланкирующую последовательность каркаса pri-miRNA;
комплементарную последовательность эффектора;
последовательность структуры типа "стебель-петля";
эффекторную последовательность; и
3'-фланкирующую последовательность каркаса pri-miRNA.
Подходящие последовательности структуры "петли" могут быть выбраны из числа известных в данной области. При этом иллюстративная последовательность "стебель-петля" представлена в SEQ ID NO:75.
Подходящие каркасы первичной микро-РНК (pri-miRNA или pri-R) для использования в структурах нуклеиновых кислот по изобретению, могут быть выбраны из числа известных в данной области. Например, каркасы pri-miRNA могут быть выбраны из каркаса pri-miR-30a, каркаса pri-miR-155, каркаса pri-miR-21 и каркаса pri-miR-136. Однако предпочтительно, когда каркас pri-miRNA представляет собой каркас pri-miR-30a. В соответствии с примером, в котором каркас pri-miRNA представляет собой каркас pri-miR-30a, 5'-фланкирующая последовательность каркаса pri-miRNA представлена в SEQ ID NO:76, и 3'-фланкирующая последовательность каркаса pri-miRNA представлена в SEQ ID NO: 77. Таким образом, нуклеиновая кислота, кодирующая shmiR по изобретению (например, shmiR-1 - shmiR-16, описанные здесь) может содержать последовательность ДНК, кодирующую последовательность, представленную в SEQ ID NO:76, и последовательность ДНК, кодирующую последовательность, представленную в SEQ ID NO:77.
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная в настоящем описании, может содержать последовательность ДНК, выбранную из группы, включающей: последовательность, изложенная в любой из SEQ ID NO: 59-74 и 146-157.
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:59, и кодирует shmiR (shmiR-1), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:43.
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:60, и кодирует shmiR (shmiR-2), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:44.
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:61, и кодирует shmiR (shmiR-3), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:45.
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:62, и кодирует shmiR (shmiR-4), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:46.
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:63, и кодирует shmiR (shmiR-5), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:47.
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:64, и кодирует shmiR (shmiR-6), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48.
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:65, и кодирует shmiR (shmiR-7), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:49.
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:66, и кодирует shmiR (shmiR-8), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:50.
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:67, и кодирует shmiR (shmiR-9), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:51.
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:68, и кодирует shmiR (shmiR-10), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:52.
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:69, и кодирует shmiR (shmiR-11), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:53.
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:70, и кодирует shmiR (shmiR-12), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:54.
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:71, и кодирует shmiR (shmiR-13), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:55.
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:72, и кодирует shmiR (shmiR-14), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:56.
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:73, и кодирует shmiR (shmiR-15), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:57.
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:74, и кодирует shmiR (shmiR-16), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:58.
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:146, и кодирует shmiR (shmiR-17), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:134.
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:147, и кодирует shmiR (shmiR-18), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:135.
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:148, и кодирует shmiR (shmiR-19), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:136.
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:149, и кодирует shmiR (shmiR-20), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:137.
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:150, и кодирует shmiR (shmiR-21), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:138.
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:151, и кодирует shmiR (shmiR-22), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:139.
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:152, и кодирует shmiR (shmiR-23), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:140.
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:153, и кодирует shmiR (shmiR-24), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:141.
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:154, и кодирует shmiR (shmiR-25), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:142.
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:155, и кодирует shmiR (shmiR-26), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:143.
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:156, и кодирует shmiR (shmiR-27), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:144.
В одном примере нуклеиновая кислота, описанная здесь, содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:157, и кодирует shmiR (shmiR-28), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:145.
Примеры нуклеиновых кислот по изобретению кодируют shmiR, выбранные из shmiR-6, shmiR-7, shmiR-12 и shmiR-15, как описано здесь. Другие примеры нуклеиновых кислот по изобретению кодируют варианты shmiR-12, выбранные из shmiR-23, shmiR-24, shmiR-25, shmiR-26, shmiR-27 и shmiR-28, или кодируют варианты shmiR-15, выбранные из shmiR-17, shmiR-18, shmiR-19, shmiR-20, shmiR-21 и shmiR-22.
Специалисту в данной области понятно, что нуклеиновая кислота в соответствии с настоящим изобретением может быть объединена или использована в сочетании с другими терапевтическими средствами для лечения HBV. Соответственно, настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, содержащей последовательность ДНК, кодирующую shmiR, как описано здесь (например, одну или несколько shmiR, обозначенные как shmiR-1 - shmiR-28, описанные в настоящей заявке), в комбинации с одним или несколькими другими средствами для лечения HBV. В одном примере предлагается множество нуклеиновых кислот, содержащих:
(a) по меньшей мере одну из описанных здесь нуклеиновых кислот; и
(b) по меньшей мере одну дополнительную нуклеиновую кислоту, выбранную из:
(i) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую shmiR, как описано здесь; или
(ii) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую короткоцепочечную шпилечную РНК (shRNA), содержащую эффекторную последовательность длиной по меньшей мере из 17 нуклеотидов, и комплементарную эффекторную последовательность, где эффекторная последовательность по существу комплементарна последовательности РНК, представленной в любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-10, 38, 40, 42, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131 и 133;
где shmiR, кодируемая нуклеиновой кислотой, указанной в (a), и shmiR или shRNA кодируемая нуклеиновой кислотой, указанной в (b), содержат различные эффекторные последовательности. Предпочтительно, когда эффекторная последовательность shmiR, указанная в (b)(ii), которая по существу комплементарна последовательности РНК, представленной в любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-10, 38, 40, 42, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131 и 133, будет иметь длину менее чем из 30 нуклеотидов. Например, подходящая длина эффекторной последовательности в shRNA может находиться в диапазоне из 17-29 нуклеотидов.
Соответственно, в одном из примеров множество нуклеиновых кислот по изобретению может содержать две или более нуклеиновых кислот, кодирующих shmiR, описанных здесь, например две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять нуклеиновых кислот, кодирующих shmiR, описанных здесь.
В другом примере множество нуклеиновых кислот по изобретению содержит, по меньшей мере, одну нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, описанную здесь, и по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую shRNA, содержащую эффектор длиной по меньшей мере из 17 нуклеотидов, и комплементарную последовательность эффектора, где эффекторная последовательность по существу комплементарна последовательности РНК, представленной в любой из SEQ ID NO: 1-10, 38, 40, 42, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131 и 133.
В одном примере shRNA, кодируемая нуклеиновой кислотой, входящей во множество, содержит: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:12, за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:12; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shRNA, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:11, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:11, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:11, может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:12. shRNA в соответствии с данным примером далее обозначена как "shRNA-1".
В одном примере shRNA, кодируемая нуклеиновой кислотой из множества, содержит: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:14, за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:14; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shRNA, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:13, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:13, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:13, может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:14. shRNA в соответствии с данным примером далее обозначена как "shRNA-2".
В одном примере shRNA, кодируемая нуклеиновой кислотой из множества, содержит: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:16, за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:16; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shRNA, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:15, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:15, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:15, может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:16. shRNA в соответствии с данным примером далее обозначена как "shRNA-3".
В одном примере shRNA, кодируемая нуклеиновой кислотой из множества, содержит: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:18, за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:18; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shRNA, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:17, и эффекторную последовательностью комплемента, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:17, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:17, может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:18. shRNA в соответствии с данным примером далее обозначена как "shRNA-4".
В одном примере shRNA, кодируемая нуклеиновой кислотой из множества, содержит: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:20, за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:20; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shRNA, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:19 и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:19, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:19, может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:20. shRNA в соответствии с данным примером далее обозначена как "shRNA-5".
В одном примере shRNA, кодируемая нуклеиновой кислотой из множества, содержит: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:22 за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:22; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shRNA, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:21, и эффекторную последовательностью комплемента, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:21, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:21, может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:22. shRNA в соответствии с данным примером далее обозначена как "shRNA-6".
В одном примере shRNA, кодируемая нуклеиновой кислотой из множества, содержит: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:24 за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:24; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shRNA, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:23, и эффекторную последовательностью комплемента, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:23, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:23, может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:24. shRNA в соответствии с данным примером далее обозначена как "shRNA-7".
В одном примере shRNA, кодируемая нуклеиновой кислотой из множества, содержит: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:26, за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:26; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shRNA, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:25, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:25, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:25, может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:26. shRNA в соответствии с данным примером далее обозначена как "shRNA-8".
В одном примере shRNA, кодируемая нуклеиновой кислотой из множества, содержит: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:28, за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:28; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shRNA, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:27, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:27, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:27, может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:28. shRNA в соответствии с данным примером далее обозначена как "shRNA-9".
В одном примере shRNA, кодируемая нуклеиновой кислотой из множества, содержит: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:30, за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:30; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shRNA, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:29, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:29, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:29 может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:а shRNA в соответствии с данным примером далее обозначена как "shRNA-10".
В одном примере shRNA, кодируемая нуклеиновой кислотой из множества, содержит: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:32, за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:32; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shRNA, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:31, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:31, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:31, может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:32. shRNA в соответствии с данным примером далее обозначена как "shRNA-11".
В одном примере shRNA, кодируемая нуклеиновой кислотой из множества, содержит: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:34, за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:34; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shRNA, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:33, и эффекторную последовательностью комплемента, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:33, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:33, может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:34. shRNA в соответствии с данным примером далее обозначена как "shRNA-12".
В одном примере shRNA, кодируемая нуклеиновой кислотой из множества, содержит: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:36 за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:36; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shRNA, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:35, и эффекторную последовательностью комплемента, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:35, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:35, может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:36. shRNA в соответствии с данным примером далее обозначена как "shRNA-13".
В одном примере shRNA, кодируемая нуклеиновой кислотой из множества, содержит: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:38, за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:38; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shRNA, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:37, и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:37, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:37, может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:38. shRNA в соответствии с данным примером далее обозначена как "shRNA-14".
В одном примере shRNA, кодируемая нуклеиновой кислотой из множества, содержит: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:40, за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:40; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shRNA, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:39, и эффекторную последовательностью комплемента, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:39, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:39, может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:40. shRNA в соответствии с данным примером далее обозначена как "shRNA-15".
В одном примере shRNA, кодируемая нуклеиновой кислотой из множества, содержит: (i) эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:42 за исключением 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ошибочных спариваний оснований, при условии, что эффекторная последовательность способна образовывать дуплекс с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:42; и (ii) комплементарную последовательность эффектора, содержащую последовательность, которая по существу комплементарна эффекторной последовательности. Например, shRNA, кодируемая нуклеиновой кислотой, может содержать эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:41 и комплементарную последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:41, и способна образовывать с ней дуплекс. Комплементарная последовательность эффектора, которая по существу комплементарна последовательности, представленной в SEQ ID NO:41 может представлять собой последовательность, представленную в SEQ ID NO:42. shRNA в соответствии с данным примером далее обозначена как "shRNA-16".
В соответствии с любым примером, в котором нуклеиновая кислота по изобретению кодирует shRNA, shRNA может содержать последовательность структуры "стебель-петля", расположенную между эффекторной последовательностью и комплементарной последовательности эффектора. Подходящие последовательности структуры "петли" могут быть выбраны из числа известных в данной области. Альтернативно, подходящая последовательность структуры "стебель-петля" может быть разработана de novo. В одном примере, нуклеиновая кислота из множества нуклеиновых кислот, описанных здесь, кодирующая shRNA, может содержать последовательность ДНК, кодирующую структуру "стебель-петля", расположенную между последовательностями ДНК, кодирующими эффекторную последовательность и комплементарную последовательность эффектора. Например, shRNA, кодируемая нуклеиновой кислотой по изобретению, может содержать последовательность, представленную в любой из последовательностей SEQ ID NO: 78-93. Таким образом, нуклеиновая кислота из множества нуклеиновых кислот, описанных здесь, может содержать или состоять из последовательности ДНК, представленной в любой из SEQ ID NO: 94-109.
В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанных здесь, включает нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:59, и кодирует shmiR (shmiR-1), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:43, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту по изобретению, которая кодирует shmiR или shRNA, нацеленную на HBV.
В одном из примеров множество нуклеиновых кислот, описанных здесь, включает нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:60, и кодирует shmiR (shmiR-2), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:44, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту по изобретению, которая кодирует shmiR или shRNA, нацеленную на HBV.
В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанных здесь, включает нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:61, и кодирует shmiR (shmiR-3), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:45, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту по изобретению, которая кодирует shmiR или shRNA, нацеленную на HBV.
В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанных здесь, включает нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:62, и кодирует shmiR (shmiR-4), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:46, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту по изобретению, которая кодирует shmiR или shRNA, нацеленную на HBV.
В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанных здесь, включает нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:63, и кодирует shmiR (shmiR-5), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:47, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту по изобретению, которая кодирует shmiR или shRNA, нацеленную на HBV.
В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанных здесь, включает нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:64, и кодирует shmiR (shmiR-6), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту по изобретению, которая кодирует shmiR или shRNA, нацеленную на HBV.
В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанных здесь, включает нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:65, и кодирует shmiR (shmiR-7), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:49, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту по изобретению, которая кодирует shmiR или shRNA, нацеленную на HBV.
В одном из примеров множество нуклеиновых кислот, описанных здесь, включает нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:66, и кодирует shmiR (shmiR-8), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:50, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту по изобретению, которая кодирует shmiR или shRNA, нацеленную на HBV.
В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанных здесь, включает нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:67, и кодирует shmiR (shmiR-9), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:51, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту по изобретению, которая кодирует shmiR или shRNA, нацеленную на HBV.
В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанных здесь, включает нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:68, и кодирует shmiR (shmiR-10), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:52, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту по изобретению, которая кодирует shmiR или shRNA, нацеленную на HBV.
В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанных здесь, включает нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:69, и кодирует shmiR (shmiR-11), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:53, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту по изобретению, которая кодирует shmiR или shRNA, нацеленную на HBV.
В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанных здесь, включает нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:70, и кодирует shmiR (shmiR-12), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:54, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту по изобретению, которая кодирует shmiR или shRNA, нацеленную на HBV.
В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанных здесь, включает нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:71, и кодирует shmiR (shmiR-13), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:55, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту по изобретению, которая кодирует shmiR или shRNA, нацеленную на HBV.
В одном из примеров множество нуклеиновых кислот, описанных здесь, включает нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:72, и кодирует shmiR (shmiR-14), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:56, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту по изобретению, которая кодирует shmiR или shRNA, нацеленную на HBV.
В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанных здесь, включает нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:73, и кодирует shmiR (shmiR-15), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:57, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту по изобретению, которая кодирует shmiR или shRNA, нацеленную на HBV.
В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанных здесь, включает нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:74, и кодирует shmiR (shmiR-16), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:58, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту по изобретению, которая кодирует shmiR или shRNA, нацеленную на HBV.
В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанных здесь, включает нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:146, и кодирует shmiR (shmiR-17), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:134, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту по изобретению, которая кодирует shmiR или shRNA, нацеленную на HBV.
В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанных здесь, включает нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:147, и кодирует shmiR (shmiR-18), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:135, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту по изобретению, которая кодирует shmiR или shRNA, нацеленную на HBV.
В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанных здесь, включает нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:148, и кодирует shmiR (shmiR-19), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:136, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту по изобретению, которая кодирует shmiR или shRNA, нацеленную на HBV.
В одном из примеров множество нуклеиновых кислот, описанных здесь, включает нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:149, и кодирует shmiR (shmiR-20), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:137, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту по изобретению, которая кодирует shmiR или shRNA, нацеленную на HBV.
В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанных здесь, включает нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:150, и кодирует shmiR (shmiR-21), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:138, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту по изобретению, которая кодирует shmiR или shRNA, нацеленную на HBV.
В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанных здесь, включает нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:151, и кодирует shmiR (shmiR-22), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:139, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту по изобретению, которая кодирует shmiR или shRNA, нацеленную на HBV.
В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанных здесь, включает нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:152, и кодирует shmiR (shmiR-23), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:140, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту по изобретению, которая кодирует shmiR или shRNA, нацеленную на HBV.
В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанных здесь, включает нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:153, и кодирует shmiR (shmiR-24), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:141, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту по изобретению, которая кодирует shmiR или shRNA, нацеленную на HBV.
В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанных здесь, включает нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:154, и кодирует shmiR (shmiR-25), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:142, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту по изобретению, которая кодирует shmiR или shRNA, нацеленную на HBV.
В одном из примеров множество нуклеиновых кислот, описанных здесь, включает нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:155, и кодирует shmiR (shmiR-26), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:143, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту по изобретению, которая кодирует shmiR или shRNA, нацеленную на HBV.
В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанных здесь, включает нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:156, и кодирует shmiR (shmiR-27), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:144, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту по изобретению, которая кодирует shmiR или shRNA, нацеленную на HBV.
В одном примере множество нуклеиновых кислот, описанных здесь, включает нуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:157, и кодирует shmiR (shmiR-28), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:145, и по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту по изобретению, которая кодирует shmiR или shRNA, нацеленную на HBV.
В соответствии с любым из примеров множества нуклеиновых кислот, как описано здесь, множество нуклеиновых кислот могут включать две или более нуклеиновых кислот, кодирующих shmiR или shRNA, описанных здесь, например две, три, четыре, пять, шесть семь, восемь, девять или десять нуклеиновых кислот, кодирующих shmiR, как описано здесь, при условии, что по меньшей мере одна из нуклеиновых кислот кодирует shmiR по изобретению.
В одном примере множество нуклеиновых кислот включает две нуклеиновых кислоты по изобретению, каждая из которых кодирует shmiR, как описано здесь. В другом примере множество нуклеиновых кислот включает три нуклеиновых кислоты по изобретению, каждая из которых кодирует shmiR, как описано здесь. В одном примере множество нуклеиновых кислот включает четыре нуклеиновых кислоты по изобретению, каждая из которых кодирует shmiR, как описано здесь. В одном примере множество нуклеиновых кислот включает пять нуклеиновых кислот по изобретению, каждая из которых кодирует shmiR, как описано здесь. В одном примере множество нуклеиновых кислот включает шесть нуклеиновых кислот по изобретению, каждая из которых кодирует shmiR, как описано здесь. В одном примере множество нуклеиновых кислот включает семь нуклеиновых кислот по изобретению, каждая из которых кодирует shmiR, как описано здесь. В одном примере множество нуклеиновых кислот включает восемь нуклеиновых кислот по изобретению, каждая из которых кодирует shmiR, как описано здесь. В одном примере множество нуклеиновых кислот включает девять нуклеиновых кислот по изобретению, каждая из которых кодирует shmiR, как описано здесь. В одном примере множество РНК включает десять нуклеиновых кислот по изобретению, каждая из которых кодирует shmiR, как описано здесь. В соответствии с любым примером, описанным здесь, одна или несколько нуклеиновых кислот из множества нуклеиновых кислот могут кодировать shRNA, как описано здесь.
В одном примере эффекторная последовательность shmiR или shRNA, кодируемая одной нуклеиновой кислотой из множества, по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему последовательность, представленную в SEQ ID NO:4. Подходящие нуклеиновые кислоты, кодирующие shmiR или shRNA, имеющие эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:4, описаны здесь.
В одном примере эффекторная последовательность shmiR или shRNA, кодируемая одной нуклеиновой кислотой из множества, по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему последовательность, представленную в SEQ ID NO:5. Подходящие нуклеиновые кислоты, кодирующие shmiR или shRNA, имеющие эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:5, описаны здесь.
В одном примере эффекторная последовательность shmiR или shRNA, кодируемая одной нуклеиновой кислотой из множества, по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему последовательность, представленную в SEQ ID NO:подходящие нуклеиновые кислоты, кодирующие shmiR или shRNA, имеющие эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:9, описаны здесь.
В одном примере эффекторная последовательность shmiR или shRNA, кодируемая одной нуклеиновой кислотой из множества, по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему последовательность, представленную в SEQ ID NO:40. Подходящие нуклеиновые кислоты, кодирующие shmiR или shRNA, имеющие эффекторную последовательность, которая по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:40, описаны здесь.
В одном примере эффекторная последовательность shmiR, кодируемая нуклеиновой кислотой из множества, по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:4, и эффекторная последовательность shmiR, кодируемая нуклеиновой кислотой из множества, по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:9.
В одном примере эффекторная последовательность shmiR, кодируемая нуклеиновой кислотой из множества, по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:4, и эффекторная последовательность shmiR, кодируемая нуклеиновой кислотой из множества, по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:9; и эффекторная последовательность shmiR, кодируемая нуклеиновой кислотой из множества, по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:5.
В одном примере эффекторная последовательность shmiR, кодируемая нуклеиновой кислотой из множества, по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:4, и эффекторная последовательность shmiR, кодируемая нуклеиновой кислотой из множества, по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:9; и эффекторная последовательность shmiR, кодируемая нуклеиновой кислотой из множества, по существу комплементарна транскрипту РНК, содержащему или состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO:40.
Примеры нуклеиновых кислот по изобретению, кодирующих shmiR, которые нацелены на HBV, включая эффекторные последовательности, которые по существу комплементарны транскриптам РНК, представленным в SEQ ID NO: 4, 5, 9 или 40, описанные здесь, могут быть, при внесении необходимых изменений, использованы в каждом примере, в котором описано множество нуклеиновых кислот по изобретению.
В одном примере множество нуклеиновых кислот по изобретению содержит:
(i) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую эффекторную последовательность, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:21, и комплементарную последовательность эффектора, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:22; и
(ii) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую эффекторную последовательность, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:33, и комплементарную последовательность эффектора, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:34.
В одном примере множество нуклеиновых кислот по изобретению содержит:
(i) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую эффекторную последовательность, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:21, и комплементарную последовательность эффектора, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:22;
(ii) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую эффекторную последовательность, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:33, и комплементарную последовательность эффектора, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:34; и
(iii) по меньшей мере одну другую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую shmiR или shRNA, содержащую эффекторную последовательность длиной по меньшей мере из 17 нуклеотидов, которая по существу комплементарна транскрипту РНК генома HBV.
В одном из примеров другая нуклеиновая кислота по изобретению представляет собой нуклеиновую кислоту, описанную здесь, которая кодирует shmiR или shRNA, содержащую эффекторную последовательность, которая отличается от последовательности гена shmiR, кодируемого нуклеиновыми кислотами в (i) и(ii).
В одном примере множество нуклеиновых кислот по изобретению содержит:
(i) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую эффекторную последовательность, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:21, и комплементарную последовательность эффектора, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:22;
(ii) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую эффекторную последовательность, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:39, и комплементарную последовательность эффектора, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:40; и
(iii) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую эффекторную последовательность, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:33, и комплементарную последовательность эффектора, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:34.
В одном примере множество нуклеиновых кислот по изобретению содержит:
(i) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую эффекторную последовательность, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:21, и комплементарную последовательность эффектора, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:22;
(ii) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую эффекторную последовательность, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:23, и комплементарную последовательность эффектора, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:24; и
(iii) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую эффекторную последовательность, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:33, и комплементарную последовательность эффектора, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:34.
В одном примере множество нуклеиновых кислот по изобретению содержит:
(i) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую эффекторную последовательность, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:21, и комплементарную последовательность эффектора, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:22;
(ii) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую shRNA, содержащую эффекторную последовательность, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:39, и комплементарную последовательность эффектора, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:40; и
(iii) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую эффекторную последовательность, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:33, и комплементарную последовательность эффектора, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:34.
В одном примере множество нуклеиновых кислот по изобретению содержит:
(i) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую эффекторную последовательность, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:21, и комплементарную последовательность эффектора, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:22; и
(ii) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую эффекторную последовательность, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:116, и комплементарную последовательность эффектора, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:117.
В одном примере множество нуклеиновых кислот по изобретению содержит:
(i) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую эффекторную последовательность, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:21, и комплементарную последовательность эффектора, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:22; и
(ii) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую эффекторную последовательность, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:124, и комплементарную последовательность эффектора, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:125.
В одном примере множество нуклеиновых кислот по изобретению содержит:
(i) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую эффекторную последовательность, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:21, и комплементарную последовательность эффектора, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:22;
(ii) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую эффекторную последовательность, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:116, и комплементарную последовательность эффектора, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:117; и
(iii) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую shmiR, содержащую эффекторную последовательность, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:124, и комплементарную последовательность эффектора, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:125.
В одном примере множество нуклеиновых кислот по изобретению содержит:
(i) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:64 (кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48); и
(ii) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:70 (кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:54).
В одном примере множество нуклеиновых кислот по изобретению содержит:
(i) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:64 (кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48);
(ii) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:73 (кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:57); и
(iii) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:70 (кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:54).
В одном примере множество нуклеиновых кислот по изобретению содержит:
(i) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:64 (кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48);
(ii) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:73 (кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:57); и
(iii) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:70 (кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:54).
В одном примере множество нуклеиновых кислот по изобретению содержит:
(i) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:64 (кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48);
(ii) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:99 (кодирующую shRNA, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:83); и
(iii) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:70 (кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:54).
В одном примере множество нуклеиновых кислот по изобретению содержит:
(i) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:64 (кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48); и
(ii) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:149 (кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:137).
В одном примере множество нуклеиновых кислот по изобретению содержит:
(i) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:64 (кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48); и
(ii) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:153 (кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:141).
В одном примере множество нуклеиновых кислот по изобретению содержит:
(i) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:64 (кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48);
(ii) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:149 (кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:137); и
(iii) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:153 (кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:141).
В соответствии с примером, в котором предусмотрено множество нуклеиновых кислот, две или более нуклеиновых кислот могут образовывать отдельные части одного и того же полинуклеотида. В другом примере две или более нуклеиновых кислот во множестве образуют части различных полинуклеотидов, соответственно. В другом примере, множество нуклеиновых кислот, описанных здесь, представлены в виде множества компонентов, например, множества композиций. Например, каждая из нуклеиновых кислот из множества может быть предоставлена отдельно. Альтернативно, в примере, где предусмотрены по меньшей мере три нуклеиновые кислоты по изобретению, по меньшей мере одна из нуклеиновых кислот может быть представлена отдельно, и две или более нуклеиновые кислоты из множества, предоставлены вместе.
В некоторых примерах, каждая нуклеиновая кислота в соответствии с настоящим изобретением может содержать или быть операбельно связана с дополнительными элементами, например, для облегчения транскрипции РНК. Например, каждая нуклеиновая кислота может содержать промотор, операбельно связанный с последовательностью, кодирующей shmiR или shRNA, описанной здесь. Другие элементы, например терминаторы и инициаторы транскрипции, известны в данной области и/или описаны здесь.
Альтернативно или дополнительно, каждая нуклеиновая кислота по изобретению может содержать один или несколько сайтов рестрикции, например, для облегчения клонирования нуклеиновой кислоты (кислот) в клонирующие или экспрессирующие векторы. Например, нуклеиновые кислоты, описанные здесь, могут включать сайт рестрикции выше и/или ниже (в положении "апстрим" и/или в положении "даунстрим") последовательности, кодирующей shmiR или shRNA по изобретению. Подходящие последовательности распознаваемые рестрикционными ферментами известны специалисту в данной области техники. Однако в одном примере нуклеиновая кислота (кислоты) по изобретению может включать сайт рестрикции BamHI (GGATCC) на 5'-конце, т.е., до последовательности, кодирующей shmiR или shRNA, и сайт рестрикции EcoRI (GAATTC) на 3'-конце, т.е. после последовательности, кодирующей shmiR или shRNA.
ddRNAi
В одном примере каждая нуклеиновая кислота по изобретению представлена в форме или представлена в составе конструкта РНК для направленной РНК интерференции (ddRNAi). Соответственно, в одном из примеров в настоящем описании предложен конструкт ddPHKi, содержащий нуклеиновую кислоту, описанную здесь. В другом примере настоящее изобретение относится к конструкту ddNAi, содержащей множество нуклеиновых кислот, описанных здесь. Примеры нуклеиновых кислот, кодирующих shmiR или shRNA, содержащих эффекторные последовательности, направленные на транскрипты HBV, описаны здесь, и могут быть, при внесении необходимых изменений, использованы для этого примере изобретения.
В одном из примеров конструкт ddRNAi содержит нуклеиновую кислоту по изобретению, функционально связанную с промотором.
В соответствии с примером, в котором конструкт ddRNAi содержит множество нуклеиновых кислот, описанных здесь, каждая из нуклеиновых кислот может быть операбельно связана с промотором. В одном примере нуклеиновые кислоты в конструкте ddRNAi могут быть операбельно связаны с одним и тем же промотором. В одном примере нуклеиновые кислоты в конструкте ddRNAi могут быть операбельно связаны с различными промоторами.
В одном из примеров ddRNAi по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:59, и кодирующую shmiR (shmiR-1), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 43. Конструкт ddRNAi может содержать одну или несколько дополнительных нуклеиновых кислот по изобретению, например, нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, выбранную из последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO: 60-74 и 146-157.
В одном из примеров ddRNAi по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:60, и кодирующую shmiR (shmiR-2), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:44. Конструкт ddRNAi может содержать одну или несколько дополнительных нуклеиновых кислот по изобретению, например, нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, выбранную из последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO: 59, 61-74 и 146-157.
В одном из примеров ddRNAi по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:61, и кодирующую shmiR (shmiR-3), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:45. Конструкт ddRNAi может содержать одну или несколько дополнительных нуклеиновых кислот по изобретению, например, нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, выбранную из последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO: 59-60, 62-74 и 146-157.
В одном из примеров ddRNAi по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:62, и кодирующую shmiR (shmiR-4), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:46. Конструкт ddRNAi может содержать одну или несколько дополнительных нуклеиновых кислот по изобретению, например, нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, выбранную из последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO: 59-61, 63-74 и 146-157.
В одном из примеров ddRNAi по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:63, и кодирующую shmiR (shmiR-5), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 47. Конструкт ddRNAi может содержать одну или несколько дополнительных нуклеиновых кислот по изобретению, например, нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, выбранную из последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO: 59-62, 64-74 и 146-157.
В одном из примеров ddRNAi по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:64, и кодирующую shmiR (shmiR-6), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48. Конструкт ddRNAi может содержать одну или несколько дополнительных нуклеиновых кислот по изобретению, например, нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, выбранную из последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO: 59-63, 65-74 и 146-157.
В одном из примеров ddRNAi по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:65, и кодирующую shmiR (shmiR-7), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:49. Конструкт ddRNAi может содержать одну или несколько дополнительных нуклеиновых кислот по изобретению, например, нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, выбранную из последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO: 59-64, 66-74 и 146-157.
В одном из примеров ddRNAi по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:66, и кодирующую shmiR (shmiR-8), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:50. Конструкт ddRNAi может содержать одну или несколько дополнительных нуклеиновых кислот по изобретению, например, нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, выбранную из последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO: 59-65, 67-74 и 146-157.
В одном из примеров ddRNAi по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:67, и кодирующую shmiR (shmiR-9), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:51. Конструкт ddRNAi может содержать одну или несколько дополнительных нуклеиновых кислот по изобретению, например, нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, выбранную из последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO: 59-66, 68-74 и 146-157.
В одном из примеров ddRNAi по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:68, и кодирующую shmiR (shmiR-10), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:52. Конструкт ddRNAi может содержать одну или несколько дополнительных нуклеиновых кислот по изобретению, например, нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, выбранную из последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO: 59-67, 69-74 и 146-157.
В одном из примеров ddRNAi по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:69, и кодирующую shmiR (shmiR-11), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:53. Конструкт ddRNAi может содержать одну или несколько дополнительных нуклеиновых кислот по изобретению, например, нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, выбранную из последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO: 59-68, 70-74 и 146-157.
В одном из примеров ddRNAi по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:70, и кодирующую shmiR (shmiR-12), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 54. Конструкт ddRNAi может содержать одну или несколько дополнительных нуклеиновых кислот по изобретению, например, нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, выбранную из последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO: 59-69, 71-74 и 146-157.
В одном из примеров ddRNAi по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:71, и кодирующую shmiR (shmiR-13), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 55. Конструкт ddRNAi может содержать одну или несколько дополнительных нуклеиновых кислот по изобретению, например, нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, выбранную из последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO: 59-70, 72-74 и 146-157.
В одном из примеров ddRNAi по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:72, и кодирующую shmiR (shmiR-14), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:56. Конструкт ddRNAi может содержать одну или несколько дополнительных нуклеиновых кислот по изобретению, например, нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, выбранную из последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO: 59-71, 73-74 и 146-157.
В одном из примеров ddRNAi по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:73, и кодирующую shmiR (shmiR-15), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:57. Конструкт ddRNAi может содержать одну или несколько дополнительных нуклеиновых кислот по изобретению, например, нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, выбранную из последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO: 59-72, 74 и 146-157.
В одном из примеров ddRNAi по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:74, и кодирующую shmiR (shmiR-16), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:58. Конструкт ddRNAi может содержать одну или несколько дополнительных нуклеиновых кислот по изобретению, например, нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, выбранную из последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO: 59-73 и 146-157.
В одном из примеров ddRNAi по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:146, и кодирующую shmiR (shmiR-17), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:134. Конструкт ddRNAi может содержать одну или несколько дополнительных нуклеиновых кислот по изобретению, например, нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, выбранную из последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO: 59-74 и 147-157.
В одном из примеров ddRNAi по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:147, и кодирующую shmiR (shmiR-18)), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:135. Конструкт ddRNAi может содержать одну или несколько дополнительных нуклеиновых кислот по изобретению, например, нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, выбранную из последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO: 59-74, 146 и 148-157.
В одном из примеров ddRNAi по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:148, и кодирующую shmiR (shmiR-19), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:136. Конструкт ddRNAi может содержать одну или несколько дополнительных нуклеиновых кислот по изобретению, например, нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, выбранную из последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO: 59-74, 146, 147 и 149-157.
В одном из примеров ddRNAi по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:149, и кодирующую shmiR (shmiR-20), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:137. Конструкт ddRNAi может содержать одну или несколько дополнительных нуклеиновых кислот по изобретению, например, нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, выбранную из последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO: 59-74, 146-148 и 150-157.
В одном из примеров ddRNAi по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:150, и кодирующую shmiR (shmiR-21), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:138. Конструкт ddRNAi может содержать одну или несколько дополнительных нуклеиновых кислот по изобретению, например, нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, выбранную из последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO: 59-74, 146-149 и 151-157.
В одном из примеров ddRNAi по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:151, и кодирующую shmiR (shmiR-22), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:139. Конструкт ddRNAi может содержать одну или несколько дополнительных нуклеиновых кислот по изобретению, например, нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, выбранную из последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO: 59-74, 146-150 и 152-157.
В одном из примеров ddRNAi по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:152, и кодирующую shmiR (shmiR-23), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:140. Конструкт ddRNAi может содержать одну или несколько дополнительных нуклеиновых кислот по изобретению, например, нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, выбранную из последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO: 59-74, 146-151 и 153-157.
В одном из примеров ddRNAi по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:153, и кодирующую shmiR (shmiR-24), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:141. Конструкт ddRNAi может содержать одну или несколько дополнительных нуклеиновых кислот по изобретению, например, нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, выбранную из последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO: 59-74, 146-152 и 154-157.
В одном из примеров ddRNAi по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:154, и кодирующую shmiR (shmiR-25), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:142. Конструкт ddRNAi может содержать одну или несколько дополнительных нуклеиновых кислот по изобретению, например, нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, выбранную из последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO: 59-74, 146-153 и 155-157.
В одном из примеров ddRNAi по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:155, и кодирующую shmiR (shmiR-26), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:143. Конструкт ddRNAi может содержать одну или несколько дополнительных нуклеиновых кислот по изобретению, например, нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, выбранную из последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO: 59-74, 146-154 и 156-157.
В одном из примеров ddRNAi по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:156, и кодирующую shmiR (shmiR-27), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:144. Конструкт ddRNAi может содержать одну или несколько дополнительных нуклеиновых кислот по изобретению, например, нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, выбранную из последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO: 59-74, 146-155 и 157.
В одном из примеров ddRNAi по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:157, и кодирующую shmiR (shmiR-28), содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:145. Конструкт ddRNAi может содержать одну или несколько дополнительных нуклеиновых кислот по изобретению, например, нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, выбранную из последовательностей, представленных в любой из SEQ ID NO: 59-74 и 146-156.
Иллюстративный пример конструкта ddRNAi, содержащего множество нуклеиновых кислот, включает:
(a) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48 (shmiR-6); и
(b) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:54 (shmiR-12).
Иллюстративный пример конструкта ddRNAi, содержащего множество нуклеиновых кислот, включает:
(a) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:64 (кодирующую shmiR-6); и
(b) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:70 (кодирующую shmiR-12).
В другом примере конструкт ddRNAi, содержащий множество нуклеиновых кислот, содержит:
(a) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48 (shmiR-6); и
(b) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:137 (shmiR-20).
Например, конструкт ddRNAi, содержащий множество нуклеиновых кислот, может содержать:
(a) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:64 (кодирующую shmiR-6); и
(b) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:149 (кодирующую shmiR-20).
В другом примере конструкт ddRNAi, содержащий множество нуклеиновых кислот, содержит:
(a) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48 (shmiR-6); и
(b) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:141 (shmiR-24).
Например, конструкт ddRNAi, содержащий множество нуклеиновых кислот, может содержать:
(a) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:64 (кодирующую shmiR-6); и
(b) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:153 (кодирующую shmiR-24).
Настоящее изобретение также относится к конструкту ddRNAi, содержащего по меньшей мере три описанные здесь нуклеиновые кислоты, и конструкт ddRNAi кодирует, по меньшей мере, три shmiR, нацеленные на HBV, каждая из которых отличается друг от друга.
В одном примере изобретение также относится к конструкту ddRNAi, содержащему:
(a) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48 (shmiR-6);
(b) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую shmiR или shRNA, описанную здесь; и
(c) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:54 (shmiR-12);
где нуклеиновая кислота, указанная в (b) кодирует shmiR или shRNA с эффекторной последовательностью, которая отличается от эффекторных последовательностей, кодируемых нуклеиновой кислотой, указанной в (а) и (с).
В одном примере конструкт ddRNAi по изобретению содержит, предпочтительно, в направлении от 5' к 3':
(a) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48 (shmiR-6);
(b) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:57 (shmiR-15); и
(c) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:54 (shmiR-12).
Например, конструкт ddRNAi по изобретению может содержать, в частности, в направлении от 5' к 3':
(a) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:64 (кодирующую shmiR-6);
(b) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:73 (кодирующую shmiR-15); и
(c) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:70 (кодирующую shmiR-12).
В одном из примеров конструкт ddRNAi по изобретению содержит, предпочтительно, в направлении от 5' к 3':
(a) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48 (shmiR-6);
(b) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:49 (shmiR-7); и
(c) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:54 (shmiR-12).
Например, конструкт ddRNAi по изобретению может содержать, в частности, в направлении от 5'до 3':
(a) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:64 (кодирующую shmiR-6):
(b) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:65 (кодирующую shmiR-7); и
(c) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:70 (кодирующую shmiR-12).
В одном из примеров изобретение предоставляет конструкцию ddRNAi, содержащую:
(a) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48 (shmiR-6);
(b) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую shmiR или shRNA, как описано здесь; и
(c) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:141 (shmiR-24);
где нуклеиновая кислота, указанная в (b) кодирует shmiR или shRNA с эффекторной последовательностью, которая отличается от эффекторных последовательностей, кодируемых нуклеиновой кислотой, указанной в (а) и (с).
В одном из примеров изобретение предусматривает конструкцию ddRNAi, содержащую:
(a) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48 (shmiR-6):
(b) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность ДНК, кодирующую shmiR или shRNA, как описано здесь; и
(c) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:137 (shmiR-20);
где нуклеиновая кислота, указанная в (b) кодирует shmiR или shRNA с эффекторной последовательностью, которая отличается от эффекторных последовательностей, кодируемых нуклеиновой кислотой, указанной в (а) и (с).
В одном примере конструкт ddRNAi по изобретению содержит, предпочтительно, в направлении от 5' к 3':
(a) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48 (shmiR-6);
(b) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:137 (shmiR-20); и
(c) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:141 (shmiR-24).
Например, конструкт ddRNAi по изобретению может содержать, в частности, в направлении от 5' к 3':
(a) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:64 (кодирующую shmiR-6);
(b) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:149 (кодирующую shmiR-20); и
(c) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:153 (кодирующую shmiR-24).
В еще одном примере конструкт ddRNAi по изобретению может содержать по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, описанную здесь, и по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую shRNA, нацеленную на HBV, как описано здесь, где shmiR и shRNA, кодируемые конструкцией ddRNAi, содержат различные эффекторные последовательности. В соответствии с этим примером конструкт ddRNAi по изобретению может содержать, предпочтительно, в направлении от 5' к 3':
(a) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48;
(b) нуклеиновую кислоту, кодирующую shRNA, содержащую эффекторную последовательность, представленную в SEQ ID NO:39, и комплементарную последовательность эффектора, представленную в SEQ ID NO:40; и
(c) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:54.
Например, конструкт ddRNAi по изобретению может содержать, предпочтительно, в направлении от 5' к 3':
(a) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48:
(b) нуклеиновую кислоту, кодирующую shRNA, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:92; и
(c) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:54.
Например, конструкт ddRNAi по изобретению может содержать, в частности, в направлении от 5' к 3':
(a) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:64:
(b) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:108; и
(c) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:70.
В каждом из предшествующих примеров, описывающих конструкт ddRNAi по изобретению, каждая нуклеиновая кислота, описанная здесь, может быть операбельно связана с промотором. Например, конструкт ddRNAi, как описано здесь, может содержать один промотор, который операбельно связан с каждой нуклеиновой кислотой, содержащейся в нем, например, для начала экспрессии одной или нескольких shmiR и/или shRNA из конструкта ddRNAi.
В другом примере каждая нуклеиновая кислота, кодирующая shmiR или shRNA по изобретению, включенная в конструкт ddRNAi, операбельно связана с отдельным промотором.
В соответствии с примером, в котором присутствуют множество промоторов, промоторы могут быть одинаковыми или различными. Например, конструкт может содержать множество копий одного и того же промотора, где каждая копия операбельно связана с различными нуклеиновыми кислотами по изобретению. В другом примере каждый промотор, операбельно связанный с РНК по изобретению, отличается от другого. Например, в конструкте ddRNAi, кодирующей три shmiR, три нуклеиновые кислоты, кодирующие shmiR, операбельно связаны с разными промоторами.
В дополнительном примере в конструкте ddRNAi, кодирующем три или более shmiR, две (или более) нуклеиновые кислоты, кодирующие shmiR, связаны с одним и тем же промотором, и одна (или более) нуклеиновая кислота, кодирующая shmiR, связана с другим промотором.
В одном примере промотор является конститутивным промотором. Термин "конститутивный", когда он применяется в отношении промотора, означает, что промотор способен направлять транскрипцию операбельно связанной последовательности нуклеиновой кислоты в отсутствие специфического стимула (например, теплового шока, химических веществ, света и т.п.). Обычно конститутивные промоторы способны направлять экспрессию кодирующей последовательности по существу в любой клетке и в любой ткани. Промоторы, используемые для транскрипции shmiR или shRNA из нуклеиновой кислоты (кислот) по изобретению включают промоторы для убиквитина, CMV, β-актина, гистона H4, EF-1α или генов pgk, контролируемые полимеразой РНК II, или промоторные элементы, контролируемые полимеразой РНК I.
В одном примере используется промотор Pol II, такой как промотор CMV, SV40, U1, β-актина, или гибридный промотор Pol II.
В другом примере используется промотор, контролируемый полимеразой РНК III, такой как промотор U6 (U6-1, U6-8, U6-9), промотор H1, промотор 7SL, промотор Y человека (hY1, hY3, hY4 (см. Maraia, et al. Nucleic Acids Res. 22 (15): 3045-52 (1994)) и hY5 (см. Maraia, et al. Nucleic Acids Res 24 (18): 3552-59 (1994)), промотор MRP-7-2 человека, промотор аденовируса VA1, промотор тРНК человека или промотор рибосомальной РНК 5s.
Подходящие промоторы для использования в конструкте ddRNAi по изобретению описаны в патенте США № 5008468 и в патенте США № 8129510.
В одном примере промотор представляет собой промотор РНК pol III. Например, промотор представляет собой промотор U6 (например, промотор U6-1, U6-8 или U6-9). В другом примере промотор представляет собой промотор H1.
В случае, когда конструкт ddRNAi по изобретению, кодирует множество shmiR, или кодирует одну или несколько shmiR и shrRNA, как описано здесь, каждая из нуклеиновых кислот в конструкте ddRNAi операбельно связана с промотором U6, например, с отдельным промотором U6.
В одном примере промотор в конструкте представляет собой промотор U6. Например, промотор представляет собой промотор U6-1. Например, промотор представляет собой промотор U6-8. Например, промотор представляет собой промотор U6-9.
В некоторых примерах используют промоторы с различной силой. Например, использование двух или более сильных промоторов (таких как промотор типа Pol III) может, например, истощить пул доступных нуклеотидов или других клеточных компонентов, необходимых для транскрипции. Кроме того, или альтернативно, использование нескольких сильных промоторов может вызывать токсичный уровень экспрессии в клетке средств для RNAi, например, shmiR или shRNA. Таким образом, в некоторых примерах один или несколько промоторов в конструкте ddRNAi с несколькими промоторами являются более слабыми, чем другие промоторы в конструкт, или все промоторы в конструкте могут экспрессировать shmiR или shRNA по меньшей мере при максимальной скорости. Промоторы также могут быть модифицированы с использованием различных молекулярных методик, или, например, посредством модификации различных регуляторных элементов, для достижения более слабых или более сильных уровней транскрипции. Одним из способов достижения пониженной транскрипции является модификация элементов последовательности в промоторах, где такие элементы известны как контролирующие активность промотора. Например, известно, что элемент проксимальной последовательности (PSE) влияет на активность промоторов U6 человека (см. Domitrovich, et al., Nucleic Acids Res 31: 2344-2352 (2003). Замена элементов PSE, присутствующих в сильных промоторах, таких как промоторы U6-1, U6-8 или U6-9 человека, на элементом из слабого промотора, такого как промотор U6-7 человека, снижает активность гибридных промоторов U6-1, U6-8 или U6-9. Этот подход был использован в примерах, представленных здесь, однако в данной области техники известны и другие средства достижения такого результата.
Промоторы, используемые в некоторых примерах настоящего изобретения, могут быть тканеспецифическими или клеточноспецифическими. Термин "тканеспецифический", когда он применяется в отношении промотора, относится к промотору, который способен направлять селективную транскрипцию представляющей интерес нуклеиновой кислоты в специфическом типе ткани (например, ткани печени), при относительном отсутствии экспрессии этой нуклеотидной последовательности, представляющей интерес, в другом типе ткани (например, мышцах). Термин "клеточноспецифический" применяемый к промотору, относится к промотору, который способен направлять селективную транскрипцию представляющей интерес нуклеиновой кислоты в конкретном типе клеток, при относительном отсутствии экспрессии этой нуклеотидной последовательности, представляющей интерес, в другом типе клеток в той же самой ткани.
В одном примере конструкт ddRNAi по изобретению может дополнительно содержать один или несколько энхансеров для увеличения экспрессии shmiR или shRNA, кодируемых нуклеиновыми кислотами, описанными здесь. Энхансеры, подходящие для использования в примерах по изобретению, включают энхансер Apo Е НСR, энхансер CMV (Xia et al. Nucleic Acids Res 31-17 (2003)) и другие энхансеры, известные специалистам в данной области. Подходящие энхансеры для использования в конструкте ddRNAi по изобретению описаны в патенте США № 8000846.
В дополнительном примере конструкт ddRNAi по изобретению может содержать терминатор транскрипции, связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей shmiR или shRNA по изобретению. В случае конструкта ddRNAi, содержащего множество нуклеиновых кислот, описанных здесь, т.е. кодирующие множество shmiR и/или shRNA, терминаторы, связанные с каждой нуклеиновой кислотой, могут быть одинаковыми или различными. В соответствии с примером, в котором используется промотор РНК pol III, терминатор может быть непрерывным и состоящим из 4 или более, 5 или более или 6 или более остатков Т.
В некоторых примерах, где используются различные промоторы, терминаторы могут быть различными и соответствовать промотору гена, из которого получен терминатор. Такие терминаторы включают терминаторы SV40 поли А, AdV гена VA1, гена рибосомальной РНК 5S и терминаторы для т-РНК человека. Кроме того, промоторы и терминаторы могут быть смешаны и соответственно согласованы, как обычно делается с промоторами и терминаторами РНК pol II.
В одном примере комбинации промотора и терминатора, используемые для каждой нуклеиновой кислоты в конструкте ddRNAi, содержащего множество нуклеиновых кислот, являются различными для уменьшения вероятности событий рекомбинации ДНК между компонентами.
Один иллюстративный конструкт ddRNAi по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48, операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-9. Например, конструкт ddRNAi по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:64, операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-9.
Другой иллюстративный конструкт ddRNAi по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:57, операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-1. Например, конструкт ddRNAi по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:73, операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-1.
Другой иллюстративный конструкт ddRNAi по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:54, операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-8. Например, конструкт ddRNAi по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:70, операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-8.
Другой иллюстративный конструкт ddRNAi по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:49, операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-1. Например, конструкт ddRNAi по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:65, операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-1.
Другой иллюстративный конструкт ddRNAi по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:137, операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-1. Например, конструкт ddRNAi по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:149, операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-1.
Другой иллюстративный конструкт ddRNAi по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:141, операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-1. Например, конструкт ddRNAi по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:153, операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-8.
В соответствии с одним примером, в котором конструкт ddRNAi по изобретению содержит множество нуклеиновых кислот, описанных здесь, конструкт ddRNAi может содержать:
(a) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48, операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-9; и
(b) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:54, операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-8.
Например, конструкт ddRNAi может содержать:
(a) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:64, операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-9; и
(b) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:70, операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-8.
В соответствии с другим примером, в котором конструкт ddRNAi по изобретению содержит множество нуклеиновых кислот, описанных здесь, конструкт ddRNAi может содержать:
(a) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48 (shmiR-6), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-9; и
(b) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:141 (shmiR-24), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-8.
Например, конструкт ddRNAi может содержать:
(a) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:64 (кодирующую shmiR-6) операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-9; и
(b) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:153 (кодирующую shmiR-24) операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-8.
В соответствии с еще одним примером, в котором конструкт ddRNAi по изобретению содержит множество нуклеиновых кислот, описанных здесь, конструкт ddRNAi может содержать:
(a) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48 (shmiR-6), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-9; и
(b) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:137 (shmiR-20), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-1.
Например, конструкт ddRNAi может содержать:
(a) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:64 (кодирующую shmiR-6), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-9; и
(b) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:149 (кодирующую shmiR-20), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-1.
В соответствии с примером, в котором конструкт ddRNAi по изобретению содержит три нуклеиновые кислоты, описанные здесь, конструкт ddRNAi содержит:
(a) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48 (shmiR-6), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-9;
(b) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:57 (shmiR-15), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-1; и
(c) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:54 (shmiR-12), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-8.
Например, конструкт ddRNAi может содержать:
(a) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:64 (кодирующую shmiR-6) операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-9;
(b) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:73 (кодирующую shmiR-15) операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-1; и
(c) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:70 (кодирующую shmiR-12) операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-8.
В соответствии с другим примером, в котором конструкт ddRNAi по изобретению содержит три нуклеиновые кислоты, описанные здесь, конструкт ddRNAi содержит:
(a) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48 (shmiR-6), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-9;
(b) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:137 (shmiR-20), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-1; и
(c) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:141 (shmiR-24), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-8.
Например, конструкт ddRNAi может содержать:
(a) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:64 (кодирующую shmiR-6) операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-9;
(b) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:149 (кодирующую shmiR-20) операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-1; и
(c) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:153 (кодирующую shmiR-24), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-8.
В соответствии с еще одним примером, в котором конструкт ddRNAi по изобретению содержит три нуклеиновые кислоты, описанные здесь, конструкт ddRNAi содержить:
(a) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48 (shmiR-6), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-9;
(b) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:49 (shmiR-7), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-1; и
(c) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:54 (shmiR-12), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-8.
Например, конструкт ddRNAi может содержать:
(a) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:64 (кодирующую shmiR-6) операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-9;
(b) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:65 (кодирующую shmiR-7) операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-1; и
(c) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:70 (кодирующую shmiR-12), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-8.
Пример конструкта ddRNAi в соответствии с настоящим изобретением включает в направлении от 5' к 3':
(a) промотор U6-9 в положении "апстрим" (выше) нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящий из последовательности, представленной в SEQ ID NO:64;
(b) промотор U6-1 в положении "апстрим" (выше) нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности, представленной в SEQ ID NO:73; и
(c) промотор U6-8 в положении "апстрим" (выше) нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности, представленной в SEQ ID NO:70.
Пример конструкта ddRNAi в соответствии с настоящим изобретением включает в направлении от 5' к 3':
(a) U6-9 промотор в положении "апстрим" (выше) нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности, представленной в SEQ ID NO:64;
(b) промотор U6-1 в положении "апстрим" (выше) нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности, представленной в SEQ ID NO:149; и
(c) промотор U6-8 в положении "апстрим" (выше) нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности, представленной в SEQ ID NO:159.
Еще один иллюстративный конструкт ddRNAi по изобретению включает в направлении от 5' к 3':
(a) промотор U6-9 в положении "апстрим" (выше) нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящий из последовательности, представленной в SEQ ID NO:64;
(b) промотор U6-1 в положении "апстрим" (выше) нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности, представленной в SEQ ID NO:65; и
(c) промотор U6-8 в положении "апстрим" (выше) нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности, представленной в SEQ ID NO:70.
В соответствии с другим примером, где конструкт ddRNAi по изобретению содержит по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, как описано здесь, и по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую shRNA, нацеленную на HBV, как описано здесь, конструкт ddRNAi по изобретению может содержать:
(a) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48, операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-9;
(b) нуклеиновую кислоту, кодирующую shRNA, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:92, операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-1; и
(c) нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:54, операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-8.
Например, конструкт ddRNAi может содержать:
(a) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:64, операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-9;
(b) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:108, операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-1; и
(c) нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:70, операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-8.
Настоящее изобретение также предоставляет множество конструктов ddRNAi, содержащее две или более конструктов ddRNAi, каждый из которых содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR по изобретению, операбельно связанную с подходящим промотором, как описано здесь.
В одном примере множество конструктов ddRNAi содержит:
(a) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48 (shmiR-6), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-9; и
(b) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:54 (shmiR-12), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-8.
Например, множество конструктов ddRNAi может содержать:
(a) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:64 (кодирующую shmiR-6) операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-9; и
(b) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:70 (кодирующую shmiR-12), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-8.
В одном примере множество конструктов ddRNAi содержит:
(a) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48 (shmiR-6), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-9; и
(b) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:57 (shmiR-15), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-1.
Например, множество конструктов ddRNAi может содержать:
(a) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:64 (кодирующую shmiR-6), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-9; и
(b) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:73 (кодирующую shmiR-15), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-1.
В одном примере множество конструктов ddRNAi содержит:
(a) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:54 (shmiR-12), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-8; и
(b) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:57 (shmiR-15), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-1.
Например, множество конструктов ddRNAi может содержать:
(a) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:54 (shmiR-12), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-8; и
(b) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:73 (кодирующую shmiR-15), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-1.
В одном примере множество конструктов ddRNAi содержит:
(a) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48 (shmiR-6), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-9; и
(b) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:137 (shmiR-20), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-1.
Например, множество конструктов ddRNAi может содержать:
(a) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:64 (кодирующую shmiR-6) операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-9; и
(b) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:149 (кодирующую shmiR-20), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-1.
В одном примере множество конструктов ddRNAi содержит:
(a) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48 (shmiR-6), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-9; и
(b) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:141 (shmiR-24), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-8.
Например, множество конструктов ddRNAi может содержать:
(a) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:64 (кодирующую shmiR-6) операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-9; и
(b) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:153 (кодирующую shmiR-24) операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-8.
В соответствии с примером, где множество конструктов ddRNAi содержит три конструкта ddRNAi, множество конструктов ddRNAi содержит:
(a) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48 (shmiR-6), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-9;
(b) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:57 (shmiR-15), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-1; и
(c) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:54 (shmiR-12), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-8.
Например, множество конструктов ddRNAi может содержать:
(a) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:64 (кодирующую shmiR-6), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-9;
(b) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:73 (кодирующую shmiR-15), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-1; и
(c) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:70 (кодирующую shmiR-12), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-8.
В соответствии с другим примером, где множество конструктов ddRNAi содержит три конструкта ddRNAi, множество конструктов ddRNAi содержит:
(a) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48 (shmiR-6), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-9;
(b) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из гена CRT последовательность, изложенная в SEQ ID NO:49 (shmiR-7), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-1; и
(c) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:54 (shmiR-12), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-8.
Например, множество конструктов ddRNAi может содержать:
(a) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:64 (кодирующую shmiR-6), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-9;
(b) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:65 (кодирующую shmiR-7) операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-1; и
(c) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:70 (кодирующую shmiR-12), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-8.
В соответствии с другим примером множество конструктов ddRNAi в соответствии с настоящим изобретением может содержать:
(a) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48 (shmiR-6), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-9;
(b) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую shRNA, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:92 (shRNA -15), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-1; и
(c) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:54 (shmiR-12), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-8.
Например, множество конструктов ddRNAi может содержать:
(a) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:64 (кодирующую shmiR-6), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-9;
(b) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:108 (кодирующую shRNA-15), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-1; и
(c) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:70 (кодирующую shmiR-12), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-8.
В соответствии с другим примером, в котором множество конструктов ddRNAi содержит три конструкта ddRNAi, множество конструктов ddRNAi содержит:
(a) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:48 (shmiR-6), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-9;
(b) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:137 (shmiR-20), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-1; и
(c) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую shmiR, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:141 (shmiR-24), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-8.
Например, множество конструктов ddRNAi может содержать:
(a) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:64 (кодирующую shmiR-6), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-9;
(b) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:149 (кодирующую shmiR-20) операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-1; и
(c) конструкт ddRNAi, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO:153 (кодирующую shmiR-24), операбельно связанную с промотором U6, например, с промотором U6-8.
Кроме того, конструкты или каждый конструкт ddRNAi может содержать один или несколько сайтов множественного клонирования, и/или уникальные сайты рестрикции, которые расположены стратегически, так что промотор, нуклеиновая кислота, кодирующая shmiR или shRNA, и/или другие регуляторные элементы, легко удаляются или замещаются. Конструкты или каждый конструкт ddRNAi может быть собран из более мелких олигонуклеотидных компонентов с использованием стратегически расположенных сайтов рестрикции и/или комплементарных липких концов. Базовый вектор для одного подхода в соответствии с настоящим изобретением содержит плазмиды с мультилинкером, в котором все сайты являются уникальными (хотя это не является обязательным требованием). Каждый промотор последовательно вставляют между соответствующих уникальных сайтов, что приводит к получению основной кассеты с одним или несколькими промоторами, все из которых могут иметь переменную ориентацию. Затем снова отожженные пары праймеров вводят в уникальные сайты в положении "даунстрим" (ниже) от каждого из отдельных промоторов, в результате чего образуется моно-, ди- или мультиэкспрессирующий кассетный конструкт. Вставка может быть перемещена, например, в каркас AdV или каркас AAV с использованием двух уникальных сайтов рестрикции (одинаковых или различных), которая фланкируют вставку кассеты с моно-, ди- или мультиэкспрессией.
Создание конструктов или каждого конструкта может быть осуществлено с использованием любых подходящих генно-инженерных методик, известных в данной области, включая, без ограничения, стандартные методы ПЦР, синтеза олигонуклеотидов, расщепления рестрикционной эндонуклеазой, лигирования, трансформации, очистки плазмиды и секвенирования ДНК. Если конструкты или каждый конструкт представляет собой вирусный конструкт, то этот конструкт включает, например, последовательности, необходимые для упаковки конструкта ddRNAi в вирусные частицы и/или в последовательности, которые позволяют встраивать конструкт ddRNAi в геном клетки-мишени. В некоторых примерах вирусные конструкты или каждый вирусный конструкт дополнительно содержит гены, которые обеспечивают репликацию и размножение вируса, однако такие гены для обеспечения доставки. Кроме того, вирусные конструкты или каждый вирусный конструкт может содержать гены или генетические последовательности из генома любого известного организма, включенные в нативной форме или в модифицированном виде. Например, вирусный конструкт может содержать последовательности, полезные для репликации конструкта в бактериях.
Конструкты или каждый конструкт может содержать также дополнительные генетические элементы. Типы элементов, которые могут быть включены в конструкт, не ограничиваются каким-либо образом, и они могут быть выбраны специалистом в данной области техники. Например, дополнительные генетические элементы могут включать репортерный ген, такой как один или несколько генов флуоресцирующего маркерного белка, такого как GFP или RFP; легко анализируемый фермент, такой как бета-галактозидаза, люцифераза, бета-глюкуронидаза, хлорамфеникол-ацетилтрансфераза или секретируемая эмбриональная щелочная фосфатаза; или белки, для которых легко доступны иммуноанализы, такие как гормоны или цитокины.
Другие генетические элементы, которые могут найти применение в вариантах осуществления настоящего изобретения, включают такие, которые кодируют белки, обеспечивающие селективное преимущество роста клеток, таких как аденозиндеаминаза, аминогликозидфосфотрансфераза, дигидрофолатредуктаза, гигромицин-В-фосфотрансфераза, ген лекарственной устойчивости, или такие гены, которые кодируют белки, обладающие способностью биосинтеза, отсутствующие у ауксотрофов. Если репортерный ген включен в конструкты или в каждый конструкт, то может быть включена последовательность внутреннего сайта связывания рибосом (IRES). В одном примере дополнительные генетические элементы операбельно связаны и контролируются независимым промотором/энхансером. Кроме того, может быть использован подходящий источник репликации для размножения конструкта в бактериях. Последовательность начала репликации (ориджин) обычно отделяют от конструкта ddRNAi и других генетических последовательностей. Такое начало репликации известно в данной области и включает в себя pUC, ColE1, 2-микронный или SV40 ориджины репликации.
Экспрессирующие векторы
В одном из примеров конструкт ddRNAi по изобретению включен в экспрессрующий вектор.
В одном из примеров экспрессрующий вектор представляет собой плазмиду, например, как известно в данной области техники. В одном из примеров подходящим плазмидным экспрессрующим вектором является вектор pSsh, например, с промотором U6 с проксимальной последовательностью элемента 7 (PSE7).
В одном из примеров экспрессрующий вектор представляет собой миникольцевую ДНК. Миникольцевая ДНК описана в патентной публикации США № 2004/0214329. Миникольцевая ДНК применима для достижения устойчивых высоких уровней транскрипции нуклеиновой кислоты. Кольцевые векторы отличаются отсутствием экспрессионного сайленсинга бактериальных последовательностей. Например, миникольцевые векторы отличаются от бактериальных плазмидных векторов тем, что они лишены начала репликации, и отсутствием маркеров селекции лекарственных средств, обычно встречающихся в бактериальных плазмидах, например, бета-лактамазы, tet и т.п. Следовательно, миникольцевая ДНК, являясь меньшей по размеру, обеспечивает более эффективную доставку.
В одном примере экспрессирующий вектор представляет собой вирусный вектор.
Для доставки ddRNAi по изобретению может быть использован вирусный вектор на основе любого подходящего вируса. Кроме того, могут быть использованы гибридные вирусные системы. Выбор системы вирусной доставки будет зависеть от различных параметров, таких как ткань, предназначенная для доставки, эффективности трансдукции системы, патогенности, иммунологических и токсических проблем, и т.п.
Обычно используемые классы вирусных систем, применяемые в генной терапии, могут быть разделены на две группы, в соответствии с их способностью интегрировать их геномы в клеточный хроматин хозяина (онкоретровирусы и лентивирусы) или оставаться в основном как внехромосомальные эписомы (аденоассоциированный вирус, аденовирусы и герпесвирусы). В одном примере вирусный вектор по изобретению интегрируется в хроматин клетки-хозяина. В другом примере вирусный вектор по изобретению сохраняется в ядре клетки-хозяина как внехромосомальная эписома.
В одном примере вирусным вектором является аденовирусный вектор (AdV). Аденовирусы представляют собой двухцепочечные, безоболочечные ДНК-вирусы среднего размера с линейными геномами, размер которых находятся в пределах от 26 до 48 т.п.н. Аденовирусы получают доступ к клетке-мишени путем рецептор-опосредованного связывания и интернализации, проникая в ядро как непролиферирующих, так и делящихся клеток.
Аденовирусы в значительной степени зависят от клетки-хозяина для выживания и репликации, и способны к репликации в ядре клеток позвоночных, используя механизм репликации хозяина.
В одном примере вирусный вектор принадлежит к семейству Parvoviridae. Parvoviridae представляет собой семейство небольших одноцепочечных безоболочечных ДНК-вирусов с геномами длиной приблизительно 5000 нуклеотидов. Среди членов семейства находится и аденоассоциированный вирус (AAV). В одном примере вирусным вектором по изобретению является AAV. AAV является зависимым парвовирусом, который обычно требует совместного инфицирования с другим вирусом (обычно аденовирусом или герпесвирусом), чтобы инициировать и поддерживать продуктивный инфекционный цикл. В отсутствие такого хелперного вируса, AAV способен к инфицированию или трансдукции клетки-мишени посредством рецептор-опосредованного связывания и интернализации, проникая в ядро как непролиферирующих, так и делящихся клеток. Поскольку в отсутствие хелперного вируса потомство вируса AAV не продуцируется после инфицирования, то степень трансдукции ограничена только исходными клетками, инфицированными вирусом. Это свойство делает AAV желательным вектором для настоящего изобретения.
Кроме того, AAV, в отличие от ретровируса, аденовируса и вируса простого герпеса, по-видимому, не обладает патогенностью и токсичностью человека (Kау, et al. Nature. 424: 251 (2003)). Так как геном обычно кодирует только два гена, то не удивительно, что AAV, в качестве средства доставки, ограничивается объемом упаковки одноцепочечных последовательностей размером 4,5 тысяч оснований (т.о.). Однако, хотя это ограничение размера может ограничивать гены, которые могут быть доставлены для заместительной генной терапии, оно не оказывает неблагоприятного воздействия на упаковку и экспрессию более коротких последовательностей, таких как shmiR и shRNA.
Другая система доставки вируса, применимая для конструкций ddRNAi по изобретению, представляет собой систему, основанную на вирусах семейства Retroviridae. Ретровирусы содержат одноцепочечные РНК вирусы животных, которые отличаются двумя уникальными признаками. Во-первых, геном ретровируса является диплоидным, состоящим из двух копий РНК. Во-вторых, эта РНК транскрибируется с помощью обратной транскриптазы, связанной с вирионом, в двухцепочечную ДНК. Эта двухцепочечная ДНК или провирус может затем интегрироваться в геном хозяина и он будет передаваться от родительской клетки в клетки потомства в качестве стабильно интегрированного компонента генома хозяина.
В некоторых примерах вирусный вектор представляет собой лентивирус. Лентивирусные векторы часто являются псевдотипированными с гликопротеином вируса везикулярного стеатита (VSV-G), и они были получены из вируса иммунодефицита человека (ВИЧ; HIV); вируса меди-висна, который вызывает энцефалит (visna) или пневмонию овец; вируса инфекционной анемии лошадей (EIAV), которая вызывает аутоиммунную гемолитическую анемию и энцефалопатию у лошадей; вируса иммунодефицита кошек (FIV), который вызывает иммунодефицит у кошек ; вируса крупного рогатого скота (BIV), который вызывает лимфоаденопатию и лимфоцитоз у крупного рогатого скота; и вируса иммунодефицита обезьян (SIV), который вызывает иммунный дефицит и энцефалопатию у приматов, отличных от человека. Векторы, которые основаны на HIV, обычно сохраняют <5% родительского генома, и <25% генома встраивают в упаковывающие конструкции, что сводит к минимуму возможность генерирования обратного репликационно-компетентного HIV. Биобезопасность была дополнительно повышена за счет разработки самоинактивирующихся векторов, которые содержат делеции регуляторных элементов в последовательности, расположенной ниже по ходу транскрипции, исключением транскрипции упаковочного сигнала, который требуется для мобилизации вектора. Одним из главных преимуществ использования лентивирусных векторов является то, что перенос генов является постоянным для большинства тканей или типов клеток, даже после деления трансдуцированной клетки.
Конструкт на основе лентивируса, используемый для экспрессии shmiR и/или shRNA из нуклеиновых кислот и конструктов ddRKi по изобретению, содержит последовательности из 5'- и 3'- концевых повторов (LTR) лентивируса. В одном примере вирусный конструкт содержит инактивированный или самоинактивирующийся 3'-LTR из лентивируса. Самоинактивирующийся 3'-LTR может быть получен любым способом, известным в данной области. Например, элемент U3 в 3'-LTR содержит делецию в энхансерной последовательности, например, в сайтах бокса TATA, Sp1 и NF-каппа B. В результате самоинактивации 3'-LTR, провирус, который интегрирован в геном хозяина, будет содержать инактивированный 5'-LTR. Последовательности LTR могут представлять собой последовательности LTR из любого лентивируса любого вида. Конструкт на основе лентивирусов также может включать последовательности генов MMMLV или MSCV, RSV или генов млекопитающих. Кроме того, в вирусном конструкте последовательность U3 из лентивирусного 5'-LTR может быть заменена промоторной последовательностью. Это может увеличить титр вируса, восстановленного из линии упаковывающих клеток. Также может быть включена энхансерная последовательность.
Другие вирусные или невирусные системы, известные специалистам в данной области, могут быть использованы для доставки ddRNAi или нуклеиновой кислоты по изобретению в целевые клетки-мишени, включая, но без ограничения, ген-делетированные аденовирусные транспозонные векторы (см. Yant, et al. Nature Biotech. 20: 999-1004); системы, полученные из вируса синдбис или вируса леса Семлики (см. Perri, et al. J Virol. 74 (20): 9802-07 (2002)); системы, полученные из вируса ньюкаслской болезни или вируса сендай.
Тестирование нуклеиновых кислот и конструктов ddRNAi по изобретению
Модели на основе клеточных культур
HBV не инфицирует клетки в культуре. Однако трансфекция ДНК HBV (как "голова-хвост" димера или в виде "перекрытия" генома >100%) в гепатоцитах HuH7 или HepG2, приводит к экспрессии вирусного гена и продуцирование вирионов HBV, высвобождаемых в среду. Примером такой клеточной линии является HepG2.2.15, которая представляет собой сублинию клеток линии клеток гепатоцеллюлярной карциномы HepG2, которая устойчиво удерживает полный геном HBV (серотип ayw, генотип D). HepG2.2.15 экспрессирует все вирусные РНК и белки HBV, продуцируют вирусные геномы и секретирует вирусоподобные частицы. Как показано в здесь, активность shmiR, экспрессированная из конструкта нуклеиновой кислоты или ddRNAi по изобретению, может быть определена путем введения в клетку нуклеиновой кислоты или конструкта ddRNAi по изобретению в клетку, с последующим измерением уровеня экспрессии РНК или белка, кодируемого геном HBV. Экспрессия внутриклеточного гена HBV может быть оценена с помощью анализа Taqman™, или с помощью анализа ПЦР в реальном времени для РНК HBV, или с помощью метода ELISA для белка HBV. Внеклеточный вирус может быть проанализирован либо с помощью ПЦР для ДНК, либо методом ELISA для белка. Для поверхностного антигена HBV и белка ядра можно использовать коммерчески доступные антитела. В данной области техники известны различные средства и методы для нормализации различий в эффективности трансфекции и для извлечения проб. Недавние достижения в системах культивирования клеток с использованием первичных гепатоцитов человека являются перспективными для определения активности лекарственных средств против HBV.
shmiR и/или shRNA, экспрессированные из конструкта нуклеиновой кислоты или ddRNAi по изобретению, которые снижают экспрессию РНК или белка, кодируемого геном HBV, по меньшей мере на 50% по сравнению со случаем, когда отсутствует нуклеиновая кислота или конструкт ddRNAi по изобретению, считаются полезными в способе по изобретению.
Модели на животных
Существует несколько моделей на небольших животных, доступных для изучения репликации HBV. Одним из способов является трансплантация инфицированной HBV ткани печени облученным мышам. Виремию (о чем свидетельствует измерение ДНК HBV с помощью ПЦР) обнаруживают через 8 дней после трансплантации, и наблюдают пики значений в течение 18-25 дней (Ilan et al., 1999, Hepatology, 29, 553-562).
Трансгенные мыши, экспрессирующие HBV, также используются в качестве модели для оценки потенциальных противовирусных средств. ДНК HBV обнаруживается как в печени, так и в сыворотке крови трансгенных мышей (Morrey et al., Antiviral Res. 42, 97-108, 1999).
Также используют дополнительную модель на голых мышах с подкожными опухолями клеток Hep G2, трансфицированных HBV. Опухоли развиваются примерно через 2 недели после инокуляции и экспрессируют поверхностные и коровые антигены HBV. ДНК HBV и поверхностный антиген также обнаруживаются в системе кровообращения у мышей с опухолью (Yao et al., J Viral Hepay. 3, 19-22, 1996).
Дополнительной моделью являются модель на мышах PXB, как описано здесь, которая представляет собой химерную группу мышей, где иммунодефицитные мыши имеют заболевание печени (uPA/SCID), с трансплантированными гепатоцитами человека. Поскольку у мышей uPA/SCID наблюдается значительная токсичность в печени, трансплантация здоровых клеток человека может привести к к здоровой и операбельной печени у мышей, в которой от 70% до 90% составляют гепатоциты человека. Поскольку мыши PXB демонстрируют нормальные гистологические структуры печени и проявляют многие признаки, характерные для клеток печени человека, мыши могут поддерживать активную инфекцию HBV в химерных тканях печени.
Дополнительной моделью является использование модели Quantum B, которая представляет собой трехмерную платформу для культивирования клеток, в которой гепатоциты человека подаются в модель, где происходит сборка, имитирующая архитектуру и физиологию печени человека. Из-за того, что модель состоит только из гепатоцитов печени, считается, что это первая стабильная модель, обеспечивающая в течение длительного времени полный жизненный цикл вируса гепатита В человека, и она позволяет имитировать некоторые критические признаки жизненного цикла инфекции HBV.
Любая из вышеуказанных моделей на животных может быть использована для определения эффективности конструктов нуклеиновой кислоты или ddRNAi по изобретению при лечении инфекции HBV или для снижения тяжести заболевания.
Носители
В некоторых примерах одна или несколько нуклеиновых кислот, конструкты ddRNAi или экспресирующие векторы по изобретению представлены в составе композиции с носителем.
В некоторых примерах носитель представляет собой носитель на основе липидов, катионный липид или комплекс нуклеиновой кислоты с липосомами, липосому, мицеллу, виросому, липидную наночастицу или их смесь.
В некоторых примерах носитель представляет собой носитель на основе полимера, такой как комплекс катионный полимер-нуклеиновая кислота.
В другом примере носитель представляет собой носитель на основе циклодекстрина, такой как комплекс циклодекстрин-полимер-нуклеиновая кислота.
В следующем примере носитель представляет собой носитель на белковой основе, такой как комплекс катионный пептид-нуклеиновая кислота.
В другом примере носитель представляет собой липидную наночастицу. Примеры наночастиц описаны, например, в патенте США № 7514099.
В некоторых примерах одна или несколько нуклеиновых кислот, конструктов ddRNAi или экспресирующих векторов по изобретению включены в состав композиции с липидным наночастицами, включающей: содержащий катионный липид/холестерин/PEG-C-DMA/DSPC (например, в соотношении: 40/48/2/10), катионный липид/холестерин/PEG-C-DMA/DSPC (например, в соотношении: 40/48/2/10), или катионный липид/холестерин/PEGГ-DMG (например, в соотношении: 60/38/2). В некоторых примерах катионный липид представляет собой октил-CL в DMA, DL в DMA, L-278, DLinKC2DMA или MC3.
В другом примере одна или несколько нуклеиновых кислот, конструктов ddRNAi или экспресирующих векторов по изобретению включены в состав препарата с любым из катионных липидов. Составы таких препаратов описаны в WO 2010/021865, WO 2010/080724, WO 2010/105209 или WO 2011/02246060.
В другом примере одна или несколько нуклеиновых кислот, конструктов ddRNAi или экспресирующих векторов по изобретению конъюгированы с другим соединением или представлены в виде комплекса с другим соединением, например, для облегчения доставки РНК, ddRNAi или экспрессирующего конструкта. Неограничивающие примеры таких конъюгатов описаны в US 2008/0152661 и US 2004/0162260 (например, CDM-LBA, CDM-Pip-LBA, CDM-PEG, CDM-NAG и т.п.).
В другом примере полиэтиленгликоль (PEG) ковалентно связан с конструктом нуклеиновой кислоты, ddRNAi или экспрессирующего конструкта по изобретению. Присоединенный PEG может иметь любую молекулярную массу, например, от примерно 100 до примерно 50000 дальтон (Да).
В еще одном примере одна или более нуклеиновых кислот, конструктов ddRNAi или экспресирующих векторов представлены в составе препарата с носителем в виде поверхностно-модифицированных липосом, содержащих поли(этиленгликоль)-липиды (PEG-модифицированные или длительно циркулирующие липосомы, или стеалильные липосомы), как описано, например, в WO 96/10391, WO 96/10390 или WO 96/10392.
В некоторых примерах нуклеиновые кислоты, конструкты ddRNAi или экспрессионные конструкты по изобретению также могут быть представлены в составе препарата, где они образует комплекс с полиэтиленимином или его производным, таким как полиэтиленимин-полиэтиленгликоль-N-ацетилгалактозамин (PEI-PEG-GAL) или с производными полиэтиленимин-полиэтиленгликоль-три-N-ацетилгалактозамина (PEI-PEG-triGAL). В одном примере РНК, ddRNAi или экспрессирующий конструкт по изобретению представлены в составе препарата в форме, как описано в публикации патентной заявки США 2003/0077829.
В других примерах одна или несколько нуклеиновых кислот, конструктов ddRNAi или экспрессирующих векторов по изобретению представлены в виде комплекса с мембраноразрушающими агентами, которые описаны в публикации патентной заявки США № 2001/000766.
Другие носители включают циклодекстрины (см. например, Gonzalez et al., 1999, Bioconjugate Chem. 10, 1068-1074; или WO 03/46185), поли(молочная-гликолевая)кислота (PLGA) и микросферы PLCA (см. например, US 2002/130430).
Композиции и способы лечения
Одна или более нуклеиновых кислот, конструктов ddRNAi или экспрессирующих векторов по изобретению могут быть использованы в композициях для профилактики или лечения инфекции HBV. Терапевтические композиции по изобретению могут использоваться отдельно или в комбинации с одним или более материалами, включая другие противовирусные агенты. В настоящее время энтекавир, тенофовир, ламивудин, адефовир дипивоксил и интерферон альфа (например, пэгилированный интерферон альфа) одобрены для лечения HBV. Поскольку нуклеиновые кислоты, конструкты ddRNAi или экспрессирующие векторы по изобретению действуют против HBV посредством другого механизма, по которому действуют другие одобренные лекарства, то ожидается, что комбинированная терапия с использованием средств по изобретению и других противовирусных средств значительно повысит эффективность терапии, в то же время существенно снижая развитие лекарственной устойчивости, например, развитие резистентности к ламивудину, что является основной проблемой при длительном лечении ламивудином.
Желательно, чтобы композиции содержали материалы, которые повышают биологическую стабильность нуклеиновых кислот, конструктов ddRNAi или экспрессирующих векторов по изобретению и/или материалы, которые повышают способность композиций селективно проникать в гепатоциты. Терапевтические композиции по изобретению можно вводить в фармацевтически приемлемых носителях (например, в физиологическом солевом растворе), которые выбирают на основе режима и путей введения, а также с учетом стандартной фармацевтической практики. Специалист в данной области может легко приготовить фармацевтическую композицию, которая содержит одну или несколько нуклеиновых кислот, конструктов ddRNAi или экспресирующих векторов по изобретению. В некоторых случаях используют изотонический препарат. Обычные добавки для изотоничности включают хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. В некоторых случаях предпочтительны изотонические растворы, такие как забуференный фосфатом физиологический раствор. Стабилизаторы включают желатин и альбумин. В некоторых примерах к композиции добавляют средство для сужения сосудов. Композиции по изобретению являются стерильными и апирогенными. Подходящие фармацевтические носители, а также фармацевтические добавки, используемые в фармацевтических составах, описаны в справочнике Remington: The Science and Practice of Pharmacy (ранее - Remington's Pharmaceutical Sciences), Mack Publishing, который является стандартным справочником в этой области, а также те, котрые описаны в Фармакопеи США и национальных фармакопеях (USP/NF).
Пути введения включают, но без ограничений, внутримышечное, внутрибрюшинное, интрадермальное, подкожное, внутривенное, интратекальное, внутриартериальное, внутриглазное и пероральное, а также трансдермальное или ингаляционное, или путем введения суппозитория. Примеры способов введения включают внутривенное, внутримышечное, пероральное, внутрибрюшинное, интрадермальное, внутриартериальное и подкожное введение. Направленную трансфекцию гепатоцитов in vivo для доставки нуклеиновых кислот, конструктов ddRNAi или экспрессирующих векторов по изобретению можно осуществлять путем внутривенной инъекции композиции, содержащей одну или несколько нуклеиновых кислот, конструктов ddRNAi или экспрессирующих векторов, как описано здесь, в виде комплекса со смесью (например, в соотношении 35%/65%) лактозилспермина (моно- или трилактозилированного) и холестерилспермина (содержащего спермин и ДНК в соотношении 0,8). Такие композиции полезны для фармацевтических применений, и они могут быть легко приготовлены в подходящем стерильном, непирогенном носителе, например в буферированном солевом растворе для инъекций, для парентерального введения, например, для внутривенного введения (включая внутривенную инфузию), внутримышечного введения, подкожного введения и для внутрибрюшинного введения. В некоторых композицияз нуклеиновая кислота, конструкт ddRNAi или экспрессрующий вектор по изобретению находится в комплексе только с эндосоматическим спермином, таким как холестерил спермин, без нацеливающего спермина; некоторые пути введения, такие как внутрибрюшинное введение или инфузия, могут обеспечить эффективную доставку нуклеиновой кислоты, конструкции ddRNAi или экспрессирующего вектора, и их трансфекцию в печень.
Интраперитонеальное введение (например, внутрибрюшинная инъекция с направленным воздействием ультразвука) стерильной фармацевтической композиции, содержащей одну или несколько нуклеиновых кислот, конструктов ddRNAi или экспрессирующих векторов по изобретению, в специально пприготовленном носителе для доставки может представлять собой предпочтительный путь доставки для стимуляции поглощения клетками печени, включая гепатоциты.
Объем, концентрация и состав фармацевтической композиции, а также режим дозирования могут быть специально подобраны для максимизирования доставку в клетки, в то же время сводя к минимуму токсичность, например, воспалительный ответ. В частности, относительно большие объемы (5, 10, 20, 50 мл или более) с соответствующими низкими концентрациями активных ингредиентов, а также включение противовоспалительного соединения, такого как кортикостероид, могут быть использованы, если это желательно.
У инфицированных HBV индивидуумов ожидается, что нуклеиновая кислота, конструкт ddRNAi или экспрессрующий вектор по изобретению полезны в качестве предварительного лечения в сочетании с протоколами терапевтической вакцинации, для усиления иммунитета против вируса. Также предполагается, что нуклеиновые кислоты, конструкты ddRNAi или экспрессирующие векторы по изобретению полезны для профилактики в режиме периодических введений пациентам, которые из-за профессиональных или других причин имеют высокий риск получения инфекции HBV.
Наборы
Настоящее изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, конструктам ddRNAi и/или экспрессирующим векторам по изобретению, представленным в составе набора. Набор может содержать контейнер. Набор обычно содержит одну или несколько нуклеиновых кислот, конструктов ddRNAi или экспрессирующих векторов по изобретению с инструкциями для его введения. В некоторых примерах набор содержит более чем одну нуклеиновую кислоту, конструкт ddRNAi или экспрессирующий вектор по изобретению и/или другую нуклеиновую кислоту, конструкт ddRNAi или экспрессрующий вектор по изобретению. В некоторых примерах набор содержит более чем одну нуклеиновую кислоту, конструкт ddRNAi или экспрессирующий вектор по изобретению, упакованные вместе с другим соединением для лечения инфекции HBV (как описано здесь). Например, другой терапевтический агент, известный для лечения инфекции HBV, может быть выбран из энтекавира, тенофовира, ламивудина, адефовира и/или пэгилированного интерферона.
Примеры
Пример 1. Получение экспрессионных конструктов ddRNAi, экспрессирующих shmiR
Для получения конструктов ddRNAi, способных экспрессировать единичные shmiR по изобретению, синтезируют последовательности ДНК, кодирующие shmiR, и клонируют в положении "даунстрим" (т.е. ниже) промотора U6 (например, U6-1, U6-8 или U6-9). Эти конструкты ddRNAi обозначены как HBV-shmiR1 - HBV-shmiR16, соответственно.
Также получают конструкты ddRNAi, способные экспрессировать единичные shRNA, которые соответствуют shmiR по изобретению. Вкратце, последовательности ДНК, кодирующие shRNA, синтезируют и клонируют ниже промотора U6 (например, U6-1, U6-8 или U6-9) с проксимальной последовательностью элемента 7 (PSE7). Эти конструкты ddRNAi обозначены как HBV-shRNA1 - HBV-shRNA16, соответственно.
Кроме того, получают конструкты ddRNAi, содержащие три кассеты экспрессии shmiR HBV и способные экспрессировать три shmiR по изобретению. Синтезированный первый тройной конструкт ddRNAi, экспрессирующий три shmiR HBV (обозначенный как HBV-shmiRх3-v1), содержит в направлении от 5' к 3', последовательность ДНК, кодирующую промотор U6-9, shmiR6 (SEQ ID NO:64), промотор U6-1, shmi15 (SEQ ID NO:73), промотор U6-8 и shmiR12 (SEQ ID NO:70). Также синтезирован второй тройной конструкт ddRNAi (обозначенный как HBV-shmiRх3-v2), содержащий в направлении от 5' к 3' последовательности ДНК, кодирующие промотор U6-9, shmiR6 (SEQ ID NO:64), промотор U6-1, shmiR7 (SEQ ID NO:65), промотор U6-8 и shmiR12 (SEQ ID NO:70).
Также получен конструкт ddRNAi, содержащий тройную экспрессирующую кассету shRNA HBV, который способен экспрессировать три shrRNA, соответствующие трем shmiR, экспрессированным конструктом, обозначенным как HBV-shmiRх3-v1. В частности, тройной конструкт HBV-shRNA-ddRNAi (обозначенный как HBV-shRNAх3-v1)содержит в направлении от 5' к 3' последовательности ДНК, кодирующие промотор U6-9, PSE7 и shRNA6 (SEQ ID NO:99), промотор U6-1, PSE7 и shrRNA15 (SEQ ID NO:108), промотор U6-8, PSE7 и shrRNA12 (SEQ ID NO:105).
Пример 2. Активность экспрессионных конструктов ddRNAi в с двойном анализе репортерного гена люциферазы
Эффективность конструктов ddRNAi, экспрессирующих shmiR или shRNA по изобретению, в отношении нокдауна транскриптов HBV определяли с использованием анализа репортерного гена люциферазы в клетках HEK293.
Репортерные плазмидные конструкты на основе репортерного вектора люциферазы pGL3 конструировали для последовательностей эффектора и комплементарных последовательностей эффектора для каждой shmiR и shRNA по изобретению. Репортерные конструкты люциферазы, например репортерный конструкт люциферазы свелячков, получали путем введения соответствующей эффекторной последовательности эффектора или комплементарной последовательности эффектора shmiR или shRNA (по необходимости) с фланкирующими последовательностями 20bp на каждом конце в векторе pGL3-control (Promega, Madison, WI). Вставки субклонируют с использованием сайтов рестрикции FseI и XbaI, расположенных после репортерного гена люциферазы.
2
4
Двойной анализ репортерного гена люциферазы проводили в клетках HEK293 (из АТСС). Клетки HEK293 культивировали в среде DMEM, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки, 2 мМ глютамина, пенициллин (100 ед/мл)) и стрептомицин (100 мкг/мл), при 37°С в инкубаторе с увлажнением и с 5% CO. Клетки НЕК293 высевали с плотностью 2×10 клеток на лунку в 96-луночный культуральный планшет за один день до трансфекции.
Синтезировали экспрессирующие конструкты ddRNAi, описанные в примере 1 (т.е. конструкты ddRNAi, обозначенные как HBV-shmiR1 - HBV-shmiR16, HBV-shmiRx3-v1 и HBV-shmiRx3-v2) и вставляли в соответствующий плазмидный вектор, например, вектор pSsh, необязательно с проксимальный последовательностью элемента 7 (PSE7) для конструктов, экспрессирующих shRNA.
Векторы экспрессии, содержащие экспрессионные конструкты ddRNAi, котрансфицировали в клетки HEK293 с люциферазным репортерным конструктом, например, конструктом репортерного гена люциферазы светлячка, экспрессировали эффекторные последовательности или комплементарные последовательности эффектора, соответственно для shmiR или shRNA (в зависимости от обстоятельств), при соотношении 10:1 (экспрессионный конструкт ddRNAi: конструкт репортерного гена люциферазы) с использованием 0,3 мкл липофектамина (реагент Lipofectamine 2000; Life Technologies, Carlsbad, CA) в соответствии с инструкциями изготовителя. Клетки также трансфицировали 1 нг конструкта репортерного гена люциферазы Renilla (для контроля трансфекции). Через 48 часов после трансфекции, клеточные лизаты собирали и анализировали с использованием системы двойного анализа репортерного гена люциферазы (Promega, Madison, WI). Отношения активности люциферазы светлячка/люциферазы Renilla определяли для каждой трансфекции. Процент ингибирования экспрессии репортера вычисляли относительно отрицательного контроля, например, конструкта, экспрессирующего случайные ненацеливающие последовательности. Эксперименты проводили с повторностями.
Затем определяли способность конструктов ddRNAi экспрессировать shmiR по изобретению и ингибировать экспрессию белка люциферазы из соответствующего конструкта репортерного гена люциферазы.
Кроме того, сравнивали активность трех shmiR, полученных из тройного конструкта ddRNAi, экспрессирующего три shmiR (т.е. конструкт ddRNAi, экспрессирующий shmiR6, shmiR15 и shmiR12, соответственно) с активностью shRNA, в отношении предпочтения цепей. Данные, представленные на фигуре 1А, показывают, что shmiR проявляют более высокую активность в отношении антисмысловых (эффекторных) цепей, по сравнению с соответствующими shRNA.
Пример 3. Гиперфункциональные свойства конструктов ddRNAi, экспрессирующих shmiR
Гиперфункциональные свойства трех конструктов ddRNAi (т.е. конструктов ddRNAi, экспрессирующих shmiR6, shmiR15 и shmiR12, соответственно) оценивали в клетках HEK293.
Для каждого из тройных экспрессирующих конструктов ddRNAi, клетки НЕК293 в лунках планшетов трансфицировали с использованием (i) 100 нг, 50 нг, 20 нг, 5 нг, 1,6 нг, 0,55 нг, 0,19 нг, 0,06 нг или 0,033 нг соответствующего экспрессирующего конструкта ddRNAi, (ii) различных количеств плазмиды-наполнителя для доведения конечного содержания ДНК до 100 нг, и (iii) 10 нг соответствующего репортерного конструкта люциферазы светлячка, с использованием 0,3 мкл липофектамина (Lipofectamine 2000; Life Technologies, Carlsbad, CA), согласно инструкциям производителя. Клетки также трансфицировали с использованием 1 нг репортерного конструкта люциферазы Renilla (служащего в качестве контроля загрузки). Через 48 часов после трансфекции собирали клеточные лизаты и анализировали с использованием системы анализа репортерного гена люциферазы (Promega, Madison, WI). Для каждой лунки определяли соотношения активности люциферазы светлячка/Renilla, и рассчитывали эффективность ингибирования экспрессии у экспрессирующих конструктов ddRNAi.
Определяли активность конструктов, экспрессирующих shmiR6, shmiR15 или shmiR12 (SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:73 или SEQ ID NO:70 соответственно), и сравнивали непосредственно с соответствующими конструктами, экспрессирующими shRNA6, shRNA15 и shRNA12 (SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:108 и SEQ ID NO:105, соответственно), результаты показаны на фигуре 1. В этих экспериментальных условиях конструкты, экспрессирующие shmiR, были более эффективны, чем соответствующие конструкты, экспрессирующие shRNA, (фиг. 1).
Относительная активность конструктов была дополнительно охарактеризована с использованием анализов на гиперфункциональность. Гиперфункциональные анализы выполняли путем титрования количества конструктов, экспрессирующих shmiR (от 100 нг до 0,02 нг) котрансфицированных с фиксированным количеством репортера люциферазы светлячка. Эти данные (Фиг. 1B-1D) показывают, что все три конструкта ddRNAi, экспрессирующих shmiR, были высокоактивными при низких концентрациях по сравнению с соответствующими конструктами, экспрессирующими shRNA, что свидетельствует о повышенной биологической активности.
Пример 4. Конструирование и тестирование конструктов ddRNAi, экспрессирующих варианты shmiR
Для улучшения активности по предпочтению цепей, получали shmiR-12 (SEQ ID NO:54) и shmiR-15 (SEQ ID NO:57), а также варианты shmiR-12 и shmiR-15 путем сдвига комплементарной последовательности эффектора (смысловая цепь) на 1 или 2 нуклеотида в направлении "апстрим" или в положении "даунстрим". Варианты shmiR-15 обозначены как shmiR-17 - shmiR-22 (соответственно: SEQ ID NO:134 - SEQ ID NO:139), и варианты shmiR-12 обозначены как shmiR-23 - shmiR-28 (соответственно: SEQ ID NO:140 - SEQ ID NO:145).
Также оценивали влияние добавления нуклеотида 'A' на 3'-конец или нуклеотида 'G' на 5'-конец смысловой последовтельности на термодинамику вариантов shmiR. Идея состояла в том, чтобы обеспечить предпочтительную нагрузку на антисмысловую (или эффекторную) цепь, которая должна быть предпочтительно нагружена в комплексе RISC для оценки функциональной активности RNAi.
Для вариантов shmiR-12 (т.е. shmiR-23 - shmiR-28), все шесть вариантов shmiR продемонстрировали лучшее предпочтение цепей по сравнению с исходной shmiR-12 (см. Фиг. 2А). Для вариантов shmiR-15 (т.е. shmiR-17 - shmiR-22) четыре из шести вариантов shmiR лучшее предпочтение цепей по сравнению с исходной shmiR-15 (Фиг. 2В). На основании этих результатов был разработан дополнительный тройной конструкт ddRNAi для HBV shmiR путем замены последовательностей в HBV-shmiRх3-v1, кодирующих shmiR-12 и shmiR-15, на последовательности, кодирующие shmiR-24 (SEQ ID NO:153) и shmiR-20 (SEQ ID NO:149), соответственно, с получением третьей тройного конструкта ddRNAi для HBV shmiR (обозначенного как HBV-shmiRх3-v3).
Пример 5. Нокдаун транскриптов HBV в клетках HepG2.2.15 с использованием векторов AdV, несущих shmiR HBV
Моно- и тройные векторы AdV, несущие shmiR HBV, (далее - векторы AdV shmiR HBV) получали путем субклонирования экспрессионных конструктов ddRNAi, описанных в примере 1 (т.е. конструкты ddRNAi, обозначенные как HBV-shmiR1 - HBV-shmiR16, HBV-shmiRх3-v1 и HBV-shmiRх3-v2) в аденовирус (AdV), сконструированный для продуцирования вируса (Vector Biolabs, Malvern PA)
Для оценки эффективности векторов AdV, несущих shmiR, описанных здесь, в отношении "нокдауна" экспрессии генов HBV, клетки HepG2.2.15 инфицировали векторами AdV, несущими shmiR по изобретению, и анализировали экспрессию гена HBV.
2
Клетки HepG2.2.15 представляет собой сублинию клеток линии клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека HepG2, которые стабильно удерживают полный геном HBV (серотип ayw, генотип D). Клетки HepG2.2.15 экспрессируют все вирусные РНК и белки HBV, продуцируют вирусные геномы и секретируют вирусоподобные частицы. Клетки HepG2.2.15 поддерживали в среде RPMI1640, с добавлением 4% фетальной телячьей сыворотки, 4 мМ глутамина, пенициллина (100 ед/мл) и стрептомицина (100 мкг/мл), и размножали в инкубаторе при 37°С в атмосфере 5% CO.
10
2
Клетки HepG2.2.15 инфицировали векторами AdV для shmiR HBV в клеточной суспензии и культивировали в многолуночных планшетах. Каждая лунка содержала суспензию, состоящую из приблизительно 1,0×10 клеток HepG2.2.15 и одного из моно- или тройных векторов AdV shmiR по изобретению при следующих множественностях заражения (MOI): 6, 15, 30, 60, 90 или 120. Клетки культивировали при 37°С в атмосфере 5% СО в течение 72 часов, а затем их собирали для экстракции РНК и ДНК с использованием наборов Qiagen miRNeasy Mini Kit и QiAmp DNA Mini Kit, соответственно (Valencia, CA).
Общую РНК выделяли с использованием набора miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). Общую РНК определяли количественно с использованием спектрофотометра NanoDrop 1000 (Thermo Scientific), и разбавляли до рабочей концентрации 10 нг/мкл.
Для каждой shmiR по изобретению определяли количество копий shmiR на клетку при экспрессии в клетках HepG2.2.15 моно- или тройного вектора AdV shmiR HBV, при различных MOI с использованием системы ПЦР Qiagen's miScript. Для каждого анализа методом количественной ПЦР в реальном времени (RT-qPCR) 50 нг общей РНК превращали в кДНК с использованием набора Qiagen's miScript II RT. Количественную ПЦР для shmiR проводили с использованием набора Qiagen miScript SYBR green PCR, и с изготовленными по заказу праймерами для соответствующих shmiR, при следующих условиях выполнения ПЦР в реальном времени (RT): начальная денатурация при 95°С в течение 15 минут с последующими 40 циклами при 94°С в течение 15 секунд, при 55°С в течение 30 секунд и при 70°С в течение 30 секунд.
Уровни ингибирования транскриптов HBV в областях, соответствующих антигенам HBV HBsAg, HBcAg и HbxAg, относительно уровней мРНК GAPDH, определяли путем нормализации соответствующих уровней транскрипта мРНК HBV относительно мРНК GAPDH для каждого образца. Вкратце, 100 нг общей РНК использовали для синтеза кДНК, с использованием набора для обратной транскрипции кДНК High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA), согласно инструкциям производителя. Количественные ПЦР-амплификации областей в антигенах HBV HBsAg, HBcAg и HbxAg выполняли с использованием Power SYBR Green PCR Master Mix (Life Technologies) и набора праймеров, указанных в Таблице 1. Использовали стандартные условия для проведения ПЦР в реальном времени: начальная денатурация при 95°С в течение 10 минут с последующими 40 циклами при 95°С в течение 15 секунд и при 60°С в течение 1 минуты.
Таблица 1
. Наборы праймеров для RT-qPCR
<b>Антиген HBV </b>
<b>Праймер</b>
<b>Последовательность (5'-3')</b>
HBsAg
HBsAg_fwd
ATGTTGCCCGTTTGTCCTCT
HBsAg_rev
CCGTCCGAAGGTTTGGTACA
HBxAg
HBxAg_fwd
CGTCCTTTGTTTACGTCCCG
HBxAg_rev
AGTCCGCGTAAAGAGAGGTG
HBcAg
HBcAg_fwd
CCACCAAATGCCCCTATCCT
HBcAg_rev
ATTGAGACCTTCGTCTGCGA
GAPDH
GAPDH_fwd
ACACCATGGGGAAGGTGAAG
GAPDH_rev
GTGACCAGGCGCCCAATA
Примечание: fwd - прямой; rev – обратный.
Уровни ингибирования транскриптов HBV в областях, соответствующих антигенам HBV, HBcAg и HbxAg относительно уровней мРНК GAPDH для каждого shmiR по изобретению (экспрессируемые отдельно или как часть тройного конструкта) определяли при различных MOI.
Пример 6. Нокдаун транскриптов HBV в клетках HepG2.2.15 с использованием векторов AdV shmiR HBV
Моно- и тройные векторы AdV shmiR или shrRNA получали субклонированием экспрессионных конструктов ddRNAi, описанных в примере 1 (т.е., конструкты ddRNAi, обозначенные как HBV-shmiR1 - HBV-shmiR16, HBV-shRNA1 - HBV-shRNA16, HBV-shmiRx3-v1, HBV-shmiRx3-v2 и HBV-shRNAx3-v1) в аденовирусный (AdV) конструкт для продуцирования вируса (Vector Biolabs, Malvern, PA).
Для проверки эффективности векторов AdV shmiR, описанных здесь, в отношении "нокдауна" экспрессии генов HBV, клетки HepG2.2.15 инфицировали векторами AdV shmiR по изобретению, и анализировали экспрессию гена HBV.
2
Клетки HepG2.2.15 представляет собой сублинию клеток линии клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека HepG2, которые устойчиво удерживают полный геном HBV (серотип ayw, генотип D). Клетки HepG2.2.15 экспрессируют все вирусные РНК и белки HBV, продуцируют вирусные геномы и секретируют вирусоподобные частицы. Клетки HepG2.2.15 поддерживали в среде RPMI1640 С добавлением 4% фетальной телячьей сыворотки, 4 мМ глутамина, пенициллина (100 ед/мл) и стрептомицина (100 мкг/мл), и размножали в инкубаторе при 37°С в атмосфере 5% CO.
5
2
Клетки HepG2.2.15 инфицировали векторами AdV shmiR HBV или векторами AdV shrRNA HBV в клеточной суспензии, и культивировали в многолуночных планшетах. Каждая лунка содержала суспензию, состоящую из приблизительно 1,25×10 клеток HepG2.2.15 и один из моно- или тройных векторов AdV shmiR, или один из моно- или тройных векторов AdV shrRNA при MOI=100. После трансдукции клетки культивировали при 37°С и в 5% СО в течение 3-7 дней и собирали для выделения общей РНК с использованием набора Qiagen miRNeasy mini kit (Valencia, CA) через 3, 4, 5 и 6 дней после трансфекции.
Общую РНК определяли количественно с использованием спектрофотометра NanoDrop 1000 (Thermo Scientific), а затем разбавляли до рабочей концентрации 10 нг/мкл.
Эффекторные молекулы RNAi, экспрессированные в виде копий на клетку, определяли для shmiR-12 и shmiR-15 (Фиг. 3A и 3B, соответственно) при экспрессии в клетках HepG2.2.15 из моно- или тройного вектора AdV shmiR, используя систему ПЦР Qiagen's Missiscript PCR system (сконструированную для количественного определения эффекторных молекул РНК, процессированных от shmiR или shRNA). Экспрессию shmiR сравнивали с уровнями эффекторных молекул RNAi, индуцируемых соответствующими shRNA в контексте моно- и тройных конструктов. Для каждого анализа RT-qPCR 50 нг общей РНК превращали в кДНК с использованием набора Qiagen's miScript II RT kit. Количественную ПЦР для эффекторных молекул RNAi проводили с использованием набора Qiagen miScript SYBR green PCR kit, используя специальные праймеры, сконструированные для соответствующих молекул RNAi, при следующих условиях ПЦР в реальном времени: начальная денатурация при 95°С в течение 15 минут с последующим 40 циклами при 94°С в течение 15 секунд, 55°С в течение 30 секунд и 70°С в течение 30 секунд. Результаты показали, что уровни эффекторных молекул RNAi против областей генома HBV, экспрессированных shmiR-12 и shmiR-15, являются более высокими, чем уровни, соответствующие shRNA, т.е. shRNA-12 и shrRNA-15, соответственно (Фиг. 3).
Уровни ингибирования транскриптов HBV в областях, соответствующих антигенам HBV HBsAg, HBcAg и HbxAg, относительно уровней мРНК GAPDH определяли по методу, описанному в примере 5.
Уровни ингибирования транскриптов HBV в областях, соответствующих антигенам HBV HBsAg, HBcAg и HbxAg, относительно уровней мРНК GAPDH, для каждой shmiR по изобретению (экспрессируемой по отдельности или как часть тройного конструкта) определяли при MOI=100 через 3, 4, 5 и 6 дней после инфицирования векторами AdV HBV shmiR HBV или AdV shRNA. Как показано на Фигурах 4A и 4B, shmiR-12 и shmiR-15 показали бóльший сайленсинг РНК HBV по сравнению с соответствующими конструктами, экспрессирующими shRNA.
Пример 7. Получение самокомплементарных плазмидных конструктов на основе AAV и вирусов, экспрессирующих shmiR HBV
Самокомплементарные плазмиды аденоассоциированного вируса типа 2 (scAAV2), экспрессирующие три shmiR по изобретению, получали путем субклонирования тройных конструктов ddRNAi shmiR HBV из примера 1 в основную цепь scAAV2.
Вкратце, тройной конструкт ddRNAi shmiR HBV примера 1 (т.е. конструкты ddRNAi, обозначенные как HBV-shmiRх3-v1 и HBV-shmiRх3-v2) клонировали в основную цепь вектора pAAV2 для получения векторов, обозначенных как pAAV-HBV-shmiRх3-v1 и pAAV-HBV-shmiRх3-v2, соответственно. Также может быть получен вирусный плазмидный контроль AAV, экспрессирующий ненацеливающие shmiR (pAAV-control-shmiR).
2
2
Затем получают рекомбинантные псевдотипированные AAV-векторные компоненты с использованием капсида ААV8. Вкратце, клетки HEK293T культивировали в роллерных флаконах в модифицированной по Дульбекко среде Игла, дополненной 10% FBS и инкубировали при 37°С и 5% СО. Получали комплекс с полиэтиленимином (PEI), в соответствии с инструкциями производителя, для каждой из тройных вирусных плазмид pAAV HBV (pAAV-HBV-shmiRх3-v1 и pAAV-HBV-shmiRх3-v2) и плазмиды pAAVhelpercap8 (pDP8r). Затем проводили двойную трансфекцию с одной из тройных вирусных плазмид pAAV HBV (pAAV-HBV-shmiRх3-v1 и pAAV-HBV-shmiRх3-v2) и pDP8r в клетках HEK293T. Клетки HEK293T культивировали в течение 72 часов при 37°С и 5% СО, после этого клетки лизировали, и частицы, экспрессирующие scAAV shmiR, для каждой из вирусных плазмид, очищали с помощью иодиксанола (Sigma-Aldrich) ультрацентрифугированим со супенчатым градиентом. Количество векторных геномов определяли с использованием количественной полимеразной цепной реакции Taqman (Q-PCR) с праймерами и зондом, сконструированными против области между экспрессионными кассетами.
Для вирусных плазмид, обозначенных как pAAV-HBV-shmiRх3-v1, pAAV-HBV-shmiRх3-v2 и pAAV-control-shmiR, соответствующие вирусные препараты scav 8 обозначены как scAAV-HBV-shmiRx3-v1, scAAV-HBV-shmiRx3-v2 и scAAV-control-shmiR, соответственно.
Плазмиды одноцепочечного аденоассоциированного вируса (ssAAV), экспрессирующие три shmiR по изобретению, также получали путем субклонирования тройных конструктов ddRNAi shmiR HBV из примера 1 в главную цепь вектора ssAAV.
Пример 8. Получение самокомплементарных и одноцепочечных плазмидных конструктов на основе ААV8 и вирусов, экспрессирующих shmiR HBV или shRNA HBV
Плазмиду одноцепочечного аденоассоциированного вируса типа 2 (ssAAV2), экспрессирующую три shmiR по изобретению, получали путем субклонирования тройного конструкта ddRNAi shmiR HBV из примера 1, обозначенного как HBV-ShmiRх3-v1, в основную цепь ssAAV8. Аналогичным образом, плазмиды ssAAV8 и самокомплементарного аденоассоциированного вируса типа 2 (ssAAV2), экспрессирующие три shRNA, соответствующие shmiR из HBV-shRNAx3-v1, получали путем субклонирования тройного конструкта ddRNAi shmiR HBV из примера 1, обозначенного как HBV-shRNAх3-v1 в основную цепь ssAAV2 или ssAAV8. ДНК конструировали для экспрессии в виде рекомбинантных геномов ДНК одноцепочечных AAV, как показано на Фиг. 5.
Затем для каждой из плазмид ААV2, с использованием коммерчески полученного капсида ААV8 (Vector Biolabs, Malvern PA; Nationwide Children's Hospital, Columbus OH; Powell Gene Therapy Center, University of Florida), в соответствии со способами, описанными в Примере 7, получали псевдотипированные рекомбинантные векторы AAV. Псевдотипированные исходные векторы обозначены как ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1, sAAV8-HBV-shRNAx3-v1 и scAAV8-HBV-shRNAx3-v1, соответственно.
Пример 9. Ингибирование параметров HBV в условиях in vivo
Эффект действия частиц scAAV, экспрессирующих shmiR, обозначенных как scAAV-HBV-shmiRх3-v1 и scAAV-HBV-shmiRх3-v2, в условиях in vivo на (i) экспрессию вирусных транскриптов HBV, (ii) внеклеточные HBsAg и HBeAg, (iii) внеклеточную и внутриклеточную ДНК HBV, и (iv) образование кДНК, определяли в модели на мышах PXB, инфицированных de novo инокулятом HBV.
Способы
Частицы scAAV, экспрессирующие shmiR, обозначенные как scAAV-HBV-shmiRх3-v1 и scAAV-HBV-shmiRх3-v2, получали в соответствии с примером 7.
Химерные мыши PXB (PXB-mice) получали из PhoenixBio. Всех мышей содержали по-отдельности при 23±5°С и влажности 55±25%, при циклах свет/темнота 12 часов и с подачей корма и воды ad libitum в течение всего эксперимента.
Мышей PXB инокулировали HBV генотипа С и инкубировали в течение 4 недель, чтобы обеспечить исходный уровень инфекции HBV. Для определения исходного уровня инфекции HBV у мышей, брали пробы крови в дни -28, -21, -14 и -7 (т.е. в дни 0, 7, 14 и 21 после инокуляции, соответственно), из которых определяли концентрацию человеческого альбумина (h-Alb) и концентрации в сыворотке ДНК HBV, HBsAg и HBeAg.
Кровь у животных отбирали под анестезией в каждый момент времени, например, с анестезией изофлураном (Escain, Mylan, Osaka, Japan) через ретро-орбитальное сплетение/синус, с использованием системы для отбора крови IntramedicTM Polyethylene Tubing (Becton, Dickinson and Company, NJ, USA).
Из собранной крови отбирали 2 мкл и разбавляли физиологическим раствором. Концентрацию h-alb в крови измеряли с помощью иммунонефелометрии с латексной агглютинацией (LZ Test ʺEikenʺ U-ALB, Eiken Chemical Co., Ltd., Tokyo, Japan), используя анализатор для клинических химических анализов (BioMajestyTM Series JCA-BM6050, JEOL Ltd., Tokyo, Japan).
Оставшуюся цельную кровь центрифугировали для отделения сыворотки, которую использовали для количественного определения ДНК HBV и анализа HBsAg и HBeAg.
+04
+09
Для измерения в сыворотке ДНК HBV, ДНК HBV экстрагировали из 5 мкл сыворотки с использованием набора для экстракции нуклеиновой кислоты SMITESTEX-R&D (MEDICAL & BIOLOGICAL LABORATORIES CO., LTD., Nagoya, Japan). Затем очищенную ДНК растворяли в 20 мкл свободной от нуклеаз воды (Ambion). Сыворотку от мышей PXB, инфицированных HBV, использовали в качестве стандарта ДНК HBV. Синтетическую ДНК HBV использовали для определения концентрации стандарта ДНК HBV, которую затем использовали для количественной оценки уровня ДНК HBV в сыворотке. ДНК HBV экстрагировали из стандарта ДНК HBV и использовали для ПЦР в реальном времени после соответствующего разбавления. Диапазон используемого стандарта может составлять, например, от 4,0 е до 2,0 е копий/мл.
Затем проводили ПЦР в реальном времени для измерения концентрации ДНК HBV в сыворотке, например, с использованием TaqMan Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific Inc.) и системы детектирования последовательностей ABI Prism 7500 (Applied Biosystems). Реакционную смесь для ПЦР добавляли в 5 мл экстрагированной ДНК. Выполняли начальную активацию урацил-N-гликозилазы при 50°С в течение 2 минут с последующей активацией полимеразы при 95°С в течение 20 секунд. Последующая амплификация ПЦР состояла из 53 циклов денатурации при 95°С в течение 3 секунд и отжига и удлинения при 60°С в течение 32 секунд на цикл в системе детектирования последовательностей ABI Prism 7500. Средний уровень ДНК HBV в сыворотке рассчитывали по значениям, полученных для двух отдельных лунок.
Для ПЦР в реальном времени использовали следующие праймеры и зонды:
<b>Расположение мишени </b>
<b>Информация о последовательности</b>
<b>Краситель </b>
<b>5' нуклеотиды 3'</b>
<b>Краситель</b>
Прямой праймер
166-186
n/a
CACATCAGGATTCCTAGGACC(SEQ ID NO: 158)
n/a
Обратный праймер
344-325
n/a
AGGTTGGTGAGTGATTGGAG(SEQ ID NO: 159)
n/a
Зонд TaqMan
242-267
6-FAM
CAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTC(SEQ ID NO: 160)
TAMRA
Примечание: n/a - не использовали.
Концентрации HBsAg и HBeAg в сыворотке определяли с использованием хемилюминесцентного иммуноанализа (CLIA), например, разработанного Abbott (ARCHITECT  SYSTEM).
Животных включали в последующие эксперименты по лечению, если они отвечали следующим критериям:
(i) масса должна быть 15 г или более в день -1 (т.е. в день 27 после инокуляции HBV);
+6
(ii) концентрация ДНК HBV в сыворотке должна быть по меньшей мере равна 1,0 Е копий/мл в день -7 (т.е. в день 21 после инокуляции HBV); и
(iii) уровень измеренного h-Alb должен составлять 10 мг/мл или более в день -7 (т.е. в день 21 после инокуляции HBV).
Мышей, у которых подтверждено исходное инфицирование HBV, и которые отвечают указанным выше критериям, распределяли в группы лечения. Для минимизирования различий между группами, состав групп может быть рандомизирован на основе среднеарифметических значений массы тела и среднегеометрических значений концентраций h-Alb в крови и концентрации ДНК HBV в сыворотке.
Группы, подвергающиеся лечению, являются следующими:
Группа 1: один болюс 200 мкг физиологического раствора;
+13
Группа 2: один болюс 200 мкг физиологического раствора, содержащего 2,0 е (vg/кг) вирусных частиц ssAAV-HBV-shmiRх3-v1, вводимый в хвостовую вену посредством внутривенной инъекции; и
+13
Группа 3: один болюс 200 мкг физиологического раствора, содержащего 2,0 е (vg/кг) вирусных частиц scAAV-HBV-shmiRх3-v2, вводимый в хвостовую вену посредством внутривенной инъекции
Непосредственно перед лечением всех мышей анестезировали 2-4% изофлураном.
После введения болюса, т.е. начала лечения (день 0), животных инкубировали в течение 56 дней. В течение этого времени еженедельно отбирали пробы крови в течение 8 недель (в дни 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49 и 56 после начала лечения), и с помощью ПЦР в реальном времени определяли концентрации в сыворотке внеклеточного HBsAg, внеклеточного HBeAg и внеклеточной ДНК HBV, используя описанные методики.
После завершения отбора проб крови в день 56, всех выживших животные под изофлурановой анестезией умерщвляли сердечной пункцией и обескровливанием.
После умерщвления у мышей извлекали цельную печень, и взвешивали ее. Из левой боковой доли получали срез печени толщиной от 3 до 5 мм, и его разрезали на кубики с размером сторон приблизительно от 1 мм до 2 мм. Эти кубики ткани печени быстро переносили в маркированную пробирку и погружали в раствор RNAlater (Ambion, Thermo Fisher Scientific Inc. Waltham, MA, USA). Образцы печени инкубировали в ≥5 объемах раствора RNAlater в течение ночи при 4°С, чтобы раствор проник в ткань. После инкубации раствор RNAlater удаляли и кусочки печени хранили при -80°С для последующего количественного определения уровней ДНК HBV в печени.
Для определения уровня ДНК HBV в печени после лечения, ДНК HBV экстрагировали из замороженной в растворе RNAlater ткани печени, используя набор DNeasy Blood & Tissue Kits (Qiagen K.K., Tokyo, Japan). ДНК растворяли в 200 мкл воды, не содержащей нуклеаз, после чего концентрацию раствора ДНК определяли с использованием фотометра BioPhotometer 6131 (Eppendorf Co., Ltd., Tokyo, Japan). Концентрацию раствора ДНК доводили до 20 нг/мкмоль, используя свободную от нуклеаз воду.
+02
+05
Затем выполняли анализ с помощью ПЦР в реальном времени для измерения концентрации ковалентнонепрерывной кольцевой ДНК (cccDNA) HBV в печени с использованием TaqMan Fast Advanced Master Mix и детекторной системы ABI Prism 7500. Вкратце, реакционную смесь для ПЦР добавляли в 5 мкл экстрагированной ДНК. Реакцию ПЦР проводили в условиях Таккенберга (Takkenberg). Начальную активацию урацил-N-гликозилазы осуществляли при 50°С в течение 2 минут, с последующей активацией полимеразы при 95°С в течение 20 секунд. Последующие 55 циклов амплификации ПЦР проводили при 95°С в течение 3 секунд и при 60°С в течение 32 секунд на цикл, например, в детекторе последовательностей ABI 7500. Средний уровень ковалентнонепрерывной кольцевой ДНК HBV рассчитывали по значениям для двух отдельных лунок. Плазмиду, содержащую полную геномную последовательность HBV, использовали в качестве стандартного образца для количественной оценки ковалентнонепрерывной кольцевой ДНК HBV. Диапазон используемого стандарта может составлять от 1,0 е до 1,0 е копий на 100 нг ДНК.
Для ПЦР в реальном времени использовали следующие праймеры и зонды:
Расположение мишени
Информация о последовательности
Краситель
5' нуклеотиды 3'
Краситель
Прямой праймер
1545-1563
n/a
CTCCCCGTCTGTGCCTTCT (SEQ ID NO: 161)
n/a
Обратный праймер
1900-1883
n/a
GCCCCAAAGCCACCCAAG (SEQ ID NO: 162)
n/a
Зонд TaqMan
1602-1628
6-FAM
CGTCGCATGGARACCACCGTGAACGCC (SEQ ID NO: 163)
TAMRA
Примечание: n/a - не использовали.
Пример 10. Ингибирование параметров HBV в модели на химерных мышах
Действие частиц AAV, экспрессирующих shmiR или shrRNA, против HBV в условиях in vivo (как показано на Фигуре 5) определяли в модели на химерных мышах PXB, инфицированных de novo инокулятом HBV. Оценивали ингибирование различных параметров HBV: (i) экспрессия вирусных транскриптов HBV, (ii) внеклеточные HbsAg, HBcAg и HBeAg, (iii) внеклеточная и внутриклеточная ДНК HBV, и (iv) образование ковалентнонепрерывной кольцевой ДНК (cccDNA).
Частицы AAV8, экспрессирующие shmiR или shRNA против HBV, описанные в Примере 8, тестировали в модели на химерных мышах PXB (Фигура 6). Испытывали следующие частицы AAV8 против HBV:
(1) ssAAV8, содержащие HBV-shRNAх3-v1 (ssAAV8-HBV-shRNA3-v1);
(2) ssAAV8, содержащие HBV-shRNAх3-v1 (ssAAV8-HBV-shRNAх3-v1); и
(3) ssAAV8, содержащий HBV-shmiRх3-v1 (ssAAV8-HBV-shmiRх3-v1).
В этом исследование in vivo оценивали активность однократных доз ssAAV8-HBV-shRNAx3-v1, scAAV8-HBV-shRNAx3-v1 и ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1 в модели на мышах PXB, при введении как монотерапии или при использовании в комбинации с обычными средствами против HBV, такими как энтекавир (ETV) или пэгилированный интерферон (PEG-IFN).
Методы
Химерные мыши PXB (PXB-mice) получали из PhoenixBio. Всех мышей содержали по-отдельности при 23±5°С и влажности 55±25%, при циклах свет/темнота 12 часов и с подачей корма и воды ad libitum в течение всего эксперимента. Измерение сывороточного альбумина человека проводили приблизительно через 10 недель после трансплантации гепатоцитов, для гарантии того, что исходная печень содержала по меньшей мере 80% гепатоцитов человека. Всех химерных животных, прошедшие этот порог в отношении содержания гепатоцитов человека, инфицировали HBV генотипа С и инкубировали в течение 4 недель, для развития базового инфицированяю HBV. Для определения исходной инфекции HBV у мышей отбирали кровь в дни -28, -21, -14 и -7 (т.е. в дни 0, 7, 14 и 21 после инокуляции, соответственно), и в ней определяли концентрацию человеческого альбумина (h-Alb) и концентрацию в сыворотке ДНК HBV, а также HBsAg и HBeAg. Это позволило обнаружить отсутствие повреждений печени у испытуемых животных и отсутствие побочных реакций.
Кровь у животных отбирали под анестезией в каждый момент времени, например, с помощью анестезии изофлураном (Escain, Mylan, Osaka, Japan) через ретроорбитальное сплетение/синус с использованием интраперитонеальной системы IntramedicTM Polyethylene Tubing (Becton, Dickinson and Company, NJ, USA). Из отобранной цельной крови 2 мкл крови разбавляли физиологическим раствором и концентрацию h-Alb в крови измеряли с помощью иммунонефелометрии с латексной агглютинацией (LZ Test ʺEikenʺ U-ALB, Eiken Chemical Co., Ltd., Tokyo, Japan), используя анализатор для клинических химических анализов (BioMajestyTM Series JCA-BM6050, JEOL Ltd., Tokyo, Japan).
Оставшуюся цельную кровь центрифугировали для отделения сыворотки, которую использовали для количественного определения ДНК HBV и анализа HBsAg и HBeAg.
+04
+09
Для измерения в сыворотке ДНК HBV, ДНК HBV экстрагировали из 5 мкл сыворотки с использованием набора для экстракции нуклеиновой кислоты SMITESTEX-R&D (MEDICAL & BIOLOGICAL LABORATORIES CO., LTD., Nagoya, Japan). Затем очищенную ДНК растворяли в 20 мкл свободной от нуклеаз воды (Ambion). Сыворотку от мышей PXB, инфицированных HBV, использовали в качестве стандарта ДНК HBV. Синтетическую ДНК HBV использовали для определения концентрации стандарта ДНК HBV, которую затем использовали для количественной оценки уровня ДНК HBV в сыворотке. ДНК HBV экстрагировали из стандарта ДНК HBV и использовали для ПЦР в реальном времени после соответствующего разбавления. Диапазон используемого стандарта может составлять, например, от 4,0 е до 2,0 е копий/мл.
Затем проводили ПЦР в реальном времени для измерения концентрации ДНК HBV в сыворотке, например, с использованием TaqMan Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific Inc.) и системы детектирования последовательностей ABI Prism 7500 (Applied Biosystems). Реакционную смесь для ПЦР добавляли в 5 мл экстрагированной ДНК. Выполняли начальную активацию урацил-N-гликозилазы при 50°С в течение 2 минут с последующей активацией полимеразы при 95°С в течение 20 секунд. Последующая амплификация ПЦР состояла из 53 циклов денатурации при 95°С в течение 3 секунд и отжига и удлинения при 60°С в течение 32 секунд на цикл в системе детектирования последовательностей ABI Prism 7500. Средний уровень ДНК HBV в сыворотке рассчитывали по значениям, полученных для двух отдельных лунок.
Для ПЦР в реальном времени использовали следующие праймеры и зонды:
Расположение мишени
Информация о последовательности
Краситель
5' нуклеотиды 3'
Краситель
Прямой праймер
166-186
n/a
CACATCAGGATTCCTAGGACC (SEQ ID NO: 158
n/a
Обратный праймер
344-325
n/a
AGGTTGGTGAGTGATTGGAG (SEQ ID NO: 159)
n/a
Зонд TaqMan
1242-267
6-FAM
CAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTC (SEQ ID NO: 160)
TAMRA
Примечание: n/a - не использовали.
Концентрации HBsAg и HBeAg в сыворотке определяли с использованием хемилюминесцентного иммуноанализа (CLIA), например, разработанного Abbott (ARCHITECT  SYSTEM).
Животных включали в последующие эксперименты по лечению, если они отвечали следующим критериям:
(i) масса должна быть 15 г или более в день -1 (т.е. в день 27 после инокуляции HBV);
+6
(ii) концентрация ДНК HBV в сыворотке должна быть по меньшей мере равна 1,0 Е копий/мл в день -7 (т.е. в день 21 после инокуляции HBV); и
(iii) уровень измеренного h-Alb должен составлять 10 мг/мл или более в день -7 (т.е., в день 21 после инокуляции HBV).
Мышей, у которых подтверждено исходное инфицирование HBV, и которые отвечают указанным выше критериям, распределяли в 12 групп лечения, каждая из которых состояла из 4 или 5 мышей. Для минимизирования различий между группами, состав групп может быть рандомизирован на основе среднеарифметических значений массы тела и среднегеометрических значений концентраций h-Alb в крови и концентрации ДНК HBV в сыворотке.
Группы, получавшие лечение, были следующими.
Группа
Линия
Кол-во мышей (ID)
Тестируемое соединение
Доза
Уровень*
Конц.**
Объем(мл/кг)
Путь введения
Частота введений
1
PXB (HBV C-инфицир.)
5 (101-105)
Носитель, контроль
0
0
200 мкл
i.v.
Однократно, день 0
2
PXB (HBV C-инфицир.)
4 (201-204)
ETV
0,006
0,0006
10
р.о.
QD, в течение 91 дней, в дни 0-90
3
PXB (HBV C-инфицир.)
4 (301-304)
Pegasys
0,03
0,003
10
s.c.
BIW, в течение 13 недель, каждый 1 и 4 день недели
4
PXB (HBV C-инфицир.)
5 (401-405)
BB-101
2,00E+13
TBP***
200 мкл
i.v.
Однократно, день 0
5
PXB (HBV C-инфицир.)
5 (501-505)
BB-101
2,00E+13
TBP***
200 мкл
i.v.
Однократно, день 0
ETV
0,006
0,0006
10
р.о.
QD, в течение 91 дней, в дни 0-90
6
PXB (HBV C-инфицир.)
5 (601-605)
BB-101
2,00E+13
TBP***
200 мкл
i.v.
Однократно, день 0
Pegasys
0,03
0,003
10
s.c.
BIW, в течение 13 недель, каждый 1 и 4 день недели
7
PXB (HBV C-инфицир.)
5 (701-705)
BB-102
2,00E+13
TBP***
200 мкл
i.v.
Однократно, день 0
8
PXB (HBV C-инфицир.)
5 (801-805)
BB-102
2,00E+13
TBP***
200 мкл
i.v.
Однократно, день 0
ETV
0,006
0,0006
10
р.о
QD, в течение 91 дней, в дни 0-90
9
PXB (HBV C-инфицир.)
5 (901-905)
BB-102
2,00E+13
TBP***
200 мкл
i.v.
Однократно, день 0
Pegasys
0,03
0,003
10
s.c.
BIW, в течение 13 недель, каждый 1 и 4 день недели
10
PXB (HBV C-инфицир.)
4 (1001-1004)
BB-103
2,00E+13
TBP***
200 мкл
i.v.
Однократно, день 0
11
PXB (HBV C-инфицир.)
4 (1101-1104)
BB-103
2,00E+13
TBP***
200 мкл
i.v.
Однократно, день 0
ETV
0,006
0,0006
10
р.о
QD, в течение 91 дней, в дни 0-90
12
PXB (HBV C-инфицир.)
4 (1201-1204)
BB-103
2,00E+13
TBP***
200 мкл
i.v.
Однократно, день 0
Pegasys
0,03
0,003
10
s.c.
BIW, в течение 13 недель, каждый 1 и 4 день недели
Примечания:
*: мг/кг для ETV и Pegasys; vg/кг для BB-101, BB-102 и BB-103
**: мг/кг для ETV и Pegasys
***: приготовлен в день введения дозы, на основании показателя массы тела для достижения целевого уровня дозы. Конечная концентрация указана в приложении 3.
n/a: не применимо
i.v. - внутривенное введение
p.o. - пероральное введение
s.c. - подкожное введение
QD - один раз в день
BIW - два раза в неделю.
Мыши, инфицированные HBV, и получавшие физиологический раствор служили в качестве отрицательного контроля. Группы, получавшие лечение стандартными средствами против HBV служили в качестве положительного контроля: энтекавир вводили ежедневно в дозе 6 мкг/кг или вводили пегилированный интерферон два раза в неделю в дозе 30 мкг/кг. Для групп, получавших ddRNAi против HBV, однократно вводили ssAAV8-HBV-shRNAx3-v1, scAAV8-HBV-shRNAx3-v1 или ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1 в дозе 2×10E+13 vg/кг путем инъекции с низким давлением в хвостовую вену в День 0. Животные, получавшие комплексное лечение, первый раз вводили ETV в день 1 или PEG-IFN в день 4.
Все мыши перед введением доз получали анестезию с помощью 2-4% изофлурана.
После начала лечения (день 0), животных инкубировали в течение 91 дней. В течение этого времени еженедельно отбирали кровь в течение 13 недель (в дни 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77, 84 и 91 после начала лечения), а также измеряли в сыворотке концентрации внеклеточной ДНК HBV (вирусный титр) и внеклеточного HBsAg. Уровни HBeAg измеряли каждые две недели в течение 70 дней, а затем каждую неделю до завершения эксперимента в день 91.
После завершения отбора проб крови в день 91, все выжившие животные получали изофлурановую анестезию и их умерщвляли путем пункции сердца и обескровливания. После умерщвления мышей у них извлекали цельную печень, и взвешивали ее. Из левой боковой доли получали срез печени толщиной от 3 до 5 мм, и его разрезали на кубики с размером сторон приблизительно от 1 мм до 2 мм. Эти кубики ткани печени быстро переносили в маркированную пробирку и погружали в раствор RNAlater (Ambion, Thermo Fisher Scientific Inc. Waltham, MA, USA). Образцы печени инкубировали в ≥5 объемах раствора RNAlater в течение ночи при 4°С, чтобы раствор проник в ткань. После инкубации раствор RNAlater удаляли и кусочки печени хранили при -80°С для последующего количественного определения уровней ДНК HBV в печени.
Для определения уровня ДНК HBV в печени после лечения, ДНК HBV экстрагировали из замороженной в растворе RNAlater ткани печени, используя набор DNeasy Blood & Tissue Kits (Qiagen K.K., Tokyo, Japan). ДНК растворяли в 200 мкл воды, не содержащей нуклеаз, после чего концентрацию раствора ДНК определяли с использованием фотометра BioPhotometer 6131 (Eppendorf Co., Ltd., Tokyo, Japan). Концентрацию раствора ДНК доводили до 20 нг/мкмоль, используя свободную от нуклеаз воду.
+02
+05
Затем выполняли анализ с помощью ПЦР в реальном времени для измерения концентрации ковалентнонепрерывной кольцевой ДНК HBV в печени с использованием TaqMan Fast Advanced Master Mix и детекторной системы ABI Prism 7500. Вкратце, реакционную смесь для ПЦР добавляли в 5 мкл экстрагированной ДНК. Реакцию ПЦР проводили в условиях Таккенберга (Takkenberg). Начальную активацию урацил-N-гликозилазы осуществляли при 50°С в течение 2 минут, с последующей активацией полимеразы при 95°С в течение 20 секунд. Последующие 55 циклов амплификации ПЦР проводили при 95°С в течение 3 секунд и при 60° С в течение 32 секунд на цикл, например, в детекторе последовательностей ABI 7500. Средний уровень ковалентнонепрерывной кольцевой ДНК HBV рассчитывали по значениям для двух отдельных лунок. Плазмиду, содержащую полную геномную последовательность HBV, использовали в качестве стандартного образца для количественной оценки ковалентнонепрерывной кольцевой ДНК HBV. Диапазон используемого стандарта может составлять от 1,0 Е до 1,0 Е копий на 100 нг ДНК.
Для ПЦР в реальном времени использовали следующие праймеры и зонды:
Расположение мишени
Информация о последовательности
Краситель
5' нуклеотиды 3'
Краситель
Прямой праймер
1545-1563
n/a
CTCCCCGTCTGTGCCTTCT (SEQ ID NO: 161)
n/a
Обратный праймер
1900-1883
n/a
GCCCCAAAGCCACCCAAG (SEQ ID NO: 162)
n/a
Зонд TaqMan
1602-1628
6-FAM
CGTCGCATGGARACCACCGTGAACGCC (SEQ ID NO: 163)
TAMRA
Примечание: n/a - не использовали.
ПЦР в реальном времени использовали для количественной оценки продукции эффекторных молекул RNAi против HBV и ингибирования транскрипта мРНК HBV, как описано в примерах 5 и 6.
Результаты
Для краткости здесь представлены только ключевые данные и результаты, полученные для cAAV8-HBV-shRNAx3-v1 и ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1.
Титр вируса у животных, получавших физиологический раствор, оставался относительно постоянным в течение 13 недель эксперимента (Фигура 7), и он составлял более чем 1Е+08 копий ДНК HBV в 1 мл. Группа лечения, состоящая из животных, получавших ежедневно только ETV, показала снижение уровня ДНК HBV в сыворотке крови на 2,63 log. В отсутствие других противовирусных лекарственных средств, введение ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1 и scAAV8-HBV-shRNAx3-v1 привело к максимальному снижению уровней ДНК HBV в сыворотке крови, где снижение составило 2,17 log и 1,87 log, соответственно.
Однако умеренный спад уровней ДНК HBV был отмечен через 63 дня лечения. Кроме того, в комбинации с ежедневным введением энтекавира, одна доза ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1 и scAAV8-HBV-shRNAx3-v1 снижала содержание ДНК HBV в сыворотке до величины ниже 3,72 log, что соответствовало нижнему пределу количественной оценки (LLOQ) для анализа. Хотя точные количественные уровни ДНК HBV было трудно определить, видно, что снижение вирусной нагрузки продолжает уменьшаться до конца 91-дневного эксперимента.
S-антиген (HBsAg) является известным участником иммуносупрессии и хронического течения инфекции HBV. Полагают, что высокие уровни экспрессии HBsAg, которые встречаются в на стадии активной инфекции, являются проблематичными в отношении достижения эффекта лечения. "Лечение" часто определяется как сероконверсия у пациентов, инфицированных HBV, определяемая экспрессией антител против HBsAg. Лечение инфицированных химерных мышей с использованием ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1+ETV или scAAV8-HBV-shRNAx3-v1+ETV, привело к снижению уровней HBsAg на 2,14 log и 1,86 log, соответственно (см. Фигуру 8). Лечение с использованием ETV в виде монотерапии снижало уровни HBsAg на 0,46 log.
Лечение с использованием ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1+ETV снижало уровни HBeAg на 1,90 log, а лечение с использованием с помощью scAAV8-HBV-shRNAx3-v1+ETV снижало уровни HBeAg на 1,42 log. Лечение энтекавиром привело к снижению уровней HBsAg на 0,37 log (см. Фигуру 9).
В дополнение к совместному лечению с ETV, в данном исследовании тестировали комбинации scAAV8-HBV-shRNAx3-v1 или ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1 с введением с PEG-IFN. Одно введение scAAV8-HBV-shRNAx3-v1 или ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1 в дополнение к схеме, состоящей из введения дважды в неделю пэгилированного интерферона, привело к значительному уменьшению уровней ДНК HBV в сыворотке на 2,67 и 3,27 log, соответственно (Фигура 10).
По окончании лечения, проводившегося в течение 91 дня, мышей умерщвляли, получали от них печень, и из нее выделяли ДНК и РНК для исследования ряда параметров гепатоцитов. Например, предполагается, что в качестве средства интерференции РНК, ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1 будет снижать уровни вирусных транскриптов HBV, присутствующих в клетках.
Используя наборы праймеров/зондов для областей, расположенных вблизи каждого из индуцированного RNAi сайта расщепления, оценивали уровни РНК HBV при помощи RT-QPCR (Фигура 11). Хотя пэгилированный интерферон обладает высокими уровнями активности при использовании в качестве монотерапии, влияние энтекавира на уровни РНК HBV было умеренным, достигая примерно 50%-ного снижения через 13 недель лечения. В качестве монотерапии ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1 обладает сильным супрессивным действием в отношении вирусной РНК, приводя к уменьшению транскриптов HBV более чем на 94%. Комбинация ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1 с любым из двух противовирусных агентов дополнительно повышает способность к ингибированию вирусной РНК, с уровнями супрессии вплоть до 98,6%.
Внутриклеточную ДНК HBV, а также ковалентнонепрерывную кольцевую ДНК, из образцов печени также оценивали с использованием количественной ПЦР. Лечение только энтекавиром или только пэгилированным интерфероном способно понижать внутриклеточные уровни ДНК на 2 log (Фигура 12, левая панель). Кроме того, однократное добавление ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1 к схеме лечения дополнительно снижало внутриклеточные уровни ДНК на 3 log. Хотя интерференция РНК не влияет непосредственно на внутриклеточную ДНК HBV, вероятно, что снижение уровней РНК и соответствующих транскриптов уменьшает способность процесса обратной транскрипции конвертировать матрицу прогеномной РНК в промежуточный продукт ДНК, приводя к его снижению. Действительно, несмотря на то, что при использовании ETV имеет место умеренное снижение уровней ковалентнонепрерывной кольцевой ДНК, составляющее немного более одного log, добавление ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1 не вызывает значительного снижения уровней cccDNA (Фигура 12, правая панель).
Экспрессию эффекторных молекул RNAi из тканей печени мышей PXB также определяли с помощью RT-QPCR (Фигура 13) и секвенированием следующего поколения (NGS, Фигуры 14-16). Результаты и данные NGS показывают, что число преобладающих эффекторных видов RNAi ограничено от 2 до 3 при продуцировании из shmiR (ssAAV8-HBV-shmiRx3-v1). Количество эффекторных видов резко увеличивается при продуцировании из shRNA (ssAAV8-HBV-shRNAx3-v1 и scAAV8-HBV-shRNAx3-v1). В качестве предшественника shmiR небольшой транскрипт РНК входит в путь RNAi выше по ходу транскрипции, где фермент Drosha обеспечивает первое расщепление и определяет один конец дуплекса RNAi. Этот конец содержит 3'-выступ длиной в 2 нуклеотида, который представлен в качестве оптимального субстрата для фермента дайсера, который расщепляет петлю для получения конечного дуплекса siRNA. Процессинг с участием ферментов дайсер и Drosha является очень точным, и путем глубокого секвенирования обнаруживается по существу минимальное количество последовательностей. С другой стороны, shrRNA первого поколения основываются на терминаторах транскрипции (т.е. поли-T) встроенных в последовательность для определения одного конца дуплекса RNAi. Этот механизм неточен и дает выступающие элементы из 2-5 нуклеотидов на 3'-выступами, которые не являются оптимальными для расщепления, опосредованного дайсером. В результате расщепления дайсером с низкой точностью, при глубоком секвенировании наблюдается большее число видов. Более важно, что это широкое распределение эффекторных видов, продуцируемых shrRNA (по сравнению с shmiR) может снижать активность желательных видов, а нежелательное продуцирование неэффективных молекул RNAi, направленных против HBV, может увеличить шансы возникновения и проявления побочных и нецелевых эффектов.
Специалистам в данной области техники понятно, что вышеописанные варианты осуществления изобретения могут быть внесены многочисленные изменения и/или модификации, без отклонения от широты заявленного объема настоящего изобретения. Поэтому описанные варианты осуществления изобретения должны рассматриваться во всех отношениях как иллюстративные, а не как ограничивающие.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Benitec Biopharma Limited
<120>  СРЕДСТВА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИИ ВИРУСА ГЕПАТИТА В (HBV) И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
<130>  177887
<150>  US 62/332,245
<151>  2016-05-05
<150>  PCT/AU2017/050413
<151>  2017-05-05
<160>  229
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  20
<212>  РНК
<213>  Вирус гепатита В
<400>  1
cauccugcug cuaugccuca                                                   20
<210>  2
<211>  23
<212>  РНК
<213>  Вирус гепатита В
<400>  2
uuugcugacg caacccccac ugg                                               23
<210>  3
<211>  20
<212>  РНК
<213>  Вирус гепатита В
<400>  3
aagccuccaa gcugugccuu                                                   20
<210>  4
<211>  28
<212>  РНК
<213>  Вирус гепатита В
<400>  4
gcaggucccc uagaagaaga acucccuc                                          28
<210>  5
<211>  23
<212>  РНК
<213>  Вирус гепатита В
<400>  5
caagguaugu ugcccguuug ucc                                               23
<210>  6
<211>  20
<212>  РНК
<213>  Вирус гепатита В
<400>  6
cucguggugg acuucucuca                                                   20
<210>  7
<211>  23
<212>  РНК
<213>  Вирус гепатита В
<400>  7
cucguguuac aggcgggguu uuu                                               23
<210>  8
<211>  29
<212>  РНК
<213>  Вирус гепатита В
<400>  8
ccgugugcac uucgcuucac cucugcacg                                         29
<210>  9
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Вирус гепатита В
<400>  9
uacgucccgu cggcgcugaa uc                                                22
<210>  10
<211>  19
<212>  РНК
<213>  Вирус гепатита В
<400>  10
aaaugccccu aucuuauca                                                    19
<210>  11
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор shmiR-1
<400>  11
ugaggcauag cagcaggaug c                                                 21
<210>  12
<211>  20
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Комплемент эффектора shmiR-1
<400>  12
cauccugcug cuaugccuca                                                   20
<210>  13
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор shmiR-2
<400>  13
cagugggggu ugcgucagca a                                                 21
<210>  14
<211>  20
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Комплемент эффектора shmiR-2
<400>  14
ugcugacgca acccccacug                                                   20
<210>  15
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор shmiR-3
<400>  15
aaggcacagc uuggaggcuu g                                                 21
<210>  16
<211>  20
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Комплемент эффектора shmiR-3
<400>  16
aagccuccaa gcugugccuu                                                   20
<210>  17
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  эффектор shmiR-4
<400>  17
gaguucuucu ucuaggggac c                                                 21
<210>  18
<211>  20
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  комплемент shmiR-4 эффектора
<400>  18
guccccuaga agaagaacuc                                                   20
<210>  19
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  эффектор shmiR-5
<400>  19
gagggaguuc uucuucuagg g                                                 21
<210>  20
<211>  20
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  кмплемент shmiR-5 эффектора
<400>  20
ccuagaagaa gaacucccuc                                                   20
<210>  21
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  эффектор shmiR-6
<400>  21
uucuucuucu aggggaccug c                                                 21
<210>  22
<211>  20
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  комплемент эффектора shmiR-6
<400>  22
cagguccccu agaagaagaa                                                   20
<210>  23
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  эффектор shmiR-7
<400>  23
acaaacgggc aacauaccuu g                                                 21
<210>  24
<211>  20
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  комплемент эффектора shmiR-7
<400>  24
aagguauguu gcccguuugu                                                   20
<210>  25
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  эффектор shmiR-8
<400>  25
uugagagaag uccaccacga g                                                 21
<210>  26
<211>  20
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  комплемент эффектора shmiR-8
<400>  26
ucguggugga cuucucucaa                                                   20
<210>  27
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  эффектор shmiR-9
<400>  27
aaaccccgcc uguaacacga g                                                 21
<210>  28
<211>  20
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  комплемент эффектора shmiR-9
<400>  28
ucguguuaca ggcgggguuu                                                   20
<210>  29
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  эффектор shmiR-10
<400>  29
ugcagaggug aagcgaagug c                                                 21
<210>  30
<211>  20
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  комплемент эффектора shmiR-10
<400>  30
cacuucgcuu caccucugca                                                   20
<210>  31
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  эффектор shmiR-11
<400>  31
gauucagcgc cgacgggacg a                                                 21
<210>  32
<211>  20
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  комплемент эффектора shmiR-11
<400>  32
cgucccgucg gcgcugaauc                                                   20
<210>  33
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  эффектор shmiR-12
<400>  33
ggauucagcg ccgacgggac g                                                 21
<210>  34
<211>  20
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  комплемент эффектора shmiR-12
<400>  34
gucccgucgg cgcugaaucc                                                   20
<210>  35
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  эффектор shmiR-13
<400>  35
ugauaagaua ggggcauuug g                                                 21
<210>  36
<211>  20
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  комплемент эффектора shmiR-13
<400>  36
caaaugcccc uaucuuauca                                                   20
<210>  37
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  эффектор shmiR-14
<400>  37
ugaggcccac ucccauaggu a                                                 21
<210>  38
<211>  20
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  комплемент эффектора shmiR-14
<400>  38
accuauggga gugggccuca                                                   20
<210>  39
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  эффектор shmiR-15
<400>  39
ggaaagcccu acgaaccacu g                                                 21
<210>  40
<211>  20
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  комплемент эффектора shmiR-15
<400>  40
agugguucgu agggcuuucc                                                   20
<210>  41
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  эффектор shmiR-16
<400>  41
gggcaacggg guaaagguuc a                                                 21
<210>  42
<211>  20
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  комплемент эффектора shmiR-16
<400>  42
gaaccuuuac cccguugccc                                                   20
<210>  43
<211>  107
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shmiR-1
<400>  43
gguauauugc uguugacagu gagcgacauc cugcugcuau gccucaacug ugaagcagau       60
ggguugaggc auagcagcag gaugccgccu acugccucgg acuucaa                    107
<210>  44
<211>  107
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shmiR-2
<400>  44
gguauauugc uguugacagu gagcgaugcu gacgcaaccc ccacugacug ugaagcagau       60
gggucagugg ggguugcguc agcaacgccu acugccucgg acuucaa                    107
<210>  45
<211>  107
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shmiR-3
<400>  45
gguauauugc uguugacagu gagcgaaagc cuccaagcug ugccuuacug ugaagcagau       60
ggguaaggca cagcuuggag gcuugcgccu acugccucgg acuucaa                    107
<210>  46
<211>  107
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shmiR-4
<400>  46
gguauauugc uguugacagu gagcgagucc ccuagaagaa gaacucacug ugaagcagau       60
gggugaguuc uucuucuagg ggacccgccu acugccucgg acuucaa                    107
<210>  47
<211>  107
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shmiR-5
<400>  47
gguauauugc uguugacagu gagcgaccua gaagaagaac ucccucacug ugaagcagau       60
gggugaggga guucuucuuc uagggcgccu acugccucgg acuucaa                    107
<210>  48
<211>  107
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shmiR-6
<400>  48
gguauauugc uguugacagu gagcgacagg uccccuagaa gaagaaacug ugaagcagau       60
ggguuucuuc uucuagggga ccugccgccu acugccucgg acuucaa                    107
<210>  49
<211>  107
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shmiR-7
<400>  49
gguauauugc uguugacagu gagcgaaagg uauguugccc guuuguacug ugaagcagau       60
ggguacaaac gggcaacaua ccuugcgccu acugccucgg acuucaa                    107
<210>  50
<211>  107
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shmiR-8
<400>  50
gguauauugc uguugacagu gagcgaucgu gguggacuuc ucucaaacug ugaagcagau       60
ggguuugaga gaaguccacc acgagcgccu acugccucgg acuucaa                    107
<210>  51
<211>  107
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shmiR-9
<400>  51
gguauauugc uguugacagu gagcgaucgu guuacaggcg ggguuuacug ugaagcagau       60
ggguaaaccc cgccuguaac acgagcgccu acugccucgg acuucaa                    107
<210>  52
<211>  107
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shmiR-10
<400>  52
gguauauugc uguugacagu gagcgacacu ucgcuucacc ucugcaacug ugaagcagau       60
ggguugcaga ggugaagcga agugccgccu acugccucgg acuucaa                    107
<210>  53
<211>  107
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shmiR-11
<400>  53
gguauauugc uguugacagu gagcgacguc ccgucggcgc ugaaucacug ugaagcagau       60
gggugauuca gcgccgacgg gacgacgccu acugccucgg acuucaa                    107
<210>  54
<211>  107
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shmiR-12
<400>  54
gguauauugc uguugacagu gagcgagucc cgucggcgcu gaauccacug ugaagcagau       60
ggguggauuc agcgccgacg ggacgcgccu acugccucgg acuucaa                    107
<210>  55
<211>  107
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shmiR-13
<400>  55
gguauauugc uguugacagu gagcgacaaa ugccccuauc uuaucaacug ugaagcagau       60
ggguugauaa gauaggggca uuuggcgccu acugccucgg acuucaa                    107
<210>  56
<211>  107
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shmiR-14
<400>  56
gguauauugc uguugacagu gagcgaaccu augggagugg gccucaacug ugaagcagau       60
ggguugaggc ccacucccau agguacgccu acugccucgg acuucaa                    107
<210>  57
<211>  107
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shmiR-15
<400>  57
gguauauugc uguugacagu gagcgaagug guucguaggg cuuuccacug ugaagcagau       60
ggguggaaag cccuacgaac cacugcgccu acugccucgg acuucaa                    107
<210>  58
<211>  107
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shmiR-16
<400>  58
gguauauugc uguugacagu gagcgagaac cuuuaccccg uugcccacug ugaagcagau       60
gggugggcaa cgggguaaag guucacgccu acugccucgg acuucaa                    107
<210>  59
<211>  107
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-1
<400>  59
ggtatattgc tgttgacagt gagcgacatc ctgctgctat gcctcaactg tgaagcagat       60
gggttgaggc atagcagcag gatgccgcct actgcctcgg acttcaa                    107
<210>  60
<211>  107
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-2
<400>  60
ggtatattgc tgttgacagt gagcgatgct gacgcaaccc ccactgactg tgaagcagat       60
gggtcagtgg gggttgcgtc agcaacgcct actgcctcgg acttcaa                    107
<210>  61
<211>  107
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-3
<400>  61
ggtatattgc tgttgacagt gagcgaaagc ctccaagctg tgccttactg tgaagcagat       60
gggtaaggca cagcttggag gcttgcgcct actgcctcgg acttcaa                    107
<210>  62
<211>  107
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-4
<400>  62
ggtatattgc tgttgacagt gagcgagtcc cctagaagaa gaactcactg tgaagcagat       60
gggtgagttc ttcttctagg ggacccgcct actgcctcgg acttcaa                    107
<210>  63
<211>  107
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-5
<400>  63
ggtatattgc tgttgacagt gagcgaccta gaagaagaac tccctcactg tgaagcagat       60
gggtgaggga gttcttcttc tagggcgcct actgcctcgg acttcaa                    107
<210>  64
<211>  107
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-6
<400>  64
ggtatattgc tgttgacagt gagcgacagg tcccctagaa gaagaaactg tgaagcagat       60
gggtttcttc ttctagggga cctgccgcct actgcctcgg acttcaa                    107
<210>  65
<211>  107
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-7
<400>  65
ggtatattgc tgttgacagt gagcgaaagg tatgttgccc gtttgtactg tgaagcagat       60
gggtacaaac gggcaacata ccttgcgcct actgcctcgg acttcaa                    107
<210>  66
<211>  107
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-8
<400>  66
ggtatattgc tgttgacagt gagcgatcgt ggtggacttc tctcaaactg tgaagcagat       60
gggtttgaga gaagtccacc acgagcgcct actgcctcgg acttcaa                    107
<210>  67
<211>  107
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-9
<400>  67
ggtatattgc tgttgacagt gagcgatcgt gttacaggcg gggtttactg tgaagcagat       60
gggtaaaccc cgcctgtaac acgagcgcct actgcctcgg acttcaa                    107
<210>  68
<211>  107
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-10
<400>  68
ggtatattgc tgttgacagt gagcgacact tcgcttcacc tctgcaactg tgaagcagat       60
gggttgcaga ggtgaagcga agtgccgcct actgcctcgg acttcaa                    107
<210>  69
<211>  107
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-11
<400>  69
ggtatattgc tgttgacagt gagcgacgtc ccgtcggcgc tgaatcactg tgaagcagat       60
gggtgattca gcgccgacgg gacgacgcct actgcctcgg acttcaa                    107
<210>  70
<211>  107
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-12
<400>  70
ggtatattgc tgttgacagt gagcgagtcc cgtcggcgct gaatccactg tgaagcagat       60
gggtggattc agcgccgacg ggacgcgcct actgcctcgg acttcaa                    107
<210>  71
<211>  107
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-13
<400>  71
ggtatattgc tgttgacagt gagcgacaaa tgcccctatc ttatcaactg tgaagcagat       60
gggttgataa gataggggca tttggcgcct actgcctcgg acttcaa                    107
<210>  72
<211>  107
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-14
<400>  72
ggtatattgc tgttgacagt gagcgaacct atgggagtgg gcctcaactg tgaagcagat       60
gggttgaggc ccactcccat aggtacgcct actgcctcgg acttcaa                    107
<210>  73
<211>  107
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-15
<400>  73
ggtatattgc tgttgacagt gagcgaagtg gttcgtaggg ctttccactg tgaagcagat       60
gggtggaaag ccctacgaac cactgcgcct actgcctcgg acttcaa                    107
<210>  74
<211>  107
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-16
<400>  74
ggtatattgc tgttgacagt gagcgagaac ctttaccccg ttgcccactg tgaagcagat       60
gggtgggcaa cggggtaaag gttcacgcct actgcctcgg acttcaa                    107
<210>  75
<211>  18
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Stemloop
<400>  75
acugugaagc agaugggu                                                     18
<210>  76
<211>  26
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  3’-фланкирующая последовательность главной цепи miR-30a
<400>  76
gguauauugc uguugacagu gagcga                                            26
<210>  77
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  3’-фланкирующая последовательность главной цепи miR-30a
<400>  77
cgccuacugc cucggacuuc aa                                                22
<210>  78
<211>  47
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  shРНК-1 sequence
<400>  78
cauccugcug cuaugccuca caagagauga ggcauagcag caggaug                     47
<210>  79
<211>  47
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shРНК-2
<400>  79
gcugacgcaa cccccacugg caagagacca guggggguug cgucagc                     47
<210>  80
<211>  47
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shРНК-3
<400>  80
aagccuccaa gcugugccuu ugugcuuaag gcacagcuug gaggcuu                     47
<210>  81
<211>  49
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shРНК-4
<400>  81
gguccccuag aagaagaacu ccaagagaga guucuucuuc uaggggacc                   49
<210>  82
<211>  49
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shРНК-5
<400>  82
cccuagaaga agaacucccu ccaagagaga gggaguucuu cuucuaggg                   49
<210>  83
<211>  49
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shРНК-6
<400>  83
gcaggucccc uagaagaaga acaagagauu cuucuucuag gggaccugc                   49
<210>  84
<211>  49
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shРНК-7
<400>  84
caagguaugu ugcccguuug ucaagagaac aaacgggcaa cauaccuug                   49
<210>  85
<211>  47
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shРНК-8
<400>  85
cucguggugg acuucucuca caagagauga gagaagucca ccacgag                     47
<210>  86
<211>  49
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shРНК-9
<400>  86
cucguguuac aggcgggguu uugugcuuaa accccgccug uaacacgag                   49
<210>  87
<211>  49
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shРНК-10
<400>  87
gcacuucgcu ucaccucugc acaagagaug cagaggugaa gcgaagugc                   49
<210>  88
<211>  49
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shРНК-11
<400>  88
acgucccguc ggcgcugaau cugugcuuga uucagcgccg acgggacgu                   49
<210>  89
<211>  49
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shРНК-12
<400>  89
cgucccgucg gcgcugaauc cugugcuugg auucagcgcc gacgggacg                   49
<210>  90
<211>  45
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shРНК-13
<400>  90
aaaugccccu aucuuaucau gugcuuugau aagauagggg cauuu                       45
<210>  91
<211>  51
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shРНК-14
<400>  91
auaccuaugg gagugggccu cacaagagau gaggcccacu cccauaggua u                51
<210>  92
<211>  51
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shРНК-15
<400>  92
cagugguucg uagggcuuuc cccaagagag ggaaagcccu acgaaccacu g                51
<210>  93
<211>  51
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shРНК-16
<400>  93
gaaccuuuac cccguugccc ggcaagagac cgggcaacgg gguaaagguu c                51
<210>  94
<211>  47
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shРНК-1
<400>  94
catcctgctg ctatgcctca caagagatga ggcatagcag caggatg                     47
<210>  95
<211>  47
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shРНК-2
<400>  95
gctgacgcaa cccccactgg caagagacca gtgggggttg cgtcagc                     47
<210>  96
<211>  47
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shРНК-3
<400>  96
aagcctccaa gctgtgcctt tgtgcttaag gcacagcttg gaggctt                     47
<210>  97
<211>  49
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shРНК-4
<400>  97
ggtcccctag aagaagaact ccaagagaga gttcttcttc taggggacc                   49
<210>  98
<211>  49
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shРНК-5
<400>  98
ccctagaaga agaactccct ccaagagaga gggagttctt cttctaggg                   49
<210>  99
<211>  49
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shРНК-6
<400>  99
gcaggtcccc tagaagaaga acaagagatt cttcttctag gggacctgc                   49
<210>  100
<211>  49
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shРНК-7
<400>  100
caaggtatgt tgcccgtttg tcaagagaac aaacgggcaa cataccttg                   49
<210>  101
<211>  47
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shРНК-8
<400>  101
ctcgtggtgg acttctctca caagagatga gagaagtcca ccacgag                     47
<210>  102
<211>  49
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shРНК-9
<400>  102
ctcgtgttac aggcggggtt ttgtgcttaa accccgcctg taacacgag                   49
<210>  103
<211>  49
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shРНК-10
<400>  103
gcacttcgct tcacctctgc acaagagatg cagaggtgaa gcgaagtgc                   49
<210>  104
<211>  49
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shРНК-11
<400>  104
acgtcccgtc ggcgctgaat ctgtgcttga ttcagcgccg acgggacgt                   49
<210>  105
<211>  49
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shРНК-12
<400>  105
cgtcccgtcg gcgctgaatc ctgtgcttgg attcagcgcc gacgggacg                   49
<210>  106
<211>  45
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shРНК-13
<400>  106
aaatgcccct atcttatcat gtgctttgat aagatagggg cattt                       45
<210>  107
<211>  51
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shРНК-14
<400>  107
atacctatgg gagtgggcct cacaagagat gaggcccact cccataggta t                51
<210>  108
<211>  51
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shРНК-15
<400>  108
cagtggttcg tagggctttc cccaagagag ggaaagccct acgaaccact g                51
<210>  109
<211>  51
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shРНК-16
<400>  109
gaacctttac cccgttgccc ggcaagagac cgggcaacgg ggtaaaggtt c                51
<210>  110
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  эффектор shmiR-17
<400>  110
gggaaagccc uacgaaccac a                                                 21
<210>  111
<211>  20
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  комплемент эффектора shmiR-17
<400>  111
gugguucgua gggcuuuccc                                                   20
<210>  112
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  эффектор shmiR-18
<400>  112
ggggaaagcc cuacgaacca c                                                 21
<210>  113
<211>  20
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  комплемент эффектора shmiR-18
<400>  113
ugguucguag ggcuuucccc                                                   20
<210>  114
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  эффектор shmiR-19
<400>  114
uggaaagccc uacgaaccac a                                                 21
<210>  115
<211>  20
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  комплемент эффектора shmiR-19
<400>  115
gugguucgua gggcuuucca                                                   20
<210>  116
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  эффектор shmiR-20
<400>  116
gaaagcccua cgaaccacug a                                                 21
<210>  117
<211>  20
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  комплемент эффектора shmiR-20
<400>  117
cagugguucg uagggcuuuc                                                   20
<210>  118
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  эффектор shmiR-21
<400>  118
aaagcccuac gaaccacuga a                                                 21
<210>  119
<211>  20
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  комплемент эффектора shmiR-21
<400>  119
ucagugguuc guagggcuuu                                                   20
<210>  120
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  эффектор shmiR-22
<400>  120
aaagcccuac gaaccacugc a                                                 21
<210>  121
<211>  20
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  комплемент эффектора shmiR-22
<400>  121
gcagugguuc guagggcuuu                                                   20
<210>  122
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  эффектор shmiR-23
<400>  122
gggauucagc gccgacggga c                                                 21
<210>  123
<211>  20
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  комплемент эффектора shmiR-23
<400>  123
ucccgucggc gcugaauccc                                                   20
<210>  124
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  эффектор shmiR-24
<400>  124
cgggauucag cgccgacggg a                                                 21
<210>  125
<211>  20
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  комплемент эффектора shmiR-24
<400>  125
cccgucggcg cugaaucccg                                                   20
<210>  126
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  эффектор shmiR-25
<400>  126
uggauucagc gccgacggga c                                                 21
<210>  127
<211>  20
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  комплемент эффектора shmiR-25
<400>  127
ucccgucggc gcugaaucca                                                   20
<210>  128
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  эффектор shmiR-26
<400>  128
gauucagcgc cgacgggacg a                                                 21
<210>  129
<211>  20
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  комплемент эффектора shmiR-26
<400>  129
cgucccgucg gcgcugaauc                                                   20
<210>  130
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  эффектор shmiR-27
<400>  130
auucagcgcc gacgggacgu a                                                 21
<210>  131
<211>  20
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  комплемент эффектора shmiR-27
<400>  131
acgucccguc ggcgcugaau                                                   20
<210>  132
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  эффектор shmiR-28
<400>  132
auucagcgcc gacgggacgc a                                                 21
<210>  133
<211>  20
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  комплемент эффектора shmiR-28
<400>  133
gcgucccguc ggcgcugaau                                                   20
<210>  134
<211>  107
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shmiR-17
<400>  134
gguauauugc uguugacagu gagcgagugg uucguagggc uuucccacug ugaagcagau       60
gggugggaaa gcccuacgaa ccacacgccu acugccucgg acuucaa                    107
<210>  135
<211>  107
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shmiR-18
<400>  135
gguauauugc uguugacagu gagcgauggu ucguagggcu uuccccacug ugaagcagau       60
ggguggggaa agcccuacga accaccgccu acugccucgg acuucaa                    107
<210>  136
<211>  107
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shmiR-19
<400>  136
gguauauugc uguugacagu gagcgagugg uucguagggc uuuccaacug ugaagcagau       60
ggguuggaaa gcccuacgaa ccacacgccu acugccucgg acuucaa                    107
<210>  137
<211>  107
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shmiR-20
<400>  137
gguauauugc uguugacagu gagcgacagu gguucguagg gcuuucacug ugaagcagau       60
gggugaaagc ccuacgaacc acugacgccu acugccucgg acuucaa                    107
<210>  138
<211>  107
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shmiR-21
<400>  138
gguauauugc uguugacagu gagcgaucag ugguucguag ggcuuuacug ugaagcagau       60
ggguaaagcc cuacgaacca cugaacgccu acugccucgg acuucaa                    107
<210>  139
<211>  107
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shmiR-22
<400>  139
gguauauugc uguugacagu gagcgagcag ugguucguag ggcuuuacug ugaagcagau       60
ggguaaagcc cuacgaacca cugcacgccu acugccucgg acuucaa                    107
<210>  140
<211>  107
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shmiR-23
<400>  140
gguauauugc uguugacagu gagcgauccc gucggcgcug aaucccacug ugaagcagau       60
gggugggauu cagcgccgac gggaccgccu acugccucgg acuucaa                    107
<210>  141
<211>  107
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shmiR-24
<400>  141
gguauauugc uguugacagu gagcgacccg ucggcgcuga aucccgacug ugaagcagau       60
gggucgggau ucagcgccga cgggacgccu acugccucgg acuucaa                    107
<210>  142
<211>  107
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shmiR-25
<400>  142
gguauauugc uguugacagu gagcgauccc gucggcgcug aauccaacug ugaagcagau       60
ggguuggauu cagcgccgac gggaccgccu acugccucgg acuucaa                    107
<210>  143
<211>  107
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shmiR-26
<400>  143
gguauauugc uguugacagu gagcgacguc ccgucggcgc ugaaucacug ugaagcagau       60
gggugauuca gcgccgacgg gacgacgccu acugccucgg acuucaa                    107
<210>  144
<211>  107
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shmiR-27
<400>  144
gguauauugc uguugacagu gagcgaacgu cccgucggcg cugaauacug ugaagcagau       60
ggguauucag cgccgacggg acguacgccu acugccucgg acuucaa                    107
<210>  145
<211>  107
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность shmiR-28
<400>  145
gguauauugc uguugacagu gagcgagcgu cccgucggcg cugaauacug ugaagcagau       60
ggguauucag cgccgacggg acgcacgccu acugccucgg acuucaa                    107
<210>  146
<211>  107
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-17
<400>  146
ggtatattgc tgttgacagt gagcgagtgg ttcgtagggc tttcccactg tgaagcagat       60
gggtgggaaa gccctacgaa ccacacgcct actgcctcgg acttcaa                    107
<210>  147
<211>  107
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-18
<400>  147
ggtatattgc tgttgacagt gagcgatggt tcgtagggct ttccccactg tgaagcagat       60
gggtggggaa agccctacga accaccgcct actgcctcgg acttcaa                    107
<210>  148
<211>  107
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-19
<400>  148
ggtatattgc tgttgacagt gagcgagtgg ttcgtagggc tttccaactg tgaagcagat       60
gggttggaaa gccctacgaa ccacacgcct actgcctcgg acttcaa                    107
<210>  149
<211>  107
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-20
<400>  149
ggtatattgc tgttgacagt gagcgacagt ggttcgtagg gctttcactg tgaagcagat       60
gggtgaaagc cctacgaacc actgacgcct actgcctcgg acttcaa                    107
<210>  150
<211>  107
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-21
<400>  150
ggtatattgc tgttgacagt gagcgatcag tggttcgtag ggctttactg tgaagcagat       60
gggtaaagcc ctacgaacca ctgaacgcct actgcctcgg acttcaa                    107
<210>  151
<211>  107
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-22
<400>  151
ggtatattgc tgttgacagt gagcgagcag tggttcgtag ggctttactg tgaagcagat       60
gggtaaagcc ctacgaacca ctgcacgcct actgcctcgg acttcaa                    107
<210>  152
<211>  107
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-23
<400>  152
ggtatattgc tgttgacagt gagcgatccc gtcggcgctg aatcccactg tgaagcagat       60
gggtgggatt cagcgccgac gggaccgcct actgcctcgg acttcaa                    107
<210>  153
<211>  107
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-24
<400>  153
ggtatattgc tgttgacagt gagcgacccg tcggcgctga atcccgactg tgaagcagat       60
gggtcgggat tcagcgccga cgggacgcct actgcctcgg acttcaa                    107
<210>  154
<211>  107
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-25
<400>  154
ggtatattgc tgttgacagt gagcgatccc gtcggcgctg aatccaactg tgaagcagat       60
gggttggatt cagcgccgac gggaccgcct actgcctcgg acttcaa                    107
<210>  155
<211>  107
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-26
<400>  155
ggtatattgc tgttgacagt gagcgacgtc ccgtcggcgc tgaatcactg tgaagcagat       60
gggtgattca gcgccgacgg gacgacgcct actgcctcgg acttcaa                    107
<210>  156
<211>  107
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-27
<400>  156
ggtatattgc tgttgacagt gagcgaacgt cccgtcggcg ctgaatactg tgaagcagat       60
gggtattcag cgccgacggg acgtacgcct actgcctcgg acttcaa                    107
<210>  157
<211>  107
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Кодирующая последовательность ДНК для shmiR-28
<400>  157
ggtatattgc tgttgacagt gagcgagcgt cccgtcggcg ctgaatactg tgaagcagat       60
gggtattcag cgccgacggg acgcacgcct actgcctcgg acttcaa                    107
<210>  158
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Прямой праймер для HBV
<400>  158
cacatcagga ttcctaggac c                                                 21
<210>  159
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Обратный праймер для HBV
<400>  159
aggttggtga gtgattggag                                                   20
<210>  160
<211>  26
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Зонд TaqMan для HBV
<400>  160
cagagtctag actcgtggtg gacttc                                            26
<210>  161
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  прямой праймер для cccДНК HBV
<400>  161
ctccccgtct gtgccttct                                                    19
<210>  162
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  обратный праймер для cccДНК HBV
<400>  162
gccccaaagc cacccaag                                                     18
<210>  163
<211>  27
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Зонд TaqMan для cccДНК HBV
<400>  163
cgtcgcatgg araccaccgt gaacgcc                                           27
<210>  164
<211>  69
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность ДНК с фланкирующей областью для shRNA-6
<400>  164
caacggatcc gcaggtcccc tagaagaaga acaagagatt cttcttctag gggacctgct       60
tttttagat                                                               69
<210>  165
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор shРНК-6, тип 1
<400>  165
ttcttctagg ggacct                                                       16
<210>  166
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  эффектор shРНК-6, тип 2
<400>  166
ttcttctagg ggacctg                                                      17
<210>  167
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  эффектор shРНК-6, тип 3
<400>  167
ttcttctagg ggacctgc                                                     18
<210>  168
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  эффектор shРНК-6, тип 4
<400>  168
ttcttctagg ggacctgct                                                    19
<210>  169
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  эффектор shРНК-6, тип 5
<400>  169
ttcttctagg ggacctgctt                                                   20
<210>  170
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  эффектор shРНК-6, тип 6
<400>  170
ttcttctagg ggacctgctt t                                                 21
<210>  171
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  эффектор shРНК-6, тип 7
<400>  171
cttcttctag gggacctg                                                     18
<210>  172
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  эффектор shРНК-6, тип 8
<400>  172
cttcttctag gggacctgc                                                    19
<210>  173
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  эффектор shРНК-6, тип 9
<400>  173
cttcttctag gggacctgct                                                   20
<210>  174
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  эффектор shРНК-6, тип 10
<400>  174
cttcttctag gggacctgct t                                                 21
<210>  175
<211>  22
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  эффектор shРНК-6, тип 11
<400>  175
cttcttctag gggacctgct tt                                                22
<210>  176
<211>  80
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность ДНК с фланкирующей областью для shmiR-6
<400>  176
ttgacagtga gcgacaggtc ccctagaaga agaaactgtg aagcagatgg gtttcttctt       60
ctaggggacc tgccgcctac                                                   80
<210>  177
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  эффектор shmiR-6, тип 1
<400>  177
ttcttctagg ggacctgc                                                     18
<210>  178
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  эффектор shmiR-6, тип 2
<400>  178
cttcttctag gggacctgc                                                    19
<210>  179
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  эффектор shmiR-6, тип 3
<400>  179
tttcttcttc taggggacct g                                                 21
<210>  180
<211>  22
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  эффектор shmiR-6, тип 4
<400>  180
tttcttcttc taggggacct gc                                                22
<210>  181
<211>  23
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  эффектор shmiR-6, тип 5
<400>  181
tttcttcttc taggggacct gcc                                               23
<210>  182
<211>  75
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность ДНК с фланкирующей областью для shRNA-15
<400>  182
gaaaggacga ggatccgcag tggttcgtag ggctttcccc aagagaggga aagccctacg       60
aaccactgtt tttct                                                        75
<210>  183
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 1 для shRNA-15
<400>  183
agccctacga accactgttt                                                   20
<210>  184
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 2 для shRNA-15
<400>  184
agccctacga accactgttt t                                                 21
<210>  185
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 3 для shRNA-15
<400>  185
aagccctacg aaccactgt                                                    19
<210>  186
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 4 для shRNA-15
<400>  186
aagccctacg aaccactgtt                                                   20
<210>  187
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 4 для shRNA-15
<400>  187
aagccctacg aaccactgtt t                                                 21
<210>  188
<211>  22
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 6 для shRNA-15
<400>  188
aagccctacg aaccactgtt tt                                                22
<210>  189
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 7 для shRNA-15
<400>  189
aaagccctac gaaccactg                                                    19
<210>  190
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 8 для shRNA-15
<400>  190
aaagccctac gaaccactgt                                                   20
<210>  191
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 9 для shRNA-15
<400>  191
aaagccctac gaaccactgt t                                                 21
<210>  192
<211>  22
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 10 для shRNA-15
<400>  192
aaagccctac gaaccactgt tt                                                22
<210>  193
<211>  23
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 11 для shRNA-15
<400>  193
aaagccctac gaaccactgt ttt                                               23
<210>  194
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 12 для shRNA-15
<400>  194
gaaagcccta cgaaccactg                                                   20
<210>  195
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 13 для shRNA-15
<400>  195
gaaagcccta cgaaccactg t                                                 21
<210>  196
<211>  22
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 14 для shRNA-15
<400>  196
gaaagcccta cgaaccactg tt                                                22
<210>  197
<211>  23
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 15 для shRNA-15
<400>  197
gaaagcccta cgaaccactg ttt                                               23
<210>  198
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 16 для shRNA-15
<400>  198
gaaagcccta cgaaccactg tttt                                              24
<210>  199
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 17 для shRNA-15
<400>  199
ggaaagccct acgaaccact                                                   20
<210>  200
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 18 для shRNA-15<400>  200
ggaaagccct acgaaccact g                                                 21
<210>  201
<211>  22
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 19 для shRNA-15
<400>  201
ggaaagccct acgaaccact gt                                                22
<210>  202
<211>  81
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность ДНК с фланкирующей областью для shmiR-15
<400>  202
gttgacagtg agcgaagtgg ttcgtagggc tttccactgt gaagcagatg ggtggaaagc       60
cctacgaacc actgcgccta c                                                 81
<210>  203
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 1 для shmiR-15
<400>  203
gaaagcccta cgaaccactg                                                   20
<210>  204
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 2 для shmiR-15
<400>  204
ggaaagccct acgaaccact g                                                 21
<210>  205
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 3 для shmiR-15
<400>  205
tggaaagccc tacgaaccac                                                   20
<210>  206
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 4 для shmiR-15
<400>  206
tggaaagccc tacgaaccac t                                                 21
<210>  207
<211>  22
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 5 для shmiR-15
<400>  207
tggaaagccc tacgaaccac tg                                                22
<210>  208
<211>  23
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 6 для shmiR-15
<400>  208
tggaaagccc tacgaaccac tgc                                               23
<210>  209
<211>  69
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность ДНК с фланкирующей областью для shRNA-12
<400>  209
ctcaacggat ccgcgtcccg tcggcgctga atcctgtgct tggattcagc gccgacggga       60
cgttttttc                                                               69
<210>  210
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 1 для shRNA-12
<400>  210
ttcagcgccg acgggac                                                      17
<210>  211
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 2 для shRNA-12
<400>  211
ttcagcgccg acgggacg                                                     18
<210>  212
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 3 для shRNA-12
<400>  212
ttcagcgccg acgggacgt                                                    19
<210>  213
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 4 для shRNA-12
<400>  213
ttcagcgccg acgggacgtt                                                   20
<210>  214
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 5 для shRNA-12
<400>  214
ttcagcgccg acgggacgtt t                                                 21
<210>  215
<211>  22
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 6 для shRNA-12
<400>  215
ttcagcgccg acgggacgtt tt                                                22
<210>  216
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 7 для shRNA-12
<400>  216
attcagcgcc gacggga                                                      17
<210>  217
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 8 для shRNA-12
<400>  217
attcagcgcc gacgggac                                                     18
<210>  218
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 9 для shRNA-12
<400>  218
attcagcgcc gacgggacg                                                    19
<210>  219
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 10 для shRNA-12
<400>  219
attcagcgcc gacgggacgt                                                   20
<210>  220
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 11 для shRNA-12
<400>  220
attcagcgcc gacgggacgt t                                                 21
<210>  221
<211>  22
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 12 для shRNA-12
<400>  221
attcagcgcc gacgggacgt tt                                                22
<210>  222
<211>  23
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 13 для shRNA-12
<400>  222
attcagcgcc gacgggacgt ttt                                               23
<210>  223
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 14 для shRNA-12
<400>  223
tggattcagc gccgacggga cgtt                                              24
<210>  224
<211>  75
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность ДНК с фланкирующей областью для shmiR-12
<400>  224
acagtgagcg agtcccgtcg gcgctgaatc cactgtgaag cagatgggtg gattcagcgc       60
cgacgggacg cgcct                                                        75
<210>  225
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 1 для shmiR-12
<400>  225
tggattcagc gccgacgg                                                     18
<210>  226
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 2 для shmiR-12
<400>  226
tggattcagc gccgacggga                                                   20
<210>  227
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 3 для shmiR-12
<400>  227
tggattcagc gccgacggga c                                                 21
<210>  228
<211>  22
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 4 для shmiR-12
<400>  228
tggattcagc gccgacggga cg                                                22
<210>  229
<211>  23
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Эффектор 5 для shmiR-12
<400>  229
tggattcagc gccgacggga cgc                                               23
<---