МИКРОБНЫЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ, ПРОИЗРАСТАЮЩИХ НА НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОЧВАХ
MICROBIAL PREPARATION FOR PROTECTING PLANTS GROWING ON OIL-CONTAMINATED SOILS

Изобретение относится к экологии и биотехнологии, а именно к технологическому использованию микроорганизмов для защиты растений, произрастающих на нефтезагрязненных почвах.
Нефть и нефтепродукты - основные химические загрязнители почвы, которая за счет своей значительной адсорбирующей поверхности способна аккумулировать загрязнения в больших количествах, что приводит к изменению агрохимических, физических, микробиологических характеристик и утрате плодородия. Все это отрицательно сказывается на росте и развитии растений, почвенных микроорганизмов и животных. Одним из наиболее перспективных и экологически безопасных методов восстановления почвы от нефтепродуктов является биоремедиация, основанная на естественных процессах разложения нефти в природе с участием микроорганизмов, способных окислять углеводороды. Однако при попадании в почву, микроорганизмы-нефтедеструкторы неизбежно вступают в контакт с растениями, произрастающими на загрязненных территориях. Их воздействие на растения осуществляется несколькими способами: непосредственное выделение внеклеточных биологически активных веществ, таких как фитогормоны; опосредованное воздействие путем разрушения пленки нефти, обволакивающей корневые волоски, для улучшения дыхания растений и получения питательных веществ, заблокированных нефтяной пленкой. Таким образом, с растения снимается не только негативный эффект нефти, но и происходит стимуляция роста и развития. Поэтому целесообразно использование микроорганизмов для защиты растений, растущих на нефтезагрязненных почвах.
Известен способ получения растительно-микробных ассоциаций для фиторемедиации на основе микроразмножаемых растений томата, рапса и арабидопсиса и плазмидосодержащих ризосферных бактерий, обладающих антимикробной активностью против бактерий вида Erwinia carotovora и грибов вида Phytophthora infestans (патент РФ №2443771, МПК C12N 1/00 C12N 1/14 A01N 63/00 В09С 1/10, опубл. 27.02.2012), который включает колонизацию посадочного материала культивируемых in vitro растений штаммом Pseudomonas aureofaciens BKM В-2500 Д, несущим плазмиды pBS216, pKSl, придающие устойчивость ему к нафталину и мышьяку, или Pseudomonas aureofaciens BKM В-2501 Д, несущим плазмиды pBS216, pBS501, придающие устойчивость ему к нафталину и никелю. Изобретение позволяет повысить защиту растений от токсического воздействия нафталина и тяжелых металлов, а также рост и устойчивость растений к фитопатогенным микроорганизмам. Общими признаками является наличие в препарате микроорганизмов, обладающих фитозащитными свойствами. Недостатками способа является присутствие в препарате генно-модифицированных микроорганизмов, а также технически сложное микроразмножение растений.
9
Запатентован штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens BKM В-2501 Д для биодеградации нефти и полициклических ароматических углеводородов и для защиты и улучшения роста растений в условиях комплексного загрязнения почв тяжелыми металлами (патент РФ 2008 126 545, МПК C12N 1/26 C12N 1/20 В09С 1/10 A01N 63/00 C12R 1/385, опубл. 10.01.2010). Биопрепарат включает аэробные нефтеокисляющие микроорганизмы, минеральный питательный субстрат, нормальные парафины С12-С18 и твердый субстрат-носитель. В качестве аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов он содержит ассоциацию представителей 4 родов и 8 видов: Bacillus cereus, В. subtilis, Actinomyces griseus, Act. glaucus, Pseudomonas fluorescens, Ps. mesentericus, Ps. denitri/icans, Arthrobacter globiformis, выделенных из нефти Советского месторождения Западной Сибири, в концентрации 2,5×10 КОЕ/г. В качестве субстрата-носителя содержит сферозолу и дополнительно содержит глюкозу. Общими признаками является наличие в препарате микроорганизмов, выделенных из нефти. Недостатком способа является большое количество видов микроорганизмов, что усложняет процесс производства препарата.
Известен микробиологический препарат для увеличения урожайности сельскохозяйственных культур и их защиты от насекомых-вредителей и болезней. Содержит в 1 г сухой крахмально-сахарозной смеси 2 млрд. жизнеспособных спор и клеток бактерий В. subtilis 26Д (ВНИИСХМ 128), 1 млрд. В. thuhngiensis ssp.thuringiensis (ВКПМ В5689) и 1 млрд. В. thuringiensis ssp.kurstaki (ВКПМ В6066) (патент РФ 2654569, МПК A01N 63/02, опубликован 21.05.2018). Изобретение позволяет повысить урожайность сельскохозяйственных культур. Общими признаками является то, что предлагаемый препарат предполагает использование микроорганизмов для увеличения урожайности растений. Недостатком способа является невозможность использования в загрязненных почвах.
Известен способ получения и применения биопрепарата для очистки почв и воды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами (патент РФ № 2428469, МПК C12N 1/20 C02F 3/34 C09K 3/32 В09С 1/10, опубл. 10.09.2011). Биопрепарат содержит, в (мас.%): нормальные парафины С12-С18 - 1.0-1.5, щавелевокислый аммоний - 0.05-0.1, хлористый калий - 0.1-0.5, водосодержащую культуральную жидкость на основе аэробных нефтеокисляющих бактерий - до 100. В качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий используются бактерии Mycobacterium phlei. Увеличение срока годности препарата до 3-х месяцев достигается за счет введения в препарат хлористого калия, который подавляет вредное воздействие продуктов жизнедеятельности бактерий на сами бактерии. Общим признаком является наличие в препарате нефтеокисляющего микроорганизма. Недостатком способа является отсутствие фитозащитного эффекта.
3
2
4
2
4
2
10
Известен способ получения и применения биопрепарата для очистки почв и воды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами (патент РФ №2365438, МПК В09С 1/10 C02F 3/34 C12N 1/26, опубл. 27.08.2009). Биопрепарат содержит в (мас.%): глицерин - 8-10, KNO - 0.360-0.367, KHPO - 0.054-0.055, NaHPO⋅12HO - 0.126-0.128, нефтеокисляющие микроорганизмы - не менее 3-10 кл/мл препарата, вода - остальное. Общими признаками является отсутствие фитотоксичности биопрепарата, что позволяет применять фиторемедиацию на завершающих стадиях очистки. Недостатком способа является применение препарата для условий повышенных температур, что нереализуемо в большинстве районов РФ.
На сегодняшний день не существует микробного препарата, который бы использовался для защиты растений в условиях нефтезагрязнения, повышая при этом всхожесть семян и улучшая развитие растений в интактных почвах.
3
2
4
2
4
4
Наиболее близким к предлагаемому является способ фиторемедиации почвы, загрязненной углеводородами включающий посев растений-фиторемедиантов и применение суспензии штамма микроорганизма - деструктора углеводородов, стимулирующего рост растений для ускорения скорости очистки почв на сильно загрязненных участках (Патент РФ №2618096 МПК В09С 1/00, опубл. 02.05.2017). При посеве используют семена люцерны посевной Medicago sativa или пшеницу озимую Triticum durum, и суспензию клеток штамма Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-2017Д совместно с содержащей фитогормоны средой культивирования следующего состава, г/л: KNO - 4.0; NaHPO - 1.4; KHPO - 0.4; MgSO×H2O - 0.8; сахароза -10.0; триптофан - 1.0. Штамм Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-2017Д применяют в качестве фитостимулятора роста растений. Общими признаками является присутствие в препарате штамма Rhodococcus erythropolis, используемого совместно со средой культивирования.
Недостатком способа являются акцент на фиторемедиацию почвы, а не на фитозащиту; применение всего двух растений.
Задачей предлагаемого технического решения является снижение стрессового воздействия нефти на растения, улучшение их питания и аэрации, стимуляция интактных растений.
Техническим результатом является улучшение состояния растений, произрастающих на нефтезагрязненных территориях, повышение биологических показателей интактных растений.
7
3
2
4
2
4
2
4
2
Технический результат достигается тем, что микробный препарат для защиты растений, произрастающих на нефтезагрязненных почвах, содержащий суспензию клеток микроорганизма, имеющую свойства повышения биологических показателей интактных растений, одновременно нефтеразрушающих, фитозащитных и ростостимулирующих, согласно изобретению, в качестве ростостимулирующего микроорганизма в составе суспензии содержит Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2784D, выделенный из ризосферы растений Elytrigia repens, произрастающего на нефтезагрязненной территории, в виде суспензии с содержанием не менее 1×10 КОЕ/г. клеток в среде роста следующего состава (г/л): NaNO - 3.0; KHPO⋅3HO - 1.0; MgSO⋅7HO - 0.5; KCl - 0.5; FeSO⋅7HO - 0.01; гексадекан - 20.0.
3
2
4
2
4
2
4
2
6
12
6
При получении биопрепарата, согласно изобретению, готовят суспензию жидкой культуры микроорганизма Rhodococcus erythropolis ВКМ Ac-2784D, выращиваемую глубинно на питательной среде следующего состава: NaNO - 3.0, KHPO⋅3HO - 1.0, MgSO⋅7HO - 0.5, KCl - 0.5, FeSO⋅7HO - 0.01, CHO - 5.0, с добавлением сырой нефти или гексадекана в концентрации 2% в качестве единственного источника углерода.
Штамм Rhodococcus erythropolis депонирован в коллекции ФБГУН ВКМ (г. Пущино) 12 октября 2017 г. под регистрационным номером ВКМ Ас-2784D.
Наличие в предлагаемом решении признаков, отличительных от признаков, характеризующих решение, принятое в качестве прототипа, позволяет сделать вывод о соответствии предлагаемого технического решения условию патентоспособности «новизна».
Сравнение предлагаемого технического решения с другими известными решениями в данной области, показывает следующее: не выявлено в результате поиска и сравнительного анализа технических решений, характеризующихся аналогичной с предлагаемым решением совокупностью признаков, обеспечивающих при использовании достижение аналогичных результатов, что позволяет сделать вывод о соответствии предлагаемого технического решения условию патентоспособности «изобретательский уровень».
Пример 1. Для получения биопрепарата брали штамм Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2784D.
3
2
4
2
2
4
2
6
12
6
Штамм микроорганизма предварительно выделяли из ризосферы растений нефтезагрязненной территории Заларинского района Иркутской области. Микроорганизм адаптирован к почвенно-климатическим условиям Восточной Сибири. Суспензию микроорганизма выращивали на питательной среде следующего состава (г/л): NaNO - 3.0, KHPO⋅3НО - 1.0, MgSO4⋅7HO - 0.5, KCl - 0.5, FeSO⋅7HO - 0.01, СНО - 5.0.
7
Приготовленную и простерилизованную в автоклаве при 1 атм. в течение 30 минут питательную среду вышеуказанного состава инокулировали бактериальным штаммом Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2784D, в количестве 1 мл с титром 10 и инкубировали в термостате при 26°С. Через 2 суток суспензия микроорганизма Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2784D с титром 10' КОЕ/мл готова для использования.
7
Пример 2. Способность суспензии микроорганизма Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2784D снижать токсическое действие нефти на растения. В качестве растительного объекта исследования использовали семена редьки масличной Raphanus sativus convar. oleiferus (L.) Sazonova&Stank., селекционный образец СИФИБР CO РАН «Линия ИрГСХА». Семена редьки масличной предварительно стерилизовали, тщательно промывали и замачивали на 24 ч в суспензии Rhodococcus erythropolis ВКМ Ac-2784D в концентрации 10 КОЕ/мл. В качестве контроля служили растения, семена которых были замочены в стерильной водопроводной воде. Обработанные семена высевали в контейнеры с увлажненным стерильным песком (60% от полной влагоемкости) с добавлением 2% (V/V) нефти. Растения выращивали в контролируемых условиях: 20°С, освещение 2.1 клк с фотопериодом 14/10 ч (день/ночь) в течение 14 суток. Анализировали всхожесть, массу и длину надземной части и корней растения (табл. 1). Нефть оказывала ингибирующее влияние на прорастание необработанных бактериями семян и рост полученных из них растений. Всхожесть снижалась на 50%, длина подземной и надземной части растения и масса проростков - на 60%. Обработка семян редьки масличной суспензией микроорганизма Rhodococcus erythropolis ВКМ Ac-2784D повышала всхожесть на 25% относительно контроля, а у полученных из этих семян растений приводила к увеличению длины корня - на 50%, высоты надземной части и ее массы - на 40%.
В качестве растительного объекта исследования использовали семена гороха Pisum sativum. Результаты снижения ингибирующего действия нефти на растения суспензией микроорганизма Rhodococcus erythropolis BKM Ас-2784D представлены в таблице 2.
В качестве растительного объекта исследования использовали семена кукурузы Zea mais L. Результаты снижения ингибирующего действия нефти на растения суспензией микроорганизма Rhodococcus erythropolis BKM Ас-2784D представлены в таблице 3.
7
Пример 3. Способность суспензии микроорганизма Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2784D восстанавливать фотосинтетическую активность растений и их пигментную систему в условиях нефтяного загрязнения. В качестве объектов исследования использовали семена гороха Pisum sativum, кукурузы Zea mais L. Семена растений предварительно стерилизовали и замачивали на 24 ч в суспензии микроорганизма в концентрации 10 КОЕ/мл. В качестве контроля использовали растения, семена которых были замочены в стерильной водопроводной воде. Обработанные семена высевали в контейнеры с увлажненным стерильным песком (60% от полной влагоемкости) с добавлением 2% (V/V) нефти на 14 суток. Результаты представлены в таблицах 4, 5.
Пример 4. Изучение фитостимулирующих свойств суспензии микроорганизма Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2784D.
4
3
2
2
4
2
4
3
Определение ауксиноподобной активности проводили в супернатанте бактерий Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2784D. Для стимуляции образования ауксинов микроорганизмом в жидкую минеральной среду следующего состава (г/л): NHNO - 1.0; Mg CI - 0.1; KHPO - 3.0; KHPO - 7.0; СаСО - 1.0; рН 7.0 добавляли D, L-триптофан в концентрации 200 мг/л.
Количество ауксинов определяли по методу Сальковского в модификации Гордона и Вебера, а их биологическую активность - с помощью двух биотестов: по подавлению прорастания семян горчицы сарепской и по интенсивности укоренения черенков фасоли. Результаты представлены в таблице 6.
Первичная оценка способности суспензии микроорганизма Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2784D выделять поверхностно-активные вещества оценивалась косвенными методами (табл. 7). Для увеличения количества синтезируемых биосурфактантов микроорганизм выращивался на питательной среде с н-гексадеканом в качестве единственного источника углерода. Содержание внеклеточных биосурфактантов Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2784D - 1.523 мг/л питательной среды. Проведенные качественные реакции выявили в составе биосурфактанта углеводный и липидный компоненты, а также отсутствие пептидов и высокомолекулярных углеводов.
f
На ТС-хроматограмме выделенных экстракцией сурфактантов Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2784D детектируется одно компактное пятно с R 0.78. Это свидетельствует о наличии лишь одного биосурфактанта, либо нескольких очень близких по структуре, что не позволяет разделить их методом ТСХ.
Для биосурфактанта микроорганизма Rhodococcus erythropolis BKM Ас-2784D был получен ИК-спектр в тонкой пленке, представленный на фиг. 1.
2
2
2
3
3
2
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
Наиболее интенсивными в спектре являются полосы валентных колебаний СН групп в интервале 2950-2855 см и деформационных колебаний этих групп при 1460 и 722 см. Широкая полоса поглощения в интервале 3400-2600 см характеризует колебания ν(OH) ассоциированных гидроксильных групп. Полоса ν(C=O) ассоциированной карбонильной группы расположена при 1652 см. Простые эфирные и сложноэфирные группы характеризуются полосами с максимумами в интервале 1165-1018 см, которые могут быть связаны с наличием фрагментов СН-О-СН и СН-O-СН. Колебанию ν(C=O) свободной карбонильной группы соответствует слабое плечо при 1738 см на высокочастотном крыле полосы при 1652 см. Дублетная полоса колебаний δ(СН) при 1375 см свидетельствует о возможном наличии разветвленных С(СН)-групп. Следовательно, биосурфактант, продуцируемый Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2784D, обладает сложной структурой, включающей длинноцепочечные алифатические углеводороды, эфирные, карбонильные и ОН-группы. Полученные данные позволяют предположить, что он представляет собой сложный эфир трегалозы и миколовых кислот.
На фиг. 2 представлены результаты световой микроскопии зоны корневых волосков Raphanus sativus convar. oleiferus, где (a) - нефть без бактерий, (б) - нефть и добавление штамма Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2784D, (в) - контроль без добавления нефти и бактерий, х 40.
Обнаруженная нами способность Rhodococcus erythropolis BKM Ас-2784D продуцировать биосурфактанты позволила предположить, что одним из возможных механизмов положительного влияния на выживаемость растений в условиях нефтезагрязнения является эмульгирование нефтяной пленки на поверхности корней. Для подтверждения этой гипотезы было проведено исследование зоны корневых волосков с помощью световой микроскопии (фиг. 2). У растений, выращенных в условиях нефтезагрязнения, эта зона оказалась покрытой нефтяной пленкой, а количество корневых волосков было незначительно. В варианте «нефть+микроорганизм» нефтяная пленка на поверхности корня не наблюдалась, а развитие корневых волосков практически не отличалось от их развития у контрольных растений, выращенных без внесения нефти и обработки бактериями.