МУТАНТНАЯ ПЕРОКСИДАЗА ТАБАКА
MUTANT TOBACCO PEROXIDASE

Настоящее изобретение относится к новым белкам, в частности мутантной негликозилированной пероксидазе табака, к кДНК, кодирующей мутантную пероксидазу табака, к применению данного фермента в биолюминесцентных анализах различного назначения, к наборам, включающим этот фермент.
Предлагаемая новая мутантная форма негликозилированной пероксидазы табака Nicotiana tabacum обладает по сравнению с известной пероксидазой табака более высокой каталитической активностью с рядом субстратов. Предложенный мутеин характеризуется тем, что природный аминокислотный остаток треонина в положении 151 в аминокислотной последовательности пероксидазы табака Nicotiana tabacum заменен на остаток триптофана (фиг.1). Данная замена может быть использована сама по себе или в комбинации с другими мутациями.
Пероксидаза катализирует окисление люминола в присутствии пероксида водорода с испусканием света. Такую реакцию используют в биолюминесцентных методах анализа.
Рекомбинантную пероксидазу табака можно производить в рекомбинантных растениях табака и томатов, при этом выход белка составляет приблизительно 60 мг и 20 мг с литра сока листьев генно-инженерного табака и плодов генно-инженерных томатов соответственно (Gazaryan, I.G., Lagrimini, L.M. (1996) Anionic tobacco peroxidase overexpressed in transgenic tobacco plants. I. Purification and unusual kinetic properties. Phytochemistry 41, 1029-1034). Фермент является гетерогенно-гликозилированным за счет суперпродукции. Также известна негликозилированная рекомбинантная пероксидаза табака, полученная путем экспрессии в клетках Е.coli. Однако при этом выход активной пероксидазы составляет не более 10%. (Хушпульян Д.М., Савицкий П.А., Рожкова A.M., Чубарь Т.А., Фечина В.А., Сахаров И.Ю., Лагримини Л.М., Тишков В.И., Газарян И.Г. (2003) Экспрессия анионной пероксидазы табака в клетках Escherichia coli и ее рефолдинг из телец включения. Биохимия, том 68, №11, с.1480-1487).
Техническая задача, решаемая посредством предлагаемого изобретения, состоит в получении мутантной формы пероксидазы табака с улучшенными характеристиками.
Технический результат, получаемый при реализации предлагаемого технического решения, состоит в улучшении каталитических свойств полученной мутантной формы пероксидазы табака по отношению к ряду субстратов, в том числе в реакции хемилюминесцентного окисления люминола.
Указанный технический результат достигается за счет введения двух нуклеотидных замен в последовательность кДНК, кодирующую аминокислотную последовательность пероксидазы табака Nicotiana tabacum, в результате чего происходит замена остатка треонина в положении 151 в аминокислотной последовательности фермента на остаток триптофана. Получаемая мутантная пероксидаза табака проявляет более высокую активность в хемилюминесцентной реакции окисления люминола по сравнению с таковой у рекомбинантной немутантной формы этого фермента. Настоящее изобретение позволяет снизить предел обнаружения фермента в ходе анализа, что обеспечит коммерциализацию его как реагента для люминесцентных методов анализа.
Мутантную форму пероксидазы табака получают следующим образом. кДНК пероксидазы табака получают на основе мРНК, выделенной из листьев Nicotiana tabacum, любым из известных методов молекулярной биологии. Далее кДНК пероксидазы амплифицируют методом ПЦР и клонируют в экспрессионный вектор. Подходящий вектор для экспрессии генов пероксидазы мутантного типов, например вектор pET40b, содержит перед геном пероксидазы табака промотор РНК-полимеразы фага Т7, находящийся под контролем лактозного репрессора. При использовании штамма-хозяина E.coli, способного экспрессировать РНК-полимеразу фага Т7, например, E.coli BL21(DE3)Codon Plus, экспрессия рекомбинантной пероксидазы табака может быть индуцирована с использованием изопропил-тиогалактозида. Введение нуклеотидных замен в гене пероксидазы табака, обеспечивающих замену Thrl51Trp в аминокислотной последовательности фермента, осуществляют с использованием одного из известных специалистам методов направленного мутагенеза, например, с использованием набора Quik-Change фирмы Stratagene. Для последующей трансформации используют полученные плазмиды с введенными нуклеотидными заменами и рекомбинантные штаммы E.coli, экспрессирующие РНК-полимеразу фага Т7 и синтезирующие тРНК редких для E.coli кодонов. Следующим этапом является культивирование трансформированных клеток E.coli до середины логарифмической фазы роста, после чего добавляют индуктор экспрессии гена пероксидазы и продолжают культивирование в течение 3-10 часов. Для выделения пероксидазы из телец включения полученную биомассу разрушают ультразвуком, центрифугируют, отмывают примесные белки солевым раствором и солюбилизируют в мочевине. После чего проводят процедуру реактивации солюбилизированной пероксидазы, т.н. рефолдинг. Для этого готовят рефолдинг-среду, содержащую гемин, хлорид кальция и другие компоненты для обеспечения искусственного фолдинга активного фермента. По окончании реактивации рефолдинг-среду концентрируют с использованием ультрафильтрации или любого другого метода, позволяющего уменьшить объем раствора. Полученный препарат очищают с использованием хроматографии, например гель-фильтрации. Полученный препарат характеризуется RZ=1,23, удельной активностью по ABTS 4030 Е/мг и аминокислотной последовательностью, изображенной на фиг.1.
Частный случай получения мутантной пероксидазы табака с заменой Thr151Trp приведен ниже.
Для получения мутантной пероксидазы табака с заменой Thr151Trp использовали плазмиду рТОР с геном пероксидазы табака дикого типа. Создание этой плазмиды описано в (Хушпульян Д.М., Савицкий П.А., Рожкова A.M., Чубарь Т.А., Фечина В.А., Сахаров И.Ю., Лагримини Л.М., Тишков В.И., Газарян И.Г. (2003) Экспрессия анионной пероксидазы табака в клетках Escherichia coli и ее рефолдинг из телец включения. Биохимия, том 68, №11, с.1480-1487).
Введение нуклеотидных замен, обеспечивающих замену в аминокислотной последовательности фермента остатка Thrl51 на остаток Trp осуществляли с использованием следующих праймеров:
GG
прямой праймер: 5'-CACAATTCTAATAAGGGGATG-3' и
CC
обратный праймер: 5'-CCCCTTATTAGAATTGTGGTAT-3' с использованием набора Quik-Change фирмы Stratagene (США). Полужирным подчеркнутым шрифтом показаны вводимые нуклеотидные замены. Эффективность введения мутации составляла 100%, как было показано секвенированием плазмид из 3 отдельных клонов. Полученная плазмида была названа рТОР Т151W.
Первоначально плазмида рТОР T151W была трансформирована в клетки Е.coli TG1 и выделена в препаративных количествах с использованием набора для выделения плазмид «Nucleospin Plasmid» фирмы "Machery-Nagel" (Германия). После этого выделенная плазмида рТОР T151W была использована для трансформации штамма Е.coli BL21(DE3)Codon Plus pLysS, в котором ген РНК-полимеразы фага Т7 находится в хромосоме клетки-хозяина под контролем промотора lacUV5, а также в больших количествах синтезируются тРНК редких для Е.coli кодонов AGA, AGG и ССС.
2
Для получения биомассы клеток с рекомбинантной мутантной пероксидазой табака дикого типа единичную колонию трансформированных клеток Е.coli BL21(DE3) Codon Plus pLysS культивировали в 3 мл среды 2YT (16 г/л бактотриптона, 10 г/л дрожжевого экстракта и 5 г/л хлорида натрия, рН 7,0) в присутствии 40 мкг/мл канамицина и 25 мкг/мл хлорамфеникола в течение 6 часов при 31°С и 180 об/мин. Далее из этой пробирки отбирали 1 мл культуральной жидкости и помещали в 200 мл той же среды, находящейся в качалочной колбе объемом 1 л. Культивирование проводили при 30°С и 100 об/мин. Клетки доращивали до начала логарифмической фазы и затем проводили индукцию экспрессию гена пероксидазы добавлением в среду ИПТГ до конечной концентрации 0,2 мМ. Далее температуру понижали до 27°С и культивировали клетки в течение 6 часов. Биомассу собирали центрифугированием при 5000 g на центрифуге фирмы "Eppendorf" 5403. Затем клетки ресуспендировали в 2 М растворе Nace, содержащем 10 мМ дитиотреитола (ДТТ), и разрушали ультразвуком в течение 10 мин при 22 кГц. Смесь после разрушения оставляли на 1,5 ч при комнатной температуре и затем повторяли обработку ультразвуком. Надосадочную жидкость удаляли, осадок промывали 10 мл 0,05 М буфера Трис-HCl, рН 8,5, и солюбилизировали в 10 мл 6 М мочевины, содержавшей 1 мМ ДТТ. Солюбилизированный апобелок (95% чистоты) приливали по каплям к среде для рефолдинга (100 мл) и инкубировали при 4°. Среда для рефолдинга содержала оптимизированные концентрации мочевины (1,8 М), окисленного глутатиона (0,5 мМ), ДТТ (0,1 мМ), а также 1 мМ CaCl, 5 мкМ гемина, 5% глицерина в 50 мМ буфере Трис-HCl, рН 9,5. В процессе инкубации измеряли активность по АБТС. После прекращения роста активности раствор фермента концентрировали в 30 раз на ячейке Amicon объемом 50 мл через мембрану YM-10. Полученный концентрированный раствор фермента наносили порциями по 3 мл на колонку (2,6×90 см) с Sephacryl S-200, уравновешенным 50 мМ буфером Трис-HCl, рН 8,5. Повторная гель-фильтрация проводилась на колонке (2,6×60 см) с Toyopearl HW 55, уравновешенным тем же буфером. Фракции, содержащие активный фермент, объединяли и концентрировали.
Свойства полученного продукта будут рассмотрены ниже.
Каталитические свойства в хемилюминесцентной реакции окисления люминола.
Реакцию окисления люминола проводили с использованием обычной рекомбинантной негликозилированной пероксидазы табака и мутантной формы, полученной представленным выше способом. Оптимальные условия катализа окисления люминола (рН среды, концентрации люминола и пероксида водорода) практически не отличаются для обеих форм пероксидазы табака. Интенсивность сигнала в случае применения мутантной формы пероксидазы табака в три раза выше (фиг.2), что обеспечивает более высокую чувствительность определения.
Активность мутантной пероксидазы табака с другими субстратами. В качестве субстратов были использованы наиболее известные субстраты пероксидаз, а именно АБТС, ферроцианид, гваякол и фенол. Удельную активность полученного мутанта пероксидазы табака сравнивали с активностью известной пероксидазы табака. Результаты сравнения представлены на фиг.3. Из фиг.3 видно, что активность нового мутантного фермента превосходит активность обычной рекомбинантной негликозилированной пероксидазы табака в случае фенола и ферроцианида в 1,5 и 4 раза соответственно. В случае АБТС и гваякола введение замены Thr151Trp в рекомбинантную пероксидазу табака не приводит к изменению активности с этими субстратами.
Представленные экспериментальные данные подтверждают достижение технического результата.