ЛАКТИЛАТЫ ДЛЯ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ И ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИЙ, ВЫЗВАННЫХ ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫМИ БАКТЕРИЯМИ У ЖИВОТНЫХ
LACTYLATES FOR PREVENTING AND TREATING INFECTIONS CAUSED BY GRAM-POSITIVE BACTERIA IN ANIMALS

Изобретение относится к способу предупреждения или лечения кишечных инфекций, вызванных грамположительными бактериями у животных, к указанным композициям для предупреждения или лечения кишечных инфекций, вызванных грамположительными бактериями у животных, к применению указанных композиций для предупреждения или лечения кишечных инфекций, вызванных грамположительными бактериями у животных, и к питательной композиции для животных, содержащей указанное соединение в количестве, эффективном для предупреждения или лечения кишечных инфекций, вызванных грамположительными бактериями у животных.
Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-синий или фиолетовый цвет путем окрашивания по методу Грама, в основном, благодаря большому количеству пептидогликана в их клеточной стенке. Среди грамположительных бактерий находятся патогенные бактерии Enterococcus, Clostridium, Listeria, Staphylococcus, различных видов Bacillus и Streptococcus. Хотя некоторые из этих организмов, главным образом, относятся к загрязнителям пищевых продуктов, другие могут вызвать заболевания у животных.
Например, Clostridia являются причиной возникновения ряда очень разнообразных заболеваний кишечника у животных. Поскольку они являются почти повсеместно распространенными бактериями, легко обнаруживаемыми в почве, пыли, фекалиях и пище, крайне трудно поддерживать животных свободными от Clostridia. Заболевания кишечника, связанные с Clostridium, могут быть достаточно тяжелыми. Например, Clostridia вовлечены в возникновение некротического энтерита у кур. У крупного рогатого скота энтерит, связанный с Clostridia, может принимать форму "синдрома внезапной смерти", который на практике может привести к гибели за ночь некоторого количества крупного рогатого скота. Также у других животных заболевания, связанные с Clostridia, могут причинить серьезный вред.
Известно введение животным антибиотиков для их защиты от кишечной инфекции. Также известно включение таких антибиотиков в питание животных. Однако существует все возрастающее сопротивление применению антибиотиков в корме для животных, и в настоящее время во многих странах введен закон, который запрещает применение антибиотиков в корме животных. Кроме того, антибиотики приходится вводить в очень строго контролируемых количествах.
Соответственно, существует необходимость в способе и композиции корма для животных без антибиотиков, которые помогут лечить или предупреждать кишечные инфекции, вызванные грамположительными бактериями у животных, в частности у млекопитающих, включая жвачных (например, крупный рогатый скот, овец, коз, оленей) и моногастричных (например, свиней, лошадей, кроликов); у птиц (например, домашней птицы, индюка, фазана, перепелки); у рыб, включая морских рыб (например, лосося, палтуса, тунца), пресноводных рыб (например, форели, карпа, тилапии); моллюсков (например, устрицы, мидий, двустворчатого моллюска, улитки) и ракообразных (например, краба, омара, креветки). Настоящее изобретение может также найти применение у человека и у пушных зверей, таких как норка, горностай, соболь и лисы.
Более того, может быть желательно подавить определенные виды грамположительных бактерий в кишечнике с целью увеличить рост животных. Считают, что это может представлять интерес для видов Lactobacillus. Настоящее изобретение также представляет интерес для данной области применения.
В настоящем изобретении предложен способ и композиция корма для животных для лечения или предупреждения кишечных инфекций, вызываемых грамположительными бактериями у животных. В соответствии с настоящим изобретением применяют антибактериальное соединение, выбранное из лактилата в соответствии с формулой 1,
3
n
формула 1: R2-COO-[-CH(СН)-СОО]-R1,
4
или его соли Na, К, Са, Mg, Fe(II), Zn, NH или Cu(II),
гликолилата формулы 2,
2
n
формула 2: R2-COO-[-CH-COO]-R1,
4
или его соли Na, К, Са, Mg, Fe(II), Zn, NH или Cu(II),
эфира молочной кислоты формулы 3,
3
2
формула 3: НО-СН(СН)-СОО-R,
и/или эфира гликолевой кислоты формулы 4,
2
2
формула 4: HO-CH-COO-R,
где в приведенных выше формулах R1 выбран из Н, n обозначает целое число со значением от 1 до 10 и R2 обозначает С1-С35алкильную или алкенильную цепь, которая может быть разветвленной или неразветвленной,
для предупреждения или лечения кишечных инфекций, вызванных грамположительными бактериями.
Настоящее изобретение относится к предупреждению или лечению кишечных инфекций, вызванных грамположительными бактериями у животных. Изобретение особенно привлекательно для применения против кишечных инфекций анаэробными или факультативно-анаэробными бактериями, даже более конкретно анаэробными бактериями. В пределах группы анаэробных бактерий особенно желательно иметь способ предупреждения или лечения кишечных инфекций спорообразующими бактериями, поскольку эти организмы трудно контролировать. Изобретение представляет особый интерес для предупреждения и лечения кишечных инфекций Clostridia.
В одном воплощении настоящее изобретение относится к предупреждению или лечению кишечных инфекций, вызванных Clostridium, в частности Clostridium perfringens у домашней птицы, в частности у кур.
В другом воплощении настоящее изобретение относится к предупреждению или лечению кишечных инфекций, вызванных Clostridium, в частности одной или более чем одной из Clostridium tetanii, novyi (тип В) septicum, chauvii, sordelii, hemolyticum, difficile, botulinum, у крупного рогатого скота.
В следующем воплощении настоящее изобретение относится к уменьшению кишечного роста видов Lactobacillus.
Отмечено, что WO 2004/107877 описывает антимикробную композицию, содержащую смесь молочной кислоты или ее производного и неорганической кислоты. Композиция описана как антимикробная в целом. Указано применение против Salmonella и Escherichia coli. Несмотря на то что лактилаты упомянуты как возможные производные молочной кислоты, их применение дополнительно не освещено. В этом источнике информации не содержится ничего, что указывает на особую эффективность, которая обнаружена при применении лактилатов против грамположительных бактерий у животных, или предполагает ее.
Далее отмечено, что GB 115480 описывает применение ацилированных альфа-гидроксикарбоновых кислот против бактерий и грибов, например плесневых грибов, милдью и дрожжей. Показано, что это соединение можно применять для внутреннего или наружного применения у человека или других животных, но это ни разу не объяснено. В этом источнике информации не содержится ничего, что указывает на особую эффективность, которая обнаружена при применении лактилатов против грамположительных бактерий у животных, или предполагает ее.
4
4
В настоящем изобретении можно применять антибактериальное соединение, выбранное из одного или более чем одного лактилата в соответствии с формулой 1 или его соли Na, К, Са, Mg, Fe(II), Zn, NH или Cu(II), гликолилата формулы 2 или его соли Na, К, Са, Mg, Fe(II), Zn, NH или Cu(II), эфира молочной кислоты формулы 3 и/или эфира гликолевой кислоты формулы 4.
Применение лактилата формулы 1 или его соли, как было показано, является предпочтительным.
В предпочтительном воплощении настоящего изобретения R2 представляет собой алкильную или алкенильную цепь с 6-20 атомами углерода. Более конкретно R2 представляет собой алкильную или алкенильную цепь с 6-18 атомами углерода. В данном воплощении подходящие заместители включают группы с 6 атомами углерода (капроновые), 8 атомами углерода (каприловые), 10 атомами углерода (каприновая кислота), 12 атомами углерода (лаурил), 14 атомами углерода (миристил), 16 атомами углерода (цетил, пальмитил), 18 атомами углерода (стеарил). Можно также применять смеси двух или более чем двух соединений. В тех случаях когда используют соль, может быть особенно предпочтительным использование соли Na, К, Са или Mg.
Значение для n предпочтительно находится в интервале от 1 до 5. Более конкретно n имеет значение 1, 2 или 3.
Особенно предпочтительно использование лауроиллактилата, миристоиллактилата и их натриевых солей. В одном воплощении используют смесь, содержащую 5-95 масс.% лауроиллактилата и 95-5 масс.% миристоиллактилата или натриевой соли (солей) этих соединений, более конкретно используют смесь, содержащую 25-75 масс.%, более конкретно 40-60 масс.% лауроиллактилата и 75-25 масс.%, более конкретно 40-60 масс.% миристоиллактилата или натриевой соли (солей) этих соединений.
В одном воплощении настоящего изобретения антибактериальное соединение, в частности лактилаты или их соли, используют в комбинации с одним или более чем одним кокцидиостатическим компонентом. Это представляет особый интерес в отношении домашней птицы в течение периода подавления иммунитета, который представляет собой период в жизни цыпленка, где иммунная система, которая защищает животное в яйце, разрушена, а иммунная система самого животного не полностью развита. Для цыплят этот период составляет период между 10 и 20 сутками жизни животного. Особый интерес представляет повышение сопротивляемости цыпленка к кишечным Clostridium инфекциям. Более конкретно, считают, что у цыплят некротическому энтериту, вызванному Clostridium, часто предшествует инфекция Eimeria. Считают, что Eimeria повреждает стенку кишечника, что делает ее менее устойчивой к инфекции Clostridium. Применение комбинации лактилата с одним или более чем одним кокцидиостатическим компонентом, следовательно, обеспечит повышенную сопротивляемость цыплят против некротического энтерита.
Подходящие кокцидиостатические компоненты известны в данной области техники, как и количества, в которых их следует давать. Подходящие компоненты включают мадурамицин, diclrzil, наразин, никарбазин, монензин, робенидин, лазалоцид, галофугинон, наразин, салиномицин, декоквинат и семдурамицин.
Композицию можно вводить животным в виде компонента традиционной композиции корма для животных. В контексте данного изобретения термин "корм для животных" включает твердый корм и жидкий корм, такой как питьевая вода. Следовательно, композицию можно вводить животному в виде твердого или жидкого компонента традиционной композиции корма для животных или в их питьевой воде. Композицию можно также вводить животному отдельным этапом, независимо от снабжения традиционной композицией корма для животных.
В одном воплощении изобретения антибактериальное соединение, в частности лактилат или его соль, присоединено к носителю. Это обеспечивает удобный путь получить антимикробную композицию в твердой порошкообразной форме. Подходящие носители выбраны из материала растительного волокна, растительных углеводов, таких как целлюлоза, и минеральных носителей, таких как кремнезем, крахмал, гипс и известь. В другом воплощении антимикробное соединение добавляют в смесь с растительным маслом, например с кукурузным маслом, соевым маслом или оливковым маслом. Антимикробное соединение может также находиться в форме таблетки или другого формованного тела, известного для обеспечения животных фармацевтическими компонентами.
Количество антимикробного соединения, в частности лактилата, вводимого животному, является таким, что оно эффективно для лечения или предупреждения кишечных инфекций, вызываемых грамположительными бактериями у животного, которому вводят соединение. Такое количество, соответственно, находится в интервале от 0,0001 до 5% на основе суммарной массы каждой порции корма животного. В предпочтительном воплощении количество может находиться в интервале от 0,001 до 2% относительно суммарной массы каждой порции корма животного. Было обнаружено, что по сравнению с применением молочной кислоты, как описано в WO 2004/107877, может быть возможным применение более низких концентраций эффективного компонента. Наряду с тем, что в Примерах WO 2004/107877 применяют 1,2 масс.% молочной кислоты, применение, например, лактилатов в соответствии с настоящим изобретением дает возможность применения уменьшенного количества активного компонента. Соответственно, в одном воплощении настоящего изобретения количество может находиться в интервале от 0,001 до 1 масс.%, более конкретно от 0,001 до 0,5 масс.% относительно суммарной массы каждой порции корма животного. Определение необходимого количества находится в пределах компетенции специалиста в данной области техники.
Если желательно, количество может быть выше, чем требуется для того, чтобы соединение было эффективным в лечении или предупреждении инфекций, вызванных грамположительными бактериями, таких как связанный с Clostridia энтерит у животного. Это может быть в том случае, если соединение также действует для стимуляции роста, улучшения корма для получения нужной пропорции и/или улучшает усваиваемость аминокислот, вводимых в кормах для животных.
Как упомянуто выше, антибактериальное соединение можно вводить животным в виде компонента традиционной композиции корма для животных. Общепринятая композиция корма для животных может содержать пшеницу, крахмал, мясную и костную муку, маис, муку подсолнечника, кукурузу, зерновые, ячмень, соевую муку, тапиоку, цитрусовую пульпу, бобовые, свекловичную пульпу и т.д. В соответствии с настоящим изобретением обеспечение животного антибактериальным соединением для лечения или предупреждения кишечных инфекций грамположительными бактериями вообще не будет объединено с обеспечением антибиотиками.
В WO 2004/107877 молочную кислоту или производное молочной кислоты применяют в комбинации с неорганической кислотой, выбранной из кислот, содержащих азот, серу и фосфор. Показано, что неорганическая кислота, как считают, снижает рН в химусе во время суммарного прохождения в организме животного, повышая посредством этого количество присутствующей недиссоциированной молочной кислоты, которая разрушает наружную мембрану патогенов.
Напротив, настоящее изобретение не основано на присутствии недиссоциированной молочной кислоты. Поэтому настоящее изобретение не требует присутствия неорганической кислоты для снижения рН в химусе. Соответственно, настоящее изобретение также относится к применению антибактериальных соединений, как описано выше, в частности лактилатов в соответствии с формулой 1, в предупреждении или лечении кишечных инфекций, вызванных грамположительными бактериями, где такое применение не сопровождается применением неорганической кислоты, выбранной из кислот, содержащих азот, серу и фосфор, для повышения присутствия недиссоциированной молочной кислоты.
Далее изобретение проиллюстрировано приведенными ниже примерами, которые показывают изобретательские качества данного изобретения без ограничения изобретения ими или посредством их.
Пример 1: Эффективность смеси лауроиллактилата натрия и миристоиллактилата натрия против некротического энтерита у кур
Эффективность смеси лауроиллактилата натрия и миристоиллактилата натрия против некротического энтерита у кур оценена компанией Schothorst Feed Research в экспериментальной модели инфекции С.perfringens, разработанной ею, в которой инфекция кокцидиоза используется в качестве предварительного инициатора для колонизации С.perfringens тонкого кишечника и индукции некротического энтерита. Инфекцию кокцидиоза инициируют патогенной Eimeria maxima и на пике инфекции кокцидиоза птицам делают прививку штаммом С.perfringens, патогенность которого для бройлерных цыплят доказана. Инфекция кокцидиоза, вызванная Е. maxima (приводящая в результате к повреждениям в среднем сегменте тонкого кишечника) с последующей инфекцией Clostridium приводит в результате к высоко воспроизводимой модели и простому и точному пути оценки повреждений, обусловленных некротическим энтеритом, поскольку повреждения, вызванные Е.maxima и Clostridium, легко отличить, поскольку повреждения обоих патогенов не встречаются в одном и том же сегменте кишечника.
Эксперименты проводят в сотрудничестве со Службой Охраны Животных (GD).
Эксперимент состоял из одной обработки и двух контрольных обработок. Все обработки состояли из шести повторов клеток с 19 цыплятами на клетку. Обработки приведены в таблице 1.
Таблица 1
Описание принципов обработки и рациона
Обр.
Сутки 9
Сутки 14, 15 и 16
Снабжение добавкой
Примечание
Прививочный материал
1
Физиологический раствор
Печеночный бульон
-
Контроль
2
Eimeria maxima
С.perfringens<sup>2</sup>
-
Контроль/Эксперимент
3
Eimeria maxima
С.perfringens
испытуемая смесь (0,3% смесь 50 масс.% лауроиллактилата натрия и 50 масс.% миристоиллактилата)
Эксперимент
<sup>1)</sup> 10000 спорулированных ооцист Eimeria maxima в 1 мл
<sup>2)</sup> 1×10<sup>8</sup> КОЕ С.perfringens в 1 мл
Животные, содержание и методы
Суточных бройлерных цыплят-петушков Ross 308 поставляла фирма Probroed & Sloot B.V., Нидерланды. На сутки 0 бройлеров привозили в лабораторный виварий Службы охраны животных (Deventer, the Netherlands) и содержали в метаболических (digestibility) клетках после индивидуального взвешивания. На основании системы весовых классов по 19 птиц были помещены в 30 Schothorst метаболических клеток с подстилкой, с получением сходного среднего веса на клетку. Цыплят содержали в этих клетках до окончания эксперимента на сутки 20. На сутки 9, если не наблюдалось смертности, число цыплят стандартизировали до 17 и снова измеряли массу птицы. Сначала удаляли птиц с явными визуальными отклонениями, а затем птиц удаляли случайным образом, чтобы уменьшить число до 17. Режим освещения и температуры на протяжении всего периода эксперимента был следующим: 22 часа света, затем 2 часа темноты в первый период от суток 0 до 9, а затем 18 часов света и 6 часов темноты на протяжении остального периода эксперимента. Температуру окружающей среды постепенно снижали с 32°С в начале до 25°С в конце эксперимента.
Корм поставлялся в свободном доступе от суток 0 и далее за исключением 5 часов перед прививками (сутки 9, 14, 15 и 16) и вскрытиями (сутки 15, 16 и сутки 20). Вода находилась в свободном доступе на протяжении всего эксперимента.
Композиция корма
Бройлеры получали стартовый рацион на основе пшеничной/соевой муки от суток прибытия до суток 9. От суток 9 и далее скармливали ростовой рацион на основе пшеницы/ячменя до окончания эксперимента (сутки 20). Ростовой рацион скармливали в виде муки в связи с необходимостью гомогенного смешивания в контрольных продуктах после приготовления корма. Рационы не содержали никаких кокцидиостатиков или антимикробных пищевых добавок, иных, чем испытуемый продукт. Состав питательных веществ в экспериментальных рационах соответствовал датским стандартам для удовлетворения потребности бройлеров в питательных веществах (CVB, 2006).
Прививочный материал
На сутки 9 бройлерам делали прививку 1 мл либо стерильного физиологического раствора, либо Е.maxima (10000 спорулированных ооцист/цыпленок в 1 мл) после 5 часов лишения корма. Начиная с суток 14 и далее бройлеров прививали либо 1 мл печеночного бульона (DIFCO), либо С.perfringens один раз в сутки, повторяя в течение трех суток, после 5 часов лишения корма. Подробный обзор различных обработок приведен в таблице 1.
8
Патогенный штамм С.perfringens был получен от Службы Охраны Животных в Девентере, Нидерланды (примерно 10 КОЕ в 1 мл). Этот штамм выращивали на агаре с овечьей кровью, и культура была типирована CIDC (Центральный институт борьбы с болезнями животных в Лелистаде) как С.perfringens, продуцирующий токсины типа α и β2. Каждые сутки использовали свежеприготовленный прививочный материал.
Оценка повреждений
Clostridium perfringens: Большие и микроскопические повреждения обычно встречаются в тонком кишечнике, в частности в проксимальном сайте. Использовали приведенный ниже способ оценки:
0: повреждений нет
1: 1-5 небольших повреждений (пятна диаметром менее 1 мм)
2: более чем 5 небольших повреждений (пятна диаметром менее 1 мм) или 1-5 повреждений большего размера (пятна диаметром 1-2 мм);
3: более чем 5 повреждений большего размера (диаметром 1-2 мм) или эрозивные зоны;
4: мертвые птицы с посмертным положительным диагнозом некротического энтерита.
Всех птиц оценивали "слепым методом", то есть человек, оценивающий птиц на наличие повреждений, не знал об обработке птиц.
Измерения
Во время эксперимента измеряли следующие параметры:
- индивидуальная масса тела на сутки прибытия и средние на клетку на сутки 9 и сутки 20 эксперимента;
- масса тела птиц перед вскрытием;
- потребление пищи на клетку в периоды от суток 0 до 9 и ежесуточное потребление пищи в возрасте от 9 до 20 суток;
- повреждения, обусловленные кокцидиозом, и повреждения, обусловленные некротическим энтеритом, в слизистой оболочке тонкого кишечника у 24 птиц на обработку на сутки 15, сутки 16 и сутки 20 эксперимента (всего 72 птицы на обработку);
- смертность на клетку в возрасте от 0 до 20 суток.
Ежесуточно записывали все рутинные действия исследования, нарушения здоровья и смертность (с ее наиболее вероятной причиной).
Статистические анализы
Необработанные данные анализировали на выбросы. Значительные выбросы исключали из статистического анализа. Встречаемость повреждений НЭ (некротический энтерит) (% пораженных птиц) анализировали с помощью точного критерия Фишера, тогда как измерения тяжести повреждений и ежесуточного потребления пищи анализировали с помощью анализа варианс (ANOVA), используя статистическое программное обеспечение Genstat. Средние для обработки сравнивали путем наименьшей значимой разности (LSD). Р не более 0,05 считали статистически значимым, тогда как Р в интервале от более 0,05 до не более 0,10 считали тенденцией, близкой к значимой.
Результаты и обсуждение
Встречаемость и тяжесть повреждений
Оценка повреждений на сутки 15 (1 сутки после инфекции)
В таблице 2 приведен как процент положительно оцененных птиц (птиц с повреждениями НЭ), так и средний балл повреждения у всех положительно оцененных птиц. Поскольку средний балл повреждения всех исследованных птиц, как пораженных, так и не пораженных, дает более репрезентативную картину для популяции, статистические анализы проводили по этим результатам (см. пятую колонку таблицы 2). Тяжесть повреждений как у положительно, так и отрицательно оцененных птиц показана на шкале от 0 до 4 (см. раздел "оценка повреждений").
Таблица 2
Птицы, у которых наблюдали НЭ (%), и средняя тяжесть повреждений, оцениваемая на сутки 15 (1 сутки после инфекции)
Группа
Обработка
Дозировка
Птицы, положительные по НЭ (%)
Тяжесть повреждений
Тяжесть повреждений (птицы, положит. по НЭ)<sup>1</sup>
1
Отрицательный контроль
-
0<sup>a</sup>
0,0<sup>а</sup>
0,0
2
Положительный контроль
-
16<sup>аб</sup>
0,5<sup>б</sup>
3,0
3
Испытуемая смесь
0,3%
17<sup>аб</sup>
0,4<sup>б</sup>
2,5
<sup>а,б</sup>Значения без общего верхнего индекса в колонке различаются значимо (Р не более 0,05).
<sup>1)</sup> Тяжесть повреждений у птиц, оцененных положительно на НЭ.
Наблюдали значимый эффект обработки на встречаемость НЭ. Как ожидали, самую низкую встречаемость наблюдали при неинфекционной контрольной обработке, но результаты были сравнимы с результатами обработок с добавлением испытуемой смеси и инфекционного контроля без добавок.
На основании ANOVA был сделан вывод, что существует значимый эффект обработки на тяжесть некротических повреждений на сутки 15 (Р менее 0,001). По тяжести повреждений было очевидно, что повреждения были более тяжелыми при инфекционных обработках как без добавок, так и с добавкой, чем при неинфекционной контрольной обработке, где при последней не было положительно оцененных птиц. Среди инфекционных обработок статистически значимых различий не наблюдали.
Оценка повреждений на сутки 16 (2 суток после инфекции)
В таблице 3 процент положительно оцененных птиц и средний балл повреждений птиц приведены на сутки 16.
Таблица 3
Птицы, у которых наблюдали НЭ (%), и средняя тяжесть повреждений, оцениваемая на сутки 16 (2 сутки после инфекции)
Группа
Обработка
Дозировка
Птицы, положительные по НЭ (%)
Тяжесть повреждений
Тяжесть повреждений (положит. птицы)<sup>1)</sup>
1
Отрицательный контроль
-
0<sup>a</sup>
0,0<sup>а</sup>
0,0
2
Положительный контроль
-
68<sup>б</sup>
2,1<sup>в</sup>
3,2
3
Испытуемая смесь
0,3%
41<sup>б</sup>
1,1<sup>б</sup>
2,7
<sup>а,б</sup>Значения без общего верхнего индекса в колонке различаются значимо (Р не более 0,05).
Из сравнения результатов встречаемости НЭ и тяжести повреждений на сутки 16 с результатами суток 15 ясно, что тяжесть инфекции была выше 2 суток после инфекции. Хотя снова наблюдали статистически значимый эффект обработки на встречаемость НЭ, очевидно, что это является следствием различия между неинфекционной контрольной обработкой и инфекционными обработками, которое соответствовало ожидаемому, тогда как среди инфекционных обработок значимого различия не наблюдали.
Четкое отличие можно вывести в отношении тяжести повреждений на 2 сутки после инфекции. Обработка с добавлением испытуемой смеси приводила в результате к явному уменьшению тяжести повреждений по сравнению с инфекционным контролем без добавок, хотя средние баллы тяжести повреждений были все же выше, чем в неинфекционном контроле.
Оценка повреждений на сутки 20 (6 суток после инфекции)
На сутки 20 значимых различий между обработками не наблюдали. При всех обработках птицы выздоравливали от НЭ, по меньшей мере на основании макроскопического исследования, при 0% встречаемости и, очевидно, 0,0 для тяжести повреждений.
Смертность
Смертность является одним из параметров для измерения тяжести инфекции Clostridium в стаде. В данном эксперименте смертность сравнивали среди обработок. Смертность составила 14,6% при инфекционной контрольной обработке (обработка 2) и 0% в неинфекционном контроле. Добавление испытуемой смеси приводило в результате к снижению смертности (5,1%).
Параметры продуктивности
Помимо оценки повреждений, в период испытания измеряли параметры продуктивности, такие как масса тела и суточное потребление пищи.
Масса тела суточных бройлеров при всех обработках составляла примерно 47 грамм. Поскольку обработки от суток 0 до 9 были сходными, в этот период различий в приросте массы тела и потреблении пищи не наблюдали.
В период инфекции от суток 9 до 20 оба параметра продуктивности подверглись значимому влиянию индивидуальных обработок. Прирост массы тела был самым высоким в неинфекционном контроле, как ожидали, тогда как бройлеры при инфекционных обработках без добавок показали самый низкий прирост массы тела. Это привело к снижению конечной массы на 30% на сутки 20 (523 г в сравнении с 749 г). Инфекционная обработка с добавками привела в результате к значительно более высокому потреблению пищи и приросту массы тела по сравнению с инфекционным контролем без добавок. Снижение продуктивности могло быть уменьшено на 10%, показывая потерю конечной массы примерно на 20% по сравнению с неинфицированной контрольной группой (примерно 583 г в сравнении с 749 г). Был сделан вывод, что испытуемая смесь значительно повышала продуктивность во время субклинической инфекции Clostridium.
Пример 2: Тесты in vitro лактилатов против Clostridium
Жидкие культуры Clostridium perfringens ATCC 13124 выращивали в пробирках с завинчивающимися крышками (100×16 мм), содержащих 10 мл бульона с сердечно-мозговой вытяжкой (Oxoid CM225, Basingstoke, United Kingdom) в течение 24 часов при 30°С. Бульон с сердечно-мозговой вытяжкой готовили с варьирующими количествами лактилатов. рН сред доводили до 6,0 с помощью 9М серной кислоты, используя рН-метр Handylab рН 12, оборудованный датчиком Blueline 16 рН (микро) (№285129163). Все среды стерилизовали фильтрованием, используя 0,45 мкм целлюлозоацетатные фильтры (Minisart syringefilter, стерильные и апирогенные, №16555, Sartorius, Gottingen, Germany) (9). 300 мкл каждой среды переносили на панель стерильного 100-луночного сотового планшета Bioscreen honeycombe (Thermo electron Oy, Vantaa, Finland). Планшеты с заполненными лунками хранили при -30°С до дальнейшего использования.
2
В лунки планшетов вносили по 3 мкл культуры, используя стерильный диспенсер для многократного дозирования Hamilton (Hamilton, Bonaduz, Switserland). Скорость роста тестируемых организмов определяли при 30°С системой культивирования Bioscreen С (Оу Growth Curves AB Ltd, Helsinki, Finland). Чтобы обеспечить условия с низким содержанием кислорода, Bioscreen помещали внутрь анаэробного бокса, оборудованного датчиком кислорода М-12 типа (In Vivo 400 hypoxia workstation, Biotrace International Plc, Bridgend, United Kingdom). Давление кислорода регулировали при 0% кислорода, используя модуль газового смесителя Ruskinn (Biotrace International Plc). Система Bioscreen С кинетически измеряет проявление мутности путем вертикальной фотометрии одновременно в количестве лунок вплоть до 200. Оптическую плотность культур автоматически измеряли при фиксированных интервалах времени при 420-580 нм, используя широкополосный фильтр.
В таблице 4 показаны значения МИК (минимальная ингибирующая концентрация) для различных лактилатов, тестируемых на Clostridium perfringens ATCC 13124 в бульоне с сердечно-мозговой вытяжкой. В скобках приведено число повторов. МИК обозначает минимальную ингибирующую концентрацию, которая представляет собой самую низкую концентрацию, где увеличение поглощения культуры не превышает порогового значения, которое было определено как среднее увеличение значения поглощения в пустых контролях плюс трехкратное стандартное отклонение. Оказалось, что даже при очень низкой концентрации лактилаты способны подавлять рост Clostridium perfringens.
Таблица 4
Значения МИК для различных лактилатов
Лактилаты
Значения МИК
С8 лактилат
0,05% (2х)
С10 лактилат
0,04% (2х)
С12 лактилат
0,002% (2х)
С14 лактилат
0,001% (2х)
С16 лактилат
0,002% (2х)
С18:1 лактилат
0,02% (2х)
Смесь 1:1 С10/С12 лактилата
0,002% (3х)
Смесь 1:1 С12/С14 лактилата
0,001% (3х)
Пример 3: Исследования зависимости доза-ответ и исследования действия смеси лауроиллактилата натрия и миристоиллактилата натрия по предупреждению некротического энтерита у кур
Аналогично Примеру 1 было исследовано влияние дозы соединения. Кроме того, было исследовано применение смеси на цыплятах, которые не были предварительно инфицированы Eimeria и Clostridium.
Проведенные обработки суммированы в таблице 5.
Таблица 5
Описание обработок
Обработка
Описание
1
Неинфекционная
2
Неинфекционная + 0,3% испытуемой смеси
3
Инфекционная<sup>1)</sup>
4
Инфекционная + 0,6% испытуемой смеси
5
Инфекционная + 0,3% испытуемой смеси
6
Инфекционная + 0,3% испытуемой смеси (диоксид кремния)
7
Инфекционная + 0,15% испытуемой смеси
8
Инфекционная + 0,075% испытуемой смеси
9
Инфекционная + 0,038% испытуемой смеси
10
Инфекционная + 0,019% испытуемой смеси
11
Инфекционная + 0,010% испытуемой смеси
12
Инфекционная + 0,005% испытуемой смеси
Испытуемая смесь была составлена из 50 масс.% лауроиллактилата натрия и 50 масс.% миристоиллактилата.
Результаты можно суммировать следующим образом. В данном эксперименте последовательная инфекция Е.maxima и С.perfringens приводила к заболеваемости некротическим энтеритом в 56% случаев и средней оценке повреждения 1,6 в течение первых двух суток после инфекции. Добавление в рацион птиц испытуемой смеси уменьшало число инфицированных птиц, и наблюдали эффект доза-ответ, показывающий самую высокую эффективность при 0,6% и 0,3% обработках. Тяжесть повреждений значительно уменьшалась вследствие добавления испытуемой смеси, и эффект доза-ответ по этому параметру также в значительной степени присутствовал. Повреждения были менее тяжелыми при обработках самыми высокими дозами испытуемой смеси. Добавление испытуемой смеси в чистой форме приводило к несколько лучшему ответу, чем добавление испытуемой смеси посредством носителя диоксида кремния. Добавление испытуемой смеси в количестве 0,6% приводило к значительному снижению смертности (4,6%), и она не была значительно выше, чем при неинфекционной контрольной обработке. Результаты с 0,3% испытуемой смеси подтвердили результаты, наблюдаемые при оценке повреждений.
В отношении продуктивности наблюдали эффект, когда сравнивали здоровых птиц в условиях добавления и без добавления испытуемой смеси друг с другом. Обеспечение испытуемой смесью вело к повышению массы тела в стартовой фазе и в ростовой фазе. Обеспечение инфицированных птиц высокими дозами испытуемой смеси приводило в результате к тому, что птицы имели конечную массу (сутки 37), сходную с массой птиц, которые вообще не были инфицированы.
Можно сделать вывод, что испытуемая смесь, особенно в дозе 0,3 масс.% или выше, эффективна при предупреждении развития некротического энтерита у бройлеров на основании пониженной заболеваемости и менее тяжелых повреждений.
Пример 4: Исследование активности лауроилгликолата натрия против грамположительных бактерий in vitro
1. Материалы и методы
1.1. Бактериальные культуры и условия культивирования
Штаммы, используемые в этом эксперименте:
Микроорганизм
Штамм
Происхождение
Clostridium perfringens
NCTC 10240
Курица
Clostridium sporogenes
NCTC 13020
Типовой штамм
Enterococcus faecalis
DSM 20478
Типовой штамм
Lactobacillus acidophilus
DSM 20079
Типовой штамм, среда человек/животное
Listeria monocytogenesStaphylococcus aureus
NRRL В-33028ATCC 6538P
Домашняя птица
Все культуры, кроме Clostridium perfringens и C.sporogenes, выращивали в пробирках с навинчивающимися крышками (100×16 мм), содержащих 10 мл бульона с сердечно-мозговой вытяжкой (Oxoid, Basingstoke, UK). Культуры Clostridium переносили в пробирки с навинчивающимися крышками, содержащими 10 мл среды мяса, прошедшего тепловую обработку (Cooked Meat medium, Oxoid). Все культуры инкубировали 24 ч при 30°С без перемешивания.
1.2. Тестируемые соединения
Готовили исходный раствор лауроилгликолата натрия в деминерализованной воде и рН доводили до 6,8 с помощью NaOH.
1.3. Исследования роста Bioscreen
Готовили бульон с сердечно мозговой вытяжкой с увеличивающимся содержанием тестируемого соединения. Готовили две различные серии концентраций: серию низких концентраций (low range) от 0 до 0,0045% с 10 шагами по 0,005% и серию высоких концентраций (high range) от 0 до 0,09% с 10 шагами по 0,01%. Среды готовили в количестве 10 мл и стерилизовали путем фильтрации (целлюлозно-нитратные мембраны Sartorius с диаметром пор 0,45 мкм). 200 мкл каждой среды переносили на панель стерильных 100-луночных планшетов Bioscreen honeycomb (Oy Growth Curves Ab Ltd, Helsinki, Finland). Планшеты с заполненными лунками замораживали при -20°С, герметично упаковывали в полиэтиленовые пакеты и хранили при -20°С до последующего использования.
1.4. Исследования роста Bioscreen
Луночные планшеты быстро размораживали и инокулировали 3 мкл культуры, которая росла в течение ночи в бульоне с сердечно-мозговой вытяжкой или среде мяса, прошедшего тепловую обработку. Скорости роста определяли с помощью Bioscreen С (Oy Growth Curves Ab Ltd, Helsinki, Finland), которые кинетически измеряли развитие помутнения путем вертикальной фотометрии. Планшеты инкубировали в течение 72 ч при 30°С, оптическую плотность культур измеряли каждые 15 минут при 420-580 нм с использованием широкополосного фильтра. Две культуры Clostridium растили при анаэробных условиях, что выполняли путем помещения Bioscreen внутрь анаэробной камеры Invivo2 hypoxia (Ruskin Technology Ltd/Ruskin Life Sciences Ltd, Bridgend, UK), оборудованной газовым смесителем Ruskin gasMixer Q(N2). Уровень кислорода устанавливали на 0,1%. Луночные планшеты Bioscreen предварительно уравновешивали азотом путем помещения их на ночь в анаэробные условия. Луночные планшеты инокулировали внутри камеры 3 мкл активно растущей культуры Clostridium.
2. Результаты и обсуждение
В таблице 1 представлены величины МИК (минимальная ингибирующая концентрация, то есть наиболее низкая концентрация, способная минимизировать рост бактерий в специфических условиях) после 72 ч при 30°С.
Таблица 1: Величины МИК лауроилгликолата натрия после 72 ч при 30°С (наиболее высокие из двух повторов).
Микроорганизм
По Граму
МИК (%)
Clostridium perfringens
Положительный
0,01
Clostridium sporogenes
Положительный
0,01
Enterococcus faecalis
Положительный
0,09
Lactobacillus acidophilus
Положительный
0,002
Listeria monocytogenes
Положительный
0,01
Staphylococcus aureus
Положительный
0,01
Как видно из таблицы 1, лауроилгликолат натрия демонстрирует значительную активность против различных штаммов грамположительных бактерий.
Примеры питательной композиции для животных
Питательная композиция приготовлена в соответствии с нидерландскими страндартами для удовлетворения потребности бройлеров в питательных веществах (CVB, 2006). Лауриллактилат натрия добавляли в количестве 0,5% от общей массы питательной композиции.
Питательная композиция приготовлена в соответствии с нидерландскими страндартами для удовлетворения потребности бройлеров в питательных веществах (CVB, 2006). Лаурилгликолилат натрия добавляли в количестве 0,5% от общей массы питательной композиции.
Питательная композиция приготовлена в соответствии с нидерландскими страндартами для удовлетворения потребности бройлеров в питательных веществах (CVB, 2006). Лауриллактат добавляли в количестве 0,5% от общей массы питательной композиции.
Питательная композиция приготовлена в соответствии с нидерландскими страндартами для удовлетворения потребности бройлеров в питательных веществах (CVB, 2006). Лаурилгликолат добавляли в количестве 0,5% от общей массы питательной композиции.