СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТОВ АГЕНТА, СВЯЗЫВАЮЩЕГОСЯ С КЛЕТКАМИ, И ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО АГЕНТА

1. Способ получения конъюгата агента, связывающегося с клетками, и цитотоксического агента, включающий стадии, на которых:
(a) цитотоксический агент приводят в контакт с бифункциональным сшивающим реагентом, представленным следующей структурной формулой:
или его солью, в буферном растворе, содержащем буферный агент, для получения первой смеси, содержащей соединение цитотоксического агента с линкером, причем буферный раствор имеет высокую буферную емкость;
(b) соединение цитотоксического агента с линкером в первой смеси, полученной на стадии (а), приводят в контакт с агентом, связывающимся с клетками, в растворе, имеющем рН от 4 до 9, для получения второй смеси, содержащей конъюгат агента, связывающегося с клетками, и цитотоксического агента.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что агент, связывающийся с клетками, подвержен фрагментации.
3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что цитотоксический агент представляет собой майтанзиноид.
4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что цитотоксический агент представляет собой DM4.
5. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что молярное отношение буферного агента к бифункциональному сшивающему реагенту составляет от 1,5:1 до 12,5:1.
6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что молярное отношение буферного агента к бифункциональному сшивающему реагенту составляет от 2:1 до 8:1.
7. Способ по п. 5, отличающийся тем, что молярное отношение буферного агента к бифункциональному сшивающему реагенту составляет от 4:1 до 6:1.
8. Способ по п. 5, отличающийся тем, что молярное отношение буферного агента к бифункциональному сшивающему реагенту составляет 5:1.
9. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что буферный раствор имеет рН от 4 до 9.
10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что буферный раствор имеет рН от 7,5 до 8,5.
11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что буферный раствор имеет рН от 7,9 до 8,5, от 8,0 до 8,4 или от 8,1 до 8,3.
12. Способ по п. 9, отличающийся тем, что буферный раствор имеет рН 8,2.
13. Способ по любому из пп. 1-12, отличающийся тем, что буферный агент выбран из группы, состоящей из цитратного буферного агента, ацетатного буферного агента, сукцинатного буферного агента и фосфатного буферного агента.
14. Способ по любому из пп. 1-12, отличающийся тем, что буферный агент выбран из группы, состоящей из HEPPSO (N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N'-(2-гидроксипропансульфоновая кислота)), POPSO (дигидрат пиперазин-1,4-бис-(2-гидроксипропансульфоновой кислоты)), HEPES (4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновая кислота), EPPS (4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-пропансульфоновая кислота), TES (N-[трис(гидроксиметил)метил]-2-аминоэтансульфоновая кислота), MES (2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота) и их комбинации.
15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что буферный агент представляет собой EPPS.
16. Способ по любому из пп. 1-15, отличающийся тем, что буферный раствор дополнительно содержит хлорид натрия.
17. Способ по любому из пп. 1-16, отличающийся тем, что буферный раствор дополнительно содержит органический растворитель.
18. Способ по п. 17, отличающийся тем, что органический растворитель представляет собой ДМАА.
19. Способ по п. 17 или 18, отличающийся тем, что органический растворитель присутствует в количестве 1-99%, 50-99%, 60%99% или 70-99% от объема буферного раствора.
20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что органический растворитель присутствует в количестве 50-90%, 55-85%, 60-80% или 65-75% от объема буферного раствора.
21. Способ по п. 19, отличающийся тем, что органический растворитель присутствует в количестве 70% от объема буферного раствора.
22. Способ по любому из пп. 1-21, отличающийся тем, что в реакции на стадии (а) используют молярный избыток цитотоксического агента по отношению к бифункциональному сшивающему реагенту.
23. Способ по п. 22, отличающийся тем, что молярное отношение цитотоксического агента к бифункциональному сшивающему реагенту составляет от 1,1:1 до 20:1, от 1,1:1 до 10:1, от 1,1:1 до 5:1 или от 1,1:1 до 2:1.
24. Способ по п. 23, отличающийся тем, что молярное отношение цитотоксического агента к бифункциональному сшивающему реагенту составляет от 1,1:1 до 1,3:1.
25. Способ по п. 23, отличающийся тем, что молярное отношение цитотоксического агента к бифункциональному сшивающему реагенту составляет 1,2:1.
26. Способ по любому из пп. 1-25, отличающийся тем, что реакцию на стадии (а) проводят от 1 часа до 2 часов.
27. Способ по любому из пп. 1-25, отличающийся тем, что реакцию на стадии (а) проводят от 2 до 5 часов.
28. Способ по любому из пп. 1-25, отличающийся тем, что реакцию на стадии (а) проводят от 5 до 20 часов.
29. Способ по п. 28, отличающийся тем, что реакцию на стадии (а) проводят от 5 до 15 часов.
30. Способ по п. 28, отличающийся тем, что реакцию на стадии (а) проводят от 4 до 8 часов или от 5 до 7 часов.
31. Способ по п. 28, отличающийся тем, что реакцию на стадии (а) проводят 6 часов.
32. Способ по любому из пп. 1-31, отличающийся тем, что реакцию на стадии (а) проводят при температуре от 15 до 25°С.
33. Способ по п. 32, отличающийся тем, что реакцию на стадии (а) проводят при температуре от 17 до 23°С, от 18 до 22°С или от 19 до 21°С.
34. Способ по п. 32, отличающийся тем, что реакцию на стадии (а) проводят при температуре 20°С.
35. Способ по любому из пп. 1-32, отличающийся тем, что раствор на стадии (b) имеет рН 5,0-9,0, 5,5-9,0, 6,0-9,0 или 6,5-9,0.
36. Способ по п. 35, отличающийся тем, что раствор на стадии (b) имеет рН 7,5-8,5.
37. Способ по п. 35, отличающийся тем, что раствор на стадии (b) имеет рН 8,0-8,4 или 8,1-8,3.
38. Способ по п. 35, отличающийся тем, что раствор на стадии (b) имеет рН 8,2.
39. Способ по любому из пп. 1-38, отличающийся тем, что раствор на стадии (b) содержит буферный агент, выбранный из группы, состоящей из цитратного буферного агента, ацетатного буферного агента, сукцинатного буферного агента и фосфатного буферного агента.
40. Способ по любому из пп. 1-38, отличающийся тем, что раствор на стадии (b) содержит буферный агент, выбранный из группы, состоящей из HEPPSO (N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N'-(2-гидроксипропансульфоновая кислота)), POPSO (дигидрат пиперазин-1,4-бис-(2-гидроксипропансульфоновой кислоты)), HEPES (4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновая кислота), EPPS (4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-пропансульфоновая кислота), TES (N-[трис(гидроксиметил)метил]-2-аминоэтансульфоновая кислота), MES (2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота) и их комбинации.
41. Способ по п. 40, отличающийся тем, что буферный агент представляет собой EPPS.
42. Способ по любому из пп. 1-41, отличающийся тем, что раствор на стадии (b) дополнительно содержит органический растворитель.
43. Способ по п. 42, отличающийся тем, что органический растворитель представляет собой ДМАА.
44. Способ по п. 42 или 43, отличающийся тем, что органический растворитель присутствует в количестве 1-25%, 2-20%, 2-15% или 2-10% от объема раствора.
45. Способ по п. 44, отличающийся тем, что органический растворитель присутствует в количестве 2,5-7,5%, 3-7%, 4-6% или 4,5-5,5% от объема раствора.
46. Способ по п. 45, отличающийся тем, что органический растворитель присутствует в количестве 5% от объема раствора.
47. Способ по любому из пп. 1-46, отличающийся тем, что концентрация агента, связывающего с клетками, в растворе на стадии (b) составляет от 5 до 100 г/л.
48. Способ по п. 47, отличающийся тем, что концентрация агента, связывающегося с клетками, составляет от 5 до 50 г/л.
49. Способ по п. 47, отличающийся тем, что концентрация агента, связывающегося с клетками, составляет от 10 до 40 г/л.
50. Способ по п. 47, отличающийся тем, что концентрация агента, связывающегося с клетками, составляет от 15 до 25 г/л, от 18 до 22 г/л или от 19 до 21 г/л.
51. Способ по п. 50, отличающийся тем, что концентрация агента, связывающегося с клетками, составляет 20 г/л.
52. Способ по любому из пп. 1-51, отличающийся тем, что реакцию на стадии (b) проводят от 10 до 30 часов.
53. Способ по п. 52, отличающийся тем, что реакцию на стадии (b) проводят от 15 до 25 часов.
54. Способ по п. 52, отличающийся тем, что реакцию на стадии (b) проводят от 8 до 24 часов, от 12 до 20 часов, от 14 до 18 часов или от 15 до 17 часов.
55. Способ по п. 54, отличающийся тем, что реакцию на стадии (b) проводят 16 часов.
56. Способ по п. 52, отличающийся тем, что реакцию на стадии (b) проводят от 18 до 26 часов, от 20 до 24 часов или от 19 до 23 часов.
57. Способ по п. 52, отличающийся тем, что реакцию на стадии (b) проводят 22 часа.
58. Способ по любому из пп. 1-57, отличающийся тем, что реакцию на стадии (b) проводят при температуре от 15 до 25°С.
59. Способ по п. 58, отличающийся тем, что реакцию на стадии (b) проводят при температуре 20°С.
60. Способ по любому из пп. 1-59, отличающийся тем, что молярное отношение бифункционального сшивающего реагента к агенту, связывающемуся с клетками, составляет от 2 до 10.
61. Способ по п. 60, отличающийся тем, что молярное отношение бифункционального сшивающего реагента к агенту, связывающемуся с клетками, составляет от 3 до 6.
62. Способ по п. 61, отличающийся тем, что молярное отношение бифункционального сшивающего реагента к агенту, связывающемуся с клетками, составляет от 3,5 до 5.
63. Способ по п. 62, отличающийся тем, что молярное отношение бифункционального сшивающего реагента к агенту, связывающемуся с клетками, составляет 4,0.
64. Способ по любому из пп. 1-63, отличающийся тем, что способ дополнительно включает стадию гашения реакции на стадии (b) путем изменения рН раствора до 5 или ниже.
65. Способ по любому из пп. 1-64, отличающийся тем, что способ дополнительно включает очистку второй смеси, чтобы получить очищенный конъюгат агента, связывающегося с клетками, и цитотоксического агента.
66. Способ по п. 65, отличающийся тем, что вторую смесь очищают, подвергая смесь тангенциально-поточному фильтрованию, селективному осаждению, адсорбционному фильтрованию, адсорбционному хроматографированию, неадсорбционному хроматографированию или их комбинации.
67. Способ по п. 66, отличающийся тем, что вторую смесь очищают, подвергая смесь тангенциально-поточному фильтрованию.
68. Способ по любому из пп. 1-67, отличающийся тем, что агент, связывающийся с клетками, представляет собой антитело.
69. Способ по п. 67, отличающийся тем, что антитело представляет собой моноклональное антитело.
70. Способ по п. 69, отличающийся тем, что антитело представляет собой гуманизированное моноклональное антитело.
71. Способ по п. 70, отличающийся тем, что антитело выбрано из huN901, huMy9-6, huB4, huC242, трастузумаба, биватузумаба, сибротузумаба, CNTO95, huDS6, ритуксимаба, антитела к Her2, антитела к EGFR, антитела к CD27L, антитела к EGFRvIII, антитела к крипто (Cripto), антитела к CD138, антитела к CD38, антитела к EphA2, антитела, нацеленного на интегрин, антитела к CD37, антитела к рецептору фолиевой кислоты, антитела к Her3 и антитела к IGFIR.