ШТАММ AMYCOLATOPSIS FRUCTIFERI SUBSP. RISTOMYCINI - ПРОДУЦЕНТ АНТИБИОТИКА РИСТОМИЦИНА
AMYCOLATOPSIS FRUCTIFERI SUBSP RISTOMYCINI STRAIN - PRODUCER OF ANTIBIOTIC RISTOMYCIN

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается нового штамма - продуцента антибактериального антибиотика ристомицина из группы полициклических гликопептидов (далбагептидов).
Структура антибиотика ристомицина
Благодаря уникальной способности подавлять биосинтез пептидогликана клеточной стенки антибиотики этой группы эффективны в отношении многих патогенных грамположительных бактерий. Подобно ванкомицину и тейкопланину, ристомицин обладает мощным бактерицидным действием на стафилококков, энтерококков и пневмококков, в том числе метициллинустойчивых и некоторых анаэробов, вызывающих тяжелые септические заболевания. Ристомицин используется в качестве диагностикума при некоторых заболеваниях кроветворения, а также входит в состав ветеринарных препаратов.
Известен штамм Proactinomyces fructiferi var. ristomycini 5339 - продуцент антибиотика ристомицина [1], принятый в качестве прототипа. Недостатком известного штамма является низкий уровень содержания антибиотика в культуральной жидкости (не более 400 мг ристомицина на 1 л культуральной жидкости).
60
Сущность изобретения состоит в том, что получен новый штамм - продуцент ристомицина - в результате многоступенчатого мутагенного воздействия метилнитрозогуанидина, ультрафиолетовых и гамма-лучей Со на исходный штамм с последующим отбором мутантов на средах, содержащих стрептомицин и ванкомицин в качестве селективных агентов.
Полученный новый штамм депонирован в коллекции культур «ГосНИИгенетика» под номером штамм ВКПМ-S1085.
Штамм Amycolatopsis fructiferi subsp. ristomycini ВКПМ-S1085 обладает повышенной продуктивностью ристомицина (2,0 г в 1 л культуральной жидкости) и характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиологическими признаками.
Культурально-морфологические признаки штамма ВКПМ-S1085
Температура 37°С; длительность выращивания - (7-12) суток. Посев на агаровые среды споровым материалом с (8-10)-дневной культуры, выращенной на гороховом агаре. Цвет определен по таблице Бондарцева и Праузера (таблица 1).
Морфологические признаки. Спороносцы прямые, споры продолговатые, поверхность спор гладкая. Гифы вегетативного мицелия септированы. Распадаются на фрагменты (2-3 мкм длины).
Физиолого-биохимические свойства. Аэроб растет при (24-37)°С; оптимум роста 37°С, биосинтеза 28°С. Желатину разжижает, молоко пептонизирует. Сахарозу инвертирует. Крахмал не гидролизует. На клетчатке не растет. Восстанавливает нитраты до нитритов. Меланоидные пигменты не образует при росте на среде Треснера с лимоннокислым железом.
Использование источников углерода. Хорошо утилизирует глюкозу, глицерин, арабинозу, мальтозу; умеренно - сахарозу, крахмал, маннит, лактозу; слабо - рамнозу, не использует ксилозу.
Антагонистические свойства
При испытании методом штриха на глюкозо-нитратном агаре №2 Гаузе штамм подавляет рост грамположительных бактерий Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus mycoides, Micrococcus luteus, не действует на Escherichia coli и дрожжи Candida albicans. Специфических вирулентных фагов не выявлено, лизиса в процессе ферментации не происходит.
Штамм-продуцент ристомицина поясняется следующим примером.
Пример 1. Споровым материалом с мицелием культуры Amycolatopsis fructiferi subsp. ristomycini ВКПМ-S1085, выращенной в течение (7-10) суток при 37°С на гороховом агаре, засевают питательную среду (100 мл в колбах Эрленмейера объемом 750 мл) и выращивают при 28°С в течение (18-24) ч на качалке при (220-240) об/мин.
Состав посевной среды, %:
Глюкоза
1,0
Пептон
0,5
Бульон Хоттингера
3,0
Натрий хлористый
0,5
Вода
Водопроводная
рН до стерилизации
6,8-7,0
Среду стерилизуют в течение 30 мин при давлении 0,6 атм при 120°С.
Выросшим мицелием в количестве (3-5) % от объема среды засевают питательную среду (100 мл в колбах Эрленмейера объемом 750 мл) следующего состава, %:
Глицерин
2,0
Соевая мука
0,5
Натрий хлористый
0,3
Мел
0,5
Вода
Водопроводная
рН до стерилизации
6,8
Ферментацию проводят при 28°С в течение (120-144) ч на качалке при (220-240) об/мин. Антибиотическую активность культуральной жидкости определяют методом диффузии в агар с использованием тест-культуры Bacillus subtilis ATCC 6633. Содержание ристомицина в культуральной жидкости к концу ферментации составляет 2000 мкг/мл.
Препарат, полученный на основе нового штамма-продуцента путем сорбции на ионно-обменных смолах и многоступенчатой химической очистки [2], по своим физико-химическим показателям, антибактериальной активности и токсичности полностью соответствует стандартному образцу ристомицина.
Преимуществом заявленного штамма по сравнению с прототипом является способность к биосинтезу с высокой продуктивностью гликопептидного антибиотика ристомицина.
Таким образом, создан новый мутантный штамм Amycolatopsis fructiferi subsp. ristomycini BKПM-S1085, отличающийся от прототипа по характеру роста на диагностических агаровых средах, по степени усвоения иточников углерода (рамноза, сахароза, крахмал, манноза), по способности образования пигмента и антибиотической активности, которая в 5 раз превосходит активность штамма-прототипа и составляет 2000 мкг/мл (Таблицы №№2 и 3).
ЛИТЕРАТУРА
1. Гаврилина Г.В., Рохленко С.Г. Образование ристомицина на синтетических средах. В сб. «Ристомицин и его применение в клинике», Изд-во «Медицина», Москва, 1965, с.7-13.
2. Бражникова М.Г., Ломакина Н.Н., Лаврова М.Ф., Юрина М.С. и Клюева Л.М. Выделение и свойства ристомицина // Антибиотики, №5, с.392 (1963).
Таблица 1
Культурально-морфологические признаки штамма Amycolatopsis fructiferi subsp. ristomycini ВКПМ-S1085
Агаровая среда
Рост воздушного мицелия*
Цвет мицелия
Растворимый пигмент
Воздушного
Субстратного
№1 Гаузе
+-
Желтовато-белый, Соо6а, скудный
Буроватый (Д-3)
Нет
Овсяная
+
Белый (Д-3) до светло-кремового (б6)
Бесцветный
Нет
Чапека
+
Белый (Д-3)
Светло-бурый (Д-4)
-
Глюкозо-аспарагиновая
+
Белый (Д-3)
Желтоватый (Соо4в)
-
Линденбайна (глицерин-нитратная)
+++
Белый (Д-3) до светло-песочного (Соо6а)
Светло-бурый (Д-4)
Глюкозо-нитратная№2 Гаузе
++
Белый (Д-3)
Желтоватый (Соо4в)
-
Треснера (с пептоном и лимоннокислым железом)
+-
Белый (Д-3)
Бесцветный
Нет
*/++ - умеренный; + - слабый.
Таблица 2
Сравнительные культурально-морфологические свойства нового штамма Amycolatopsis fructiferi subsp. ristomycini BKПM-S1085 и штамма-прототипа 5339
Агаровая среда
Рост, мицелий и пигмент
Новый штамм
Штамм-прототип
№1 Гаузе
Скудный, субстратный мицелий буроватый б3
Умеренный, субстратный мицелий красноватый б1
№2 Гаузе
Скудный, субстратный мицелий белый Д3
Умеренный, субстратный мицелий буроватый б3, растворимый пигмент
Чапека с сахарозой
Хороший, воздушный мицелий белый Д3 до песочного Соо6а
Умеренный, воздушный мицелий розоватый 4б, субстратный мицелий оранжево-коричневый в1, пигмент сиреневого цвета
Таблица 3
Сравнительные культурально-морфологические свойства нового штамма Amycolatopsis fructiferi subsp. ristomycini ВКПМ-S1085 и штамма-прототипа 5339
Агаровая среда
Рост, мицелий и пигмент
Новый штамм
Штамм-прототип
Усвоение источников
углерода:
Сахароза
Умеренно
Хорошо
Крахмал
Умеренно
Хорошо
Рамноза
Слабо
Не утилизует
Маннит
Хорошо
Слабо
Водорастворимый пигмент
Нет
Образует
Антибиотическая активность,
2000
400
мкг/мл
Диапазон изменчивости
1000-3000
200-600
активности, мкг/мл
Заявитель-патентообладатель:
ГУ научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе Российской академии медицинских наук (ГУ НИИНА им. Г.Ф.Гаузе РАМН)