ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ
PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение относится к фармацевтической композиции.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Ребамипид [химическое название: (±)-2-(4-хлорбензоиламино)-3-(2-хинолон-4-ил)пропионовая кислота] известно как полезное противоязвенное лекарственное средство.
Кроме того, ребамипид обладает усиливающим действием на плотность бокаловидных клеток в глазу, усиливающим действием на продукцию слизи в глазу и усиливающим действием на продукцию слезной жидкости и уже известен в качестве средства для лечения сухости глаз, то есть синдрома сухого глаза (WO 97/013515).
Ребамипид растворим в щелочных водных растворах, но его растворимость в нейтральных растворах крайне низка. С другой стороны, глазные капли с высоким pH непригодны для пациента, страдающего от нарушения функции кератоконъюктивы, такого как сухость глаз. Помимо этого, даже в случае щелочного раствора, содержащего ребамипид, иногда могут образовываться кристаллы ребамипида, и, таким образом, считается, что разработки офтальмологических изделий на водной основе, содержащих ребамипид, являются сложной задачей.
WO 97/013515 раскрывает нейтральную водную суспензию, содержащую ребамипид. Однако суспензия может образовать слой осадка при стоянии в течение долгого времени. Таким образом, суспензию требуется хорошо взбалтывать для того, чтобы повторно диспергировать. Кроме того, такой продукт в виде суспензии может, как полагают, обладать некоторыми недостатками, например вызывать страдание от расфокусировки зрения и оставлять белые пятна на одежде, поскольку продукт в виде суспензии является белой офтальмологической суспензией.
WO 2008/050896 раскрывает аналогичную суспензию, содержащую ребамипид, в которой ребамипид устойчиво диспергирован в состоянии мелких частиц, и, кроме того, мелкие частицы не подвергаются повторной агглютинации. Водная суспензия, содержащая ребамипид, в WO 2008/050896 улучшена по суспензированности по сравнению с продукцией вышеупомянутого WO 97/013515. Однако водную суспензию, содержащую ребамипид, в WO 2008/050896 также необходимо хорошо взбалтывать для повторного диспергирования, поскольку суспензия в WO 2008/050896 представляет собой белую офтальмологическую суспензию, в которой ребамипид растворен не полностью, и невозможно избежать образования слоя осевшего ребамипида при стоянии в течение долгого времени. Более того, такие недостатки, как страдание от расфокусировки зрения и белые пятна на одежде при разливе суспензии, все еще не были устранены в WO 2008/050896.
WO 2006/052018 раскрывает водную суспензию, содержащую кристаллический ребамипид, которая включает смесь по меньшей мере одного из соединений, выбираемых из водорастворимых полимеров и поверхностно-активных веществ, водного кислого раствора и водного раствора, содержащего водорастворимую соль ребамипида, которую не требуется повторно диспергировать, обладающую достаточной прозрачностью и представляющую собой нейтральную суспензию, не вызывающую повреждение кератоконъюктивы у пациентов, страдающих сухостью глаз.
Однако водная суспензия, содержащая кристаллический ребамипид в WO 2006/052018, имеет проблему, связанную с высокой себестоимостью, поскольку для осуществления процесса требуется дорогостоящее оборудование, такое как гомогенизатор высокого давления, коллоидная мельница и соникатор, и производственный процесс является трудным, сложным и длительным.
Вообще, для предотвращения микробного заражения к обычным офтальмологическим средствам добавляют консервант. Однако для пациента, страдающего от нарушения, связанного с роговицей, такого как сухость глаз, необходимо офтальмологическое средство, не содержащие консерванта, поскольку консервант вреден для пациента. Известные емкости для офтальмологического агента, не содержащего консервант, включают одноразовую пластиковую упаковку с однократной дозой и емкость для многократного применения, снабженную фильтром, который способен задерживать бактерии вблизи отверстия капельницы. Однако водные суспензии в вышеупомянутых WO 2008/050896 и WO 2006/052018 трудно пропускать через фильтр, таким образом, становится невозможным использовать емкость для многоразового применения и необходимо использовать сравнительно дорогую упаковку с однократной дозой.
Таким образом, требуется разработать фармацевтическую композицию, содержащую ребамипид, которая не требует повторного диспергирования, обладает достаточной прозрачностью и имеет уровень рН от нейтрального до слабокислого, не причиняющую вред кератоконъюктиве пациента, страдающего от сухости глаз, и недорогой способ получения такой фармацевтической композиции без использования дорогостоящего оборудования.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
(Проблема, которая решена изобретением)
Задачей данного изобретения является предоставление фармацевтической композиции, содержащей ребамипид, не требующей повторного диспергирования, обладающей достаточной прозрачностью и имеющей рН от нейтрального до слабокислого, не причиняющей вред кератоконъюктиве пациента, страдающего от сухости глаз. В частности, фармацевтическая композиция является офтальмологической композицией.
Кроме того, задачей данного изобретения является предоставление фармацевтической композиции, которую можно изготовить с низкой стоимостью без использования дорогостоящего оборудования.
(Способ решения проблемы)
Для решения вышеобозначенной задачи авторы данного изобретения провели тщательное исследование и затем обнаружили, что фармацевтическая композиция, содержащая (1) ребамипид, (2) аминосахар и (3) буферный агент, не содержащий катиона, обладает хорошей способностью повторно диспергироваться и имеет повышенную прозрачность. Кроме того, авторы данного изобретения обнаружили, что данная фармацевтическая композиция обладает противомикробной эффективностью. На основании полученных новых данных было реализовано данное изобретение.
Данное изобретение предоставляет фармацевтические композиции и их применение, как показано в следующих абзацах [1]-[8].
[1] Фармацевтическая композиция, содержащая (1) ребамипид, (2) аминосахар и (3) буферный агент, не содержащий неорганический катион.
[2] Фармацевтическая композиция по согласно абзацу [1], в которой аминосахар представляет собой по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из D-глюкозамина и меглумина.
[3] Фармацевтическая композиция согласно абзацу [1] или [2], в которой буферный агент представляет собой по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из борной кислоты, фосфорной кислоты и аминокислоты.
[4] Фармацевтическая композиция по любому из абзацев [1-3], дополнительно содержащая регулятор рН.
[5] Фармацевтическая композиция по любому из абзацев [1-4], дополнительно содержащая солюбилизатор.
[6] Фармацевтическая композиция согласно абзацу [5], в которой солюбилизатор представляет собой по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из поливинилпирролидона и макрогола.
[7] Фармацевтическая композиция по любому из абзацев [1-6], где фармацевтическая композиция представляет собой офтальмологическую фармацевтическую композицию.
[8] Применение фармацевтической композиции по любому из абзацев [1-7] для лечения сухости глаз путем местного введения в глаза.
Фармацевтическая композиция по данному изобретению представляет собой композицию, содержащую (1) ребамипид, (2) аминосахар и (3) буферный агент, не содержащий неорганический катион.
Фармацевтическая композиция, предпочтительно, составлена в виде жидкого раствора на водной основе и, более предпочтительно, применяется в качестве офтальмологической фармацевтической композиции.
Концентрация ребамипида в фармацевтической композиции по изобретению составляет от приблизительно 0,1% (мас./об.) до приблизительно 5% (мас./об.), предпочтительно от приблизительно 0,5% (мас./об.) до приблизительно 3% (мас./об.), более предпочтительно от приблизительно 1% (мас./об.) до приблизительно 2% (мас./об.). Например, «1% (мас./об.)», используемый в данном описании, означает концентрацию 1 г на 100 мл.
Используемый здесь катион относится к неорганическому катиону и включает, например, одновалентный катион щелочного металла, такой как ион лития, ион натрия, ион калия и ион цезия, и двухвалентный катион щелочноземельного металла, такой как ион магния и ион кальция.
Используемый здесь термин «фармацевтическая композиция не содержит неорганический катион» означает «фармацевтическая композиция фактически не содержит неорганический катион». Более подробно, это означает, что количество неорганического катиона в фармацевтической композиции составляет менее 15 мЭкв, предпочтительно менее 1,5 мЭкв, более предпочтительно менее 0,3 мЭкв.
Используемый здесь аминосахар включает, например, меглумин (то есть N-метил-D-глюкамин), D-глюкозамин, D-галактозамин, D-маннозамин, микозамин, канозамин, неозамин C, N-метил-L-глюкозамин, микаминозу, мурамовую кислоту и стрептамин.
Среди этих аминосахаров предпочтительными аминосахарами являются меглумин, D-глюкозамин, D-галактозамин, D-маннозамин, микозамин, канозамин, неозамин C, N-метил-L-глюкозамин, микаминоза, мурамовая кислота и стрептамин; особенно меглумин и D-глюкозамин являются наиболее предпочтительными. Вышеупомянутые аминосахара можно использовать в виде одиночного ингредиента или в комбинации, состоящей из двух или нескольких ингредиентов.
Концентрация аминосахара в фармацевтической композиции по изобретению составляет, например, от приблизительно 0,1% (мас./об.) до приблизительно 15% (мас./об.), предпочтительно от приблизительно 0,5% (мас./об.) до приблизительно 10% (мас./об.), более предпочтительно от приблизительно 1% (мас./об.) до приблизительно 8% (мас./об.).
Используемый здесь буферный агент включает, например, кислоту в некатионной форме, такую как борная кислота, фосфорная кислота, аминокислота и органическая кислота; предпочтительно, используются борная кислота и фосфорная кислота. Вышеупомянутые буферные агенты можно использовать в виде одиночного ингредиента или в комбинации, состоящей из двух или нескольких ингредиентов.
Концентрация буферного агента в фармацевтической композиции по изобретению составляет, например, от приблизительно 0,01% (мас./об.) до приблизительно 4% (мас./об.), предпочтительно от приблизительно 0,03% (мас./об.) до приблизительно 3% (мас./об.), более предпочтительно от приблизительно 0,05% (мас./об.) до приблизительно 2% (мас./об.).
Фармацевтическая композиция по изобретению может необязательно содержать регулятор pH. Регулятор pH включает, например, обычную кислоту в некатионной форме, такую как соляная кислота, молочная кислота, уксусная кислота, серная кислота, азотная кислота, угольная кислота, фосфорная кислота и лимонная кислота; предпочтительно, используют соляную кислоту и лимонную кислоту. Регуляторы pH можно использовать в виде одиночного ингредиента или в комбинации, состоящей из двух или нескольких ингредиентов.
Фармацевтическая композиция по изобретению может необязательно содержать изотонический агент для того, чтобы сделать фармацевтическую композицию изотоничной содержащей воду слезе. Изотонический агент предпочтительно представляет собой изотонический агент, свободный от катионов, который включает обычный агент для офтальмологического раствора, такой как маннит, глицерин, полипропиленгликоль, полиэтиленгликоль, мальтоза, сахароза, сорбит и глюкоза, более предпочтительно, используются свободные от катионов глицерин и сахароза. Изотонические агенты можно использовать в качестве единственного ингредиента или в комбинации, состоящей из двух или нескольких ингредиентов.
Фармацевтическая композиция по изобретению может необязательно содержать солюбилизирующий агент. Солюбилизирующий агент включает, например, не содержащий катионов солюбилизирующий агент. Не содержащий катионов солюбилизирующий агент включает, например, полимер, такой как поливинилпирролидон, макрогол (полиэтиленгликоль), поливиниловый спирт и гидроксиметилцеллюлозу; поверхностно-активное вещество, такое как полисорбат, полиоксиэтиленовый эфир гидрированной жирной кислоты и полиоксиэтилен-полиоксипропилен; многоатомный спирт, такой как полипропиленгликоль; органическую кислоту, такую как бензойная кислота и сорбиновая кислота; аминокислоту, такую как аспирагиновая кислота, гистидин, глицин и лизин; и производное ксантина, такое как кофеин. Предпочтительный солюбилизирующий агент представляет собой поливинилпирролидон, макрогол, поливиниловый спирт, бензойную кислоту, сорбиновую кислоту и аспарагиновую кислоту; в особенности, более предпочтительными солюбилизирующими агентами являются поливинилпирролидон и макрогол. Солюбилизирующие агенты можно использовать в качестве единственного ингредиента или в комбинации, состоящей из двух или нескольких ингредиентов.
Молекулярная масса используемого здесь поливинилпирролидона предпочтительно составляет не более 200000, более предпочтительно не более 40000. Предпочтительный поливинилпирролидон включает, но не ограничивается, поливинилпирролидон (PVP, BASF, марка: Kollidon 25): PVP (K-25) и поливинилпирролидон (PVP, BASF, марка: Kollidon 17PF): PVP (K-17PF). Соотношение концентраций ребамипида и поливинилпирролидона предпочтительно составляет 20:1-1:20, более предпочтительно 4:1-1:6.
Молекулярная масса используемого здесь макрогола предпочтительно составляет не более 50000, более предпочтительно не более 10000. Предпочтительный макрогол включает, но не ограничивается, макрогол 1500, макрогол 4000, макрогол 6000 и макрогол 20000. Соотношение концентраций ребамипида и макрогола предпочтительно составляет 20:1-1:20, более предпочтительно 4:1-1:6.
В случае добавления к данной композиции солюбилизирующего агента концентрация солюбилизирующего агента обычно лежит в пределах от приблизительно 0,01% (мас./об.) до приблизительно 15% (мас./об.), предпочтительно от приблизительно 0,1% (мас./об.) до приблизительно 10% (мас./об.), более предпочтительно от приблизительно 0,5% (мас./об.) до приблизительно 6% (мас./об.).
Фармацевтическая композиция по изобретению может необязательно содержать консервант, такой как соль четвертичного аммония (например, бензалкониум хлорид и бензетониум хлорид, хлоргексидин глюконат, параоксибензоат (например, метилпараоксибензоат и пропилпараоксибензоат)), и спиртовое соединение (например, хлорбутанол и бензиловый спирт); и/или стабилизатор, такой как не содержащая неорганический катион аскорбиновая кислота и токоферол.
В случае, когда данная фармацевтическая композиция представляет собой водный жидкий препарат, pH составляет приблизительно от 3 приблизительно до 9, предпочтительно приблизительно от 7 приблизительно до 9 и наиболее предпочтительно 7,7-9.
Соотношение между (1) ребамипидом и (2) аминосахаром, содержащимся в данной композиции, зависит от типа используемых здесь ингредиентов и от типа рецептуры композиции. Количество (1) ребамипида составляет, но не ограничивается, например, от приблизительно 0,01 до приблизительно 10 весовых частей, предпочтительно от приблизительно 0,05 до приблизительно 2 весовых частей, более предпочтительно от приблизительно 0,1 до приблизительно 1,5 весовых частей и наиболее предпочтительно 0,1-1 весовую часть, на одну весовую часть (2) аминосахара.
Предпочтительная фармацевтическая композиция по данному изобретению представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую (1) ребамипид, (2) меглумин и (3) борную кислоту, которая не содержит неорганический катион. Более предпочтительная фармацевтическая композиция представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую от 0,5% (мас./об.) до 3% (мас./об.) ребамипида, от 0,5% (мас./об.) до 10% (мас./об.) меглумина и от 0,03% (мас./об.) до 3% (мас./об.) борной кислоты, которая не содержит неорганический катион. Даже более предпочтительная фармацевтическая композиция представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую от 1% (мас./об.) до 2% (мас./об.) ребамипида, от 1% (мас./об.) до 8% (мас./об.) меглумина, от 0,05% (мас./об.) до 2% (мас./об.) борной кислоты, и регулятор рН выбирают из группы, состоящей из лимонной кислоты и соляной кислоты, которая не содержит неорганический катион.
Наиболее предпочтительной фармацевтической композицией является вышеупомянутая фармацевтическая композиция, дополнительно содержащая поливинилпирролидон в качестве солюбилизирующего агента. Концентрация солюбилизирующего агента составляет предпочтительно от 0,5% (мас./об.) до 6% (мас./об.).
(Эффект от изобретения)
Прозрачность данной фармацевтической композиции, содержащей (1) ребамипид, (2) аминосахар и (3) буферный агент, можно повысить при отсутствии какого-либо неорганического катиона. Данную фармацевтическую композицию не требуется повторно диспергировать, кроме того, ее можно составить по рецептуре в виде водного препарата, который обладает достаточной прозрачностью и имеет рН от нейтрального до слабокислого.
Данная фармацевтическая композиция обладает антисептическим эффектом, таким образом, ожидается, что она проявляет консервирующий эффект. Таким образом, данному водному препарату не требуется содержать обычный консервант (например, соль четвертичного аммония, такую как бензалкониум хлорид и бензетониум хлорид; катионное соединение, такое как хлоргексидин глюконат; параоксибензоат, такой как метилпараоксибензоат и пропилпараоксибензоат; и спиртовое соединение, такое как хлорбутанол и бензиловый спирт).
Кроме того, данная фармацевтическая композиция настолько стабильна, что, таким образом, к ней не требуется добавлять стабилизатор (например, аскорбиновую кислоту, не содержащую неорганический катион, или токоферол).
Способ производства данной фармацевтической композиции можно осуществить при низких затратах, без трудноосуществимого процесса, без применения специального диспергирующего/суспендирующего устройства, что является большим преимуществом промышленного масштаба.
Настоящий водный офтальмологический продукт может предотвратить нежелательную расфокусировку зрения у применяющего его пациента, таким образом, ожидается значительное повышение его соответствия для пациента, страдающего сухостью глаз, и он дает возможность использовать емкость для многократного применения, снабженную асептическим фильтром вблизи отверстия капельницы, который предназначен для офтальмологического агента, не содержащего консервант, поскольку его можно пропустить через асептический фильтр. Таким образом, данное изобретение обеспечит большой вклад в медицину.
Кроме того, данная фармацевтическая композиция обладает отличной прозрачностью, таким образом, отсутствует неприятность оставить белые пятна на одежде при разливе композиции.
НАИЛУЧШИЙ СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение проиллюстрировано более подробно следующими примерами, которые не должны считаться ограничивающими его.
Пример 1
Ребамипид
2 г
Поливинилпирролидон (К-25)
3 г
Борная кислота
1,5 г
Меглумин
5,9 г
Глицерин
0,722 г
Соляная кислота
q.s. (до рН=8,3)
Очищенная вода
q.s.
Всего
100 мл
Примечание: q.s. означает достаточное количество.
К небольшому количеству очищенной воды добавляли ребамипид, поливинилпирролидон (K-25), борную кислоту, меглумин и глицерин при перемешивании и рН получившейся в результате смеси регулировали соляной кислотой. Перемешивание осуществляли низкоскоростной винтовой мешалкой без применения высокоскоростного перемешивателя, такого как смеситель-гомогенизатор или гомогенизатор. Каждый ингредиент легко растворялся при помощи низкоскоростной винтовой мешалки. Затем получившийся в результате раствор в стерильных условиях фильтровали через 0,2 мкм фильтр для получения фармацевтической композиции. Фармацевтическая композиция представляла собой прозрачный раствор с цветом от светло-желтоватого до бледно-желтоватого.
Пример 2
Ребамипид
2 г
Поливинилпирролидон (К-25)
3 г
Борная кислота
1 г
Меглумин
4,3 г
Глицерин
1,185 г
Соляная кислота
q.s. (до рН=8,3)
Очищенная вода
q.s.
Всего
100 мл
К небольшому количеству очищенной воды добавляли ребамипид, поливинилпирролидон (K-25), борную кислоту, меглумин и глицерин при перемешивании и рН получившейся в результате смеси регулировали соляной кислотой. Перемешивание осуществляли низкоскоростной винтовой мешалкой без применения высокоскоростного перемешивателя, такого как смеситель-гомогенизатор или гомогенизатор. Каждый ингредиент легко растворялся при помощи низкоскоростной винтовой мешалки. Затем получившийся в результате раствор в стерильных условиях фильтровали через 0,2 мкм фильтр для получения фармацевтической композиции. Фармацевтическая композиция представляла собой прозрачный раствор с цветом от светло-желтоватого до бледно-желтоватого.
Пример 3
Ребамипид
2 г
Поливинилпирролидон (К-25)
1 г
Борная кислота
1,5 г
Меглумин
6 г
Глицерин
0,796 г
Соляная кислота
q.s. (до рН=8,5)
Очищенная вода
q.s.
Всего
100 мл
К небольшому количеству очищенной воды добавляли ребамипид, поливинилпирролидон (K-25), борную кислоту, меглумин и глицерин при перемешивании и рН получившейся в результате смеси регулировали соляной кислотой. Перемешивание осуществляли низкоскоростной винтовой мешалкой без применения высокоскоростного перемешивателя, такого как смеситель-гомогенизатор или гомогенизатор. Каждый ингредиент легко растворялся при помощи низкоскоростной винтовой мешалки. Затем получившийся в результате раствор в стерильных условиях фильтровали через 0,2 мкм фильтр для получения фармацевтической композиции. Фармацевтическая композиция представляла собой прозрачный раствор с цветом от бесцветного до светло-желтоватого.
Пример 4
Ребамипид
2 г
Поливинилпирролидон (К-25)
6 г
Борная кислота
1,5 г
Меглумин
5,9 г
Глицерин
0,398 г
Соляная кислота
q.s. (до рН=8,3)
Очищенная вода
q.s.
Всего
100 мл
К небольшому количеству очищенной воды добавляли ребамипид, поливинилпирролидон (K-25), борную кислоту, меглумин и глицерин при перемешивании и рН получившейся в результате смеси регулировали соляной кислотой. Перемешивание осуществляли низкоскоростной винтовой мешалкой без применения высокоскоростного перемешивателя, такого как смеситель-гомогенизатор или гомогенизатор. Каждый ингредиент легко растворялся при помощи низкоскоростной винтовой мешалки. Затем получившийся в результате раствор в стерильных условиях фильтровали через 0,2 мкм фильтр для получения фармацевтической композиции. Фармацевтическая композиция представляла собой прозрачный раствор с цветом от светло-желтоватого до бледно-желтоватого.
Пример 5
Ребамипид
1 г
Поливинилпирролидон (К-25)
3 г
Борная кислота
1,5 г
Меглумин
4,7 г
Глицерин
0,991 г
Соляная кислота
q.s. (до рН=8,0)
Очищенная вода
q.s.
Всего
100 мл
К небольшому количеству очищенной воды добавляли ребамипид, поливинилпирролидон (K-25), борную кислоту, меглумин и глицерин при перемешивании и рН получившейся в результате смеси регулировали соляной кислотой. Перемешивание осуществляли низкоскоростной винтовой мешалкой без применения высокоскоростного перемешивателя, такого как смеситель-гомогенизатор или гомогенизатор. Каждый ингредиент легко растворялся при помощи низкоскоростной винтовой мешалки. Затем получившийся в результате раствор в стерильных условиях фильтровали через 0,2 мкм фильтр для получения фармацевтической композиции. Фармацевтическая композиция представляла собой прозрачный раствор с цветом от светло-желтоватого до бледно-желтоватого.
Пример 6
Ребамипид
1 г
Поливинилпирролидон (К-25)
3 г
Борная кислота
1 г
Меглумин
3,4 г
Глицерин
1,389 г
Соляная кислота
q.s. (до рН=8,0)
Очищенная вода
q.s.
Всего
100 мл
К небольшому количеству очищенной воды добавляли ребамипид, поливинилпирролидон (K-25), борную кислоту, меглумин и глицерин при перемешивании и рН получившейся в результате смеси регулировали соляной кислотой. Перемешивание осуществляли низкоскоростной винтовой мешалкой без применения высокоскоростного перемешивателя, такого как смеситель-гомогенизатор или гомогенизатор. Каждый ингредиент легко растворялся при помощи низкоскоростной винтовой мешалки. Затем получившийся в результате раствор в стерильных условиях фильтровали через 0,2 мкм фильтр для получения фармацевтической композиции. Фармацевтическая композиция представляла собой прозрачный раствор с цветом от светло-желтоватого до бледно-желтоватого.
Пример 7
Ребамипид
1 г
Поливинилпирролидон (К-25)
1 г
Борная кислота
1,5 г
Меглумин
5 г
Глицерин
1,046 г
Соляная кислота
q.s. (до рН=8,2)
Очищенная вода
q.s.
Всего
100 мл
К небольшому количеству очищенной воды добавляли ребамипид, поливинилпирролидон (K-25), борную кислоту, меглумин и глицерин при перемешивании и рН получившейся в результате смеси регулировали соляной кислотой. Перемешивание осуществляли низкоскоростной винтовой мешалкой без применения высокоскоростного перемешивателя, такого как смеситель-гомогенизатор или гомогенизатор. Каждый ингредиент легко растворялся при помощи низкоскоростной винтовой мешалки. Затем получившийся в результате раствор в стерильных условиях фильтровали через 0,2 мкм фильтр для получения фармацевтической композиции. Фармацевтическая композиция представляла собой прозрачный раствор с цветом от бесцветного до светло-желтоватого.
Пример 8
Ребамипид
1 г
Поливинилпирролидон (К-25)
6 г
Борная кислота
1,5 г
Меглумин
4,7 г
Глицерин
0,676 г
Соляная кислота
q.s. (до рН=8,0)
Очищенная вода
q.s.
Всего
100 мл
К небольшому количеству очищенной воды добавляли ребамипид, поливинилпирролидон (K-25), борную кислоту, меглумин и глицерин при перемешивании и рН получившейся в результате смеси регулировали соляной кислотой. Перемешивание осуществляли низкоскоростной винтовой мешалкой без применения высокоскоростного перемешивателя, такого как смеситель-гомогенизатор или гомогенизатор. Каждый ингредиент легко растворялся при помощи низкоскоростной винтовой мешалки. Затем получившийся в результате раствор в стерильных условиях фильтровали через 0,2 мкм фильтр для получения фармацевтической композиции. Фармацевтическая композиция представляла собой прозрачный раствор с цветом от светло-желтоватого до бледно-желтоватого.
Пример 9
Прозрачную фармацевтическую композицию с цветом от желтоватого до бледно-желтоватого получали способом, аналогичным примеру 1, используя поливинилпирролидон (K-17) вместо поливинилпирролидона (K-25).
Пример 10
Прозрачную фармацевтическую композицию с цветом от светло-желтоватого до бледно-желтоватого получали способом, аналогичным примеру 2, используя поливинилпирролидон (K-17) вместо поливинилпирролидона (K-25).
Пример 11
Прозрачную фармацевтическую композицию с цветом от бесцветного до бледно-желтоватого получали способом, аналогичным примеру 3, используя поливинилпирролидон (K-17) вместо поливинилпирролидона (K-25).
Пример 12
Прозрачную фармацевтическую композицию с цветом от светло-желтоватого до бледно-желтоватого получали способом, аналогичным примеру 4, используя поливинилпирролидон (K-17) вместо поливинилпирролидона (K-25).
Пример 13
Прозрачную фармацевтическую композицию с цветом от светло-желтоватого до бледно-желтоватого получали способом, аналогичным примеру 5, используя поливинилпирролидон (K-17) вместо поливинилпирролидона (K-25).
Пример 14
Прозрачную фармацевтическую композицию с цветом от светло-желтоватого до бледно-желтоватого получали способом, аналогичным примеру 6, используя поливинилпирролидон (K-17) вместо поливинилпирролидона (K-25).
Пример 15
Прозрачную фармацевтическую композицию с цветом от бесцветного до светло-желтоватого получали способом, аналогичным примеру 7, используя поливинилпирролидон (K-17) вместо поливинилпирролидона (K-25).
Пример 16
Прозрачную фармацевтическую композицию с цветом от светло-желтоватого до бледно-желтоватого получали способом, аналогичным примеру 8, используя поливинилпирролидон (K-17) вместо поливинилпирролидона (K-25).
Пример 17
Прозрачную фармацевтическую композицию с цветом от светло-желтоватого до бледно-желтоватого получали способом, аналогичным примеру 1, используя лимонную кислоту вместо соляной кислоты.
Пример 18
Прозрачную фармацевтическую композицию с цветом от светло-желтоватого до бледно-желтоватого получали способом, аналогичным примеру 2, используя лимонную кислоту вместо соляной кислоты.
Пример 19
Прозрачную фармацевтическую композицию с цветом от бесцветного до светло-желтоватого получали способом, аналогичным примеру 3, используя лимонную кислоту вместо соляной кислоты.
Пример 20
Прозрачную фармацевтическую композицию с цветом от светло-желтоватого до бледно-желтоватого получали способом, аналогичным примеру 4, используя лимонную кислоту вместо соляной кислоты.
Пример 21
Прозрачную фармацевтическую композицию с цветом от светло-желтоватого до бледно-желтоватого получали способом, аналогичным примеру 5, используя лимонную кислоту вместо соляной кислоты.
Пример 22
Прозрачную фармацевтическую композицию с цветом от светло-желтоватого до бледно-желтоватого получали способом, аналогичным примеру 6, используя лимонную кислоту вместо соляной кислоты.
Пример 23
Прозрачную фармацевтическую композицию с цветом от бесцветного до светло-желтоватого получали способом, аналогичным примеру 7, используя лимонную кислоту вместо соляной кислоты.
Пример 24
Прозрачную фармацевтическую композицию с цветом от светло-желтоватого до бледно-желтоватого получали способом, аналогичным примеру 8, используя лимонную кислоту вместо соляной кислоты.
Пример 25
Прозрачную фармацевтическую композицию с цветом от светло-желтоватого до бледно-желтоватого получали способом, аналогичным примеру 1, используя сахарозу (2,889 г) вместо глицерина (0,722 г).
Пример 26
Прозрачную фармацевтическую композицию с цветом от светло-желтоватого до бледно-желтоватого получали способом, аналогичным примеру 2, используя сахарозу (4,741 г) вместо глицерина (1,185 г).
Пример 27
Прозрачную фармацевтическую композицию с цветом от бесцветного до светло-желтоватого получали способом, аналогичным примеру 3, используя сахарозу (3,185 г) вместо глицерина (0,796 г).
Пример 28
Прозрачную фармацевтическую композицию с цветом от светло-желтоватого до бледно-желтоватого получали способом, аналогичным примеру 4, используя сахарозу (1,593 г) вместо глицерина (0,398 г).
Пример 29
Прозрачную фармацевтическую композицию с цветом от светло-желтоватого до бледно-желтоватого получали способом, аналогичным примеру 5, используя сахарозу (3,963 г) вместо глицерина (0,991 г).
Пример 30
Прозрачную фармацевтическую композицию с цветом от светло-желтоватого до бледно-желтоватого получали способом, аналогичным примеру 6, используя сахарозу (5,556 г) вместо глицерина (1,389 г).
Пример 31
Прозрачную фармацевтическую композицию с цветом от бесцветного до светло-желтоватого получали способом, аналогичным примеру 7, используя сахарозу (4,185 г) вместо глицерина (1,046 г).
Пример 32
Прозрачную фармацевтическую композицию с цветом от светло-желтоватого до бледно-желтоватого получали способом, аналогичным примеру 8, используя сахарозу (2,704 г) вместо глицерина (0,676 г).
Пример 33
Прозрачную фармацевтическую композицию с цветом от светло-желтоватого до бледно-желтоватого получали способом, аналогичным примеру 1, используя сахарозу (2,889 г) вместо глицерина (0,722 г) и используя лимонную кислоту вместо соляной кислоты.
Пример 34
Прозрачную фармацевтическую композицию с цветом от светло-желтоватого до бледно-желтоватого получали способом, аналогичным примеру 5, используя сахарозу (3,963 г) вместо глицерина (0,991 г) и используя лимонную кислоту вместо соляной кислоты.
Пример 35
Прозрачную фармацевтическую композицию с цветом от светло-желтоватого до бледно-желтоватого получали способом, аналогичным примеру 1, используя сахарозу (2,889 г) вместо глицерина (0,722 г) и используя фосфорную кислоту вместо соляной кислоты.
Пример 36
Прозрачную фармацевтическую композицию с цветом от светло-желтоватого до бледно-желтоватого получали способом, аналогичным примеру 5, используя сахарозу (3,963 г) вместо глицерина (0,991 г) и используя фосфорную кислоту вместо соляной кислоты.
Пример 37
Ребамипид
2 г
Борная кислота
1,5 г
Меглумин
6,2 г
Глицерин
0,861 г
Соляная кислота
q.s. (до рН=8,7)
Очищенная вода
q.s.
Всего
100 мл
К небольшому количеству очищенной воды добавляли ребамипид, борную кислоту, меглумин и глицерин при перемешивании и рН получившейся в результате смеси регулировали соляной кислотой. Перемешивание осуществляли низкоскоростной винтовой мешалкой без применения высокоскоростного перемешивателя, такого как смеситель-гомогенизатор или гомогенизатор. Каждый ингредиент легко растворялся при помощи низкоскоростной винтовой мешалки. Затем получившийся в результате раствор в стерильных условиях фильтровали через 0,2 мкм фильтр для получения фармацевтической композиции. Фармацевтическая композиция представляла собой бесцветный прозрачный раствор.
Пример 38
Ребамипид
2 г
Борная кислота
1 г
Меглумин
4,5 г
Глицерин
1,259 г
Соляная кислота
q.s. (до рН=8,7)
Очищенная вода
q.s.
Всего
100 мл
К небольшому количеству очищенной воды добавляли ребамипид, борную кислоту, меглумин и глицерин при перемешивании и рН получившейся в результате смеси регулировали соляной кислотой. Перемешивание осуществляли низкоскоростной винтовой мешалкой без применения высокоскоростного перемешивателя, такого как смеситель-гомогенизатор или гомогенизатор. Каждый ингредиент легко растворялся при помощи низкоскоростной винтовой мешалки. Затем получившийся в результате раствор в стерильных условиях фильтровали через 0,2 мкм фильтр для получения фармацевтической композиции. Фармацевтическая композиция представляла собой бесцветный прозрачный раствор.
Пример 39
Ребамипид
1 г
Борная кислота
1,5 г
Меглумин
5,2 г
Глицерин
1,287 г
Соляная кислота
q.s. (до рН=8,4)
Очищенная вода
q.s.
Всего
100 мл
К небольшому количеству очищенной воды добавляли ребамипид, поливинилпирролидон (K-25), борную кислоту, меглумин и глицерин при перемешивании и рН получившейся в результате смеси регулировали соляной кислотой. Перемешивание осуществляли низкоскоростной винтовой мешалкой без применения высокоскоростного перемешивателя, такого как смеситель-гомогенизатор или гомогенизатор. Каждый ингредиент легко растворялся при помощи низкоскоростной винтовой мешалки. Затем получившийся в результате раствор в стерильных условиях фильтровали через 0,2 мкм фильтр для получения фармацевтической композиции. Фармацевтическая композиция представляла собой бесцветный прозрачный раствор.
Пример 40
Ребамипид
1 г
Борная кислота
1 г
Меглумин
3,6 г
Глицерин
1,565 г
Соляная кислота
q.s. (до рН=8,0)
Очищенная вода
q.s.
Всего
100 мл
К небольшому количеству очищенной воды добавляли ребамипид, поливинилпирролидон (K-25), борную кислоту, меглумин и глицерин при перемешивании и рН получившейся в результате смеси регулировали соляной кислотой. Перемешивание осуществляли низкоскоростной винтовой мешалкой без применения высокоскоростного перемешивателя, такого как смеситель-гомогенизатор или гомогенизатор. Каждый ингредиент легко растворялся при помощи низкоскоростной винтовой мешалки. Затем получившийся в результате раствор в стерильных условиях фильтровали через 0,2 мкм фильтр для получения фармацевтической композиции. Фармацевтическая композиция представляла собой бесцветный прозрачный раствор.
Пример 41
Бесцветную прозрачную фармацевтическую композицию получали способом, аналогичным примеру 37, используя лимонную кислоту вместо соляной кислоты.
Пример 42
Бесцветную прозрачную фармацевтическую композицию получали способом, аналогичным примеру 39, используя лимонную кислоту вместо соляной кислоты.
Пример 43
Бесцветную прозрачную фармацевтическую композицию получали способом, аналогичным примеру 37, используя сахарозу (3,444 г) вместо глицерина (0,861 г).
Пример 44
Бесцветную прозрачную фармацевтическую композицию получали способом, аналогичным примеру 39, используя сахарозу (5,148 г) вместо глицерина (1,287 г).
Пример 45
Бесцветную прозрачную фармацевтическую композицию получали способом, аналогичным примеру 37, используя сахарозу (3,444 г) вместо глицерина (0,861 г) и используя лимонную кислоту вместо соляной кислоты.
Пример 46
Бесцветную прозрачную фармацевтическую композицию получали способом, аналогичным примеру 39, используя сахарозу (5,148 г) вместо глицерина (1,287 г) и используя лимонную кислоту вместо соляной кислоты.
Пример 47
Бесцветную прозрачную фармацевтическую композицию получали способом, аналогичным примеру 37, используя сахарозу (3,444 г) вместо глицерина (0,861 г) и используя фосфорную кислоту вместо соляной кислоты.
Пример 48
Бесцветную прозрачную фармацевтическую композицию получали способом, аналогичным примеру 39, используя сахарозу (5,148 г) вместо глицерина (1,287 г) и используя фосфорную кислоту вместо соляной кислоты.
Композиции по примерам 49-52 и сравнительным примерам 1-5 представленные в следующей таблице 1, готовили тем же самым способом, что и в примере 1, используя каждый ингредиент и каждое его количество, как описано в таблице 1, каждая из которых представляла собой прозрачную фармацевтическую композицию, имеющую pH в пределах 7-9. Композиции хранили в холодильнике в течение 4 недель, затем наблюдали и регистрировали каждый аспект композиций. В результате в фармацевтических композициях сравнительных примеров 1-5, которые содержали неорганический катион, образовался осадок или гель. В то время как в фармацевтических композициях по примерам 49-52, которые не содержали какой-либо неорганический катион, осадок или гель вообще не образовывался.
Таблица 1
Пример 49
Сравнит. пример 1
Сравнит. пример 2
Сравнит. пример 3
Сравнит. пример 4
Пример 50
Сравнит. пример 5
Пример 51
Пример 52
Ребамипид (г)
2,02
2,02
2,02
2,02
2,02
2,02
2,02
2,02
2,02
Меглумин (г)
5
5
5
5
5
5
5
5
5
PVP K25 (г)
4
4
4
4
4
4
4
-
-
Макрогол (г)
-
-
-
-
-
-
-
-
3
Борная кислота (г)
1
-
-
-
-
1
1
1
1
Боракс<sup>1)</sup> (г)
-
1,9
-
-
-
-
-
-
-
Фосфат Na (г)
-
-
1
-
-
-
-
-
-
Цитрат Na (г)
-
-
-
1
-
-
-
-
-
Карбонат Na (г)
-
-
-
-
1
-
-
-
-
Ангидрид лимонной кислоты
q.s.
q.s.
q.s.
q.s.
q.s.
-
q.s.
q.s.
q.s.
10% HCl
-
-
-
-
-
q.s.
-
-
-
Глицерин (г)
0,706
0,706
0,706
0,706
0,706
0,706
-
0,706
0,706
NaCl (г)
-
-
-
-
0,25
-
-
Очищенная вода<sup>2)</sup>
q.s.
q.s.
q.s.
q.s.
q.s.
q.s.
q.s.
q.s.
q.s.
<sup>1)</sup> 1,9 г боракс: 1 г тетрабората натрия.
<sup>2)</sup> «q.s.» очищенной воды: общий объем препарата доводили до 100 мл очищенной водой.
Для того чтобы подтвердить хорошую прозрачность и хорошую проницаемость данной фармацевтической композиции, изготовили пример 1, пример 37, сравнительный пример 6, согласно WO 2008/050896, и сравнительный пример 7, согласно WO 2006/052018. Вкратце, после изготовления каждой композиции наблюдали и регистрировали каждый аспект, оптическую прозрачность при 640 нм и способность к фильтрованию через мембранный фильтр с размером пор 0,2 мкм. После того, как композиции выдерживали при комнатной температуре в течение четырех недель, наблюдали и регистрировали каждый аспект.
Результаты представлены в таблице 2. В данных фармацевтических композициях (примеры 1 и 37) их оптическая прозрачность не нарушалась, способность к фильтрованию была хорошей и эти аспекты не изменялись даже через 4 недели. В то время как фармацевтическая композиция по сравнительному примеру 6 была молочно-белая, то есть непрозрачная, и ее было трудно фильтровать. Фармацевтическая композиция по сравнительному примеру 7 была белая, и ее нельзя было фильтровать, поскольку фильтр был забит ее кристаллами. Кроме того, фармацевтическую композицию по сравнительному примеру 7, которая простояла в течение 4 недель, приходилось тщательно взбалтывать для повторного диспергирования, поскольку выделялись кристаллы.
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ПРИМЕР 6
(Изготовление суспензии, содержащей 2% (мас./об.) кристаллического ребамипида)
К 700 мл водного раствора гидроксида натрия, полученного путем растворения 4,4 г гидроксида натрия в очищенной воде, добавляли 20 г ребамипида. Смесь растворяли при нагревании и затем раствор охлаждали до 30-40°C. С другой стороны, смешивали 12 мл 10 н. соляной кислоты, 68 мл очищенной воды и 200 мл водной 10% (мас./об.) гидроксипропилметилцеллюлозы (производства Shin-Etsu Chemical Co., Ltd, TC-5E) и раствор охлаждали на бане со льдом. Раствор перемешивали при 1400 об/мин, вышеописанный раствор гидроксида натрия, содержащий ребамипид, постепенно выливали при озвучивании для выделения кристаллов ребамипида. После выделения кристаллов скорость перемешивания поднимали до 3000 об/мин и смесь перемешивали в течение дополнительных 20 минут. По окончании выделения pH смеси устанавливали на уровне 6-6,5 5 н. гидроксидом натрия и общий объем доводили до 1 литра очищенной водой до получения требуемой водной суспензии, содержащей кристаллический ребамипид.
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ПРИМЕР 7
(Изготовление суспензии, содержащей 2% (мас./об.) кристаллического ребамипида)
К 80 мл очищенной воды добавляли 0,5 г частично сапонифицированного поливинилового спирта (производства KURARAY CI., LTD, Poval 224C), 0,11 г лимонной кислоты, 0,146 г цитрата натрия, 0,715 г хлорида натрия и 0,180 г хлорида калия и смесь растворяли при нагревании. После охлаждения раствор фильтровали. К фильтрату добавляли ребамипид и получившуюся в результате смесь перемешивали. Затем ее общий объем доводили до 100 мл очищенной водой до получения требуемой водной суспензии.
Таблица 2
Композиция
Пример 1
Пример 37
Сравнительный пример 6
Сравнительныйпример 7
Сразу после изготовления
Аспект
Прозрачная
Прозрачная
Молочно белая, прозрачная
Белая
Оптическая прозрачность при 640 нм (%)
100,0
100,0
44,5
0,0
Способность к фильтрованию через 0,2 мкм мембранный фильтр
очень хорошая
очень хорошая
немного трудная
блокируется кристаллами
Спустя 4 недели
Аспект
без изменений
без изменений
без изменений
Выделились кристаллы, повторное диспергирование при тщательном взбалтывании
ИСПЫТАНИЯ НА ПРОТИВОМИКРОБНУЮ ЭФФЕКТИВНОСТЬ
(Бактериальные штаммы)
В качестве посевной культуры в испытаниях использовали следующие штаммы.
бактерии:
Escherichia Coli NBRC 3972
Pseudomonas aeruginosa NBRC 13275
Staphylococcus aureus NBRC 13276
дрожжи и плесени:
Candida albicans NBRC 1594
Aspergillus niger NBRC 9455
(Образцы для испытаний)
Примеры 53-58 получали способом, аналогичным примеру 1, используя ингредиенты, перечисленные в таблице 3.
Таблица 3
Композиции для исследования противомикробной эффективности
Пример 53
Пример 54
Пример 55
Пример 56
Пример 57
Пример 58
Ребамипид
2 г
2 г
2 г
2 г
2 г
2 г
PVP (K25)
-
-
3 г
3 г
-
-
PVP (K17)
-
-
-
-
3 г
3 г
Борная кислота
1,5 г
2 г
1,5 г
2 г
1,5 г
1,2 г
Меглумин
6,2 г
7,9 г
5,9 г
7,4 г
5,7 г
4,8 г
Глицерин
0,972 г
0,616 г
0,844 г
0,5 г
0,819 г
1,05 г
10% HCl
q.s.(ок. 8,7)
q.s.(ок. 8,7)
q.s.(ок. 8,3)
q.s.(ок. 8,3)
q.s.(ок. 8,3)
q.s.(ок. 8,3)
Очищенная вода
q.s.
q.s.
q.s.
q.s.
q.s.
q.s.
Всего
100 мл
100 мл
100 мл
100 мл
100 мл
100 мл
Примечание: PVP означает поливинилпирролидон.
(Способ)
5
6
Каждую посевную культуру асептически добавляли к примерам 53-58 при концентрации 10-10 колоний образующих единиц/мл и каждую композицию равномерно перемешивали для получения каждого тестируемого образца. Эти образцы хранили при 20-25°C, оберегая от попадания света. На 0, 14 и 28 дни из каждого тестируемого образца отбирали по 1 мл и определяли количество жизнеспособных клеток.
Определение количества жизнеспособных клеток бактерий проводили следующим образом. Раствор каждого образца разбавляли десятикратными разбавлениями SCDLP средой. По 1 мл из каждого разбавления высевали на чашки Петри и добавляли туда по 15-20 мл SCDLP среды с агаром. После культивирования среды при 30-35°C в течение 5 дней проводили подсчет жизнеспособных клеток. Отбирали чашки Петри, в которых подсчет жизнеспособных клеток был не больше 300, и записывали результат подсчета.
Определение количества жизнеспособных клеток дрожжей и плесени определяли следующим образом. Раствор каждого образца разбавляли десятикратными разбавлениями GPLP средой. По 1 мл из каждого разбавления высевали на чашки Петри и добавляли туда по 15-20 мл GPLP среды с агаром. После культивирования среды при 20-25°C в течение 5 дней проводили подсчет жизнеспособных клеток. Отбирали чашки Петри, в которых подсчет жизнеспособных клеток был не больше 100, и записывали результат подсчета.
Подсчет жизнеспособных клеток в растворе каждого образца получали умножением записанного числа на степень его разбавления и дополнительно вычисляли процентное отношение подсчета жизнеспособных клеток к исходному подсчету жизнеспособных клеток.
(Определение)
Для бактерий определение «хорошо» давали в случае, когда процентное отношение на 14 день составляло не более чем 0,1% и процентное отношение на 28 день оставалось на том же уровне, как результат на 14 день, или было меньше. Об определении противомикробной эффективности судили как о «соответствующей» в случае, когда оба результата были «приемлемыми».
Для дрожжей и плесеней определение «хороший» давали в случае, когда процентное отношение оставалось на том же самом уровне, как первоначально, или было меньше. Об определении противомикробной эффективности судили как о «положительной» в случае, когда оба результата на 14 и на 28 день были «хорошими».
(Результат)
Все примеры 53-58 оценивали в отношении противомикробной эффективности.
Таблица 4
Результат испытаний противомикробной эффективности
Бактериальный штамм
Результаты
Противомикробная эффективность
Спустя14 дней
Спустя28 дней
Пример 53
E. Coli
приемлемый
приемлемый
соответствующая
P. aeruginosa
приемлемый
приемлемый
соответствующая
S. aureus
приемлемый
приемлемый
соответствующая
C. albicans
приемлемый
приемлемый
соответствующая
A. niger
приемлемый
приемлемый
соответствующая
Пример 54
E. Coli
приемлемый
приемлемый
соответствующая
P. aeruginosa
приемлемый
приемлемый
соответствующая
S. aureus
приемлемый
приемлемый
соответствующая
C. albicans
приемлемый
приемлемый
соответствующая
A. niger
приемлемый
приемлемый
соответствующая
Пример 55
E. Coli
приемлемый
приемлемый
соответствующая
P. aeruginosa
приемлемый
приемлемый
соответствующая
S. aureus
приемлемый
приемлемый
соответствующая
C. albicans
приемлемый
приемлемый
соответствующая
A. niger
приемлемый
приемлемый
соответствующая
Пример 56
E. Coli
приемлемый
приемлемый
соответствующая
P. aeruginosa
приемлемый
приемлемый
соответствующая
S. aureus
приемлемый
приемлемый
соответствующая
C. albicans
приемлемый
приемлемый
соответствующая
A. niger
приемлемый
приемлемый
соответствующая
Пример 57
E. Coli
приемлемый
приемлемый
соответствующая
P. aeruginosa
приемлемый
приемлемый
соответствующая
S. aureus
приемлемый
приемлемый
соответствующая
C. albicans
приемлемый
приемлемый
соответствующая
A. niger
приемлемый
приемлемый
соответствующая
Пример 58
E. Coli
приемлемый
приемлемый
соответствующая
P. aeruginosa
приемлемый
приемлемый
соответствующая
S. aureus
приемлемый
приемлемый
соответствующая
C. albicans
приемлемый
приемлемый
соответствующая
A. niger
приемлемый
приемлемый
соответствующая