ИНГИБИТОРЫ АРГИНАЗЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ДЕПРЕССИИ
ARGINASE INHIBITORS FOR TREATING DEPRESSION

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к композициям, полезным в терапии депрессии и связанных с депрессией состояний. Более конкретно, изобретение относится к соединениям, которые проявляют ингибирующую активность в отношении аргиназы.
Уровень техники
Аргиназа (ЕС Номер 3.5.3.1) - это фермент, активность которого приводит к преобразованию аминокислоты L-аргинина в L-орнитин и мочевину, что является важной частью цикла мочевины. Помимо метаболического преобразования в L-орнитин, L-аргинин является предшественником NO, молекулы-свободного радикала, вовлекаемого в большое число биологических процессов.
Для некоторых соединений, полезных для лечения множества болезней и нарушений, также было показано ингибирование аргиназы. Например, показана возможность применения ингибиторов аргиназы N(омега)-гидрокси-L-аргинина (NOHA), N'-гидрокси-нор-L-аргинина (нор-NOHA), 2(S)-амино-6-бороногексановой кислоты (АВН), S-(+)-амино-6-йодацетамидогексановой кислоты, S-(+)-амино-5-йодацетамидопентановой кислоты, L-норвалина, или L-HOArg для лечения астмы, легочной гипертензии и серповидно-клеточной болезни (WO/2004/073623 Treatment of conditions associated with decreased nitric oxide bioavailability, including elevated arginase conditions).
L-Норвалин считается сильным ингибитором аргиназы (Rognstad R. Sources of ammonia for urea synthesis in isolated rat liver cells. Biochim Biophys Acta 1977; 496: 249-254; Chang CI, Liao JC, Kuo L. Arginase modulates nitric oxide production in activated macrophages. Am J Physiol 1998; 274: H342-H348). Альфа-DFMO - хорошо известный ингибитор орнитиндекарбоксилазы, но также и сильный ингибитор аргиназы (Selamnia M., Mayeur С, Robert V, Blachier F. Alpha-difluoromethylornithine (DFMO) as a potent arginase activity inhibitor in human colon carcinoma cells. Biochem Pharmacol 1998; 55: 1241-1245.3).
Известно и описано в US6573290 (DFMO and celecoxib in combination for cancer chemoprevention and therapy), US 6258845 (DFMO and sulindac combination in cancer chemoprevention) и US 4925835 (Aziridinyl putrescine containing compositions and their uses in treating prostate cancer), US 6277411 (Pharmaceutical formulation containing DFMO for the treatment of cancer) применение альфа-DFMO (эфлорнитина, иногда называемого «эльфорнитином») для лечения или профилактики рака индивидуально или в комбинации с другими соединениями.
Норвалин - аналог валина, аминокислоты с разветвленной цепью, и он отсутствует среди 20 общих природных белковых аминокислот.Его использовали в различных комбинациях в исследовательской работе, включая в пептиды и в пищевые композиции, например, по WO/2008/067641 (Composition for improving blood flow in working muscles comprising L-arginine, Crataegus extract and artichoke flavonoids).
Было показано, что повышенная активность аргиназы приводит к снижению образования NO (Que LG, George SE, Gotoh T, Mori M, Huang YC. Effects of arginase isoforms on NO production by nNOS. Nitric Oxide 2002; 6: 1-8). Таким образом, ингибиторы аргиназы могут увеличить выработку NO. Поскольку ингибиторы NO-синтазы обладают свойствами, подобными антидепрессантам и транквилизаторам (Volke V, Wegener G, Bourin M, Vasar E. Antidepressant - and anxiolytic-like effects of selective neuronal NOS inhibitor l-(2-trifluoromethylphenyl)-imidazole in mice. Behavioural Brain Research 2003; 140: 141-147), у ингибиторов аргиназы должен быть противоположный эффект. Неожиданно, как мы показали в нижеследующем изобретении, ингибиторы аргиназы обладают антидепрессантными свойствами.
В настоящем документе раскрыт новый сильный и неожиданный эффект двух структурно различных ингибиторов аргиназы, DFMO и L-норвалина, что ведет к перспективе применения ингибирующих аргиназу соединений для лечения и/или профилактики депрессии и/или связанных с депрессией состояний.
Краткое описание чертежей
Фиг.1 Влияние имипрамина (15 мг/кг), L-норвалина и DFMO в тесте принудительного плавания (n=8 на группу). Результаты выражаются как среднее ±S.E.M. (стандартная погрешность среднего). *-Р<0,01, **- Р<0,001, в сравнении с физраствором.
Фиг.2 Влияние L-орнитина (500 мг/кг), L-норвалина (500 мг/кг) и их комбинации в тесте принудительного плавания (n=10 на группу). Результаты выражаются как среднее ±S.E.M. *-Р<0,01 в сравнении с группой физраствор+физраствор; # - Р<0,001, в сравнении с группой физрастовор+L-норвалин.
Раскрытие изобретения
Было обнаружено, что ингибиторы аргиназы, например L-норвалин и альфа-DFMO представляют собой терапевтически перспективные антидепрессантные средства.
Объектом настоящего изобретения являются соединения, которые ингибируют аргиназу (включая дифторметилорнитин (DFMO) и L-норвалин, но не ограничиваясь ими), и которые могут применяться в качестве терапевтически активных средств для лечения и профилактики депрессии и/или связанных с депрессией состояний.
Ингибирующими активность аргиназы соединениями могут быть дифторметилорнитин (DFMO), L-норвалин, но не ограничиваясь ими.
Другими объектами настоящего изобретения являются: применение упомянутых ингибирующих аргиназу соединений в качестве терапевтически активных средств для производства фармацевтических композиций для применения к человеку и в ветеринарии, и фармацевтические композиции, содержащие упомянутые соединения и фармацевтически приемлемый носитель. Примеры таких носителей широко известны в фармацевтической практике в препаратах для человека и в ветеринарии. Примерами таких носителей являются крахмал, альгинаты, стеараты, желатин, лактоза, микрокристаллическая целлюлоза и т.д. Фармацевтические композиции могут быть в любой форме, подходящей для их применения, например, в форме капсул, порошка, таблеток, раствора, суспензии, лосьона и т.д.
Таким образом, дифторметилорнитин (DFMO), L-норвалин или другие ингибиторы аргиназы могут применяться в качестве терапевтически активных средств для производства фармацевтических композиций для применения к человеку и в ветеринарии. Фармацевтические композиции, содержащие дифторметилорнитин (DFMO), L-норвалин или другие ингибиторы аргиназы, могут применяться для лечения и/или профилактики депрессии и/или связанных с депрессией состояний.
Кроме того, раскрыт способ выявления соединений, подходящих для применения в качестве терапевтически активных средств для лечения и/или профилактики депрессии и/или связанных с депрессией состояний и/или тревожности, содержащий этап, на котором определяют, проявляет ли исследуемое соединение ингибирующую активность в отношении аргиназы, и если упомянутое соединение ингибирует аргиназу, то это соединение выбирают в качестве кандидата, подходящего для применения в качестве терапевтически активного средства для лечения и/или профилактики упомянутых болезней и/или состояний.
Также в изобретение включен способ лечения и профилактики депрессии и/или связанных с депрессией состояний, содержащий этап, на котором вводят млекопитающему, страдающему от депрессии и/или связанных с депрессией состояний, или млекопитающему с подозрением на развитие депрессии или связанного с депрессией состояния терапевтически эффективное количество соединения, проявляющего ингибирующую активность в отношении аргиназы.
Кроме того, раскрыт набор для выбора новых соединений для лечения и/или профилактики депрессии и/или связанных с депрессией состояний. Набор такого вида содержит по меньшей мере средство для определения ингибирующей активности в отношении аргиназы способом, известным специалисту в данной области техники. Если обнаружена ингибирующая активность в отношении аргиназы, соединение отбирается для дальнейшего скрининга его свойств в качестве кандидата лекарственного средства для лечения и/или профилактики депрессии и/или связанных с депрессией состояний.
Осуществление изобретения
Антидепрессантные свойства ингибирующих аргиназу средств L-норвалина и DFMO были исследованы посредством ряда поведенческих тестов на животных, обычно применяемых в фармакологии и считаются в общем прогнозирующими антидепрессантную активность у людей (Porsolt RD, Bertin A, Jalfre M. Behavioral despair in mice: a primary screening test for antidepressants. Arch Int Pharmacodyn Ther 1977; 229: 327-336; Crawley J, Goodwin FK).
L-норвалин, DFMO и L-орнитин были проверены в следующих тестах: тест принудительного плавания на мышах, (пример 1, пример 2), тест двигательной активности (пример 3). Двигательную активность животных измеряли с помощью автоматизированной системы, описанной ранее (Volke V, Wegener G, Bourin M, Vasar E. Antidepressant - and anxiolytic-like effects of selective neuronal NOS inhibitor l-(2-trifluoromethylphenyl)-imidazole in mice. Behavioural Brain Research 2003; 140: 141-147).
Данные анализировали с помощью однофакторного или двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA), когда это целесообразно. Сравнение по полученным данным между индивидуальными группами выполнено по тесту Ньюмена-Кеулса.
Пример 1. Тест принудительного плавания
Использовались мыши-самцы C57Bl/6/Bkl (Scanbur ВК АВ, Швеция) массой тела 20-25 г. Мыши содержались в клетках по 10 особей (21×37×15 см) в виварии при 20°С с циклом дня и ночи по 12 ч (свет включали в 7.00 утра). Водопроводная вода и пищевые гранулы были без ограничений. Животных до введения в эксперимент содержали в питомнике для животных в течение по меньшей мере двух недель.
Измерение двигательной активности и тест принудительного плавания проводили последовательно через 45 и 55 минут после введения исследуемых соединений, согласно Volke V, Wegener G, Bourin M, Vasar E. Antidepressant - and anxiolytic-like effects of selective neuronal NOS inhibitor 1-(2-trifluoromethylphenyl)-imidazole in mice. Behavioural Brain Research 2003; 140: 141-147. В отдельном эксперименте за 15 минут до введения L-норвалина вводили продукт активности аргиназы L-орнитин или солевой раствор.
Тест принудительного плавания проводили согласно Porsolt et al.., Porsolt RD, Bertin A, Jalfre M. Behavioral despair in mice: a primary screening test for antidepressants. Arch Int Pharmacodyn Ther 1977; 229: 327-336.
Стеклянный цилиндр диаметром 12 см заполнен водой на 8 см при 25°С. Животное помещали в воду и регистрировали его поведение на видео в течение 6 мин. Наблюдатель, не владеющий информацией о протоколе введения вещества, регистрировал время неподвижности в течение последних 4 минут из 6 минут теста.
Результаты:
Время неподвижности составило 220 секунд в контрольной группе животных. При введении L-норвалина внутрибрюшинно (в/б) в дозах 20, 100 и 500 мг/кг время неподвижности снизилось до 146, 107 и 96 секунд, соответственно (фиг.1).
В отдельном эксперименте DFMO (400 мг/кг, в/б) снизил время неподвижности с 219 секунд до 191 секунды. Более низкие дозы DFMO (10-100 мг/кг, в/б) были неэффективны.
И L-норвалин, и DFMO уменьшают время неподвижности, тем самым проявляя антидепрессант-подобный эффект.
Пример 2. Эффект L-орнитина, L-норвалина, и их комбинации в тесте принудительного плавания
В отдельном эксперименте L-орнитин (500 мг/кг) не влиял на время неподвижности (физраствор 199 секунд, L-орнитин 214 секунд. Фиг.2). Однако предварительное введение L-орнитина снизило влияние L-норвалина на время неподвижности (L-норвалин 127 секунд, L-орнитин+L-норвалин 215 секунд; р<0,001 против группа L-норвалина).
Таким образом, два структурно различных ингибитора аргиназы вызвали антидепрессант-подобный эффект, что указывает на то, что обе молекулы, равно как и ингибиторы аргиназы вообще, представляют интерес как терапевтически активные средства для лечения и/или профилактики депрессии и/или связанных с депрессией состояний. Кроме того, продукт активности аргиназы L-орнитин был способен блокировать эффект L-норвалина, что дополнительно свидетельствует в пользу того, что антидепрессантный эффект исследуемых соединений зависит от ингибирования аргиназы.
Пример 3. Влияние L-орнитина, L-норвалина, и их комбинации на двигательную активность
Двигательную активность измеряли с помощью автоматизированной системы с шестью камерами (45×45×45 см) из прозрачного акрила (MOTI, Technical & Scientific Equipment GMBH, Германия; Volke V, Wegener G, Bourin M, Vasar E. Antidepressant - and anxiolytic-like effects of selective neuronal NOS inhibitor l-(2-trifluoromethylphenyl)-imidazole in mice. 20 Behavioural Brain Research 2003; 140: 141-147). В камеру помещали интактных в отношении аппарата мышей и регистрировали активность в вертикальном и горизонтальном направлении в течение 10 мин.
Результаты:
Исследуемые соединения самостоятельно или в комбинации не изменяли способность животных передвигаться, что исключает возможность того, что эффекты лекарственных средств в тесте принудительного плавания были неспецифического происхождения.
Описанные выше результаты приводят к заключению, что соединения, проявляющие ингибирующую активность в отношении аргиназы, могут применяться как фармакологические средства для лечения и/или профилактики депрессии и/или связанных с депрессией состояний. Дифторметилорнитин (DFMO) проявил себя как кандидат для лечения и/или профилактики депрессии и/или связанный с депрессией состояний. L-норвалин проявил себя как кандидат для лечения и/или профилактики депрессии и/или связанных с депрессией состояний.
Соответственно, L-норвалин, DFMO и другие ингибирующие аргиназу соединения можно рассматривать в качестве кандидатов на производство лекарств для людей для лечения и/или профилактики депрессии и/или связанных с депрессией состояний. Соответственно, L-норвалин, DFMO и другие ингибирующие аргиназу соединения можно рассматривать в качестве кандидатов на производство ветеринарных лекарственных средств для лечения и/или профилактики депрессии и/или связанных с депрессией состояний.
В настоящем документе раскрыт способ лечения или профилактики депрессии и/или связанных с депрессией состояний путем введения млекопитающему фармацевтической композиции, содержащей соединение, проявляющее ингибирующее активность в отношении аргиназы.
Специалисту в данной области техники очевидно, что другие ингибирующие аргиназу соединения также могут быть полезными для лечения и/или профилактики депрессии и/или связанных с депрессией состояний. Таким образом, способ выявления соединения, подходящего для лечения и/или профилактики депрессии и/или связанных с депрессией состояний, содержит этап, на котором определяют, проявляет ли исследуемое соединение ингибирующую активность в отношении аргиназы, и, если упомянутое соединение ингибирует аргиназу, тогда это соединение выбирают как кандидат, подходящий для применения в качестве терапевтически активного средства для лечения и/или профилактики упомянутых болезней и/или состояний.
Специалист в данной области техники также может заключить, что набор для выбора новых соединений для лечения и/или профилактики депрессии и/или связанных с депрессией состояний содержит по меньшей мере средство для определения ингибирующей активности соединения в отношении аргиназы способом, известным специалисту в этой области техники. Это средство включает биохимический анализ, в котором измеряется выработка L-орнитина или мочевины, не ограничиваясь этим. Анализ выполняется in vitro с очищенным ферментом аргиназой в клеточной культуре или в другой модельной системе. Если обнаруживается ингибирующая активность в отношении аргиназы, то соединение отбирается для дальнейшего скрининга его свойств как кандидат лекарственного средства для лечения и/или профилактики депрессии и/или связанных с депрессией состояний.