КОСМЕТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ КУЛЬТИВИРОВАННЫЕ КЛЕТКИ ИЗ КАМБИЯ ИЛИ ПРОКАМБИЯ ТИССА(TAXUS)
COSMETIC COMPOSITION CONTAINING CULTURE CELLS OF YEW (TAXUS) STEM CAMBIUM OR PROCAMBIUM

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к антиоксидантной, противовоспалительной или противовозрастной композиции, содержащей какую-либо одну или более линий клеток, происходящих из камбия или прокамбия тисса (Taxus), их экстракт, лизат и культуральную среду.
Уровень техники
Старение - это функциональный, структурный и биохимический процесс, происходящий непрерывно на протяжении жизни любого живого существа, включая человека. Старение осуществляется на всех уровнях (клеточном, тканевом и проч.) организма, проявляясь снижением интенсивности обмена веществ, повышением заболеваемости, ухудшением приспособляемости и др.; в конечном итоге оно приводит к гибели клеток и тканей организма, например человеческого. Теоретические объяснения процессов и причин старения подразделяются на генетические (см., например, Chung.H.Y. et al., Kor. J. Gerontol., 2:1, 1992) и теории износа (Chung.H.Y. et al., Kor. J. Gerontol., 2:1, 1992). Теории износа полагают, что клетки живого организма утрачивают свои функции с течением времени или из-за накопления вредных веществ. Среди этих объяснений наиболее правдоподобной представляется теория свободных радикалов, согласно которой свободные радикалы, образующиеся в организме в метаболических процессах, вследствие воздействия радиации, вирусов, тяжелых металлов и загрязнителей воздуха, вызывают возникновение высокотоксичных веществ, тем самым способствуя старению и приводя к различным связанным с возрастом заболеваниям.
Свободные радикалы - это соединения, несущие неспаренный электрон на внешней орбите; они очень нестабильны и, стремясь обрести недостающий электрон, высоко реакционноспособны. В частности, кислородные свободные радикалы, содержащие атом кислорода с неспаренным электроном, которые называются также активными формами кислорода (ROS), взаимодействуют с белками, липидами, углеводами и другими компонентами организма, приводя к перекисному окислению липидов, повреждению ДНК, окислению белков и прочим негативным явлениям, тем самым вызывая нарушение внутриклеточных структур и, в конечном счете, гибель клетки.
Так, эти активные формы кислорода усугубляют атеросклероз, болезнь Альцгеймера и, образуясь при повышенном уровне гомоцистеина в крови, инициируют воспалительные процессы, ведущие к старению сосудов.
Содержащие кислород токсичные вещества в организме человека называют активными формами кислорода (ROS). Примеры этих веществ включают свободные радикалы, как, например, супероксид-радикал, гидроксильный, пероксильный, алкоксильный и гидропероксильный радикалы, и несвободные радикалы, как, например, перекись водорода, хлорноватистая кислота, озон, синглетный кислород и пероксинитрит.Из числа активных форм кислорода наиболее изучены супероксидные свободные радикалы, которые играют весьма важную роль (Fridovich L., Science, 201:175, 1978).
В процессе старения в митохондриях клетки образуются ROS, которые становятся средоточием окислительного повреждения (Lesnefsky, E.J. & Hoppel, C.L. Arch. Biochem.Biophys 420, 287, 2003). Неоднократно сообщалось, что согласно теории свободных радикалов, внутриклеточные свободные радикалы имеют прямое отношение к связанному с возрастом окислительному стрессу и обусловленным им возрастным заболеваниям (Finkel, Т. & Holbrook, N.J., Science 408; 239, 2000). Сообщалось также, что такой окислительный стресс играет важную роль в причинах и инициировании старения (Chen Q. etal., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. May 9; 92(10):4337, 1995; Packer L. & Fuehr K., Nature, 267(5610):423, 1977). Термин «окислительный (оксидативный) стресс» употребляется для описания повреждения клеток, вызываемого окислением макромолекул при возрастающем уровне активных форм кислорода и пониженных резервах антиоксидантов (Thomas С. & Squier, Experimental Gerontology, 36;1539, 2001).
В старых клетках, в которых ухудшаются процессы репликации, ROS образуются в большем количестве и с большей скоростью, чем в молодых клетках; кроме того, старые клетки в ходе рутинного обмена веществ производят токсичные побочные продукты, например надперекись (суперокид), перекись водорода, гидроксильный радикал и др. Экспериментальные данные свидетельствуют, что у старых людей и животных в тканях накапливаются окислительные повреждения ДНК, белков и липидов (Chen, Ann. N. Y. Acad. Sci., 908:111, 2000). Активные формы кислорода, в частности гидроксильный радикал, воздействуют на ДНК так, что образуются 8-оксо-2'-дезоксигуанозин и другие сильные мутагенные агенты; содержание активных форм кислорода у каждого вида живых организмов связано с продолжительностью жизни, свойственной данному виду, а это означает, что уровень ROS является решающим фактором в определении скорости старения и развития различных связанных со старением заболеваний (Finkel & Holbrook, Nature, 408(6809): 239, 2000).
В 1961 г.Хейфлик (Hayflick) и Морхед (Moorhead) впервые сообщили о том, что репликативный потенциал молодых клеток в культуре снижается по мере увеличения числа клеточных делений, так что в конце концов клетки теряют способность к размножению, имея «предел удвоения», за которым клеточный рост прекращается. С тех пор ROS используются для определения связанных со старением молекулярных изменений человеческих клеток в качестве экспериментальных моделей старения in vitro и внутриклеточного старения человеческих фибробластов. (HAYFLICK L. & MOORHEAD P.S., Exp.Cell Res., 25:585, 1961).
Все аэробные организмы, включая человека, изначально обладают защитными механизмами против повреждения активными формами кислорода, неизбежно происходящего в ходе метаболических процессов энергообмена с использованием кислорода; когда образование активных форм кислорода превышает защитные возможности тканей, начинают развиваться различные возрастные заболевания, включая артрит, расстройства сердечно-сосудистой системы и слабоумие (Halliwell et al.. Drugs, 42:569, 1991; Fukuzawae/ al., J. Act. oxyg. Free Pad, 1:55, 1990).
2-
2
2
2
Активные формы кислорода, которые нередко называют вредными, включают супероксид-анион (О), представляющий собой синглетный кислород, образующийся в результате окисления-восстановления наиболее стабильного, триплетного кислорода (3O); перекись водорода (НО), гидроксильный радикал (ОН); содержат неспаренный электрон, эти свободные радикалы вызывают болезни, повреждая компоненты иммунной системы - ферменты и другие белки, ДНК, Т-клетки (Regnstrom et al., Lancet., 16:1183, 1992; Gey etal., Am. Ac. J. Cm. Nutr., 53:326, 1991).
По этой причине активно изучалось формирование антиоксидантов и в результате теперь известно множество соединений с антиоксидантными свойствами, включая ферменты, например супероксиддисмутазу, каталазу и глутатионпероксидазу, природные антиоксиданты, например витамины Е и С, каротиноиды и глутатион, и синтетические антиоксиданты, например /ирети-бутил-4-гидроксианизол (ВНА) и 3,5-(трет-бутил)-4-гидрокситолуол (ВНТ). Однако с возрастом у людей ослабевает способность антиоксидантных ферментов противостоять активным формам кислорода, а синтетические антиоксиданты, как выяснилось, обладают токсичностью и мутагенностью. Поэтому настоятельно необходимо разработать более стабильные и мощные естественные антиоксиданты (Hatano et al., Natural Medicines, 49:359, 1995; Masaki et al., Biol. Pharm. Bull, 18:162, 1995).
Заметим между тем, что воспаление представляет собой местную реакцию, возникающую в участке повреждения для ликвидации проникших патогенных агентов и/или поврежденных тканей. Несмотря на свою положительную роль, воспаление является одним из основных механизмов патогенеза заболеваний человека. Образование окиси азота (NO) в активированных моноцитах и макрофагах дает начало мощной вопалительной реакции и представляется наиболее важным в инициации иммунного ответа на бактериальные патогенные агенты (Bogdan С., Nat. Immunol., 2:907, 2001).
Повреждение ткани (клетки) или проникновение в организм чужеродного агента (например, бактерий, грибов, вирусов, различных аллергенных веществ) обычно вызывает воспалительную реакцию, проявляющуюся рядом сложных физиологических процессов, например активацией ферментов, секрецией медиаторов воспаления, перемещением и скоплением тканевой жидкости, миграцией клеток и разрушением тканей, что связано с различными опосредующими воспаление факторами и иммунокомпетентными клетками в крови и лимфе в сосудах в участке повреждения и в тканевой жидкости; внешне воспалительная реакция проявляется покраснением, отеком, гипертермией и болью. У здоровых людей воспалительная реакция ликвидирует проникшие в организм инфекционные агенты, восполняет поврежденные ткани и восстанавливает нарушившееся функционирование организма; но если антиген остался в организме или если из-за каких-либо внутренних факторов воспалительная реакция избыточна или неадекватно продолжительна, она приводит к повреждению слизистых оболочек и в результате в некоторых случаях вызывает заболевание, например рак. Соответственно, существует потребность в разработке естественных противовоспалительных агентов, которые способны предотвращать избыточную непрекращающуюся воспалительную реакцию, не вызывая негативных побочных эффектов.
Поэтому авторы настоящего изобретения предприняли попытки разработать композиции на основе природных компонентов, обладающие высокой антиоксидантной и противовоспалительной активностью и сводящие к минимуму побочные эффекты по сравнению с существующими антиоксидантными и противовоспалительными агентами. В результате этих усилий авторы настоящего изобретения обнаружили, что линии клеток, происходящие из камбия и прокамбия тисса (Taxus), и их экстракты обладают превосходной способностью подавлять воспаление и тормозить старение, в чем и состоит настоящее изобретение.
Раскрытие изобретения
Задачей настоящего изобретения является композиция на основе естественных субстанций, которая сводит к минимуму побочные эффекты по сравнению с существующими антиоксидантными и противовоспалительными агентами и проявляет антиоксидантную и противовоспалительную активность, предотвращая и задерживая старение.
Для достижения указанной цели настоящее изобретение предоставляет антиоксидантную, противовоспалительную или противовозрастную композицию, содержащую какую-либо одну (или более) линию клеток, происходящих из камбия или прокамбия тисса (Taxus) (или их экстракт, лизат и культуральную среду) и обладающих следующими свойствами:
(a) клетки недифференцированные;
(b) культура клеток стабильна, причем скорость роста выше, чем у линий клеток, происходящих из других тканей Taxzis; и
(c) морфологически характеризуется числом вакуолей.
Настоящее изобретение предоставляет также противовозрастную косметическую композицию, содержащую какую-либо одну (или более) из указанных линий клеток, их экстракт, лизат и культуральную среду.
Настоящее изобретение предоставляет также отбеливающую косметическую композицию, содержащую какую-либо одну (или более) из указанных линий клеток, их экстракт, лизат и культуральную среду.
Настоящее изобретение предоставляет также антиоксидантный функциональный пищевой продукт, содержащий какую-либо одну (или более) из указанных линий клеток, их экстракт, лизат и культуральную среду.
Настоящее изобретение предоставляет также противовозрастной продукт функционального питания, содержащий какую-либо одну (или более) из указанных линий клеток, их экстракт, лизат и культуральную среду.
Другие признаки и воплощения настоящего изобретения прояснятся полнее в нижеследующем описании осуществления изобретения и прилагающейся формуле изобретения.
Краткое описание чертежей
Фиг.1 представляет серию фотографий, демонстрирующих процесс формирования линии клеток по данному изобретению, показывающих внешний вид камбия и прокамбия после выделения, а также позволяющих сравнить дедифференцированные клетки и клетки, происходящие из камбия и прокамбия Taxus.
Фиг.2 изображает схему последовательных этапов экстракции активных субстанций из клеток линии по данному изобретению.
2
2
Фиг.3 представляет в сравнении графики, характеризующие количество активных форм кислорода (ROS), и изображения флуоресценции DCFH, которые демонстрируют антиоксидантную активность экстрактов культивированных клеток по данному изобретению при старении диплоидных фибробластов человека (HDF), вызванном НО (P-WE - водный экстракт прокамбиальных клеток; C-WE - водный экстракт камбиальных клеток).
Фиг.4 представляет серию фотографий, демонстрирующих подавление экспрессии p-ERK1/2 под действием экстрактов культивированных клеток по данному изобретению при старении диплоидных фибробластов человека (HDF), вызванном обработкой перекисью водорода (P-WE - водный экстракт прокамбиальных клеток; C-WE - водный экстракт камбиальных клеток).
Фиг.5 представляет серию фотографий, демонстрирующих индукцию экспрессии MnSOD под действием экстрактов культивированных клеток по данному изобретению при старении диплоидных фибробластов человека (HDF), вызванном обработкой перекисью водорода (P-WE - водный экстракт прокамбиальных клеток; C-WE - водный экстракт камбиальных клеток).
Фиг.6 представляет серию фотографий, демонстрирующих подавление экспрессии IL-1(3 под действием экстрактов культивированных клеток по данному изобретению при обработке диплоидных фибробластов человека (HDF) липополисахаридом (LPS) для индукции воспаления (Р-МЕ - метанольный экстракт прокамбиальных клеток; С-МЕ - метанольный экстракт камбиальных клеток).
Фиг.7 представляет серию фотографий, демонстрирующих подавление экспрессии ММР-9 под действием экстрактов культивированных клеток по данному изобретению при обработке диплоидных фибробластов человека (HDF) липополисахаридом (LPS) для индукции воспаления (Р-МЕ - метанольный экстракт прокамбиальных клеток; С-МЕ - метанольный экстракт камбиальных клеток).
Фиг.8 представляет серию фотографий, демонстрирующих подавление экспрессии ММР-2 под действием экстрактов культивированных клеток по данному изобретению при обработке диплоидных фибробластов человека (HDF) липополисахаридом (LPS) для индукции воспаления (Р-МЕ - метанольный экстракт прокамбиальных клеток; С-МЕ - метанольный экстракт камбиальных клеток).
Фиг.9 представляет серию фотографий, демонстрирующих подавление экспрессии ICAM-1 под действием экстрактов культивированных клеток по данному изобретению при обработке диплоидных фибробластов человека (HDF) липополисахаридом (LPS) для индукции воспаления (Р-МЕ - метанольный экстракт прокамбиальных клеток; С-МЕ -метанольный экстракт камбиальных клеток).
Фиг.10 представляет диаграмму, показывающую результаты определения жизнеспособности фибробластов, обработанных экстрактом культивированных клеток по данному изобретению (диметилсульфоксидным экстрактом культуры клеток, происходящих из камбия Taxus).
Фиг.11 представляет диаграмму, показывающую влияние экстракта культивированных клеток и культуральной среды по данному изобретению на ликвидацию активных форм кислорода, образовавшихся под действием ультрафиолетового излучения.
Фиг.12 представляет диаграмму, показывающую подавление образования ММР-1, вызванного ультрафиолетовым излучением, под влиянием экстракта культивированных клеток и культуральной среды по данному изобретению.
Фиг.13 представляет диаграмму, показывающую подавление меланогенеза в меланомных клетках В-16 под влиянием экстракта культивированных клеток и культуральной среды по данному изобретению.
Осуществление изобретения
Все технические и научные термины употребляются в настоящем документе в своих общепринятых, известных специалистам в данной области техники значениях, если не оговорено иного. Как правило, в настоящем документе используется общепринятая номенклатура, известная в данной области техники.
Основные термины, употребляемые при описании осуществления данного изобретения, определяются следующим образом.
Пучковый сосудистый камбий представляет собой латеральную меристему, расположенную цилиндрическим слоем между корой и глубже лежащей древесиной. За счет деятельности камбия происходит рост стебля в толщину; существуют гигантские растения, насчитывающие 11 000 лет судя по кольцам роста на поперечном срезе ствола. В процессе индивидуального развития растения пучковый сосудистый камбий происходит из прокамбия, так что одна и та же меристема постепенно дифференцируется, сохраняя свою непрерывность. В силу меристематического единства камбия и прокамбия в настоящем изобретении полагается, что использование камбия и прокамбия дает одинаковый эффект.
В настоящем документе термин «лизат» относится к лизату клеток, получаемому путем их разрушения химическими средствами, например с помощью детергента, или же физическим путем. Термин «экстракт» клеточной линии относится к субстанции, получаемой путем смешивания культивированных клеток с растворителем и последующего отделения клеток; экстракт можно сконцентрировать путем перегонки или выпаривания. Также термин «культуральная среда» клеточной линии относится к жидкости, получаемой в результате отделения клеток от среды, в которой они культивировались.
Термин «изначально недифференцированные клетки» в настоящем документе означает, что клетки не стали недифференцированными в процессе дедифференцировки, а исходно пребывали в предифференцированном состоянии.
В одном своем аспекте настоящее изобретение относится к антиоксидантной, противовоспалительной или противовозрастной композиции, содержащей какую-либо одну (или более) из линий клеток, происходящих из камбия или прокамбия тисса (Taxus), их экстракт, лизат и культуральную среду.
Линии клеток, происходящих из камбия или прокамбия Taxus, по данному изобретению характеризуются следующими свойствами: (а) эти клетки пребывают в изначально недифференцированном состоянии; (b) растут в культуре стабильно и со скоростью, превышающей таковую клеточных линий, происходящих из других некамбиальных тканей Taxus; (с) морфологичеки отличаются большим количеством вакуолей. Кроме того, линии клеток, происходящих из камбия или прокамбия Taxus, по данному изобретению характеризуются тем, что: (а) в суспензионной культуре клетки одиночные; (b) клетки обладают низкой чувствительностью к напряжению сдвига в ферментере по сравнению с линиями клеток, происходящих из других некамбиальных клеток Taxus.
Линии клеток по данному изобретению могут быть получены с помощью способа выделения, включающего следующие стадии: а) получение камбиальной или прекамбиальной ткани Taxus; b) культивирование полученной камбиальной или прекамбиальной ткани Taxus для образования слоя камбия или прокамбия путем пролиферации камбиальных или прокамбиальных клеток и аморфного каллусного слоя путем пролиферации некамбиальных тканей; (с) отделение камбиального или прекамбиального слоя от каллусного слоя и сбор линии клеток камбиального или прекамбиального происхождения из слоя камбия или прокамбия.
3
По данному изобретению линию клеток предпочтительно дополнительно культивируют в среде, содержащей 3-5% (масса/масса) неочищенного сахара или сахара и по меньшей мере одной субстанции, выбираемой из группы, состоящей из метилжасмоната, грибного экстракта, бактериального экстракта, дрожжевого экстракта, хитозана, глюкоманнана, глюкана, фенилаланина, бензойной кислоты, салициловой кислоты, арахидоновой кислоты, STS, N-бензоилглицина мевалоната, АВА, SNP, IPP, ВНТ, ССС, этефона, гиппуровой кислоты, церий-аммоний-нитрата, AgNO, ванадилсульфата, пара-аминобензойной кислоты, брассиностероидов, альгината натрия и ацетата натрия. Содержание метилжасмоната предпочтительно составляло 10~100 мкМ.
В данном изобретении экстракты получали предпочтительно используя растворитель, выбираемый из группы, состоящей из дистиллированной воды, этилового спирта, ацетона, диметилсульфоксида (DMSO) и их смесей.
В настоящем изобретении диплоидные фибробласты обрабатывали экстрактом культивированных клеток по данному изобретению вместе с перекисью водорода, и оказалось, что клеточный экстракт подавлял образование активных форм кислорода и экспрессию p-ERK1/2, вызывая при этом экспрессию MnSOD; это позволяет полагать, что экстракт культивированных клеток по данному изобретению обладает антиоксидантной активностью. Также в настоящем изобретении диплоидные фибробласты обрабатывали экстрактом культивированных клеток по данному изобретению вместе с LPS, и оказалось, что клеточный экстракт по данному изобретению подавлял образование ICAM-1, MMP9, ММР2 и IL-1β; это позволяет полагать, что экстракт культивированных клеток по данному изобретению обладает противовоспалительной активностью. А именно, было обнаружено, что экстракт культивированных клеток по данному изобретению блокировал указанные сигнальные вещества, когда указанные клетки-мишени обрабатывали клеточным экстрактом прежде, чем начинались старение и воспаление.
Кроме того, в другом Примере настоящего изобретения было обнаружено, что экстракт и культуральная среда клеток линии по данному изобретению обладают способностью ликвидировать активные формы кислорода, образовавшиеся под действием ультрафиолетового излучения.
Соответственно, обнаружено, как отмечено выше, что экстракт клеток линии по данному изобретению обладает антиоксидантной, противовоспалительной и противовозрастной активностью. Таким образом, хотя в настоящем изобретении нет конкретного примера, демонстрирующего, что композиция, содержащая клетки линии по данному изобретению проявляет антиоксидантную, противовоспалительную и противовозрастную активности, специалистам в данной области техники должно быть понятно, что композиция, содержащая клетки линии по данному изобретению или их лизат, способны также проявлять антиоксидантную и противовоспалительную активности, и тем самым указанная композиция может предотвращать старение, а также предотвращать и ослаблять воспаление кожи.
Антиоксидантная, противовоспалительная или противовозрастная композиция, содержащая в качестве активного ингредиента какую-либо одну (или более) из линий клеток по данному изобретению, их экстракт или лизат и культуральную среду, может быть предоставлена в виде фармацевтической композиции, содержащей один (или более) из указанных компонентов сам (сами) по себе либо в сочетании с по меньшей мере одним фармацевтически приемлемым носителем, эксипиентом или разбавителем. Клетки линии по данному изобретению или их экстракт в фармацевтической композиции могут содержаться в фармацевтически эффективном количестве, зависящем от специфики и тяжести заболевания, возраста и пола пациента, его массы тела, общего состояния здоровья, способа введения препарата и периода лечения.
В настоящем документе термин «фармацевтически приемлемый» означает, что данная композиция физиологически приемлема для человека и ее введение не вызывает расстройства желудка, аллергических реакций, например желудочно-кишечных нарушений или головокружения, или подобных реакций. Примеры указанных носителей, эксипиентов или разбавителей включают, например, лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, манит, ксилит, эритрит, мальтит, крахмал, смолу акации, альгинат, желатинг, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральные масла.
Фармацевтическая композиция по данному изобретению может также содержать наполнители, агенты, предотвращающие агрегацию частиц и/или обеспечивающие скольжение, увлажняющие агенты, отдушки, эмульгаторы и консерванты. Кроме того, фармацевтическая композиция по данному изобретению может быть составлена с помощью известных в данной области техники методов таким образом, что будет обеспечено быстрое, постоянное или продолжительное высвобождение активного ингредиента после ее введения в организм млекопитающего. Она может иметь форму порошка, гранул, таблеток, эмульсии, сиропа, аэрозоля, мягких или твердых желатиновых капсул, стерильных растворов или порошков для инъекций и проч.
Между тем в другом Примере настоящего изобретения было обнаружено, что экстракт и культуральная среда клеток линии по данному изобретению проявляют превосходную способность подавлять образование матриксных металлопротеиназ-1 (ММР-1), сравнимым с действием экстракта Taxus и ретиноевой кислоты, которые известны своим отличным противовозрастным эффектом; это позволяет предполагать, что композиция, содержащая клетки линии по данному изобретению, их экстракт, лизат или культуральную среду, подавляют деградацию коллагена, тем самым предотвращая старение кожи и сокращая морщины. Таким образом, композиция по данному изобретению весьма полезна в качестве противовозрастной косметической композиции. Соответственно, в этом аспекте настоящее изобретение относится к противовозрастной косметической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента какую-либо одну (или более) из линий клеток, происходящих из камбия или прокамбия Taxus, их экстракт, лизат и культуральную среду.
В еще одном Примере настоящего изобретения было обнаружено, что экстракт и культуральная среда клеток линии по данному изобретению обладают способностью подавлять меланогенез в меланомных клетках мышей; это позволяет предполагать, что композиция, содержащая экстракт клеток линии по данному изобретению или их культуральную среду, весьма полезна в качестве отбеливающей косметической композиции. Соответственно, в другом своем аспекте настоящее изобретение относится к отбеливающей косметической композиции, содержащей какую-либо одну (или более) линию клеток, происходящих из камбия или прокамбия Taxus, их экстракт, лизат и культуральную среду.
В настоящем документе термин «функциональный косметический продукт» означает косметический продукт, функциональность которого улучшена добавлением в него одной или более из линий клеток по данному изобретению, их экстракта, лизата и культуральной среды. Например, для получения функционального косметического продукта может использоваться противовозрастная композиция, содержащая культивированные клетки по данному изобретению или их экстракт.
Косметическая композиция по данному изобретению, помимо экстракта клеток линии по данному изобретению в качестве активного ингредиента, может содержать обычно используемые в косметической продукции ингредиенты. Например, косметическая композиция по данному изобретению может содержать обычно используемые в косметической продукции добавки, как то: растворители, стабилизаторы, солюбилизирующие агенты, эмульгаторы, витамины, красители, отдушки, а также носители.
Косметическая композиция по данному изобретению может быть приготовлена в формах, обычно используемых в данной области техники. Предпочтительно косметическая композиция по данному изобретению может быть приготовлена в форме, выбираемой из группы, состоящей из лосьона для кожи, питательного лосьона, питательного крема, массажного крема, питательной эссенции, маски, основы под макияж, масла для тела, масла для волос, шампуня и ополаскивателя.
Говоря о примерах косметических форм, отметим, что косметическая композиция по данному изобретению, содержащая одну или более линий клеток по данному изобретению, их экстракт, лизат и культуральную среду, обладает антиоксидантным действием и таким образом ликвидирует образующиеся в коже свободные радикалы и защищает внутриклеточные антиоксидантные системы. Соответственно, косметическая композиция по данному изобретению может предотвращать и задерживать старение кожи, обусловленное окислением под действием свободных радикалов, и может подавлять образование ММР-1, тем самым предотвращая старение кожи и сокращая морщины.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к антиоксидантному функциональному пищевому продукту, содержащему в качестве активного ингредиента одну или более линий клеток, происходящих из камбия или прокамбия Taxus, их экстракта, лизата и культуральной среды.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к противовозрастному функциональному пищевому продукту, содержащему в качестве активного ингредиента одну или более линий клеток, происходящих из камбия или прокамбия Taxus, их экстракта, лизата и культуральной среды.
В настоящем документе термин «функциональный пищевой продукт» относится к пищевому продукту, функциональность которого улучшена добавлением в него клеток одной или более из линий по данному изобретению или их экстракта.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Ниже настоящее изобретение описывается более подробно с рассмотрением примеров. Следует отметить, что эти примеры приводятся лишь для иллюстрации и не могут считаться ограничивающими объем данного изобретения.
В частности, хотя антиоксидантный, противовозрастной и отбеливающий эффекты экстракта и культуральной среды клеток, происходящих из камбия и прокамбия Taxus, подтверждаются приведенными ниже примерами, специалистам в данной области техники должно быть очевидно, что использование самих культивированных клеток может обеспечить такое же действие и результаты, как их экстракт или культуральная среда.
Пример 1. Получение линий клеток, происходящих из камбия или прокамбия Taxus.
(1) Получение растительного материала
Собрав ветви и стебли Taxus, их тотчас погружали в антиоксидантный раствор L-аскорбиновой кислоты (DUCHEFA, Нидерланды) в концентрации 100 мг/л, после чего транспортировали и хранили.
Растительный материал предварительно обрабатывали раствором, содержавшим 1% беномила (Dongbu Hannong Chemical, Корея), 1% даконила (Dongbu Hannong Chemical, Корея), 1% стрептомицина сульфата (DUCHEFA, Нидерланды) и 0,1% цефотаксима натрия (DUCHEFA, Нидерланды) в течение 24 часов, после чего промывали водопроводной водой в течение 30 минут, чтобы удалить фенольные соединения и остатки реактивов. Затем растительный материал подвергали поверхностной стерилизации в 70%-ном этиловом спирте (DC Chemical, Корея) в течение 1 мин, в 30%-ной перекиси водорода (LG Chemical, Корея) в течение 15 мин, в 1%-ном растворе CLOROX в течение 15 мин и в 3%-ном растворе CLOROX в течение 5 мин, после чего промывали 3-4 раза водой.
(2) Выделение камбиальной и прокамбиальной тканей из веток и стеблей. Наружные ткани веток и стеблей, прошедших поверхностную стерилизацию, как описано выше, легко счищались в продольном направлении. Счищенные ткани состояли из ксилемы, прокамбия или камбия, флоэмы, коры и эпидермиса; их культивировали таким образом, что самая внутренняя из счищенных тканей, а именно ксилема, контактировала со средой.
(3) Получение линии клеток, происходящих из камбия и прокамбия Taxus. На 4-7-е сутки в исходной культуре наблюдалось деление клеток из прокамбия и камбия; через 15 суток культивирования формировался аморфный каллус путем дедифференцировки, индуцированной слоем, состоящим из флоэмы, коры и эпидермиса. Однако в ксилеме на протяжении периода культивирования деления клеток не происходило, так что слой камбия естественным образом отделялся от ксилемы. Через 30 суток культивирования ткань начинала разделяться на слой камбия и содержащий флоэму верхний слой, а именно аморфный каллус ((а)А и (b)А фигуры 1). После того, как ткань естественным образом полностью разделялась на два слоя, эти слои культивировали по отдельности в разных чашках Петри ((а)В~С и (b)B~D фигуры 1). На фигуре 1(а)А показано выделение прокамбия: вверху - ткань, содержащая флоэму/кору/эпидермис, внизу - прокамбий. На фигуре 1(b), "А" показано выделение камбия: вверху - ткань, содержащая флоэму/кору/эпидермис, в середине - камбий, внизу - ксилема, поскольку культура формируется после удаления ксилемы. Стрелкой отмечен раздел между слоем камбий/прокамбий и тканью, содержащей флоэму/кору/эпидермис. На фигурах 1(а) и 1(b), "В" показывает линию клеток, происходящих из ткани, содержащей флоэму/кору/эпидермис, которая пролиферирует неравномерно из-за разницы в делении между вышеуказанными клетками; "С" показывает линию клеток, происходящих из камбия/прокамбия, которая пролиферирует с образованием однообразного клеточного слоя путем равномерного клеточного деления; "D" в 1(b) показывает ксилему, в которой клеточного деления не происходит. После того, как нужная ткань отделяется, как описано выше, берут ее белую рыхлую часть с хорошей скоростью роста и пересевают в такую же свежую среду, как индукционная среда, с интервалом 21 сутки.
Среда, использованная для индукции только линий клеток, происходящих из прокамбия и камбия, показана в приведенной ниже Таблице 1.
ТАБЛИЦА 1.
Индукционная среда для линий клеток Taxus spp.(среда 1)
Компоненты
Содержание (мг/л)
Неорганические соли
KNO<sub>3</sub>
2500
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
134
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
121,56
MnSO<sub>4</sub>·4H<sub>2</sub>O
10
ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
2
CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O
0,025
CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O
113.23
KI
0.75
CoCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O
0,025
NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O
130,44
Н<sub>3</sub>ВО<sub>3</sub>
3
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O
0,25
FeNaEDTA
36,7
Витамины
Миоинозитол
200
Тиамин-HCl
20
Никотиновая кислота
2
Пиридоксин-HCl
2
L-аскорбиновая кислота
50
Лимонная кислота
75
Аминокислоты
L-аспарагиновая кислота
133
L-аргинин
175
Глицин
75
Пролин
115
Гормоны
α-нафтилуксусная кислота
2
Сахароза
10000
Активированный уголь
100
Гельрит
2000
В эту среду добавляли ауксиновый регулятор роста (NAA или IAA) в концентрации 1-3 мг/л, предпочтительно 2 мг/л. Культуру держали в темной комнате при температуре 25±1°С.
Для сравнения стерилизовали и культивировали в среде, описанной в Таблице 1, эксплантаты зародышей и хвои Taxus. Этот растительный материал образовывал каллусную ткань путем дедифференцировки. Каллусы, возникшие из эксплантатов зародышей и хвои, имели неправильную форму вследствие разницы в скоростях клеточных делений различных клеток, как в случае тканей, содержащих флоэму; при этом скорость роста была непостоянной и каллусная ткань быстро приобретала коричневый оттенок. Побуревшая агрегированная каллусная культура, образовавшаяся из эксплантатов зародышей и хвои, росла с низкой скоростью из-за секретируемых фенольных соединений и в конце концов погибала. А именно, через 6 месяцев культивирования каллусы, возникшие из эксплантатов зародышей и хвои, с трудом удавалось сохранять и культивировать. А клетки, происходящие из прокамбия и камбия, напротив, долгое время - более 20 месяцев - стабильно культивировались без колебаний в скорости и характере роста и степени агрегированности; это позволяло полагать, что возможно получение культур таких клеток в больших масштабах.
(4) Фазы роста и свойства выделенных линий клеток.
Линии клеток, происходящих из прокамбия и камбия, помещали в колбы, содержащие жидкую среду, описанную в приведенной ниже Таблице 2. Клетки в колбах культивировали в темноте на переворачивающем шейкере с частотой вращения 100 об/мин при температуре 25±1°С. Интервал между пассажами составлял 2 недели, так что культивируемые клетки постоянно находились в состоянии высокой жизнеспособности в экспоненциальной фазе роста.
ТАБЛИЦА 2.
Суспензионная среда для Taxus spp.(среда 2)
Компоненты
Содержание (мг/л)
Неорганические соли
Са(NО<sub>3</sub>)<sub>2</sub>
471,26
NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub>
400
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
180,54
MnSO<sub>4</sub>·4H<sub>2</sub>O
22,3
ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
8,6
CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O
0,25
CaCl<sub>2</sub>-2H<sub>2</sub>O
72,5
K<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
990
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O
0,25
Н<sub>3</sub>ВО<sub>3</sub>
6,2
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
170
FeNaEDTA
36,7
Витамины
Миоинозитол
200
Тиамин-HCl
20
Никотиновая кислота
2
Пиридоксин-НСl
2
L-аскорбиновая кислота
50
Лимонная кислота
75
Аминокислоты
L-аспарагиновая
133
кислота
L-аргинин
175
Глицин
75
Пролин
115
Гормоны
α-Нафтилуксусная кислота
2
Сахароза
30000
Каллусы, происходящие из зародышей и хвои, также культивировали в среде 2, описанной в Таблице 2, и сравнивали с линиями клеток, происходящих из прокамбия и камбия, по данному изобретению.
Степень агрегации клеток определяли с помощью лабораторного бинокулярного микроскопа СХ31 (Olympus, Japan). Судя по результатам, представленным в Таблице 3, в суспензионной культуре более 90% клеток линий по данному изобретению находились по одиночке, не образуя агрегатов. Как показано на фигуре 1(с), клетки морфологически характеризовались большим количеством вакуолей и находились в недифференцированном состоянии; на этой иллюстрации стрелкой указаны вакуоли в клетках, происходящих из прокамбия Taxus.
ТАБЛИЦА 3.
Клеточные агрегаты в долгоживущих культурах Taxus.
Крупные агрегаты
Средние агрегаты
Мелкие агрегаты
Одиночные клетки
Источник эксплантата
60%
30%
7%
3%
Зародыш Хвоя
0
0
9%
91%
Камбий
0
0
7,4%
92,6%
Прокамбий
Размеры клеточных агрегатов:
Крупные 1,5×10<sup>3</sup> мкм;
средние 1×10<sup>3</sup> мкм;
4×10<sup>2</sup> мкм < мелкие < 1×10<sup>3</sup> мкм
Чтобы изучить возможность культивирования клеток в больших масштабах, каллусы, происходящие из зародышей/хвои, и клетки, происходящие из прокамбия и камбия, выращивали в эрлифтном ферментере (Sung-Won Cytec, Корея), имеющем внутренний объем 3 л. Культивирование осуществляли в жидкой среде, описанной в Таблице 2, в темноте при температуре 25±1°С. В колбах время удвоения каллусных культур, происходящих из зародышей/хвои, составляло 12 суток, а в указанном ферментере оно оказалось 21 сутки. Можно предполагать, что это объясняется быстрым снижением жизнеспособности клеток из-за формирования кольца роста клеток в ферментере, агрегации клеток в процессе культивирования и чувствительности жестких клеточных стенок к напряжению сдвига. А у культур клеток, происходящих из прокамбия и камбия Taxus, по данному изобретению время удвоения в ферментере составляло 4-5 суток, не отличаясь от такового в колбах или было короче, чем в колбах (см. Таблицу 4). Клетки, происходящие из прокамбия и камбия, линий по данному изобретению в ферментере образовывали очень небольшую кольцевую область роста, и такое кольцо, образовавшееся на внутренней стенке ферментера, легко удалялось просто встряхиванием среды. Было показано, что у клеток линий по данному изобретению низкая степень агрегации, они содержат множество вакуолей и обладают низкой чувствительностью к напряжению сдвига, так что их жизнеспособность не снижалась.
ТАБЛИЦА 4.
Источник эксплантата
Время удвоения (сутки)
Колба
Ферментер
Зародыш
11,5
21
Хвоя
12
21
Камбий
5
4
Прокамбий
5
4
(5) Обработка сахаром и метилжасмонатом.
Клеточные линии, находившиеся в суспензионной культуре, как описано в Примере 1-(4), в течение 14 суток, культивировали в среде, содержащей стерильную воду, неочищенный сахар 3-5% масса\масса (г/л) и метилжасмонат 100 мкМ, в темноте в течение 10 суток, после чего клетки собирали и использовали в дальнейших экспериментах.
Пример 2. Получение экстракта клеток, происходящих из прокамбия или камбия.
(1) Получение диметилсульфоксидного (DMSO) экстракта
(i) Клетки линии по данному изобретению отделяли от культуральной среды и в количестве 500 г растворяли в 500 мл DMSO при перемешивании в течение 6 часов при температуре 50°С.
(ii) После полного растворения клеток полученный раствор центрифугировали при 3000 g в течение 10 минут и собирали супернатант, тем самым получая растворимый в DMSO материал.
(iii) Полученный растворимый в DMSO материал концентрировали с помощью ротационного вакуумного концентратора.
(iv) Концентрированный образец высушивали с помощью лиофилизатора, таким образом получая диметилсульфоксидный экстракт.
(2) Получение водного (дистиллированная вода), метанольного и ацетонового экстрактов.
Из клеток линии по данному изобретению, полученным в Примере 1, постадийно экстрагировали активные вещества, как описано ниже (Фигура 2).
(i) 500 г клеток линии по данному изобретению, отделенных от культуральной среды, растворяли в 500 мл дистиллированной воды при перемешивании в течение 6 часов при температуре 50°С.
(ii) По завершении растворения клеточный раствор центрифугировали при 3000 g в течение 10 минут и собирали супернатант, таким образом получая материал, растворимый в дистиллированной воде.
(iii) Получив материал, растворимый в дистиллированной воде, оставшийся материал, нерастворимый в дистиллированной воде, растворяли в 500 мл метилового спирта при перемешивании в течение 6 часов при комнатной температуре.
(iv) По завершении растворения полученный раствор центрифугировали при 3000 g в течение 10 минут и собирали супернатант, таким образом получая материал, растворимый в метиловом спирте.
(v) Получив материал, растворимый в метиловом спирте, оставшийся материал, нерастворимый в метиловом спирте, растворяли в 500 мл ацетона при перемешивании в течение 6 часов при комнатной температуре.
(vi) По завершении растворения полученный раствор центрифугировали при 3000 g в течение 10 минут и собирали супернатант, таким образом получая материал, растворимый в ацетоне.
(vii) Полученные, как описано выше, материал, растворимый в дистиллированной воде, материал, растворимый в метиловом спирте, и материал, растворимый в ацетоне, концентрировали с помощью ротационного вакуумного концентратора.
(viii) Концентрированные образцы высушивали с помощью лиофилизатора и растворяли в дистиллированной воде, метиловом спирте и ацетоне, таким образом получая водный, метанольный и ацетоновый экстракты.
Пример 3. Культивирование диплоидных фибробластов человека (HDF).
2
2
Клетки HDF выделяли из фетальной крайней плоти полового члена и культивировали. Культуральную среду готовили следующим образом: к среде DMEM (Invitroge Gibco life tech. Vienna, Austria) добавляли 10% фетальной коровьей сыворотки (FBS, Hyclone, Logan, Utah, USA), инактивированной путем нагревания при 56°С в течение 30 минут, 100 единиц/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 300 мкг/мл глутамина. Клетки культивировали в описанной выше среде в СО-инкубаторе (5% СО) при температуре 37°С и влажности 95%, пересевая с интервалом 3-4 суток, непосредственно перед тем как клетки сливались друг с другом. Пассированные клетки разделяли соответственно числу пассажей на молодые (менее 20 пассажей), средние (21-49 пассажей) и старые (более 50 пассажей). Культивированные клетки использовали в экспериментах Примеров 4-6.
2
2
Пример 4. Измерение антиоксидантной активности экстракта культивированных клеток, происходящих из прокамбия или камбия Taxus, (1) - определение активных форм кислорода, индуцированных HO.
2
2
Чтобы измерить антиоксидантную активность культивированных клеток, происходящих из прокамбия или камбия, проводили следующие опыты. А именно, определяли активные формы кислорода (ROS), чтобы выяснить, подавляется ли активность ROS, индуцированных НО, когда диплоидные фибробласты кожи (клетки HDF) обрабатывают водным экстрактом из числа экстрактов, полученных в Примере 2.
Внутриклеточные ROS определяли с помощью проточного цитофлуориметра FACScan, используя флуоресцентный краситель DCFDA (2',7'-дихлорфлуоресцеиндиацетат, Fluka Cat 35847 Molecular Probes, USA), чувствительный к активным формам кислорода. Клетки HDF соответственно каждому PD выращивали на 100-миллиметровом планшете и затем инкубировали с 5 мкМ DCFDA в темноте в течение 30 минут при температуре 37°С. После этого клетки дважды промывали PBS, обрабатывали трипсином-EDTA и центрифугировали при 900 об/мин в течение 4 минут. Определяли содержание активных форм кислорода на 10000 клеток (Фигуры 3(а) и 3(b)).
5
2
2
Наносили 5×10 клеток на 6-луночный планшет и обрабатывали НО самой по себе или в сочетании с экстрактом, полученным в Примере 2. В качестве такового экстракта брали водный экстракт из числа экстрактов, полученных в Примере 2, в концентрации 10-100 мкг/мл, предпочтительно 50 мкг/мл. Затем клетки промывали 2-3 раза HBSS (сбалансированным солевым раствором Хэнка) и стабилизировали в HBSS в течение 30 минут. После этого клетки обрабатывали 10 мкМ DCFDA (Molecular Probes USA) в темноте при температуре 37°С в течение 1 часа, промывали три раза HBSS и рассматривали под флуоресцентным микроскопом (Фигура 3(с)).
2
2
Как описано выше, клетки HDF обрабатывали 200 мкМ НО и 10-100 мкг/мл (предпочтительно 50 мкг/мл) водного экстракта, полученного в Примере 2, и изучали морфологические особенности клеток.
2
2
Через 24 часа после обработки НО, в клетках HDF в результате окислительного стресса образовывались активные формы кислорода (ROS). Поскольку не флуоресцирующий DCFDA окисляется активными формами кислорода с образованием DCF, который интенсивно флуоресцирует, возможно количественно оценить уровень ROS. В этом Примере для измерений использовали аналитический проточный цитометр FACS Calibur (Becton Dickinson, USA).
В результате, как показано на фигуре 3, экстракты клеток, происходящих как из прокамбия, так и из камбия Taxus, подавляли образование активных форм кислорода (ROS) (P-WE - водный экстракт прокамбиальных клеток, C-WE - водный экстракт камбиальных клеток на фигуре 3). А именно, наблюдалось подавление образования активных форм кислорода этими двумя экстрактами клеток линий по данному изобретению.
2
2
Пример 5. Измерение активности экстракта культивированных клеток, происходящих из прокамбия или камбия Taxus, (2) - определение способности подавлять p-ERK1/2, индуцированный НО, и определение способности индуцировать MnSOD.
5-1. Влияние экстракта культивированных камбиальных или прокамбиальных клеток Taxus на подавление экспрессии p-ERK1/2
2
2
Известно, что активные формы кислорода усиливают экспрессию p-ERKl/2 in vivo. Поэтому для того чтобы установить, подавляет ли экстракт клеток линий по данному изобретению экспрессию p-ERK1/2, клетки HDK обрабатывали указанным экстрактом, полученным в Примере 2, вместе с НО.
2
2
Клетки HDF обрабатывали 200 мкМ НО и водным экстрактом культивированных клеток, полученным в Примере 2. Через 11 суток клетки собирали и выделяли из них белок, который количественно определяли по методу Брэдфорда. А именно, из собранных клеток HDF экстрагировали внутриклеточный белок и определяли его количество.
Определение p-ERK1/2 проводили методом Вестерн-блоттинга. А именно, количественно определенный белок смешивали с раствором красителя «бромфеноловый синий», затем проводили электрофорез в полиакриламидном геле (10% SDS-PAGE). После электрофореза белок переносили на поливинилиденфторидную мембрану (Millipore) и погружали в TBS (физиологический раствор, забуференный трисом), содержащий детергент Tween (10 мМ Tris HCl; 100 мМ NaCl; 0,1% Tween 20; pH 7,5) и 0,5% обезжиренное молоко для блокирования неспецифических реакций.
После этого указанную мембрану инкубировали с антикроличьими антителами к ERK (Upstate) в разведении 1:600 при комнатной температуре в течение 3 часов и затем с антикроличьими IgG в качестве вторичных антител. По завершении реакции мембрану промывали 4 раза раствором TBS, содержащим Tween, инкубировали в течение 1 минуты с реагентом для усиленной хемилюминесценции (ECL) и экспонировали с рентгеновской пленкой при комнатной температуре.
2
2
В результате, как показано на фигуре 4, было установлено, что экспрессия р-ERK1/2 была ниже в случае обработки клеток перекисью водорода вместе с экстрактом по данному изобретению (опыт), нежели одной НO (контроль).
5-2. Влияние экстракта культивированных камбиальных или прокамбиальных клеток Taxus на индукцию экспрессии p-ERK1/2
2
2
Известно, что активные формы кислорода усиливают экспрессию MnSOD in vivo. Поэтому для того, чтобы установить, индуцирует ли экстракт клеток линий по данному изобретению экспрессию p-ERK1/2, клетки HDK обрабатывали указанным экстрактом, полученным в Примере 2, вместе с НО.
2
2
Клетки HDF обрабатывали 200 мкМ НO и водным экстрактом культивированных клеток, полученным в Примере 2. Через 3, 7 и 11 суток клетки собирали и выделяли из них белок, который количественно определяли по методу Брэдфорда. А именно, из собранных клеток HDF экстрагировали внутриклеточный белок и определяли его количество.
Определение MnSOD проводили методом Вестерн-блоттинга. А именно, количественно определенный белок смешивали с раствором красителя «бромфеноловый синий», затем проводили электрофорез в полиакриламидном геле (10% SDS-PAGE). После электрофореза белок переносили на поливинилиденфторидную мембрану(Millipore) и погружали в TBS (физиологический раствор, забуференный трисом), содержащий детергент Tween (10 мМ Tris HCl; 100 мМ NaCl; 0,1% Tween 20; pH 7,5) и 0,5% обезжиренное молоко для блокирования неспецифических реакций.
После этого указанную мембрану инкубировали с антимышиными антителами к MnSOD в разведении 1:600 при комнатной температуре в течение 3 часов и затем с антимышиными IgG в качестве вторичных антител. По завершении реакции мембрану промывали 4 раза раствором TBS, содержащим Tween, инкубировали в течение 1 минуты с реагентом для усиленной хемилюминесценции (ECL) и экспонировали с рентгеновской пленкой при комнатной температуре.
2
2
В результате, как показано на фигуре 5, было установлено, что сигнал, соответствующий MnSOD, был сильнее в случае обработки клеток перекисью водорода вместе с экстрактом по данному изобретению (опыт), нежели одной НО (контроль).
Пример 6. Измерение противовоспалительной активности экстракта культивированных клеток, происходящих из камбия или прокамбия Taxus, -способности подавлять образование CAM-1, MMP-9, ММР-2 и IL-1β, индуцированное LPS.
Липополисахаридный токсин (LPS), выделенный из клеток Escb.ericb.ia coli (штамм В5:025, Sigma, St. Louis, МО), вызывает активацию ядерного фактора кВ (NP-кВ) в ядрах таких клеток, как макрофаги, фибробласты, дендритные клетки и лимфоциты, что стимулирует секрецию различных цитокинов воспаления. Известно, что если на клетки воздействовать LPS, то индуцируется образование IL-1β, ICAM-1, MMP-9 и ММР-2 для стимуляции воспалительной реакции. Поэтому чтобы выяснить, подавляется ли сигнал от таких белков под действием полученного по данному изобретению экстракта культивированных клеток, происходящих из камбия или прокамбия Taxus, были проведены следующие опыты.
6-1. Влияние экстракта культивированных клеток, происходящих из камбия иди прокамбия Taxus, на подавление экспрессии IL-1β
Известно, что в клетках, обработанных LPS, в процессе передачи сигнала, ведущего к воспалению, усиливается образование IL-1β. Поэтому чтобы выяснить, подавляется ли экспрессия IL-1β под действием указанного экстракта, клетки HDK обрабатывали LPS и экстрактом культивированных клеток, полученным в Примере 2.
Клетки HDF обрабатывали LPS (10 мкг/мл) и метанольным экстрактом клеток линии по данному изобретению, полученным в Примере 2 (10-100 мкг/мл, предпочтительно 50 мкг/мл). Через 3, 6 и 24 часа после обработки метанольным экстрактом клетки собирали и экстрагировали из них белки, которые количественно определяли по методу Брэдфорда. А именно, собирали клетки HDF, экстрагировали из них внутриклеточные белки и определяли их количество.
Определение IL-1β проводили методом Вестерн-блоттинга. Количественно определенный белок смешивали с раствором красителя «бромфеноловый синий», затем проводили электрофорез в полиакриламидном геле (10% SDS-PAGE). После электрофореза белок переносили на поливинилиденфторидную мембрану (Millipore) и погружали в TBS (физиологический раствор, забуференный трисгидроксиметиламинометаном), содержащий детергент Tween (10 мМ Tris HCl; 100 мМ NaCl; 0,1% Tween 20; pH 7,5) и 0,5% обезжиренное молоко, для блокирования неспецифических реакций.
После этого указанную мембрану инкубировали с антимышиными антителами к IL-1β в разведении 1:600 при комнатной температуре в течение 3 часов и затем с антимышиными IgG в качестве вторичных антител. По завершении реакции мембрану промывали 4 раза раствором TBS, содержащим Tween, инкубировали в течение 1 минуты с реагентом для усиленной хемилюминесценции (ECL) и экспонировали с рентгеновской пленкой при комнатной температуре.
В результате, как показано на фигуре 6, было установлено, что сигнал, соответствующий IL-1β, был слабее в случае обработки клеток липополисахаридом вместе с экстрактом по данному изобретению (опыт) по сравнению с одним LPS (контроль).
6-2. Влияние экстракта культивированных клеток, происходящих из камбия иди прокамбия Taxu,s на подавление экспрессии ММР-9
Известно, что в клетках, обработанных LPS, в процессе передачи сигнала, ведущего к воспалению, усиливается образование ММР-9. Поэтому чтобы выяснить, подавляется ли экспрессия ММР-9 под действием указанного экстракта, клетки HDK обрабатывали LPS и экстрактом культивированных клеток, полученным в Примере 2.
Клетки HDF обрабатывали LPS (10 мкг/мл) и метанольным экстрактом клеток линии по данному изобретению, полученным в Примере 2 (10-100 мкг/мл, предпочтительно 50 мкг/мл). Через 6 часов после обработки метанольным экстрактом клетки собирали и экстрагировали из них белки, которые количественно определяли по методу Брэдфорда. А именно, собирали клетки HDF, экстрагировали из них внутриклеточные белки и определяли их количество.
Определение ММР-9 проводили методом Вестерн-блоттинга. А именно, количественно определенный белок смешивали с раствором красителя «бромфеноловый синий», затем проводили электрофорез в полиакриламидном геле (10% SDS-PAGE). После электрофореза белок переносили на поливинилиденфторидную мембрану (Millipore) и погружали в TBS (физиологический раствор, забуференный трисгидроксиметиламинометаном), содержащий детергент Tween (10 мМ Tris HCl; 100 мМ NaCl; 0,1% Tween 20; pH 7,5) и 0,5% обезжиренное молоко, для блокирования неспецифических реакций.
После этого указанную мембрану инкубировали с антимышиными антителами к ММР-9 (Upstate) в разведении 1:600 при комнатной температуре в течение 3 часов и затем с антимышиными IgG в качестве вторичных антител. По завершении реакции мембрану промывали 4 раза раствором TBS, содержащим Tween, инкубировали в течение 1 минуты с реагентом для усиленной хемилюминесценции (ECL) и экспонировали с рентгеновской пленкой при комнатной температуре.
В результате, как показано на фигуре 7, было установлено, что сигнал, соответствующий ММР-9, был слабее в случае обработки клеток липополисахаридом вместе с экстрактом культивированных клеток по данному изобретению (опыт) по сравнению с одним LPS (контроль).
6-3. Влияние экстракта культивированных клеток, происходящих из камбия или прокамбия Taxus, на подавление экспрессии ММР-2
Известно, что в клетках, обработанных LPS, в процессе передачи сигнала, ведущего к воспалению, усиливается образование ММР-2. Поэтому чтобы выяснить, подавляется ли экспрессия ММР-2 под действием указанного экстракта, клетки HDK обрабатывали LPS и экстрактом культивированных клеток, полученным в Примере 2.
Клетки HDF обрабатывали LPS (10 мкг/мл) и метанольпым экстрактом клеток линии по данному изобретению, полученным в Примере 2 (10-100 мкг/мл, предпочтительно 50 мкг/мл). Через 3, 6 и 24 часа после обработки метанольным экстрактом клетки собирали и экстрагировали из них белки, которые количественно определяли по методу Брэдфорда. А именно, собирали клетки HDF, экстрагировали из них внутриклеточные белки и определяли их количество.
Определение ММР-2 проводили методом Вестерн-блоттинга. А именно, количественно определенный белок смешивали с раствором красителя «бромфеноловый синий», затем проводили электрофорез в полиакриламидном геле (10% SDS-PAGE). После электрофореза белок переносили на поливинилиденфторидную мембрану (Millipore) и погружали в TBS (физиологический раствор, забуференный трисгидроксиметиламинометаном), содержащий детергент Tween (10 мМ Tris.HCl; 100 мМ NaCl; 0,1% Tween 20; pH 7,5) и 0,5% обезжиренное молоко, для блокирования неспецифических реакций.
После этого указанную мембрану инкубировали с мышиными антителами (Upstate) к ММР-2 в разведении 1:600 при комнатной температуре в течение 3 часов и затем с антимышиными IgG в качестве вторичных антител. По завершении реакции мембрану промывали 4 раза раствором TBS, содержащим Tween, инкубировали в течение 1 минуты с реагентом для усиленной хемилюминесценции (ECL) и экспонировали с рентгеновской пленкой при комнатной температуре.
В результате, как показано на фигуре 8, было установлено, что сигнал, соответствующий ММР-2, был слабее в случае обработки клеток липополисахаридом вместе с экстрактом культивированных клеток по данному изобретению (опыт) по сравнению с одним LPS (контроль).
6-4. Влияние экстракта культивированных клеток, происходящих из камбия или прокамбия Taxus, на подавление экспрессии ICAM-1
Чтобы выяснить, подавляется ли экспрессия ICAM-1 под действием экстракта клеток линии по данному изобретению, клетки HDK обрабатывали LPS и экстрактом культивированных клеток, полученным в Примере 2.
Клетки HDF обрабатывали LPS (10 мкг/мл) и метанольным экстрактом клеток линии по данному изобретению, полученным в Примере 2 (10-100 мкг/мл, предпочтительно 50 мкг/мл). Через 1, 3, 6, 12 и 24 часа после обработки метанольным экстрактом клетки собирали и экстрагировали из них белки, которые количественно определяли по методу Брэдфорда. А именно, собирали клетки HDF, экстрагировали из них внутриклеточные белки и определяли их количество.
Определение ICAM-1 проводили методом Вестерн-блоттинга. А именно, количественно определенный белок смешивали с раствором красителя «бромфеноловый синий», затем проводили электрофорез в полиакриламидном геле (10% SDS-PAGE). После электрофореза белок переносили на поливинилиденфторидную мембрану (Millipore) и погружали в TBS (физиологический раствор, забуференный трисгидроксиметиламинометаном), содержащий детергент Tween (10 мМ Tris HCl; 100 мМ NaCl; 0,1% Tween 20; pH 7,5) и 0,5% обезжиренное молоко, для блокирования неспецифических реакций.
После этого указанную мембрану инкубировали с мышиными антителами к ICAM-1 (Upstate) в разведении 1:600 при комнатной температуре в течение 3 часов и затем с антимышиными IgG в качестве вторичных антител. По завершении реакции мембрану промывали 4 раза раствором TBS, содержащим Tween, инкубировали в течение 1 минуты с реагентом для усиленной хемилюминесценции (ECL) и экспонировали с рентгеновской пленкой при комнатной температуре.
В результате, как показано на фигуре 9, было установлено, что сигнал, соответствующий ICAM-1, был слабее в случае обработки клеток липополисахаридом вместе с экстрактом клеток линии по данному изобретению (опыт) по сравнению с одним LPS (контроль).
ICAM-1 - это типичный белок из группы молекул клеточной адгезии, который присутствует на поверхности эндотелиальных клеток. В норме уровень его экспрессии очень низкий; однако при стимуляции медиаторами воспаления - такими цитокинами, как TNF-α, интерферон-γ и интерлейкин-1β, экспрессия ICAM-1 быстро усиливается для того, чтобы участвующие в воспалительной реакции клетки (моноциты, лимфоциты), циркулирующие в крови, перемещались в пораженные воспалительным процессом ткани и чтобы происходила адгезия этих клеток [Wegner С.D. et al, Science, 247(1941):456, 1990; Dustin, M. L. et al, J. Immunol., 137(1):245, 1986]. Следовательно, экспрессия ICAM-1 играет важную роль в интенсификации воспаления, когда на ранних его стадиях участвующие в воспалительной реакции клетки скапливаются в пораженном участке организма. Таким образом, показано, что обработка клетками линий по данному изобретению подавляла экспрессию ICAM-1, откуда следует, что композиция по данному изобретению способна подавлять и предотвращать воспаление.
Пример 7. Определение цитотоксичности
Чтобы выяснить, обладают ли культивированные клетки, происходящие из камбия или прокамбия Taxus, цитотоксическим действием, был проведен следующий эксперимент.
4
Нормальные диплоидные фибробласты человека (NHDF; приобретены в МСТТ, Корея) культивировали в среде DMEM (Welgene, Корея), содержащей 10% FBS. Фибробласты высевали на 96-луночный планшет по 1×10 клеток на лунку и культивировали 12 часов. Затем среду DMEM, не содержащую FBS, инкубировали в течение 24 часов с полученными в Примере 2 диметилсульфоксидными экстрактами (1 часть на миллион, 10 и 100 частей на миллион) культивированных клеток, происходящих из камбия Taxus, либо с культуральной средой (1%, 5% и 10% объем/объем), полученной в результате удаления из нее культивировавшихся там клеток в Примере 2. В контрольном опыте (N) в инкубируемую среду образцы не добавлялись. Жизнеспособность фибробластов определяли путем культивирования этих клеток в течение 2 часов в среде DMEM без FBS, содержащей раствор WST-1 (10%), и последующего измерения поглощения при 450 им.
В результате, как показано на фигуре 10, диметилсульфоксидный экстракт культивированных клеток, происходящих из камбия Taxus, не снижал жизнеспособность клеток во взятом диапазоне концентраций, а культуральная среда в концентрации 10% (объем/объем) несколько уменьшала жизнеспособность клеток. Цитотоксичным считается вещество, в присутствии которого жизнеспособность клеток составляет менее 80%; таким образом, подтвердилось, что экстракт культивированных клеток и культуральная среда по данному изобретению не обладают цитотоксичностью во взятом диапазоне концентраций.
Пример 8. Изучение ликвидации активных форм кислорода, образовавшихся под действием ультрафиолетового излучения.
Чтобы определить антиоксидантную и противовозрастную активность культивированных клеток, происходящих из камбия или прокамбия Taxus, по данному изобретению, был проведен следующий эксперимент.
4
Вначале кератиноциты человека (НаСаТ; German Cancer Research Institute, Гейдельберг, Германия) культивировали в среде DMEM, содержащей 10% FBS. Клетки высевали на 96-луночный планшет по 3х10 клеток на лунку и культивировали в течение 12 часов, чтобы клетки прикрепились к планшету. Также среду DMEM, не содержащую FBS, инкубировали в течение 3 часов с полученными в Примере 2 диметилсульфоксидиыми экстрактами (1, 10, 25 и 50 частей на миллион) культивированных клеток, происходящих из камбия и прокамбия Taxus, или с культуральной средой из Примера 2 (0,1% и 1% объем/объем). Кроме того, в положительном контроле инкубацию проводили с N-ацетилцистеином (NAC) в концентрации 10 нМ и в дополнительном контроле - с диметилсульфоксидными экстрактами Taxus (1, 10, 25 и 50 частей на миллион).
2
Затем указанные клетки промывали буферным раствором HBSS и культивировали с 50 мкМ DCF-DA (HBSS) при 37°С в течение 20 минут. Клетки опять промывали (два раза) буферным раствором HBSS, прибавляли 3 мкл HBSS и подвергали клетки воздействию ультрафиолетового излучения (365 нм) в дозе 200 мДж/см. После этого клетки культивировали в течение 2 часов при 37°С и измеряли флуоресценцию (длина волны возбуждения 485 нм, длина волны испускания 535 нм. Infinite M-200, Тесап); используя раствор WST-1, определяли жизнеспособность клеток. Влияние испытываемых образцов на ликвидацию активных форм кислорода оценивали путем сравнения флуоресценции после воздействия ультрафиолетового излучения и без такового (последнее значение принималось за 100).
В результате, как показано на фигуре 11, диметилсульфоксидный экстракт и культуральная среда клеток линии по данному изобретению вызывали уменьшение количества активных форм кислорода, образовавшихся под действием ультрафиолетового излучения (в случае экстракта клеток линии по данному изобретению брали среднее от значений, полученных для прокамбиальных и для камбиальных клеток). В частности, когда кератиноциты обрабатывали экстрактом Taxus в качестве контроля и подвергали воздействию ультрафиолетового излучения, флуоресценция ослабевала на 44% (1 часть на миллион), 55% (10 частей на миллион), 48% (25 частей на миллион) и 56% (50 частей на миллион) по сравнению с опытом без обработки образцами (0 частей на миллион). Когда же для обработки кератиноцитов брали экстракт культивированных клеток по данному изобретению, флуоресценция ослабевала значительнее - 62% (1 часть на миллион), 70% (10 частей на миллион), 73% (25 частей на миллион), 70% (50 частей на миллион) по сравнению с опытом без обработки образцами (0 частей на миллион). Из этого следует, что культивированные клетки по данному изобретению обладают более сильным антиоксидантным действием, чем сам Taxus.
Пример 9. Изучение подавления образования коллагеназы (ММР-1) под действием ультрафиолетового излучения.
Чтобы определить противовозрастную активность культивированных клеток, происходящих из камбия или прокамбия Taxus, по данному изобретению, был проведен следующий эксперимент.
4
Вначале фибробласты (МСТТ, Корея) высевали на 24-луночный планшет по 2×10клетки на лунку и культивировали 12 часов, чтобы клетки прикрепились к планшету. Затем клетки инкубировали в среде DMEM без FBS в течение 12 часов, после чего промывали буферным раствором DPBS и подвергали воздействию ультрафиолетового излучения (365 нм) в дозе 100 мДж/см". Также среду DMEM инкубировали в течение 24 часов с полученными в Примере 2 диметилсульфоксидными экстрактами (25 и 50 частей на миллион) культивированных клеток, происходящих из камбия и прокамбия Taxus, или с культуральной средой из Примера 2 (0,1% и 1% объем/объем). Кроме того, в положительном контроле инкубацию проводили с ретипоевой кислотой (RA) в концентрации 1 мкМ и в дополнительном контроле - с экстрактами Taxus (25 и 50 частей на миллион). После этого собирали культуральную среду, центрифугировали и в супернатанте количественно определяли ММР-1 путем твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA, Amersham). Используя раствор WST-1, определяли жизнеспособность клеток.
В результате, как показано на фигуре 12, экстракт и культуральная среда клеток линии по данному изобретению превосходно подавляли образование ММР-1 (в случае экстракта клеток линии по данному изобретению брали среднее от значений, полученных для прокамбиальных и для камбиальных клеток). В частности, экстракт и культуральная среда клеток линии по данному изобретению подавляли образование ММР-1 эффективнее, чем экстракт Taxus (контроль) и ретиноевая кислота (RA), противовозрастной эффект которых хорошо известен. Из этого следует, что культивированные клетки по данному изобретению особенно ценны в качестве противовозрастной косметической композиции.
Пример 10. Изучение подавления внутриклеточного меланогенеза
Чтобы определить отбеливающую активность культивированных клеток, происходящих из камбия или прокамбия Taxus, по данному изобретению, был проведен следующий эксперимент.
5
2
2
Вначале меланомные клетки мыши (В-16 F1) (Корея Cell Line Bank, Корея) помещали в среду DMEM, содержащую 10% FBS, высевали на 6-луночный планшет по 1×10 клетки на лунку и культивировали при 37°С в атмосфере с 5% СО до тех пор, пока около 80% клеток не прикреплялись к дну лунки. После этого среду заменяли на новую, содержащую полученные в Примере 2 диметилсульфоксидные экстракты (1 и 10 частей на миллион) культивированных клеток, происходящих из камбия и прокамбия Taxus, или культуральную среду из Примера 2 (0,05; 0,1% и 1% объем/объем), и клетки культивировали при 37°С в атмосфере с 5% СO в течение заданного времени. Также в положительном контроле обработка делалась койевой кислотой (1 мМ), а в отрицательном контроле (на фигуре 13 - «контроль») обработки образцами не было. Затем клетки отделяли от среды, промывали PBS и обрабатывали трипсином. К полученному клеточному материалу прибавляли 100 мкл 1М NaOH, содержащего 10% DMSO; таким образом получался внутриклеточный меланин. Определяли поглощение раствора при 490 нм с помощью микропланшетного ридера (Tecan Infinite M200, Австрия). Количество белка определяли по методу Брэдфорда.
В результате, как показано на фигуре 13, экстракт и культуральная среда клеток линии по данному изобретению подавляли меланогенез (в случае экстракта брали среднее от значений, полученных для прокамбиальных и для камбиальных клеток). В частности, экстракт (1 часть на миллион) и культуральная среда клеток линии по данному изобретению подавляли меланогенез, по существу, так же, как койевая кислота, известная своим отбеливающим эффектом. Из этого следует, что экстракт и культуральная среда клеток линии по данному изобретению весьма ценны в качестве отбеливающей косметической композиции.
Пример 11. Получение фармацевтических композиций
Композиция 1. Получение таблеток
100 мг полученного в Примере 2 экстракта клеток линии по данному изобретению смешивали с 100 мг кукурузного крахмала, 100 мг лактозы и 2 мг стеарата магния; из этой смеси формовали таблетки обычным для изготовления такой лекарственной формы способом.
Композиция 2. Получение капсул
500 мг полученного в Примере 2 экстракта клеток линии по данному изобретению заключали в мягкую желатиновую капсулу, получая препарат в форме капсул.
Композиция 3. Получение сиропа
1 г культивированных клеток по Примеру 1 смешивали с 10 г изомеризованного сахара, 5 г маннита и таким количеством очищенной воды, чтобы в результате применения обычных способов изготовления данной лекарственной формы получилось 100 мл композиции в виде сиропа.
Композиция 4. Получение раствора для инъекций
200 мг полученного в Примере 2 экстракта клеток линии по данному изобретению нагревали и растворяли в 200 мг физиологического раствора, содержащего полиоксиэтилированное гидрогизированное касторовое масло; таким образом получали раствор для инъекций, содержащий указанный экстракт в концентрации 0,1%.
Пример 12. Получение функционального пищевого продукта: получение функционального напитка
Получение 1
200 мг культивированных клеток по Примеру 1 растворяли в 96 мл воды и прибавляли 500 мг витамина С в качестве добавки, 1 г лимонной кислоты и 1 г олигосахарида в качестве усилителей аромата и 0,05 г бензоата натрия в качестве консерванта. К этой смеси добавляли очищенную воду в таком количестве, чтобы в результате получилось 100 мл функционального напитка.
Получение 2
200 мг полученного в Примере 2 клеток линии по данному изобретению растворяли в 96 мл воды и прибавляли 500 мг витамина С в качестве добавки, 1 г лимонной кислоты и 1 г олигосахарида в качестве усилителей аромата и 0,05 г бензоата натрия в качестве консерванта. К этой смеси добавляли очищенную воду в таком количестве, чтобы в результате получилось 100 мл функционального напитка.
Пример 13. Получение функциональных косметических продуктов
Получение 1: Молочный лосьон
Молочный лосьон, имеющий следующий состав, готовили обычным для изготовления таких препаратов способом: 6,2 мг полученного в Примере 2 экстракта клеток линии по данному изобретению; 6,5 мг 1,3-бутиленгликоля; 1,2 мг глицерина; 0,2 мг D-пантенола; 0,3 мг этилового спирта; 0,1 мг карбомера; 1,5 мг стеариновой кислоты; 0,7 мг полисорбата 60; 0,6 мг липофильного глицерилстеарата; 0,3 мг сорбитан-сесквиолеата; 0,6 мг цетеарилового спирта; 3,5 мг сквалена; 3 мг триглицеридов каприловой/каприновой кислот; 0,4 мг диметикона; небольшое количество консерванта; желаемое количество отдушки и очищенная вода в таком количестве, чтобы общая масса препарата составила 100 мг.
Получение 2: Крем
Крем, имеющий следующий состав, готовили обычным для изготовления таких препаратов способом: 5,0 мг полученного в Примере 2 экстракта клеток линии по данному изобретению; 7,0 мг 1,3-бутиленгликоля; 1,0 мг глицерина; 0,1 мг D-пантенола; 0,4 мг алюмосиликата магния; 2,0 мг стеариновой кислоты; 1,5 мг полисорбата 60; 2,0 мг липофильного глицерилстеарата; 1,5 мг сорбитан-сесквиолеата; 4,0 мг минерального масла; 3,0 мг цетеарилового спирта; 3,8 мг сквалена; 2,8 мг триглицеридов каприловой/каприновой кислот; 0,4 мг диметикона; требуемое количество ксантановой камеди; требуемое количество триэтаноламина; требуемое количество токоферолацетата; небольшое количество консерванта; желаемое количество отдушки и очищенная вода в таком количестве, чтобы общая масса препарата составила 100 мг.
Промышленное применение
Как описано выше, композиции по данному изобретению по сравнению с существующими антиоксидантными и противовоспалительными агентами сводят к минимуму побочные эффекты; они участвуют во внутриклеточных метаболических процессах, сокращающих количество активных форм кислорода внутри клетки, и ослабляют возрастные признаки. Таким образом, композиции по данному изобретению полезны для предотвращения и задержки старения. Кроме того, композиции по данному изобретению обладают способностью подавлять меланогенез и поэтому полезны в качестве косметического отбеливающего средства.
Хотя в настоящем документе данное изобретение описано подробно в отношении конкретных признаков, специалистам в данной области техники будет ясно, что это описание касается лишь предпочтительных воплощений изобретения и не ограничивает его объем. Таким образом, объем изобретения, по существу, определяется прилагаемой формулой изобретения и эквивалентными ей формулировками.