АНТИТЕЛА К ЧЕЛОВЕЧЕСКОМУ NKG2D И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
ANTIBODIES TO HUMAN NKG2D AND THEIR APPLICATION

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Данное изобретение относится к антителам к NKG2D человека (hNKG2D) и их применению в лечении или предупреждении заболеваний и нарушений у пациентов.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
+
+
Иммунорецептор NKG2D обычно экспрессируется на CD8 Т клетках и NK клетках человека. На преактивированных CD8 клетках рецептор NKG2D человека (hNKG2D), представляющий собой гомодимер, при связывании с DAP10 выполняет функции ко-стимулятора передачи сигналов TCR и CD28+TCR, тогда как в NK клетках он выполняет функцию непосредственного активатора. Были идентифицированы и охарактеризованы различные лиганды hNKG2D, включая лиганды MICA и MICB, относящиеся к I классу главного комплекса гистосовметсимости (МНС), семейство UL16-связывающих белков (ULBP) и семейство раннего транскрипта-1 ретиноевой кислоты (RAET1).
+
-
При хронических аутоиммунных заболеваниях, таких как ревматоидный артрит, hNKG2D экспрессируется на субпопуляции CD4 CD28T клеток и участвует в стимуляции их пролиферации и выработке IFNγ, что сопровождается повышением экспрессии MIC (Groh et al., PNAS 2003:100:9452). Также было продемонстрировано, что CD4+ hNKG2D-экспрессирующие Т клетки при болезни Крона опосредуют воспалительные и цитотоксические ответы через взаимодействие с MICA (Allez et al., Gastroenterology 2007; 132:2346-2358). Первоначальное предположение о том, что NKG2D играет важную роль в аутоиммунных воспалительных процессах, основывалось на том, на модели диабета у мышей (мыши NOD) моноклональное антитело (mAb), связывающее и блокирующее мышиный NKG2D (СХ5) позволяло предупреждать и лечить воспалительные процессы, ведущие к развитию диабета (Ogasawara et al., Immunity 2004; 20:757-767), что позволило предположить возможность терапевтического применения антител к NKG2D. Такие применения были описаны, например, в US20050158307, WO2005097160, WO2005115517 и WO2006024367.
Однако, mAbs мыши к NKG2D человека, которые описаны (см, например, Pende et al., Eur J Immunol 2001; 31:1076-86, WO02068615; Bauer et al., Science 1999:285:727-9; Castriconi et al., PNAS 2003; 100:4120-25; и Andre et al., Eur J Immunol 2004:34:1-11) или имеются в продаже (например, антитело 149810 компании R&D Systems, MN, USA, или ON72 компании Beckman Coulter Inc.), являются иммуногенными. По имеющимся данным, единственное полностью человеческое mAb к NKG2D, описанное в литературе, проявляло как стимулирующий, так и ингибирующий эффект на передачу сигналов NKG2D (Kwong et al., J Mol Biol 2008; 384:1143-1156), что делает его менее пригодным в качестве терапевтического агента при воспалительных и/или аутоиммунных нарушениях.
Соответственно, существует необходимость в получении mAbs к hNKG2D с оптимальными свойствами для терапевтического применения в воспалительных и/или аутоиммунных заболеваниях и нарушениях. Данное изобретение направлено на решение этих и других потребностей и предусматривает ряд дополнительных полезных эффектов, которые будут описаны ниже в данном документе.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение описывает выделенные моноклональные анти-hNKG2D антитела, пригодные для терапевтического использования у человека. Как правило, антитела являются полностью человеческими или гуманизированными для минимизации риска развития иммунного ответа на антитела при их введении пациенту. Согласно данному описанию, на основе таких антител могут быть сконструированы или произведены другие антиген-связываюшие молекулы, такие как, например, антиген-связывающие фрагменты антител, производные антител и мультиспецифичные молекулы.
В одном аспекте антитела характеризуются одним или более функциональными свойствами, или комбинацией функциональных свойств. Приводимые в качестве примера свойства включают, например, предупреждение hNKG2D-опосредованной активации hNKG2D-экспрессирующих NK или Т клеток; конкурирование по меньшей мере с одним естественным лигандом hNKG2D или с несколькими лигандами за связывание с hNKG2D; снижение количества hNKG2D на поверхности hNKG2D-экспрессирующих NK или Т клеток; связывание также NKG2D яванского макака и/или макаки-резус; связывание только одной молекулы антитела на каждый димер hNKG2D; сшивание не более чем 2 димеров hNKG2D при добавлении к hNKG2D-экспрессирующим NK и/или Т клеткам; незначимый агонистический эффект на передачу сигналов hNKG2D при связывании; и/или связывание с hNKG2D с константой диссоциации (KD) 1 нМ или ниже. Определенные антитела к hNKG2D по данному изобретению могут также или в альтернативном случае конкурировать, связываться по существу с теми же эпитопами, или связываться с такой же или более высокой аффинностью, как одно или несколько конкретных антител человека к hNKG2D, описанных здесь, включая антитела MS и 21F2. Например, в одном воплощении антитела также или в альтернативном случае способны лучше конкурировать с hNKG2D за связывание с MS и/или 21F2 или блокировать его, чем известные мышиные антитела к hNKG2D (например, те, что описаны выше). В одном воплощении антитела связываются с тем же эпитопом hNKG2D, что и MS и/или 21F2. В другом воплощении антитела также или в альтернативном случае связываются с тем же эпитопом, что и MS. В другом воплощении антитела также или в альтернативном случае связываются с тем же эпитопом, что и 21F2. Специалистам очевидно, что антитела, описываемые и/или применяемые в воплощениях по данному изобретению, могут проявлять три, четыре или более описанных выше характеристик.
В другом аспекте антитела также или в альтернативном случае содержат один или более паратоп и/или антиген-связывающих последовательностей, идентичных или схожих с паратопами MS или 21F2 и/или антиген-связывающими последовательностями, описанными здесь.
В других аспектах изобретение описывает нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела по изобретению, векторы экспрессии, содержащие такие нуклеиновые кислоты, клетки-хозяева, содержащие такие нуклеиновые кислоты, клетки-хозяева, продуцирующие антитела по изобретению и способы получения антител к hNKG2D путем культивирования таких клеток-хозяев в соответствующих условиях.
Антиген-связывающие фрагменты таких антител, а также молекулы, содержащие такие антиген-связывающие фрагменты, включая фрагменты антител, полученные посредством инженерии, производные антител, биспецифичные антитела и другие мультиспецифичные молекулы, также охватываются изобретением.
Фармацевтические композиции и наборы или другие изделия, включающие такие антитела или другие молекулы, также охватываются изобретением.
Ниже рассматриваются способы снижения или ингибирования активации hNKG2D, передачи сигнала hNKG2D или активации hNKG2D-экспрессирующих NK или Т клеток, способы уменьшения воспаления и способы лечения или предупреждения аутоиммунных и/или воспалительных заболеваний или нарушений, включая но не ограничиваясь ревматоидным артритом, воспалительными заболеваниями кишечника (ВЗК), включая болезнь Крона и язвенный колит, системной красной волчанкой (СКВ), псориазом, псориатическим артритом, рассеянным склерозом, целиакией, вирусными заболеваниями (такими как, например, вирусным гепатитом) и отторжением трансплантата различных органов и тканей (включая сердце и костный мозг, но не ограничиваясь ими) с применением таких антител, молекул и композиций.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На фигуре 1 показан анализ образцов сыворотки мышей линии KM mouse™, иммунизированных hNKG2D. Анализ при помощи проточной цитометрии NKG2D-экспрессирующих BAF/3 клеток или контрольных клеток (BAF/3 клетки) на различных отрезках времени демонстрирует повышение титров антитела с селективным связыванием NKG2D в 1 мкл сыворотки (А). Предварительная инкубация с сывороткой (1 мкл), взятой после 6 иммунизации, содержащей антитело, способное предотвращать связывание MICA-Fc с NKG2D (Б).
На фигуре 2 показан пример человеческого антитела в форме супернатанта гибридомы, специфически связывающегося с клетками, экспрессирующими NKG2D (А), но не с клетками той же линии, не экспрессирующими NKG2D (Б). Антитело добавляли к клеткам в форме супернатанта гибридомы. Также показано непосредственное связывание меченного положительного контроля, анти-NKG2D антитела грызунов 149810 с клетками, экспрессирующими NKG2D (В) и клетками, не экспрессирующими его (Г). Черный контур представляет фоновое окрашивание, а сплошные пики представляют специфическое окрашивание.
На фигуре 3 показано дозозависимое связывание NKG2D клеток, экспрессирующих NKG2D, с рекомбинантными и очищенными полностью человеческими антителами lgG4 (16F16, 16F31, MS и 21F2) в сравнении с коммерческими антителами грызунов (ON72 и 149810).
На фигуре 4 показаны аминокислотные последовательности тяжелых (Н) и легких (L) цепей человеческих анти-hNKG2D антител 16F16 и 16F31 (А), и MS и 21F2 (Б) с изотипом lgG4, на которых выделены вариабельные участки (жирным) и участки CDR (подчеркнуты). Соответствующие кодовые обозначения для аминокислотных последовательностей и различные выделенные фрагменты приведены в Таблице 1.
На фигуре 5 показано выравнивание последовательностей VH и VL с соответствующими рекомбинированными зародышевыми последовательностями. Участки CDR обозначены жирным и пронумерованы по Kabat, а соматические гипермутации обозначены жирным подчеркнутым текстом. (А) 16F16 lgG4 цепь Н; (Б) 16F16 lgG4 цепь L; (В) 16F31 lgG4 цепь Н; (Г) 16F31 lgG4 цепь L; (Д) MS lgG4 цепь Н; (Е) MS lgG4 цепь L; (Ж) 21 F2 lgG4 цепь Н; (3) 21 F2 lgG4 цепь L. SEQ ID NOS:27-30 соответствуют рекомбинированным VH3_21/D3-9/JH4, VKI_L15/JK2, VH3 20/D3- 10/JH6 и VKIII_A27/JK3, соответственно, a SEQ ID NOS 60-63 соответствуют рекомбинированным VH4_59//JH3, VKIII_A27/JK1, VH5_51/D3_10_R3/JH4 и VKIII_L6/JK1, соответственно.
На фигуре 6 показано блокирование связывания лиганда (MICA-) приведенным в качестве примера человеческим антителом к NKG2D, изображенное в виде блокирования связывания лиганда при предварительной инкубации с антителом в супернатанте гибридомы. Контур обозначает фон, серым обозначено связывание лиганда без предварительной инкубации, а черным с точками обозначено связывании е лиганда после предварительной инкубации.
На фигуре 7 показана кривая доза-ответ, полученная при анализе различных концентраций рекомбинантных очищенных полностью человеческих антител к hNKG2D (16F16, 16F31, MS и 21 F2; изотип lgG4), отображающая IC50 и дозу, необходимую для полной блокады связывания 1 мкг MICA-mFc.
На фигуре 8 показано, что связывание ON72 с NKG2D полностью предотвращалось при предварительной инкубации с супернатантом гибридомы, содержащим 16F16. Контур обозначает фон, серым обозначено связывание ON72 без предварительной инкубации, а черным с точками обозначено связывание ON72 после предварительной инкубации.
На фигуре 9 показана способность полностью человеческих антител к hNKG2D блокировать последующее связывание анти-hNKG2D антител грызунов, или наоборот.(А) 16F16: Предварительная инкубация с рекомбинантным и очищенным 16F16 (0,3 мкг; изотип lgG4) предотвращала связывание ON72 (0,3 мкг) с NKG2D. Инкубация в обратном порядке показала, что предварительная инкубация с ON72 (0,3 мкг) только на 85% сокращала связывание рекомбинантного и очищенного 16F16 с изотипом lgG4 (0,3 мкг), указывая на то, что какая-то фракция NKG2D оставалась доступной для связывания полностью человеческим антителом, что предполагало существование эпитопа, по меньшей мере частично отличающегося от того, который связывался с ON72. Антитело 149810 демонстрировало только 50% перекрестное ингибирование рекомбинантного и очищенного 16F16 (изотип lgG4), при тестировании антител 149810 и 16F16 в соотношении 1:1 (0,3 мкг, 0,3 мкг) и в соотношении 3:1 (1 мкг, 0,3 мкг), соответственно, что вновь с большой вероятностью указывало на различия в связывании с эпитопом на NKG2D. Использовали следующие комбинации инкубации и детекции: детекция ON72 без (а) или с (б) предварительной инкубацией с 16F16; детекция 16F16 без (в) или с (г) предварительной инкубацией с ON72; детекция 149810 (0,3 мкг) без (д) или с (е) предварительной инкубацией с 16F16 (0,3 мкг); детекция 16F16 без (ж) или с (з) предварительной инкубацией с 149810 (0,3 мкг); детекция 149810 (1 мкг) без (и) или с (к) предварительной инкубацией с 16F16 (0,3 мкг); детекция 16F16 (0,3 мкг) без (л) или с (м) предварительной инкубацией с 149810 (1 мкг); детекция 16F16 (0,3 мкг). (Б) MS: 0,1 мкг анти-hNKG2D антитела грызунов инкубировали с или без предварительной инкубации с 0,1 мкг антитела MS, с последующей детекцией с анти-мышиным антителом при помощи проточной цитометрии. Инкубация с 0,1 мкг ON72, 1D11 или 149810 без предварительной инкубации с MS, нормализованная к 100%, показана в (а), (в) и (д), соответственно. Инкубация с 0,1 мкг MS в течение 30 минут с последующей инкубацией и детекцией ON72, 1D11 или 149810 показана в (б), (г) и (е), соответственно. Предварительная инкубация с MS ингибировала связывание NKG2D с ON72, 1D11 и 149810 на 98%, 88% и 96,5%, соответственно, что предполагало существование одинаковых эпитопов по меньшей мере у некоторых из антител. (В) 21F2: детекция связывания ON72 с (а) или без (б) предварительной инкубации с 21F2; детекция связывания 1D11 с (в) или без (г) предварительной инкубации с 21F2; и детекция связывания 149810 с (д) или без (е) 21F2 (все антитела в количестве 0,1 мкг).
На фигуре 10 показано окрашивание клеток макаки резус или яванского макака с антителом ON72 и 16F16, очищенным из исходной гибридомы. (A) NK клетки яванского макака, (Б) CD8+ Т клетки яванского макака, (В) NK клетки макаки-резус и (Г) CD8+ Т клетки макаки-резус. Приведенные значения представляют собой среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) связывания после вычитания MFI связывания только вторичного антитела. Ни у одного вида не наблюдалось связывания с CD4+ Т клетками.
На фигуре 11 показано связывание человеческого антитела MS с CD8-положительной фракцией мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) человека или яванского макака при различных концентрациях антител, демонстрирующее одинаковую аффинность NKG2D к клеткам человека и яванского макака.
51
На фигуре 12 показано, что добавление антител, блокирующих лиганд (ON72 или рекомбинантного и очищенного 16F16 (изотип lgG4)), блокировало NK-опосредованную гибель клеток-мишеней, экспрессирующих MICA в дозозависимым образом в радионукпеидном тесте с Cr.
На фигуре 13 показано, что рекомбинантные и очищенные антитела 16F16 и 16F31 (оба с изотипом lgG4) были способны дозозависимым образом подавлять гибель клеток-мишеней (BaF/3), несущих как MICA (А), так и ULBP3 (Б), под воздействием клеток NK-92, с почти полным блокированием 16F16 в концентрации 0,8 мкг/мл для обоих лигандов и с частичным блокированием 16F31 в максимальной исследованной концентрации 20 мкг/мл для обоих лигандов.
На фигуре 14 показано, что рекомбинантные и очищенные антитела MS, 21F2, и 16F16 (все с изотипом lgG4) были способны подавлять NK-опосредованную гибель клеток-мишеней, экспрессирующих лиганды. (А) ингибирование киллерного действия клеток NK-92 на клетки ULBP3-BaF/3 в присутствии MS или 21F2. (Б) ингибирование киллерного действия клеток NKL на клетки BaF/3-MICA в присутствии MS или 16F16.
На фигуре 15 показано снижение поверхностной экспрессии NKG2D в ответ на антитело на модели клеток BaF/3, трансфецированных NKG2D и DAP10. На фигуре показано процентное содержание рецепторов NKG2D, оставшихся на поверхности клеток после инкубации в течение ночи с ON72 (1 мкг) или с рекомбинантными и очищенными антителами человека 16F16 (1 мкг; изотип lgG4) или 16F31 (3 мкг; изотип lgG4), в сравнении с контролем (поверхностная экспрессия рецептора NKG2D после инкубации в течение ночи без антитела к NKG2D=100%).
На фигуре 16 показано снижение поверхностной экспрессии NKG2D в ответ на антитело MS на модели клеток BaF/3, трансфецированных NKG2D и DAP10 (выполнено как на фигуре 15) (А) или свежевыделенных из периферической крови NK клеток человека (Б). На панели (Б) NK клетки человека инкубировали в течение ночи в присутствии человеческой сыворотки для имитации присутствия IgG в крови и с различными концентрациями антитела MS. Максимальное ингибирование достигалось даже при самой низкой концентрации, что соответствовало приблизительно 60% насыщению рецепторов, определенному в тесте связывания с использованием NKG2D+ NK клеток в аналогичных условиях.
На фигуре 17 показано снижение в процентах поверхностного NKG2D на NK клетках человека после инкубации в течение ночи с указанными концентрациями антитела 21F2.
На фигуре 18 показан эффект ON72, MS и 21F2 на представленнный на поверхности различных клеток NKG2D в образцах крови человека через указанные промежутки времени. Концентрация каждого антитела составляла 0,1 мкг/мл. Не ограничиваясь какой-либо теорией, снижение поверхностной экспрессии NKG2D в экспериментах вероятно представляет интернализацию NKG2D. Панели с (А) по (В) отображают интернализацию NKG2D в ответ на антитело в экспрессирующих NKG2D клетках NK, CD8+ Т клетках и δγ Т клетках, соответственно. MS и 21F2 вызывают менее выраженное снижение экспрессии связанного с поверхностью NKG2D, по сравнению с ON72.
На фигуре 19 показаны результаты исследования активирующего эффекта иммобилизованных MS и ON72 на пролиферацию Т клеток с применением 2 различных субоптимальных концентраций CD3 для обеспечения возможной ко-стимуляции. (А) [CD3]=0,1 нг/мл; (Б) [CD3]=0,3 нг/мл. Пролиферацию Т клеток оцениивали при помощи разведения CFSE в популяции МКПК, стимулированных иммобилизованным антителом, как указано, в течение 3 дней с последующей стимуляцией IL-2 в течение 4 дней. Стимуляция CD28 приведена в качестве положительного контроля ко-стимуляции. Для MS не было выявлено значимого активирующего эффекта, тогда как ON72 оказывал слабый, но значимый эффект на пролиферацию Т клеток.
На фигуре 20 изображена 3-мерная суперпозиционная модель, изображающая димер hNKG2D в комплексе с Fab-фрагментом (фрагментами) анти-NKG2D антитела (MS или hzON72) или с лигандом MICA. Гомодимер hNKG2D ('NKG2D') изображен в стиле «поверхность» с одним из мономеров, имеющим более темный цвет по сравнению с другим. Fab-фрагменты ('MS' и 'hzON72', соответственно) изображены в стиле «черная труба», а изображение MICA ('MICA') представлено в стиле «схемы вторичной структуры светлого цвета». (А), (Б) Совмещение кристаллических структур комплексов hNKG2D/MS Fab и hNKG2D/MICA (Li et al, Nat Immunol 2001; 2:443-451; PDB-code 1HYR, с использованием в качестве матрицы альфа-атомов углерода общей молекулы hNKG2D). Поскольку и MICA, и MS связываются с димером NKG2D асимметрично, на панелях (А) и (Б) показаны два возможных способа относительной ориентации двух молекул лигандов при связывании с димером NKG2D. Существует значительное перекрывание между MICA и MS Fab при расчетах суперпозиции hNKG2D в обеих ориентациях, что указывает на способность MS Fab блокировать связывание MICA с рецептором hNKG2D. См. Пример 11. (В) Совмещение кристаллических структур комплексов hNKG2D/hzON72 Fab и hNKG2D/MICA. Каждый мономер hNKG2D связан с hzON72 Fab. При расчетах суперпозиции hNKG2D, антитело hzON72 также демонстрировало существенное перекрывание с сайтом связывания MICA, что указывало на способность hzON72 блокировать связывание MICA с hNKG2D. См. Пример 12.
На фигуре 21 показаны остатки в последовательности эпитопа (SEQ ID NO:2) каждой единицы мономера NKG2D в димере hNKG2D для MS Fab (A), hzON72 Fab (Б) и молекулы MICA (В) в последовательностях (SEQ ID NO:2) двух единиц мономеров hNKG2D. Остатки NKG2D на расстоянии в пределах 4.0 Å от атомов лигандов кристаллической структуры считали частью связывающего эпитопа, они подчеркнуты. Остатки, подчеркнутые двойной линией, вовлечены в образование водородных связей с лигандом. (А) Связывающий эпитоп для одного MS Fab в 1 и 2 единицах мономера hNKG2D в составе димера hNKG2D. Кристаллографические мономеры N и С объединили в 1 единице мономера NKG2D, а кристаллографические мономеры М and D объединили во 2 единице мономера NKG2D. Во 2 единице мономера атом Nζ боковой цепи Lys 150 был задействован только в образовании водородной связи с в одном из двух кристаллографически независимых комплексов. См. также Таблицы 9-12. (Б) Соответствующие связывающие эпитопы для 2 hzON72 Fabs одновременно были связаны с 1 и 2 единицами мономера hNKG2D. Trp 166 был задействован в образовании водородных связей в одной из кристаллографически независимых молекулярных комплексов (одна молекула hzON72 Fab в комплексе с одним мономером hNKG2D), но расстояние было слишком большим для образования водородных связей в составе другого. См. Таблицы 14-15. (В) Связывающий эпитоп для молекулы MICA в 1 и 2 единицах мономера hNKG2D. Отмечалось асимметричное связывание MICA с димером hNKG2D и, следовательно, существовала возможность связывания в двух ориентациях относительно MS-Fab. Вторая ориентация MICA может быть получена при простой перестановке изображений 2 единицы мономера.
На фигуре 22 показаны молекулы hNKG2D, представленные в стиле «поверхность» с одним из мономеров, имеющим более темный цвет по сравнению с другим. Атомы NKG2D на расстоянии в пределах 4.0 Å от их соответствующих кристаллических структур атомов MS/hzON72/MICA Fab окрашены в черный цвет и указаны для MS Fab (A), 2 hzON72 Fabs (Б) и для MICA, (В) и (Г). Поскольку и MICA, и MS Fab связываются с димером NKG2D асимметрично, относительная ориентация при связывании с NKG2D может отличаться. Это показано на фигуре, изображающей две возможных ориентации при связывании с MICA на панели (В) и с MS на панели (Г). См. также Таблицы 9-12 и 14-15.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
В данном описании "hNKG2D" и, если не утверждается иначе или не противоречит контексту, термины "NKG2D," а также "NKG2-D," "CD314," "D12S2489E," "KLRK1," " 1 член подсемейства К пектин-подобных рецепторов киллерных клеток" и "KLRK1," означают ген активирующего рецептора киллерных клеток человека, его мРНК (например, NCBI RefSeq NM_007360; SEQ ID NO:1) и его генный продукт (NCBI RefSeq NP_031386; SEQ ID NO:2), или их естественные варианты. В NK и Т клетках лиганд-связывающая форма рецептора hNKG2D представляет собой гомодимер (Li et al,, Nat Immunol 2001; 2:443-451). Рецептор hNKG2D обычно представлен на поверхности в комплексе с DAP10 (Wu et al, J Exp Med 2000:192:1059 et seq.; NCBI Accession No. AAG29425, AAD50293) и предположительно также формирует комплексы более высокого порядка. Любая активность, относящаяся здесь к hNKG2D, например, клеточная активация, распознавание антителами и т.д., может также быть отнесена на счет hNKG2D в форме комплекса или комплексов более высокого порядка с DAP10 и/или другими компонентами.
Термин "антитело" здесь используется в самом широком смысле и, в частности, включает моноклональные полноразмерные антитела, поликлональные антитела и, если не утверждается иначе или не противоречит контексту, антиген-связывающие фрагменты, варианты антител и их мультиспецифичные молекулы, когда они проявляют желаемую биологическую активность. В общем, полноразмерное антитело представляет собой гликопротеин, содержащий по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, связанные между собой дисульфидными связями, или их антиген-связывающие участки. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельного участка тяжелой цепи (сокращенно обозначаемого VH) и константного участка тяжелой цепи. Константный участок тяжелой цепи состоит из трех доменов, СН1, СН2 и СНЗ. Каждая легкая цепь состоит из вариабельного участка легкой цепи (сокращенно обозначаемого VL) и константного участка легкой цепи. Константный участок легкой цепи состоит из одного домена, CL. Участки VH и VL могут дальше подразделяться на гипервариабельные участки, называемые участками, определяющими комплементарность (от англ. complementarily determining regions, CDR), чередующимися с более консервативными участками, называемыми каркасными участками (FR). Каждый VH и VL состоит из трех CDRs и четырех FRs, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные участки тяжелых и легких цепей содержат связывающий домен, взаимодействующий с антигеном. Основные принципы построения молекулы антитела и разнообразные методики, относящиеся к продукции антител, описаны, например, в Harlow and Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988).
"Антиген-связывающий фрагмент" антитела представляет собой молекулу, содержащую часть полноразмерного антитела, которое способно детектируемо связываться с антигеном, обычно содержащую одну или несколько частей по меньшей мере участка VH. Антиген-связывающие фрагменты включают мультивалентные молекулы, содержащие один, два, три или более антиген- связывающих участков антитела, а также одноцепочечные конструкции, в которых участки VL и VH или их отдельные фрагменты соединены между собой искусственными линкерами или с использованием рекомбинантных методов, таким образом, что они образуют функциональную антиген-связывающую молекулу. Несмотря на то, что некоторые антиген-связывающие фрагменты антитела могут быть получены путем настоящей фрагментации более крупной молекулы антитела (например, ферментативного расщепления), большинство из них обычно продуцируют при помощи рекомбинантных технологий.
Термины "производное антител" и "иммуноконъюгат" используются здесь как взаимозаменяемые для обозначения молекул, содержащих полноразмерное антитело или его антиген-связывающий фрагмент, в котором одна или более иминокислот химически модифицированы, например, путем алкилирования, пегилирования, ацилирования, образования эфиров или образования амидов или тому подобного, например, для связывания антитела со второй молекулой. Примеры модификаций включают пегилирование (например, пегилирование цистеина), биотинилирование, радиоактивное мечение и конъюгирование со вторым агентом (таким как цитотоксический агент).
"Мультиспецифическая молекула" включает антитело или его антиген-связывающий фрагмент, который ассоциирован с или связан по меньшей мере с одной иной функциональной молекулой (например, другим пептидом или белком, таким как другое антитело или лиганд рецептора), таким образом образуя молекулу, связывающуюся по меньшей мере с двумя различными сайтами связывания или молекулами-мишенями. Примеры мультиспецифических молекул включают биспецифичные антитела и антитела, связанные с растворимыми фрагментами рецептора или лигандами.
Термин "антитело человека" используемый здесь, предназначен для определения антител с вариабельными участками, в которых как каркасные, так и гипервариабельные участки получены на основе последовательностей зародышевой линии (т.е. неперестроенных) иммуноглобулинов человека (т.е., являются идентичными или практически идентичными им). Более того, если антитело содержит константный участок, то константный участок также "получен на основе" последовательностей зародышевой линии иммуноглобулинов человека. Антитела человека по изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями зародышевой линии иммуноглобулинов человека (например, мутации, введенные в ходе случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro или соматические мутации in viva). Однако, термин "антитело человека", используемый здесь, не предназначен для определения антител, в которых последовательности CDR, полученные на основе зародышевых линий других видов млекопитающих, таких как мышь, были пересажены на последовательности каркасных участков человека.
"Гуманизированное" антитело представляет собой химерное антитело человеческого/не-человеческого происхождения, содержащее минимальную последовательность, произведенную на основе иммуноглобулина не-человеческого происхождения. Главным образом, гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека (антитело-реципиент), в которых остатки гипервариабельных участков реципиента заменены на остатки гипервариабельных участков видов, не имеющих человеческое происхождение (антитело-донор), таких как мышь, крыса, кролик или приматов, кроме человека, имеющих желаемую специфичность, аффинность и связывающую способность. В некоторых случаях остатки FR иммуноглобулина человека заменены на соответствующие остатки нечеловеческого происхождения. Более того, гуманизированные антитела могут содержть остатки, которые не обнаруживаются в антителе-реципиенте или в антителе-доноре. Такие модификации производятся для дальнейшего улучшения свойств антитела. В общем, гуманизированное антитело включает практически все из по меньшей мере одного, а обычно двух вариабельных доменов, в которых все или практически все из гипервариабельных петель соответствуют таковым иммуноглобулинов, не имеющих человеческое происхождение, и все или практически все из остатков FR относятся к последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело может, как вариант, также включать по меньшей мере часть константного участка иммуноглобулина (Fc), обычно принадлежащего иммуноглобулину человека. Более подробно см., например, в Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992), WO 92/02190, предварительной заявки США 20060073137 и патентов США 6750325, 6632927, 6639055, 6548640, 6407213, 6180370, 6054297, 5929212, 5895205, 5886152, 5877293, 5869619, 5821337, 5821123, 5770196, 5777085, 5766886, 5714350, 5693762, 5693761, 5530101, 5585089 и 5225539.
Термин "гипервариабельный участок", используемый здесь, означает аминокислотные остатки антитела, отвечающие за связывание антигена. Гипервариабельный участок обычно содержит аминокислотные остатки, определяющие комплементарность или "CDR" (остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (H1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи; (Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) и/или эти остатки из гипервариабельной петли (остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (Н1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 1987; 196:901-917). Как правило, нумерация аминокислотных остатков в этих участках производится способом, описанным Kabat et al., supra. Словосочетания "позиция по Kabat", "нумерация остатков в вариабельном домене по Kabat" и "согласно Kabat" здесь означают данную систему нумерации для вариабельных доменов тяжелой цепи или вариабельных доменов легкой цепи. При применении системы нумерации Kabat истинная линейная аминокислотная последовательность пептида может содержать меньше или больше аминокислот, что соответствует укорочению или инсерции в FR или CDR вариабельного домена. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может содержать инсерцию единственной аминокислоты (остаток 52а согласно Kabat) после остатка 52 в CDR H2 и инсерцию нескольких остатков (например, остатков 82а, 82b и 82c, и т.д., согласно Kabat) после остатка 82 в FR тяжелой цепи. Нумерация остатков по Kabat может быть определена для данного антитела при выравнивании по гомологичным участкам последовательности антитела со «стандартной» последовательностью, пронумерованной по Kabat.
Аминокислотные остатки "каркасного участка" или "FR" представляют собой остатки VH или VL, отличные от таковых CDR, согласно данному описанию.
"Эпитоп" или "сайт связывания" представляет собой область или участок на поверхности антигена, с которыми специфически связывается антиген-связывающий пептид (такой, как антитело). Эпитоп белка может включать аминокислотные остатки, непосредственно задействованные в связывании (также называемые иммунодоминантными компонентами эпитопа) и другие аминокислотные остатки, которые не являются непосредственно задействованными в связывании, такие, как аминокислотные остатки, которые успешно блокируются пептидом, специфически связывающим антиген (другими словами, аминокислотный остаток находится в составе поверхности, недоступной растворителю, и/или «отпечатка» пептида, специфически связывающего антиген). Термин эпитоп здесь включает оба типа сайтов связывания аминокислот в любом конкретном участке hNKG2D, который специфически связывается с анти-hNKG2D антителом или любым другим специфичным к hNKG2D агентом согласно изобретению, если не утверждается иначе (например, в некотором контексте изобретение относится к антителам которые непосредственно связываются с определенными аминокислотными остатками). NKG2Ds может включать ряд различных эпитопов, которые могут включать (1) линейные антигенные детерминанты пептидов, (2) конформационные антигенные детерминанты, состоящие из одной или более аминокислот, не являющихся смежными, расположенных вблизи друг от друга в активной конформации NKG2D; и (3) антигенные детерминанты, прошедшие посттрансляционную модификацию, состоящие полностью или частично из молекулярных структур, ковалентно связанных с NKG2D, таких как углеводные группировки, не ограничиваясь ими. Если не утверждается иначе или не противоречит контексту, конформационные антигенные детерминанты включают аминокислотные остатки NKG2D на расстоянии в пределах 4 Å от атома антиген-связывающего пептида.
"Поверхность, недоступная растворителю" представляет собой область молекулы, которая, согласно компьютерным расчетам, является недоступной для молекул воды, например, из-за связывания молекулы с лигандом (Lee and Richards, J Mol Biol 1971; 55:379-400, включено сюда путем ссылки).
Словосочетание "связывается практически с тем же эпитопом или детерминантой, что и антитело, представляющее интерес" (например, MS или 21F2) означает, что антитело "конкурирует" с антителом, представляющим интерес, за молекулы NKG2D, с которыми специфически связывается антитело, представляющее интерес.
"Паратоп" представляет собой область или участок антиген-связывающей части антитела, которая специфически связывается с антигеном. Если не утверждается иначе или явно не противоречит контексту, паратоп может содержать аминокислотные остатки, непосредственно задействованные в связывании с эпитопами, несколько из которых обычно принадлежат CDR, а также другие аминокислотные остатки, которые не являются непосредственно задействованными в связывании, такие как аминокислотные остатки, которые успешно блокируются специфически связанным антигеном (иными словами, аминокислотный остаток находится внутри "поверхности, недоступной растворителю" и/или "отпечатка" специфически связанного антигена).
Способность антитела к NKG2D "блокировать" связывание молекулы NKG2D с естественным лигандом NKG2D (например, MICA), означает, что антитело в тесте с применением растворимого или поверхностно-связанного NKG2D и молекул лигандов, может детектируемо снижать связывание молекулы NKG2D с лигандом дозозависимым образом, когда молекула NKG2D детектируемо связывается с лигандом в отсутствие антитела. Пример теста на определение способности анти-NKG2D антитела блокировать связывание MICA приводится в Примере 3. Этот же тест можно применять для тестирования блокирования других лигандов NKG2D, опосредованного антителами.
"Вариант" полипептида означает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, по существу идентичную референсному полипептиду, как правило, нативному или "материнскому" полипептиду. Вариант полипептида может иметь одну или более аминокислотных замен, делеций, и/или инсерций в определенных положениях в составе нативной аминокислотной последовательности и/или вставки на одном или обоих концах.
Термин "по существу идентичный" в контексте двух аминокислотных последовательностей означает, что последовательности, при их оптимальном выравнивании, например, с помощью программ GAP или BEST-FIT с применением веса разрыва, используемого по умолчанию, имеют по меньшей мере около 50 процентов идентичности. Как правило, по существу идентичные последовательности имеют по меньшей мере приблизительно 60, по меньшей мере приблизительно 70, по меньшей мере приблизительно 80, по меньшей мере приблизительно 90, по меньшей мере приблизительно 95, по меньшей мере приблизительно 98, или по меньшей мере приблизительно 99 процентов идентичности.
"Соответствующие" положения аминокислот у двух по существу идентичных аминокислотных последовательностей являются теми, которые получены при выравнивании с помощью любого программного обеспечения для анализа белков, на которое здесь имеется ссылка.
Последовательность нуклеиновой кислоты (или элемент) является "оперативно связанной" с другой последовательностью нуклеиновой кислоты (или элементом), если она находится в функциональной взаимосвязи с последовательностью другой аминокислоты. Например, ДНК пре-последовательности или последовательности секреторного лидерного пептида является оперативно связанной с ДНК (например, кодирующей экспрессию) полипептида, если она экспрессируется в виде пропептида, участвующего в секреции полипептида; промотор или энхансер оперативно связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию последовательности; либо сайт связывания рибосомы является оперативно связанным с кодирующей последовательностью, если он располагается таким образом, что способствует трансляции. Как правило, "оперативно связанный" означает, что связанные последовательности ДНК являются смежными, и, в случае секреторного лидерного пептида, смежными и считывающимися в одной рамке. Однако, некоторые элементы, такие как энхансеры, не обязательно должны быть смежными с кодирующей последовательностью, чтобы считаться оперативно связанными. Связывание обычно осуществляется за счет лигирования по подходящим рестрикционным сайтам. В случае отсутствия таких сайтов, согласно общепринятой практике могут применяться синтетические олигонуклеотидные адаптеры или
линкеры.
"Выделенная" молекула представляет собой молекулу, которая является преобладающей разновидностью в смеси, в которой она обнаруживается, в соответствии с классом молекул, к которому она принадлежит (например, она составляет по меньшей мере приблизительно 50% вида молекул в смеси и, как правило, она составляет по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% или более разновидности молекул, например, белков, в составе смеси). Как правило, смесь молекул антител будет гомогенна на 98%, 98% или 99% по молекулам антитела относительно всех представленных разновидностей белков в смеси или по меньшей мере относительно разновидностей белков, обладающих существенной активностью, в контексте предлагаемого применения.
В контексте данного изобретения "лечение" или "терапия" означает предупреждение, облегчение, ведение, излечение или уменьшение проявлений одного или более симптомов или клинически значимых проявлений заболевания или нарушения, если это не противоречит контексту. Например, "терапия" пациента, у которого не было выявлено симптомов или клинически значимых проявлений заболевания или нарушения, является превентивным или профилактическим, тогда как клиническая, лечебная или паллиативная "терапия" пациентов, у которых были выявлены симптомы или клинически значимые проявления заболевания или нарушения, как правило, не составляют превентивную или профилактическую терапию. Каждая форма терапии может считаться отдельным аспектом изобретения.
СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение основано частично на свойствах анител к NKG2D, подходящих для лечения пациентов, страдающих от нарушений, связанных с NKG2D, например, таких как аутоиммунные и воспалительные заболевания и нарушения. Антитела по изобретению, как правило, являются либо полностью человеческими либо гуманизироваными с целью минимизации риска развития аутоиммунного ответа со стороны собственной иммунной системы пациента в ответ на антитело и связываются с активной формой hNKG2D, т.е. с гомодимером на поверхности клетки, ассоциированным с DAP10.
Антитела по изобретению, как правило, могут применяться для лечения состояний, при которых активность NKG2D должна быть снижена. Такие антитела могут снижать или ингибировать активацию МК020-экспрессирующих NK и/или Т клеток за счет, например, конкурирования с одним или несколькими эндогенными лигандами к NKG2D за связывание с NKG2D или его блокирования, сокращения или иного уменьшения количества поверхностного NKG2D при связывании и/или за счет развития антителозависимой клеточной цитотоксичности или комплемент-зависимой цитотоксичности против этих клеток.
В одном аспекте антитела по изобретению являются антагонистами и конкурируют с одним или более естественными лигандами, такими как MICA, за связывание с NKG2D человека, таким образом, снижая лиганд-индуцированную активацию NKG2D. Молекулы MICA определенно являются задействованными в воспалительных заболеваниях и, как показано в Примере 3, несколько антител человека, в частности, MS и 21F2, оказались эффективными в блокировании связывании MICA с повехностным NKG2D, а распознавание эпитопа показало, что MS Fab препятствовало связыванию MICA (Пример 11, Фигура 20). Как MS, так и 21F2 также высоко эффективно блокировали опосредованную NK-клетками цитотоксичность (Пример 6). Таким образом, эти результаты свидетельствуют, что в изобретении представлены антитела, обладающие такими свойствами.
В более частном аспекте, антитела по изобретению являются эффективными антагонистами, обладая незначительным активирующим эффектом на передачу сигнала hNKG2D, таким образом не внося вклад в NKG2D-обусловленное воспаление. Например, как показано на Фигуре 19, не было обнаружено совместного активирующего влияния иммобилизованного MS на вызванную CD3 пролиферацию МКПК, тогда как иммобилизация ON72 приводила к небольшой, но значимой ко-стимуляции. Не ограничиваясь какой-либо теорией, это различие может по меньшей мере частично быть связано с различиями между эпитопами, как показано на Фигурах 20-22. Антиген-связывающая часть бивалентного антитела MS прочно связывается с одним мономером в комплексе димера hNKG2D, но блокирует связывание второго антитела MS (или второй антиген-связывающей части молекулы того же антитела) со вторым мономером. Напротив, связывание первой антиген-связывающей части молекулы бивалентного антитела hzON72 с первым мономером димера hNKG2D не блокирует связывание второго антитела hzON72 (или второй антиген-свзывающей части того же антитела) со вторым мономером.
В одном воплощении в изобретении описываются человеческие или гуманизированные антитела к NKG2D, которые при добавлении к NK или Т клеткам, экспрессирующим NKG2D, перекрестно сшивают не более чем 2 димера hNKG2D. Предпочтительно такие антитела являются бивалентными. Бивалентное антитело (например, такое как, MS), у которого связывание антиген-связывающей части с единицей мономера NKG2D блокирует дальнейшее связывание со второй единицей мономера NKG2D, может, перекрестно сшивать не более чем 2 димера hNKG2D. Напротив, бивалентное антитело, которое может связывать едиинцу мономера NKG2D с димером hNKG2D без блокирования связывания со второй единицей мономера NKG2D в составе димера hNKG2D, может приводить к перекрестному сшиванию любого количества димеров hNKG2D. Образование кластеров поверхностных рецепторов обычно возникает при активации рецепторов.
В одном воплощении в изобретении описываются человеческие или гуманизированные антитела к NKG2D, которые при добавлении к NK или Т клеткам, экспрессирующим NKG2D, прочно связываются только с одним мономером в составе комплекса димера hNKG2D. Не ограничиваясь какой-либо теорией, прочное связывание с обоими мономерами димера может быть необходимо для активации рецептора NKG2D. MICA и hzON72 прочно связываются с обоими единицами мономера в составе димера hNKG2D. Тем не менее, при связывании MS с димером hNKG2D доминирует связывание с одной из единиц мономера, тогда как связывание со второй единицей мономера является слабым и неспецифичным, с меньшей площадью поверхности, недоступной растворителю, у второго мономера hNKG2D (Пример 11). В отдельных конкретных предпочтительных воплощениях соотношение поверхностей, недоступных растворителю, возникающих у первой и второй единиц мономера NKG2D при связывании антитела по изобретению, превышает 1:1, составляя по меньшей мере приблизительно 2:1, или по меньшей мере приблизительно 3:1.
В одном воплощении в изобретении описываются человеческие или гуманизированные антитела к NKG2D, которые связывают преимущественно тот же самый эпитоп, что и MS. He ограничиваясь какой-либо теорией, взаимодействия лиганда с определенными аминокислотными остатками или комбинациями аминокислотых остатков на поверхности димера hNKG2D может предотвратить или минимизировать активность агониста. В отдельных конкретных воплощениях эпитоп антитела по изобретению содержит по меньшей мере один остаток, по меньшей мере 3 остатка, по меньшей мере 5 остатков, по меньшей мере 8 остатков, по меньшей мере 10 остатков, по меньшей мере 12 остатков или все остатки, выбранные из группы, состоящей из Lys 150, Ser 151, Tyr 152, Thr 180, Ile 181, Ile 182, Glu 183, Met 184, Gln 185, Leu 191, Lys 197, Tyr 199, Glu 201, Thr 205, Pro 206, Asn 207 и Thr 208 в составе hNKG2D (SEQ ID NO:2).
В одном аспекте данного изобретения описывается полностью человеческое антитело или его антиген-связывающий фрагмент, который эффективно препятствует NKG2D-опосредованной цитотоксичности NK или Т клеток, экспрессирующих hNKG2D, конкурирует по меньшей мере с MICA за связывание с hNKG2D; уменьшает количество hNKG2D на клеточной поверхности при связывании, например, способствует снижению уровня hNKG2D, интернализации hNKG2D и/или препятствует появлению hNKG2D заново; имеет аффинность к hNKG2D, равную 10 нМ или менее, перекрестно реагирует с NKG2D яванского макака или макаки-резус; и является неистощающим, например, имеет изотип lgG4. В конкретном воплощении антитело является неистощающим полностью человеческим антителом изотипа lgG4 с аффинностью к hNKG2D, равной 1 нМ или менее, предпочтительно 300 пМ или менее, блокирующим связывание с эндогенными лигандами к hNKG2D по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 90% и снижает количество поверхностного hNKG2D по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 30%, или по меньшей мере на 50%. В другом конкретном воплощении антитело является бивалентным неистощающим полностью человеческим антителом изотипа lgG4 с аффинностью менее 100 пМ, имеющим концентрацию ЕС50 ниже 0,01 нг/мл при блокировании свяывания MICA-Fc в насыщающей концентрации с NKG2D на клеточной поверхности, способно снижать количество NKG2D на клеточной поверхности по меньшей мере на 75% при связывании и, возможно, имеет более низкую концентрацию ЕС50 при подавлении лиганд-индуцированной цитотоксичности NK клеток, чем концентрация ЕС50, требуемая для связывания с поверхностно-связанным NKG2D. В тесте с клетками, экспрессирующими NKG2D, антитело может также быть способно достигать максимально выраженного снижения уровня hNKG2D при концентрации меньшей, чем та, что требуется для достижения насыщения рецепторов hNKG2D (т.е. насыщающей концентрации).
Продукция, характеризация и применение антител, специфически связывающихся с hNKG2D и обладающих некоторыми или всеми из перечисленных свойств, более подробно описаны в следующих ниже разделах, включая Примеры.
Антитела к NKG2D
Антитела по изобретению характеризуются определенными функциональными и/или структурными чертами или свойствами. Тесты для оценки функциональной активности анти-hNKG2D антител подробно описаны в Примерах, а структурные характеристики, например, такие как аминокислотные последовательности, описаны ниже.
Функциональные свойства
-7
-8
Антитела по изобретению связываются с hNKG2D. В одном воплощении антитело по изобретению связывается с hNKG2D с высокой аффинностью, например, с KD 10 М или менее, с KD 10 М или менее, с KD 1 нМ или менее, с KD 0,3 нМ или менее, с KD 0,2 нМ или менее, 0,1 нМ или менее, 0,05 нМ или менее, или 0,01 нМ или менее. В конкретном воплощении антитело связывается с hNKG2D с аффинностью 0,1 нМ или менее.
В одном аспекте изобретения описываются антитела также связывающиеся с одним или более ортологом NKG2D обезьян, таких как яванский макак (Масаса fascicularis, NCBI код No. AJ426429) и макака резус {Масаса mulatta, NCBI код No. AJ554302), и/или с гомодимером hNKG2D, правильно свернутым полноразмерным мономером hNKG2D, фрагментом hNKG2D, содержащим внеклеточную часть hNKG2D, денатурированным hNKG2D или с любой комбинацией вышеупомянутых форм NKG2D. Например, как показано в Примере 5, уровень связывания человеческих антител 21F2 и MS с определенными типами клеток яванского макака составлял более чем приблизительно 65% и приблизительно 75%, соответственно, от их связывания с теми же типами клеток человека, в расчете на соответствующие значения ЕС50 (т.е. средней эффективной концентрации). Соответственно, в одном воплощении антитело по изобретению связывается с NKG2D яванского макака и/или макаки резус с одинаковой аффинностью или эффективностью, как и при связывании с hNKG2D. Например, антитело может связываться с экспрессирующими NKG2D NK или Т клетками яванского макака или макаки резус с ЕС50, равной приблизительно 50% или более, приблизительно 65% или более, или приблизительно 75% или более от соответствующей ЕС50 для соответствующей популяции экспрессирующих NKG2D NK или Т клеток человека. Дополнительно или альтернативно, антитело может связываться с NKG2D яванского макака или макаки резус с аффинностью приблизительно 30% или выше, приблизительно 50% или выше, приблизительно 65% или выше, или приблизительно 75% или выше, приблизительно 80% или выше, приблизительно 85% или выше, или приблизительно 90% или выше от соответствующей аффинности к hNKG2D. Такие антитела имеют преимущество в том, что позволяют изучать цитотоксичность в наиболее подходящей модели (моделях) на животных перед применением у человека.
В одном конкретном аспекте антитела по изобретению также связываются с формой NKG2D, с которой не связываются известные антитела грызунов к hNKG2D, такие как ON72. В частности, как описано в Примере 3, предварительная инкубация с ON72 блокировала связывание hNKG2D с добавляемым впоследствии человеческим антителом 16F16 только приблизительно на 82%, тогда как предварительная инкубация с 16F16 блокировала связывание hNKG2D с добавляемым впоследствии ON72 приблизительно на 95%.
Кроме того, антитела по изобретению могут снижать или ингибировать hNKG2D-опосредованную активацию NK или Т клеток, т.е. быть антагонистами рецептора hNKG2D. Это может быть проверено, например, в одном или более цитотоксических тестов, описываемых здесь или известных в области техники. Например, антитело ингибирует hNKG2D-опосредованную активацию NK или Т клеток, если оно ингибирует опосредованную NK или Т клетками гибель клеток-мишеней, экспрессирующих лиганды NKG2D, по меньшей мере на 10%, более предпочтительно по меньшей мере на 30%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90%, по сравнению с гибелью клеток-мишеней в отсутствие какого-либо антитела к hNKG2D или в присутствии неспецифичного антитела, служащего контролем.
Антитела по изобретению, являющиеся антагонистами hNKG2D, могут иметь низкую активность как агонисты или не иметь ее. Предпочтительно, такие антитела являются человеческими или гуманизированными. Активность как агониста может быть проверена в одном из тестов, описываемых здесь, или в тесте, известном в области техники. Например, один вид теста представляет собой тест костимуляции, в котором измеряется пролиферация лимфоцитов периферической крови (МКПК), стимулированных низкими концентрациями CD3 в присутствии или отсутствии иммобилизованных антител к NKG2D (см. Пример 10). В таком тесте пролиферация в отсутствие антител по изобретению не превышает 30%, не превышает 20%, не превышает 10%, не превышает 5% или не является значимо большей, чем в отсутствие антитела. Предпочтительно пролиферациия в присутствии антитела по изобретению не является значимо большей, чем в отсутствие антитела. В другом или альтернативном воплощении, активность как агониста hNKG2D у антитела по изобретению в тесте не превышает 30%, не превышает 20%, не превышает 10%, не превышает 5% или не является значимо большей по сравнению с контрольными значениями. Контролем является предпочтительно отрицательный контроль, такой как, например, без добавления антитела, без добавления клеток или других реагентов, и/или в присутствии нерелевантного антитела. Предпочтительно, активность антитела по изобретению как агониста не является значимо большей по сравнению с контрольными значениями.
В другом аспекте изобретения описываются антитела, имеющие более низкую, предпочтительно существенно более низкую концентрацию ЕС50 при блокировании лиганд-индуцированной цитотоксичности, чем при связывании с NKG2D на поверхности NK или Т клеток. Например, для ON72, концентрация ЕС50 при связывании с NKG2D, экспрессируемым на поверхности BaF/3 клеток (0,062 мкг/мл), была такой же, как концентрация ЕС50 при блокировании опосредованной NK-клетками гибели клеток-мишеней, экспрессирующих лиганд (ULBP3-) (0,065 мкг/мл), тогда как 21F2 обладало более низкой, a MS - существенно более низкой ЕС50 при подавлении цитотоксичного эффекта (21F2: 0,021 мкг/мл; MS: 0,012 мкг/мл), чем при связывании с поверхностным NKG2D (21F2: 0,033 мкг/мл; MS: 0,032 г/мл) (см. Примеры 6 и 9). Кроме того, максимальное подавление цитотоксического эффекта для MS достигалось при более низких концентрациях (концентрация, соответствующая приблизительно только 80% от насыщающей для поверхностных рецепторов NKG2D, Фигура 3), чем для 21F2 и 16F16 (у которых концентрации соответствовали насыщающим концентрациям или превышали их, Фигура 3). Так, в одном воплощении изобретения описываются антитела, предпочтительно человеческие или гуманизированные, имеющие более низкую концентрацию ЕС50 при блокировании лиганд-индуцированной цитотоксичности, чем при связывании с NKG2D на поверхности NK или Т клеток. ЕС50 при блокировании цитотоксичности NK или Т клеток у клеточной линии или другом подходящем препарате может составлять, например, около 95% или менее, около 90% или менее, около 85% или менее, около 80% или менее, около 70% или менее, около 50% или менее, или около 40% или менее от ЕС50 при связывании с поверхностным NKG2D для той же клеточной линии или препарата. Примеры клеточных линий для тестирования включают клетки NK-92 и NKL.
В другом воплощении изобретения описываются антитела, обеспечивающие максимальное подавление цитотоксичности NK клеток при более низкой концентрации по сравнению с концентрацией, необходимой для насыщения доступных рецепторов hNKG2D. В конкретном воплощении антитела также конкурируют с MS за связывание с hNKG2D. В другом конкретном воплощении такие антитела связываются по существу с тем же эпитопом hNKG2D, что и MS.
Антитела могут снижать или ингибировать опосредованную NKG2D активацию, например, за счет препятствования связыванию hNKG2D с одним или более эндогенными лигандами к hNKG2D. Например, антитела могут понижать или ингибировать связывание hNKG2D с MICA; MICB; ULBP1; ULBP2; ULBP4; и/или представителями семейства RAET1; например, за счет понижения или ингибирования связывания hNKG2D с MICA; или с MICA и MICB; или с MICA и ULBP3; или с MICA, MICB и ULBP3; или с MICA, MICB и всеми ULBP1, -2, -3 и 4; или с MICA, MICB и одним или более представителем семейства RAET1. Способность антитела ингибировать связывание hNKG2D с эндогенными лигандами NKG2D можно оценить при помощи теста связывания или конкурентного теста, описываемого здесь. В одном воплощении антитела по изобретению способны ингибировать связывание лигандов по меньшей мере на 30%, или по меньшей мере на 50%, или по меньшей мере на 70%, или или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%. В другом воплощении IC50 для антитела по изобретению при ингибировании связывания hNKG2D с 1 мкг MICA-mFc составляет 1 нМ или менее, 0,5 нМ или менее, 0,2 нМ или менее, 0,1 нМ или менее, 0,05 нМ или менее или 0,02 нМ или менее, 0,01 нМ или менее, 0,005 или менее или 0,002 или менее. В другом воплощении полное блокирование связывания с 1 мкг MICA-mFc достигается при концентрации антитела 5 нМ или менее, 1 нМ или менее, 0,7 нМ или менее, 0,5 нМ или менее или 0,2 нМ или менее, 0,1 нМ или менее, 0,05 нМ или менее или приблизительно 0,02 нМ или менее. В одном воплощении изобретения описываются антитела, особенно человеческие антитела, являющиеся настолько же эффективными или более эффективными при подавлении или ингибировании связывания с лигандами hNKG2D, например, связывания MICA с hNKG2D, по сравнению с любым из антител ON72, ВАТ221, 5С6, 1D11, ЕСМ217 и 149810.
Дополнительно или альтернативно, анти-hNKG2D антитело по изобретению может быть способно снижать количество поверхностного hNKG2D при связывании (т.е. после связывания). Сокращение количества ассоциированного с поверхностью hNKG2D при связывании антитела может быть преимуществом, поскольку это приводит к уменьшению количества рецепторов hNKG2D, доступных для связывания с лигандами и последующей активации. Не ограничиваясь какой-либо теорией, такое сокращение может быть вызвано ингибированием NKG2D, интернализацией или другим механизмом. Как здесь показано, анти-hNKG2D антитела, имеющие фрагмент Fc человека, такие как человеческие антитела, способны эффективно сокращать количество поверхностного hNKG2D. Например, человеческие антитела к hNKG2D - 16F16, MS и 21F2, все снижали количество hNKG2D на клеточной поверхности приблизительно на 75% или более после инкубации в течение ночи в отсутствие сыворотки, при этом MS оказалось наиболее эффективным, вызывая снижение на 75-90% при низкой концентрации (Фигуры 15-17). Кроме того, в присутствии сыворотки концентрация MS, соответствующая концентрации меньшей, чем насыщающая, вызывала максимальное снижение уровня hNKG2D на поверхности экспрессирующих его клеток BaF/3 (Фигура 16Б). Соответственно, в одном воплощении изобретения описываются антитела, связывающиеся с hNKG2D, способные вызывать максимальное снижение уровня hNKG2D при концентрациях меньших, чем насыщающие. В другом воплощении такие антитела также конкурируют с MS за связывание с hNKG2D. В другом воплощении такие антитела также связываются практически с тем же эпитопом hNKG2D, что и MS. Антитело по изобретению может быть способно снижать количество hNKG2D на клеточной поверхности по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 70% или по меньшей мере на 90% по сравнению с количеством hNKG2D на клеточной поверхности в отсутствие антител к hNKG2D или в присутствии неспецифического контрольного антитела. Предпочтительно, антитела вызывают уменьшение количества NKG2D на клеточной поверхности, не активируя или вызывая минимальную активацию передачи сигналов рецептором NKG2D, т.е. обладают минимальной активностью как агонисты или не обладают ей. Здесь описываются примеры тестов для оценки hNKG2D на клеточной поверхности и активности анти-hNKG2D антител как агонистов. В одном воплощении изобретения описываются антитела, в частности, антитела человека, которые способны на ингибирование в большей степени, чем контрольное антитело, выбранное из ON72, ВАТ221, 5С6, 1D11, ЕСМ217 и 149810. В другом воплощении aHTH-hNKG2D антитело по изобретению может быть способно вызывать максимальное снижение количества NKG2D, экспрессируемого на поверхности клеток или клеточных линий, при концентрациях более низких по сравнению с насыщающей концентрацией.
В другом воплощении изобретения описываются антитела, которые конкурируют и/или связываются с тем же эпитопом на hNKG2D, что и 16F16, 16F31, MS и/или 21F2, более предпочтительно MS и/или 21F2. Такие антитела могут быть идентифицированы на основании их способности взаимно конкурировать с 16F16, 16F31, MS или 21F2 в стандартных тестах связывания hNKG2D, согласно данному описанию. Способность тестируемого антитела ингибировать связывание 16F16, 16F31, MS или 21F2 с hNKG2D показывает, что тестируемое антитело может конкурировать с 16F16, 16F31, MS или 21F2 за связывание с hNKG2D и, таким образом, может связываться с тем же эпитопом на hNKG2D, что и 16F16, 16F31, MS или 21F2. В предпочтительном воплощении антитело, которое связывается с тем же самым эпитопом на hNKG2D, что и 16F16, 16F31, MS или 21F2, представляет собой моноклональное антитело человека. Такие моноклональные антитела человека могут быть произведены и выделены согласно описанию, приведенному в Примерах.
В другом предпочтительном воплощении антитело связывается с эпитопом, отличным от того, который используется любым из моноклональных мышиных антител ON72, ВАТ221, 5С6, 1D11, ЕСМ217 и 149810, и взаимно конкурирует в большей степени с 16F16, 16F31, MS или 21F2, чем с любым из перечисленных мышиных моноклональных антител.
В одном воплощении эпитоп антитела по изобретению содержит один или более аминокислотных остатков, выбранных из Lys 150, Ser 151, Tyr 152, Thr 180, Ile 181, Ile 182, Glu 183, Met 184, Gln 185, Leu 191, Lys 197, Tyr 199, Glu 201, Thr 205, Pro 206, Asn 207 и Thr 208 из hNKG2D (SEQ ID NO:2). В одном воплощении эпитоп антитела по изобретению содержит 5 или более аминокислотных остатков, выбранных из Lys 150, Ser 151, Tyr 152, Thr 180, Ile 181, Ile 182, Glu 183, Met 184, Gln 185, Leu 191, Lys 197, Tyr 199, Glu 201, Thr 205, Pro 206, Asn 207 и Thr 208 из hNKG2D (SEQ ID NO:2). В одном воплощении эпитоп антитела по изобретению содержит 8, 10, 12 или более аминокислотных остатков, выбранных из Lys 150, Ser 151, Tyr 152, Thr 180, Ile 181, Ile 182, Glu 183, Met 184, Gln 185, Leu 191, Lys 197, Tyr 199, Glu 201, Thr 205, Pro 206, Asn 207 и Thr 208 из hNKG2D (SEQ ID NO:2). В одном воплощении эпитоп антитела по изобретению содержит аминокислотные остатки Lys 150, Ser 151, Tyr 152, Thr 180, Ile 181, Ile 182, Glu 183, Met 184, Gln 185, Leu 191, Lys 197, Tyr 199, Glu 201, Thr 205, Pro 206, Asn 207 и Thr 208 из hNKG2D (SEQ ID NO:2). В одном воплощении эпитоп антитела по изобретению состоит преимущественно из остатков Lys 150, Ser 151, Tyr 152, Thr 180, Ile 181, Ile 182, Glu 183, Met 184, Gln 185, Leu 191, Lys 197, Tyr 199, Glu 201, Thr 205, Pro 206, Asn 207 и Thr 208 из hNKG2D (SEQ ID NO:2). В одном воплощении эпитоп антитела по изобретению состоит из одного или более остатков, выбранных из Lys 150, Ser 151, Tyr 152, Thr 180, Ile 181, Ile 182, Glu 183, Met 184, Gln 185, Leu 191, Lys 197, Tyr 199, Glu 201, Thr 205, Pro 206, Asn 207 и Thr 208 из hNKG2D (SEQ ID NO:2). В одном воплощении эпитоп антитела по изобретению состоит из остатков Lys 150, Ser 151, Tyr 152, Thr 180, Ile 181, Ile 182, Glu 183, Met 184, Gln 185, Leu 191, Lys 197, Tyr 199, Glu 201, Thr 205, Pro 206, Asn 207 и Thr 208 из hNKG2D (SEQ ID NO:2).
В одном воплощении эпитоп антитела по изобретению содержит один или более аминокислотных остатков, задействованных в образовании водородных связей, выбранных из Lys 150, Ser 151, Tyr 152, Ile 181, Met 184, Gln 185, Lys 197, Thr 205 и Asn 207 из hNKG2D (SEQ ID NO:2). В одном воплощении эпитоп антитела по изобретению содержит 5 или более аминокислотных остатков, задействованных в образовании водородных связей, выбранных из Lys 150, Ser 151, Tyr 152, Ile 181, Met 184, Gln 185, Lys 197, Thr 205 и Asn 207 из hNKG2D (SEQ ID NO:2). В одном воплощении эпитоп антитела по изобретению содержит Lys 150, Ser 151, Tyr 152, Ile 181, Met 184, Gln 185, Lys 197, Thr 205 и Asn 207 из hNKG2D (SEQ ID NO:2).
Предпочтительные антитела по изобретению проявляют по меньшей мере одно, более предпочтительно, два, три, четыре, пять или более из следующих свойств: (а) предотвращает NKG2D-опосредованную активацию NK или Т клеток, экспрессирующих NKG2D, возможно с ЕС50 при подавлении лиганд-индуцированной цитотоксичности меньшей, чем ЕС50 при связывании с клетками; (б) конкурирует по меньшей мере с одним лигандом NKG2D за связывание с NKG2D, предпочтительно, по меньшей мере с MICA и ULBP3; (в) снижает количество NKG2D на поверхности NK или Т клеток, экспрессирующих NKG2D, предпочтительно по меньшей мере на 75%; (г) связывается с NKG2D яванского макака или макаки резус, предпочтительно с аффинностью не менее чем 50% от аффинности, с которой оно связывается с hNKG2D; (д) связывается более чем с одной формой или конформацией NKG2D; (е) связывается с NKG2D с Kd, равной 1 нМ или менее, предпочтительно 0,1 нМ или менее; (ж) конкурирует с одним или более антител из 16F16, 16F31, MS или 21F2 за связывание с hNKG2D, (з) конкурирует в большей степени с 16F16, 16F31, MS или 21F2, чем с любым из антител ON72, ВАТ221, 5С6, 1D11, ЕСМ217 и 149810 за связывание с hNKG2D; (и) подавляет связывание 16F16, MS или 21F2 с hNKG2D на клеточной поверхности более чем на 90%; (к) обладает незначительной активностью в как агонист и (л) связывается практически с тем же эпитопом, что и любое из антител 16F16, 16F31, MS и/или 21F2, предпочтительно, практически с тем же эпитопом, что и MS и/или 21F2. Любое сочетание описанных выше функциональных характеристик и/или функциональные характеристики, описываемые в Примерах, могут быть присущи антителу по изобретению.
Структурные характеристики
Предпочтительные антитела по изобретению являются моноклональными человеческими антителами 16F16, 16F31, MS и 21F2, полученными, выделенными и структурно и функционально охарактеризованными согласно описанию в Примерах.
Полноразмерные последовательности, последовательности вариабельных участков и CDR этих антител приведены в Таблице 1.
Таблица 1
Полноразмерные аминокислотные последовательности, последовательности вариабельных участков и CDR антител 16F16, 16F31, MS и 21F2
Часть антитела
SEQ ID NO:
Часть антитела
SEQ ID NO:
16F16 lgG4 Н цепь
7
MS lgG4 H цепь
40
16F16 L цепь
8
MS L цепь
41
16F31 lgG4 Н цепь
9
21F2 lgG4 Н цепь
42
16F16 L цепь
10
21F2 L цепь
43
16F16 участок VH
11
MS участок VH
44
16F16 участок VL
12
MS участок VL
45
16F31 участок VH
13
21F2 участок VH
46
16F31 участок VL
14
21 F2 участок VL
47
16F16 VH CDR1
15
MS VH CDR1
48
16F16 VH CDR2
16
MS VH CDR2
49
16F16 VH CDR3
17
MS VH CDR3
50
16F16 VL CDR1
18
MS VL CDR1
51
16F16 VL CDR2
19
MS VL CDR2
52
16F16 VL CDR3
20
MS VL CDR3
53
16F31 VH CDR1
21
21F2 VH CDR1
54
16F31 VH CDR2
22
21F2 VH CDR2
55
16F31 VH CDR3
23
21F2 VH CDR3
56
16F31 VL CDR1
24
21 F2 VL CDR1
57
16F31 VL CDR2
25
21F2 VL CDR2
58
16F31 VL CDR3
26
21F2 VL CDR3
59
Определенные анти-NKG2D антитела по изобретению имеют такой же или аналогичный паратоп, как MS. В одном воплощении антитело имеет паратоп, содержащий аминокислотные остатки, соответствующие одному или более из остатков Tyr 33 и Trp 97 в L цепи MS (SEQ ID NO:41), и/или одному или более из остатков Gln 1, Asp 26, Asp 27, Ser 30, Ser 31, Tyr 32, Tyr 33, His 50, Ser 52, Tyr 53, Ser 54, Ser 56, Ala 57, Asn 58, Trp 98 и Asp 99 в H цепи MS (SEQ ID NO:40). В одном воплощении антитело имеет паратоп, содержащий аминокислотные остатки, соответствующие Tyr 33 and Trp 97 в L цепи MS (SEQ ID NO:41), и/или 3, 5, 7, 10 или более остатков Gln 1, Asp 26, Asp 27, Ser 30, Ser 31, Tyr 32, Tyr 33, His 50, Ser 52, Tyr 53, Ser 54, Ser 56, Ala 57, Asn 58, Trp 98 и Asp 99 в Н цепи MS (SEQ ID NO:40). В одном воплощении антитело имеет паратоп, содержащий аминокислотные остатки, соответствующие Tyr 33 и Trp 97 в L цепи MS (SEQ ID NO:41), и Gln 1, Asp 26, Asp 27, Ser 30, Ser 31, Tyr 32, Tyr 33, His 50, Ser 52, Tyr 53, Ser 54, Ser 56, Ala 57, Asn 58, Trp 98 и Asp 99 в Н цепи MS (SEQ ID NO:40). В одном воплощении антитело имеет паратоп, состоящий преимущественно из аминокислотных остатков, соответствующих Tyr 33 и Trp 97 в L цепи MS (SEQ ID NO:41), и Gln 1, Asp 26, Asp 27, Ser 30, Ser 31, Tyr 32, Tyr 33, His 50, Ser 52, Tyr 53, Ser 54, Ser 56, Ala 57, Asn 58, Trp 98 и Asp 99 в Н цепи MS (SEQ ID NO:40). В одном воплощении антитело имеет паратоп, состоящий из аминокислотных остатков, соответствующих Tyr 33 и Trp 97 в L цепи MS (SEQ ID NO:41), и Gln 1, Asp 26, Asp 27, Ser 30, Ser 31, Tyr 32, Tyr 33, His 50, Ser 52, Tyr 53, Ser 54, Ser 56, Ala 57, Asn 58, Trp 98 и Asp 99 в Н цепи MS (SEQ ID NO:40).
Учитывая, что все антитела 16F16, 16F31, 21F2 и MS могут связываться с hNKG2D, может оказаться возможным "скомбинировать" соответствующие последовательности VH и VL этих антител с целью создания других молекул, связывающихся с hNKG2D, согласно изобретению. Связывание с hNKG2D у таких комбинированных антител может быть исследовано с помощью описанных здесь тестов связывания (например, проточной цитометрии, системы Biacore, ИФА) и/или с помощью цитотоксического теста, согласно данному описанию. Предпочтительно, чтобы при комбинировании цепей VH и VL, последовательность VH из конкретной пары VH/VL была заменена на похожую по структуре последовательность VH. Также, предпочтительно, чтобы последовательность VL из конкретной пары VH/VL была заменена на похожую по структуре последовательность VL.
Соответственно, в одном аспекте изобретения описано выделенное моноклональное антитело или его антиген-связывающая часть, содержащая: (а) участок VH, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NOS: 11, 13, 44 и 46, и (б) участок VL, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NOs:12, 14, 45 и 47; и антитело связывается с hNKG2D. Предпочтительные комбинации легких и тяжелых цепей включают: (а) участок VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11; и (б) вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12; (а) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13; и (б) вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14; (а) участок VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:44; и (б) вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:46; или (а) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:45; и (б) вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:47.
В другом аспекте изобретения описаны антитела, содержащие участки CDR1, CDR2 и/или CDR3 тяжелой цепи и легкой цепи 16F16, 16F31, MS или 21F2, или их комбинации. Участки CDR описаны согласно системе Kabat (Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). См., например, Фигуры 4 и 5. Учитывая, что каждое из этих антител может также связываться с hNKG2D и что специфичность связывания антигена обусловлена прежде всего участками CDR1, 2 и 3, последовательности VH CDR1, 2 и 3 и последовательности VL CDR1, 2 и 3 могут быть "комбинированы" (т.е. участки CDR из различных антител могут быть комбинированы, несмотря на то, что каждое антитело может содержать VH CDR1, 2 и 3 и VL CDR1, 2 и 3) для создания других связывающих hNKG2D молекул по изобретению. Связывание hNKG2D у таких "комбинированных " антител может быть исследовано с помощью тестов связывания, описанных выше и в Примерах (например, проточной цитометрии, Biacore, или ИФА). Предпочтительно, чтобы при комбинировании последовательностей VH CDR, последовательность CDR1, CDR2 и/или CDR3 конкретной последовательности VH была заменена на похожую по структуре последовательность (последовательности) CDR. Также, при комбинировании последовательностей VL CDR, предпочтительно, чтобы последовательность CDR1, CDR2 и/или CDR3 конкретной последовательности VL была заменена на похожую по структуре последовательность (последовательности) CDR. Например, последовательности VL CDR1 и CDR3 у 16F16, 16F31, MS и 21F2 и последовательности VL CDR2 у MS и 21F2 обладают некоторым сходством структуры и, таким образом, являются легко поддающимися комбинированию. Специалисту в данной области техники очевидно, что новые последовательности VH и VL могут быть созданы путем замены одной или более последовательностей участков CDR цепей VH и/или VL на похожие по структуре последовательности из последовательностей CDR, описанных здесь для моноклональных антител 16F16, 16F31, MS и 21F2.
Соответственно, в другом аспекте изобретения предлагается выделенное моноклональное антитело или его антиген-связывающая часть, содержащая: (a) VH CDR1, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NOs:15, 21, 48 и 54; (6) VH CDR2, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NOs:16, 22, 49 и 55; (в) VH CDR3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NOs:17, 23, 50 и 56; (г) VL CDR1, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NOs:18, 24, 51 и 57; (д) VL CDR2, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NOs:19, 25, 52 и 57; и (е) VL CDR3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NOs:20, 26, 53 и 59; и антитело связывается с hNKG2D.
В предпочтительном воплощении антитело содержит: (а) VH CDR1, содержащий SEQ ID NO:15; (б) VH CDR2, содержащий SEQ ID NO:16; (в) VH CDR3, содержащий SEQ ID NO:17; (г) VL CDR1, содержащий SEQ ID NO:18; (д) VL CDR2, содержащий SEQ ID NO:19; и (е) VL CDR3, содержащий SEQ ID NO:20.
В другом предпочтительном воплощении антитело содержит: (а) VH CDR1, содержащий SEQ ID NO:21; (б) VH CDR2, содержащий SEQ ID NO:22; (в) VH CDR3, содержащий SEQ ID NO:23; (г) участок VL CDR1, содержащий SEQ ID NO:24; (д) VL CDR2, содержащий SEQ ID NO:25; и (е) VL CDR3, содержащий SEQ ID NO:26.
В другом предпочтительном воплощении антитело содержит: (а) VH CDR1, содержащий SEQ ID NO:48; (б) VH CDR2, содержащий SEQ ID NO:49; (в) VH CDR3, содержащий SEQ ID NO:50; (г) участок VL CDR1, содержащий SEQ ID NO:51; (д) VL CDR2, содержащий SEQ ID NO:52; и (е) VL CDR3, содержащий SEQ ID NO:53.
В другом предпочтительном воплощении антитело содержит: (а) VH CDR1, содержащий SEQ ID NO:54; (б) VH CDR2, содержащий SEQ ID NO:55; (в) VH CDR3, содержащий SEQ ID NO:56; (г) участок VL CDR1, содержащий SEQ ID NO:57; (д) VL CDR2, содержащий SEQ ID NO:58; и (е) VL CDR3, содержащий SEQ ID NO:59.
В другом предпочтительном воплощении антитело содержит: (а) VH CDR1 consisting of SEQ ID NO:15; (6) VH CDR2 состоящий из SEQ ID NO:16; (в) а VH CDR3 consisting of SEQ ID NO:17; (г) VL CDR1 состоящий из SEQ ID NO:18; (д) VL CDR2 consisting of SEQ ID NO:19; и (е) VL CDR3 состоящий из SEQ ID NO:20.
В другом предпочтительном воплощении антитело содержит: (a) VH CDR1, состоящий из SEQ ID NO:21; (б) VH CDR2, состоящий из SEQ ID NO:22; (в) VH CDR3, состоящий из SEQ ID NO:23; (г) участок VL CDR1, состоящий из SEQ ID NO:24; (д) VL CDR2, состоящий из SEQ ID NO:25; и (е) VL CDR3, состоящий из SEQ ID NO:26.
В другом предпочтительном воплощении антитело содержит: (а) VH CDR1, состоящий из SEQ ID NO:48; (б) VH CDR2, состоящий из SEQ ID NO:49; (в) VH CDR3, состоящий из SEQ ID NO:50; (г) участок VL CDR1, состоящий из SEQ ID NO:51; (д) VL CDR2, состоящий из SEQ ID NO:52; и (е) VL CDR3, состоящий из SEQ ID NO:53.
В другом предпочтительном воплощении антитело содержит: (а) VH CDR1, состоящий из SEQ ID NO:48; (б) VH CDR2, состоящий из SEQ ID NO:49; (в) VH CDR3, состоящий из SEQ ID NO:50; (г) участок VL CDR1, состоящий из SEQ ID NO:51; (д) VL CDR2, состоящий из SEQ ID NO:52; и (е) VL CDR3, состоящий из SEQ ID NO:53,и аминокислотные сотатки, соответствующие одному, двум или всем из Gln 1, Asp 26 и Asp 27 в Н цепи MS (SEQ ID NO:40).
В другом предпочтительном воплощении антитело содержит: (а) VH CDR1, состоящий из SEQ ID NO:54; (б) VH CDR2, состоящий из SEQ ID NO:55; (в) VH CDR3, состоящий из SEQ ID NO:56; (г) участок VL CDR1, состоящий из SEQ ID NO:57; (д) VL CDR2, состоящий из SEQ ID NO:58; и (е) VL CDR3, состоящий из SEQ ID NO:59.
В конкретных воплощениях антитело по изобретению содержит участок VH из определенного гена зародышевой линии Н цепи иммуноглобулина или сочетания определенных генов зародышевой линии Н цепи иммуноглобулинов; и/или участок VL из определенного гена зародышевой линии L цепи иммуноглобулина или сочетания определенных генов зародышевой линии L цепи иммуноглобулинов. Такие сочетания могут быть получены, например, in vivo посредством соматических рекомбинаций В клеток.
Например, в одном воплощении изобретения описывается выделенное антитело к hNKG2D или его антиген-связывающий фрагмент, причем антитело: (а) содержит участок VH из генов VH3_21, VH3_20, VH4_59 или VH5_51 человека, рекомбинированных с геном D3-9, D3-10 или D3_10_R3 человека и геном JH3, JH4 или JH6, (б) содержит участок VL, полученный на основе гена VKI L15 или VKIII A27 или VKIII_L6 человека, рекомбинированного с геном JK1, JK2 или JK3 человека, и (в) антитело связывается с hNKG2D.
В другом воплощении изобретения описывается выделенное антитело к hNKG2D или его антиген-связывающий фрагмент, содержащие участок VH, полученный при рекомбинации генов VH3_21, D3-9 и JH4 человека и участок VL, полученный при рекомбинации генов VKI_L15 и JK2 человека.
В другом воплощении изобретения описывается выделенное антитело к hNKG2D или его антиген-связывающий фрагмент, содержащие участок VH, полученный при рекомбинации генов VH3_20, D3-10 и JH6 человека и участок VL, полученный при рекомбинации генов VKIII_A27 и JK3 человека.
В другом воплощении изобретения описывается выделенное антитело к hNKG2D или его антиген-связывающий фрагмент, содержащие участок VH, полученный при рекомбинации гена VH4_59, гена D и гена JH3 человека и участок VL, полученный при рекомбинации генов VKIII_A27 и JK1 человека.
В другом воплощении изобретения описывается выделенное антитело к hNKG2D или его антиген-связывающий фрагмент, содержащие участок VH, полученный при рекомбинации генов VH5_51, D3_10_R3 и JH4 человека и участок VL, полученный при рекомбинации генов VKIII_L6 и JK1 человека.
В отдельных конкретных воплощениях изобретения описываются выделенные антитела к NKG2D, полученные путем введения одной, двух, трех, четырех или более замен аминокислотных остатков и/или соматических гипермутаций в VH и/или VL участках антитела к hNKG2D, описанного выше.
Согласно данному описанию, антитело человека содержит вариабельные участки тяжелой или легкой цепи "из" или "полученные на основе" или являющиеся "продуктом" определенной последовательности зародышевой линии, если вариабельные участки антитела получены в системе (согласно описанию ниже), в которой используются гены зародышевой линии иммуноглобулинов человека. Такие "системы" включают иммунизацию трансгенных мышей, несущих гены иммуноглобулинов человека с помощью антигена, представляющего интерес, или скрининг библиотеки генов иммуноглобулинов человека, представленной в составе фага, при помощи антигена, представляющего интерес. Антитело человека "из" или "полученное на основе" или "являющееся продуктом" последовательности зародышевой линии иммуноглобулинов человека может быть идентифицировано в качестве такового путем сравнения аминокислотной последовательности антитела человека с аминокислотными последовательностями зародышевой линии иммуноглобулинов человека и выбора последовательности зародышевой линии иммуноглобулинов человека, являющейся наиболее близкой (т.е. имеющей наибольший % идентичности) к последовательности антитела человека. Антитело человека "из" или "полученное на основе" или "являющееся продуктом" определенной последовательности зародышевой линии иммуноглобулина человека может иметь различия в аминокислотах по сравнению с последовательностью зародышевой линии, например, из-за естественным образом возникающих соматических мутаций или намеренного введения сайт-специфических мутаций (которые могут быть направленными заменами).
Однако, антитело человека, как правило, по меньшей мере на 90% идентично по аминокислотной последовательности аминокислотной последовательности, кодируемой рекомбинированной последовательностью зародышевой линии иммуноглобулина и, как правило, может быть иденитифицировано как человеческое при сравнении с аминокислотными последовательностями зародышевых линий иммуноглобулинов других видов (например, последовательностями зародышевых линий грызунов). В определенных случаях антитело человека может быть по меньшей мере на 95%, или даже по меньшей мере на 96%, 97%, 98% или 99% идентично в своей аминокислотной последовательности аминокислотной последовательности, кодируемой рекомбинированным геном зародышевой линии иммуноглобулина.
Как правило, антитело человека, произведенное на основе конкретной последовательности зародышевой линии человека будет иметь отличия не более чем по 10 аминокислотам по сравнению с аминокислотной последовательностью, кодируемой геном зародышевой линии иммуноглобулина человека. В определенных случаях антитело человека может иметь отличия не более чем по 8, не более чем по 5, или даже не более чем по 4, 3, 2 или 1 аминокислоте, или не иметь отличий по аминокислотам по сравнению с аминокислотной последовательностью, кодируемой рекомбинированным геном зародышевой линии иммуноглобулина.
В следующем воплощении антитело по изобретению содержит вариабельные участки тяжелой и легкой цепи, содержащие аминокислотные последовательности гомологичные аминокислотным последовательностям предпочтительных антител, описанных здесь, причем антитела сохраняют описанные функциональные свойства анти-ПМК020 антител по изобретению. Например, изобретение описывает выделенное антитело или его антиген-связывающую часть, содержащие вариабельный участок тяжелой цепи и вариабельный участок легкой цепи, где: (а) участок VH содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs:11, 13, 44 и 46; (б) участок VL содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs:12, 14, 45 и 47; (в) антитело связывается с hNKG2D и проявляет по меньшей мере одно из описанных здесь функциональных свойств, предпочтительно несколько из описанных здесь функциональных свойств.
В других воплощениях аминокислотные последовательности VH и/или VL могут быть на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны последовательностям, приведенным выше. Антитело, имеющее участки VH и VL, обладающие высокой (т.е. 80% или выше) идентичностью с участками VH и VL последовательностей, приведенных выше, могут быть получены при помощи мутагенеза (например, сайт-специфического или ПЦР-опосредованного мутагенеза) молекул нуклеиновых кислот, кодирующих SEQ ID NOs:11-14 или 44-47, с последующим тестированием кодируемого измененного антитела на сохранность функциональных свойств (например, аффинность связывания с hNKG2D, блокирование лигандов к hNKG2D, уменьшение количества hNKG2D или подавление NKG2D-опосредованной активации NK или Т клеток) с применением функциональных тестов, описанных здесь.
Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией от числа идентичных позиций, присутствующих в сравниваемых последовательностях (т.е. % идентичности = кол-во идентичных позиций/общее кол-во позиций × 100), с учетом количества гэпов и длины каждого гэпа, которые необходимо ввести для оптимального выравнивания двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями может выполняться с применением математического алгоритма в программном обеспечении для анализа последовательностей. Программное обеспечение для анализа белков определяет соответствие схожих последовательностей с применением мер сходства, приписываемых различным заменам, делециям и другим модификациям, включая консервативные замены аминокислот.
Процент идентичности между аминокислотными последовательностями может быть определен, например, с применением алгоритма Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)), встроенного в программу GAP в программном обеспечении GCG (http://www.gcg.com), с применением либо матрицы Blossum 62 либо матрицы РАМ250, а также показателей веса гэпа, равными 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и веса его удлинения, равными 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
Полипептидные последовательности можно также сравнивать при помощи FASTA, применяя параметры по умолчанию или рекомендуемые параметры. Программа FASTA в GCG Версии 6.1 (например, FASTA2 и FASTA3) позволяет проводить выравнивание и определять процент идентичности между последовательностями в участках с наилучшим перекрыванием между запрашиваемой и исследуемой последовательностями (Pearson, Methods Enzymol. 1990:183:63-98; Pearson, Methods Mol. Biol. 2000; 132:185-219).
Процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями может также быть определен с помощью алгоритма Е. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 1988; 11-17), встроенного в программу ALIGN (версия 2.0), с применением матрицы замен аминокислотных остатков РАМ 120, со штрафом за удлинение гэпа 12 и штрафом за открытие гэпа 4.
Другой алгоритм для сравнения одной последовательности с другими последовательностями, имеющимися в базе данных, представляет компьютерная программа BLAST, особенно blastp, использующая параметры по умолчанию. См., например, Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990; 215:403-410; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997:25:3389-402 (1997); включенных сюда путем ссылки. Последовательности белков по данному изобретению могут использоваться в качестве "запрашиваемой последовательности " для проведения поиска в общедоступных базах данных, например, для выявления родственных последовательностей. Такой поиск может проводиться с применением программы XBLAST (версия 2.0) Altschul, et al. 1990 (supra}. Поиск белков в BLAST для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных молекулам антител по изобретению, может выполняться с применением программы XBLAST, и параметров «оценка» (score)=50, «длина слова» (wordlength)=3. Для выравнивания с гэпами с целью сравнения, может применяться Gapped BLAST, как описано в Altschul et al., 1997 (supra). При использовании программ BLAST и Gapped BLAST могут применяться параметры по умолчанию из соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST). См. http://www. ncbi.nlm.nih.gov.
В определенных воплощениях антитело по изобретению содержит участок VH, содержащий последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, и участок VL, содержащий последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, в которых одна или более из этих последовательностей CDR содержит определенные аминокислотные последовательности, на основе предпочтительных антител, описанных здесь; 16F16, 16F31, MS или 21F2, в которых один или более участков CDR, возможно, имеет одну или более консервативных модификаций аминокислот, причем антитела сохраняют желаемые функциональные свойства анти-hNKG2D антител по изобретению. Соответственно, в изобретении описывается выделенное антитело или его антиген-связывающий фрагмент, содержащий вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, причем: (а) последовательность CDR3 фрагмента VH содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NOs:17, 23, 50 и 56; (б) последовательность CDR3 фрагмента VL содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NOs:20, 26, 53 и 59; (в) один или более CDR, возможно, содержит одну или более консервативных модификаций аминокислот, и (г) антитело связывается с hNKG2D и проявляет по меньшей мере одно из функциональных свойств, описанных здесь, более предпочтительно, несколько из функциональных свойств, описанных здесь.
В следующем воплощении последовательность CDR2 фрагмента VH содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NOs:16, 22, 49 и 55; а последовательность CDR2 фрагмента VL аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NOs:19, 25, 52 и 58, причем один или более CDR, возможно, содержит одну или более консервативных модификаций аминокислот.
В еще одном воплощении последовательность CDR1 фрагмента VH содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NOs:15, 21, 48 и 54, и их консервативные модификации; а последовательность CDR1 фрагмента VL содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NOs:18, 24, 51 и 57, причем один или более CDR, возможно, содержит одну или более консервативных модификаций аминокислот.
Согласно данному описанию термин "консервативные модификации аминокислот" обозначает модификации аминокислот, которые существенным образом не влияют или не изменяют характеристики связывания антитела, содержащего аминокислотную последовательность. Такие консервативные модификации включают замены аминокислот, вставки и делеции. Модификации могут быть введены в антитело по изобретению при помощи стандартных методик, известных в данной области техники, например, таких как сайт-специфический мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Антитело с последовательностью, содержащей модификации аминокислот, по сравнению с материнским антителом, как правило, по меньшей мере на 90%, предпочтительно, по меньшей мере на 95%, 98% или 99% идентично соответствующей аминокислотной последовательнсти материнского антитела и/или содержит не более чем 10, предпочтительно, не более чем 5, 4, 3, 2 модификации аминокислот по сравнению с последовательностью материнского антитела.
"Консервативные" замены аминокислот, как правило, представляют собой замены, при которых аминокислотный остаток заменяется на аминокислотный остаток с боковой цепью с аналогичными физико-химическими свойствами. Группы аминокислотных остатков, имеющих схожие боковые цепи, известны в данной области техники. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), основными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин).
Таким образом, один или более аминокислотных остатков в составе участков CDR антитела по изобретению могут быть заменены на другие аминокислотные остатки из семейства с аналогичными боковыми цепями и измененное антитело может быть протестировано на сохранность функции (т.е. функции, приведенные выше в пунктах (в), (г) и (д)) с применением описанных здесь функциональных тестов.
Антиген-связывающие фрагменты
Анти-hNKG2D антитела по изобретению могут быть получены в виде полноразмерных антител или их антиген-связывающих фрагментов. Примеры антиген-связывающих фрагментов включают Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, F(ab)3, Fv (как правило, VL и VH домены одного плеча антитела), одноцепочечные Fv (scFv; см., например, Bird et al., Science 1988; 242:423-426; и Huston et al. PNAS 1988; 85:5879-5883), dsFv, Fd (как правило, VH и СН1 домен) и dAb (как правило, VH домен) фрагменты; VH, VL, VhH и V-NAR домены; моновалентные молекулы, содержащие одну VH и одну VL цепь; миниантитела, димерные, тримерные, тетрамерные антитела и т.н. «каппа-тела» (см., например, III et al., Protein Eng 1997; 10:949-57); верблюжьи IgG; IgNAR; а также один или более выделенных CDR или функциональных паратопов, где выделенные CDR или антиген-связывающие остатки или полипептиды могут быть ассоциированы или связаны друг с другом с формированием функционального фрагмента антитела. Различные типы фрагментов антител были описаны или приведены в обзорах, например, Holliger and Hudson, Nat Biotechnol 2005; 23:1126-1136; в WO2005040219 и опубликованных заявках на патент США 20050238646 и 20020161201.
Фрагменты антител могут быть получены с применением общепринятых методов рекомбинантной или белковой инженерии, и может быть проведен скрининг фрагментов на связывание антител или другие функции таким же образом, как и у интактных антител.
Для производства фрагментов антител были разработаны различные способы. Традиционно, эти фрагменты получали при протеолитическом расщеплении полноразмерных антител (см., например, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24:107-117 (1992); и Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Однако, теперь эти фрагменты могут быть непосредственно произведены рекомбинантными клетками-хозяевами. В альтернативном случае, Fab'-SH фрагменты могут быть получены в Е. coli и химически соединены с образованием F(ab')2 фрагментов (Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992)). Согласно другому подходу, F(ab')2 фрагменты могут быть изолированы непосредственно из культуры рекомбинантных клеток-хозяев. В других воплощениях антитело выбора представляет собой одноцепочечный Fv фрагмент (scFv). См. WO 1993/16185; патент США 5,571,894; и патент США 5,587,458. Фрагмент антитела может также быть "линейным антителом ", например, как описано в U.S. Pat, No. 5,641,870. Такие фрагменты линейных антител могут быть моноспецифичными или биспецифичными.
Мультиспецифичные молекулы
В другом аспекте данное изобретение описывает мультиспецифичные молекулы, включая анти-hNKG2D антитело по изобретению или его антиген-связывающий фрагмент. Такие мультиспецифичные молекулы включают биспецифичные молекулы, содержащие, по меньшей мере одну первую связывающую валентность для hNKG2D, и вторую связывающую валентность для второго эпитопа-мишени.
Одной из разновидностей биспецифичных молекул являются биспецифичные антитела. Биспецифичные антитела представляют собой антитела, имеющие способность специфически связываться по меньшей мере с двумя различными эпитопами. Способы получения биспецифичных антител известны в данной области техники и традиционные способы получения биспецифичных полноразмерных антител, как правило, основаны на совместной экспрессии двух пар тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов, из которых две цепи имеют различную специфичность (Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1983)). Биспецифичные антитела могут быть произведены в виде полноразмерных антител или фрагментов антител (например, F(ab')2 биспецифичных антител) или любых других антиген-связывающих фрагментов, описанных здесь.
У биспецифичных антител согласно данному изобретению по меньшей мере один связывающий эпитоп принадлежит белку hNKG2D. Анти-NKG2D-связывающая часть может быть скомбинирована со второй частью, связывающейся с молекулами провоспалительных лейкоцитов, например, молекулами Т-клеточных рецепторов (например, CD2, CD3, CD4 или CD8), для фокусирования механизмов клеточной защиты против провоспалительных клеток, экспрессирующих hNKG2D. В данном воплощении биспецифичные антитела могут, например, применяться для направления цитотоксических агентов или ADCC/CDC атак на провоспалительные клетки, экспрессирующие NKG2D. Цитотоксическим агентом может быть, например, сапорин, анти-интерферон альфа, алкалоид барвинка, А субъединица рицина, метотрексат или радиоактивный изотоп.
В другом воплощении вторая часть связывается с ассоциированной с клетками мишенью, презентируемой или экспрессируемой клетками при заболеваниях, в регуляции которых, как правило, задействованы эффекторные лимфоциты, таких как рак, вирусная инфекция и т.п. Так, например, характерной мишенью могут быть молекулы клеточного стресса, такие как молекулы MIC (например, MIC-A или MIC-B) или ULBP (например, Rae-1, H-60, ULBP2, ULBP3, HCMV UL18 или Rae-1β) или ассоциированные с патогеном молекулы, такие как вирусный гемагглютинин.
Другие мультиспецифичные молекулы включают те, что образованы при слиянии hNKG2D-связывающей части с одним или более других белков, не являющихся антителами. Такие мультиспецифичные белки и способы их получения описаны в данной области техники. См., например, Dreier et al. (Bioconjug. Chem. 9(4): 482-489 (1998)); патент США 6,046,310; публикации No. 20030103984; европейскую заявку на патент 1 413 316; публикации No. 20040038339; von Strandmann et al., Blood (2006; 107:1955-1962.) и WO 2004056873. Согласно данному изобретению белок, не являющийся антителом, может, например, быть подходящим лигандом для любого из антигенов, распознающихся "вторым компонентом" описанным в предыдущем разделе; например, лигандом для Т-клеточного или Fc рецептора, или молекул клеточного стресса, таких как MIC-A, MIC-B, ULBP, или ассоциированных с патогенами молекул, такими как вирусный гемагглютинин.
Мультиспецифичные молекулы, имеющие более двух валентностей, также рассматриваются в изобретении. Например, могут быть произведены триспецифичные антитела. Tutt et al., J. Immunol, 147:60 (1991).
Мультиспецифичные молекулы по данному изобретению могут быть получены путем конъюгирования элементов связывающих валентностей при помощи методов, известных в данной области техники. Например, каждая связывающая валентность мультиспецифичной молекулы может быть произведена отдельно, а затем конъюгирована с другой. В случае, если связывающие валентности являются белками или пептидами, для ковалентного связывания могут быть использованы различные связующие или сшивающие агенты. Примеры сшивающих агентов включают протеин А, карбодиимид, N-сукцинимидил-S-ацетил-тиоацетат (SATA), 5,5'-дитиобис(2-нитробензойную кислоту (DTNB), о-фенилендималеимид (oPDM), N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP) и сульфосукцинимидил 4-(N-малеимидометил) циклогексан-1-карбоксилат(sulfo-SMCC) (см., например, Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Другие способы включают те, что описаны Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83) и Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375). Предпочтительными конъюгрующими агентами являются SATA и sulfo-SMCC, оба производятся Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).
В случае, если связывающие валентности являются антителами, они могут быть конъюгированы посредством сульфгидрильных связей между С-концами шарнирных участков двух тяжелых цепей. В особо предпочтительном воплощении шарнирный участок модифицирован с той целью, чтобы перед конъюгированием в нем содержалось нечетное количество сульфгидрильных остатков, предпочтительно один.
Возможно, что обе связывающие валентности могут кодироваться одним и тем же вектором и экспрессироваться и собираться в одних и тех же клетках-хозяевах. Этот способ может найти применение особенно в случаях, когда биспецифичные молекулы представляют собой гибридный белок mAb × mAb, mAb × Fab, Fab × F(ab')2 или лиганд × Fab. Биспецифичная молекула по изобретению может представлять собой одноцепочечную молекулу, содержащую одно одноцепочечное антитело и связывающую детерминанту, или одноцепочечную биспецифичную молекулу, содержащую две связывающие детерминанты. Биспецифичные молекулы могут содержать по меньшей мере две одноцепочечные молекулы. Способы получения биспецифичных молекул описаны и приведены в обзорах, например, в патенте США 5,260,203; в патенте США 5,455,030; в патенте США 4,881,175; в патенте США 5,132,405; в патенте США 5,091, 513; в патенте США 5,476,786; в патенте США: 5,013,653; в патенте США 5,258,498; в патенте США 5,482,858; опубликованной заявке на патент США 20030078385, Kontermann et al., (2005) Acta Pharmacological Sinica 26(1):1-9; Kostelny et al., (1992) J. Immunol. 148(5): 1547-1553; Hollinger et al., (1993) PNAS (USA) 90:6444-6448; и Gruber et al. (1994) J. Immunol. 152: 5368.
Варианты антител
Антитело по изобретению также может быть получено с применением антитела, имеющего одну или более последовательностей VH и/или VL, описанных здесь, в качестве исходного материала для создания модифицированного антитела или «варианта» антитела, при этом измененное антитело может иметь измененные свойства по сравнению с материнским антителом. Антитело может быть создано путем модифицирования одного или более аминокислотных остатков в составе одного или обоих вариабельных участков (т.е. VH и/или VL), например, в составе одного или более участков CDR и/или в составе одного или более каркасных участков. Дополнительно или альтернативно, антитело может быть создано путем модификации аминокислотных остатков в составе константного участка (участков), например, для изменения эффекторной функции (функций) антитела. Кроме того, на основе антиген-связывающих участков антитела можно получить другие конструкции, такие как антиген-связывающие фрагменты, производные антител, иммуноконъюгаты и мультиспецифичные молекулы.
Для получения и экспрессии антитела с измененной последовательностью могут применяться стандартные методы молекулярной биологии.
Несмотря на то, что вариант или производное антитела обычно имеет по меньшей мере одно измененное свойство по сравнению с родительским антителом, вариант или производное антитела может сохранять одно, несколько или большинство из функциональных свойств антител к hNKG2D, описываемых здесь, функциональные свойства которых включают: (а) предотвращение NKG2D-опосредованной активации NKG2D-экспрессирующих NK или Т клеток, возможно с более низкой ЕС50 при снижении лиганд-индуцированной цитотоксичности, чем ЕС50 при связывании с клетками; (б) конкуренцию по меньшей мере с одним лигандом NKG2D за связывание с NKG2D, предпочтительно по меньшей мере с MICA и ULBP3; (в) уменьшение количества NKG2D на поверхности NKG2D-экспрессирующих NK или Т клеток, предпочтительно по меньшей мере на 75%; (г) связывание с NKG2D яванского макака и/или макаки резус предпочтительно с такой же эффективностью или аффинностью; (д) связывание более чем с одной формой или конформацией NKG2D; (е) связывание с NKG2D с Kd равной 1 нМ или менее, предпочтительно 0,1 нМ или менее; (ж) конкуренцию с более чем одним из 16F16, 16F31, MS или 21F2, (з) более выраженную конкуренцию с 16F16, 16F31, MS или 21F2, чем с любым из ON72, ВАТ221, 5С6, 1D11, ЕСМ217 и 149810 за связывание с hNKG2D; (и) блокирование более чем на 90% связывания 16F16, MS или 21F2 с hNKG2D на поверхности клеток; (к) меньшую активность как агонист hNKG2D по сравнению с любым из ON72, ВАТ221, 5С6, 1D11, ЕСМ217 и 149810; но не ограничиваются ими. Антитело по изобретению может обладать любым сочетанием вышеперечисленных функциональных характеристик и/или функциональных характеристик, описанных в Примерах.
Функциональные свойства вариантов и производных антитела можно оценивать при помощи стандартных тестов, известных в данной области техники и/или описываемых здесь. Например, способность антитела связываться с hNKG2D можно определять при помощи стандартных тестов связывания, таких как те, что приводятся в Примерах (например, Biacore, проточная цитометрия или ИФА).
Модификации вариабельных участков
Один из видов конструирования вариабельных участков, который можно осуществить, это пересаживание CDR. Антитела взаимодействуют с антигенами-мишенями преимущественно при помощи аминокислотных остатков, расположенных в шести гипервариабельных участках (CDR) тяжелой и легкой цепи. По этой причине аминокислотные последовательности в составе CDR больше различаются между отдельными антителами, чем последовательности за пределами CDR. Поскольку последовательности CDR отвечают за большинство взаимодействий антиген-антитело, возможно экспрессировать рекомбинантные антитела, имитирующие свойства определенных антител, образующихся естественным образом, путем конструирования векторов экспрессии, включающих последовательности CDR определенного естественным образом образованного антитела, пересаженных на каркасные последовательности другого антитела с другими свойствами (см., например, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029-10033; патент США 5225539 (Winter) и патенты США 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370 (Queen et al.). Соответственно, другое воплощение изобретения относится к выделенному антителу или его антиген-связывающей части, содержащей: участок VH, содержащий последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, содержащие аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NOs:15, 21, 48 и 54, SEQ ID NOs:16, 22, 49 и 55 и SEQ ID NOs:17, 23, 50 и 56, соответственно, и участок VL, содержащий последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, содержащие аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NOs:18, 24, 51 и 57, SEQ ID NOs:19, 25, 52 и 58 и SEQ ID NOs:20, 26, 53 и 59, соответственно. Таким образом, такие антитела содержат последовательности CDR VH и VL антител 16F16, 16F31, MS или 21F2, хотя могут содержать иные каркасные последовательности, чем у этих антител.
В изобретении также представлены химерная, или гуманизированная форма моноклонального анти-hNKG2D антитела грызунов или его антиген-связывающий фрагмент, связывающиеся с hNKG2D, и применение таких антител (например, для модулирования hNKG2D-опосредованных физиологических процессов в организме млекопитающего-хозяина). В одном воплощении антитело грызунов представляет собой одно из ON72, ВАТ221, 5С6, 1D11, 149810 и ЕСМ217. В другом воплощении антитело грызунов не является одним из ON72, ВАТ221, 5С6, 1D11, 149810 и ЕСМ217. Таким образом, такие антитела содержат последовательности VH и VL CDR из ON72, ВАТ221, 5С6, 1D11, 149810 или ЕСМ217, или моноклонального антитела грызунов, отличного от ON72, ВАТ221, 5С6, 1D11, 149810, ЕСМ217, с иными каркасными последовательностями, чем у этих антител. В одном воплощении гуманизированное антитело представляет собой гуманизированную форму ON72, содержащую, например, аминокислотные последовательности SEQ ID NOS:70 и 71 тяжелой и легкой цепи, соответственно.
Такие каркасные последовательности могут быть взяты в общедоступных базах данных ДНК или опубликованных последовательностях, включающих последовательности генов зародышевой линии антител. Например, последовательности ДНК генов зародышевой линии вариабельных участков тяжелой и легкой цепи человека могут быть взяты из базы данных последовательностей зародышевой линии человека "dBase" (по адресу в Интернете www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), а также у Kabat, Е. А., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; и Сох, J. P. L. et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836; описание каждой из публикаций включено сюда посредством ссылки.
Предпочтительные каркасные последовательности для применения в антителах по изобретению представляют собой те, что сходны по структуре с каркасными последовательностями, имеющимися у избранных антител по изобретению, например, имеют сходство с каркасными последовательностями VH3_21, D3-9, JH4, VKI_L15 и JK2, или VH3_20, D3-10, JH6, VKIII_A27 и JK3, или VH4_59, JH3, VKIII_A27 и JK1, или VH5_51, D3_10_R3, JH4, VKIII_L6 и JK1, имеющимися у антител 16F16, 16F31, MS и 21F2. Последовательности VH CDR1, 2 и 3 антител 16F16, 16F31, MS или 21F2, и последовательности VL CDR1, 2 и 3 антител 16F6, 16F31, MS или 21F2 могут быть пересажены на каркасные последовательности, которые имеют такие же последовательности, как и те, что присутствуют в гене зародышевой линии иммуноглобулина, от которого получена каркасная последовательность, или последовательности CDR могут быть пересажены на каркасные участки, содержащие одну или более мутаций, по сравнению с последовательностями зародышевой линии. Например, было обнаружено, что в определенных случаях выгодно изменять аминокислотные остатки в составе каркасных участков для сохранения или усиления способности антитела связывать антиген (см., например, патенты США 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370 (Queen et al.)).
В другом аспекте изобретения структурные характеристики анти-hNKG2D антител по изобретению, например, 16F16 и 16F31, используются для создания родственных по структуре анти-hNKG2D антител, сохраняющих, по меньшей мере, одно функциональное свойство антител по изобретению, такое как связывание с hNKG2D. Например, один или более участков CDR 16F16 или 16F31 или их вариантов можно объединять с помощью рекомбинации с известными каркасными последовательностями и/или другими CDR для создания дополнительных рекомбинантных анти-hNKG2D антител по изобретению. Исходный материал для методов инженерии представляет собой одну или более последовательностей VH и/или VL, приведенных здесь, или один или более их участков CDR. Для создания антитела методами инженерии не обязательно действительно получать (т.е. экспрессировать в виде белка) антитело, имеющее одну или более последовательностей VH и/или VL, приведенных здесь, или один или более их участков CDR. В качестве исходного материала для создания последовательности (последовательностей) «второго поколения» на основе исходной последовательности (последовательностей) скорее используется информация, кодируемая последовательностью (последовательностями), а затем последовательность (последовательности) «второго поколения» получают и экспрессируют в виде белка.
Соответственно, в другом воплощении изобретение описывает способ получения анти-hNKG2D антитела, включающий: (а) получение: (1) последовательности вариабельного участка тяжелой цепи антитела, включающей последовательность CDR1, выбранную из SEQ ID NOs:15, 21, 48 и 54, последовательность CDR2, выбранную из SEQ ID NOs:16, 22, 49 и 55, и/или последовательность CDR3, выбранную из SEQ ID NOs:17, 23, 50 и 56; и (2) последовательности вариабельного участка легкой цепи антитела, включающей последовательность CDR1, выбранную из SEQ ID NOs:18, 24, 51 и 57, последовательность CDR2, выбранную из SEQ ID NOs:19, 25, 53, и 59 и/или последовательность CDR3, выбранную из SEQ ID NOs:20, 26, 53 и 59; (б) изменение по меньшей мере одного аминокислотного остатка в составе первой последовательности антитела и/или второй последовательности антитела для создания по меньшей мере одной измененной последовательности антитела; и (в) получение измененной последовательности антитела; и (г) экспрессию измененной последовательности антитела в виде белка.
Другой вид модификации вариабельного участка состоит в мутации аминокислотных остатков в составе VH и/или VL CDR1, CDR2 и/или CDR3 участков для улучшения таким образом одной или более характеристик связывания (например, аффинности) антитела, представляющего интерес. Для внедрения мутации (мутаций) можно проводить сайт-специфический мутагенез или ПЦР-опосредованный мутагенез, а эффект на связывание антитела или другие функциональные свойства, представляющие интерес, можно оценивать в тестах in vitro или in vivo согласно описанию здесь и в приведенных Примерах. Предпочтительно, вводятся консервативные модификации (согласно изложенному выше). Мутации могут представлять собой замены аминокислот, вставки или делеции. Кроме того, в составе одного участка CDR изменению подвергаются, как правило, не более 8, более типично, не более 5 аминокислотных остатков.
Соответственно, в другом воплощении изобретения предложены выделенные анти-hNKG2D антитела, содержащие вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий: (а) участок VH CDR1, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NOs:15, 21, 48 и 54, или аминокислотную последовательность, имеющую замену, делецию или вставку одной, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи или восьми аминокислот по сравнению с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NOs:15, 21, 48 и 54; (б) участок VH CDR2, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NOs:16, 22, 49 и 55, или аминокислотную последовательность, имеющую замену, делецию или вставку одной, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи или восьми аминокислот по сравнению с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NOs:16, 22, 49 и 55; (в) участок VH CDR3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NOs:17, 23, 50 и 56, или аминокислотную последовательность, имеющую замену, делецию или вставку одной, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи или восьми аминокислот по сравнению с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NOs:17, 23, 50 и 56; (г) участок VL CDR1, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:18, 24, 51 и 57, или аминокислотную последовательность, имеющую замену, делецию или вставку одной, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи или восьми аминокислот по сравнению с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:18, 24, 51 и 57; (д) участок VL CDR2, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs:19, 25, 52 и 58, или аминокислотную последовательность, имеющую замену, делецию или вставку одной, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи или восьми аминокислот по сравнению с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs:19, 25, 52 и 58; и (е) участок VL CDR3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs:20, 26, 53 и 59, или аминокислотную последовательность, имеющую замену, делецию или вставку одной, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи или восьми аминокислот по сравнению с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs:20, 26, 53 и 59.
Антитела по изобретению, полученные методами инженерии, включают те, в которых были произведены модификации остатков каркасных участков в составе VH и/или VL, например, для улучшения свойств антитела. Как правило, такие модификации каркасных участков выполняются для уменьшения иммуногенности антитела. Например, один подход заключается в "обратной мутации" одного или более остатков каркасных участков на соответствующие остатки последовательности зародышевой линии. Более конкретно, антитело, подвергшееся соматической мутации, может содержать аминокислотные остатки каркасных участков, отличающиеся от последовательности зародышевой линии, на основе которой получено антитело. Такие аминокислотные остатки можно выявить при сравнении каркасных последовательностей антитела с последовательностями зародышевой линии, на основе которых получено антитело.
Например, для 16F16 аминокислотный остаток R111 (остаток 103 по Kabat; в составе FR4) VH является аргинином, тогда как в соответствующей последовательности зародышевой линии этот остаток является триптофаном (см. Фигуру 5А). Для возврата последовательностей каркасного участка к их конфигурации зародышевой линии, можно произвести "обратную мутацию" нескольких или всех соматических мутаций к последовательности зародышевой линии, например, при помощи сайт-специфического мутагенеза или мутагенеза при помощи ПЦР (например, остаткок 111 в VH 16F16 может быть обратно мутирован из треонина в аланин). В качестве другого примера можно рассмотреть 16F31, в котором аминокислотный остаток Y95 (в составе FR3) участка VH представляет собой тирозин, тогда как в соответствующей последовательности зародышевой линии этот остаток является гистидином (см. Фигуру 5В). Для возврата последовательностей каркасного участка к их конфигурации зародышевой линии, соматическая мутация может быть "обратно мутирована" из тирозина в гистидин. В качестве другого примера можно привести MS, у которого остатки 3, 6 и 7 по Kabat в участке VH являются гистидин (Н), аспарагиновая кислота (D) и D, соответственно, тогда как эти аминокислотные остатки в соответствующих последовательностях зародышевой линии представляют собой глутамин (Q), глицин (G) и G, соответственно (см. Фигуру 5Д). У 21F2 остатки 13, 24, 76 и 93 по Kabat являются глутаминовая кислота (Е), аспарагин (N), N и G, соответственно, тогда как эти аминокислотные остатки в соответствующих последовательностях зародышевой линии представляют собой лизин (K), G, серин (S) и аланин (А), соответственно. Для возврата последовательностей каркасных участков к их конфигурации зародышевой линии, соматические мутации можно таким же образом "мутировать обратно". Такие антитела, подвергнувшиеся "обратной мутации" также находятся в рамках изобретения.
Другой вид модификации каркасного участка включает мутирование одного или более аминокислотных остатков в составе каркасного участка, или даже в составе одного или более участков CDR, для удаления эпитопов Т клеток для снижения, таким образом, потенциальной иммуногенности антитела. Такой подход также обозначается "деиммунизацией" и описывается более подробно в публикации No. 20030153043 (Carr et al.)
Модификации Fc
В дополнение или в качестве альтернативы модификациям, произведенным на каркасных участках или участках CDR, антитела по изобретению могут быть разработаны таким образом, что будут иметь модификации в составе участка Fc, как правило, для изменения одного или более функциональных свойств антитела, таких как время полужизни в сыворотке, фиксация комплемента, связывание Fc рецептора, стабильность белка и/или антиген-зависимая клеточная цитотоксичность или ее отсутствие. Кроме того, антитело по изобретению может быть модифицировано химически (например, к антителу могут быть присоединены один или более химических компонентов) или быть модифицировано для изменения его степени гликозилирования, также для изменения одного или более функциональных свойств антитела. Каждое из этих воплощений описано далее более подробно. Аминокислотные остатки в участке Fc пронумерованы согласно Kabat.
При желании может быть изменен класс антитела при помощи известных методов. Такие методы включают, например, применение методов непосредственной рекомбинации (см., например, патент США 4816397) и методов клеточной гибридизации (см., например, патент США 5916771). Например, антитело, исходно полученное в виде молекулы IgM, может быть переведено в класс антител IgG. Методы изменения класса также могут применяться для конвертирования одного подкласса IgG в другой, например, из lgG1 в lgG2. Таким образом, эффекторная функция антител по изобретению может быть изменена путем изменения изотипа, например, на антитела класса lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgD, IgA, IgE или IgM для различных терапевтических применений. Примеры последовательностей ДНК константных участков можно получить, например, через GenBank (доступ через NCBI или другие общедоступные веб-сайты), каждая из которых включена во всей полноте путем ссылки, представляют собой следующие:
Константный участок тяжелой цепи lgG1 человека: код доступа GenBank No.: J00228;
Константный участок тяжелой цепи lgG2 человека: код доступа GenBank No.: J00230;
Константный участок тяжелой цепи lgG3 человека: код доступа GenBank No.: Х04646;
Константный участок тяжелой цепи lgG4 человека: код доступа GenBank No.: K01316; и
Константный участок легкой цепи каппа человека: код доступа GenBank No.: J00241.
В одном воплощении шарнирный участок СН1 модифицирован таким образом, что количество цистеиновых остатков в шарнирном участке изменено, например, увеличено или уменьшено. Такой подход более подробно описан в патенте США 5677425 (Bodmer et al.). Количество цистеиновых остатков в шарнирном участке СН1 изменено, например, для облегчения сборки легкой и тяжелой цепей или для увеличения или снижения стабильности антитела.
В другом воплощении шарнирный участок Fc антитела изменен для уменьшения биологической полужизни антитела. Более конкретно, мутации одной или более аминокислот введены в области между доменами СН2-СН3 шарнирного фрагмента Fc таким образом, что связывание антитела с протеином А стафилококков (SpA) нарушено по сравнению со связыванием SpA нативным шарнирным доменом Fc. Такой подход более подробно описан в патенте США No. 6165745 (Ward et al.). В другом воплощении антитело модифицировано для повышения его биологической полужизни. Возможны различные подходы. Например, могут быть произведены одна или более из следующих мутаций: T252L, T254S и T256F, согласно описанию в патенте США 6277375 (Ward). Кроме того, для увеличения биологической полужизни, могут быть произведены изменения в составе участков СН1 или CL антитела для создания эпитопа связывания улучшенного рецептора, взятого из двух петель СН2 домена Fc участка IgG, согласно описанию в патентах США 5869046 и 6121022 (Presta et al.). В других воплощениях участок Fc изменен путем замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка на другой аминокислотный остаток для изменения эффекторной функции (функций) антитела. Например, одна или более аминокислот, выбранных из аминокислотных остатков 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 и 322 могут быть заменены на другой аминокислотный остаток, так что антитело приобретет измененную аффинность к лиганду-эффектору, но сохранит антиген-связывающую способность материнского антитела. Лиганд-эффектор, к которому изменена аффинность, может представлять собой, например, Fc рецептор С1 компонента комплемента. Такой подход более подробно описан в патентах США 5624821 и 5648260 (Winter et al.). В другом примере одна или более аминокислот, выбранных из аминокислотных остатков 329, 331 и 322 могут быть заменены на другой аминокислотный остаток, так что антитело приобретет измененную способность связывать C1q и/или пониженную или отсутствующую комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC). Такой подход более подробно описан в патенте США 6194551 Idusogie et al. В другом примере один или более аминокислотных остатков в составе аминокислот в положениях 231 и 239 изменены для изменения таким образом способности антитела фиксировать комплемент. Такой подход более подробно описан в публикации WO 94/29351 (Bodmer et al.). Еще в одном примере участок Fc модифицирован для повышения способности антитела опосредовать антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) и/или повышать аффинность антитела к любому Fcy рецептору путем модификации одной или более аминокислот в следующих позициях: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 или 439. Такой подход описан более подробно в публикации WO 00/42072 (Presta). Более того, сайты связывания на lgG1 человека для FcyRI, FcyRII, FcyRIII и FcRn были картированы и были описаны варианты с улучшенным связыванием (см. Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604). Было показано, что определенные мутации в позициях 256, 290, 298, 333, 334 и 339 улучшают связывание с FcRIII. Кроме того, было показано, что следующие комбинированные мутанты обладают улучшенным связыванием с FcyRIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A и S298A/E333A/K334A.
Константный участок может быть далее модифицирован для стабилизации антитела, например, для снижения риска разделения бивалентного антитела на два моновалентных фрагмента VH-VL. Например, в константном участке lgG4 остаток S241 может быть изменен на остаток пролина (Р) для возможности образования полноценного дисульфидного мостика в шарнирном участке (см, например, Angal et al., Mol Immunol. 1993; 30:105-8).
Модификации гликозилирования
В следующем воплощении проводится модификация гликозилирования антитела. Например, может быть произведено агликозилированное антитело (т.е., антитело, не имеющее гликозилирования). Гликозилирование может быть, например, изменено для повышения аффинности антитела к антигену. Такие углеводные модификации могут быть выполнены, например, путем изменения одного или более сайтов гликозилирования в составе последовательности антитела. Например, могут быть проведены одна или более аминокислотных замен, приводящих к удалению одного или более сайтов гликозилирования каркасных участков вариабельных доменов для предупреждения, таким образом, гликозилирования по этому сайту. Подобное агликозилирование может повышать аффинность антитела к антигену. Такой подход описан более детально в патентах США 5714350 и 6350861 (Со et al.). Дополнительно или альтернативно, может быть получено антитело, имеющее измененный тип гликозилирования, такое как гипофукозилированное антитело, имеющее сниженное количество фукозильных остатков или антитело, имеющее повышенное количество остатков н-ацетил-глюкозамина с симметричными ответвлениями. Было показано, что подобные видоизмененные паттерны гликозилирования повышают способность антител индуцировать антитело-зависимую клеточную цитотоксичность. Подобные углеводные модификации могут быть выполнены, например, при экспрессии антитела в клетках хозяина с измененными "механизмами" гликозилирования. Клетки с подобными изменениями были описаны в данной области техники и могут использоваться в качестве клеток-хозяев, в которых будут экспрессировать рекомбинантные антитела по изобретению для получения, таким образом, антитела с измененным гликозилированием. Например, в ЕР1176195 (Hanai et al.) описана клеточная линия с функционально «разорванным» геном FUT8, кодирующим фукозил трансферазу, и антитела, экспрессируемые в такой клеточной линии, имеют пониженную степень фукозилирования. В публикации WO 03/035835 (Presta) описан вариант клеточной линии СНО, клеток Lecl3, с пониженной способностью присоединять фукозу к Asn(297)-связанным углеводам, также приводящей к пониженному фукозилированию антител, экспрессируемых в таких клетках-хояевах (см. также Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740). В публикации WO 99/54342 (Umana et al.) описаны клеточные линии, созданные для экспрессирования гликопротеин-модифицирующих гликозил-трансфераз, (например, бета(I,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы III (GnTIII)), так что антитела, экспрессируемые в созданных методами инженерии клеточных линиях обладают повышенным количеством остатков н-ацетил-глюкозамина с симметричными ответвлениями, что выражается в повышенной активности антител при индукции антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (см. также Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 7:176 180).
В определенных воплощениях способов инженерии антител по изобретению мутации могут быть введены посредством случайного или направленного мутагенеза вдоль всей кодирующей последовательности анти-hNKG2D антитела (например, кодирующей последовательности 16F16, 16F31, MS или 21F2) или ее части, и среди полученных модифицированных антител может проводиться скрининг по связывающей активности и/или другим функциональным свойствам, согласно данному описанию. Способы введения мутаций описаны в данной области техники. Например, в публикации WO 02/092780 (Short) описаны способы получения и скрининга мутаций антител с применением насыщающего мутагенеза, химического синтеза, или их сочетания.
В альтернативном случае, в публикации WO 03/074679 (Lazar et al.) описаны способы применения методов компьютерного скрининга для оптимизации физико-химических свойств антител.
Производные антител
Производные антител (или иммуноконъюгаты) в рамках данного изобретения включают анти-hNKG2D антитела, конъюгированные или ковалентно связанные со вторым агентом.
Например, в одном аспекте изобретения описаны иммуноконъюгаты, содержащие антитело, конъюгированное или ковалентно связанное с цитотоксическим агентом. Термин "цитотоксический агент" в данном описании представляет собой молекулу, способную вызывать гибель клетки, несущей на своей клеточной поверхности рецептор к hNKG2D. С данными антителами может быть конъюгирован любой компонент с цитотоксическим или цитоингибиторным эффектом, для образования конъюгатов с цитотоксической активностью по данному изобретению и для подавления или гибели определенных клеток, экспрессирующих рецепторы NK, включая радиоизотопы, использующиеся в терапевтических целях, токсические белки, токсические низкомолекулярные молекулы, такие как лекарства, токсины, иммуномодуляторы, гормоны, антагонисты гормонов, ферменты, олигонуклеотиды, ингибиторы ферментов, радионуклиды, используемые в терапевтических целях, ингибиторы ангиогенеза, химиотерапевтические препараты, алкалоиды барвинка, антрациклины, эпидофиллотоксины, таксаны, антиметаболиты, алкилирующие агенты, антибиотики, ингибиторы циклооксигеназы-2, SN-38, антимикотики, антиангиогенные агенты и агенты, запускающие апоптоз, особенно доксорубицин, метотрексат, таксол, СРТ-11, камптотеканы, горчичные газы, гемцитабин, алкил сульфонаты, нитрозомочевину, триазен, аналоги фолиевой кислоты, аналоги пиримидина, аналоги пурина, координационные соединения платины, экзотоксин Pseudomonas, рицин, абрин, 5-флуороуридин, рибонуклеазу (РНКаза), ДНКазу I, энтеротоксин А стафилококка, антивирусный белок лаконоса, гелонин, дифтерийный токсин, экзотоксин Pseudomonas и эндотоксин Pseudomonas и другие (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Ed. (Mack Publishing Co. 1995); Goodman and Oilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics (McGraw Hill, 2001); Pastan et al. (1986) Cell 47:641; Goldenberg (1994) Cancer Journal for Clinicians 44:43; U.S. Pat. No. 6,077,499; включенные сюда во всей полноте путем ссылки). Специалисты оценят, что токсин может быть животного, растительного, грибкового или микробного происхождения, или может быть создан de novo при помощи химического синтеза.
В другом воплощении предложены производные антитела с радиоактивным изотопом, таким как радионуклид, применяемый в терапевтических целях или радионуклид, подходящий для диагностических целей. Может применяться любое количество подходящих радиоактивных изотопов, включая 1-131, индий-111, лютеций-171, висмут-212, висмут-213, астат-211, медь-62, медь-64, медь-67, иттрий-90, иод-125, иод-131, фосфор-32, фосфор-33, скандий-47, серебро-111, галлий-67, празеодим-142, самарий-153, тербий-161, диспрозий-166, гольмий-166, рений-186, рений-188, рений-189, свинец-212, радий-223, актиний-225, железо-59, селен-75, мышьяк-77, стронций-89, молибден-99, родий-105, палладий-109, празеодим-143, прометий-149, эрбий-169, иридий-194, золото-198, золото-199 и свинец-211, но не граничиваясь ими. Как правило, радионуклид предпочтительно имеет энергию распада в пределах от 20 до 6000 кэВ, предпочтительно, в пределах от 60 до 200 кэВ для излучателей Оже-электронов, 100-2500 кэВ для бета-излучателей и 4000-6000 кэВ для альфа-излучателей. Также предпочтительными являются радионуклиды, которые распадаются, главным образом, с испусканием альфа-частиц.
Конъюгаты антитела по изобретению могут применяться для модификации заданного биологического ответа, когда не требуется, чтобы лекарственный компонент ограничивался классическими химическими терапевтическими агентами. Например, лекарственный компонент может быть белком или полипептидом, обладающим желаемой биологической активностью. Такие белки могут включать, например, токсин, обладающий ферментативной активностью или его активный фрагмент, такой как абрин, А субъединица рицина, экзотоксин Pseudomonas или дифтерийный токсин; такой белок, как фактор некроза опухоли или интерферон-y; или вещества, модифицирующие биологический ответ, такие как, например, лимфокины, интерлейкин-I ("IL-1"), интерлейкин-2 ("IL-2"), интерлейкин-6 ("IL-6"), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор ("GM-CSF"), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор ("G-CSF") или другие факторы роста.
Второй агент может быть связан с антителом напрямую или опосредовано, с применением любого из существующих в большом количестве способов. Например, агент может быть присоединен к шарнирному участку редуцированного компонента антитела за счет образования дисульфидных связей, с помощью кросс-линкеров, таких как N-сукцинил 3-(2-пиридилдитио)проприонат (SPDP), или к углеводному компоненту в Fc участке антитела (см., например, Yu et al. (1994) Int. J. Cancer 56: 244; Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking (CRC Press 1991); Upeslacis et al., "Modification of Antibodies by Chemical Methods," in Monoclonal antibodies: principles and applications, Birch et al. (eds.), pages 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," in Monoclonal antibodies: Production, engineering and clinical application, Ritter et al. (eds.), pages 60-84 (Cambridge University Press 1995), Cartel et al. (1989) Chemistry today 7:51-58, Delprino et al. (1993) J. Pharm. Sci 82:699-704; Arpicco et al. (1997) Bioconjugate Chemistry 8:3; Reisfeld et al. (1989) Antihody, Immunicon. Radiopharrn. 2:217; описание которых включено сюда во всей полноте путем ссылки). См., также, например, Arnon et al,, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp.243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp.623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp.475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al, (eds.), pp.303-16 (Academic Press 1985) и Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982).
Для более подробного описания типов цитотоксинов, линкеров и способов конъюгирования терапевтических агентов с антителами, см. также Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Alien, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. and Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. and Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264.
В других воплощениях второй агент представляет собой детектируемый компонент, который может быть любой молекулой, которую возможно количественно или качественно определять или измерять. Примерами маркеров, подлежащих определению, подходящих для применения в составе конъюгированных антител по данному изобретению, являются радиоизотопы, флуоресцентные красители, или представители комплементарно связывающихся пар, такие как представители любой из молекулярных систем: антиген/антитело (отличное от антитела к NKG2D), лектин/углевод; авидин/биотин; рецептор/лиганд; или системы молекулярно-импринтированный полимер/молекула-шаблон.
Второй агент может также или в альтернативном случае быть полимером, предназначенным, например, для увеличения времени полужизни антитела. Примеры полимеров и способов присоединения таких полимеров к пептидам проиллюстрированы, например, в патентах США 4766106; 4179337; 4495285 и 4609546. Другие примеры полимеров включают полиоксиэтилированные полиолы и фрагменты полиэтиленгликоля (PEG). В данном описании термин "полиэтиленгликоль" включает любую из форм PEG, которая применялась для получения производных других белков, таких как моно (С1-С10) алкокси- или арилокси-полиэтиленгликоль или полиэтиленгликоль-малеимид. Например, полнорамзерное антитело или фрагмент антитела могут быть конъюгированы с одной или более молекул PEG, имеющими молекулярный вес между приблизительно 1000 и приблизительно 40000, такой как между приблизительно 2000 и приблизительно 20000, например, приблизительно 3000-12000. Для пегилирования антитела или его фрагмента, антитело или фрагмент реагирует с полиэтиленгликолем (PEG), таким реактивным производным PEG как эфир или или альдегид, в условиях при которых одна или более группировок PEG присоединяется к антителу или фрагменту антитела. Предпочтительно, пегилирование проводится через реакцию ацилирования или реакцию алкилирования с реактивной молекулой PEG (или аналогичным реактивным водорастворимым полимером). В определенных воплощениях антитело, подлежащее пегилированию, является агликозилированным антителом. Способы пегилирования белков известны в данной области техники и могут применяться к антителам по изобретению. См., например, ЕР154316 (Nishimura et al.), международную заявку на патент PCT/US04/11494, и ЕР401384 (Ishikawa et al.)
Нуклеиновые кислоты
Другой аспект изобретения относится к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующих антитела по изобретению. Нуклеиновые кислоты могут существовать в целых клетках, в клеточном лизате или в частично очищенной или существенно очищенной форме. Нуклеиновая кислота является "выделенной" или "существенно очищенной", когда она очищена от других клеточных компонентов или других примесей, например, других нуклеиновых кислот или белков клетки, при помощи стандартных методов, включающих обработку щелочами и додецилсульфатом натрия, разделение в градиенте хлориде цезия, колоночную хроматографию, электрофорез в агарозном геле и другие известные в данной области техники методы. См., F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. Нуклеиновая кислота по изобретению может быть, например, ДНК или РНК и может содержать или не содержать интронные последовательности. В предпочтительном воплощении нуклеиновая кислота является молекулой кДНК. Хотя следующие параграфы относятся к последовательностям ДНК или их применению, такие же способы или принципы могут, как правило, применяться и к последовательностям мРНК.
Нуклеиновые кислоты по изобретению могут быть получены с применением стандартных методов молекулярной биологии. Для антител, экспрессируемых гибридомами (например, гибридомами, полученными от трансгенных мышей, несущих гены иммуноглобулинов человека, согласно следующему ниже описанию), кДНК, кодирующие легкие и тяжелые цепи антитела, секретируемого гибридомой, могут быть получены при помощи стандартных методик амплификации в ходе ПЦР или клонирования кДНК. Для антител, полученных из библиотеки генов иммуноглобулинов, (например, при помощи методик фагового дисплея), нуклеиновые кислоты, кодирующие антитело, могут быть выделены из библиотеки.
Предпочтительными молекулами нуклеиновых кислот по изобретению являются те, которые кодируют (или содержат последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует) последовательности Н и L цепи антител 16F16, 16F31, MS или 21F2 изотипа lgG4. Последовательности ДНК, кодирующие последовательности VH и VL 16F16, приведены в SEQ ID NOs:3 и 4, соответственно. Последовательности ДНК, кодирующие последовательности VH и VL 16F31, приведены в SEQ ID NOs:5 и 6, соответственно. Последовательности ДНК, кодирующие последовательности VH и VL MS, представляют собой последовательности, кодирующие SEQ ID NOS:44 и 45, соответственно. Последовательности ДНК, кодирующие VH и VL 21 F2, представляют собой последовательности, кодирующие SEQ ID NOS:46 и 47, соответственно.
После получения фрагментов ДНК, кодирующих сегменты VH и VL, эти фрагменты ДНК могут в дальнейшем обрабатываться при помощи стандартных методов получения рекомбинантной ДНК, например, для превращения генов вариабельных участков в гены цепей полноразмерных антител, в гены Fab фрагментов или в гены scFv. В случаях таких превращений VL- или VH-кодирующий фрагмент ДНК, оперативно связан с другим фрагментом ДНК, кодирующим другой белок, такой как константный участок антитела или подвижный линкер. Термин "оперативно связан", в данном контексте означает, что два фрагмента ДНК соединены таким образом, что последовательности аминокислот, кодируемые двумя фрагментами ДНК, остаются в внутри рамки считывания.
Выделенная ДНК, кодирующая участок VH, может быть превращена в ген полноразмерной тяжелой цепи путем оперативного связывания ДНК, кодирующей VH, с другой молекулой ДНК, кодирующей константные участки тяжелой цепи (СН1, СН2 и СН3). Последовательности генов константных участков тяжелых цепей человека известны в данной области техники (см., например, Kabat, E. A., el al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), и фрагменты ДНК, содержащие эти участки, могут быть получены при помощи стандартной амплификации в ходе ПЦР. Константный участок тяжелой цепи может быть константным участком lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgE, IgM или IgD, но наиболее предпочтительно представляет собой константный участок lgG4. Для генов тяжелой цепи Fab фрагмента, VH-кодирующая ДНК может быть оперативно связана с другой молекулой ДНК, кодирующей только константный участок СН1 тяжелой цепи.
Выделенная ДНК, кодирующая участок VL, может быть превращена в ген полноразмерной легкой цепи (также как и ген легкой цепи Fab) путем оперативного связывания ДНК, кодирующей VL, с другой молекулой ДНК, кодирующей константный участок легкой цепи, CL. Последовательности генов константных участков легкой цепи человека известны в области техники (см., например, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), и фрагменты ДНК, содержащие эти участки, могут быть получены при помощи стандартной амплификации в ходе ПЦР. Константный участок легкой цепи может быть константным участком каппа или лямбда, но наиболее предпочтительно представляет собой константный участок каппа.
4
3
Для получения гена scFv фрагменты ДНК, кодирующие VH и VL, оперативно связываются с другим фрагментом, кодирующим подвижный линкер, например, аминокислотную последовательность (Gly-Ser), так что последовательности VH и VL могут быть экспрессированы в виде смежных белков одной цепи, в котором участки VL и VH соединены посредством подвижного линкера (см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554).
Получение антител
Моноклональные антитела (mAbs) по данному изобретению могут быть получены при помощи различных методов, включая общепринятую технологию получения моноклональных антител, например, стандартный метод гибридизации соматических клеток по Kohler и Milstein (1975) Nature 256: 495. Хотя процедуры гибридизации соматических клеток являются предпочтительными, в принципе, могут применяться и другие методы получения моноклональных антител, например, вирусная или онкогенная трансформация В лимфоцитов.
Животными, которых предпочтительнее всего используют для получения гибридом, являются грызуны. Протоколы иммунизации и методы выделения иммунизированных спленоцитов для гибридизации известны в данной области техники, также как и «партнеры» для гибридизации (например, клетки миеломы грызунов) и процедуры гибридизации. Химерные или гуманизированные антитела по данному изобретению могут также быть получены на основе последовательности моноклонального антитела грызунов с помощью отработанных методов. Например, ДНК, кодирующая тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов, может быть получена из гибридомы грызунов, представляющей интерес, и так модифицировна с помощью стандартных методов молекулярной биологии, что будет содержать последовательности иммуноглобулинов не-грызунов (например, человека). Например, для создания химерного антитела вариабельные участки грызунов могут быть присоединены к константным участкам человека с помощью известных в данной области техники способов (см., например, патент США 4816567 (Cabilly et al.)). Для создания гуманизированного антитела CDR участки грызунов могут быть вставлены в каркасный участок человека с помощью способов, известных в данной области техники (см., например, патент США 5225539 (Winter) и патенты США 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370 (Queen et al.)).
В предпочтительном воплощении антитела по изобретению являются моноклональными антителами человека. Такие моноклональные антитела, направленные против hNKG2D, могут быть получены с помощью трансгенных или трансхромосомных мышей, несущих части иммунной системы человека вместо мышиной. Такие трансгенные и трансхромосомные мыши включают мышей, обозначаемых здесь мыши HuMAb и мыши КМ, соответственно, и обозначаются здесь общим термином "мыши с Ig человека." Мышь HuMAb (Medarex, Inc.) содержит минилокусы гена иммуноглобулина человека, кодирующие неизмененные последовательности тяжелой (µ? и γ) и легкой к цепи иммуноглобулинов человека, наряду с направленными мутациями, инактивирующими эндогенные локусы µ и κ цепей (см., наример, Lonberg, et al. (1994) Nature 368: 856-859). Соответственно, у мышей отмечается пониженная экспрессия мышиных IgM или Igκ, и, в ответ на иммунизацию внедренные трансгены тяжелой и легкой цепи человека претерпевают изменение класса и соматические мутации с образованием высокоаффинного моноклонального IgGκ человека (Lonberg, N. et al. (1994), supra; обзоры Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 и Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546). Получение и применение мышей HuMab и модификации генома, имеющиеся у таких мышей, более подробно описаны у Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4: 117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912 2920; Taylor, L. et al. (1994) International immunology 6: 579-591; и Fishwild, D, et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851, описание которых во всей полноте включено сюда путем ссылки. См. также патенты США 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299 и 5770429 (Lonberg and Kay); патент США 5545807 (Surani et al.); публикациях WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 и WO 99/45962 (Lonberg и Kay); и публикации WO 01/14424 (Korman et al). В другом воплощении антитела человека по изобретению могут быть получены с применением мышей, несущих последовательности иммуноглобулинов человека в перенесенных генах и перенесенных хромосомах, таких как мышей, несущих перенесенные гены тяжелой цепи человека и перенесенные хромосомы легкой цепи человека. Такие мыши, обозначаемые здесь "KM mice", описаны подробно в публикации WO 02/43478 (Ishida et al.). Кроме того, в данной области техники известны альтернативные трансгенные животные системы, экспрессирующие гены иммуноглобулинов человека, которые могут применяться для получения анти-hNKG2D антител по изобретению. Например, может применяться альтернативная трансгенная система, обозначаемая Xenomouse (Abgenix, Inc.); такие мыши описаны, например в патентах США 5939598; 6075181; 6114598; 6150584 и 6162963 (Kucherlapati et al.). Кроме того, в данной области техники известны альтернативные системы трансхромосомных животных, экспрессирующих гены иммуноглобулинов человека, которые могут применяться для получения анти-hNKG2D антител по изобретению. Например, могут применяться мыши, несущие как перенесенные хромосомы тяжелой цепи чловека, так и перенесенные хромосомы легкой цепи человека, обозначаемые "ТС mice"; такие мыши описаны Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727. Кроме того, в данной области техники описаны коровы, несущие перенесенные хромосомы тяжелой и легкой цепи человека (Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894), которые могут применяться для получения анти-hNKG2D антител по изобретению.
Моноклональные антитела человека по изобретению могут также быть получены с применением методов фагового дисплея для скрининга библиотек генов иммуноглобулинов человека. Такие методы фагового дисплея для выделения антител человека хорошо известны в данной области техники. См., например, патенты США 5223409; 5403484 и 5571698 (Ladner et al.); патенты США 5427908 и 5580717 (Dower et al.); патенты США 5969108 и 6172197 (McCafferty et al.); и патенты США 5885793; 6521404; 6544731; 6555313; 6582915 и 6593081 (Griffiths et al.). Моноклональные антитела человека по изобретению могут также быть получены при помощи мышей SCID, в которых были введены иммунные клетки человека, так что при иммунизации у них развивается иммунный ответ с образованием антител человека. Такие мыши описаны например, в патентах США 5476996 и 5698767 (Wilson et al.).
При использовании мышей с Ig человека для получения антител по изобретению, таких мышей можно иммунизировать очищенным или обогащенным препаратом антигена hNKG2D и/или клетками, экспрессирующими hNKG2D, как описано Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; и публикации WO 98/24884 и WO 01/14424. Предпочтительно, мыши должны быть в возрасте 6-16 недель при первой инъекции. Например, очищенный или обогащенный препарат (5-50 мкг) антигена hNKG2D может применяться для иммунизации мышей с Ig человека интраперитонеально. В случае если иммунизации с применением очищенного или обогащенного препарата антигена hNKG2D не приводят к выработке антител, мышей можно также иммунизировать клетками, экспрессирующими hNKG2D, например, NK или Т-клеточной линии человека, или клетками млекопитающих, экспрессирующими рекомбинантный hNKG2D с или без DAP10, для усиления иммунного ответа.
Процедуры получения полностью человеческих моноклональных антител к hNKG2D подробно описаны ниже в Примере 1. Форму и количество вводимого антигена (например, полипептида hNKG2D или клеток, экспрессирующих hNKG2D), а также график введения и возможное применение адъювантов, таких как, например, полный адъювант Фрейнда или неполный адъювант Фрейнда, как правило, оптимизируют для каждой системы мышь-антиген, согласно установленным в данной области техники способам.
Иммунный ответ можно мониторировать в ходе протокола иммунизации по образцам плазмы, полученным при ретроорбитальном взятии крови, возможно проведение скрининга плазмы и сыворотки при помощи ИФА (согласно описанию ниже), для гибридизации могут использоваться мыши с достаточными титрами анти-hNKG2D иммуноглобулинов человека. Повторные инъекции антигена мышам могут проводиться внутривенно за 3 дня до забивания и удаления селезенки. Предполагается, что для каждой иммунизации может потребоваться проведение 2-3 гибридизаций.
5
Для получения гибридом, продуцирующих моноклональные антитела человека по изобретению, сленоциты и/или клетки лимфатических узлов иммунизированных мышей могут быть выделены и гибридизованы с соответствующей иммортализованной клеточной линией, такой как клеточной линией мышиной миеломы. Среди полученных в результате гибридом можно провести скрининг на образование антиген-специфичных антител. Например, суспензии одиночных клеток лимфоцитов селезенки иммунизированных мышей могут быть гибридизованы с одной шестой частью клеток Р3Х63-Ag8.653 несекретирующей миеломы мыши (АТСС, CRL 1580) с 50% ПЭГ. В альтернативном случае клетки могут быть гибридизованы при помощи электрогибридизации. Клетки сажают с концентрацией приблизительно 2×10 в плоскодонном планшете для микротитрования с последующей инкубацией в течение 2 недель в селективной среде, содержащей 20% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 18% кондиционированной среды "653", 5% Origen (IGEN), 4 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 5 мМ HEPES, 0,055 мМ 2-меркаптоэтанола, 50 ед/мл пенициллина, 50 мг/мл стрептомицина, 50 мг/мл гентамицина и 1Х HAT (Sigma; HAT добавляется через 24 ч спустя после гибридизации). Приблизительно через две недели клетки можно культивировать в среде, в которой HAT заменяют на НТ. Затем может быть проведен скрининг моноклональных IgM и IgG антител человека в отдельных клетках с помощью ИФА. Среду изучают, как правило, через 10-14 дней после начала обширного роста гибридом. Гибридомы, секретирующие антитела, затем могут быть пересажены, подвергнуты скринингу, и если результаты скрининга на IgG человека все еще будут положительны, моноклональные антитела могут быть субклонированы по меньшей мере дважды при помощи предельного разведения. Стабильные субклоны затем можно культивировать in vitro для получения небольших количеств анитела в культуральной среде для характеризования. Для очистки моноклональных антител человека отобранные гибридомы можно выращивать в 2-литровых вращающихся сосудах для очистки монокпональных антител. До проведения аффинной хроматографии с протеин-А сефарозой (Pharmacia, Piscataway, N.J.) супернатанты могут быть профильтрованы и сконцентрированы. Для проверки степени чистоты элюированного IgG может быть проведен электрофорез в геле и высокоэффективная жидкостная хроматография. Буферный раствор может быть заменен на PBS и концентрация определена при помощи спектроскопии. Моноклональные антитела могут быть разделены на аликвоты и храниться при -80°.
Антитела по изобретению также могут быть получены в трансфектомах клеток хозяев например, при помощи, сочетания методов получения рекомбинантной ДНК и способов трансфекции генов, хорошо известных в данной области техники (например, Morrison, S. (1985) Science 229:1202).
Например, для экспрессирования антител можно получить ДНК, частично или полностью кодирующие легкие и тяжелые цепи, при помощи стандартных методов молекулярной биологии (например, амплификации в ходе ПЦР или клонирования кДНК при помощи гибридом, экспрессирующих антитела, представляющие интерес) и ДНК могут быть вставлены в векторы экспрессии, так что гены будут оперативно связаны с последовательностями, контролирующими транскрипцию и трансляцию для выполнения предназначенной им функции регулирования транскрипции и трансляции гена антитела.
Вектор экспрессии и последовательности, контролирующие экспрессию, выбираются так, чтобы они были совместимы с используемыми для экспрессии клетками-хозяевами. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела могут быть вставлены в отдельные векторы или, что бывает чаще, оба гена вставляют в один и тот же вектор экспрессии. Гены антитела вставляют в вектор экспрессии с помощью стандартных способов (например, лигирования комплементарных сайтов рестрикции на фрагменте гена антитела и на векторе или лигирования по тупым концам, если сайты рестрикции отсутствуют). Вариабельные участки легкой и тяжелой цепи антител, описанных здесь, могут применяться для создания генов полноразмерного антитела любого изотипа путем их вставки в векторы экспрессии, которые уже кодируют константные участки тяжелой и легкой цепи желаемого изотипа, так что сегмент VH оказывается оперативно связан с СН сегментом (сегментами) в составе вектора, а сегмент VL оказывается оперативно связан с CL сегментом в составе вектора. Дополнительно или альтернативно, рекомбинантный вектор экспрессии может кодировать сигнальный пептид, облегчающий секрецию цепей антитела клетками-хозяевами. Ген цепи антитела может быть клонирован в вектор таким образом, чтобы внутри рамки считывания сигнальный пептид был связан с N-концом цепи антитела. Сигнальный пептид может быть сигнальным пептидом иммуноглобулина или гетерологичным сигнальным пептидом (т.е., сигнальным пептидом белка, не относящегося к иммуноглобулинам).
В дополнение к генам цепей антитела рекомбинантные векторы экспрессии по изобретению несут регуляторные последовательности, контролирующие экспрессию генов цепей антитела в клетках-хозяевах. Термин "регуляторная последовательность" включает промоторы, энхансеры и другие элементы, контролирующие экспрессию (например, сигналы полиаденилирования), контролирующие транскрипцию или трансляцию генов цепей антитела. Такие регуляторные последовательности описаны, например, Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)).
Любой специалист оценит, что дизайн вектора экспрессии, включая выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор клеток-хозяев, подлежащих трансформации, уровень экспрессии необходимого белка и т.д. Предпочтительные регуляторные последовательности для экспрессии в клетках хозяев-млекопитающих включают вирусные элементы, направляющие экспрессию белка в клетках млекопитающих на высоком уровне, такие как промоторы и/или энхансеры, полученные на основе цитомегаловируса (ЦМВ), вируса Simian 40 (SV40), аденовируса (например, аденовирусный главный поздний промотор (AdMLP) и полиомы. В альтернативном случае могут применяться невирусные регуляторные последовательности, такие как промотор убиквитина или промотор р-глобина. Кроме того, могут применяться регуляторные элементы, состоящие из последовательностей из различных источников, таких как промоторная система Sra, содержащая последовательности раннего промотора SV40 и длинный концевой повтор вируса Т клеточного лейкоза человека 1 типа (Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472).
Кроме генов цепей антитела и регуляторных последовательностей рекомбинантные векторы экспрессии по изобретению могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, регулирующие репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, точки начала репликации) и гены маркеров селекции. Ген маркера селекции облегчает проведение селекции клеток-хозяев, в которые был внедрен вектор (см., например патенты США 4399216, 4634665 и 5179017 (Axel et al.)). Например, как правило, ген маркера селекции придает устойчивость клеткам-хозяевам, в которые был внедрен вектор, к лекарствам, таким как G418, гигромицин или метотрексат. Предпочтительные гены маркеров селекции включают ген дигидрофолатредуктазы (DHFR) (для применения в dhfr-клетках- хозяевах с селекцией/амплификацией на фоне метотрексата) и ген «neo» (для селекции на фоне G418).
Для экспрессии легкой и тяжелой цепей клетки-хозяева трансфецируют вектором (векторами) экспрессии, кодирующим тяжелые и легкие цепи, при помощи стандартных методик. Различные трактовки термина "трансфекция" подразумевают разнообразные методы, которые обычно применяются для внедрения экзогенной ДНК в клетки-хозяева прокариот или эукариот, например, электропорацию, преципитацию фосфатом кальция, трансфекцию с помощью DEAE-декстрана и т.п. Несмотря на теоретическую возможность экспрессировать антитела по изобретению как в клетках-хозяевах прокариот, так и эукариот, экспрессия антител в клетках эукариот, и наиболее предпочтительно, в клетках-хозяевах млекопитающих, более предпочтительна, поскольку такие клетки эукариот, и особенно клетки млекопитающих, с большей вероятностью, чем клетки прокариот, обеспечат сборку и секрецию правильно свернутого и иммунологически активного антитела. Было описано, что экспрессия прокариотами генов антител неэффективна для получения большого количества активного антитела (Boss, M. A. and Wood, С.R. (1985) Immunology Today 6:12-13).
Предпочтительные клетки-хозяева млекопитающих для экспрессии рекомбинантных антител по изобретению включают клетки яичников китайского хомячка (клетки СНО) (включая клетки dhfr-CHO, описанные Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Nail. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, используемые с селективным маркером DHFR, например, согласно описанию R. J. Kaufman и Р. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), клетки миеломы NSO, клетки COS и клетки SP2. В частности, для применения в клетках миеломы NSO, другой предпочтительной системой экспрессии является GS-система экспрессии генов, описанная в WO 87/04462, WO 89/01036 и ЕР 338,841. При внедрении рекомбинантных векторов экспрессии, кодирующих гены антитела, в клетки-хозяева млекопитающих антитела продуцируются культивируемыми клетками-хозяевами на протяжении периода времени, достаточного для экспрессии антитела в клетках-хозяевах или, более предпочтительно, для секреции антитела в культуральную среду, в которой выращиваются клетки-хозяева. Антитела могут быть выделены из культуральной среды с применением стандартных способов очистки белков.
Характеристика антител
После получения или очистки или в составе процедуры скрининга или селекции, могут быть исследованы функциональные характеристики анти-hNKG2D антитела по изобретению. Функциональные свойства, представляющие интерес, включают, например, специфичность связывания антитела с hNKG2D, конкуренцию антитела с лигандами hNKG2D, конкуренцию антитела с референсными антителами (такими как, например, 16F16, 16F31, MS и 21F2), эпитоп, с которым связывается антитело, аффинность взаимодействия антиген-анитело, и свойства антитела как агониста/антагониста.
Ниже следует краткое описание примеров тестов для характеризации антитела. Некоторые из них описаны далее в последующих разделах и/или описаны в Примерах.
(1) Специфичность антитела к hNKG2D можно оценить, подтвердив, что моноклональное антитело (или, как часть процедур скрининга животных, сыворотки, содержащие поликлональные антитела) связывается с клетками, экспрессирующими NKG2D, но не с NKG2D-негативными клетками. Клеточные линии с или без NKG2D инкубируют с антителом, и затем инкубируют со вторичным антителом, меченным напрямую, и визуализируют, например, при помощи проточной цитометрии.
(2) Блокирование связывания с лигандами может быть оценено путем инкубации клеток, экспрессирующих NKG2D, с антителом или супернатантом гибридомы или без них, с последующей инкубацией с белком-лигандом, связанным с mFc, и вторичным антителом, специфичным к лиганду; уровень связывания с лигандом и его блокирование определяется при помощи проточной цитометрии. Блокирование может быть выражено в % связывания с лигандом после пре-инкубации по сравнению с отсутствием пре-инкубации, когда более низкое связывание обнаруживается после пре-инкубации.
(3) Конкуренция за сайт связывания, используемый одним или более из референсных анти-NKG2D антител, может быть оценена аналогичным образом, с тем исключением, что пре-инкубация может либо выполняться с антителом по изобретению, либо с референсным антителом (например, ON72 или 149810), с последующей инкубацией с другим антителом и его детекцией.
(4) Параметры аффинности антител, включая скорость ассоциации и диссоциации, могут определяться на аппаратах Biacore. Например, можно иммобилизовать на чипе белок hNKG2D-Fc, антитело пропускать по поверхности чипа и определять скорости ассоциации и диссоциации и рассчитывать KD.
(5) Индукция интернализации NKG2D под воздействием антител может быть измерена путем инкубации клеток, экспрессирующих hNKG2D, с антителом или без антитела в течение ночи, с последующим повторным добавлением антитела и определением уровня NKG2D (т.е. уровня связанного антитела) при помощи проточного цитометра.
51
(6) Способность антитела блокировать опосредованную лигандом hNKG2D гибель можно, например, при помощи клеточных линий NK: NK92 или NKL, используемых в качестве эффекторных клеток, вызывающих гибель нагруженных Cr клеток-мишеней, экспрессирующих лиганд NKG2D: MICA, MICB или ULBP1-4.
(7) Перекрестное реагирование анти-NKG2D антител человека с NK и CD8+ Т клетками обезьян, но не с CD4+ Т клетками (как и у людей), может быть продемонстрировано при помощи проточной цитометрии после инкубации МКПК обезьяны или человека с антителом hNKG2D и вторичным антителом, наряду с маркерами клеток различных типов в составе МКПК, и анализа связывания NKG2D с различными субпопуляциями.
(8) Активация NKG2D после связывания с антителом может быть измерена как индукция клеточной пролиферации CD8+ клеток в составе популяции МКПК после стимуляции через Т-клеточный рецептор, CD28 и/или NKG2D, с предварительной стимуляцией (например, через TCR, CD28 и IL-2 или IL-15) или без таковой.
Тесты связывания
Данное изобретение описывает антитела и антиген-связывающие фрагменты и их иммуноконъюгаты, связывающие hNKG2D. Для оценки связывания антитела с hNKG2D может применяться любой из всего разнообразия тестов. В данной области техники известны и могут найти применение протоколы на основе ИФА, радиоиммунологические тесты, Вестерн блоттинг, система BIACORE и другие тесты конкурентного связывания, в числе прочих. Кроме того, в Примерах описаны несколько тестов связывания, включая тесты конкурентного связывания.
Например, могут применяться простые тесты связывания, в которых тестируемое антитело инкубируют в присутствии белка-мишени или эпитопа (например, NKG2D или его части), несвязанные антитела отмывают и присутствие связанных антител оценивают, например, с помощью радиоактивных меток, физических методов, таких как масс-спектрометрия, или определения прямых или непрямых флуоресцентных меток с помощью, например, цитофлуориметрического анализа (например, FACScan). Такие способы хорошо известны специалистам в данной области техники. Любой уровень связывания, превышающий уровень, наблюдаемый с контрольным, неспецифическим антителом, указывает на то, что антитело связывается с мишенью специфическим образом.
В таких тестах способность тестируемого антитела связываться с клеткой-мишенью или NKG2D человека можно сравнивать со способностью контрольного белка (негативного контроля), например, антитела, выработанного против антигена с иной структурой, или белка или пептида, не относящегося к иммуноглобулинам, связываться с той же мишенью. Антитела или фрагменты, при использовании любого подходящего теста связывающиеся с клетками-мишенями или NKG2D с аффинностью выше, чем у контрольного белка на 25%, 50%, 100%, 200%, 1000%, или более, обозначаются как "специфически связывающиеся" или "специфически взаимодействующие" с мишенью, и являются предпочтительными для применения в терапевтических способах, описанных ниже. Также можно оценивать способность тестируемого антитела влиять на сязывание контрольного антитела (позитивного контроля) к NKG2D, например, 16F16, 16F31, MS или 21F2.
В одном аспекте изобретение описывает анти-hNKG2D антитела, имеющие одинаковые биологические характеристики и/или существенно идентичные последовательности с VH и/или VL участками 16F16, 16F31, MS или 21F2. Одним из примеров биологических характеристик является связывание с эпитопом 16F16, 16F31, MS или 21F2, т.е. с соответствующими участками внеклеточного домена hNKG2D, с которыми связываются антитела 16F16, 16F31, MS или 21F2. Для скрининга антител, связывающихся с эпитопом 16F16, 16F31, MS или 21F2, можно выполнять обычный тест с перекрестным блокированием связывания, как описано в Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988).
В примерах тестов с перекрестным блокированием связывания или тестов конкурентного связывания, антитело 16F16, 16F31, MS или 21F2 (контроль) и тестируемое антитело смешивают (или предварительно адсорбируют) и добавляют к образцу, содержащему NKG2D. В определенных воплощениях предварительно смешивают контрольные антитела с различным количеством тестируемого антитела (например, 1:10 или 1:100) в течение определенного времени перед добавлением образца, содержащего NKG2D. В других воплощениях контроль и тестируемое антитело в различных количествах просто смешивают во время инкубации с антигеном/образцом-мишенью. При возможности отличить свободные антитела от связанных (например, при помощи методов сепарации или отмывки для удаления несвязанных антител) и контрольное антитело от тестируемого (например, с применением вторичных антител, специфичных в отношении вида или изотипа, при помощи специфического мечения контрольного антитела детектируемой меткой или при помощи физических методов, таких как масс-спектрометрия, для того, чтобы отличить разные компоненты), существует возможность определить, снижает ли тестируемое антитело связывание контрольного антитела с антигеном, что будет указывать на то, что тестируемое антитело распознает практически тот же эпитоп, что и контрольное. В таком тесте связывание контрольного (меченного) антитела в присутствии полностью нерелевантного антитела является контрольным высоким значением. Контрольное низкое значение получают при инкубации меченного контрольного антитела (позитивного контроля) с немеченным контрольным антителом, когда связывание меченного антитела будет снижаться в результате конкуренции.
В тесте значимое снижение реакционной способности меченного антитела в присутствии тестируемого антитела указывает на то, что тестируемое антитело распознает тот же самый эпитоп, т.е. на его кросс-реактивность с меченным контрольным антителом. Любое тестируемое антитело или компонент, снижающие связывание меченного контроля с антигеном/мишенью по меньшей мере на 50% или, более предпочтительно, на 70%, при любом соотношении контроля и тестируемого антитела или компонента между приблизительно 1:10 и приблизительно 1:100, считаются антителом или компонентом, связывающимся практически с тем же эпитопом или детерминантой, что и контроль. Предпочтительно, такое тестируемое антитело или компонент будут снижать связывание контроля с антигеном/мишенью по меньшей мере на 90%. Тем не менее, в данном изобретении может применяться любой компонент или антитело, снижающие связывание контрольного антитела или компонента в любой измеримой степени,.
В одном воплощении конкуренцию можно оценить при помощи проточной цитометрии. Клетки, несущие hNKG2D, вначале инкубируют с контрольным антителом, которое известно способностью специфически связываться с рецептором (например, Т или NK клетки, экспрессирующие hNKG2D или клетки BaF/3, экспрессирующие рекомбинантный hNKG2D, с антителом 16F16, 16F31, MS или 21F2), а затем с тестируемым антителом, которое может быть мечено, например, флуорохромом или биотином. Считается, что тестируемое антитело конкурирует с контрольным, если связывание, полученное при предварительной инкубации с контрольным антителом в насыщающих концентрациях, составляет 80%, предпочтительно 50%, 40% или менее от уровня связывания (средней интенсивности флуоресценции), полученного в присутствии антитела без предварительной инкубации с контролем. В альтернативном случае считается, что тестируемое антитело конкурирует с контролем, если связывание, полученное в присутствии меченного (флуорохромом или биотином) контрольного антитела с клетками, пре-инкубированными с тестируемым антителом в насыщающих концентрациях, составляет 80%, предпочтительно 50%, 40%, или менее от связывания, полученного в отсутствие пре-инкубации с антителом. См. Пример 5 как пример анализа конкуренции антител.
Аналогичные тесты со преекрестным блокированием могут также использоваться для оценки влияния тестируемого (гуманизированного) антитела на связывание естественного лиганда NKG2D, такого как MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, или члена семейства RAET1, при простой замене 16F16, 16F31, MS или 21F2 на подходящую форму лиганда hNKG2D. Одной из подходящих форм, описанных в Примерах, являются белки лиганда (например, MICA), сшитые с Fc-частью антитела. Наличие лиганда, конъюгированного с Fc-участком, позволяет детектировать гибридный белок при помощи антител, специфичных в отношении видов животных, от которых получен Fc-участок, например, при помощи антимышиных антител козы для детекции Fc-участка грызунов.
+
-
В одном воплощении используется клеточный тест, в котором клетки, экспрессирующие hNKG2D, например, CD4CD28 клетки пациентов с ревматоидным артритом (или аналогичные клетки пациентов с другим аутоиммунным или воспалительным нарушением) инкубируют с лигандом NKG2D, таким как MICA, MICB или белок ULBP, например, в форме белка сшитого с Fc-фрагментом, или с клетками, экспрессирующими любой из этих лигандов, и определяют способность анти-NKG2D антитела или другой молекулы блокировать активацию клеток. В альтернативном случае определяют базальный уровень активности рецептора NKG2D в отсутствие лиганда, и измеряют способность антитела или компонента вызывать снижение базальной активности. В одной форме воплощения для идентификации компонентов, способных блокировать активацию рецептора, или иным образом снижать его активность, применяется высокопроизводительный скрининг. См. Пример 3 в качестве примера теста с конкуренцией лигандов.
Предпочтительно моноклональные антитела, распознающие эпитоп NKG2D, будут реагировать с эпитопом, представленным на существенной части CD4+ Т клеток, особенно CD4+CD28- Т клеток, у пациентов, таких как пациентов с ревматоидным артритом, но не будут значимо реагировать с другими клетками, т.е. иммунными или не-иммунными клетками, не экспрессирующими NKG2D. Соответственно, когда антитело специфически распознает hNKG2D на NK или Т клетках, можно исследовать его способность связываться с Т клетками, полученными у пациентов с аутоиммунными или воспалительными нарушениями, такими как ревматоидный артрит. Специалисты оценят, что данное изобретение может применяться для лечения любого нарушения, патогенез которого связан с активностью NKG2D, независимо от типа клеток, экспрессирующих рецептор (например, CD4+ Т клетки, CD8+ Т клетки, NK клетки и т.д.), и антитела можно исследовать на их способность связываться с рецептором на клетках любого типа, имеющих отношение к определенному нарушению. Например, если отмечено, что определенное нарушение связано с повышенной активностью или пролиферацией NK-клеток, экспрессирующих NKG2D, то можно выделить антитела и протестировать их на NK клетках, экспрессирующих такой же рецептор.
В одном воплощении антитела анализируют в иммунологическом тесте для проверки их способности связывать NKG2D-экспрессирующие клетки, например, CD4+CD28- Т клетки, полученные у пациентов с ревматоидным артритом. Например, лимфоциты периферической крови (PBLs) получают от множества пациентов, и обогащают PBLs по CD4+, предпочтительно по CD4+CD28- клеткам, например, при помощи проточной цитометрии с использованием соответствующих антител. Способность заданного антитела связываться с клетками затем оценивается при помощи стандартных способов, хорошо известных специалистам в данной области техники. Антитела, которые оказываются способными связываться со значительной частью (например, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или более) клеток, которые, как известно, экспрессируют NKG2D, например, NK клеток, CD8 Т клеток, CD4 Т клеток пациентов с РА и т.д., у значительной части пациентов (например, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% или более) могут считаться подходящими для применения в данном изобретении, как для диагностических целей для определения экспрессии рецептора NKG2D на клетках пациента, так и для применения в описанных здесь терапевтических способах, например, для применения в качестве подходящих для людей блокирующих или, в альтернативном случае, цитотоксических антител. Для оценки связывания антител с клетками, антитела могут быть помечены напрямую или опосредованно. При опосредованном мечении, как правило, добавляют вторичное меченное антитело. Связывание антител с клетками может затем определяться при помощи, например, цитофлуориметрического анализа (например, FACS). Такие методы хорошо известны в данной области техники.
В некоторых аспектах изобретения, например, когда нежелательно вызывать гибель клеток, экспрессирующих NKG2D, антитела по изобретению предпочтительно не обладают значимым специфичным связыванием с Fc рецепторами. Такие антитела могут содержать константные участки различных тяжелых цепей, известных тем, что они не связываются с Fc рецепторами. Одним таким примером является константный участок lgG4. В альтернативном случае фрагменты антитела, не содержащие константных участков, такие как фрагменты Fab или F(ab')2, могут применяться для того, чтобы избежать связывания с Fc рецепторами. Связывание с Fc рецепторами можно оценить согласно известным в данной области техники способам, включая, например, исследование связывания антитела с белком Fc рецептора в системе BIACORE. Также, может применяться антитело любого другого типа, в котором Fc часть модифицирована с целью минимизации или предотвращения связывания с Fc рецепторами (см., например, WO03101485, описание которых включено сюда путем ссылки). Такие тесты для оценки связывания с Fc рецепторами, например, тесты, основанные на использовании клеток, хорошо известны в данной области техники и описаны, например, в WO03101485.
Функциональные тесты
Для оценки полезных свойств тестируемого компонента или антитела можно использовать любое подходящее изменение, отражающее активность NKG2D. Например, можно измерять различные эффекты, например, в тестах с применением клеток, такие как изменение экспрессии генов, продукцию цитокинов, фосфорилирование сигнальных молекул, клеточный рост, клеточную пролиферацию, рН, внутриклеточные вторичные мессенджеры, например, Са2+, IP3, cGMP или сАМР, или активность, такую как цитотоксическую активность или способность активировать другие Т клетки. Например, активность рецептора можно оценить путем опредения экспрессии генов, задействованных в ответе NKG2D, например, CD25, IFN-гамма или TNF-альфа (см., например, Groh et al. (2003) PNAS 100: 9452-9457; Andre et al. (2004) Eur. J. Immunol 34: 1-11). В альтернативном случае активность NKG2D может быть оценена путем инкубации CD4+CD28-NKG2D+клеток в присутствии лиганда или активирующего анти-NKG2D антитела, а также анти-CD3 антитела для оценки способности компонента или тестируемого антитела ингибировать высвобождение TNF-альфа или IFN-гамма Т клетками. В альтернативном случае CD4+CD28-NKG2D+Т клетки можно инкубировать в присутствии лиганда, например, MICA, MICB, ULBP-1, ULBP-2, ULBP-3, и т.д., или лиганд-продуцирующих клеток, например, аутологичных MIC+ синовиоцитов РА, и оценивать способность тестируемого антитела или компонента ингибировать продукцию цитокинов (например, IFN-гамма или TNF-альфа), или пролиферацию Т клеток.
В тестах in vitro возможно использование клеток, полученных у пациентов с аутоиммунными или воспалительными заболеваниями, такими как РА, например, CD4+CD28- клеток, экспрессирующих NKG2D, полученных у пациентов с РА (или клеточных линий, установленных на их основе), но, в общем, могут использоваться любые клетки, экспрессирующие NKG2D. Например, линии иммунных клеток, не относящихся к РА, например, линии Т клеток, можно трансфецировать NKG2D-кодирующим трансгеном и применять в данных тестах, при условии что экспрессия рецептора будет измеримо изменять активность клеток, например, придавать им способность к активации под воздействием лиганда NKG2D. Клеточные линии могут, например, быть установлены с применением CD4+CD28-NKG2D+ клеток пациентов с РА, например, лимфоцитов периферической крови или Т клеток, выделенных из синовиальных оболочек. Такие клетки можно культивировать в присутствии IL-15 для обеспечения стабильной экспрессии NKG2D (см., например, Groh et al. (2003) PNAS 100: 9452-9457, описание которых включено сюда во всей полноте путем ссылки).
51
Если анти-hNKG2D антитело ослабляет или блокирует взаимодействия NKG2D с одним или более из его лигандов, или конкурирует с антителом, которое известно своей способностью блокировать взаимодействие с лигандом hNKG2D, его можно применять для снижения NKG2D-опосредованной активации NK или Т клеток. Ее можно оценить в обычных цитотоксических тестах. Пример 6 описывает пример цитотоксического теста, NKG2D-лиганд опосредованную гибель клеток-мишеней. В данном случае способность анти-hNKG2D антител снижать или ингибировать опосредованную NK клетками гибель клеток BaF/3, трансфецированных MICA, оценивается путем измерения высвобождения Cr клетками-мишенями.
В других аспектах может быть целесообразно обеспечить отсутствие у антител по изобретению выраженной активности как агонистов. Для этой цели могут применяться несколько тестов, включая следующие.
7
Один тест позволяет оценивать пролиферацию и продукцию цитокинов после активации антителами, либо растворимыми, либо связанными с поверхностью планшета, в сочетании с анти-CDS и/или анти-CD28 антителами или МКПК здоровых доноров или пациентовс ВЗК. В этом методе МКПК выделяют общепринятыми способами у здоровых лиц или пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника (ВЗК). Клетки окрашивают CFSE (Molecular probes, кат. номер С34554). К 10 клеткам (в 0,5 мл PBS с 2% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS)) добавляют 1 мкл CFSE (0,5 мМ) и инкубируют клетки при 37°С в течение 10 мин. Затем добавляют 2 мл FBS и смесь оставляют на 1 мин при комнатной температуре. Затем клетки отмывают 3 раза при центрифугировании со средой RPMI-1640 (12 мл). После отмывания клетки ресуспендируют в 1 мл среды (например, RPMI-1640) с 2% FBS.
96-луночные планшеты покрывают 30 мкл антитела к Fc мыши (Jackson - Immuno Resarch 115-006-008) в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем отмывают PBS. Антитела (анти-CD3 Biosceince cat#14-0037-82, анти-CD28 cat#348046 Becton Dickison) добавляют согласно схеме, приведенной выше, и оставляют в лунках:
Клетки без добавления реагентов
CD3 0,1 или 0,3нг/мл
CD3 0,1 или 0,3 нг/мл + CD28 0,2 мкг/мл
CD3 0,1 или 0,3 нг/мл + С028 0,2 мкг/мл+anti-NKG2D 0,2 мкг/мл
CD3 0,1 или 0,3 нг/мл+анти-NKG2D 0,2 мкг/мл
Затем, добавляют 100000 меченных CFSE МКПК и оставляют на 3 дня. Затем собирают супернатант для анализа на цитокины и МКПК анализируют при помощи проточной цитометрии с учетом типа лимфоцитов, используя анти-CD56, анти-CD4, анти-CD8, а также CFSE для оценки пролиферации.
В другом тесте оценивают эффект цитотоксического потенциала CD8+ Т клеток, направленного на клетки-мишени, не имеющие лигандов NKG2D. Если связывание усиливает цитотоксический потенциал клеток, это свидетельствует о проявлении агонистической активности. Кратко, стимулированные IL-2 МКПК здоровых лиц инкубируют с клетками р815, экспрессирующими MICA, или с нетрансфецированными клетками р815, а также с анти-CD3 антителом (что приведет к «перенаправлению» киллерного эффекта за счет связывания с Fc рецепторами на клетках р815) и CD8 цитотоксическими Т клетками. Затем анализируют, способно ли анти-NKG2D антитело, не связывающееся с клетками р815 (например, антитело с изотипом lgG4 человека), блокировать MICA-NKG2D-обусловленное связывание и/или усиливать CD3-p815 перенаправленное связывание. Таким образом, можно продемонстрировать, что активность CD8+ Т клеток не повышается при инкубации клеток р815 с анти-CD3 антителом и дополнительным анти-NKG2D антителом, тогда как то же самое анти-NKG2D антитело может оказаться эффективным, если оно будет блокировать взаимодействие NK-MICA при индуцированной р815 гибели на той же самой популяции МКПК.
В другом тесте можно исследовать, происходит ли активация путей передачи сигнала NKG2D и молекул, передающих сигнал, при добавлении одного или более анти-NKG2D антител. Для этого можно использовать клеточные линии NK (такие как, например, клетки NKL или клетки NK-92) или NK или CD8+ Т клетки человека, выделенные из периферической крови. Например, клетки NKL можно инкубировать с анти-NKG2D антителом человека в растворе или в связанном с поверхностью планшета виде, например, с Fc-MICA или облученными клетками, экспрессирующими MICA, в качестве контроля. После инкубации в течение подходящего периода времени (например, 5, 10, 30 мин), клетки лизируют в присутствии ингибиторов протеаз и фосфатаз на льду и посредством стандартных методов Вестерн блоттинга анализируют в них уровни одной или более фосфориллированных сигнальных молекул, располагающихся «в нисходящем направлении» относительно стимулированного NKG2D (например, Pi3K, Akt и vav).
В тестах на животных любое физиологическое или патологическое следствие активации NKG2D в клетках в организме животного может применяться для оценки активности антитела или тестируемого компонента.
Например, в моделях на животных можно вводить CD4+CD28-NKG2D+ клетки в суставы совместно с введением или без введения клеток, продуцирующих лиганды, таких как синовиоцитов, продуцирующих MICA, и оценивать воспаление или повреждение тканей. Затем можно вводить тестируемые компоненты или антитела и определять их способность ингибировать, замедлять, вызывать обратное развитие или любым способом влиять на воспаление или повреждение тканей.
Также можно проводить эксперименты с эксплантацией клеток синовиальных оболочек пациентов с ревматоидным артритом (РА), для изучения эффектов блокирования NKG2D на спонтанный выброс провоспалительных цитокинов (см., например, Brennan et al., Lancet 1989; 2 (8657); 244-247). В таком тесте исследуют анти-hNKG2D анитела, имеющие человеческое происхождение или гуманизированные, на культурах клеток синовиальных оболочек пациентов с РА и сравнивают, например, с анти-hNKG2D антителами грызунов в концентрациях, которые, как было показано, с успехом блокируют связывание лигандов и функцию NKG2D. Клетки синовиальных обьлочек пациентов с РА культивируют в течение 48 ч в отсутствие или в присутствии анти-NKG2D антител или изотипического контроля. В качестве положительного контроля можно использовать известные противовоспалительные лекарственные препараты. Эффекты анти-NKG2D антител, как правило, тестируют при концентрациях до 30 мкг/мл на синовиальных оболочках 6 пациентов с РА. Жизнеспособность клеток анализируют в тесте с окрашиванием живых клеток (например, в тесте с МТТ) для определения, обладает ли добавляемый реагент какой-либо цитотоксичностью. Затем проводят ИФА для определения уровня таких цитокинов, как, например, TNFα, IL-1β и IL-6 в культуральных супернатантах.
В альтернативном случае антитела по изобретению можно исследовать в экспериментальных моделях, например, псориаза или язвенного колита. Образец кожи, пораженной псориазом, можно трансплантировать мыши SCID совместно с МКПК самого пациента, а затем определить эффект от введения тестируемого компонента и их способность ингибировать, замедлять, вызывать обратное развитие или любым способом влиять на воспаление или повреждение тканей. Kjellev et al. (Eur J Immunol 2008; 37:1397-1406) и Ito et al. (Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2008; 294:G199-G207) описывают экспериментальные модели для оценки лечения язвенного колита с применением антитела NKG2D против грызунов.
Фармацевтические препараты
В одном воплощении данное изобретение описывает фармацевтическую композицию или препарат, включающие анти-hNKG2D антитела согласно данному описанию совместно с одним или более носителями.
Соответственно, одним из примеров аспекта изобретения является фармацевтический препарат, содержащий такое антитело, которое представлено в концентрации от 1 мг/мл до 500 мг/мл, причем указанный препарат имеет рН от 2,0 до 10,0. Препарат может также содержать буферную систему, консервант (консерванты), агент (агенты) для регулирования тоничности, хелатирующий агент (агенты), стабилизаторы и/или сурфактанты. В одном воплощении фармацевтический препарат представляет собой водный препарат, т.е. препарат, содержащий воду. Такой препарат, как правило, представляет собой раствор или суспензию. В следующем воплощении фармацевтический препарат представляет собой водный раствор. Термин "водный препарат" означает препарат, содержащий по меньшей мере 50% (объем/объем) воды. Аналогичным образом, термин "водный раствор" означает раствор, содержащий по меньшей мере 50% (объем/объем) воды, а термин "водная суспензия" означает суспензию, содержащую по меньшей мере 50% (объем/объем) воды.
В другом воплощении фармацевтический препарат представляет собой высушенный вымораживанием препарат, в который перед введением врач или пациент могут добавлять растворители и/или дилюенты.
В другом воплощении фармацевтический препарат представляет собой высушенный препарат (например, высушенный вымораживанием или высушенный распылением) готовый к применению без какого-либо предварительного растворения.
В следующем аспекте фармацевтический препарат содержит водный раствор такого антитела и буфер, где антитело представлено в концентрации от 1 мг/мл или выше, и где указанный препарат имеет рН от приблизительно 2,0 до приблизительно 10,0.
В следующем воплощении рН препарата находится в диапазоне, выбранном из перечня, состоящего из приблизительно от 2,0 до приблизительно 10,0, приблизительно от 3,0 до приблизительно 9,0, приблизительно от 4,0 до приблизительно 8,5, приблизительно от 5,0 до приблизительно 8,0 и приблизительно от 5,5 до приблизительно 7,5.
В следующем воплощении препарат включает буфер, который выбран из группы, состоящей из ацетата натрия, карбоната натрияе, цитрата, глицилглицина, гистидина, глицина, лизина, аргинина, дигидрофосфата натрия, гидрофосфата натрия, фосфата натрия и трис(гидроксиметил)-аминометана, бицина, трицина, яблочной кислоты, сукцината, малеиновой кислоты, фумаровой кислоты, винной кислоты, аспарагиновой кислоты или их смесей. Каждый из этих конкретных буферов составляет альтернативное воплощение изобретения.
В следующем воплощении препарат также или в альтернативном случае содержит фармацевтически приемлемый консервант. Консервант может быть выбран из группы, состоящей, например, из фенола, о-крезола, m-крезола, p-крезола, метил p-гидроксибензоата, пропил p-гидроксибензоата, 2-феноксиэтанола, бутил p-гидроксибензоата, 2-фенилэтанола, бензилового спирта, хлоробутанола и тимеросала, пронопола, бензойной кислоты, имидомочевины, хлорогексидина, дегидроацетата натрия, хлоркрезола, этил p-гидроксибензоата, бензетоний хлорида, хлорфенезина (3р-хлорфеноксипропан-1,2-диола) или их смесей. Консервант может быть представлен, например, в концентрации от 0,1 мг/мл до 20 мг/мл, от 0,1 мг/мл до 5 мг/мл, от 5 мг/мл до 10 мг/мл или от 10 мг/мл до 20 мг/мл. Каждый из этих конкретных консервантов представляет собой альтернативное воплощение изобретения. Применение консерванта в фармацевтических композициях хорошо известно специалистам. Для удобства приводится следующая ссылка: Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19 издание, 1995.
В следующем воплощении препраат также или в альтернативном случае включает изотонический агент. Изотонический агент может, например, быть выбран из группы, состоящей из соли (например, хлорида натрия), углевода или многоатомного спирта, аминокислоты (например, L-глицина, L-гистидина, аргинина, лизина, изолейцина, аспарагиновой кислоты, триптофана, треонина), альдита (например, глицерола (глицерина), 1,2-пропандиола (пропиленгликоля), 1,3-пропандиола, 1,3-бутандиола) полиэтиленгликоля (например, PEG400) или их смесей. Может применяться любой углевод, такой как моно-, ди-, или полисахариды, или водорастворимые глюканы, вкючая, например, фруктозу, глюкозу, маннозу, сорбозу, ксилозу, мальтозу, лактозу, сахарозу, трегалозу, декстран, пуллулан, декстрин, циклодекстрин, растворимый крахмал, гидроксиэтилкрахмал и карбоксиметилцеллюлозу-Na. В одном воплощении добавляемый углевод представляет собой сахарозу. Ммногоатомный спирт по определению является С4-С8 углеводородом, имеющим по меньшей мере одну --ОН группу и включает, например, маннитол, сорбитол, инозитол, галактит, дульцит, ксилит и арабит. В одном воплощении добавляемым многоатомным спиртом является маннитол. Углеводы или многоатомные спирты, упомянутые выше, могут применяться отдельно или в сочетании. Для применяемого количества не существует определенных ограничений, до тех пор, пока углевод или многоатомный спирт растворяется в водном препарате и не оказывает нежелательного воздействия на стабилизирующий эффект, достигаемый в способах по изобретению. Концентрация углевода или многоатомного спирта может варьировать, например, между приблизительно 1 мг/мл и приблизительно 150 мг/мл. Изотонический агент может быть представлен в концентрации, например, от 1 мг/мл до 50 мг/мл, от 1 мг/мл до 7 мг/мл, от 8 мг/мл до 24 мг/мл или от 25 мг/мл до 50 мг/мл. Каждый из этих конкретных изотонических агентов составляет альтернативное воплощение изобретения. Применение изотонического агента в фармацевтических композициях хорошо известно специалистам. Для удобства приводится следующая ссылка: Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19 издание, 1995.
В следующем воплощении препарат также или в альтернативном случае содержит хелатирующий агент. Хелатирующий агент может быть выбран, например, из солей этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), лимонной кислоты и аспарагиновой кислоты и их смесей. Хелатирующий агент может, например, быть представлен в концентрации от 0,1 мг/мл до 5 мг/мл, от 0,1 мг/мл до 2 мг/мл или от 2 мг/мл до 5 мг/мл. Каждый из этих конкретных хелатирующих агентов составляет альтернативное воплощение изобретения. Применение хелатирующих агентов в фармацевтических композициях хорошо известно специалистам. Для удобства приводится следующая ссылка: Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19 издание, 1995.
В следующем воплощении изобретения препарат также или в альтернативном случае содержит стабилизатор. Применение стабилизаторов в фармацевтических композициях хорошо известно специалистам. Для удобства приводится следующая ссылка: Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19 издание, 1995. Более конкретно, композиции по изобретению могут быть стабилизированными жидкими фармацевтическими композициями, терапевтически активные компоненты которых включают полипептид, который, возможно, характеризуется формированием агрегатов при хранении в жидких фармацевтических препаратах. Под "формированием агрегатов" подразумевается физическое взаимодействие между молекулами полипептида, которое приводит к формированию олигомеров, которые могут оставаться в растворе, или большими видимыми агрегатами, которые преципитируют из раствора. Под словосочетанием "при хранении" подразумевается то, что после приготовления фармацевтической композиции или препарата они не вводятся субъекту немедленно. Точнее, после приготовления они упаковываются для хранения, либо в жидкой форме или в замороженном состоянии или в высушенной форме для последующей реконституции в жидкую форму или в другую форму, пригодную для введения субъекту. Под "высушенной формой" подразумевается то, что жидкую фармацевтическую композицию или препарат высушивают либо при помощи сушки вымораживанием (т.е. лиофилизации; см., например, Williams and Polli (1984) J. Parenteral Sci. Technol. 38:48-59), сушки распылением (см. Masters (1991) in Spray-Drying Handbook (5th ed; Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.), pp.491-676; Broadhead et al. (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169-1206; and Mumenthaler et al. (1994) Pharm. Res. 11:12-20), или воздушной сушки (Carpenter and Crowe (1988) Cryobiology 25:459-470; and Roser(1991) Biopharm. 4:47-53). Формирование агрегатов полипептидом при хранении жидкой фармацевтической композиции может нежелательным образом сказываться на биологической активности этого полипептида, что приведет к потере терапевтической эффективности фармацевтической композиции. Кроме того, формирование агрегатов может вызвать другие проблемы, такие как забивание трубок, мембран или помп при введении фармацевтической композиции, содержащей полипептид, через инфузионную систему.
Фармацевтические композиции по изобретению могут также или в альтернативном случае содержать аминокислотные остатки в количестве, достаточном для уменьшения формирования агрегатов полипептидом при хранении композиции. Под "аминокислотными остатками" подразумевается аминокислота или сочетание аминокислот, где любая заданная аминокислота представлена либо в свободной форме или в форме соли. При использовании комбинации аминокислот все аминокислоты могут быть представлены в своей свободной форме, все могут быть представлены в форме своих солей или некоторые могут быть представлены в своей свободной форме, тогда как другие представлены в форме своих солей. В одном воплощении аминокислоты для применения в приготовлении композиций по изобретению представлены несущими заряженную боковую цепь, такими как аргинин, лизин, аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота. Любой стереоизомер (т.е. L, D или их смесь) конкретной аминокислоты (например, метионина, гистидина, имидазола, аргинина, лизина, изолейцина, аспарагиновой кислоты, триптофана, треонина и их смесей) или сочетания этих стереоизомеров могут быть представлены в фармацевтических композициях по изобретению, причем конкретная аминокислота будет представлена либо в своей свободной форме или в форме своей соли. В одном воплощении применяется L-стереоизомер. Композиции по изобретению могут также быть приготовлены с аналогами этих аминокислот. Под "аналогом аминокислоты" подразумевают производное естественной аминокислоты, которое позволяет добиться желаемого эффекта уменьшения формирования агрегатов полипептидом при хранении жидких фармацевтических композиций по изобретению. Подходящие аналоги аргинина включают, например, аминогуанидин, орнитин и N-моноэтил L-аргинин, подходящие аналоги метионина включают этионин и бутионин, а подходящие аналоги цистеина включают S-метил-L цистеин. Как и дугие аминокислоты, аналоги аминокислот включают в композиции либо в их свободной форме, либо в форме их солей. В следующем воплощении изобретения аминокислоты или аналоги аминокислот применяют в концентрации, которая достаточна для предотвращения или замедления агрегации белка.
В следующем воплощении изобретения метионин (или другие серо-содержащие аминокислоты или аналоги аминокислот) можно добавлять для ингибирования окисления остатков метионина в сульфоксид метионина в случаях, когда полипептид, действующий в качестве терапевтического агента, представляет собой полипептид, содержащий по меньшей мере один остаток метионина, подверженный такому окислению. Термин "ингибировать" в данном контексте подразумевает минимальное накопление окисленных форм метионина с течением времени. Ингибирование окисления метионина приводит к лучшему сохранению полипептида в надлежащей молекулярной форме. Может применяться любой стереоизомер метионина (L или D) или их сочетания. Добавляемое количество должно быть количеством, достаточным для ингибирования окисления остатков метионина, так чтобы количество сульфоксида метионина было приемлемым согласно требованиям регулятивных органов. Как правило, это означает, что композиция содержит не более чем приблизительно от 10% до приблизительно 30% сульфоксида метионина. В общем, этого можно добиться путем добавления метионина так, чтобы соотношение добавленного метионина к остаткам метионина варьировало от приблизительно 1:1 до приблизительно 1000:1, например, от 10:1 до приблизительно 100:1.
В следующем воплощении препарат также или в альтернативном случае содержит стабилизатор, выбранный из группы высокомолекулярных полимеров или низкомолекулярных соединений. В следующем воплощении изобретения стабилизатор выбран из полиэтиленгликоля (например, PEG 3350), поливинилового спирта (PVA), поливинилпирролидона, карбокси-/гидроксицеллюлозы или их производных (например, НРС, HPC-SL, HPC-L и НРМС), циклодекстринов, серо-содержащих веществ, таких как монотиоглицерол, тиогликолевая кислота и 2-метилтиоэтанол, а также различных солей (например, хлорида натрия). Каждый из этих конкретных стабилизатров составляет альтернативное воплощение изобретения.
Фармацевтические композиции могут также или в альтернативном случае содержать дополнительные стабилизирующие агенты, которые еще более повышают стабильность терапевтически активного полипептида. Стабилизирующие агенты, представляющие наибольший интерес для данного изобретения, включают метионин и EDTA, которые защищают полипептид от окисления метионина, и неионный сурфактант, который защищает полипептид от агрегации, связанной с замораживанием-оттаиванием или механическим воздействием, но не ограничиваются ими.
α
α
α
В следующем воплощении препарат также или в альтернативном случае содержит сурфактант. Сурфактант может быть выбран, например, из детергента, этоксилированного касторового масла, полигликолизированных глицеридов, ацетилированных моноглицеридов, эфиров сорбита и жирной кислоты, блок-полимеров полиоксипропилена-полиоксиэтилена (например, полоксамеров, таких как Pluronic F68, полоксамеры 188 и 407, Тритон Х-100), полиоксиэтиленовых эфиров сорбита и жирной кислоты, производных полиоксиэтилена и полиэтилена, таких как алкилированных и алкоксилированных производных (tween, например, Tween-20, Tween-40, Tween-80 и Brij-35), моноглицеридов или их этоксилированных производных, диглицеридов или их полиоксиэтиленовых производных, спиртов, глицерола, пектинов и фосфолипидов (например, фосфатидил серина, фосфатидил холина, фосфатидил этаноламина, фосфатидил инозитола, дифосфатидил глицерола и сфингомиелина), производных фосфолипидов (например, дипальмитоилфосфатидной кислоты) и лизофосфолипидов (например, пальмитоил лизофосфатидил-L-серин и 1-ацил-sn-глицеро-3-фосфат эфиров этаноламина, холина, серина или треонина) и алкилов, алкоксил- (алкилы сложных эфиров), алкокси- (алкилы эфиров) производных лизофосфатидила и фосфатидилхолинов, например, лауроил и миристоил производных лизофосфатидилхолина, дипальмитоилфосфатидилхолина и модификаций полярных головных групп, которые являются холинами, этаноламинами, фосфатидной кислотой, серинами, треонинами, глицеролом, инозитолом и положительно заряженными DODAC, DOTMA, DCP, BISHOP, лизофосфатидилсерином и лизофосфатидилтреонином, а также глицерофосфолипидов (например, кефалинов), глицерогликолипидов (например, галактопиранозида), сфингогликолипидов (например, керамидов, ганглиозидов), додецилфосфохолина, лизолецитина куриного яйца, производных фузидиевой кислоты (например, тауро-дигидрофузидата натрия и т.д.), длинноцепочечных жирных кислот С6-С12 (например, олеиновой кислоты и каприловой кислоты) и их солей, ацилкарнитинов и производных, N-ацилированных производных лизина, аргинина или гистидина или производных лизина или аргинина с ацилированной боковой цепью, N-ацилированных производных дипептидов, составляющих любую комбинацию из лизина, аргинина или гистидина и нейтральной или кислой аминокислоты, N-ацилированных производных трипептида, содержащего любую комбинацию из нейтральной аминокислоты и двух заряженных аминокислот, DSS (докузата натрия, номер CAS [577-11-7]), докузата кальция, номер CAS [128-49-4]), докузата калия, номер CAS [7491-09-0]), SDS (додецилсульфат натрия или лаурилсульфат натрия), каприлата натрия, холевой кислоты или ее производных, желчных кислот и их солей и конъюгатов глицина или таурина, урсодеоксихолевой кислоты, холата натрия, дезоксихолата натрия, таурохолата натрия, гликохолата натрия, N-гексадецил-N,N-диметил-3-аммонио-1-пропансульфонатом, анионных (алкил-арил-сульфонатов) моновалентных сурфактантов, амфотерных сурфактантов (например, N-алкил-N,N-диметиламмонио-1-пропансульфонатов, 3-холамид-1-пропилдиметиламмонио-1-пропансульфоната), катионных сурфактантов (четвертичных оснований аммония) (например, цетил-триметиламмоний бромида, цетилпиридиниум хлорида), неионных сурфактантов (например, додецил β-D-глюкопиранозида), полоксаминов (например, под торговым названием Tetronic), которые являются тетрафункциональными блок-сополимерами, полученными при последовательном добавлении оксида пропилена и оксида этилена к этилендиамину, или сурфактант может быть выбран из группы производных имидазолина или их смесей. Каждый из этих отдельных сурфактантов составляет альтернативное воплощение изобретения.
Применение сурфактантов в фармацевтических композициях хорошо известно специалистам. Для удобства приводится следующая ссылка: Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19 издание, 1995.
В следующем воплощении препарат также или в альтернативном случае содержит ингибиторы протеаз, такие как EDTA (этилендиаминтетрауксусную кислоту) и бензамидин-HCl, но могут применятся и другие коммерчески доступные ингибиторы протеаз. Применение ингибиторов протеаз особенно приогдно для фармацевтических композиций, содержащих зимогены протеаз для ингибирования аутокатализа.
Возможно, что в пептидном фармацевтическом препарате по данному изобретению также или в альтернативном случае могут присутствовать другие ингредиенты. Такие дополнительные ингредиенты могут включать смачивающие агенты, эмульгаторы, антиоксиданты, наполнители, регуляторы осмоляльности, хелатирующие агенты, ионы металлов, жировые наполнители, белки (например, альбумин сыворотки человека, желатин или другие белки) и амфотерные молекулы (например, аминокислоту, такую как бетаин, таурин, аргинин, глицин, лизин и гистидин). Такие дополнительные ингредиенты, конечно, не должны оказывать нежелательный эффект на общую стабильность фармацевтического препарата по данному изобретению.
Фармацевтические композиции, содержащие антитело по данному изобретению можно вводить пациенту, нуждающемуся в таком лечении многократно, например, местно, например, в участки кожи и слизистых оболочек, в участках, где отсутствует абсорбция, например, введение в артерию, вену, в сердце, а также в участки, где существет абсорбция, например, введение внутрикожно, подкожно, внутримышечно или в брюшную полость.
Введение фармацевтических композиций по изобретению может осуществляться пациентам, нуждающемся в таком лечении, через несколько путей введения, например, лингвальный, сублингвальный, буккальный, в ротовую полость, оральный, в желудок и кишечник, назальный, в легкие, например, через бронхиолы и альвеолы или с их сочетаниием, эпидермальный, дермальный, трансдермальный, вагинальный, ректальный, окулярный, например, через конъюнктиву, уретральный и парентеральный.
Композиции по настоящему изобретению могут вводиться в виде нескольких форм дозирования, например, в виде растворов, суспензий, эмульсий, микроэмульсий, множественных эмульсий, пен, бальзамов, паст, пластырей, мазей, таблеток, таблеток с оболочкой, средств для полоскания, капсул, например, твердых желатиновых капсул и мягких желатиновых капсул, суппозиториев, ректальных капсул, капель, гелей, спреев, порошков, аэрозолей, ингаляторов, глазных капель, офтальмологических мазей, жидкостей для промывания глаз, вагинальных суппозиториев, вагинальных колец, вагинальных мазей, растворов для инъекций, трансформируемых in situ растворов, например, желатинизируемых in situ, затвердевающих in situ, преципитирующих in situ, кристаллизующихся in situ, растворов для инфузий и имплантов.
Композиции по изобретению могут также быть смешаны или присоединены, например, посредством ковалентного, гидрофобного и электростатического взаимодействий к носителю лекарственного препарата, системе доставки лекарственного препарата и усовершенствованной системе доставки лекарственного препарата для дальнейшего повышения стабильности антитела, повышения биодоступности, повышения растворимости, уменьшения нежелательных эффектов, достижения эффекта хронотерапии, хорошо известной специалистам, и повышения комплаентности пациентов или любого их сочетания. Примеры носителей, систем доставки лекарственных препаратов и усовершенствованных систем доставки лекарственных препаратов включают полимеры, например, целлюлозу и производные, полисахариды, например, декстран и производные, крахмал и производные, поливиниловый спирт), полимеры акрилата и метакрилата, полимолочную и полигликолевую кислоту и их блок-сополимеры, полиэтилен гликоли, белки носители, например, альбумин, гели, например, термогелевые составы, например, блок-сополимеры, хорошо известные специалистам, мицеллы, липосомы, микросферы, наночастицы, жидкие кристаллы и их дисперсии, фазы L2 и их дисперсии, хорошо известные специалистам, знающим свойства фазы в системах липиды-вода, полимерные мицеллы, множественные эмульсии, само-эмульгирующиеся, само-микроэмульгирующиеся, циклодекстрины и их производные, а также дендримеры, но не ограничиваются ими.
Композиции по настощему изобретению могут применяться в препаратах твердых веществ, полутвердых веществ, порошков и растворов для введения антитела в легкие, применяя, например, дозирующий ингалятор, порошковый ингалятор и небулайзер, все из этих приспособлений хорошо известны специалистам.
Композиции по данному изобретению особенно успешно могут применяться при изготовлении систем доставки лекарств с контролируемым, длительным, продленным, замедленным и медленным высвобождением. Более конкретно, композиции могут применяться в изготовлении систем с контролируемым и длительным высвобождением для парентерального введения (обе системы приводят к многократному снижению количества введений), хорошо известных специалистам, но не ограничиваются ими. Еще более предпочтительными являются системы с контролируемым и длительным высвобождением для подкожного введения. Примерами систем с контролируемым высвобождением и композиций, которые могут применяться, не ограничивая рамки изобретения, являются гидрогели, масляные гели, жидкие кристаллы, полимерные мицеллы, микросферы, наночастицы.
Способы получения систем с контролируемым высвобождением, пригодные для композиций по настоящему изобретению, включают кристаллизацию, конденсацию, ко-кристаллизацию, преципитацию, ко-преципитацию, эмульсификацию, дисперсию, гомогенизацию высокого давления, инкапсуляцию, распылительную сушку, микроинкапсуляцию, коацервацию, фазовое расслоение, испарение растворителя для получения микросфер, экструзию и процессы с применением сверхкритических флюидов, но не ограничиваются ими. Приводится общая ссылка на Handbook of Pharmaceutical Controlled Release (Wise, D.L, ed. Marcel Dekker, New York, 2000) и Drug and the Pharmaceutical Sciences vol. 99: Protein Formulation and Delivery (MacNally, E.J., ed. Marcel Dekker, New York, 2000).
Парентеральное введение может осуществляться посредством подкожной, внутримышечной, интраперитонеальной или внутривенной инъекции посредством шприца, возможно шприца-ручки. В альтернативном случае, парентеральное введение может осуществляться посредством инфузионного насоса. Следующим вариантом является композиция, которая может представлять собой раствор или суспензию для введения компонента антитела в форме спрея для назального или пульмонального введения. Как еще один вариант, фармацевтические композиции, содержащие антитело по изобретению, могут быть также адаптированы для трансдермального введения, например, при помощи безыгольной инъекции или при помощи электрода, возможно, ионофоретического электрода, или чресслизистого, например, трансбуккального введения.
Антитело можно вводить с носителем через легкие, в виде раствора, суспензии или сухого порошка, с применением любого из известных типов приспособлений, подходящих для доставки лекарств в легкие. Их примеры включают, три основных вида аэрозоль-образующих приспособлений для доставки лекарств в легкие и могут включать джет-небулайзеры или ультразвуковые небулайзеры, дозирующие ингаляторы или порошковые ингаляторы, но не ограничиваются ими (Cf. Yu J, Chien YW. Pulmonary drug delivery: Physiologic and mechanistic aspects. Crit Rev Ther Drug Carr Sys 14(4) (1997) 395-453).
a
a
3
На основании стандартного способа тестирования аэродинамический диаметр частицы (d) определяется как геометрический эквивалент диаметра референтного стандарта сферической частицы единицы плотности (1 г/см). В простейшем случае для сферических частиц d относится к референсному диаметру (d) как функция квадратного корня из отношения плотностей, согласно формуле:
Модификации этого отношения существуют для несферических частиц (см. Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385). Термины "MMAD" и "MMEAD" хорошо описаны и известны в данной области техники и отражают показатель среднего значения в распределении размера аэродинамической частицы (см. Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385). Средний аэродинамический диаметр массы (MMAD) и средний эффективный аэродинамический диаметр массы (MMEAD) применяются взаимо-заменяемо, являются статистическими показателями и эмпирически описывают размер частиц аэрозоля по отношению к вероятности их отложения в легких, независимо от реальной формы, размера или плотности (см. Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385). MMAD обычно рассчитывают по результатам измерений, сделанных при помощи импакторов, инструментов, измеряющих поведение частиц в воздухе под действием сил инерции.
В следующем воплощении препарат может быть превращен в аэрозоль при помощи любой известной технологии распыления, такой как небулизация, для получения MMAD частиц аэрозоля менее 10 мкм, более предпочтительно между 1-5 мкм, и более предпочтительно между 1-3 мкм. Предпочтительный размер частиц определяется по наиболее эффективному размеру для доставки лекарства глубоко в легкие, где белок оптимально абсорбируется (см. Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer A, Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385).
Доставка глубоко в легкие легочных препаратов, содержащих антитело, возможно может быть далее оптимизирована посредством модификаций способов ингаляции, например, ингаляции с медленным потоком (например, 30 л/мин), задержка дыхания и времени срабатывания, но не ограничиваясь ими.
Термин "стабилизированный препарат" относится к препаратам с повышенной физической стабильностью, повышенной химической стабильностью или повышенной физической и химической стабильностью.
Термин "физическая стабильность" белкового препарата, согласно данному описанию, относится к тенденции антитела формировать биологически неактивные и/или нерастворимые агрегаты в результате воздействия на антитело термомеханических стрессов и/или взаимодействия с дестабилизирующими границами раздела и поверхностями, такими как, гидрофобные поверхности и границы раздела. Физическую стабильность водных препаратов антитела оценивают посредством визуальной инспекции и/или турбидиметрических измерений после воздействия на препарат, помещенный в подходящие контейнеры (например, картриджи или флаконы), механического/физического стресса (например, взбалтывания) при различных температурах в течение различных периодов времени. Визуальная инспекция препарата выполняется в четко сфокусированном свете на темном фоне. Мутность препарата характеризуется при помощи визуальной оценки с градацией степени мутности, например, по шкале от 0 до 3 (препарат, не имеющий мутности, соответствует визуальной оценке 0, а препарат, обладающий видимой мутностью в дневном свете, соответствует визуальной оценке 3). Препарат классифицируют как физически нестабильный, с учетом агрегации антитела, когда он обладает видимой мутностью в дневном свете. В альтернативном случае, мутность препарата можно оценивать при помощи простых турбидиметрических измерений, хорошо известных специалистам. Физическая стабильность водных препаратов антитела может также оцениваться при помощи агента или зонда для спектроскопических исследований, позволяющих определить конформационный статус антитела. Зонд предпочтительно является низкомолекулярной молекулой, которая предпочтительно связывается с не-нативной конформацией антитела. Одним из примеров низкомолекулярного спектроскопического зонда структуры белка является тиофлавин Т. Тиофлавин Т представляет собой флуоресцентный краситель, который широко применяли для детекции амилоидных фибрилл. В присутствии фибрилл и, возможно, также других конфигураций белка, Тиофлавин Т приобретает новый максимум возбуждения приблизительно при 450 нм и усиленную эмиссию приблизительно при 482 нм при связывании с фибриллами белка. Несвязанный Тиофлавин Т не обладает значимой флуоресценцией при указанных длинах волн.
Для определения изменений структуры белков от нативных к не-нативным состояниям, в качестве зондов могут применяться другие низкомолекулярные молекулы. Например, зонды типа "гидрофобная зона", связывающиеся предпочтительно с экспонированными гидрофобными зонами белка. Гидрофобные зоны, как правило, скрыты внутри третичной структуры белка в его нативном состоянии, но оказываются экспонированными, когда белок начинает разворачиваться или денатурировать. Примерами таких низкомолекулярных спектроскопических зондов являются ароматические, гидрофобные красители, такие как антрацен, акридин, фенантролин и т.п. Другими спектроскопическими зондами являются комплексы металлов с аминокислотами, такие как комплексы металла кобальта с гидрофобными аминокислотами, такими как фенилаланин, лейцин, изолейцин, метионин, валин или им подобными.
Термин "химическая стабильность" препарата антитела в данном описании относится к химическим изменениям ковалентной структуры антитела, приводящим к формированию продуктов химического распада с потенциально меньшим биологическим потенциалом и/или потенциально более высокой иммуногенностью по сравнению с нативной структурой антитела. Различные продукты химической деградации могут быть сформированы в зависимости от типа и природы нативного антитела и окружения, в котором находится антитело. Вероятнее всего, что химической деградации полностью избежать не удается, и в процессе хранения и применения препарата антитела часто появляется нарастающее количество продуктов химической деградации, что хорошо известно специалистам в данной области техники. Большинство белков подвержены дезамидированию, процессу, при котором амидная группа в боковой цепи остатков глутаминила или аспарагинила подвергается гидролизу с образованием свободной карбоксиловой кислоты. Другие пути деградации включают формирование высокомолекулярных продуктов трансформации, в которых две или более молекул белка ковалентно связываются друг с другом в ходе трансамидирования и/или дисульфидных взаимодействий, с формированием ковалентно связанных димерных, олигомерных и полимерных продуктов деградации (Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T.J. & Manning M.C., Plenum Press, New York 1992). В качестве другого варианта химической деградации может быть упомянуто окисление (например, остатков метионина). Химическую стабильность препарата антитела можно оценить при помощи измерения количества продуктов химической деградации в различных точках времени после воздействия различных условий окружающей среды (формирование продуктов деградации может зачастую быть ускорено, например, при повышении температуры). Количество каждого отдельного продукта деградации часто определяют путем разделения продуктов деградации в зависимости от молекулярного веса и/или заряда при помощи различных способов хроматографии (например, SEC-HPLC и/или RP-HPLC).
Следовательно, как подчеркивлаось выше, "стабилизированный препарат" относится к препаратам с повышенной физической стабильностью, повышенной химической стабильностью или повышенной физической и химической стабильностью. Как правило, препарат должен сохранять стабильность во время применения и хранения (в соответствии с рекомендованными условиями применения и хранения) до окончания срока годности.
В одном воплощении изобретения фармацевтический препарат, содержащий антитело, стабилен в течение более 6 недель применения и более 3 лет хранения.
В другом воплощении изобретения фармацевтический препарат, содержащий антитело, стабилен в течение более 4 недель применения и более 3 лет хранения.
В следующем воплощении изобретения фармацевтический препарат, содержащий антитело, стабилен в течение более 4 недель применения и более 2 лет хранения.
В еще воплощении изобретения фармацевтический препарат, содержащий антитело, стабилен в течение более 2 недель применения и более 2 лет хранения.
Подходящие препараты антител могут также быть установлены при изучении опыта, полученного при использовании других, разработанных ранее моноклональных антител для терапевтического применения. Было показано, что несколько моноклональных антител эффективны в клинических ситуациях, такие как Ритуксан (Ритуксимаб), Герцептин (Трастузумаб), Ксолаир (Омализумаб), Бексар (Тоситумомаб), Кэмпас (Алемтузумаб), Зевалин, Онколим, Хумира, и аналогичные препараты могут применяться с антителами по изобретению. Например, монокпональное антитело может поставляться в концентрации 10 мг/мл либо в 100 мг (10 мл), либо в 500 мг (50 мл) флаконах для однократного применения, разработанных для внутривенного введения с 9,0 мг/мл хлорида натрия, 7,35 мг/мл двухводного цитрата натрия, 0,7 мг/мл Полисорбата 80 и стерильной воды для инъекций. рН доводят до 6,5. В альтернативном случае, антитело может быть представлено в виде раствора, содержащего гистидин, сахарозу и Полисорбат 80.
Диагностические применения
Анти-hNKG2D антитела по изобретению также имеют не-терапевтические применения. Например, анти-hNKG2D антитела могут также применяться в диагностических тестах с белком NKG2D, например, для определения его экспрессии в специфических клетках, тканях или сыворотке. Например, анти-hNKG2D антитела можно применять в тестах для отбора пациентов для анти-hNKG2D терапии. Для таких целей анти-hNKG2D антитела можно применять для анализа присутствия hNKG2D в образцах сыворотки или ткани, исследования наличия CD4+ Т клеток, экспрессирующих NKG2D или присутствия заболевания, при котором создаются благоприятные условия для клеток, экспрессирующих NKG2D (например, NK или CD4+ или CD8+ Т клетки). Такой анализ можно сочетать с клиническим определением в крови, например, уровней MICA в растворенном виде (см., например, WO2003089616 (Spies et al.)).
Для применения в целях диагностики к антителу, как правило, прикрепляют компонент, подлежащий детекции. Существуют различные метки, которые, как правило, можно сгруппировать в следующие категории:
35
14
125
3
131
(а) Радиоизотопы, такие как S, C, I, H и I. Антитело может быть маркировано радиоизотопом при помощи методик, описанных, например, в Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed. Wiley-lnterscience, New York, N.Y., Pubs. (1991), и радиоактивность может быть измерена при помощи сцинтилляционного измерения.
(б) Существуют такие флуоресцентные метки, как редкоземельные хелаты (хелаты европия) или флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, дансил, Лиссамин, фикоэритрин и Техасский Красный. Флуоресцентные метки могут быть конъюгированы с антителом при помощи методик, изложенных, например, в Current Protocols in Immunology, supra. Флуоресценцию можно измерять при помощи флуориметра.
(в) Существуют различные метки фермент-субстрат, и в патенте США 4275149 приводится обзор некоторых из них. Фермент, как правило, катализирует химическое изменение хромогенного субстрата, которое может быть измерено при помощи различных методик. Например, фермент может катализировать изменение цвета субстрата, которое может быть измерено спектрофотометрически. В альтернативном случае, фермент может изменять флуоресценцию или хемилюминесценцию субстрата. Методики для количественного определения изменения флуоресценции описаны выше. Хемилюминесцентный субстрат переходит в электронно-возбужденное состояние в ходе химической реакции, и затем может испускать свет, который можно регистрировать (например, при помощи хемилюминометра) или служить донором энергии для флуоресцентного акцептора. Примеры ферментативных меток включают люциферазы (например, люцифераза светлячка и бактериальная люцифераза; патент США 4737456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, малат дегидрогеназа, уреаза, пероксидаза, например, пероксидаза хрена (HRP), щелочная фосфатаза, бета-галактозидаза, глюкоамилаза, лизозим, оксидазы углеводов (например, глюкозооксидаза, галактозооксидаза и глюкозо-6-фосфат дегидрогеназа), оксидазы гетероциклических соединений (такие как уриказа и ксантиноксидаза), лактопероксидаза, микропероксидаза и т.п. Методики для конъюгирования ферментов с антителами описаны в O'Sullivan et al, "Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay," в Methods in Enzym. (Ed., J. Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, New York, 73:147-166 (1981).
Примеры комбинаций фермент-субстрат включают, например:
(1) пероксидазу хрена (HRP) с гидроген-пероксидазой в качестве субстрата, где гидроген-пероксидаза окисляет предшественник красителя (например, ортофенилен диамин (OPD) или 3,3',5,5'-тетраметил бензидин гидрохлорид (ТМВ));
(2) щелочную фосфатазу (ЩФ) с паранитрофенилфосфатом в качестве хромогенного субстрата и
(3) бета-D-галактозидазу (бета-D-гал) с хромогенным субстратом (например, р-нитрофенил-бета-D-галактозидазой) или флуорогенным субстратом 4-метилумбеллиферил-р-бета-галактозидазой.
Специалистам известно множество других комбинаций фермент-субстрат. Обзор приведен в патентах США 4275149 и 4318980.
В некоторых случаях метка конъюгирована с антителом опосредованно. Специалистам известны различные методики, позволяющие это сделать. Например, антитело может быть конъюгировано с биотином, а любая из трех больших категорий меток, упомянутых выше, может быть конъюгирована с авидином, и наоборот. Биотин специфически связывается с авидином и таким образом метка может быть конъюгирована с антителом таким опосредованным способом. В альтернативном случае для достижения опосредованного конъюгирования метки с антителом, антитело конъюгируют с низкомолекулярным гаптеном (например, дигоксином), а одна из разных типов меток, упомянутых выше, конъюгирована с анти-гаптеновым антителом (например, антителом к дигоксину). Таким образом, можно добиться опосредованного конъюгирования метки с антителом.
В другом воплощении изобретения анти-NKG2D антитело не нуждается в мечении, а его присутствие может быть определено при помощи меченного вторичного антитела, связывающегося с антителом к NKG2D.
Антитела по данному изобретению могут применяться в любых известных способах тестирования, таких как реакция конкурентного связывания, прямые и непрямые сендвич-тесты и иммунопреципитация. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc. 1987).
Для иммуногистохимического анализа образец ткани может быть свежим или замороженным или может быть заключен в парафин и зафиксирован с консервантом, например, таким как формалин.
125
131
67
99m
111
Антитела могут также применяться в диагностических тестах in vivo. Как правило, антитело метят радионуклидом или нерадиоактивным индикатором, обнаруживаемым, например, посредством ядерно-магнитного резонанса, или других средств, известных в данной области техники. Предпочтительно, метка представляет собой радиоактивную метку, например, такую как I, I, Cu, Tc, или In. Меченное антитело вводят хозяину, предпочтительно в кровоток, и оценивают наличие и локализацию меченного антитела в организме хозяина. Эта методика визуализации удобна для применения в диагностике, определении стадии и лечении неоплазм. Радиоизотоп может быть конъюгирован с белком любым способом, включая хелаторы металлов или лактопероксидазу или иодогенного метода для иодирования.
Для удобства антитела по настоящему изобретению могут быть представлены в составе набора, т.е. в виде комбинации реагентов в предопределенных количествах в упаковке с инструкциями для выполнения диагностического теста. В случае, если антитело мечено ферментом, в состав набора будут входить субстраты и кофакторы, необходимые ферменту (например, предшественник субстрата, дающий начало хромофору или флуорофору, подлежащему детекции). Кроме того, в состав набора могут входить другие компоненты, такие как стабилизаторы, буферы (например, блокирующий буфер или лизирующий буфер) и т.п. Относительное количество различных реагентов может варьировать в широких пределах для достижения концентраций растворов реагентов, позволяющих существенно оптимизировать чувствительность теста. В частности, реагенты могут быть представлены в виде сухих порошков, как правило, лиофилизированных, включая эксципиенты, при растворении обеспечивающие необходимую концентрацию раствора реагента.
Терапевтические применения
Способы лечения пациета с применением человеческого или гуманизированного антитела к hNKG2D, согласно данному описанию также предусматриваются настоящим изобретением. В одном воплощении изобретение описывает применение человеческого или гуманизированного антитела согласно данному описанию в составе фармацевтической композиции для введения человеку. Как правило, пациент страдает от аутоиммунного или воспалительного заболевания или нарушения или имеет риск его развития.
Например, в одном аспекте изобретение предлагает способ снижения или ингибирования hNKG2D-опосредованной активации NK или Т клеток у нуждающегося в этом пациента, включающий этап введения пациенту анти-NKG2D человеческого или гуманизированного антитела, при котором антитело снижает или предотвращает лиганд-опосредованную активацию рецептора NKG2D. В одном воплощении способ направлен на снижение активности таких лимфоцитов у пациента, имеющего заболевание, при котором повышенная активность NK или Т клеток пагубна для здоровья, которое включает, затрагивает или вызвано клетками, подверженными лизису под влиянием NK или Т клеток, или вызвано или характеризуется повышенной активностью NK и/или Т клеток, такое как аутоиммунное заболевание или нарушение или воспалительное состояние. В одном аспекте изобретение описывает способ снижения хронического воспаления у пациентов.
Примерами состояний или нарушений, для лечения которых могут применяться полипептиды, антитела и другие компоненты по изобретению, включают системную красную волчанку, ревматоидный артрит, ювенильный хронический артрит, псориатический артрит, остеоартрит, спондиллоартропатии (анкилозирующий спондилит), системный склероз (склеродермию), идиопатические воспалительные миопатии (дерматомиозит, полимиозит), синдром Шегрена (Сьогрена), васкулит, системный васкулит, височный артериит, атеросклероз, саркоидоз, миастению, аутоиммунную гемолитическую анемию (иммунную панцитопению, пароксизмальную ночную гемоглобинурию), пернициозную анемию, аутоиммунную тромбоцитопению (идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, иммунную тромбоцитопению), тиреоидит (болезнь Грейвса, тиреоидит Хашимото, ювенильный лимфоцитарный тиреоидит, атрофический тиреоидит), сахарный диабет, иммуноопосредованные заболевания почек (гломерулонефрит, тубулоинтерстициальный нефрит, аутоиммунный оофорит), аутоиммунный орхит, аутоиммунный увеит, антифосфолипидный синдром, демиелинизирующие заболевания центральной и периферической нервной системы, такие как рассеянный склероз, идиопатическую демиелинизирующую полинейропатию или синдром Гийена-Барре и хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию, заболевания гепатобилиарной системы, такие как инфекционный гепатит (гепатит А, В, С, D, Е и другие негепатотропные вирусы), аутоиммунный хронический активный гепатит, вирусный гепатит, первичный билиарный цирроз, гранулематозный гепатит, гранулематоз Вегенера, болезнь Бехчета и склерозирующий холангит, воспалительные заболевания кишечника, такие как язвенный колит или болезнь Крона, целиакию, глютен-чувствительную энтеропатию и болезнь Уипла, аутоиммунные или иммуно-опосредованные заболевания кожи, включающие буллезные заболевания кожи, полиформную эритему и контактный дерматит, герпетиформный дерматит, псориаз, пузырчатку, витилиго (лейкодерму), аллергические заболевания, такие как астму, аллергический ринит, атопический дерматит, пищевую гиперчувствительность и крапивницу, иммунологические заболевания легких, такие как эозинофильную пневмонию, идиопатический легочный фиброз и гиперчувствительный пневмонит, хроническую обструктивную болезнь легких и заболевания, связанные с трансплантацией, включая отторжение трансплантата и реакцию трансплантат против хозяина, но не ограничиваются ими.
Например, в одном аспекте анти-NKG2D антитело, применяемое в сочетании с одним или более из других противовоспалительных агентов, включая анальгезирующие агенты, иммуносупрессивные агенты (например, антагонисты В-или Т-клеток, такие как агенты, вызывающие деплецию В-клеток и агенты, ингибирующие Т клетки; агенты, ингибирующие комплемент), кортикостероиды и антагонисты TNFальфа или другие агенты, являющиеся антагонистами цитокинов или антагонистами цитокиновых рецепторов, а также анти-ангиогенные агенты, но не ограничиваясь ими. Конкретные примеры включают метотрексат, TSG-6, Ритуксан или другие терапевтические агенты, воздействующие на В-клетки, антитела к IL12 (р40), гибридные белки CTLA4-FC, антагонисты к рецептору IL-1, антитела к IL-1, антитела к IL-15, антитела к IL-18 и антитела к IL6R. Другие примеры комбинированной терапии приводятся ниже.
При использовании одного или более других агентов или подходов в сочетании с настоящей терапией аддитивность сочетанного воздействия по сравнению с эффектами, наблюдаемыми при применении каждого способа терапии по-отдельности, не является необходимым условием. Несмотря на то, что эффекты, являющиеся по меньшей мере аддитивными, как правило, желательны, любое снижение активности NKG2D или другой благоприятный эффект, превышающий эффект от монотерапии, будет полезным. Аналогично, синергетический эффект комбинированной терапии не является необходимым условием, хотя он несомненно является возможным и благоприятным. Лечение на основе NKG2D может предшествовать или следовать за другим лечением, например, с интервалами от нескольких минут до недель и месяцев. Также предполагается, что может проводиться более одного введения любой из композиций анти-NKG2D или другого агента. Агенты могут вводиться взаимозаменяемо, или через день или через неделю; или может проводиться один цикл анти-NKG2D терапии с последующим циклом лечения с применением другого агента. В любом случае все, что требуется, это доставлять оба агента в сочетании, достаточном для обеспечния терапевтически благоприятного эффекта, независимо от времени введения.
Ниже следуют описания некоторых воспалительных и/или аутоиммунных заболеваний и нарушений, при которых анти-hNKG2D антитела по изобретению могут применяться в качестве терапевтических агентов. Предпочтительно, анти-hNKG2D антитело представляет собой бивалентное полноразмерное антитело MS или 21F2, или его антиген-связывающий фрагмент, вариант или производное.
Ревматоидный артрит
Ревматоидный артрит (РА) представляет собой хроническое системное аутоиммунное воспалительное заболевание, которое в основном затрагивает синовиальные мембраны множества суставов, приводящее к повреждению суставного хряща. В патогенезе заболевания существует зависимость от Т лимфоцитов и связь с продукцией ревматоидных факторов, аутоантител, направленных против собственных IgG, приводящих к формированию иммунных комплексов, достигающих высоких концентраций в суставной жидкости и в крови. Эти комплексы в суставах могут вызывать выраженную инфильтрацию синовиальной оболочки лимфоцитами и моноцитами и последующие выраженные изменения синовиальной облочки; пространство суставов подвергается инфильтрации такими же клетками с примесью многочисленных нейтрофилов. Патологические Т клетки продуцируют цитокины и другие растворимые факторы, внося дополнительный вклад в привлечение и активацию других клеток и в деструкцию ткани. Пораженные ткани представляют собой в первую очередь суставы, зачастую поражаемые симметрично. Однако, развиваются также и внесуставные заболевания в двух основных формах. Первая форма представляет собой развитие внесуставных поражений с непрерывным прогрессирующим заболеванием суставов и поражениями, типичными для легочного фиброза, васкулита и кожных язв. Вторая форма внесуставных заболеваний представляет собой так называемый синдром Фелти, который возникает позже в ходе заболевания РА, иногда после того, как заболевание суставов стало бессимптомным и включает развитие нейтропении, тромбоцитопении и спленомегалии. Это может сопровождаться васкулитом, затрагивающим множественные органы, с формированием зон инфаркта, язв кожи и гангрены. У пациентов также зачастую развиваются ревматоидные узелки в подкожной ткани, расположенной над пораженными суставами; узелки на поздней стадии имеют в центре некротическую область, окруженную смешанным воспалительным клеточным инфильтратом. Другие проявления, которые могут развиться при РА включают: перикардит, плеврит, коронарный артериит, интерстициальную пневмонию с легочным фиброзом, сухой кератоконъюнктивит и ревматоидные узелки.
Соответственно, в одном аспекте изобретения описывается способ лечения и/или предупреждения ревматоидного артрита (РА). Способ включает доставку эффективного количества анти-hNKG2D антитела пациенту, который имеет РА или у которого идентифицировали/диагностировали как имеющего существенный риск развития РА, для лечения или предупреждения РА. В одном аспекте продемонстрировано, что анти-NKG2D антитело эффективно для облегчения РА на подходящей модели РА, такой, как описанной в патенте США 6414218 и публикации No. 20030005469 (схожие принципы и модели описаны, например, Wooley, Р. Н., Animal Models of Arthritis, eds. J. Н. Klippel and P. A. Dieppe, Mosby Publishers (London), 1998; Erning et al., Arthritis Res, 4 Suppl 3:8 133-40, 2002; Holmdahl et al., Ageing Res Rev, 1(1): 135-47, 2002; Anthony et al., Clin Exp Rheumatol, 17(2):240-4,1999; Durie et al., Clin Immunol Immunopathol, 73(1):11-8, 1994; и Muller-Ladner etal., Drugs Today (Bare), 35(4-5):379-88, 1999). В следующем аспекте антитело, способное измеримо снижать лиганд-индуцируемую активацию NKG2D у лейкоцитов, экспрессирующих NKG2D, и/или нарушать рост NKG2D+ Т клеток или NK клеток (например, нарушая рост и/или функцию аутореактивных CD8+ Т клеток) (в противоположность, например, по меньшей мере некоторым из антител, описанных в публикации No. 20040115198), без существенной деплеции таких клеток (например, вызывая снижение приблизительно на 10% или менее таких клеток по сравнению с соответствующим контролем). В одном аспекте способ обеспечивает модуляцию одного или более биомаркеров не противоречащим лечению или предупреждению РА образом (выбирается применимый) (например, сывороточного IL-6, TNF-α, IL-1, VEGF, TIFF R, IL-2R, расщепленных мембранных форм CD4, расщепленных мембранных форм CD8, и/или С реактивного белка). В другом аспекте осуществление способа приводит к измеримому снижению воспаления синовиальных оболочек периферических суставов пациента/хозяина. В одном аспекте способ приводит к предупреждению повреждения, выявляемого рентгенографически, и улучшает физическую функцию пациента или хозяина, что проявлется, например, снижением прогрессирования рентгенографически выявляемых нарушений у пациента или хозяина, уменьшению опухоли и болезненности суставов (установленным согласно принятым аналитическим критериям), и/или существенным улучшением качества жизни (например, по снижению индекса нетрудоспособности по опроснику для оценки состояния здоровья при PA (RA Health Assessment Questionnaire). Антитело может применяться в отдельности или в сочетании с одним или более из других противоревматоидных агентов, таких как нестероидных противовоспалительных препаратов (НСПВП), ингибиторов циклооксигеназы-2, анальгетиков, кортикостероидов (например, преднизолона, гидрокортизона), золота, иммуносупрессанта (например, метотрексата), агента, вызывающего деплецию В-клеток (например, под коммерческим названием Ритуксан), агента, обладающего сродством к В-клеткам (например, под коммерческим названием Лимфостат-В) и агента против TNFальфа (например, под коммерческими названиями Эмбрел, Хумира) и Ремикад), антагониста рецептора IL1 (например, под коммерческим названием Кинерет), антитела к IL-15 или противоревматических препаратов, модифицирующих течение заболевания (DMARD).
Демиелинизирующие заболевания
Считается, что демиелинизирующие заболевания центральной и периферической нервной системы, включая рассеянный склероз (PC); идиопатическая демиелинизирующая полинейропатия или синдром Гийена-Барре; и хроническая воспалительная демиелинизирующая полинейропатия имеют аутоиммунную основу и приводят к демиелинизации нервных волокон в результате повреждения олигодендроцитов или самого миелина. Есть данные, позволяющие предположить, что при PC начало и прогрессирование заболевания зависят от Т лимфоцитов. PC является демиелинизирующим заболеванием, которое зависимо от лимфоцитов и имеет либо рецидивирующее-ремиттирующее течение или хроническое прогрессирующее течение. Этиология заболевания неизвестна, однако предполагается, что способствовать его развитию могут вирусные инфекции, генетическая предрасположенность, окружающая среда и аутоиммунные нарушения. Очаги поражения содержат инфильтрат, представленный преимущественно Т лимфоцитами, клетками микроглии и инфильтрующими макрофагами; доминирующим типом клеток в очагах повреждения являются CD4+ Т лимфоциты.
Таким образом, в другом аспекте изобретение описывает способ для лечения и/или предупреждения PC. Способ включает доставку эффективного количества анти-hNKG2D антитела пациентам, которые имеют PC или у которых выявлен/диагностирован существенный риск развития PC, для лечения или предотвращения таким образом PC у пациента или в организме хозяина. В частном аспекте моноклональное антитело к NKG2D способно измеримо снижать лиганд-индуцированную активацию NKG2D лейкоцитов, экспрессирующих NKG2D, и/или нарушать экспансию NKG2D+ Т клеток или NK клеток без существенной деплеции этих клеток. Антитело может применяться отдельно или в сочетании с другими противоревматическими агентами, такими как Тизабри.
Воспалительные заболевания кишечника
+
-
В CD8 Т клетках кишечника NKG2D выполняет роль ко-стимулятора CD28 клеток (Roberts et al., J Immunol 2001:167:5527-30). Кроме того, при воспалении кишечника (целиакии) NKG2D повышается и лимфоциты эпителия кишеника стимулируются опосредованно через NKG2D для выполнения киллерной функции и продукции цитокинов (Hue et al., Immunity 2004; 21:367-77; Meresse et al., Immunity 2004; 21:357-66). Кроме того, IL-15, зачастую обнаруживаемый при воспалении кишечника, приводит к повышению NKG2D на лимфоцитах эпителия кишечника (Roberts et al., J Immunology 2001; 167:5527-30). Более того, при воспалении кишечника повышается уровень MICA, лиганда NKG2D (Meresse et al, supra, Hue et al., supra). Уровень NKG2D также повышается на провоспалительных лимфоцитах у пациентов с болезнью Крона (Allez et al., доклад на 16 Европейском Конгрессе по Иммунологии (ECI2006), September 6-9, 2006; Paris, France).
Таким образом, в другом аспекте изобретения рассматривается способ лечения и/или редупреждения воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК), таких как болезнь Крона или язвенный колит. Как показано Kjellev et al. (Eur J Immunol 2008; 37:1397-1406), ингибирование функции рецептора NKG2D при ранней терапии антителами облегчало течение трансфер-индуцированного колита у мышей SCID, экспериментальной модели колита на животных.
Способ лечения воспалительных заболеваний кишечника включает доставку эффективного количества анти-NKG2D антитела пациентам, которые имеют ВЗК или у которых выявлен/диагностирован существенный риск развития ВЗК, для лечения или предупреждения таким образом ВЗК у пациента. В частном аспекте способ лечения/ предупреждения ВЗК осуществляется посредством применения моноклонального антитела к NKG2D, способного измеримо снижать лиганд-индуцированную активацию NKG2D у лейкоцитов, экспрессирующих NKG2D, и/или нарушать рост NKG2D+ Т клеток или NK клеток, без существенной деплеции таких клеток. Антитело может применяться отдельно или в сочетании с другими агентами, применяющимися при ВЗК, такими, как препаратами, содержащими месаламин (включая сульфасалазин и другие агенты, содержащие 5-аминосалициловую кислоту (5-АСК), такие как олсалазин и балсалазид), нестероидные противовоспалительные препараты (НСПВП), анальгетики, кортикостероиды (например, преднизон, гидрокортизон), ингибиторы TNF (включая адалимумаб (Хумира), этанерцепт (Энбрел) и инфликсимаб (Ремикад)), антитела к IL12, иммуносупрессанты (такие как 6-меркаптопурин, азатиоприн и циклоспорин А) и антибиотики.
Псориаз
Псориаз представляет собой опосредованное Т лимфоцитами воспалительное заболевание. Очаги повреждения содержат инфильтраты Т лимфоцитов, макрофагов и антиген-процессирующих клеток и небольшое количество нейтрофилов.
Таким образом, в другом аспекте изобретения рассматривается способ лечения и/или предупреждения псориаза. Способ включает доставку эффективного количества анти-hNKG2D антитела пациенту, который имеет псориаз или у которого выявлен/диагностирован существенный риск развития псориаза, для лечения или предупреждения таким образом псориаза у пациента. В более частном аспекте агент представляет собой моноклональное антитело к NKG2D, способное измеримо снижать лиганд-индуцированную активацию NKG2D лейкоцитов, экспрессирующих NKG2D, и/или нарушать рост NKG2D+ Т клеток или NK клеток без существенной деплеции этих клеток. Антитело может применяться отдельно или в сочетании с одним или более способами лечения псориаза, такими как фототерапия, местная терапия (например, деготь, местные глюкокортикоиды) или системная терапия (например, метотрексат, синтетический ретиноид, циклоспорин), агент против TNF альфа (например, Эмбрел, Хумира, Ремикад), ингибитор Т клеток (например, Раптива), аналоги витамина D, ингибиторы митогенактивируемой протеинкиназы р38 (МАРК), а также биологические агенты, такие как Ритуксан.
Псориатический артрит
Псориатический артрит представляет собой хроническое воспалительное артритическое заболевание, поражающее кожу, суставы, участки прикрепления сухожилий, лигаментов и фасций, зачастую ассоциированное с псориазом (приблизительно у 7% пациентов с псориазом развивается Псориатический артрит). Многие данные свидетельствуют о том, что в патофизиологии псориатического артрита задействован опосредованный Т-клетками процесс. Моноциты также могут играть роль при псориатическом артрите и отвечают за продукцию матриксных металлопротеиназ, которые могут опосредовать деструктивные изменения в суставах пациента с псориатическим артритом. Кроме того, в пораженных суставах также обнаруживаются NK клетки, что предполагает их роль в патогенезе заболевания.
Таким образом, в другом аспекте изобретения рассматривается способ лечения и/или предупреждения псориатического артрита. Способ включает доставку эффективного количества анти-hNKG2D антитела пациенту, у которого имеется псориатический артрит или у которого выявлен/диагностирован существенный риск развития псориатического артрита, для лечения или предупреждения таким образом псориатического артрита у пациента. В более частном аспекте агент представляет собой моноклональное антитело к NKG2D, способное измеримо снижать лиганд-индуцированную активацию NKG2D у лейкоцитов, экспрессирующих NKG2D, и/или нарушать рост NKG2D+ Т клеток или NK клеток без существенной деплеции этих клеток. Антитело может применяться отдельно или в комбинации с одним или более из других способов лечения псориатического артрита, таких как нестероидные противовоспалительные препараты (аспирин, ибупрофен), метотрексат, синтетический ретиноид, цикпоспорин, кортикостероид, агент против TN Ральфа (например, Эмбрел, Хумира, Ремикад).
Системная красная волчанка
При системной красной волчанке (СКВ) основным медиатором заболевания является продукция аутореактивных антител к собственным белкам/тканям и последующее развитие иммунно-опосредованного воспаления. Антитела либо прямо, либо косвенно опосредуют повреждение тканей. Хотя не было показано непосредственное участие Т лимфоцитов в поражении тканей, Т лимфоциты обязательны при возникновении аутореактивных антител. Генез заболевания, таким образом, зависит от Т лимфоцитов. Происходит клиническое поражение множественных органов и систем, включая почки, легкие, опорно-двигательную систему, кожу и слизистые оболочки, глаза, центральную нервную систему, сердечно-сосудистую систему, желудочно-кишечный тракт, костный мозг и кровь.
Таким образом, в другом аспекте изобретения рассматривается способ лечения и/или предупреждения СКВ. Способ включает доставку эффективного количества анти-hNKG2D антитела пациенту, у которого имеется СКВ или у которого выявлен/диагностирован существенный риск развития СКВ, для лечения или предупреждения таким образом СКВ у пациента. В более частном аспекте агент представляет собой моноклональное антитело к NKG2D, способное значимо снижать лиганд-опосредованную активацию NKG2D лейкоцитов, экспрессирующих NKG2D, и/или препятствовать росту NKG2D+ Т клеток или NK клеток без существенной деплеции этих клеток. Антитело может применяться отдельно или в сочетании с другими агентами, применяющимися при СКВ, такими как нестероидные противовоспалительные препараты (НСПВП), анальгетики, кортикостероиды (например, преднизон, гидрокортион), иммуносупрессанты (такие как циклофосфамид, азатиоприн и метотрексат), противомалярийные препараты (такие как гидроксихлорохин) и биологические препараты, ингибирующие продукцию антител к двуспиральной ДНК (например, LIP 394).
Диабет
Сахарный диабет I типа, или инсулин-зависимый диабет, возникает вследствие аутоиммунной деструкции В клеток панкреатических островков; такая деструкция опосредована ауто-антителами и аутореакгивными Т клетками. Антитела к инсулину или рецептору инсулина могут также обусловливать фенотип инсулинорезистентности.
Таким образом, в другом аспекте антитело к NKG2D дают пациенту, страдающему от сахарного диабета I типа или имеющему существенный риск его развития, в количестве и при условиях, достаточных для лечения или предупреждения состояния пациента. Антитело может применяться отдельно или в сочетании с другими агентами для лечения диабета, такими как инсулин, или факторами, необходимыми для роста или выживаемости бета клеток, или иммуномодулирующими антителами, такими, как антитела к CD3.
Трансплантация
Заболевания, связанные с трансплантацией, включая отторжение трансплантата и реакцию трансплантат против хозяина (GVHD) являются зависимыми от Т лимфоцитов; ингибирование функции Т лимфоцитов оказывает благоприятный эффект.
Таким образом, в другом аспекте изобретения рассматривается способ снижения вероятности отторжения трансплантата (или снижения тяжести или увеличения времени начала состояния, связанного с отторжением трансплантата, т.е. увеличением времени выживаемости аллотрансплантата). Способ включает введение эффективного количества анти-hNKG2D антитела пациенту, которому предстоит стать реципиентом или который недавно был реципиентом трансплантата ткани/органа, при котором вероятность отторжения измеримо снижается (например, в сравнении с контролем). В частном аспекте анти-NKG2D антитело способно измеримо снижать лиганд-индуцированную активацию NKG2D лейкоцитов, экспрессирующих NKG2D, и/или подавлять рост NKG2D+ Т клеток или NK клеток без существенной деплеции таких клеток. Примеры трансплантируемых тканей, которые могут подвергаться обработке, включают печень, легкие, почки, сердце, тонкий кишечник, клетки островков поджелудочной железы, а также трансплантация костного мозга и лечение реакции трансплантат против хозяина (GVHD), но не ограничиваются ими. Антитело может применяться отдельно или в сочетании с другими агентами для подавления отторжения трансплантата, такими как иммуносупрессивные агенты (например, циклоспорин, азатиоприн, метилпреднизолон, преднизолон, преднизон, микофенолат мофетил, сиролимус, рапамицин, такролимус), противоинфекционные агенты (например, ацикловир, клотримазол, ганцикловир, нистатин, триметоприм/сульфаметоксазол), диуретики (например, буметанид, фуросемид, метолазон) и противоязвенные препараты (например, циметидин, фарнотидин, лансопразол, омепразол, ранитидин, сукральфат). При трансплантации для лечения гематологических заболеваний в качестве дополнительной терапии можно вводить гемопоэтические факторы роста (например, эритропоэтин, G-CSF, GM-CSF, IL-3, IL-11, тромбопоэтин и т.д.) или противомикробный агент (агенты) (например, антибиотики, противовирусные и противогрибковые препараты).
Другие аутоиммунные и воспалительные заболевания
В других отдельных аспектах изобретение описывает способы лечения и/или предупреждения других аутоиммунных или воспалительных заболеваний или нарушений, включая введение эффективного количества анти-hNKG2D антитела пациентам, которые имеют заболевание или у которых выявлен/диагностирован существенный риск развития заболевания или нарушения, так что пациенту проводится лечение или предупреждение одного из описанных ниже заболеваний или нарушений. В более частном аспекте агент представляет собой моноклональное антитело к NKG2D, способное измеримо снижать лиганд-индуцированную активацию NKG2D у лейкоцитов, экспрессирующих NKG2D, и/или нарушение экспансии NKG2D+ Т клеток или NK клеток без существенной деплеции этих клеток. Антитело может применяться отдельно или в сочетании одним или более терапевтическими агентами, которые применяют для лечения заболевания или нарушения.
Ювенильный хронический артрит предствляет собой хроническое идиопатическое воспалительное заболевание, начинающееся зачастую в возрасте младше 16 лет. Его фенотип имеет некоторое сходство с РА; некоторых позитивных по ревматоидному фактору пациентов классифицируют как имеющих ювенильный ревматоидный артрит. Заболевание делится на три основных подкласса: пауциартикулярный, полиартикулярный и системный. Артрит может быть тяжелым и, как правило, деструктивным и приводит к анкилозу суставов и замедлению роста. Другие проявления могут включать хронический передний увеит и системный амилоидоз.
Спондилоартропатии представляют собой группу нарушений с некоторыми общими клиническими чертами и общей взаимосвязью с экспрессией продукта гена HLA-B27. Нарушения включают: анкилозирующий спондилит, синдром Рейтера (реактивный артрит), артрит, ассоциированный с воспалительными заболеваниями кишечника, спондилит, ассоциированный с псориазом, ювенильную спондилоартропатию и недифференцированную спондилоратропатию. Отличительные черты включают сакроилеит со спондилитом или без; асимметричный воспалительный артрит; связь с наличием HLA-B27 (серологически типируемый аллель локуса HLA-B главного комплекса гистосовместимости (МНС) I класса); воспалительные заболевания глаз и отсутствие аутоантител, ассоциированных с другим ревматоидным заболеванием. Клетками, с наибольшей вероятностью задействованными в качестве ключевого индуктора заболевания, являются CD8+ Т лимфоциты, клетки, которые прицельно воздействуют на антиген, презентируемый молекулами МНС I класса. CD8+ Т клетки могут реагировать на аллель HLA B27 I класса МНС, как если бы это был чужеродный белок, экспрессируемый молекулами I класса МНС. Предполагают, что эпитоп HLA-B27 может имитировать эпитоп антигена бактерий или других микробов и, таким образом, индуцировать CD8+ Т клеточный ответ.
Системный склероз (склеродермия) имеет неизвестную этиологию. Характерным признаком заболевания является уплотнение кожи; вероятно его индуцирует активный воспалительный процесс. Склеродермия может быть локализованной или системной; типичны патологические изменения сосудов, а повреждение эндотелиальных клеток в микрососудистом русле является ранним и важным событием в развитии системного склероза; сосудистое повреждение может быть опосредовано иммунными процессами. Иммунологическая основа предполагается на основании наличия инфильтрата мононуклеарных клеток в очагах повреждения кожи и наличия антинуклеарных антител у многих пациентов. Зачастую нарушается регуляция ICAM-1 на поверхности фибробластов в очагах повреждения кожи, что позволяет предположить, что взаимодействие Т клеток с этими клетками может играть роль в патогенезе заболевания. Другие органы, затрагивающиеся заболеванием, включают: желудочно-кишечный тракт (атрофия гладких мышц и фиброз приводят к аномальной моторике); почки (концентрическая пролиферация субэндотелия интимы, затрагивающая малые дуговые и междолевые артерии, приводит в результате к нарушению кровотока в корковом веществе почки и к протеинурии, азотемии и гипертензии); скелетные мышцы (атрофия, интерстициальный фиброз; воспаление); легкие (интерстициальные пневмонии и интерстициальный фиброз); и сердце (некроз, сопровождающийся появлением «полос сморщивания», рубцовые изменения/фиброз).
Идиопатические воспалительные миопатии, включая дерматомиозит, полимиозит и др., являются нарушениями с хроническим воспалением мышц неизвестной этиологии, приводящим к мышечной слабости. Повреждение/воспаление мышц часто бывает симметричным и прогрессирующим. Аутоантитела ассоциированы с большинством форм. Такие аутоантитела, специфичные для миозита, направлены против белков и РНК, вовлеченных в белковый синтез, и ингибируют их функцию.
Синдром Шегрена (Сьогрена) обусловлен иммуно-опосредованным воспалением и последующим функциональным разрушением слезных желез и слюнных желез. Заболевание может быть обусловлено или сопровождаться воспалительными заболеваниями соединительной ткани. Заболевание сопровождается выработкой аутоантител к антигенам Ro и La, оба из которых представляют собой низкомолекулярные комплексы РНК-белок. Повреждения приводят к развитию сухого кератоконъюнктивита, ксеростомии и другим проявлениями или сопутствующим симптомам, включая билиарный цирроз, периферическую или сенсорную нейропатию и пальпируемую пурпуру.
Системные васкулиты представляют собой заболевания, при которых первичным патологическим изменением является воспаление с последующим повреждением кровеносных сосудов, приводящее к ишемии/некрозу/дегенеративным изменениям тканей, питаемых поврежденными сосудами, с возможной дисфункцией органов-мишеней в некоторых случаях. Васкулиты могут также возникать как вторичное повреждение или следствие других иммуно-воспалительных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, системный склероз и т.д., особенно при состояниях, которые также ассоциированы с формированием иммунных комплексов. Заболевания из группы первичного системного васкулита включают: системный некротизирующий васкулит: узелковый полиартериит, аллергический ангиит и гранулематоз, полиангиит; гранулематоз Вегенера; лимфоматоидный гранулематоз и гигантоклеточный артериит. Смешанные васкулиты включают: слизисто-кожный лимфоузлковый синдром (MLNS или болезнь Кавасаки), изолированный васкулит ЦНС, болезнь Бехчета, облитерирующий тромбоангиит (болезнь Бюргера) и кожный некротизирующий венулит. Считается, что в патогенетическом механизме большинства из перечисленных форм васкулита первичным является отложение иммуноглобулиновых комплексов в сосудистой стенке и последующий запуск воспалительного ответа либо посредством антитело-зависимой клеточной цитотоксичности, либо посредством активации комплемента, или обоими способами.
Саркоидоз представляет собой состояние неизвестной этиологии, которое характеризуется наличием эпителиоидных гранулем практически в любых тканях организма; наиболее часто поражаются легкие. Патогенез включает персистенцию активированных макрофагов и лимфоидных клеток в участках поражения с последующими хроническими осложнениями, развивающимся вследствие секреции этими клетками продуктов, действующих локально и системно.
Аутоиммунная гемолитическая анемия, включающая аутоиммунную гемолитическую анемию, иммунную панцитопению и пароксизмальную ночную гемоглобинурию, является результатом продукции антител, реагирующих с антигенами, экспрессируемыми на поверхности красных кровяных клеток (и в некоторых случаях, других клеток крови, включая также тромбоциты) и сопровождается удалением этих покрытых антителами клеток за счет комплемент-опосредованного лизиса и/или ADCC/Fc-рецептор-опосредованных механизмов.
При аутоиммунной тромбоцитопении, включающей тромбоцитопеническую пурпуру и иммуно-опосредованную тромбоцитопению при других клинических ситуациях, разрушение/удаление тромбоцитов возникает в результате присоединения к тромбоцитам антител или комплемента и последующего их удаления посредством комплемент-опосредованного лизиса, ADCC или Fc-рецептор-опосредованных механизмов.
Тиреоидиты, включая болезнь Грейвса, тиреоидит Хашимото, ювенильный лимфоцитарный тиреоидит и атрофический тиреоидит, являются результатом аутоиммунного ответа на тиреоидные антигены с выработкой антител, реагирующих с белками, присутствующими в тиреоидной железе, и зачастую специфичными для нее. Существующие экспериментальные модели включают спонтанные модели: на крысах (крысы линий BUF и ВВ) и цыплятах (линия цыплят с ожирением); индуцибельные модели: иммунизация животных либо тиреоглобулином, либо тиреоидным микросомальным антигеном (тиреоидной пероксидазой).
Иммунно-опосредованные заболевания почек, включая гломерулонефрит и тубулоинтерстициальный нефрит, являются результатом повреждения почечной ткани, опосредованного антителами или Т лимфоцитами, непосредственно в результате выработки аутореактивных антител или Т клеток, направленных против почечных антигенов, или косвенно в результате отложения в почках антител и/или иммунных комплексов, реагирующих с другими, непочечными антигенами. Таким образом, иммуно-опосредованные заболевания, приводящие к формированию иммунных комплексов, могут также индуцировать иммуно-опосредованное заболевание почек как непрямое следствие. Как прямые, так и непрямые иммунные механизмы приводят к воспалительному ответу, который производит/вызывает поражение тканей почек с результирующим нарушением функции органа и, в некоторых случаях, развитием почечной недостаточности, В патогенез повреждений могут быть вовлечены как гуморальный, так и клеточный иммунные механизмы.
Воспалительные и фиброзирующие болезни легких, включая эозинофильные пневмонии; идиопатический легочный фиброз и гиперчувствительный пневмонит могут включать иммуно-воспалительный ответ с нарушенной регуляцией. Ингибирование этого ответа будет терапевтически благоприятно.
Аутоиммунные или иммуно-опосредованные заболевания кожи, включая буллезные заболевания кожи, полиформную эритему и контактный дерматит опосредованы аутоантителами, в происхождении которых играют роль Т лимфоциты.
Аллергические заболевания, включая астму; аллергический ринит; атопический дерматит; пищевую гиперчувствительность и крапивницу, являются Т лимфоцит-зависимыми. Эти заболевания преимущественно опосредованы воспалением, запущенным Т лимфоцитами, воспалением, опосредованным 1дЕ, или их сочетанием.
Другим заболеванием, подходящим для лечения анти-NKG2D антителами человека, является вирусный гепатит, как показано в WO2007130642 (Chen et al. (Hepatology, Vol.46 (3) pp.706-715 (2007))).
Очевидно, что эффективное количество модулятора NKG2D, также как и общий режим дозирования можно варьировать согласно заболеванию и клиническому статусу пациента, что, в свою очередь, может отражаться в одном или более из клинических параметров, таких как принятые в клинике баллы заболевания. Например, для ревматоидного артрита тяжесть заболевания и/или эффект лечения можно оценить при отслеживании показателей, отражающих отек суставов; боль; подвижность; и/или согласно официальным критериям Американского Колледжа Ревматологов ACR 20/50 или 70. При диабете 1 типа тяжесть заболевания и/или исход лечения можно оценивать путем измерения уровня глюкозы в крови или его вариаций, уровня HblC, количества требующегося инсулина и т.п. При рассеянном склерозе воспаление мозга можно оценивать при сканировании мозга. В гематологии тяжесть заболевания при отторжении трансплантата (неприживаемость) и/или исход лечения можно оценивать по наличию пролонгированной нейтропении, тромбоцитопении и зависимости от переливания эритроцитов у пациентов, прошедших миелоаблативное кондиционирование и по отсутствию химеризма у пациентов, прошедших немиелоаблативное кондидицонирование. Как правило, измеримый эффект на исход лечения с применением способов и композиций по данному изобретению включает уменьшение потребности в других способах лечения (включая, например, уменьшение количества и/или продолжительности применения других препаратов или способов лечения), уменьшение количества и продолжительности госпитализаций, уменьшение количества потерянных из-за болезни рабочих дней и т.п. Очевидно, что эффективное количество может быть определено специалистом при помощи рутинных исследований, при построении таблиц значений и проверке различных элементов таблицы.
Дозировки
Для введения антитела дозировки варьируют приблизительно от 0,0001 до 100 мг/кг, чаще от 0,01 до 5 мг/кг веса тела хозяина. Например, дозировки могут составлять приблизительно 0,3 мг/кг веса тела, приблизительно 1 мг/кг веса тела, приблизительно 3 мг/кг веса тела, приблизительно 5 мг/кг веса тела или приблизительно 10 мг/кг веса тела или в пределах диапазона 1-10 мг/кг. Примеры режимов лечения предусматривают введение дважды в неделю, один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в три недели, один раз в четыре недели, один раз в месяц, один раз в 3 месяца или один раз в 3-6 месяцев. Предпочтительный режим дозирования анти-hMKG2D антитела по изобретению включает приблизительно 1, 3 или 10 мг/кг веса тела посредством внутривенного введения или подкожной инъекции с введением антитела согласно одному из следующих графиков дозирования: (1) введение 2-4 дозировок каждые 1-3 недели, затем каждые два месяца; (2) каждые четыре недели; (3) каждую неделю, либо любой другой оптимальный способ дозирования. В некоторых способах два или более моноклональных антител с различными связывающими валентностями вводят одновременно, в этом случае дозировка каждого вводимого антитела находится в указанном диапазоне. Антитело, как правило, вводят многократно. Интервалы между отдельными дозировками могут составлять, например, неделю, месяц, три месяца или год. Интервалы могут также быть нерегулярными, в соответствии с измерениями уровня антитела в крови, для направленного воздействия на антиген в организме пациента. В некоторых способах дозировка подбирается для достижения концентрации антитела в плазме приблизительно 1-1000 мкг/мл, а в некоторых способах приблизительно 25-300 мкг/мл. В альтернативном случае, антитело можно вводить в качестве препарата, обеспечивающего длительное высвобождение, в этом случае требуется менее частое введение. Дозировка и частота варьируют в зависимости от времени полужизни антитела в организме пациента. Как правило, антитела человека обладают наибольшим временем полужизни, затем следуют гуманизированные антитела, химеризованные антитела и антитела, не принадлежащие человеку. Дозировка и частота введения могут варьировать в зависимости от того, является ли воздействие профилактическим или непрофилактическим (например, паллиативным или лечебным). При профилактическом применении относительно низкие дозировки вводят с относительно редкими интервалами в течение длительного времени. Некоторые пациенты продолжают получать лечение до конца своей жизни. При паллиативном или лечебном применении иногда требуется относительно высокая дозировка при относительно коротких интервалах, до тех пор пока прогрессирование заболевания не замедлится или не прекратится, предпочтительно до тех пор, пока у пациента не наступит уменьшение интенсивности симптомов заболевания, частично или полностью. Впоследствии пациент может быть переведен на профилактический режим.
Соответствующие дозировки противовоспалительных агентов будут приблизительно соответствовать тем, что уже применялись в клинической практике, когда противовоспалительные агенты вводят отдельно или в сочетании с другими агентами. Вариации дозировок будут возникать в зависимости от состояния, лечение которого проводится. Врач, проводящий лечение, сможет определять требуемую дозировку для отдельного субъекта.
Изделия
В другом воплощении изобретения описывается изделие, содержащее материалы, пригодные для лечения описанных выше нарушений. Например, изделие может включать контейнер, содержащий человеческое или гуманизированное анти-hNKG2D антитело, согласно данному описанию, вместе с инструкциями для пользователей, объясняющими как лечить такое заболевание, как аутоиммунное или воспалительное заболевание или нарушение у людей при помощи эффективного количества антитела. Изделие, как правило, содержит контейнер и этикетку или листовку-вкладыш на контейнере или внутри него. Подходящие контейнеры включают, например, бутыли, флаконы, шприцы и т.д. Контейнеры могут быть сделаны из разнообразных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию, эффективную при лечении состояния, и может иметь отверстие для стерильного доступа (например, контейнер может представлять собой пакет с раствором для внутривенного введения или флакон с пробкой, которую можно проткнуть иглой для подкожных инъекций). По крайней мере один активный агент в составе композиции является человеческим или гуманизированным анти-hNKG2D антителом или антиген-связывающим фрагментом или производным антитела (например, иммуноконъюгатом), содержащим такое антитело. На этикетке или листовке-вкладыше указано, что композицию применяют для лечения предпочтительного заболевания, например, такого, как ревматоидный артрит.
Кроме того, изделие может содержать (а) первый контейнер с находящейся в нем композицией, композиция содержит человеческое или гуманизированное антитело, и (б) второй контейнер с находящейся в нем композицией, композиция содержит терапевтический агент, отличный от человеческого или гуманизированного антитела. Изделие в данном воплощении изобретения может также листовку-вкладыш, с указанием о том, что первая и вторая композиции могут применяться в сочетании для лечения аутоиммунного или воспалительного заболевания или нарушения. Такие терапевтические агенты могут быть любым из компонентов дополнительной терапии, описанных в предыдущем разделе. Ополнительно или альтернативно, изделие может также включать второй (или третий) контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическую воду для инъекций (BWFI), фосфатно-солевой буфер, раствор Рингера и раствор декстрозы. Он может также включать другие материалы, желательные с коммерческой или потребительской точки зрения, включая другие буферы, растворители, фильтры, иглы и шприцы.
ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Детали изобретения дополнительно иллюстрируются в следующих Примерах, не являющихся исчерпывающими.
Пример 1: Получение и первоначальный скрининг моноклональных антител человека к hNKG2D
Материалы и методы
Антиген. Для иммунизации в качестве антигенов использовали растворимый гибридный белок NKG2D-hFc (R&D, cat: 1299-NK) или NKG2D, экспрессируемый на поверхности клеток (NK, BAF или СНО). Клетки BAF ко-трансфецировали NKG2D и полноразмерным DAP10. Клетки СНО трансфецировали NKG2D с точечной мутацией, обеспечивающей транспорт на клеточную поверхность без DAP10 (Wu et al., Science 1999; 385:730-2). NK клетки были первичными NK клетками, естественным образом экспресирующими NKG2D.
Мыши. Полностью человеческие моноклональные антитела к NKG2D продуцировали в трансгенных мышах линии KM mouse™, экспрессирующих гены антител человека (публикация WO 02/43478 (Ishida et al.)). У мышей этой линии имеется разорванный ген эндогенной легкой цепи каппа в гомозиготном состоянии, как описано Chen et al (1993) EMBO J. 12:811-820, и разорванный ген эндогенной тяжелой цепи мыши в гомозиготном состоянии, как описано в Примере 1 публикации WO 01/09187 для мышей Humab. Мыши линии несут трансген легкой каппа цепи человека, KC05, согласно описанию Fishwild et al (1996) Nature Biotechnology 14:845-851. Мыши линии также несут перенесенную хромосому, кодирующую тяжелую цепь человека, SC20, согласно описанию в WO0243478.
6
6
Иммунизации. В первой серии иммунизации животных иммунизировали интраперитонеально посредством чередующихся инъекций клеток BAF, трансфецированных NKG2D, и клеток СНО, трансфецированных NKG2D, или первичными NK клетками человека с адъювантом или без. Каждую мышь иммунизировали интраперитонеальным введением 5×10 клеток каждую неделю или через неделю (всего 6 раз). Мышей реиммунизировали внутривенным введением 5×10 клеток BAF, трансфецированных NKG2D, за 3 и 2 дня до забивания и удаления селезенки. Эксперименты на животных проводились в соответствии с рекомендациями Датского Национального Совета по Исследованиям.
Во второй серии иммунизации животных иммунизировали интраперитонеально и в лапу NKG2D-hFc с различными адъювантами. Каждую мышь иммунизировали 7×25 мкг NKG2F-hFc/адъювант Ribi/ип/пк, 1×25 мкг NKG2D-hFc/полный адъювант Фрейнда/ип/пк, 1×25 мкг NKG2D-hFc/неполный адъювант Фрейнда/ип/пк, 1×30 мкг анти-CTLA4+40 мкг NKG2D-hFc/неполный адъювант Фрейнда/ип/пк, 1×25 мкг NKG2D-hFc/адъювант Ribi/ип/пк и реиммунизировали 2×30 мкг/PBS/ип/пк за 3 и 2 дня до забивания и удаления селезенки. Эксперименты на животных проводились в соответствии с рекомендациями Американского Национального Совета по Исследованиям.
Скрининг сыворотки мышей. Проводили скрининг сыворотки иммунизированных мышей в ходе анализа при помощи проточной цитометрии на специфичность в отношении NKG2D и выбранные сыворотки также тестировали на их способность нейтрализовать связывание лиганда MICA, согласно описанию в Примере 3. Мышей, у которых антитела, специфичнески связывающие NKG2D и нейтрализующие связывание MICA, выработались в высоком титре, отбирали для получения гибридом.
Получение гибридом. Селезенку каждой отобранной иммунизированной мыши гомогенизировали и суспензии одиночных спленоцитов применяли для слияния с клетками миеломы Х61 Ag8653 (АТСС, CRL 1580). Слияние клеток проводили с применением полиэтиленгликоля (ПЭГ) 1500 как описано ранее (Harlow and Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988)), а электрогибридизацию проводили при помощи системы The Cyto Pulse™ CEEF-50 Electrofusion System (Cyto Pulse Sciences, Inc.).
Гибридные клетки вначале рассаживали в 96-луночные культуральные планшеты в селективной среде DMEM HAT с добавлением 10% FBS и 5% Origen (Hybridoma cloning Factor, BioVeris). Планшеты инкубировали в течение 10-14 дней со сменой среды 1-2 раза, соответственно, на среду DMEM HT с добавлением 5% FBS и 0,7% Origen, перед сбором и скринингом супернатанта. Клоны, оказавшиеся при тестировании позитивными, рассевали и субклонировали методом предельного разведения для получения стабильных клонов. Скрининг отобранных клонов на наличие антител, специфичных к NKG2D, проводили постоянно при помощи FACS анализа, а также по их способности нейтрализовывать связывание MICA.
3
4
Скрининг супернатант гибридом. Первоначальный скрининг супернатантов гибридом для первой серии иммунизации проводили при помощи прямого ИФА или при помощи проточной цитометрии (FACS) для тестирования на наличие антител, специфичных к NKG2D. Кратко, ИФА проводили покрывая планшеты «maxisorp» 50 мкл 0,4 мкг/мл mFc-NKG2D (содежащих внеклеточную часть NKG2D, сшитых с Fc грызунов и экспрессированных в клетках СНО) в течение ночи в PBS при 4°C, с последующим блокированием PBS, 0,05% Tween 20, в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем планшеты инкубировали с 50 мкл супернатанта гибридомы и антитела, специфичные в отношении NKG2D, определяли при помощи специфичных к фрагменту Fey человека IgG козы, конъюгированных с HRP (Jackson, 109-036-098). Инкубацию проводили в течение 1 ч при комнатной температуре и между каждым этапом планшеты промывали PBS, 0,05% Tween 20. Связанные антитела детектировали при помощи 100 мкл субстрата ТМВ (Kem-En-Tec) и останавливали реакцию 4М HPO. Оптическую плотность измеряли при 450 и 620 нм. Для FACS анализа связывание с экспрессирующими NKG2D клетками BaF/3 и контрольными клетками BaF/3, не экспрессирующими NKG2D, анализировали при инкубации 50000 клеток в 10 мкл с 90 мкл супернатанта гибридомы в течение 30 мин при 4°С, с последующим отмыванием PBS с 2% FBS и последующей инкубацией со вторичными IgG козы, специфичными к фрагменту Fey человека, конъюгированными с HRP (Jackson, 109-036-098). Затем клетки анализировали на B&D FACSArray (BD Biosciences). Антитела, окрашивающие только экспрессирующие NKG2D клетки BaF/3, но не контрольные клетки, считали специфичными в отношении NKG2D.
Первичный скрининг для второй серии иммунизации выполняли при помощи прямого ИФА для тестирования наличия специфичных в отношении NKG2D антител, Кратко, ИФА выполняли покрывая планшеты «maxisorp» 1-2 мг/мл hFc-NKG2D (R&D Systems) в течение ночи в PBS при 4°С, с последующим блокированием PBS, 0,05% Tween 20, 5% сыворотки цыпленка в течение 30-60 мин при комнатной температуре. Планшеты затем инкубировали с 50 мкл супернатанта гибридомы и 50 мкл блокирующего буфера и определяли антитела, специфичные в отношении NKG2D, при помощи конъюгированного с HRP IgG козы к каппа цепи человека (Bethyl, A80-115Р) в блокирующем буфере. Инкубации проводили в течение 1 ч при комнатной температуре и между каждым этапом планшеты промывали PBS, 0,05% Tween 20. Связанные антитела детектировали при помощи субстрата ABTS (Moss Inc, реагент ABTS-1000). Оптическую плотность считывали при 415 нм с применением программы Molecular Devices.
Гибридомы, отобранные при первоначальном скрининге при помощи ИФА, подвергали вторичному скринингу при помощи FACS, согласно описанию выше.
В качестве контролей применяли коммерчески доступные антитела грызунов (149810 и ON72).
Результаты
Сыворотки иммунизированных мышей, обладающие высокой селективностью, идентифицировали по способности связывать NKG2D и блокировать лиганды (примеры результатов показаны на Фигуре 1А и 1Б), а отобранных мышей использовали для слияния и получения гибридом. Был проведен скрининг приблизительно 2500 гибридом при помощи ИФА и проточной цитометрии и идентифицированы клоны, специфичные в отношении NKG2D. На фигуре 2 показано, что антитело человека в супернатанте гибридомы связывалось с экспрессирующими NKG2D клетками, но не с клетками, негативными по NKG2D, при сравнении с коммерческим антителом (149810). Антитела из трех гибридом (16F16, 16F31 и 21F2) из первых серий иммунизации и несколько антител из вторых серий иммунизации (включая MS), были отобраны для получения рекомбинантов и последующего тестирования.
Пример 2: Получение рекомбинатов и секвенирование
Вторую партию из нескольких сотен гибридом, полученных из спленоцитов мышей, экспрессирующих антитела человека, получили в отдельной серии иммунизации. Провели их скрининг на специфичность в отношении NKG2D при помощи FACS таким же обраом, как описано в Примере 1. Антитела из одной гибридомы, MS, были отобраны для получения рекомбинантов и последующего тестирования.
Вариабельные участки тяжелой и легкой цепей антител идентифицировали при помощи ПЦР и последущего секвенирования выделенного продукта, мРНК гибридомы.
Материалы и методы
Очистка РНК. Общую РНК очищали при помощи набора RNeasy Qiagen согласно инструкциям производителя, за исключением того, что из процесса исключали β-меркаптоэтанол. Качество РНК проверяли при помощи спектрофотометрии (260/280 нм, 1,8 < соотношение < 2,0) и в некоторых случаях деградацию РНК оценивали при помощи анализатора.
ОТ-ПЦР. Полноразмерную кДНК синтезировали при помощи набора SMART-RACE (Clonetech).
ПЦР. ПЦР проводили с использованием полимеразы HFII Clonetech. Праймер 5' (с сайтом EcoRI) гибридизовали с консервативной последовательностью, введенной в ходе SMART-RACE. Два праймера 3' разработали таким образом, что они гибридизовались с консервативными участками IgG (VH) и каппа цепей (VL), соответственно. В праймерах 3' также присутствовали рестрикционные сайты (BsiWI (VL) и Nhel (VH)). ПЦР проводили в дубликате (для проверки возможных мутаций, появившихся в ходе ПЦР) как при амплификации VH, так и VL. В случае, если ПЦР оказывалась неудачной, амплификацию VL и VH проводили с применением смеси вырожденных праймеров 5' (Novagen).
Очистка продуктов ПЦР. Продукт ПЦР (~550 пн) разделяли в 1% агарозном геле, вырезали, очищали на колонках GFX (Amersham) и элюировали водой, не содержащей ДНКаз.
Лавирование. Продукты ПЦР и вектор экспрессии (с устойчивостью к ампициллину) разрезали соответствующими рестрикционными ферментами (VH, EcoRI + Nhel и VL, EcoRI + BsiWI). Лигирование вариабельных доменов в вектор, предопределяющий изотип (lgG4 для NKG2D), катализировали Т4-лигазой (Roche). Использовали плазмиду рТТ5 (Durocher et al., Nucleic Acids Res 2002; 30(2):e9; Pham et al., Biotechnol Bioeng 2003; 84(3):332-42).
Проверка инсерции в вектор экспрессии (ПЦР колоний). Компетентные E. coli (Тор10) трансформировали смесью для лигирования и проводили селекцию устойчивых к ампициллину клонов в течение ночи. В общем было выбрано 8 позитивных колоний для VH и VL. При помощи ПЦР колоний и электрофореза в геле (1% агароза), у всех колоний проверяли, соответствует ли размер вставок ожидаемому.
Секвенирование/минипреп. Аликвоту продуктов ПЦР всех позитивных колоний использовали для секвенирования (с помощью ExoSAPit). Всего для каждого клона было секвенировано 32 продукта ПЦР ((8*VH+8*VL)*2 (ПЦР в дубликате)). Последовательности анализировали (с помощью VectorNTI), нарабатывали позитивные колонии бактерий, соответствующие клонированным VH и VL (mini/maxiprep), а ДНК очищали для трансфекции HEK293/6Е (колонки GFX). Если идентифицировали более одной последовательности VH и VL, то в клетках HEK293/6Е экспрессировали все возможные комбинации VL и VH.
Получение рекомбинантов. Идентифицированные вариабельные участки тяжелой и легкой цепей вставляли в каркасные участки тяжелой и легкой цепей lgG4 человека, соответственно, и экспрессировали в двух векторах в клетках HEK293 в большом количестве. Антитела очищали на колонках с протеином А.
Экспрессия антител в клетках HEK293/6Е. Клетки HEK293 выращивали в среде Freestyle293 (Gibco). В день трансфекции клетки разводили до концентрации 1 миллион клеток/мл. Для трансфекции в 30 мл смешивали 15 мкг вектора с тяжелой цепью и 15 мкг вектора с легкой цепью с 2 мл Opti-MEM и 40 мкл 293fectin (затем добавляли среду Freestyle293 до конечного объема 30 мл). После 6 дней инкубации клетки осаждали центрифугированием (1000 об/мин, 10 мин) и супернатант собирали для очистки при помощи протеина А.
Очистка. Экспрессированные рекомбинантные варианты lgG4 антител человека очищали на колонках MabSelect™ SuRe протеин-А. После нанесения антитела на колонку, колонку промывали 10 кратным объемом буфера PBS и элюировали антитело буфером (100 мМ глицин, 100 мМ NaCl, pH 3,0), с последующей заменой буфера на PBS с применением колонок HighTrap™ Desalting. Все операции контролировали системой Aktaxpress (GE Healthcare Amersham Biosciences AB).
Типичный диапазон концентраций очищенного антитела составлял 10-130 мг/л (0,3-3,3 мг/30 мл).
Результаты
Последовательности кДНК, кодирующие Н цепь 16F16 (lgG4), L цепь 16F16, Н цепь 16F31 (lgG4) и L цепь 16F31 приведены в SEQ ID NOS:3-6, соответственно, а соответствующие кодовые обозначения для полноразмерных аминокислотных последовательностей, последовательностей вариабельных участков и участков CDR 16F16 (lgG4), 16F31 (lgG4), MS (lgG4) и 21F2 (lgG4) приведены в Таблице 1. На Фигуре 4 показаны аминокислотные последовательности 16F16, 16F31, MS и 21F2 изотипа lgG4, на которых выделены вариабельные (жирно) и CDR (жирно, подчеркнуто) участки.
При помощи алгоритма JointMLc для анализа состава участка, соединяющего константный и вариабельный участки тяжелой цепи IgH, и классификации D-генов, описанного Ohm-Laursen et al., (Immunology 2006; 119:265-77), идентифицировали следующие последовательности зародышевой линии вариабельных участков 16F16 и 16F31:
16F16 VH: VH3_21/D3-9/JH4
(SEQ ID NOS:31/32/33, соответственно)
16F16 VL: VKIJ-15/JK2
(SEQ ID NOS:34/35, соответственно)
16F31 VH: VH3_20/D3-10/JH6
(SEQ ID NOS:36/(EL)/37, соответственно)
16F31 VL: VKIII_A27/JK3
(SEQ ID NOS:38/39, соответственно)
MS VH: VH4_59/D3_27_R3/JH3
(SEQ ID NOS:64/(NWG)/65, соответственно)
MS VL: VKIII_A27/JK1
(SEQ ID NOS:38/66, соответственно)
21F2 VH: VH5_51/D3_10_R3/JH4
(SEQ ID NOS:67/68/33, соответственно)
21F2 VL: VKIIIJ-6/JK1
(SEQ ID NOS:69/66, соответственно)
Выравнивание последовательностей VH и VL с соответствующими рекомбинированными последовательностями зародышевой линии (SEQ ID NOS:27-30 соответствуют рекомбинированным VH3_21/D3-9/JH4, VKI_L15/JK2, VH3_20/D3-10/JH6 и VKIII_A27/JK3, соответственно, a SEQ ID NOS:60-63 соответствуют рекомбинированным VH4_59/D7_27_3/JH3, VKIII_A27/JK1, VH5_51/D3_10_R3/JH4 и VKIII_L6/JK1, соответственно), с указанными соматическими гипермутациями, показаны на Фигурах 5А-5Н.
Пример 3. Эксперименты с блокированием MICA
Материалы и методы
Исследования при помощи проточной цитометрии - блокирование MICA. Для анализа блокирования связывания с лигандами 50000 клеток BaF/3, экспрессирующих NKG2D/DAP10, инкубировали в общем объеме 100 мкл (PBS с 2% FBS при рН 7,4) с различным количеством супернатанта гибридомы или с очищенным антителом в течение 1h при 16°С, с последующей инкубацией с mFc-MICA (для антител человека) или hFc-MICA (для ON72) (1 мкг) в течение 30 мин при 4°С. Затем клетки отмывали и для детекции связывания MICA-mFc добавляли вторичное антитело: IgG козы, конъюгированное с HRP, специфичное к фрагменту Fcγ мыши, Jackson (109-036-151). Затем клетки анализировали на проточном цитометре B&D FACSArray. Степень снижения связывания MICA при предварительной инкубации анализировали по MFI (средней интенсивности флуоресценции) связывания после пре-инкубации в % от связывания MICA без пре-инкубации.
Для анализа концентраций экспрессированного рекомбинантного и очищенного антитела также проводили более подробное исследование кривых доза-ответ для расчета 50% ингибирования (IC50) и полного блокирования связывания 1 мкг MICA-mFc.
Результаты
Анализировали способность антител блокировать связывание лигандов. На Фигуре 6 продемонстрировано, что пре-инкубация с супернатантом гибридомы на самом деле блокирует связывание лиганда MICA. Кривая доза-ответ, построенная при помощи рекомбинантных антител, отображает, что IC50 и полное блокирование связывания NKG2D с MICA-mFc в насыщающей концентрации (1 мкг) для антитела 16F16 составляет 0,017 и 0,2 нМ, а для 16F31 составляет 0,16 и 0,7 нМ (Фигура 7). Аналогичные показатели у ON72 составляли 0,02 и 0,24 нМ для IC50 и полного блокирования связывания 1 мкг MICA-Fc, соответственно. Подробные результаты показаны ниже в Таблице 2. IC50 для MS и 21F2 были наиболее низкими, 0,0016 нМ и 0,0048 нМ, соответственно.
Таблица 2
Антитело
IC50 (мкг/мл)
Полное блокирование связывания 1 мкг MICA-Fc (мкг/мл)
16F16
0,019
0,59
16F31
0,24
4,8
MS
0,0025
0,053
21F2
0,0063
0,16
ON72
0,019
0,54
Пример 4. Конкуренция с антителами грызунов
Материалы и методы
Исследования при помощи проточной цитометрии - конкуренция с антителами грызунов. Для анализа блокирования коммерчески доступных анти-hNKG2D антител грызунов, 50000 клеток, экспрессирующих NKG2D, инкубировали в общем объеме 100 мкл (PBS с 2% FBS при рН 7,4) с супернатантом гибридомы или очищенным рекомбинантным антителом (0,3 мкг или согласно указанному) в течение 1 ч при 16°С, с последующей инкубацией с анти-hNKG2D антителом грызунов (ON72, 149810, 1D11 или 5С6 (для 1D11 и 5С6, см., например, Bauer et al., Science 1999:285:727-9 and WO02068615); в количестве 0,3 мкг или согласно указанному) в течение 30 мин при 4°С. Затем клетки отмывали и для детекции связывания антитела грызунов добавляли вторичное антитело IgG козы, конъюгированное с HRP, специфичное к фрагменту Fey мыши (Jackson, 109-036-151). Клетки анализировали при помощи B&D FACSArray. Эксперимент также проводили с пре-инкубацией с антителом грызунов и затем с супернатантом гибридомы или очищенным антителом человека, используя для детекции IgG козы, конъюгированный с HRP, специфичный к фрагменту Fcγ человека (Jackson, 109-036-098). Степень снижения связывания MICA при предварительной инкубации анализировали по MFI связывания после пре-инкубации в % от связывания без пре-инкубации.
Результаты
Пре-инкубация клеток с супернатантом гибридомы с последующей инкубацией с ON72 показала, что происходило блокирование связывания ON72 на 95% (Фигура 8). Проведение такого же эксперимента с рекомбинантным антителом 16F16 показало, что 16F16 блокировало связывание ON72 на 95%, тогда как пре-инкубация с ON72 блокировала последующее связывание 16F16 только на 82% (Фигура 9А). Аналогично, для 149810 и 16F16, с каждым антителом наблюдалось только приблизительно 50% блокирование, независимо от порядка инкубации или относительной концентрации антитела (Фигура 9А). Для других доступных анти-hNKG2D антител результаты их перекрестного ингибирования представлены в Таблице 3, свидетельствуя практически о полной блокаде связывания ON72 антителами 1D11 и 5С6 и приблизительно 85% ингибирование анителом 149810. Проведение аналогичного теста с рекомбинантным MS показало, что пре-инкубация с MS ингибировала связывание ON72 на 98%, связывание 1D11 на 88% и связывание 149810 на 96,5% (Фигура 9Б).
Таблица 3
Предварительная инкубация с антителом
Последующая инкубация с антителом
Ингибирование (%)
149810
ON72
85
1D11
ON72
97
5С6
ON72
97
Пример 5. Связывание с клетками крови и перекрестное реагирование с NKG2D обезьян
Материалы и методы
Исследования при помощи проточной цитометрии - МКПК человека и обезьяны. Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) выделяли у человека или у яванского макака или макаки-резус. Все работы с животными проводили в соответствии с рекомендациями Датского Национального Совета по Исследованиям. Каждый образец МКПК метили маркером, характерным для различных подклассов клеток (NK, CD8+, CD4+ и γδ Т клеток), а также для NKG2D - при помощи ON72 или рекомбинантного очищенного 16F16. Затем клетки отмывали и анализировали при помощи BD FACSDiva (BD Biosource) окрашивание на NKG2D с применением двух антител клеток различных подклассов. MFI окрашивания рассчитывали для антител по-отдельности.
В отдельном эксперименте тестировали связывание MS и 21F2 как с препаратами МКПК, так и с цельной кровью, полученной от здоровых доноров или яванского макака, при добавлении всего спектра концентраций MS или 21F2 с последующей детекцией при помощи lgG4 антитела к антигенам человека и рассчитывали значения ЕС50. Кратко, инкубацию с антителом проводили при 4°С в течение 30 мин с последующим отмыванием и затем добавлением напрямую меченного вторичного антитела против hlgG4 с инкубацией в течение 30 мин при 4°С вместе с антителами, специфичными для различных клеточных популяций, представляющих интерес - CDS, CD4, NK и γδ-Т клеток, затем клетки дважды отмывали в PBS с 2% FBS и лизировали эритроциты. Затем клетки анализировали при помощи проточной цитометрии и оценивали связывание с различными клеточными популяциями.
Результаты
Результаты для 16F16 и ON72 показаны на Фигурах 10A-10D. Все NK и CD8+ Т клетки положительно окрашивались на NKG2D, тогда как CD4+ Т не имели положительного окрашивания в МКПК яванского макака или макаки-резус. Аналогичные результаты были получены для МКПК человека, исследуемых параллельно. Это согласуется с данными литературы, т.е., у человека NKG2D обычно экспрессируется на NK клетках и CD8+ Т клетках, но не на CD4+ Т клетках.
Окрашивание МКПК яванского макака или макаки-резус при помощи ON72 или 16F16 демонстрировало одинаковое связывание двух антител с NK клетками и CD8+ Т клетками, и отсутствие связывания с CD4+ Т клетками. Эти результаты подтвердили, что эти два вида обезьян пригодны для исследования цитотоксичности.
Перекрестного реагирования с NKG2D мыши, крысы, собаки или свиньи не наблюдалось как с коммерчески доступными, так и с любым из 16F16 или 16F31.
Результаты связывания MS с CD8 Т клетками человека и яванского макака показаны на Фигурах 11А и 11Б, соответственно, а значения ЕС50 для связывания MS и 21F2 с препаратами МКПК показаны в Таблице 4, наряду с относительными значениями ЕС50 для клеток яванского макака в % к клеткам человека. Это показывает, что как MS, так и 21F2 имеют очень схожую аффинность к NKG2D человека и яванского макака.
Таблица 4
Тип клеток
ЕС50 (мкг/мл) для MS
ЕС50 мкг/мл) для 21F2
Яванский макак
Человек
%
Яванский макак
Человек
%
Gd
0,0301
0,0355
85,5
0,0464
0,0572
81,1
CD8
0,0286
0,0357
80,1
0,0435
0,0605
71,9
NK
0,0309
0,0411
75,2
0,0475
0,0712
66,7
Пример 6. Биологический тест
51
Для исследования того, что полностью человеческие антитела действительно блокировали активность NKG2D, был разработан тест для определения опосредованной лигандом NKG2D цитотоксичности. Использовали тест с высвобождением Cr, в котором клетки-мишени загружали радиоактивной меткой и измеряли ее высвобождение, как следствие киллерной активности NK клеток.
Материалы и методы
51
Тестирование киллерной активности клеток, опосредованной взаимодействием NKG2D-MICA. Для тестирования анти-NKG2D антител могут применяться биологические тесты, в которых определяется гибель клеток-мишеней, опосредованная лигандом NKG2D. Линии NK клеток NK92 или NKL (ATCC No. CRL-2407; Robertson et al., Exp Hematol 1996; 24:406-15) обе вызывали гибель BaF/3 клеток, трансфецированных MICA, NKG2D-зависимым образом, и могут применяться в качестве эффекторных клеток, вызывающих гибель нагруженных Ск клеток-мишеней, экспрессирующих лиганд NKG2D (либо MICA, либо MICB, либо ULBP1-4).
51
51
51
В первом тесте клетки NKL инкубировали в течение 4 ч с нагруженными Ск BaF/3 клетками, экспрессирующими MICA, в соотношении 10:1, в присутствии или отсутствии 1 или 5 мкг ON72 или рекомбинантного 16F16 изотипа lgG4. После инкубации супернатант переносили в планшеты для микротитрования, добавляли сцинтилляционную жидкость и измеряли высвобождение Сг в результате гибели клеток-мишеней при помощи счетчика Topcounter (Wallach). Уменьшение высвобождения Сг было мерой ингибирования киллерного эффекта под воздействием добавленного антитела, проводили рассчет процентного содержания погибших клеток.
51
Во втором тесте клетки NK-92 инкубировали с меченными Cr клетками BaF/3, экспрессирующими либо MICA, либо ULBP3, и определяли снижение киллерного эффекта под воздействием нарастающих концентраций рекомбинантного очищенного антитела 16F16, 16F31, MS или 21F2 с изотипом lgG4. Результаты представлены как % ингибирования киллерного эффекта.
Результаты
Добавление антитела, блокирующего прикрепление лиганда, как ON72, так и 16F16, дозо-зависимым образом блокировало гибель клеток, несущих MICA, под воздействием NKL клеток, выраженным как % ингибирования киллерного эффекта (см. Фигуру 12). Контрольные клетки, не экспрессирующие MICA, не погибали под воздействием NKL клеток.
16F16 также ингибировал дозо-зависимым образом гибель клеток-мишеней BaF/3, несущих как MICA, так и ULBP, под воздействием клеток NK-92 (Фигуры 12А и 12Б), выраженным как % ингибирования киллерного эффекта, с практически полным блокированием киллерного эффекта, индуцированного как MICA, так и ULBP-NKG2D, при концентрации 0,8 мкг/мл. 16F31 (lgG4) блокировал киллерный эффект приблизительно на 75% при наиболее высокой исследованной концентрации (20 мкг/мл; Фигуры 13А и 13Б).
51
51
Как показано на Фигуре 14А, как MS, так и 21F2 ингибировали гибель клеток, несущих ULBP3, под воздействием клеток NK-92 в тесте с высвобождением Cr. На Фигуре 14А блокирование цитотоксического эффекта выражено как % ингибирования, где 0 представляет собой совместную инкубацию двух типов клеток без добавления антитела, при этом MS оказывается более эффективным. Как показано на Фигуре 14Б, максимальное подавление гибели клеток, несущих лиганд (MICA), под воздействием клеток NKL в тесте с высвобождением Cr было получено при очень низкой концентрации MS (0,01 мкг/мл), тогда как наиболее высокая из протестированных концентраций 16F16 (0,1 мкг/мл) вызывала только 40% ингибирование. Сводные данные по IC50 приведены в Таблице 5.
Таблица 5
Антитело
ЕС50 (мкг/мл)
Клетки-мишени, экспрессирующие ULPB3
Клетки-мишени, экспрессирующие MICA
16F16
0,35
0,14
16F31
14,8
14,9
MS
0,012
0,0016
21F2
0,021
ON72
0,065
Пример 7. Снижение уровня NKG2D, индуцированное антителом
Было показано, что при инкубации клеток, экспрессирующих hNKG2D, с антителом происходит уменьшение количества NKG2D, например, за счет интернализации, таким же образом, как было показано ранее для определенных антител против mNKG2D на моделях с мышами. Это повлечет за собой иной механизм действия и, возможно, замедление проявления эффекта антитела. В данном случае уменьшение уровня NKG2D анализировали путем измерения, насколько он снижался после инкубации с антителом в течение ночи.
Материалы и методы
Исследования при помощи проточной цитометрии - снижение уровня NKG2D. Снижение уровня NKG2D, опосредованное антителом, анализировали на различных типах клеток, экспрессирующих NKG2D, при инкубации в течение ночи с ON72, 16F16, 16F31, MS или 21F2. Не ограничиваясь какой-либо теорией, различия в снижении уровня могут отражать различия во взаимодействии антиген-антитело, например, различия в эпитопах. Экспрессировали рекомбинантные антитела человека с изотипом lgG4, обусловливающим связывание Fc рецептора с низкой аффинностью.
В первом эксперименте добавляли 1 мкг ON72 или 16F16; 3 мкг 16F31; 0,1 мкг MS или 0,3 или 1 мкг 21 F2 в 1 мл к клеткам, экспрессирующим NKG2D и DAP10.
Во втором эксперименте свежевыделенные NK клетки инкубировали с различным количеством MS (0; 0,003; 0,01; 0,03; 0,1; 0,3; 1 мкг) или 21 F2 (0,1 мкг) в присутствии 10% сыворотки человека для имитации цельной крови, в присутствии IgG с более высокой аффинностью к Fc рецепторам.
В третьем эксперимете 0,1 мкг/мл MS, ON72 или 21F2 добавляли к цельной крови, содержащей NK, CD8+ и γδ Т клетки. После инкубации окрашивание при помощи анти-CD8, анти-CD56 (NK клетки), анти-γδ и антитела к антигенам человека позволяло определить связывание с различными популяциями.
В качестве контролей в вышеупомянутых экспериментах клетки оставляли в течение ночи при 37°С без какой-либо обработки. На следующий день как необработанные клетки, так и клетки, обработанные антителом, инкубировали с 0,1 мкг антитела, с которым проводили предварительную обработку, и затем добавляли либо специфичные к фрагменту Fcγ мыши IgG козы, конъюгированные с HRP (Jackson, 109-036-151) - для детекции ON72, либо специфичные к фрагменту Fey человека IgG козы, конъюгированные с HRP (Jackson, 109-036-098) - для детекции антитела человека. Затем клетки отмывали и анализировали при помощи B&D FACSArray. Анализировали разницу в уровне окрашивания без обработки и после обработки антителами как показатель снижения уровня NKG2D, и рассчитывали % оставшегося на клеточной поверхности NKG2D как % окрашивания после предварительной обработки в сравнении с окрашиванием необработанных клеток.
Результаты
Как показано на Фигуре 15, ON72, 16F16 и 16F31 вызывали уменьшение количества NKG2D в клетках BAF/3, экспрессирующих NKG2D, Для ON72 и 16F31 наблюдали снижение приблизительно на 55%, по сравнению со снижением приблизительно на 75% в случае 16F16. Это позволяет предположить, что 16F16 вызывает снижение более эффективно, т.к. значение Kd у него сходно с ON72. Не ограничиваясь какой-либо теорией, это может быть следствием связывания с различными эпитопами. После инкубации с MS, наблюдалось приблизительно 95% снижение поверхностного NKG2D (Фигура 16А). В свежевыделенных NK клетках концентация MS, соответствующая только приблизительно 60% насыщения (0,03 мкг/мл) вызывала максимальную интернализацию NKG2D на клеточной поверхности в присутствии сыворотки, в этом случае только приблизительно 35% NKG2D оставалось доступным для связывания после инкубации с антителом в течение ночи (Фигура 16Б). Для 21F2, в отсутствие сыворотки концентрация 1 мкг/мл вызывала снижение уровня NKG2D на 78% (Фигура 17).
В 3 различных популяциях NKG2D+ лимфоцитов в цельной крови в случае MS и 21F2 приблизительно 80% интернализации наблюдалось через 24 ч, тогда как ON72 вызывал интернализацию практически на 100% (Фигура 18). Кроме того, ON72 вызывал интернализацию быстрее, чем MS и 21F2 (Фигура 18), до 50-75% за 1 ч.
Пример 8. Неистощающие IgG4-варианты антител человека
Антитела, перекрестно связывающие клетки в крови, могут вызывать истощение клеток, связанных с антителом. Однако, аффинность антител lgG4 к активирующим Fc-рецепторам очень низка по сравнению с аффинностью lgG1, так что антитела lgG4 не приводят к истощению.
Материалы и методы
Тест истощения клеток в цельной крови. Чтобы продемонстрировать отсутствие истощения клеток, экспрессирующих NKG2D, цельную кровь человека инкубировали с 1 мкг IgG4-вариантов антител человека в течение 4 часов и анализировали относительное распределение NKG2D-позитивных и NKG2D-негативных клеток и сравнивали с цельной кровью, которую инкубировали в отсутствие антитела. Для оценки может быть использован способ анализа, описанный в Примере 4.
Пример 9. Определение аффинности
Измерение поверхностного плазменного резонанса выполняли при помощи аппарата Biacore 1000 upgrade (Biacore GE Healthcare; Biacore Upgrade CA0396) при 25°C. Во всех экспериментах на Biacore в качестве проточного буфера служил буфер HBS-EP (Biacore GE Healthcare; BR-1001-88), а анализ сенсограмм выполняли при помощи программного обеспечения Biaevaluation 4.1.
Иммобилизация белков. Рекомбинантные белки MICA-Fc были получены в R&D systems или при помощи рекомбинантных технологий. Рекомбинантные ULBP-1, 2, 3, MICB и NKG2D-Fc приобрели в R&D systems. Рекомбинантные белки NKG2D-FC иммобилизовали при помощи ковалентного связывания с карбоксильными группами декстранового слоя сенсорного чипа СМ5 (Biacore GE Healthcare; BR-1000-14). Поверхность сенсорного чипа активировали при помощи EDC/NHS (N-этил-N'-(3-диметиламинопропил) карбодиимидгидрохлорид и N-гидроксисукцинимид (Biacore GE Healthcare; BR-1000-50)). Белки разводили до концентрации 10 мкг/мл в связывающем буфере (10 мМ ацетат, рН 5,2) и инжектировали до достижения необходимого уровня иммобилизации (т.е. от 500 до 1000 RU). Дезактивацию оставшихся активных групп проводили при помощи 100 мМ этаноламина рН 8 (Biacore GE Healthcare; BR-1000-50).
Определение аффинности. Рекомбинантные антитела человека 16F16, 16F31, MS и 21F2, имеющие изотип lgG4, сравнивали с антителом грызунов ON72. Для экспериментов по кинетике последовательные разведения растворимых антител (от 0,3 до 30 нМ) инжектировали в течение 2 мин при постоянной скорости тока 40 мкл/мин на декстрановый слой, содержащий иммобилизированные белки NKG2D-Fc (от 500 до 1000 RU), и затем проводили диссоциацию в течение 3 мин с последующей регенерацией путем инжектирования в течение 8 секунд буфера с 500 mM NaCl и 10 mM NaOH. Полученные сенсограммы анализировали путем аппроксимации единым образом с применением модели Ленгмюра. Константы диссоциации (KD) рассчитывали по формуле: KD=kd/ka.
Аффинность к NKG2D, расположенному на клеточной мембране. Для анализа аффинности связывания с естественным рецептором выполняли построение подробных кривых доза-ответ связывания антител с клетками, экспрессирующими NKG2D.
Результаты
Результаты определения аффинности для 16F16 показаны в Таблице бАдля двух различных плотностей NKG2D на поверхности чипа Biacore, демонстрирующие высокую аффинность (KD 1,72 Е-10 М) и низкую скорость диссоциации (kd 3,7 Е-5/с). Результаты для ON72 были аналогичными, с ka=9,6E5/(M*c); kd=1,1E-4/c; и KD=1,7E-10 М. Однако, как MS, так и 21F2, имели более высокую аффинность (KD 2,52 Е-12 М и 7,79 Е-11 М, соответственно), a MS характеризовался более низкой скоростью диссоциации (kd 1,45 Е-05/с) (Таблица 6Б).
На Фигуре 3 приведено дозозависимое связывание полученных и очищенных рекомбинантных антител человека 16F16, 16F31, MS и 21F2 с NKG2D на клетках BaF/3, экспрессирующих NKG2D- и DAP10, в сравнении с коммерческими антителами грызунов (ON72 и 149810), по результатам проточной цитометрии. Значения ЕС50 при связывании были следующими:
16F16: 0,051 мкг/мл (0,034 нМ)
16F31: 0,31 мкг/мл (0,21 нМ)
MS: 0,032 мкг/мл (0,021 нМ)
21F2: 0,033 мкг/мл (0,023 нМ)
ON72: 0,062 мкг/мл (0,048 нМ)
149810: 0,063 мкг/мл (0,042 нМ).
Таблица 6А
Исследования связывания 16F16 и NKG2D при помощи Biacore
Плотность NKG2D (RU)
Ka (М(-1) с(-1))
Kd (с(-1))
Rмакс
KD (М)
Хи<sup>2</sup>
Совпадение с моделью
1200
2,08Е+05
3,71Е-05
1,61Е+03
1,78Е-10
0,56
оч. хорошее
600
4,19Е+05
6,91Е-05
657
1,65Е-10
0,43
оч. хорошее
Среднее±SD
(1,72Е-10±9,19Е-12)М
Таблица 6Б
Исследования связывания MS и 21F2 с NKG2D при помощи Biacore
Плотность NKG2D (RU)
Ka (1/Мс)
Kd (1/с)
KD (M)
Rмакс (RU)
Хи<sup>2</sup> (RU<sup>2</sup>)
Совпадение с моделью
MS - 350
5,75+0Е6
1,45Е-05
2,52 Е-12
89,7
2,9
оч. хорошее
21F2 - 400
1,85Е+06
1,44Е-04
7,79 Е-11
112,3
1,42
оч. хорошее
Пример 10. Активность иммобилизованных анти-NKG2D антител как агонистов
Для анализа активности антител как агонистов оценивали пролиферацию лимфоцитов периферической крови (МКПК), стимулированных низкими дозами CD3, в присутствии или отсутствии иммобилизованного анти-NKG2D антитела, используя в качестве контроля CD28. Стимуляцию проводили в условиях, при которых NKG2D, как было показано, выполняет роль молекулы-костимулятора (Mashoo et al, Immunol. 2005; 174:4480-4484), что, как полагают, отражает активацию NKG2D в присутствии провоспалительных цитокинов, как и в условиях хронического воспаления. В данном тесте МКПК стимулировали в течение 3 дней при помощи связывающихся с поверхностью антител с последующей стимуляцией IL-2 в течение 4 дней и оценкой пролиферации по разведению CFSE либо во всех лимфоцитах, либо в CD8+ или CD4+ Т клетках.
Материалы и методы
Тест пролиферации МКПК. МКПК выделяли путем центрифугирования в градиенте плотности. 96-луночные планшеты Maxisorp покрывали анти-Fc антителом (Jackson - Immuno Resarch, 115-006-008), затем отмывали и после этого добавляли анти-CD3 (0,1 или 0,3 нг/мл, Bioscience cat#14-0037-82), анти-NKG2D (MS или ON72, 0,2 мкг/мл) и/или анти-CD28 антитело (0,2 мкг/мл, Becton Dickison cat# 348040). В каждую лунку вносили по 150 тыс МКПК и инкубировали клетки при 37°С в течение 3 дней. Затем клетки окрашивали CFSE (molecular probes, cat# C34554). Инкубировали 10 млн клеток в 0,5 мл 1 мкМ CFSE в течение 10 мин при 37°С, с последующей отмывкой и инкубировали 150 тыс МКПК на лунку 60-луночных планшетов течение 4 дней с IL-2 (10 U/мл). Наконец, клетки клетки окрашивали при помощи анти-CD8 и анти-CD4 антител и оценивали пролиферацию по разведению CFSE либо во всех лимфоцитах (общие результаты представлены на Фигуре 19), либо в CD8+ или CD4+ Т клетках (получены аналогичные результаты).
Результаты
Как показано на Фигуре 19, MS не вызывал значимой ко-стимуляции пролиферации лимфоцитов как при стимуляции CD3 в концентрации 0,1, так и 0,3 нг/мл, тогда как ON72 приводил к небольшой, но статистически достоверной ко-стимуляции при обеих концентрациях CD3. См. Таблицу 7. В обоих случаях контроль, анти-CD28, вызывал значительную ко-стимуляцию, a анти-NKG2D не приводил к дополнительному значимому усилению эффекта. Это показывает, что существует различие в способах связывания двух антител, иммобилизованное антитело ON72 обладает измеримой активностью как агонист, a MS является более строгим антагонистом.
Таблица 7
Результаты теста с пролиферацией МКПК
Станд. ош. средн.
Стимуляция
% пролиферации
CD3 0,1
2,82
0,39
CD3 0,1+MS
3,60
0,65
CD3 0,1+ON72
7,12
1,35
CD3 0,1+CD28
24,53
4,71
CD3 0,1+CD28+MS
21,64
7,59
CD3 0,1+CD28+ON72
22,86
6,09
CD3 0,3
15,80
5,30
CD3 0,3+MS
17,32
4,41
CD3 0,3+ON72
28,38
7,00
CD3 0,3+CD28
39,90
6,91
CD3 0,3+CD28+MS
46,08
5,71
CD3 0,3+CD28+ON72
40,12
7,93
Пример 11. Кристаллическая структура растворимого hNKG2D в комплексе с MS-Fab
Кристаллическая структура растворимого фрагмента hNKG2D в комплексе с Fab фрагментом моноклонального антитела человека MS была решена и уточнена с разрешением 1,7 Å при помощи рентгеноструктурной кристаллографии. Результаты подтвердили, что антитело, будучи связанным с hNKG2D, блокирует связывание молекулы MICA (Фиг.20-22). Было также показано, что каждый димер hNKG2D связывал только один Fab фрагмент MS. Fab часть MS связывалась первоначально с одним из двух мономеров hNKG2D ("1 единица мономера NKG2D"), но, несмотря на то, что он только слабо взаимодействовал с другим мономером ("2 единица мономера NKG2D"), связывание следующего MS Fab со 2 единицей мономера было заблокировано.
Список литературы, относящейся к этому Примеру, приведен в Примере 12.
Материалы и методы
2
2
1
1
Растворимый hNKG2D (остатки 89-216 в SEQ ID NO:2) и MS Fab (содержащий легкую цепь, соответствующую SEQ ID NO:41, и фрагмент тяжелой цепи, соответствующий остаткам 1-213 в SEQ ID NO:40) смешивали с небольшим превышением в мольном отношении hNKG2D, затем комплекс очищали при помощи гель-фильтрации на колонке. После этого комплекс концентрировали приблизительно до 9,5 мг/мл. Кристаллы выращивали при помощи методики висящей капли в 17% PEG3350, 200 мМ малоната натрия и 100 мМ бис-трис-пропанового буфера с рН 7,5. Затем кристаллы переносили в криораствор, содержащий 75% осадителя и 25% глицерола. Кристаллы оставляли в растворе приблизительно на 15 секунд. Затем кристаллы подвергали сверхбыстрой заморозке в жидком N и оставляли при 100 K во время сбора данных в криогенном потоке N. Набор кристаллографических данных вначале собирали с разрешением 2,4 Å на источнике рентгеновского излучения с вращающимся анодом Rigaku 007HF, а затем с разрешением 1,7 Å с нового кристалла на источнике синхротронного излучения BL911-3(2), в лаборатории MAX-lab, Lund, Sweden. Определение пространственных групп, обобщение и пересчет данных выполняли при помощи программного обеспечения XDS(3). Были определены следующие параметры ячейки при съемке на синхротронном излучении: 82,1, 54,2, 169,4 Å, 90°, 102,62° и 90°, соответственно. Решение структуры проводили методом молекулярного замещения, с помощью программного обеспечения MOLREP (4) и PHASER (5;6) пакета программ ССР4 (7), использовали молекулу Fab депонированной в банке PDB (8) структуры с кодом 1L71 (9), и молекулу hNKG2D структуры с кодом 1MPU (10). Молекулу Fab разделяли на два домена, вариабельный и константный домены, а для NKG2D в качестве поисковой модели в основе расчетов по методу молекулярного замещения использовали мономер. Стадии кристаллографического уточнения с помощью программного обеспечения REFMAC5 (11) чередовали с визуальной инспекцией карт электронной плотности и корректировкой модели с использованием графической программы Coot (12). Процедуру повторяли до тех пор, пока вносимые изменения существенно улучшали качество модели. Структуру первоначально решали в пространственной группе С2, с применением данных, полученных на вращающемся аноде. Поскольку в программе XDS(3) пространственные группы по данным синхротронных исследований были охарактеризованы как ацентричные моноклинные, был осуществлен переход в пространственную группу Р2, затем измененную на P2. Базоцентрированная орторомбическая ячейка также находилась вверху списка возможных решений. При анализе данных синхротронных исследований в программе pointless (13) в качестве потенциальной пространственной группы также предлагалось выбрать P2. Программное обеспечение phaser применяли на следующем этапе молекулярного замещения, используя предварительные модели, полученные на первом этапе молекулярного замещения в пространственной группе С2. Поскольку несмотря на успешное применение метода молекулярного замещения, значения R-фактора и свободного R-фактора (R-free) (мера несоответствия наблюдаемых экспериментальных данных с вычисленными на основе модели значениями) после уточнения не снижались, как предполагалось, (R- и R-Free составляли 0,35 и 0,43), хотя качество карт электронной плотности было удовлетворительным, то была проведена дальнейшая по обработка данных и уточнение структур. Были исследованы различные пространственные группы, включая Р1, что, тем не менее, не способствовало дальнейшему улучшению параметров. Тогда исследовали возможность двойникования, и данные ввели в комплекс программ для уточнения кристиллических структур SHELXL (14). При введении поправки на двойникование (h,k,l) ->(h,k,-h-l) значения факторов недостоверности R- и R-free для всех данных снизились с 0,34 и 0,40 до 0,30 и 0,34, соответственно, с уточненным значением коэффициента двойникования BASF, равным 0,25. Внесение изменений в модель вручную выполняли при помощи графической программы соот. Уточнение проводили при помощи компьютерной программы SHELXL. Результирующие значения R- и R-free для всех данных без стереохимических ограничений, после 14 циклов ручной корректировки модели и последующих уточнений, составили 0,277 и 0,320, соответственно, а значения среднеквадратичных отклонений смещения атомов (RMSD) от «идеального» значения длины связи, полученные на основании модели, составили 0,008 Å (Таблица 8). Уточненное значение коэффициента двойникования, рассчитанное при помощи shelxl, составило 0,26.
Результаты
Как показано на Фигурах 20А, 20Б, 21А и 21В, MS-Fab эффективно блокирует связывание MICA с обоими мономерами димера hNKG2D. Однако, хотя молекула MICA связывалась с обоими мономерами димера NKG2D (1), MS Fab связывался преимущественно с одним из двух мономеров, обозначенным здесь как "1 единица мономера NKG2D" (Фиг.21А и 21Б). Взаимодействия между MS и 2 единицей мономера NKG2D оказались менее специфичными (например, содержали меньше водородных связей или не содержали их совсем) и менее важными для поддержания комплекса MS Fab/NKG2D.
2
2
2
Согласно расчетам при помощи программного обеспечения AREAIMOL пакета программ ССР4 (7), средние размеры защищенной от водной среды контактной поверхности составили для двух независимых растворимых молекулярных комплексов hNKG2D/MS-Fab решенных кристаллических структур всего 909 и 876 Å, соответственно. Средние размеры защищенной от водной среды контактной поверхности между 1 единицей мономера NKG2D и MS Fab, согласно расчетам, составили для двух независимых комплексов 710 и 736 А, соответственно. У второго мономера ("2 единица мономера NKG2D") недоступные для растворителя поверхности были значительно меньше, 227 и 158 Å, соответственно.
Непосредственные контакты между hNKG2D и MS Fab идентифицировали при помощи программного обеспечения contacts пакета программ ССР4 (7) с предельным расстоянием между молекулами MS-Fab и hNKG2D, равным 4,0 Å. Результаты для двух независимых растворимых молекулярных комплексов hNKG2D/MS-Fab, упакованных в кристаллическую структуру, приведены в Таблицах 9-12. Обнаружили, что результирующий эпитоп hNKG2D для MS содержит следующие остатки hNKG2D (SEQ ID NO:2): Lys 150, Ser 151, Tyr 152, Thr 180, Ile 181, Ile 182, Glu 183, Met 184, Gln 185, Leu 191, Lys 197, Tyr 199, Glu 201, Thr 205, Pro 206, Asn 207 и Thr 208 (Фиг.21А). Во 2 единице мономера NKG2D было обнаружено только 5 взаимодействий и только один остаток (Tyr 152) был представлен в обоих кристаллографически независимых комплексах. Более того, NC, атом боковой цепи Lys 150 был вовлечен в образование водородных связей в одном из комплексов, а остальные взаимодействия относились к более слабым полярным и гидрофобным.
Эпитоп MS hNKG2D содержал остатки, расположенные в петле непосредственно до и в начале β-слоя β3'(1), Lys 150-Tyr 152; в β5' и в следующей за ним петле, Thr 180-Gln 185; в β5, Leu 191; в β6, Lys 197, Tyr 199 и Glu 201; и в предшествующей петле и в β7 слое, Thr 205-Thr 208. Эти области контактов находились в хорошем соответствии с описанными в литературе сайтами hNKG2D для связывания MICA (1). MICA связывается асимметрично с симметричным гомодимером NKG2D(10). Это также справедливо для связывания MS Fab с hNKG2D. Таким образом, существует две возможные ориентации при связывании NKG2D с MS Fab относительно MICA. Это показано на Фигуре 20А, Б и Фигуре 22, где четко видно, что MS Fab блокирует связывание MICA в обеих относительных ориентациях.
Паратоп MS для hNKG2D включает остатки Tyr 33 и Trp 97 легкой (L) цепи MS (SEQ ID NO:41, Таблицы 9-12) и остатки Gln 1, Asp 26, Asp 27, Ser 30, Ser 31, Tyr 32, Tyr 33, His 50, Ser 52, Tyr 53, Ser 54, Ser 56, Ala 57, Asn 58, Trp 98 и Asp 99 тяжелой (Н) цепи (SEQ ID NO:40, Таблицы 9-12). Эпитоп hNKG2D и остатки, задействованные в образовании водородных связей, также указаны в аминокислотной последовательности hNKG2D на Фигуре 21А.
Пример 12. Кристаллическая структура растворимого hNKG2D в комплексе с hzON72-Fab
Кристаллическая структура растворимого hNKG2D в комплексе с гуманизированной формой Fab фрагмента ON72 (hzON72) была решена и уточнена с разрешением 3,15 Å при помощи рентгеноструктурной кристаллографии. Результаты подтвердили, что антитело при связывании с hNKG2D, будет способно блокировать связывание молекул MICA с hNKG2D (Фигуры 20-22). Было также показано, что каждый димер hNKG2D может одновременно связывать две части hzON72 Fab.
Список литературы, относящийся к этому Примеру, приведен в конце данного
Примера.
Материалы и методы
4
2
2
1
Растворимый фрагмент hNKG2D (соответствующий остаткам 81-216 из SEQ ID NO:2) и hzON72 Fab (SEQ ID NO:70 и SEQ ID NO:71, фрагмент тяжелой цепи и легкая цепь, соответственно) смешивали с небольшим превышением в мольном отношении hNKG2D и очищали комплекс при помощи гель-фильтрации на колонке. Затем комплекс концентрировали приблизительно до 7,5 мг/мл. Кристаллы выращивали при помощи методики висящей капли в 1М LiSO и 100 мМ MES буфере рН 6,5. Кристаллы переносили в криораствор, содержащий 75% осадителя и 25% глицерина. Кристаллы оставляли в растворе приблизительно на 15 секунд. Затем кристаллы подвергали сверхбыстрой заморозке в жидком N и оставляли при 100 K во время сбора данных в криогенном потоке N. Набор кристаллографических данных собирали с разрешением 3,15 Å на источнике синхротронного излучения BL911-5(2), в лаборатории MAX-lab, Lund, Sweden. Определение пространственных групп, обобщение и пересчет данных выполняли при помощи программного обеспечения XDS (3). Были определены следующие параметры ячейки 65,7, 93,3, 128,9 Å, 90°, 93,83° и 90°, соответственно. Установили, что структура относится к пространственной группе P2, в асимметричной ячейке располагается один димер NKG2D и две молекулы hzON72 Fab. Решение структуры проводили методом молекулярного замещения, с применением программного обеспечения MOLREP(4) пакета программ ССР4 (7), молекулы Fab депонированной в банке PDB (8) структуры 1UJ3(15), и димера hNKG2D депонированной структуры 1MPU (10). Молекулу Fab вначале исследовали при вращении с различными углами поворота, из которых выбрали модель, возглавляющую перечень возможных решений. Для NKG2D в качестве поисковой модели при расчетах по методу молекулярного замещения использовали димер. Кристаллографические уточнения, с наложением некристаллографических ограничений для двух мономеров hNKG2D и для двух молекул Fab, выполняли с помощию программного обеспечения REFMAC5 (11) пакета программ ССР4 (7). Стадии кристаллографического уточнения с чередовали с визуальной инспекцией карт электронной плотности и корректировкой модели с использованием графической программы Coot (12). Процедуру повторяли до тех пор, пока вносимые изменения существенно улучшали качество модели. Результирующие значения R- и R-free для всех данных составили 0,216 и 0,268, соответственно, а значения среднеквадратичных отклонений смещения атомов (RMSD) от «идеального» значения длины связи, полученные на основании модели, составили 0,012 Å (Таблица 13).
Результаты
2
2
2
Молекула MICA прочно связывается с обоими мономерами NKG2D(1), но две молекулы hzON72-Fab связывались независимо с каждым из мономеров hNKG2D, эффективно блокируя связывание MICA с димером NKG2D (Фигуры 20В, 21Б, В и 22). Согласно расчетам при помощи программного обеспечения AREAIMOL пакета программ ССР4 (7), средние размеры защищенной от водной среды контактной поверхности составили для двух кристаллографически независимых растворимых молекулярных комплексов hNKG2D/hzON72-Fab (одна молекула hzON72 Fab в комплексе с одним мономером hNKG2D) решенных кристаллических структур в общем 791 и 801 Å, соответственно. Средние размеры защищенной от водной среды контактной поверхности между мономерами растворимого hNKG2D и тяжелыми цепями hzON72-Fab, согласно расчетам, составили для двух кристаллографически независимых комплексов 642 и 631 Å, соответственно, а для легких цепей 208 и 242 Å, соответственно.
Непосредственные контакты между hNKG2D и hzON72-Fab были идентифицированы при помощи программного обеспечения contacts пакета программ ССР4 с предельным расстоянием между молекулами hzON72-Fab и hNKG2D, равным 4,0 Å. Результаты, полученные для двух независимых растворимых молекул hNKG2D/hzON72-Fab, упакованных в кристаллическую структуру, приведены в Таблицах 14-15. Было обнаружено, что результирующий эпитоп hNKG2D для hzON72 содержит следующие остатки hNKG2D (SEQ ID NO:2): Ser 165, Trp 166, Leu 174, Ser 175, Pro 176, Asn 177, Leu 179, Thr 180, Ile 181, Ile 182, Glu 183, Met 184, Lys 186, Ala 193, Ser 194, Ser 195, Lys 197 и Tyr 199. Паратоп hzON72 для hNKG2D включал остатки Tyr 1, Lys 92, Thr 93 и Leu 94 легкой (L) цепи hzON72 (SEQ ID NO:71, Таблица 14-15) и остатки Trp 33, Asp 52, Asp 55, Tyr 57, Asn 59, Tyr 60, Tyr 101, Asp 102, Gly 103, Tyr 104, Tyr 105 и Val 106 тяжелой (Н) цепи hzON72 (SEQ ID NO:70). Эпитоп hNKG2D для hzON72 и остатки, задействованные в образовании водородных связей, также указаны в аминокислотной последовательности hNKG2D на Фигуре 21Б.
Эпитоп hNKG2D состоял из остатков, расположенных в начале β-слоя β4(1), Ser 165-Trp 166; в петле перед β5', Leu 174-Asn 177; в β5' слое и следующей за ним петле, Leu 179-Lys 186; в петле перед β6, Ala 193-Ser 195; и в β6 слое, Lys 197 и Tyr 199. Данные области контактов находились в хорошем соответствии с описанными в литературе сайтами hNKG2D(1) для связывания MICA, и было очевидно, что антитело hzON72 может блокировать связывание MICA. Это показано на Фигурах 20В, 21Б, В и 22.
Таблица 9
Взаимодействия мономера hNKG2D "N" (SEQ ID NO:2) с "Н", тяжелой цепью MS-Fab (SEQ ID NO:40) и "L", легкой цепью MS-Fab (SEQ ID NO:41). Представлены результаты для молекул первого кристаллографически независимого комплекса hNKG2D/MS-Fab в кристалле. Выбрали предельное расстояние 4,0 Д. Контакты идентифицировали при помощи компьютерной программы CONTACT пакета программ ССР4 (7). В последней колонке "***" означает высокую вероятность формирования водородной связи в этой области контакта (расстояние <3,3 Å) согласно расчетам, выполненным в программе CONTACT, "*" означает низкую вероятность (расстояние >3,3 Å). Пробел означает, что согласно программным расчетам, вероятности формирования водородных связей не существует. Водородные связи между донором и акцептором характеризуются специфичностью, и, как правило прочностью, и легко поддаются выявлению.
hNKG2D
MS
Расстояние [Å]
Вероятность формирования водородной связи
Тип остатка
Номер остатка и цепь
Наим. атома
Тип остатка
Номер остатка и цепь
Наим. атома
Lys
150 N
CG
Ser
31 Н
СВ
3,93
Ser
31 Н
OG
2,84
Lys
150 N
CD
Ser
31 Н
OG
3,11
Lys
150 N
СЕ
Ser
31 Н
OG
3,78
Ser
151 N
CA
Ser
30 Н
O
3,73
Ser
31 Н
O
3,84
hNKG2D
MS
Расстояние [Å]
Вероятность формирования водородной связи
Тип остатка
Номер остатка и цепь
Наим. атома
Тип остатка
Номер остатка и цепь
Наим. атома
Ser
31 Н
СА
3,79
Ser
151 N
СВ
Ser
30 Н
O
3,26
Ser
151 N
OG
Ser
30 Н
O
2,30
***
Ser
31 Н
СА
3, 99
Ser
30 Н
С
3,26
Tyr
152 N
CG
Tyr
33 Н
CE2
3,91
Tyr
152 N
CD1
Tyr
33 Н
CE2
3,94
Tyr
152 N
CE1
Tyr
33 Н
CE2
3,77
Tyr
53 Н
CE2
3,59
Tyr
53 Н
CD2
3,42
Tyr
152 N
CZ
Tyr
33 Н
CE2
3,58
Ser
30 Н
O
3,88
Tyr
53 Н
CD2
3,66
Tyr
32 Н
С
3,84
Tyr
32 Н
O
3,52
Tyr
33 Н
CD2
3,67
Tyr
152 N
OH
Tyr
53 Н
CD2
3,28
Ser
52 Н
СА
3,78
Ser
52 Н
С
3,86
Tyr
53 Н
N
3,06
***
Tyr
32 Н
С
3,38
Tyr
32 Н
O
2,68
* * *
Tyr
33 Н
N
3,99
*
Tyr
33 Н
CD2
3,99
Tyr
53 Н
СВ
3,84
Tyr
152 N
CE2
Tyr
33 Н
CE2
3,56
Ser
30 Н
O
3,93
Tyr
32 Н
N
3,80
Tyr
32 Н
СА
3,61
Tyr
32 Н
С
3,37
Tyr
32 Н
O
3,49
Tyr
33 Н
N
3,81
Tyr
33 Н
CD2
3,40
Tyr
152 N
CD2
Tyr
33 Н
CE2
3,73
Tyr
33 Н
CD2
3,87
Thr
180 N
CG2
Tyr
33 L
ОН
3,43
Tyr
33 L
CE1
3,96
Thr
180 N
С
Tyr
33 L
ОН
3,94
Ile
181 N
N
Tyr
33 L
ОН
3,46
*
Ile
181 N
С
Tyr
33 L
ОН
3,53
Ile
181 N
O
Tyr
33 L
ОН
2,65
***
Tyr
33 L
CZ
3,42
Tyr
33 L
CE2
3,33
Ile
182 N
CD1
Tyr
33 L
ОН
3,53
Tyr
33 L
CZ
3,51
Tyr
33 L
CE2
3,65
Glu
183 N
O
Trp
97 L
СН2
3,67
Trp
97 L
CZ2
3,09
Met
184 N
СЕ
Trp
98 Н
CD1
3,75
Tyr
33 Н
СВ
3,85
Tyr
33 Н
CG
3,71
Tyr
33 Н
CD2
3,75
Met
184 N
С
Asn
58 Н
ND2
3,92
hNKG2D
MS
Расстояние [Å]
Вероятность формирования водородной связи
Тип остатка
Номер остатка и цепь
Наим. атома
Тип остатка
Номер остатка и цепь
Наим. атома
Met
184 N
0
Asn
58 Н
CB
3,95
Asn
58 Н
CG
3,86
Asn
58 Н
ND2
2,94
***
Trp
97 L
СН2
3,62
His
50 Н
СЕ1
3,55
His
50 Н
NE2
3,45
*
Gln
185 N
CG
Asn
58 Н
ND2
4,00
Gln
185 N
CD
Ser
56 Н
OG
3,04
Ser
56 Н
O
3,92
Ala
57 Н
O
3,52
Gln
185 N
OE1
Ser
56 Н
CB
3,77
Ser
56 Н
OG
2,41
***
Ala
57 Н
O
3,95
*
Gln
185 N
NE2
Asn
58 Н
CB
3,55
Ser
56 Н
OG
2,99
***
Ser
56 Н
С
3,70
Ser
56 Н
O
2,97
***
Ala
57 Н
O
2,64
***
Asn
58 Н
СА
3,96
Ala
57 Н
С
3,27
Asn
58 Н
N
3,78
*
Leu
191 N
GD1
Tyr
33 Н
ОН
3,05
Lys
197 N
NZ
Asp
99 Н
O
3,13
***
Tyr
199 N
ОН
Trp
98 Н
CD1
3,92
Tyr
199 N
CD2
Tyr
33 Н
СЕ2
3,67
Glu
201 N
CG
Tyr
33 Н
CZ
3,92
Tyr
33 Н
ОН
2,80
Glu
201 N
CD
Tyr
33 Н
ОН
3,29
Ser
56 Н
OG
3,60
Glu
201 N
OE1
Tyr
33 Н
CZ
3,58
Tyr
33 Н
ОН
3,01
***
Ser
56 Н
CB
3,59
Ser
56 Н
OG
3,14
* * *
Ser
56 Н
0
3,94
*
Tyr
33 Н
СЕ1
3,24
Glu
201 N
OE2
Ser
56 Н
CB
3,78
Ser
56 Н
OG
3,26
***
Thr
205 N
OG1
Ser
56 Н
CB
3,63
Ser
56 Н
OG
3,95
*
Thr
205 N
CG2
Ser
56 Н
CB
3,99
Ser
54 Н
OG
3,18
Pro
206 N
O
Ser
54 Н
CB
3,03
Ser
54 Н
OG
2,87
***
Asn
207 N
OD1
Ser
54 Н
OG
3,67
*
Thr
208 N
N
Tyr
53 Н
OH
3,43
*
Thr
208 N
CB
Tyr
53 Н
OH
3,96
Thr
208 N
OG1
Tyr
53 Н
OH
3,57
*
Thr
208 N
CG2
Tyr
53 Н
OH
3,37
Таблица 10
Взаимодействия мономера hNKG2D "С" (SEQ ID NO:2) с "В", тяжелой цепью MS-Fab (SEQ ID NO:40) и "А", легкой цепью MS-Fab (SEQ ID NO:41). Представлены результаты для молекул второго кристаллографически независимого комплекса hNKG2D/MS-Fab в кристалле. Выбрали предельное расстояние 4,0 А. Контакты идентифицировали при помощи компьютерной программы CONTACT пакета программ ССР4 (7). В последней колонке "***" означает высокую вероятность формирования водородной связи в этой области контакта (расстояние <3,3 Å) согласно расчетам, выполненным в программе CONTACT, "*" означает низкую вероятность (расстояние >3,3 Å). Пробел означает, что согласно программным расчетам, вероятности формирования водородных связей не существует.
hNKG2D
MS
Расстояние [Å]
Вероятность формирования водородной связи
Тип остатка
Номер остатка и цепь
Наим. атома
Тип остатка
Номер остатка и цепь
Наим. атома
Lys
150 С
CG
Ser
31 В
OG
3,54
Lys
150 С
CD
Asp
27 В
OD1
3,96
Ser
31 В
OG
3,56
Lys
150 С
СЕ
Asp
27 В
CG
3,67
Asp
27 В
OD1
2,83
Asp
27 В
OD2
3,81
Ser
31 В
OG
3,30
Lys
150 С
NZ
Asp
27 В
CG
3,30
Asp
27 В
OD1
2,76
***
Asp
27 В
OD2
3,46
*
Ser
151 С
СА
Ser
30 В
O
3,46
Ser
31 В
O
3,80
Ser
151 С
СВ
Ser
30 В
С
3,99
Ser
30 В
O
3,00
Ser
151 С
OG
Ser
30 В
СВ
3,93
Ser
30 В
С
3,58
Ser
30 В
O
2,47
***
Tyr
152 С
CD1
Tyr
33 В
СЕ2
3,93
Tyr
152 С
СЕ1
Tyr
53 В
СЕ2
3,54
Tyr
53 В
CD2
3,44
Tyr
33 В
СЕ2
3,72
Tyr
152 С
CZ
Tyr
32 В
O
3,62
Tyr
53 В
CD2
3,59
Tyr
33 В
СЕ2
3,61
Tyr
33 В
CD2
3,68
Tyr
152 С
ОН
Tyr
53 В
СВ
3,88
Ser
52 В
СА
3,64
Ser
52 В
СВ
3,73
Ser
52 В
С
3,75
Tyr
53 В
N
2,98
***
Tyr
32 В
С
3,65
Tyr
32 В
O
2,92
***
Tyr
53 В
CD2
3,25
Tyr
33 В
CD2
3,98
Tyr
152 С
СЕ2
Tyr
32 В
N
3,82
Tyr
32 В
СА
3,74
Tyr
32 В
С
3,42
hNKG2D
MS
Расстояние [Å]
Вероятность формирования водородной связи
Тип остатка
Номер остатка и цепь
Наим. атома
Тип остатка
Номер остатка и цепь
Наим. атома
Tyr
32 В
O
3,43
Tyr
33 В
N
3, 90
Tyr
33 В
СЕ2
3,72
Tyr
33 В
CD2
3,52
Ser
30 В
O
3,76
Tyr
152 С
CD2
Tyr
33 В
СЕ2
3,93
Tyr
33 В
CD2
3, 99
Thr
180 С
CG2
Tyr
33 А
ОН
3,46
Thr
180 С
С
Tyr
33 А
ОН
3,86
Ile
181 С
N
Tyr
33 А
ОН
3,37
*
Ile
181 С
СА
Tyr
33 А
ОН
3,92
Ile
181 С
С
Tyr
33 А
ОН
3,38
Ile
181 С
O
Tyr
33 А
СЕ2
3,11
Tyr
33 А
CZ
3,20
Tyr
33 А
ОН
2,53
***
Ile
182 С
CG1
Trp
98 В
CZ2
3,52
Trp
98 В
СН2
3,37
Ile
182 С
CD1
Tyr
33 А
СЕ2
3,55
Trp
98 В
CZ2
3,93
Tyr
33 А
CZ
3,48
Tyr
33 А
ОН
3,59
Ile
182 С
CG2
Trp
98 В
CZ2
3,97
Glu
183 С
O
Trp
97 А
СН2
3,27
Trp
97 А
CZ2
3,49
Met
184 С
СА
His
50 В
NE2
3,99
Met
184 С
СВ
Tyr
33 В
СЕ1
3,74
Tyr
33 В
ОН
3,98
Tyr
33 В
CZ
3,96
Met
184 С
CG
Tyr
33 В
CD1
3,90
Tyr
33 В
СЕ1
3,52
Tyr
33 В
ОН
3,95
Tyr
33 B
СЕ2
3,98
Tyr
33 В
CZ
3,57
Met
184 С
СЕ
Tyr
33 В
CB
3,60
Tyr
33 В
CG
3,39
Tyr
33 В
CD1
3,68
Tyr
33 В
CD2
3,74
Met
184 С
С
His
50 В
NE2
3,85
Met
184 С
O
Asn
58 В
ND2
3,02
***
His
50 В
СЕ1
3,14
His
50 В
NE2
2,99
***
Gln
185 С
CD
Ala
57 В
O
3,73
Asn
58 В
CB
3,48
Asn
58 В
CG
3,89
Asn
58 В
ND2
3,73
Gln
185 С
ОЕ1
Asn
58 В
СА
3,96
Asn
58 В
СВ
3,03
Asn
58 В
CG
3,53
Asn
58 В
ND2
3,23
***
His
50 В
ND1
3,91
*
His
50 В
СЕ1
2,97
His
50 В
NE2
3,62
*
Gln
185 С
NE2
Ala
57 В
С
3,00
hNKG2D
MS
Расстояние [Å]
Вероятность формирования водородной связи
Тип остатка
Номер остатка и цепь
Наим. атома
Тип остатка
Номер остатка и цепь
Наим. атома
Asn
58 В
N
3,41
*
Asn
58 В
СА
3,59
Ser
56 В
OG
3, 64
*
Ala
57 В
O
2,50
***
Asn
58 В
СВ
3,55
Leu
191 С
CD1
Tyr
33 В
ОН
3,20
Lys
197 С
CD
Trp
98 В
CZ3
3,77
Trp
98 В
СН2
3,71
Lys
197 С
СЕ
Trp
98 В
CZ3
3,54
Asp
99 В
O
3,86
Lys
197 С
NZ
Trp
98 В
CZ3
3,50
Asp
99 В
O
2,73
***
Asp
99 В
OD1
3,56
•k
Asp
99 В
С
3,74
Tyr
199 С
СЕ1
Trp
98 В
СЕ3
3,87
Trp
98 В
CZ3
3,29
Trp
98 В
СН2
3,84
Tyr
199 С
CZ
Trp
98 В
СЕ3
3,64
Trp
98 В
CZ3
3,39
Tyr
199 С
ОН
Trp
98 В
СЕ3
3,01
Trp
98 В
CZ3
2,80
Tyr
199 С
CD2
Tyr
33 В
СЕ2
3,57
Tyr
33 В
CD2
3,98
Glu
201 С
CG
Tyr
33 В
ОН
2,80
Glu
201 С
CD
Ser
56 В
СВ
3,72
Ser
56 В
OG
3,32
Tyr
33 В
ОН
3,32
Glu
201 С
ОЕ1
Ser
56 В
СВ
3,29
Ser
56 В
OG
3,04
***
Tyr
33 В
СЕ1
3,58
Tyr
33 В
ОН
3,08
***
Tyr
33 В
CZ
3,80
Glu
201 С
ОЕ2
Ser
56 В
СВ
3,49
Ser
56 В
OG
2,87
***
Thr
205 С
OG1
Ser
56 В
СВ
3,83
Ser
56 В
OG
3,49
*
Thr
205 С
CG2
Ser
56 В
N
3,85
Ser
56 В
СА
3,99
Ser
56 В
СВ
3,30
Ser
56 В
OG
3,84
Ser
54 В
OG
3,93
Pro
206 С
CG
Ser
54 В
O
3,97
Pro
206 С
С
Ser
54 В
OG
3,94
Pro
206 С
0
Ser
54 В
СВ
2,96
Ser
54 В
OG
2,71
***
Asn
207 С
OD1
Ser
54 В
OG
3,78
*
Thr
208 С
N
Tyr
53 В
ОН
3,59
*
Thr
208 С
OG1
Tyr
53 В
ОН
3,92
*
Thr
208 С
CG2
Tyr
53 В
ОН
3,59
Таблица 11
Взаимодействия мономера hNKG2D "M" (SEQ ID NO:2) с "Н", тяжелой цепью MS-Fab (SEQ ID NO:40) и "L", легкой цепью MS-Fab (SEQ ID NO:41). Представлены результаты для молекул первого кристаллографически независимого комплекса hNKG2D/MS-Fab в кристалле. Выбрали предельное расстояние 4,0 Å. Контакты идентифицировали при помощи компьютерной программы CONTACT пакета программ ССР4 (7). В последней колонке "***" означает высокую вероятность формирования водородной связи в этой области контакта (расстояние <3,3 Å) согласно расчетам, выполненным в программе CONTACT, "*" означает низкую вероятность (расстояние >3,3 Å). Пробел означает, что согласно программным расчетам, вероятности формирования водородных связей не существует.
hNKG2D
MS
Расстояние [Å]
Вероятность формирования водородной связи
Тип остатка
Номер остатка и цепь
Наим. атома
Тип остатка
Номер остатка и цепь
Наим. атома
Tyr
152 М
ОН
Asp
26 Н
O
3,66
*
Met
184 М
CG
Gln
1 Н
ОЕ1
3,58
Gln
185 М
NE2
Gln
1 Н
ОЕ1
3,92
*
Tyr
199 М
ОН
Asp
26 Н
OD2
3,87
*
Таблица 12
Взаимодействия мономера hNKG2D "D" (SEQ ID NO:2) с "В", тяжелой цепью MS-Fab (SEQ ID NO:40) и "А", легкой цепью MS-Fab (SEQ ID NO:41). Представлены результаты для молекул второго кристаллографически независимого комплекса hNKG2D/MS-Fab в кристалле. Выбрали предельное расстояние 4,0 Å. Контакты идентифицировали при помощи компьютерной программы CONTACT пакета программ ССР4 (7). В последней колонке "***" означает высокую вероятность формирования водородной связи в этой области контакта (расстояние <3,3 Å) согласно расчетам, выполненным в программе CONTACT, "*" означает низкую вероятность (расстояние >3,3 Å). Пробел означает, что согласно программным расчетам, вероятности формирования водородных связей не существует.
hNKG2D
MS
Расстояние [Å]
Вероятность формирования водородной связи
Тип остатка
Номер остатка и цепь
Наим. атома
Тип остатка
Номер остатка и цепь
Наим. атома
Lys
150 D
СЕ
Tyr
32 В
СЕ1
3,99
Tyr
32 В
CZ
3,78
Tyr
32 В
ОН
2,80
Lys
150 D
NZ
Tyr
32 В
СЕ1
3,00
Tyr
32 В
CZ
3,05
Tyr
32 В
ОН
2,60
***
Tyr
152 D
ОН
Asp
26 В
O
3,99
*
Gln
1 В
СА
3,72
Таблица 14.
Взаимодействия мономера hNKG2D "N" (SEQ ID NO:2) с "Н", тяжелой цепью h20N72-Fab (SEQ ID NO:70) и "L", легкой цепью hzON72-Fab (SEQ ID NO:71). Представлены результаты для молекул первого кристаллографически независимого
комплекса hNKG2D/hzON72-Fab в кристалле. Выбрали предельное расстояние 4,0 Å. Контакты идентифицировали при помощи компьютерной программы CONTACT пакета программ ССР4 (7). В последней колонке "***" означает высокую вероятность формирования водородной связи в этой области контакта (расстояние <3,3 Å) согласно расчетам, выполненным в программе CONTACT, "*" означает низкую вероятность (расстояние >3,3 Å). Пробел означает, что согласно программным расчетам, вероятности формирования водородных связей не существует.
hNKG2D
hzON72
Расстояние [Å]
Вероятность формирования водородной связи
Тип остатка
Номер остатка и цепь
Наим. атома
Тип остатка
Номер остатка и цепь
Наим. атома
Ser
165 N
СВ
Tyr
104 Н
СЕ2
3,66
Ser
165 N
OG
Tyr
104 Н
СЕ2
3,53
Tyr
104 Н
CD2
3,95
Trp
166 N
NE1
Tyr
105 Н
ОН
3,38
*
Leu
174 N
CG
Tyr
104 Н
СЕ1
3,94
Leu
174 N
CD2
Tyr
104 Н
CD1
3,78
Tyr
104 Н
СЕ1
3,91
Leu
174 N
С
Tyr
104 Н
ОН
3,97
Leu
174 N
O
Tyr
104 Н
СЕ1
3,61
Tyr
104 Н
CZ
3,61
Tyr
104 Н
OH
2,90
***
Ser
175 N
С
Tyr
104 Н
СЕ1
3,81
Ser
175 N
O
Tyr
104 Н
СЕ1
3,79
Pro
176 N
N
Tyr
104 Н
СЕ1
3,84
Pro
176 N
СА
Gly
103 Н
O
3,99
Gly
103 Н
СА
3,78
Pro
176 N
СВ
Gly
103 Н
СА
3,81
Asn
177 N
N
Gly
103 Н
O
3,29
***
Tyr
101 Н
ОН
3,79
*
Asn
177 N
СА
Tyr
101 Н
он
3,63
Asn
177 N
OD1
Tyr
101 Н
СЕ2
3,52
Leu
179 N
С
Tyr
101 Н
ОН
3,54
Leu
179 N
O
Gly
103 Н
O
3,77
*
Tyr
101 Н
СЕ1
3,60
Tyr
101 Н
CZ
3,35
Tyr
101 Н
ОН
2,33
***
Thr
180 N
СА
Tyr
104 Н
O
3,40
Thr
180 N
CG2
Trp
33 Н
CZ2
3,76
Val
106 Н
CG2
3,60
Trp
33 Н
NEl
3,77
Tyr
101 Н
СЕ1
3,73
Thr
180 N
С
Tyr
104 Н
0
3,55
Ile
181 N
N
Tyr
104 Н
0
2,78
***
Ile
181 N
СА
Tyr
104 Н
0
3,78
Ile
181 N
СВ
Tyr
104 Н
0
3,76
Ile
181 N
CG2
Tyr
105 Н
СЕ1
3,90
Tyr
105 Н
CZ
3, 63
hNKG2D
hzON72
Расстояние [Å]
Вероятность формирования водородной связи
Тип остатка
Номер остатка и цепь
Наим. атома
Тип остатка
Номер остатка и цепь
Наим. атома
Tyr
105 Н
ОН
3,76
Ile
182 N
CD1
Asn
59 Н
OD1
3,49
Ile
182 N
CG2
Asn
59 Н
CG
3,80
Asn
59 Н
OD1
3,51
Asn
59 Н
ND2
3,66
Glu
183 N
N
Leu
94 L
CD1
3,64
Glu
183 N
CB
Lys
92 L
O
3,81
Glu
183 N
CG
Tyr
105 Н
ОН
3,91
Glu
183 N
CD
Tyr
105 Н
СЕ1
3,87
Tyr
105 Н
CZ
3,90
Tyr
105 Н
ОН
3,06
Glu
183 N
OE1
Lys
92 L
CG
3,77
Lys
92 L
CD
3,95
Lys
92 L
СЕ
3,20
Thr
93 L
CG2
3,94
Tyr
105 Н
ОН
3,64
*
Glu
183 N
OE2
Tyr
105 Н
СЕ1
3,95
Tyr
105 Н
CZ
3,54
Tyr
105 Н
ОН
2,39
***
Glu
183 N
С
Leu
94 L
CD1
3,86
Glu
183 N
O
Leu
94 L
N
3,16
***
Thr
93 L
С
3,86
Leu
94 L
CD1
3,45
Thr
93 L
CA
3,51
Thr
93 L
CB
3,61
Met
184 N
CG
Leu
94 L
CB
3,95
Met
184 N
СЕ
Tyr
60 Н
O
3,39
Asn
59 Н
CB
3,92
Met
184 N
O
Tyr
1 L
CD2
3,98
Leu
94 L
O
3,84
*
Lys
186 N
N
Tyr
1 L
ОН
3,90
*
Lys
186 N
CB
Tyr
1 L
он
3,78
Ala
193 N
CB
Tyr
57 Н
СЕ1
3,84
Ser
194 N
O
Asp
55 Н
CG
3,84
Asp
55 Н
OD1
3,41
*
Asp
55 Н
OD2
3,47
*
Ser
195 N
CA
Asp
55 Н
OD1
3,82
Ser
195 N
CB
Asp
55 Н
CG
3,46
Asp
55 Н
OD1
2,61
Asp
55 Н
OD2
3,81
Ser
195 N
OG
Asp
55 Н
CG
3,74
Asp
55 Н
OD1
3,07
***
Ser
195 N
O
Asp
55 Н
CG
3,71
Asp
55 Н
OD1
3,81
*
Asp
55 Н
OD2
3,23
***
Lys
197 N
CG
Tyr
57 Н
CD1
3,79
Tyr
57 Н
СЕ1
3,95
hNKG2D
hzON72
Расстояние [Å]
Вероятность формирования водородной связи
Тип остатка
Номер остатка и цепь
Наим. атома
Тип остатка
Номер остатка и цепь
Наим. атома
Tyr
57 Н
CD2
3,99
Tyr
57 Н
CG
3,82
Lys
197 N
CD
Tyr
57 Н
CD1
3,84
Tyr
57 Н
CG
3,74
Asp
55 Н
OD2
3,17
Tyr
57 Н
СВ
3,89
Lys
197 N
СЕ
Trp
33 Н
СН2
3,75
Trp
33 Н
CZ2
3,39
Asp
52 Н
OD2
3,64
Asp
55 Н
OD2
3,27
Tyr
57 Н
СВ
3,98
Lys
197 N
NZ
Asp
55 Н
CG
3,27
Trp
33 Н
CZ2
3,68
Asp
52 Н
СВ
3,78
Asp
52 Н
CG
3,38
Asp
52 Н
OD2
2,53
***
Asp
55 Н
СВ
3,57
Asp
55 Н
OD2
2,36
***
Tyr
57 Н
СВ
3,77
Tyr
199 N
CD1
Tyr
57 Н
ОН
3,64
Таблица 15
Взаимодействия мономера hNKG2D "С" (SEQ ID NO:2) с "В", тяжелой цепью hzON72-Fab (SEQ ID NO:70) и "А", легкой цепью hzON72-Fab (SEQ ID NO:71). Представлены результаты для молекул второго кристаллографически независимого комплекса hNKG2D/hzON72-Fab в кристалле. Выбрали предельное расстояние 4,0 Å. Контакты идентифицировали при помощи компьютерной программы CONTACT пакета программ ССР4 (7). В последней колонке "***" означает высокую вероятность формирования водородной связи в этой области контакта (расстояние <3,3 Å) согласно расчетам, выполненным в программе CONTACT, "*" означает низкую вероятность (расстояние >3,3 Å). Пробел означает, что согласно программным расчетам, вероятности формирования водородных связей не существует.
hNKG2D
hzON72
Расстояние [Å]
Вероятность формирования водородной связи
Тип остатка
Номер остатка и цепь
Наим. атома
Тип остатка
Номер остатка и цепь
Наим. атома
Trp
166 С
NE1
Tyr
105 В
ОН
3,26
***
Leu
174 С
С
Tyr
104 В
ОН
3,78
Leu
174 С
O
Tyr
104 В
СЕ1
3,62
Tyr
104 В
CZ
3,37
Tyr
104 В
ОН
2,66
***
Ser
175 С
С
Tyr
104 В
СЕ1
3,27
hNKG2D
hzON72
Расстояние [Å]
Вероятность формирования водородной связи
Тип остатка
Номер остатка и цепь
Наим. атома
Тип остатка
Номер остатка и цепь
Наим. атома
Ser
175 С
O
Tyr
104 В
CD1
3,74
Tyr
104 В
СЕ1
3,37
Pro
176 С
N
Tyr
104 В
CD1
3,99
Tyr
104 В
СЕ1
3,13
Tyr
104 В
CZ
3,98
Tyr
104 В
ОН
3,92
*
Pro
176 С
СА
Gly
103 В
СА
3,84
Tyr
104 В
CD1
3,70
Tyr
104 В
СЕ1
3,24
Pro
176 С
СВ
Gly
103 В
СА
3,76
Tyr
104 В
СЕ1
3,94
Pro
176 С
CG
Tyr
104 В
СЕ1
3,75
Tyr
104 В
ОН
3,71
Pro
176 С
CD
Tyr
104 В
СЕ1
3,77
Tyr
104 В
ОН
3,68
Asn
177 С
N
Gly
103 В
СА
3,94
Gly
103 В
С
3,79
Tyr
101 В
ОН
3,92
*
Gly
103 В
O
3,02
***
Asn
177 С
СА
Tyr
101 В
OH
3,49
Gly
103 В
O
3,66
Asn
177 С
OD1
Asp
102 В
O
3,70
*
Tyr
101 В
СЕ2
3,41
Leu
179 С
С
Tyr
101 В
ОН
3,99
Leu
179 С
O
Tyr
101 В
CZ
3,78
Tyr
101 В
СЕ1
3,82
Tyr
104 В
O
3,71
*
Tyr
101 В
ОН
2,82
***
Gly
103 В
O
3,90
*
Thr
180 С
СА
Tyr
104 В
O
3,36
Thr
180 С
CG2
Trp
33 В
CZ2
3,99
Val
106 В
CG2
3,72
Tyr
101 В
СЕ1
3,84
Thr
180 С
С
Tyr
104 В
O
3,76
Ile
181 С
N
Tyr
104 В
O
3,15
***
Ile
181 С
СВ
Tyr
105 В
СЕ2
3,99
Tyr
105 В
CZ
3,91
Ile
181 С
CG2
Tyr
105 В
СЕ1
3,72
Tyr
105 В
CZ
3,49
Tyr
105 В
ОН
3,43
Ile
182 С
CD1
Asn
59 В
OD1
3,39
Ile
182 С
CG2
Leu
94 А
CD2
3,97
Asn
59 В
CG
3,80
Asn
59 В
OD1
3,57
Asn
59 В
ND2
3,62
Leu
94 А
CD1
3,96
Glu
183 С
N
Leu
94 А
CD1
3,44
hNKG2D
hzON72
Расстояние [Å]
Вероятность формирования водородной связи
Тип остатка
Номер остатка и цепь
Наим. атома
Тип остатка
Номер остатка и цепь
Наим. атома
Glu
183 С
CD
Tyr
105 В
ОН
3,53
Glu
183 С
ОЕ1
Lys
92 А
СЕ
3,17
Thr
93 А
CG2
3,35
Glu
183 С
ОЕ2
Tyr
105 В
CZ
3,86
Tyr
105 В
ОН
2,71
***
Glu
183 С
O
Thr
93 А
С
3,88
Leu
94 А
N
3,06
***
Leu
94 А
СА
3,93
Leu
94 А
O
3,37
*
Thr
93 А
СА
3,68
Thr
93 А
СВ
3,54
Leu
94 А
CD1
3,94
Met
184 С
СА
Leu
94 А
O
3,78
Met
184 С
СЕ
Tyr
60 В
O
3,16
Met
184 С
O
Leu
94 А
O
3,72
*
Tyr
1 А
CG
3,98
Tyr
1 А
CD2
3,93
Lys
186 С
N
Tyr
1 А
ОН
3,81
*
Lys
186 С
СА
Tyr
1 А
ОН
3,65
Lys
186 С
СВ
Tyr
1 А
ОН
3,51
Ala
193 С
СВ
Tyr
57 В
СЕ1
3,90
Ser
194 С
O
Asp
55 В
OD1
3,94
*
Asp
55 В
OD2
3,84
*
Ser
195 С
СВ
Asp
55 В
CG
3,63
Asp
55 В
OD1
2,94
Asp
55 В
OD2
3,78
Ser
195 С
OG
Asp
55 В
CG
3,81
Asp
55 В
OD1
3,25
***
Ser
195 С
O
Asp
55 В
OD2
3,52
*
Lys
197 С
CG
Tyr
57 В
CZ
3,90
Tyr
57 В
CG
3,96
Tyr
57 В
CD1
3,80
Tyr
57 В
СЕ1
3,77
Lys
197 С
CD
Asp
55 В
OD2
3,58
Tyr
57 В
CG
3,73
Tyr
57 В
CD1
3,67
Lys
197 С
СЕ
Trp
33 В
CZ2
3,56
Asp
52 В
OD2
3,96
Asp
55 В
OD2
3,49
Trp
33 В
СН2
3,83
Lys
197 С
NZ
Trp
33 В
CZ2
3,77
Asp
52 В
CG
3,77
Asp
52 В
OD2
2,83
***
Asp
55 В
СВ
3,88
Asp
55 В
CG
3,44
Asp
55 В
OD2
2,41
***
Tyr
57 В
СВ
3,78
Ссылки
1. Li, P., Morris, D. L, Willcox, B. E., Steinle, A, Spies, T., and Strong, R. K. (2001) Nature Immunology 2, 443-451
2. Ursby, Т., Mammen, С. В., Cerenius, Y., Svensson, С., Sommarin, В., Fodje, M. N., Kvick, Å., Logan, D. Т., Als-Nielsen, J., Thunnissen, M. M. G. M., Larsen, S., and Liljas, A. (2004) The New Macromolecular Crystallography Stations At MAX-lab: The MAD Station.
3. Kabsch, W. (1993) J. Appl. Crystallogr. 26, 795-800
4. Vagin, A. and Teplyakov, A. (1997) J. Appl. Crystallogr. 30, 1022-1025
5. Mccoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Storoni, L. C., and Read, R. J. (2005) Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography 61, 458-464
6. Mccoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., and Read, R. J. (2007) J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674
7. Bailey, S. (1994) Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 50, 760-763
8. Berman, H. M., Westbrook, J., Feng, Z., Gilliland, G., Bhat, T. N., Weissig, H., Shindyalov, I. N., and Bourne, P. E. (2000) Nucleic Acids Res. 28, 235-242
9. Vajdos, F. F., Adams, C. W., Breece, T. N., Presta, L. G., de Vos, A. M., and Sidhu, S. S. (2002) Journal of Molecular Biology 320, 415-428
10. McFarland, B. J., Kortemme, Т., Yu, S. F., Baker, D., and Strong, R. K. (2003) Structure (Cambridge) 11, 411-422
11. Murshudov, G. N., Vagin, A. A., and Dodson, E. J. (1997) Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 53, 240-255
12. Emsley, P. and Cowtan, K. (2004) Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 60, 2126-2132
13. Evans, P. (1962) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2006. Jan. 72-82
14. Sheldrick, G. (2008) Act Cryst a 64, 112-122
15. Ohto, U., Mizutani, R., Nakamura, M., Adachi, H., and Satow, Y. (2004) J Synchrotron Radiat 11, 105-108
ПРИМЕРЫ ВОПЛОЩЕНИЙ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Ниже следуют примеры воплощений изобретения.
1. Выделенное человеческое или гуманизированное моноклональное антитело или его антиген-связывающий фрагмент, которое связывается с NKG2D человека (hNKG2D).
2. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по предыдущему воплощению, снижающий hNKG2D-опосредованную активацию NK или Т клеток, экспрессирующих hNKG2D.
3. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по любому из предыдущих воплощений, которые конкурируют по меньшей мере с одним лигандом hNKG2D за связывание с hNKG2D.
4. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по предыдущему воплощению, отличающиеся тем, что лигандом является MICA.
5. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по любому из предыдущих воплощений, снижающие уровень NKG2D на поверхности NK или Т клеток, экспрессирующих NKG2D.
6. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по любому из предыдущих воплощений, которые при иммобилизации не вызывают значимой ко-стимуляции CD3-индуцированной пролиферации мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК).
7. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по любому из предыдущих воплощений, которые при иммобилизации не проявляют значимого агонистического эффекта на hNKG2D-опосредованную активацию NK или Т клеток, экспрессирующих hNKG2D.
8. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по любому из предыдущих воплощений, которые связываются с NKG2D яванского макака и макаки резус.
9. Антитело по любому из предыдущих воплощений, которое связывается с hNKG2D с KD, равной 1 нМ или менее.
10. Антитело по любому из предыдущих воплощений, которое связывается с hNKG2D с KD, равной 0,1 нМ или менее.
11. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по любому из предыдущих воплощений, которое при добавлении к NK или Т клеткам, экспрессирующим NKG2D, перекрестно сшивает не более двух димеров hNKG2D.
12. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по любому из предыдущих воплощений, которые прочно связываются только с первым мономером hNKG2D в составе димера hNKG2D.
13. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по любому из предыдущих воплощений, которые при связывании с первым мономером hNKG2D блокируют связывание антитела или антиген-связывающего фрагмента со вторым мономером hNKG2D.
14. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по любому из предыдущих воплощений, для которых соотношение поверхностей, недоступных растворителю, у молекул первого и второго мономеров hNKG2D в составе димера hNKG2D составляет приблизительно 2:1 или более.
15. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по любому из предыдущих воплощений, для которых данное соотношение составляет 3:1 или более.
16. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по любому из предыдущих воплощений, которые конкурируют с референсным антителом за связывание с NKG2D, где референсное антитело выбрано из группы, состоящей из:
(а) антитела, содержащего вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:11 и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:12;
(б) антитела, содержащего вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:13 и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:14;
(в) антитела, содержащего вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:44 и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:45; и
(г) антитела, содержащего вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:46 и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:47.
17. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по любому из предыдущих воплощений, которые связываются с тем же эпитопом NKG2D, что и референсное антитело, причем референсное антитело выбрано из группы, состоящей из:
(а) антитела, содержащего вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:11, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:12;
(б) антитела, содержащего вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:13, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:14;
(в) антитела, содержащего вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:44, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:45; и
(г) антитела, содержащего вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:46, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:47.
18. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по любому из предыдущих воплощений, которые связываются с NKG2D с практически с той же KD, что и референсное антитело, причем референсное антитело выбрано из группы, состоящей из:
(а) антитела, содержащего вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:11, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:12;
(б) антитела, содержащего вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:13, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:14;
(в) антитела, содержащего вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:44, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:45; и
(г) антитела, содержащего вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:46, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:47.
19. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по любому из воплощений 16-18, где референсное антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:44, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:45.
20. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по предыдущему воплощению, которые связываются с эпитопом, содержащим Lys 150, Ser 151, Tyr 152, Thr 180, Ile 181, Ile 182, Glu 183, Met 184, Gln 185, Leu 191, Lys 197, Tyr 199, Glu 201, Thr 205, Pro 206, Asn 207 и/или Thr 208 по последовательности SEQ ID NO:2.
21. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по предыдущему воплощению, которые связываются с эпитопом, содержащим 5 или более аминокислотных остатков, выбранных из Lys 150, Ser 151, Tyr 152, Thr 180, Ile 181, Ile 182, Glu 183, Met 184, Gln 185, Leu 191, Lys 197, Tyr 199, Glu 201, Thr 205, Pro 206, Asn 207 и Thr 208 по последовательности SEQ ID NO:2.
22. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по предыдущему воплощению, которые связываются с эпитопом, содержащим Lys 150, Ser 151, Tyr 152, Thr 180, Ile 181, Ile 182, Glu 183, Met 184, Gln 185, Leu 191, Lys 197, Tyr 199, Glu 201, Thr 205, Pro 206, Asn 207 и Thr 208 по последовательности SEQ ID NO:2.
23. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по любому из воплощений 16-18, где референсное антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:46, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:47.
24. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по любому из предыдущих воплощений, содержащие вариабельный участок тяжелой цепи, который является продуктом или получен на основе набора генов человека, включающих:
(а) гены VH3_21, D3-9 и JH4;
(б) гены VH3_20, D3-10 и JH6;
(в) гены VH4_59, D7_27_R3 и JH3; или
(г) гены VH5_51, D3_10_R3 и JH4.
25. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по любому из предыдущих воплощений, содержащие вариабельный участок легкой цепи, который является продуктом или получен на основе набора генов человека, включающих
(а) гены VKI_L15 и JK2;
(б) гены VKIII_A27 и JK3;
(в) гены VKIII_A27 и JK1; или
(г) гены VKIII_L6 и JK1.
26. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по любому из предыдущих воплощений, содержащие вариабельный участок тяжелой цепи, который является продуктом или получен на основе набора генов человека, включающих гены VH4_59, D7_27_R3 и JH3, и вариабельный участок легкой цепи, который является продуктом или получен на основе набора генов человека, включающих гены VKIII_A27 и JK1.
27. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по любому из предыдущих воплощений, содержащие паратоп, содержащий аминокислотный остаток, соответствующий Gln 1, Asp 26, Asp 27, Ser 30, Ser 31, Tyr 32, Tyr 33, His 50, Ser 52, Tyr 53, Ser 54, Ser 56, Ala 57, Asn 58, Trp 98 или Asp 99 по последовательности SEQ ID NO:44 или Tyr 33 или Trp 97 по последовательности SEQ ID NO:45, или любую их комбинацию.
28. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по предыдущему воплощению, содержащие паратоп, содержащий по меньшей мере 5 аминокислотных остатков, выбранных из остатков, соответствующих Gln 1, Asp 26, Asp 27, Ser 30, Ser 31, Tyr 32, Tyr 33, His 50, Ser 52, Tyr 53, Ser 54, Ser 56, Ala 57, Asn 58, Trp 98 или Asp 99 по последовательности SEQ ID NO:44 или Tyr 33 или Trp 97 по последовательности SEQ ID NO:45 или любую их комбинацию.
29. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по предыдущему воплощению, содержащие паратоп, содержащий аминокислотные остатки, соответствующие Gln 1, Asp 26, Asp 27, Ser 30, Ser 31, Tyr 32, Tyr 33, His 50, Ser 52, Tyr 53, Ser 54, Ser 56, Ala 57, Asn 58, Trp 98 и Asp 99 по последовательности SEQ ID NO:44 и Tyr 33 и Trp 97 по последовательности SEQ ID NO:45.
30. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по любому из предыдущих воплощений, содержащие:
(а) вариабельный участок CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:48;
(б) вариабельный участок CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:49; и
(в) вариабельный участок CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:50.
31. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по предыдущему воплощению, содержащие:
(а) вариабельный участок CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:51;
(б) вариабельный участок CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:52; и
(в) вариабельный участок CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:53.
32. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по любому из предыдущих воплощений, содержащие вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:44, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:45.
33. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по любому из воплощений 1-25, содержащие вариабельный участок тяжелой цепи, который является продуктом или получен на основе набора генов человека, включающих гены VH5_51, D3_10_R3 и JH4, и вариабельный участок легкой цепи, который является продуктом или получен на основе набора генов человека, включающих гены VKIIIJ-6 и JK1.
34. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по предыдущему воплощению, содержащие:
(а) вариабельный участок CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:54;
(б) вариабельный участок CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:55; и
(в) вариабельный участок CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:56.
35. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по предыдущему воплощению, содержащие:
(а) вариабельный участок CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:57;
(б) вариабельный участок CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:58; и
(в) вариабельный участок CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:59.
36. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по предыдущему воплощению, содержащие вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:46, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:47.
37. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по воплощению 1, содержащие:
(а) вариабельный участок CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:15;
(б) вариабельный участок CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:16; и
(в) вариабельный участок CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:17.
38. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по предыдущему воплощению, содержащие:
(а) вариабельный участок CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:18;
(б) вариабельный участок CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:19; и
(в) вариабельный участок CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:20.
39. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по предыдущему воплощению, содержащие вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:11, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:12.
40. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по воплощению 1, содержащие:
(а) вариабельный участок CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:21;
(б) вариабельный участок CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:22; и
(в) вариабельный участок CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:23.
41. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по предыдущему воплощению, содержащие:
(а) вариабельный участок CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:24;
(б) вариабельный участок CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:25; и
(в) вариабельный участок CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:26.
42. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по предыдущему воплощению, содержащие вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:13, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:14.
43. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по воплощению 1, содержащие:
(а) вариабельный участок CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:48;
(б) вариабельный участок CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:49; и
(в) вариабельный участок CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:50.
44. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по предыдущему воплощению, содержащие:
(а) вариабельный участок CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:51;
(б) вариабельный участок CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:52; и
(в) вариабельный участок CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:53.
45. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по воплощению 1, содержащие вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:44, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:45.
46. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по воплощению 1, содержащие:
(а) вариабельный участок CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:54;
(б) вариабельный участок CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:55; и
(в) вариабельный участок CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:56.
47. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по предыдущему воплощению, содержащие:
(а) вариабельный участок CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:57;
(б) вариабельный участок CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:58; и
(в) вариабельный участок CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:59.
48. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по предыдущему воплощению, содержащие вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:46, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:47.
49. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по воплощению 1, содержащие
(а) вариабельный участок CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:15, 21, 48 или 54;
(б) вариабельный участок CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:16, 22, 49 или 55;
(в) вариабельный участок CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:17, 23, 50 или 56;
(г) вариабельный участок CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:18, 24, 51 или 57;
(д) вариабельный участок CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:19, 25, 52 или 58; и
(е) вариабельный участок CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:20, 26, 53 или 59;
не более чем с 8 консервативными заменами аминокислот.
50. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по предыдущему воплощению, содержащие не более 5 аминокислотных замен.
51. Антитело по любому из предыдущих воплощений, являющееся человеческим.
52. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по любому из предыдущих воплощений, являющееся бивалентным.
53. Антитело по предыдущему воплощению, представляющее собой антитело lgG1, lgG2, lgG3 или lgG4.
54. Антитело по предыдущему воплощению, представляющее собой антитело lgG4.
55. Антитело по любому из предыдущих воплощений, содержащее мутацию S241P в цепи VH.
56. Выделенное антитело, содержащее последовательность тяжелой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO:7, и последовательность легкой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO:8.
57. Выделенное антитело, содержащее последовательность тяжелой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO:9, и последовательность легкой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO:10.
58. Выделенное антитело, содержащее последовательность тяжелой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO:40, и последовательность легкой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO:41.
59. Выделенное антитело, содержащее последовательность тяжелой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO:42, и последовательность легкой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO:43.
60. Выделенное антитело, конкурирующее за связывание с hNKG2D в большей степени с 16F16, 16F31, MS или 21F2, чем с любым из ON72, ВАТ221, 5С6, 1D11, ЕСМ217 или 149810, и предотвращающее NKG2D-опосредованную активацию NK или Т клеток, экспрессирующих NKG2D.
61. Выделенное антитело по предыдущему воплощению, конкурирующее в большей степени с MS, чем с ON72, ВАТ221, 5С6, 1D11, ЕСМ217 или 149810.
62. Выделенное антитело по воплощению 60, конкурирующее в большей степени с 21F2, чем с ON72, ВАТ221, 5С6, 1D11, ЕСМ217 или 149810.
63. Выделенное антитело, которое связывается с ассоциированным с клеточной поверхностью hNKG2D в препаратах NK-клеток с первой средней эффективной концентрацией (ЕС50) и подавляет гибель экспрессирующих NKG2D-лиганд клеток-мишеней, опосредованную препаратом NK клеток, со второй ЕС50, где второе значение ЕС50 существенно ниже, чем первое значение ЕС50.
64. Антитело по предыдущему воплощению, в котором препарат NK-клеток представляет собой клетки NK-92 или NKL.
65. Антитело по предыдущему воплощению, в котором лигандом является ULBP-3 или MICA.
66. Антитело по предыдущему воплощению, в котором второе значение ЕС50 не превышает 80% от первого значения ЕС50.
67. Антитело по предыдущему воплощению, в котором второе значение ЕС50 не превышает 50% от первого значения ЕС50.
68. Выделенное антитело, связывающееся с hNKG2D, проявляющее максимальное ингибирование опосредованной NK-клетками гибели клеток-мишеней, экспрессирующих лиганд, при концентрации ниже, чем концентрация, являющаяся насыщающей для ассоциированного с клеточной поверхностью NKG2D.
69. Выделенное антитело, связывающееся с hNKG2D, предотвращающее NKG2D-опосредованную активацию NK или Т клеток, экспрессирующих NKG2D, и способное более чем на 70% снижать уровень ассоциированного с клеточной поверхностью NKG2D.
70. Антитело по предыдущему воплощению, способное снижать ниже 90% уровень NKG2D, ассоциированного с клеточной поверхностью NK клеток.
71. Выделенное антитело, связывающееся с hNKG2D и связывающееся с NKG2D-экспрессирующими клетками человека и яванского макака с одинаковой аффинностью.
72. Антитело по предыдущему воплощению, у которого ЕС50 связывания с CD8+ Т клетками яванского макака в препарате МКПК составляет по меньшей мере 50% от ЕС50 связывания с CD8+ Т клетками человека в препарате МКПК.
73. Антитело по предыдущему воплощению, у которого ЕС50 связывания с CD8+ Т клетками яванского макака в препарате МКПК составляет по меньшей мере 65% от ЕС50 связывания с CD8+ Т клетками человека в препарате МКПК.
74. Выделенное антитело по любому из предыдущих воплощений, у которого аффинность к NKG2D человека составляет не более 0,1 нМ.
75. Антитело по любому из предыдущих воплощений, у которого аффинность к NKG2D человека составляет не более 10 пМ.
76. Антитело по любому из воплощений 60-75, содержащее:
(а) вариабельный участок CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:48 или 54;
(б) вариабельный участок CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:49 или 55; и
(в) вариабельный участок CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:50 или 56.
77. Антитело по предыдущему воплощению, содержащее:
(а) вариабельный участок CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:51 или 57;
(б) вариабельный участок CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:52 или 58; и
(в) вариабельный участок CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:53 или 59.
78. Антитело по любому из воплощений 60-77, являющееся человеческим.
79. Антиген-связывающий фрагмент антитела по любому из воплощений 60-78.
80. Нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный участок тяжелой или легкой цепи антитела или антиген-связывающего фрагмента по любому из предыдущих воплощений.
81. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по предыдущему воплощению.
82. Клетки-хозяева, содержащие вектор экспрессии по предыдущему воплощению.
83. Клетки-хозяева, продуцирующие антитело или антиген-связывающий фрагмент по любому из воплощений 1-79.
84. Клетки-хозяева по любому из воплощений 82 и 83, являющиеся клетками СНО.
85. Способ получения анти-NKG2D антитела или антиген-связывающего фрагмента, включающий культивирование клеток-хозяев по любому из воплощений с 82 по 84 при подходящих условиях и выделение указанного антитела или его антиген-связывающего фрагмента.
86. Способ получения варианта анти-NKG2D антитела или его антиген-связывающего фрагмента, включающий:
(а) создание вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего последовательность CDR1, выбранную из SEQ ID NOS:15, 21, 48 и 54, последовательность CDR2, выбранную из SEQ ID NOS:16, 22, 49 и 55, и последовательность CDR3, выбранную из SEQ ID NOS:17, 23, 50 и 56;
(б) создание вариабельного участка легкой цепи, содержащего последовательность CDR1, выбранную из SEQ ID NOS:18, 24, 51 и 57, последовательность CDR2, выбранную из SEQ ID NOS:19, 25, 52 и 58, и последовательность CDR3, выбранную из SEQ ID NOS:20, 26, 53, и 59;
(в) изменение до 8 аминокслотных остатков в каждом из вариабельных участков тяжелой и легкой цепи для получения измененных вариабельных участков тяжелой и легкой цепи; и
(г) экспрессию варианта анти-NKG2D антитела, содержащего измененные вариабельные участки тяжелой и легкой цепи, в клетках-хозяевах.
87. Иммуноконъюгат, содержащий антитело или антиген-связывающий фрагмент по любому из воплощений 1-79, связанный с терапевтическим агентом.
88. Мультиспецифичную молекулу, содержащую антитело или антиген-связывающий фрагмент по любому из воплощений 1-79, связанную со вторым компонентом, имеющим иную связывающую валентность, чем антитело.
89. Мультиспецифичную молекулу по предыдущему воплощению, в котором вторым компонентом является второе антитело или его антиген-связывающий фрагмент.
90. Композиция, содержащая антитело или антиген-связывающий фрагмент по любому из воплощений 1-79, и фармацевтически приемлемый носитель.
91. Способ предупреждения NKG2D-опосредованной активации NK или Т клеток, экспрессирующих NKG2D, содержащий инкубацию NK или Т клеток с антителом или антиген-связывающим фрагментом по любому из воплощений 1-79, в котором антитело или антиген-связывающий фрагмент конкурирует по меньшей мере с одним лигандом NKG2D за связывание с NKG2D.
92. Способ по предыдущему воплощению, в котором лигандом NKG2D является MICA.
93. Способ снижения уровня NKG2D на поверхности NK или Т клеток, экспрессирующих NKG2D, включающий инкубацию NK или Т клеток с антителом или антиген-связывающим фрагментом по любому из воплощений 1-79, в котором антитело или антиген-связывающий фрагмент конкурирует по меньшей мере с одним лигандом NKG2D за связывание с NKG2D человека.
94. Способ лечения воспалительного или аутоиммунного нарушения, включающий введение композиции по воплощению 90 человеку, страдающему от воспалительного или аутоиммунного нарушения или имеющего риск его развития.
95. Способ по предыдущему воплощению, в котором пациент страдает от аутоиммунного нарушения или имеет риск его развития.
96. Способ по предыдущему воплощению, в котором аутоиммунным нарушением является ревматоидный артрит.
97. Способ по воплощению 95, в котором нарушением является рассеянный склероз.
98. Способ по воплощению 95, в котором нарушением является системная красная волчанка (СКВ).
99. Способ по воплощению 95, в котором нарушением является псориаз.
100. Способ по воплощению 95, в котором нарушением является целиакия.
101. Способ по воплощению 95, в котором нарушением является воспалительное заболевание кишечника.
102. Способ по предыдущему воплощению, в котором воспалительным заболеванием кишечника является язвенный колит.
103. Способ по воплощению 101, в котором воспалительным заболеванием кишечника является является болезнь Крона.
104. Способ по воплощению 94, в котором человек страдает от или имеет риск развития отторжения трансплантата или реакции трансплантат против хозяина.
105. Способ по предыдущему воплощению, в котором трансплантат представляет собой трансплантат сердца или костного мозга.
106. Способ по любому из воплощений с 94 по 105, также включающий введение второго противовоспалительного агента.
107. Способ по предыдущему воплощению, в котором второй противовоспалительный агент выбран из иммуносупрессирующего, анальгезирующего, анти-ангиогенного агента, кортикостероида, агента, вызывающего деплецию В-клеток, антагониста В-клеток, антагониста Т-клеток агента, ингибирующего комплемент, антагониста цитокинов и антагониста цитокиновых рецепторов и их комбинаций.
108. Способ по любому из воплощений 106 и 107, в котором вторым противовоспалительным агентом является антагонист активности TNFальфа.
109. Способ лечения воспалительного или аутоиммунного нарушения, включающий введение композиции по воплощению 90 человеку, имеющему риск воспалительного или аутоиммунного нарушения.
110. Способ по предыдущему воплощению, в котором человек имеет риск отторжения трансплантата или реакции трансплантат против хозяина.
111. Применение антитела или антиген-связывающего фрагмента по любому из воплощений 1-79, в приготовлении лекарственного препарата для лечения воспалительного или аутоиммунного нарушения у человека.
112. Антитело или антиген-связывающий фрагмент по любому из воплощений 1-79, для применения в лечении воспалительного или аутоиммунного нарушения у человека.
Все ссылки, включая публикации, заявки на патенты и патенты, цитируемые здесь, включены сюда посредством ссылки в той же степени, как если бы для каждой ссылки отдельно и специально было указано, что она включена сюда во всей своей полноте путем ссылки.
Все заголовки и подзаголовки использованы здесь только для удобства и не должны рассматриваться как ограничивающие изобретение каким-либо образом.
Любое сочетание описанных выше элементов во всех их возможных вариантах включено в изобретение, если здесь это не утверждается иначе или явно не противоречит контексту.
Все термины, используемые в контексте описания изобретения должны рассматриваться как в единственном, так и во множественном числе, если здесь это не утверждается иначе или явно не противоречит контексту.
Перечисление диапазонов значений здесь предназначено для того, чтобы попросту служить в качестве краткого обозначения отдельного упоминания каждого самостоятельного значения, находящегося в пределах указанного диапазона, если это здесь не указано иначе, и каждое самостоятельное значение включено в описание, как если бы оно было здесь упомянуто отдельно. Если это не указано иначе, все точные значения, приведенные здесь, являются репрезентативными для соответствующих приблизительных значений (например, все точные значения, приведенные в качестве примеров, в отношении конкретного фактора или показателя, можно считать также предусматривающими соответствующую приближенную оценку, при употреблении с термином «приблизительно», в необходимых случаях).
Все описанные десь способы могут осуществляться в любом подходящем порядке, если здесь это не утверждается иначе или явно не противоречит контексту.
Применение всех или любых примеров или примеров формулировок (например, "такой как") в данном описании предназначено попросту для лучшего разъяснения изобретения и не ограничивает рамки изобртения, если это не указано иначе. Ни одна формулировка в описании не должна рассматриваться как указание на то, что какой-либо элемент является незаменимым для осуществления изобретения, если именно это четко не обозначено иначе.
Упоминание и включение посредством ссылки патентных документов здесь производится только для удобства и не отражает никоим образом действительность, патентоспособность и/или законность таких патентных документов.
Описание здесь любых аспектов или воплощений изобретения при помощи таких терминов, как "состоящий из", "имеющий", "включающий" или "содержащий" со ссылкой на элемент или элементы, предназначено для обеспечения аналогичных аспектов или воплощений изобретения, которые "состоят из", "состоят главным образом из" или "содержат главным образом" тот конкретный элемент или элементы, если это не утверждается иначе или явно не противоречит контексту (например, композиция, которая по данному описанию содержит конкретный элемент, должна рассматриваться как описывающая в том числе и композицию, состоящую из этого элемента, если это не указано иначе или явно не противоречит контексту).
Данное изобретение включает все модификации и эквиваленты объекта изобретения, упомянутые в аспектах или пунктах формулы изобретения, представленных здесь, в максимальной степени, допускаемой существующим законодательством.