Лекарственное средство пролонгированного действия на основе анастрозола
PROLONGED ACTION THERAPEUTIC AGENT BASED ON ANASTROZOLE

Область техники
Изобретение относится к фармацевтике и медицине и представляет собой лекарственное средство пролонгированного действия на основе анастрозола в виде лиофилизата, для приготовления суспензии для внутримышечного введения.
Уровень техники
Снижение смертности от рака молочной железы (РМЖ) в Российской Федерации является актуальной и приоритетной задачей. Рак молочной железы занимает первое место в структуре онкологической заболеваемости женского населения. Ежегодно в России выявляется 54 тысячи больных РМЖ женщин, при этом более 22 тысяч из них умирает. Создание высокоэффективных препаратов для лечения рака молочной железы является актуальной проблемой для РФ.
Большинство больных РМЖ, после завершения хирургического этапа лечения, нуждается в проведении адъювантной лекарственной терапии, в том числе гормональной так, как 30% случаев РМЖ относится к гормончувствительным опухолям. Для данной категории больных, согласно проведенным фармакоэкономическим исследованиям, доказана обоснованность проведения адъювантной терапии ингибитором ароматазы III поколения анастрозолом. Анастрозол представляет собой α,α,α',α'-тетраметил-5-(1Н-1,2,4-триазол-1-ил-метил)-м-бензолдиацетонитрил и является высокоселективным нестероидным ингибитором ароматазы (биомишень). Механизм действия анастрозола связан с ингибированием ароматазы в периферических тканях, что приводит к уменьшению количества эстрадиола. Снижение уровня циркулирующего эстрадиола оказывает терапевтический эффект при эстрогенозависимых опухолях молочной железы у женщин в постменопаузном периоде.
Препараты на основе анастрозола выпускается несколькими фармацевтическими компаниями под разными торговыми названиями (Анастрозол. Регистр лекарственных средств России, www.rlsnet.ru). Выпускаемые препараты на основе анастрозола представляют собой таблетки для перорального применения, покрытые пленочной оболочкой, с содержанием активного вещества (анастрозола) - 1 мг. Различия между препаратами наблюдаются по составу вспомогательных веществ. Один из наиболее продаваемых препаратов анастрозола известен в РФ под торговым названием «Аримидекс» (состав таблеток: активное вещество - анастрозол - 1 мг, вспомогательные вещества - лактозы моногидрат - 93 мг; повидон - 2 мг; карбоксиметилкрахмал натрия - 3 мг; магния стеарат - 1 мг; оболочка пленочная: гипромеллоза - 1,5 мг; макрогол 300 - 0,3 мг; титана диоксид - 0,45 мг (Аримидекс. Регистр лекарственных средств России, www.rlsnet.ru).
Из уровня техники известна международная публикация заявки на изобретение WO № WO 2003053438 A1 «Use of anastrozole for the treatment of post-menopausal women having early breast cancer» (опубл. 03.07.2003) описывается лекарственное средство на основе анастрозола или его фармацевтически приемлемой соли для снижения значения возникновения рецидивов рака у женщин в постклимактерическом периоде, страдающих ранним раком молочной железы. позитивным по рецептору эстрогена или позитивной по рецептору прогестерона. В соответствии с формулой изобретения анастрозол обеспечивается для введения в дозе 1 мг/день. Предпочтительной лекарственной формой для введения анстрозола является пероральная с содержанием 1 мг анастрозола. В примерах заявки № WO 2003053438 A1 описано исследование, в котором использовали таблетки, содержащие 1 мг анастрозола. Введение лекарственного средства осуществляют непрерывно в течение, предпочтительно пяти лет беспрерывного лечения.
После приема препаратов на основе анастрозола для перорального введения в дозировке 1 мг анастрозол быстро всасывается из ЖКТ (83-85% дозы). При однократном пероральном приеме терапевтической дозы 1 мг/сутки анастрозола максимальная концентрация в плазме крови (Cmax) достигается через 1-2 часа и составляет по данным разных литературных источников от 8 до 15 нг/мл (Аримидекс. Регистр лекарственных средств России, www.rlsnet.ru; Noh Y.H., Ko Y.J., Cho S.H., Ghim J.L., Choe S., Jung J.A., Kim U.J., Jin S.J., Park H.J., Song G.S., Lim H.S., Bae K.S. Pharmacokinetic comparison of 2 formulations of anastrozole (1 mg) in healthy Korean male volunteers: a randomized, single-dose, 2-period, 2-sequence, crossover study // Clin. Ther. 2012, Feb. - V. 34 (2). - P. 305-313; R.A. Yates, M. Dowsett, G.V. Fisher, A. Selen, and P.J. Wyld Arimidex (ZD1033): a selective, potent inhibitor of aromatase in postmenopausal female volunteers // Br. J. Cancer. - 1996 Feb. - V. 73 (4). - P. 543-548). Равновесная концентрация в крови при ежедневном пероральном приеме достигается примерно через 7-12 дней, и величина ее в 2-3 раза выше, чем при однократном приеме (Noh Y.H., Kо Y.J., Cho S.H., Ghim J.L., Choe S., Jung J.A., Kim U.J., Jin S.J., Park H.J., Song G.S., Lim H.S., Bae K.S. Pharmacokinetic comparison of 2 formulations of anastrozole (1 mg) in healthy Korean male volunteers: a randomized, single-dose, 2-period, 2-sequence, crossover study // Clin. Ther. 2012, Feb. - V. 34 (2). - P. 305-313). Анастрозол экстенсивно метаболизируется у женщин в постменопаузе. Биотрансформация в печени осуществляется путем N-деалкилирования, гидроксилирования и глюкуронизации с образованием неактивных метаболитов, основной из которых - триазол. Менее 10% экскретируется с мочой в неизмененном виде в течение 72 ч после приема, 60% выводится в виде метаболитов. Терминальный Т1/2 составляет примерно 40-50 ч (Аримидекс. Регистр лекарственных средств России. www.rlsnet.ru).
Серьезная проблема описанных выше препаратов и методов при применении анастрозола заключается в длительном и регулярном его приеме, что часто сопровождается сбоями в графике лечебного процесса и приводит к нежелательным осложнениям. Длительное применение препаратов на основе анастрозола приводит также к нарушениям со стороны костно-мышечной системы, репродуктивной системы, пищеварительной системы, гепатобилиарной системы, почек, нервной системы, метаболизма. Прием препарата часто вызывает снижение минеральной плотности костной ткани в связи со снижением концентрации циркулирующего эстрадиола, тем самым повышая риск возникновения остеопороза и переломов костей. Решением данной проблемы является создание новой лекарственной формы анастрозола, обеспечивающей длительность (пролонгированность) его действия. Это позволит снизить дозу препарата и создать более комфортные условия для пациентов, вынужденных регулярно и длительно применять лекарство. Введение лекарственное средство пролонгированного действия также позволяет избежать резких подъемов и колебаний плазменной концентрации анастрозола, которые являются причиной многих побочных эффектов. Данный результат может быть достигнут путем разработки лекарственного средства на основе анастрозола, включающего также биодеградируемый полимер из группы полилактидгликолидов, разрешенных для медицинского применения.
Лекарственные системы пролонгированного действия (депо-композиции) представляют большой интерес для современной фармации, поскольку позволяют осуществлять контроль над процессом высвобождения активного лекарственного вещества в соответствии с реальной потребностью живого организма (Алексеев К.В., Грицкова И.А., Кедик С.А. Полимеры для фармацевтической технологии: учебное пособие. М.: Изд-во ЗАО «Институт фармацевтических технологий», 2011. С. 468-497). Дополнительным значительным преимуществом депо-композиций является то, что активные агенты высвобождаются постепенно на протяжении длительных периодов времени без необходимости повторной дозировки. Длительное обеспечение постоянной концентрации лекарственного вещества в организме позволяет эффективно осуществлять терапию. Лекарственные системы пролонгированного действия наиболее востребованы в областях медицины, где требуются длительные курсы терапии, например в случае длительного гормонального лечения (например, при адъювантной терапии гормончувствительных опухолей, гормональная терапия детей гормоном роста, контрацептивные гормоны), при терапии хронических воспалительных заболеваний (например, ревматоидный артрит), при терапии некоторых психических заболеваний (например, шизофрения), в терапии некоторых инфекционных заболеваний (например, туберкулез), так как подходят для ситуаций, когда соблюдение пациентом схемы и режима лечения является ненадежным, и когда очень важным является уровень дозировки (Zhang, Н.; Wang, G.; Yang Н. Drug delivery systems for differential release in combination therapy // Expert Opin. Drug Deliv. - 2011. - Vol. 8(2). - P. 171-190; Makadia, H.K.; Siegel, S.J. Poly Lactic-co-Glycolic Acid (PLGA) as Biodegradable Controlled Drug Delivery Carrier // Polymers. - 2011. - Vol. 3. - P. 1377-1397). Лекарственные системы пролонгированного действия позволяют устранять побочные эффекты традиционных лекарственных форм, в том числе раздражающее действие лекарства на желудочно-кишечный тракт при приеме пероральных препаратов.
В работе A.S. Zidan и соавт. (Zidan A.S., Sammour О.А., Hammad М.А., Megrab N.A., Hussain M.D., Khan M.A., Habib M.J.. Formulation of Anastrozole Microparticles as Biodegradable Anticancer Drug Carriers // AAPS Pharm. Sci. Tech 2006; V. 7 (3) Article 61 (http://www.aapspharmscitech.org) осуществлено получение композиции, включающей кроме анастрозола также биодеградируемый полимер - сополимер молочной и гликолевой кислот PLGA 50:50 с молекулярной массой 70000÷100000 дальтон, поверхностно-активное вещество - поливиниловый спирт (ПВС). Композиция представляет собой полимерные микрочастицы с размером частиц 75-420 мкм. Для получения полимерных микрочастиц применяли метод однократного эмульгирования (вода/масло) с последующим удалением органического растворителя из полученной эмульсии. В исследовании была изучена зависимость степени включения анастрозола в состав полимерных частиц от величины весового избытка полимера, концентрации ПВС и соотношения органической и водной фаз. Следует отметить, что степень включения анастрозола в композициях характеризовалась низкими значениями - не более 33%, и лишь в одном случае при большом избытке полимера и соотношении органической и водной фаз равном 1/50 удалось повысить степень включения анастрозола до 50%. Описанные условия мало приемлемы для практического использования и наработки препарата, в силу необходимости использования огромных объемов водной фазы. В данной работе также было изучено высвобождение анастрозола из полимерных частиц в модельных экспериментах in vitro. Было показано, что в течение недели высвобождалось из полимерной матрицы не более 40% анастрозола, а в последующие дни (до 40 дня наблюдения) происходит высвобождение до уровня 45-70%. Однако исследования по изучению кинетики высвобождения в организме не проводились, в связи с чем, не понятно, может ли введение препарата обеспечивать поддержание терапевтических концентраций анастрозола в организме, обеспечивающих снижение уровня эстрогенов в эффективных пределах.
В работе A. Kumar и соавт. (A. Kumar and K.K. Sawant J. Application of multiple regression analysis in optimization of anastrozole-loaded PLGA nanoparticles Microencapsul, 2014; 31 (2):105-14) приведен способ получения композиции анастрозола на основе полилактидгликолидов в виде наночастиц с размером 120-200 нм. Наночастицы получали методом наноприципитации с использованием микрофлюидной технологии.
В заявке ВОИС № WO 2007026145 «Prolonged release formulations comprising anastrozole» (опубл. 15.01.2015) приводятся данные по получению композиций пролонгированного высвобождения в виде геля in situ (гелеобразующая композиция). Гелеобразующая композиция состоит из анастрозола и биодеградируемого полимера - полимера молочной кислоты (полилактида) или сополимера молочной и гликолевой кислот PLGA 50:50 с молекулярной массой 10000÷50000 дальтон. Молярное отношение лактида и гликолида в полимере в пределах от 100:0 до 50:50; содержание анастрозола - от 5 до 30% по весу в расчете на общий вес композиции. Композиция также содержит подходящий растворитель подходящий растворитель, прим этом массовое отношение полимера к растворителю от 50:50 до 60:40. Растворитель выбирается предпочтительно из N-метилпирролидона и бензилового спирта. Гелеобразующая композиция in situ непрерывно высвобождает анастрозол в течение периода, по меньшей мере, примерно 7 дней при помещении в водную среду физиологического типа. В заявке предложен способ получения гелеобразующей композиции in situ, включающий стадии растворения полимера в подходящем растворителе; а также растворения эффективного количества анастрозола в растворе полимера. Также предложен способ формирования имплантата in situ в живом организме. В заявке описан фармацевтический набор, подходящий для образования биодеградируемого имплантата из гелеобразующей композиции in situ в теле пациента, который содержит: (А) устройство, содержащее анастрозол; (Б) устройство, содержащее раствор полилактидного полимера или сополимера поли (лактид-согликолид) в подходящем растворителе, а также эжектор, в котором содержимое двух устройств смешивают вместе непосредственно перед доставкой содержимого устройства, содержащего смесь, в тело пациента. Однако у применения описанных имплантов имеются ограничения, связанные с неудобством и сложностью предложенной системы введения.
В патенте № ES 2390439 B1 «Injectable composition» (опубл. 13.11.207) описана композиция, для формирования внутримышечного имплантата, содержащего биодеградируемый полимер полимолочной кислоты (PLA), диметилсульфоксида (ДМСО) и соединения, относящиеся к ингибиторам ароматазы, а также набор, подходящий для образования in situ композиции и его использование в качестве лекарственного средства для лечения рака молочной железы. При этом ингибитор ароматазы (летрозол или анастрозол, либо отдельно, либо в комбинации) находится в суспензии в растворе, содержащем ДМСО и PLA, и составляет от 15 до 50 мас. %, предпочтительно 25 мас. %, от общей композиции. Содержание PLA составляет 40-43 мас. %, содержание ДМСО - 57-60 мас. %. Распределение по размеру частиц в композиции следующее: <10% частиц менее 20 мкм, <10% частиц более 350 мкм и основная фракция частиц 70-200 мкм. Данная композиция может затвердевать, с образованием твердой или гелевой формы в виде имплантата in situ при контакте с водной средой или жидкостью организма с после введения in vivo. Максимальный объем композиции для внутримышечной инъекции составляет 2 мл с содержанием 500 мг летрозола. Показатель AUC первичного «всплеска» (выход из состава композиции в первые 3 дня после инъекции) ингибитора ароматазы должен составлять не менее 10% от общей AUC и не более 50% от общей AUC первых 30 дней после инъекции. Также в патенте описан набор, подходящий для получения in situ композиции, который может состоять из двух контейнеров (один - ингибитор ароматазы + полимер, второй - ДМСО или один - ингибитор ароматазы, второй - ДМСО + полимер) или из одного контейнера с композицией в виде суспензии. Недостатком композиций является присутствие в составе ДМСО, что снижает степень безопасности применения композиций при описанном парентеральном способе введения в организм.
Известно лекарственное средство, описанное в патенте РФ №2548722 «Противоопухолевое лекарственное средство пролонгированного действия на основе противоопухолевого препарата, ингибитора синтеза эстрогенов анастрозола» (опубл. 20.04.2015), содержащее также сополимер молочной и гликолевой кислот, поливиниловый спирт, D-маннитол и представляющее собой частицы субмикронного размера. Исследование высвобождения анастрозола из полимерных частиц в модельных экспериментах при рН 7,6 и 36°С показало, что в течение 40 часов высвобождалось из полимерных частиц не более 40% анастрозола. Показано, что внутрибрюшинное введение лекарственного средства овариоэктамированным мышам линии С57 Bl/6j с привитой опухолью аденокарциномы молочной железы линии Са755 более эффективно ингибировало рост опухоли (примерно в 2 раза) и увеличивало продолжительность жизни животных на 20%, по сравнению с субстанцией анастрозола. При определении концентрации анастрозола в крови после внутрибрюшинного введения мышам лекарственного средства курсом в течение трех дней было показано, что анастрозол определялся в крови в течение 7 дней после последнего введения, в отличие от введенной субстанции анастрозола. Однако данных о значениях уровня концентрации анастрозола в крови не представлено, как и данных об уровне эстрогенов в крови, что имеет первостепенное терапевтическое значение и позволяет оценить эффективность препарата. Кроме того, описанный в примерах данного патента внутрибрюшинный способ введения лекарственного средства малоприменим в клинической практике. Следует отметить, что описанный кинетический профиль (определение анастрозола в крови в течение 7 дней) не является оптимальным для применения препаратов пролонгированного действия, так как наиболее предпочтительно длительное поддержание терапевтически эффективных концентраций более 14 дней и введение препарата пациенту не чаще чем раз в 2-3 недели. По-видимому, особенности кинетики высвобождения анастрозола в случае описанного лекарственного средства связаны с тем, что субмикронные частицы не могут обеспечивать необходимую длительность высвобождения в силу своих геометрических параметров, поэтому предпочтительным становится применение частиц микронного диапазона, обеспечивающих большее включение анастрозола, а также более длительную биодеградацию, что в комплексе обеспечивает удлинение периода высвобождения включенного в состав частиц анастрозола.
Согласно общепринятой градации наночастицы - это частицы, размером от единиц до 100 нм, (ГОСТ Р 55416-2013/ISO/TS 80004-1:2010), субмикронные частицы - частицы в диапазоне 100 нм - 1 мкм, микронные - от 1 мкм и выше.
Следовательно, существует необходимость в усовершенствовании состава и технологии для получения лекарственного средства пролонгированного действия на основе анастрозола в виде инъекционной лекарственной формы с терапевтически приемлемым способом и режимом введения, обеспечивающей длительное поддержание терапевтической концентрации анастрозола в крови и достижение снижения уровня эстрогенов в крови до терапевтически эффективных значений на протяжении не менее чем 14 дней, предназначенной для лечения эстрогенозависимых опухолей молочной железы.
Раскрытие изобретения
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка лекарственного средства на основе анастрозола для лечения эстрогенозависимых форм РМЖ.
Технический результат заявленного изобретения заключается в том, что предложено лекарственное средство на основе анастрозола пролонгированного действия, свободное от недостатков, присущих приведенным в ранее опубликованных работах, так как обладает удобным способом и режимом введения, оптимальным составом и характеристиками, обеспечивающими повышение длительности и эффективности действия, что позволит широко использовать лекарственное средство при лечении больных с эстрогенозависимыми формами РМЖ.
Технический результат заявленного изобретения достигается тем, что предложено лекарственное средство пролонгированного действия на основе анастрозола в виде лиофилизата для приготовления суспензии для внутримышечного введения, содержащее анастрозол, сополимер молочной и гликолевой кислот, D-маннитол, поливиниловый спирт, метилцеллюлозу при следующем соотношении компонентов, % мас.:
анастрозол
10,0÷15,0
сополимер молочной и гликолевой кислот
70,0÷76,0
D-маннитол
12,0÷14,0
поливиниловый спирт
0,01÷0,5
метилцеллюлоза
0,01÷0,5
при этом лекарственное средство, описанное выше, характеризуется тем, что при добавлении к лиофилизату физиологического раствора при соотношении 1:15-1:30 по массе и встряхивании в течение 1-2 минут образует суспензию частиц с размером 5-100 мкм, составляющих не менее 90% от общего количества частиц в суспензии.
Совокупность приведенных выше существенных признаков приводит техническому результату, заключающемуся в пролонгированном высвобождении анастрозола из суспензии микрочастиц указанного размера при их внутримышечном введении, что обеспечивает длительное поддержание терапевтической концентрации анастрозола в крови и снижение уровня эстрогенов в крови до терапевтически эффективных значений на протяжении не менее чем 14 дней. Описанный технический результат достигается по совокупности всех существующих признаков созданного лекарственного средства.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлено распределение частиц по размерам суспензии образца лекарственного средства. По оси абсцисс - диаметр частиц, мкм; по оси ординат - относительные содержания фракций, %.
На фиг. 2 представлен профиль высвобождения анастрозола из суспензии лекарственного средства в (PBS) при рН (7.5±0.1) и 37°С.
Осуществление и примеры реализации изобретения
Для получения заявляемого лекарственного средства в виде инъекционной лекарственной формы в первую очередь необходимо было разработать технологически приемлемые режимы получения эмульсии типа масло/вода.
3
В ходе экспериментальных исследований был отобран способ получения продукта с использованием в качестве органического растворителя хлористого метилена (метиленхлорид). Для получения частиц использовали сополимер молочной и гликолевой кислот - PLGA-COOH 50/50, характеристическая вязкость 0.18 см/г. Был использован двухкомпонентный стабилизатор эмульсии, содержащий поливиниловый спирт и водорастворимую метилцеллюлозу. Примененный стабилизатор позволил получить частицы, средний размер которых находится в микронном диапазоне.
Полученный препарат представляет собой лиофилизат для приготовления суспензии для внутримышечного введения пролонгированного действия. Лиофилизат предлагется использовать в виде дозированной лекарственной формы. Особенностью технологии получения является использование стерилизации гамма-излучением, которая проводится после стадий дозирования и укупорки.
Подробное описание получения лекарственного средства, представлено ниже в примере 1.
Были подобраны условия технологического процесса, позволяющие стабильно и с высоким выходом получать лиофилизат со следующими основными характеристиками: содержание анастрозола 10÷15%, средний размер частиц в диапазоне 5-100 мкм (для 90% частиц), пролонгированное высвобождение действующего вещества, проходимость восстановленной суспензии через иглу 0.8 мм ×40 мм. Содержание остаточного растворителя (метиленхлорида) в лекарственном средстве соответствует требованиям Государственной фармакопеи (Государственная Фармакопея Российской Федерации. XIII издание. Т. 1, 2, 3 // Москва, 2015 (электронная версия) - допустимое содержание метиленхлорида в образце не больше 600 ppm.
Для внутримышечного введения лекарственного средства необходимо добавление в флакон с лиофилизатом фармакологически приемлемого растворителя с последующим переводом содержимого флакона в суспензию. В качестве растворителя предлагается использовать физиологический раствор - коммерчески доступный стерильный 0.9% раствор натрия хлорида для инъекций в ампулах 2 мл, 5 мл, 10 мл. Состав растворителя на 1 г: вода для инъекций - 0.991 г; натрия хлорид - 0.009 г. Для получения суспензии предлагается добавить к лиофилизату физиологический раствор при соотношении 1:15-1:30 по массе и встряхивание в течение 1-2 минут. Подробное описание приготовления суспензии лиофилизата лекарственного средства, представлено ни же в примере 2.
Размер частиц определяли методом лазерной дифракции света, который широко применяется для определения размеров частиц в суспензиях. Полученные частицы имели микронные размеры - средний диаметр 90% частиц из диапазона 5-100 мкм. Пример изображения распределения частиц по размерам суспензии лекарственного средства в графическом виде приведён на фиг. 1.
На фиг. 2 представлены результаты эксперимента по изучению профиля высвобождения анастрозола из суспензии лекарственного средства в фосфатно-солевом буферном растворе (PBS) при рН (7.5±0.1) и 37°С по данным нескольких опытов. Испытания проводили в соответствии с требованием нормативного документа (Государственная Фармакопея Российской Федерации. XIII издание. Т. 1, 2, 3 // Москва, 2015 (электронная версия), используя аппарат типа «лопастная мешалка». Определение количества анастрозола, перешедшее в раствор за определенные промежутки времени проводили путём отбора проб с последующим их анализом методом ВЭЖХ. Как видно из фиг. 2, в данных условиях наблюдается длительное высвобождения анастрозола в раствор. Приведенный профиль высвобождения характеризуется наличием начальной фазы достаточно быстрого высвобождения на 1 сутки эксперимента, после чего скорость высвобождения замедляется. Высвобождение анастрозола длится до 21 суток, достигая значения 98.9% от взятого в опыт. В соответствии с общепринятыми представлениями высвобождение активного вещества из полимерной матрицы (релиз) происходит разными способами: в результате его десорбции с поверхности частиц (начальная фаза быстрого высвобождения); диффузии из объема частиц, с последующей десорбцией; в результате деградации полимера. Эти процессы протекают с разными скоростями, что и приводит в итоге к замедленному высвобождению анастрозола из полимерных микрочастиц.
Для исследования динамики изменения концентрации анастрозола после внутримышечного введения суспензии лекарственного средства проводился модельный эксперимент in vivo на мышах. Подробное описание эксперимента, представлено ниже в примере 3.
Проводилось однократное внутримышечное введение лекарственного средства с последующим отбором образцов крови на 1, 7, 14 сутки. В качестве препарата сравнения использовалась пероральная лекарственная форма анастрозола (таблетки, 1 мг) в общепринятой терапевтической дозе 1 мг (Аримидекс. Регистр лекарственных средств России, www.rlsnet.ru; R.A. Yates, М. Dowsett, G.V. Fisher, A. Selen, and P.J. Wyld Arimidex (ZD1033): a selective, potent inhibitor of aromatase in postmenopausal female volunteers // Br. J. Cancer. - 1996 Feb. - V. 73 (4). - P. 543-548), а также в дозе 10 мг (с учетом межвидового пересчета на мышей дозы составили 0.2 и 2 мг/кг). С учетом характеристик высвобождения анастрозола в системе in vitro (профиль высвобождения анастрозола в фосфатно-солевом буферном растворе), а также того, что однократное введение разработанного лекарственного средства должно обеспечить поддержание терапевтической концентрации в течение не менее 14 дней для модельного эксперимента выбраны дозировки лекарственного средства, превышающие однократную минимальную терапевтическую дозу пероральной лекарственной формы анастрозола (1 мг) в 10, 20 и 40 раз, что составляет 10 мг, 20 мг и 40 мг, или с учетом межвидового пересчета на мышей - 2 мг/кг, 4 мг/кг и 8 мг/кг. Концентрация анастрозола в крови после внутрижелудочного введения пероральной лекарственной формы анастрозола в терапевтической дозе 0.2 мг/кг через 24 часа составляла 6.1±0.85 нг/мл, на 7 и 14 сутки - препарат не определялся в крови. При введении препарата сравнения в дозе 2 мг/кг наблюдался резкий подъем, а затем резкое падение концентрации ниже терапевтических значений (1 сутки - 52.6±5.4 нг/мл, 7 сутки - 5.5±0.43 нг/мл, 14 сутки - 2.3±0.22 нг/мл). В группах с внутримышечным введением разработанного лекарственного средства резких колебаний плазменной концентрации не выявлено и на всем протяжении эксперимента до 14 дня уровень концентрации анастрозола находился в диапазоне терапевтических значений. При дозах 2 мг/кг концентрация анастрозола на 1, 7 и 14 сутки составила - 10.35±0.88 нг/мл, 6.9±0.55 нг/мл, 4.2±0.62 нг/мл; при дозе 4 мг/кг - 15.45±0.86 нг/мл, 10.69±1.35 нг/мл, 6.85±0.85 нг/мл, при дозе 8 мг/кг - 25.7±2.55 нг/мл, 15.4±2.02 нг/мл, 9.97±0.85. Таким образом, в отличие от применения пероральной формы анастрозола при которой наблюдаются резкие колебания плазменной концентрации, отрицательно влияющие на безопасность его применения, при внутримышечном введении разработанного лекарственного средства наблюдается отсутствие резких колебаний концентрации анастрозола в крови и его пролонгированное нахождение в терапевтическом диапазоне концентраций на протяжении 14 суток после однократного введения.
Механизм гормонального действия действия анастрозола, являющегося высокоселективным ингибитором ароматазы (биомишень), чей эффект связан с ингибированием ароматазы в периферических тканях, что приводит к снижению уровня эстрадиола, а в свою очередь снижение уровня циркулирующего эстрадиола оказывает терапевтический эффект при эстрогенозависимых опухолях молочной железы у женщин в постменопаузном периоде. Учитывая механизм действия анастрозола проводилось изучение гормонального действия разработанного лекарственного средства in vivo по определению уровня эстрогенов в крови - эстрадиола и эстрона. В ходе исследования воспроизводили состояние экспериментальной менопаузы на мышах-самках линии BALB/c (операция овариоэктомии), с контролем снижения уровня эстрогенов. Подробное описание эксперимента, представленониже в примере 4.
В таблице представлены результаты определения концентрации эстрогенов в сыворотке овариоэктомированных мышей на 2, 7 и 14 сутки после внутримышечного введения разработанного лекарственного средства в дозе 2 мг/кг и 4 мг/кг и внутрижелудочного введения препарата сравнения - пероральной лекарственной формы анастрозола в дозе 2 мг/кг.
Показано, что внутримышечное введение разработанного лекарственного средства в дозах 2 мг/кг и 4 мг/кг вызывает длительное снижение уровня эстрадиола на 70-80% и эстрона на 90-99%. Внутрижелудочное введение препарата сравнения в дозе 2 мг/кг приводило к меньшему снижению уровня эстрогенов по сравнению с внутримышечным введением разработанного лекарственного средства в аналогичной дозе: на 2-7 дни мониторинга снижение уровня эстрадиола составило - 75-85% и эстрона - 85%, а на 14 день - 50% для эстрадиола и 31% для эстрона. Таким образом, внутримышечное введение разработанного лекарственного средства позволяет добиваться более длительного снижения уровня эстрогенов до значений, обеспечивающих терапевтический эффект (снижение не менее 70-80%) (Анастрозол (Anastrozole). Регистр лекарственных средств России, www.rlsnet.ru; Geisler J., Haynes В., Anker G., Dowsett M.,  P.E. Influence of letrozole and anastrozole on total body aromatization and plasma estrogen levels in postmenopausal breast cancer patients evaluated in a randomized, cross-over study // J. Clin. Oncol. - 2002, Feb 1. - V. 20 (3). - P. 751-757) - в течение как минимум 14 дней, чего не наблюдается в случае внутрижелудочного введения препарата сравнения, приводящего к терапевтически значимому снижению на протяжении 7 дней с последующим уменьшением этого эффекта к 14 дню. Полученные результаты свидетельствует о пролонгированном действии разработанного лекарственного средства.
Предлагаемое изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами.
Пример 1. Получение лекарственного средства.
В стеклянном сосуде вместимостью 125 мл взвешивали 25.00 г смеси 2% раствора поливинилового спирта и 2% раствора метилцеллюлозы в воде очищенной. При перемешивании на магнитной мешалке добавляли в эту смесь по каплям раствор 0.2005 г субстанции анастрозола и 0.7506 г сополимер молочной и гликолевой кислот (полимер PLGA-COOH 50/50) в 4 мл метиленхлорида в течение 15 мин. Эмульсию перемешивали еще 25 мин.
В 3-гордую круглодонную колбу вместимостью 0.5 л, снабжённую лопастной мешалкой и термометром, загружали 400 мл воды очищенной и при перемешивании охлаждали до 2÷4°С в бане со смесью воды и льда. В охлажденную воду при перемешивании пипеточным дозатором постепенно добавляли полученную эмульсию порциями по 4 мл в течение 10 мин. Остатки смеси смывали водой. Смесь перемешивали при охлаждении в течение 20 ч, осуществляя при этом продувку воздуха через боковое горло колбы.
Полученную смесь переливали в круглодонную колбу вместимостью 1 л, остатки смывали водой. Проводили упаривание остаточного количества метиленхлорида на роторном испарителе в вакууме водоструйного насоса в режиме: при комнатной температуре - 20 мин, при 25°С в бане - 20 мин и до 45 мин - при 35°С. Суспензию разливали в пластиковые центрифужные флаконы, остатки смывали водой. Помещали флаконы в ротор центрифуги, проводили осаждение суспензии при скорости 10 тыс. об/мин и температуре 4°С в течение 10 мин. Надосадочную жидкость декантировали. К осадку в один из флаконов добавляли достаточное количество воды, перемешивали и переносили суспензию во второй флакон. Остатки осадка смывали водой несколько раз для полноты смыва. Суспензию в флаконе перемешивали в течение 10 мин на магнитной мешалке до получения однородной смеси. Суспензию перегружали в грушевидную колбу вместимостью 250 мл, содержащую раствор 0.1003 г D-маннитола в 2 мл воды. Остатки суспензии в колбу для упаривания смывали водой. Замораживали смесь в бане с жидким азотом. Процесс высушивания проводили на сублимационной сушилке при остаточном давлении 0.03÷0.1 мБар и комнатной температуре в помещении в течение 48 ч. Лиофилизат тщательно перемешивали в колбе и выгружали в пластиковый контейнер. Выход продукта составил 75.5% от общей массы взятых ингредиентов: анастрозола, полимера и D-маннитола.
По результатам ранее выполненного количественного определения содержания анастрозола в полученном лиофилизате рассчитывали навеску для получения одной дозы препарата. Флаконы с лиофилизатом укупоривали и после этого стерилизовали гамма-излучением.
Пример 2. Приготовление суспензии лиофилизата лекарственного средства для внутримышечного введения.
Флакон с лиофилизатом с нужной дозировкой извлекают из холодильника, где он хранился при +2…+6°С и выдерживают при комнатной температуре до приобретения содержимым флакона комнатной температуры. С помощью шприца с иглой внутрь флакона вводят необходимое количество 0,9% раствора натрия хлорида, которое подбирается таким образом, чтобы соотношение лиофилизата и растворителя по массе составляло 1:15-1:30.
Надавливая на поршень шприца, во флакон вводят весь объем 0,9% раствора хлорида натрия, добиваясь того, чтобы вводимый раствор размывал лиофилизат во флаконе. Затем встряхивают содержимое флакона в течение 1-2 минут до получения однородной, слегка пенящейся суспензии молочно-белого цвета. Содержимое флакона повторно отбирают в шприц и сразу после этого проводят внутримышечную инъекцию.
Пример 3. Исследование динамики изменения концентрации анастрозола после внутримышечного введения суспензии лекарственного средства в модельном эксперименте in vivo на мышах
Для исследование динамики изменения концентрации анастрозола проводился модельный эксперимент in vivo на мышах линии BALB/c с внутримышечным введением суспензии разработанного лекарственного средства в дозах 2, 4 и 8 мг/кг (группы по 5 животных на каждую дозу) и внутрижелудочным введением препарата сравнения (пероральная лекарственная форма анастрозола в таблетках дозировкой 1 мг) и последующим отбором крови через 0, 1, 7, 14 суток после введения препаратов. Сформированы группы по 5 животных в группе. На каждую временную точку проводили отбор крови у 5 животных. Пробы крови мышей отбирали из ретроорбитального синуса при помощи гематокритного капилляра в пластиковые центрифужные пробирки типа «эппендорф» в объеме, достаточном для получения 0,1 мл плазмы. Из крови готовили плазму обычным способом: кровь, собранную в пластиковые пробирки предварительно обработанные гепарином (5000 МЕ/мл), далее центрифугировали в течение 10 минут при 3000 об/мин, отбирали плазму и сразу замораживали полученную плазму при -20°С до исследования. Пробоподготовку биообразцов плазмы крови проводили следующим образом: к 50 мкл исследуемой плазмы, помещенной в центрифужные пробирки вместимостью 2 мл, прибавляли 950 мкл ацетонитрила, встряхивали на встряхивателе типа вортекс, затем центрифугировали в течение 10 мин при 15000 об/мин, после чего отбирали 800 мкл надосадочной жидкости, которую переносили в виалы для хроматографа. Количественное определение анастрозола в образцах плазмы мышей методом ВЭЖХ-МС. Предварительно проводили хроматографический анализ модельных растворов стандартного образца анастрозола в плазме крови мышей и по полученным значениям строили калибровочный график, с помощью которого проводили количественное определение анастрозола в опытных образцах плазмы мышей.
Пример 4. Изучение гормонального действия лекарственного средства в модельном эксперименте in vivo на мышах
Для изучения гормонального действия лекарственного средства в модельном эксперименте in vivo на первом этапе воспроизводили состояние экспериментальной менопаузы на мышах-самках линии BALB/c (операция овариоэктомии) Операцию овариоэктомии проводили в соответствии с рекомендациями Киршенблата Я.Д., 1969 (Киршенблат Я.Д. Практикум по эндокринологии / под ред. Я.Д. Киршенблат // М.: Высш. шк. 1969. - С. 55-57). В после операционный период проводили контроль снижения уровня эстрогенов. На 28 день после операции овариоэктомии мышей проводили введение препаратов - внутримышечное введения разработанного лекарственного средства в дозе 2 мг/кг и 4 мг/кг и внутрижелудочное введение препарата сравнения - пероральной лекарственной формы анастрозола в дозе 2 мг/кг. Определения концентрации эстрогенов (эстрадиол и эстрон) в сыворотке овариоэктомированных мышей проводили на 2, 7 и 14 сутки после введения. На каждую временную точку проводили отбор крови и исследование гормонов у 5 животных. Сыворотку готовили обычным способом: проводили инкубацию в течение 40 минут при 37 градусах в термостате для образования сгустка, проводили центрифугирование при 2500 об/мин. в течение 15 минут с использованием лабораторной центрифуги Eppendorf 5417R, отбирали сыворотку (супернатант) и сразу замораживали при -20°С до исследования. Определение уровня эстрадиола, эстрона в сыворотке крови мышей проводили с использованием метода иммуноферментного анализа в соответствии с инструкциями фирм-производителей ИФА наборов.
Таким образом, по совокупности всех полученных результатов испытаний лекарственное средство пролонгированного действия на основе анастрозола, содержащее также сополимер молочной и гликолевой кислот, D-маннитол, поливиниловый спирт, метилцеллюлозу виде лиофилизата для приготовления суспензии (размером частиц суспензии 5-100 мкм) для внутримышечного введения показало пролонгированное высвобождение анастрозола из суспензии микрочастиц указанного размера при их внутримышечном введении, что обеспечивает длительное поддержание терапевтической концентрации анастрозола в крови и снижение уровня эстрогенов в крови до терапевтически эффективных значений на протяжении не менее чем 14 дней.