ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ РЕГУЛИРОВАНИЯ САХАРА И ЖИРА В КРОВИ, ЕЕ ПОЛУЧЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ
PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR BLOOD SUGAR AND FAT CONTROL, ITS MANUFACTURING AND ADMINISTRATION THEREOF

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для регулирования сахара и жира в крови, в частности к фармацевтической композиции, полученной из китайских лекарственных растений или их экстрактов, применяемых в качестве активных компонентов, к способу получения фармацевтической композиции и к применению фармацевтической композиции для лечения сахарного диабета и его осложнений.
Уровень техники
Сахарный диабет, обычное метаболическое заболевание, связанное с эндокринными железами, встречается во всем мире и проявляет тенденцию к постепенному увеличению. В настоящее время распространение сахарного диабета в Китае составляет до 1,5%. Китай имеет вторую по численности группу населения из диабетиков в мире, и эта группа увеличивается при скорости удвоения за 15 лет. Среди популяции диабетиков основная часть диабетиков страдает сахарным диабетом типа II. После появления инсулинорезистентности (т.е. состояния, при котором нормальная доза инсулина вызывает более низкий уровень биологического действия, чем нормальное действие), толерантность к глюкозе сохраняется или незначительно ослабляется, пока поджелудочная железа может поддерживать достаточную секрецию инсулина для преодоления инсулинорезистентности. После того как начинает проявляться недостаточность функции бета-клеток, толерантность к глюкозе быстро ухудшается и развивается сахарный диабет. Инсулинорезистентность является важным патогенным фактором сахарного диабета типа II, и нарушение метаболизма сахара обычно сопровождается нарушением метаболизма жира. Таким образом, это является ключевой точкой для лечения сахарного диабета, чтобы ослабить инсулинорезистентность, регулировать нарушение метаболизма сахара и жира и предотвратить появление осложнений.
В настоящее время большинство доступных традиционных лекарственных продуктов действуют посредством механизма пополнения Qi и снабжения Yin и активации циркуляции крови для диссипации кровяного стаза и оказывают значительное влияние на снижение уровня сахара крови, но проявляют менее сильные действия по снижению жира крови и исправлению нарушения метаболизма жира при сахарном диабете при лечения сахарного диабета типа II. Лечение посредством механизма пополнения Qi и снабжения Yin и диссипации слизи и драгирования коллатералей редко применяют при лечении сахарного диабета типа II, но такое лечение может оказывать значительные действия по исправлению нарушения метаболизма жира при сахарном диабете типа II, наряду с тем, что снижает уровень сахара крови.
Раскрытие изобретения
Одной задачей настоящего изобретения является обеспечение новой фармацевтической композиции для регуляции сахара и жира в крови.
Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение способа изготовления фармацевтической композиции настоящего изобретения.
Еще одной задачей настоящего изобретения является обеспечение способа лечения сахарного диабета и его осложнений с применением фармацевтической композиции настоящего изобретения или применение фармацевтической композиции настоящего изобретения при изготовлении лекарственного средства для лечения сахарного диабета и его осложнений.
Авторы настоящего изобретения после длительных экстенсивных исследований установили, что может быть обеспечена фармацевтическая композиция для регуляции уровня сахара и жира в крови, ослабления инсулинорезистентности и эффективной профилактики и лечения сахарного диабета и его осложнений, использующая механизм пополнения Qi и снабжения Yin и диссипации слизи и драгирования коллатералей. Задачи, указанные выше, достигаются на основе вышеуказанного открытия.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для регуляции уровня сахара и жира в крови, состоящей из следующих китайских лекарственных растений или их экстрактов в массовых частях: 5-17 Ligustrum lucidum (бирючины блестящей, Fructus Ligustri lucidui), 3-12 Mongolian mikvetch root (корня монгольского астрагала, Radix Astragali Mongolici), 1-5 Chinese goldthread rhizome (ризомы коптиса китайского, Rhizoma Coptidis), 1-5 семян личи китайской (нефелиума, Semen Litchi), 1-6 ламинарии (Thallus Laminariae Japonicae) и 1-6 Common turmeric rhizome (ризомы куркумы длинной, Rhizoma Curcumae Longae).
Настоящее изобретение предпочтительно относится к фармацевтической композиции для регуляции сахара и жира в крови, состоящей из следующих китайских лекарственных растений или их экстрактов в массовых частях: 8-15 Ligustrum lucidum (бирючины блестящей), 4-10 Mongolian mikvetch root (корня астрагала монгольского), 2-3 Chinese goldthread rhizome (ризомы коптиса китайского), 3-4 семян личи китайской, 3-5 ламинарии и 3-5 Common turmeric rhizome (ризомы куркумы длинной).
Наиболее предпочтительно, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для регуляции сахара и жира в крови, состоящей из следующих китайских лекарственных растений или их экстрактов в массовых частях: 8 Ligustrum lucidum (бирючины блестящей), 4 Mongolian mikvetch root (корня астрагала монгольского), 2 Chinese goldthread rhizome (ризомы коптиса китайского), 4 семян личи китайской, 3 ламинарии и 3 Common turmeric rhizome (ризомы куркумы длинной).
В фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению каждое из китайских лекарственных растений можно заменить их экстрактами в растворителе, активными фракциями или активными ингредиентами, где экстракты могут быть спиртовыми экстрактами, водными экстрактами или эфирными маслами. Например, фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может содержать спиртовый экстракт Ligustrum lucidum (бирючины блестящей), спиртовый экстракт Mongolian mikvetch root (корня астрагала монгольского), спиртовый экстракт Chinese goldthread rhizome (ризомы коптиса китайского), эфирное масло Common turmeric rhizome (ризомы куркумы длинной), водный экстракт Common turmeric rhizome (ризомы куркумы длинной), водный экстракт семян личи китайской и водный экстракт ламинарии в эффективных количествах для лечения или ослабления симптомов сахарного диабета и его осложнений.
Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать любые фармацевтически приемлемые вспомогательные средства, такие как декстрин, предпочтительно бета-декстрин.
В фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению отдельные китайские лекарственные растения могут быть заменены или добавлены/исключены согласно народным китайским медицинским теориям, и количества ингредиентов могут варьироваться. Например ламинария может отсутствовать или может быть заменена морской капустой (Laminaria japonica aresch) или морской водорослью (Thallus Sargassi Pallidi) и Common turmeric rhizome (ризома куркумы длинной) может отсутствовать или может быть заменена корневыми клубеньками wenchow куркумы длинной (Radix Curcumae Wenyujin) или ризомой синей куркумы (Rhizoma Curcumae Phaeocaulis).
Следовательно, настоящее изобретение относится также к фармацевтической композиции для регуляции сахара и жира в крови, состоящей из следующих китайских лекарственных растений или их экстрактов в массовых частях: 5-17 Ligustrum lucidum (бирючины блестящей) (Fructus Ligustri Lucidui), 3-12 корня астрагала монгольского (Radix Astragali Mongolici), 1-5 ризомы коптиса китайского (Rhizoma Coptidis) и 1-5 семян личи и фармацевтически приемлемого вспомогательного средства.
Фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению можно изготовить в виде лекарственной формы, обычно применяемой в данной области, вместе с любыми фармацевтически приемлемыми вспомогательными средствами, такими как таблетки, гранулы или капсулы. Можно применять непосредственно смесь ингредиентов или можно также применять экстракты ингредиентов в растворителе или их смеси.
Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению образует пятна такого же цвета, как и пятна контроля, в соответствующих положениях при тестировании с применением тонкослойной хроматографии, описанной в Part I, Annex VIB of the Pharmacopoeia of the People's Republic of China, 2005 ed., и с применением олеаноловой кислоты, гидрохлорида берберина, астрагалозида IV и протокатеховой кислоты в качестве контролей, соответственно. Применяют следующую специфическую идентификацию.
(1) Взвешивают 2 г фармацевтической композиции настоящего изобретения, добавляют 5 мл безводного этанола, полученную смесь обрабатывают ультразвуковыми волнами в течение 25 мин, охлаждают и фильтруют и фильтрат применяют в качестве раствора тест-пробы. Олеаноловую кислоту в качестве контроля растворяют в безводном этаноле с образованием 0,5 мг/мл раствора в качестве контрольного раствора. Согласно тонкослойной хроматографии (Annex VIB), 5 мкл раствора тест-пробы и 10 мкл контрольного раствора наносят в виде пятен на одну пластинку с тонким слоем силикагеля G с натриевой солью карбоксиметилцеллюлозы в качестве адгезива и смесь петролейный эфир-ацетон-метанол (8:2:0,3) применяют в качестве проявляющего растворителя. После окончания проявления пластинку вынимают, сушат на открытом воздухе, опрыскивают 10% раствором серной кислоты в этаноле и нагревают при 80°С до тех пор, пока пятна явно не будут окрашены. Хроматография тест-пробы обнаруживает пятна такого же цвета, что и пятна контроля, в соответствующих положениях хроматографии контроля.
(2) Взвешивают 0,5 г фармацевтической композиции настоящего изобретения, добавляют 5 мл метанола, полученную смесь обрабатывают ультразвуковыми волнами в течение 30 мин, охлаждают и фильтруют и фильтрат дополняют метанолом до 5 мл и применяют в качестве раствора тест-пробы. Гидрохлорид берберина в качестве контроля растворяют в метаноле с образованием 0,1 мг/мл раствора в качестве контрольного раствора. Согласно тонкослойной хроматографии (Annex VIB), 2 мкл раствора тест-пробы и 2 мкл контрольного раствора наносят в виде пятен на одну пластинку с тонким слоем силикагеля G с натриевой солью карбоксиметилцеллюлозы в качестве адгезива и смесь бензол-этилацетат-изопропанол-метанол-вода (6:3:1,5:1,5:0,3) применяют в качестве проявляющего растворителя. После окончания проявления в ванне для проявления, насыщенной газообразным аммиаком, пластинку вынимают, сушат на открытом воздухе и визуально исследуют в УФ-свете (365 нм). Хроматография тест-пробы обнаруживает флуоресцентные пятна такого же цвета, что и пятна контроля в соответствующих положениях хроматографии контроля.
(3) Взвешивают 6 г фармацевтической композиции настоящего изобретения, добавляют 20 мл раствора 2% NaOH в метаноле, полученную смесь нагревают при кипячении с обратным холодильником в течение 40 мин, охлаждают и фильтруют, фильтрат упаривают досуха, остаток растворяют в 30 мл воды и раствор экстрагируют насыщенным водой н-бутанолом три раза (30 мл, 20 мл и 20 мл). Слои н-бутанола объединяют, промывают дважды водой каждый раз по 20 мл и после удаления водных слоев промывают один раз 1% раствором дигидрофосфата калия. Водный слой удаляют, слой н-бутанола упаривают досуха и полученный остаток растворяют в 5 мл метанола с образованием раствора образца для тестирования. Астрагалозид IV в качестве контроля растворяют в метаноле с образованием 0,3 мг/мл раствора в качестве контрольного раствора. Согласно тонкослойной хроматографии (Annex VIB), 10-15 мкл раствора тест-пробы и 10-15 мкл контрольного раствора наносят в виде пятен на одну пластинку с тонким слоем силикагеля G с натриевой солью карбоксиметилцеллюлозы в качестве адгезива, смесь хлороформ-метанол-вода (20:7:2) применяют в качестве проявляющего растворителя. После окончания проявления пластинку вынимают, сушат на открытом воздухе, опрыскивают 10% раствором серной кислоты в этаноле и нагревают при 80°С до тех пор, пока пятна явно не будут окрашены. Хроматография тест-пробы обнаруживает пятна такого же цвета, что и пятна контроля, в соответствующих положениях хроматографии контроля.
(4) Взвешивают 3 г фармацевтической композиции настоящего изобретения, добавляют 50 мл воды, полученную смесь нагревают при кипячения с обратным холодильником в течение 1 час, охлаждают и фильтруют, рН фильтрата регулируют 10% HCl до рН 2, подкисленный раствор экстрагируют этиловым простым эфиром три раза по 15 мл каждый раз, слои этилового эфира объединяют и этиловый эфир удаляют. Полученный остаток растворяют в 1 мл метанола с получением раствора тест-пробы. Протокатеховую кислоту в качестве контроля растворяют в метаноле с образованием 0,2 мг/мл раствора в качестве контрольного раствора. Согласно тонкослойной хроматографии (Annex VIB), 10 мкл раствора образца для тестирования и 8 мкл контрольного раствора наносят в виде пятен на одну пластинку с тонким слоем диоксида кремния G с натриевой солью карбоксиметилцеллюлозы в качестве адгезива, смесь толуол-этилацетат-муравьиная кислота (12:6:1) применяют в качестве проявляющего растворителя. После окончания проявления пластинку вынимают, сушат на открытом воздухе и визуально изучают в УФ-свете (254 нм). Хроматография тест-пробы обнаруживает пятна такого же цвета, что и пятна контроля, в соответствующих положениях хроматографии контроля.
Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению содержит олеаноловую кислоту и урсоловую кислоту в количествах не менее 0,4 мг и 1,0 мг соответственно при тестировании с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии, описанной в Part I, Annex VI D of the Pharmacopoeia of the People's Republic of China, 2005 ed., и с применением олеаноловой кислоты и урсоловой кислоты в качестве контролей соответственно. Специфическое детектирование проводят следующим образом.
30
48
3
Связанный с октадецилсиланом силикагель применяют в качестве наполнителя-адсорбента; смесь метанол-0,05% фосфорная кислота в воде (90:10) применяют в качестве подвижной фазы, и длина волны для детектирования равна 215 нм. Число теоретических тарелок не меньше 3000, вычисляемое с применением олеаноловой кислоты. Подходящие количества олеаноловой кислоты и урсоловой кислоты в качестве контролей точно взвешивают и растворяют в ацетонитриле с образованием раствора 0,20 мг/мл олеаноловой кислоты и раствора 0,15 мг/мл урсоловой кислоты в качестве контрольных растворов соответственно. Фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению измельчают однородно по содержанию частиц измельчения, точно взвешивают 0,8 г и добавляют 20 мл метанола. Образовавшуюся смесь нагревают при кипячении с обратным холодильником в течение 45 мин, охлаждают и переносят в мерную колбу на 50 мл. Применяют небольшое количество метанола для промывания контейнера и остатка и промывочные жидкости переносят в ту же самую мерную колбу. Раствор в мерной колбе перемешивают для достижения гомогенности и фильтруют с применением микропористой фильтрующей мембраны (0,45 мкм) и фильтрат применяют в качестве раствора тест-пробы. 15 мкл каждого из контрольных растворов и 10 мкл раствора тест-пробы вводят впрыскиванием в прибор для хроматографии в жидкой фазе и детектируют, показывая, что фармацевтическая композиция настоящего изобретения содержит олеаноловую кислоту (СНО) не меньше 4,0 мг.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения фармацевтической композиции настоящего изобретения, причем способ содержит следующие стадии:
экстракцию Ligustrum lucidum (бирючины блестящей) этанолом нагреванием при кипячении с обратным холодильником несколько раз, объединение растворов экстракта в этаноле, удаление этанола и сушку экстракта для хранения в качестве заготовки;
экстракцию Common turmeric rhizome (ризомы куркумы длинной) дистилляцией с водяным паром, сбор эфирного масла, водного раствора и остатка для хранения в качестве заготовки;
смешивание полученного эфирного масла с циклодекстрином и водой, перемешивание смеси, замораживание, фильтрование, криосушку полученного комплекса с включением, пульверизацию для хранения в качестве заготовки;
отваривание семян личи и ламинарии с водой несколько раз, объединение растворов отваривания, фильтрование, объединение фильтрата и указанного выше водного раствора ризомы куркумы длинной, концентрирование, добавление спирта, замораживание, фильтрование для получения раствора после отваривания с водой и осаждения спиртом для хранения в качестве заготовки и
экстракцию ризомы контиса китайского, корня астрагола монгольского и указанного выше остатка Common turmeric rhizome (куркумы длинной) спиртом нагреванием при кипячении с обратным холодильником несколько раз, объединение растворов спиртовых экстрактов, объединение с указанным выше раствором после отваривания с водой и осаждения спиртом, удаление спирта, сушку, гомогенное смешивание с указанным выше экстрактом Ligustrum lucidum (бирючины блестящей) и циклодекстрина с комплексом с включением Common turmeric rhizome (ризомы куркумы длинной), если нужно, смешивание с фармацевтически приемлемыми вспомогательными средствами с образованием требуемых лекарственных форм.
Стадии и условия способа получения согласно настоящему изобретению можно оптимизировать согласно следующим экспериментальным результатам.
1. Оптимизация условий для экстракции и включения в комплекс эфирного масла Common turmeric rhizome (ризомы куркумы длинной).
1.1. Влияние степени измельчения на количество экстракта эфирного масла Common turmeric rhizome (ризомы куркумы длинной) и определение времени для экстракции эфирного масла.
Взвешивали две части Common turmeric rhizome (ризомы куркумы длинной) (100 г для каждой части), спецификациями двух частей для отваривания были соответственно кусочки ризомы куркумы и измельченная ризома куркумы с размером частиц 10 меш. Добавляли 10-кратное количество воды, соответственно, и эфирные масла экстрагировали дистилляцией с водяным паром. Результаты показаны в таблице 1.
Таблица 1
Исследование влияния времени и степени измельчения на экстракции эфирного масла из Common turmeric rhizome (ризомы куркумы длинной)
Время экстракции (час)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Выход, отвар кусочков (мл)
0,4
0,8
1,0
1,2
1,4
1,5
1,6
1,95
2,0
Выход, 10 меш (%)
1,4
2,2
3,1
3,6
3,8
4,1
4,4
4,6
4,7
Указанные выше результаты показывают, что степень измельчения оказывает значительное влияние на выход эфирного масла из Common turmeric rhizome (ризомы куркумы длинной). Таким образом, для экстракции эфирного масла из ризомы куркумы длинной необходима подходящая степень измельчения. Для гарантии того, что при получении не происходит спекания, выбирают степень измельчения Common turmeric rhizome (ризомы куркумы длинной) 10 меш. Выход эфирного масла из Common turmeric rhizome (ризомы куркумы длинной) с размером частиц 10 меш был 4,7 мл при экстракции 9 час, 4,6 мл при экстракции 8 час, таким образом, выход 97% был достигнут за 8 час. Следовательно, время для экстракции эфирного масла Common turmeric rhizome (ризомы куркумы длинной) определили как 8 час.
1.2 Влияние вымачивания на количество экстрагированного эфирного масла
Взвешивали две части Common turmeric rhizome (ризомы куркумы длинной) (100 г каждой части), где одну часть непосредственно экстрагировали без вымачивания, тогда как другую часть вымачивали в течение 2 час перед экстракцией. Результаты показаны в таблице 2.
Таблица 2
Влияние вымачивания на экстракцию эфирного масла из Common turmeric rhizome (ризомы куркумы длинной)
Время экстракции (час)
1
2
3
4
5
6
7
8
Вымачивание (мл)
0,4
1,4
1,9
2,2
2,6
2,8
3,2
3,4
Без вымачивания (мл)
1,4
2,2
3,1
3,6
3,8
4,1
4,4
4,6
Указанные выше результаты показывают, что влияния вымачивания на количество экстрагированного эфирного масла из Common turmeric rhizome (ризомы куркумы длинной) были незначительными. Следовательно, для экстракции эфирного масла из Common turmeric rhizome (ризомы куркумы длинной) с частицами 10 меш вымачивание не требуется.
2. Влияние количества воды на экстракцию эфирного масла из Common turmeric rhizome (ризомы куркумы длинной)
Таблица 3
Влияние количества воды на экстракцию эфирного масла из Common turmeric rhizome (ризомы куркумы длинной)
Время экстракции (час):
1
2
3
4
5
6
7
8
8-кратное количество воды
1,4
1,9
2,3
2,7
3,3
3,6
3,9
4,1
10-кратное количество воды
1,4
2,3
3,1
3,6
3,8
4,1
4,4
4,6
12-кратное количество воды
1,3
2,3
2,8
3,3
3,7
3,9
4,3
4,6
Указанные выше результаты показывают, что выходы эфирного масла из Common turmeric rhizome (ризомы куркумы длинной) были выше с 10-кратным количеством воды и 12-кратным количеством воды, применяемыми при экстракции, чем с 8-кратным количеством воды, в то время как выходы с 10-кратным и 12-кратным количеством воды были близкими. Поэтому выбрано 10-кратное количество воды.
В итоге, оптимизированные условия для экстракции эфирного масла из Common turmeric rhizome (ризомы куркумы длинной) являются следующими: применяют Common turmeric rhizome (ризому куркумы длинной) 10 меш и 10-кратное количество воды, эфирное масло из Common turmeric rhizome (ризомы куркумы длинной) экстрагируют дистилляцией с водяным паром и временем для экстракции эфирного масла из Common turmeric rhizome (ризомы куркумы длинной) является 8 час.
3. Оптимизация способа включения в комплекс эфирного масла Common turmeric rhizome (ризомы куркумы длинной)
Включение эфирного масла Common turmeric rhizome (ризомы куркумы длинной) в комплекс проводят использованием 6-кратного количества бета-циклодекстрина и 60-кратного количества воды, перемешиванием при 70°С в течение 1 час, охлаждением на протяжении ночи, фильтрованием и сушкой комплекса включения при низкой температуре (40°С), пульверизацией с получением тонкоизмельченного порошка для хранения в качестве заготовки.
4. Оптимизация условий для экстракции Ligustrum lucidum (бирючины блестящей) спиртом
9
4
Взвешивали 20 г Ligustrum lucidum (бирючины блестящей) в качестве одной пробы, всего приготовили 9 проб. Концентрацию спирта, кратность количества спирта и число спиртовых экстракций применяли в качестве трех факторов, исследованных в ортогональном эксперименте. Каждый из факторов имел три уровня (см. таблицу 4). Экстракцию проводили в течение 2 час для каждого раза. Эксперимент проводили в соответствии с ортогональной схемой L(3). Содержание олеаноловой кислоты и содержание урсоловой кислоты в Ligustrum lucidum (бирючине блестящей) применяли в качестве наблюдаемых показателей. Изучение факторов и уровней показано в таблице 4. Ортогональный эксперимент и его результаты показаны в таблице 5, и статистическая обработка результатов таблицы 5 показана в таблицах дисперсионного анализа (см. таблицу 6 и таблицу 7).
Таблица 4
Уровни факторов спиртовой экстракции
Уровень
А (концентрация спирта, %)
В (кратность количества спирта)
С (число экстракций спиртом)
1
55
4
1
2
75
5
2
3
95
6
3
Таблица 5
Схема и результаты ортогонального эксперимента
№
А
В
С
D
Содержание олеаноловой кислоты в экстракте (мг/г)
Содержание урсоловой кислоты в экстракте (мг/г)
1
1
1
1
1
2,24
0,42
2
1
2
2
2
4,83
1,02
3
1
3
3
3
7,28
1,90
4
2
1
2
3
7,65
2,17
5
2
2
3
1
8,13
2,19
6
2
3
1
2
6,34
1,97
7
3
1
3
2
6,94
2,12
8
3
2
2
3
6,26
1,99
9
3
3
1
1
7,26
2,58
Олеаноловая кислота:
K1
14,35
16,83
14,84
17,63
K2
22,12
19,22
19,74
18,11
Σ=56,93
К3
20,46
20,88
22,35
21,19
СТ=360,1138777
S
11,1623
2,7633556
9,6913556
2,4878233
Урсоловая кислота:
K1
3,34
4,71
4,38
5,19
K2
6,33
5,2
5,77
5,11
Σ=16,36
К3
6,69
6,45
6,21
6,06
CT=29,73884444
S
2,2546888989
0,53668889
0,60828889
0,18508889
Таблица 6
Таблица дисперсионного анализа для олеаноловой кислоты
Источник
Сумма квадрата
Степень свободы
Средняя сумма квадрата
F-отношение
Значимость
А
11,1623
2
5,58115
4,4868
В
2,7633556
2
1,3816778
1,1108
С
9,6913556
2
4,8456778
3,8955
Ошибка = D
2,4878223
2
1,24391115
F<sub>1-0,05(2,2)</sub>=19
F<sub>1-0,01(2,2)</sub>=99
Таблица 7
Таблица дисперсионного анализа для урсоловой кислоты
Источник
Сумма квадрата
Степень свободы
Средняя сумма квадрата
F-отношение
Значимость
А
2,25468889
2
4,127344445
12,1817
В
0,53668889
2
0,268344445
2,8996
С
0,60828889
2
0,304144445
3,2865
Ошибка = D
0,18508889
2
0,092544445
F<sub>1-0,05(2,2)</sub>=19
F<sub>1-0,01(2,2)</sub>=99
2
3
3
3
3
3
2
2
3
3
Приведенные выше дисперсионные анализы показывают, что все три фактора не имеют значимого различия. Согласно ранговому анализу условия экстракции для олеаноловой кислоты являются АВС и условия экстракции для урсоловой кислоты являются АВС. Поскольку концентрация спирта не оказывает значительное влияние на экстракцию, А является более благоприятным для экстракции олеаноловой кислоты. Таким образом, в конце концов, выбирают АВС, т.е. условия экстракции для Ligustrum lucidum (бирючины блестящей) являются следующими: экстракцию проводят 3 раза, каждую в течение 2 час, с применением 75% этанола в 6-кратном количестве.
5. Оптимизация условий экстракции спиртом для ризомы китайского контиса и корней монгольского астрагала
5.1. Ортогональный эксперимент для ризомы китайского контиса и корней монгольского астрагала
9
4
Взвешивали 15 г ризомы китайского контиса и 30 г корней монгольского астрагала в качестве одной пробы и всего приготовили 9 образцов. Концентрацию спирта, кратность количества спирта и число спиртовых экстракций применяли в качестве трех факторов, исследованных в ортогональном эксперименте. Каждый из факторов имел три уровня (см. таблицу 4). Экстракцию проводили в течение 2 час для каждого раза. Эксперимент проводили согласно ортогональной схеме L(3). Содержание гидрохлорида берберина в ризоме китайского контиса применяли в качестве наблюдаемого показателя. Исследование факторов и уровней показано в таблице 8. Ортогональный эксперимент и его результаты показаны в таблице 9, и статистическая обработка результатов таблицы 9 показана в таблице дисперсионного анализа (см. таблицу 10).
Таблица 8
Уровни факторов спиртовой экстракции
Уровень
А (концентрация спирта, %)
В (кратность количества спирта)
С (число экстракций спиртом)
1
30
4
1
2
50
5
2
3
70
6
3
Таблица 9
Схема и результаты ортогонального эксперимента
№
А
В
С
D
Содержание гидрохлорида берберина в экстракте (мг/г)
1
1
1
1
1
10,86
2
1
2
2
2
17,14
3
1
3
3
3
19,39
4
2
1
2
3
18,58
5
2
2
3
1
21,38
6
2
3
1
2
14,04
7
3
1
3
2
20,71
8
3
2
1
3
13,53
9
3
3
2
1
19,55
К1
47,39
50,15
38,43
51,79
К2
54,00
52,05
55,27
51,89
Σ=155,18
К3
53,79
52,98
61,48
51,50
СТ=2675,648044
S
9,410689
1,387089
94,827889
0,027356
Таблица 10
Таблица дисперсионных анализов для гидрохлорида берберина
Источник
Сумма квадрата
Степень свободы
Средняя сумма квадрата
Отношение
Значимость
А
9,410689
2
4,7053445
344,0082
**
В
1,387089
2
0,6935445
50,7051
*
С
94,827889
2
47,4139445
3466,4384
**
Ошибка = D
0,027356
2
0,013678
F<sub>1-0,10(2,2)</sub>=19
F<sub>1-0,05(2,2)</sub>=99
2
3
3
2
3
3
Приведенный выше дисперсионный анализ показывает, что все три фактора имеют значимые различия. А выбирают для фактора А, В выбирают для фактора В и Свыбирают для фактора С. Поэтому АВС выбрали в качестве оптимальных условий экстракции для гидрохлорида берберина, т.е. экстракция 3 раза, каждый раз в течение 2 час с применением 50% этанола в 6-кратном количестве.
6. Подтверждение ортогонального эксперимента для ризомы китайского контиса и корней монгольского астрагала
Для подтверждения вышеуказанных экспериментальных условий взвешивали ризому китайского контиса и корни монгольского астрагала и пробы экстрактов получали согласно указанным выше оптимальным условиям. Измеряли содержания гидрохлорида берберина экстрактов, результаты показаны в таблице 11.
7. Оптимизация условий для отваривания с водой
9
4
Взвешивали 24 г семян личи и 18 г ламинарии в качестве одной пробы, всего приготовили 9 образцов. Кратность количества воды, время отваривания и число отвариваний применяли в качестве трех факторов, наблюдаемых в ортогональном эксперименте. Каждый из факторов имел три уровня. Эксперимент проводили согласно ортогональной схеме L(3). Содержание протокатеховой кислоты в семенах личи применяли в качестве наблюдаемого индекса. Разработка факторов и уровней показана в таблице 12. Ортогональный эксперимент и его результаты показаны в таблице 13, и статистическая обработка результатов таблицы 13 показана в таблице дисперсионного анализа (см. таблицу 14).
Таблица 12
Факторы и уровни
Уровень
А (кратность количества воды)
В (время отваривания)
С (число отвариваний)
1
6
0,5
1
2
8
1,0
2
3
10
1,5
3
Таблица 13
Схема и результаты ортогонального эксперимента
№
А
В
С
D
Содержание протокатеховой кислоты в экстракте (мг/г)
1
1
1
1
1
2
1
2
2
2
3
1
3
3
3
4
2
1
2
3
5
2
2
3
1
6
2
3
1
2
7
3
1
3
2
8
3
2
1
3
9
3
3
2
1
К1
10,0855
14,619
6,1112
12,4708
К2
13,2996
12,0689
16,009
13,1835
Σ=39,3775
К3
15,9924
12,6896
17,2573
13,7232
CT=172,2875007
S
5,8303421
1,1789848
24,8622492
0,26308030
Таблица 14
Таблица дисперсионного анализа для протокатеховой кислоты
Источник
Сумма квадрата
Степень свободы
Средняя сумма квадрата
F-отношение
Значимость
А
5,8303421
2
2,91517105
22,16183416
*
В
1,1789848
2
0,5894924
4,481463644
С
24,8622492
2
12,4311246
94,50441253
*
Ошибка = D
0,26308030
2
0,13154015
F<sub>1-0,05(2,2)</sub>=19
F<sub>1-0,01(2,2)</sub>=99
3
1
3
3
1
3
Приведенный выше дисперсионный анализ показывает, что факторы А и С имеют значимые различия и фактор В не имеет значимого различия. Таким образом, А выбирают для фактора A, B выбирают для фактора В и С выбирают для фактора С, т.е. АВС. Оптимальные условия для отваривания семян личи и ламинарии являются следующими: экстрагирование 3 раза, каждое в течение 0,5 час с применением воды в 10-кратном количестве.
Фармацевтическую композицию настоящего изобретения изучали на моделях сахарного диабета типа II у крыс. Инсулинорезистентность успешно индуцировали у крыс кормлением крыс кормом с высоким содержанием жира и высоким содержанием сахара в течение до 1 месяца, когда гиперинсулинизм сопровождался повышенным уровнем холестерина и сахара крови. Модели сахарного диабета типа II у крыс устанавливали внутрибрюшинной инъекцией небольшой дозы STZ. После перорального введения настоящей композиции при кормлении в течение последовательных двух месяцев уровень сахара крови у крыс в группе большой дозы настоящей композиции значимо снижался (Р<0,001 в сравнении с модельной группой) и степень снижения уровня сахара крови была 31,23%. Уровень жира крови крыс в группах больших и средних доз значимо снижался (Р<0,05~0,001 в сравнении с модельной группой), соответственно. Таким образом, фармацевтическая композиция настоящего изобретения проявляет действия снижения сахара и жира у крыс, имеющих сахарный диабет типа II.
Модели сахарного диабета с быстрым проявлением заболевания (сахарного диабета типа I) у крыс устанавливали инъекцией STZ. Результаты показали, что после перорального кормления в течение последовательных двух месяцев уровни сахара в крови у крыс во всех группах дозирования значимо снижались (Р<0,05 по сравнению с модельной группой). По сравнению с модельной группой гликозилированный гемоглобин и процент гликозилированного гемоглобина значимо снижались (Р<0,05~0,01) и снижался также глюкагон (Р<0,05) в группе высокой дозы. Хотя уровень инсулина проявлял тенденцию к повышению, и потребление корма снижалось в такой же степени, они не являются статистически значимыми. Таким образом, фармацевтическая композиция настоящего изобретения проявляет действия по снижению уровня сахара в крови у крыс, имеющих быстрое проявление сахарного диабета.
Таким образом, настоящее изобретение далее относится к способу лечения сахарного диабета и его осложнений с применением фармацевтической композиции настоящего изобретения. Альтернативно предложено применение фармацевтической композиции настоящего изобретения при изготовлении лекарственного средства для лечения сахарного диабета и его осложнений.
Осуществление изобретения
Китайские растения, применяемые в нижеследующих экспериментах, были куплены в Angio Trading Market of Chinese herbs, Hebei Province, и все они удовлетворяли соответствующим требованиям, указанным в фармакопее Народной республики Китая, часть первая, издание 2005.
Декстрин был куплен в Langfang Starch Plant, Hebei Province и имел №партии 200308202 и одобренный номер: (1998) №090127. Бета-циклодекстрин был куплен в Fine Chemicals Experimental Plant of Nankai University и имел № партии 20000804. Все другие реагенты были получены коммерческим образом из торгового источника.
Настоящее изобретение дополнительно иллюстрируется, но не ограничивается следующими примерами.
Пример 1: получение фармацевтической композиции (в форме гранул) настоящего изобретения
1. Состав
9 г Ligustrum lucidum (бирючины блестящей); 6 г корня монгольского астрагала; 4,5 г ризомы китайского коптиса; 3 г семян личи; 3 г ламинарии; 3 г ризомы куркумы длинной и декстрин в подходящем количестве.
2. Способ изготовления
Ligustrum lucidum (бирючину блестящую) нагревали с 75% этанолом в 6-кратном количестве при кипячении с обратным холодильником и экстрагировали 3 раза, каждый раз в течение 2 час. Все этанольные экстракты объединяли для хранения в качестве заготовки. Ризому китайского коптиса и корень монгольского астрагала нагревали с 50% этанолом в 6-кратном количестве при кипячении с обратным холодильником и экстрагировали 3 раза, каждый раз в течение 2 час. Все этанольные экстракты объединяли для хранения в качестве заготовки. Ризому куркумы длинной дробили на мелкие кусочки, добавляли воду в 10-кратном количестве, проводили экстракцию дистилляцией с водяным паром в течение 8 час и эфирное масло, водный раствор и остаток собирали для хранения в качестве заготовки. Комплекс с включением эфирного масла получали с применением бета-циклодекстрина в 8-кратном количестве и воды в 80-кратном количестве, перемешиванием при 50°С в течение 1 час, выдерживанием на протяжении ночи в условиях охлаждения и фильтрованием. Комплекс с включением сушили при низкой температуре (40°С) и измельчали, получая при этом тонкоизмельченный порошок для хранения в качестве заготовки. Семена личи и ламинарию экстрагировали водой в 10-кратном количестве 3 раза, каждый раз в течение 0,5 час, причем воду объединяли с вышеуказанным остатком ризомы куркумы длинной и отваривали при третьей экстракции и все экстракты объединяли и фильтровали. Фильтрат объединяли с указанным выше водным раствором и объединенный раствор концентрировали до тех пор, пока относительная плотность не была 1,10-1,15 (измеренная при 50°С); затем добавляли этанол до достижения содержания спирта 60% и образовавшийся раствор сохраняли в холодных условиях на протяжении ночи и фильтровали. Фильтрат и указанные выше растворы, такие как экстракт Ligustrum lucidum (бирючины блестящей) и т.д., соответственно обрабатывали для удаления этанола до тех пор, пока их относительные плотности не были 1,15-1,20 (измеренные при 50°С), сушили, смешивали с тонкоизмельченным порошком комплекса включения бета-циклодекстрина и эфирного масла и подходящим количеством декстрина, обрабатывали для образования гранул и сушили с получением гранул (10 г).
Пример 2: получение фармацевтической композиции (таблетки) настоящего изобретения
1. Состав
22,5 г Ligustrum lucidum (бирючины блестящей); 15 г корня монгольского астрагала; 4,5 г ризомы китайского коптиса; 6 г семян личи; 7,5 г ламинарии; 7,5 г ризомы куркумы длинной и декстрин в подходящем количестве.
2. Способ изготовления
Ligustrum lucidum (бирючину блестящую) нагревали с 75% этанолом в 6-кратном количестве при кипячении с обратным холодильником и экстрагировали 3 раза, каждый раз в течение 2 час. Все этанольные экстракты объединяли, обрабатывали для удаления этанола и сушили для хранения в качестве заготовки. Ризому куркумы длинной дробили на мелкие кусочки, добавляли воду в 10-кратном количестве, проводили экстракцию дистилляцией с водяным паром в течение 8 час, эфирное масло и водный раствор собирали для хранения в качестве заготовки и остаток сушили для хранения в качестве заготовки. Комплекс с включением эфирного масла получали с применением бета-циклодекстрина в 8-кратном количестве и воды в 80-кратном количестве, перемешиванием при 50°С в течение 1 час, выдерживанием на протяжении ночи в условиях охлаждения и фильтрованием. Комплекс с включением сушили при низкой температуре (40°С) и измельчали, получая при этом тонкоизмельченный порошок для хранения в качестве заготовки. Семена личи и ламинарию отваривали с водой в 10-кратном количестве 3 раза, каждый раз в течение 0,5 час, экстракты объединяли и фильтровали, фильтрат объединяли с указанным выше водным раствором ризомы куркумы длинной и объединенный раствор концентрировали до достижения относительной плотности 1,10-1,15 (измеренной при 50°С); затем добавляли до достижения содержания спирта 60% и образовавшийся раствор сохраняли в условиях охлаждения на протяжении ночи и фильтровали, получая при этом фильтрат для хранения в качестве заготовки. Ризому китайского коптиса, корень монгольского астрагала и остаток ризомы куркумы длинной нагревали с 50% этанолом в 6-кратном количестве при кипячении с обратным холодильником и экстрагировали 3 раза, каждый раз в течение 2 час. Все этанольные экстракты объединяли и затем объединяли с раствором, полученным после отваривания с водой и осаждения спиртом. Из объединенного раствора удаляли этанол до достижения относительной плотности 1,15-1,20 (измеренной при 50°С), сушили, смешивали до достижения гомогенности с экстрактом Ligustrum lucidum (бирючины блестящей), тонкоизмельченным порошком комплекса включения бета-циклодекстрина и подходящим количеством декстрина, обрабатывали для образования гранул, сушили с получением таблеток (0,72~0,75 г/таблетку, всего 9 таблеток).
Пример 3: получение фармацевтической композиции (капсулы) настоящего изобретения
1. Состав
25,5 г Ligustrum lucidum (бирючины блестящей); 18 г корня монгольского астрагала; 7,5 г ризомы китайского коптиса; 7,5 г семян личи; 9 г ламинарии; 9 г ризомы куркумы длинной и декстрин в подходящем количестве.
2. Способ получения
Ligustrum lucidum (бирючину блестящую) нагревали с 75% этанолом в 6-кратном количестве при кипячении с обратным холодильником и экстрагировали 3 раза, каждый раз в течение 2 час. Все этанольные экстракты объединяли, обрабатывали для удаления этанола и сушили для хранения в качестве заготовки. Ризому куркумы длинной дробили на мелкие кусочки, добавляли воду в 10-кратном количестве, проводили экстракцию дистилляцией с водяным паром в течение 8 час, эфирное масло и водный раствор собирали для хранения в качестве заготовок и остаток сушили для хранения в качестве заготовки. Комплекс с включением эфирного масла получали с использованием бета-циклодекстрина в 8-кратном количестве и воды в 80-кратном количестве, перемешиванием при 50°С в течение 1 час, выдерживанием на протяжении ночи в условиях охлаждения и фильтрованием. Комплекс с включением сушили при низкой температуре (40°С) и измельчали, получая при этом тонкоизмельченный порошок для хранения в качестве заготовки. Семена личи и ламинарию отваривали с водой в 10-кратном количестве 3 раза, каждый раз в течение 0,5 час, экстракты объединяли и фильтровали, фильтрат объединяли с указанным выше водным раствором ризомы куркумы длинной и объединенный раствор концентрировали до достижения относительной плотности 1,10-1,15 (измеренной при 50°С); затем добавляли этанол до достижения содержания спирта 60% и образовавшийся раствор сохраняли в условиях охлаждения на протяжении ночи и фильтровали с получением фильтрата для хранения в качестве заготовки. Ризому китайского коптиса, корень монгольского астрагала и остаток ризомы куркумы длинной нагревали с 50% этанолом в 6-кратном количестве при кипячении с обратным холодильником и экстрагировали 3 раза, каждый раз в течение 2 час. Все этанольные экстракты объединяли и затем объединяли с раствором, полученным после отваривания с водой и осаждения спиртом. Из объединенного раствора удаляли этанол до достижения относительной плотности 1,15-1,20 (измеренной при 50°С), сушили, смешивали до достижения гомогенности с экстрактом Ligustrum lucidum (бирючины блестящей), тонкоизмельченным порошком комплекса с включением бета-циклодекстрина и подходящим количеством декстрина, обрабатывали для образования гранул, сушили и капсулировали, получая при этом капсулы (0,43 г/капсулу, всего 15 капсул).
Пример 4: получение фармацевтической композиции (густой пастообразный экстракт) настоящего изобретения
1. Состав
12 г Ligustrum lucidum (бирючины блестящей); 6 г корня монгольского астрагала; 3 г ризомы китайского коптиса; 6 г семян личи; 4,5 г ламинарии; 4,5 г ризомы куркумы длинной и декстрин в подходящем количестве.
2. Способ получения
Ligustrum lucidum (бирючину блестящую) нагревали с 75% этанолом в 6-кратном количестве при кипячении с обратным холодильником и экстрагировали 3 раза, каждый раз в течение 2 час. Все этанольные экстракты объединяли, обрабатывали для удаления этанола и сушили для хранения в качестве заготовки. Ризому куркумы длинной дробили на мелкие кусочки, добавляли воду в 10-кратном количестве, проводили экстракцию дистилляцией с водяным паром в течение 8 час, эфирное масло и водный раствор собирали для хранения в качестве заготовки и остаток сушили для хранения в качестве заготовки. Комплекс с включением эфирного масла получали с применением бета-циклодекстрина в 8-кратном количестве и воды в 80-кратном количестве, перемешиванием при 50°С в течение 1 час, выдерживанием на протяжении ночи в условиях охлаждения и фильтрованием. Комплекс с включением сушили при низкой температуре (40°С) и измельчали, получая при этом тонкоизмельченный порошок для хранения в качестве заготовки. Семена личи и ламинарию отваривали с водой в 10-кратном количестве 3 раза, каждый раз в течение 0,5 час, экстракты объединяли и фильтровали, фильтрат объединяли с указанным выше водным раствором ризомы куркумы длинной и объединенный раствор концентрировали до достижения относительной плотности 1,10-1,15 (измеренной при 50°С); затем добавляли этанол до достижения содержания спирта 60% и образовавшийся раствор сохраняли в условиях охлаждения на протяжении ночи и фильтровали для получения фильтрата для хранения в качестве заготовки. Ризому китайского коптиса, корень монгольского астрагала и остаток ризомы куркумы длинной нагревали с 50% этанолом в 6-кратном количестве при кипячении с обратным холодильником и экстрагировали 3 раза, каждый раз в течение 2 час. Все этанольные экстракты объединяли и затем объединяли с раствором отвара с водой и осаждения спиртом. Из объединенного раствора удаляли этанол до достижения относительной плотности 1,15-1,20 (измерено при 50°С), смешивали до достижения гомогенности с экстрактом бирючины блестящей, тонкоизмельченным порошком бета-циклодекстрина с образованием густого пастообразного экстракта.
Пример 5: Экспериментальное изучение фармацевтической композиции настоящего изобретения на крысах, имеющих сахарный диабет типа II
1. Экспериментальные материалы
1.1. Животные
Крысы Wistar grade II, половина самцов и половина самок с массой тела 180-200 г были предоставлены the Institute of Laboratory Animals, Chinese Academy of Medical Sciences, License №SCXK (Beijing) 2000-0006.
Крысы были выращены в the Center of Laboratory of Xiyuan Hospital of Chinese Academy of Medical Sciences, Second grade animal breading facility, Certificate №SYXK (Beijing) 2003-0008. Комнатная температура: 22-25°С, относительная влажность: 45-60°С.
1.2. Корма
Обычные корма обеспечивала Beijing Ke Ao Xie Li Diets Company, product license №: Beijing (formulation) 238, practiced standard: GB 14924, 3-2001.
Обязательные питательные вещества: ≥18% неочищенного белка, ≤5% неочищенной клетчатки, ≤8% неочищенной золы, 0,8-1,8% кальция, 0,6-1,2% фосфора, ≥1,35% лизина, 0,5% хлорида натрия, ≤10% воды, различные витамины и микроэлементы.
Корма с высоким содержанием жиров были получены the Center of Laboratory Animals, Chinese Academy of Medical Sciences. Состав: 10% свиного сала, 10% сахарозы, 2,5% холестерина, 1% холата натрия, 76,5% обычного корма.
1.3. Лекарственные средства
Фармацевтическая композиция настоящего изобретения: пастообразный экстракт, 3,37 г неочищенных растений на грамм пасты, партия №050401, полученная согласно способу примера 4.
Таблетки гидрохлорида меформина: 0,25 г/таблетку, партия №041226, Beijing Li Ling Heng Tai Pharmaceutical Company, GUOYAOZHUNZI H11021560.
Таблетки Jin Qi Jiang Tang: 0,42 г/таблетку, партия №0503746, изготовлены Long Shun Rong Pharmaceutical Factory of Tianjin Zhong Xin Pharmaceutical Group Company, GUOYAOZHUNZI Z10920027.
1.4. Реагенты
Лимонная кислота и цитрат натрия: Beijing Chemical Plant, партия №960904. Стрептозотоцин (STZ): изготовляемый Sigma Company, партия №S0130, и субупакованный Beijing Tian Lai Biomedicine Science Company. Бумага для тестирования сахара в крови: изготовляемая Roche Company, партия №22898731, и субупакованная Roche-Diagnostics (Shanghai) Company, Ltd. Наборы для анализа радиорезистентности (инсулин, фактор некроза опухоли, интерлейкин-6): Tianjin Jiu Ding Medical Bioengineering Company, Ltd., batch №200510. Биохимические наборы (общий холестерин, триглицериды): Zhong Sheng Bei Kong Biological Science Corporation, batch №050331. 50% глюкоза для инъекции: изготовляемая Beijing Shuang He Pharmaceutical Corporation, batch №0502142.
2. Экспериментальные способы
Были сформированы группа обычного корма и группа с высоким содержанием жиров, высоким содержанием сахара. Инсулинорезистентность индуцировали у крыс после кормления кормом с высоким содержанием жиров и высоким содержанием сахара в течение одного месяца и затем гипергликемию индуцировали внутрибрюшинной инъекцией 25 мг/кг STZ дважды. Крыс с содержанием сахара крови натощак больше 16,7 ммоль/л, измеренным через 72 час, считали успешными моделями и их распределяли в следующие группы: (1) группа слепого контроля (обычный корм + внутрибрюшинная инъекция буфера с 0,1 М лимонной кислотой); 2) модельная группа, (3) группа положительного метформина (0,2 г/кг); (4) группа положительной таблетки Jin Qi Jiang Tang (2 г/кг); (5) группа большой дозы фармацевтической композиция настоящего изобретения (8 г неочищенного растения/кг); (6) группа средней дозы фармацевтической композиции настоящего изобретения (4 г неочищенного растения/кг); (7) группа малой дозы фармацевтической композиции настоящего изобретения (2 г неочищенного растения/кг); где крыс групп (2)-(7) кормили кормом с высоким содержанием жира и высоким содержанием сахара и внутрибрюшинно вводили инъекцию смеси STZ-буфер с 1 М лимонной кислотой. За исключением контрольной группы и модельной группы, крыс других групп подвергали пероральному зондовому введению лекарственных средств настоящего изобретения и давали корм с высоким содержанием жира и высоким содержанием сахара в течение одного месяца. Массу тела и потребление корма измеряли каждую неделю, а сахар в крови измеряли каждую вторую неделю. После последовательных двух месяцев введения пробы крови получали из абдоминальной аорты анестезированных крыс и анализировали для определения таких показателей, как сахар крови, жир крови, инсулин, фактор некроза опухоли, интерлейкин-6 и т.д. Поджелудочную железу и печень применяли для получения патологических срезов и сердце, печень и почки взвешивали для расчета индекса органа: масса органа/масса тела × 100 (г/100 г). Результаты подвергали статистической обработке (t-критерий).
3. Результаты
3.1. Влияния фармацевтической композиции настоящего изобретения на сахар крови крыс, имеющих сахарный диабет типа II
Крысам групп, которым давали корм с высоким содержанием жира и высоким содержанием сахара, подвергали внутрибрюшинной инъекции STZ, затем натощак через 72 час измеряли их уровни сахара в крови, уровень сахара в крови значимо повышался (Р<0,001) в этих группах по сравнению с контрольной группой перед введением лекарственных средств, и средний уровень сахара крови был приблизительно 25-26 ммоль/л, это означает, что модели были собраны успешно. Крыс этих групп подвергали пероральному зондовому введению лекарственных средств в течение двух последовательных месяцев. По сравнению с модельной группой сахар крови крыс группы с большой дозой фармацевтической композиции настоящего изобретения снижался на 2-, 4- и 6-й неделе (Р<0,05~0,01) и значимо снижался на 8-й неделе (Р<0,001). Степень снижения сахара в крови была равна 31,23%. Результаты показаны в таблице 15.
3.2. Влияния фармацевтической композиции настоящего изобретения на жир в крови крыс, имеющих сахарный диабет типа II
После подвергания крыс пероральному зондовому введению лекарственных средств в течение последовательных двух месяцев по сравнению с модельной группой группа большой дозы фармацевтической композиции настоящего изобретения проявляла значимое снижение уровня триглицерида (Р<0,01), и уровень триглицерида и общий уровень холестерина значимо снижались в группе средней дозы (Р<0,05~0,001). Результаты показаны в таблице 16.
Таблица 16
Влияния фармацевтической композиции настоящего изобретения на жир в крови крыс, имеющих сахарный диабет типа II (x±s)
Группа
Доза (г/кг)
n
Общий холестерин (ммоль/л)
Триглицерид (ммоль/л)
Контрольная группа
Модельная группа
-
12
1,47±0,25
1,05±0,32
Группа метформина
Группа таблетки Jin Q
-
11
2,28±0,27***
1,83±0,42***
Jiang Tang
Группа большой дозы
0,2
12
2,34±0,99
1,82±0,63
Группа средней дозы
Группа малой дозы
2
8
2,16±0,36
1,52±0,59
8
11
2,05±0,56
1,18±0,49##
4
10
2,01±0,31#
0,92±0,58###
2
11
2,39±1,08
1,48±0,65
По сравнению с контрольной группой: ***Р<0,001;
по сравнению с модельной группой: # Р<0,05, Р<0,01; Р<0,001.
3.3. Влияния фармацевтической композиции настоящего изобретения на такой показатель, как уровень инсулина у крыс, имеющих сахарный диабет типа II
После подвергания крыс пероральному зондовому введению лекарственных средств в течение последовательных двух месяцев по сравнению с модельной группой их уровень инсулина повышался (Р<0,05). По сравнению с модельной группой группы различных доз фармацевтической композиции настоящего изобретения не обнаруживали значимого различия в таких показателях, как фактор некроза опухоли, интерлейкин-6 и т.д. Результаты показаны в таблице 17.
Таблица 17
Влияния фармацевтической композиции настоящего изобретения на такие показатели, как уровень инсулина у крыс, имеющих сахарный диабет типа II (x±s)
Группа
Доза (г/кг)
n
Инсулин (ulE/мл)
Фактор некроза опухоли (нг/мл)
Интерлейкин-6 (пг/мл)
Контрольная группа
Модельная группа
-
12
10,34±1,69
4,10±1,37
149,39±19,23
Группа метформина
Группа таблетки Jin Q Tang
-
11
9,24±2,39
5,04±1,55
191,07±36,64**
Группа большой дозы
0,2
12
13,29±3,53##
4,68±1,19
178,01±36,67
Группа средней дозы
Группа малой лозы
2
8
11,64±3,54
4,64±1,24
179,61±29,80
8
11
11,41±1,64#
4,32±1,90
193,52±79,02
4
10
10,37±1,25
4,16±0,75
234,76±64,22
2
11
10,57±1,76
4,13±1,08
234,84±28,93##
По сравнению с контрольной группой: **Р<0,01;по сравнению с модельной группой: # Р<0,05, Р<0,01.
3.4. Влияния фармацевтической композиции настоящего изобретения на массу тела крыс, имеющих сахарный диабет типа II
По сравнению с контрольной группой масса тела всех групп крыс уменьшалась в различной степени после инъекции STZ и снижалась значимо со 2-й недели (Р<0,05~0,001). После перорального зондового введения фармацевтической композиции в течение последовательных двух месяцев масса тела крыс все еще не достигала уровня, измеренного перед тем, как модели были установлены. Результаты показаны в таблицах 18 и 19.
3.5 Влияния фармацевтической композиции настоящего изобретения на потребление корма крысами, имеющими сахарный диабет типа II
По сравнению с контрольной группой потребление корма всеми крысами значимо увеличивалось после инъекции STZ и обнаруживало значимое отличие от потребления на 0-й неделе (Р<0,05~0,001 после инъекции STZ и перед введением лекарственных средств). После перорального зондового введения в течение 3 недель по сравнению с модельной группой потребление кормов крысами групп различных доз фармацевтической композиции настоящего изобретения снижалось в различной степени, и различие было значимым на 4-й неделе (Р<0,05), что указывает на снижение уровня сахара крови и ослабление симптомов сахарного диабета. Результаты показаны в таблицах 20 и 21.
Таблица 20
Влияния фармацевтической композиции настоящего изобретения на потребление корма крысами, имеющими сахарный диабет типа II (г корма/100 г массы тела (г, x±s)
Группа
n
0-я неделя
1-я неделя
2-я неделя
3-я неделя
4-я неделя
Контрольная группа
Модельная группа
12
5,79±0,78
6,64±1,01
5,00±1,23
6,27±0,28
5,34±1,24
Группа метформина
Группа таблетки Jin QJiang Tang
11
13,34±4,78
12,44±1,29*
18,86±0,88**
19,56±2,08*
21,93±0,62**
Группа большой дозы
12
14,26±2,82
11,46+3,90
15,17±2,13
14,73±0,20
13,67±0,63##
Группа средней дозы
Группа малой дозы
8
11,61±1,65*
12,78±0,72
13,79±0,88#
14,49±0,58
15,9±0,22##
11
14,15±0,07**
14,39±0,86
18,92±2,75
17,10±1,49
18,48±0,08#
10
13,28±0,67**
12,75±2,11
17,81±1,29
17,78±0,36
17,49±2,08
11
11,41±1,64*
12,68±0,70
16,92±1,14
15,13±1,28
15,13±1,22#
Таблица 21
Влияния фармацевтической композиции настоящего изобретения на потребление корма крысами, имеющими сахарный диабет типа II (г корма/100 г массы тела (г, x±s)
Группа
n
5-я неделя
6-я неделя
7-я неделя
8-я неделя
Контрольная группа
Модельная группа
12
3,59±0,35
5,31±1,34
4,40±0,07
4,78±0,11
Группа метформина
11
18,30±0,94**
19,68±0,61**
21,56±3,21*
20,48±4,22*
Группа таблетки Jin Qi Jiang
Tang
12
13,38±1,79
15,31±1,59
16,96±2,60
15,59±2,65
Группа большой дозы
Группа средней дозы
8
14,12±0,51#
18,26±1,19
16,63±1,03
20,36±3,87
Группа малой дозы
11
16,42±3,41
21,29±1,45
18,17±0,44
18,24±1,78
10
16,46+0,80
17,99±7,81
18,25±0,67
18,00±3,08
11
16,83±1,76
17,54±1,65
16,78±1,30
16,71±1,89
По сравнению с контрольной группой: *Р<0,05, **Р<0,01;
по сравнению с модельной группой: # Р<0,05, ## Р<0,01.
3.6. Влияния фармацевтической композиции настоящего изобретения на этот показатель органов диабетических крыс
Увеличение показателей органов после инъекции STZ было связано с потерей массы тела. Результаты показаны в таблице 22.
Таблица 22
Влияния фармацевтической композиции настоящего изобретения на этот показатель органов крыс, имеющих сахарный диабет типа II (единица: г/100 г массы тела (г, x±s)
Группа
Доза
n
Показатель сердца
Показатель печени
Показатель почек
0,344±0,068
2,395±0,122
0,292±0,038
Контрольная группа
-
12
0,416±0,043**
4,549±0,395***
0,488±0,049***
Модельная группа
-
11
0,438±0,041***
4,900±0,394***
0,471±0,053***
Группа метформина
0,2
12
Группа таблетки Jin Qi Tang
0,402±0,029*
4,856±0,253***
0,499±0,058***
Группа большой дозы
2
8
Группа средней дозы
0,443±0,0б7**
4,954±0,603***
0,483±0,050***
Группа малой дозы
8
11
0,396±0,039*
4,731±0,508***
0,466±0,026***
4
10
0,437±0,051**
4,810±0,304***
0,483±0,043***
2
11
По сравнению с контрольной группой: *Р<0,05, **Р<0,01, ***Р<0,001.
4. Заключение
Указанные выше результаты показывают, что инсулинорезистентность была успешно индуцирована у крыс кормлением крыс кормом с высоким содержанием жира и высоким содержанием сахара в течение до одного месяца, когда и гиперинсулинизм сопровождался повышенным уровнем холестерина и сахара в крови. Крысиные модели сахарного диабета типа II создавали внутрибрюшинной инъекцией STZ. После перорального зондового введения лекарственных средств в течение последовательных двух месяцев уровень сахара в крови у крыс в группе большой дозы значимо снижался и степень снижения сахара крови была равна 31,23%. Уровень жира в крови крыс в группе с большой дозой и группе со средней дозой значимо уменьшался. Таким образом, фармацевтическая композиция настоящего изобретения проявляет действия снижения уровня как сахара, так и жира в крови у крыс, имеющих сахарный диабет типа II.
Пример 6: экспериментальное исследование фармацевтической композиции настоящего изобретения на крысах с быстрым проявлением сахарного диабета (сахарного диабета типа I)
1. Экспериментальный материал
1.1. Животные
Крысы Wistar grade II с массой тела 180-200 г были предоставлены Institute of Laboratory Animals, Chinese Academy of Medical Sciences, License №SCXK (Beijing) 2000-0006. Крысы были выращены в Center of Laboratory Animals of Xiyuan Hospital of Chinese Academy of Medical Sciences, Second drade animal breading facility, Certificate №SYXK (Beijing) 2003-0008. Комнатная температура: 22-25°С, относительная влажность: 45-60°С.
1.2. Корма
Обычные корма обеспечивала Beijing Ke Ao Xie Li Diets Company, product license №238, standard: GB14924, 3-2001. Обязательные питательные вещества: ≥18% неочищенного белка, ≤5% неочищенной клетчатки, ≤8% неочищенной золы, 0,8-1,8% кальция, 0,6-1,2% фосфора, ≥1,35% лизина, 0,5% хлорида натрия, ≤10% воды, различные витамины и микроэлементы.
1.3. Лекарственные средства
Фармацевтическая композиция настоящего изобретения: пастообразный экстракт, 3,37 г неочищенного растения на грамм пасты, партия №050401, полученная согласно способу примера 4.
Таблетки гидрохлорида метформина: 0,25 г/таблетку, партия №041226, Beijing Li Ling Heng Tai Pharmaceutical Company, H11021560.
Таблетки Jin Qi Jiang Tang: 0,42 г/таблетку, партия №0503746, изготовленные Long Shun Rong Pharmaceutical Factory of Tianjin Zhong Xin Pharmaceutical Group Company, Z10920027.
1.4. Реагенты
Лимонная кислота и цитрат натрия: Beijing Chemical Plant, партия №960904. Стрептозотоцин (STZ): предоставленный Sigma Company, партия №S0130, и субупакованный Beijing Tian Lai Biomedicine Science Company. Бумага для тестирования сахара в крови: изготовленная Roche Company, партия №22898731, и субупакованная Roche-Diagnostics (Shanghai) Company, Ltd. Инсулиновые наборы для анализа радиорезистентности: Beijing Fu Rui Bioengineering Company, партия 200601. Глюкагоновые наборы для анализа радиорезистентности: Beijing Atomic High-Tech Nuclear Technology Applicatio Corporation, партия №200601. Гликозилированный гемоглобин: изготовленный Roche Company, партия №200512.
2. Экспериментальные способы
Применяли самцов крыс Wistar grade II с массой тела 180~200 г. За исключением крыс группы слепого контроля, всем крысам инъекцией вводили стрептозотоцин (STZ) через хвостовую вену (90 мг/кг, приготовленный с использованием буфера с 0,1 М лимонной кислотой) для создания моделей. Крыс с содержанием сахара крови натощак 16,7 ммоль/л, измеренным через 72 час, считали удачными моделями и распределяли по следующим группам: (1) группа слепого контроля; 2) модельная группа; (3) группа положительного метформина (0,2 г/кг); (4) группа положительной таблетки Jin Мао Jiang Tang (2 г/кг); (5) группа большой дозы фармацевтической композиции настоящего изобретения (8 г неочищенного растения/кг); (6) группа средней дозы фармацевтической композиции настоящего изобретения (4 г неочищенного растения/кг); (7) группа малой дозы фармацевтической композиции настоящего изобретения (2 г неочищенного растения/кг). За исключением контрольной группы и модельной группы, крыс других групп подвергали пероральному зондовому введению лекарственных средств в заданных дозах. Массу тела измеряли каждую неделю и сахар крови измеряли каждую вторую неделю. Пробы цельной крови (25 мкл EDTA+1 мл антикоагулянта цельной крови) получали из абдоминальной аорты анестезированных крыс для определения гликозилированного гемоглобина, отделяли сыворотку крови для определения инсулина и отделяли плазму (25 мкл EDTA+1 мл антикоагулянта цельной крови) для определения глюкагонов. Поджелудочную железу применяли для получения патологических срезов (краситель НЕ и специфический краситель альдегид-фуксин). Результаты подвергали статистической обработке (t-тест).
3. Результаты
3.1. Влияния фармацевтической композиции настоящего изобретения на сахар в крови крыс, имеющих быстрое проявление сахарного диабета
Крысам инъекцией вводили STZ через хвостовую вену, затем измеряли их уровни сахара крови натощак через 72 час, по сравнению с контрольной группой сахар крови значимо повышался (Р<0,001) в группах перед введением лекарственных средств, и средний уровень сахара крови был приблизительно 23-24 ммоль/л, это означает, что модели были успешно установлены. Крыс этих групп подвергали пероральному зондовому введению лекарственных средств в течение двух последовательных месяцев. По сравнению с модельной группой сахар крови крыс группы большой дозы фармацевтической композиции настоящего изобретения значимо снижался с 6-й до 8-й недели (Р<0,05) и группа малой дозы обнаруживала гипогликемические действия на 8-й неделе (Р<0,05). Результаты показаны в таблице 23.
Таблица 23
Влияния фармацевтической композиции настоящего изобретения на сахар крови крыс, имеющих сахарный диабет с быстрым проявлением заболевания (x±s)
Сахар крови (ммоль/л)
Группа
n
Перед введением
2 недели после введения
4 недели после введения
6 недель после введения
8 недель после введения
Контроль-ная группа
Модельная
13
6,53±0,43
6,32±0,32
6,46±0,53
6,39±0,43
5,39±0,32
группа
Группа метформи-на
13
23,27±3,48***
29,38±3,48***
29,85±2,17***
28,75±1,40***
28,99±2,30***
Группа
таблетки Jin Qi Jiang
12
23,61±2,38***
25,91±2,61##
25,36±4,83##
18,43±9,36###
22,51±3,50###
Tang
Группа
большой дозы
11
24,08±2,69***
27,23±2,50
26,82±5,45
27,42±3,88
26,66±3,53
Группа средней дозы
Группа малойдозы
11
23,13±2,64***
28,30±5,24
27,25±5,17
24,98±5,37#
25,02±5,72#
12
23,50±2,92***
29,50±3,25
29,11±2,62
26,88±2,02#
25,58±4,50#
10
23,64±3,44***
29,20±3,21
28,58±1,73
28,34±2,09
25,50±5,36#
По сравнению с контрольной группой: ***Р<0,001;
по сравнению с модельной группой: # Р<0,05, ## Р<0,01, ### Р<0,001.
3.2. Влияния фармацевтической композиции настоящего изобретения на гликозилированный гемоглобин крыс, имеющих быстрое проявление сахарного диабета
После перорального зондового введения лекарственных средств в течение двух последовательных месяцев по сравнению с модельной группой группа большой дозы фармацевтической композиции настоящего изобретения обнаруживала снижение гликозилированного гемоглобина (HBAIc) (P<0,05) и значимое снижение процента гликозилированного гемоглобина (Halc%) (Р<0,01), но гемоглобин (НВ) этой группы значимо не отличался от гемоглобина модельной группы. Результаты показаны в таблице 24.
Таблица 24
Влияния фармацевтической композиции настоящего изобретения на гликозилированный гемоглобин крыс, имеющих сахарный диабет с быстрым проявлением заболевания (x±s)
Группа
Доза
n
Halc %
HBAIc
HB
Контрольная группа
-
13
3,60±0,08
0,27±0,04
17,94±3,14
Модельная группа
-
13
7,83±0,47***
1,10±0,19***
17,35±2,51
Группа метформина
0,2 г/кг
12
7,38±0,47#
0,92±0,16#
15,69±2,00
Группа таблетки Jin Qi JiangTang
2 г/кг
11
7,39±0,73
1,02±0,17
17,36±1,35
Группа большой дозы
Группа средней дозы
8 г/кг
11
7,04±0,80##
0,92±0,20#
16,81±1,36
Группа малой дозы
4 г/кг
12
7,43±0,73
1,04±0,21
17,60±1,80
2 г/кг
10
7,59±0,79
1,06±0,25
17,36±3,24
По сравнению с контрольной группой: *Р<0,05, ***Р<0,001;
по сравнению с модельной группой: # Р<0,05, ## Р<0,01.
3.3. Влияния фармацевтической композиции настоящего изобретения на инсулин и глюкагоны крыс, имеющих сахарный диабет с быстрым проявлением заболевания
После перорального зондового введения лекарственных средств в течение двух последовательных месяцев по сравнению с модельной группой уровень инсулина имел тенденцию к повышению, которое не имело статистической значимости. По сравнению с модельной группой группа большой дозы обнаруживала снижение глюкагонов (Р<0,05). Результаты показаны в таблице 25.
Таблица 25
Влияния фармацевтической композиции настоящего изобретения на инсулин и глюкагоны крыс, имеющих сахарный диабет с быстрым проявлением заболевания (x±s)
Группа
Доза (г/кг)
n
Инсулин (ulE/мл)
Глюкагоны (пг/мл)
Контрольная группа
-
13
14,92±7,18
219,72±42,88
Модельная группа
-
13
4,72±1,79***
445,63±134,52***
Группа метформина
0,2
12
5,51±2,21
337,35±70,83#
Группа таблетки Jin Qi Jiang Tang
Группа большой дозы
2
11
4,38±1,81
349,39±96,65
Группа средней дозы
8
11
4,88±1,23
350,35±73,99#
Группа малой дозы
4
12
5,34±1,49
380,11±130,68
2
10
4,85±0,85
406,54±140,05
По сравнению с контрольной группой: ***Р<0,001;
по сравнению с модельной группой: # Р<0,05.
3.4 Влияния фармацевтической композиции настоящего изобретения на массу тела крыс, имеющих сахарный диабет с быстрым проявлением заболевания
По сравнению с контрольной группой потерю массы тела наблюдали в каждой группе крыс после инъекции STZ, и масса тела значимо снижалась со 2-й недели (Р<0,05~0,001). После перорального зондового введения лекарственных средств в течение двух последовательных месяцев масса тела крыс была все еще меньше, чем масса тела до того, как были установлены модели. Результаты показаны в таблице 26.
3.5. Влияния фармацевтической композиции настоящего изобретения на потребление корма крысами, имеющими сахарный диабет с быстрым началом заболевания
По сравнению с контрольной группой потребление корма каждой группы крыс значимо повышалось после инъекции STZ, это различие была значимым с 0-й недели (после инъекции STZ, но перед введением лекарственных средств) (Р<0,05~0,001) и были очевидными диабетические симптомы полифагии и полидипсии. По сравнению с модельной группой группы большой и средних доз фармацевтической композиции настоящего изобретения снижали в различной степени потребление корма после неделей перорального зондового введения лекарственных средств, но различие не было статистически значимым. Со снижением уровня сахара крови ослаблялись диабетические симптомы. Результаты показаны в таблице 27.
4. Заключение
Модель сахарного диабета с быстрым проявлением заболевания (сахарного диабета типа I) индуцировалась у крыс после введения им инъекцией STZ. После перорального зондового введения лекарственных средств в течение двух последовательных месяцев уровни сахара крови во всех группах доз фармацевтической композиции настоящего изобретения значимо снижались. По сравнению с модельной группой гликозилированный гемоглобин и процент гликозилированного гемоглобина значимо снижались в группе большой дозы и до некоторой степени снижался также глюкагон в группе большой дозы. Хотя уровень инсулина обнаруживал тенденцию к повышению и потребление корма до некоторой степени снижалось, они не были статистически значимыми. Таким образом, фармацевтическая композиция настоящего изобретения демонстрирует действия снижения уровня сахара в крови у крыс, имеющих сахарный диабет с быстрым проявлением заболевания.