Тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого "сэндвич"-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма А N2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII в сыворотках крови животных после иммунизации
TEST SYSTEM BASED ON A LIQUID-PHASE BLOCKING INDIRECT SANDWICH-TYPE VARIANT OF ELISA FOR DETERMINING THE TITRE OF ANTIBODIES AGAINST THE FOOT-AND-MOUTH DISEASE VIRUS STRAIN A N2269/ARRIAH/2015, GENOTYPE A/ASIA/G-VII, IN ANIMAL BLOOD SERA AFTER IMMUNISATION

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности, созданию тест-системы жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII в сыворотках крови животных после иммунизации.
Ящур - высококонтагиозное вирусное заболевание парнокопытных животных, которое характеризуется высокой заболеваемостью, что влечет за собой ограничения на международную торговлю скотом и его продукцией. Основными клиническими признаками заболевания являются лихорадка, хромота, афты во рту, ступнях и сосках. Молодые животные имеют более высокую смертность из-за миокардита по сравнению со взрослыми особями. Ящур был полностью ликвидирован в Северной Америке и Европе, но продолжает существовать в некоторых частях Южной Америки, Африки, Ближнего Востока и Азии [1, 2].
1
2
3
4
1
Вирус ящура является представителем рода Aphthovirus семейства Picornaviridae и имеет 7 различных серотипов: О, А, Азия-1, С и SAT-1, SAT-2, SAT-3 [2]. Геном кодирует 4 структурных белка VP, VP, VP, VP. Петля G-H белка VP была идентифицирована как основной антигенный сайт. РНК вируса ящура также несет в себе информацию о 8 неструктурных белках (Lpro, 2А, 2В, 2С, 3А, 3В, 3Cpro и 3D-РНК-зависимая РНК-полимераза). Вирус ящура имеет очень высокую частоту мутаций из-за отсутствия механизма репарации вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы. Антигенные варианты вызваны различными аминокислотными мутациями, приводящими к трудностям в борьбе с ящуром [1, 2].
В РНК-содержащих вирусах вариациям в геноме благоприятствуют высокие частоты мутаций во время репликации вируса, а возникающие линии и сублинии обусловлены мутациями и рекомбинацией. Рекомбинация - еще один важный процесс, определяющий биологию и эволюцию вирусов. Она представляет собой обмен генетическим материалом между двумя несегментированными РНК-геномами. Было показано, что генетическая рекомбинация происходит между вирусами одного и того же серотипа [3, 4]. Внутритипическая рекомбинация происходит часто и, по-видимому, события рекомбинации при ящуре происходят легче в 3'-части генома, чем в участках, кодирующих структурные вирусные белки. Мутации в результате рекомбинации приводят к обмену генетическим материалом и образованию новых антигенных вариантов, которые могут избежать иммунного давления и привести к изменениям тропизма клеток и диапазона хозяев [2, 5, 6]. Одна или несколько аминокислотных замен на поверхности вирусных частиц могут привести к изменению распознавания и использования рецепторов. В результате один и тот же вирус будет приобретать способность проникать в клетки с использованием альтернативных рецепторов [6].
Антигенные вариации возникают из-за аминокислотных мутаций, которые изменяют распознавание вирусных белков иммунной системой организма. Поверхностно открытые структуры вируса особенно подвержены иммунной атаке. Процесс появления новых антигенных форм определяется сложным взаимодействием вирусных факторов и клеток-хозяев [6, 7]. Изменения в генах, кодирующих капсидные белки, путем мутации могут привести к антигенным изменениям и появлению новых генетических линий [6].
1
1
Белок VP является наиболее вариабельным, поскольку на него приходится около 90% мутаций всех структурных генов. Самыми вариабельными областями являются участки 40-60, 130-160 и 190-213 а.о. [7]. Участок поверхностного белка VP в регионе 130-160 а.о. отличается высокой вариабельностью, поскольку участвует в процессе связывания с рецепторами клетки-хозяина [8, 9, 10]. Изменчивость данного региона дает возможность вирусу ящура взаимодействовать с рецепторами клеток разных типов и облегчает переход от одного вида хозяина к другому. Серотипы вируса ящура в среднем на 86% имеют идентичные последовательности, хотя VP1 значительно более вариабелен [9].
В 2015 г. широкое распространение на территории Саудовской Аравии, Ирана, Турции получил вирус ящура, который принадлежит к генотипу A/ASIA/G-VII. В ФГБУ «ВНИИЗЖ» данный изолят был адаптирован к различным чувствительным клеточным линиям, в том числе, к монослойной и суспензионной перевиваемой клеточной линии почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/2-17 и получен штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 (генотип A/ASIA/G-VII) [11].
Иммунизация является эффективным инструментом борьбы с болезнью. Для изготовления вакцин используются инактивированные вирусные штаммы ящура. В связи с появлением представителя нового генотипа вируса ящура и необходимостью защиты животных от него в ФГБУ «ВНИИЗЖ» разработали вакцину, в состав которой входит антиген вируса ящура данного штамма [12].
Возникла необходимость создания высокоспецифичных и высокочувствительных диагностических тест-систем, которые позволили бы выявлять антитела против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII.
2
2
Защита от ящура после вакцинации определяется уровнем специфических антител в сыворотке крови животных. Имеются сведения, что IgM, специфичные к вирусу ящура, могут быть обнаружены на 2-4 сутки после вакцинации [13, 14, 15, 16]. Уровень гуморального иммунитета вакцинированного поголовья определяется путем выявления антител, специфичных к капсиду или структурным белкам вируса ящура. В соответствии с рекомендациями МЭБ (OIE) [2] для определения иммунного статуса животных применяют реакцию нейтрализации и иммуноферментный анализ (ИФА). Реакция нейтрализации считается чувствительным, специфичным и надежным методом, однако проведение исследования имеет ряд ограничений, в частности, большая продолжительность времени постановки реакции (не менее 3 суток), высокая стоимость процедуры, связанная с применением чувствительной клеточной линии, наличие СО-инкубатора, а также предполагает использование неинактивированного вируса ящура, который является биологическим агентом II группы патогенности. При этом ИФА обладают многими преимуществами, включая экспрессность, высокую специфичность и чувствительность, пригодность для крупномасштабного скрининга полевых образцов и отсутствие требований к специальным лабораторным условиям, например, культуре клеток или среде СО [17, 18]. Исходя из этого метод ИФА целесообразно применять для определения титра антител у вакцинированных животных.
В настоящее время выделяют прямой и непрямой варианты ИФА. Преимущества прямого варианта ИФА заключаются в быстроте анализа, поскольку используется только один вариант иммуноглобулинов G и устраняется перекрестная реактивность вторичных антител. При этом имеются и некоторые недостатки, а именно, снижение иммунной активности первичных антител в следствие отрицательного влияния ферментов или меток, отсутствие гибкости в выборе первичной метки антител в зависимости от задачи исследования, а также минимальное усиление сигнала.
Существует непрямой вариант ИФА, который имеет заметные преимущества по сравнению с прямым. К достоинствам этого варианта метода относится следующее: 1) наличие большого разнообразия меченых вторичных антител, 2) универсальность (многие первичные антитела могут быть получены у одного вида, и одно и то же меченое вторичное антитело может быть использовано для обнаружения), 3) максимальная иммунная активность основного антитела сохраняется, поскольку оно не маркировано, 4) повышение чувствительности, поскольку каждое первичное антитело содержит несколько эпитопов, которые могут быть связаны меченым вторичным антителом, что позволяет усиливать детектируемый сигнал. К ограничениям метода относится вероятность появления перекрестной активности со вторичным антителом, что может привести к появлению неспецифического сигнала, а также наличие дополнительного этапа реакции [4, 17, 19].
Широко применяют «сэндвич»-вариант ИФА, который обычно требует использования пар подобранных антител, где каждое антитело специфично для другого, неперекрывающегося эпитопа антигена. Первые антитела принято называть сенсибилизирующими и предназначены для захвата антигена. Вторые антитела - детекторные, необходимы для обнаружения антигена. Данный вариант ИФА имеет следующие преимущества: 1) высокая специфичность; 2) подходит для неочищенных образцов; 3) высокая чувствительность реакции.
ИФА также разделяют на твердофазные и жидкофазные варианты. В настоящее время твердофазный вариант широко распространен по причине удобства применения и быстроте проведения анализа. На первом этапе реакции для твердофазного варианта адсорбируют антитела на твердой фазе. При этом не связавшиеся с твердой фазой реагенты легко удаляются отмыванием. В сенсибилизированных лунках инкубируют исследуемый образец. При этом на поверхности твердой фазы формируются иммунные комплексы. Не связавшиеся компоненты удаляют отмыванием. При добавлении конъюгата и связывании его с иммобилизованным иммунным комплексом активный центр фермента остается доступным для последующего взаимодействия с субстратом. Инкубация субстрата в лунках с иммобилизованным конъюгатом приводит к развитию цветной реакции. Эту реакцию можно остановить на нужной стадии, выраженность окрашивания можно оценить визуально или по оптической плотности.
Жидкофазный блокирующий непрямой вариант ИФА имеет ряд преимуществ, а именно наиболее приближен к реакции нейтрализации, поскольку частицы антигена не прикреплены к субстрату, эпитопы антигена наиболее доступны в пространстве для применяемых специфичных антител, и это позволяет получать наиболее приближенные результаты к реакции нейтрализации в клеточной линии; обладает высокой специфичностью и чувствительностью, общей диагностической точностью.
При анализе литературных данных обнаружено, что Basagoudanavar S.H., Hosamani М., Tamil Selvan R.P., Sreenivasa B.P., Saravanan P., Chandrasekhar Sagar B.K., Venkataramanan R. (2013) предложили жидкофазный вариант ИФА для выявления антител против вируса ящура типа А. Данная тест-система позволяла проводить серодиагностику и серомониторинг стада сельскохозяйственных животных. Коэффициент корреляции с результатами реакции нейтрализации составлял до 0,89 [20]. В качестве блокирующего компонента используется дорогое сухое молоко, красителем является ортофенилендиамин (ОФД), который является сильным канцерогеном. Остановку реакции проводят с помощью разбавленной ортофосфорной кислоты.
В последние 6 лет широко распространяется вирус ящура нового генотипа A/ASIA/G-VII. Референтная последовательность нуклеотидов и аминокислот для данной генотипа представлена в GenBank [21]. Полученная авторами тест-система ИФА универсальна, но она не позволяет с высокой чувствительностью выявлять антитела, которые сформировались против вируса ящура генотипа A/ASIA/G-VII. Иными словами, требуется создать такую тест-систему ИФА, которая позволит выявлять антитела против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 с корреляцией относительно реакции нейтрализации на 99% и более.
Sharma G.K., Mahajan S., Matura R., Subramaniam S., Mohapatra J.K., Pattnaik В. в 2015 г. предложили тест-систему жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения антител против вируса ящура типов А, О, Азия-1 [22]. Данная методика позволяет идентифицировать широкий спектр противоящурных антител, но при этом специфичность по отношению к вирусу ящура генотипа A/ASIA/G-VII невысокая, а, следовательно, точное выявление иммуноглобулинов не представляется возможным. Коэффициент корреляции с данными реакции нейтрализации не более 85-90%. Следует заметить, что в данной тест-системе применяется в качестве блокирующего компонента неиммунная сыворотка лошади, которая содержит различные белковые соединения, в том числе, возможно, гомологичные участки аминокислотных последовательностей относительно антигенных детерминант. Для создания данной тест-системы применяют моноклональные антитела, использование которых увеличивает спектр выявления различных генетических линий вируса ящура в рамках одного серотипа, но при этом существенно снижается специфичность относительно выявления антител против изолятов/штаммов конкретного генотипа, в частности A/ASIA/G-VII. В качестве красителя использовали тетраметилбензидин (ТМВ), являющийся агрессивным канцерогеном. Для остановки реакции применяли рабочий раствор серной кислоты, который готовили из концентрата опасного соединения.
Указанные выше тест-системы не представлены на рынке в качестве набора для детекции противоящурных антител в сыворотках крови животных и остаются в качестве недоступных для широкого потребителя диагностикумов. В свою очередь на мировом рынке в настоящее время имеются европейские наборы для детекции антител против вируса ящура типа А - IZSLER (Италия) и PrioCHECK (Нидерланды).
Тест-система в наборе IZSLER предназначена для детекции противоящурных антител с помощью твердофазного прямого «сэндвич»-варианта ИФА. Комплектующие набора IZSLER (Instituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell'Emilia Romagna Brescia, Italy The Pirbright Institute) следующие:
1. Герметичные микропланшеты, сенсибилизированные инактивированным вирусом ящура типа А.
2. Конъюгат (моноклональные антитела против вируса ящура типа А, конъюгированные с пероксидазой).
3. Положительный контроль сыворотки против вируса ящура типа А.
4. Отрицательный контроль.
5. Буферный раствор для ИФА - фосфатно-солевой буфер с твином-20 (ФСБ-Tween).
6. Буфер для разведения сыворотки крови и конъюгата.
7. Субстрат (раствор хромогена ТМВ - тетраметиленбензидина).
8. Раствор для остановки реакции (0,6N раствор серной кислоты). Представлена процедура анализа сывороток крови с помощью данного набора:
1) Внесение отрицательного контроля. По 50 мкл отрицательного контроля вносят в 4 лунки (E11, F11, G11, H11).
2) Внесение буфера ФСБ-Tween. Буфер для ИФА вносят в лунки для разведения сыворотки и положительного контроля 1/10 в количестве по 67,5 мкл и по 50 мкл во все остальные лунки.
3) Внесение положительного контроля и сывороток и приготовление их разведений.
4) Планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 60±10 мин.
5) Внесение конъюгата. Во все лунки микропланшета вносят по 25 мкл готового рабочего (1х) раствора конъюгата. Планшет накрывают и инкубируют при комнатной температуре (допустим диапазон 18-30°С) в течение 60±10 мин.
6) Промывание планшета. Из лунок удалить содержимое. Во все лунки вносят по 200 мкл раствора для отмывания. Инкубируют 3 минуты при комнатной температуре. Из лунок удаляю содержимое и повторяют процедуру еще 3 раза. После последнего раунда промывки проводят инкубацию с раствором для отмывания 5 минут (всего 4 этапа промывки).
7) Внесение субстрата. Во все лунки микропланшета вносят по 50 мкл субстрата при комнатной температуре. Планшет накрывают и помещают его в темноту на 20 минут. Время начинают отсчитывать с момента внесения субстрата в первую лунку микропланшета.
8) Остановка реакции. Серную кислоту (0,6 N раствор) вносят во все лунки планшета в объеме по 50 мкл. До начала считывания результатов анализа необходимо встряхнуть содержимое планшета.
9) Детекция результатов исследования. Сразу после остановки реакции проводят оценку оптической плотности содержимого лунок при длине волны 450 нм.
Калькуляция результатов анализа следующая:
сыворотки
К-cp
% ингибиции (PI)=100-(OD/OD)×100
Критерии валидации:
- Процент ингибиции в лунках с положительным контролем сыворотки (1/10) должен быть ≥90%, для разведений (1/30) - >50%.
- Спектрофотометрические показания должны быть ≥0,800 о.е. в лунках отрицательного контроля.
Интерпретация результатов следующая:
- если процент ингибиции в лунках с разведениями 1/10 и 1/30≥80%, то сыворотки являются сильно положительными;
- если процент ингибиции находится в диапазоне 50-80% для разведений сыворотки 1/10 и 1/30, то сыворотки являются среднеположительными;
- если процент ингибиции ≤50% для сывороток с разведениями 1/10 и 1/30, то сыворотки слабо положительные.
Титр антител рассчитывают, как крайнее разведение сыворотки крови с процентом ингибиции не менее 50%. Данные представлены в инструкции производителя.
Достоинством данного набора является применение моноклональных антител, однако они были получены до появления нового генотипа A/ASIA/G-VII и не могут с высокой достоверностью и точностью детектировать специфические антитела в сыворотках крови животных. Специфичность и чувствительность указанной тест-системы для выявления антител против вируса ящура генотипа A/ASIA/G-VII ниже 50%, что подтверждают данные реакции нейтрализации в чувствительной клеточной линии почки свиньи IB-RS-2. Иными словами, применяемая тест-система не позволяет получать достоверных результатов именно в отношении изолятов и штаммов вируса ящура вновь появившегося генотипа.
Наиболее близким прототипом для разработанной нами тест-системы является тест-система PrioCHECK (Prionics Lelystad B.V., Netherlands) для выявления антител к вирусу ящура типа А.
Комплектующие для соответствующего набора представлены ниже:
Компонент 1 - Планшеты иммунологические.
Компонент 2 - Конъюгат (30х). Разбавленный конъюгат не стабилен, готовят непосредственно перед применением.
Компонент 3 - Буфер для разведения (5х).
Компонент 4 - Неиммунная сыворотка крови лошади.
Компонент 5 - Деминерализованная вода.
Компонент 6 - Промывочный буфер (200х).
Компонент 7 - Референтная сыворотка 1 (позитивная) (жидкая).
Компонент 8 - Референтная сыворотка 2 (менее позитивная) (жидкая).
Компонент 9 - Референтная сыворотка 3 (еще менее позитивная) (жидкая).
Компонент 10 - Референтная сыворотка 4 (отрицательный контроль) (жидкая).
Компонент 11 - Субстрат хромогена (ТМВ).
Компонент 12 - Стоп-раствор (1 N раствор серной кислоты). Данные отражены в инструкции производителя.
450cp blank
450cp blank
450
450 corrected
450
450
450 max
450 max
Основные этапы проведения реакции ИФА для применения данной тест-системы представлены ниже. Проводят приготовление восстановленной не иммунной сыворотки лошади, рабочего буферного раствора, ИФА-буфера на основе не иммунной сыворотки лошади и буфера для разведения, разведения исследуемой сыворотки крови животного 1:5. На следующем этапе анализа проводят инкубацию планшета с исследуемыми и контрольными сыворотками крови в течение 1 ч при температуре 37±0,5°С, промывают лунки планшета с помощью промывочного буфера. Инкубируют содержимое планшета с конъюгатом, разбавленным до рабочего разведения, в течение 60 мин. Лунки планшета промывают, инкубируют с хромогеном в течение 15 мин при комнатной температуре без доступа световых лучей, останавливают реакцию стоп-раствором и проводят расчет оптических плотностей с помощью планшетного спектрофотометра-ридера при длине волны 450 нм. Вычисляют среднее значение OD содержимого лунок А1 и В1 с положительной сывороткой. OD должно быть <0,350. Вычисляют скорректированный OD для всех образцов путем вычитания (OD=OD S-OD blank). Вычисляют среднее значение оптической плотности для содержимого лунок G1 и H1 с отрицательной сывороткой (OD). Данное значение должно быть ≥1,000. Если значение OD ниже 1,000, то, вероятнее всего, хромоген был очень холодным. В таком случае инкубируют еще 30 минут.
Процент ингибиции (PI) эталонных и тестовых сывороток рассчитывают в соответствии с приведенной ниже формулой:
450 corrected
450 max
PI=100-(OD/OD)×100
450
2
3
Рассчитывают среднее значение OD для лунок с референтными сыворотками 2 и 3. Процент ингибиции для S должен быть >60%, для S <40%.
Данная тест-система удобна в применении и позволяет за 4-5 ч получить результаты исследования. Диагностикум включает в себя конъюгат, который представляет собой меченые моноклональные антитела против вируса ящура серотипа А, исходя из этого является типоспецифичной, но без более узкой дифференциации. Разработана прототипная тест-система в конце 90-гг XX в. и получены соответствующие антитела против антигенов вируса ящура различных генотипов, созданных с использованием антигенов вируса ящура различных генотипов, кроме активно циркулирующего с 2015 г. генотипа A/ASIA/G-VII. Изоляты и штаммы данной линии имеют существенные отличия от других линий серотипа А. Анализируя нуклеотидную и аминокислотную последовательность высоко вариабельного пептида вируса ящура VP1, ученые пришли к выводу о наличии достаточного количества существенных замен, позволяющих отнести вирус к иному генотипу. Исходя из выше отраженного, прототипная тест-система не является высокочувствительной и специфичной по отношению к вирусу ящура генотипа A/ASIA/G-VII. Исходя из этого требуется разработать высокочувствительную, специфичную тест-систему для детекции и количественного анализа антител против вируса ящура представленного генотипа.
Кроме того, прототипная тест-система основана на твердофазном конкурентном «сэндвич»-варианте ИФА, однако эта форма хоть и является одним из вариантов серологических реакций, но при этом находится дальше от реакции нейтрализации относительно возможностей улавливания антигенных сайтов по сравнению с жидкофазным блокирующим непрямым «сэндвич»-вариантом ИФА.
Прототипный вариант предполагает наличие в своем составе нативных контрольных сывороток крови животных, что снижает сохранность компонентов тест-системы в течение длительного периода времени и есть риск контаминации микроорганизмами.
Прототипный вариант имеет также некоторое ограничение в применении, а именно, рабочий раствор конъюгата не стабилен и быстро разрушается. В составе набора он представлен в виде 30-кратного концентрата. В таком состоянии в отличии от лиофилизированного компонента срок хранения заметно сокращается. Следует также отметить, что данная тест-система не предусматривает контроля конъюгата, что не позволяет получать более достоверные данные по оптическим плотностям и титру антител против вируса ящура.
В прототипной тест-системе применяется прямой конъюгат, что удобно в применении, однако при этом повышается вероятность шумовых фоновых явлений, что может негативно отражаться на конечных результатах количественного исследования сывороток крови животных.
В прототипной тест-системе для проявления цветной реакции используют ТМВ, который является сильным канцерогеном, а также для остановки реакции применяют серную кислоту, рабочий раствор которой готовят с применением концентрата, негативно влияющего на слизистые органов дыхания и зрения.
Учитывая найденные ограничения в применении имеющихся тест-систем, в том числе прототипной, для проведения достоверного исследования гуморального иммунитета животных после инокуляции противоящурными вакцинами, содержащими инактивированный антиген вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII, актуальной является разработка серологической тест-системы жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для выявления антител в сыворотках крови животных после иммунизации вакцинами с учетом выше приведенных недостатков.
В настоящее время ветеринарная служба Российской Федерации не располагает современной отечественной тест-системой ИФА, которая позволила бы с высокой достоверностью определять титр антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII в сыворотках иммунизированных животных.
Целью изобретения является создание тест-системы на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII.
Поставленная цель достигается тем, что предлагаемая тест-система содержит следующие иммуноспецифические компоненты: культуральный инактивированный антиген вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII (лиофилизированный); сенсибилизирующие антитела - иммуноглобулины G кролика против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII (лиофилизированные); детекторные антитела - иммуноглобулины G морской свинки против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII (лиофилизированные); контроль 1 - лиофилизированная положительная сыворотка крови крупного рогатого скота к вирусу ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII (с процентом ингибиции ≥75%); контроль 2 - лиофилизированная положительная сыворотка крови крупного рогатого скота к вирусу ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII (с процентом ингибиции от 50% до 75%); контроль 3 - лиофилизированная сыворотка крови крупного рогатого скота, не содержащая антитела к вирусу ящура; лиофилизированную фетальную сыворотку крови крупного рогатого скота нормальная для блокирования открытых сайтов связывания на дне лунок планшета; антивидовой конъюгат - иммуноглобулины кролика против IgG морской свинки, конъюгированные с пероксидазой хрена. Предлагаемая тест-система содержит неспецифические компоненты: карбонатно-бикарбонатный буфер (рН 9,5-9,6) для разведения антигена (в виде капсул), концентрат (20х) буферного раствора, хромогенный субстрат ABTS (2,2-азино-ди-(3-этилбензоаминосульфоновая кислота), «стоп»-раствор - 1%-ный раствор додецилсульфата натрия.
Цель достигается также благодаря тому, что метод жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА наиболее приближен к реакции нейтрализации в естественных условиях, поскольку все антигенные сайты полных вирионов вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII находятся в свободном состоянии в жидкой фазе, открыты для связывания со специфическими сенсибилизирующими и детекторными антителами кролика и морской свинки, соответственно. Реакция основана на взаимодействии исследуемой сыворотки крови животного и инактивированного антигена вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII в жидкой фазе в лунках круглодонного планшета с образованием иммунных комплексов. Параллельно с этим проводится сенсибилизация лунок плоскодонного планшета иммуноглобулинами G кролика против вируса ящура того же генотипа. После этого сенсибилизированные лунки блокируют с помощью фетальной сыворотки крови КРС, добавляют полученные иммунные комплексы из круглодонного планшета, инкубируют, добавляют детекторные антитела. Образовавшийся сложный иммунный комплекс выявляют с помощью антител против IgG морской свинки, конъюгированных с пероксидазой хрена и хромогенного субстрата.
Технический результат от изобретения заключается в разработке современной, высокоспецифической и чувствительной тест-системы, предназначенной для определения титра антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII методом жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА, вследствие применения инактивированного антигена вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII и при получении специфических компонентов реакции в жидкой фазе.
В состав разработанной тест-системы ИФА входят следующие иммуноспецифические компоненты:
3
1. культуральный инактивированный антиген вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII (лиофилизированный) - 1 флакон (0,5 см);
3
2. сенсибилизирующие антитела - иммуноглобулины G кролика против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII (лиофилизированные) - 1 флакон (0,5 см);
3
3. детекторные антитела - иммуноглобулины G морской свинки против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII (лиофилизированные) - 1 флакон (0,5 см);
3
4. контроль 1 - лиофилизированная положительная сыворотка крови крупного рогатого скота к вирусу ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII (с процентом ингибиции ≥75%) - 1 флакон (0,2 см);
3
5. контроль 2 - лиофилизированная положительная сыворотка крови крупного рогатого скота к вирусу ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII (с процентом ингибиции от 50% до 75%) - 1 флакон (0,2 см);
3
6. контроль 3 - лиофилизированная нормальная сыворотка крови крупного рогатого скота, не содержащая антител к вирусу ящура - 1 флакон (0,2 см);
3
7. лиофилизированная фетальная сыворотка крови крупного рогатого скота нормальная для блокирования открытых сайтов связывания на дне лунок планшета - 2 флакона (4,0 см);
8. антивидовой конъюгат - лиофилизированные иммуноглобулины кролика против IgG морской свинки, конъюгированные с пероксидазой хрена.
Предлагаемая тест-система содержит неспецифические компоненты:
9. карбонатно-бикарбонатный буфер (рН 9,5-9,6) для разведения антигена (в виде капсул);
10. концентрат (20х) буферного раствора, хромогенный субстрат ABTS (2,2-азино-ди-(3-этилбензоаминосульфоновая кислота);
11. «стоп»-раствор - 1%-ный раствор додецилсульфата натрия.
В состав тест-системы также входят 4 иммунологических 96-луночных плоскодонных полистироловых планшета для проведения ИФА и 1 полимерный 96-луночный круглодонный планшет для связывания антигена и антител в жидкой фазе.
В отличии от прототипа в разработанной тест-системе применяется культуральный инактивированный антиген вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII, который представлен в лиофилизированном состоянии. Это позволяет детектировать именно антитела против вируса ящура указанного генотипа с высокими показателями чувствительности (более 99%) и специфичности (100%), что более чем на 10% выше по сравнению с прототипом. Кроме того, лиофильно высушенный компонент остается стабильным не менее 3 лет, чем антиген в нативном состоянии, что является преимуществом в использовании данной тест-системы. Активность полученного антигена вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII составляет 1:3000.
В отличии от прототипа применяются сенсибилизирующие и детекторные антитела кролика и морской свинки, соответственно, высокоспецифичные по отношению к антигену вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII, поскольку были получены с применением высокоочищенного антигена. Указанные в тест-системе ИФА иммуноглобулины G кролика и морской свинки против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII представлены в виде лиофилизата, что позволяет антителам находится в стабильном состоянии не менее 3 лет с активностью не менее 1:12000 и 1:3000, соответственно.
В отличии от прототипа сыворотки крови КРС, контроль 1 и 2, получены против высокоочищенного инактивированного антигена вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII, что позволяет достичь высокой специфичности и чувствительности при контроле работы тест-системы. Указанные компоненты представлены в лиофилизированном состоянии, что позволяет хранить их не менее 3 лет с сохранением высокой активности в ИФА. Для контроля 1 - не менее 1:4000, для контроля 2 - не менее 1:3000.
В отличии от прототипа для блокирования открытых сайтов связывания применяется фетальная сыворотка КРС, белковые составляющие которой обеспечивают полное закрытие пустых участков на дне иммунологического планшета. Данный компонент также представлен в виде лиофилизата, что позволяет хранить его в данном состоянии не менее 3 лет.
В отличии от прототипного варианта представленная тест-система предусматривает контроль антигена и конъюгата, что дает возможность учитывать фоновые значения и, тем самым, получать более достоверные данные по оптическим плотностям и титру антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII.
В отличии от прототипа в предложенной тест-системе применяется непрямой конъюгат, что позволяет снижать вероятность шумовых фоновых явлений и получать более достоверные результаты определения титра антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII в сыворотках крови животных. Активность конъюгата составляет 1:2000.
Сущность изобретения отражена на графических изображениях:
Фиг. 1 - Принципиальная схема жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.
Фиг. 2 - Спектральный профиль фракций антигена вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII.
Фиг. 3 - Электрофореграмма для инактивированного антигена вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII в 12% полиакриамидном геле.
Примечание: 1-9 - фракции №№2-10 градиента плотности сахарозы (40-30%); 10 - 146S компонент вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 для ИФА (С≈1 мг/мл); 11 - 146S компонент вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 для иммунизации животных (C≈0,2 мг/мл)
Фиг. 4 - Филогенетическая принадлежность штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура генотипа A/ASIA/G-VII.
Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:
SEQ ID NO: 1 представляет последовательность нуклеотидов гена белка VP1 штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура генотипа A/ASIA/G-VII;
SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот гена белка VP1 штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура генотипа A/ASIA/G-VII.
Разработанная тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА основана на специфическом блокировании антигена вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII антителами, содержащимися в исследуемой пробе сыворотки в жидкой фазе. Смесь «исследуемая сыворотка/антиген» переносится в лунки планшета, предварительно иммобилизованного сенсибилизирующими антителами. Наличие антител к вирусу ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII в исследуемой пробе будет выражаться в образовании иммунного комплекса и уменьшении количества свободного антигена, который связывается иммобилизованными на планшете сенсибилизирующими антителами. Фиксированный в лунках антиген взаимодействует с детекторными антителами, которые выявляются в реакции с иммунопероксидазным конъюгатом против IgG морской свинки и последующим окрашиванием с помощью хромогенного субстрата ABTS. Интенсивность окрашивания обратно пропорциональна концентрации специфических антител в исследуемой пробе. Интенсивность цветной реакции учитывают с помощью спектрофотометра-ридера. Принципиальная схема жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА представлена на фиг. 1.
Перед началом работы набор с компонентами выдерживают 30 минут при температуре (18-25)°С.
Проводят подготовку лиофилизированных компонентов тест-системы. Перед началом работы лиофилизированные препараты (антиген вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII, конъюгат, контроли, фетальную сыворотку крови КРС) восстанавливают до объема, указанного на этикетке, для чего к содержимому флаконов добавляют необходимое количество дистиллированной воды.
Проводят приготовление рабочих растворов.
3
Раствор №1. Карбонатно-бикарбонатный буферный (КББ) раствор, рН 9,5-9,6, для сенсибилизации планшетов. Содержимое капсулы КББ растворяют в 100 см дистиллированной воды и тщательно перемешивают.
3
Раствор №2. Раствор используется для приготовления рабочего раствора для межэтапной промывки планшетов и подготовки проб для исследования, а так же как основа для приготовления рабочего буферного раствора для разведения детекторных антител и иммунопероксидазного конъюгата. Для этого содержимое флакона с концентратом (20х) буферного раствора переливают в мерную посуду, добавляют дистиллированную воду до 2000 см и тщательно перемешивают. Значение рН раствора №2 должно быть в пределах 7,4-7,6.
3
3
3
Раствор №3. Рабочий буферный раствор для разведения детекторных антител и иммунопероксидазного конъюгата (рН 7,4-7,6) готовится из раствора №2 с добавлением 10% фетальной сыворотки КРС. Для этого к 36 см раствора №2 следует добавить 4,0 см фетальной сыворотки КРС, восстановленной из лиофилизированного препарата путем добавления к содержимому флакона с сывороткой 4,0 см дистиллированной воды. Готовится непосредственно перед использованием.
Этапы проведения жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII представлены ниже.
Сенсибилизация планшетов
3
Раствор сенсибилизирующих антител готовят в разведении, указанном на флаконе с данным компонентом, в растворе №1 (карбонатно-бикарбонатный буферный раствор). Например, при указанном разведении сенсибилизирующих антител 1:100 в объеме 110 мкл восстановленный концентрат добавляют в 11,0 см раствора №1. Во все лунки иммунологического полистиролового 96-луночного планшета для ИФА вносят по 100 мкл раствора сенсибилизирующих антител, накрывают крышкой и инкубируют в течение 18 часов при температуре (2-8)°С.
Промывание лунок планшета
Промывание производят с использованием автоматических устройств, либо вручную. При этом содержимое лунок планшета удаляют, затем заполняют лунки раствором №2 и сбрасывают интенсивным встряхиванием. Процедуру повторяют два раза.
Реакция в жидкой фазе
3
3
3
Параллельно с сенсибилизацией планшета проводят реакцию антигена с испытуемыми и контрольными пробами сыворотки крови. Готовят следующие разведения сывороток крови животных: 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512, 1:1024 в растворе №2. Для этого во все лунки полимерного планшета за исключением лунок H1-6, которые оставляют для контроля антигена (КА) и контроля конъюгата (КК), вносят по 0,047 см (47 мкл) буферного раствора и 0,003 см (3 мкл) пробы. В лунки H1-6 вносят по 0,05 см (50 мкл) буферного раствора. Испытуемые и контрольные пробы располагают на планшете согласно таблице 1.
В качестве контроля 1 используют положительную сыворотку крови КРС против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII (процент ингибиции ≥75%), контроля 2 - положительную сыворотку крови КРС против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII (процент ингибиции от 50% до 75%), контроля 3 - нормальную сыворотку КРС.
3
Затем во все лунки планшета добавляют по 0,05 см (50 мкл) рабочего разведения антигена в растворе №2 в соответствии с разведением, указанным на этикетке. После перемешивания содержимого лунок планшета при помощи шейкера или легким встряхиванием вручную планшет закрывают крышкой и инкубируют в течение 18 часов при температуре (2-8)°С.
Улавливание антигена
3
В промытые лунки сенсибилизированного планшета вносят по 0,05 см (50 мкл) смеси контрольных и испытуемых проб и антигена, планшет закрывают крышкой и инкубируют в течение 1 часа при температуре (37±2)°С.
Промывание лунок планшета
Проводят, как представлено выше. Процедуру повторяют 4 раза. Внесение детекторных антител
3
3
Во все лунки планшета, за исключением лунок с КК, куда добавляют по 0,05 см (50 мкл) раствора №3, вносят по 0,05 см (50 мкл) рабочего разведения детекторных антител в растворе №3 в соответствии с разведением, указанным на этикетке флакона, планшет закрывают крышкой и инкубируют в течение 1 часа при температуре (37±2)°С.
Промывание лунок планшета
Проводят, как представлено выше. Процедуру повторяют 4 раза.
Внесение конъюгата
3
Во все лунки планшета вносят по 0,05 см (50 мкл) рабочего разведения конъюгата в растворе №3 в соответствии с разведением, указанным на этикетке флакона с лиофилизированным конъюгатом, планшет закрывают крышкой и инкубируют в течение 1 часа при температуре (37±2)°С.
Промывание лунок планшета
Проводят, как представлено выше. Процедуру повторяют 4 раза.
Проявление цветной реакции
3
Во все лунки планшета вносят по 0,05 см (50 мкл) хромогенного субстрата ABTS, закрывают крышкой и выдерживают 15-20 минут при температуре (18-25)°С.
Остановка реакции
3
Реакцию останавливают добавлением в каждую лунку планшета 0,05 см (50 мкл) «стоп»-раствора.
Учет результатов ИФА
Результаты анализа учитывают инструментальным способом. Сразу после остановки реакции измеряют оптическую плотность (ОП) продуктов реакции в каждой лунке при длине волны 405 нм, используя спектрофотометр-ридер для микропланшетов с вертикальным лучом света. Значения ОП контрольных и исследуемых проб переводят в значение процента ингибиции (PI) по формуле:
пробы
где, ОП  - среднее значение оптической плотности смеси исследуемой или контрольной пробы с инактивированным антигеном вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII;
КА
ОП  - среднее значение оптической плотности контроля антигена;
КК
ОП  - среднее значение оптической плотности контроля конъюгата.
Реакция считается достоверной, если удовлетворяет следующим критериям:
КА
КК
- разница между значениями ОП  и ОП  не менее 0,4 о.е.;
- контроль 1 имеет значение PI >75%;
- контроль 2 имеет значение PI в пределах 50-75%;
- контроль 3 имеет значение PI <50%.
Пробы, демонстрирующие значение PI ≥50%, считают положительными, а животные, от которых получены данные пробы сыворотки крови, иммунными к ящуру, вызванного вирусом штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII. Значение PI <50% является отрицательным, что свидетельствует об отсутствии специфических антител к ящуру, вызванного вирусом генотипа A/ASIA/G-VII в сыворотке крови обследуемых животных. Исходя из полученных данных берут последнее разведение сыворотки, для которого процент ингибиции составляет ≥50%. Это разведение считают титром антител против ящура, вызванного вирусом штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015.
В результате проведенных экспериментов были оптимизированы условия постановки реакции. Концентрация детекторных антител, определенная в непрямом варианте ИФА, составила 1:3000, а антивидового конъюгата 1:2000; рабочее разведение сенсибилизирующих антител, определенное путем постановки жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА, составило 1:12000. С использованием разработанной тест-системы проведено исследование образцов сывороток крови животных с определением титра антител и проведен сравнительный анализ с результатами реакции нейтрализации в чувствительной монослойной клеточной линии почки свиньи (IB-RS-2) [2].
Разработанный вариант ИФА позволяет тестировать одновременно в формате 96-луночного планшета до 12 проб сывороток в разведениях с 1:16 до 1:1024. Срок годности предлагаемой тест-системы составляет не менее 24 месяцев со дня изготовления при температуре хранения 4-8°С.
В качестве рабочего штамма применяли штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура генотипа A/ASIA/G-VII.
Контроль штамма А/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура на специфичность.
Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура, был выделен от КРС в селе Аразап Армавирской области Республики Армения. Специфичность определена с помощью ОТ-ПЦР с последующим секвенированием 1D-гена, соответствующего белку VP1, отвечающему за изменчивость вируса ящура. По результатам исследования нуклеотидной последовательности (представлена в приложении) указанного гена была выявлена принадлежность штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 к генотипу A/ASIA/G-VII. Данная последовательность наиболее близка к нуклеотидной последовательности, представленной в GenBank под номером AF390646.1 [21]. Расчет проводился в соответствии с Байесовской теорией вероятности. Специфичность подтверждена также в реакции связывания комплемента со штаммоспецифической сывороткой. Концентрация общего вирусного белка в исследуемом инактивированном антигене вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 составила 3,45 мкг/мл, концентрация 146S компонента - 2,84 мкг/мл, 75S компонента - 0,51 мкг/мл, 12S - 0,10 мкг/мл.
По сравнению с известными штаммами данный штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 обладает более высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации.
Экспериментально подтверждена возможность использования штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура для контроля антигенной и иммуногенной активности, а также для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа А.
Морфологические признаки
Штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура относится к семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus, серотипу А, генотипу A/ASIA/G-VII и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.
Антигенные свойства
По своим антигенным свойствам штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура относится к серотипу А, генотипу A/ASIA/G-VII. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции нейтрализации.
При гипериммунизации морских свинок концентрированный антиген из инактивированного вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 индуцирует образование вирусоспецифических антител, выявляемых в РСК в разведении 1:3000.
22
22
Степень нуклеотидных различий последовательностей штамма А/ВНИИЗЖ/2015 со штаммами вируса ящура серологического типа А составило: А№550 - 21,49%, А/Ирак/64 - 21,73%, А/Иран/96 - 22,03%, А/Армения/98 - 22,39%, А/Турция/06 - 22,11%, А/Иран/05 - 22,32%.
22
22
Антигенное родство штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура с имеющимися производственными штаммами вируса ящура серотипа А исследовано серологическим методом в перекрестной реакции микронейтрализации (РМН). Штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 антигенно отличается от производственных штаммов А№550, А/Ирак/64, А/Иран/97, А/Турция/06, А №2187/Кути/13, А №2171/Кабардино-Балкарский/13.
1
22
22
1
1
Результаты исследований в РМН представлены в таблице 2. Антигенное соответствие (r) составило для А№550 - 0,01; А/Ирак/64 -0,01; А/Иран/97 - 0,05; А/Турция/06 - 0,02; А №2187/Кути/13 - 0,01; А №2171/Кабардино-Балкарский/13 - 0,06. При значении r ≥ 0,3 полевой изолят и производственный штамм являются близкородственными, и вакцина из производственного штамма будет защищать от эпизоотического полевого вируса, при значении r < 0,3 полевой изолят отличается от производственного штамма, и вакцина из данного штамма не защищает от эпизоотического полевого вируса.
Биотехнологические характеристики.
50
3
Штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 репродуцируется в перевиваемых монослойных клеточных линиях почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи IB-RS-2, почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21, и в течение 17-24 часов инкубирования вируса в указанных культурах клеток накапливается от 6,50 до 7,75 lg ТЦД/см. При высокой множественности заражения (1-10 ТЦД/клетка) вызывает ЦПД через 17-24 часов, сохраняет исходные характеристики при пассировании в клеточных культурах на протяжении 5 пассажей (срок наблюдения).
Генотаксономическая характеристика.
6
Штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура типа А является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 7×10 Да.
6
1
2
3
4
Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой с молекулярной массой 2,8×10 Да. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех структурных белков VP, VP, VP и VP.
1
66a
Основным антигенным белком является VP. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.
Физические свойства.
-18
3
Масса вириона составляет 8,4×10 г. Плавучая плотность вирионов в растворе сахарозы 1,45 г/см.
Устойчивость к внешним факторам.
Штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и другим органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,4-7,8. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам.
Дополнительные признаки и свойства. Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.
Антигенная активность - введение инактивированного антигена вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII морским свинкам индуцирует образование вирусоспецифических антител.
Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.
Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок.
Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.
Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения).
Сущность изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.
Пример 1. Получение инактивированного антигена вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015.
50
3
Для получения инактивированного антигена вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 для диагностических целей проводили суспензионное культивирование вируса в клеточной линии ВНК-21 в течение 12-14 ч с получением вирусной суспензии с титром инфекционной активности не ниже 6,5 lg ТЦД/см. Полученную вирусную суспензию инактивировали с помощью аминоэтилэтиленимина и осветляли благодаря полигексаметиленгуанидина.
Инактивированную культуральную жидкость, содержащую антиген вирус ящура, осветляли в течение 30 мин. при 6000 об/мин и 4°С на центрифуге типа Bekman J2-21 или Avanti J-26 ХР (Beckman Coulter, USA). Надосадочную жидкость отбирали.
В надосадочную жидкость добавляли ПЭГ-6000 до конечной концентрации 8% и NaCl до конечной концентрации 0,85%, интенсивно перемешивали и выдерживали при температуре 4±2°С в течение 18-24 часов. Вирусную суспензию осаждали при 6000 об/мин в течение 60 мин., осадок растворяли в 1/15 М растворе ФСБ, концентрируя приблизительно в 100 раз (1/100 от первоначального объема).
К полученному преципитату добавляли 50% хлороформа, интенсивно перемешивали и фракционируя в течение 30 мин. при 3000 об/мин. Отбирали верхнюю водную фракцию, содержащую антиген вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015. Небольшое количество (50-100 мкл) переносили в криопробирку и замораживали при температуре - 10-20°С для последующего электрофоретического анализа в полиакриламидном геле.
На следующем этапе проводили получение 146S компонента вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 (данный компонент является иммуногенным и наиболее важным в иммунизации животных, поскольку представляет собой полные вирионы).
Перед помещением в градиент сахарозы антиген вируса ящура обрабатывали детергентом NP-40 в концентрации 1%.
Для выделения 146S компонента готовили линейный градиент сахарозы с концентрациями 10, 20, 30, 40, 50%. Обработанный с помощью NP-40 антиген вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 наливали по 13-15 мл в центрифужные пробирки, затем последовательно подслаивали растворы сахарозы, начиная с 10%-го и заканчивая 50%-м раствором. Пробирки помещали в металлические центрифужные стаканы и после тщательно выполненного уравновешивания откручивали при температуре 4°С в течение 4 часов при скорости 25000 об/мин.
Фракционирование градиента сахарозы производили с помощью перистальтического насоса, отбирая фракции по 1 мл в отдельные пробирки. Начало и конец пика 146S компонента определяли по спектрофореграмме, объединяя фракции, входящие в этот диапазон.
При использовании перистальтического насоса сначала оценивали визуально пробирку с градиентом сахарозы. Белковая полоса, содержащая 146S компонент, располагается приблизительно в 30%-м слое сахарозы, и выделяется опалесценцией. В этом случае отбирали последнюю верхнюю фракцию 50%-го слоя (1,0 мл), все фракции 30%-го слоя (5,0 мл) и нижнюю фракцию 20%-го слоя сахарозы (1,0 мл). Общий объем составляет приблизительно 7,0 мл. Затем 146S компонент переосаждали с помощью ультрацентрифугирования в течение 4 часов при скорости 25000 об/мин. и температуре 4°С и ресуспендировали осадок в 1/15 М растворе ФБР.
Результаты спектрометрического исследования полученных фракций антигена вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 в виде антигенного профиля представлены на фиг. 2. Проведен электрофорез полученных фракций в 12% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (фиг. 3).
Пример 2. Получение гипериммунной сыворотки крови кроликов (сенсибилизирующие антитела).
Для получения специфических сывороток крови против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 применяли клинически здоровых кроликов средней упитанности массой 2,5-3,0 кг.
3
Для гипериммунизации животных применяли концентрированный очищенный инактивированный антиген вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015, полученный как описано в примере 1, из которого готовили эмульсию с использованием масляного адъюванта Montanide ISA-61 VG (в соотношении адъювант/антиген = 60/40 по массе). Полученную вакцину вводили в мышцу задних конечностей кролика на 0, 21 и 42 дни в объеме 0,5 см. Через 7 дней после последней иммунизации кроликов тотально обескровливали и получали сыворотку крови - содержащую сенсибилизирующие антитела, которую лиофильно высушивали и хранили при температуре 4-8°С.
Пример 3. Получение гипериммунной сыворотки крови морских свинок (детекторные антитела).
Для гипериммунизации морских свинок использовали эмульсию очищенного препарата концентрированного инактивированного антигена вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015, полученного как описано в примере 1. Приготовление вакцины и схема иммунизации такая, как в примере 2.
Пример 4. Определение активности антигена вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015, сенсибилизирующих и детекторных антител.
Индивидуальные пробы сывороток проверяли на активность и специфичность в жидкофазном блокирующем непрямом «сэндвич»-варианте варианте ИФА. Был проведен подбор оптимальных рабочих разведений указанных компонентов для получения достоверных результатов в ИФА. Полученные данные анализа представлены в таблице 3. Выявлено, что рабочее разведение антигена вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015, сенсибилизирующих и детекторных антител составило 1:3000, 1:12000, 1:3000, соответственно.
Пример 5. Применение тест-системы жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.
Перед началом работы набор с компонентами выдерживают 30 минут при температуре (18-25)°С. Проводили подготовку лиофилизированных компонентов тест-системы. Перед началом работы лиофилизированные препараты (антиген вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII, конъюгат, контроли, фетальную сыворотку крови КРС) восстанавливали до объема, указанного на этикетке, для чего к содержимому флаконов добавляли необходимое количество дистиллированной воды.
Проводили приготовление рабочих растворов.
3
Раствор №1. Карбонатно-бикарбонатный буферный (КББ) раствор, рН 9,5-9,6, для сенсибилизации планшетов. Содержимое капсулы КББ растворяли в 100 см дистиллированной воды и тщательно перемешивали.
3
Раствор №2. Раствор использовали для приготовления рабочего раствора для межэтапной промывки планшетов и подготовки проб для исследования, а так же в качестве основы для приготовления рабочего буферного раствора для разведения детекторных антител и иммунопероксидазного конъюгата. Для этого содержимое флакона с концентратом (20х) буферного раствора переливали в мерную посуду, добавляли дистиллированную воду до 2000 см и тщательно перемешивали. Значение рН раствора №2 должно быть в пределах 7,4-7,6.
3
3
3
Раствор №3. Рабочий буферный раствор для разведения детекторных антител и иммунопероксидазного конъюгата (рН 7,4-7,6) готовили из раствора №2 с добавлением 10% фетальной сыворотки КРС. Для этого к 36 см раствора №2 добавили 4,0 см фетальной сыворотки КРС, восстановленной из лиофилизированного препарата путем добавления к содержимому флакона с сывороткой 4,0 см дистиллированной воды. Готовили непосредственно перед использованием.
Этапы проведения жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII представлены ниже.
Сенсибилизация планшетов
Раствор сенсибилизирующих антител готовили в разведении, указанном на флаконе с данным компонентом, в растворе №1 (карбонатно-бикарбонатный буферный раствор).
3
Например, при указанном разведении сенсибилизирующих антител 1:100 в объеме 110 мкл восстановленный концентрат добавляют в 11,0 см раствора №1.
Во все лунки иммунологического полистиролового 96-луночного планшета для ИФА вносили по 100 мкл раствора сенсибилизирующих антител, накрывали крышкой и инкубировали в течение 18 часов при температуре (2-8)°С.
Промывание лунок планшета
Промывание производили с использованием автоматических устройств, либо вручную. При этом содержимое лунок планшета удаляли, затем заполняли лунки раствором №2 и сбрасывали интенсивным встряхиванием. Процедуру повторяли два раза.
Реакция в жидкой фазе
3
3
3
Параллельно с сенсибилизацией планшета проводили реакцию антигена с испытуемыми и контрольными пробами сыворотки крови. Готовили разведения следующих сывороток крови: 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512, 1:1024 в растворе №2. Для этого во все лунки полимерного планшета за исключением лунок H1-6, которые оставляли для контроля антигена (КА) и контроля конъюгата (КК), вносили по 0,047 см (47 мкл) буферного раствора и 0,003 см (3 мкл) пробы. В лунки H1-6 вносили по 0,05 см (50 мкл) буферного раствора. Испытуемые и контрольные пробы располагали на планшете согласно таблице 1.
В качестве контроля 1 использовали положительную сыворотку крови КРС к ящура вируса штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII (процент ингибиции ≥75%), контроля 2 - положительную сыворотку крови КРС к ящуру вируса штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII (процент ингибиции от 50% до 75%), контроля 3 - нормальную сыворотку КРС.
3
Затем во все лунки планшета добавляли по 0,05 см (50 мкл) рабочего разведения антигена в растворе №2 в соответствии с разведением, указанным на этикетке. После перемешивания содержимого лунок планшета при помощи шейкера или легким встряхиванием вручную планшет закрывали крышкой и инкубировали в течение 18 часов при температуре (2-8)°С.
Улавливание антигена
3
В промытые лунки сенсибилизированного планшета вносили по 0,05 см (50 мкл) смеси контрольных и испытуемых проб и антигена, планшет закрывали крышкой и инкубировали в течение 1 часа при температуре (37±2)°С.
Промывание лунок планшета
Проводили, как представлено выше. Процедуру повторяли 4 раза.
Внесение детекторных антител
3
3
Во все лунки планшета, за исключением лунок с КК, куда добавляли по 0,05 см (50 мкл) раствора №3, вносили по 0,05 см (50 мкл) рабочего разведения детекторных антител в растворе №3 в соответствии с разведением, указанным на этикетке флакона, планшет закрывали крышкой и инкубировали в течение 1 часа при температуре (37±2)°С.
Промывание лунок планшета
Проводят, как представлено выше. Процедуру повторяли 4 раза.
Внесение конъюгата
3
Во все лунки планшета вносили по 0,05 см (50 мкл) рабочего разведения конъюгата в растворе №3 в соответствии с разведением, указанным на этикетке флакона с лиофилизированным конъюгатом, планшет закрывали крышкой и инкубировали в течение 1 часа при температуре (37±2)°С.
Промывание лунок планшета
Проводили, как представлено выше. Процедуру повторяли 4 раза.
Проявление цветной реакции
3
Во все лунки планшета вносили по 0,05 см (50 мкл) хромогенного субстрата ABTS, закрывали крышкой и выдерживали 15-20 минут при температуре (18-25)°С.
Остановка реакции
3
Реакцию останавливали добавлением в каждую лунку планшета 0,05 см (50 мкл) «стоп»-раствора.
Учет результатов ИФА
Результаты анализа учитывали инструментальным способом, используя спектрофотометр-ридер для микропланшетов с вертикальным лучом света. Сразу после остановки реакции измеряли оптическую плотность (ОП) продуктов реакции в каждой лунке при длине волны 405 нм. Значения ОП контрольных и исследуемых проб переводили в значение процента ингибиции (PI) по формуле:
пробы
где, ОП  - среднее значение оптической плотности смеси исследуемой или контрольной пробы с инактивированным антигеном вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII;
КА
ОП  - среднее значение оптической плотности контроля антигена;
КК
ОП  - среднее значение оптической плотности контроля конъюгата.
Реакция считается достоверной, если удовлетворяет следующим критериям:
КА
КК
- разница между значениями ОП  и ОП  не менее 0,4 о.е.;
- контроль 1 имеет значение PI >75%;
- контроль 2 имеет значение PI в пределах 50-75%;
- контроль 3 имеет значение PI <50%.
Пробы, демонстрирующие значение PI ≥50%, считали положительными, а животные, от которых получены данные пробы сыворотки крови, иммунными к ящуру вируса штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII. Значение PI <50% является отрицательным, что свидетельствует об отсутствии специфических антител к ящуру генотипа A/ASIA/G-VII в сыворотке крови обследуемых животных.
Исследовали 12 сывороток крови КРС, полученных после иммунизации животных инактивированными сорбированными вакцинами против ящура, содержащими антиген вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII. Определены значения титра антител с применением разработанной тест-системы ИФА, а также данные сыворотки были исследованы в реакции нейтрализации в чувствительной монослойной клеточной линии IB-RS-2, рекомендованной OIE [2]. Полученные результаты отражены в таблице 4, из которой следует, что степень корреляции результатов разработанной тест-системы ИФА (предлагаемое изобретение) и классического метода (РН) составляет 100%.
Пример 6. Определение степени корреляции результатов реакции нейтрализации и ИФА с помощью разработанной тест-системы (предлагаемое изобретение) при исследовании большого количества сывороток крови животных.
Для анализа использовали 630 сывороток крови животных содержащих антитела против 146S антигена вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 с титрами специфических антител 1:16-1:1024. Данные сыворотки исследовали в реакции нейтрализации в соответствии с рекомендациями Руководства МЭБ (OIE) и в жидкофазном блокирующем непрямом «сэндвич»-варианте ИФА (предлагаемое изобретение) для определения специфических антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 (генотип A/ASIA/G-VII).
Выявили, что данные (n=630), полученные с помощью разработанной тест-системы, коррелировали с данными реакции нейтрализации на 99,17% для сывороток крови животных с титром антител 1:16 (n=90), на 99,21% для сывороток крови животных с титром антител 1:32 (n=90), на 99,38% для сывороток крови животных с титром антител 1:64 (n=90), на 99,54% для сывороток крови животных с титром антител 1:128 (n=90), на 99,57% для сывороток крови животных с титром антител 1:256 (n=90), на 99,81% для сывороток крови животных с титром антител 1:512 (n=90), на 99,97% для сывороток крови животных с титром антител 1:1024 (n=90). Полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанной тест-системы на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII в сыворотках крови животных после вакцинации по сравнению с реакцией нейтрализации.
Пример 7. Определение диагностических показателей разработанной тест-системы для определения титра антител в сыворотках крови животных против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 с применением жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.
Для исследования представленной тест-системы (предлагаемое изобретение) для определения титра антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 исследовали стандартные диагностические показатели. Для определения чувствительности предложенной тест-системы анализировали 450 сывороток крови животных, которые являлись заведомо положительными по данным реакции нейтрализации в чувствительной клеточной линии почки свиньи IB-RS-2. Титр антител для данных сывороток крови находилась в диапазоне 1:32-1:1024. Постановку ИФА проводили, как отражено выше. Разработанной тест-системой (предлагаемое изобретение) определили, что из 450 образцов сывороток крови 449 определены в качестве положительных, а 1 - в качестве отрицательной (титр 1:16). Для исследования специфичности метода тестировали 190 отрицательных сывороток крови. В результате исследования с помощью ИФА (предлагаемое изобретение) определили, что из 190 отрицательных проб - 190 определены в качестве отрицательных. Пользуясь представленными выше статистическими методами анализа определили, что диагностическая чувствительность (DSe) составила 99,78% (в 95%-ном доверительном интервале: 98,77-99,99%), диагностическая специфичность (DSp) - 100% (в 95%-ном доверительном интервале: 98,08-100,0%), k-критерий - 0,996; прогностичность положительного результата (PPV) - 100%, прогностичность отрицательного результата (NPV) - 99,48% (в 95%-ном доверительном интервале: 96,41-99,93%), общая точность (DAc) - 99,84% (в 95%-ном доверительном интервале: 99,13-100,00%) (таблица 5).
Таким образом предлагаемая «Тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII в сыворотках крови животных после иммунизации» является специфичной и чувствительной, позволяющей быстро в течение 4-5 часов провести анализ сывороток крови животных с определением уровня антител после вакцинации против ящура, вызванного вирусом ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII.
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII в сыворотках крови животных после иммунизации»:
1. Груздев, К.Н. Программа совместных действий по профилактике и борьбе с ящуром животных в странах СНГ / К.Н. Груздев, В.М. Захаров, A.M. Рахманов // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2005. - Т. 3. - С. 3-13.
2. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. - Paris, 2018. - Chapter 2.1.8.
3. Гуленкин, В.М. Экономическая эффективность проведения профилактической вакцинации животных против ящура на территории Российской Федерации / В.М. Гуленкин // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2012. - Т. 10. - С. 31-41.
4. Anon (2012) Global Strategy for control of foot-and-mouth disease. In, Bangkok, Thailand, pp. 27-29.
5. Динамика развития противоящурного гуморального иммунитета у крупного рогатого скота, иммунизированного трехвалентной сорбированной вакциной типов А, О, Азия-1 / Д.В. Михалишин, Т.Н. Лезова, Н.Н. Ходакова [и др.] // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2007. - Т. 5. - С. 75-82.
6. Wong C.L., Yong C.Y., Ong Н.K., Но K.L., Tan W.S. Advances in the Diagnosis of Foot-and-Mouth Disease. Front Vet Sci. 2020 Aug 21;7:477.
7. Curry S., Abu-Ghazaleh R., Blakemore W., Fry E., Jackson Т., King A., Lea S., Logan D., Newman J., Stuart D. (1992) Crystallization and preliminary X-ray analysis of three serotypes of foot-and-mouth disease virus. J. Mol Biol 228(4): 1263-1268.
8. Fry E.E., Stuart D.I., Rowlands D.J. (2005) The structure of foot-and-mouth disease virus. Curr Top Microbiol Immunol 288:71-101.
9. Palmenberg A.C. (1990) Proteolytic processing of picornaviral polyprotein. Annu Rev Microbiol 44:603-623.
0
10. Curry S., Fry E., Blakemore W., Abu-Ghazaleh R., Jackson Т., King A., Lea S., Newman J., Stuart D. (1997) Dissecting the roles of VP cleavage and RNA packaging in picornavirus capsid stabilization: the structure of empty capsids of foot-and-mouth disease virus. J. Virol. 71(12):9743-9752.
11. Российский патент RU2640261, 27.12.2017 по МПК C12N 7/00 A61K 39/135. Штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура Aphtae epizooticae типа А для контроля антигенной и иммуногенной активности и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа А.
12. Российский патент RU2665850, 25.12.2017 61K 39/135 (2006.01); C12N 7/00 (2006.01) Вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа А.
13. Curry S.R. Zunszain P.A., Leatherbarrow R.J. (2007) Foot-and-mouth disease virus 3C protease: recent structural and functional insights into an antiviral target. Int J Biochem Cell Biol 39(1): 1-6.
14. Oem J.K., Park J.H., Lee K.N., Kim Y.J., Kye S.J., Park J.Y., Song H.J. (2007) Characterization of recombinant foot-and-mouth disease virus pentamer-like structures expressed by baculovirus and their use as diagnostic antigens in a blocking ELISA. Vaccine 25(20):4112-412.
15. Lewis S.A., Morgan D.O., Grubman M.J. (1991) Expression, processing, and assembly of foot-and-mouth disease virus capsid structures in heterologous systems: induction of a neutralizing antibody response in guinea pigs. J. Virol. 65(12):6572-6580.
16. Cao Y., Lu Z., Sun J., Bai X., Sun P., Bao H., Chen Y., Guo J., Li D., Liu X., Liu Z. (2009) Synthesis of empty capsid-like particles of Asia I foot-and-mouth disease virus in insect cells and their immunogenicity in guinea pigs. Vet. Microbiol. 137(1-2):10-17.
17. Hamblin C, Barnett I.T., Hedger R.S. (1986) A new enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus. I. Development and method of ELISA. J. Immunol. Methods 93(1):115-121.
18. Grubman M.J., Moraes M.P., Diaz-San Segundo F., Pena L., de los Santos T. (2008) Evading the host immune response: how foot-and-mouth disease virus has become an effective pathogen. FEMS Immunol Med Microbiol 53(1):8-17.
19. Ma L.N., Zhang J., Chen H.T., Zhou J.H., Ding Y.Z., Liu Y.S. An overview on ELISA techniques for FMD. Virol J. 2011 Sep 4;8:419.
20. Basagoudanavar S.H., Hosamani M., Tamil Selvan R.P., Sreenivasa B.P., Saravanan P., Chandrasekhar Sagar B.K., Venkataramanan R. Development of a liquid-phase blocking ELISA based on foot-and-mouth disease virus empty capsid antigen for seromonitoring vaccinated animals. Arch Virol. 2013 May;158(5):993-1001.
21. GenBank. Foot-and-mouth disease virus A A/IND/40/2000 1D protein (po1) gene, partial cds / URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/21591351 (Дата обращения: 28.05.2021).
22. Diagnostic assays developed for the control of foot-and-mouth disease in India / Sharma G.K., Mahajan S., Matura R., Subramaniam S., Ranjan R., Biswal J., Rout M., Mohapatra J.K., Dash B.B., Sanyal A., Pattnaik B. Diagnostic assays developed for the control of foot-and-mouth disease in India. World J Virology 2015; 4(3): 295-302.
--->
Перечень последовательностей
<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный центр охраны
здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ») Federal Governmental Budgetary Institution
«Federal Centre for Animal Health» (FGBI «ARRIAH»)
<120> Тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-
варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма А
№2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII в сыворотках крови животных после
иммунизации
<160>    2
<210>    1
<211>    636
<212>    РНК
<213>    вирус ящура
<400>    1
accaccgcca ccggggaatc agcagaccct gtcacaacca ccgttgagaa ctacggtggc  60
gagacacaag tacagcggcg ttaccacacc gacgtcggct tcttaatgga caggttcgtg 120
cagatcaagc ctgtgggccc cacacatgtc attgacctca tgcagacaca ccaacacggg 180
ctggtgggcg ccatgttgcg cgcggccacc tactactttt ctgatcttga gattgtggtg 240
aaccacacgg gtaacctaac gtgggtaccc aatggagcac ccgaggcagc actgcaaaac 300
acgagcaacc ccactgctta ccacaaagcg ccgttcacga ggcttgcgct cccctacacc 360
gcgccacacc gcgtgctggc aactgtgtac agtgggacga gcaagtactc cgcacctcaa 420
aaccggcgag gtgacttggg tcctctcgcg gcgagactcg ctgcacagct ccctgcctcc 480
ttcaacttcg gtgcaattcg ggccacggag atctgcgaac tccttgtgcg catgaagcgc 540
gccgagctct actgccccag gccactgttg gcggtggagg tgtcgtcgca agacagacac 600
aagcagaaaa tcattgcccc tgcaaaacaa ctcctg                           636
<210>    2
<211>    213
<212>    ПРТ
<213>    вирус ящура
<400>    2
1     Thr Thr Ser Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Thr Thr Val   15
16    Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg His His Thr   30
31    Asp Val Gly Phe Ile Met Asp Arg Phe Val Lys Ile Val Asn Val   45
46    Ser Pro Thr His Val Ile Asp Leu Met Gln Thr His Gln His Gly   60
61    Leu Val Gly Ala Leu Leu Arg Ala Ala Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp   75
76    Leu Glu Ile Val Val Arg His Glu Gly Asn Leu Thr Trp Val Pro   90
91    Asn Gly Ala Pro Glu Ala Ala Leu Ser Asn Thr Gly Asn Pro Thr   105
106   Ala Tyr Asn Lys Ala Pro Phe Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr   120
121   Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr Val Tyr Asn Gly Thr Asn Lys   135
136   Tyr Ser Ala Ala Ser Gly Arg Ala Arg Gly Asp Leu Gly Gln Leu   150
151   Ala Ala Arg Val Ala Ala Gln Leu Pro Ala Ser Phe Asn Phe Gly   165
166   Ala Ile Arg Ala Thr Thr Ile His Glu Leu Leu Val Arg Met Lys   180
181   Arg Ala Glu Leu Tyr Cys Pro Arg Pro Met Leu Ala Val Glu Val   195
196   Ser Ser Gln Asp Arg His Lys Gln Lys Ile Ile Ala Pro Ala Lys   210
211   Gln Leu Leu  213
<---