ПОДЛОЖКА ДЛЯ БИОЧИПА

Заявляемая полезная модель относится к области медицины, в частности, к средствам для иммунологических исследований биологических материалов, и может найти применение в клинических и биологических лабораториях.
Известны белковые биочипы, которые применяются в таких областях исследований, как фундаментальные биологические научные исследования для характеристики ассоциированных с заболеваниями белковых каскадов; для оценки токсичности лекарственных препаратов; для медицинской диагностики и др., что значительно повышает производительность и биологическую значимость экспериментов по анализу экспрессии белков [1].
Для клинической медицинской диагностики большой интерес представляют биочипы с иммобилизованными аффинными захватывающими агентами (антителами, антигенами, аптамерами). Для иммобилизации захватывающих агентов используется субстрат с нанесенной на него подложкой. К подложке предъявляется ряд требований, выполнение которых необходимо для корректного выполнения иммунологических исследований. Подложка должна иметь высокую связывающую способность и способность сохранять функциональную активность антител, а также высокое соотношение сигнал-шум при последующем сканировании связанных материалов.
В качестве субстрата могут применяться стекло, силиконовые материалы, а также синтетические полимеры, такие как полистирол, нитроцеллюлоза, поливинилиденфторид. В качестве подложки используется широкий спектр материалов, способных образовывать со связываемыми белками химические связи; это могут быть гидрогель на основе декстрана, агароза, пористый акриламидный гидрогель, гидрофильные полимеры или полиаминокислоты, тонкие полоски металлов и т.п.
Известна подложка для биочипа, у которой область, предназначенная для иммобилизации антител, ограничена по периметру бортиком, который может быть выполнен съемным или отламывающимся [2]. Известное устройство позволяет сокращать непроизводительные расходы исследуемого материала и реактивов, но оно сложно в исполнении и не достигает оптимального соотношения сигнал-шум, так как не исключает перетекания антител через бортики и связывания их с субстратом подложки.
Известна подложка для биочипа, имеющая, по крайней мере, один контрольный участок, «обеспечивающий прочность связывания клеток, заведомо, меньшую, чем прочность их специфического связывания в области любого из участков с иммобилизованными антителами, но заведомо большую, чем прочность неспецифического связывания клеток с подложкой» [3]. Известная полезная модель позволяет повысить точность анализа за счет контроля качества отмывки биочипа, однако это решение не влияет на соотношение сигнал-шум, свойственное используемой подложке.
Известна подложка для биочипа [4], наиболее близкая по решаемой технической задаче и совокупности существенных признаков к заявляемой полезной модели, которая представляет собой стеклянную пластину с нанесенным на нее функциональным покрытием из халькогенидного стекла. Пластина для микроскопических исследований фирмы «Chemints» выполнена из покровного боросиликатного стекла, обладающего гидролитической устойчивостью и высокой устойчивостью к химически агрессивным средам, и содержит покрытие из халькогенидного стекла, полученное напылением с помощью излучения XeCl эксимерного лазера. Тем самым достигается повышение адсорбирующей способности и возможность избирательного травления поверхности, что позволяет формировать заданную геометрию распределения активного слоя на поверхности подложки.
Недостатком известной подложки для биочипа является низкая чувствительность и низкий предел обнаружения проводимого с ее использованием анализа за счет отсутствия усиления полезного сигнала.
Заявляемая полезная модель свободна от указанного недостатка.
Технический результат, достигаемый в заявляемой полезной модели, заключается в увеличении чувствительности анализа в несколько десятков раз за счет усиления полезного сигнала люминесценции благодаря использованию эффекта плазмонного резонанса на металлических наночастицах.
Указанный технический результат достигается тем, что в подложке для биочипа, содержащей стеклянную основу и функциональное покрытие из халькогенидного стекла, в соответствии с заявленной полезной моделью, функциональное покрытие из халькогенидного стекла имеет дополнительное покрытие толщиной не более 200 нм, которое состоит из гомогенных частиц металлов, входящих в группу, включающую серебро, золото, платину, размер которых не более 50 нм.
В качестве стеклянной основы использовали покровные стекла для микроскопических исследований фирмы «Chemints», выполненные из боросиликатного стекла, обладающего гидролитической устойчивостью и высокой устойчивостью к химически агрессивным средам. Указанные стекла наиболее подходят для флуоресцентной микроскопии, так как падающие УФ лучи с длинной волны не менее 320 нм не вызывают автофлуоресценцию стекол.
Сущность заявляемой полезной модели иллюстрируется Фиг. 1 - Фиг. 4. На Фиг. 1 представлена схема подложки биочипа. Заявленная полезная модель содержит пластинку из оксидного стекла 1, на которой находится слой халькогенидного стекла 2. На халькогенидном стекле расположен слой 3 металлических частиц, имеющих неплотную упаковку. Толщина слоя (L) не превосходит 200 нм. Размер металлических частиц (d) не превышает 50 нм. На фиг. 2 приведены электронномикроскопические фотографии подложки для биочипа с нанесенным слоем металлических частиц различной толщины. Продолжительность нанесения металлических наночастиц составляет 1 минуту, соответственно на Фиг. 2-1-10 мин. минут и на Фиг. 2-2 мин.. Благодаря рыхлой упаковке металлических наночастиц остаются участки слоя халькогенидного стекла, открытые для доступа раствора антител. Это обеспечивает высокую адгезию последних, характерную для взаимодествия антител с халькогенидным стеклом. Об этом свидетельствует Фиг. 3, на которой приведено изображение пленки с напечатанными белками (крысиные моноклональные антитела, полученные к иммуноглобулинам мыши), полученное на флуоресцентном сканере (активировался краситель Су3) до (1) и после промывки в буферном растворе в течение 5 минут с перемешиванием при комнатной температуре (2). Вместе с тем присутствующие на подложке металлические наночастицы, благодаря эффекту плазменного резонанса, усиливают интенсивность сигнала люминесценции в 70-80 раз, что повышает чувствительность анализа (повышает отношение сигнал-шум). Это показано на фиг. 4, где приведены спектры люминесценции антител, нанесенных на подложки биочипа: 1 - без нанесенного слоя металлических наночастиц (увеличен на вставке); 2-е нанесенным в течение 5 минут слоем металлических наночастиц; 3-е нанесенным в течение 15 минут слоем металлических наночастиц..
Заявленная полезная модель была испытана в лабораторных условиях в ФБГУ НИИ гриппа Минздравсоцразвития РФ (Санкт-Петербург), в режиме реального времени.
Результаты апробации представлены в виде примера конкретной реализации заявленной полезной модели.
Пример.
Халькогенидные стекла получали охлаждением соответствующих расплавов в вакуумированных кварцевых ампулах. Исходными веществами служили галлий, германий медь, индий, мышьяк, сера и селен чистоты выше 99.999%.
Халькогенидное стекло (соединения или сплавы) наносили на стеклянную основу следующим образом.
Покровные стекла мыли мыльным раствором, после чего выдерживали в растворе перманганата калия в течение 15 мин, ополаскивали дистиллированной водой и высушивали.
-5
Напыление халькогенидного стекла производилось в вакуумной камере при базовом давлении 10 мм рт.ст. Образец халькогенидного стекла облучался XeCl эксимерным лазером, генерирующим 20 не импульсы на длине волны 308 нм с энергией импульса 10-40 мДж. Лазерный луч фокусировали на мишени (образце халькогенидного стекла) под углом 45°. Поток формирующейся плазмы направляли на предметное стекло, где происходило формирование пленки.
Формирование гомогенных гетерометаллических наночастиц проводилось с помощью лазерно-индуцированного синтеза из раствора. В качестве источника лазерного излучения использовался гелий-кадмиевый лазер с длинной волны 325 нм, работающий в непрерывном режиме. Свежеприготовленным раствором металл органического комплекса покрывалась поверхность подложки биочипа, которая подвергалась затем лазерному облучению. Продолжительность лазерного воздействия не превышает 15 минут. После проведения синтеза подложки с полученными наночастицами промывались ацетоном и высушивались.
Для проведения лазерно-индуцированного синтеза наночастиц из раствора использовались светочувствительные металлорганические комплексы, например [Au12Ag12(C2Ph)18Br3(PPh2(C6H4)3PPh2)3](PF6)3. В качестве растворителя используется 1,2-дихлорэтан.
Способность полученной подложки к адсорбции белка определяли с помощью зеленого флуоресцирующего белка. Печать проводилась на споттере SpotArray 24 при 50% влажности и температуре 25°C с использованием одной иглы SMP3 (Telechem, USA). Данная игла при установленных по умолчанию параметрах забирает 250 нл образца за один раз и наносит по 0.6 рл на каждый спот. После печати слайды были оставлены на 1 час при комнатной температуре.
Сканирование биочипов проводилось путем рассеивающего сканирования на длине волны 570 нм на сканере ScanArray Express (PerkinElmer, USA) с разрешением 10 µn и РМТ=70 по задаваемому протоколу сканирования.
Обработка получаемых изображений проводилась с использованием программного обеспечения ScanArray и QuantArray 3.0. Microanalysis Soft Ware (Perkin Elmer, USA).
На Фиг. 3 представлены результаты сканирования напечатанного на подложку белка (крысиные моноклональные антитела, полученные к иммуноглобулинам мыши) до и после отмывки в буферном растворе в течение 5 минут с перемешиванием при комнатной температуре. Как показывают результаты апробации, белок превосходно адсорбируется, о чем свидетельствует сохранение интенсивности люминесценции после промывки.
Технико-экономическая эффективность заявленной полезной модели состоит в том, что наряду со свойственными прототипу высокой адсорбирующей способностью и возможностью избирательного травления поверхности для формирования заданной геометрии распределения активного слоя на поверхности подложки, преимуществом данной подложки является (как видно из Фиг. 4) усиление полезного сигнала люминесценции в несколько десятков раз за счет эффекта плазменного резонанса на металлических наночастицах. Это дает возможность повысить предел обнаружения анализируемых белков и использовать более простую аппаратуру для считывания сигнала. Новая полезная модель может стать эффективной основой для изготовления диагностических систем, доступных для широкого использования стандартно оснащенными лабораториями, в частности, биохимическими, иммунологическими, микробиологическими и др.
Список использованных источников информации
1. Hall Е.А.Н. In Handbook of Biosensors and Biochips. Eds. Wiley, Chichester, 2007, v. 2, ch. 72, p. 1111-1129.
2. Патент РФ №86091, МПК A61B 10/00, 2009.
3. Патент РФ №86090, МПК A61B 10/00, 2009
4. Патент РФ №121081, МПК G01N 33/48, 2012].(прототип)