Способ получения гомографта сердечно-сосудистой системы методом криоконсервации
METHOD FOR PRODUCING A HOMOGRAFT OF THE CARDIOVASCULAR SYSTEM BY MEANS OF CRYO-CONSERVATION

Изобретение относится к медицине, в частности к кардиохирургии, касается способа создания биологических протезов, а именно гомографтов, методом криоконсервации и может быть использовано при операциях по протезированию на сердечно-сосудистой системе после проведения доклинических исследований на животной модели.
Известен способ получения гомографта сердечно-сосудистой системы (ГССС) в виде участка магистрального сосуда или выходных трактов левого и правого желудочков сердца, в котором гомографт получают химической обработкой биологического тканевого компонента (БТК) средами, содержащими гентамицин, дифлюкан, цефалоспорин, метрогил и стабилизатор рН, а метод криоконсервации применяют для подготовки готового ГССС к хранению в режиме криоконсервации, для чего ГССС помещают в стерильный полимерный пакет с криопротекторной смесью, охлажденной до температуры 2±2°С, содержащей альбумин, диметилсульфоксид и DMEM/F12, пакет герметично запаивают и выдерживают в холодильнике с температурой -150±2°С или в криоконтейнере, содержащем пары жидкого азота, в течение не менее 120 минут (RU 2525197, МПК A61F 2/06, A01N 1/02, A01K 31/7036, А61Р 43/00, опубл. 10.08.2014 Бюл. №22. Гомографт сердечно-сосудистой системы (варианты). Способ получения гомографта. Среда для воздействия на ткани гомографта (варианты)).
Ниже перечислены недостатки данного способа:
• излишняя кросс-сшивка коллагеновых волокон сосудистой ткани в результате предложенной обработки большим количеством реагентов, содержащих токсичные бактерицидные препараты, что негативно сказывается на долгосрочном функционировании гомографта после имплантации;
• сложный процесс криоконсервации с использованием чрезмерно низких температур: при криоконсервации -150±2°С и при хранении ГССС до его реализации -130°С, приводящих к образованию экстрацеллюлярных кристаллов льда;
• хранение замороженного гомографта в среде криопротекторной смеси, содержащей вышеупомянутые бактерицидные препараты.
Известен способ, относящийся к области криоконсервации биологического материала, касающийся криоконсервации донорских аллотрансплантатов магистральных сосудов (артерий, вен), позволяющий избежать образования экстрацеллюлярных кристаллов льда, применения токсичных криопротекторов и исключить использование программных методов замораживания с применением жидкого азота (RU 2650694, МПК A01N 1/00, опубл. 17.04.2018 Бюл. №11.
Способ эффективной и безопасной криоконсервации донорских, сосудистых трансплантатов, обеспечивающий оптимизацию их дальнейшего процессинга - радиационной стерилизации и децеллюляризации).
Известный способ криоконсервации основан на применении жидкого полимера полидиметилсилоксана (ПДМС), обладающего гидрофобностью, биосовместимостью, способностью не замерзать при сверхнизких температурах, инертного, нетоксичного и негорючего. В данном способе ПДМС использован в качестве хладоагента, непроникающего криопротектора и криоконсервирующего средства с опосредованными экстрацеллюлярными криопротекторными свойствами.
Известный способ включает забор биологического трупного компонента, преимущественно, участка магистрального сосуда, его морфометрию, оценку уровня инициальной контаминации, стерильную обработку раствором Кустодиола, предварительное охлаждение в течение 1 часа в объеме ПДМС с вязкостью 1 сСт и температурой +4°С, криоконсервацию сверхбыстрым замораживанием со скоростью примерно (-10°С/сек.) в течение 1 минуты путем погружения и перемещения в объеме ПДМС с вязкостью 1 сСт и температурой -80°С, упаковку замороженных аллотрансплантатов с криопротекторным слоем ПДМС в стерильные пакеты без использования криопротекторной смеси, хранение замороженных аллотрансплантатов при -80°С и размораживание в течение 5 минут в объеме ПДМС с вязкостью 25 сСт. и температурой +25°С. В известном способе для фиксации положения сосудистых аллотрансплантатов в объеме ПДМС используют специально разработанные крепежные средства - подложки из пластика или металла, подбираемые, исходя из внутреннего диаметра аллотрансплантата.
К недостаткам известного способа относится следующее:
• его ограниченность криоконсервацией аллотрансплантатов магистральных кровеносных сосудов, единообразно трубчатых по форме, различающихся по длине и диаметру,
• размещение аллотрансплантатов на подложках для фиксации их положения в объеме ПДМС, результатом которого является неравномерность образования криопротекторного слоя при охлаждении, примораживание аллотрансплантатов к подложкам при криоконсервации и отслаивание их эндотелия при снятии с подложек во время размораживания,
• неоптимальность условий размораживания (высокая вязкость ПДМС 25 сСт. при невысокой температуре разогрева +25°С, увеличивающие время размораживания,
• неопределенность характеристики «перемещение аллотрансплантатов в объеме ПДМС» во время криоконсервации без указания скорости перемещения,
• длительность стартовой подготовки, связанная с затратами времени на изготовление подложек и размещение на них аллотрансплантатов,
• неопределенность методик фильтрации и стерилизации ПДМС.
Термин «аллотрансплантаты» требует пояснения: он является общим для гомографтов, ксенографтов и аутографтов. На основании этого в заявляемом способе используется термин гомографт, как это принято в практике протезирования на сердечно-сосудистой системе.
Способ по патенту RU 2650694 по совокупности существенных признаков является наиболее близким к заявляемому и выбран в качестве ближайшего аналога (прототипа).
Задачей, на решение которой направлено изобретение, является разработка упрощенного, но эффективного способа получения ГССС методом криоконсервации с применением ПДМС в качестве хладоагента, криопротекторного и криоконсервирующего средства, который исключает контакт крепежного средства с функциональной частью БТК и обеспечивает при оптимальных режимах получение ГССС как типичной конфигурации, характерной для магистральных сосудов (артерии, вены), так и нетипичной, характерной для участков выходных трактов правого и левого желудочков сердца, митрального и аортального клапанов и фрагментов аорты.
Результат, который может быть получен при использовании изобретения, заключается в расширении возможностей протезирования сосудов и органов сердечно-сосудистой системы методом криоконсервации, в повышении качества полученных ГССС, в снижении экономических и временных затрат на их получение.
Для решения поставленной задачи и достижения указанного результата в способе получения ГССС методом криоконсервации с применением ПДМС в качестве хладоагента, криопротекторного и криоконсервирующего средства, включающем забор участка магистрального сосуда в качестве БТК, его морфометрию, оценку уровня инициальной контаминации, предварительное охлаждение путем погружения изъятого БТК в раствор Кустодиола с температурой +4°С, создание криопротекторного слоя на поверхности БТК путем погружения его в объем ПДМС с вязкостью 1 сСт. и температурой +4°С, криоконсервацию путем погружения полученного БТК в объем ПДМС с вязкостью 1 сСт. и температурой -80°С с перемещением его в объеме для равномерного замораживания, упаковку полученного ГССС в самозапаивающийся пакет, вакуумизацию и радиационную стерилизацию пакета, его хранение при температуре -80°С, извлечение ГССС из пакета перед использованием и его размораживание путем погружения в объем ПДМС, согласно изобретению, в качестве БТК, кроме участка магистрального сосуда, используют участок выходного тракта правого или левого желудочков сердца, митрального или аортального клапанов сердца или фрагмент аорты, забор БТК выполняют с сохранением, прилежащего к нему, нефункционального участка, предназначенного для обеспечения в процессе осуществления способа, бесконтактных с БТК и готовым ГССС, манипуляций путем захвата этого участка инструментом, преимущественно, пинцетом, криоконсервацию проводят в течение, по меньшей мере, 1 минуты со средней скоростью замораживания 300°С/мин. при скорости мануального перемещения БТК в объеме ПДМС 1-2 об/сек., или при скорости автоматического перемешивания раствора вокруг БТК в криостате 0,2 м/сек„ размораживание ГССС перед имплантацией производят путем его погружения на 1 минуту в объем ПДМС с вязкостью 5 сСт и температурой +30°С и после размораживания удаляют нефункциональный участок, при этом для охлаждения, криоконсервации и размораживания используют ПДМС, стерилизованный на производстве или фильтрованный в асептических условиях.
Отличительными от прототипа признаками заявленного способа, обеспечивающими получение результата во всех случаях, являются следующие:
• в качестве БТК, кроме участка магистрального сосуда, используют участок выходного тракта правого или левого желудочков сердца, митрального или аортального клапанов сердца или фрагмент аорты,
• забор БТК выполняют с сохранением прилежащего к нему нефункционального участка, предназначенного для обеспечения в процессе осуществления способа, бесконтактных с БТК и готовым ГССС, манипуляций путем захвата этого участка инструментом, преимущественно, пинцетом,
• криоконсервацию БТК проводят в течение, по меньшей мере, 1 минуты со средней скоростью замораживания 300°С/мин.,
• криоконсервацию проводят со скоростью мануального перемещения БТК в объеме ПДМС 1-2 об/сек. или при скорости автоматического перемешивания раствора вокруг БТК в криостате 0,2 м/сек.,
• размораживание ГССС перед имплантацией производят со средней скоростью 500°С/мин. путем его погружения на 1 минуту в объем ПДМС с вязкостью 5 сСт. и температурой +30°С,
• после размораживания удаляют нефункциональный участок,
• для охлаждения, криоконсервации и размораживания используют ПДМС, стерилизованный на производстве или фильтрованный в асептических условиях.
Указанные отличительные признаки, каждый в отдельности и все вместе, направлены на достижение заявленного результата и являются существенными. В предшествующем уровне техники представленная в формуле изобретения совокупность известных и отличительных признаков не известна.
Описание способа.
Осуществляют доставку ПДМС, стерилизованного в производственных условиях, или фильтруют ПДМС, имеющийся в лаборатории, в асептических условиях. Охлаждают индивидуальные объемы ПДМС до конкретной температуры каждого этапа обработки.
Выполняют забор БТК: участка магистрального сосуда (артерии или вены) или участка органа сердечно-сосудистой системы: выходного тракта правого или левого желудочков сердца, митрального или аортального клапанов сердца или фрагмента аорты. Забор выполняют с сохранением прилежащего к выбранному БТК нефункционального участка, предназначенного для обеспечения в процессе осуществления способа, бесконтактных с БТК и готовым ГССС, манипуляций путем захвата этого участка инструментом, например, пинцетом или зажимом, подходящим для этой цели. Для получения нефункционального участка увеличивают длину участка изымаемого БТК магистрального сосуда и используют участок биологической ткани, прилежащий к БТК органов сердечно-сосудистой системы.
На месте изъятия проводят морфометрию изъятого БТК и оценку уровня его инициальной контаминации. Затем БТК погружают в раствор Кустодиола с температурой +4°С для предварительного охлаждения БТК и транспортируют на место проведения криоконсервации. Там БТК перемещают из раствора Кустодиола в подготовленный объем ПДМС с вязкостью 1 сСт. и температурой +4°С для создания на поверхности БТК криопротекторного слоя из ПДМС. После этого осуществляют криоконсервацию, для чего охлажденный БТК с криопротекторным слоем ПДМС погружают, по меньшей мере, на 1 минуту в объем ПДМС с вязкостью 1 сСт. и температурой -80°С и замораживают его со средней скоростью 300°С/мин. Замораживание в горизонтальном морозильном шкафу выполняют с обязательным перемещением БТК в объеме ПДМС со скоростью 1-2 об./сек. при мануальном перемещении или со скоростью 0,2 м/сек при автоматическом перемешивании раствора вокруг БТК в криостате.
Усредненное значение скорости, возможность увеличения времени и диапазон числа оборотов перемещения БТК при замораживании объясняются их зависимостью от естественной толщины стенки БТК, которая, при возможности ее измерения, составляет примерно 1-4 мм. Как показывают результаты экспериментов, для замораживания БТК указанной толщины достаточна скорость в диапазоне примерно 240-490°С/мин., время до 2-х минут и скорость перемещения до 2-х об./сек. Точное соотношение толщины БТК, времени и скорости замораживания, а также скорости перемещения БТК в объеме ПДМС не выявлено. Выбор условий проведения замораживания производится по принципу: чем тоньше БТК, тем ниже скорость, меньше время и ниже скорость перемещения.
Полученный ГССС упаковывают в самозапаивающийся пакет, выполняют вакуумизацию и радиационную стерилизацию пакета, после чего пакет помещают на хранение при температуре -80°С в морозильник. Перед имплантацией ГССС извлекают из пакета, погружают на 1 минуту в объем ПДМС с вязкостью 5 сСт. и температурой +30°С и размораживают со средней скоростью 500°С/мин., после чего удаляют нефункциональный участок. Средняя скорость размораживания обусловлена той же причиной, что и скорость замораживания, то есть толщиной БТК, и взята из экспериментального диапазона 470-1140°С/мин.
Процедура обработки БТК и ГССС проходит в условиях стерильности во избежание бактериального загрязнения.
Предложенный способ получения ГССС по сравнению с прототипом обладает следующими преимуществами:
• возможностью получения ГССС любой конфигурации: типичной, характерной для магистральных сосудов (артерии, вены), и нетипичной, характерной для участков выходных трактов правого и левого желудочков сердца, митрального и аортального клапанов сердца, фрагментов аорты;
• обеспечением прямого контакта БТК с ПДМС с внешней и внутренней стороны благодаря изъятию БТК с дополнительным нефункциональным участком, удаляемым после размораживания, обеспечивающим в процессе осуществления способа, возможность, бесконтактных с БТК и ГССС, манипуляций с ними путем захвата этого участка инструментом (пинцетом или зажимом);
• выбором оптимальных условий криоконсервации с указанием средней скорости замораживания 300°С/мин., скорости мануального перемещения БТК в объеме ПДМС 1-2 об./сек., скорости автоматического перемещения жидкости вокруг стенок БТК 0,2 м/сек., достаточных для равномерного распределения ПДМС, по однородному с ним, непроникающему криопротекторному слою;
• оптимальными условиями размораживания ГССС перед имплантацией: средней скоростью размораживания, составляющей 500°С/мин., временем размораживания, составляющим 1 минуту, характеристиками ПДМС, подготовленного для размораживания ГССС: вязкостью 5 сСт. и температурой +30°С, то есть условиями, позволяющими добиваться оперативной разморозки ГССС в среде прогретого низковязкого ПДМС;
• использованием ПДМС, стерилизованного на производстве с контролем за уровнем инициальной контаминации или фильтрованного в асептических условиях для охлаждения, криоконсервации и размораживания как обязательного этапа получения ГССС, исключающего бактерицидное загрязнение.
Положительный эффект от использования заявленного способа заключается в возможности получения качественно нового ГССС за счет, с одной стороны, бесконтактных с функциональной частью, манипуляций с БТК и ГССС в объеме ПДМС, с другой, - за счет оптимизации режимов обработки БТК и получения ГССС. Бесконтактные манипуляции с минимальным травмированием БТК при изъятии, при переносах БТК и ГССС из одного раствора или объема в другой, при перемещениях в объемах ПДМС, обеспечивают образование полноценного криопротекторного слоя по всей поверхности БТК и исключают риск повреждения ГССС при размораживании. Оптимизация процесса получения ГССС заключается в выборе низковязкого ПДМС для всех этапов процесса, включая этап размораживаниия, в выборе оптимальных условий проведения криоконсервации БТК, в выборе температурного режима и времени проведения процесса размораживания ГССС. Совместно с отказом от изготовления и использования крепежных средств по прототипу, вышесказанное значительно упрощает способ и снижает временные и экономические затраты.
Примеры экспериментального осуществления заявленного способа.
В клинике аортальной и сердечно-сосудистой хирургии ФГАОУ ВО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова совместно с МГТУ им. Н.Э. Баумана были проведены эксперименты по созданию и имплантации гомографтов трупного происхождения на свиной модели. Для исследования были изъяты в качестве БТК клапаны (митральный и аортальный) сердца и фрагменты аорты. Перед экспериментами были подготовлены объемы стерилизованного на производстве ПДМС для следующих этапов эксперимента: с вязкостью 1 сСт. и с температурой +4°С для охлаждения, с такой же вязкостью и с температурой -80°С для криоконсервации и с вязкостью 5 сСт. и температурой +30°С для размораживания. Для криоконсервации, в отличие от вертикальных морозильных шкафов по прототипу, была использована горизонтальная холодильная камера «Ларь» объемом 200 л и с рабочей температурой до -110°С, при этом кратковременное замораживание производилось на дне этой камеры при открытой крышке.
Эксперимент №1. Получение гомографта митрального клапана заявленным способом.
Митральный клапан сердца был изъят с дополнительным нефункциональным участком бифуркации, обеспечивающим, при захвате его пинцетом, бесконтактную с функциональной частью, фиксацию положения фрагмента клапана при манипуляциях с ним на всех последующих этапах. После изъятия была проведена морфометрия и оценка уровня инициальной контаминации. Критерием исключения из эксперимента было наличие атеросклеротических и иных повреждений клапана. Далее клапан был помещен в стерильный раствор Кустодиола с температурой (+4°С) для предварительного охлаждения и транспортирован в клинику, где в асептических условиях был иссечен с получением фрагмента размером 1,0×1,0×0,1 см с сохраненным вышеупомянутым нефункциональным участком биоткани. Полученный фрагмент с помощью пинцета был погружен на 1 час в объем ПДМС с вязкостью 1 сСт. и температурой +4°С для образования на нем криопротекторного слоя из ПДМС. После этого фрагмент был подвергнут криоконсервации со скоростью замораживания 240°С/мин. (в соответствии с его толщиной 0,1 см) путем погружения на 1 минуту в объем ПДМС с вязкостью 1 сСт. и температурой -80°С. Замораживание сопровождалось мануальным перемещением фрагмента в объеме ПДМС со скоростью 1 об/сек. для равномерного замораживания. Сразу после криоконсервации полученный гомографт размораживали со скоростью 470°С/мин. в объеме ПДМС с вязкостью 5 сСт. и температурой +30°С в течение 1 минуты со скоростью мануального перемещения 1 об./сек.. С размороженного гомографта удаляли нефункциональный участок биоткани. Гомографт промывали физиологическим раствором и фиксировали в 10% забуференном формалине в течение 24 часов для дальнейшей транспортировки в лабораторию для гистологических тестов и сравнения с изъятым нативным контрольным клапаном. В лаборатории образцы помещали в парафин, нарезали на срезы толщиной 5 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином для гистоморфологии, орсеином для визуализации эластичных волокон и ван Гизоном (EVG) для коллагеновых волокон и для характеристики плотности и структуры соединительной ткани. Анализ микроструктуры биоткани гомографта проводили с помощью светопольной микроскопии (Olympus ВХ40; камера AxioCam MRc, Carl Zeiss). Срезы нативного клапана также окрашивались и служили в качестве положительного контроля. В результате светооптического исследования, зафиксированного на гистологических слайдах, не было обнаружено существенных различий в ультраструктуре криоконсервированного и контрольного клапанов и был сохранен эндотелий. Значимых морфологических различий в структуре исследуемых биопатов также не было выявлено. Дефекты и разрывы тканей, набухание и отечные изменения, экстравазаты, денудация в замороженных образцах отсутствовали. В толще tunica media эндотелиальная выстилка vasa vasorum хорошо визуализировалась, что говорило о возможности сохранения адекватной трофики. Сохранение полной структурной состоятельности образцов и их кровоснабжения являются основным доказательством возможности использования данного способа для получения гомографтов.
Эксперимент №2. Получение легочного гомографта заявленным способом.
Во втором эксперименте было проведено ограниченное пилотное доклиническое исследование на свиной модели легочного клапана с корнем аорты (далее - легочного гомографта) в условиях искусственного кровообращения. Протокол криоконсервации, детали изъятия клапана и обработки его фрагмента, включая криоконсервацию, совпадали с вышеописанным первым экспериментом. После криоконсервации гомографт был упакован в запаивающийся пакет и оставлен в камере «Ларь» на две недели при температуре -80°С. В день оперативного вмешательства гомографт был разморожен в фильтрованном объеме ПДМС с вязкостью 5 сСт. и температурой +30°С в течение 1 минуты с мануальным перемещением по емкости с ПДМС без касания стенок. После этого гомографт был отмыт физиологическим раствором, излишки ПДМС были убраны с биоткани впитывающими стерильными салфетками, упакован в стерильный контейнер с раствором Кустодиола (+5°С, 500 мл) и помещен в сумку-холодильник для транспортировки в зону проведения оперативного вмешательства. Перед ее началом иммобилизованной свинье была проведена тотальная внутривенная анестезия с искусственной вентиляцией легких. Имплантация легочного гомографта проводилась при постоянном мониторинге жизненно важных функций: ЧСС, АД, сатурации по установленному в Первом Московском государственном медицинском университете им. И.М. Сеченова протоколу. Имплантация была осуществлена в аортальную позицию вворачивающим швом: на правую полуокружность наложены П-образные швы, на левую полуокружность -обвивной непрерывный шов, проведена имплантация «кнопок» коронарных артерий в легочный гомографт на уровне синусов, наложен дистальнный анастомоз гомографта с аортой. Произведена профилактика воздушной эмболии. После восстановления кровообращения и синусового ритма было проведено послойное закрытие торакотомного доступа. Общая кровопотеря составила 400 мл (ЧД 17. АД 110/60, ЧСС 98. SpO2 98%). Животное переведено в загон. Свинья наблюдалась в течение недели с плановым выходом из эксперимента, состояние изменилось от средней тяжести до удовлетворительного с восстановлением аппетита. По результатам проведенного ЭХО-КГ: камеры сердца не были расширены, сократимость желудочков не нарушена. На аортальном клапане регургитация не регистрировалась (АД 110/69, ЧСС 91, ЧД 18, SpO2 99%). Результаты пилотного доклинического эксперимента дают основание рекомендовать предложенный способ для дальнейшего проведения полного цикла доклинических исследований с переводом в хронический эксперимент.
Первые опыты применения заявленного способа получения ГССС методом криоконсервации с применением ПДМС в качестве хладоагента, криопротекторного и криоконсервирующего средства демонстрируют его перспективность, так как он позволяет упростить и ускорить получение высококачественного ГССС и повысить эффективность его имплантации.
Неоднократное воспроизведение предложенного способа получения гомографтов сердечно-сосудистой системы возможно в целевых лабораториях исследовательских центров, а после клинических испытаний станет возможным.во всех отделениях сердечно-сосудистой хирургии.