Технология получения мышей с гуманизированным участком Gnao1 в области однонуклеотидного полиморфизма rs587777057 для тестирования РНК-терапии для GNAO1 c.607 G>A пациентов
TECHNOLOGY FOR OBTAINING MICE WITH A HUMANIZED GNAO1 REGION IN THE REGION OF SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM rs587777057 FOR TESTING RNA THERAPY FOR GNAO1 c.607 G>A PATIENTS

Технология получения мышей с гуманизированным участком Gnao1 в области однонуклеотидного полиморфизма rs587777057 для тестирования РНК-терапии для GNAO1 c. 607 G>A пациентов
Область техники
em1(GNAO1)IGB
Изобретение относится к области медицины и биотехнологий. Изобретение представляет собой технологию получения линии мышей с гуманизированным участком гена Gnao1 в районе однонуклеотидного полиморфизма rs587777057 без внесения нежелательных замен в кодирующую область гена. Данная линия мышей (CBA.Cg-Gnao1) может быть использована для проверки in vivo специфической токсичности препаратов РНК-терапии (на основе siRNA, shRNA, miRNA и ASO) для пациентов с вариантом c. 607 G>A GNAO1 энцефалопатии, направленной на подавление экспрессии мутантного аллеля.
Изобретение создано при финансовой поддержке Министерства Науки и Высшего образования Российской Федерации в рамках Соглашения № 075-15-2019-1661 от 31.10.2019.
Уровень техники
GNAO1 энцефалопатия является орфанным генетическим заболеванием, проявляющемся в младенческой эпилепсии, двигательными нарушениями и серьёзной задержкой развития. Заболевание вызвано гетерозиготными мутациями гена GNAO1, имеющими доминантное проявление. Наиболее часто встречающимся патогенным вариантом является замена с. 607 G>A в 6-м экзоне гена GNAO1 (rs587777057). К сожалению, лечения для данного тяжелого заболевания на сегодняшний день не существует. Большие надежды возлагаются на современные подходы к лечению генетических патологий, например, такие как РНК-направленная терапия. К РНК-терапии относятся препараты на основе антисмысловых олигонуклеотидов (АСО), а также коротких шпилечных РНК (shRNA) и искусственных микроРНК (amiRNA), которые доставляются в ткани пациента с помощью векторов на основе адено-ассоциированных вирусов. Применительно к GNAO1 энцефалопатии с вариантом с. 607 G>A, предполагается, что РНК-терапия снизит содержание мутантного белкового продукта, вероятно обладающего токсичными действием на нейроны пациента (Nakamura et al, 2013; Feng et al., 2017; Mihalek et al., 2017; Muntean et al., 2021). При этом работа здорового аллеля, производящего функциональный белок, затронута не будет. Тестирование безопасности подобных препаратов РНК-терапии целесообразно проводить на организмах, у которых нуклеотидная последовательность РНК идентична человеческой.
В научных работах 2013/2014 года была показана связь гетерозиготных мутаций гена GNAO1 с младенческими эпилептическими энцефалопатиями, сопровождающимися нарушением двигательных функций и серьёзной задержкой развития. В литературе описано около 25 различных патогенных мутаций гена GNAO1, наиболее часто встречается мутация с. 607 G>A (полиморфизм rs587777057), приводящая к аминокислотной замене G203R в белке. В настоящий момент остро стоит проблема создания линий мышей с точечными заменами в гене Gnao1 для изучения молекулярного механизма патологии, а также тестирования потенциальных лекарственных препаратов для данного заболевания.
Первая линия мышей с мутацией G184S в гене Gnao1 была получена с использованием генетически модифицированных эмбриональных стволовых клеток (Goldenstein et al., 2009; Kehrl et al., 2014). Эта технология предполагает трехэтапный процесс получения генетически модифицированных мышей: а) получение требуемой мутации в культуре стволовых клеток, б) инъекцию стволовых клеток в полость бластоцисты мыши, в) получение от мозаичных родителей потомков с требуемой модификацией в геноме в гомозиготном состоянии. Каждый из этапов работы представляется высокозатратным, весь процесс требует не менее 2,5 лет научно-исследовательских работ.
Альтернативой является технология редактирования генома с помощью программируемых эндонуклеаз. Так, технология редактирования генома на основе CRISPR/Cas9 позволяет вносить точечные замены в гены модельных организмов. Данная технология была также применена для редактирования гена Gnao1 мышей в работах группы Ричарда Ньюбига Мичиганского государственного университета, США (Feng et al., 2019; Larrivee et al., 2020).
Наиболее близкой по технической сущности к настоящему изобретению является работа работа Feng et al. (2019). В данной работе последовательность мышиного гена Gnao1 была отредактирована с образованием белкового продукта с аминокислотной заменой G203R. Наряду с введением целевой мутации, в кодирующую последовательность гена Gnao1 были введены дополнительные замены: (1) мутация, разрушающая PAM-сайт (protospaser adjacent motif), необходимый для внесения разрыва белком Cas9 и (2) синонимическая нуклеотидная замена для облегчения генотипирования методом рестрикционного анализа. Данная мышиная модель может быть использована для изучения механизма GNAO1 энцефалопатии с вариантом c. 607G>A и тестирования фармакологических препаратов. Однако ввиду различия последовательностей мышиного и человеческого генов, а также дополнительных нуклеотидных замен в кодирующей части, данная мышиная модель не может быть использована для тестирования препаратов РНК-терапии, работающих по принципу нуклеотидной комплементарности.
В другой работе группы Ричарда Ньюбига (Larrivee et al., 2020) технология CRISPR/Cas9 была успешно использована для введения гетерозиготной мутации c. 626G>A (R209H) в мышиный ген Gnao1. В данном случае кодирующую последовательность удалось сохранить без введения дополнительных замен. Вследствие этого единственным возможным способом генотипирования мышиного потомства было секвенирование соответствующего участка по Сэнгеру.
Работа по гуманизации участков гена GNAO1 модельных организмов была проведена на плодовой мушке (Drosophila melanogaster) группой Владимира Катанаева (Университет Женевы, Швейцария). Используя систему CRISPR/Cas9, участки гена gnao1 насекомого, содержащие экзоны 2-3 и 4-7, были замещены на нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислоты соответствующего белка человека (Savitsky et al., 2020). Полученную линию Drosophila c гуманизацией гена gnao1 авторы планируют в дальнейшем использовать для моделирования GNAO1 энцефалопатии с мутациями пациентов. Стоит отметить, что в данной работе гуманизация гена подразумевает изменение аминокислотной последовательности белка плодовой мушке на человеческую, при этом нуклеотидная последовательность гуманизированных участков гена отличается от последовательности гена человека.
Задачей данного изобретения является создание линии мышей с гуманизированным участком гена Gnao1 (экзон 6), пригодной для тестирования in vivo специфичности препаратов РНК-терапии для пациентов с вариантом c.607 G>A GNAO1 энцефалопатии. Для этого последовательность мышиного гена Gnao1 должна быть идентичной нуклеотидной последовательности гена GNAO1 человека в окне ±25 нуклеотидов вокруг полиморфизма rs587777057. При этом желательно введение дополнительных нуклеотидных маркеров для облегчения генотипирования полученных мутантов, не меняющих кодирующую область гена Gnao1. На фигуре 1 показано, что мышиная и человеческая последовательность транскрипта GNAO1 в окне ±25 нуклеотидов вокруг полиморфизма rs587777057 отличаются на один нуклеотид. Для гуманизации указанного участка мышиного Gnao1 достаточно внести единственную точечную замену G>A в 6-й экзон.
Настоящее изобретение заключается в создании технологии CRISPR/Cas9 для редактирования генома мыши и гуманизации участка гена Gnao1 в окне ±25 нуклеотидов вокруг полиморфизма rs587777057 (экзон 6). При этом интронная область содержит дополнительные замены, не влияющие на кодирующую область и облегчающие генотипирование путем рестрикционного анализа. Сайт разрезания геномной ДНК был подобран в ближайшем, 5-м интроне. Рядом с сайтом разрезания в интронной области была внесена вторая нуклеотидная замена с образованием сайта рестрикции BspMI. Гуманизированная линия мышей может быть использована для тестирования in vivo специфической токсичности препаратов РНК-терапии (например, антисмысловые олигонуклеотиды, короткие шпилечные РНК, искусственные микроРНК), разрабатываемые для пациентов с GNAO1 c. 607 G>A энцефалопатией.
Раскрытие сущности изобретения
Настоящее изобретение представляет собой технологию создания мышей с гуманизированной нуклеотидной последовательностью экзона 6 гена Gnao1 с использованием системы редактирования генома на основе CRISPR/Cas9, которая доставляется в мышиные зиготы путем микроинъекции и состоит из трех компонентов: (1) мРНК белка Cas9 (S.Pyogenes), вносящего двухцепочечный разрыв в геномную ДНК, (2) РНК-гида, направляющего Cas9 к специфичной нуклеотидной последовательности, и (3) короткой одноцепочечной ДНК (ssODN), служащей матрицей для застраивания разрыва и несущей желаемую нуклеотидную последовательность.
Настоящее изобретение представляет собой также способ редактирования генома яйцеклетки мыши с помощью комплекса редактирования генома, который доставляется в мышиные зиготы путем микроинъекции и состоит из трех компонентов: (1) мРНК белка Cas9 (S.Pyogenes), вносящего двухцепочечный разрыв в геномную ДНК, (2) РНК-гида, направляющего Cas9 к специфичной нуклеотидной последовательности, и (3) короткой одноцепочечной ДНК (ssODN), служащей матрицей для застраивания разрыва и несущей желаемую нуклеотидную последовательность.
Для осуществления изобретения были преобразованы РНК-гид и одноцепочечная ДНК-матрица.
РНК-гид был подобран к интронной области гена Gnao1, максимально близко расположенной к области, требующей гуманизации в экзоне 6 гена Gnao1. В одном из вариантов осуществления изобретения РНК-гид, таргетирующий Gnao1, имеет последовательность 5’-gctttccctgactccctgc-3’ (SEQ ID NO: 1).
В качестве матрицы для застраивания используется ssODN длиной 90 нуклеотидов. 3’ конец матрицы (40 нуклеотидов) содержит участок экзона 6 человеческого гена GNAO1, предназначенный для гуманизации мышиной последовательности. 5’-конец матрицы (50 нуклеотидов) идентичен участку интронной области мышиного гена Gnao1, а также содержит однонуклеотидную замену C>A. Данная замена находится в непосредственной близости (+6 нуклеотидов) от PAM-сайта в так называемой затравочной области (“seed region”) таргетной последовательности РНК-гида и имеет двойную функцию. С одной стороны, замена нуклеотида снижает вероятность повторного Cas9-опосредованного разрезания геномной ДНК после застраивания с использованием ssODN. C другой стороны, она приводит к образованию нового рестрикционного сайта BspMI (ACCTGC) в некодирующей области гена Gnao1, что удобно для быстрого первичного генотипирования потомства без секвенирования по Сэнгеру.
В одном из вариантов осуществления изобретения последовательность ssODN представлена SEQ ID NO: 2 (5’-tct agc tct tag gcg tcc ccg ccc tca cag ctt tcc ctg act Acc tgc agg ctg ttt gac gtc ggA ggc cag cga tct gaa cgc aag aag-3’).
Вышеперечисленные особенности настоящего изобретения позволили избежать при CRISPR/Cas9-опосредованном редактировании мышиного генома внесения дополнительных замен в кодирующую область экзона 6 гена Gnao1, как это было описано в Feng et al. (2019). При этом в отличие от работы Larrivee et al., 2020, при данном техническом решении внесены дополнительные маркерные замены в некодирующую область, что позволяет проводить генотипирование не только секвенированием по Сэнгеру, но и рестрикционным анализом.
em1(GNAO1)IGB
Изобретение также представляет собой линию мышей CBA.Cg-Gnao1 , содержащую последовательность гена Gnao1 в окне ±25 нуклеотидов вокруг полиморфизма rs58777705, идентичную человеческой, и новый рестриктный сайт BspMI в некодирующей области гена Gnao1 (интрон 5). Линия мышей не содержит дополнительных замен в кодирующей области Gnao1 в месте редактирования с помощью комплекса CRISPR/Cas9.
em1(GNAO1)IGB
Технический результат изобретения: разработан способ получения линии мутантных мышей c гуманизированной нуклеотидной последовательностью экзона 6 гена Gnao1 и выведена соответствующая линия мышей CBA.Cg-Gnao1  с гуманизированным участком гена в районе полиморфизма rs587777057.
Краткое описание чертежей
Фигура 1. Сравнение нуклеотидной последовательности человеческого (NM_020988.3) и мышиного (NM_010308.3) транскриптов гена GNAO1 в окне ±25 нуклеотидов вокруг полиморфизма rs587777057. Пунктирной вертикальной линией показана граница 5-го и 6-го экзона. Заглавным шрифтом отмечен нуклеотид в мышином транскрипте, отличный от человеческой последовательности. Ниже приведены кодируемые транскриптом аминокислоты и их позиция в белковом продукте.
Фигура 2. Иллюстрация технического решения по редактированию участка 6-го экзона мышиного гена Gnao1 с помощью инструментов CRISPR/Cas9. Приведена последовательность гена Gnao1 на границе 5-го интрона и 6-го экзона (выделен серым). Заглавным шрифтом отмечен нуклеотид, подлежащий замене для гуманизации данного участка. Жирным шрифтом выделен PAM-сайт для Cas9 (S.pyogenes), в данном случае совпадающий с 3' сплайс сайтом. Вертикальной стрелкой показано предполагаемое место Cas9-опосредованного разрезания геномной ДНК. Ниже приведена последовательность РНК-гида, таргетирующая Gnao1, курсивом отмечена затравочная область (“seed region”). Ниже приведена последовательность ДНК-матрицы для застраивания; заглавным шрифтом выделены вносимые точечные замены; сайт рестрикции BspMI подчеркнут. Крестиками условно показано предполагаемое застраивание разрыва по механизму гомологичной рекомбинации.
Фигура 3. Генотипирование первичного мутанта. ПЦР-продукты геномной ДНК, выделенные из фрагментов ткани мышей, обрабатывали рестриктазой BspMI и анализировали в агарозном геле. Появление двух рестрикционных фрагментов указывает на наличие рестрикционного сайта, а следовательно, на успешное Cas9-опосредованное разрезание геномного участка Gnao1 и застраивание c использованием привнесенной ДНК-матрицы.
Фигура 4. Генотипирование потомства первичного мутанта. Аналогично фигуре 3, ПЦР-продукты геномной ДНК мышей обрабатывали рестриктазой BspMI и анализировали в агарозном геле. Наличие и интенсивность рестрикционных фрагментов соответствует присутствию модифицированной последовательности в гетеро- (мыши №4-6) и гомозиготном (мыши №7-9) состоянии в геномной ДНК исследуемых животных.
em1(GNAO1)IGB
em1(GNAO1)IGB
Фигура 5. Нуклеотидная последовательность гена Gnao1 на стыке 5-го интрона и 6-го экзона. Показаны результаты секвенирования по Сэнгеру указанного геномного участка Gnao1 в мышах дикого типа (линия СВА) и полученной гуманизированной линии мышей CBA.Cg-Gnao1 . Мыши CBA.Cg-Gnao1  содержат две однонуклеотидные замены в геномной последовательности (отмечены звездочкой): замена С>A в интроне 5 для генотипирования рестрикционным анализом и замена G>A в экзоне 6 для гуманизации участка кодирующей области Gnao1.
em1(GNAO1)IGB
Фигура 6. Нуклеотидная последовательность транскрипта Gnao1 в линии мышей CBA.Cg-Gnao1 . Показаны результаты секвенирования по Сэнгеру для участка транскрипта в окне ±25 нуклеотидов вокруг полиморфизма rs587777057. Введенная точечная замена для гуманизации данного участка Gnao1 отмечена звездочкой.
Осуществление изобретения
Пример 1. Подготовка инструментов CRISPR/Cas9. Для введения точечной замены в экзон 6 мышиного гена Gnao1 c целью гуманизации участка в районе полиморфизма rs587777057 (Фиг. 1) мы использовали инструменты для редактирования генома на основе CRISPR/Cas9 (Фиг. 2):
• Таргетирующая последовательность РНК-гида подбиралась вручную. Был выбран ближайший к подлежащей замене нуклеотиду PAM-сайт (консенсус 5’-NGG-3’) в области интрона 5 (Фиг. 2). 20 нуклеотидов выше PAM-сайта (5’-gctttccctgactccctgc-3’, SEQ ID NO: 1) являются Gnao1-таргетирующим участком РНК-гида. РНК-гид был получен по описанной ранее методике in vitro транскрипции на матрице, полученной с помощью ПЦР с перекрывающимися праймерами (Egorova et al., 2019). РНК-гид разводили в воде, свободной от нуклеаз до 150 нг/мкл, аликвоты хранили при -70°C до использования.
• Cas9 мРНК была получена по описанной ранее методике (Egorova et al., 2019). Полученная РНК была разведена до концентрации 500 нг/мкл, аликвоты хранились при -70°C до использования.
• В качестве матрицы для гомологичной рекомбинации использовался короткий одноцепочечный ДНК-олигонуклеотид (ssODN), что является оптимальным для введения точечных замен в геномную ДНК (Фиг. 2). Одноцепочечный фрагмент ДНК длиной 90 нуклеотидов был синтезирован и очищен компанией Евроген (Россия). Лиофилизированную ДНК ресуспендировали в стерильной воде до конечной концентрации 100 мкМ и хранили при температуре -20°C.
Пятьдесят 5’-концевых нуклеотидов последовательности ssODN идентичны участку интронной области мышиного гена Gnao1 и содержат однонуклеотидную замену C>A для создания нового рестрикционного сайта BspMI (ACCTGC) в некодирующей области гена для генотипирования. Сорок 3’-концевых нуклеотидов идентичны участку экзона 6 человеческого гена GNAO1 и вносят однонуклеотидную замену в кодирующую область мышиного Gnao1.
2
Пример 2. Редактирование генома мышиной яйцеклетки. Получение оплодотворенных яйцеклеток мышей C57BL/6xCBA/lac проводили по ранее описанной процедуре (Zvezdova et al., 2010). мРНК Cas9, РНК-гид и ssODN смешивали в буфере для инъекций (10 мМ Tris-HCl (pH 7.4); 0.1 мМ EDTA) в объёме 50 мкл и до конечной концентрации 50 нг/мкл, 18.6 нг/мкл и 5 мкМ, соответственно. Полученную смесь прогревали 5 минут при 65°С и центрифугировали 5 минут при 14000 об/мин. С помощью микроинъекции комплекс доставляли в мужской пронуклеус зиготы через 12 часов после оплодотворения (Egorova et al., 2019). После микроинъекции зиготы переносили в каплю (50-60 мкл) среды KSOM (MTI-GlobalStem) под минеральное масло (Sigma) и культивировали 2-3 часа при 37°С в атмосфере 5% CO. Жизнеспособные эмбрионы пересаживали самкам реципиентам согласно стандартной процедуре (Silaeva et al., 2019).
Пример 3. Получение первичного мутанта и генотипирование потомства. Через неделю после рождения у мышат брали биопсию хвоста для генотипирования. Для получения геномной ДНК образцы мышиной ткани инкубировали 1 час при 95°C в щелочном лизирующем буфере [25 mM NaOH, 0.2 mM Na2-EDTA (pH 12.0)], затем нейтрализовали 40 mM Tris-HCl (pH 5.0). Амплификацию фрагментов ДНК проводили путем стандартной ПЦР-реакции с 2 мкл грубого лизата ткани с помощью набора GenPak™ PCR Core (Isogene) и в присутствии прямого (5’-actaggagacggagaggtgag-3’) и обратного (5’-gtgcgtcctagccaagacc-3’) праймера. Использовался следующий режим: денатурация 95°С - 5 мин; далее следовало 35 циклов: 95°С - 30 сек, 60°С - 30 сек; 72°С - 1 мин; и последний синтез 72°С - 5 мин. В результате получали ПЦР-продукт длиной 533 п.н., который очищали на колонках набора Cleanup Standard (Evrogen) согласно стандартного протоколу.
Первичное генотипирование животных проводили с помощью рестрикционного анализа. Для этого 250 нг очищенного ПЦР-продукта инкубировали 1 час при 37°C с 0.5 единицами рестриктазы BspMI (New England Biolabs, R0502S) в буфере NEBuffer 3.1. Рестриктазу инактивировали прогреванием при 65°C при 20 минут. Получаемые фрагменты ДНК анализировали путем электрофореза в 2% агарозном геле. Наличие рестрикционных фрагментов длиной 332 и 201 п.н. свидетельствовало об успешном событии застраивания Cas9-обусловленного разрыва геномной ДНК с помощью ssODN по механизму гомологичной рекомбинации. Наличие целевой мутации в кодирующей области подтверждали методом секвенирования по Сэнгеру ПЦР-продукта с прямым праймером (ЦКП “Геном”).
em1(GNAO1)IGB
Пример 4. Выведение линии мышей CBA.Cg-Gnao1. В результате пересадки отредактированных зигот был получен один первичный мутант - самка с идентификационным номером 5349 (дата рождения 02.04.2019) с гетерозиготной модификацией участка гена Gnao1. Первичного мутанта скрещивали с самцом линии CBA для получения потомства F1. Генотипирование F1 мышей проводили рестрикционным анализом с помощью BspMI, как описано выше. C гетерозиготными самцами из поколения F1 после достижения половозрелости проводили обратное скрещивание и проводили генотипирование помёта рестрикционным анализом (Фиг. 4). Отсутствие сайта рестрикции BspMI указывает на образование потомства дикого типа. Мутантные особи отличаются наличием рестрикционных фрагментов, при этом интенсивность фрагментов в геле указывает на присутствие замены в гетерозиготном или гомозиготном состоянии.
em1(GNAO1)IGB
Для выведения линии мышей с гуманизацией участка обоих аллелей Gnao1 CBA.Cg-Gnao1  проводили дальнейшее скрещивание гомозиготных мышей. Наличие целевой мутации в кодирующей области геномной ДНК (Фиг. 5) и транскрипта (Фиг. 6) гена Gnao1 подтверждали секвенирование по Сэнгеру, как описано выше.
Использованная литература:
Egorova TV, Zotova ED, Reshetov DA, et al. CRISPR/Cas9-generated mouse model of Duchenne muscular dystrophy recapitulating a newly identified large 430 kb deletion in the human DMD gene. Dis Model Mech. 2019; 12(4):dmm037655. https://doi.org/10.1242/dmm.037655
ES, Silaeva IuIu, Vagida MS, Mariukhnich EV, Deĭkin AV, Ermolkevich TG, Kadulin SG, Sadchikova ER, Gol'dman IL, Kazanskiĭ DB. [Generation of transgenic animals, expressing alpha- and beta-chains of autoreactive TCR]. Mol Biol (Mosk). 2010 Mar-Apr; 44(2):311-22. Russian. PMID: 20586192.
Feng H, Larrivee CL, Demireva EY, Xie H, Leipprandt JR, Neubig RR. Mouse models of GNAO1-associated movement disorder: Allele- and sex-specific differences in phenotypes. PLoS One. 2019 Jan 25; 14(1):e0211066. doi: 10.1371/journal.pone.0211066. PMID: 30682176; PMCID: PMC6347370.
Feng H, Sjögren B, Karaj B, et al (2017) Movement disorder in GNAO1 encephalopathy associated with gain-of-function mutations. Neurology 89:762-770. https://doi.org/10.1212/WNL.0000000000004262
Goldenstein BL, Nelson BW, Xu K, Luger EJ, Pribula JA, Wald JM, O'Shea LA, Weinshenker D, Charbeneau RA, Huang X, Neubig RR, Doze VA. Regulator of G protein signaling protein suppression of Galphao protein-mediated alpha2A adrenergic receptor inhibition of mouse hippocampal CA3 epileptiform activity. Mol Pharmacol. 2009 May; 75(5):1222-30. doi: 10.1124/mol.108.054296. Epub 2009 Feb 18. PMID: 19225179; PMCID: PMC2672807.
Kehrl JM, Sahaya K, Dalton HM, Charbeneau RA, Kohut KT, Gilbert K, Pelz MC, Parent J, Neubig RR. Gain-of-function mutation in Gnao1: a murine model of epileptiform encephalopathy (EIEE17)? Mamm Genome. 2014 Jun; 25(5-6):202-10. doi: 10.1007/s00335-014-9509-z. Epub 2014 Apr 5. PMID: 24700286; PMCID: PMC4042023.
Larrivee CL, Feng H, Quinn JA, Shaw VS, Leipprandt JR, Demireva EY, Xie H, Neubig RR. Mice with GNAO1 R209H Movement Disorder Variant Display Hyperlocomotion Alleviated by Risperidone. J Pharmacol Exp Ther. 2020 Apr; 373(1):24-33. doi: 10.1124/jpet.119.262733. Epub 2020 Jan 6. PMID: 31907305.
Mihalek I, Waugh JL, Park, Kayani S, Poduri A, Bodamer O. (2020) Molecular map of GNAO1-related disease phenotypes and reactions to therapy. bioRxiv 232058; doi: https://doi.org/10.1101/232058
Muntean BS, Zucca S, MacMullen CM, Dao MT, Johnston C, Iwamoto H, Blakely RD, Davis RL, Martemyanov KA. Interrogating the Spatiotemporal Landscape of Neuromodulatory GPCR Signaling by Real-Time Imaging of cAMP in Intact Neurons and Circuits. Cell Rep. 2018 Jan 2; 22(1):255-268. doi: 10.1016/j.celrep.2017.12.022.
Nakamura K, Kodera H, Akita T, et al (2013) De Novo mutations in GNAO1, encoding a Gαo subunit of heterotrimeric G proteins, cause epileptic encephalopathy. Am J Hum Genet 93:496–505. https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2013.07.014
Savitsky M., Solis G.P., Kryuchkov M., Katanaev V.L. (2020) Humanization of Drosophila Gαo to Model GNAO1 Paediatric Encephalopathies. Biomedicines, 8(10): 395. doi: 10.3390/biomedicines8100395
Silaeva Y, Kirikovich Y, Skuratovskaya L, Deikin A. Optimal Number of Embryos for Transplantation in Obtaining Genetic-Modified Mice and Goats. Russian Journal of Developmental Biology. 2019-2-; 49(6):356-361. doi: 10.1134/S106236041806005X.
<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт
биологии гена Российской академии наук (Institute of Gene
Biology Russian Academy of Sciences)
<120> Технология получения мышей с гуманизированным участком Gnao1
в области однонуклеотидного полиморфизма rs587777057 для
тестирования РНК-терапии для GNAO1 c.607 G>A пациентов
<160> 2
<210> 1
<211> 19
<212> ДНК
<213> artificial sequence
<220>
<223> guide RNA
<400> 1
gctttccctg actccctgc 19
<210> 2
<211> 90
<212> ДНК
<213> artificial sequence
<220>
<223> ssODN
<400> 2
tct agc tct tag gcg tcc ccg ccc tca cag ctt tcc ctg act Acc tgc agg ctg ttt gac 60
gtc ggA ggc cag cga tct gaa cgc aag aag 90