ПОЛИПЕПТИДЫ, СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С КОМПОНЕНТОМ С5 СИСТЕМЫ КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА
POLYPEPTIDES BINDING TO HUMAN COMPLEMENT C5

Область техники
Настоящее изобретение относится к полипептидам, которые связываются с компонентом 5 (C5) системы комплемента человека, и к применению таких полипептидов в терапии.
Предпосылки создания изобретения
Белок С5 комплемента является центральным компонентом системы комплемента, ключевой части врожденной иммунной системы. Система комплемента является сложной системой иммунного выживания с многочисленными задачами в жестко контролируемых, разнообразных процессах. Одной из ее функций является как раз первая линия обороны организма против инфекции, вызванной другими организмами, за счет способности отличать здоровые ткани хозяина от клеточного дебриса и апоптотических и некротических клеток. Кроме того, эта система участвует в клиренсе иммунных комплексов, регулировании адаптивного иммунного ответа, стимуляции регенерации тканей, ангиогенезе, мобилизации стволовых клеток и развитии центральной нервной системы (Woodruff et al. Mol Immunol 2011, 48(14):1631-1642); Ricklin et al. Nat Immunol 2010, 11(9):785-795). Любой пусковой фактор, например, ошибочная или неограниченная активация или недостаточное регулирование, которые нарушают тонкий баланс активации и регулирования комплемента, могут привести к патологическим состояниям, включая аутоиммунную атаку на клетки организма-хозяина, приводящую к обширному повреждению тканей.
Система комплемента состоит примерно из 30 белков. Существует три пути для активации системы комплемента: классический путь, в котором для распознавания иммунных комплексов на поверхности клеток используется C1q; лектиновый путь, который инициируется при распознавании маннозосвязывающим лектином (MBL) определенных сахаров; и альтернативный путь, который инициируется спонтанно путем гидролиза фактора комплемента 3 (C3), причем процесс подавляется некоторыми молекулами на поверхности клеток млекопитающих, которые отсутствуют на поверхности болезнетворных микроорганизмов. Альтернативный путь также выступает в качестве усилительной петли для системы комплемента. Все три пути сходятся на уровне С3. Расщепление С3 на C3b и С3а приводит к образованию конвертазы, которая, в свою очередь, расщепляет фактор комплемента 5 (C5) на С5а и C5b. С5а является очень мощным аттрактантом различных иммунных клеток, в то время как C5b олигомеризуется с C6-9 с образованием поры, известной как мембраноатакующий комплекс (MAC) или, иногда, терминальный комплекс комплемента (TCC). Активация системы комплемента запускает ряд механизмов с целью нейтрализации патогена: образование MAC на поверхности клетки, такой как болезнетворная бактерия, приводит к лизису; отложение продуктов расщепления С3 и С4 (C3b и C4b) способствует опсонизации, которая приводит к фагоцитозу возбудителя макрофагами, а анафилотоксины, такие как С3а и C5a, привлекают моноциты и нейтрофилы к месту активации, активируют поверхностные маркеры, что приводит к увеличению иммунологической чувствительности и высвобождению цитокинов.
C5 представляет собой гликопротеин весом 190 кДа, содержащий две связанные дисульфидной связью полипептидные цепи - альфа и бета, с молекулярной массой 115 и 75 кДа, соответственно (Tack et al. Biochem 1979, 18:1490-1497). Haviland et al. (J. Immun 1991, 146:362-368) сконструировали полную последовательность кДНК пробелка C5 комплемента человека, которая предположительно кодирует 1676-аминокислотную промолекулу, содержащую 18-аминокислотный лидерный пептид и 4-аминокислотный линкер, разделяющий бета- и альфа-цепи. Блокирование расщепления C5 на C5a и C5b предупреждает образование MAC и провоспалительного C5a, но оставляет нетронутой вышестоящую эффекторную систему комплемента, позволяя C3/C4-опосредованную опсонизацию.
Ключевая роль системы комплемента в защите от патогенов в целом делает ее интересным объектом для фармацевтического вмешательства. Это подчеркивается тем фактом, что многие мутации или нарушенная регуляция системы комплемента связаны с различными заболеваниями и болезненными состояниями. Они включают в себя повышение вероятности возникновения аутоиммунных заболеваний, таких как системная красная волчанка (SLE), при которой отложение иммунных комплексов запускает классический путь (Manderson et al. Annu Rev Immunol 2004, 22:431-456). Кроме того, мутации в белках комплемента C1-C5 часто приводят к SLE или SLE-подобным симптомам. Другими аутоиммунными заболеваниями с заметным вкладом системы комплемента являются ревматоидный артрит (RA), при котором иммунные комплексы могут активировать систему комплемента в пораженном RA суставе, синдром Шегрена, дерматомиозит и другие заболевания, вызываемые аутоантителами, такие как синдром Гийена-Барре (GBS), синдром Фишера (Kaida et al. J. Neuroimmun 2010, 223:5-12), различные типы васкулита, системный склероз, антитела к клубочковой базальной мембране (анти-GBM) и антифосфолипидный синдром (АФС) (Chen et al. J Autoimmun 2010, 34:J276-J286).
Система комплемента, кроме того, участвует в нейродегенеративных расстройствах, таких как болезнь Альцгеймера (AD), при которой амилоидные (Аβ) бляшки непосредственно активируют систему комплемента, приводя к С5а-опосредованному привлечению микроглии. Это было дополнительно подтверждено демонстрацией нейропротекторного действия антагониста C5aR в мышиной модели AD (Fonseca et al. J Immunol 2009, 183:1375-1383). Аутоантитела к ацетилхолиновому рецептору и последующая активация комплемента являются наиболее распространенной причиной миастении гравис, болезни, затрагивающей нервно-мышечные соединения (Toyka and Gold, Schweizer Archive Neurol Psych 2007, 158:309-321). Образование MAC участвует в патофизиологии рассеянного склероза (MS) (Oh et al. Immunol Res 2008, 40:224-234). Также при болезни Паркинсона, болезни Хантингтона и прионных заболеваниях, таких как болезнь Крейтцфельда-Якоба, активация комплемента является частью патологического процесса (Bonifati and Kishore, Mol Immunol 2007, 44:999-1010). В процессе заживления ран воспалительные реакции являются ключевым компонентом восстановления тканевого гомеостаза, а система комплемента участвует в ранней диагностике поврежденных тканей. Тем не менее в моделях хронических ран и сильных ожогов ингибирование системы комплемента, например, ингибитором C1, приводило к улучшению заживления и уменьшению повреждения тканей, что позволяет предположить участие системы комплемента. Кроме того, было найдено, что различные нарушения в системе комплемента, такие как, например, у мышей, нокаутных по C4, защищают от долгосрочного повреждения тканей в результате ран (обзор приведен в статье Cazender et al. Clinical and Developmental Immunology 2012, опубликованной он-лайн). В последнее время было показано, что росту опухоли и пролиферации способствует активация системы комплемента, в частности С5а, а блокирование рецептора С5а замедляет этот процесс. Кроме того, у мышей, лишенных C3, наблюдался значительно более медленный рост опухоли, чем у их однопометников дикого типа (Markiewski et al. Nat Immunol 2008, 9:1225-1235).
Нарушенное регулирование системы комплемента является причиной нескольких редко встречающихся или ультраредко встречающихся болезненных состояний, таких как пароксизмальная ночная гемоглобинурия (PNH) и атипичный гемолитико-уремический синдром (aHUS), при которых гемолиз является ключевой особенностью патологии. При PNH клон гематопоэтических стволовых клеток с мутациями в гене PIG-A, кодирующем субъединицу А фосфатидилинозит-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы, занимает весь пул клеток крови. Эта мутация приводит к потере белков, заякоренных через GPI на поверхности клеток, таких как регуляторы комплемента, CD55 и CD59. Красные кровяные клетки, лишенные CD55 и CD59 на поверхности, подвергаются комплемент-опосредованному лизису с помощью MAC. Клинически PNH проявляется гемолизом, приводящим к анемии, тромбозу и нарушениям работы костного мозга. Атипичный HUS вызывается мутациями в регуляторных белках, главным образом, альтернативного пути, такими как мутации в факторе H.
Достоверно показано, что глаз является участком, затрагиваемым патологическими процессами при нарушениях работы комплемента. Наиболее распространенной причиной потери зрения является возрастная макулярная дегенерация (AMD), при которой в ее более тяжелой форме (экссудативная или влажная AMD) под сетчаткой развиваются патологические хориоидальные нейроваскулярные мембраны. В США около 10% населения в возрасте 65-74 лет имеет признаки макулярной дегенерации и до 5% имеют нарушения зрения в результате AMD. Эти цифры резко увеличиваются с возрастом, но также присутствуют и генетические факторы. Из генов наиболее сильно связанными с AMD белками системы комплемента являются факторы H, B и С3 и ингибитор С1 (Bradley et al. Eye 2011, 25:683-693). Кроме того, несколько исследований и клинических испытаний с использованием различных блокирующих систему комплемента молекул доказали их эффективность при этом заболевании, позволяя предположить, что молекула, блокирующая С5, может помочь этой группе пациентов. Тем не менее, современные методы лечения поздних стадий AMD направлены на ингибирование васкуляризации, индуцированной фактором роста эндотелия сосудов (VEGF), путем интравитреальных инъекций, например, Ранибизумаба (фрагмента моноклонального антитела) и Бевацизумаба (моноклонального антитела). В животных моделях увеита, воспаления глаз из-за иммунного ответа на глазные антигены, блокирующие антитела к фактору В альтернативного пути (Manickam et al. J. Biol Chem 2011, 286:8472-8480), а также к фактору C5 (Copland et al. Clin Exp Immunol 2009, 159:303-314), улучшали состояние заболевания.
При трансплантации солидных органов существуют два основных механистических пути, ведущих к отказу или задержке/нарушению функций трансплантата: 1) иммунологические барьеры между донором и реципиентом по группе крови (АВО) и классам MCH, а также степень предварительной сенсибилизации реципиента к донору, то есть появление донор-специфических антител (DSA), ведущих к острому антитело-опосредованному отторжению (AMR); и 2) состояние трансплантируемого органа, а также период времени, в течение которого он хранился без постоянного кровотока, т.е. степень ишемического повреждения или ишемического-реперфузионного повреждения (IRI) трансплантата. В обоих случаях AMR и IRI, система комплемента атакует орган, распознаваемый как чужеродный, и, следовательно, объект, который должен быть отторгнут. При AMR уже существующие антидонорные антитела быстро образуют иммунные комплексы на внешней поверхности органа, приводящие к узнаванию его C1q и последующей активации системы комплемента по классическому пути. Этот процесс, известный как сверхострое отторжение, происходит в течение нескольких минут, и поэтому современная трансплантация несовместимых органов включает в себя ликвидацию DSA перед трансплантацией с помощью плазмафереза или обмена плазмы и внутривенного введения IgG в сочетании с различными иммунодепрессантами. Новые методики также включают истощение В-клеток с использованием анти-CD20 антитела ритуксимаба (Genberg et al. Transplant 2008, 85:1745-1754). Эти протоколы значительно снижают возникновение сверхострого отторжения, но все еще у сильно сенсибилизированных больных заболеваемость острым AMR (в течение недель-месяцев) достигает 40% (Burns et al. Am J Transplant 2008, 6:2684-2694; Stegall et al. Am J Transplant 2011, ранняя публикация он-лайн). В отношении IRI, в качестве основной причины повреждения тканей большинство данных указывает на терминальный путь с последующим образованием MAC и лизиса. Таким образом, блокирование полипептида С5 будет защищать от отторжения, независимо от его причины, которой является AMR, IRI или, как это часто бывает, комбинация обоих AMR и IRI. Как и ожидалось, сильно перфузированные органы, такие как печень (Qin et al. Cell Mol Immunol 2006, 3:333-340), сердце и почки, особенно подвержены повреждениям, опосредованным системой комплемента.
Центральная позиция белка C5, соединяющего проксимальную и терминальную части каскада системы комплемента, делает его привлекательной мишенью для фармацевтического вмешательства. Поскольку C5 является общим для всех путей активации комплемента, блокирование С5 остановит развитие каскада независимо от стимула и тем самым предупредит патологические свойства терминальной активации комплемента, оставляя нетронутыми иммунозащитные и иммунорегуляторные функции проксимального участка каскада комплемента.
Известны антитела, направленные на белок С5 системы комплемента человека, например, указанные в патентах WO 95/29697, WO 02/30985 и WO 2004/007553. Экулизумаб (Солирис™) представляет собой гуманизированное моноклональное антитело против белка C5, которое предупреждает расщепление C5 на С5а и C5b. Было показано, что экулизумаб эффективен при лечении PNH, редкого и иногда угрожающего жизни заболевания крови, характеризующегося внутрисосудистой гемолитической анемией, тромбофилией и нарушениями работы костного мозга, и этот препарат был одобрен для лечения этого заболевания. Экулизумаб также недавно был одобрен FDA для лечения атипичного гемолитического синдрома (aHUS), редкого, но опасного для жизни заболевания, вызванного потерей контроля альтернативного пути комплемента, приводящей к избыточной его активации, проявляющейся в виде тромботической микроангиопатии (TMA), которая приводит к постоянному риску повреждения жизненно важных органов, таких как почки, сердце и мозг. При aHUS трансплантация поврежденного органа только временно помогает пациенту, так как печень продолжает производить мутантную форму белка-регулятора (наиболее часто, фактора Н системы комплемента или других белков альтернативного пути). Родственным заболеванием с временной острой патофизиологией является HUS, вызванный инфекцией положительной по Шига-токсину E. coli (STEC-HUS), и уже есть многообещающие клинические данные, свидетельствующие об эффективности также и для этого болезненного состояния (Lapeyraque et al. N Engl J Med 2011, 364:2561-2563). Наконец, было доказано, что блокирующее С5 антитело экулизумаб эффективно для предупреждения AMR у реципиентов почек, являющихся высоко несовместимыми (Stegall, M. D. et al. Am J Transplant 2011, 11:2405-2413).
Помимо полноразмерных антител, в литературе описаны одноцепочечные фрагменты вариабельных областей (ScFv), миниантитела и аптамеры, направленные на C5. Эти ингибиторы C5 могут связываться с различными участками (эпитопами) на молекуле C5 и могут иметь различные способы действия. Например, тогда как Экулизумаб взаимодействует с C5 на некотором удалении от сайта расщепления конвертазы, миниантитело Мубодина взаимодействует с участком расщепления С5. Было высказано предположение, что ингибитор комплемента из мягкого клеща Ornithodoros moubata, ингибирующий белок C5 (OmCI, Nunn, M. A. et al. J Immunol 2005, 174:2084-2091), связывается с удаленным концом супердомена CUB-C5d-MG8, который находится рядом с участком расщепления конвертазой (Fredslund et al. Nat Immunol 2008, 9(7):753-760). В отличие от указанных выше трех белков, ингибирующих расщепление C5, моноклональное антитело TNX-558 связывается с эпитопом С5а, присутствующим как на исходном C5, так и на высвобождаемом C5a, и не ингибирует расщепление C5. (Fung и et al. Clin Exp Immunol 2003, 133(2):160-169).
Антитела с их сложной мультидоменной структурой, 12 внутрицепочечными и 4 межцепочечными дисульфидными мостиками и сложной схемой гликозилирования, имеют ряд собственных недостатков, связанных со своей молекулярной структурой. Например, размер Экулизумаба составляет примерно 148 кДа. Концентрация C5 в крови человека составляет около 400 нМ, и для полного блокирования активности C5 концентрация ингибитора по меньшей мере должна быть равна ей или превышать ее. Таким образом, стандартной пожизненной схемой лечения PNH с использованием Солириса™ является внутривенная инфузия 900 мг белка каждую вторую неделю, которую в основном проводят в клинике, что приводит к большим неудобствам для пациента и затратам для общества. Также было опубликовано, что Солирис™ вызывает боль в груди, лихорадку, озноб, зуд, крапивницу, гиперемию кожи лица, сыпь, головокружение, проблемы с дыханием или отек лица, языка и горла, хотя причины этих побочных эффектов не ясны. Кроме того, Экулизумаб не активен ни в одной из протестированных животных моделей, в том числе на приматах, что делает исследования действующего препарата на животных невозможными. Как указано выше, существующие методы лечения AMD также зависят от антител и, таким образом, существует сильная потребность в процедурах, основанных на инъекциях или других способах введения молекул с низкой молекулярной массой.
Кроме того, получение антител сложнее и дороже, чем получение небольших белков (Kenanova et al. Expert Opin Drug Deliv 2006, 3(1):53-70). Другие недостатки, обычно связанные с антителами, перечислены в статье Reilly et al. (Clin Pharmacokinet 1995, 28:126-142), например, перекрестная реактивность и неспецифическое связывание в нормальных тканях, ускорение метаболизма вводимых антител и образование у человека антител к антителам человека (НАМА), вызывающее снижение или потерю терапевтического эффекта.
Таким образом, дальнейший поиск агентов с сопоставимой блокирующей С5 активностью по-прежнему вызывает значительный интерес в этой области. В частности, существует постоянная потребность в молекулах, предупреждающих терминальный каскад комплемента, а также образование провоспалительной молекулы С5а. Большой интерес вызывает также предоставление вариантов применения таких молекул при лечении заболеваний.
Описание
Задачей настоящего изобретения является предоставление новых агентов, связывающих белок C5. Кроме этого, задачей изобретения является предоставление новых агентов, связывающих белок C5, для применения в терапии.
В одном аспекте изобретение относится к С5-связывающему полипептиду, содержащему С5-связывающий мотив, BM, причем данный мотив состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из:
в которой, независимо друг от друга,
2
X выбран из Н, Q, S, T и V;
3
X выбран из I, L, M и V;
4
X выбран из A, D, E, H, K, L, N, Q, R, S, T и Y;
6
X выбран из N и W;
7
X выбран из A, D, E, H, N, Q, R, S и T;
11
X выбран из A, E, G, H, K, L, Q, R, S, T и Y;
16
X выбран из N и T;
17
X выбран из I, L и V;
18
X выбран из A, D, E, H, K, N, Q, R, S и T;
21
X выбран из I, L и V;
25
X выбран из D, E, G, H, N, S и T;
26
X выбран из K и S;
28
X выбран из A, D, E, H, N, Q, S, T и Y;
и
ii) аминокислотной последовательности, которая имеет по меньшей мере 86%-ную идентичность с последовательностью по п. i), причем полипептид связывается с C5.
Определенный выше класс родственных по последовательности полипептидов, имеющих аффинность связывания к C5, происходит от общей родительской полипептидной последовательности. Более конкретно, определение класса основано на анализе большого числа случайных полипептидных вариантов родительского полипептида, которые были выбраны в экспериментах по отбору по их взаимодействию с С5. Идентифицированный С5-связывающий мотив, или ВМ, соответствует целевой области связывания в родительском полипептидном каркасе, причем область составляют две альфа-спирали внутри белкового домена, представляющего пучок из трех спиралей. В родительском полипептидном каркасе варьируемые аминокислотные остатки двух спиралей BM составляют связывающую поверхность для взаимодействия с константной частью антител, Fc. Путем случайного изменения остатков связывающей поверхности и последующего отбора вариантов, способность связывающей поверхности взаимодействовать с Fc была заменена способностью взаимодействовать с C5.
Как пояснено в нижеследующих примерах, отбор связывающих С5 полипептидных вариантов можно провести, например, с помощью фагового дисплея для отбора исходных вариантов белкового каркаса, необязательно, с последующим созреванием аффинности и клеточным дисплеем для отбора аффинно зрелых вариантов, связывающих C5. Однако следует понимать, что для отбора C5-связывающих полипептидов может использоваться любая система отбора, будь то фаговая, бактериальная, клеточная или какая-либо другая система отбора.
D
D
D
Термины «связывание с C5» и «аффинность связывания с С5», используемые в данном описании, относятся к свойству полипептида, которое может быть проверено, например, путем использования методики поверхностного плазмонного резонанса, например, в приборе Biacore (GE Healthcare). Аффинность связывания с C5 может, например, быть проверена в эксперименте, в котором С5 иммобилизован на чипе датчика инструмента Biacore, а образец, содержащий полипептид, подлежащий проверке, пропускают через чип. В альтернативном варианте проверяемый полипептид иммобилизуют на сенсорном чипе прибора, а образец, содержащий С5 или его фрагмент, пропускают через чип. Специалист в данной области может затем интерпретировать результаты, полученные в таких экспериментах, чтобы установить по меньшей мере качественное измерение связывания полипептида с C5. Если желательно количественное измерение, например, для определения кажущейся равновесной константы диссоциации K для взаимодействия, также могут использоваться способы поверхностного плазмонного резонанса. Величина связывания, например, может быть определена на приборе Biacore 2000 (GE Healthcare). C5 иммобилизуют на чипе измерительного датчика, а образцы полипептида, аффинность которого необходимо определить, получают путем серийного разведения и вводят в поток, проходящий через чип. Величины K можно рассчитать по результатам с использованием, например, Ленгмюровской модели связывания 1:1 в программном обеспечении BIAevaluation, предоставленном изготовителем прибора. C5 или его фрагмент, используемый в определении K, может, например, содержать аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:760.
D
-6
-7
-8
-9
В одном варианте С5-связывающего полипептида по настоящему изобретению С5-связывающий полипептид связывается с C5 таким образом, что величина K для взаимодействия составляет не более 1×10 М, например, не более 1×10 М, 1×10 M или 1×10 М.
С5-связывающий полипептид по настоящему изобретению может использоваться в качестве альтернативы обычным антителам или низкомолекулярным веществам для различных вариантов применения в медицине, ветеринарии и диагностике. В частности, С5-связывающий полипептид может быть полезен в любом способе, требующем от реагента аффинности к C5. Соответственно, С5-связывающий полипептид может использоваться в качестве детектирующего реагента, захватывающего реагента, разделяющего реагента, диагностического агента или терапевтического агента в таких способах.
Как будет понятно специалистам в данной области, функция любого полипептида, например, сила связывания с C5 полипептидов, определенных в настоящем документе, зависит от третичной структуры полипептида. Таким образом, можно осуществить незначительные изменения в аминокислотной последовательности полипептида без значительного влияния на их третичную структуру и функцию. Таким образом, в одном варианте осуществления изобретения полипептид включает модифицированные варианты BM по п. i), которые представляют собой такие варианты, что полученная последовательность по меньшей мере на 89% идентична последовательности, принадлежащей классу по п. i), например, по меньшей мере, на 93% идентична, например, по меньшей мере на 96% идентична последовательности, принадлежащей к классу по п. i). Например, возможно, что аминокислотный остаток, принадлежащий к определенной функциональной группе аминокислотных остатков (например, гидрофобной, гидрофильной, полярной и т.д.), может быть заменен на другой аминокислотный остаток из той же функциональной группы.
n
В другом варианте С5-связывающего полипептида, определенного выше, аминокислотная последовательность выбрана из i), определенного выше, и iii) аминокислотной последовательности, которая в 13 вариабельных позициях, обозначенных X, где n составляет 2-4, 6-7, 11, 16-18, 21, 25-26 и 28, имеет по меньшей мере 84%-ную идентичность с последовательностью по п. i), и которая в положениях 1, 5, 8-10, 12-15, 19-20, 22-24, 27 и 29 имеет по меньшей мере 87%-ную идентичность с последовательностью по п. i).
2
2
2
В одном варианте полипептида по настоящему изобретению, X выбран из H, T и V. В другом варианте X выбран из Т и V. В еще одном варианте осуществления X является V.
3
3
3
3
В одном варианте полипептида по настоящему изобретению, X выбран из I, L и V. В другом варианте осуществления X выбран из I и L. В еще одном варианте осуществления, X является I. В альтернативном варианте осуществления, X является L.
4
4
4
В одном варианте полипептида по настоящему изобретению, X выбран из A, D, E, K, L, Q и R. В другом варианте X выбран из A, D, E, K и R. В еще одном родственном варианте X выбран из D и E.
6
В одном варианте полипептида по настоящему изобретению, X представляет собой W.
7
7
7
7
В одном варианте полипептида по настоящему изобретению, X выбран из A, D, N и Т. В другом варианте осуществления X выбран из D и N. В еще одном родственном варианте осуществления X является D. В альтернативном варианте осуществления X является N.
11
11
11
11
В одном варианте полипептида по настоящему изобретению, X выбран из A, H, K, Q, R и S. В другом варианте X выбран из A, H, K и R. В еще одном родственном варианте осуществления X выбран из A, K и R. В еще одном родственном варианте осуществления X выбран из K и R.
16
В одном варианте полипептида по настоящему изобретению, X является T.
17
17
17
В одном варианте полипептида по настоящему изобретению, X выбран из I и L. В другом варианте X является I. В альтернативном варианте X является L.
18
18
18
18
18
18
В одном варианте полипептида по настоящему изобретению, X выбран из A, D, E, N, Q, S и T. В другом варианте X выбран из A, D, E, Q и S. В еще одном родственном варианте X выбран из D, E и Q. В еще одном родственном варианте X выбран из D и E. В еще одном родственном варианте X является D. В альтернативном варианте X является E.
21
21
21
В одном варианте полипептида по настоящему изобретению, X выбран из I и L. В другом варианте X является I. В альтернативном варианте X является L.
25
25
25
В одном варианте полипептида по настоящему изобретению, X выбран из E, H, N и T. В другом варианте X выбран из E и N. В еще одном родственном варианте X является N.
26
В одном варианте полипептида по настоящему изобретению, X является K.
28
28
28
28
28
В одном варианте полипептида по настоящему изобретению, X выбран из A, D, E, H, N, Q и S. В другом варианте вышеописанного полипептида, X выбран из A, D, E и S. В еще одном родственном варианте X выбран из A, D и Е. В еще одном родственном варианте X выбран из D и E. В еще одном родственном варианте X является D.
3
4
В одном варианте полипептида по настоящему изобретению, XX выбран из LE и LD.
17
18
В одном варианте полипептида по настоящему изобретению, XX выбран из IE и LD.
2
28
В вышеописанных вариантах осуществления первого аспекта изобретения, идентифицированы примеры С5-связывающих полипептидов, входящих в класс полипептидов. Следует понимать, что вышеуказанные отдельные варианты осуществления могут быть объединены всеми мыслимыми способами и при этом все еще входить в объем настоящего изобретения. Такие комбинации отдельных вариантов осуществления определяют ограниченную, в одном или нескольких положениях X-X, аминокислотную последовательность, по сравнению с определением аминокислотной последовательности в i).
Вышеуказанные варианты осуществления С5-связывающего полипептида, например, могут быть объединены таким образом, что аминокислотная последовательность i) соответствует по меньшей мере четырем из следующих восьми условий I-VIII:
2
I. X является V;
3
II. X выбран из I и L;
6
III. X является W;
7
IV. X выбран из D и N;
17
V. X выбран из I и L;
21
VI. X является L;
25
VII. X является N;
28
VIII. X является D.
В некоторых примерах С5-связывающего полипептида по первому аспекту изобретения, аминокислотная последовательность i) соответствует по меньшей мере пяти из восьми условий I-VIII. В частности, аминокислотная последовательность i) может соответствовать по меньшей мере шести из восьми условий I-VIII, например, по меньшей мере семи из восьми условий I-VIII, например, всем восьми условиям I-VIII.
Как описано в следующих примерах, отбор С5-связывающих вариантов привел к идентификации индивидуальных последовательностей с С5-связывающим мотивом (BM). Эти последовательности представляют собой индивидуальные варианты С5-связывающих полипептидов по этому аспекту. Последовательности индивидуальных C5-связывающих мотивов представлены на фигуре 1 и в качестве SEQ ID NO:1-248. В некоторых вариантах осуществления этого аспекта, BM-последовательность i) выбрана из любой одной из SEQ ID NO:1-12, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:23-24, SEQ ID NO:26-28, SEQ ID NO:32-35, SEQ ID NO:38-39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:56-57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:78-79, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:125, SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:151, SEQ ID NO:161, SEQ ID NO:166, SEQ ID NO:187, SEQ ID NO:197, SEQ ID NO:203, SEQ ID NO:205, SEQ ID NO:215 и SEQ ID NO:243. Более конкретно, BM-последовательность i) выбрана из любой одной из SEQ ID NO:1-12, например, из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5. В частности, BM-последовательность i) может быть выбрана из SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:4.
В конкретных вариантах осуществления С5-связывающий мотив (ВМ) является частью белкового домена, представляющего пучок из трех спиралей. Например, BM может по существу составлять две альфа-спирали с соединительной петлей, внутри указанного трехспирального пучка белкового домена.
Белковый домен, представляющий собой трехспиральный пучок, в другом варианте осуществления изобретения, выбран из доменов бактериальных рецепторных белков. Неограничивающими примерами таких доменов являются пять различных трехспиральных доменов белка A из Staphylococcus aureus, такие как домен B и его производные. В некоторых вариантах осуществления изобретения трехспиральный пучок белкового домена представляет собой вариант белка Z, который является производным от указанного домена B стафилококкового белка А.
В вариантах осуществления, в которых С5-связывающий полипептид по изобретению образует часть белкового домена в виде трехспирального пучка, С5-связывающий полипептид может содержать аминокислотную последовательность, выбранную из:
в которой
[BM] является С5-связывающим мотивом, определенным выше;
а
X выбран из A и S;
b
X выбран из N и E;
с
X выбран из A, S и C;
d
X выбран из A и S;
и
ii) аминокислотной последовательности, которая имеет по меньшей мере 79%-ную идентичность с любой одной из последовательностей, определенных выше. Указанная аминокислотная последовательность может иметь по меньшей мере 81%, например, по меньшей мере 83%, например, по меньшей мере 85%, например, по меньшей мере 87%, например, по меньшей мере 89%, например, по меньшей мере 91%, например, по меньшей мере 93%, например, по меньшей мере 95%, например, по меньшей мере 97% идентичности с любой одной из последовательностей, определенных выше.
а
а
В одном варианте С5-связывающего полипептида, определенного выше, X является А. В альтернативном варианте С5-связывающего полипептида, определенного выше, X является S.
b
b
В одном варианте С5-связывающего полипептида, определенного выше, X является N. В альтернативном варианте X является E.
с
с
с
В одном варианте С5-связывающего полипептида, определенного выше, X является A. В альтернативном варианте X является S. В еще одном альтернативном варианте X является C.
d
d
В одном варианте С5-связывающего полипептида, определенного выше, X является А. В альтернативном варианте С5-связывающего полипептида, определенного выше, X является S.
а
b
с
d
В одном варианте С5-связывающего полипептида, определенного выше, X является A; X является N; X является A; и Х является А.
а
b
с
d
В дополнительном варианте С5-связывающего полипептида, определенного выше, X является A; X является N; X является C; и Х является А.
а
b
с
d
В дополнительном варианте С5-связывающего полипептида, определенного выше, X является S; X является E; X является S; и Х является S.
а
b
с
d
В дополнительном варианте С5-связывающего полипептида, определенного выше, X является S; X является E; X является C; и Х является S.
В еще одном дополнительном варианте осуществления изобретения аминокислотная последовательность С5-связывающего полипептида, определенного выше, выбрана из SEQ ID NO:249-496, в частности из SEQ ID NO:249-260, SEQ ID NO:268, SEQ ID NO:271-272, SEQ ID NO:274-276, SEQ ID NO:280-283, SEQ ID NO:286-287, SEQ ID NO:289, SEQ ID NO:294, SEQ ID NO:297, SEQ ID NO:304-305, SEQ ID NO:307, SEQ ID NO:314, SEQ ID NO:326-327, SEQ ID NO:335, SEQ ID NO:340, SEQ ID NO:354, SEQ ID NO:358, SEQ ID NO:367, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:389, SEQ ID NO:399, SEQ ID NO:409, SEQ ID NO:414, SEQ ID NO:435, SEQ ID NO:445, SEQ ID NO:451, SEQ ID NO:453, SEQ ID NO:463 и SEQ ID NO:491, например, из SEQ ID NO:249-260. В дополнительном варианте осуществления изобретения, аминокислотная последовательность выбрана из SEQ ID NO:249, SEQ ID NO:250, SEQ ID NO:251, SEQ ID NO:252 и SEQ ID NO:253, например, из SEQ ID NO:249 и SEQ ID NO:252.
Таким образом, в дополнительном варианте осуществления изобретение относится к С5-связывающему полипептиду, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из:
в которой [BM] является С5-связывающим мотивом, определенным выше и
с
X выбран из S и C; и
ii) аминокислотной последовательности, которая имеет по меньшей мере 81%-ную идентичность с любой одной из последовательностей по п. i) выше.
В альтернативном варианте изобретение относится к С5-связывающему полипептиду, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из:
в которой [BM] является С5-связывающим мотивом, определенным выше, и
с
X выбран из A и С; и
ii) аминокислотной последовательности, которая имеет по меньшей мере 81%-ную идентичность с любой одной из последовательностей по п. i) выше.
Как обсуждалось выше, полипептиды, содержащие незначительные изменения в указанных выше аминокислотных последовательностях, которые значительно не влияют на их третичную структуру и функции, также входят в объем настоящего изобретения. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения, C5-связывающие полипептиды, определенные выше, могут иметь, например, последовательность, которая по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 96% или по меньшей мере на 98% идентична последовательности по п. i).
В некоторых вариантах осуществления изобретения и, как раскрыто в приведенных ниже примерах, С5-связывающий мотив может образовывать часть 58- или 60-аминокислотного полипептида. Такой полипептид может, например, содержать последовательность, выбранную из любой одной из SEQ ID NO:497-757, в частности, последовательность, выбранную из любой одной из SEQ ID NO:497-508, SEQ ID NO:516, SEQ ID NO:519-520, SEQ ID NO:522-524, SEQ ID NO:528-531, SEQ ID NO:534-535, SEQ ID NO:537, SEQ ID NO:542, SEQ ID NO:545, SEQ ID NO:552-553, SEQ ID NO:555, SEQ ID NO:562, SEQ ID NO:574-575, SEQ ID NO:583, SEQ ID NO:588, SEQ ID NO:602, SEQ ID NO:606, SEQ ID NO:615, SEQ ID NO:621, SEQ ID NO:637, SEQ ID NO:647, SEQ ID NO:657, SEQ ID NO:662, SEQ ID NO:683, SEQ ID NO:693, SEQ ID NO:699, SEQ ID NO:701, SEQ ID NO:711, SEQ ID NO:739 и SEQ ID NO:745-757, например, последовательность, выбранную из SEQ ID NO:497-508 и SEQ ID NO:745-757. В другом варианте осуществления изобретения аминокислотная последовательность выбрана из SEQ ID NO:497, SEQ ID NO:498, SEQ ID NO:499, SEQ ID NO:500, SEQ ID NO:501, SEQ ID NO:746, SEQ ID NO:747, SEQ ID NO:748, SEQ ID NO:750 и SEQ ID NO:753, например, из любой одной из SEQ ID NO:497, SEQ ID NO:500, SEQ ID NO:748 и SEQ ID NO:753.
Связывание молекулы с С5 не обязательно ингибирует расщепление C5. Ингибирование зависит от сайта связывания, и так как еще не совсем понятно, какие эффекты дает взаимодействие с конкретными областями C5, некоторые C5-связывающие молекулы могут взаимодействовать с С5, не препятствуя его расщеплению на C5a и C5b. В одном варианте осуществления настоящего изобретения, С5-связывающий полипептид при его введении млекопитающему ингибирует расщепление C5. С5-связывающий полипептид по изобретению может более специфически ингибировать расщепление C5 человека при введении человеку.
Структура C5 несколько отличается между видами, и поэтому вещество, связывающее C5 из одного вида, может быть неактивным в случае другого биологического вида. Например, гуманизированное антитело Экулизумаб связывается с доменом C5, часто называемым MG7. Эта область сильно варьирует между видами, и поэтому Экулизумаб связывается только с C5 человека. С5-связывающий полипептид по настоящему изобретению, однако, не ограничен C5 человека, а также проявляет активность в животных моделях, как показано в прилагаемых примерах.
6
6
Специалисту в данной области будет понятно, что для того чтобы адаптировать полипептид к конкретному применению, в С5-связывающий полипептид могут быть внесены различные модификации и/или дополнения в соответствии с любым аспектом, раскрытым в данном документе, не выходя за пределы объема настоящего изобретения. Например, С5-связывающий полипептид по любому аспекту может включать дополнительные C- и/или N-концевые аминокислоты. Такой полипептид должен восприниматься как полипептид, имеющий дополнительные аминокислотные остатки в первом и/или последнем положении в полипептидной цепи, т.е. на N- и/или С-конце. Таким образом, С5-связывающий полипептид может содержать любое подходящее количество дополнительных аминокислотных остатков, например, по меньшей мере, один дополнительный аминокислотный остаток. Каждый дополнительный аминокислотный остаток по отдельности или в совокупности может быть добавлен для того, чтобы, например, улучшить получение, очистку, стабильность in vivo или in vitro, образование связей или обнаружение полипептида. Такие дополнительные аминокислотные остатки могут содержать один или несколько аминокислотных остатков, добавленных для осуществления химического связывания. Одним из примеров этого является добавление остатка цистеина. Такие дополнительные аминокислотные остатки могут также обеспечивать так называемые «тэги» для очистки или обнаружения полипептида, например, His-тэг, «myc» (c-myc)-тэг или «FLAG»-тэг, для взаимодействия с антителами, специфичными к тэгу, или для использования аффинной хроматографии на иммобилизованных металлах (IMAC) в случае His-тэга.
Дополнительные аминокислоты, обсуждаемые выше, могут быть соединены со С5-связывающим полипептидом посредством химической конъюгации (с использованием известных способов органической химии) или любыми другими средствами, такими как экспрессия С5-связывающего полипептида в виде слитого белка.
Дополнительные аминокислоты, обсуждаемые выше, например, могут включать в себя один или несколько полипептидных доменов. Дополнительный полипептидный домен может придать С5-связывающему полипептиду другую функцию, такую как, например, другая связывающая функция, или ферментативная функция, или токсичная функция (например, в случае иммунотоксина), или флуоресцентная сигнальная функция или их комбинации.
Дополнительный полипептидный домен, кроме того, может обеспечить С5-связывающий полипептид такой же связывающей функцией. Поэтому в дополнительном варианте осуществления изобретения предложен С5-связывающий полипептид, содержащий по меньшей мере две мономерные единицы С5-связывающего полипептида, аминокислотные последовательности которых могут быть одинаковыми или разными. Мультимерные формы полипептидов может содержать подходящее количество доменов, каждый из которых имеет С5-связывающий мотив, и каждый образующий «мономер» в мультимере. Эти домены могут все иметь одинаковую аминокислотную последовательность, а в альтернативном варианте они могут иметь разные аминокислотные последовательности. В частности, С5-связывающий полипептид по изобретению может образовывать гомо- или гетеродимеры.
Дополнительные полипептидные домены, описанные выше, могут быть соединены с С5-связывающим полипептидом ковалентной связью с использованием известных способов органической химии. В альтернативном варианте С5-связывающий полипептид, содержащий дополнительные полипептидные домены, может быть экспрессирован как один или несколько слитых полипептидов, например, в системе для рекомбинантной экспрессии полипептидов, или они могут быть соединены любым другим способом, либо непосредственно, либо через линкер, например, аминокислотный линкер.
В некоторых вариантах осуществления изобретения дополнительные полипептидные домены могут включать в себя элемент, увеличивающий стабильность, который увеличивает время полужизни С5-связывающего полипептида in vivo. Как понятно специалисту в данной области, увеличенное или удлиненное время полужизни означает более медленное выведение (клиренс) конкретной молекулы из крови. Существует целый ряд известных стратегий увеличения времени полужизни конкретного полипептида in vivo, например, соединение с Fc-доменом антитела (конъюгация с Fc) или соединение с альбумином. Другим примером является соединение с элементом, увеличивающим время полужизни, например, пептидом или белком, которые будут связываться с сывороточным альбумином in vivo. В частности, элементом, увеличивающим время полужизни, может быть элемент, связывающийся с альбумином. Элемент, связывающийся с альбумином, может, например, состоять из природного полипептида или его альбумин-связывающего фрагмента, или искусственно сконструированного полипептида. Искусственно сконструированный полипептид может быть получен из исходного природного полипептида методами белковой инженерии, такими как направленное или случайное внесение мутаций и изменений, с целью создания новых или улучшения исходных свойств, таких как аффинность связывания с молекулой, такой как альбумин. Такой сконструированный альбумин-связывающий полипептид может быть, например, вариантом каркасного белка, который был отобран по своей специфической аффинности связывания с альбумином. В конкретном варианте осуществления изобретения каркасный белок может быть выбран из доменов стрептококкового белка G или их производных, таких как, например, домен GA1, домен GA2 и домен GA3 белка G из штамма G148 Streptococcus, в частности, домена GA3.
Соответственно, в одном варианте осуществления C5-связывающего полипептида дополнительные аминокислоты улучшают стабилизацию in vivo или in vitro и включают альбумин-связывающий домен (ABD) стрептококкового белка G или его производное. Один пример альбумин-связывающего домена, который может содержаться в качестве дополнительного полипептидного домена в C5-связывающем полипептиде по изобретению, приведен в SEQ ID NO:759. Другие примеры подходящих альбумин-связывающих доменов описаны в WO 2009/016043 и WO 2012/004384. Такой полипептид, удлиненный на ABD-домен, связывается с сывороточным альбумином in vivo и выгоден благодаря своему большему времени полужизни, что увеличивает время жизни самого полипептида (см., например, WO 91/01743). Фармакокинетический профиль С5-связывающего полипептида, содержащего альбумин-связывающий элемент, описанный выше, таким образом, похож на профиль сывороточного альбумина при введении, например, млекопитающему. ABD и его производные очень сильно связываются с сывороточным альбумином человека (HSA), а также с сывороточным альбумином других биологических видов, таких как мышь и крыса.
Длина ABD из стрептококкового белка G составляет 46 аминокислот, и поэтому, когда С5-связывающий полипептид по изобретению содержит ABD-элемент или его производное, общий размер С5-связывающего полипептида является относительно небольшим. При введении, например, млекопитающему, такому как человек, альбумин-связывающая часть С5-связывающего полипептида будет нековалентно связываться с сывороточным альбумином, и полипептид, таким образом, может быть более эффективным благодаря уменьшению выведения через почки и повышению рециркуляции в эпителиальных клетках. Проникновение в ткани, однако, все еще может оставаться быстрым из-за способности сывороточного альбумина к проникновению из сосудов в ткани. Кроме того, С5-связывающий полипептид, содержащий элемент, увеличивающий время полужизни, может иметь не только увеличенное время полужизни in vivo, но и вызывать меньший иммунный ответ in vivo, по сравнению с полипептидом, у которого отсутствует соответствующий элемент, увеличивающий время полужизни (см., например, WO 2005/097202).
В родственном аспекте изобретение относится к С5-связывающему соединению, содержащему по меньшей мере один С5-связывающий полипептид по любому из предшествующих пунктов, по меньшей мере один альбумин-связывающий домен стрептококкового белка G или его производное, и по меньшей мере один соединительный элемент для соединения по меньшей мере одного домена или его производного с C- или N-концом по меньшей мере одного С5-связывающего полипептида. Такое С5-связывающее соединение обладает высоким сродством к С5, а также к сывороточному альбумину in vivo, например, при введении млекопитающему, и связывание с сывороточным альбумином не мешает взаимодействию с С5, как показано в нижеследующих примерах.
В одном варианте осуществления изобретения C5-связывающее соединение имеет структуру, выбранную из:
[CBP1]-[L1]-[ALBD];
[CBP1]-[CBP2]-[L1]-[ALBD];
[CBP1]-[L1]-[ALBD]-[L2]-[CBP2];
[ALBD]-[L1]-[CBP1];
[ALBD]-[L1]-[CBP1]-[CBP2];
[CBP1]-[L1]-[CBP2]-[L2]-[ALBD], и
[ALBD]-[L1]-[CBP1]-[L2]-[CBP2]
в которой, независимо друг от друга,
[CBP1] и [CBP2] являются связывающими С5 полипептидами, которые могут быть одинаковыми или разными;
[L1] и [L2] являются соединительными элементами, которые могут быть одинаковыми или различными; и
[ALBD] является альбумин-связывающими доменом стрептококкового белка G или его производным.
Предпочтительные C5-связывающие соединения имеют структуру, выбранную из:
[CBP1]-[CBP2]-[L1]-[ALBD];
[CBP1]-[L1]-[ALBD]-[L2]-[CBP2]; и наиболее предпочтительно
[CBP1]-[L1]-[ALBD].
2
n
3
n
4
n
4
n
2
m
3
m
4
m
4
2
Примеры соединительных элементов, которые могут использоваться в таких C5-связывающих соединениях, выбраны из G, GS, [GS], [GS], [GS], GS[GS], в которых n составляет 0-7 (предпочтительно, n составляет 0-2); [SG], [SG], [SG], в которых m составляет 0-7, и VDGS. Предпочтительными линкерами являются GS и GS[GS].
Примеры альбумин-связывающих доменов или их производных, которые могут входить в состав С5-связывающего соединения, описаны выше. В частности, один пример альбумин-связывающего домена приведен в SEQ ID NO:759.
Особенно предпочтительные C5-связывающие соединения имеют структуру [CBP1]-[L1]-[ALBD], в которой [CBP1] представляет собой полипептид, выбранный из SEQ ID NO:748 и SEQ ID NO:753, [L1] является GS, а [ALBD] представляет собой полипептид, приведенный в SEQ ID NO:759.
С5-связывающие полипептиды, содержащиеся в C5-связывающем полипептиде, в одном варианте осуществления изобретения независимо выбраны из 58-мерных или 60-мерных C5-связывающих полипептидов, описанных выше. В частности, C5-связывающее соединение может содержать один или несколько C5-связывающих полипептидов, независимо выбранных из любой одной из SEQ ID NO:497-508, SEQ ID NO:516, SEQ ID NO:519-520, SEQ ID NO:522-524, SEQ ID NO:528-531, SEQ ID NO:534-535, SEQ ID NO:537, SEQ ID NO:542, SEQ ID NO:545, SEQ ID NO:552-553, SEQ ID NO:555, SEQ ID NO:562, SEQ ID NO:574-575, SEQ ID NO:583, SEQ ID NO:588, SEQ ID NO:602, SEQ ID NO:606, SEQ ID NO:615, SEQ ID NO:621, SEQ ID NO:637, SEQ ID NO:647, SEQ ID NO:657, SEQ ID NO:662, SEQ ID NO:683, SEQ ID NO:693, SEQ ID NO:699, SEQ ID NO:701, SEQ ID NO:711, SEQ ID NO:739 и SEQ ID NO:746-757, например, последовательность, выбранную из SEQ ID NO:497-508 и SEQ ID NO:746-757. В другом варианте осуществления изобретения, аминокислотная последовательность выбрана из SEQ ID NO:497, SEQ ID NO:498, SEQ ID NO:499, SEQ ID NO:500, SEQ ID NO:501, SEQ ID NO:746, SEQ ID NO:747, SEQ ID NO:748, SEQ ID NO:750 и SEQ ID NO:753, например, из любой одной из SEQ ID NO:497, SEQ ID NO:500, SEQ ID NO:748 и SEQ ID NO:753.
В дополнительном аспекте предложен полинуклеотид, кодирующий С5-связывающий полипептид, или соединение, описанное выше. Вектор экспрессии, содержащий такой полинуклеотид, может обеспечить возможность экспрессии С5-связывающего полипептида или С5-связывающего соединения, например, путем экспрессии в клетке-хозяине.
Следует понимать, что С5-связывающий полипептид по настоящему изобретению может быть полезен в качестве терапевтического или диагностического агента сам по себе или в качестве средства, направленного на другие терапевтические или диагностические агенты, например с прямым или косвенным воздействием на белок C5 системы комплемента. Прямой терапевтический эффект, например, может быть достигнут путем ингибирования расщепления C5. Поэтому в одном варианте осуществления изобретения предложена комбинация С5-связывающего полипептида или С5-связывающего соединения по изобретению с терапевтическим агентом. Неограничивающими примерами терапевтических агентов, которые могут оказаться полезными в такой комбинации, являются иммуностимулирующие агенты и радионуклиды.
Таким образом, С5-связывающий полипептид как таковой или содержащийся в связывающем C5 соединении или комбинации по изобретению, в одном варианте осуществления изобретения, предложен для применения в терапии, например, для лечения связанных с C5 состояний, например, связанных с С5 состояний у млекопитающего, например, у человека. В одном варианте осуществления изобретения указанное связанное с C5 состояние выбрано из воспалительного заболевания, такого как антиген-индуцированный артрит, сепсис, воспаление синовиальной оболочки, васкулит и астма; аутоиммунного заболевания, такого как системная красная волчанка (SLE), болезнь холодовых агглютининов, ревматоидный артрит, рассеянный склероз (MS), синдром Шегрена, дерматомиозит, миастения гравис и другие вызванные аутоантителами заболевания, такие как синдром Гийена-Барре (GBS), синдром Фишера, системный склероз, антитела к базальной мембране клубочков (анти-GBM) и антифосфолипидный синдром (APS); инфекционного заболевания, такого как гемолитико-уремический синдром (HUS), вирусные инфекции, бактериальные инфекции и грибковые инфекции; сердечно-сосудистого заболевания, такого как (острый) инфаркт миокарда (с реваскуляризацией или в результате фибринолиза, или чрескожного коронарного вмешательства (PCI)); нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Альцгеймера (AD), болезнь Хантингтона, болезнь Крейтцфельда-Якоба и болезнь Паркинсона; рака; ран; повреждения трансплантата, например, ишемического-реперфузионного повреждения (IRI) и острого антитело-опосредованного отторжения (AMR); глазного заболевания, например, возрастной макулярной дегенерации (AMD), увеита, диабетических глазных заболеваний и расстройств и ретинопатии недоношенных; заболевания почек, такого как мембранный гломерулонефрит, мембранный нефрит, иммуноглобулиновая нефропатия, волчаночный нефрит, синдром Гудпасчера и постстрептококковый гломерулонефрит; легочных заболеваний, таких как респираторный дистресс-синдром взрослых, хроническая обструктивная болезнь легких и кистозный фиброз; гематологических заболеваний, таких как гемолитическая анемия, пароксизмальная холодовая гемоглобинурия, атипичный гемолитический уремический синдром (aHUS) и пароксизмальная ночная гемоглобинурия (PNH); аллергических заболеваний, таких как анафилактический шок, аллергии и астма; и дерматологических заболеваний, таких как пузырчатка, буллезный пемфигоид, фототоксические реакции и псориаз. В более конкретном варианте осуществления C5-связывающие полипептид, соединение или комбинация по изобретению используются для лечения пароксизмальной ночной гемоглобинурии (PNH).
Как уже было указано при обсуждении трансплантации органов в разделе предпосылок изобретения выше, различия между донором и реципиентом (например, по АВО и MCH-классам), а также состояние трансплантированного органа, могут привести к задержке функционирования или даже отторжению пересаженного органа. Поэтому может понадобиться лечение для того, чтобы удалить антитела против донорского органа, несмотря на положительное перекрестное совпадение донора и реципиента, или удалить АВО-антитела при проведении АВО-несовместимой трансплантации. Такое лечение обычно включает в себя иммуноадсорбцию, например, с помощью методик аффинной хроматографии, до, а также после трансплантации, или плазмаферез. Однако такие процедуры несут риск удаления практически всех антител, присутствующих в кровотоке, то есть, включая терапевтические антитела. Однако С5-связывающие полипептиды или соединения по изобретению не зависят от любой процедуры удаления антител и, следовательно, могут использоваться при данных видах лечения.
При некоторых связанных с С5 патологических состояниях, когда превалирует не системных патология, а более локальная острая патология в легкодоступных тканях, таких как легкие и кровоток, может оказаться предпочтительным препарат с очень коротким временем полужизни по сравнению медленно выводимым препаратом. Поэтому при таких связанных с С5 состояниях может быть полезным С5-связывающий полипептид без элемента, увеличивающего время полужизни. Как объяснялось ранее, С5-связывающий полипептид по изобретению вследствие своего относительно небольшого размера при введении млекопитающему, такому как человек, будет иметь относительно быстрый фармакокинетический профиль. С5-связывающий полипептид по изобретению может потенциально быть активным при лечении связанных с C5 состояний, таких как астма (Zhang et al. Expert Rev Clin Immunol 2010, 6:269-277), сепсис (Ward et al. The Sci World J 2010, 10:2395-2402) и синдром гиперчувствительности, включая связанную с активацией системы комплемента псевдоаллергию (CARPA, реакция на определенные терапевтические липосомы и лекарственные соединения на основе липидных вспомогательных веществ, которая в редких случаях может привести к угрожающему жизни сердечно-легочному дистрессу (Szebeni et al. Adv Drug Delivery Rev 2011, 63:1020-1030). Дополнительно, С5-связывающий полипептид по изобретению может использоваться для ингибирования системы комплемента, когда реципиент при переливании крови получил кровь несовместимого типа (ситуация, случающаяся с частотой примерно 1 на 14000 единиц перелитой крови в США, которая связана с высокой смертностью, Goodnough et al. Lancet 2003, 361:161-169).
В родственном аспекте предложен способ лечения связанных с C5 состояний, включающий введение С5-связывающих полипептида или комбинации, описанных выше, млекопитающему, нуждающемуся в этом. Таким образом, в способе лечения субъекта лечат С5-связывающим полипептидом, С5-связывающим соединением или их комбинацией по изобретению. В более конкретном варианте осуществления указанного способа, связывание C5-связывающих полипептида или комбинации с C5, экспрессирующимся на поверхности клеток субъекта, ингибирует расщепление C5. В одном варианте осуществления способа лечения, связанное с C5 состояние выбрано из воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания, инфекционного заболевания, сердечно-сосудистого заболевания, нейродегенеративных расстройств, рака, ран, повреждения трансплантата, глазного заболевания, болезни почек, легочных заболеваний, гематологических заболеваний, аллергических заболеваний и кожных заболеваний. В частности, связанное с C5 состояние может, как определено выше, зависеть от терапевтического применения C5-связывающих полипептида, соединения или комбинации по изобретению. Соответствующим связанным с C5 состоянием, например, может быть пароксизмальная ночная гемоглобинурия (PNH). В одном варианте осуществления способа лечения, указанный С5-связывающий полипептид вводят внутривенно, подкожно, путем ингаляции, интраназально, перорально, интравитреально или местно.
Изобретение далее будет проиллюстрировано следующими неограничивающими примерами.
Краткое описание чертежей
6
Фигура 1 представляет собой список аминокислотных последовательностей примеров С5-связывающих мотивов, содержащихся в С5-связывающих полипептидах по изобретению (SEQ ID NO:1-248), примеров 49-мерных C5-связывающих полипептидов по изобретению (SEQ ID NO:249-496), примеров 58-мерных C5-связывающих полипептидов по изобретению (SEQ ID NO:497-744) и примеров 60-мерных C5-связывающих полипептидов по изобретению (SEQ ID NO:745-757), а также последовательностей белка Z (SEQ ID NO:758), альбумин-связывающего домена (ABD094, SEQ ID NO:759), имеющего номер P01031 в базе Swiss-Prot белка С5 человека (аминокислотные остатки 1-1676, SEQ ID NO:760, из которых α-цепи соответствуют аминокислотные остатки 678-1676, а β-цепи соответствуют аминокислотные остатки 19-673), последовательность используемого в настоящем изобретении His-меченного белка OmCI из клеща (SEQ ID NO:761) и последовательность белка C5 яванского макака (SEQ ID NO:762), выведенную из геномной последовательности (опубликовано он-лайн на www.ebi.ac.uk/ENA; Ebeling et al. (2001) Genome Res. 21(10):1746-1756) с использованием C5 человека в качестве матрицы. Последовательность содержит две неизвестные аминокислоты «X» в позициях 63 и 1346.
На фигуре 2 показан результат типичного анализа связывания, выполненного на приборе Biacore, как описано в примере 2. Сенсограммы были получены введением C5 человека (hC5; черная сплошная линия), C5 яванского макака (cC5; черный короткий пунктир), С5 крысы (rC5; черный длинный пунктир), MG7-домена человека (hMG7; серый пунктир) и иммуноглобулина G человека (hIgG; серая сплошная линия), соответственно, над иммобилизованным димерным Z-вариантом (Z05477, SEQ ID NO:509).
Фигура 3 представляет собой столбиковую диаграмму, показывающую ответ в ELISA против hC5 и rC5, соответственно, для отдельных зрелых Z-вариантов. Черные столбики соответствует поглощению при 450 нм, полученному с использованием 0,05 мкг/мл hC5 (левый столбик в каждой группе) и поглощению при 450 нм, полученному с использованием 4 мкг/мл rC5 для каждого Z варианта (правый столбик в каждой группе), как описано в примере 4. Ответы для Z-варианта Z05363 (SEQ ID NO:510) приведены в качестве положительного контроля.
На фигуре 4 схематически показаны различные конструкции, охватывающие один или несколько C5-связывающих Z-вариантов, выбранных из SEQ ID NO:745-757, необязательно связанных с ABD094 (SEQ ID NO:759).
4
2
На фигуре 5 показан анализ с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ очищенных C5-связывающих Z-вариантов (в восстанавливающих условиях), визуализированных с помощью Instant Blue, как описано в примере 6. (А) представляет один пример димерного ZZ-ABD (дорожка 1, где Z соответствует SEQ ID NO:745, а ABD соответствует SEQ ID NO:759), по сравнению с различными слитыми белками Z-ABD (где Z соответствует SEQ ID NO:745 (дорожка 2), SEQ ID NO:748-757 (дорожки 4-13), слитым с ABD094 (SEQ ID NO:759) через GS-линкер); (B) представляет собой один С5-связывающий Z-вариант (SEQ ID NO:753) в различных конструкциях; а (С) представляет собой два различных C5-связывающих Z-варианта (SEQ ID NO:748, дорожки 2-3 и 6, и SEQ ID NO:753, дорожки 4-5 и 7), в мономерной форме (дорожки 6-7) и слитые с ABD094 (SEQ ID NO:759) через GS(GS)-линкер (дорожки 2-5).
6
Фигуры 6А и B являются диаграммами, на которых показаны примеры данных «доза-ответ» для характеристики способности различных С5-связывающих Z-вариантов ингибировать активацию системы комплемента, наблюдаемую по анализу гемолиза, описанному в примере 6. Сыворотку без C5 разбавляли в 63 раза и добавляли 0,1 нМ hC5. На панели (A) показано действие различных слитых белков Z-ABD (Z-варианты, соответствующие SEQ ID NO:745, SEQ ID NO:748-753 и SEQ ID NO:756, слитым с ABD094 (SEQ ID NO:759) через GS-линкер) на hC5, тогда как на панели (B) показано действие различных С5-связывающих конструкций, содержащих один и тот же С5-связывающий Z-вариант (Z06175a, SEQ ID NO:753), в виде мономера или димера, слитых с ABD094 (SEQ ID NO:759) или имеющих His-тэг (шесть остатков гистидина), по сравнению со С5-связывающим белком OmCI из клеща (SEQ ID NO:761).
6
Фигуры 7А и B являются диаграммами, на которых показаны примеры данных равновесного связывания на основе вытесняющей ECL-методики, описанной в примере 6. На фигуре 7А показано связывание с C5 различных Z-вариантов (SEQ ID NO:745, SEQ ID NO:748-757), слитых с ABD094 (SEQ ID NO:759), по сравнению со C5-связывающим белком OmCI из клеща (SEQ ID NO:761). На фигуре 7B показано связывание различных С5-связывающих конструкций, содержащих один и тот же С5-связывающий Z-вариант (SEQ ID NO:753) в виде мономера или димера, слитых с ABD094 (SEQ ID NO:759) или имеющих His-тэг.
На фигурах 8А и 8В показано взаимодействие между Z-ABD-вариантами и сывороточным альбумином человека (HSA), исследованное, как описано в примере 7. (А) Эксклюзионная хроматография (SEC), где Z-ABD (Z06175a (SEQ ID NO:753), слитая с ABD094 (SEQ ID NO:759) через GS-линкер) предварительно инкубируют с эквимолярным количеством HSA (1). Для сравнения на графике также показаны хроматограммы для только HSA (2) и только Z-ABD (3). (B) Сенсограммы, полученные на Biacore для Z-ABD и Z-ABD-Z (Z06175a (SEQ ID NO:753), слитая с ABD094 (SEQ ID NO:759) с помощью линкеров, указанных на фигуре 4 в конструкции 2 и конструкции 5, соответственно), вводимых над поверхностью, покрытой HSA. Каждую из двух конструкций вводили в концентрации 25, 100 и 400 нм.
Фигура 9 представляет собой диаграмму, на которой показаны фармакокинетические профили во времени для С5-связывающих соединений Z-ABD и Z-ABD-Z (Z06175a (SEQ ID NO:753), слитая с ABD094 (SEQ ID NO:759) с помощью линкеров, указанных на фигуре 4 в конструкции 2 и конструкции 5, соответственно) у самцов крыс Sprague Dawley после внутривенного (0,25 мкмоль/кг) и подкожного (0,5 мкмоль/кг) введения, описанного в примере 8. Каждая точка представляет собой среднее из данных от трех отдельных животных в конкретной временной точке на протяжении от 5 минут до двух недель после внутривенного введения животным и на протяжении от 15 минут до двух недель после подкожного введения животным.
На фигуре 10 показан ex vivo гемолиз овечьих эритроцитов после взаимодействия с разведенной 1:5 сывороткой из образцов, полученных от крыс Sprague Dawley после внутривенного (0,25 мкмоль/кг) введения Z-ABD (Z06175a (SEQ ID NO:753), слитая с ABD094 (SEQ ID NO:759) через GS-линкер), описанного в примере 8. Каждая точка представляет данные для одного индивидуального животного в конкретной временной точке на протяжении от 5 минут до двух недель после введения соединения.
На фигуре 11 показан ex vivo гемолиз овечьих эритроцитов после взаимодействия с разведенной 1:5 сывороткой из образцов, полученных от крыс Sprague Dawley после подкожного (0,5 мкмоль/кг) введения Z-ABD (Z06175a (SEQ ID NO:753), слитая с ABD094 (SEQ ID NO:759) через GS-линкер), описанного в примере 8. Каждая точка представляет данные для одного индивидуального животного в конкретной временной точке на протяжении от 15 минут до двух недель.
На фигуре 12 показан гемолиз относительно концентрации Z-ABD (Z06175a (SEQ ID NO:753), слитая с ABD094 (SEQ ID NO:759)через GS-линкер) в сыворотке крови после внутривенного и подкожного введения самцам крыс Sprague Dawley, как описано в примере 8.
На фигуре 13 показан гемолиз овечьих эритроцитов относительно концентрации Z-ABD-Z (Z06175a (SEQ ID NO:753), слитая с ABD094 (SEQ ID NO:759) через линкеры, указанные на фигуре 4, конструкция 5) в сыворотке крови после внутривенного и подкожного введения самцам крыс Sprague Dawley, как описано в примере 8.
На фигуре 14 показано присутствие в сыворотке Z-ABD (Z06175a (SEQ ID NO:753), слитая с ABD094 (SEQ ID NO:759) через GS-линкер) после внутривенного (415 нмоль/кг) и подкожного (1250 нмоль/кг) введения в самцов яванского макака, как описано в примере 9. Каждая точка данных представляет собой среднее из данных для трех отдельных животных.
Фигура 15 представляет собой диаграмму, на которой показан эффект (концентрация С5а в лаваже) провоспалительной молекулы зимозана (40 мг/кг внутрибрюшинно) отдельно и в комбинации с C5-связывающей слитой молекулой Z-ABD (Z06175a (SEQ ID NO:753), слитая с ABD094 (SEQ ID NO:759) через GS-линкер) или OmCI (SEQ ID NO:761), проанализированный, как описано в примере 10. Z-ABD вводили в количестве 20 нмоль/кг (низкая доза), 100 нмоль/кг (средняя доза) и 500 нмоль/кг (высокая доза) подкожно за 18 ч до индукции зимозаном. OmCI (30 нмоль/кг) вводили внутрибрюшинно за 1 ч до введения зимозана, и отбирали образцы через 1 ч после индукции зимозаном.
На фигурах 16A и 16B показан фармакокинетический профиль Z-ABD (Z06175a (SEQ ID NO:753), слитая с ABD094 (SEQ ID NO:759) через GS-линкер) после интратрахеального введения в количестве 500 нмоль/кг самкам мышей C57BL, как описано в примере 11. (A) Концентрация в сыворотке для каждого животного (n=3 для каждой временной точки, всего 27 животных); и (В) гемолиз овечьих эритроцитов после взаимодействия с этими образцами сыворотки, разбавленными 1:5.
Примеры
В данной работе использовались следующие материалы за исключением случаев, когда указано иное.
- Штамм RR1ΔM15 Escherichia coli (Rüther, Nucleic Acids Res 10:5765-5772, 1982).
- Штамм XL1-Blue Escherichia coli (Agilent Technologies, кат. №200268).
- Белок С5 системы комплемента человека (hC5). Полноразмерный 1676-аминокислотный пробелок имеет номер доступа NP_001726 (SEQ ID NO:760) в базе данных GenBank, причем аминокислоты 19-673 являются бета-цепью, а аминокислоты 678-1676 являются альфа-цепью. Используемый в настоящем изобретении C5 был приобретен в компании Quidel (кат. № A403).
- Белок С5 системы комплемента яванского макака (cC5; SEQ ID NO:762). Последовательность cC5 была выведена из геномной последовательности яванского макака (Macaca fascicularis) (www.ebi.ac.uk/ena; Ebeling et al. (2001) Genome Res. 21(10):1746-1756). Кодирующая область С5 человека была получена из www.ensembl.org, и ген C5 был локализован на 15-ой хромосоме. Область, содержащая ген, приблизительно составляет в длину 110000 оснований и содержится в контигах CAEC01154150-CAEC01154178. Контиги соединяли вручную, чтобы получить единый файл, и использовали в качестве геномного контекста в программе sim4 для выравнивания кодирующей области С5 человека с необработанными данными по геному яванского макака. Белок С5 из яванского макака, используемый в настоящем изобретении, очищали самостоятельно из сыворотки, используя трехстадийную процедуру: осаждение с использованием ПЭГ6000, ионообменную хроматографию и аффинную хроматографию на белке OmCI.
- Белок С5 системы комплемента крысы (rC5; номер доступа XP-001079130 в базе данных GenBank). Крысиный белок С5, используемый в настоящем изобретении, очищали самостоятельно из сыворотки, используя трехстадийную процедуру: осаждение с использованием ПЭГ6000, ионообменную хроматографию и аффинную хроматографию на белке OmCI.
- MG7 (hMG7) домен белка С5 системы комплемента человека, соответствующий аминокислотным остаткам 822-931 C5 человека (SEQ ID NO:760; Fredslund et al. (2008) Nature Immunology 9:753-760) был получен самостоятельно в клетках Freestyle HEK293.
- hMG7-связывающий белок.
6
- Белок OmCI (AF2999, Nunn, M.A. et al., выше) из мягкого клеща Ornithodoros moubata. OmCI с His-тэгом на С-конце (SEQ ID NO:761) был получен самостоятельно в штамме Origami(DE3) E. coli и очищен на колонке HisTrap1.
Пример 1: отбор и скрининг полипептидов, связывающих белок С5 системы комплемента
Материалы и способы
Биотинилирование целевого белка hC5: биотинилирование hC5 проводили согласно рекомендациям изготовителя при комнатной температуре (RT) в течение 40 мин, используя No-Weigh EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce, кат. №21327) в десятикратном молярном избытке. Последующую смену буфера на PBS (10 мМ фосфат, 137 мМ NaCl, 2,68 мМ KCl, pH 7,4) проводили, используя Protein Desalting Spin Columns (Pierce, кат. №89849) в соответствии с инструкциями изготовителя.
TaqS1-1
9
10
10
Отбор С5-связывающих полипептидов с помощью фагового дисплея: для отбора полипептидов, связывающих С5, использовали библиотеки случайных вариантов белка Z, представленных на бактериофагах (сконструированные на базе фагмид pAffi1/pAY00065/pAY02947/pAY02592 по существу, как описано в Grönwall et al. J Biotechnol 2007, 128:162-183). Использовали три различных вектора для создания библиотек. В двух из них используется альбумин-связывающий домен (ABD, GA3 белка G из стрептококкового штамма G148) в качестве партнера для создания слитых белков с Z-вариантами, что дало две библиотеки - Zlib003Naive.I и Zlib006Naive.II. В третьей библиотеке, Zlib004Naive.I, в качестве партнера для получения слитых белков используется связывающая Taq-ДНК-полимеразу молекула Z03639 (обозначается Z в Gunneriusson et al. Protein Eng 1999, 12:873-878). Библиотеки имели следующие фактические размеры: 3×10 (Zlib003Naive.I), 1,5×10 (Zlib006Naive.II) и 1,4×10 (Zlib004Naive.I), причем число указывает количество вариантов.
Запас фагов получали либо во встряхиваемых колбах (Zlib003Naive.I), как описано в Grönwall et al., выше, или в 20-литровом ферментере (Zlib006Naive.II и Zlib004Naive.I). Клетки из запаса в глицерине, содержащие фагмидную библиотеку Zlib004Naive.I, высевали в 20 л среды TSB-YE (триптический соевый бульон-дрожжевой экстракт: 30 г/л TSB, 5 г/л дрожжевого экстракта), содержащей 2% глюкозу и 100 мкг/мл ампициллина. Клетки из запаса в глицерине, содержащие фагмидную библиотеку Zlib006Naive.II, высевали в 20 л рецептурной среды без пролина [дикалия гидрофосфат, 7 г/л; тринатрия цитрат дигидрат, 1 г/л; урацил 0,02 г/л; YNB (Difco™ Дрожжевое азотистое основание без аминокислот, Becton Dickinson), 6,7 г/л; глюкозы моногидрат, 5,5 г/л; L-аланин, 0,3 г/л; L-аргинина моногидрохлорид 0,24 г/л; L-аспарагина моногидрат, 0,11 г/л; L-цистеин, 0,1 г/л; L-глутаминовая кислота, 0,3 г/л; L-глутамин, 0,1 г/л; глицин 0,2 г/л; L-гистидин, 0,05 г/л; L-изолейцин, 0,1 г/л; L-лейцин, 0,1 г/л; L-лизина моногидрохлорид, 0,25 г/л; L-метионин, 0,1 г/л; L-фенилаланин, 0,2 г/л; L-серин, 0,3 г/л; L-треонин, 0,2 г/л; L-триптофан, 0,1 г/л; L-тирозин, 0,05 г/л; L-валин, 0,1 г/л], содержащей 100 мкг/мл ампициллина. Культуры выращивали при 37°C в ферментере (Belach Bioteknik, BR20). Когда клетки достигали оптимальной плотности (OD), приблизительно составляющей 0,7-0,8, приблизительно 2,6 л культуры заражали 10-кратным избытком хелперного фага M13K07 (New England Biolabs #N0315S). Клетки инкубировали в течение 30 минут, после чего ферментер заполняли до 20 л средой TSB-YE, содержащей 100 мкМ IPTG (изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид, для индукции экспрессии), 25 мкг/мл канамицина и 12,5 мкг/мл карбенициллина, и растили при 30°C в течение 22 ч. Клетки в культуре осаждали центрифугированием при 15900 g, а фаговые частицы, остающиеся в среде после этого, дважды переосаживали в ПЭГ/NaCl (полиэтиленгликоль/хлорид натрия), фильтровали и растворяли в PBS с глицерином, как описано в Grönwall et al., выше. Запас фагов хранили при -80°C до использования.
Отбор проводили против биотинилированного hC5 за четыре цикла. Получение запаса фагов, процедуру отбора и амплификацию фагов между циклами отбора проводили по существу, как описано в WO 2009/077175. В качестве буфера для отбора использовали PBS, содержащий 3% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 0,1% Tween20, и комплексы фагов с мишенью напрямую захватывались на стрептавидиновые шарики Dynabeads M-280 Streptavidin (Dynal, кат. №112.06). Использовали 1 мг шариков на 10 мкг белка С5 системы комплемента. Для амплификации фагов использовали штамм RR1ΔM15 E. coli. На первом цикле отбора использовали 100 нМ hC5, и проводили две промывки буфером PBST 0,1% (PBS, содержащим 0,1% Tween-20). В последующих трех циклах увеличивали жесткость условий, используя для этого меньшую концентрацию мишени и большее число промывок. В циклах 2, 3 и 4 использовали 50 или 33 нМ hC5, 25 или 11 нМ hC5 и 12,5 или 3,7 нМ hC5. В циклах 2, 3 и 4 проводили 4, 6 и 8 промывок, используя PBST 0,1% во всех циклах или PBST 0,2%, 0,3% и 0,4% в циклах 2, 3 и 4, соответственно.
Скрининг Z-вариантов с помощью ELISA: для того чтобы проверить, могут ли отобранные молекулы Z-вариантов действительно взаимодействовать с белком С5 системы комплемента человека, проводили анализ методам ELISA. Z-варианты получали, высевая одиночные колонии из отобранных в 1 мл среды TSB-YE, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 0,1 мМ IPTG в планшетах с глубокими лунками (Nunc, кат. №278752). Планшеты инкубировали в течение 18-24 часов при 37°C. Клетки осаждали центрифугированием, ресуспендировали в 300 мкл PBST 0,05% и замораживали при -80°C для высвобождения периплазматической фракции клеток. Замороженные образцы размораживали в водяной бане, и клетки осаждали центрифугированием. Периплазматический супернатант содержал Z-варианты в виде белков, слитых с альбумин-связывающим доменом (GA3 белка G из штамма G148 Streptococcus), экспрессированных как AQHDEALE-[Z#####]-VDYV-[ABD]-YVPG (Grönwall et al., выше), или слитых со связывающей Taq-ДНК-полимеразу молекулой Z03639, экспрессированных как AQHDEALE-[Z#####]-VDYV-[Z03639]-YVPG. Z##### относится к отдельным 58-аминокислотным Z-вариантам.
3
96-луночные планшеты для ELISA с уменьшенной в два раза поверхностью (Costar, кат. №3690) покрывали 50 мкл на лунку буфера для покрытия пластика белком (50 мМ карбонат натрия, рН 9,6), содержащего 4 мкг/мл антител, специфичных к Z-вариантам (Affibody, кат. №20.1000.01.0005) и инкубировали в течение ночи при 4°C. Раствор антител вытряхивали, и лунки блокировали 100 мкл буфера PBSC (PBS, содержащего 0,5% казеина (Sigma, кат. № C8654)) в течение 1-2 ч при RT. Блокирующий раствор удаляли, и в лунки добавляли по 50 мкл периплазматического раствора и инкубировали в течение 1 ч при RT и медленном качании. Супернатанты вытряхивали, и лунки промывали 4 раза PBST 0,05%. Затем в каждую лунку добавляли по 50 мкл биотинилированного белка hC5 с концентрацией 5 мкг/мл в PBSC. Планшеты инкубировали в течение 1,5 ч при RT с последующими промывками, как описано выше. Стрептавидин-HRP (HRP - пероксидаза хрена; Dako, кат. № P0397) разбавляли 1:10000 в PBSC, добавляли в лункам и затем инкубировали в течение 45 мин. После промывки, как описано выше, в лунки добавляли по 50 мкл TMB-субстрата ImmunoPure (Thermo Scientific, кат. №34021), и планшеты обрабатывали в соответствии с рекомендациям изготовителя. Поглощение в лунках измеряли при 450 нм, используя планшетный спектрофотометр Victor (Perkin Elmer).
В качестве положительного контроля анализировали периплазматическую фракцию, также содержащую PSMA-связывающую молекулу Z03938, экспрессируемую как AQHDEALE-[Z03938]-VDYV-[Z03639]-YVPG, против 5 мкг/мл биотинилированного белка PSMA. В качестве отрицательного контроля анализировали эту же периплазматическую фракцию против белка hC5. Проводили секвенирование клонов, дающих положительный сигнал (положительное поглощение) против hC5.
Секвенирование: ПЦР-фрагменты были амплифицированы из одиночных колоний с использованием стандартной программы для ПЦР и праймеров AFFI-21 (5ʹ-tgcttccggctcgtatgttgtgtg) и AFFI-22 (5ʹ-cggaaccagagccaccaccgg). Секвенирование амплифицированных фрагментов проводили с использованием биотинилированного олигонуклеотида AFFI-72 (5ʹ-биотин-cggaaccagagccaccaccgg) и набора BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems), используемого в соответствии с протоколом изготовителя. Реакции секвенирования очищали путем связывания на магнитных покрытых стрептавидином шариках (Detach Streptavidin Beads, Nordiag, кат. №2012-01), используя Magnatrix 8000 (Magnetic Biosolution), и анализировали на ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (PE Applied Biosystems).
Блокирующий метод ELISA: клоны, положительные по hC5 в скрининге методом ELISA, анализировали с помощью блокирующего метода ELISA для того, чтобы выяснить, нарушается ли их связывание с мишенью в присутствии связывающего hC5 белка OmCI и/или hMG7-связывающего белка. Блокирующий метод ELISA проводили, используя Z-варианты, экспрессированные в периплазматических фракциях, как описано в разделе скрининга с помощью ELISA выше, но используя объем культур 5 мл в круглодонных пробирках объемом 12 мл и 2 мл PBST 0,05% для растворения осадка. Блокирующий анализ ELISA проводили как анализ ELISA для скрининга, с модификацией протокола на стадии внесения белка-мишени; белки OmCI или hMG7-связывающий белок смешивали с белком-мишенью до внесения в аналитический планшет. 5 мкг/мл биотинилированного hC5 смешивали с 5-кратным или 20-кратным молярным избытком OmCI или hMG7-связывающего белка, соответственно, затем инкубировали в течение 1 ч при RT, чтобы позволить сформироваться комплексам перед внесением в планшет. Для каждого клона эталонный (1), отрицательный контроль (2) и фоновый (3) ответ/сигнал, соответственно, были получены следующим образом: на стадии внесения мишени к Z-вариантам добавляли только hC5 (как в анализе ELISA для скрининга) (1); к белку комплемента hC5 вместо OmCI или hMG7-связывающего белка добавляли посторонний белок PSMA (самостоятельно полученный) (2); к Z-вариантам добавляли только буфер (3).
Результаты
Отбор С5-связывающих полипептидов с помощью фагового дисплея: индивидуальные клоны были получены через 2-4 цикла отбора с помощью фагового дисплея на биотинилированном hC5.
Скрининг Z-вариантов с помощью ELISA: клоны, полученные после четырех циклов отбора, продуцировали в 96-луночных планшетах и скринировали по их способности связывать белок С5 методом ELISA. Всего было скринировано около 400 клонов. Измерение поглощения показало множество явно положительно связывающих hC5 клонов. Результат после отбора клонов представлен в таблице 1; вариант Z05363 (SEQ ID NO:510) имеет ABD-тэг, тогда как другие, перечисленные Z-варианты имеют в качестве тэга Taq-связывающую молекулу Z03639, как описано в разделе Способы. Специфичная к PSMA молекула Z03938, используемая в качестве положительного контроля, давала положительный сигнал на PSMA при отсутствии какого-либо сигнала против hC5.
Блокирующий метод ELISA: клоны, положительные по hC5, проверяли блокирующим методом анализа, используя связывающий hC5 белок OmCI и hMG7-связывающий белок. Для пяти клонов сигнал от связывания с белком С5 комплемента полностью исчезал в присутствии OmCI, достигая уровня фона (таблица 1). Один из этих клонов, а именно вариант Z05363 (SEQ ID NO:510), также проверяли на его способность связываться с hC5 в присутствии hMG7-связывающего белка. hMG7-связывающий белок не ингибировал связывание Z05363 с hC5.
Таблица 1
Ответ в ELISA на мишень с или без блокирующей молекулы для ряда Z-вариантов
Z-вариант
SEQ ID NO:№
hC5 (OD 450 нм)
Блокирующая молекула OmCI
Z05363
SEQ ID NO:510
3,143
полное блокирование
Z05477
SEQ ID NO:509
2,872
полное блокирование
Z05483
SEQ ID NO:511
0,531
полное блокирование
Z05538
SEQ ID NO:512
0,099
полное блокирование
Z05692
SEQ ID NO:513
0,944
полное блокирование
Секвенирование: секвенирование проводили на клонах, дающих положительные величины оптической плотности при скрининге методом ELISA против белка С5 комплемента. Каждому варианту присваивали уникальный идентификационный номер #####, и индивидуальные варианты указывали как Z#####. Аминокислотные последовательности 58-аминокислотных Z-вариантов перечислены на фигуре 1 и в списке последовательностей, как SEQ ID NO:509-513. Выведенные мотивы связывания с белком С5 комплемента этих Z-вариантов перечислены на фигуре 1 и в списке последовательностей как SEQ ID NO:13-17. Аминокислотные последовательности 49-аминокислотных полипептидов, которые предположительно составляют полный трехспиральный пучок в каждом из этих Z-вариантов, перечислены на фигуре 1 и в списке последовательностей как SEQ ID NO:261-265.
Пример 2: получение и характеристика Z-вариантов
Материалы и способы
Субклонирование Z-вариантов, экспрессия и очистка белка:
6
Пять связывающих белок С5 комплемента Z-вариантов (Z05363 (SEQ ID NO:510), Z05477 (SEQ ID NO:509), Z05483 (SEQ ID NO:511), Z05538 (SEQ ID NO:512) и Z05692 (SEQ ID NO:513)) были амплифицированы на основе библиотечных векторов pAffil/pAY00065/pAY02947. Для создания димерных молекул «Аффибоди» с N-концевыми His-тэгами применяли стратегию субклонирования с использованием стандартных методик молекулярной биологии, подробно описанную в WO 2009/077175. Фрагменты Z-генов субклонировали в экспрессионный вектор pAY01448, что давало кодируемую последовательность MGSSHHHHHHLQ-[Z#####][Z#####]-VD.
600
Субклонированные Z-варианты трансформировали в E. coli BL21(DE3) и экспрессировали в мультиферментерной системе Greta (Belach Bioteknik). Кратко, культуры выращивали при 37°C в 800 мл среды TSB-YE, содержащей 50 мкг/мл канамицина. При OD приблизительно 1, культуры индуцировали автоматизированным добавлением IPTG до конечной концентрации 0,05 мМ. Культуры охлаждали приблизительно до 10°C после 5 ч индукции и собирали центрифугированием (20 мин, 15900 g). Супернатанты отбрасывали, а клеточные осадки собирали и хранили при -20°C до дальнейшего использования. Уровень экспрессии и степень растворимости оценивали электрофорезом в ДСН-ПААГ, используя 4-12% NuPAGE™ гели (Invitrogen) и окрашивание Кумасси синим.
Для Z-вариантов, экспрессированных в основном в виде растворимого белка, клеточные осадки ресуспендировали в буфере для связывания (20 мМ фосфат натрия, 0,5 M NaCl, 20 мМ имидазол, pH 7,4) с добавлением 1000 Ед. Benzonase (Merck, кат. № 1.01654.001) и разрушали ультразвуком. Для каждого из Z-вариантов суспензию после обработки ультразвуком осветляли центрифугированием (40 мин, 25000 g, 4°C), и супернатант наносили на колонку His GraviTrap™ объемом 1 мл (GE Healthcare). Колонку промывали буфером для промывки (20 мМ фосфат натрия, 0,5 M NaCl, 60 мМ имидазол, pH 7,4), перед элюцией Z-вариантов 3 мл элюирующего буфера (20 мМ фосфат натрия, 0,5 M NaCl, 0,5 М имидазол, pH 7,4). Z-варианты, которые экспрессировались в основном в виде нерастворимых белков, очищали аналогичным образом, но буферы для связывания и промывки включали 8 М мочевину. При необходимости, Z-варианты дополнительно очищали с помощью обращенно-фазовой хроматографии (RPC) на колонках Resource™ объемом 1 мл (GE Healthcare), используя воду, содержащую 0,1% TFA (трифторуксусная кислота) в качестве подвижной фазы и элюцию соответствующим градиентом (как правило, 0-50% за 20 объемов колонки) ацетонитрила, включающего 0,1% TFA.
Буфер обменивали на PBS, используя колонки PD-10 (GE Healthcare).
Характеристика белка: концентрацию очищенных Z-вариантов определяли путем измерения поглощения при 280 нм с использованием теоретических коэффициентов экстинкции. Чистоту оценивали электрофорезом в ДСН-ПААГ, используя 4-12% NuPAGE™ гели (Invitrogen) и окрашивание Кумасси синим. Для идентификации и определения молекулярных масс очищенных Z-вариантов проводили LC/MS-анализ на LC/MSD-системе Agilent 1100 (Agilent Technologies).
КД-анализ: очищенные Z-варианты разбавляли до 0,5 мг/мл в PBS. Для каждого разбавленного Z-варианта записывали КД-спектр в диапазоне 250-195 нм при температуре 20°C. Дополнительно, для определения температуры плавления (Tm) проводили измерения при переменной температуре (VTM). В VTM поглощение измеряли при 221 нм во время повышения температуры с 20 до 90°C со скоростью 5°C/мин. Способность Z-варианта восстанавливать исходную укладку оценивали, измеряя дополнительный КД-спектр в диапазоне 250-195 нм после охлаждения до 20°C. Измерение КД проводили на спектрополариметре Jasco J-810 (Jasco Scandinavia AB), используя ячейку с длиной оптического пути 1 мм.
6
Анализ связывания на приборе Biacore: взаимодействие пяти субклонированных имеющих His-тэг димерных Z-вариантов, связывающих hC5, cC5, rC5, hMG7 и hIgG (Sigma, кат. № G4386), анализировали на приборе Biacore (GE Healthcare). Z-варианты иммобилизовали в различных проточных ячейках на слое из карбоксилированного декстрана на поверхности нескольких СМ5-чипов (GE Healthcare). Иммобилизацию проводили через аминогруппы, следуя протоколу изготовителя. Поверхность одной ячейки на каждом чипе активировали и дезактивировали для использования в качестве фоновой при введении анализируемого вещества. Анализируемые вещества, разведенные в рабочем буфере HBS-EP (GE Healthcare) до конечной концентрации 100 нМ, вводили при скорости потока 10 мкл/мин в течение 1 мин. После диссоциации в течение 2 минут поверхность регенерировали однократным введением 10 мМ HCl. Результаты анализировали с помощью программы BiaEvaluation (GE Healthcare). Кривые, полученные для фоновой поверхности, вычитали из кривых, полученных для поверхностей, покрытых лигандом.
Результаты
Субклонирование Z-вариантов: пять отобранных уникальных клонов (Z05477 (SEQ ID NO:509), Z05363 (SEQ ID NO:510), Z05483 (SEQ ID NO:511), Z05538 (SEQ ID NO:512) и Z05692 (SEQ ID NO:513)) были выбраны для субклонирования в виде димеров в экспрессионный вектор, и впоследствии правильность субклонирования была подтверждена секвенированием.
Получение белка: меченные гистидинами димерные Z-варианты давали приемлемый уровень экспрессии растворимого продукта гена. Чистоту полученных партий оценивали как превышающую 90%, по анализу методом электрофореза в ДСН-ПААГ. LC/MS-анализ подтвердил правильный молекулярный вес для молекул всех Z-вариантов.
КД-анализ: температуры плавления (Tm) различных Z-вариантов вычисляли, определяя среднюю точку перехода на зависимости КД-сигнала от температуры. Результаты для ряда обратимо сворачивающихся Z-вариантов приведены в таблице 2 ниже.
Таблица 2
Температуры плавления для ряда Z-вариантов
Z-вариант
SEQ ID NO:# мономерного Z-варианта
Tm (°C)
His<sub>6</sub>-(Z05477)<sub>2</sub>
SEQ ID NO:509
45
His<sub>6</sub>-(Z05363)<sub>2</sub>
SEQ ID NO:510
35
His<sub>6</sub>-(Z05483)<sub>2</sub>
SEQ ID NO:511
44
His<sub>6</sub>-(Z05538)<sub>2</sub>
SEQ ID NO:512
54
His<sub>6</sub>-(Z05692)<sub>2</sub>
SEQ ID NO:513
52
Анализ связывания на приборе Biacore: связывание пяти субклонированных димерных Z-вариантов с различными видами C5 и MG7, субдоменом hC5, а также фоновое связывание с IgG, проверяли на приборе Biacore, путем введения различных белков над поверхностью, содержащей Z-варианты. Уровень иммобилизации лигандов для различных Z-вариантов на поверхности составлял: Z05363: 2080 RU, Z05477: 2180 RU, Z05483: 2010 RU, Z05538: 2570 RU и Z05692: 3270 RU. Различные Z-варианты были проверены на связывание с различными наборами белков, вводимыми в концентрации 100 нМ, см. таблицу 3. Результат для протестированных Z-вариантов представлен в таблице в виде «+/-» для каждого белка. В качестве примера анализа связывания на приборе Biacore, на фигуре 2 показаны сенсограммы, полученные для иммобилизованного димерного Z05477 относительно связывания с hC5, cC5, rC5, hMG7 и hIgG.
Таблица 3
Ответ, полученный с помощью Biacore, для различных Z-вариантов относительно С5 различных биологических видов и важных отобранных фоновых белков
Z-вариант
SEQ ID NO:# мономерного Z-варианта
hC5
cC5
rC5
hMG7
hIgG
His<sub>6</sub>-(Z05477)<sub>2</sub>
SEQ ID NO:509
+
+
+
-
-
His<sub>6</sub>-(Z05363)<sub>2</sub>
SEQ ID NO:510
+
+
+
-
-
His<sub>6</sub>-(Z05483)<sub>2</sub>
SEQ ID NO:511
+
+
+
-
-
His<sub>6</sub>-(Z05538)<sub>2</sub>
SEQ ID NO:512
+
+
+
-
-
His<sub>6</sub>-(Z05692)<sub>2</sub>
SEQ ID NO:513
+
+
-
-
-
Пример 3: разработка и создание зрелой библиотеки связывающих белок С5 комплемента Z-вариантов
В этом примере была сконструирована зрелая библиотека. Библиотеку использовали для отбора hC5-связывающих полипептидов. Обычно ожидается, что отбор из зрелых библиотек дает связывающие молекулы с большей аффинностью (Orlova et al. Cancer Res 2006, 66(8):4339-48). В этом исследовании рандомизированные двухцепочечные линкеры были созданы с помощью технологии Slonomics, которая позволяет включение рандомизированных наборов тринуклеотидных строительных блоков, используя лигирование и рестрикции для последовательного построения двухцепочечной ДНК.
Материалы и способы
Разработка библиотеки: библиотека была основана на отборе последовательностей связывающих hC5 Z-вариантов, описанных в примерах 1 и 2. В новой библиотеке 13 вариабельных позиций в каркасе Z-молекулы были изменены на некоторые аминокислотные остатки в соответствии со стратегией, основанной на последовательностях Z-вариантов, определенных в SEQ ID NO:509-513 (Z05477, Z05363, Z05483, Z05538, Z05692). Библиотека SlonoMax двухцепочечной ДНК, содержащей 147 п.о., кодирующих частично рандомизированную аминокислотную последовательность спиралей 1 и 2, 5ʹ-AA ATA AAT CTC GAG GTA GAT GCC AAA TAC GCC AAA GAA/GAG NNN NNN NNN GCA/GCC NNN NNN GAG/GAA ATC/ATT NNN NNN TTA/CTG CCT AAC TTA ACC/ACT NNN NNN CAA/CAG TGG NNN GCC/GCG TTC ATC/ATT NNN AAA/AAG TTA/CTG NNN GAT/GAC GAC CCA AGC CAG AGC TCA TTA TTT A-3ʹ (рандомизированные кодоны проиллюстрированы как NNN), фланкированных сайтами рестрикции XhoI и SacI, была заказана в Sloning BioTechnology GmbH (Pucheim, Germany). Теоретическое распределение аминокислотных остатков в новой библиотеке, в итоге включающей 12 вариабельных Z-позиций, приведено в таблице 4.
Таблица 4
Разработка библиотеки
Аминокислотная позиция в молекуле Z-варианта
Рандомизация (сокращенные названия аминокислот)
Число аминокислот
Доля
9
H,Q,S,T,V
5
1/5
10
I,L,V,W
4
1/4
11
A,D,E,H,K,L,N,R,S,T,Y
12
1/12
13
N,Q,W,Y
4
1/4
14
A,D,E,H,I,K,L,N,Q,R,S,T,V,W,Y
15
1/14
17
D,E
2
1/2
18
A,D,E,G,H,I,K,L,Q,R,S,T,V,Y
14
1/14
24
I,L,V
3
1/3
25
A,D,E,H,K,N,Q,R,S,T,Y
11
1/11
28
I,L,V
3
1/3
32
A,D,E,F,G,H,K,L,N,Q,R,S,T,V
14
1/14
35
A,D,E,H,K,N,Q,R,S,T,W,Y
12
1/12
Конструирование библиотеки: библиотеку амплифицировали с использованием полимеразы AmpliTaq Gold (Applied Biosystems, кат. №4311816) в течение 12 циклов ПЦР, и собранные продукты очищали набором QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, кат. №28106) в соответствии с рекомендациями поставщика. Очищенный пул фрагментов рандомизированной библиотеки расщепляли рестрикционными ферментами XhoI и SacI (New England Biolabs, кат. № R01460L и кат. № R0156L) и очищали еще раз набором для очистки ПЦР-фрагментов. Далее, продукт очищали, используя препаративный гель-электрофорез в 1%-ном агарозном геле.
Фагмидный вектор pAY02592 (по существу pAffi1, описанный в Grönwall et al., выше) расщепляли такими же ферментами, очищали экстракцией фенолом/хлороформом и переосаждением этанолом. Обработанные рестриктазами фрагменты и вектор лигировали в молярном соотношении 5:1 с помощью ДНК-лигазы фага Т4 (New England Biolabs, кат. № M0202S) в течение 2 часов при RT с последующей инкубацией в течение ночи при 4°C. Лигированную ДНК выделяли экстракцией фенолом/хлороформом и переосаждением этанолом с последующим растворением в 10 мМ Tris-HCl, pH 8,5.
2
4
Реакции лигирования (приблизительно по 250 нг ДНК на трансформацию) вводили электропорацией в электрокомпетентные клетки E. coli RR1ΔM15 (100 мкл). Сразу после электропорации добавляли приблизительно 1 мл среды SOC (среда TSB-YE, 1% глюкозы, 50 мкМ MgCl, 50 мкМ MgSO, 50 мкМ NaCl и 12,5 мкМ KCl). Трансформированные клетки инкубировали при 37°C в течение 50 мин. Образцы отбирали для титрования и для определения числа трансформантов. После этого клетки пулировали и культивировали в течение ночи при 37°C в 7 л среды TSB-YE, содержащей 2% глюкозы и 100 мкг/мл ампициллина. Клетки осаждали в течение 15 мин при 4000 g, ресуспендировали в растворе глицерина и PBS (содержащего приблизительно 40% глицерина). Клетки аликвотили и хранили при -80°C. Клоны из библиотеки Z-вариантов секвенировали для того, чтобы определить содержание и оценить выход полученной библиотеки относительно ее дизайна. Секвенирование проводили, как описано в примере 1, и подтверждали распределение аминокислот.
Получение фагового запаса: клетки из глицеринового запаса, содержащего С5-фагмидную библиотеку, высевали в 20 л рецептурной среды без пролина (описанной в примере 1), содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и выращивали при 37°C в ферментере (Belach Bioteknik, BR20). Все стадии проводили, как описано в примере 1 для библиотеки Zlib006Naive.II. После культивирования клетки осаждали центрифугированием при 15900 g, а фаговые частицы, остающиеся в среде после этого, дважды переосаждали в PEG/NaCl, фильтровали и растворяли в PBS с глицерином, как описано в примере 1. Фаговые стоки хранили при -80°C до использования в процедуре отбора.
Результаты
9
9
Конструирование библиотеки: новая библиотека была разработана на основе набора блокируемых OmCI C5-связывающих Z-вариантов с подтвержденной способностью к связыванию С5 (примеры 1 и 2). Теоретический размер разработанной библиотеки составлял 6,7×10 Z-вариантов. Фактический размер библиотеки, определенной титрованием после трансформации в клетки E. coli RR1ΔM15, составлял 1,4×10 трансформантов.
Качество библиотеки было проверено путем секвенирования 64 трансформантов и путем сравнения их фактических последовательностей с теоретическим дизайном. Было показано, что содержание фактической библиотеки в сравнении с теоретическим является удовлетворительным. Фиксированная позиция в теоретической аминокислотной последовательности (W в позиции 27) соблюдалась в фактической последовательности, поскольку только ожидаемая аминокислота наблюдалась в этой позиции. Таким образом, была успешно сконструирована зрелая библиотека hC5-связывающих полипептидов.
Пример 4: отбор, скрининг и характеристика Z-вариантов из зрелой библиотеки
Материалы и способы
Отбор полипептидов, связывающих белок С5 системы комплемента, с помощью фагового дисплея: белок-мишень hC5 биотинилировали, как описано в примере 1. Отбор методом фагового дисплея проводили против hC5 по существу, как описано в примере 1, используя новую библиотеку молекул Z-вариантов, описанную в примере 3. Для амплификации фагов использовали E. coli XL1-Blue. Отбор первоначально проводили в двух параллельных экспериментах. В одном из них время отбора составляло 2 ч, тогда как в другом эксперименте использовали более короткие времена отбора: 20 мин для первого цикла и 10 мин для последующих циклов 2-4. Эти два эксперимента (1 и 2) были дополнительно разделены на втором цикле, что в общем дало шесть экспериментов (1а-с и 2а-с, отличающихся по концентрации мишени и условиям промывки). Отбор проводили всего за четыре цикла. В 1-ом цикле использовали 25 мМ белок С5 системы комплемента и проводили пять промывок PBST 0,1%. В последующих трех циклах увеличивали жесткость условий, снижая концентрацию мишени и увеличивая число промывок. В циклах 2, 3 и 4 использовали 10, 5 или 2,5 нМ белок С5 комплемента, 4, 1 или 0,25 нМ белок С5 комплемента и 1,6, 0,2 или 0,05 нМ белок С5 комплемента. В циклах 2, 3 и 4 проводили 10, 15 и 20 промывок, используя PBST 0,1%. Дополнительно, предпоследнюю промывку увеличивали до 3 ч с 50х избытком небиотинилированного hC5 в промывочном растворе для двух экспериментов (1с и 2с).
Секвенирование потенциальных связывающих молекул: для секвенирования были отобраны индивидуальные клоны из различных экспериментов по отбору. Все клоны, взятые для скрининга методом ELISA, были просеквенированы. Амплификацию фрагментов генов и анализ последовательности фрагментов генов проводили, как описано в примере 1.
Скрининг Z-вариантов методом ELISA: одиночные колонии, содержащие Z-варианты, отбирали случайным образом из отобранных клонов зрелой библиотеки полипептидов, потенциально связывающих белок С5 комплемента, и растили в 1 мл среды, как описано в примере 1. Периплазматические белки высвобождали за 8 повторных циклов замораживания-оттаивания. Скрининг методом ELISA проводили по существу, как описано в примере 1 за исключением следующего. 96-луночные планшеты для ELISA с уменьшенной в два раза поверхностью покрывали 2 мкг/мл специфичного к ABD козьего антитела (полученного авторами самостоятельно), разведенного в буфере для покрытия поверхности белком. Биотинилированный hC5 использовали в концентрации 0,15 мкг/мл, и инкубацию проводили в течение 1,5-2 ч. Конъюгированная со стрептавидином HRP была получена от Thermo Scientific (кат. № N100). Z-вариант Z05363 (SEQ ID NO:510) из первых экспериментов по отбору (пример 1) использовали в качестве положительного контроля, а также в качестве отрицательного контроля за исключением hC5.
Отобранные зрелые Z-варианты проходили второй скрининг против hC5 при более низкой концентрации и в сравнении с rC5. Анализ по существу проводили, как описано выше. hC5 и rC5 использовались в концентрации 0,05 мкг/мл и 4 мкг/мл, соответственно. Z-вариант Z05363 (SEQ ID NO:510) также использовался в качестве положительного контроля в этом эксперименте. В качестве отрицательного контроля анализировали Z-вариант, связывающийся с PDGF-Rβ (Z01977; описанный в WO 2009/077175), против биотинилированных hC5 или rC5.
50
Тщательный анализ последовательностей отобранных Z-вариантов и корреляция аминокислот в 13 рандомизированных позициях с измеренными температурами плавления и величинами IC для С5 человека и мыши в анализе гемолиза (описанного в примере 6) позволили предположить, что предпочтительный Z-вариант не был идентифицирован среди 558 просеквенированных клонов. На основе Z-варианта Z05998 (SEQ ID No:499), одна аминокислота, Ile в позиции 10, была заменена на Leu с использованием стандартной методики сайт-направленного мутагенеза. Новый вариант именуется как Z08044 (SEQ ID NO:498). Выведенный мотив, связывающий белок С5 комплемента, этого Z-варианта приведен на фигуре 1 и в списке последовательностей как SEQ ID NO:2. Аминокислотная последовательность полипептида, имеющего 49 аминокислот в длину, предположительно составляющих полный трехспиральный пучок в этом Z-варианте, приведена на фигуре 1 и в списке последовательностей как SEQ ID NO:250.
Результаты
Отбор полипептидов, связывающий белок С5 системы комплемента, с помощью фагового дисплея: отбор проводили всего в шести параллельных экспериментах, каждый из которых включал в себя четыре цикла. Эксперименты различались между собой по концентрации мишени и условиям промывки: 1а) время отбора составляло 2 ч, высокая концентрация мишени, стандартная промывка, 1b) время отбора составляло 2 ч, низкая концентрация мишени, стандартная промывка, 1с) время отбора составляло 2 ч, средняя концентрация мишени, длительная промывка, 2а) время отбора составляло 10 мин, высокая концентрация мишени, стандартная промывка, 2b) время отбора составляло 10 мин, низкая концентрация мишени, стандартная промывка, и 2c) время отбора составляло 10 мин, средняя концентрация мишени, длительная промывка. Для каждого цикла при отборе концентрация мишени снижалась, а условия промывки становились более жесткими. Все эксперименты давали в каждом раунде достаточное количество фаговых частиц в элюате. Большинство фаговых частиц было найдено в экспериментах 1а и 2а, представляющих максимальную концентрацию мишени и наиболее мягкие условия промывки.
Секвенирование: случайным образом отобранные клоны (558) были просеквенированы. Каждому индивидуальному Z-варианту был присвоен уникальный идентификационный номер, Z#####, как описано в примере 1. Всего были идентифицированы 242 новых уникальных молекул Z-вариантов. Аминокислотные последовательности 58-аминокислотных длинных Z-вариантов приведены на фигуре 1 и в списке последовательностей как SEQ ID NO:497, SEQ ID NO:499-508 и SEQ ID NO:514-744. Выведенные мотивы, связывающие белок С5 системы комплемента, из этих Z-вариантов приведены на фигуре 1 и в списке последовательностей, как SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3-12 и SEQ ID NO:18-248. Аминокислотные последовательности 49-аминокислотных полипептидов, предположительно составляющих полный трехспиральный пучок в каждом из этих Z-вариантов, приведены на фигуре 1 и в списке последовательностей как SEQ ID NO:249, SEQ ID NO:251-260 и SEQ ID NO:266-496. Среди клонированных последовательностей 63 последовательности встречались 2 или большее число раз.
Скрининг Z-вариантов с помощью ELISA: клоны, полученные после четырех циклов отбора, продуцировали в 96-луночных планшетах и скринировали по их способности связывать белок hС5, используя метод ELISA. Были проанализированы все случайно отобранные клоны. Было найдено, что 229 из 242 уникальных Z-вариантов дают более высокий ответ (0,3-3,1 AU) против hC5 в концентрации 0,15 мкг/мл по сравнению с положительным контролем, клоном Z05363 (SEQ ID NO:510; среднее поглощение составляло 0,3 AU), полученным в первоначальном отборе (пример 1). Клоны из всех экспериментов по отбору давали положительные сигналы. Отрицательные контроли имели поглощение приблизительно 0,1 AU.
Z-варианты были отобраны исходя из их активности в скрининге методом ELISA против hC5 и частоты встречаемости. 43 уникальных Z-варианта были проанализированы против более низкой концентрации hC5 (0,05 мкг/мл), а также против rC5 (4 мкг/мл). Положительный результат в отношении rC5 был получен для 40 из протестированных Z-вариантов, определяемый как двукратное превышение сигнала от отрицательного контроля (0,4 AU). Результаты для всех протестированных Z-вариантов против более низкой концентрации hC5, а также против rC5, показаны на фигуре 3.
Пример 5: субклонирование, получение и характеристика подгруппы Z-вариантов, связывающих белок С5 системы комплемента
Материалы и способы
Субклонирование молекул Z-вариантов в экспрессионные векторы: для субклонирования в экспрессионный вектор pAY01448 были отобраны 45 клонов, исходя из анализа последовательности и активности в ELISA против белка С5 системы комплемента человека и крысы. Мономерные фрагменты Z-вариантов были амплифицированы из фагмидного вектора pAY02592 и субклонированы в pAY01448, как описано в примере 2, что давало вектор, кодирующий белковую последовательность MGSSHHHHHHLQ-[Z#####]-VD.
6
Экспрессия и очистка белка: 45 Z-вариантов в формате His-(Z#####) были проэкспрессированы в автоматизированной мультиферментерной системе, как описано в примере 2, или аналогичным образом в маломасштабном эксперименте в 100-миллилитровых культурах во встряхиваемых колбах с производимой вручную индукцией экспрессии путем добавления IPTG до конечной концентрации 0,4 мМ. Очистку проводили, используя колонки HisGraviTrap™ объемом 1 мл, как описано в примере 2, или в меньшем масштабе, используя колонки His SpinTrap объемом 0,1 мл (GE Healthcare, кат. №28-4013-53). Буфер меняли на PBS, используя колонки PD-10 или PD SpinTrap G-25 (GE Healthcare, кат. №28-9180-04) в соответствии с инструкциями изготовителя. Концентрацию очищенных Z-вариантов определяли путем измерения поглощения при 280 нм, а чистоту и идентичность оценивали электрофорезом в ДСН-ПААГ и LC/MS, как описано в примере 2. Образцы аликвотили и хранили при -80°C до дальнейшего использования.
КД-анализ: КД-анализ для определения температуры плавления и обратимости денатурации проводили, как описано в примере 2.
Результаты
Экспрессия и очистка белка: все 45 субклонированных Z-вариантов могли экспрессироваться, и растворимость in vitro для всех очищенных вариантов была хорошей. Чистоту оценивали с помощью LC/MS, чтобы получить превышающую 90% для всех вариантов. Правильный молекулярный вес был подтвержден с помощью LC-MS.
КД-анализ: измерения КД-спектров, проведенные при 20°C, подтвердили α-спиральную структуру Z-вариантов при этой температуре. Наложение спектров, полученных измерениями при переменной температуре (нагревание до 90°C с последующим охлаждением до 20°C), на спектры, полученные до измерения при переменной температуре, показало, что укладка всех Z-вариантов восстанавливается полностью или практически полностью, до их α-спиральных структур после нагревания до 90°C (результаты не показаны). Температуры плавления для группы Z-вариантов были определены из измерений при переменной температуре и приведены в таблице 5.
Таблица 5
Температуры плавления зрелых Z-вариантов с гистидиновым тэгом, напрямую слитым с аминоконцом SEQ ID NO:497 и SEQ ID NO:499-508
Z-вариант
SEQ ID NO:# Z-варианта
Tm (°C)
His<sub>6</sub>-Z06175
SEQ ID NO:497
44
His<sub>6</sub>-Z05998
SEQ ID NO:499
45
His<sub>6</sub>-Z06009
SEQ ID NO:500
45
His<sub>6</sub>-Z06079
SEQ ID NO:501
46
His<sub>6</sub>-Z06126
SEQ ID NO:502
44
His<sub>6</sub>-Z06140
SEQ ID NO:503
42
His<sub>6</sub>-Z06189
SEQ ID NO:504
47
His<sub>6</sub>-Z06214
SEQ ID NO:505
44
His<sub>6</sub>-Z06215
SEQ ID NO:506
41
His<sub>6</sub>-Z06226
SEQ ID NO:507
44
His<sub>6</sub>-Z06018
SEQ ID NO:508
46
Пример 6: характеристика in vitro С5-связывающих Z-вариантов
Материалы и способы
Клонирование и получение белка: ДНК, кодирующая подгруппу связывающих С5 Z-вариантов (SEQ ID NO:745-757) с оптимизированными под E. coli кодонами, была синтезирована GeneArt, GmbH. Синтетические гены, представляющие С5-связывающие Z-варианты, были субклонированы и экспрессированы в E. coli. Экспрессионные векторы, кодирующие конструкции мономеров или димеров Z-вариантов, необязательно соединенных с альбумин-связывающим доменом (ABD094, SEQ ID NO:759), схематически показаны на фигуре 4.
Экспрессированные внутриклеточно Z-варианты были очищены с использованием стандартных хроматографических способов. Гомогенизацию и осветление проводили с помощью ультразвука с последующим центрифугированием и фильтрацией. В качестве стадии захвата использовали анионообменную хроматографию. Дополнительную очистку осуществляли с помощью хроматографии гидрофобных взаимодействий. Очистку проводили в кислых условиях (рН 5,5). Доочистку и смену буфера проводили с помощью эксклюзионной хроматографии. Перед концентрированием до конечного содержания белка уровень эндотоксина снижали с помощью аффинной хроматографии на полимиксине В. Полученные белки анализировали с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии и электрофореза в ДСН-ПААГ.
Дополнительно, в исследованиях in vitro использовали рекомбинантно экспрессированный белок OmCI (SEQ ID NO:761).
Ингибирование гемолиза: для исследования функций классического пути системы комплемента и их ингибирования С5-связывающими полипептидами, получали овечьи эритроциты из цельной крови овец в растворе Элсевера (Swedish National Veterinary Institute) и после этого обрабатывали кроличьей антисывороткой против овечьих эритроцитов (Sigma), чтобы получить сенсибилизированные антителами овечьи эритроциты (ЕА). Весь процесс проводили при асептических условиях. Все другие реагенты были покупными.
2
2
3
Анализ in vitro проводили в 96-луночном круглодонном микротитровочном планшете, последовательно добавляя исследуемый белок, содержащую комплемент сыворотку и суспензию ЕА. Конечные концентрации всех реагентов в общем реакционном объеме 50 мкл на лунку и рН 7,3-7,4 составляли: 0,15 мМ CaCl; 0,5 мМ MgCl; 3 мМ NaN; 138 мМ NaCl; 0,1% желатина; 1,8 мМ барбитурат натрия; 3,1 мМ барбитуровая кислота; 5 миллионов EA; содержащая белок C5 системы комплемента сыворотка в соответствующем разведении; и С5-связывающие Z-варианты при заданных концентрациях. В анализе использовалась сыворотка из различных биологических видов, для того чтобы определить межвидовую перекрестную реактивность Z-вариантов. Для мышиной сыворотки должна быть добавлена истощенная по С5 сыворотка человека (C5D от Quidel, кат. № A501) в равном количестве.
Z-варианты предварительно инкубировали с вышеописанной содержащей комплемент сывороткой в течение 20 мин на льду до начала реакции путем добавления суспензии ЕА. Гемолитическую реакцию оставляли для прохождения на 45 мин при 37°C и встряхивании и, необязательно, останавливали добавлением 100 мкл холодного физиологического раствора, содержащего 0,02%-ый Tween 20. Клетки центрифугированием осаждали на дно, и верхнюю часть, соответствующую 100 мкл супернатанта, переносили в прозрачный микропланшет с уменьшенной в два раза поверхностью и плоскодонными лунками. Результаты реакции анализировали по оптической плотности, используя спектрофотометр для микропланшетов, при длине волны 415 нм.
50
Всегда в каждый планшет включали контроли, носитель и OmCI (SEQ ID NO:761) для определения на каждом планшете значений для неингибированных и полностью ингибированных реакций, соответственно. Эти значения использовали для вычисления % ингибирования гемолиза с помощью комплемента при данной концентрации образца. Сила ингибирования (величины IC) тестируемых Z-вариантов определяли, используя этот же анализ в присутствии контролируемой концентрации С5 человека, добавленной к истощенной по С5 сыворотке. Для высокоактивных ингибиторов (низкие наномолярные и субнаномолярные концентрации) конечную концентрацию С5 в реакционной смеси поддерживали при 0,1 нМ, для чего, необязательно, использовали истощенную по С5 или недостаточную по С5 сыворотку.
In vitro кинетика и аффинность С5-связывающих Z-вариантов в отношении иммобилизованного hC5: аффинность связывания ряда С5-связывающих Z-вариантов в отношении hC5 анализировали, используя прибор Biacore T200 (GE Healthcare). C5 человека (A403, Quidel Corporation) конъюгировали с сенсорным чипом СМ5 (900 RU) через аминогруппы в соответствии с протоколом изготовителя. Конъюгирование проводили, вводя hC5 с концентрацией 7,5 мкг/мл в 10 мМ Na-ацетатном буфере с рН 5 (GE Healthcare). Референсную ячейку обрабатывали такими же реагентами без введения С5 человека.
Все эксперименты проводили в 10 мМ HEPES pH 7,4, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA, 0,005% Surfactant P20 (буфер HBS-EP, GE Healthcare). Для анализа кинетики скорость потока составляла 30 мкл/мин, и данные собирали при 25°C. Вычитали данные, полученные от референсной ячейки, чтобы компенсировать общие изменения показателя преломления. В большинстве случаев введение HBS-EP также включали в качестве контроля, так что сенсограммы являлись двукратно нормализованными. Поверхность чипов регенерировали в буфере HBS-EP.
Связывание Z-вариантов с иммобилизованным hC5 исследовали способом измерения кинетики за один цикл, в котором пять концентраций образца вводят одну за другой в одном цикле без регенерации между введениями. Кинетические константы вычисляли из сенсограмм, используя Ленгмюровскую модель 1:1 или бивалентную аналитическую модель в программе Biacore T200 Evaluation Software version 1.0.
In vitro кинетика и аффинность С5-связывающих молекул Z-ABD в отношении иммобилизованного hC5: связывание молекул Z-ABD (SEQ ID NO:748-757, слитая с ABD094 (SEQ ID NO:759) через GS-линкер) с иммобилизованным hC5 оценивали с использованием прибора Biacore T200 (GE Healthcare).
Конструкции Z-ABD, в которых Z06175a (SEQ ID NO:753) в качестве мономера или димера слита с ABD094 (SEQ ID NO:759) либо на N-конце, либо на С-конце, через разные линкеры, как описано на фигуре 4 (конструкции 2, 7, 5 и 4), также предварительно инкубировали с рекомбинантным альбумином человека (Cell Prime rAlbumin AF-G, 9301, Novozymes), разбавляли и затем вводили над иммобилизованным С5 человека в соответствии со способом исследования кинетики за один цикл, как описано выше. В качестве сравнения такие же конструкции вводились в отсутствие HSA. Две конструкции, Z06175a-GS (фигура 4, конструкция 1) и Z06175a-GSGGGGSGGGGS-ABD094 (фигура 4, конструкция 3), были протестированы только в отсутствие HSA.
Равновесное связывание С5-связывающих Z-вариантов с покрытыми С5 ECL-планшетами: аффинность ряда С5-связывающих конструкций, содержащих Z-варианты (SEQ ID NO:745, SEQ ID NO:748-757, необязательно слитые с ABD094 (SEQ ID NO:759) в конструкциях, описанных на фигуре 4) в отношении С5 человека была измерена путем замещения меченного рутением С5-связывающего Z-ABD-варианта (SEQ ID NO:748, слитая с SEQ ID NO:759 через GS-линкер).
D
Z-ABD-вариант (SEQ ID NO:748, слитая с SEQ ID NO:759 через GS-линкер) для использования в качестве трейсера метили в молярном соотношении 1:12 до 1:20 (белок: SULFO-TAG NHS-Ester, Meso Scale Discovery, кат. № R91AN-1). Реакцию мечения проводили на льду в течение двух часов. Несвязавшийся SULFO-TAG удаляли с использованием центрифужных колонок для обессоливания Zeba™ (Thermo Scientific, кат. № 89889), и конечную концентрацию белка измеряли с использованием реагента Бредфорд (Bradford, M.M., Anal. Biochem. 72: 248-254, 1976). Аффинность (константа диссоциации, K) меченного SULFO-TAG Z-ABD-варианта была определена путем анализа насыщения связывания при повышении концентраций меченого Z-ABD-варианта относительно покрытых C5 электрохемилюминесцентных лунок (ECL, Meso Scale Discovery). Меченый Z-ABD-вариант дополнительно был проанализирован с помощью LC/MS с целью определения распределения молекул SULFO-TAG на Z-ABD-варианте.
2
Замещение проводили путем покрытия многозадачных непокрытых 96-луночных планшетов с высоком связыванием (Meso Scale Discovery, кат. № L15XB) 50 фмолями hC5 на лунку в течение ночи при 4°C. После этого неспецифичные сайты блокировали PBS с 1%-ным казеином в течение двух часов при RT. Различные Z-варианты, необязательно слитые с ABD094 (SEQ ID NO:759) (см. фигуру 4), инкубировали при различных концентрациях совместно с приблизительно 100 пМ меченным SULFO-TAG С5-связывающим Z-ABD-вариантом в PBS с 1%-ным казеином. Инкубацию проводили в течение трех часов при комнатной температуре и встряхивании планшета со скоростью 300 об/мин. В конце, инкубацию останавливали тремя промывками по 150 мкл ледяного буфера PBS-Tween20. Сразу после последней промывки в каждую лунку добавляли по 150 мкл 2x буфера для измерения оптической плотности (4x reading buffer T, Meso Scale Discovery, кат. № R92TC-3, разведенный 1:1 в сверхчистой HО), и сигнал измеряли с помощью планшетного спектрометра (SECTOR Imager 2400, Meso Scale Discovery). В качестве положительного контроля в анализ вытеснения включали природный С5-связывающий белок OmCI (Nunn et al., выше, SEQ ID NO:761). Аффинность связывания с С5 конкурирующих конструкций, связывающих С5, и контролей была определена путем нелинейного регрессионного анализ с использованием программ Excel plugin XLfit5 и GraphPad Prism 4.
Избирательность связывания Z-ABD с C5 относительно C3, C4 и IgG: связывание одного Z-ABD-варианта (SEQ ID NO:748, слитая с SEQ ID NO:759 через GS-линкер) с близкородственными белками С3 и С4 системы комплемента человека, а также связывание с IgG (поскольку источник Z-домена, стафилококковый белок A, является IgG-связывающим белком) исследовали с помощью поверхностно-плазмонного резонанса (SPR) с использованием прибора Biacore 2000 (GE Healthcare). Конструкцию Z-ABD иммобилизовали на чипе CM5 (GE-Healthcare) через аминогруппы (70 RU). Над поверхностью пропускали 40 нM и 400 нM белки C3 (A401, Quidel), C4 (A402, Quidel) и IgG (I2511, Sigma) человека, разведенные в буфере HBS-P (GE Healthcare). За введением каждого белка следовал цикл регенерации путем введения 20 мМ NaOH в течение 30 с. В качестве положительного контроля параллельно вводили С5 человека в таких же концентрациях.
Результаты
Клонирование и получение белка: полученные варианты белков, схематически описанные на фигуре 4, где «Z» может представлять собой SEQ ID NO:745 и SEQ ID NO:748-757, были проанализированы с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии и электрофорезом в ДСН-ПААГ (фигура 5).
50
Ингибирование гемолиза: подгруппу связывающих С5 Z-вариантов анализировали на С5-связывающую активность in vitro и ингибирование гемолиза овечьих эритроцитов. Вычисляли концентрацию Z-варианта, приводящую к 50%-му ингибированию гемолиза (IC) или к 50%-му ингибированию связывания меченого белка с С5 человека. Представительные кривые зависимости ответа от концентрации для Z-вариантов, показанных в SEQ ID NO:745 и SEQ ID NO:748-757, ингибирующих гемолиз, как описано в разделе способов, показаны на фигурах 6А и 6В. Результат для различных Z-вариантов, слитых с ABD094 (SEQ ID NO:759) через короткий GS-линкер, показан на фигуре 6А.
50
50
Родительский Z-вариант Z05477a (SEQ ID NO:745), слитый с ABD094 (SEQ ID NO:759) через короткий GS-линкер, имел величину IC примерно 100 нМ, тогда как протестированные С5-связывающие Z-ABD-варианты второго поколения, как правило, ингибировали гемолиз с величинами IC, составляющими примерно или меньше 1 нМ. Это указывает на более чем 100-кратное увеличение активности С5-связывающих Z-вариантов, найденных при отборе из зрелой библиотеки и последующем скрининге.
50
На фигуре 6В связывание с С5 показано для различных комбинаций одного представительного Z-варианта (Z06175a; SEQ ID NO:753): самого по себе, в виде димера и в виде белка, слитого с ABD094 (SEQ ID NO:759), либо на N-конце, либо на C-конце через различные линкеры, как указано на фигуре. С5-связывающие комбинации имеют величины IC в диапазоне от 86 пМ до 12 пM для сыворотки крови человека, измеренные с использованием вышеописанного анализа. Соответствующее значение для белка OmCI из мягкого клеща, как правило, составляло от 300 до 500 пМ.
In vitro кинетика: исследования кинетических характеристик связывания для ряда Z-вариантов (SEQ ID NO:748-757), необязательно слитых с ABD094 (SEQ ID NO:759), с иммобилизованным hC5, а также с С5 в присутствии альбумина человека, проводили, используя прибор Biacore T200.
Данные для десяти различных Z-вариантов, слитых с ABD094 через GS-линкер, представлены в таблице 6.
Таблица 6
Характеристики связывания с С5 человека для различных слитых белков Z-ABD
Конструкция
SEQ ID NO:# Z-варианта
k<sub>a</sub> (1/Mс)
k<sub>d</sub> (1/с)
K<sub>D</sub> (M)
Z-GS-ABD094
SEQ ID NO:748
6,93×10<sup>5</sup>
9,04×10<sup>-4</sup>
1,31×10<sup>-9</sup>
SEQ ID NO:749
6,75×10<sup>5</sup>
1,23×10<sup>-3</sup>
1,83×10<sup>-9</sup>
SEQ ID NO:750
7,65×10<sup>5</sup>
1,34×10<sup>-3</sup>
1,75×10<sup>-9</sup>
SEQ ID NO:751
6,90×10<sup>5</sup>
1,29×10<sup>-3</sup>
1,87×10<sup>-9</sup>
SEQ ID NO:752
7,02×10<sup>5</sup>
1,81×10<sup>-3</sup>
2,58×10<sup>-9</sup>
SEQ ID NO:753
7,90×10<sup>5</sup>
1,01×10<sup>-3</sup>
1,18×10"<sup>9</sup>
SEQ ID NO:754
5,00×10<sup>5</sup>
1,14×10<sup>-3</sup>
2,28×10<sup>-9</sup>
SEQ ID NO:755
6,84×10<sup>5</sup>
2,08×10<sup>-3</sup>
3,05×10<sup>-9</sup>
SEQ ID NO:756
3,17×10<sup>5</sup>
6,37×10<sup>-3</sup>
2,01×10<sup>-9</sup>
SEQ ID NO:757
4,63×10<sup>5</sup>
1,08×10<sup>-3</sup>
2,34×10<sup>-9</sup>
Также с использованием Biacore T200 было проанализировано связывание одного Z-варианта (SEQ ID NO:753), но в различных конструкциях, то есть с или без ABD и различными линкерами. В дополнение также оценивали эффект альбумина на некоторые слитые конструкции Z-ABD путем проведения одинакового анализа в отсутствие и в присутствии альбумина человека. Эти данные представлены ниже в таблице 7.
Таблица 7
Характеристики связывания с С5 человека для Z-ABD-слитого варианта Z06175a (SEQ ID NO:753, сокращенно указана как Z), содержащегося в различных конструкциях
Конструкция
Альбумин человека
k<sub>a</sub> (1/Mс)
k<sub>d</sub> (1/с)
K<sub>D</sub> (M)
Z-GS-ABD094
-
7,37×10<sup>5</sup>
1,06×10<sup>-3</sup>
1,43×0<sup>-9</sup>
Z-GS-ABD094
+
6,74×10<sup>5</sup>
9,62×10<sup>-4</sup>
1,43×10<sup>-9</sup>
Z-Z-GS-ABD094
-
5,93×10<sup>5</sup>
3,74×10<sup>-4</sup>
6,30×10<sup>-10</sup>
Z-Z-GS-ABD094
+
6,02×10<sup>5</sup>
4,67×10<sup>-4</sup>
7,76×10<sup>-10</sup>
Z-GS-ABD094-GSGGGGSGGGGS-Z
-
8,69×10<sup>5</sup>
5,75×10<sup>-4</sup>
6,62×10<sup>-10</sup>
Z-GS-ABD094-GSGGGGSGGGGS-Z
+
6,55×10<sup>5</sup>
3,83×10<sup>-4</sup>
5,86×10<sup>-10</sup>
Z-Z-GSGGGGSGGGGS-ABD094
-
4,59×10<sup>5</sup>
6,32×10<sup>-4</sup>
1,38×10<sup>-9</sup>
Z-Z-GSGGGGSGGGGS-ABD094
+
8,32×10<sup>5</sup>
9,39×10<sup>-4</sup>
1,13×10<sup>-9</sup>
Z-GS
-
2,42×10<sup>6</sup>
1,40×10<sup>-3</sup>
5,79×10<sup>-10</sup>
Z-GSGGGGSGGGGS-ABD094
-
3,64×10<sup>5</sup>
1,37×10<sup>-3</sup>
3,75×10<sup>-9</sup>
Неожиданно маленькие эффекты можно наблюдать при сравнении аффиностей для конструкций, связывающих hC5 (SEQ ID NO:760) в присутствии или в отсутствие альбумина. Это позволяет предположить, что одновременное связывание альбумина с ABD-фрагментом конструкции не влияет на взаимодействие с С5.
d
d
Равновесное связывание связывающих С5 Z-вариантов с покрытыми С5 ECL-планшетами: равновесное связывание С5-связывающих конструкций, состоящих из различных Z-вариантов (SEQ ID NO:745 и 748-757), необязательно слитых с ABD094 (SEQ ID NO:759) в конструкциях, описанных на фигуре 4, с hC5 оценивали в конкурентном анализе. Равновесное связывание С5-связывающих конструкций оценивали путем конкуренции за связывание с С5 на поверхности ECL-планшетов с меченными SULFO-TAG C5-связывающими Z-вариантами (SEQ ID NO:748), слитыми с ABD (SEQ ID NO:759). Для сравнения также был включен белок OmCI (SEQ ID NO:761) из клеща. Меченый Z-ABD-вариант, содержащий SEQ ID NO:748, имел аффинность (K) к hC5, составляющую 0,9 нМ. Дополнительно было найдено, что этот меченый Z-ABD-вариант связывается с антителом, специфичным к константной области Z-вариантов концентрационно-зависимым образом с K, составляющей 0,34 нM.
50
50
50
Было найдено, что С5-связывающие Z-варианты (SEQ ID NO:748-757), слитые на карбоксильном конце с ABD094 (SEQ ID NO:759) через GS-линкер, вытесняли 200 пМ меченный SULFO-TAG Z-ABD-вариант, со значениями IC в диапазоне от примерно 300 пM до 1 нМ (фигура 7A), тогда как соответствующая конструкция, содержащая родительский Z-вариант Z05477a (SEQ ID NO:745), давала величину IC аффинности примерно 30 нМ. В отличие от этого, было найдено, что природный С5-связывающий белок OmCI связывает hC5 с IC, составляющей 1,5 нМ (фигура 7A). Таким образом, все протестированные Z-варианты второго поколения (SEQ ID NO:748-757) проявляли более высокую аффинность связывания к С5 человека, чем родительский Z-вариант Z05477a (SEQ ID NO:745). Кроме того, аффинность превышала таковую для связывания OmCI с C5 человека при использовании такого же способа.
6
50
50
Также был протестирован ряд различных конструкций, содержащих одинаковый связывающий С5 домен в виде мономера, димера, с или без ABD, а также нескольких различных линкеров между различными доменами (фигура 7В). Было найдено, что мономерные варианты Z06175a (SEQ ID NO:753, необязательно слитые с His-тэгом или на C-конце с ABD) и димерные варианты с ABD на С-конце вытесняли 200 пМ меченный SULFO-TAG Z-ABD-вариант, со значениями IC в диапазоне от примерно 500 пM до 1,7 нМ, тогда как димерный вариант без ABD и мономерный вариант с ABD на N-конце вытесняли 200 пМ меченный SULFO-TAG Z-ABD, со значениями IC 4 нM и 17 нМ, соответственно.
Избирательность: избирательность оценивали, используя SPR-анализ, и поверхность с иммобилизованным Z-ABD-вариантом (SEQ ID NO:748, слитая с SEQ ID NO:759 через GS-линкер) не давала никакого значительного SPR-сигнала при воздействии 40 и 400 нМ паралогов С5, белков С3 и С4 человека, а также IgG человека. В качестве сравнения 400 нМ С5 человека вызывал SPR-ответ примерно 450 RU, показывая, что тестируемый Z-ABD-вариант в действительности является избирательным к С5 относительно C3, C4 и IgG.
Пример 7: исследования взаимодействия Z-ABD-вариантов с HSA, BSA и сывороточным альбумином из крысы и мыши
Материалы и способы
Для исследований взаимодействия альбумин-связывающего домена ABD094, слитого с С5-связывающими Z-вариантами, использовали два различных способа - эксклюзионную хроматографию и метод Biacore.
Эксклюзионную хроматографию (SEC) использовали для исследования взаимодействия между Z06175a-GS-ABD094 (SEQ ID NO:753, слитая с SEQ ID NO:759 через GS-линкер) и HSA. Кратко, эквимолярные количества Z06175a-GS-ABD094 и рекомбинантного HSA (Novozymes) предварительно инкубировали в PBS при комнатной температуре в течение 60 минут и далее пропускали через колонку Superdex200 (GE Healthcare), используя систему SMART (GE Healthcare). В качестве контролей пропускали Z06175a-GS-ABD094 и HSA по отдельности.
Связывание с иммобилизованным альбумином исследовали с использованием прибора Biacore 2000 (GE Healthcare). Рекомбинантный альбумин человека (Recombumin, Novozymes) присоединяли к сенсорному чипу СМ5 (385 RU) через аминогруппы, как описано изготовителем. Реакцию присоединения проводили путем введения альбумина человека в 10 мМ Na-ацетатном буфере с рН 4,5 (GE Healthcare). Референсную ячейку обрабатывали такими же реагентами без введения альбумина человека. Также в качестве контроля вводили HBS-EP, так что сенсограммы являлись двукратно нормализованными. Эксперименты проводили в буфере HBS-EP, для регенерации использовали 10 мM глицин-HCl pH 2 (GE Healthcare), скорость потока составляла 30 мкл/мин, и данные собирали при 25°C. Были протестированы две различные конструкции, Z-ABD (Z06175a-GS-ABD094) и Z-ABD-Z (Z06175a-GS-ABD094-GSGGGGSGGGGS-Z06175a), при трех различных концентрациях: 25 нМ, 100 нМ и 400 нМ. Для оценки данных сенсограмм использовали BIAevaluation version 4.1.1. Аналогичным образом было исследовано связывание Z-ABD (Z06175a-GS-ABD094) с поверхностями, на которых был иммобилизован сывороточный альбумин крысы (A4538, Sigma), мыши (A3559, Sigma) и быка (BSA, Sigma).
Результаты
На SEC-колонке более крупные молекулы элюируются быстрее более мелких. Как видно из фигуры 8А, совместное введение HSA и Z06175a-GS-ABD094 давало более быструю элюцию относительно введения одного HSA, позволяя предположить, что две молекулы ведут себя как стабильный комплекс при этих условиях. Меньшая по размеру молекула Z06175a-GS-ABD094 элюируется медленнее комплекса или только HSA, показывая, что эти белки в одиночку меньше по размеру, чем комплекс.
D
Данные, полученные на Biacore 2000 для анализируемых Z-ABD- и Z-ABD-Z-вариантов, показывают, что Z-ABD имеет более быструю скорость ассоциации, чем когда ABD фланкирован Z-доменами с двух сторон (фигура 8В). Анализ аффинности связывания ABD, слитого с двумя Z-доменами, показывает аффинность ниже 1 нМ для Z-ABD, тогда как вариант Z-ABD-Z связывается с иммобилизованным HSA с K выше 1 нМ.
D
D
Z06175a-GS-ABD094 связывался с сывороточным альбумином крысы с очень высокой аффинностью (K<100 пМ), тогда как взаимодействие с иммобилизованным мышиным сывороточным альбумином было слабее (K примерно 4 нM), чем с сывороточным альбумином как человека, так и крысы. Взаимодействие с бычьим сывороточным альбумином невозможно было измерить.
Эти данные согласуются с опубликованными данными по более раннему варианту ABD (Jonsson et al. Protein Engineering, Design & Selection 2008, 21:515-527) и показывают, что протестированный Z-ABD-вариант сильно связывается с сывороточным альбумином у человека при клинически значимых концентрациях, а также с у мыши и у крысы, позволяя проводить сравнение фармакокинетических данных между животными и человеком.
Пример 8: фармакокинетические исследования С5-связывающего Z-варианта на крысах
Материалы и способы
4
2
Прижизненные исследования на грызунах: фармакокинетику двух С5-связывающих конструкций Z-ABD (Z06175a-GS-ABD094; SEQ ID NO:753, слитая с SEQ ID NO:759 через GS-линкер, фигура 4, конструкция 2) и Z-ABD-Z (Z06175a-GS-ABD094-GSGGGGSGGGGS-Z06175a; (SEQ ID NO:753, слитая с SEQ ID NO:759 через GS-линкер, с последующими GS(GS)-линкером и вторым мотивом SEQ ID NO:753, фигура 4, конструкция 5)) исследовали на самцах крыса Sprague Dawley (вес тела 250-300 г). Каждой крысе однократно вводили Z-ABD или A-ABD-Z (n=3 на группу дозировки) внутривенно (250 нмоль/кг) или подкожно (500 нмоль/кг). Образцы крови (200 мкл) отбирали через 5, 20 и 45 мин, а также через 1,5, 4, 7, 24, 48, 72, 120, 168, 240 и 336 ч после введения для группы внутривенного введения, и через 15 и 30 мин, 1, 2, 4, 7, 24, 48, 72, 120, 168, 240 и 336 ч после введения для группы подкожного введения. Кровь собирали в пробирки и помещали в холодильник на 20 мин для коагуляции. Далее отбирали сыворотку после центрифугирования при 4000 об/мин в течение 10 мин. Образцы сыворотки хранили при -70°C до анализа.
Определение концентраций С5-связывающих Z-вариантов в образцах сыворотки от животных с использованием LC/LC/MS/MS: сывороточные концентрации введенных С5-связывающих конструкций Z-ABD и Z-ABD-Z, описанных выше, определяли масс-спектрометрически (LC/LC/MS/MS).
13
15
6
Образцы сыворотки или плазмы (25 мкл) разбавляли 150 мкл пепсиновой агарозы (7 мг/мл, Sigma, кат. № P0609), ресуспендированной в 1 М аммоний-формиатном буфере с рН 3,0 в эппендорфовской пробирке объемом 500 мкл. Пробирки закрывали и встряхивали в компактном термомиксере Eppendorf при 37°С в течение 20 мин. После встряхивания добавляли 25 мкл раствора внутреннего стандарта I(C;N)NKLDDDPSQSSEL (аминокислоты 31-44 в SEQ ID NO:746-757) (Thermo Fisher Scientific GmbH), разведенного до 0,5 мкΜ в 0,1%-ной трифторуксусной кислоте (TFA). После добавления внутреннего стандарта образцы перемешивали и фильтровали через целлюлозные центрифужные фильтры с диаметром пор 0,45 мкм (Grace).
Стандартные образцы для калибровки приготавливали, взвешивая 20 мкл стокового раствора белка с известной концентрацией белка (5-10 мг/мл) с последующим разбавлением чистой плазмой от биологических видов, подлежащих анализу. Первый стандарт стока плазмы (3 мкМ) разбавляли до 0,1 мкΜ.
40 мкл образца вводили в соединенную систему колонок с последующей тандемной масс-спектрометрией с мониторингом множественных реакций (MRM). Первой колонкой была колонка Ascentis RP-Amide, заполненная частицами 5 мкм (2,1×150 мм, Supelco). Для захвата анализируемой пептидной фракции из первой колонки использовали обогащающую колонку, Brownlee newgard (3,2×15 мм), заполненную частицами С18 7 мкм. Поток, выходящий из первой колонки, разбавляли водой в количестве 1 мл/мин, нагнетаемой насосом Shimadzu в вихревой смеситель (Lee Scientific). Последней колонкой была смешанная обращенно-фазовая и катионообменная колонка (2,1×100 мм), заполненная частицами Primesep 100 диаметром 5 мкм (SIELC Inc).
Мобильными фазами для первой колонки (RP-Amide) на первом жидкостном хроматографе (Acquity UPLC) были (A): 2% ацетонитрила, 0,1% уксусной кислоты, 0,1% TFA и 97,8% воды; и (B): ацетонитрил с 0,1% уксусной кислоты и 0,02% TFA. Поток составлял 0,5 мл/мин, а для элюции использовали линейный градиент. Образец элюировали при изократических условиях 100% A в течение 1 мин с последующей элюцией 80% А за 7,9 мин. Через 8,1 мин колонку промывали 100% В в течение 1 минуты и последующим уравновешиванием 100% А. Поток, выходящий из колонки, был соединен с 6-штуцерным клапаном Valco, который контролировался программным обеспечением масс-спектрометра.
Захватывающая колонка (3,2×15 мм) была подсоединена к 6-штуцерному клапану в режиме обратной циркуляции. Мобильными фазами для второй колонки на втором жидкостном хроматографе (Agilent 1100) были (A): 80% ацетонитрила, 19,9% воды и 0,1% муравьиной кислоты, и (B): 80% ацетонитрила, 19% воды, 0,5% уксусной кислоты и 0,5% TFA, подаваемые жидкостным хроматографом Agilent 1100 при скорости потока 0,5 мл/мин, и элюцию осуществляли следующим градиентом: 100% A в течение первых 5 минут с последующим постепенным повышением В от 0 до 40% с 5-ой до 10-ной минуты с последующим повышением до 100% B в течение следующих 6 секунд (с 10 до 10,1 минуты). Оставляли 100% B до 11,5 минуты с последующим его падением до 0 (100% A) за следующие 6 секунд (с 11,5 до 11,6 минуты) и поддерживали 0% B на протяжении цикла до остановки на 13 минуте.
Выходящий поток из последней колонки был соединен с масс-спектрометром с тройным квадруполем (Sciex API 4000), оборудованным электроспреем в качестве источника ионов, работающим в режиме положительно заряженных ионов. MRM-переходы составляли 780,9>814,4 для анализируемого вещества и 784,5>821,4 для внутреннего стандарта. Потенциал декластеризации был оптимизирован на 55 В, и энергия столкновения составляла 35 В. Эффективная энергия столкновения составляла 70 эВ, поскольку ион-предшественник был двухзарядный, давая однозарядный ионный фрагмент. Соотношения площадей пиков между анализируемым веществом и внутренним стандартом использовали для количественной оценки. Линейные калибровочные кривые были получены при восстановлении 85% и пределом количественного определения примерно 40 нМ.
max
max
0-∞
0-последнее измерение
подкожн.
внутривен.
внутривен.
подкожн.
1/2,z
z
z
0-∞
ss
z
z
Ex vivo гемолиз: ex vivo гемолитический анализ активации системы комплемента проводили для оптимального подбора in vivo условий для образцов сыворотки из описанных выше исследований in vivo. Образцы сыворотки разбавляли в 5 раз до общего объема реакции 25 мкл на лунку, содержащего 5 миллионов сенсибилизированных антителами овечьих эритроцитов (EA). В общем, порцию 20 мкл суспензии EA, содержащей все другие компоненты (см. пример 6), смешивали (при встряхивании в течение 10 минут) с 5 мкл образца сыворотки, чтобы инициировать активацию гемолиза при 37°С. Однако для образцов мышиной сыворотки, таких как в примере 11, один мкл раствора C5D должен был быть включен в 20 мкл EA суспензии. Анализ ex vivo был проведен по существу, как описано для анализа in vitro в примере 6. Вычисления: оценка фармакокинетических параметров была основана на индивидуальных данных по концентрации в сыворотке, для каждой группы дозировки приводится среднее значение (± среднеквадратичное отклонение). Уровни ниже нижнего предела количественного определения (LLOQ), появляющиеся в конечных точках отбора образцов исключали из фармакокинетического анализа. Максимальная концентрация в сыворотке, C, и время достижения наблюдаемой максимальной концентрации в сыворотке, T, были получены непосредственно из данных по концентрации в сыворотке. Фармакокинетические параметры, а именно площадь под кривой (AUC, AUC и AUC, вычисляемые способом линейных трапеций), подкожная биодоступность (F, вычисляемая как (AUC/AUC)*(Доза/Доза)), конечное время полужизни в сыворотке (T, вычисляемое как ln2/λ, где оценка конечного наклона, λ, основана по меньшей мере на 4 наблюдениях зависимости C=f(t)), среднее время пребывания (MRT, вычисляемое как AUMC/AUC), сывороточный клиренс (CL, вычисляемый как Доза/AUC), равновесный объем распределения (V, вычисляемый как CL*MRT) и объем распределения в конечной фазе (V, вычисляемый как CL/λ), вычисляли, используя некомпартментальный анализ в программе WinNonlin software version 5.2.1 (Pharsight Corp., США).
Результаты
Фармакокинетические данные для Z-ABD и Z-ABD-Z после внутривенного (250 нмоль/кг) и подкожного (500 нмоль/кг) введения приведены в таблице 8. Z-ABD количественно определялся в сыворотке до 10-14 дней после введения дозы в группе внутривенного введения и через 14 дней в группе подкожного введения, тогда как Z-ABD-Z количественно определялся в сыворотке до 10 дней после введения дозы в обеих группах (фигура 9). 14-й день был последним днем отбора образцов.
Сравнение сывороточной концентрации С5-связывающего полипептида со степенью гемолиза эритроцитов человека показало, что полное ингибирование гемолиза при описанных условиях (например, при разведении сыворотки 1:5) было получено для Z-ABD при его концентрациях в сыворотке выше 1 мкМ (фигура 12), тогда как Z-ABD-Z давал полное ингибирование при концентрациях в сыворотке около 0,5 мкМ (фигура 13). Неожиданно было найдено (как видно из фигуры 9 и таблицы 8), что Z-ABD имеет меньший сывороточный клиренс, более длительное время полужизни и более высокую биодоступность по сравнению с Z-ABD-Z. Во времени это приводило к полному ингибированию гемолиза в течение примерно трех дней после внутривенного введения 250 нмоль/кг Z-ABD (фигура 10) или 500 нмоль/кг подкожного введения Z-ABD (фигура 11) крысам Sprague Dawley.
Таблица 8
Средние значения (± среднеквадратичное отклонение) фармакокинетических параметров для Z-ABD и Z-ABD-Z после внутривенного и подкожного введения самцам крыс Sprague Dawley
Z-ABD
Z-ABD-Z
Путь введения
Внутривенно
Подкожно
Внутривенно
Подкожно
Доза
нмоль/кг
250
500
250
500
Cmax
мкМ
2,8 (0,2)
0,90 (0,10)
Tmax
ч
18 (9,8)
17 (12)
AUC<sub>0-∞</sub>
мкМ*ч
233 (34)
252 (11)
79 (7,5)
64 (1,2)
AUC<sub>0-последнее измерение</sub>
мкМ*ч
226 (37)
247 (11)
79 (6,9)
63 (1,0)
F
%
55 (3,1)
41 (2,6)
T<sub>1/2Z</sub>
ч
58 (4,6)
57 (4,2)
36 (0,6)
46 (1,2)
MRT
ч
69 (2,6)
80 (4,6)
27 (1,5)
63 (2,6)
CL
мл/ч*кг
1,1 (0,2)
3,2 (0,2)
V<sub>SS</sub>
мл/кг
73 (12)
83 (10)
V<sub>Z</sub>
мл/кг
90 (18)
159 (12)
Пример 9: фармакокинетические исследования С5-связывающих Z-вариантов на обезьянах
Материалы и способы
1/2α
1/2β
1/2γ
1/2
Прижизненные исследования проводили в компании Charles River, штат Невада (www.criver.com), вводимый препарат готовили, и анализ образцов сыворотки проводили самостоятельно. Фармакокинетику Z-ABD-варианта (Z06175a (SEQ ID NO:753), слитая с ABD094 (SEQ ID NO:759) через GS-линкер) исследовали на самцах яванского макака (n=3) после i.v. (внутривенного) и s.c. (подкожного) ведения. Оценку фармакокинетических параметров проводили в соответствии с примером 8, однако после внутривенного введения определяли исходное время полужизни (T), соответствующее исходному наклону логарифмически-линейной кривой зависимости сывороточной концентрации от времени, промежуточное время полужизни (T), соответствующее наклону логарифмически-линейной кривой зависимости сывороточной концентрации от времени, ассоциированному с второй (промежуточной) фазой, и конечное время полужизни (T), соответствующее конечному наклону логарифмически-линейной кривой зависимости сывороточной концентрации от времени. T вычисляли как ln2/λ, где оценка наклона, λ, была основана по меньшей мере на 4 наблюдениях зависимости C=f(t). Фармакокинетические данные, представленные для подкожного введения, скомпенсированы на уровень Z-ABD до введения, тогда как на графике, показывающем концентрацию в сыворотке относительно времени после подкожного введения, приведены фактически определенные концентрации в сыворотке. Обезьяны являлись 2-4-летними и весили 2,3-3 кг. Каждая обезьяна получала однократную дозу внутривенно (540 нмоль/кг) с последующим введением однократной подкожной дозы (1635 нмоль/кг) через три недели после внутреннего введения. Образцы крови отбирали через 10 и 30 минут и через 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 120, 168, 240, 336 и 504 часов после дозирования для двух типов введения. Образцы крови оставляли коагулировать на 20-40 минут при комнатной температуре и затем центрифугировали при 1500-2200 g и 2-8°C в течение 10-15 минут до отбора и заморозки сыворотки. Образцы сыворотки хранили до проведения анализа при температуре ниже -20°C.
Концентрации Z-ABD в сыворотке анализировали с помощью LC/LC/MS/MS, как описано в примере 8. Концентрации в сыворотке, определенные с помощью LC/LC/MS/MS, также подтверждали с помощью количественного сэндвич-иммуноферментного анализа. Микропланшет покрывали поликлональными антителами, специфичными к Z-части молекулы Z-ABD. Несвязанные поликлональные антитела отмывали, и добавляли казеин в качестве блокирующего агента для снижения неспецифического связывания на поверхности пластика. Образцы и стандарты разводили в PBS, содержащем 0,5% казеина и 1-5% нормальной сыворотки обезьяны. После отмывания несвязанного казеина, стандарты и образцы вносили с помощью пипетки в лунки, позволяя любому Z-ABD, предположительно, в основном связанному с сывороточным альбумином, присутствующим в образце, связаться с иммобилизованным антителом. После отмывания несвязанного Z-ABD, добавляли HRP-меченные поликлональные антитела, специфичные к альбумину, для обнаружения иммобилизованного комплекса Z-ABD и альбумина колориметрическим способом. Несвязанные поликлональные антитела отмывали, и в лунки добавляли раствор субстрата, причем образование цветного продукта пропорционально количеству связанного Z-ABD. Оценку и расчет фармакокинетических параметров проводили, как описано в примере 8.
Ex vivo гемолиз в сыворотке яванских макак, получавших дозировки вышеописанного Z-ABD-варианта, наблюдали с помощью способа, описанного в примерах 6 и 8, за исключением того, что сыворотку обезьян разводили всего в два раза по сравнению с пятикратным разведением для сыворотки грызунов.
Результаты
ss
z
Представлены средние данные (± среднеквадратичное отклонение) фармакокинетических параметров для каждой группы дозировки. Сывороточные концентрации Z-ABD количественно определялись во всех временных точках после внутривенного и подкожного введения с помощью LC/LC/MS/MS (фигура 14). Данные от ELISA и данные от LC/LC/MS/MS коррелировали линейно с коэффициентом 0,986, но для вычислений использовали данные от LC/LC/MS/MS. После внутривенного введения Z-ABD исходное время полужизни в сыворотке составляло 9,1 (0,8) часов, промежуточное время полужизни в сыворотке составляло 84 (4) часов, и конечное время полужизни в сыворотке составляло 198 (57) часов. Среднее время удержания составляло 246 (62) часов. Объем распределения, V и V, были вычислены как 110 (23) мл/кг и 127 (27) мл/кг, соответственно, и клиренс оценивали как 0,45 (0,02) мл/ч*кг.
maх
После подкожного введения скорректированные на предшествующие дозированию уровни в сыворотке, остающиеся после внутривенного введения, максимальные сывороточные концентрации (среднее значение C составляло 21 (3) мкΜ) достигались через 8-24 ч после дозирования. Конечное время полужизни составляло 206 (40) часов, и среднее время удерживания составляло 250 (68) часов. Подкожную биодоступность оценивали как превышающую 70%.
Фармакодинамический эффект вводимого Z-ABD-варианта (Z06175a (SEQ ID NO:753), слитая с ABD094 (SEQ ID NO:759) через GS-линкер) наблюдали по гемолизу. Гемолитический эффект у яванских макаков был полностью подавлен (<20% от уровня до дозирования) в течение по меньшей мере семи дней после введения 5 мг/кг Z-ABD внутривенно и 15 мг/кг Z-ABD подкожно.
Пример 10: in vivo исследования с использованием индуцированного зимозаном перитонита
Материалы и способы
Введение мышам: самки мышей C57BL/6 получали различные концентрации слитой молекулы Z-ABD (Z06175a-GS-ABD094, SEQ ID NO:753, слитая с SEQ ID NO:759 через GS-линкер) или положительный контроль OmCI внутрибрюшинно (i.p.) за 1 час до индукции зимозаном или подкожно (s.c.) за 18 часов до индукции зимозаном.
0,8 мг зимозана на мышь вводили внутрибрюшинно. Через 1 час отбирали образцы крови из глаза (во флаконы для сыворотки с активатором коагуляции) под анестезией изофлураном. Животных умерщвляли путем смещения шейных позвонков. Делали разрез кожи, и обнажали брюшинную мышечную стенку. В брюшную полость осторожно вводили раствор PBS (содержащий 2 мМ EDTA). Живот массировали, и отбирали образец жидкости (1-2 мл). Образцы помещали в пробирки и хранили на льду до центрифугирования при 600 g в течение 10 мин. Анализировали общий белок и концентрацию С5а в супернатанте.
Образцы крови хранили в холодильнике в течение не менее 30 мин и после этого центрифугировали при 2000 g. Образцы сыворотки хранили в морозильной камере (-70°C) для последующего анализа гемолитической активности и уровня Z06175a-GS-ABD094.
Анализ гемолитической активности в образцах сыворотки от животных: анализ гемолитической активности проводили в соответствии с анализом гемолиза, описанным в примерах 6 и 7.
Анализ концентрации С5а в лаваже от мышей, которым вводили зимозан и C5-связывающие слитые молекулы Z-ABD: для обнаружения С5а в мышиных образцах перитонеального лаважа, микротитрационные планшеты (MaxiSorp, Nunc) покрывали в течение ночи при 4°C 100 мкл на лунку антитела к С5а (кат. № MAB21501, R&D Systems) с концентрацией 1 мкг/мл в 0,05 М натриевом карбонатном-бикарбонатном буфере, рН 9,6 (кат. № С-3041, Sigma). Планшеты промывали три раза PBS, содержащим 0,05% Твин 20 (PBST, кат. №09-9410-100, Medicago) и блокировали 200 мкл на лунку 1%-го BSA (кат. № A7030, Sigma) в PBST в течение 1-1,5 ч при комнатной температуре и перемешивании при 450 об/мин. Планшет повторно промывали три раза PBST, а затем инкубировали со 100 мкл на лунку рекомбинантного стандарта, мышиного С5а (кат. №2150-С5, R&D Systems), в различных концентрациях в PBST с 0,1%-ым BSA или образцами в течение 2 ч при комнатной температуре и перемешивании при 450 об/мин. Образцы с высокой концентрацией также разводили в PBST с 0,1%-ным BSA. Планшет еще раз трехкратно промывали PBST, а затем инкубировали с 100 мкл на лунку биотинилированного анти-С5а антитела (кат. № BAF2150, R&D Systems) в концентрации 0,1 мкг/мл в течение 1,5 ч при комнатной температуре и встряхивании планшета при 450 об/мин. После трехкратного промывания с PBST, планшет инкубировали с 100 мкл на лунку стрептавидина-HRP (кат. № DY998, R&D Systems) при 200-кратном разведении в блокирующем буфере в течение 20 мин при комнатной температуре и перемешивании при 450 об/мин. После трех финальных промывок проводили цветную реакцию, добавляя в планшет по 100 мкл на лунку ТМВ-субстрата (кат. № T0440, Sigma), и измеряли поглощение через 20-30 мин при 650 нм с использованием планшетного спектрофотометра Spectramax Plus (Molecular Devices).
Стандартную кривую получали построением зависимости поглощения при 650 нм для каждого стандарта от его концентрации (в диапазоне 0-4000 мкг/мл).
4
2
Определение концентрации Z-варианта в образцах сыворотки от животных с использованием ECL: концентрации сыворотки для введенных C5-связывающих Z06175a-GS-ABD094 (SEQ ID NO:753, слитая с SEQ ID NO:759 через GS-линкер) и Z06175a-GS-ABD094-GSGGGGSGGGS-Z06175a (SEQ ID NO:753, слитая с SEQ ID NO:759 через GS-линкер с последующими GS(GS)-линкером и вторым мотивом SEQ ID NO:753, см. конструкцию на фигуре 4) определены с помощью ECL. Многозадачные непокрытые 96-луночные планшеты с высоком связыванием (Meso Scale Discovery, кат. № L15XB) покрывали козьими антителами против молекул аффибоди (Affibody AB, кат. № 20.1000.01.0005).
Аналогично с примером 6, Z-ABD-вариант (Z06009a, SEQ ID NO:748, слитая с ABD094, SEQ ID NO:759). Многозадачные планшеты были покрыты козьими IgG против молекул аффибоди (Affibody AB) в течение ночи при 4°C, и впоследствии неспецифичные сайты были блокированы PBS с 1%-ным казеином в течение двух часов при комнатной температуре.
2
Между тем, размораживали образцы сыворотки с -70°C и разбавляли в PBS с казеином в сыворотке от того же животного вида. Стандарты и контроли разводили в соответствующем буфере. Образцы и стандарты инкубировали в течение трех часов при комнатной температуре и встряхивании планшета при 300 об/мин. Инкубацию останавливали путем 3-кратной промывки 150 мкл ледяного PBS-Tween20. Сразу после последней промывки в каждую лунку добавляли по 150 мкл 2x буфера для измерения оптической плотности (4x reading buffer T, Meso Scale Discovery, кат. № R92TC-3, разведенный 1:1 в сверхчистой HО), и сигнал измеряли с помощью планшетного спектрометра (SECTOR Imager 2400, Meso Scale Discovery).
В альтернативном эксперименте планшеты покрывали C5 человека (SEQ ID NO:760, 1 пмоль на лунку). Перед добавлением в покрытые С5 планшеты, образцы сыворотки и стандарты, разбавленные в сыворотке или в сыворотке и PBS с казеином (во всех образцах и стандартах концентрация сыворотки была подобрана одинаковой), нагревали до 60°C в течение 30 мин с целью денатурации эндогенного С5. Этот альтернативный эксперимент давал способ обнаружения исключительно С5-связывающих белков, тогда как основанная на антителах стратегия, описанная выше, может применяться ко всем белкам, связывающимся с этим конкретным антителом.
Результаты
Анализ сывороточной концентрации Z-ABD и гемолитической активности в образцах сыворотки от животных: концентрации в сыворотке, а также способность оказывать влияние на гемолиз овечьих эритроцитов, для слитой молекулы Z-ABD (Z06175a-GS-ABD094, SEQ ID NO:753, слитая с SEQ ID NO:759 через GS-линкер) оценивали после введения низкой (20 нмоль/кг), средней (100 нмоль/кг) и высокой дозы (500 нмоль/кг). Концентрации в сыворотке были относительно линейными с дозой, а ингибирование гемолиза подтвердило активность молекул в сыворотке, и что ингибирование гемолиза также действительно зависит от концентрации.
Анализ концентрации С5а в лаваже от мышей, которым вводили зимозан и C5-связывающие молекулы слитых Z-ABD: провоспалительную молекулу зимозан вводили внутрибрюшинно, и на фигуре 15 показан эффект на высоко воспалительный продукт расщепления C5, С5а, в лаваже в виде функции введения только зимозана и введения зимозана после введения С5-связывающего Z-варианта в количестве 20, 100 и 500 нмоль/кг подкожно за 18 часов до введения зимозана обращения или OmCI, вводимого внутрибрюшинно за 1 ч до введения зимозана. Введение только зимозана приводит к сильному подъему уровня С5а в лаваже. Этот эффект блокируется дозозависимым образом в присутствии C5-связывающей слитой молекулы Z-ABD.
Пример 11: Фармакокинетические исследования C5-связывающего белка у мышей после интратрахеального введения
Материалы и способы
Был исследован фармакокинетический профиль С5-связывающей конструкции Z06175a-GS-ABD094 (SEQ ID NO:753, слитая с SEQ ID NO:759 через GS-линкер) после интратрахеального введения самкам мышей C57BL. Температура, относительная влажность и освещение были установлены для поддержания следующих параметров: 22±1°C, 55±5% и 12/12 ч световой-темновой цикл; питание и вода были предоставлены ad libitum. Животных анестезировали изофлураном, и соединение вводили непосредственно в легкие с помощью микрораспыления 500 нмоль/кг Z06175a-GS-ABD094. Для приготовления образцов сыворотки из полой вены отбирали максимально возможное количество крови под наркозом с помощью изофлурана через 5 мин, 30 мин, 1 ч, 3 ч, 7 ч, 16 ч, 24 ч, 48 ч и 72 ч (по три животных на одну временную точку). Образцы сыворотки приготавливали путем сбора крови в пробирки и помещением пробирок в холодильник на 20 мин. Затем пробирки центрифугировали при 4000 об/мин в течение 10 минут. Из каждого образца крови получали как минимум 100 мкл сыворотки. Образцы сыворотки хранили при -70°C до проведения анализа. Концентрацию Z06175a-GS-ABD094 в сыворотке для каждого образца определяли с помощью ECL, как описано в примере 10, и способность образцов сыворотки влиять на гемолиз овечьих эритроцитов определяли, как описано в примерах 6 и 8.
Результаты
Сывороточная концентрация в каждом образце и соответствующая способность воздействовать на гемолиз овечьих эритроцитов описаны на фигурах 16А и 16В, соответственно. В течение 30 минут достигалось плато концентрации в сыворотке крови в пределах от 300 до 1000 нм, при которой гемолиз почти полностью блокировался. В образцах сыворотки, отобранных в моменты времени после 7 ч после введения, гемолиз постепенно усиливался. На заключительный момент времени, через три дня после введения, гемолиз составлял около 70% от контроля (фигура 16В). Эти данные явно демонстрируют проникновение Z06175a-GS-ABD094 в системный кровоток после интратрахеального введения, а также то, что молекула функционально ингибирует гемолиз.
Пример 12: фармакокинетические исследования C5-связывающего Z-варианта в глазах кролика после местного и интравитреального введения
Материалы и способы
Прижизненная фаза исследований на кроликах: фармакокинетику Z-варианта (Z06175a, SEQ ID NO:753 с последующим GS (фигура 4, конструкция 1)) исследовали в глазах кролика после интравитреального введения.
Прижизненную фазу исследования и препарирование глаз животных (окрашенные кролики, 2-2,5 кг), которым вводили исследуемое соединение, были выполнены в Iris Pharma, La Gaude, Франция (www.iris-pharma.com). Животных содержали индивидуально при 20±2°C и относительной влажности 55±10% с доступом к пище и воде ad libitum.
Животных разделяли на три группы: 1) интравитреальное введение (по 50 мкл в каждый глаз, n=3, всего шесть глаз) с последующим препарированием и отбором сыворотки через один день; 2) интравитреальное введение (по 50 мкл в каждый глаз, n=3) с последующим препарированием и отбором сыворотки через четыре дня; и 3) необработанные животные (n=5).
Препарировали четыре различных отдела глаза (водянистая влага, стекловидное тело, нейросетчатка и пигментный эпителий сетчатки-хориоид) и немедленно замораживали при -80°С. Приготовление вводимого препарата (20,2 мг/мл в 10 мМ фосфатном буфере, 145 мМ NaCl, рН 7,4) и анализ препарата в различных отделах глаза проводили самостоятельно.
Анализ Z-варианта в препарированных отделах глаза: препарированные отделы глаза были пересланы на сухом льду и хранились при -80°C до проведения анализа. Образцы сетчатки и хориоида оттаивали в 10-кратном избытке (объем/вес) PBS, содержащего 1%-ный человеческий сывороточный альбумин в пробирках Lysing Matrix D (MP Biomedical), содержащих керамические шарики, и перемешивали при скорости 4 два раза по 20 с в гомогенизаторе Savant Bio 101. Гомогенат удаляли от гранул с помощью пипетки, переносили в 1,5-мл эппендорфовскую пробирку и центрифугировали при 900 об/мин в течение десяти минут. Образцы водянистой влаги и стекловидного тела обрабатывали так же, как образцы сетчатки и хориоида, за исключением отсутствия необходимости гомогенизации. Образцы стекловидного тела из групп 1 и 2 дополнительно разводили в 10 раз в том же буфере, как описано выше. Пять стандартов были подготовлены в PBS с HSA (35,8 мкΜ, 3,58 мкΜ, 358 нМ, 35,8 нМ и 17,9 нМ). Далее стандарты и образцы расщепляли пепсином, и концентрацию Z-варианта в тканевых экстрактах определяли с помощью способа LC/LC/MS/MS, описанного в примере 8.
Результаты
1/2
1/2
1/2
1/2
Через один день после интравитреального введения концентрации Z-варианта были высокими во всех отделах (6-200 мкΜ) и, что удивительно, оставались высокими через 4 дня после введения (1,5-78 мкΜ). В частности, концентрация Z-молекул в стекловидном теле находилась в диапазоне от 118 до 201 мкΜ (в среднем 161 мкΜ, n=6 глаз) через один день после инъекции и оставалась от 26 до 78 мкΜ (в среднем 46 мкМ, n=6) через четыре дня после инъекции, указывая на T в несколько дней. Это, по-видимому, вызвано обратной зависимостью размера и выведения лекарственного препарата после интравитреальной инъекции в глазе кролика, описанной на следующих примерах: Моксифлоксацин (MW<0,35 кДа, T=1,72 ч, Mohan et al. Trans Am Ophthalmol Soc 2005, 103:76-83), ESBA105 (MW=26 кДа, T=25 ч, Ottiger et al. Investigative Ophthalmology & Visual Science 2009, 50:779-786) и Ранибизумаб (MW=48 кДа, T=2,88 дней, Bakri et al. American Academy of Ophthalmology 2007, 114:2179-2182). Z-вариант, исследованный в данном эксперименте, имеет молекулярную массу 7,0 кДа, позволяя предположить, что выведение Z-молекулы было медленнее, чем можно было бы ожидать для такой маленькой молекулы в стекловидном теле.