Сравнительная характеристика цитокин-индуцирующей активности антигенов буркхольдерий различных видов

центном содержании в крови Т- и В-лимфоцитов не наблюдалось. В то же время выявлено достоверное увеличение содержания иммуноглобулина М с 1,05 до 1,4 г/л при отсутствии значимого возрастания 1дС (табл.). Подобные изменения свидетельствуют об ослабленной иммунной реактивности родильниц, о недостаточности ее Т-клеточного звена и перенапряжении гуморального иммунитета, что и обусловливает стертую клиническую картину.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о выраженном иммуностимулирующем действии препарата "Дибикор" в комплексном лечении родильниц с послеродовым эндометритом. Дибикор не оказывает побочных действий. Новый комплекс лечения обеспечивает прерывание воспалительного процесса в течение 5-6 дней, предупреждает развитие тяжелых форм эндометрита, сокращает на 2,8 койко-дня пребывание родильниц в стационаре, что

имеет большое медицинское и социальное значение.

ЛИТЕРАТУРА

1. Абдурахманова Ф.М., Исмаилова Т. Д., Умаро-ва Н.Г. и др. // Матер. Всерос. форума "Мать и дитя". -М., 2005. - С. 7-8.

2. Басиладзе Е.Н. // Матер. Всерос. форума "Мать и дитя". - М., 2005. - С. 27-28.

3. Елизарова Е.П. Дибикор: пособ. для врачей. -М., 2004. -30 с.

4. Меджидова Д.Р. // Матер. съезда акушеров-гинекологов Южн. Федеральн. округа. - Ростов-н/Д, 2005. - С. 86-88.

5. Пухальский А.Л., Кузьменко Л.Г. Основы общей иммунологии: метод. пособ. по курсу клинич. иммунологии. - М.: Academia, 1998. - 56 с.

6. Серов В.Н., Фомин М.Д., Каншина Л.Г. и др. // Матер. Всерос. форума "Мать и дитя". - 2002. - С. 538-542.

7. Токова З.З., Мекша Ю.В. // Матер. Всерос. форума "Мать и дитя". - М., 2005. - С. 257.

8. Тохиян А.А., Ковтун О.Г., Карапетян Т.Э. // Матер. Всерос. форума "Мать и дитя". - М., 2005. - С. 656.

УДК 576.8.097.29

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЦИТОКИН-ИНДУЦИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ АНТИГЕНОВ БУРКХОЛЬДЕРИЙ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ

О.Б. Прошина, С.И. Жукова, Н.Н. Пивень, Н.П. Храпова, И.В. Авророва, Н.М. Дрефс

Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт

Целью работы явилось изучение цитокин-индуцирующей активности антигенов возбудителя мелиоидоза (Burkholderia pseudomallei) и близкородственного непатогенного вида буркхольдерий (Burkholderia thailandensis). Была изучена активность лимфокинов и монокинов, полученных in vitro на лимфоцитах и макрофагах мышей BALB/с, индуцированных водно-солевыми экстрактами буркхольдерий. Показана взаимосвязь между защитными свойствами антигенов буркхольдерий и некоторыми показателями их цитокин-индуцирующей активности (уровнем экспрессии Fc-рецепторов на нейтрофилах, фагоцитарной активностью макрофагов и цитоксической активностью ФНО-а для клеток мышиных фибробластов L-929).

Ключевые слова: мелиоидоз, иммунитет, цитокины, антигены буркхольдерий.

COMPARISON OF CYTOKINE-INDUCING ACTIVITY OF DIFFERENT TYPES OF BURKHOLDERIA'S ANTIGENS

O.B. Proshina, S.I. Zukova, N.N. Piven, N.P. Khrapova, I.V. Avrorova, N.M. Drefs

Abstract. The purpose of this work was to study the сук>ктечг^истд activity of antigens of the melioidosis agent (Burkholderia pseudomallei) and its nonpathogenic type (Burkholderia thailandensis). In experiments in vitro on BALB/c mice macrophages and lymphocytes induced by water-salt extracts of Burkholdeias the activity of lymphokines and monokines was studied. The interrelation between the protective properties of Burkholderia's antigens and some parameters of its cytokin-inducing activity (the level of expression of Fc-receptors on neutrophils, phagocytic activity of macrophages and cytotoxic activity of TNF-а for mice fibroblasts L-929) was shown.

Key words: melioidosis, immunity, cytokines, Burkholderia's antigens.

Мелиоидозная инфекция относится к кате- сих пор остаются не вполне ясными, в том гории особо опасных и характеризуется высокой числе и закономерности цитокиновой иммуноре-летальностью и резистентностью к антибиотико- гуляции [3, 4], что серьезно затрудняет разработ-терапии, особенно при хроническом течении. ку эффективной вакцины.

Специфическая профилактика мелиоидоза пока

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

не разработана, хотя научные исследования в этом

направлении продолжаются более пятидесяти Изучение цитокин-индуцирующей активности

лет. Механизмы иммунитета к мелиоидозу до различных антигенных комплексов возбудителя

ВЕСТНИК ВолГМУ

2

мелиоидоза и ее связи с протективными свойствами антигенов.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве продуцентов цитокинов (моноки-нов и лимфокинов) были использованы макрофаги (Мф) перитонеального экссудата (ПЭ) и лимфоциты селезенки мышей BALB/с. Индукторами цитокинов служили водно-солевые экстракты (ВСЭ) буркхольдерий: B.pseudomallei С-141 (умеренно вирулентный штамм возбудителя ме-лиоидоза - АГ1), B.pseudomallei 100 (высоковирулентный штамм возбудителя мелиоидоза -АГ2), B.thailandensis 251 (непатогенный близкородственный вид буркхольдерий - АГ3). Клетки-продуценты примировали всеми ВСЭ в дозе 10 мкг/мл для получения лимфокинов 48 ч, моно-кинов - 24 ч. По окончании срока инкубации супер-натанты центрифугировали при 1000 об/мин 10 мин, фильтровали через фильтры с диаметром пор 0,22 мкм и замораживали при -20 °С до исследования.

Тестирование биологической активности лимфокинов проводили на перитонеальных Мф мышей. Изучали влияние лимфокинов на экспрессию Fc-рецепторов на поверхности Мф, на способность вызывать реакцию исчезновения Мф (РИМ) из брюшной полости, а также на фагоцитарную активность Мф. Биологическую активность монокинов оценивали на нейтрофилах ПЭ мышей. Определяли способность монокинов модулировать хемотаксис Нф и экспрессию Fc-рецепторов. Кроме того, определяли активность ФНО-а, продуцируемого Мф на перевиваемой клеточной линии мышиных фибробластов L-929.

Фагоцитарную активность Мф изучали хе-милюминесцентным методом [2]. Об экспрессии Fc-рецепторов (FcR) судили по розеткообразова-нию с эритроцитами барана, опсонизированными противоэритроцитарными кроличьими антителами (ЕА) [1]. Вычисляли процент клеток Нф или Мф, адсорбировавших на своей поверхности 3 и более эритроцитов (ЕА-РОК). Хемотаксис Нф определяли в опытах in vivo через 4 ч после внутрибрюшинного введения монокинов (50 мкл) интактным мышам, контрольным животным вводили физиологический раствор. В мазках из ПЭ, окрашенных по Романовскому-Гимзе, подсчитывали процент Нф, определяли общее число клеток в 1 мл ПЭ в камере Горяева, вычисляли абсолютное количество Нф в 1 мл ПЭ и определяли индекс активации Нф (ИАН) по формуле:

ИАН = (Нфо - Нфк)/Нфк, где Нфо и Нфк - число Нф в опыте и контроле соответственно.

Для выявления способности лимфокинов вызывать РИМ, являющуюся моделью повышенной чувствительности замедленного типа in vivo [1], иммунизированным (на 3-и сут. после введения

30 мкг АГ1, АГ2 и АГ3) и интактным мышам вводили внутрибрюшинно 50 мкл лимфокинов (опытная группа) или физиологического раствора (контрольная группа) и через 4 ч у животных исследовали клеточный состав ПЭ. Определяли концентрацию клеток в камере Горяева и процент Мф в мазках, окрашенных по Романовско-му-Гимзе. Интенсивность реакции оценивали по индексу исчезновения макрофагов (ИИМ), который рассчитывали по формуле:

ИИМ = ИМо - ИМк,

где ИМо и ИМк - показатели исчезновения Мф в опыте и контроле, вычислявшиеся по формулам:

ИМо = а0 - в0/а0  100 и ИМк = ак - вк/ак  100, где ао и ак - абсолютное число Мф в ПЭ прими-рованных и интактных животных соответственно через 4 ч после введения физраствора, во и вк -абсолютное число Мф в ПЭ примированных и ин-тактных животных через 4 ч после введения лимфокинов. Цитотоксическую активность ФНО-а в монокинах определяли на клетках мышиных фибробластов L-929. Активность ФНО-а выражали в количестве единиц активности, обратном титру разведения монокинов, обеспечивающему 50 %-ю гибель клеток L-929 в лунке (ЦТЕ-50). Протективные свойства антигенов изучали на беспородных белых мышах, которых двукратно иммунизировали 30 мкг антигенов в смеси с гидратом окиси алюминия (до конечной концентрации 1,2 мг/мл) с интервалом 10 сут., и на 21-е сут. после первичной иммунизации заражали 5 и 50 ЛД50 умеренно вирулетного штамма Burkholderia pseudomallei 115. Определяли процент выживших животных и среднюю продолжительность жизни погибших (СПЖ). Статистический анализ результатов исследований осуществляли с определением средних величин и доверительных интервалов для уровня достоверности 95 %.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Показано, что ВСЭ B.pseudomallei 100 (АГ2) был наиболее протективным, он защищал 50 % животных от 5 ЛД50 возбудителя мелиоидоза и существенно повышал СПЖ павших мышей от 5-50 ЛД50. ВСЭ B.pseudomallei С-141 (АГ1) защищал 40 % животных от 5 ЛД50 и также увеличивал СПЖ павших мышей от 5-50 ЛД50. Наименьшие защитные свойства зарегистрированы у ВСЭ B.thailandensis 251 (АГ3): значимое увеличение СПЖ при заражении небольшой дозой возбудителя мелиоидоза - 5 ЛД50. Выживаемость от 5 ЛД50 составила всего 22 %. Все изученные препараты существенно не влияли на выживаемость мышей при заражении 50 ЛД50.

2006

Биологическая активность лимфокинов и монокинов, индуцированных антигенами буркхольдерий

Таблица

Индукторы Лимфокины Монокины

Функции макрофагов нейтрофилы нейтрофилы L-929

ЕА-РОК, % ИИМ, % КС ИАН ЕА-РОК, % ФНО-а

ВСЭ B.pseudomallei C-141 39±2,8 Контроль 32±1,8 8,0 4,13±0,8* Контроль 1,33±0,4 2,92 58±1,4* Контроль 28±0,6 32

ВСЭ B.pseudomallei 100 47±2,9 Контроль 32±1,8 13,8 4,94±0,9* Контроль 1,33±0,4 3,23 62±2,2* Контроль 28±0,6 128

ВСЭ B.thailandensis 251 49±3,6 Контроль 32±1,8 11,1 3,34±0,6 Контроль 1,33±0,4 2,73 34±2,1 Контроль 28±0,6 16

* - различия с контролем статистически достоверны (р <0,05).

Анализируя результаты исследований влияния монокинов и лимфокинов на количество РеР на поверхности фагоцитов, следует отметить, что все изученные препараты не вызывали индукции лимфокинов, регулирующих экспрессию РеР на Мф (см. табл.). Вместе с тем монокины, индуцированные АГ1 и АГ2, усиливали ее на поверхности Нф: отмечено возрастание процента ЕА-РОК по сравнению с контролем. Активность монокинов, индуцированных АГ3, была значительно ниже и существенно не отличалась от контрольных цифр. Изучение способности моно-кинов оказывать регуляторное воздействие на хемотаксис Нф показало, что АГ1 в качестве индуктора не отличается от АГ3. Более выраженной хемотаксической активностью обладали ци-токины Мф, стимулированных АГ2. Изучение цитотоксичности ФНО-а в супернатантах лимфоцитов, стимулированных антигенами буркхольдерий, на клетках Ь-929 показало, что в лимфо-кинах, индуцированных АГ2, активность ФНО-а была максимальной. При изучении регуляторного влияния лимфокинов на фагоцитарную активность Мф установлено, что цитокины, стимулированные АГ2, в наибольшей степени повышали фагоцитарную активность Мф. Лимфоциты, при-мированные АГ1, также продуцировали цитоки-ны, существенно стимулировавшие фагоцитоз Мф. Наименьшей активностью обладали лимфо-кины, индуцированные АГ3. Оценка влияния лимфокинов на содержание Мф в ПЭ показала, что введение лимфокинов, стимулированных всеми тремя антигенными комплексами, иммунизированным мышам сопровождалась РИМ, уровень которой был невысоким.

Анализ полученного экспериментального материала позволяет констатировать взаимосвязь между цитокин-индуцируюшй активностью

антигенных комплексов буркхольдерий и их про-тективными свойствами. Установлена зависимость между уровнем активности лимфокинов, модулирующих фагоцитарную способность Мф, и степенью протективности антигена - индуктора лимфокинов. Отмечена прямая взаимосвязь между степенью экспрессии Fc-рецепторов на поверхности Нф под влиянием монокинов и защитными свойствами антигена-индуктора. Выявлена взаимосвязь между активностью ФНО-а монокинов и защитными свойствами антигенов бурк-хольдерий.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, защитные свойства антигенов буркхольдерий зависят от их способности индуцировать выработку цитокинов, стимулирующих клеточное звено иммунитета. Полученные нами данные вполне согласуются с известным положением о доминирующей роли клеточных факторов иммунитета в защите от мелиои-дозной инфекции [5] и могут быть использованы при конструировании мелиоидозной вакцины в качестве дополнительных критериев отбора про-тективных антигенов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Васильева Г.И., Иванова И.А., Беспалова И.А. и др. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -2002. - № 3. - С. 39-45.

2. Любимов Г.Ю., Зенков Н.К., Вольский Н.Н. и др. // Иммунология. - 1992. - № 1. - С. 40-43.

3. Barnes J.L., Ulett G.C., Retheesan N., et al. // Immunol. Cell Biol. - 2001. - Vol. 79. - P. 490-501.

4. Simpson A.J., Smith M.D., Weverling G.Y., et al. // J. Infect. Dis. - 2000. - Vol. 181(2). - P. 621-625.

5. Stephens D.P., Fisher D.A., Currie B.J. // Intern. Med. J. - 2002. - Vol. 32. - № 4. - P. 143-148.