Кристаллографический метод исследования морфоструктур биологических жидкостей организма в хирургии

КРИСТАЛЛОГРАФИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ МОРФОСТРУКТУР БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ ОРГАНИЗМА В ХИРУРГИИ

Г.В. Плаксина, А.Е. Машков, Д.А. Пыхтеев, В.И. Шумский

МОНИКИ

В последнее десятилетие в медицине успешно развивается новое направление по изучению и использованию особенностей морфоструктурного анализа различных биологических жидкостей и биосред организма в клинической практике. Разработаны основные изменения жидкого кристалла при патологическом процессе и в ходе лечения, что рассматривается как переход от статического усреднённого мета-стабильного - патологического состояния жидкокристаллической биосреды к стабильному - состоянию нормы [2].

Доказано, что характер морфоструктур биологических жидкостей, определяемых с помощью кристаллооптических методов, позволяет выявить признаки нарушения метаболизма в них на молекулярном и надмолекулярном уровнях, и значительно раньше, чем эти изменения могут быть определены биохимическими методами [4]. Разработаны методы кристаллооптического исследования биологических жидкостей путём краевой дегидратации (закрытая капля), позволяющие оценить спектр морфоструктурных образований в жидкокристаллическую фазу кристаллизации. Поляризационно-оптическое изучение диагностических препаратов в скрещенных поляризаторах выявляет анизотропные структуры, среди которых появление атипичных патологических форм свидетельствует о выраженных метаболических нарушениях сложнобелкового состава [1, 6].

Методика клиновидной дегидратации позволяет оценить процессы системной самоорганизации биологической жидкости путём исследования высохшей капли (фации), структура которой определяется большим комплексом количественных и качественных параметров, присутствующих в данной жидкости. Этот метод часто позволяет выявить характер их взаимосвязей, что представлено в виде концентрационных волн, располагающихся в строго определённых местах высохшей капли. Степень гармонизации фации зависит от выраженности и особенностей нарушения «физиологического ритма» волновых колебаний и химической активности жидкой фазы среды, изменения которой наблюдаются при патологических процессах.

Использование кристаллооптических методов в клинической практике позволило определить их диагностическое и прогностическое значение в оценке эффективности терапии и особенностей течения заболеваний. Одним из перспективных направлений применения данных методов является использование их для подбора лекарственных препаратов при данной патологии (в том числе индивидуально). Это во многом связано с тем, что в настоящее время значительно расширяется перечень новых лекарственных препаратов природного и синтетического происхождения, которые нередко используются без должного контроля за эффективностью лечения и без ка-тамнестических наблюдений [1, 5, 6].

В последние годы в зарубежной и отечественной литературе публикуются медико-биологические исследования, доказывающие положительное влияние ангиогенина (АГ) на репаративно-регенерацион-ные процессы незаживающих тканевых дефектов, хрящевой ткани, остеогенез, а также на показатели гомеостаза и повышение иммунологической защиты и т.д. [3, 4, 8]. Однако механизмы действия АГ раскрыты не полностью, что может быть связано с особенностями его конформационной перестройки на молекулярном уровне in vivo.

С учётом данных литературы о высокой эффективности АГ как стимулятора репаративных процессов, нами была поставлена цель исследования: раскрыть некоторые аспекты механизма действия вещества АГ природного происхождения для обоснования целесообразности его применения в хирургической практике.

Задачи исследования:

- разработать лабораторные тесты кристаллоптических методов исследования для объективизации данных о влиянии АГ на общие адаптационно-защитные реакции организма и процессы заживления ран.

-доказать отсутствие сенсибилизирующего влияния АГ на организм при его местном применении.

Было изучено влияние АГ на белково-электролитный состав сыворотки крови in vitro и на защитно-репаративные процессы в очаге локального асептического воспаления in vivo как показателя функции гистогематического барьера в оценке гомеостаза организма.

В качестве основной лабораторной методики использован метод изучения морфологии биологических жидкостей: сыворотки крови и раневого экссудата с места локального асептического воспаления. Кристаллооптическое исследование проводилось с помощью методик клиновидной дегидратации (открытая капля) и краевой дегидратации (закрытая капля) с последующим поляризационно-оптическим изучением препарата в скрещенных поляризаторах. Именно в таких условиях выявлялись жидкокристаллические двулучепреломляющие структуры.

Морфоструктурный анализ сыворотки крови был проведён путём исследования нативной сыворотки крови у детей в возрасте от 5 до 14 лет, находившихся на лечении в детском хирургическом отделении МОНИКИ с заболеваниями невоспалительного характера. Одновременно исследовалась та же сыворотка крови с АГ в соотношении 10:1.

Проведено 25 исследований сыворотки крови по 2 методикам кристаллооптического метода и серия исследований препарата АГ в различных концентрациях. Наиболее чёткие кристаллограммы получены при большом разведении АГ (в 1000 раз), что ослабляло влияние солей, содержащихся в препарате.

В нативной сыворотке крови детей с помощью методики закрытой капли отмечено наличие небольшого количества жидкокристаллических линий (ЖКЛ), мелких единичных сферолитов, что соответствовало норме, патологических морфоструктур не обнаружено.

В препаратах сыворотки крови с АГ отмечено значительное увеличение числа тонких ветвистых ЖКЛ, обилие мелких и средних по размеру сферолитов, появление пластовых структур. Увеличение морфоструктур рассматривалось как расширение спектра белкового состава сыворотки крови, в том числе за счёт «защитных белков».

Изучение нативной сыворотки у обследуемых детей методом клиновидной дегидратации выявило в 20 пробах небольшие признаки изменений структурных элементов, расположения концентрационных волн в фации, что отражает наличие метаболических нарушений на молекулярном и надмолекулярном уровнях. В биохимических показателях этих детей изменений не выявлено, что подчёркивает большую информативность данного метода морфоструктурного анализа в сопоставлении с другими химико-физическими методами.

Введение в каплю изучаемой сыворотки АГ приводило к гармонизации структуры высохшей капли, что определяет положительное влияние АГ на её белково-солевой состав, нормализацию физико-хи-мических процессов в сложной системе сыворотки крови.

Не менее важным доказательством положительного влияния АГ на сыворотку крови больных является стабилизация белкового состава под его воздействием. Так, у 2 больных с тяжёлым течением бронхиальной астмы (гормонозависимой) в нативной сыворотке методом краевой дегидратации выявлено значительное количество атипичных, анизотропных, патологических морфотипов в виде крупных «веерных форм».

Введение в сыворотку крови больных препарата АГ приводило к уменьшению в размерах «структур», что отражало снижение количества патологических белковых комплексов. Негативных изменений в кристаллограммах под действием АГ не выявлено.

Оценка воздействия АГ на состояние адаптационной защиты была проведена путём изучения функции гистогематического барьера. В соответствии с данными литературы, эта методика позволяет определить состоятельность потенциальных возможностей организма в развитии адаптационно-компенсаторных реакций при любой патологии, в том числе прогноз течения процесса репарации дефектов ткани любой этиологии.

Действие АГ природного происхождения на течение защитно-вос-становительного процесса в очаге локального асептического воспаления было изучено с помощью модифицированной нами скарифика-ционной пробы (функциональный тест «кожное окно»). По этой методике учитывались критерии состоятельности клеточной защиты и особенностей структурной характеристики сложно-белкового компонента раневого экссудата, участвующего в стимуляции гранулоцитар-ной и моноцитарно-лимфоцитарной клеточной кооперации.

Методика проведения теста: на предплечье ребёнка проводилась скарификация эпидермиса в виде сетки с размером 1,5x1,5 см. На один из углов скарифицированного участка накладывался диск из фильтровальной бумаги диаметром 0,3 см. Весь скарифицированный участок кожи закрывался покровным стеклом. Ставились две параллельные пробы. Через 8 и 24 часа подсчитывалась дермоцитограмма

в отпечатках с места скарификации и проводилось кристаллографическое исследование жидкокристаллической фазы в закрытой капле, для чего диагностические диски помещались в пластиковые пробирки с 0,3 мл 0,9% раствора 1ЧаС1 на 2-4 часа. Далее анализ проводился по методике, указанной выше.

Обследовано 20 больных с невоспалительными заболеваниями; у 18 выявлена слабость макрофагально-лимфоцитарной фазы воспаления, которая характеризует снижение иммунной защиты. Грануло-цитарная фаза защиты (через 8 часов) была выражена у всех обследованных, при этом количество нейтрофилов в дермоцитограмме составляло более 80%. Сопоставление результатов определения спектра морфоструктур (кристаллографического метода краевой дегидратации) и дермоцитограммы выявило их высокую корреляцию: г=0,89.

Наличие анизотропных сферолитов в кристаллограммах отражает присутствие в раневом экссудате сложно-белковых комплексов, в том числе участвующих в стимуляции клеточного ответа на воспаление (кинины, ферменты, гормоны). Отсутствие анизотропных структур в раневом экссудате сочеталось со слабостью лимфоцитарно-моноци-тарного ответа (II фаза воспаления) и увеличением продуктов катаболизма в дермоцитограмме.

Воздействие АГ на течение асептического воспаления оценивалось путём нанесения его на скарифицированный участок эпидермиса. Далее исследование проводилось аналогично вышеописанной методике. Сравнение дермоцитограмм и кристаллограмм по этапам воспаления с АГ и без него выявило усиление активности клеточной защиты под влиянием АГ, что отмечено в 18 из 20 проведённых проб. Уже через 8 часов после постановки пробы отмечалось усиление макрофагально-лимфоцитарной реакции и появление в кристаллограммах типичных сферолитов. Таким образом, АГ стимулирует развитие адекватного ответа на воспаление.

В результате проведенных нами исследований разработаны кристаллооптические лабораторные тесты оценки влияния АГ на состояние адаптационно-защитных реакций организма; установлено положительное влияние АГ на белково-солевой состав сыворотки крови; выявлено наличие стимулирующего влияния АГ на заживление тканевых дефектов на основе кристаллооптических исследований раневого экссудата.

ЛИТЕРАТУРА

1. Аюпова А.К., Ющенко А.А. // Сб. науч. тр. II Всерос. науч.-практ. конф. - 2001. -С. 14-16.

2. Лисиенко В.М. // Тр. науч. семинара к 70-летию Р.И. Минца. - М., 2001. - С. 14.

3. Машков А.Е, Плаксина Г.В. и др. // Сб. науч. тр. 2-й Всерос. научно-пракг. конф. -2001.-С. 51-52.

4. Мертвецов Н.П., Стефанович Л.Е. Ангиогенин и механизм ангиогенеза. -Новосибирск, 1997.

5. Плаксина Г.В., Римарчук Г.В., и др. Кристаллографический метод исследования в детской гастроэнтерологии / Методич. рекоменд. - М., 1995.

6. Шабалин В.Н., Шатохина С.Н. Морфология биологических жидкостей человека. -М., 2001.-306 с.