УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ГЛЮКОЗЫ НА ОСНОВЕ ГЛЮКОЗООКСИДАЗЫ PENICILLIUM ADAMETZII И pH-ЧУВСТВИТЕЛЬНОГО ПОЛЕВОГО ТРАНЗИСТОРА

Полезная модель относится к биосенсорным аналитическим устройствам с областью применения в биотехнологии, пищевой промышленности, сельском хозяйстве и медицине. Биосенсор может быть использован для определения содержания глюкозы в пищевых продуктах, ферментационных процессах, а также в физиологических жидкостях.
В предлагаемой полезной модели в качестве биологически чувствительного элемента используется иммобилизованная ГОД (синтезированная штаммом Penicillium adametzii F-3298 Д), в качестве преобразователя применяется pH-чувствительный полевой транзистор (ПТ).
Ниже перечислены аналоги предлагаемого биосенсора на основе ПТ.
Два ион-селективных полевых транзистора, один из которых содержал пероксидазу, иммобилизованную в гель бычьего сывороточного альбумина, а второй глюкозооксидазу и уреазу, коиммобилизованные в полимерную пленку, были использованы для определения глюкозы (1-10 мМ), аскорбиновой кислоты (0.25-2 мМ) и лимонной кислоты (5-100 мМ) в составе фруктовых напитков (Volotovsky, V. and N. Kim (1998). "Determination of glucose, ascorbic and citric acids by two-ISFET multienzyme sensor." Sensors and Actuators B: Chemical 49(3): 253-257.)
2
3
В работе (Kharitonov, A.B., M. Zayats, et al. (2000). "Enzyme monolayer-functionalized field-effect transistors for biosensor applications." Sensors and Actuators B: Chemical 70: 222-231) затворная область ион-селективного полевого транзистора была модифицирована ферментным монослоем. Сборка биокаталитического слоя включала начальную силанизацию AlO-затвора 3-аминопропилтриэтоксисиланом с последующей активацией аминогрупп глутаровым альдегидом и ковалентной привязкой фермента на затворной области. Для образования биокаталитических матриц использовали уреазу, глюкозооксидазу, ацетилхолинэстеразу и α-химотрипсин. Преимуществом данного типа биосенсора являлось быстрое время ответа (десятки секунд).
В качестве прототипа использован биосенсор на основе ПТ и глюкозооксидазы, иммобилизованной с использованием бычьего сывороточного альбумина и глутарового альдегида представлен в работе (Soldatkin, A.P., A.V.El'skaya, et al. (1993). "Glucose-sensitive field-effect transistor with additional Nafion membrane: Reduction of influence of buffer capacity on the sensor response and extension of its dynamic range." Analvtica Chimica Acta 283(2): 695-701). Дополнительное использование мембран Nafion позволяло увеличить диапазон детекции до 10 мМ глюкозы. Время отклика составляло 30 с. Глюкозооксидаза выделена из Penicillium vitale.
В отличие от вышеуказанного прототипа в предлагаемой модели используется фермент - глюкозооксидаза, синтезируемая штаммом Penicillium adametzii F-3298 Д.
Задача, на решение которой направлена заявляемая полезная модель, состоит в создании рецепторного элемента для биосенсора по определению глюкозы и применении в таких областях как пищевая промышленность, биотехнология, медицина и сельское хозяйство.
Технический результат, который может быть получен при использовании предлагаемой полезной модели, заключается в том, что предлагаемый рецепторный элемент позволяет исследовать кинетические параметры фермента и обладает малым временем ответа, в шесть раз меньшим, чем модели прототипа.
Сущность полезной модели заключается в том, что биорецептор, содержащий иммобилизованный на носителе фермент - глюкозооксидазу -сопряжен с ПТ.
2
2
Биосенсор работает следующим образом. Биокаталитические трансформации, инициируемые ферментом, изменяют pH на поверхности затвора транзистора путем генерации протонов. Эти изменения pH влияют на потенциал поверхности затвора и приводят к изменению тока стока. Окисление глюкозы до глюконовой кислоты с сопутствующим образованием HO приводит к выделению протонов в раствор электролита, вызывая увеличение кислотности (подкисление) поверхности затвора. При этом pH-чувствительный ПТ (1) укреплен на основании (2) и подключен в измерительную цепь через разъем (3). На затворной области транзистора находится биорецептор (4), укрепленный на поверхности транзистора с помощью фиксатора (5). Транзистор погружен в измерительную ячейку (6) с буферным раствором (Фиг.1).
Формирование биорецептора осуществляют отдельно от транзистора. Иммобилизацию глюкозооксидазы выполняли на нитроцеллюлозной мембране Millipore (тип SC, диаметр пор 0.8 мкм, Sigma-Aldrich Corporation) кросс-сшивкой глутаровым альдегидом. Мембрану фиксировали на затворной зоне полевого транзистора. Измерения выполняли в кювете объемом 3 мл. В качестве среды измерения использовали 1 мМ NaCl. Введение глюкозы приводило к изменению pH мембраны и соответственно, к генерации сигнала. Регистрируют базовый уровень электрического сигнала.
На основании полученных данных строят калибровочную кривую (Фиг.2).
Для определения неизвестной концентрации глюкозы после стабилизации базовой линии добавляют раствор неизвестной концентрации и затем по калибровочной кривой (Фиг.2), отражающей зависимость сигнала сенсора от концентрации глюкозы, определяют концентрацию глюкозы в анализируемом образце.
Принципиальными особенностями, отличающими предлагаемый биосенсор от известных устройств для определения глюкозы является применение в биорецепторе глюкозооксидазы, продуцируемой штаммом Penicillium adametzii F-3298 Д.
max
M
Диапазон количественного определения глюкозы составил 1-100 мМ. Время измерения одного образца - 1-5 с.Кажущиеся значения V и K при аппроксимации кривой уравнением Михаэлиса-Ментен составили 17.1±6.1 мВ и 71.3±57.3 мМ, соответственно.
На фиг.1 представлена схема биосенсора на основе pH-чувствительного полевого транзистора для определения глюкозы, а - вид сбоку, б - вид спереди.
На фиг.2 приведена калибровочная кривая биосенсора для определения глюкозы.
Таким образом, разработан биосенсор для определения глюкозы, который обеспечивает быстрое определение содержания глюкозы в образце без использования сложного дорогостоящего оборудования. Формирование биорецептора отдельно от транзистора позволяет избежать процедуры регенерации поверхности транзистора после использования и сокращает время анализа.