СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ УСПЕХА ИМПЛАНТАЦИИ В СТАНДАРТНОМ ДЛИННОМ ПРОТОКОЛЕ СТИМУЛЯЦИИ СУПЕРОВУЛЯЦИИ
METHOD FOR PREDICTING SUCCESS OF IMPLANTATION IN THE STANDARD LONG PROTOCOL OF STIMULATION OF SUPEROVULATION

Изобретение относится к медицине, в частности, к гинекологии.
Увеличение количества рецепторов прогестерона в клетках мононуклеарной фракции крови в середине лютеиновой фазы является необходимым условием успешной имплантации эмбриона. Прогестерон через собственные рецепторы стимулирует секрецию лимфоцитами прогестерон-индуцированный блокирующий фактор (PIBF). Это иммуномодулирующая молекула 34 кДа, секретируемая лимфоцитами играет решающую роль в предотвращении отторжения эмбриона материнским иммунным ответом (Int J Cancer. 2004; 112(1):51-60. PIBF (Progesterone induced blocking factor) is overexpressed in highly proliferating cells and associated with the centrosome. Lachmann M., Gelbmann D,  E,  B, Buschle M, Von Gabain A,  J, Nagy E.). Однако уровень самого цитокина в крови значительно варьирует и не используется в качестве прогностического критерия эффективности ЭКО.
Несмотря на разрабатываемые более 40 лет методы вспомогательных репродуктивных технологий, эффективность даже наиболее действенного метода ЭКО и ПЭ оставляет желать лучшего: частота имплантации достаточно низка - 35-55% по данным European IVF-Monitoring Program, 2015.
Общепринятые прогностические факторы успеха ЭКО и ПЭ хорошо известны и включают в себя:
- Возраст пациентки. Большое количество работ демонстрируют резкий спад эффективности программы с каждым годом после 35 лет.
- Фолликулярный резерв яичников, оцениваемый по числу антральных фолликулов в яичниках при УЗИ или по уровню антимюллерова гормона. Во многих исследованиях показано снижение результативности программы в 2-3 раза у пациенток с бедным ответом яичников на стимуляцию гонадотропинами.
- Курение. Для курильщиц требуется примерно в 2 раза больше попыток ЭКО и ПЭ для достижения желаемого результата.
- Ожирение. Пациенткам с ожирением также как и курильщицам для достижения беременности в среднем требуется проведение большего количества циклов ЭКО.
Однако, даже для некурящих пациенток моложе 35 лет, не страдающих ожирением и имеющих нормальный фолликулярный резерв, прогнозировать результаты ЭКО и ПЭ весьма затруднительно. В связи с этим разрабатываются более сложные методы прогнозирования, которые нуждаются в дальнейших исследованиях и доработке.
Близкими к предлагаемому нами способу прогнозирования результатов ЭКО и ПЭ является определение уровня интерлейкинов 12, 15 и 18 и клеток-натуральных киллеров CD56+ в биоптате эндометрия или смывах из полости матки (Ledee-Bataille N, Bonnet-Chea K, Hosny G, Dubanchet S, Frydman R, Chaouat G. Role of the endometrial tripod interleukin-18-15, and - 12 in inadequate uterine receptivity in patients with a history of repeated in vitro fertilization-embryo transfer failure, Fertil Steril, 2005, vol. 83, p. 598-605), определение уровня интегрина aVb3 в биоптате эндометрия (Tei С, Maruyama Т, Kuji N, Miyazaki T, Mikami M, Yoshimura Y. Reduced expression of alphavbeta3 integrin in the endometrium of unexplained infertility patients with recurrent IVF-ET failures: improvement by danazol treatment, J Assist Reprod Genet, 2003, vol. 20 p. 13-20) или определение уровня матриксных металлопротеиназ 2 и 9, ИЛ-1 и ИЛ-10, а также гамма-ИФ в смывах из полости матки (Inagaki N, Stern С, McBain J, Lopata A, Kornman L, Wilkinson D. Analysis of intra-uterine cytokine concentration and matrix-metalloproteinase activity in women with recurrent failed embryo transfer, Hum Reprod, 2003, vol. 18 p. 608-615). Также было предложено определение уровня мРНК эндометриальной ароматазы Р450 в биоптате эндометрия (Brosens J, Verhoeven Н, Campo R, Gianaroli L, Gordts S, Hazekamp J, Hagglund L, Mardesic T, Varila E, Zech J, et al. High endometrial aromatase P450 mRNA expression is associated with poor IVF outcome, Hum Reprod, 2004, vol. 19 p. 352-356). Недостатками методов является их инвазивность, а именно забор биоптата или смыва из полости матки, а также сложность интерпретации результатов при проведении анализа смыва из полости матки.
Известен метод определения экспрессии цитокинов Т-хелперного звена лимфоцитами периферической крови пациенток (Kwak-Kim JY, Chung-Bang HS, Ng SC, Ntrivalas EI, Mangubat CP, Beaman KD, Beer AE, Gilman-Sachs A. The prevalence of dominant Th1 immune responses in peripheral blood lymphocytes may reflect the systemic contribution of Th1 cytokines to RSA or multiple implantation failures in IVF cycles, Hum Reprod, 2003, vol. 18 p. 767-773). Недостатком метода является его многокомпонентность: необходимость отдельного выделения фракций лимфоцитов, а затем тестирования их функциональной активности по уровню экспрессии ими различных цитокинов, а также его высокая стоимость.
Известен способ прогнозирования вероятности наступления клинической беременности у женщин с индексом массы тела от 18,5 до 28,49 в программе ЭКО на основании оценки уровня лептина в плазме крови и трансмембранного потенциала митохондрий в мононуклеарах периферической крови (RU 2614725 С1 "Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова", 28.03.2017). Включает оценку трансмембранного потенциала митохондрий в мононуклеарах периферической крови, измерение концентрации лептина в плазме крови и прогнозирование вероятности наступления клинической беременности по формуле. Недостаток способа состоит в том, что наряду со стандартным методом определения лептина в плазме крови пациенток (характеризующих метаболический статус) необходимо наличие специфического оборудования для анализа трансмембранного потенциала митохондрий, которое не входит в штатный набор клинических лабораторий.
Наиболее близким к патентуемому является способ прогнозирования успеха имплантации в стандартном длинном протоколе стимуляции суперовуляции (RU2430379 С1, ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, 27.09.2011 - ПРОТОТИП). Исследуют гормональный статус пациентки, для чего в середине лютеиновой фазы менструального цикла пациентки, перед назначением агониста гонадотропин-релизинг гормона, при проведении лечения по стандартному длинному протоколу стимуляции суперовуляции, определяют содержание рецепторов прогестерона в мононуклеарной фракции клеток периферической крови и при величине более 700 рецепторов прогестерона на клетку прогнозируют наступление беременности в результате проведения программы ЭКО и переноса эмбрионов в стандартном длинном протоколе стимуляции суперовуляции.
Недостаток способа состоит в том, что в большинстве клинических лабораторий отсутствуют радиоизотопные счетчики, к тому же необходимо приобретение изотопов (меченых гормонов).
Проблема, на решение которой направлено настоящее изобретение, состоит в расширении доступности и повышении достоверности определения вероятности успеха имплантации у пациенток в длинном протоколе ЭКО.
3
Способ состоит в определении уровня экспрессии прогестерон-индуцированного блокирующего фактора (PIBF) в клетках мононуклеарной фракции периферической крови пациенток с бесплодием перед лечением. Уровень мРНК PIBF более 0,4 у.е. (0,5^ΔCt⋅10/GAPDH) в мононуклеарах крови свидетельствует о высокой вероятности наступления имплантации у данных пациенток, поэтому им целесообразно начинать протокол ЭКО и ПЭ.
Технический результат изобретения - расширение доступности и повышение достоверности определения вероятности успеха имплантации у пациенток в длинном протоколе ЭКО.
Заявляемое изобретение не очевидно для специалистов, работающих в области эндокринологической гинекологии и репродукции человека.
Методика. Мононуклеарные клетки периферической крови выделяют стандартным методом [Boyum A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow // Scand. J. Clin. Lab. Investig. - 1968. - Vol. 21 - Suppl. 97. p. 1-9] из гепаринизированной крови (7-10 ME гепарина/мл) с модификациями. Кровь в объеме 5 мл получают из кубитальной вены у пациенток на 22-24 день менструального цикла. Кровь разводят физиологическим раствором (рН 7,2) в соотношении 1:2 (v:v). Разведенную физиологическим раствором кровь (5 мл) наслаивают на подогретый до комнатной температуры фиколл (Pharmacia Fine Chemicals, Швеция, плотность 1, 077 г/мл, 3 мл в центрифужной пробирке) и центрифугируют при 400 g в течение 30 мин 4°С [Хейфиц Л.Б., Абалкин В.А. Разделение форменных элементов крови человека // Ж. Лаб. дело, 1973. - 10. - с. 579-581]. Интерфазу отбирают стерильной стеклянной пипеткой и полученную мононуклеарную фракцию трижды отмывают бесцветным раствором Хенкса (клетки ресуспендируют в десятикратном объеме раствора Хенкса и центрифугируют 5 минут при 250 g). Жизнеспособность клеток, определяемая по методу окрашивания с трипановым синим (Ланг Н.Р. Стимуляция лимфоцитов // М.: Медицина, 1976. - 288 с.), составила 96%. Оставшийся осадок (МНФК) используют для анализа экспрессии генов ПИБФ и гена домашнего хозяйства.
Выделение мРНК из клеток МНФК периферической крови проводят с помощью набора "Рибо-преп" («AmpliSens», Россия) согласно инструкции производителя. Получение кДНК на матрице мРНК проводят с использованием комплекта готовых реагентов "Реверта-L'' "AmpliSens", Россия) согласно инструкции производителя. Для полимеразной цепной реакция в реальном времени с целью определения уровня экспрессии генов использовали набор готовых реактивов для ПЦР "Реакционная смесь 2,5х для проведения ПЦР-РТ в присутствии SYBR Green I" ("Синтол", Россия) на приборе iCycler iQ5 real-time PCR (BioRad, Германия). В качестве контрольного гена использовали ген GAPDH (Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, локализован на хромосоме 12р13). Последовательности праймеров для GAPDH: upgaa-ggt-gaa-ggt-cgg-agt, lowgaa-gat-ggt-gat-ggg-att-tcc. PIBF: uptgc-cct-gct-gtg-tga-tct-talowgat-agc-tga-ggc-tcc-tgg-at; Программа амплификации: 1 цикл: 10:00 мин - 950С, 2-40 циклы: 00:15 мин - 950С, 01:00 мин - 600С.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программного пакета GraphPadPrism 5. Результаты представлены в виде М±SE, где М - среднее значение, SE - стандартная ошибка. Данные анализировали с применением критериев Колмогорова-Смирнова, Манна-Уитни.
Нижеследующие примеры иллюстрируют изобретение.
Пример №1. Больная В. 28 лет повторно обратилась в отделение ЭКО ЦПСиР с диагнозом: бесплодие вторичное длительностью 7 лет, мужской фактор, трубно-перитонеальный фактор для проведения второй попытки ЭКО (ИКСИ) и ПЭ. В анамнезе 1 неудачная попытка ЭКО (ИКСИ) и ПЭ по короткому протоколу с антагонистами ГнРГ. На 21-й день менструального цикла, перед назначением пациентке ежедневных подкожных инъекций Диферелина 0,1, был произведен забор периферической крови из кубитальной вены для определения уровня экспрессии гена домашнего хозяйства и PIBF в клетках МНФК.
При определении количества мРНК PIBF относительно GAPDH получили следующее значение: 0,51 у.е. Таким образом, результат исследования транскрипторного профиля клеток МНФК позволил предположить благоприятный для данной пациентки прогноз на наступление беременности в протоколе ЭКО и ПЭ, что подтвердилось в последующем: наступила одноплодная беременность, завершившаяся срочными родами и рождением живой доношенной девочки.
Пример №2. Больная М. 33 года первично обратилась в отделение ЭКО ЦПСиР с диагнозом: бесплодие вторичное длительностью 2 года, абсолютный трубный фактор для проведения первой попытки ЭКО и ПЭ. На 20-й день менструального цикла, перед назначением пациентке ежедневных подкожных инъекций Диферелина 0,1, был произведен забор периферической крови из кубитальной вены для определения уровня мРНК PIBF в мононуклеарных клетках, который составил 0, 35 у.е. Таким образом, результаты исследования транскриптома клеток МНФК, позволили предположить неблагоприятный для данной пациентки прогноз на наступление беременности в протоколе ЭКО и ПЭ, что не подтвердилось в последующем: наступила одноплодная беременность, завершившаяся экстренным кесаревым сечением и рождением живой доношенной девочки.
Нами показано, что уровень экспрессии гена PIBF в клетках мононуклеарной фракции может служить надежным критерием в оценке успеха имплантации у пациенток, включенных в программу ЭКО. Анализ транскриптома клеток мононуклеарной фракции крови пациенток проводился непосредственно перед началом терапии (длинный протокол ЭКО). Полученные результаты были сгруппированы ретроспективно по признаку наличия имплантации у пациентки (табл.). Как видно из представленных данных, уровень мРНК PIBF в МНФК пациенток зависит от успеха имплантации, и может быть использован с прогностической целью. Данная зависимость выявлена впервые.
3
Сравнительный анализ уровня мРНК PIBF в МНК у пациенток при бесплодии показал, что пороговыми значениями прогнозирования успеха лечения можно считать количество мРНК PIBF в МНФК 0,4 у.е. (1 y.e.=0,5^ΔCt⋅10/GAPDH).
При проведении прогнозирования успеха лечения в цикле ЭКО и ПЭ у 39 пациенток была подтверждена его возможность использования для целей прогноза и его высокая точность.
* - значение статистически достоверно отличается от аналогичного параметра в I и II группах. Приведены средние данные исследованных параметров.