СПОСОБЫ, КОМПОЗИЦИИ И НАБОРЫ ДЛЯ ЛИОФИЛИЗАЦИИ
METHODS, COMPOSITIONS AND SETS FOR LYOPHILISATION

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка заявляет приоритет заявки США № 61/264014, поданной 24 ноября 2009 г., которая включена в настоящее описании посредством ссылки во всей полноте.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к способам лиофилизации композиций, в частности водных фармацевтических составов, содержащих по меньшей мере один активный ингредиент, и композиций, получаемых из них, в частности к композициям, наборам и способам лиофилизации антитромбина-III (AT III).
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Лиофилизация является широко применяемым способом получения активных ингредиентов в виде более твердых форм фармацевтических препаратов. Например, было показано, что активный ингредиент, такой как AT III, который представляет собой альфа-гликопротеин, обычно присутствующий в плазме, и представляет собой плазматический ингибитор тромбина, обладает относительно низкой стабильностью в растворе. Соответственно, AT III перерабатывают в лиофилизированные препараты.
Предполагается, что лиофилизация уменьшает или ингибирует деградацию активного ингредиента посредством удаления компонентов растворителя в составе до таких количеств, которые уже не поддерживают химические реакции или биологический рост. Кроме того, полагают, что удаление растворителя уменьшает молекулярную подвижность, уменьшая возможность деструктивной реакции. К тому же, желательно, чтобы кристаллизующиеся вспомогательные вещества (например, аминокислоты и соли), которые широко применяются в лиофилизированных продуктах, кристаллизовались насколько возможно полностью во время замораживания, для того чтобы обеспечить твердую матрицу для поддержки структуры кека. Однако в ряде предыдущих попыток лиофилизировать водные фармацевтические составы не удалось достигнуть удовлетворительной степени кристаллизации. Например, было показано, что различные стадии замораживания и/или отжига типичного протокола лиофилизации как такового неэффективно поддерживают кристаллизацию. Более того, предполагается, что присутствие определенных кристаллизующихся вспомогательных веществ (например, аланина и хлорида натрия) может ингибировать или уменьшать кристаллизацию любого вспомогательного вещества, тем самым также ограничивая степень кристаллизации.
При том, что было сделано несколько попыток лиофилизировать водные фармацевтические составы, сохраняется необходимость в способах лиофилизации и композициях, получаемых с их помощью.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает способ лиофилизации композиции, содержащей по меньшей мере один активный ингредиент и по меньшей мере одно кристаллизующееся вспомогательное вещество. Данный способ включает в себя: выдерживание данной композиции при первой температуре в течение первого периода времени, достаточного для того, чтобы получить первую композицию, содержащую по меньшей мере одно частично или полностью кристаллизованное кристаллизующееся вспомогательное вещество.
В другом аспекте настоящее изобретение предлагает способ лиофилизации жидкой композиции, содержащей получаемый из плазмы AT III, NaCl и аланин. Данный способ включает в себя:
(a) выдерживание данной композиции при приблизительно 54°C или ниже, так что температура композиции равна приблизительно 48°C или ниже в течение приблизительно 5 часов или более, для того чтобы обеспечить полную или почти полную кристаллизацию первой композиции, включающей в себя один или несколько компонентов; и
(b) высушивание первой композиции, для того чтобы получить лиофилизированный кек.
В некоторых аспектах настоящее изобретение предлагает композиции, включающие в себя лиофилизированные кеки, полученные в соответствии со способами, раскрытыми в настоящем описании.
В других аспектах настоящее изобретение предлагает набор, содержащий одну или несколько из композиций и/или лиофилизированных кеков, полученных в соответствии со способами, раскрытыми в настоящем описании.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фигура 1 - ДСК термограмма во время замораживания и нагревания раствора NaCl (0,15M).
Фигура 2 - ДСК термограммы во время замораживания (A) и нагревания (B) раствора аланина (0,1M).
Фигура 3 - ДСК термограммы во время замораживания (A) и нагревания (B) восстановленного AT III.
Фигура 4 - оптимальные условия кристаллизации по анализу DOE.
Фигура 5: A - изменение теплоемкости (Cp) во время замораживания и отжига в цикле ETP-5807; B - изменение Cp во время первого замораживания; C - изменение Cp во время отжига; D - изменение Cp во время второго замораживания.
Фигура 6 - изменение теплового потока с температурой в цикле ETP-5807. Была определена теплота плавления для пика плавления, составившая 5,5 Дж/г.
Фигура 7: A - изменение Cp во время замораживания и отжига при увеличении времени выдержки при замораживании до 5 часов; B - изменение Cp во время первого замораживания; C - изменение Cp во время линейного нагревания от -52°C до -30°C; D - изменение Cp во время отжига; E - изменение Cp во время второго замораживания.
Фигура 8 - изменение теплового потока с температурой при увеличении времени выдержки при замораживании от 2 часов до 5 часов. Была определена теплота плавления для пика плавления, составившая 6,4 Дж/г.
Фигура 9 - профиль лиофилизации AT III в цикле ETP-5807, выполненном в аппарате lyostar II FTS.
Фигура 10 - данные по температуре продукта во время замораживания в цикле ETP-5807 в аппарате FTS.
Фигура 11 - профиль лиофилизации AT III при замораживании при -54°C в течение 2 часов.
Фигура 12 - данные по температуре продукта при замораживании при -54°C в течение 2 часов.
Фигура 13 - профиль лиофилизации AT III при замораживании при -54°C в течение 6 часов в аппарате FTS.
Фигура 14 - данные по температуре продукта при замораживании при -54°C в течение 6 часов в аппарате FTS.
Фигура 15 - профиль лиофилизации AT III при замораживании при -50°C в течение 6 часов в аппарате FTS.
Фигура 16 - данные по температуре продукта при замораживании при -50°C в течение 6 часов в аппарате FTS.
Фигура 17 - профиль лиофилизации AT III при замораживании при -60°C в течение 6 часов в Usifroid.
Фигура 18 - данные по температуре продукта при замораживании AT III при -60°C в течение 6 часов в Usifroid.
Фигура 19 - профиль лиофилизации AT III при замораживании при -52°C в течение 15 часов.
Фигура 20 - данные по температуре продукта при замораживании при -52°C в течение 15 часов.
Фигура 21 - растрово-электронный микроснимок кеков (200x увеличение). Масштабные метки равны 100 мкм. A: кек с нарушенной структурой. B: твердый кек.
Фигура 22 - растрово-электронный микроснимок NaCl, 200x увеличение слева и 1500x увеличение справа. Масштабная метка равна 100 мкм (A) и 10 мкм (B).
Фигура 23 - растрово-электронный микроснимок аланина, 50x увеличение слева и 200x увеличение справа. Масштабная метка равна 500 мкм (A) и 100 мкм (B).
Фигура 24 - порошковые рентгеновские дифракционные (РД) диаграммы с применением дифрактометра для NaCl, аланина, ETP 5807 (кека с нарушенной структурой) и материал от второго прохода ETP 5807 (твердого кека).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение предлагает неожиданное открытие, что одной стадии низкотемпературного замораживания перед высушиванием достаточно, для того чтобы вызвать кристаллизацию способных кристаллизоваться вспомогательных веществ в составах, содержащих активный ингредиент, и, следовательно, настоящие способы предлагают надежную кристаллизацию вспомогательных веществ, в то же время предлагая также более эффективный, удобный и/или надежный протокол лиофилизации. Настоящие способы допускают повышенное количество кристаллических объемообразующих агентов по сравнению с предшествующими способами, при этом сохраняя стабильность и активность активного ингредиента, присутствующего в составах.
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает способ лиофилизации композиции, содержащей по меньшей мере один активный ингредиент и по меньшей мере одно кристаллизующееся вспомогательное вещество. Данный способ включает в себя выдерживание данной композиции при первой температуре в течение первого периода времени, достаточного для того, чтобы получить первую композицию, содержащую по меньшей мере одно частично или полностью кристаллизованное кристаллизующееся вспомогательное вещество.
Композиция может представлять собой жидкую или полужидкую композицию. Например, композиция может представлять собой водный фармацевтический раствор или суспензию, содержащий по меньшей мере один активный ингредиент и по меньшей мере одно кристаллизующееся вспомогательное вещество.
В одном варианте осуществления композиция представляет собой жидкий состав, предпочтительно водный раствор. В другом варианте осуществления композиция представляет собой подходящую для фармацевтического применения, например, фармацевтическую композицию, содержащую фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
В одном варианте осуществления композиция представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую по меньшей мере один активный ингредиент, по меньшей мере одно кристаллизующееся вспомогательное вещество и фармацевтически приемлемый носитель. В контексте настоящего описания "фармацевтически приемлемый носитель" включает любые и все растворители, диспергирующие среды, покрытия и тому подобное, которые физиологически совместимы. Тип носителя может быть выбран на основании планируемого пути введения. В некоторых вариантах осуществления носитель подходит для введения посредством, без ограничения, внутривенных, ингаляционных, парентеральных, подкожных, внутримышечных, внутрисуставных, внутрибронхиальных, внутрибрюшных, внутрикапсульных, внутрихрящевых, внутриполостных, интрацелиальных, внутримозжечковых, интрацеребровентрикулярных, вводимых внутрь толстой кишки, интрацервикальных, внутрижелудочных, внутрипеченочных, интрамиокардиальных, внутрикостных, внутритазовых, интраперикардиальных, внутрибрюшинных, внутриплевральных, внутрипростатных, внутрилегочных, интраректальных, внутрипочечных, интраретинальных, интраспинальных, внутрисуставных, внутригрудных, внутриматочных, внутрипузырных, болюсных, вагинальных, ректальных, буккальных, сублингвальных, интраназальных или трансдермальных средств. Фармацевтически приемлемые носители включают, без ограничения, стерильные водные растворы или дисперсии для получения стерильных инъецируемых растворов или дисперсии.
Активный ингредиент
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один активный ингредиент может представлять собой любой активный ингредиент, включая, без ограничения, белки, нуклеиновые кислоты и их комбинации. Белки могут включать, без ограничения, гликопротеины (например, AT III), факторы свертывания крови, факторы роста, цитокины, антитела и химерные конструкции. Термин "белок" в настоящем описании рассматривается как широкий и относится к индивидуальным или коллективным нативным белкам человека или другого млекопитающего; и/или гомогенному или гетерогенному распределению полипептидов, происходящих от одного или нескольких генных продуктов; и/или фрагментам белков, проявляющим определенную активность; и/или таким белкам и/или их активным фрагментам, получаемым посредством рекомбинантных методов, включая трансгенную технологию.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одним активным ингредиентом является белок. В одном варианте осуществления белок представляет собой AT III. В других вариантах осуществления композиция содержит только один активный ингредиент, причем данный активный ингредиент представляет собой AT III. В другом варианте осуществления AT III является единственным активным ингредиентом в композиции, однако композиция содержит другие белки, включая белки, не являющиеся AT III, и/или неактивные формы AT III. Например, функциональный AT III может составлять часть от общего содержания белка в композиции.
Термин "AT III" в контексте настоящего описания рассматривается как широкий, если иное не указано явно. Например, данный термин относится ко всем встречающимся в природе полиморфам AT III. Данный термин также включает в себя функциональные фрагменты AT III, химерные белки, содержащие AT III, или их функциональные фрагменты, гомологи, полученные посредством замещения аналогами одной или нескольких аминокислот AT III, и видовые гомологи. Данный термин также относится ко всем полипептидам AT III, которые являются продуктом технологии рекомбинантной ДНК, включая AT III, который является продуктом трансгенной технологии. Например, ген, кодирующий AT III, может быть вставлен в ген млекопитающего, кодирующий белок молочной сыворотки, таким образом, что последовательность ДНК экспрессируется в молочной железе, как описано, например, в патенте США № 5322775, который включен в настоящее описание посредством ссылки ради идеи способа получения белкового соединения. Данный термин также относится ко всем белкам AT III, химически синтезированным посредством способов, известных в данном уровне техники, таких как, например, твердофазный пептидный синтез. Данный термин также относится к AT III, полученному из плазмы. Данный термин также относится к AT III, который может быть получен коммерчески. AT III может соответствовать человеческому или не человеческому AT III.
В одном варианте осуществления AT III представляет собой получаемый из плазмы AT III. В другом варианте осуществления AT III получают из суспензии фракций плазмы. В других вариантах осуществления AT III получают из обедненной альбумином фракции плазмы или предварительно очищенной фракции для получения AT III. Патент США № 5561115, Tenold, включен в настоящее описание посредством ссылки ради идеи способа получения AT III из сыворотки или плазмы.
В других вариантах осуществления AT III представляет собой рекомбинантный AT III. Получение рекомбинантных белков, включая рекомбинантный AT III, описано, например, в патентах США №№ 4517294, 4632981, 4873316, 5420252, 5618713, 5700663, 5843705, 6441145, 6878813, 7019193, Fan et al., JBC, 268:17588 (1993), Garone et al., Biochemistry, 35:8881 (1996), международной публикации № WO02/02793; публикации США №№ US2003/096974 и US2006/0024793 и Gillespie et al., JBC, 266:3995 (1991), все они включены в настоящее описание посредством ссылки ради идеи получения рекомбинантных белков, включая рекомбинантный AT III.
В одном варианте осуществления композиция характеризуется как содержащая AT III, имеющий чистоту более чем 90%. В других вариантах осуществления AT III имеет чистоту более чем 95%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 99%. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере приблизительно 50%, для иллюстрации от приблизительно 50% до приблизительно 100%, от приблизительно 60% до приблизительно 90%, от приблизительно 70% до приблизительно 80% от всего AT III в композиции составляет активный AT III.
В других вариантах осуществления лиофилизируемая композиция содержит по меньшей мере приблизительно 0,1 мг/мл AT III, для иллюстрации от приблизительно 0,1 до приблизительно 100 мг/мл, от приблизительно 0,5 до приблизительно 50 мг/мл, от приблизительно 1 до приблизительно 30 мг/мл и от приблизительно 5 до приблизительно 15 мг мл AT III, причем AT III составляет частично или полностью общий белок, присутствующий в композиции.
В одном варианте осуществления композиция содержит терапевтически эффективное количество AT III. "Терапевтически эффективное количество" относится к количеству, эффективному при необходимых дозировках и периодах времени в том, чтобы достигнуть необходимого терапевтического результата, такого как, например, антикоагуляция, связанная с наследственным дефицитом антитромбина. Терапевтически эффективное количество AT III может варьироваться в соответствии с такими факторами, как состояние заболевания, возраст, пол и вес отдельного субъекта и способность AT III добиваться необходимого отклика субъекта. Терапевтически эффективное количество также может быть таким, при котором любые токсические или вредные воздействия AT III перевешиваются терапевтически благоприятными воздействиями.
В других вариантах осуществления композиция содержит профилактически эффективное количество AT III. "Профилактически эффективное количество" относится к количеству, эффективному при необходимых дозировках и периодах времени в том, чтобы достигнуть необходимого профилактического результата, такого как, например, предупреждение или ингибирование тромбоэмболических эпизодов у субъектов, которые перенесли несколько тромбоэмболических эпизодов, или пациентов, которые подвержены риску будущих эпизодов. Профилактически эффективное количество может быть определено, как описано выше, для терапевтически эффективного количества.
Кристаллизующееся вспомогательное вещество
В одном варианте осуществления по меньшей мере одно кристаллизующееся вспомогательное вещество выбирают из группы, состоящей из аланина, маннита, глицина и NaCl.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно кристаллизующееся вспомогательное вещество присутствует в композиции с общим количеством кристаллизующихся вспомогательных веществ, составляющим по меньшей мере приблизительно 0,01% (вес./об.), для иллюстрации от приблизительно 0,01% до приблизительно 10%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 5% и от приблизительно 0,7% до приблизительно 1,8% (вес./об.).
В других вариантах осуществления лиофилизированный продукт содержит по меньшей мере приблизительно 20% (вес./об.) всех кристаллизующихся вспомогательных веществ, для иллюстрации от приблизительно 20 до приблизительно 80%, от приблизительно 30 до приблизительно 70% и от приблизительно 36 до приблизительно 60% (вес./об.) всех кристаллизующихся вспомогательных веществ.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно кристаллизующееся вспомогательное вещество представляет собой аланин и NaCl. В одном варианте осуществления NaCl присутствует в количестве, равном от приблизительно 50 мМ до приблизительно 300 мМ, предпочтительно от приблизительно 100 мМ до приблизительно 250 мМ. В одном варианте осуществления хлорид натрия как таковой может применяться без какого-либо другого из вышеупомянутых кристаллизующихся вспомогательных веществ, в каком случае он может быть включен в состав в количестве, равном приблизительно 300 мМ или более. В других вариантах осуществления композиция (например, водный фармацевтический состав) представляет собой гипертонический раствор.
В дополнение к по меньшей мере одному активному ингредиенту и по меньшей мере одному кристаллизующемуся вспомогательному веществу композиция также может дополнительно содержать одно или несколько других вспомогательных веществ, т.е. одно или несколько других веществ, применяемых в сочетании с активным ингредиентом, для того чтобы составить композицию. Некоторые не ограничивающие примеры одного или нескольких других вспомогательных веществ включают стабилизирующие агенты, буферные агенты, двухвалентные катионы (например, соли кальция), связывающие вещества, смазывающие вещества, разрыхлители, разбавители, красители, корригенты, скользящие вещества, поверхностно-активные вещества, абсорбенты и подслащивающие вещества.
Комбинации активных ингредиентов и вспомогательных веществ в соответствии с настоящим изобретением могут обеспечить стабильность активного ингредиента в лиофилизированных препаратах; однако композиции настоящего изобретения также могут проявлять определенную стабильность в жидком или полужидком состоянии.
В других вариантах осуществления композиция дополнительно содержит стабилизирующий агент. Например, стабилизирующий агент может быть выбран из группы, состоящей из сахарозы, маннита и трегалозы. Перед лиофилизацией стабилизирующие агенты могут присутствовать в композиции с общим количеством стабилизирующих агентов, составляющим по меньшей мере приблизительно 1%, для иллюстрации от приблизительно 1% до приблизительно 4% и от приблизительно 2% до приблизительно 3%. В некоторых вариантах осуществления стабилизирующий агент присутствует в композиции в количестве, равном приблизительно 2%.
Буфер также может присутствовать в композициях настоящего изобретения, в частности, когда активный ингредиент подвержен неблагоприятному воздействию сдвигов pH во время лиофилизации. pH следует предпочтительно поддерживать в диапазоне приблизительно от 6 до 8 во время лиофилизации и более предпочтительно при pH, равном приблизительно 7. Буферный агент может представлять собой любое физиологически приемлемое химическое соединение или комбинацию химических соединений, которые обладают способностью действовать как буферы, включая, без ограничения, фосфатный буфер, цитратный буфер, ацетатный буфер, буфер лимонная кислота/фосфат, гистидин, трис-(гидроксиметил)аминометан (Трис), 13-бис-[трис-(гидроксиметил)метиламино]пропан (Бис-трис-пропан), пиперазин-N,N'-бис-(2-этансульфоновую кислоту) (PIPES), 3-(N-морфолино)пропансульфоновую кислоту (MOPS), N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновую кислоту (HEPES), 2-(N-морфолино)этансульфоноваую кислоту (MES) и N-2-ацетамидо-2-аминоэтансульфоновую кислоту (ACES).
В одном варианте осуществления буферный агент включают в композицию в концентрации, равной от приблизительно 10 до приблизительно 50 мМ. Когда в композиции добавляют гистидин, могут использоваться концентрации, равные по меньшей мере приблизительно 20 мМ, предпочтительно приблизительно 25 мМ, отдельно или в комбинации с другими буферами, такими как Трис.
В других вариантах осуществления композиция дополнительно содержит двухвалентный катион, например соль кальция. В одном варианте осуществления соль кальция присутствует в количестве, равном от приблизительно 1 мМ до приблизительно 5 мМ.
В одном варианте осуществления композиция дополнительно содержит поверхностно-активное вещество. Поверхностно-активное вещество может присутствовать в количестве, равном приблизительно 0,1% или менее. Неограничивающие примеры поверхностно-активных веществ включают POLYSORBATE 20 (например, TWEEN 20), POLYSORBATE 80 (например, TWEEN 80), полиоксиэтиленовый (80) эфир сорбита и жирной кислоты, плюрониловые полиолы (например, F-38, F-68) и додециловые эфиры полиоксиэтиленгликоля (например, Brij-35).
В соответствии с настоящим изобретением композиция также может дополнительно содержать антиоксидант. Антиоксидант может присутствовать в композиции в общем количестве, равном по меньшей мере 0,05 мг/мл, для иллюстрации от приблизительно 0,05 до приблизительно 50 мг/мл, от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 мг/мл и от приблизительно 1 до приблизительно 5 мг/мл. Не ограничивающие примеры антиоксидантов включают N-ацетил-L-цистеин/гомоцистеин, глутатион, 6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновую кислоту (Trolox), липоевую кислоту, метионин, тиосульфат натрия, платину, глицин-глицин-гистидин (трипептид) и бутилированный гидрокситолуол (BHT). В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит глутатион в количестве, равном от приблизительно 0,05 мг/мл до приблизительно 5 мг/мл.
Композиции настоящего изобретения также могут содержать кальций или другой двухвалентный катион, в частности когда катион обеспечивает взаимодействие с активным ингредиентом, для того чтобы сохранить его активность. В одном варианте осуществления композиция дополнительно содержит двухвалентный катион. В другом варианте осуществления двухвалентный катион предлагается в виде соли кальция, например хлорида кальция, но может также представлять собой другие соли кальция, такие как глюконат кальция, глубионат кальция или глюцептат кальция. В некоторых вариантах осуществления соль кальция присутствует в количестве, равном от приблизительно 1 мМ до приблизительно 5 мМ. В других вариантах осуществления соль кальция присутствует в количестве, равном от приблизительно 3 мМ до приблизительно 4 мМ, предпочтительно приблизительно 4 мМ.
++
В некоторых вариантах осуществления комбинация гистидина и глутатиона может оказывать синергически благоприятное воздействие на стабильность определенного активного ингредиента, присутствующего в композиции. Например, гистидин, действуя как буфер, также может действовать как хелатор металла. В тех случаях, когда, как полагают, на уровень активности активного ингредиента воздействует вызванное металлом окисление, гистидин, например, может, следовательно, действовать так, чтобы стабилизировать связывание окисляющими металлическими ионами. Полагают, что посредством связывания данных металлов глутатион (или любой другой присутствующий антиоксидант) тем самым способен обеспечить дальнейшую антиокислительную защиту, поскольку окисляющее воздействие металлических ионов, связанных гистидином, подавляется. Другие хелатирующие агенты также можно включать в композиции/составы настоящего изобретения. Такие хелатирующие агенты, предпочтительно, связывают металлы, такие как медь и железо, с большим сродством, чем кальций, например когда в композиции используется соль кальция. Одним примером такого хелатора является дефероксамин, который представляет собой хелатирующий агент, который облегчает удаление Al и железа.
Лиофилизация
Как правило, определенные температуры и/или температурные диапазоны способа лиофилизации относятся к температуре хранения лиофилизирующего оборудования, если не указано иное. Температура хранения относится к контрольной температуре холодоносителя, протекающего через хранение лиофилизатора, которой, как правило, управляют в качестве температуры во время лиофилизации. Температура образца (т.е. температура продукта) зависит от температуры хранения, давления в камере и/или скорости испарения/сублимации во время первичного высушивания (при испарительном охлаждении температуры продуктов ниже, чем температура хранения).
A. Замораживание
В одном варианте осуществления первая температура равна приблизительно -48°C или ниже. В другом варианте осуществления первая температура равна приблизительно -54°C или ниже. В других вариантах осуществления период времени составляет по меньшей мере приблизительно 30 минут, для иллюстрации от приблизительно 30 минут до приблизительно 20 часов, от приблизительно 1 до приблизительно 18 часов, от приблизительно 2 до приблизительно 16 часов, от приблизительно 3 до приблизительно 14 часов, от приблизительно 4 до приблизительно 10 часов, от приблизительно 5 до приблизительно 8 часов и от приблизительно 6 до приблизительно 7 часов. В одном варианте осуществления период времени составляет приблизительно 6 часов.
Температура и период времени могут зависеть от таких факторов, как объем раствора на флакон, вне зависимости от лиофилизируемой композиции.
Настоящее изобретение в некоторых случаях относится к цели полной или на 100% кристаллизации вспомогательного вещества, и специалист в данной области техники понимает, что "полную кристаллизацию" может быть сложно верифицировать, в частности, когда чувствительности метода недостаточно для полной уверенности в том, что вспомогательное вещество полностью или на 100% кристаллизовано. Поэтому на практике настоящее изобретение предлагает способы лиофилизации, которые по меньшей мере улучшают кристаллизацию вспомогательного вещества в сравнении с предыдущими способами. Соответственно, в контексте настоящего описания, "полностью кристаллизованные" продукты могут быть определены, например, посредством дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), когда специалист в данной области техники определяет, что необратимый экзотермический акт при первом сканировании представляет акт кристаллизации, который указывает на то, что кристаллизующееся вспомогательное вещество не полностью кристаллизовалось во время лиофилизации. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно кристаллизующееся вспомогательное вещество частично кристаллизовано, причем частичная кристаллизация характеризуется как степень кристаллизации, составляющая приблизительно 50% или более, для иллюстрации по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99%, по меньшей мере приблизительно 99,5%, по меньшей мере приблизительно 99,8% и менее чем 100%.
B. Отжиг
В других вариантах осуществления способ дополнительно содержит выдерживание первой композиции при второй температуре в течение второго периода времени, для того чтобы получить вторую композицию, причем вторая температура выше первой температуры.
В одном варианте осуществления вторая температура по меньшей мере приблизительно на 5°C выше первой температуры, для иллюстрации от приблизительно на 5°C до приблизительно на 30°C и от приблизительно на 10°C до приблизительно на 20°C выше первой температуры. Например, в некоторых вариантах осуществления вторая температура равна приблизительно -30°C, причем первая температура равна приблизительно -50°C.
В некоторых вариантах осуществления второй период времени составляет по меньшей мере 10 минут, для иллюстрации от приблизительно 10 минут до приблизительно 10 часов, от приблизительно 30 минут до приблизительно 8 часов, от приблизительно 1 часа до приблизительно 6 часов и от приблизительно 2 часов до приблизительно 4 часов. В других вариантах осуществления второй период времени составляет менее чем, более чем или приблизительно равен первому периоду времени.
Без ограничения какой-либо конкретной теорией предполагается, что такие стадии отжига могут помочь улучшить скорости сублимации и/или уменьшить гетерогенность в пределах партии, зависящую от условий и конкретной композиции.
В одном варианте осуществления стадия отжига необязательна.
В других вариантах осуществления после второго периода времени вторую композицию подвергают третьей температуре в течение третьего периода времени, причем третья температура ниже второй температуры. Например, в некоторых вариантах осуществления третья температура является приблизительно такой же, как первая температура. В других вариантах осуществления третья температура по меньшей мере на 5°C ниже второй температуры, для иллюстрации от приблизительно на 5°C до приблизительно на 30°C и от приблизительно на 10°C до приблизительно на 20°C ниже второй температуры. Например, в некоторых вариантах осуществления вторая температура равна приблизительно -30°C, причем вторая температура равна приблизительно -50°C.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает способ лиофилизации композиции, содержащей по меньшей мере один активный ингредиент и по меньшей мере одно кристаллизующееся вспомогательное вещество. Данный способ включает в себя:
(a) выдерживание данной композиции при первой температуре в течение первого периода времени, достаточного для того, чтобы получить первую композицию, содержащую по меньшей мере одно частично или полностью кристаллизованное кристаллизующееся вспомогательное вещество;
(b) выдерживание первой композиции при второй температуре в течение второго периода времени, для того чтобы получить вторую композицию, причем вторая температура выше первой температуры; и
(c) выдерживание второй композиции при третьей температуре в течение третьего периода времени, для того чтобы получить третью композицию, причем третья температура ниже второй температуры.
В одном варианте осуществления период времени составляет по меньшей мере приблизительно 30 минут, для иллюстрации от приблизительно 30 минут до приблизительно 20 часов, от приблизительно 1 до приблизительно 18 часов, от приблизительно 2 до приблизительно 16 часов, от приблизительно 3 до приблизительно 14 часов, от приблизительно 4 до приблизительно 10 часов, от приблизительно 5 до приблизительно 8 часов и от приблизительно 6 до приблизительно 7 часов. В другом варианте осуществления период времени составляет приблизительно 6 часов. В других вариантах осуществления период времени составляет приблизительно 3 часа. В других вариантах осуществления третий период времени составляет менее чем, более чем или приблизительно равен первому периоду времени. В других вариантах осуществления условия (например, температура и время) на стадии (a) и (b) являются одинаковыми или по существу одинаковыми.
C. Высушивание
В других вариантах осуществления способы настоящего изобретения дополнительно включают в себя фазу высушивания. Фаза высушивания может включать в себя фазу первичного высушивания и фазу вторичного высушивания.
Соответственно, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает способ лиофилизации композиции, содержащей по меньшей мере один активный ингредиент и по меньшей мере одно кристаллизующееся вспомогательное вещество. Данный способ включает в себя:
(a) выдерживание данной композиции при первой температуре в течение первого периода времени, достаточного для того, чтобы получить первую композицию, содержащую по меньшей мере одно частично или полностью кристаллизованное кристаллизующееся вспомогательное вещество; и
(b) высушивание первой композиции, для того чтобы сформировать лиофилизированный кек.
В других вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает способ лиофилизации композиции, содержащей по меньшей мере один активный ингредиент и по меньшей мере одно кристаллизующееся вспомогательное вещество, причем данный способ включает в себя:
(a) выдерживание данной композиции при первой температуре в течение первого периода времени, достаточного для того, чтобы получить первую композицию, содержащую по меньшей мере одно частично или полностью кристаллизованное кристаллизующееся вспомогательное вещество;
(b) выдерживание первой композиции при второй температуре в течение второго периода времени, для того чтобы получить вторую композицию, причем вторая температура выше первой температуры;
(c) выдерживание второй композиции при третьей температуре в течение третьего периода времени, для того чтобы получить третью композицию, причем третья температура ниже второй температуры; и
(d) высушивание третьей композиции, для того чтобы сформировать лиофилизированный кек.
В одном варианте осуществления высушивание содержит стадию первичного высушивания. Первичное высушивание может удалить замерзшую воду (сублимация льда). Предпочтительно, несвязанный или легко удаляемый лед удаляют из образца посредством первичного высушивания. Несвязанная вода в начале стадии первичного высушивания может предпочтительно иметь форму свободного льда, который может быть удален посредством сублимации, т.е. превращения непосредственно из твердого состояния в пар.
В некоторых вариантах осуществления стадия первичного высушивания может проводиться при температуре, равной от приблизительно -35°C до приблизительно 20°C, или от приблизительно -25°C до приблизительно 10°C, или от приблизительно -20°C до приблизительно 0°C. В одном варианте осуществления стадию первичного высушивания проводят при приблизительно 0°C. В других вариантах осуществления стадия первичного высушивания может осуществляться в течение общего времени, составляющего по меньшей мере приблизительно 1 час, для иллюстрации от приблизительно 1 часа до приблизительно 1 недели, от приблизительно 10 часов до приблизительно 4 дней и от приблизительно 20 часов до приблизительно 40 часов. В другом варианте осуществления стадия первичного высушивания включает в себя высушивание первой или третьей композиции при давлении, равном от приблизительно 0 до приблизительно 200 мТорр, предпочтительно приблизительно 100 мТорр, при температуре, равной приблизительно -50°C, в течение приблизительно 1 часа и затем при 0°C в течение приблизительно 35 часов.
Необязательная стадия "линейного изменения перед первичным высушиванием" (т.е. повышения температуры от стадии, предшествующей первичному высушиванию, до температуры первичного высушивания) может осуществляться в соответствии со способами настоящего изобретения при скорости, равной от приблизительно 0,1°C до приблизительно 10°C в минуту.
Стадия первичного высушивания может проводиться в течение времени, достаточного для того, чтобы удостовериться, что по существу вся замерзшая вода удалена из образца. Специалист в данной области техники понимает, что время первичного высушивания изменяется с конфигурацией, поскольку продолжительность первичного высушивания может зависеть от заполненного объема и геометрии (площадь поверхности кека - сопротивление/поток). В одном варианте осуществления продолжительность первичного высушивания составляет по меньшей мере приблизительно 5 часов, для иллюстрации от приблизительно 5 часов до приблизительно 100 часов, от приблизительно 10 часов до приблизительно 80 часов, от приблизительно 30 часов до приблизительно 60 часов и от приблизительно 40 до приблизительно 50 часов.
За первичным высушиванием можно следить с помощью любого количества способов, включая наблюдение за изменениями температуры продуктов во время сублимационной сушки. Другим способом является наблюдение за изменениями давления в камере, поскольку, когда сублимация заканчивается, в камере больше не остается молекул воды, вносящих свой вклад в изменения давления. Конец стадии первичного высушивания можно определить как тот момент, когда температура продукта (образца) приближается к температуре хранения, о чем, например, свидетельствует значительное изменение наклона кривой температуры продукта вследствие уменьшившейся скорости сублимации; когда сублимация заканчивается, заканчивается испарительное охлаждение. Для того чтобы предупредить преждевременное окончание, в некоторых вариантах осуществления продолжительность первичного высушивания можно увеличить на дополнительные 2-3 часа. Другим способом следить за окончанием первичного высушивания является проверка по возрастанию давления, когда при отсоединении источника вакуума давление в камере должно возрастать со скоростью, зависящей от количества влаги в продукте. В одном варианте осуществления конец процесса первичного высушивания может быть установлен как момент, когда скорость возрастания давления становится ниже определенного значения. Другим способом для определения конца стадии первичного высушивания является измерение скорости передачи тепла.
В других вариантах осуществления непосредственно перед первичным высушиванием композиция может быть помещена в вакуум при температуре стадии, непосредственно предшествующей первичному высушиванию. Единожды включенный вакуум может присутствовать в течение оставшейся части процесса лиофилизации, хотя уровень вакуума может меняться.
Дополнительную информацию о высушивании во время лиофилизации можно найти в Carpenter, J. F. and Chang, B. S., Lyophilization of Protein Pharmaceuticals, Biotechnology and Biopharmaceutical Manufacturing, Processing and Preservation, K. E. Avis and V. L. Wu, eds. (Buffalo Grove, IL Interpharm Press, Inc.) (1996), которая включена в настоящее описание посредством ссылки ради идеи высушивания.
В одном варианте осуществления высушивание дополнительно включает в себя одну или несколько стадий вторичного высушивания, для того чтобы уменьшить уровень влаги предпочтительно до уровня, который обеспечивает необходимые биологические и/или структурные свойства конечного продукта.
В некоторых вариантах осуществления каждая из одной или нескольких стадий вторичного высушивания проводится при температуре, равной приблизительно 0°C или выше, для иллюстрации от приблизительно 0°C до приблизительно 100°C, от приблизительно 10°C до приблизительно 90°C, от приблизительно 20°C до приблизительно 80°C, от приблизительно 30°C до приблизительно 70°C, от приблизительно 40°C до приблизительно 60°C и от приблизительно 45°C до приблизительно 50°C. В одном варианте осуществления стадия вторичного высушивания включает в себя первую, вторую и третью стадии вторичного высушивания, осуществляемые при приблизительно 40°C, приблизительно 45°C и приблизительно 50°C соответственно. В одном варианте осуществления стадия вторичного высушивания имеет температуру, равную приблизительно 35°C, в течение периода времени, равного приблизительно 16 часам.
Стадия повышения температуры перед одной или несколькими стадиями вторичного высушивания, которая может быть необязательной, в настоящем описании именуется "линейное изменение перед вторичным высушиванием". Линейное изменение перед вторичным высушиванием может осуществляться при скорости повышения температуры, равной от приблизительно 0,1°C до приблизительно 10°C в минуту.
Каждая из одной или нескольких стадий вторичного высушивания может проводиться в течение времени, достаточного для того, чтобы уменьшить остаточный уровень влаги в лиофилизированном продукте до конечного уровня. В некоторых вариантах осуществления конечный остаточный уровень влаги равен приблизительно 10% или менее, для иллюстрации приблизительно 9% или менее, приблизительно 8% или менее, приблизительно 7% или менее, приблизительно 6% или менее, приблизительно 5% или менее, приблизительно 4% или менее, приблизительно 3% или менее, приблизительно 2% или менее, приблизительно 1% или менее, приблизительно 0,8% или менее, приблизительно 0,6% или менее, приблизительно 0,5% или менее, приблизительно 0,2% или менее и приблизительно 0,1% или менее.
В одном варианте осуществления стадия вторичного высушивания проводится при приблизительно 35°C. В других вариантах осуществления стадия вторичного высушивания может осуществляться в течение общего времени, равного по меньшей мере приблизительно 1 часу, для иллюстрации от приблизительно 1 часа до приблизительно 1 недели, от приблизительно 10 часов до приблизительно 4 дней и от приблизительно 16 часов до приблизительно 40 часов. В другом варианте осуществления стадия вторичного высушивания содержит высушивание под давлением, равным от приблизительно 0 до приблизительно 200 мТорр, предпочтительно приблизительно 100 мТорр, при температуре, равной приблизительно 35°C, в течение приблизительно 16 часов.
Для того чтобы определять остаточный уровень влаги в образце, может применяться, например, метод Карла Фишера. Кроме того, проверка по возрастанию давления или измерение скорости передачи тепла также могут применяться для того, чтобы определять конец каждой из одной или нескольких стадий вторичного высушивания. Альтернативно, можно применять также электронный гигрометр или анализатор остаточных газов. При этом минимальная продолжительность одной или нескольких стадий вторичного высушивания может быть определена с применением различных комбинаций температур хранения (когда температура хранения одной или нескольких стадий вторичного высушивания является той же самой или меньшей, чем температура, применяемая на высокотемпературной стадии) и продолжительностей. Остаточное содержание влаги можно определять с помощью нескольких способов, включая потери при высушивании, титрование по Карлу Фишеру, термический гравиметрический анализ (TGA), газовую хроматографию (ГХ) или инфракрасную спектроскопию.
Без ограничения какой-либо конкретной теорией полагают, что во время лиофилизации активный ингредиент преобразуется из пребывающего в водной фазе в пребывающий в аморфной твердой фазе, которая, как полагают, защищает активный ингредиент от химической и/или конформационной нестабильности. Лиофилизированный препарат не только содержит аморфную фазу, но также включает в себя компонент, который кристаллизуется во время лиофилизации. Это может обеспечить лиофилизацию активного ингредиента и образование более качественного кека (например, кека с минимальным уменьшением относительно стенок контейнера, в котором он был лиофилизирован).
В одном варианте осуществления лиофилизированный кек характеризуется как имеющий структуру, нарушенную менее чем на 50%. В другом варианте осуществления лиофилизированный кек характеризуется как имеющий структуру, нарушенную на от приблизительно 0% до приблизительно 24%.
В другом аспекте настоящее изобретение предлагает способ лиофилизации водного фармацевтического состава, содержащего AT III, причем данный способ включает в себя:
(a) выдерживание данного состава при температуре ниже приблизительно -45°C в течение периода времени, достаточного для того, чтобы получить первую композицию, содержащую по меньшей мере одно частично или полностью кристаллизованное кристаллизующееся вспомогательное вещество; и
(b) высушивание первой композиции, для того чтобы сформировать лиофилизированный кек.
В других аспектах настоящее изобретение предлагает способ лиофилизации водного фармацевтического состава, содержащего AT III, причем данный способ включает в себя:
(a) выдерживание данного состава при температуре замораживания ниже приблизительно -50°C в течение периода времени, достаточного для того, чтобы получить первую композицию, содержащую по меньшей мере одно частично или полностью кристаллизованное кристаллизующееся вспомогательное вещество; и
(b) высушивание первой композиции, для того чтобы сформировать лиофилизированный кек. В некоторых вариантах осуществления данный способ, необязательно, дополнительно содержит стадию отжига, при которой состав выдерживают при температуре отжига, которая выше температуры замораживания.
В другом аспекте настоящее изобретение предлагает способ лиофилизации водного фармацевтического состава, содержащего AT III, причем данный способ включает в себя:
(a) выдерживание состава при температуре ниже приблизительно -60°C в течение периода времени, достаточного для того, чтобы получить первую композицию, содержащую по меньшей мере одно частично или полностью кристаллизованное кристаллизующееся вспомогательное вещество; и
(b) высушивание первой композиции, для того чтобы сформировать лиофилизированный кек.
Также предлагаются композиции (например, кристаллизованные и/или лиофилизированные фармацевтические композиции и кеки), полученные в соответствии со способами настоящего изобретения.
Соответственно, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает лиофилизированную композицию AT III или кек, полученный в соответствии с настоящим изобретением.
В других вариантах осуществления способы настоящего изобретения предлагают продукты, которые по меньшей мере сохраняют или по существу сохраняют активность активного ингредиента(ов) после хранения лиофилизированного продукта. В одном варианте осуществления активность активного ингредиента(ов) сохраняется или по существу сохраняется после хранения продукта лиофилизации при приблизительно 5°C, приблизительно 25°C или приблизительно 40°C в течение приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3 или приблизительно 6, или более месяцев. В другом варианте осуществления после хранения лиофилизированного продукта активность активного ингредиента составляет по меньшей мере приблизительно 70%, 80%, 90%, 95%, 99% и 100% по отношению к его активности перед лиофилизацией.
Наборы
В других аспектах также предлагаются наборы, содержащие фармацевтические композиции настоящего изобретения, причем набор дополнительно содержит сухой и жидкий компонент, причем сухой и жидкий компоненты могут присутствовать в отдельных контейнерах в наборе, или некоторые из компонентов могут быть объединены в один контейнер, как например в наборе, в котором сухие компоненты присутствуют в первом контейнере, а жидкие компоненты присутствуют во втором контейнере, где данные контейнеры могут присутствовать или не присутствовать в объединенной конфигурации. Необязательно, наборы могут дополнительно содержать ряд дополнительных реагентов. Необязательно, наборы могут дополнительно включать в себя инструкции по применению компонентов набора, включая, например, инструкции по восстановлению лиофилизированной композиции с помощью соответствующего разбавителя. Данные инструкции могут присутствовать в наборах в виде вкладыша в упаковку, на маркировке контейнера набора или его компонентов.
Настоящее изобретение будет проиллюстрировано более подробно с помощью примеров, но следует отметить, что настоящее изобретение не ограничено данными примерами.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Для того чтобы определить условия замораживания, которые способствуют кристаллизации компонентов в растворе AT III и улучшают физические свойства конечного продукта, осуществляли лиофилизацию составов с AT III, содержащих человеческий получаемый из плазмы AT III (6,88 мг/мл), аланин (100 мМ) и NaCl (150 мМ). Как аланин, так и NaCl представляют собой кристаллические вспомогательные вещества. Для данного состава физические свойства могут быть непосредственно связаны со степенью кристаллизации вспомогательных веществ. Необходимо кристаллизовать NaCl и аланин насколько возможно полностью во время замораживания, для того чтобы обеспечить твердую матрицу для поддержки структуры кека.
Дифференциальная сканирующая калориметрия: исследовали термальные акты замораживания-оттаивания состава с AT III с помощью дифференциального сканирующего калориметра (Model 2920, TA instruments, Inc., New Castle, DE). Температуру и постоянную ячейки ДСК откалибровали в соответствии со стандартной методикой с применением высокочистого индия. Модулированную ДСК применяли для изучения изменения теплового потока и теплоемкости (Cp) максимально концентрированных вымораживанием растворов. Опыты осуществляли с амплитудой, равной 0,5°C, с периодом, равным 80 секунд. Образец, 20 микролитров, закупорили в алюминиевый герметичный тигель и сканировали в минусовом диапазоне температур.
Термальные акты в NaCl, аланине и восстановленном растворе AT III: исследовали акты кристаллизации и плавления в NaCl, аланине и восстановленном растворе AT III.
Планирование эксперимента ДСК с помощью E-CHIP: выполнили DOE, разработанное Echip, для того чтобы определить влияние температуры замораживания, времени выдержки при замораживании и времени выдержки при отжиге на кристаллизацию вспомогательных веществ. Скорость линейного изменения при замораживании (от 5°C до температуры замораживания) была установлена равной 2°C/мин. После отжига продукт замораживали от -30°C до температуры замораживания при 5°C/мин. Скорость линейного нагревания установили в 1°C/мин.
Влияние скорости линейного изменения на кристаллизацию: сравнили различные скорости охлаждения (2°C/мин против 0,2°C/мин), для того чтобы исследовать влияние скорости линейного изменения на кристаллизацию. Также сравнили различные скорости линейного изменения во время отжига (5°C/мин против 0,2°C/мин, 1°C/мин против 0,2°C/мин).
Образование конденсированной фазы: во время процесса переохлаждения молекулярные конформации и конфигурации, которые доступны в жидкой фазе, но не в кристаллической твердой фазе, вмерзают. Данный процесс 'захвата' конформаций и конфигураций во время охлаждения имеет место, когда скорость возрастания вязкости превосходит скорость изменения ориентации молекул. 'Вмерзание' конформационных состояний приводит к конденсированной фазе, которая обладает некоторой степенью ближнего молекулярного порядка, но, аналогично жидкости, не имеет признаков дальнего молекулярного порядка кристаллического твердого PI.
Образование конденсированной фазы наблюдали посредством модулированной ДСК, при которой теплоемкость (Cp) концентрированной вымораживанием аморфной фазы уменьшали непрерывно до тех пор, пока не достигли равновесия. Cp является внутренним свойством и непосредственно связано с молекулярной подвижностью. Большая Cp означает большую подвижность, а меньшая Cp указывает на меньшую подвижность. Материал в жидком состоянии имеет большую Cp, чем его твердый аналог. Уменьшение Cp обусловлено физической трансформацией материала из более жидкого состояния в твердое состояние.
Cp отслеживали с применением протокола замораживания и отжига, показанного в таблице 1.
Раствор замораживали от 0 до -52°C и выдерживали в течение 120 мин. Затем его нагревали вплоть до -30°C и выдерживали в течение 1 часа. Наконец продукт снова замораживали до -52°C в течение других 2 часов и затем линейно нагревали вплоть до 0°C. Скорость первого замораживания составляла 0,2°C/мин. Также сравнили влияние времени выдержки при замораживании (2 часа, 5 часов и 10 часов) и температуры (-46°C, -48°C и -52°C) на Cp.
Сублимационная сушка: большая часть экспериментов была проведена в Lyostar II FTS system (SP Industries). Некоторые провели в сублимационной сушилке Minilyo (Usifroid). Методы замораживания перечислены в таблице 2.
Таблица 2
Методы замораживания
Метод
Температура замораживания (°C)
Время выдержки при замораживании (часы)
1
-52
2
2
-54
2
3
-54
6
4
-50
6
5
-60
6
6
-52
15
Методы 1-5 отличаются температурой хранения и временем выдержки для первой стадии замораживания. Вторая температура замораживания была установлена равной первой температуре замораживания. И время выдержки для второго замораживания составляло 2 часа. Метод 6 описывает режим, при котором продукт замораживали при -52°C в течение 2 часов, отжигали при -30°C в течение 1 часа и замораживали снова до -52°C в течение других 15 часов. Отжиг, первичное и вторичное высушивание были одинаковыми для всех циклов, перечисленных в таблице 1.
Растровый электронный микроскоп (РЭМ): для того чтобы изучить структуру сублимированных кеков, использовали РЭМ (Hitachi, модель S-3200, NCSU). Изображения образца у поверхностей или ниже поверхностей изображены с увеличением от 50 до 5000 раз. Поскольку сублимированные кеки являются хорошими электрическими изоляторами, они заряжались под воздействием электронного пучка. Это приводило к потере разрешения. Для того чтобы уменьшить заряжающий эффект воздействия электронного пучка на образцы, все образцы покрыли тонким слоем золота посредством напыления с применением настольного Denton Vacuum. Получили изображения кека с нарушенной структурой, твердого кека, кристалла NaCl и кристалла аланина.
Порошковая рентгеновская дифракция: для того чтобы охарактеризовать степень кристаллизации кека с нарушенной структурой (ETP 5807) и твердого кека (ETP 5807 26N9540) применяли порошковую рентгеновскую дифракцию (РД). РД диаграммы записывали с применением дифрактометра (Rigaku, модель Multiflex) с излучением медного катода при 40 кВ и 40 мА. Сканирования проводили в 20 диапазоне от 10° до 90°. Скорость сканирования составляла 1°/мин для образца NaCl и 0,125°/мин для аланина, ETP 5807.
Результаты и обсуждение
Целью проведения ДСК было охарактеризовать критические факторы, которые регулируют свойства кристаллизации вспомогательных веществ в составе с AT III, определили температуру кристаллизации (Tx), температуру эвтектического плавления (Te) и степень кристаллизации.
Кристаллизация и плавление NaCl, аланина и раствора AT III: для чистого раствора NaCl экзотермический пик кристаллизации расположен при приблизительно -38°C во время замораживания, и эндотермический пик плавления оказался при -19°C во время нагревания (фиг. 1). Определили теплоту плавления для пика плавления, составившую 7,4 Дж/г. Термограмма для раствора аланина демонстрировала экзотермический пик при -45°C во время замораживания, включая кристаллизацию. Во время нагревания, однако, наблюдалась группа маленьких пиков, расположенных приблизительно при -44°C. Происхождение данных пиков было сложно определить (фиг. 2).
При анализе восстановленного раствора AT III доказательств экзотермической активности во время замораживания не наблюдали. Тем не менее, наблюдали эвтектический пик плавления при -22° C, вероятнее всего благодаря NaCl (фиг.3). Теплота плавления (2,0 Дж/г) оказалась меньше, чем у чистого раствора NaCl. Уменьшение теплоты плавления можно отнести за счет частичной кристаллизации NaCl в составе с AT III. На основании данной корреляции вычислили степень кристаллизации посредством деления теплоты плавления, полученной от составов, на постоянную 7,4 Дж/г, которая представляет собой теплоту плавления для чистого раствора NaCl.
Результаты DOE: выполнили DOE, разработанное ECHIP с применением модели центрального составного куба, для того чтобы определить влияние температуры замораживания, времени выдержки при замораживании и времени выдержки при отжиге на кристаллизацию раствора AT III (Таблица 3).
Результаты DOE указывают на то, что все исследованные переменные условия оказывают значительное влияние на кристаллизацию раствора. Замораживание при -52°C приводит к большему количеству кристаллического NaCl по сравнению с замораживанием при температурах, равных -44°C и -60°C. Уменьшение кристаллизации при более низкой температуре (-60°C) можно объяснить обратной зависимостью между степенью кристаллизации и скоростью кристаллизации. Степень кристаллизации была больше при более низкой температуре. Тем не менее, раствор становился настолько вязким, что скорость кристаллизации значительно уменьшалась. Анализ данных DOE дал оптимальную температуру замораживания при -54°C (фиг. 4).
Исследование времен выдержки показывает, что увеличение времени выдержки при замораживании и времени выдержки при отжиге приводит к увеличению степени кристаллизации. Результаты DOE указывают на то, что оптимальное время выдержки составляет 10 часов как для замораживания, так и для отжига (фиг. 4).
Анализ данных также выдает сообщение о несоответствии, указывающее на то, что модель, созданная E-CHIP, может не полностью отражать процесс кристаллизации. Поэтому выполнили дополнительный эксперимент ДСК, для того чтобы лучше понять изменение физических свойств, сопровождающее процесс кристаллизации во время замораживания и отжига.
Влияние линейного изменения скорости на кристаллизацию: скорость охлаждения: как пластификатор, вода действует как физический разбавитель, который увеличивает свободный объем и молекулярную подвижность. Свойством воды является увеличение молекулярной подвижности, что может содействовать контролируемым диффузией процессам, таким как кристаллизация. Быстрое охлаждение захватывает больше воды в аморфной фазе, тогда как замедление охлаждения позволяет воде вытечь из системы. Соответственно, быстрое охлаждение способствует образованию кристаллов. Когда скорость замораживания уменьшалась от 2°C/мин до 0,2°C/мин, степень кристаллизации NaCl уменьшалась на 82% (от 17% до 3%).
Линейное изменение скорости во время отжига: при линейном изменении от температуры замораживания до более теплой молекулярная подвижность увеличивается до такой степени, что происходит образование активных центров и кристаллизация. Линейное изменение скорости на этой стадии должно быть достаточно медленным, для того чтобы получить удовлетворительные кристаллы. Уменьшение линейного изменения скорости от 1°C до 0,2°C/мин увеличивало степень кристаллизации от 38% до 95%. Дальнейшее уменьшение линейного изменения скорости до 0,1°C/мин не привело к значительной разнице.
При линейном изменении от -30°C до -52°C уменьшение скорости от 5°C/мин до 0,2°C/мин увеличивало кристаллизацию в 1,35 раза (от 17% до 39%). Данные результаты указывают на то, что линейное изменение скорости, равное 0,2°C/мин, оказалось достаточным, для того чтобы произошла кристаллизация.
Конденсированная фаза и кристаллизация: дополнительное исследование было посвящено конденсированной фазе и кристаллизации. Фиг. 5A показывает изменение Cp со временем в цикле ETP-5807 (таблица 1). Небольшое изменение Cp имеет место во время первого замораживания (фиг. 5B), отжига (фиг. 5C) и второго замораживания (фиг. 5D). Образование конденсированной фазы видно по падению Cp. Небольшое изменение Cp указывает на то, что во время замораживания и отжига происходит небольшое изменение фазы. С применением данных параметров получили кристаллизацию только на 75%. Степень кристаллизации вычислили посредством деления теплоты плавления, которая составляет 5,5 Дж/г (фиг. 6), на постоянную 7,4 Дж/г, которая представляет собой теплоту плавления для чистого раствора NaCl.
Образование конденсированной фазы наблюдается при увеличении времени выдержки при замораживании. Фиг. 7A показывает всю картину изменения Cp во время замораживания и отжига. Когда первое время выдержки при замораживании увеличивали от 2 часов до 5 часов, Cp падала до минимального равновесного значения, что указывает на изменение от более жидкой фазы до более конденсированной фазы (фиг. 7B). Дальнейшее увеличение времени выдержки от 5 часов до 10 часов не продемонстрировало дальнейшего уменьшения Cp (данные не показаны). Пик кристаллизации наблюдался во время линейного нагревания (фиг. 7C). Данный уникальный пик отсутствовал, когда время выдержки при замораживании составляло только 2 часа. Если раствор полностью кристаллизовался во время первого замораживания и линейного нагревания, можно предположить, что дополнительный отжиг или замораживание будет иметь небольшой эффект на Cp или никакого. Это было продемонстрировано тем фактом, что не наблюдалось изменений Cp во время отжига и второго замораживания (фиг. 7D и 7E). Степень кристаллизации увеличивалась до 87% при увеличении времени замораживания от 2 часов до 5 часов. Степень кристаллизации вновь вычислили посредством деления теплоты плавления, которая составляет 6,4 Дж/г (фиг. 8), на постоянную 7,4 Дж/г.
Данные результаты показывают, что необходимо 5 часов при -52°C, для того чтобы закончить физическую трансформацию аморфной фазы AT III. Конденсированная фаза только начинает образовываться при замораживании в течение всего 2 часов. Достаточное время выдержки при замораживании является одним предварительным условием для кристаллизации.
Аналогичное исследование провели при температурах выше, чем -52°C. Данные результаты показывают, что кристаллизационной активности нет, когда температура продукта равна -46°C. При температуре, равной -48°C, когда время выдержки увеличили от 4 часов до 5 часов, степень кристаллизации увеличилась от 36% до 84%. Поэтому предпочтительно, чтобы раствор AT III замерзал ниже -48°C в течение по меньшей мере 5 часов, для того чтобы вызвать достаточную кристаллизацию.
Развитие процесса лиофилизации: для того чтобы подтвердить результаты исследования ДСК в макроскопическом масштабе, четыре температуры замораживания (-50°C, -52°C, -54°C и -60°C) и два времени выдержки (2 часа и 6 часов) сравнили в лабораторной сублимационной сушилке.
Замораживание при -52°C в течение 2 часов: начальная оценка параметров таблицы 1 текущего цикла, использованных во время выполнения, осуществлялась с применением аппарата Lyostar II FTS. Профиль температуры и давления в камере представлен на фиг. 9. Наивысшая температура продукта, измеренная термопарами во время процесса замораживания, составила приблизительно -49°C (фиг. 10.). После обработки физическая проверка показала, что только 2% кеков были приемлемыми, 17% имели небольшие отверстия, 57% имели частично нарушенную структуру, и 23% были разрушены. На основании результатов ДСК температура продукта (-49°C) оказалась достаточно низкой, для того чтобы вызвать кристаллизацию, однако время выдержки при замораживании должно составлять по меньшей мере 5 часов, для того чтобы перед кристаллизацией образовалась конденсированная фаза. Продолжительность замораживания, равная 2 часам, оказалась слишком малой, для того чтобы получить достаточно кристаллов.
Замораживание при -54°C в течение 2 часов: в данном цикле раствор AT III замораживали при -54°C в течение 2 часов, отжигали при -30°C в течение 1 часа и снова замораживали при -54°C в течение 2 часов. Замораживание проводили в аппарате Lyostar II FTS. Первичное и вторичное высушивание проводилось в CSl0-0.5 (Serail 14L03). Графики на фиг. 11 и 12 демонстрируют, что температуры продукта оставалась ниже -50°C во время замораживания. Физическая проверка показала, что 74% кеков были приемлемыми, и 26% имели небольшие отверстия. Несмотря на то что мы видим улучшение свойств кека при понижении температуры продукта от -49°C до -50°C, результат все еще остается неудовлетворительным. Данные результаты показывают, что одного лишь замораживания при низкой температуре недостаточно, для того чтобы вызвать полную кристаллизацию.
Замораживание при -54°C в течение 6 часов: в данном цикле раствор AT III замораживали при -54°C в течение 6 часов, отжигали при -30°C в течение 1 часа и снова замораживали при -54°C в течение 2 часов. Цикл проводили в аппарате FTS Freeze-dry. Температуры продукта поддерживались ниже -50°C во время замораживания (фиг. 13 и 14). Физическая проверка показала, что все кеки были приемлемыми. Данные результаты показывают, что температура продукта и время выдержки при замораживании в равной мере важны, для того чтобы обеспечить оптимальную кристаллизацию. Такой результат согласуется с данными ДСК.
Замораживание при -50°C в течение 6 часов: в данном цикле раствор AT III замораживали при -50°C в течение 6 часов, отжигали при -30°C в течение 1 часа и снова замораживали при -50°C в течение 2 часов. Цикл проводили в аппарате Lyostar II FTS. С применением данных параметров температуры продукта поддерживались ниже -47°C и выше -48°C во время замораживания (фиг. 15 и 16). Физическая проверка показала, что только 18% были приемлемыми, 23% имели небольшие отверстия и 59% демонстрировали нарушение структуры. Данное исследование подтверждает предыдущий вывод по ДСК, что температура продукта должна быть ниже -48°C, для того чтобы начать кристаллизацию. Оно также демонстрирует, что одного лишь увеличения времени выдержки при замораживании недостаточно, для того чтобы образовать удовлетворительные кристаллы.
Замораживание при -60°C в течение 6 часов: в данном цикле раствор AT III замораживали при -60°C в течение 6 часов, отжигали при -30°C в течение 1 часа и снова замораживали при -60°C в течение 2 часов. Цикл проводили в сублимационной сушилке Minilyo (Usifroid). Температура продукта во время замораживания составила -51,6°C на верхней полке и -52,7°C на нижней полке (фиг. 17 и 18). Физическая проверка показала, что все кеки были приемлемыми. Данный эксперимент дополнительно демонстрирует, что понижение температуры хранения и увеличение времени выдержки при замораживании являются важными подходами для получения фармацевтически приемлемых кеков.
Замораживание при -52°C в течение 15 часов: в данном цикле раствор AT III замораживали при -52°C в течение 2 часов, отжигали при -30°C в течение 1 часа и замораживали снова до -52°C в течение 15 часов. Замораживание проводили в аппарате Lyostar II FTS. Первичное и вторичное высушивание проводилось в Serail, поскольку изолирующий клапан в FTS застрял во время первичного высушивания. Наивысшие температуры продукта, измеренные термопарами во время замораживания, были ниже -48°C (фиг. 19 и 20). Физические свойства всех кеков были приемлемыми. На основании результатов ДСК -48°C является наивысшей температурой продукта, необходимой, для того чтобы вызвать кристаллизацию. И время выдержки, равное 15 часам, оказалось достаточно большим, для того чтобы обеспечить полную кристаллизацию.
Итог: в таблице 4 приведена реакция температур на различные заданные значения температуры хранения.
Поскольку температура продукта, как правило, выше на 4-6°C, чем заданное значение целевой температуры хранения целевую температуру хранения предпочтительно устанавливают при -54°C, для того чтобы иметь уверенность, что все температуры продукта остаются ниже -48°C во всем лиофилизаторе. На основании результатов данных исследований (таблица 5) можно выбрать целевую температуру хранения во время замораживания для того, чтобы иметь уверенность, что температуры продукта значительно ниже -48°C.
Кроме того, достаточное время может быть выделено, для того чтобы обеспечить полную кристаллизацию. Данные показывают, что температура хранения, равная -54°C, с 6-часовой выдержкой может обеспечить данные условия и способствовать надлежащей кристаллизации. Поэтому как увеличение времени выдержки при замораживании от 2 часов до 6 часов, так и понижение заданного значения целевой температуры хранения от -52 до -54°C улучшат физические свойства конечного продукта.
Структура сублимированных кеков: структуры сублимированных кеков наблюдали посредством растрового электронного микроскопа. Кек с частично нарушенной структурой использовали в качестве контроля для твердого и прочного кека. Кек с нарушенной структурой содержит много тонких и пористых чешуек (фиг. 21A). Твердый кек (фиг. 21B) состоит главным образом из пластинчатых кристаллов с некоторым количеством округлых кристаллов, распределенных по всему кеку. NaCl сам по себе образует небольшие округлые кристаллы (фиг. 22). Аланин сам по себе (фиг. 23) образует непрерывные пластины с некоторым количеством отверстий, вероятно, вследствие сублимации льда. Можно предположить, что пластинчатые кристаллы на фиг. 21B представляют собой в первую очередь аланин, а кристаллы округлой формы - NaCl.
Порошковая рентгеновская дифракция: на основании данных, полученных в исследованиях ДСК и замораживания, осуществили второй проход ETP-5807 с максимальной нагрузкой. Данный проход включал низкую температуру замораживания во время стадии первого замораживания, а также увеличенное время выдержки. В модифицированном цикле получили продукт с приемлемыми физическими свойствами.
Для того чтобы охарактеризовать степень кристаллизации кека с нарушенной структурой после первого прохода и твердого кека после второго прохода, сравнили РД диаграммы NaCl, аланина, ETP 5807 (кека с нарушенной структурой) и материала от второго прохода ETP 5807 (твердого кека) (фиг. 24). Основные пики кристаллической дифракции NaCl расположены при 31,7° и 45,5°. Главный пик кристаллической дифракции аланина расположен при 20,5°. Широкий пик, имеющий место в образцах аланина, относится к аморфной части. Кеки ETP 5807 (первый проход) и ETP 5807 (второй проход) демонстрируют комбинацию пиков NaCl и аланина. Широкий пик также наблюдается для обоих образцов.
Степень кристаллизации вычисляют посредством деления площади кристаллического пика на сумму площадей аморфного и кристаллического пиков. Степени кристаллизации NaCl, аланина, ETP 5807 и ETP 5807 (второй проход), соответственно, соответствуют 99±20%, 50±1%, 66±2% и 60±1%. Для кека с нарушенной структурой и твердого кека не было отмечено отличий в диаграмме дифракции.
Выводы: состав с AT III охарактеризовали, уделив особое внимание степени кристаллизации, для разработки протокола замораживания при лиофилизации. Результаты показывают, что температура замораживания и время выдержки являются в равной мере важными предварительными условиями полной кристаллизации. В некоторых вариантах осуществления лиофилизация может включать температуру замораживания, равную приблизительно -54°C, а также увеличенное время выдержки, равное приблизительно 6 часам. В испытаниях получили фармацевтически приемлемые конечные продукты.
Пример 2
Литые флаконы емкостью тридцать мл заполнили десятью миллилитрами стерильного фильтрованного раствора, содержащего AT III (~6,88 мг/мл), аланин (100 мМ (~8,91 мг/мл)) и NaCl (150 мМ, (~8,7 мг/мл)). Образцы AT III были сначала заморожены до -25°C, выдержаны в течение 2 часов и затем снова заморожены до -54°C, за чем последовала выдержка в течение 6 часов. Затем температуру хранения медленно подняли до -30°C со скоростью, равной 0,2°C/мин, и выдержали при данной температуре в течение 2 часов, и затем медленно понизили при 0,2°C/мин назад до -54°C. Продукты выдержали при -54°C в течение 2 часов до начала первичного высушивания. Первичное высушивание проводилось при температуре хранения, равной 0°C, и заданном давлении в камере, равном 100 мТорр. Первичное высушивание продолжалось в течение приблизительно 32 часов до начала вторичного высушивания. Вторичное высушивание проводилось при температуре хранения 35°C и давлении в камере 100 мТорр в течение 14 часов.
После высушивания получили приблизительно 100% фармацевтически приемлемого лиофилизированного кека. Долю фармацевтически приемлемого кека вычислили посредством деления количества приемлемого кека на количество кеков во всей партии. Кроме того, применили модулированную ДСК и наблюдали образование конденсированной фазы во время стадии замораживания и процесса кристаллизации во время линейного нагревания.