КОМПОЗИЦИЯ ОТ БЕШЕНСТВА, СОДЕРЖАЩАЯ АДЪЮВАНТ PIKA
RABIES COMPOSITION CONTAINING PIKA ADJUVANT

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к иммунологической области, более конкретно, к композиции вакцины от бешенства для профилактики или лечения бешенства, вызванного заражением вирусом бешенства, способу и его применению, и, более конкретно, к композиции вакцины для профилактики или лечения бешенства, вызванного заражением вирусом бешенства, с ускоренной схемой лечения.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Вирус бешенства представляет собой оболочечный вирус, содержащий одноцепочечный РНК-ген, кодирующий пять структурных белков. Бешенство представляет собой зооноз, передаваемый от животных к человеку через загрязнения, содержащие зараженную вирусом слюну, через неповрежденную слизистую оболочку. Коэффициент смертности составляет почти 100% после наступления клинических симптомов, и бешенство остается одним из самых летальных из известных инфекционных заболеваний.
В более развитом регионе случаи заражения бешенством через животных семейства собачьих редки из-за обязательной вакцинации домашних животных, так, например, в Соединенных Штатах немногие случаи бешенства людей вызваны больными бешенством летучими мышами. В развивающихся странах бешенство у человека, передаваемое бешеными собаками, более широко распространено, и только в Индии является причиной 25 000-30 000 смертей ежегодно. Бездомные собаки или щенки без вакцинации являются потенциальными переносчиками заболевания, и они обитают совместно с такими жертвами, как дети в деревнях. Программы вакцинации бродячих собак в основном не оправдали себя в этих районах. Согласно докладу ВОЗ, ежегодно от бешенства по всему миру умирает более 60 000 человек. Наиболее подверженными регионами являются Азия и Африка. Современная вспышка бешенства в Бали, Индонезия, угрожает жизни более 130 человек.
На сегодняшний день не существует эффективного лечения от бешенства после заражения. Такие способы лечения, как антивирусное лекарство, стероиды, иммунномодулятор и иммуноглобулиновая инфузия, в основном показали свою неэффективность. К счастью, инфекция бешенства может быть предотвращена путем вакцинации после контакта с потенциально больными бешенством животными, немедленного локального лечения ран и надлежащей пост-контактной профилактики (ПКП). В более серьезных случаях может потребоваться применение антирабических иммуноглобулинов (АИГ). Лицам, профессия которых связана с высоким риском быть укушенными животными, также рекомендуется профилактика против вируса бешенства. Протективным для млекопитающих считается титр антител против вируса бешенства, составляющий 0,5 или более международных единиц (МЕ), определяемый быстрым тестом на ингибирование флуоресцентного свечения (RFFIT) с контролем по референсной сыворотке ВОЗ. Подробное описание теста проводится в: Laboratory Techniques in Rabies, Edited by F X Meslin, M M Kaplan H Koprowski, 4th Edition, ISBN 92 4 1544 1.
Коммерческие вакцины от бешенства основаны на фиксированных штаммах вируса бешенства, таких как штамм Pitman Moore (PM), штамм Kissling контрольного вируса (КВ) или штамм Flury на низком (НП) или высоком уровне (ВП) пассажей в яйцеклетках, фиксированный штамм Evelin Rokitniki Abelseth (ERA) вируса Street-Alabama-Dufferin (SAD) и различные варианты вируса SAD. Эти вирусные штаммы адаптированы к четырем основным культуральным системам, утвержденным ВОЗ, включающим диплоидные клетки человека, куриные или утиные эмбрионы, клетки почки хомяка и клеточную линию Vero.
Адъюванты, в основном, являются соединениями, которые, будучи введены совместно с антигеном (либо в смеси с ним, либо непосредственно перед введением антигена), усиливают или модифицируют иммунную реакцию на этот конкретный антиген. Алюминий рутинно добавляется к вакцине против бешенства в качестве адъюванта, чтобы повысить иммуногенность инактивированной вакцины. Однако было обнаружено, что алюминий вызывает задержку производства антител и не обеспечивает лучшей защиты в постконтакном испытании. Поэтому поиск подходящего адъюванта к вакцине от бешенства все еще продолжается.
Кроме того, инактивированная вакцина нестабильна при очистке, лиофильной сушке и хранении. Поэтому к раствору вакцины добавляются химические и/или биологические стабилизирующие агенты. Примерами известных на данный момент химических стабилизирующих веществ являются человеческий альбумин, гидролизат желатина, сахарные спирты, аминокислоты и другие нетоксичные вещества. Патент США Prince et al, No. 4,164,565 описывает применение альбумина в качестве стабилизатора в вакцинах. Таким образом, типичная композиция вакцины от бешенства состоит из антигена инактивированного вируса бешенства, культивированного в подходящей линии клеток, с адъювантом или без него, и стабилизированного альбумином и другими стабилизирующими агентами или вспомогательными веществами.
В профилактических целях вакцинация обычно проводится 3 раза, что обеспечивает от 3 до 4 лет иммунитета. После заражения вирусом бешенства вакцины обычно вводятся четыре раза на 0-й, 3-й, 7-й и 14-й день, или пять раз с применением эссенского режима, включающего 5 инъекций на 0-й, 3-й, 7-й, 14-й и 28-й день.
Для предотвращения смертельного заболевания после контакта с животными - потенциальными носителями, вакцины от бешенства рутинно вводятся постконтактно. Несмотря на то, что миллионы людей получают ПКП каждый год после контакта с животными, предположительно страдающими бешенством, все еще имеются сообщения о смертях, связанных с бешенством даже после прохождения ПКП, или даже при одновременном введении иммуноглобулина.
Анализ 1120 случаев бешенства в Китае в Гуанси показывает, что 27,2% случаев смерти было вызвано неудачей вакцинации; среди них в 78,2% случаев смерть наступала до пятой инъекции. Эти случаи могут быть связаны с задержкой производства антирабических нейтрализующих антител (АРНА), запускаемого антирабической вакциной, отсутствием Т-лимфоцит-опосредованного иммунного ответа, отсутствием иммунной реакции в связи с индивидуальными особенностями, или отклонением от руководящих принципов постконтактного лечения, рекомендованных ВОЗ, например, пренебрежение инъекциями иммуноглобулина.
Исследования показали, что животные и человек могут продуцировать антирабические нейтрализующие антитела при заражении или в ответ на вакцинацию. Ранние исследования на животных показали, что стимулируемая вакциной выработка иммуноглобулинов IgM и IgG играет важную роль в защите иммунизированных животных от вируса. Таким образом, ранняя выработка более высокого титра нейтрализующих антител имеет жизненно важное значение для защиты пациентов, которые потенциально подвержены риску заражения вирусом.
С другой стороны, имеются исследования, в которых тестируются и рекомендуются новые схемы вакцинации, способные повысить эффективность вакцинации, снизить уровень клинической сложности (т.е. сократить количество инъекций или сократить продолжительность клинического лечения) и издержки. Европейский патент No 1 593 392 описывает способ пре- и пост-иммунизации вакциной от бешенства с пониженной дозой.
В настоящем описании изобретения мы представляем более мощную вакцину от бешенства, способную индуцировать более ранние и более высокие титры нейтрализующих антител против вируса бешенства. Конкретный состав, описанный в настоящем документе, включающий инактивированный очищенный антиген вируса бешенства, адъювант PIKA и человеческий сывороточный альбумин в буферном растворе в присутствии или в отсутствие других вспомогательных веществ, безопасен и стабилен при использовании для человека, и имеет большой срок годности. Дополнительно, мы описываем способ вакцинации, включающий новый режим вакцинации, который требует меньшего числа посещений клиники и более короткой продолжительности периода иммунизации.
Литература
Могут представлять интерес следующие ссылки:
Wunner, W. H., Larson, J. K., Dietzschold, B., & Smith, C. L. (1988). The molecular biology of rabies viruses. Review of Infectious Diseases, 10 (Supplement 4), S771-S784
Sudarshan MK, Madhusudana SN, Mahendra BJ, Rao NS, Ashwath Narayana DH, et al. (2007). Assessing the burden of human rabies in India: results of a national multi-certer epidemiological survey. Int J Infect Dis 11:29-35.
Jackson AC, Warrell MJ, Pupprecht CE, Ertl HC, Dietzschold B, et al. (2003). Management of rabies in humans. Clin Infect Dis 36:60-63.
World Health Organization (2014). Rabies Fact Sheet N° 99. Находится по адресу: http:// www.who.int/mediacentre/factsheets/fs099/en/
Putra, A. A. G., Hampson, K., Girardi, J., Hiby, E., Knobel, D., Mardiana, W., & Scott-Orr, H (2013). Response to a rabies epidemic, Bali, Indonesia, 2008-2011. Emerging infectious diseases, 19(4), 648.
World Health Organization (2010). Current strategies for human rabies pre and post-exposure prophylaxis. Находится по адресу: http://www.who.int/ rabies/human/WHO _strategy_prepost_exposure/en/
Патент США No 4 164 565
Wang, S. et al (2010). A new PIKA adjuvant rabies vaccine. Journal of Applied preventive medicine 16(1), 1-4.
Deshmukh DG, Damle AS, Bajaj JK, Bhakre JB, Patil NS. Fatal rabies despite post-exposure prophylaxis. Indian J Med Microbiol. 2011 Apr-Jun;29(2):178-80
Shantavasinkul, P., Tantawichien, T., Wacharapluesadee, S., Jeamanukoolkit, A., Udomchaisakul, P., Chattranukulchai, P., & Hemachudha, T. (2010). Failure of rabies postexposure prophylaxis in patients presenting with unusual manifestations. Clinical Infectious Diseases, 50(1), 77-79
Wilde H, Sirikawin S, Sabcharoen A, Kingnate D, Tantawichien T, Harischandra PA, Chaiyabutr N, de Silva DG, Fernando L, Liyanage JB, Sitprija V. Failure of postexposure treatment of rabies in children. Clin Infect Dis. 1996 Feb;22(2):228-32
European Patent No. 1 593 392
Bertoletti, A, (2012) PIKA dose response to determine effective concentration for monocyte-derived DC activation. Singapore Institute for Clinical Sciences, Biomedical Sciences Institutes.
World Health Organization (2007). Rabies vaccines WHO position paper (1st ed.). Находится по адресу: http://www.who.int/immunization/sage/SAGEmeetingRabies_PP_ Draft_oct12.pdf
Сущность изобретения
Учитывая вышеизложенные недостатки в предшествующем уровне техники, настоящее изобретение представляет собой композицию вакцины от бешенства, включающую или состоящую из: a) инактивированного очищенного вируса бешенства (сокращенно ИОВБ), b) адъюванта PIKA и c) человеческого сывороточного альбумина (сокращенно ЧСА). В некоторых вариантах осуществления композиция вакцины от бешенства включает от 0,2 МЕ до 4,0 МЕ на одну дозу ИОВБ, от 250 мкг до 5000 мкг адъюванта PIKA на одну дозу, и от 0,1 до 0,9 концентрационных % ЧСА (до лиофильной сушки или после растворения).
Единичная доза, подходящая для описываемой композиции вакцины, готовится в объеме 0,1 мл, 0,15 мл, 0,2 мл, 0,5 мл, 1,0 мл, 1,5 мл, 2,0 мл или в диапазоне между любыми двумя из следующих значений: 0,1 мл, 0,15 мл, 0,2 мл, 0,5 мл, 1,0 мл, 1,5 мл и 2,0 мл. Понятно, что слишком большой и слишком малый объем введения приводит к неудобствам в клинической практике, если речь идет о применении к человеку. Таким образом, единичная доза для взрослого человека, в основном, может быть приготовлена в объеме 0,5 мл или 1,0 мл для инъекций (жидкая форма или после растворения лиофилизированного порошка), или в объеме 0,15 мл или 0,2 мл для интраназального применения.
В некоторых вариантах осуществления количество ИОВБ составляет 0,2 МЕ, 0,5 МЕ, 1,0 МЕ, 1,5 МЕ, 2,0 МЕ, 2,5 МЕ, 3,0 МЕ, 3,5 МЕ, 4,0 МЕ на одну дозу, или попадает в диапазон между любыми двумя следующими значениями: 0,2 МЕ, 0,5 МЕ, 1,0 МЕ, 1,5 МЕ, 2,0 МЕ, 2,5 МЕ, 3,0 МЕ, 3,5 МЕ и 4,0 МЕ. В некоторых вариантах осуществления количество ИОВБ составляет от 0,2 МЕ до 4,0 МЕ на одну дозу. В некоторых конкретных вариантах осуществления количество ИОВБ составляет 1,0 МЕ, 1,5 МЕ, 2,0 МЕ, 2,5 МЕ на одну дозу, или попадает в интервал между двумя из следующих значений на одну дозу: 1,0 МЕ, 1,5 МЕ, 2,0 МЕ и 2,5 МЕ на одну дозу. В одном конкретном варианте осуществления количество ИОВБ для взрослого человека может составлять от 1,0 МЕ до 2,0 МЕ на одну дозу, например 1,0 МЕ или 2,0 МЕ на одну дозу. В других вариантах осуществления, в применении к детям, количество ИОВБ на одну дозу может быть уменьшено; например, количество ИОВБ может составлять от 0,5 МЕ до 1,0 МЕ, на одну дозу, например, 0,5 МЕ или 1,0 МЕ на одну дозу. В некоторых конкретных вариантах осуществления концентрация ИОВБ составляет от 0,05 МЕ/мл до 40,0 МЕ/мл, например, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 МЕ/мл, или попадает в диапазон между любыми двумя из следующих концентраций: 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0, 3,0 и 4,0, 5,0, 10, 15, 20, 25, 30, 35 и 40 МЕ/мл.
В некоторых вариантах осуществления количество адъюванта PIKA, подходящее для описываемой композиции вакцины, составляет 250 мкг, 500 мкг, 1000 мкг, 1500 мкг, 2000 мкг, 3000 мкг, 4000 мкг, 5000 мкг на одну дозу, или попадает в интервал между любыми двумя из следующих значений: 250 мкг, 500 мкг, 1000 мкг, 1500 мкг, 2000 мкг, 3000 мкг, 4000 мкг, 5000 мкг на одну дозу. В некоторых конкретных вариантах осуществления для использования в применении к человеку количество адъюванта PIKA составляет от 250 мкг до 4000 мкг на одну дозу. В некоторых конкретных вариантах осуществления количество адъюванта PIKA составляет 500 мкг, 1000 мкг, 1500 мкг, 2000 мкг или 2500 мкг на одну дозу, или попадает в диапазон между любыми двумя из следующих значений: 500 мкг, 1000 мкг, 1500 мкг, 2000 мкг, 2500 мкг на одну дозу. В других вариантах осуществления, в случае, если они применяются к детям, количество адъюванта PIKA на одну дозу может быть уменьшена, и составлять, например, 250 мкг, 500 мкг, 750 мкг, 1000 мкг или 1250 мкг на одну дозу, или попадать в диапазон между любыми двумя из следующих значений: 250 мкг, 500 мкг, 750 мкг, 1000 мкг и 1250 мкг на единицу дозы.
Любой подходящий адъювант PIKA может быть использован в композиции вакцины в настоящем изобретении. PIKA представляет собой синтетический химический аналог двухцепочечной РНК, проявивший свою активность как агонист TLR3 в доклинических исследованиях. Адъювант PIKA состоит из Poly I:C, антибиотика (например, канамицина) и положительного иона (например, хлорида кальция). Он растворим в водном растворе с pH в диапазоне от 6,0 до 8,0. Если не указано иное, то под адъювантом PIKA, пригодным для использования в вакцине от бешенства согласно настоящему изобретению, подразумевается адъювант PIKA, описанный в заявке WO2006/131023, включенной в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки. В соответствующих вариантах осуществления адъювант PIKA является гетерогенным молекулярной массе, причем молекулярная масса составляет от порядка 66 000 до 1 200 000 Дальтон, или от порядка 66 000 до 660 000 Дальтон, или от порядка 138 000 до 660 000 Дальтон, или от порядка 150 000 до 660 000 Дальтон, или от порядка 138 000 до 1 200 000 Дальтон, или от порядка 150 000 до 1 200 000 Дальтон, или от порядка 300 000 до 1 200 000 Дальтон, или от порядка 300 000 до 660 000 Дальтон или от порядка 337 000 до 660 000 Дальтон, или от порядка 337 000 до 1 200 000 Дальтон, или от порядка 500 000 до 1 200 000 Дальтон, или от порядка 500 000 до 2 000 000 Дальтон.
В соответствующих вариантах осуществления молекулы адъюванта PIKA в композиции вакцины от бешенства имеют средний молекулярный вес, равный или превышающий 100 000 Дальтон, либо равный или превышающий 120 000 Дальтон, либо равный или превышающий 138 000 Дальтон, либо равный или превышающий 150 000 Дальтон, либо равный или превышающий 250 000 Дальтон, либо равный или превышающий 300 000 Дальтон, либо равный или превышающий 337 000 Дальтон, либо равный или превышающий 500 000 Дальтон, либо равный или превышающий 750 000 Дальтон, либо равный или превышающий 1 000 000 Дальтон, либо равный или превышающий 1 200 000 Дальтон, либо равный или превышающий 1 500 000 Дальтон, либо равный или превышающий 2 000 000 Дальтон.
В некоторых вариантах осуществления соотношение ИОВБ и адъюванта PIKA составляет 1МЕ/100мкг, 1МЕ/125мкг, 1МЕ/200мкг, 1МЕ/250мкг, 1МЕ/300мкг, 1МЕ/350мкг, 1МЕ/400мкг, 1МЕ/450мкг, 1МЕ/500мкг, 1МЕ/550мкг, 1МЕ/600мкг, 1МЕ/700мкг, 1МЕ/800мкг, 1МЕ/1000мкг, 1МЕ/1500 мкг, 1МЕ/2000 мкг, или попадает в диапазон между любыми двумя вышеуказанными соотношениями. В одном из вариантов осуществления соотношение ИОВБ и адъюванта PIKA составляет 1МЕ/500мкг. В одном из вариантов осуществления ИОВБ составляет 2,0 МЕ на одну дозу, а количество адъюванта PIKA составляет 1000 мкг на одну дозу. В другом варианте осуществления ИОВБ составляет 4,0 МЕ на одну дозу, а количество адъюванта PIKA составляет 2000 мкг на одну дозу. В другом варианте осуществления ИОВБ составляет 3,0 МЕ на одну дозу, а количество адъюванта PIKA составляет 1000 мкг на одну дозу. В еще одном варианте осуществления ИОВБ составляет 1,0 МЕ на одну дозу, а количество адъюванта PIKA составляет 1000 мкг на одну дозу. В еще одном варианте осуществления ИОВБ составляет 1,0 МЕ на одну дозу, а количество адъюванта PIKA составляет 2000 мкг на одну дозу.
В некоторых вариантах осуществления в композицию вакцины согласно настоящему изобретению входит также фармацевтически приемлемый буфер. В некоторых вариантах осуществления фармацевтически приемлемый буфер выбирается из следующего набора: PBS, ацетат, трис-гидроксиметил аминометан, гидрокарбонаты и карбонаты. В некоторых вариантах осуществления pH буфера составляет 7,00, 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,30, 7,35, 7,40, 7,45, 7,50 и 7,55, 7,60, 7,65, 7,70, 7,75, 7,80, 7,85, 7,90, 7,95 или 8,00, либо находится в диапазоне между любыми двумя из следующих значений pH: 7,00, 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,30, 7,35, 7,40, 7,45, 7,50, 7,55, 7,60, 7,65, 7,70, 7,75, 7,80 и 7,85, 7,90, 7,95 и 8,00. В некоторых вариантах осуществления буфер представляет собой PBS, и pH буфера PBS составляет 7,3, 7,4 или 7,5, либо находится в диапазоне между любыми двумя из вышеуказанных значений.
В некоторых вариантах осуществления количество ЧСА, который может быть использован в композиции вакцины согласно настоящему изобретению, составляет 0,15%, 0,20%, 0,25%, 0,30%, 0,35%, 0,40%, 0,45%, 0,50% или 0,60% по концентрации (до лиофильной сушки или после растворения), либо попадает в диапазон между любыми двумя из вышеуказанных значенний. Человеческий альбумин добавляется в вакцину против бешенства в качестве стабилизатора для обработки, лиофильной сушки и хранения. Квалифицированному специалисту в данной области техники понятно, что альбумин является известным аллергеном для некоторых животных, однако человеческий альбумин сам по себе является утвержденным препаратом для использования в применении к человеку, и его можно безопасно использовать в применении к человеку.
В некоторых вариантах осуществления композиция вакцины от бешенства в соответствии с настоящим изобретением дополнительно включает в себя мальтозу. В некоторых вариантах осуществления количество мальтозы составляет от 1,0% до 6,0% по концентрации (до лиофильной сушки или после растворения). В некоторых вариантах осуществления количество мальтозы составляет 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0% или 6,0% по концентрации либо попадает в диапазон между любыми двумя из вышеуказанных значений. В некоторых вариантах осуществления количество мальтозы составляет 5,0% по концентрации.
В некоторых вариантах осуществления композиция вакцины от бешенства в соответствии с нынешним изобретением не содержит желатин.
Если не указано иное, любой доступный антиген вируса бешенства может использоваться для приготовления вакцины от бешенства в соответствии с настоящим изобретением. ВОЗ утвердила несколько штаммов вируса бешенства для производства вакцин, включая, не ограничиваясь нижеперечисленным, штамм Pitman Moore (PM), вирусные штаммы Пастера (PV), штамм контрольного вируса (КВ), штамм Flury, адаптированный к куриным эмбрионам, на низком (НП) или высоком уровне пассажей в яйцеклетках, фиксированный штамм Evelin Rokitniki Abelseth (ERA) вируса Street-Alabama-Dufferin (SAD) и различные варианты вируса SAD. Эти утвержденные штаммы вируса адаптированы к культуре ткани мозга, куриным или утиным эмбрионам, линии первичных клеток (например, линии клеток почки хомяка), диплоидным клеткам человека или непрерывным клеточным линиям (например, клеточной линии Vero). Вышеупомянутые вирусные штаммы могут использоваться для изготовления вакцин после их инактивации и очистки. В некоторых вариантах осуществления ИОВБ представляет собой вирус из штамма CTN, штамма aG, штамма Pitman-Moore (PM) и штамма Пастера (PV). В некоторых вариантах осуществления ИОВБ представляет собой вирус штамма CTN, штамма Pitman-Moore L503 и штамма PV-2061.
В некоторых вариантах осуществления ИОВБ созревает в клеточной линии Vero или в первичной клетке почки хомяка (PHK). ИОВБ нарабатывается путем переноса фиксированного штамма вируса в клетку Vero или PHK. После отбора супернатанта, полученного из среды культивирования, вирус собирается, концентрируется, инактивируется, очищается и хранится как антиген.
Если не указано иное, композиция вакцины от бешенства в соответствии с настоящим изобретением может быть приготовлена в жидкой форме, включая раствор или суспензию, но не ограничиваясь вышеперечисленным. В некоторых других вариантах осуществления композиция вакцины от бешенства готовится в виде твердой, например, лиофилизированной формы.
В некоторых вариантах осуществления композиция вакцины от бешенства в соответствии с настоящим изобретением включает или состоит из: 2,0 МЕ/мл ИОВБ, 1,0 мг/мл PIKA и 0,3% ЧСА. В некоторых других вариантах осуществления композиция вакцины от бешенства в соответствии с настоящим изобретением включает или состоит из: 2,0 МЕ/мл ИОВБ, 2,0 мг/мл PIKA и 0,3% ЧСА. В некоторых других вариантах осуществления композиция вакцины от бешенства в соответствии с настоящим изобретением включает или состоит из: 1,0 МЕ/мл ИОВБ, 2,0 мг/мл адъюванта PIKA и 0,3% ЧСА; либо 1,5 МЕ/мл ИОВБ, 2,0 мг/мл адъюванта PIKA и 0,3% ЧСА; либо 2,0 МЕ/мл ИОВБ, 2,0 мг/мл адъюванта PIKA и 0,5% ЧСА; либо 4,0 МЕ/мл ИОВБ, адъюванта PIKA и 0,5% ЧСА.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтическому набору, включающему: а) композицию вакцины от бешенства согласно настоящему изобретению, b) контейнер, например флакон или ампулу с) инструкцию по применению и, при необходимости, d) воду для инъекций. В некоторых конкретных вариантах осуществления для удобства транспортировки и хранения фармацевтический набор готовится в лиофилизированной форме. Таким образом, фармацевтический набор включает или состоит из а) лиофилизированной композиции вакцины от бешенства, b) флакона, который содержит лиофилизированную вакцину от бешенства, и c) инструкцию по применению. При необходимости, вода для инъекций может быть включена в фармацевтический набор для получения жидкой формы вакцины от бешенства путем растворения перед применением. В некоторых вариантах осуществления инструкция по применению предлагает следующий режим вакцинации: режим "2-2-1" для постконтактной защиты и/или режим "2-1" для профилактики, причем указанный режим "2-2-1" относится к 2 одинарным дозам, вводимым на 0-й день, 2 одинарным дозам, вводимым на 3-й день и 1 одинарной дозе, вводимой на 7-й день; режим "2-1" относится к 2 одинарным дозам, вводимым на 0-й день, и 1 одинарной дозе, вводимой на 7-й день. В другом варианте осуществления инструкция по применению предлагает следующий режим вакцинации: режим "2-2-2" для постконтактной защиты, причем указанный режим "2-2-2" относится к 2 одинарным дозам, вводимым на 0-й, 3-й и 7-й дни, соответственно. В другом варианте осуществления инструкция по применению предлагает следующий режим вакцинации: режим "1-1-1" для постконтактной защиты, причем указанный режим "1-1-1" относится к 1 одинарной дозе, вводимой на 0-й, 3-й и 7-й день, соответственно.
Настоящее изобретение также относится к способу индукции иммунного ответа на вирус бешенства путем введения в организм хозяина вакцины от бешенства, содержащей адъювант PIKA в соответствии с настоящим изобретением. Хозяин может быть человеком или другим животным. Вакцинация может осуществляться путем инъекции или ингаляции.
В настоящем документе также приводится композиция вакцины от бешенства для использования в способе лечения. В частности, изобретение относится к композиции вакцины от бешенства для использования в способе лечения или профилактики бешенства. Состав вакцины от бешенства может быть применен в способе индукции иммунного ответа на вирус бешенства. Композиция вакцины от бешенства полезна в способах медицинского лечения и профилактики, а также в способах индукции иммунного ответа, описанных в настоящем документе.
Кроме того, изобретение предусматривает применение вакцины от бешенства при изготовлении медикаментов для лечения или профилактики бешенства. В одном из аспектов настоящее изобретение предусматривает применение композиции вакцины от бешенства в соответствии с настоящим изобретением при изготовлении медикаментов для лечения или профилактики бешенства, вызванного заражением вирусом бешенства. В другом аспекте настоящее изобретение также относится к композиции вакцины от бешенства для лечения или профилактики бешенства, вызванного заражением вирусом бешенства. Медикамент полезен в способах лечения и профилактики, а также способах индукции иммунного ответа, описанных в настоящем документе.
На существующем уровне техники существует два рутинно используемых режима внутримышечных инъекций вакцины: один представляет собой эссенскую схему, включающую 5 инъекций на 0-й, 3-й, 7-й, 14-й и 28-й дни; второй представляет собой загребскую схему, включающую четыре инъекции, из которых две вводятся на 0-й день в разные участки тела, а остальные две инъекции проводятся на 7-й и 21-й день. Однако существующий режим вакцинирования, как правило, ограничен ввиду экстенсивного плана иммунизации, предусматривающего 5 посещений клиники, а также низкого титра антител на раннем этапе иммунизации. В отличие от этого, настоящее изобретение предусматривает способ лечения заражения вирусом бешенства в ускоренном режиме. В некоторых вариантах осуществления этот способ включает стадию введения вакцины от бешенства согласно настоящему изобретению в организм хозяина, причем указанный хозяин был подвержен контакту с вирусом бешенства. В некоторых вариантах осуществления хозяин является человеком. В некоторых других вариантах осуществления хозяин представляет собой другое животное, например, является грызуном, собакой и обезьяной.
Настоящее изобретение предусматривает ускоренный режим вакцинации, в рамках которого вакцина вводится хозяину 5 раз в течение 7 дней после контакта с вирусом бешенства, причем 0-м днем считается день контакта с вирусом бешенства. В некоторых вариантах осуществления вакцина вводится хозяину согласно следующему режиму: 1) первая доза на 0-й день после контакта с вирусом, 2) вторая доза на 0-й день после контакта с вирусом, 3) третья доза на 2-й или 3-й день после контакта с вирусом, 4) четвертая доза на 2-й или 3-й день после контакта с вирусом и 5) пятая доза на 6-й или 7-й день после контакта с вирусом, соответственно. В качестве альтернативы, в некоторых других вариантах осуществления, вакцина вводится хозяину согласно следующему режиму: первая и вторая дозы на 0-й день после контакта с вирусом; третья и четвертая дозы на 2-й или 3-й день после контакта с вирусом; и пятая и/или шестая дозы на 7-й день после контакта с вирусом, соответственно. Описанные в настоящем документе вакцины от бешенства могут быть введены согласно ускоренному режиму вакцинации.
В другом аспекте настоящее изобретение также предусматривает способ профилактики бешенства, вызванного заражением вирусом бешенства, и композицию вакцины от бешенства для применения этим способом. В некоторых вариантах осуществления этот способ включает стадию введения вакцины от бешенства согласно настоящему изобретению в организм хозяина, причем указанный хозяин не был подвержен контакту с вирусом бешенства. В некоторых вариантах осуществления хозяин является человеком. В некоторых других вариантах осуществления хозяин представляет собой другое животное, например, является грызуном, собакой и обезьяной. В некоторых вариантах осуществления композиция вакцины от бешенства согласно настоящему изобретению вводится хозяину 3 раза в течение 7 дней. В некоторых вариантах осуществления композиция вакцины от бешенства вводится хозяину согласно следующему режиму: 1) первая доза на 0-й день; 2) вторая доза на 0-й день; и 3) третья доза на 7-й день, соответственно. Профилактические меры включают воздействие на субъекта, особенно человека, который не имеет этого заболевания или не имеет симптомов заболевания. В частности, предпочтительными способами предотвращения бешенства, или профилактики, являются способы преконтактной профилактики (преКП), в которых вакцина вводится до того, как объект подвергается контакту, или риску контакта, с вирусом бешенства. Этот субъект может быть определен как предрасположенный к заболеванию или подверженный риску заболевания. В случае бешенства этот субъект может быть определен как предрасположенный к заболеванию бешенством или подверженный риску заболевания бешенством. Причинами могут быть, например, посещение или намерение посетить страну или место, где, как известно, распространено бешенство, или работа с вирусом или с животными.
В контексте настоящего изобретения, вакцинация осуществляется посредством парентеральной инъекции, внутримышечной инъекции, интраперитонеальной инъекции, внутривенной инъекции, подкожной инъекции, местного нанесения, трансдермального введения и внутрикожного введения. В некоторых вариантах осуществления вакцинация животных может осуществляться путем интраперитонеальной инъекции. В некоторых других вариантах осуществления вакцинация человека осуществляется путем внутримышечной инъекции или внутривенной инъекции. В другом варианте осуществления вакцинация осуществляется посредством ингаляции, ректального введения, назального введения, оральным способом (включая ингаляцию).
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг.1. Данные о токсичности вакцины от бешенства с адъювантом PIKA и расчет конверсии доз.
Фиг.2. Процесс получения антигена ИОВБ.
Фиг.3. Индукция выработки антител различными иммунизационными композициями.
Фиг.4. Титр антител IgG у иммунизированной обезьяны, выработка которых была индуцирована вакциной от бешенства с адъювантом PIKA.
Фиг.5. Нейтрализующие антитела у иммунизированной обезьяны, выработка которых была индуцирована вакциной от бешенства с адъювантом PIKA (по оси Y указаны единицы МЕ).
ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
[0039] Настоящее изобретение может быть лучше понято при рассмотрении следующего подробного описания некоторых вариантов осуществления и примеров, приведенных в настоящем документе. В настоящем документе ссылки на публикации подразумевают, что раскрытия изобретений в этих публикациях тем самым включаются в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки для более полного описания уровня техники, к которому относится настоящее изобретение.
Прежде чем приступить к дальнейшему описанию настоящего изобретения, следует подчеркнуть, что описываемое изобретение не ограничивается конкретными приведенными вариантами осуществления, каковые могут варьировать. Следует также понимать, что используемая в настоящем документе терминология предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления и не подразумевает ограничения, поскольку сфера применения настоящего изобретения ограничивается только прилагаемой к настоящему документу формулой изобретения. Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, обозначают то же, что понимает под ними квалифицированный специалист в данной области техники. Хотя любые способы и материалы, сходные или эквивалентные описанным в настоящем документе, могут также использоваться при использовании или тестировании настоящего изобретения, в данном разделе описываются предпочтительные способы и материалы. Следует отметить, что в настоящем документе и в прилагаемой к нему формуле изобретения, единственные формы относятся также ко множественным формам, если контекст подразумевает иного в явном виде.
Определения терминов
Термин "адъювант", используемый в настоящем документе, относится к любому веществу или смеси веществ, которые увеличивают или диверсифицируют иммунный ответ организма хозяина на антиген.
Термин "PIKA" означает композицию, состоящую из поли I:C, антибиотика (например, канамицина) и положительного иона (например, кальция). PIKA проявляет характеристики адъюванта со сниженными неблагоприятными побочными эффектами (например, со сниженной токсичностью) относительно, например, PICKCa, и более высокой иммуногенностью (например, стимуляцией усиленного иммунного отклика) относительно, например, AV-PICKCa.
Термин "вакцина от бешенства c адъювантом PIKA" означает композицию вакцины от бешенства, содержащий антиген ИОВБ и адъювант PIKA. Термины «вакцина от бешенства с адъювантом PIKA», «композиция вакцины от бешенства с адъювантом PIKA», «композиция вакцины, включающая PIKA», «композиция вакцины от бешенства, включащий адъювант PIKA», «вакцина от бешенства, содержащая PIKA» и «композиция вакцины, содержащей PIKA» можно использовать взаимозаменяемо.
Термин "животное" подразумевает человека и всех домашних и диких млекопитающих, включая, без ограничений, крупный рогатый скот, лошадей, коров, свиней, овец, коз, собак, кошек, грызунов, обезьян и т.п.
in vivo
Термин "антиген" означает вещество, которое при введении вызывает иммунный ответ, например, образование антител, включая антитела, которые специфично связывают антиген. Двумя характерными особенностями антигенов являются их имунногенность, то есть их способность вызывать иммунный ответ , и их антигенность, то есть их способность быть селективно опознанными антителами, выработка которых индуцирована этими антигенами.
Термины «клеточный иммунитет» и «клеточный иммунный ответ» относятся к иммунной защите, обеспечиваемой лимфоцитами, такие как защита, обеспечиваемая клетками T-лимфоцитов, когда они находятся в непосредственной близости от своих клеток-жертв. Клеточный иммунный ответ обычно включает пролиферацию лимфоцитов. При измерении «пролиферации лимфоцитов» измеряется способность лимфоцитов пролиферировать в ответ на конкретный антиген. Пролиферация лимфоцитов предполагает пролиферацию B-клеток, T-хелперов или цитотоксических T-лимфоцитов (ЦТЛ).
Выражение «усиленный иммунный ответ» или аналогичное ему означает, что иммунный ответ интенсифицируется, улучшается или усиливается с пользой для организма-хозяина, относительно предыдущего статуса иммунного ответа, например, перед введением иммуногенной композиции согласно настоящему изобретению.
Термины «гуморальный иммунитет» и «гуморальный иммунный ответ» относятся к форме иммунитета, в котором молекулы антител производятся в ответ на стимуляцию антигеном.
Термин "иммунный ответ" означает любой ответ на антиген иммунной системы позвоночного животного. К числу примеров иммунного ответа относятся, не ограничиваясь нижеперечисленным, клеточный, а также локальный и системный гуморальный ответ, такой как ответ ЦТЛ, в том числе антиген-специфическая индукция CD8+ ЦТЛ, ответы T-клеток, включая пролиферацию последних и выработку цитокина, а также ответы B-клеток, включая выработку антител.
Термин "возникновение иммунного ответа" используется в настоящем документе в основном для обозначения индукции или потенциации иммунного ответа.
Термин "индукция иммунного ответа" означает иммунный ответ, который стимулируется, инициируется или индуцируется.
Термин "потенцирование иммунной реакции" относится к существовавшему ранее иммунному ответу, который улучшается, дополняется, расширяется, усиливается, интенсифицируется, увеличивается или продливается.
Термин "лечение", и ему подобные используются в настоящем документе в основном в значении получения желаемого фармакологического и/или физиологического эффекта. Этот эффект может быть профилактическим с точки зрения полного или частичного предотвращения заболевания или симптома и/или терапевтическим с точки зрения частичной или полной стабилизации или лечения заболевания и/или неблагоприятного воздействия, приписываемого болезни. Термин "лечение", используемый в настоящем документе, охватывает любое лечение заболевания субъекта, особенно человека, и включает: i) профилактику возникновения этого заболевания у субъектов, которые могут быть предрасположены к заболеванию, но у которых диагноз еще не был поставлен; II) подавление этого заболевания, т. е. остановка его развития; или III) смягчения болезни, т.е. обеспечение регрессии этого заболевания. Термин "профилактика" или "предупреждение" и подобные им используются в настоящем документе в основном для обозначения лечения, предоставляемого для предотвращения или замедления развития заболевания.
Термин "смешивание" подразумевает любой способ объединения компонентов композиции; такие способы включают в себя, не ограничиваясь нижеперечисленным, блендирование, диспергирование, растворение, эмульсификацию, коагулирование, суспендирование или иной способ физического объединения компонентов композиции.
Термин "одна доза", используемый в настоящем документе, относится к физически дискретным единицам, служащих в качестве одинарных доз для человеческих и животных субъектов, причем каждая единица содержит заранее определенное количество настоящего состава, в расчете на количество состава, достаточное для получения желаемого эффекта. В любом случае термин "одна доза" не следует понимать как объем композиции вакцины, содержащийся в контейнере (например, флаконе).
Композиция вакцины от бешенства
Настоящее изобретение относится к композиции вакцины от бешенства, включающей или состоящей из: a) инактивированного очищенного вируса бешенства (далее ИОВБ), b) адъюванта PIKA и c) человеческого сывороточного альбумина (далее ЧСА). В некоторых вариантах осуществления в композицию вакцины от бешенства входит от 0,2 МЕ до 4,0 МЕ на одну дозу ИОВБ, от 250 мкг до 5000 мкг на одну дозу адъюванта PIKA и 0,1%-0,9% по концентрации ЧСА, причем концентрация определяется как масса на единицу объема (w/v) при формулировании, т.е. 0,1% ЧСА означает, что в 1 мл общего объема содержится 1 мг ЧСА. В процессе лиофильной сушки вода удаляется путем сублимации из твердой фазы в газовую фазу. Лиофилизированный порошок содержит такое же по массе количество ЧСА, и концентрация, определяемая как масса/объем, восстанавливается при его растворении.
Единичная доза, подходящая для описываемой композиции вакцины, готовится в объеме 0,1 мл, 0,15 мл, 0,2 мл, 0,5 мл, 1,0 мл, 1,5 мл, 2,0 мл или в диапазоне между любыми двумя из следующих значений: 0,1 мл, 0,15 мл, 0,2 мл, 0,5 мл, 1,0 мл, 1,5 мл и 2,0 мл. При этом понимается, что слишком большой и слишком малый объем введения приводит к неудобствам в клинической практике в применении к человеку. Таким образом, единичная доза для взрослого человека, в основном, может быть приготовлена в объеме 0,5 мл или 1,0 мл для инъекций (жидкая форма или после растворения лиофилизированного порошка), или в объеме 0,15 мл или 0,2 мл для интраназального применения.
В некоторых вариантах осуществления количество ИОВБ составляет 0,2 МЕ, 0,5 МЕ, 1,0 МЕ, 1,5 МЕ, 2,0 МЕ, 2,5 МЕ, 3,0 МЕ, 3,5 МЕ, 4,0 МЕ на одну дозу, или попадает в диапазон между любыми двумя следующими значениями: 0,2 МЕ, 0,5 МЕ, 1,0 МЕ, 1,5 МЕ, 2,0 МЕ, 2,5 МЕ, 3,0 МЕ, 3,5 МЕ и 4,0 МЕ. В некоторых вариантах осуществления количество ИОВБ составляет от 0,2 МЕ до 4,0 МЕ на одну дозу. В некоторых конкретных вариантах осуществления количество ИОВБ составляет 1,0 МЕ, 1,5 МЕ, 2,0 МЕ, 2,5 МЕ на одну дозу, или попадает в интервал между двумя из следующих значений на одну дозу: 1,0 МЕ, 1,5 МЕ, 2,0 МЕ и 2,5 МЕ на одну дозу. В одном конкретном варианте осуществления количество ИОВБ для взрослого человека может составлять от 1,0 МЕ до 2,0 МЕ на одну дозу, например 1,0 МЕ или 2,0 МЕ на одну дозу. В других вариантах осуществления, в применении к детям, количество ИОВБ на одну дозу может быть уменьшено; например, количество ИОВБ может составлять от 0,5 МЕ до 1,0 МЕ, на одну дозу, например, 0,5-МЕ или 1,0 МЕ на одну дозу. В некоторых конкретных вариантах осуществления концентрация ИОВБ составляет от 0,05 МЕ/мл до 40,0 МЕ/мл, например, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 МЕ/мл, или попадает в диапазон между любыми двумя из следующих концентраций: 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0, 3,0 и 4,0, 5,0, 10, 15, 20, 25, 30, 35 и 40 МЕ/мл.
В некоторых вариантах осуществления количество адъюванта PIKA, подходящее для описываемой композиции вакцины, составляет 250 мкг, 500 мкг, 1000 мкг, 1500 мкг, 2000 мкг, 3000 мкг, 4000 мкг, 5000 мкг на одну дозу, или попадает в интервал между любыми двумя из следующих значений: 250 мкг, 500 мкг, 1000 мкг, 1500 мкг, 2000 мкг, 3000 мкг, 4000 мкг, 5000 мкг на одну дозу. В некоторых вариантах осуществления для использования в применении к взрослым людям, количество адъюванта PIKA составляет от 250 мкг до 4000 мкг на одну дозу. В некоторых конкретных вариантах осуществления количество адъюванта PIKA составляет 500 мкг, 1000 мкг, 1500 мкг, 2000 мкг или 2500 мкг на одну дозу, или попадает в диапазон между любыми двумя из следующих значений: 500 мкг, 1000 мкг, 1500 мкг, 2000 мкг, 2500 мкг на одну дозу. В других вариантах осуществления, в случае, если они применяются к детям, количество адъюванта PIKA на одну дозу может быть уменьшена, и составлять, например, 250 мкг, 500 мкг, 750 мкг, 1000 мкг или 1250 мкг на одну дозу, или попадать в диапазон между любыми двумя из следующих значений: 250 мкг, 500 мкг, 750 мкг, 1000 мкг и 1250 мкг на единицу дозы.
Из многих адъювантов, доступных для применения к млекопитающим, лишь несколько из них, включая гидроксид алюминия и фосфат алюминия, широко использовались в вакцинах от бешенства для человека. Другие адъюванты были не применялись к человеку, поскольку они вызывают тяжелую локальную или системную реакцию. Например, полный адъювант Freund, содержащий минеральное масло, не метаболизируется и вызывает рак у лабораторных животных. Недавно была разработана вакцина от бешенства без солей алюминия. Она могла генерировать титры антирабических антител, сравнимые с титрами, индуцируемыми вакцинами с алюминий-содержащими адъювантами.
Адъювант PIKA, состоящий из Poly I:C, антибиотика (например, канамицина) и положительного иона (например, кальция), описанный в патенте WO2006/131023, включенном в настоящий документ во всей полноте посредством ссылки, был одобрен для как усиливающий иммунногенность антигена вируса в исследованиях на животных. В соответствующих вариантах осуществления адъювант PIKA является гетерогенным по молекулярной массе, причем молекулярная масса составляет от порядка 66 000 до 1 200 000 Дальтон, или от порядка 66 000 до 660 000 Дальтон, или от порядка 138 000 до 660 000 Дальтон, или от порядка 150 000 до 660 000 Дальтон, или от порядка 138 000 до 1 200 000 Дальтон, или от порядка 150 000 до 1 200 000 Дальтон, или от порядка 300 000 до 1 200 000 Дальтон, или от порядка 300 000 до 660 000 Дальтон или от порядка 337 000 до 660 000 Дальтон, или от порядка 337 000 до 1 200 000 Дальтон, или от порядка 500 000 до 1 200 000 Дальтон, или от порядка 500 000 до 2 000 000 Дальтон.
В соответствующих вариантах осуществления молекулы адъюванта PIKA в композиции вакцины от бешенства имеют средний молекулярный вес, равный или превышающий 100 000 Дальтон, либо равный или превышающий 120 000 Дальтон, либо равный или превышающий 138 000 Дальтон, либо равный или превышающий 150 000 Дальтон, либо равный или превышающий 250 000 Дальтон, либо равный или превышающий 300 000 Дальтон, либо равный или превышающий 337 000 Дальтон, либо равный или превышающий 500 000 Дальтон, либо равный или превышающий 750 000 Дальтон, либо равный или превышающий 1 000 000 Дальтон, либо равный или превышающий 1 200 000 Дальтон, либо равный или превышающий 1 500 000 Дальтон, либо равный или превышающий 2 000 000 Дальтон.
Любой подходящий адъювант PIKA может быть использован в композиции вакцины в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления молекулярная масса адъюванта PIKA находится в диапазоне от 66 000 Дальтон до 1 200 000 Дальтон. В предпочтительном варианте осуществления молекулярная масса адъюванта PIKA составляет от 66 000 Дальтон до 660 000 Дальтон.
В некоторых вариантах осуществления соотношение ИОВБ и адъюванта PIKA составляет 1МЕ/100мкг, 1МЕ/125мкг, 1МЕ/200мкг, 1МЕ/250мкг, 1МЕ/300мкг, 1МЕ/350мкг, 1МЕ/400мкг, 1МЕ/450мкг, 1МЕ/500мкг, 1МЕ/550мкг, 1МЕ/600мкг, 1МЕ/700мкг, 1МЕ/800мкг, 1МЕ/1000мкг, 1МЕ/1500 мкг, 1МЕ/2000 мкг, или попадает в диапазон между любыми двумя вышеуказанными соотношениями. 1МЕ/100мкг, 1МЕ/125мкг, 1МЕ/200мкг, 1МЕ/250мкг, 1МЕ/300мкг, 1МЕ/350мкг, 1МЕ/400мкг, 1МЕ/450мкг, 1МЕ/500мкг, 1МЕ/550мкг, 1МЕ/600мкг, 1МЕ/700мкг, 1МЕ/800мкг, 1МЕ/1000мкг, 1МЕ/1500 мкг и 1МЕ/2000 мкг. В одном из вариантов осуществления соотношение ИОВБ и адъюванта PIKA составляет 1МЕ/500мкг. В одном из вариантов осуществления ИОВБ составляет 2,0 МЕ на одну дозу, а количество адъюванта PIKA составляет 1000 мкг на одну дозу. В другом варианте осуществления ИОВБ составляет 4,0 МЕ на одну дозу, а количество адъюванта PIKA составляет 2000 мкг на одну дозу. В другом варианте осуществления ИОВБ составляет 3,0 МЕ на одну дозу, а количество адъюванта PIKA составляет 1000 мкг на одну дозу. В еще одном варианте осуществления ИОВБ составляет 1,0 МЕ на одну дозу, а количество адъюванта PIKA составляет 1000 мкг на одну дозу. В еще одном варианте осуществления ИОВБ составляет 1,0 МЕ на одну дозу, а количество адъюванта PIKA составляет 2000 мкг на одну дозу.
В пределах уровня техники известно, что согласно стандарту ВОЗ, концентрация очищенного антигена в вакцине с инактивированным вирусом бешенства, с адьювантом или без него, составляющая более 2,5 МЕ, определенная на основе теста концентрации NIH или его варианта, подходит для профилактики или пост-контактного лечения заражения вирусом бешенства. В фактическом производстве активность вакцины, как правило, превышает 4,5 МЕ в момент выпуска, но уменьшается при хранении. В пределах срока годности вакцины активность не должна снижаться ниже 2,5 МЕ.
Низкая доза антигена, используемая в настоящем изобретении, может быть потенцирована путем добавления адъюванта PIKA для получения высокоэффективного защитного иммунитета у мышей и обезьян при вакцинации (см. примеры 1-3 и 6). Исследования на животных также свидетельствуют о том, что вакцина от бешенства, содержащая адъювант PIKA, может индуцировать более ранние и более высокие титры производства специфичных антител (см. Пример 1).
Таким образом, полученная в результате композиция вакцины имеет более высокую активность с более низким содержанием антигена. По сути, состав вакцины от бешенства с более низкой дозой антигена снижает затраты на производство и потенциальные побочные эффекты, в то же время эффективно стимулируя иммунный ответ на заражение вирусом бешенства.
Кроме того, мы обнаружили, что полученная в результате вакцина от бешенства с адъювантом PIKA показывает высокую термостабильность, в случае, если добавляется вышеуказанное количество ЧСА и мальтозы в отсутствие желатина. ЧСА и мальтоза известны как стабилизирующий агент вакцины против бешенства; однако было неизвестно, что комбинация их определенных количеств в составе вакцины в соответствии с настоящим изобретением обладает термостабильностью.
Процесс производства композиции вакцины от бешенства
Если не указано иное, любой доступный антиген вируса бешенства может использоваться для изготовления композиции вакцины от бешенства в соответствии с настоящим изобретением. Наиболее часто используемые штаммы вируса бешенства для производства вакцин включают, не ограничиваясь нижеперечисленным, штамм CTN-1, штамм aG, штамм Pitman Moore (PM), штамм Kissling контрольного вируса (КВ) или штамм Flury на низком (НП) или высоком (ВП) уровне пассажей в яйцеклетках, фиксированный штамм Evelin Rokitniki Abelseth (ERA) вируса Street-Alabama-Dufferin (SAD) и различные варианты вируса SAD.
В одном из конкретных вариантов осуществления инактивированный очищенный антиген для вакцины от бешенства получают из штамма aG вируса бешенства, культивированного в линии клеток почки хомяка (PHK). Вирус подготавливают и перфузируют в клетку PHK. Клетки затем культивируют в среде культивирования вируса, после чего собирают для получения раствора, содержащего вирусы.
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения инактивированный очищенный антиген для вакцины от бешенства получают из штамма вируса бешенства CTN-1, который культивируется в клетках линии Vero. Штамм вируса бешенства CTN-1 инокулируют и перфузируют в клеточную линию Vero, а затем собирают для получения раствора, содержащего вирусы.
Полученный таким образом вирус-содержащий раствор затем подвергается процессам концентрации и инактивации для производства инактивированного антигена. Инактивированный очищенный вирус-содержащий раствор затем получают с помощью колоночной хроматографии после добавления ЧСА (см. рис. 1 для иллюстрации производственного процесса). В одном конкретном варианте осуществления количество ЧСА, подходящего для композиции вакцины согласно настоящему изобретению, составляет 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5% по концентрации, либо попадает в диапазон между любыми двумя из вышеуказанных значений.
2
В одном из вариантов осуществления адъювант PIKA изготовлен из одноцепочечных полинуклеотидных полимеров, PolyI и PolyC, к которым добавляется моно-канамицина сульфат (канамицин) и хлорид кальция (CaCl), для получения готового адъюванта. В некоторых вариантах осуществления pH адъюванта PIKA составляет 6,0, 6,05, 6,1, 6,15, 6,2, 6,25, 6,3, 6,35, 6,4, 6,45, 6,5, 6,55, 6,6, 6,65, 6,7, 6,75, 6,8, 6,85, 6,9, 6,95, 7,0 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,35, 7,4, 7,45, 7,5, 7,55, 7,6, 7,65, 7,7, 7,75 и 7,8, 7,85, 7,9 7,95, 8,0, либо попадает в диапазон между любыми вышеуказанными двумя значениями pH: 6,0, 6,05, 6,1, 6,15, 6,2, 6,25, 6,3, 6,35, 6,4, 6,45, 6,5, 6,55, 6,6, 6,65, 6,7, 6,75, 6,8, 6,85, 6,9, 6,95, 7,0 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,35, 7,4, 7,45, 7,5, 7,55, 7,6, 7,65, 7,7, 7,75, 7,8, 7,85, 7,9, 7,95 и 8,0. В некоторых конкретных вариантах осуществления pH адъюванта PIKA составляет от pH 6.0 до pH 8.0.
В одном из вариантов осуществления композиция вакцины от бешенства производится путем объединения ИОВБ и адъюванта PIKA в фосфатном буфере. ИОВБ и адъювант PIKA смешиваются при рН, составляющем 6,0, 6,05, 6,1, 6,15, 6,2, 6,25, 6,3, 6,35, 6,4, 6,45, 6,5, 6,55, 6,6, 6,65, 6,7, 6,75, 6,8, 6,85, 6,9, 6,95, 7,0 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,35, 7,4, 7,45, 7,5, 7,55, 7,6, 7,65, 7,7, 7,75, 7,8, 7,85, 7,9 7,95, 8,0 или попадающем в диапазон между любыми двумя из следующих значений pH: 6,0, 6,05, 6,1, 6,15, 6,2, 6,25, 6,3, 6,35, 6,4, 6,45, 6,5, 6,55, 6,6, 6,65, 6,7, 6,75, 6,8, 6,85, 6,9, 6,95, 7,0 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,35, 7,4, 7,45, 7,5, 7,55, 7,6, 7,65, 7,7, 7,75, 7,8, 7,85, 7,9, 7,95 и 8,0.
В некоторых вариантах осуществления композиция вакцины от бешенства в соответствии с нынешним изобретением не содержит желатин.
В некоторых вариантах осуществления конечный продукт включает: 2,0 МЕ/мл ИОВБ, 1,0 мг/мл PIKA, 5,0% мальтозы и 0,3% ЧСА. В некоторых других вариантах осуществления композиция вакцины от бешенства в соответствии с настоящим изобретением включает или состоит из: 2,0 МЕ/мл ИОВБ, 2,0 мг/мл PIKA и 0,3% ЧСА. В некоторых других вариантах осуществления композиция вакцины от бешенства в соответствии с настоящим изобретением включает или состоит из: 1,0 МЕ/мл ИОВБ, 2,0 мг/мл адъюванта PIKA и 0,3% ЧСА; либо 1,5 МЕ/мл ИОВБ, 2,0 мг/мл адъюванта PIKA и 0,3% ЧСА; либо 2,0 МЕ/мл ИОВБ, 2,0 мг/мл адъюванта PIKA и 0,5% ЧСА; либо 4,0 МЕ/мл ИОВБ, адъюванта PIKA и 0,5% ЧСА.
Конечный продукт помещается в стерильный флакон с объемом заполнения 1мл/флакон, что составляет одну дозу, а затем закрывается крышкой. Квалифицированному специалисту понятно, что объем наполнения 1мл/флакон подразумевает ошибки оператора. Поэтому объем наполнения 1мл/флакон может варьироваться в пределах от 0,90 до 1,20 мл/флакон, и составлять, например, от 1,10 до 1,12 мл/флакон.
Следует отметить, что объем наполнения не ограничивается 1мл/флакон и может быть любым подходящим значением, составляющим 0,1 мл, 0,2 мл, 0,3 мл, 0,4 мл, 0,5 мл, 0,6 мл, 0,7 мл, 0,8 мл, 0,9 мл, 1,0 мл, 1,2 мл, 1,5 мл, 2,0 мл/флакон или любой объем, попадающий в диапазон между любыми двумя вышеуказанными значениями. В предпочтительном варианте осуществления, когда речь идет о взрослом человеке, слишком большой и слишком малый объем дозы приводит к неудобствам в клинической практике, поэтому объем дозы для человека составляет 1 мл. Таким образом, композиция согласно настоящему изобретению изготавливается в объеме 1 мл/флакон. При применении к детям или другим вакцинируемым, объем наполнения и единичная доза могут быть скорректированы соответствующим образом.
В некоторых вариантах осуществления вакцина от бешенства изготавливается не в жидкой форме, а в соответствующей твердой форме. В таком случае жидкая форма вакцины далее подвергается лиофилизации. Такая твердая форма вакцины от бешенства, при необходимости, упаковывается вместе с водой для инъекций. Вакцину перед применением растворяют в воде, причем окончательный объем инъекции составляет 0,1 мл, 0,15 мл, 0,2 мл, 0,25 мл, 0,3 мл, 0,4 мл, 0,5 мл, 0,6 мл, 0,7 мл, 0,8 мл, 0,9 мл, 1,0 мл, 1,2 мл, 1,5 мл, 2,0 мл, или попадает в диапазон между любыми двумя вышеуказанными значениями.
В одном из вариантов осуществления жидкая форма вакцины от бешенства в подходящей концентрации изготавливается в форме для интраназального применения. В таком случае объем введения вакцины от бешенства колеблется от 0,05 до 0,1 мл, 0,1 мл до 0,15 мл, 0,15 мл до 0,2 мл, 0,2 до 0,25 мл, 0,25 мл до 0,3 мл, 0,3 мл до 0,35 мл, 0,35 мл до 0,4 мл, 0,4 мл до 0,45 мл, 0,45 мл до 0,5 мл или попадает в любой диапазон между любыми двумя из следующих значений: 0,05 мл до 0,1 мл, 0,1 мл до 0,15 мл, 0,15 до 0,2 мл, 0,2 мл до 0,25 мл, 0,25 мл до 0,3 мл, 0,3 до 0,35 мл, 0,35 до 0,4 мл, 0,4 до 0,45 мл, 0,45 до 0,5 мл. Концентрация указанного ИОВБ составляет от 0,05, до 40,0, МЕ/мл, например, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 МЕ/мл, или попадает в диапазон между любыми двумя вышеуказанными значениями.
Безопасность композиции вакцины от бешенства
По существу, способ оценки безопасности лекарственных средств представляет собой способ выявления и уменьшения рисков. Для лекарственных средств, впервые применяемых к человеку, безопасность может быть оценена на определенных видах животных, использованных для тестирования. Переход от данных о токсичности, полученных на животных, к максимальной рекомендуемой безопасной дозе для человека может включать следующие стадии: 1) определение уровня, при котором не наблюдается побочных эффектов (No Observed Adverse Effect Level, NOAEL), 2) преобразование NOAEL в эквивалентную дозу для человека, ЭДЧ (Human Eauivalent Dose, HED) в случае большинства подходящих тестовых видов животных и 3) применение подходящего фактора безопасности (например, 10).
В соответствии с руководящими принципами FDA в области индустрии "Оценка максимальной безопасной стартовой дозы в начальных клинических испытаниях лекарственных средств на взрослых здоровых волонтерах", эквивалентная доза для человека может быть рассчитана на основе доклинических исследований на животных, выбранных из модельных видов животных, описанных в таблице ниже:
Таблица 1: Конверсия доз животного в человеческие эквивалентные дозы
Вид
Референсная масса тела (кг)
Диапазон рабочей массы (кг)
Деление дозы для животного на
Умножение дозы для животного на
Человек
60
---
---
---
Ребенок
20
---
---
---
Мышь
0,02
0,011-0,034
12,3
0,081
Хомяк
0,08
0,047-0,157
7,4
0,135
Крыса
0,15
0,080-0,270
6,2
0,162
Хорек
0,3
0,160-0,540
5,3
0,189
Морская свинка
0,4
0,208-0,700
4,6
0,216
Кролик
1,8
0,9-3,0
3,1
0,324
Собака
10
5-17
1,8
0,541
Приматы:
Обезьяны
3
1,4-4,9
3,1
0,324
Игрунка
0,35
0,140-0,720
6,2
0,162
Обезьяна
0,6
0,290-0,970
5,3
0,189
Павиан
12
7-23
1,8
0,541
Микро-пиг
20
10-33
1,4
0,73
Мини-пиг
40
25-64
1,1
0,946
Любое из вышеуказанных животных, подходящих для оценки безопасности исследуемого продукта, может быть выбрано в качестве модельного животного для исследования. Как правило, хотя бы один вид экспериментального животного-грызуна и хотя бы один вид экспериментального животного-примата должен быть выбран для оценки, прежде чем препарат можно будет применить к человеку. Подопытные животные проходят тест на острую токсичность при однократном введении и на долговременную токсичность при многократном введении.
Вакцина от бешенства согласно настоящему изобретению, содержащая адъювант PIKA, была протестирована как на грызунах, так и на приматах и показала отличные характеристики безопасности (см. более подробное описание тестов на безопасность в примерах 5 и 7).
Стабильность композиции вакцины от бешенства
Перед применением вакцины обычно проходят транспортировку или хранение. Обычно срок годности вакцины составляет от 1 до 3 лет. Поэтому для обеспечения нужной концентрации вакцины в момент введения требуется, чтобы вакцина была термостабильна. Из-за высокой распространенности заболевания бешенством вакцины обычно отправляются в страны тропического пояса, где отсутствуют системы транспортировки, обеспечивающие охлаждение. Поставляемые в эти районы вакцины должны быть стабильны при высокой температуре.
Вакцина от бешенства согласно настоящему изобретению протестирована как при температуре 2-8 ° С, так и на 37 °С в течение продолжительного периода времени, что подтверждает ее термостабильность (подробности см. в примере 13).
Наборы для вакцинирования
В некоторых вариантах осуществления наборы для вакцинирования включают композицию вакцины от бешенства в стерильном жидком (например, водном) составе, где состав является стерильным и поставляется в стерильном контейнере, стерильном флаконе, стерильной ампуле или стерильном шприце.
В некоторых вариантах осуществления в набор для вакцинирования входит композиция вакцины от бешенства, лиофилизированный и содержащийся в стерильном контейнере; и контейнер, содержащий стерильную жидкость для растворения лиофилизированной композиции. В некоторых вариантах осуществления в набор дополнительно входят инструкции по растворению лиофилизированной композиции.
Набор для вакцинирования в некоторых вариантах осуществления также дополнительно содержит инструкции по использованию, включая, например, дозировку и частоту введения. В некоторых вариантах осуществления инструкции напечатаны непосредственно на наборе. В других вариантах осуществления инструкции представляют собой печатный материал, предоставляемыми вместе с набором. Инструкции могут также предоставляться в других носителях, например, компакт-дисках, DVD и т.п.
Настоящее изобретение также подразумевает фармацевтический набор, включающий: а) композицию вакцины от бешенства согласно настоящему изобретению, b) контейнер, например, флакон или ампулу, с) инструкции по применению и, при необходимости, d) воду для инъекций. В некоторых конкретных вариантах осуществления для удобства транспортировки и хранения фармацевтический набор готовится в лиофилизированной форме. Таким образом, фармацевтический набор включает или состоит из а) лиофилизированноой композиции вакцины от бешенства, b) флакона, который содержит лиофилизированную вакцину от бешенства, и c) инструкцию по применению. При необходимости, вода для инъекций может быть включена в фармацевтический набор для получения жидкой формы вакцины от бешенства путем растворения перед применением. В некоторых вариантах осуществления инструкция по применению предлагает следующий режим вакцинации: режим "2-2-1", режим "2-2-2", режим "1-1-1" и/или режим "2-1", причем указанный режим "2-2-1" относится к 2-м единичным дозам, вводимым на 0-й день, 2-м единичным дозам, вводимым на 3-й день и 1-й единичной дозе, вводимой на 7-й день; режим "2-2-2" относится к 2-м единичным дозам, вводимым на 0-й, 3-й и 7-й дни; режим "1-1-1" относится к 1-й единичной дозе, вводимой на 0-й, 3-й и 7-й дни; режим "2-1" относится к 2-м единичным дозам, вводимым на 0-й день, и 1-й единичной дозе, вводимой на 7-й день.
Способы введения
Настоящее изобретение также относится к способу индукции иммунного ответа на вирус бешенства путем введения в организм хозяина вакцины от бешенства, содержащей адъювант PIKA в соответствии с настоящим изобретением. Хозяин может быть человеком или другим животным. Вакцинация может осуществляться путем инъекции или ингаляции.
В настоящем документе также приводится композиция вакцины от бешенства для использования в способе лечения. В частности, изобретение относится к композиции вакцины от бешенства для использования в способе лечения или профилактики бешенства. Композиция вакцины от бешенства может быть применена в способе индукции иммунного ответа на вирус бешенства. Композиция вакцины от бешенства полезна в способах медицинского лечения и профилактики, а также в способах индукции иммунного ответа, описанных в настоящем документе.
Кроме того, изобретение предусматривает применение вакцины от бешенства при изготовлении лекарственного средства для лечения или профилактики бешенства. В одном из аспектов настоящее изобретение предусматривает применение композиции вакцины от бешенства в соответствии с настоящим изобретением при изготовлении медикаментов для лечения или профилактики бешенства, вызванного заражением вирусом бешенства. В другом аспекте настоящее изобретение также относится к композиции вакцины от бешенства для лечения или профилактики бешенства, вызванного заражением вирусом бешенства. Лекарственное средство полезно в способах лечения и профилактики, а также способах индукции иммунного ответа, описанных в настоящем документе.
На существующем уровне техники существует два рутинно используемых режима внутримышечных инъекций вакцины: один представляет собой эссенскую схему, включающую 5 инъекций на 0-й, 3-й, 7-й, 14-й и 28-й дни; второй представляет собой загребскую схему, включающую четыре инъекции, из которых две вводятся на 0-й день в разные участки тела, а остальные две инъекции проводятся на 7-й и 21-й день. Однако существующий режим вакцинирования, как правило, ограничен ввиду экстенсивного плана иммунизации, предусматривающего 5 посещений клиники, а также низкого титра антител на раннем этапе иммунизации. С учетом этого настоящее изобретение предоставляет способ лечения заражения вирусом бешенства в ускоренным режиме. В некоторых вариантах осуществления этот способ включает стадию введения вакцины от бешенства согласно настоящему изобретению в организм хозяина, причем указанный хозяин был подвержен контакту с вирусом бешенства. В некоторых вариантах осуществления хозяин является человеком. В некоторых других вариантах осуществления хозяин представляет собой другое животное, например, является грызуном, собакой и обезьяной.
В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ускоренный режим вакцинирования, при котором композиция вакцины от бешенства согласно настоящему изобретению вводится в организм хозяина 5 раз в течение 7 дней после контакта с вирусом бешенства. В некоторых вариантах осуществления композиция вакцины от бешенства вводится хозяину согласно следующему режиму: 1) первая доза на 0-й день после контакта с вирусом, 2) вторая доза на 0-й день после контакта с вирусом, 3) третья доза на 2-й или 3-й день после контакта с вирусом, 4) четвертая доза на на 2-й или 3-й день после контакта с вирусом, 5) пятая доза на 6-й или 7-й день после контакта с вирусом, при необходимости, 6) шестая доза на 6-й или 7-й день после контакта с вирусом, соответственно. В качестве альтернативы, в некоторых других вариантах осуществления, вакцина от бешенства согласно настоящему изобретению вводится хозяину согласно следующему режиму: первая и вторая дозы на 0-й день после контакта с вирусом; третья и четвертая дозы на 2-й или 3-й день после контакта с вирусом; и пятая и/или шестая дозы на 7-й день после контакта с вирусом, соответственно.
В другом аспекте настоящее изобретение также предусматривает способ профилактики заражения вирусом бешенства, и композицию вакцины от бешенства для использования этим способом. В некоторых вариантах осуществления этот способ включает стадию введения вакцины от бешенства согласно настоящему изобретению в организм хозяина, причем указанный хозяин не был подвержен контакту с вирусом бешенства. В некоторых вариантах осуществления хозяин является человеком. В некоторых других вариантах осуществления хозяин представляет собой другое животное, например, является грызуном, собакой и обезьяной. В некоторых вариантах осуществления состав вакцины от бешенства согласно настоящему изобретению вводится хозяину 3 раза в течение 7 дней. В некоторых вариантах осуществления состав вакцины от бешенства вводится хозяину согласно следующему режиму: 1) первая доза на 0-й день; 2) вторая доза на 0-й день; и 3) третья доза на 7-й день, соответственно. Профилактические меры включают воздействие на субъекта, особенно человека, который не имеет этого заболевания или не имеет симптомов заболевания. В частности, предпочтительными способами предотвращения бешенства, или профилактики, являются способы преконтактной профилактики (преКП), в которых вакцина вводится до того, как объект подвергается контакту, или риску контакта, с вирусом бешенства. Этот субъект может быть определен как предрасположенный к заболеванию или подверженный риску заболевания. В случае бешенства этот субъект может быть определен как предрасположенный к заболеванию бешенством или подверженный риску заболевания бешенством. Причинами могут быть, например, посещение или намерение посетить страну или место, где, как известно, распространено бешенство, или работа с вирусом или с животными.
В контексте настоящего изобретения, вакцинация осуществляется посредством парентеральной инъекции, внутримышечной инъекции, интраперитонеальной инъекции, внутривенной инъекции, подкожной инъекции, местного нанесения, трансдермального введения и внутрикожного введения. В некоторых вариантах осуществления вакцинация животных может осуществляться путем интраперитонеальной инъекции. В некоторых других вариантах осуществления вакцинация человека осуществляется путем внутримышечной инъекции или внутривенной инъекции. В другом варианте осуществления вакцинация осуществляется посредством ингаляции, ректального введения, назального введения, оральным способом (включая ингаляцию).
Примеры
Пример 1. Гуморальный иммунный ответ и тест с контрольным заражением у мышей
Протоколы:
Протокол 1: Гуморальный иммунный ответ
Мышам OF1 вводили ИОВБ (штамм PV, наработанный в клетках BHK 21, 0,2 МЕ) в присутствии или отсутствие PIKA (75 мкг) на 0-й, 3-й, 7-й, 14-й и 30-й дни. Образцы крови отбирали 5 раз в течение 60-дневного периода после иммунизации и определяли содержание в них вирус-нейтрализующих антител с помощью быстрого теста на ингибирование флуоресцентного свечения (RFFIT), а также IgG, IgM с применением иммуноферментного анализа (ELISA).
Протокол 2: Тест с контрольным заражением
6
2
3
Мышей OF1 заражали подкожным введением вируса бешенства дикого типа (5 × 10 icLD50), после чего вводили им только адъювант PIKA (50 мкг), высокую или низкую дозу ИОВБ (0,1 или 0,2 МЕ, штамм PV) без адъюванта, с 50 мкг AlО или с 50 мкг PIKA на 6-й час, 3-й и 7-й дни после заражения. Наблюдали процент выживания мышей.
Краткое изложение выводов:
(1) замечено, что гуморальный иммунный ответ (т.е. титр антител согласно тесту RFFIT) выше у животных, получивших вакцину от бешенства с адъювантом PIKA. В то же время композиция вакцины с адъювантом PIKA может индуцировать более высокие титры производства IgG и IGM уже на 4-й день после иммунизации. Композиция вакцины с алюминий-содержащим адъювантом уменьшает титр антител на раннем этапе. Титры антител IgG, производимых составом вакцины от бешенства с адъювантом или без него, представлены на рисунке 3.
(2) в тестах с введением летальной дозы контрольного вируса, в которых 95% мышей умирали в отсутствие вакцинации или при использовании вакцины с алюминиевым адъювантом, вакцина от бешенства с адъювантом PIKA обеспечили 90% защиту даже при использовании субоптимального уровня ИОВБ (0,1 МЕ). Все мыши, иммунизированные с оптимальным уровнем ИОВБ (0,2 МЕ) с PIKA адъювантом, выжили, в то время как только 30% мышей выжили при иммунизации с оптимальным уровнем ИОВБ и алюминиевым адъювантом.
В результате, композиция вакцины от бешенства, включающая PIKA адъювант, могла индуцировать в 6-7 раз более высокие титры нейтрализующих антител после иммунизации по сравнению с традиционной вакциной с алюминий-содержащим адъювантом. Высокий уровень IgG поддерживается в течение 60-дневного периода наблюдения, что обеспечивает долгосрочную гуморальную защиту после иммунизации.
Более раннее производство нейтрализующих антител может также обеспечить более эффективную защиту пациентов, получивших вакцинацию после контакта с вирусом. Можно сделать более прямой вывод, поскольку все мыши, иммунизованные вакциной от бешенства с адъювантом PIKA, выжили, несмотря на летальную дозу контрольного вируса.
Пример 2. Клеточный иммунный ответ у мышей
2.1. Индукция T-клеточного фактора роста IL-2 и пролиферации спленоцитов in vitro
3
3
Протокол: Мышей линии C3H подкожно иммунизировали PBS (контроль) либо ИОВБ (0,1 МЕ) с адъювантом PIKA или без него (10 мкг). Через неделю мышей забивали и выделяли спленоциты для оценки производства IL-2 по способу Гиллиса. В кратком изложении, спленоциты культивировали и стимулировали контрольным воздействием, ИОВБ, адъювантом PIKA или ConA. Затем по прошествии 24 часов собирали и фильтровали супернатант перед титрованием IL-2. Супернатант добавляли в культуру клеток CTLL, рост которой зависит от присутствия IL-2. Продукцию IL-2 титровали, измеряя пролиферацию клеток CTLL. Кроме того, H-тимидин добавляли для определения пролиферации спленоцитов путем измерения поглощения H-тимидина после стимуляции.
Краткое изложение выводов: композиция вакцины от бешенства, содержащая 0,1 МЕ ИОВБ и 10 мкг адъюванта PIKA, увеличивала эффективность производства IL-2 и пролиферацию спленоцитов. При использовании в стимуляции in vitro, один лишь адъювант PIKA индуцирует слабое производство IL-2 и высокую скорость пролиферации спленоцитов, что указывает на участие адъюванта PIKA в нескольких клеточных механизмах активации спленоцитов помимо T-хелперов, требующих IL-2.
2.2. Активация макрофагов
Протокол: 3 группы мышей линии Kunming (средний вес 20 г) иммунизировали контрольным солевым раствором либо 0,1 МЕ ИОВБ с адъювантом PIKA или без него (10 мкг). Мышам вводили вышеуказанные композиции интраперитонеально на 0-й, 3-й, 7-й и 14-й дни. Перитонеальные макрофаги собирали и изолировали через 4 часа после каждой иммунизации для микроскопирования. Фагоцитарную активность макрофага подсчитывали, и результаты представили в таблице ниже:
Таблица 2: Фагоцитарный индекс макрофагов
Группа
День 0
День 3
День 7
День 14
Контроль с введением солевого раствора
11%(0,13)
31%(0,47)
34%(0,49)
6%(0,12)
ИОВБ
4%(0,09)
10%(0,12)
27%(0,45)
12%(0,14)
ИОВБ+PIKA
82%(1,48)
70%(1,9)
66%(2,46)
45%(1,14)
Примечание: Проценты показывают количество макрофагов с фагоцитарной активностью по сравнению с количеством макрофагов без фагоцитарной активности; число в скобках показывает количество красных кровяных телец, поглощенных одним макрофагом.
В таблице 2 показано, что адъювант PIKA способствует активности макрофагов, а ИОВБ сам по себе ингибирует активацию макрофагов.
2.3. Увеличение производства интерферона-γ (ИФН-γ)
Антиген вируса бешенства (0,1 или 0,2 МЕ), наработанный в клетках PHK с адъювантом PIKA или без него (10 или 50 мкг) по сравнению со стандартом. Мышей линии BALB/c имуннизировали интраперитонеально одной или двумя дозами вышеуказанных трех композиций на 0-й день либо на 0-й день и 7-й день, соответственно. Мышей забивали через 7 дней после иммунизации (т.е. на 7-й день, получивших одну дозу, и на 14-й день для мышей, получивших две дозы). Спленоциты изолировали для оценки выработки ИФН-γ с применением ELISPOT.
Результат: Композиция вакцины от бешенства, содержащая ИОВБ, изготовленный в клетках PHK, и адъювант PIKA, индуцировала выработку ИФН-γ у мышей уже через 7 дней после первой дозы. В группе без адъюванта PIKA не наблюдалось существенного производства ИФН-γ. Мыши, получившие две дозы вакцины от бешенства, содержащей ИОВБ, изготовленный в клетках PHK, и адъювант PIKA (50 мкг), производили в 2 раза больше ИФН-γ, чем мыши стандартной группы. Даже при субоптимальной концентрации адъюванта PIKA (10 мкг), мыши производили значительный уровень ИФН-γ после второй дозы. Это свидетельствует о том, что вакцина от бешенства с адъювантом PIKA, способна обеспечить опосредованный T-клетками иммунный ответ вскоре после иммунизации, и увеличивать его вплоть до 14 дней после иммунизации.
Композиция вакцины от бешенства, содержащая субоптимальный уровень ИОВБ (0,1 МЕ) и (10 мкг) адъюванта согласно вышеприведенным двум примерам, эквивалентна композиции, используемой для человека, содержащей 24,39 МЕ ИОВБ и 2439 мкг адъюванта PIKA в одной дозе (см. Фиг. 1 и Таблицу 1 для конверсии доз). Это означает дозу для человека, составляющую примерно 2.4 МЕ ИОВБ и 240 мкг адъюванта PIKA, если применен широко используемый коэффициент безопасности прочности 10. В случае оптимального уровня ИОВБ (0,2 МЕ) и (50 мкг или 75 мкг) адъюванта, показательная доза для человека составляет около 4 МЕ ИОВБ и 1200 мкг адъюванта PIKA.
Пример 3. Способность адъюванта к потенцированию антигена ИОВБ
50
50
Ту же серия ИОВБ использовали для подготовки композиции вакцин без адъюванта, с адъювантом PIKA и с алюминий-содержащим адъювантом. Мышей иммунизировали различными композициями вакцины от бешенства и заражали инъекцией контрольного вируса в мозг. ED измеряли по способу NIH. Количество добавленного адъюванта и результирующие ED приводятся в таблице 3:
Таблица 3: Тест на активность вакцины от бешенства
Количество адъюванта (мкг)
ED<sub>50</sub>
День 0
День 7
ИОВБ (0,2 МЕ)
0
0
221
ИОВБ (0,2 МЕ)+PIKA
100
100
22
ИОВБ (0,2 МЕ)+Алюминий
1000
1000
132
50
Результаты: В случае композиции вакцины, содержащей адъювант PIKA, ED уменьшилось примерно в 10 раз, тогда как в случае вакцины с алюминиевым адъювантом лишь примерно в 1 раз. В результате, адъювант PIKA в значительно большей степени потенцирует антиген бешенства по сравнению с алюминий-содержащим адъювантом.
Пример 4. Оптимизация состава вакцины
Существующие вакцины от бешенства обычно содержат антиген ИОВБ в концентрации больше 4,5 МЕ. Однако для вакцины от бешенства, содержащей PIKA, согласно настоящему изобретению, предлагаемое содержание антигена составляет < 4,5 МЕ. Это было рекомендовано на основе доклинических испытаний, включая тест на постконтактную защиту, проведенный на сирийском хомячке (пример 5). Результаты показали, что вакцина от бешенства с PIKA, содержащая 2 МЕ антигена, обеспечивает лучшую защиту, чем коммерчески доступная композция вакцины, содержащий > 4,5 МЕ антигена. Как таковые, мы протестировали различные уровни содержания антигена от 0,25 до 3,0 МЕ, в окончательной форме дозы; это может привести к снижению побочных эффектов, а также к снижению стоимости вакцины с сохранением хорошего уровня эффективности при добавлении адъюванта PIKA. Для целей испытания доза PIKA была постоянной и составляла 1,0 мг. Кроме того, также изучалось влияние содержания PIKA и концентрации человеческого альбумина на эффективность вакцины.
4.1. Эффективность вакцин с различными титрами антигена ИОВБ
В то время как содержание других компонентов вакцины от бешенства (PIKA, ЧСА и мальтоза) было постоянным, в таблице 4 ниже приводится эффективность иммунной защиты композиций вакцин с различными титрами антигена:
Таблица 4: Эффективность иммунной защиты вакцин с различными титрами антигена
<b>Группа</b>
<b>Формула</b>
<b>Результат</b>
ИОВБ антигенМЕ/дозу
PIKA(мг/дозу)
ЧСА(%)
Мальтоза(%)
КонцентрацияМЕ/дозу
V-1
0,25
1,0
0
5,0
1,7
V-2
0,5
1,0
0
5,0
3,4
V-3
1,0
1,0
0
5,0
3,0
V-4
1,5
1,0
0
5,0
3,3
V-5
2,0
1,0
0
5,0
4,7
V-6
2,5
1,0
0
5,0
3,7
V-7
3,0
1,0
0
5,0
5,1
Анализ:
Активность вакцины с титрами антигена между 0,5 и 3,0 МЕ/дозу (относительное количество в международных единицах) всегда превышала 2,5 МЕ (относительная активность в международных единицах), что соответствует стандартным требованиям, предъявляемыми к вакцине от бешенства, рекомендованным ВОЗ, а также Фармакопеей Китайской Народной Республики, редакция 2010 года, том 3.
4.2. Эффективность композиции вакцин с различным содержанием адъюванта PIKA
В Таблице 5 приведены значения эффективности иммунной защиты, обеспечиваемой вакцинами с различным содержанием адъюванта PIKA при одном и том же содержании ИОВБ, ЧСА и мальтозы:
Таблица 5: Эффективность иммунной защиты вакцин с различными титрами антигена
<b>Группа</b>
<b>Формула</b>
<b>Результат</b>
ИОВБ антигенМЕ/дозу
PIKA(мг/дозу)
ЧСА(%)
Мальтоза(%)
КонцентрацияМЕ/дозу
P-1
2,0
0,25
0
5,0
6,8
P-2
2,0
0,5
0
5,0
6,0
P-3
2,0
0,75
0
5,0
5,6
P-4
2,0
1,0
0
5,0
4,7
P-5
2,0
1,25
0
5,0
4,4
P-6
2,0
1,5
0
5,0
6,6
P-7
2,0
2,0
0
5,0
8,9
Анализ:
Если количество добавленного адъюванта PIKA составляет от 0,25 до 2,0 мкг/дозу, эффективность результирующей композиции вакцины от бешенства всегда превышала 2,5 МЕ/дозу, что соответствует стандартным требованиям, предъявляемым к вакцине от бешенства, рекомендованной ВОЗ. При использовании в качестве антивирусного лекарственного препарата одобрено многократное применение вплоть до 4 мг PIKA в применении к человеку, что дает хороший терапевтический эффект и хорошо переносится. Кроме того, 1,0 мг адъюванта PIKA использовали в ходе фазы I клинических испытаний на людях для потенцирования антигена бешенства с хорошей профилактической эффективностью. Таким образом, количество адъюванта PIKA колеблется от 0,25 до 4 мг PIKA, что должно быть безопасно и эффективно при добавлении в окончательный состав вакцины.
4.3. Влияние концентрации ЧСА на стабильность вакцины от бешенства
В таблице 6 приведены данные по стабильности лиофилизованной вакцины от бешенства с содержанием PIKA при различных концентрациях ЧСА:
Таблица 6: Влияние концентрации ЧСА на стабильность вакцины от бешенства
<b>Группа</b>
<b>Формула</b>
<b>Результат (активность вакцины)</b>
ИОВБ антигенМЕ/дозу
PIKA(мг/дозу)
ЧСА(%)
Мальтоза(%)
Активность на 0-й месяцМЕ/дозу
Увеличение стабильностиМЕ/дозу
H-1
2,0
1,0
0
5,0
4,7
4,9
H-2
2,0
1,0
0,1
5,0
5,5
6,9
H-3
2,0
1,0
0,2
5,0
7,8
4,6
H-4
2,0
1,0
0,3
5,0
7,9
10,5
H-5
2,0
1,0
0,5
5,0
10,9
7,2
H-6
2,0
1,0
1,0
5,0
9,1
5,5
Анализ:
В то время как остальные концентрации (антиген, PIKA и мальтоза) сохранялись постоянными, активность вакцины и увеличение стабильности всегда составляли более 2,5 МЕ, если концентрация ЧСА составляла от 0 до 1,0%. Эти результаты отвечают стандартным требованиям ВОЗ в отношении аналогичной продукции на рынке.
Таким образом, сбалансированный состав композиции вакцины от бешенства, содержащей адъювант PIKA, включает ИОВБ - 2,0 МЕ; адъювант PIKA - 1,0 мг; человеческий альбумин - 0,3% (3мг в 1мл окончательной композиции вакцины перед лиофильной сушкой или после растворения); и мальтозы - 5% (т.е. 50 мг в 1 мл окончательной композиции вакцины перед лиофильной сушкой или после растворения).
Пример 5. Тест на постконтактную защиту у сирийских хомячков
50
Протокол: 7 групп из 7-8-недельных самок сирийских хомячков с массой тела 100-150 г (по 15 в группе) заражали 0,1 мл 50 LD дикого штамма BD06 вируса бешенства. Вакцину вводили внутримышечно в область задних лап. Процент выживания животных наблюдали в течение 45 дней. Информация о группах:
Группа 1: - контроль с введением солевого раствора и режимом иммунизации "1-1-1-1-1" (т.е. инъекции одной дозы через 2 часа и 3, 7, 14, 28 дней после заражения);
Группа 2: Коммерчески доступная вакцина от бешенства (штамма ИОВБ "flurry LEP", наработанный в клетках куриных эмбрионов > 2,5 МЕ) с тем же режимом иммунизации, что и группа 1;
Группа 3: Человеческие антивирусные иммуноглобулины, вводимые в 2-х точках, т.е. половина из 1,5 МЕ вводится в область правой задней лапы, а другая половина - в область левой задней лапы через 2 часа после заражения;
Группа 4: композиция вакцины от бешенства, содержащая штамм ИОВБ КТН-1, наработанный в клеточной линии Vero, и адъювант PIKA, с режимом иммунизации "1-1-1-1-1";
Группа 5: композиция вакцины от бешенства, содержащая штамм КТН-1 ИОВБ, наработанный в клеточной линии Vero, и адъювант PIKA c режимом иммунизации "2-2-1" (т.е. инъекция двойной дозы через 2 часа и 2 дня после заражения и инъекция однократной дозы через 7 дней после заражения).
Группа 6: композиция вакцины от бешенства, содержащая штамм aG ИОВБ, наработанный в клетках PHK, и адъювант PIKA c режимом иммунизации "1-1-1-1-1";
Группа 5: композиция вакцины от бешенства, содержащая штамм aG ИОВБ, наработанный в клетках PHK, и адъювант PIKA c режимом иммунизации "2-2-1" (т.е. инъекция двойной дозы через 2 часа и 2 дня после заражения и инъекция однократной дозы через 7 дней после заражения).
Композиции вакцин: композиция вакцины от бешенства, используемая в группах 4-5, содержащих 2,0 МЕ/мл ИОВБ, 1000 мкг/мл адъюванта PIKA, 5% мальтозы и 0,3% ЧСА, введенная с единицей дозы 0,1 мл, эквивалентна дозе для человека в расчете на массу тела, а именно, 10,8 МЕ ИОВБ и 5405 мкг адъюванта PIKA на одну дозу (см. Фиг. 1 и Таблицу 1 для конверсии доз). При делении на коэффициент безопасности, равный 10, этот тест показателен для дозы в применении к человеку, составляющей примерно 1,0 МЕ ИОВБ и 500 мкг PIKA.
Краткое изложение выводов: Коммерчески доступная вакцина от бешенства со стандартным режимом иммунизации обеспечивает ограниченную защиту по результатам теста на постконтакную защиту, в то время как композиция вакцины от бешенства может обеспечить гораздо более эффективную защиту с применением того же самого режима. Как вакцина от бешенства с содержанием PIKA и улучшенным режимом, так и пассивная иммунизация иммуноглобулинами защищала 80% животных (p < 0,005). Коэффициент защиты для всех тестовых групп показан ниже:
Таблица 7: Тест на постконтакную защиту на сирийском хомячке
Разбиение на группы
Общее количество животных
Количество выживших животных
Количество умерших животных
СмертиДоля (%)
Уровень защиты (%)
<b>1</b>
Контроль с введением солевого раствора
15
1
14
93,3
/
<b>2</b>
Вакцина от бешенства Novartis(1-1-1-1-1)
15
3
12
80,0
20,0
<b>3</b>
Иммуноглобулин
15
12
3
20,0
80,0
<b>4</b>
Вакцина от бешенства c PIKA (1-1-1-1-1), клетки Vero
15
10
5
33,3
66,7
<b>5</b>
Вакцина от бешенства c PIKA (2-2-1), клетки Vero
15
12
3
20,0
80,0
6
Вакцина от бешенства c PIKA (1-1-1-1-1), клетки PHK
15
7
8
53,3
46,7
7
Вакцина от бешенства c PIKA (2-2-1), клетки Vero
15
10
5
33,3
66,7
В заключение, коммерчески доступная вакцина обеспечивает лишь ограниченную защиту, в то время как описанный в настоящем изобретении композиция вакцины от бешенства обеспечивает значительно более сильную защиту. С помощью ускоренного режима "2-2-1" (т.е. двойной дозы для первых двух инъекций), композиция вакцины от бешенства, содержащая КТН-1 штамм ИОВБ, наработанный в клетке Vero, и адъювант PIKA, может обеспечить уровень защиты от иммуноглобулинов, сходный с защитой, обеспечиваемой человеческими иммуноглобулинами от бешенства.
Пример 6. Тест на постконтактную защиту на мышах
Протокол: Четыре группы мышей (по 20 в каждой группе), зараженные высокой дозой вируса бешенства CQ92, были иммунизованы 0,06 мл коммерческой вакцины от бешенства из различных источников, композицией вакцины от бешенства, содержащего адъювант PIKA или PBS в качестве отрицательного контроля на 0-й, 3-й, 6-й и 9-й дни.
Композиции вакцин: композиция вакцины от бешенства, содержащая адъювант PIKA, используемая в группе 1, содержащая 1,5 МЕ/мл ИОВБ штамма PM, 1000 мкг/мл адъюванта PIKA и 0,3% ЧСА, объем одной дозы 0,06 мл, что эквивалентно составу для применения к человеку, содержащему 21,95 МЕ ИОВБ и 14634 мкг адъюванта PIKA на одну дозу (см. Фиг. 1 и Таблицу 1 для конверсии доз). Это показательно для человеческой дозы, составляющей примерно 2 МЕ ИОВБ и 1500 мкг адъюванта PIKA, если применен широко используемый коэффициент безопасности 10.
Мышей затем наблюдали в течение 21 дня после последней инъекции. Проценты выживаемости показаны в таблице 8 ниже:
Таблица 8: Тест на постконтактную защиту на мышах
Разбиение на группы
Доза антигена (МЕ/мл)
Доза адъюванта (мкг/мл)
Число выживших животных
Число погибших животных
Процент выживания
1
PIKA-содержащая вакцина от бешенства
1,5
1000 PIKA
16
4
80%
2
Вакцина сравнения (Франция)
2,5
-
2
18
10%
3
Вакцина сравнения (Китай)
2,5
1000 Алюминий
3
17
15%
4
Контроль PBS
-
-
4
16
20%
Краткое изложение выводов: Мыши из групп вакцин сравнения приобретают уровень защиты, сходный с мышами из контрольной группы, при введении летальной дозы контрольного вируса. Вакцина от бешенства с PIKA подтверждает 80% защиты мышей при испытании на постконтактную защиту при использовании более низкой дозы антигена. В кратком изложении, композиция согласно настоящему изобретению значительно повышает степень защиты, обеспечиваемый вакциной от бешенства, против заражения смертельной дозой у мышей, имея при этом более низкое содержание антигена.
Пример 7. Исследование острой токсичности на грызунах
Протокол: Пяти группам 3-5-недельных мышей линии Kunming (KM), по 20 мышей в каждой группе (10 самцов и 10 самок), массой 20 г в среднем, вводили одну дозу (0,2 мл) композиции вакцины, как указано в таблице ниже:
Таблица 9: Острая токсичность на грызунах
Группа
Тестируемая композиция
Объем инъекции
Содержимое тестируемого материала
PIKAАдъювант
Антиген вируса бешенства
1
Контроль 0,1 М PBS
0,2 мл
-
-
2
Только адъювант PIKA
0,2 мл
200 мкг
-
3
Адъювант PIKA
0,2 мл
200 мкг
-
4
Состав пика PIKA-содержащей вакцины от бешенства (1/2 доза)
0,2 мл
100 мкг
0,2 МЕ
5
Состав пика PIKA-содержащей вакцины от бешенства (полная доза)
0,2 мл
200 мкг
0,4 МЕ
Затем в течение 4 часов после инъекции мышей наблюдали на предмет развития токсических реакций, смерти и аномальных клинических симптомов, после чего следовало ежедневное наблюдение в течение 14 дней. Вес тела измеряли перед первой инъекцией, а также на 1-й, 4-й, 7-й, 11-й и 14-й дни после инъекций. Потребление пищи регистрировали на 1-й, 7-й и 14-й дни после инъекции. Мышей забивали на 14-й день, после чего производился макропатологический анализ следующих органов: сердца, печени, селезенки, легких, почек, надпочечников, мозга, желудка, кишечника, трахеи, семенников, придатков семмеников, матки, яичников, вилочковой железы, лимфатических узлов (включая шейные лимфатические узлы, мезентериальные лимфатические узлы и подвздошные лимфатические узлы), мышцы левой и правой задних конечностей.
Результаты: Животные в исследуемой группе не показали значительных вариаций в потреблении пищи и весе тела по сравнению с группами контроля. В течение 14 дней после введения лекарства не наблюдалось никаких аномальных клинических симптомов, причем все животные пережили максимальную дозу введенного лекарства, без наблюдаемых токсических реакций и аномалий во время визуального осмотра органов.
В заключение, композиция вакцины от бешенства, содержащая адъювант PIKA, хорошо переносится мышами KM вплоть до максимальной дозы 0,4 МЕ антигена вируса бешенства с 200 мкг PIKA. Вводимая мышам вакцина от бешенства содержащую 0,4 МЕ ИОВБ и 200 мкг адъюванта PIKA, имеет широту терапевтического диапазона (ШТД) от 150 до 300 раз, в то время как в применении к человеку следует использовать 2 МЕ ИОВБ и 1000 мкг. Расчет ШТД приводится в таблице 10 ниже:
Таблица 10: Острая токсичность на мышах Kunming - расчет широты терапевтического диапазона
Исследуемые группы
Объем (масса)/инъекция
Эффективная доза
Доза (мл/кг массы тела)
ШТД
Доза для человека
2,0 мл (60 кг массы тела)/инъекция
0,03
/
½ дозы для мышей
0,2 мл (20г массы тела)/инъекция
5,00
150
Полная доза для мышей
0,2 мл (20г массы тела)/инъекция
10,00
300
Пример 8. Испытание на аллергическую реакцию на грызунах
Протокол: Семи группам морских свинок Dunkin-Hartley массой 299,6 г-339,1 г, по 6 животных (3 самца и 3 самки) на группу, каждые два дня внутримышечно вводили три дозы композиций, приведенных в таблице 11 ниже. Затем животные были провоцированы внутривенным введением удвоенной иммунизационной дозы с 10-го по 14-й день после иммунизации:
Таблица 11: Аллергическая реакция у грызунов - иммунизация и график провокаций
Группа
Тестируемая композиция
Иммунизация(0,5 мл/инъекция, 3 инъекции)
Провокация(1 инъекция)
ИОВБДоза
PIKAДоза
Доза
Объем
1
Отрицательный контроль с 0,9% NaCl
-
-
-
1 мл
2
Положительный контроль с БСА
-
-
40 мг
1 мл
3
Только адъювант PIKA
-
1,5 мг
1,0 мг
1 мл
4
Адъювант PIKA+0,3% ЧСА
-
1,5 мг
1,0 мг
1 мл
5
ИОВБ (клетки Vero) без ЧСА
3 МЕ/мл
-
2 МЕ/1,0 мг
1 мл
6
ИОВБ (клетки PHK) без ЧСА
3 МЕ/мл
-
2 МЕ/1,0 мг
1 мл
7
PIKA+ИОВБ (клетки Vero),+0,3% ЧСА (низкая доза)
1,5 МЕ/мл
1,5 мл
1 МЕ/0,5 мг
1 мл
7,1
PIKA+ИОВБ (клетки Vero, без ЧСА, низкая доза)
1,5 МЕ/мл
1,5 мл
1 МЕ/1,5 мг
1 мл
8
PIKA+ИОВБ (клетки Vero),+0,3% ЧСА (высокая доза)
3 МЕ/мл
1,5 мл
2 МЕ/1,0 мг
1 мл
8,1
PIKA+ИОВБ (клетки PHK, без ЧСА, высокая доза)
3 МЕ/мл
1,5 мл
2 МЕ/1,0 мг
1 мл
Результаты: Все животные в группе отрицательного контроля не показали никаких признаков аллергической реакции, в то время как животные в группе положительного контроля начали показывать аллергические реакции в течение 1 минуты после провокации. Симптомы включали в себя: потирание носа, кашель, гемморагическая сыпь, атаксия и спазмы. Животные, которым вводили адъювант PIKA или вакцину от бешенства без человеческого альбумина не демонстрировали какой-либо очевидной аллергической реакции при иммунизации и провокации, в то время как животные, которым вводили адъювант PIKA или вакцину от бешенства, содержащие человеческий альбумин, проявили различные степени аллергической реакции. Двум парам животных (1 самец и 1 самка), выбранных из групп 6 и 7 (с 0,3% ЧСА) дополнительно ввели 1 мл (объем провокации) PIKA-содержащей вакцины с низкой дозой или высокой дозой, но без человеческого альбумина, соответственно (обозначены как группы 6.1 и 7.1). В дополнительном провокационном испытании в отсутствие человеческого альбумина аллергических реакций не отмечено.
В заключение, композиция вакцины от бешенства, содержащая адъювант PIKA, а также адъювант PIKA без добавления человеческого альбумина являются неаллергенными и хорошо переносятся подопытными животными после внутримышечного введения многократных доз вплоть до 3 МЕ антигена вируса бешенства и 1500 мкг адъюванта PIKA. ШТД для композиции вакцины от бешенства, используемой в испытании на аллергическую реакцию, составляет 25 раз для группы низкой дозы и 50 раз для группы высокой дозы. Расчетные значения представлены ниже:
Таблица 12: Аллергическая реакция у морских свинок -расчет широты терапевтического диапазона
Исследуемые группы
Объем/инъекция
Общий объем/Масса тела
Эффективная доза
Общая доза/кг массы тела
ШТД
Доза для человека
1,0 мл
5,0 мл/60кг массы тела
0,03
/
Адъювант PIKA
0,5 мл
2,5 мл/0,3 кг массы тела
8,30
50
Группа низкой дозы
0,5 мл (разбавление 1/2)
2,5 мл/0,3 кг массы тела
4,17
25
Группа высокой дозы
0,5 мл (стандартная концентрация)
2,5 мл/0,3 кг массы тела
8,30
50
Пример 9. Исследование хронической токсичности при повторных дозах и их эффективности на приматах
Протокол для определения безопасности: Четырем группам 2-3-летних макак-резусов, по 8 животных в группе (4 самца и 4 самки) с массой тела от 2,5 кг до 4,0 кг в весе, вводили PIKA-содержащую вакцину против бешенства в увеличивающейся дозировке (две группы), только PIKA либо 0,9% NaCl (контрольная группа) путем инъекции в дельтовидную мышцу 5 раз в течение 6 недель, а именно, на 0-й, 2-й, 7-й, 28-й и 42-й дни. Первые две инъекции делали в два участка (т.е. двойная доза), см. ниже в таблице 13.
Таблица 13: Исследуемые группы по хронической токсичности приматов
Группа
Тестируемая композиция
Содержание на дозу
Объем
Пика (мкг)
ИОВБ(МЕ)
Контроль
На одну инъекцию
Всего
1
Контроль
/
/
0,9% NaCl
0,5 мл
3,5 мл
3
1000 мкг/мл адъюванта PIKA+0,3% альбумин
1,000
/
/
0,5 мл
3,5 мл
4
500 мкг/мл адъюванта PIKQ+1 МЕ/мл ИОВБ+0,3% ЧСА(низкая доза)
500
1 МЕ
/
0,5 мл
3,5 мл
5
1000 мкг/мл адъюванта PIKA+2 МЕ/мл ИОВБ+0,3% ЧСА (высокая доза)
1,000
2 МЕ
/
1.0 мл
7.0 мл
Место инъекции и системные клинические симптомы у обезьян наблюдали несколько раз до и после иммунизации. Образцы крови отбирали 4 раза, на 0-й (т.е. в период карантина у животных), 44-й и 70-й день. Образцы крови использовались для исследований гематологии, свертывания крови и биохимии сыворотки.
Протокол исследования на эффективность: Гуморальный иммунный ответ и активность измеряли на 44-й и 70-й дни. Два самца и две самки обезьян были умерщвлены на 45-й и 70-й дни для гистологического исследования. Органы взвешивали, готовили срезы и фиксировали их перед окрашиванием для исследования с помощью светового микроскопа.
Результаты:
1. У всех животных, которым вводили адъювант PIKA или PIKA-содержащую вакцину от бешенства, не наблюдалось никаких аномальных местных или системных клинических симптомов. Все значения в тесте попадали в диапазон шума данных, никаких значительных изменений не отмечено не было. Не было выявлено значительных различий в массе различных органов между контрольной и другими тестируемыми группами.
2. Гуморальные иммунные ответы, представленные геометрическими средними титров специфических к вирусу бешенства IgG и активностью нейтрализующих антител в сыворотке крови, были оценены с помощью тестов ИФА и FAVN, соответственно. Таблицы 14-15 и Фиг. 4-5 иллюстрируют увеличение иммунного ответа у приматов, которым ввели PIKA или PIKA-содержащую вакцину от бешенства.
Таблица 14: IgG в сыворотке крови (ИФА)
Дни, в которые проводился тест
Только PIKA
Вакцина с PIKA(половина)
Вакцина с PIKA(полная доза)
44-й день
11,396
48,062
93,256
70-й день
8,879
20,552
55,550
Таблица 15: Активность (тест FAVN)
Дни, в которые проводился тест
Контроль PBS
PIKA
Вакцина с PIKA (половина)
Вакцина с PIKA (полная доза)
44-й день
0,115
0,113
4,795
7,366
70-й день
0,115
0,890
5,653
5,670
На 44-й день группы обезьян, которым вводили низкую и высокую дозу PIKA-содержащей вакцины от бешенства, индуцировали в среднем 4,795 и 7,366 МЕ нейтрализующих антител, соответственно, что соответствует 9,6 и 14,7 раз более высокому уровню защиты, чем требуемый ВОЗ. Активность нейтрализующих антител немного снизилась до 5,653 в группе высокой дозы и увеличилась до 5,670 в группе низкой дозы на 70-й день.
В заключение, композиция вакцины от бешенства, содержащая ИОВБ, наработанный в клетках Vero, хорошо переносится и показывает хорошую иммуногенность у макак-резусов после многократных внутримышечных инъекций на протяжении периода наблюдения в 84 дня. Специфические антитела имеют важное значение для нейтрализации свободного вируса и борьбы с инфекцией вируса бешенства.
Расчет широты терапевтического диапазона (ШТД) приводится в таблице 16 ниже и определяется следующим: ШТД=полная протестированная доза для приматов (мг/кг)/Предлагаемая полная доза для человека (мг/кг).
Таблица 16: Хроническая токсичность у приматов - широта терапевтического диапазона
Исследуемые группы
Объем/Инъекция (режим)
Общий объем/Масса тела
Эффективная доза
Общая доза/кг
ШТД
Доза для человека
1,0 мл (2-2-1)
5,0 мл/60кг массы тела
0,083
/
Группа половинной дозы
0, 5 мл (2-2-1-1-1)
3,5 мл/3кг массы тела
1,667
14
Группа полной дозы
1,0 мл (2-2-1-1-1)
7,0 мл/3кг массы тела
2,333
28
Широта терапевтического диапазона для PIKA-содержащей вакцины от бешенства, в случае если для взрослого человека используется 2 МЕ ИОВБ и 1000 мкг адъюванта PIKA с 0,3% ЧСА по сравнению с дозировкой, использованной для теста токсичности на обезьянах, составляет 28 раз для группы полной дозы и 14 раз для группы половины дозы.
Пример 10. Проверка безопасности и эффективности на здоровых добровольцах
Проводилась фаза I клинических испытаний композиции вакцины от бешенства, содержащей адъювант PIKA (1 МЕ ИОВБ и 1000 мкг адъюванта PIKA). Здоровые добровольцы были разбиты на три группы по 10 добровольцев в каждой группе. Добровольцам в каждой группе вводили PIKA-содержащую вакцину от бешенства или вакцину сравнения (9.4 МЕ ИОВБ) без адъюванта на 0-й, 3-й, 7-й, 14-й и 28-й дни. Образцы крови отбирали на 0-й, 7-й, 10-й, 30-й и 60-й дни для оценки титра нейтрализующих антител, результаты которой показаны ниже:
Таблица 17: Титр нейтрализующих антител (МЕ/мл)
Дни
Вакцина сравнения
PIKA-содержащая вакцина от бешенства
0
0
0
7
0
0,13
10
0,25
0,42
30
3,24
5,32
60
8,55
17,81
Краткое изложение выводов: В ходе испытания не наблюдалось никаких явных неблагоприятных эффектов. Вакцина от бешенства, содержащая адъювант PIKA, индуцировала выработку антител уже на 7-й день после первичной иммунизации. По отношению к вакцине сравнения, PIKA-содержащая вакцина от бешенства индуцировала более ранний и более высокий титр нейтрализующих антител.
Пример 11. Ранняя индукция выработки антител у здоровых добровольцев
В ходе другого пилотного испытания, в котором участвовали 4 здоровых добровольца, им вводили композицию вакцины от бешенства, содержащую 2 МЕ ИОВБ и 1000 мкг адъюванта PIKA согласно режиму "2-2-1" с инъекциями на 0-й, 3-й и 7-й дни (т.е. в общей сложности 4 МЕ ИОВБ и 2000 мкг адъюванта PIKA вводили на 0-й и 3-й день в два разных участка). Образцы крови отбирали на 0-й, 7-й и 14-й дни после иммунизации. В таблице 18 приведены оценки гуморального иммунного ответа.
Таблица 18: Средний титр нейтрализующих антител (МЕ/мл) у 4 человек
День 0
День 7
День 14
Средний титр антител
0,00
1,08
18,06
Краткое изложение выводов: Четыре добровольца не сообщили о каких-либо явных неблагоприятных эффектах в ходе испытания. Композиция вакцины от бешенства индуцировала нейтрализующие антитела с активностью выше 0,5 МЕ уже на 7-й день после первичной иммунизации. В соответствии со стандартом ВОЗ, это считается достаточной степенью защиты. Таким образом, доза вакцины вплоть до 4 МЕ ИОВБ и 2000 мкг адъюванта PIKA для первых двух инъекций безопасна и эффективна в плане обеспечения раннего и высокого уровня иммунной защиты у человека.
Пример 12. Долговременный иммунный ответ у здоровых добровольцев
Здоровые добровольцы были иммунизированы вакциной от бешенства, содержащей 1,5 ИОВБ и 1000 мкг/мл адъюванта PIKA. Периферические мононуклеарные клетки крови выделяли из образцов крови, отобранных через 2,5 года после иммунизации. Клетки стимулировали PBS (контроль) или разными уровнями ИОВБ и тестировали на производство интерферона гамма с помощью анализа ELISPOT. Результаты показали, что добровольцы по-прежнему вырабатывают значительный уровень интерферона гамма при стимуляции через 2,5 года после иммунизации вакциной от бешенства, содержащей адъювант PIKA.
Пример 13. Анализ стабильности лиофилизованной вакцины от бешенства
Для анализа стабильности композиции вакцины были запланированы долгосрочные испытания на устойчивость при температуре от 2 до 8 °С и краткосрочное испытание при 37 °С. Проверке подвергнуты четыре серии лиофилизованной вакцины от бешенства (1.0 мл/флакон) (номера серий II-20130401, II-20130402, II-20130501 и II-20130901).
Композиции
Номер серии II-20130402, в композицию вакцины от бешенства входят:
2,0 МЕ/доза ИОВБ, 1000 мкг/доза адъюванта PIKA, 5,0% мальтозы, 0,3% ЧСА и 7,60 ± 0, 05 буфера PBS.
Номер серии II-20130401, в композицию вакцины от бешенства входят:
1,5 МЕ/доза ИОВБ, 2000 мкг/доза адъюванта PIKA, 5,0% мальтозы, 0,3% ЧСА и 7,60 ± 0,05 буфера PBS.
Номер серии II-20130501, в композицию вакцины от бешенства входят:
2,0 МЕ/доза ИОВБ, 2000 мкг/доза адъюванта PIKA, 5,0% мальтозы, 0,3% ЧСА и 7,60 ± 0,05 буфера PBS.
Номер серии II-20130901, в композицию вакцины от бешенства входят:
4,0 МЕ/доза ИОВБ, 1000 мкг/доза адъюванта PIKA, 5,0% мальтозы, 0,5% ЧСА и 7,60 ± 0,05 буфера PBS.
13.1. Испытание на долгосрочную устойчивость
Четыре серии вышеупомянутых вакцин хранятся при 2-8 °С для испытания на долгосрочную устойчивость, спланированного в соответствии с Китайской и Европейской Фармакопеей на период 42 месяца. К числу тестируемых параметров относятся внешний вид, pH, содержание влаги, эндотоксины, стерильность, концентрация, идентификация, остаточный бычий сывороточный альбумин, остаточный гентамицина сульфат, остатки белка от клеток-хозяев, содержание канамицина, содержание PIKA, молекулярная масса PIKA и остатки ДНК от клеток-хозяев.
Результаты вплоть до 6 месяцев хранения являются удовлетворительными согласно Китайской Фармакопее (редакция 2010 года) и Европейской Фармакопее (редакция Е7.0), при этом концентрация вакцины по-прежнему значительно превышает 2,5 МЕ/мл, требуемые согласно стандарту ВОЗ. С 0-го месяца не наблюдалось никаких существенных изменений внешнего вида, pH, содержания влаги, эндотоксина и стерильности.
13.2. Ускоренный тест на стабильность
Ускоренный тест на стабильность также проводится на трех вышеупомянутых партиях путем хранения вакцины при 37 °С в течение 6 месяцев. Он выступал в качестве предварительного показателя для долгосрочной стабильности. Тесты качества на внешний вид, pH, содержание влаги, эндотоксины, стерильность и концентрацию вакцины проводили на 1-й, 2-й, 3-й и 6-й месяцы, соответственно. В таблице 19 кратко суммированы результаты испытаний по четырем вышеупомянутым сериям вакцины от бешенства.
Таблица 19: Результаты ускоренного теста на стабильность
<i>Номер серии II-20130401</i>
Продолжительность хранения
Тестируемые параметры
Внешний вид
pH
Содержание влаги
Эндотоксины
Стерильность
Концентрация(МЕ)
1 месяц
Квалифицировано
7,4
1,6%
<25
Квалифицировано
6,6
2 месяца
Квалифицировано
7,4
1,6%
<25
Квалифицировано
9,1
3 месяца
Квалифицировано
7,4
1,6%
<25
Квалифицировано
6,2
6 месяцев
Квалифицировано
7,5
1,6%
<25
Квалифицировано
8,1
<i>Номер серии II-20130402</i>
Продолжительность хранения
Тестируемые параметры
Внешний вид
pH
Содержание влаги
Эндотоксины
Стерильность
Концентрация (МЕ)
1 месяц
Квалифицировано
7,4
1,5%
<25
Квалифицировано
4,9
2 месяца
Квалифицировано
7,4
1,5%
<25
Квалифицировано
9,5
3 месяца
Квалифицировано
7,4
1,7%
<25
Квалифицировано
5,5
6 месяцев
Квалифицировано
7,4
1,7%
<25
Квалифицировано
8,1
<i>Номер серии II-20130501</i>
Продолжительность хранения
Тестируемые параметры
Внешний вид
pH
Содержание влаги
Эндотоксины
Стерильность
Концентрация (МЕ)
1 месяц
Квалифицировано
7,4
1,6%
<25
Квалифицировано
5,7
2 месяца
Квалифицировано
7,4
1,6%
<25
Квалифицировано
10,0
3 месяца
Квалифицировано
7,4
1,6%
<25
Квалифицировано
6,2
6 месяцев
Квалифицировано
7,4
1,6%
<25
Квалифицировано
9,1
<i>Номер серии II-20130901</i>
Продолжительность хранения
Тестируемые параметры
Внешний вид
pH
Содержание влаги
Эндотоксины
Стерильность
Концентрация (МЕ)
1 месяц
Квалифицировано
7,5
1,1%
<25
Квалифицировано
7,4
2 месяца
Квалифицировано
7,6
1,1%
<25
Квалифицировано
11,7
3 месяца
Квалифицировано
7,6
1,2%
<25
Квалифицировано
7,2
6 месяцев
---
---
---
---
---
---
Композиции вакцины приготовлены и испытаны в соответствии со стандартом GMP. После хранения при температуре 37°C в течение 1, 2, 3 и 6 месяцев, концентрация вакцины по-прежнему значительно превышает 2,5 МЕ/мл, требуемые согласно стандарту ВОЗ. С 0-го месяца не наблюдалось никаких существенных изменений внешнего вида, pH, содержания влаги, эндотоксинов и стерильности. Эти результаты являются предварительным свидетельством долгосрочной стабильности композиции вакцины от бешенства.