АНТИТЕЛО ПРОТИВ УДЛИНЕННОГО ГЛИКОСФИНГОЛИПИДА I ТИПА, ЕГО ПРОИЗВОДНЫЕ И ПРИМЕНЕНИЕ
ANTI-EXTENDED TYPE I GLYCOSPHINGOLIPID ANTIBODY, ITS DERIVATIVES AND USE THEREOF

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к антителам против удлиненного гликосфинголипида I типа и к их применению при ослаблении интенсивности симптомов, лечении и профилактике заболеваний или расстройств млекопитающих, включая людей, которые возникают вследствие ненадлежащей активности или метаболизма вышеупомянутых гликосфинголипидов; которые возникают вследствие, служат причиной или связанны с; или присутствуют, например, при злокачественном новообразовании, таком как колоректальный рак или другая патология. Антитело интереса может быть применено в терапевтических или диагностических целях. Таким образом, также раскрываются профилактические, иммунотерапевтические и диагностические композиции, содержащие представляющие интерес антитела и их производные, и их применение в способах профилактики или лечения, или диагностики заболеваний у млекопитающих, включая людей, которые вызваны неправильным метаболизмом и/или экспрессией удлиненного гликосфинголипида I типа в и на клетках, например клетках злокачественных новообразований.
Уровень техники
Удлиненный гликосфинголипид I типа является молекулой клеточной поверхности, которая может быть ассоциирована, например, с некоторыми злокачественными состояниями.
a
Было замечено, что аберрантное гликозилирование является распространенным признаком многих типов злокачественных новообразований, Hakomori, PNAS 99: 10231-10233, 2002. Некоторые из углеводных антигенов, используемых в диагностике человеческих злокачественных новообразований, несут полилактозаминные структуры. Полилактозамины, как правило, классифицируют на две категории в соответствии со структурой звеньев. Полилактозамин, имеющий структуру Galβ1→3GlcNAc, называется цепью I типа, а имеющий структуру Galβ1→4GlcNAc называется цепь II типа. Наиболее распространенные ассоциированные с опухолями антигены, обнаруженные в некоторых типах злокачественных новообразований человека, имеют структуру цепи лакто ряда II типа, которая, как правило, является, сиалированной и/или фукозилированной. Антигены с цепью I типа распространены в нормальных клетках и тканях и эпизодически ассоциированы со злокачественными новообразованиями, Stroud et al., JBC 266: 8439-8446, 1991. Например, 2→3 сиалированный антиген Le (антиген СА 19-9, определяемый антителом N 19-9) является антигеном с цепью I типа, который ассоциирован со злокачественными новообразованиями. Однако продвижение способов диагностики злокачественных новообразований, основанных на обнаружении этих антигенов I типа, было затруднено из-за высоких уровней ложноположительных и/или высоких уровней ложноотрицательных результатов, например, см. Пат.США No. 6,083,929 и 6,294,523.
a
a
a
a
Два мышиных моноклонольных антитела, NCC-ST421 и IMH2, были созданы против антигенов с удлиненной цепью I типа. NCC-ST421 является специфичным к Le-Le. Антитело NCC-ST421 индуцирует сильную антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) с помощью периферических лейкоцитов крови, применяемых в качестве эффекторов против множества человеческих опухолевых клеток, и индуцирует коплементзависимую цитотоксичность (CDC) с помощью источника комплемента человека, Watanabe et al., Cancer Res. 51:2199-2204, 1991. Было обнаружено, что антиген Le-Le сильно экспрессируется в клеточной линии карциномы толстой кишки человека, Colo205.
1
b
a
y
x
b
y
IMH2 также был разработан против удлиненных цепей I типа. На основании результатов Н-ЯМР, масс-спектрометрии с бомбардировкой ускоренными атомами (FAB-MS) и ферментативной деградации ясно, что IMH2 связывает Le-Le, Le-Le, Le и Le, Stroud et al., Eur. J. Biochem. 203:577-586, 1992. IMH2 продемонстрировало сильный, активированный лимфоцитами, а также комплементзависимый цитолиз клеток Colo205 in vitro и ингибирование роста Colo205 in vivo.
IMH2 реагирует с тканями карциномы, полученными из толстой кишки, поджелудочной железы, печени и эндометрия. Однако нормальная толстая кишка не демонстрирует реактивность с IMH2. Нормальная печень и поджелудочная железа демонстрируют слабую или сильно ограниченную реактивность в нормальных гепатоцитах и клетках островков Лангерганса. Интенсивность гистохимического окрашивания была намного сильнее в эндометриальных карциномах по сравнению с нормальным эндометрием, Ito et al., Cancer Res. 52:3739-3745, 1992.
И NCC-ST421 и IMH2 демонстрируют ингибирование опухолевого роста в голых мышах, экспрессирующих антиген с удлиненной цепью I типа, но не ингибируют рост опухолевых клеток, в которых не происходит экспрессия антигена с удлиненной цепью I типа.
Из-за избытка структур I типа на нормальных клетках применение антител I типа для диагностики и/или терапевтических целей прежде было невозможно.
Обычные типы лечения злокачественных новообразований, такие как химиотерапия и радиотерапия, показали определенные преимущества у пациентов с различными типами злокачественных новообразований. Однако, несмотря на пользу противоопухолевой активности обычных типов терапии, индуцированная лечением токсичность в нормальных тканях может существенно ухудшить качество жизни пациентов со злокачественными новообразованиями. Усиление дозы для лучшей противоопухолевой активности также ограничено. Моноклональные антитела, нацеливаясь на опухолевые ткани, а не на нормальные ткани, реализуют надежду на направленную цитотоксичность.
Моноклональные антитела (mAb) могут быть разработаны с высокой специфичностью к экспрессированным на опухолевых клетках антигенам и могут проявлять требуемую противоопухолевую активность. Перспективность mAb способствовала разработке мышей, которые продуцируют полностью человеческие mAb. Одним из таких инструментов являются КМ-мыши, Патент США No.7,041,870 и Tomizuka et al., Nat. Genet. 16:133-143, 1997. В КМ-мышах мышиные гены, кодирующие иммуноглобулины, были инактивированы и заменены на человеческие гены антител. Таким образом, КМ-мыши экспрессируют полностью человеческие антитела.
Несколько полностью человеческих антител были успешно разработаны с помощью КМ-мышей.
Например, Motoki et al. разработали человеческое IgG (KMTR2), которое направлено на антителозависимую олигомеризацию TRAIL-R2 и инициирует эффективный апоптотический сигнальный путь и опухолевую регрессию независимо от эффекторной функции хозяина (Clin. Cancer Res. 11(8):3126-3135, 2005; см. Пат. США No.7,115,717 и Imakire et al., Int. J. Cancer 108:564-570, 2004). HD8, полностью человеческое моноклональное антитело, специфичное к человеческому лейкоцитарному антигену, проявляет антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC), а также комплементзависимую цитотоксичность (CDC) in vitro и увеличивает продолжительность жизни мышей со сниженным иммунитетом, инокулированных клеточными линиями неходжкинской лимфомы, Tawara et al., Cancer Sci. 98 (6) 921-928, 2007.
Кроме того, было сообщено о двух человеческих IgM, полученных в КМ-мышах и направленных против углеводных антигенов. НММС-1 специфично распознают новую O-гликановую структуру, положительно реагирующую с карциномами, связанными с мюллеровыми протоками, и демонстрируют комплементзависимую цитотоксичность на человеческих клеточных линиях эндометриального рака матки, SNG-S, Nozawa et al., Clin Cancer Res. 10:7071-7078, 2004. Другое человеческое IgM-антитело, НМОСС-1, распознающее гликопротеин, расположенный на клеточной мембране, реагирует с раком яичника (Suzuki et al., Gynecol. Oncol. 95:290-298, 2004). Поскольку эти два антитела являются IgM, применение этих антител в терапии злокачественных новообразований лимитировано размером молекул и ограничениями при производстве.
Раскрытие сущности изобретения
Настоящее изобретение обеспечивает новые человеческие антитела, фрагменты и их производные, которые специфически связывают удлиненный гликосфинголипид I типа.
Изобретение включает аминокислотные последовательности вариабельной тяжелой и легкой цепей антител и их соответствующие нуклеотидные последовательности.
Другое воплощение изобретения включает гипервариабельные области (complementarity determining regions (CDR)) последовательностей антитела, представляющего интерес для получения связывающих молекул, которые содержат одну или более областей CDR, или областей, полученных из CDR, которые сохраняют способность связывания с удлиненным гликосфинголипидом I типа родительской молекулы, из которой были получены CDR.
Другое воплощение настоящего изобретения включает клеточные линии и векторы, содержащие последовательности антитела настоящего изобретения.
Другое воплощение настоящего изобретения относится к применению антител для приготовления лекарственного средства или композиции для лечения заболеваний и расстройств, ассоциированных с функцией, метаболизмом и экспрессией удлиненного гликосфинголипида I типа.
Другое воплощение настоящего изобретения относится к применению антител в диагностике заболеваний, ассоциированных с атипичной или аномальной биологией и экспрессией гликосфинголипида I типа.
Эти и другие цели были достигнуты разработкой человеческих моноклональных антител против углеводных антигенов с удлиненной цепью I типа. Например, mAb GNX-8 являются человеческими IgG1, полученными из КМ-мышей. GNX-8 демонстрируют CDC-и ADCC-активность на нескольких клеточных линиях колоректального рака человека и ингибируют рост опухолей Colo205 и DLD-1 in vivo. GNX-8 реагируют с первичными и метастатическими колоректальными раками, раками молочной железы, раками поджелудочной железы, а также раками легких, но не с нормальными человеческими тканями и клетками крови.
Дополнительные признаки и преимущества описаны в данном документе и будут ясны из следующего раздела «Осуществление изобретения».
Осуществление изобретения
Изобретение не ограничено конкретной методологией, протоколами, полипептидами, полинуклеотидами, клеточными линиями, векторами или реактивами, описанными в данном документе, потому что вариации могут происходить или могут быть применены без отхода от духа и объема притязаний изобретения. Кроме того, используемая в данном документе терминология необходима только в целях иллюстрации определенных воплощений и не предназначена для ограничения объема притязаний настоящего изобретения. Если иное не определено, все технические и научные термины, и любые акронимы, использованные здесь, имеют те же смыслы, которые вкладываются в них обычным специалистом в данной области. Любой способ и материал или эквивалент, описанный в данном документе, может быть использован в практическом воплощении настоящего изобретения, а в данном документе описаны только примерные способы, устройства и материалы.
Все патенты и публикации, упомянутые в данном документе, включены в данный документ полностью посредством отсылки в целях описания и раскрытия белков, ферментов, векторов, клеток-хозяев и методологий, сообщенных в вышеуказанном, которые могут быть применены с и в настоящем изобретении. Однако ничто в данном документе не должно быть истолковано как признание того, что изобретение не имеет прав на отнесение к более ранней дате, чем такие раскрытия, будучи предшествующим изобретением.
«Заболеванием удлиненного гликосфинголипида I типа» является недомогание, расстройство, заболевание, патология, состояние, нарушение и т.п. которое характеризуется, ассоциировано с или вызвано аномальным метаболизмом, сверхэкспрессией или повышенными уровнями удлиненного гликосфинголипида I типа, например, на клеточной поверхности.
Выражение «по существу идентичный» в отношении последовательности полипептида антитела может толковаться как цепь антитела, демонстрирующая по меньшей мере 70%, 80%, 90%, 95% или большую идентичность последовательности по отношению к эталонной полипептидной последовательности. Термин в отношении нуклеотидной последовательности может толковаться как последовательность нуклеотидов, которая демонстрирует по меньшей мере около 85%, 90%, 95%, 97% или большую идентичность последовательности по отношению к эталонной нуклеотидной последовательности.
Термины «идентичность» или «гомология» могут означать процент нуклеотидных оснований или аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые являются идентичными остаткам соответствующей последовательности, с которой сравнивается кандидат, после выравнивания последовательностей и внесения, при необходимости, разрывов для достижения максимального процента идентичности с полной последовательностью, не рассматривая какие-либо консервативные замены как часть идентичности последовательности. Ни N-концевые, ни С-концевые удлинения или вставки не должны толковаться как уменьшающие идентичность или гомологию. Способы и компьютерные программы для сравнения последовательностей доступны и хорошо известны в данной области. Идентичность последовательностей может быть измерена с помощью программного обеспечения для анализа последовательностей.
Выражения и термины «функциональный фрагмент, вариант, производное или аналог» и т.п., а также их формы, антитела, нуклеиновой кислоты или антигена являются соединением или молекулой, имеющей качественную биологическую активность, общую с полноразмерным антителом или антигеном интереса. Например, функциональным фрагментом или аналогом антитела против удлиненного гликосфинголипида I типа является то, что может связывать молекулу удлиненного гликосфинголипида I типа, или является агонистическим или антагонистическим антителом, которое связывает удлиненный гликосфинголипид I типа. Примером является молекула scFv. Что касается удлиненного гликосфинголипида I типа, то вариантом или его производным является молекула, которая не является идентичной встречающемуся в естественных условиях удлиненному гликосфинголипиду I типа, но еще может быть использована в целях рассматриваемого изобретения, например, не идентичный дикому типу удлиненный гликосфинголипид I типа, тем не менее, может быть использован, например, как иммуноген для получения антител, которые селективно связывают удлиненный гликосфинголипид I типа дикого типа.
«Замещенные» варианты являются теми, которые имеют, по меньшей мере, один аминокислотный остаток, который удален или замещен в естественной последовательности на отличную аминокислоту, вставленную в той же позиции. Замены могут быть одиночными, когда в молекуле замещается только одна аминокислота, или могут быть множественными, когда в одной и той же молекуле замещаются две и более аминокислот. Множественные замены могут происходить в идущих подряд участках. Также одна аминокислота может быть заменена на множество остатков, в случае которых такой вариант содержит и замену, и вставку.
«Инсерционными» вариантами являются те, в которые одна или более аминокислот вставлены непосредственно прилегающими к аминокислоте в определенной позиции нативной последовательности. В непосредственной близости к аминокислоте означает связь либо по α-карбоксильной, либо по α-аминной функциональной группе аминокислоты.
«Делеционными» вариантами называются те, у которых удалены одна или более аминокислот в естественной аминокислотной последовательности. Обычно, делеционные варианты будут иметь одну или более удаленных аминокислот в определенной области молекулы.
Термины «замещенные», «инсерционные» и «делеционные варианты» также применяются аналогично к нуклеиновым кислотам.
Адаптивный иммунный ответ имеет две основные ветви: клеточный иммунный ответ Т-лимфоцитов и гуморальный иммунный ответ В-лимфоцитов, секретирующих антитела. Эпитопы В-клеток могут быть линейными, смежными аминокислотами, или могут быть конформационными (Protein Science (2005) 14, 246). В противоположном случае, Т-клеточные эпитопы являются короткими линейными пептидами, которые отщепляются от антигенных белков и которые представлены в контексте белков главного комплекса гистосовместимости (major histocompatibility complex (MHC)) или, в случае человека, в контексте молекул человеческих лейкоцитарных антигенов (human leukocyte antigen (HLA)) классов I или II. Презентация эпитопа зависит как от связывания МНС-пептида, так и от взаимодействий Т-клеточного рецептора (Т cell receptor (TCR)). МНС-белки сильно полиморфны и каждый связывает ограниченный набор пептидов. Таким образом, определенная комбинация аллелей MHC, присутствующих в хозяине, ограничивает диапазон потенциальных эпитопов, распознаваемых в ходе инфекции.
+
+
+
Два функциональных типа Т-клеток распознаются по экспрессии белков CD8 и CD4, которые обуславливают, будут ли Т-клетки распознавать эпитопы, представляемые I или II классом молекул, соответственно. CD4 Т-эпитопы процессируются после инкапсулирования антигенпрезентирующими клетками в мембраносвязанных везикулах, в которых антиген разрушается протеазами на пептидные фрагменты, которые связывают белки MHC II класса. В противоположном случае, CD8 Т-клетки, как правило, распознают вирусные или аутоантигены, экспрессируемые в клетке, белки, которые в цитозоле расщепляются иммунопротеасомой на более короткие пептиды. После расщепления пептиды транслоцируются транспортером, ассоциированным с антигеном (ТАР - transporter associated with antigen), в эндоплазматический ретикулюм для загрузки на HLAI антигены. CD4 (хэлперные) Т-клеточные эпитопы являются критичными в проведении Т-клеточнозависимых иммунных ответов с белковыми антигенами.
Термин «антитело» применяется в наиболее широком смысле и включает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные анитела), поликлональные антитела, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела), фрагменты антител или синтетические полипептиды, несущие одну или более CDR или несущие полученные из CDR последовательности при условии, что полипептиды демонстрируют требуемую биологическую активность. Антитела и иммуноглобулины являются гликопротеинами, имеющими похожие структурные характеристики. В общем, антитела считаются иммуноглобулинами с определенной или распознанной специфичностью. Таким образом, в то время как антитела демонстрируют специфичность связывания со специфичной мишенью, иммуноглобулины включают как антитела, так и другие антителоподобные молекулы, которые потеряли специфичность к мишени.
1
2
2a
3
4
1
2
H
L
Антитела по изобретению могут быть любым классом (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и т.д.), или подклассом (например, IgG, IgG, IgG, IgG, IgG, IgA, IgA и т.д.) («тип» и «класс» и «подтип» и «подкласс» в данном документе используются взаимозаменямо). Нативные или дикого типа, то есть полученные из не являющегося обработанным искусственно члена популяции, антитела и иммуноглобулины и мономеры полимерных антител, таких как IgA и IgM, как правило, являются гетеротетрамерными гликопротеинами размером 150000 дальтон, состоящими из двух идентничных легких (L) и двух идентичных тяжелых (Н) цепей. Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (V), за которым следуют некоторое число константных доменов. Каждая легкая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (V) и константный домен на другом конце.
Под «не являющийся отработанным искусственно» понимается не обработанный неприродными средствами, такими как иммунизация или трансформация, с целью содержать или экспрессировать инородную антигенсвязывающую молекулу. Дикий тип может относиться к наиболее распространенному аллелю или виду, обнаруженному в популяции, или к антителу, полученному из не являющегося отработанным искусственно животного, а также из естественных аллелей или полиморфизмов, которые возникают естественно и могут быть устойчивыми в популяции, или к варианту или производному, возникшему естественным путем, таким как злокачественное новообразование, что можно сравнить с тем, что получено обработкой, такой как мутагенез, применение рекомбинантных способов и т.п., для изменения аминокислоты антигенсвязывающей молекулы. Применение термина легко выводится и понимается специалистом в контексте предложения, абзаца, концепции, мысли, идеи и так далее, в которых термин найден, используется и т.д.
В данном документе «антитело против удлиненного гликосфинголипида I типа» означает антитело или производный полипептид, который специфично связывается с человеческим удлиненным гликосфинголипидом I типа.
Термин «вариабельный» в контексте вариабельного домена антител относится к некоторым частям соответствующей молекулы, которые отличаются экстенсивно по последовательности между и среди антител и которые могут быть неотъемлемыми при специфическом распознавании и связывании определенного антитела с определенной мишенью. Однако вариабельность не распределяется равномерно на протяжении вариабельных доменов антител.
Вариабельность может быть сконцентрирована в трех сегментах, называемых областями, определяющими комплементарность (complementarity determining regions (CDR); т.е. CDR1, CDR2 и CDR3), также известных как гипервариабельные области, как в легкой цепи, так и в тяжелой цепи вариабельных доменов. Более высоко консервативные части вариабельных доменов называются каркасными областями ((FR) framework regions) или последовательностями. Каждый вариабельный домен природных тяжелой и легкой цепей содержит четыре FR-области, в основном принимающие конфигурацию бета-листа, соединенные тремя CDR, которые образуют петли, соединяющие, и в некоторых случаях формирующие, части структуры-бета-листа. CDR в каждой цепи удерживаются вместе, часто в непосредственной близости, посредством FR-областей и с помощью CDR из другой цепи вносят вклад в образование участка связывания мишени (эпитопа или детерминанты) антитела (см. Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, MD (1987)). Один CDR, например CDR3 тяжелой цепи, может отдельно нести способность специфически связывать сходный эпитоп.
В данном документе нумерация аминокислотных остатков иммуноглобулина производится в соответствии с системой нумерации аминокислотных остатков иммуноглобулина Kabat et al., если не указано иное.
ab
ab'
(ab')2
v
v
ab
(ab')2
Термин «фрагмент антитела» относится к части интактной или полноразмерной цепи антитела, как правило, к связывающей мишень или к вариабельной области. Примеры фрагментов антител включают, но не ограничиваются перечисленным, фрагменты F, F, F и F. «Функциональный фрагмент» или «аналог антитела против удлиненного гликосфинголипида I типа» является фрагментом, который может связывать сходный антиген. При использовании в настоящем документе, функциональный фрагмент, как правило, является синонимом «фрагменту антитела», а в отношении антител, может относиться к фрагментам, таким как F, F, F и т.п., которые могут связывать сходный антиген.
v
H
L
H
L
v
Фрагмент «F» состоит из димера одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи в нековалентной ассоциации (V-V димер). Такая конфигурация трех CDR каждого вариабельного домена взаимодействует для определения участка связывания мишени димера V-V, как в интактном антителе. В совокупности шесть CDR придают специфичность связывания с мишенью интактного антитела. Однако даже одиночный вариабельный домен (или половина F, содержащая только три CDR специфичных к мишени) может обладать способностью распознавать и связывать мишень.
v
H
L
v
H
L
Фрагменты антитела «одноцепочечный F», «sFv» или «scAb» содержат V и V домены антитела, где домены находятся в единственной полипептидной цепи. В общем, полипептид F дополнительно содержит полипептидный линкер, часто гибкую молекулу, такую как олигопептиды, которые могут быть получены из естественной молекулы и которые могут происходить из естественной молекулы, который является искусственной молекулой, такой как полиглицин, и т.п., между V и V доменами, которые позволяют sFv образовывать необходимую структуру для связывания мишени. Некоторые молекулы могут включать один или более константных доменов или их части.
H
L
Термин «диантитела» («diabodies») относится к конструктам фрагментов антитела с двумя антигенсвязывающими участками, где фрагменты могут содержать вариабельный домен тяжелой цепи (V), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (V) в одной и той же полипептидной цепи. С помощью линкера, который является слишком коротким, чтобы позволить спаривание между двумя вариабельными доменами на одной и той же цепи, домены диантитела вынуждены связываться с доменами связывания другой цепи для образования антигенсвязывающего участка.
ab
H1
ab'
ab
H1
ab'
(ab')2
F-фрагмент содержит вариабельный и константный домены легкой цепи и вариабельный и первый константный домен (C) тяжелой цепи. F-фрагменты отличаются от F-фрагментов добавлением нескольких остатков на карбоксильный конец C-домена для включения одного или более цистеинов из шарнирной области антитела. F-фрагменты могут быть получены расщеплением дисульфидной связи в шарнирных цистеинах продукта гидролиза пепсином F. Дополнительные ферментативные и химические обработки антител могут в результате давать другие функциональные фрагменты интереса.
Термин «моноклональное антитело» (mAb или MAb), используемый в данном документе, относится к антителу, полученному из популяции частично гомогенных антител, т.е. индивидуальных антител, составляющих популяцию, которые являются идентичными за исключением возможных естественных мутаций, которые могут присутствовать в минорных количествах.
Моноклональные антитела в данном документе специфически включают «химерные» антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи является идентичной или гомологичной соответствующим последовательностям в антителе, полученном из определенного вида или принадлежащего к определенному классу или подклассу антител (типу или подтипу), с остатком цепи(ей), идентичной или гомологичной соответствующим последовательностям в антителах, полученных из других видов или принадлежащих другим классам или подклассам антител, а также включают фрагменты таких антител, при условии, что химерные антитела проявляют требуемую биологическую активность связывания удлиненного гликосфинголипида I типа или влияют на активность или метаболизм удлиненного гликосфинголипида I (Пат. США No. 4,816,567 и Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA 81:6851 (1984)). Таким образом, CDR из одного класса антител могут быть привиты к FR антитела другого класса или подкласса.
Моноклональные антитела являются специфичными, направленными против одиночного участка мишени, эпитопа или детерминанты. Более того, в отличие от препаратов обычных (поликлональных) антител, которые, как правило, включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов) антигена, каждое моноклональное антитело направлено против одиночной детерминанты на мишени. В дополнение к их специфичности, моноклональные антитела эффективно синтезируются клеткой-хозяином, неконтаминированной другими иммуноглобулинами и обеспечивающей клонирование релевантного гена и обеспечивающей мРНК, кодирующую цепи антитела. Модификатор «моноклональный» указывает на характер антитела, полученного из практически гомогенной популяции антител, и не должен толковаться как требующий производство антитела каким-либо определенным способом. Например, моноклональные антитела для применения в настоящем изобретении могут быть выделены из фаговой библиотеки антител с помощью хорошо известных методов или могут быть очищены из поликлонального препарата. Родительские моноклональные антитела для применения по настоящему изобретению могут быть сделаны посредством технологии гибридом, описанной в работе Kohler et al., Nature 256:495 (1975), или могут быть сделаны рекомбинантными способами, хорошо известными в данной области.
v
ab
ab'
(ab')2
«Гуманизированные» формы нечеловеческих (например, мышиных) антител являются химерными иммуноглобулинами, иммуноглобулиновыми цепями или их фрагментами (такими как F, F, F, F или другими связывающими мишень последовательностями или антителами), которые содержат последовательности, полученные из нечеловеческого иммуноглобулина, если сравнивать с человеческим антителом. В общем, гуманизированное антитело будет содержать практически все, как правило, два вариабельных домена, в которые все или частично все области CDR соответствуют областям нечеловеческого иммуноглобулина и все или частично все FR-области являются человеческой-иммуноглобулиновой шаблонной последовательностью.
c
Гуманизированное антитело также может содержать, по меньшей мере, часть иммуноглобулиновой константной области (F), как правило, из выбранного иммуноглобулинового шаблона. В общем, цель состоит в получении молекулы антитела определенной специфичности, которое является минимально иммуногенным в человеке. Таким образом, возможно, что одна или более аминокислот в одном или более CDR также могут быть изменены на аминокислоты, которые являются менее иммуногенными для человеческого организма, без фактического минимизирования специфической функции связывания с одного или более CDR с удлиненным гликосфинголипидом I типа.
В ином случае, FR может быть нечеловеческим, но наиболее иммуногенные аминокислоты заменяются на менее иммуногенные. Тем не менее, прививание CDR, как обсуждалось выше, не является единственным путем для получения гуманизированного антитела. Например, модификация только CDR областей может быть недостаточной для оптимизации антитела, поскольку довольно часто встречается, что каркасные остатки играют роль в определении общей трехмерной структуры петель CDR и общего сродства антитела к лиганду.
Следовательно, для уменьшения иммуногенности антитела может быть осуществлен любой подход, с помощью которого молекула нечеловеческого родительского антитела модифицируется таким образом, чтобы быть молекулой, менее иммуногенной в человеке, а глобальная идентичность последовательности с человеческим антителом не всегда является необходимой. Таким образом, гуманизация также может быть достигнута, например, всего лишь заменой нескольких остатков, особенно тех, которые экспонируются на поверхности молекулы антитела и не скрыты в молекуле, и, следовательно, не являются легкодоступными для иммунной системы хозяина. Такой способ указывается в данном документе в отношении замены, например, заряженных или некоторых других остатков на молекуле антитела, и цель его состоит в том, чтобы уменьшить или ослабить иммуногенность конечной молекулы без ущерба для специфичности антитела к сходному эпитопу или детерминанте. См., например, Studnicka et al., Prot Eng 7(6)805-814, 1994; Mol Imm 44:1986-1988, 2007; Sims et al., J Immunol 151:2296 (1993); Chothia et al., J Mol Biol 196:901 (1987); Carter et al., Proc Natl Acad Sci USA 89:4285 (1992); Presta et al., J Immunol 151:2623 (1993), WO 2006/042333 и Пат. США No.5,869,619.
Стратегии и способы для изменения поверхности антител и другие способы для уменьшения иммуногенности антител в пределах различных хозяев раскрыты, например, в Пат. США No.5,639,641. Вкратце, в предпочтительном способе (1) проводят сравнение позиций пула вариабельных областей антитела тяжелой и легкой цепей для получения экспонированных на поверхности каркаса позиций вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, где позиции выравнивания для всех вариабельных областей являются идентичными, по меньшей мере, на около 98%; (2) определяют набор экспонированных на поверхности каркаса аминокислотных остатков вариабельных областей тяжелой и легкой цепей для нечеловеческого антитела, например антитела грызуна (или для его фрагмента); (3) идентифицируют набор аминокислотных остатков, экспонированных на поверхности каркаса вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей, который является наиболее близко идентичным набору аминокислотных остатков грызунов, экспонированных на поверхности; и (4) замещают набор экспонированных аминокислотных остатков каркасной поверхности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей, определенных в стадии (2), на набор экспонированных остатков каркасной поверхности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей, идентифицированных в стадии (3), за исключением того, что аминокислотные остатки, которые находятся в пределах 5Å от любого атома любого остатка CDR, например антитела грызуна, для получения гуманизированного, таким образом, антитела грызуна, сохраняющего специфичность связывания.
Антитело может быть гуманизировано множеством различных способов, включая прививание CDR (EPO 0239400; WO 91/09967; и Пат. США No. 5,530,101 и 5,585,089), облицовкой или изменением поверхности (EPO 0592106; EPO 0519596; Padlan, 1991, Molec Imm 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Prot Eng 7(6):805-814; и Roguska et al., 1994, PNAS 91:969-973) и перетасовкой цепей (Пат. США No. 5,565,332). Человеческие антитела могут быть получены различными способами, известными в данной области, включая, в частности, способы фагового дисплея, см. Пат. США №4,444,887, 4,716,111, 5,545,806 и 5,814,318; и WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 и WO 91/10741, с помощью трансгенных животных, таких как грызуны (мыши Amgen, Kirin и Merdarex), с помощью химерных клеток и т.п.
ab
v
«Гомолог антитела» или «гомолог» относится к любой молекуле, которая специфически связывает удлиненный гликосфинголипид I типа, как указано в данном документе. Таким образом, гомолог антитела включает естественное или рекомбинантное антитело, либо модифицированное либо нет, части антител, которые сохраняют интересующие биологические свойства, такие как связывание удлиненного гликосфинголипида I типа, например молекулы F или F одноцепочечного антитела, полипептида, несущего один или более CDR областей и т.п. Аминокислотная последовательность гомолога не должна быть идентичной естественному антителу, но может быть изменена или модифицирована, для того чтобы нести замененные аминокислоты, вставленные аминокислоты, удаленные аминокислоты, аминокислоты, отличные от тех двадцати, которые обычно встречаются в белках и т.п. для получения полипептида с усиленными или другими полезными свойствами.
Антитела с гомологичными последовательностями являются антителами с аминокислотными последовательностями, которые имеют последовательности, гомологичные аминокислотной последовательности антитела настоящего изобретения против удлиненного гликосфинголипида I типа. Предпочтительно, если гомология является гомологией с аминокислотной последовательностью вариабельных областей антитела настоящего изобретения. «Гомология последовательностей» применительно к аминокислотной последовательности, описанной в данном документе, определяется как последовательность с, по меньшей мере, около 90%, 91%, 92%, 93%, 94% или большей гомологией последовательностей, а более предпочтительно, по меньшей мере, около 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологией последовательности к другой аминокислотной последовательности, как определено, например, поисковым способом «FASTA» в соответствии с работой Pearson & Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 85, 2444-2448 (1988).
Химерное антитело, как указано выше, является антителом с различными частями антитела, полученными из различных источников, таких как различные антитела, различные классы антител, различные виды животных, например, антитело, имеющее вариабельную область, полученную из мышиного моноклонального антитела, спаренную с человеческой иммуноглобулиновой константной областью и т.п. Таким образом, гуманизированное антитело является видом химерного антитела. Способы получения химерных антител известны в данной области, например, см. Morrison, 1985, Science 229:1202; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; Gillies et al., 1989, J Immunol Methods 125:191-202; и Пат. США №5,807,715, 4,816,567 и 4,816,397.
H
L
Искусственные антитела включают фрагменты scFv, химерные антитела, диантитела, триантитела («triantibodies», тетрантитела («tetrabodies») и «mru» (см. обзор Winter & Milstein, 1991, Nature 349:293-299; и Hudson, 1999, Curr Opin Imm 11:548-557), каждое с антигенсвязывающей или эпитопсвязывающей способностью. В одноцепочечном фрагменте Fv (scFv), V и V домены антитела связаны гибким пептидом. Как правило, линкером является пептид длиной около 15 аминокислот. Если линкер является слишком малым, например 5 аминокислот, образуется диантитело, которое является бивалентным димером scFv. Если линкер уменьшен до менее чем трех аминокислотных остатков, образуются тримерные и тетрамерные структуры, которые называют триантителами и тетраантителами, соответственно. Наименьшей связывающей единицей антитела является гипервариабельный участок (CDR), например CDR3 тяжелой цепи, который обладает достаточными специфическим распознаванием и связывающей способностью. Такой фрагмент называют молекулярной единицей распознавания, или mru. Несколько таких mru могут быть связаны вместе при помощи коротких линкерных пептидов, образуя, таким образом, связывающий белок с более высокой авидностью, чем индивидуальный mru.
Также в объем притязаний изобретения включены функциональные эквиваленты антитела интереса. Термин «функциональные эквиваленты» включают антитела с гомологичными последовательностями, гомологи антитела, химерные антитела, варианты антитела, производные антитела, искусственные антитела и модифицированные антитела, например, где каждый функциональный эквивалент определяется способностью связывать удлиненный гликосфинголипид I типа. Специалист поймет, что существует перекрывание в группе молекул, называемых «фрагментами антител» и группой, называемой «функциональными эквивалентами». Способы получения функциональных эквивалентов, которые сохраняют способность связывать удлиненный гликосфинголипид I типа, известные специалистам в данной области, раскрыты, например, в WO 93/21319, ЕРО No.239,400, WO 89/09622, ЕРО No.338,745 и ЕРО No.332,424.
Функциональные эквиваленты настоящей заявки также включают модифицированные антитела, например антитела, модифицированные ковалентным прикреплением к любому типу молекул антител. Например, модифицированные антитела включают антитела, которые были модифицированы, например, гликозирированием, ацетилированием, пэгилированием, дезамидированием, фосфорилированием, амидированием, дериватизацией известными защитными/блокирующими группами, протеолитичесим расщеплением, связью с клеточным лигандом, связью с токсином или цитотоксичной составляющей или с другим белком и т.д. Потребность в ковалентном присоединении не дает антитело, которое является имммунным при образовании антиидиотипического ответа. Модификации могут быть получены известными методами, включая, в частности, специфическое химическое расщепление, ацетилирование, формилирование, метаболический синтез, химическую конъюгацию и т.д. Кроме того, модифицированные антитела могут содержать одну или более неклассических аминокислот.
Любому специалисту в данной области доступно множество методов, позволяющих оптимизировать сродство связывания. Как правило, методы включают замены различных аминокислотных остатков в интересующем участке, с последующим скрининг-анализом сродства связывания мутантного полипептида со сходным антигеном или эпитопом.
Как только антитело идентифицируется и выделяется, оно часто становится полезным для получения вариантного антитела или мутанта, или мутеина, в котором один или более аминокислотных остатков изменяются, например, в одной или более гипервариабельных областях антитела. В ином случае, или в дополнение, в антителе может быть проведено одно или более изменений (например, замен) в каркасных остатках, там, где это приводит к улучшению сродства связывания мутанта антитела с удлиненным гликосфинголипидом I типа.
L
H
Примеры остатков каркасной области, которые могут быть модифицированы, включают те, которые нековалентно напрямую связывают антиген (Amit et al., Science 233:747-753 (1986)); взаимодействуют/оказывают влияние на конформацию CDR (Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)); и/или участвуют во взаимодействии V-V (ЕР 239 400). В некоторых воплощениях модификация одного или более таких остатков каркасной области приводит к усилению сродства связывания антитела со сходным антигеном. Например, от около одного до около пяти каркасных остатков могут быть изменены в определенном воплощении изобретения. Иногда, что может быть достаточно для получения мутанта антитела, подходящего для применения в преклинических испытаниях, в гипервариабельной области не изменяют никаких остатков. Как правило, однако, мутант антитела может содержать одно или более изменений в гипервариабельной области. Константные области также могут быть изменены для получения желательных или более желательных эффекторных свойств.
Изменяемые остатки гипервариабельной области могут быть изменены случайным образом, особенно в случае, когда начальное сродство связывания родительского антитела таково, что случайно продуцируемые варианты антител могут быть легко подвергнуты скринингу на предмет измененного связывания с помощью анализа, указанного в данном документе.
Одной процедурой для получения вариантов антитела, таких как CDR-мутанты, является «аланиновый сканирующий мутагенез» (Cunningham & Wells, Science 244:1081-1085 (1989) и Cunningham & Wells, Proc Nat. Acad Sci USA 84:6434-6437 (1991)). Один или более остатков гипервариабельной области заменяются на аланины или полиаланиновые остатки. Демонстрирующие функциональную чувствительность к заменам остатки гипервариабельной области, затем уточняют путем введения дополнительных или других мутаций в или для сайтов замены. Таким образом, хотя участок введения вариации аминокислотной последовательности является предопределенным, природа мутации сама по себе не нуждается в предопределении. Подобные замены могут быть предприняты с другими аминокислотными остатками, в зависимости от требуемого свойства сканируемых остатков.
Более систематический способ для идентификации аминокислотных остатков для модификации включает идентифицирование остатков гипервариабельной области, вовлеченных в связывание удлиненного гликосфинголипида I типа, и тех остатков гипервариабельной области, у которых небольшое или отсутствующее участие в связывании с удлиненным гликосфинголипидом I типа. Осуществляется аланиновое сканирование несвязывающих остатков гипервариабельной области, каждый ala-мутант тестируется на предмет усиленного связывания с удлиненным гликосфинголипидом I типа. В другом воплощении этот остаток(ки), в значительной степени вовлеченный в связывание удлиненного гликосфинголипида I типа, выбирается для модификации. Модификация может включать делецию остатка или вставку одного или более остатков, среди прилегающих к остатку, представляющему интерес. Однако, как правило, модификация включает замену остатка на другую аминокислоту. Консервативная замена может быть первой заменой. Если такая замена приводит в результате к изменению биологической активности (например, к изменению сродства связывания), то другая консервативная замена может быть сделана для определения, если получены более существенные изменения.
Отбором аминокислоты, которая более существенно отличается по свойствам от той, что обычно в норме присутствует в этом участке, могут быть получены еще более существенная модификация в ряде антител и представление биологических свойств. Таким образом, такая замена может быть сделана при сохранении: (а) структуры полипептидного остова в области замены, например, в виде листа или спиральной конформации; (b) заряда или гидрофобности молекулы в целевом сайте, или (с) объема боковой цепи.
Например, природные аминокислоты могут быть разделены на группы, основанные на общих свойствах боковой цепи:
(1) гидрофобные: метионин (М или met), аланин (А или аlа), валин (V или val), лейцин (L или leu) и изолейцин (I или ile);
(2) нейтральные, гидрофильные: цистеин (С или cys), серин (S или ser), треонин (Т или thr), аспарагин (N или asn) и глутамин (Q или gln);
(3) кислые: аспарагиновая кислота (D или asp) и глутаминовая кислота (Е или glu);
(4) основные: гистидин (Н или his), лизин (K или lys) или аргинин (R или arg);
(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: глицин (G или gly) и пролин (Р или pro), и
(6) ароматические: триптофан (W или trp), тирозин (Y или tyr) и фенилаланин (F или phe).
Неконсервативные замены могут повлечь за собой замену аминокислоты на аминокислоту из другой группы. Консервативные замены могут повлечь за собой замену одной аминокислоты на другую в пределах группы.
Предпочтительные аминокислотные замены могут включать те, которые, например:
[1] уменьшают восприимчивость к протеолизу, (2) уменьшают восприимчивость к окислению, (3) изменяют сродство связывания и (4) придают или модифицируют другие физико-химические или функциональные свойства таким аналогам.
Аналоги могут включать различные мутеины с последовательностями, отличными от естественной пептидной последовательности. Например, одиночные и множественные аминокислотные замены (предпочтительно консервативные аминокислотные замены) могут быть сделаны в естественной последовательности, предпочтительно в части полипептида снаружи домена(ов), образующего межмолекулярные контакты. Консервативная аминокислотная замена не должна существенно изменять структурные характеристики родительской последовательности (например, замена аминокислоты не должна иметь тенденции к разрушению спирали, которая присутствует в родительской последовательности, или к разрушению других типов вторичной структуры, которые характеризуют родительскую последовательность) за исключением замены в объеме или конформации R-группы или боковой цепи, Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, ed., W.Н.Freeman, and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (Branden & Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); и Thomton et al. Nature 354:105 (1991).
Как правило, мутант антитела с улучшенными биологическими свойствами будет обладать аминокислотной последовательностью, имеющей, по меньшей мере, 75% идентичности аминокислотной последовательности или схожести с аминокислотной последовательностью, либо тяжелой, либо легкой цепи вариабельного домена родительского антитела против удлиненного гликосфинголипида I типа, имеющей, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95% идентичности. Идентичность или схожесть в отношении последовательности родительского антитела определяется в данном документе как процент аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, которые являются идентичными (т.е. теми же самыми остатками) или похожими (т.е. аминокислотным остатком из той же группы, основанной на общих свойствах боковой цепи, выше) на остатки родительского антитела, после выравнивания последовательности и внесения разрывов, при необходимости, для достижения максимального процента идентичности последовательности.
В ином случае, мутанты антитела могут быть получены системной мутацией FR- и CDR-областей тяжелой или легкой цепей, или Fc-области антитела против удлиненного гликосфинголипида I типа.
ab
Другая процедура для получения мутантов антител включает применение созревания сродства с помощью фагового дисплея (Hawkins et al., J Mol Biol 254:889-896 (1992) и Lowman et al., Biochemistry 30(45): 10832-10838(1991)). Химерные белки оболочки бактериофага (Smith, Science 228:1315 (1985); Scott & Smith, Science 249:386 (1990); Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 8:309 (1990); Devlin et al. Science 249:404 (1990); Wells & Lowman, Curr Opin Struct Biol 2:597 (1992) и Пат. США No. 5,223,409) известны как полезные для связи фенотипа представленных белков или пептидов с генотипом частиц бактериофага, которые их кодируют. F-домены антител также были представлены на фаге (McCafferty et al., Nature 348: 552 (1990); Barbas et al. Proc Natl Acad Sci USA 88:7978 (1991) и Garrard et al. Biotechnol 9:1373 (1991)).
Моновалентный фаговый дисплей состоит из представления набора белковых вариантов в виде химерного белка оболочки бактериофага на фаговых частицах (Bass et al., Proteins 8:309 (1990)). Созревание сродства, или улучшение или равновесие сродства связывания различных белков, было достигнуто посредством последовательного применения мутагенеза, моновалентного фагового дисплея и функционального анализа (Lowman & Wells, J Mol Biol 234:564 578 (1993); и Пат. США No. 5,534,617), а также путем применения этого подхода на Fab-доменах антител (Barbas et al., Proc Natl Acad Sci USA 91:3809 (1994) и Yang et al., J Mol Biol 254:392 (1995)).
6
Библиотеки множества (например, 10 или больше) белковых вариантов, отличающихся в различных позициях последовательности, могут быть сконструированы на частицах бактериофага, каждая из которых содержит ДНК, кодирующую определенный белковый вариант. Таким образом, сайты гипервариабельной области (например, 6-7 сайтов) мутируют для получения всех возможных аминокислотных замен в каждом сайте. После циклов аффинной очистки, с помощью иммобилизованного антигена, индивидуальные клоны бактериофага выделяют, и аминокислотная последовательность представленного белка выводится из ДНК.
При последующем производстве мутанта антитела биологическая активность этой молекулы относительно родительского антитела может быть определена, как указано в данном документе. Как отмечено выше, это может включать определение сродства связывания и/или других биологических активностей или физических свойств антитела. В предпочтительно воплощении изобретения панель мутантов антитела готовят и скринируют на предмет сродства связывания с антигеном. Один или более мутантов, выбранных из скрининга, необязательно подвергают одному или нескольким анализам биологической активности, для подтверждения того, что мутант(ы) антитела обладает новыми или улучшенными свойствами. В предпочтительных воплощениях мутант антитела сохраняет способность связывать удлиненный гликосфинголипид I типа со сродством связывания похожей или более лучшей/высокой, чем у родительского антитела.
В ином случае, мультивалентный фаг (McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554; и Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628) также может быть использован для экспрессии случайных точечных мутаций (например, полученных применением склонной к ошибкам ДНК-полимеразы) для образования библиотеки фаговых фрагментов антитела, которые затем могут быть скринированы для предмет сродства к удлиненному гликосфинголипиду I типа, Hawkins et al., [1992] J Mol Biol 254:889-896.
Предпочтительно, если в течение процесса созревания сродства реплицирующийся экспрессирующий вектор находится под сильным контролем элемента, регулирующего транскрипцию, и условия культивирования корректируются таким образом, чтобы количество или число частиц с более чем одной копией слитого белка составляло менее чем около 1%. Также предпочтительно, если количество частиц с более чем одной копией химерного белка больше чем около 10% от количества частиц с одиночную копию химерного белка. Предпочтительно, если количество меньше чем около 20%.
ab
v
Другим эквивалентным выражением, используемым в данном документе, является антигенсвязывающая часть, которая относится к той части антитела интереса, которая связывает эпитоп гликосфинголипида I типа. Все формулировки и термины, использованные в данном документе для описания различных изменений, которые могут быть сделаны в исходном антителе, рассматриваются как подпадающие в сферу выражения «антигенсвязывающая часть». Следовательно, например, фрагмент антитела, такой как молекула F, F, scAb, mru, любые такие функциональные фрагменты, вариант антитела, такой как аллель или молекула, содержащая изменения в ее первичной аминокислотной последовательности, производное, такое как химерное или гуманизированое антитело, аналог и т.п., включая функциональные эквиваленты, которые включают генетически модифицированные формы антитела интереса, гомологи антитела, как описано в данном документе, и т.п., включены в выражение антигенсвязывающая часть.
v
Мутант(ы) антитела выбирают таким образом, чтобы можно было подвергнуть его дополнительным модификациям, часто в зависимости от целевого применения антитела. Такие модификации могут включать дополнительное изменение аминокислотной последовательности, слияние с гетерологичным полипептидом(ами) и/или ковалентные модификации. Например, остаток цистеина, не вовлеченный в поддержание надлежащей конформации мутанта антитела, может быть заменен, как правило, на серин, для улучшения окислительной стабильности молекулы и предотвращения аберрантного перекрестного сшивания. И наоборот, цистеин может быть добавлен к антителу для улучшения стабильности (особенно когда антитело является фрагментом антитела, таким как F-фрагмент).
Другой тип мутанта антитела имеет измененный паттерн гликозилирования. Это может быть достигнуто добавлением или удалением одной или более углеводных составляющих, обнаруженных в антителе, и/или добавлением или удалением одного или более сайтов гликозилирования, которые отсутствуют в антителе. Гликозилирование антитела, как правило, является N-связанным с Asn или O-связанным с Ser или Thr. Трипептидные последовательности, аспарагин-Х-серин и аспарагин-Х-треонин, в которых Х является любой аминокислотой, кроме пролина, являются общими последовательностями распознавания для ферментативного присоединения углеводной составляющей к боковой цепи аспарагина. Например, N-ацетилгалактозамин, галактоза, фукоза или ксилоза являются связанными с гидроксиаминной кислотой, чаще всего с серином или треонином, хотя 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин также могут быть использованы. Дополнение или замещение одного или более остатков серина или треонина в последовательность исходного антитела могут усилить вероятность O-связанного гликозилирования.
c
Это может быть необходимо для модификации антитела изобретения в отношении эффекторной функции, с тем, чтобы усилить эффективность антитела. Например, остаток(и) цистеина может быть введен в F-область, тем самым позволяя образование дисульфидной связи в этой области. Гомодимерное антитело, образованное таким образом, может быть улучшено способностью интернализации и/или увеличения клеточного цитолиза опосредованного комплемент- и антителозавистимой клеточной цитотоксичностью (ADCC), см. Caron et al., J Exp Med 176:1191-1195 (1992) и Shopes, Immunol 148:2918-2922 (1993). Такое производное антитела или аналог могут быть более устойчивыми к деградации in vivo.
c
В ином случае, может быть сконструировано антитело, которое имеет двойные F-области и может быть, таким образом, усилено комплементным лизисом и ADCC возможностями, см. Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219 230 (1989).
Ковалентные модификации антитела включаются в объем притязаний изобретения. Подобное может быть осуществлено посредством химического синтеза или ферментативного или химического расщепления антитела, если это применимо. Другие типы ковалентных модификаций антитела вводятся в молекулу посредством взаимодействия целевых аминокислотных остатков антитела с органическим дериватизующим агентом, который способен реагировать с выбранными боковыми цепями или с N-концевым, или с С-концевым остатком.
Цистеиниловые остатки могут реагировать с α-галоацетатами (и соответствующими аминами), такими как хлоруксусная кислота или хлороацетамид, для получения карбоксиметильных или карбоксиамидометильных производных. Цистеинильные остатки также могут быть дериватизованы реакцией, например, с бромтрифторацетоном, α-бром-β-(5-амидозоил)пропионовой кислотой, хлорацетилфосфатом, N-алкилмалеимидами, 3-нитро-2-пиридил дисульфидом, метил-2-пиридил дисульфидом, р-хлоромеркурилбензоатом, 2-хлормеркура-4-нитрофенолом или хлор-7-нитробензо-2-окса-1,3-диазолом.
Гистидильные остатки могут быть дериватизованы реакцией с диэтилпирокарбонатом при рН 5,5-7,0. р-Бромфенацил бромид также может быть применен, реакция предпочтительно осуществляется в 0,1 М какодилате натрия при рН 6,0.
Лизиниловые и α-концевые остатки могут реагировать с ангидридами янтарной или другой карбоксильной кислоты для обращения заряда остатков. Другие подходящие реактивы для дериватизации α-аминосодержащих остатков включают имидоэфиры, такие как метилпиколинимидат, пиродоксал фосфат, пиридоксал, хлороборогидрид, тринитробензолсульфоновую кислоту, O-метилизомочевину и 2,4-пентандион, и аминокислота может быть катализирована трансаминазой с помощью глиоксилата.
Аргинильные остатки могут быть модифицированы реакцией с одними или несколькими обычными реактивами, такими как фенилглиоксаль, 2,3-бутандион, 1,2-циклогександион и нингидрин. Дериватизация остатков аргинина часто требует щелочных условий реакции. Более того, реактивы, которые могут вступать в реакцию с лизином, также реагируют с ε-аминогруппой аргинина.
125
131
Специфическая модификация тирозильных остатков может быть сделана с помощью ароматических соединений диазония или с помощью тетранитрометана. Например, N-ацетилимидизол и тетранитрометан используются для образования O-ацетильных тирозильных производных и 3-нитро производных, соответственно. Тирозильные остатки могут быть иодированы с помощью I или I для получения меченых белков для применения в радиоиммуноанализе.
Карбоксильные боковые группы (аспартильные или глутамильные) могут быть модифицированы реакцией с карбодиимидами (R-N=C=C-R'), где R и R' могут быть различными алкильными группами, такими как 1-циклогексил-3-(2-морфолинил-4-этил)карбодиимид или 1-этил-3-(4-азониа-4,4-диметилпентил)карбодиимид. Кроме того, аспартильные и глутамильные остатки могут быть превращены в аспарагинильные и глутаминильные остатки реакцией с ионами аммония.
Глутаминильные и аспарагильные остатки часто деамидируются в соответствующие глутамильные и аспартильные остатки, соответственно, в нейтральных или основных условиях. Деамидированная форма этих остатков подпадает под объем притязаний данного изобретения.
Другие модификации включают гидроксилирование пролина и лизина, фосфорилирование гидроксильных групп сериновых и треониновых остатков, метилирование α-аминогрупп боковых цепей лизина, аргинина и гистидина (Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H.Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)), ацилирование N-концевого амина и амидирование любой С-концевой карбоксильной группы.
Другой тип ковалентной модификации включает химическое или ферментативное сопряжение углеводов и гликозидов с антителом. Эти процедуры не требуют продуцирования антитела в клетке-хозяине, которая обладает гликозилирующими способностями в отношении N-связанного или O-связанного гликозилирования. В зависимости от используемого режима конъюгации сахар(а) может быть прикреплен к: (а) аргинину и гистидину; (b) карбоксильным группам; (с) свободным сульфогидрильным группам, таким как цистеин; (d) свободным гидроксильным группам, таким как те, что у серина, треонина или гироксипролина; (е) ароматическим остаткам, таким как те, что у фенилаланина, тирозина или триптофана; или (f) амидной группе глутамина. Такие способы описаны в WO 87/05330 и в Aplin & Wriston, CRC Crit Rev Biochem, pp.259-306 (1981).
Удаление любой углеводной составляющей, присутствующей в антителе, может быть выполнено химически или ферментативно. Химическое дегликозилирование, например, может потребовать представления антитела соединению, трифторметансульфоновой кислоте, или эквивалентному соединению, что приводит к расщеплению большинства или всех сахаров, за исключением связывающего сахара (N-ацетилглюкозамина и N-ацетилгалактозамина), при этом антитело остается интактным. Химическое дегликозилирование описано, например, в работах Hakimuddin et al., Arch Biochem Biophys 259:52 (1987) и Edge et al., Anal Biochem 118:131 (1981). Ферментативное отщепление углеводных составляющих антител может быть проведено любой из множества эндогликозидаз и экзогликозидаз, как описано, например, в работе Thotakura et al., Meth Enzymol 138:350 (1987).
Другой тип ковалентной модификации антитела содержит связывание антитела с одним из множества небелковых полимеров, например полиэтиленгликолем, полипропиленгликолем или полиоксиалкиленами, в форме, изложенной в Пат. США No.4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 или 4,179,337.
1-4
1-2
Функциональные эквиваленты могут быть получены обменом различных CDR различных цепей антитела в пределах каркаса или композитных FR, полученных из множества антител. Таким образом, например, возможны различные классы антитела для данного набора CDR посредством замены различных тяжелых цепей, например, IgG, IgM, lgA или IgD для получения различных типов и изотипов антител против удлиненного гликосфинголипида I типа. Подобным образом, искусственные антитела в пределах объема притязаний изобретения могут быть получены путем внедрения данного набора CDR в полностью синтетический каркас.
Фрагменты антитела и функциональные эквиваленты настоящего изобретения охватывают молекулы с детектируемой степенью специфического связывания удлиненного гликосфинголипида I типа. Детектируемый уровень связывания включает все значения в диапазоне, по меньшей мере, 10-100%, предпочтительно, по меньшей мере, 50%, 60% или 70%, более предпочтительно, по меньшей мере, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% от способности связывания антитела интереса. Также включенными являются эквиваленты со сродством больше чем 100%, чем у антитела интереса.
CDR, в общем, имеют важное значение для распознавания эпитопа или для связывающей способности антитела. Однако изменения могут быть внесены в остатки, которые содержат CDR без пересечения со способностью антитела распознавать и связывать родственный эпитоп. Например, могут быть внесены изменения, которые не оказывают воздействие на распознавание эпитопа, при этом увеличивают сродство связывания антитела с эпитопом. Несколько исследований засвидетельствовали эффекты введения одной или более аминокислотных замен в различные позиции в последовательности антитела, на основе сведений о последовательности первичного антитела, о его свойствах, таких как связывание и уровень экспрессии (Yang et al., 1995, J Mol Biol 254:392-403; Rader et al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95:8910-8915; и Vaughan et al., 1998, Nature Biotechnology 16, 535-539).
Таким образом, эквиваленты антитела, представляющего интерес, могут быть получены изменением последовательностей генов тяжелой и легкой цепей в CDR1, CDR2 и/или CDR3 или в каркасных областях, например, с помощью способов, таких как олигонуклеотид-опосредованный сайт-направленный мутагенез, кассетный мутагенез, подверженный ошибкам ПЦР, перетасовка ДНК, аминокислотная модификация или мутаторные штаммы Е. coli (Vaughan et al., 1998, Nat Biotech 16:535-539; и Adey et al., 1996, Chap.16, pp.277-291, in Phage Display of Peptides and Proteins, eds. Kay et al., Academic Press). Способы изменения нуклеотидной последовательности первичного антитела в результате могут привести к появлению антитела с улучшенным сродством (Gram et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:3576-3580; Boder et al., 2000, Proc Natl Acad Sci USA 97:10701-10705; Davies & Riechmann, 1996, Immunotech 2:169-179; Thompson et al., 1996, J Mol Biol 256:77-88; Short et al., 2002, J Biol Chem 277:16365-16370; и Furukawa et al., 2001, J Biol Chem 276:27622-27628).
Повторяющиеся циклы «полипептидного отбора» могут быть применены для отбора на предмет более высокого сродства связывания посредством, например, отбора множественных замен аминокислот, которые отбираются посредством множества циклов отбора. После первого цикла отбора, вовлекающего первую область отбора аминокислот в полипептиде лиганда или антитела, проводят дополнительные циклы отбора в других областях или аминокислотных остатках лиганда. Циклы отбора повторяют до тех пор, пока требуемые свойства сродства не будут достигнуты.
Улучшенные антитела также включают те антитела, которые обладают улучшенными характеристиками, которые получают посредством стандартных методов иммунизации животных, образования гибридом и отбора антител со специфическими характеристиками.
«Антагонист» относится к молекуле, способной ингибировать одну или более биологических активностей, связанных с удлиненным гликосфинголипидом I типа. Антагонисты могут создавать помехи в поддержании и росте клетки, экспрессирующей гликосфинголипид I типа. Все точки вмешательства антагониста считаются эквивалентными для целей рассматриваемого изобретения. Таким образом, включенными в сферу притязаний изобретения являются антагонисты, например нейтрализующие антитела, которые связывают удлиненный гликосфинголипид I типа.
«Агонистом» называют антитело, фрагмент антитела, конъюгат и т.п., который активирует одну или более биологических активностей удлиненного гликосфинголипида I типа или экспрессирующей его клетки. Агонисты могут действовать как митогены на клетки, экспрессирующие гликосфинголипид I типа. Все точки вмешательства агониста считаются эквивалентными для целей рассматриваемого изобретения. Таким образом, включенными в область притязаний изобретения являются антитела, которые связывают удлиненный гликосфинголипид I типа и усиливают активность, например, такую как дифференцировка.
Термины «клетка», «клеточная линия» и «культура клеток» включают их потомство. Следует также понимать, что все потомство может не быть точно идентичным, например, по ДНК-содержимому из-за преднамеренной или случайной мутации. Вариант потомства, который имеет ту же самую функцию или биологическое свойство, представляющее интерес, что и обнаруженная в исходной клетке, включают в область притязаний изобретения. «Клетки-хозяева», примененные в настоящем изобретении, в общем, являются прокариотическими или эукаритическими хозяевами, выбираемыми в качестве проектного решения.
«Трансформация» клеточного организма, клетки или клеточной линии нуклеиновой кислотой означает введение нуклеиновой кислоты в клетку-мишень так, чтобы нуклеиновая кислота являлась воспроизводимой, либо в виде экстрахромасомального элемента, либо в виде хромасомной интеграции, и необязательно, являлась экспрессируемой. «Трансфекцией» клетки или организма нуклеиновой кислотой называется поглощение нуклеиновой кислоты, например экспрессирующего вектора, клеткой или организмом, вне зависимости от того, экспрессируют ли она кодирующую последовательность. Термины «трансфицированная клетка-хозяин» и «трансформированный» относятся к клетке, в которую была введена нуклеиновая кислота. Типичные прокариотические клетки-хозяева включают различные штаммы Е.coli. Типичными эукариотическими клетками-хозяевами являются клетки млекопитающих, такие как клетки яичника китайского хомяка, или клетки человеческого происхождения. Введенная нуклеиновая последовательность может происходить из того же вида, что и клетка-хозяин, или из отличных от хозяйской клетки видов, или может быть гибридной нуклеиновой последовательностью, содержащей несколько инородных и несколько гомологичных нуклеиновых последовательностей. Трансформация может также осуществляться трансдукцией или инфекцией с помощью полученных из вирусов элементов.
Термин «вектор» означает конструкцию нуклеиновой кислоты, носитель, содержащий нуклеиновую кислоту, трансген, инородный ген или ген, представляющий интерес, который может быть функционально связан с подходящей контролирующей последовательностью для экспрессии трансгена в подходящем хозяине. Такие контролирующие последовательности включают промотор для осуществления транскрипции, необязательную, операторную последовательность для контроля такой транскрипции, последовательность, кодирующую подходящие сайты связывания рибосомы на мРНК и последовательности, которые контролируют терминацию транскрипции и трансляции. Вектор может быть плазмидой, фаговой частицей или просто потенциальной геномной вставкой. Будучи трансформированным в подходящего хозяина вектор может воспроизводиться и функционировать независимо в геноме хозяина, или может в некоторых случаях интегрироваться в геном клетки-хозяина или в другие нуклеиновые кислоты. В настоящем описании изобретения термины «плазмида» и «вектор» могут быть использованы взаимозаменяемо, поскольку плазмида является наиболее часто используемой формой вектора. Однако изобретение предназначено для включения других форм векторов, которые сохраняют эквивалентную функцию носителя и которые являются, или стали, известными в данной области, такие как вирусы, фагемиды, транспозоны, синтетические молекулы, которые несут нуклеиновые кислоты, липосомы и т.п.
«Млекопитающее» для целей лечения относится к любому животному, классифицируемому как млекопитающее, включая человека, домашним и сельскохозяйственным животным, нечеловеческим приматам, животным зоопарка, спортивным животным или домашним любимцам, таким как собаки, лошади, кошки, коровы и т.п.
Антитела интереса могут быть проверены или могут быть применены в анализе, как описано в данном документе, или как известно в данной области. Часто такие анализы требуют реактива, который может быть определен, т.е., например, метка. Слово «метка», если используется в данном документе, относится к детектируемому соединению или к композиции, которая может быть конъюгирована непосредственно или опосредованно с молекулой или белком, например с антителом. Метка может быть детектируемой сама по себе (например, радиоизотопными метками, частицами или флюоресцентными метками) или может быть инструментом для получения детектируемого сигнала, например, в случае ферментативной метки, которая может катализировать химическое изменение субстратного соединения или композиции, которая затем детектируется.
При использовании в данном документе «твердая фаза» означает матрицу, с которой структура или молекула, такая как антитело рассматриваемого изобретения, может быть соединена или связана. Пример твердых фаз, охватываемых данным документом, включает те, которые образованы частично или полностью из стекла (например, стекло с контролируемым размером пор), полисахаридов (например, агарозы), пластиков, полипропиленов, полиакриламидов, полистерена, поливинилового спирта и силиконов. В некоторых воплощениях, в зависимости от контекста, твердая фаза может включать лунку планшета для анализа; в других может быть применена в колонке очистки (например, в колонке для аффинной хроматографии). Таким образом, твердая фаза может быть бумагой, бусинами, пластиком, чипом и т.п., может быть сделана из различных материалов, таких как нитроцеллюлоза, агароза, полистирен, полипропилен, силикон и т.п., и может быть во множестве конфигураций.
Клетки, экспрессирующие удлиненный гликосфинголипид I типа или их гликаны, такие как препараты клеточных мембран, а также очищенный удлиненный гликосфинголипид I типа могут быть применены в качестве иммуногена для получения антител интереса. Иммуноген может быть получен или выделен из естественного источника и может быть создан синтетически ферментативно или химически. Могут применяться целые клетки, такие как клетки, экспрессирующие гликосфинголипид I типа, клетки, полученные из естественных источников, или из злокачественных новообразований, таких как злокачественные клеточные линии. Клетки, которые сверхэкспрессируют удлиненный гликосфинголипид I типа, могут быть применены в качестве иммуногена для изготовления антител интереса. Также могут применяться мембранные препараты, несущие удлиненный гликосфинголипид I типа, как известно в данной области. Такие клетки или их части могут быть использованы в качестве источника антигена в диагностическом анализе.
Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие мутантные аминокислотные последовательности, могут быть приготовлены различными способами, известными в данной области. Способы включают, но не ограничиваются перечисленным, олигонуклеотид-опосредованный (или сайт-направленный) мутагенез, ПЦР-мутагенез и кассетный мутагенез ранее приготовленного мутанта или немутантной версии молекулы, представляющей интерес (см., например, Kunkel, Proc Natl Acad Sci USA 82:488 (1985)).
Рекомбинантная экспрессия антитела изобретения, или фрагмента, производного или его аналога (например, тяжелой или легкой цепи антитела изобретения, одноцепочечного антитела изобретения, или мутеина антитела изобретения) включает конструкцию экспрессирующего вектора, содержащего полинуклеотид, который кодирует антитело или фрагмент антитела, как описано в данном документе. Сразу после получения полинуклеотида, кодирующего молекулу антитела, вектор для получения антитела может быть получен технологией рекомбинантных ДНК, как это известно в данной области. Экспрессирующий вектор конструируется так, чтобы он содержал кодирующие антитело последовательности и соответствующие транскрипционные и трансляционные контрольные сигналы. Способы включают, например, in vitro методы рекомбинантных ДНК, синтетические методы и in vivo генетическую рекомбинацию.
Экспрессирующий вектор переносится в клетку-хозяин обычными методами и трансфицированные клетки затем культивируются обычными методами для продуцирования антитела изобретения или его фрагмента. В одном аспекте изобретения векторы, кодирующие как тяжелую, так и легкую цепи, могут коэкспрессироваться в клетках-хозяевах для экспрессии целой молекулы иммуноглобулина, как детально описано в данном документе.
Разнообразные системы хозяин/экспрессирующий вектор могут быть применены для экспрессии молекулы антитела изобретения. Такие экспрессирующие системы представляют собой носители, посредством которых кодирующие последовательности, представляющие интерес, могут быть получены и затем очищены, но также представляют собой клетки, которые могут быть затем трансформированы или трансфицированы подходящими нуклетидными кодирующими последовательностями, экспрессирующими молекулу антитела изобретения in situ. Бактериальные клетки, такие как E.coli и эукаритические клетки, как правило, применяются для экспрессии молекулы рекомбинатного антитела, особенно для экспрессии молекулы полноразмерного рекомбинантного антитела. Например, клетки млекопитающих, такие как клетки СНО, в сочетании с вектором, например вектором, несущим промоторный элемент основного промежуточного раннего гена человеческого цитомегаловируса, являются эффективной экспрессирующей системой для антител (Foecking et al., Gene 45:101 (1986); и Cockett et al., Bio/Technology 8:2 (1990)). Растения и культура клеток растений, клетки насекомых и т.п. также могут быть использованы для изготовления белка, представляющего интерес, как известно в данной области.
Кроме того, клетка-хозяин выбирается так, чтобы она модулировала экспрессию вставленных последовательностей, или модифицировала и процессировала генный продукт в требуемый конкретным образом. Такие модификации (например, гликозилирование) и процессирование (например, расщепление) белковых продуктов могут быть важными для функции белка. Различные клетки-хозяева могут обладать определенными характерными и специфичными механизмами для посттрансляционного процессирования и модификации белков и генных продуктов. Подходящие клеточные линии или хозяйские системы могут быть выбраны для обеспечения корректной модификации и процессирования экспрессируемого антитела интереса. Следовательно, могут использоваться эукариотические хозяйские клетки, которые обладают клеточной машинерией для правильного процессирования первичного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования генного продукта. Такие клетки-хозяева млекопитающих включают, не ограничиваясь перечисленным, СНО, COS, 293, 3Т3 или клетки миеломы.
Для долговременного производства рекомбинантных белков с высоким выходом предпочтительной является стабильная экспрессия. Например, могут быть сконструированы клеточные линии, которые стабильно экспрессируют молекулу антитела. Вместо применения экспрессирующего вектора, который содержит вирусные точки начала репликации, клетки-хозяева могут быть трансформированы ДНК, контролируемой подходящими элементами контроля экспрессии (например, промотором, энхансерными последовательностями, терминаторами транскрипции, сайтами полиаденилирования и т.п.) и селективным маркером. После введения инородной ДНК сконструированным клеткам можно позволить расти в течение одного-двух дней в обогащенной среде, а затем клетки перемещают в селективную среду. Селективный маркер в рекомбинантной плазмиде придает устойчивость к отбору и позволяет клеткам стабильно интегрировать плазмиду в хромосому и быть превращенными в клеточную линию. В ином случае, в клетках селективным действием может поддерживаться экстрахромосомный элемент. Такие сконструированные клеточные линии не только являются полезными для производства антител, но также являются полезными при скрининге и оценке соединений, которые взаимодействуют прямо или косвенно с молекулой антитела.
Множество систем отбора может быть применено, включая, но, не ограничиваясь перечисленным, применение генов тимидинкиназы вируса простого герпеса (Wigler et al., Cell 11:223 (1977)), гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы (Szybalska et al., Proc Natl Acad Sci USA 48:202 (1992)), глутаматсинтазы, в присутствии метионин сульфоксимида (Adv Drug Del Rev 58, 671, 2006 и см. вэбсайт и литературу Lonza Group Ltd.) и аденинфосфорибозилтрансферазы (Lowy et al., Cell 22:817 (1980)), в tk-, hgprt- или aprt-клетках, соответственно. Также в качестве основы отбора может быть применена антиметаболитная устойчивость следующих генов: dhfr, который придает устойчивость к метотрексату (Wigler et al., Proc Natl Acad Sci USA 77:357 (1980); O'Hare et al., Proc Natl Acad Sci USA 78:1527 (1981)); gpt, который придает устойчивость к микофеноловой кислоте (Mulligan et al., Proc Natl Acad Sci USA 78:2072 (1981)); neo, который придает устойчивость к аминогликозиду G-418 (Wu et al., Biotherapy 3:87 (1991)); и hygro, который придает устойчивость к гигромицину (Santerre et al., Gene 30:147 (1984)). Для отбора требуемого рекомбинантного клона обычно применяются способы, известные в области технологии рекомбинантных ДНК, и такие способы описаны, например, в Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press (1990); Dracopoli et al., eds., Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons (1994); и Colberre-Garapin et al., J Mol Biol 150:1 (1981).
Уровни экспрессии молекулы антитела могут быть повышены амплификацией векторов (например, см. Bebbington et al., in DNA Cloning, Vol.3. Academic Press (1987)). Если маркер в векторной системе, экспрессирующей антитело, является амплифицируемым, то повышение уровня присутствующего в культуре ингибитора будет увеличивать количество копий маркерного гена. Поскольку амплифицируемая область связана с геном антитела, то продуцирование антитела также будет увеличиваться (Crouse et al., Mol Cell Biol 3:257 (1983)).
Клетка-хозяин может быть котрансфицирована двумя или большим количеством экспрессирующих векторов изобретения, например первым вектором, кодирующим полипептид, полученный из тяжелой цепи, и вторым вектором, кодирующим полипептид, полученный из легкой цепи. Два вектора могут содержать идентичные селективные маркеры, которые способны одинаково экспрессировать полипептиды тяжелой и легкой цепей. В ином случае может быть применен одиночный вектор, который кодирует и который способен экспрессировать полипептиды как тяжелой, так и легкой цепей. В таких ситуациях легкая цепь может быть размещена до тяжелой цепи для того, чтобы избежать избытка токсичной в свободном состоянии тяжелой цепи (Proudfoot, Nature 322:52 (1986); и Kohler, Proc Natl Acad Sci USA 77:2197 (1980)). Кодирующие последовательности тяжелой и легкой цепей могут содержать кДНК или геномную ДНК.
Как только молекула антитела изобретения была произведена животным, химически синтезирована или рекомбинантно экспрессирована, она может быть очищена любым способом, известным в данной области для очистки иммуноглобулиновой молекулы, например хроматографией (например, ионообменной, аффинной, особенно аффинной в отношении удлиненного гликосфинголипида I типа, после хроматографии с протеином А и гель-фильтрации и т.п.), центрифугированием, дифференциальной растворимостью или любым другим стандартным методом для очистки белков. Кроме того, антитела рассматриваемого изобретения или их фрагменты могут быть слиты с гетерологичными полипептидными последовательностями, описанными в данном документе, или в ином случае, известными в данной области, для облегчения очистки.
Антитела настоящего изобретения могут быть получены любым подходящим способом, известным в данной области. Таким образом, очищенная протяженная структура I типа может быть применена в качестве антигена, необязательно, с адъювантом, например полным или неполным адъювантом Фрейнда. Антитело настоящего изобретения может содержать поликлональные антитела, хотя из-за модификации антител для оптимизации применения в людях, а также для оптимизации применения антител самих, по себе, моноклональные антитела являются предпочтительными из-за простоты производства и обработки конкретных белков. Способы приготовления поликлональных антител известны квалифицированному специалисту (Harlow et al., Antibodies: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988)).
Например, иммуноген, о чем свидетельствует настоящий документ, может быть введен в различных животных-хозяев, включая, но, не ограничиваясь перечисленным, кроликов, мышей, верблюдовых, крыс и т.п., для индукции продуцирования сыворотки, содержащей поликлональные антитела, специфичные к удлиненному гликосфинголипиду I типа. Введение иммуногена может повлечь за собой одну или более инъекций иммунизирующего агента и, при необходимости, адъюванта. Различные адъюванты могут быть применены для увеличения иммунологического ответа, в зависимости от вида-хозяина, и включают, не ограничиваясь перечисленным, адъювант Фрейнда (полный или неполный), минеральное масло, гели, алюминивые квасцы (гидроксид алюминия), поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, полиолы плюроник, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианины лимфы моллюска «морское блюдечко» (KLH), динитрофенол и потенциально полезные человеческие адъюванты, такие как БЦЖ (бацилла Кальметта-Герена) и Corynebacterium parvum. Дополнительные примеры адъювантов, которые могут быть использованы, включают адъювант «MPL-TDM» (монофосфорил липид А, синтетический трегалозодикориномиколат). Протоколы иммунизации хорошо известны в данной области и могут быть осуществлены любым способом, который вызывает иммунный ответ в выбранном животном-хозяине. Таким образом, могут быть использованы различные пути введения в течение различных периодов в качестве проектного решения.
Как правило, иммуноген (с или без адъюванта) инъецируется в млекопитающее множественными подкожными или внутрибрюшинными инъекциями или внутримышечными или внутривенными инъекциями. При некоторых обстоятельствах могут быть использованы целые клетки, экспрессирующие удлиненный гликосфинголипид I типа. В зависимости от природы иммуногена (т.е. процента гидрофобности, процента гидрофильности, стабильности, суммарного заряда, изоэлектрической точки и т.д.) удлиненный гликосфинголипид I типа или его части может быть модифицирован или конъюгирован для того, чтобы быть иммуногенным или более иммуногенным в животном, таком как млекопитающие, которое должно быть иммунизировано. Например, удлиненный гликосфинголипид I типа или его часть могут быть конъюгированы с носителем. Конъюгация включает любую химическую конъюгацию дериватизацией активных химических функциональных групп на иммуногене и/или иммуногенном белке, который конъюгирован таким образом, чтобы формировались ковалентная связь или другие способы, известные специалисту в данной области. Примеры таких носителей или иммуногенных белков включают, не ограничиваясь перечисленным, KLH, овальбумин, альбумин сыворотки, бычий тироглобулин, соевый ингибитор трипсина и разнородные Е-хэлперные пептиды. Различные адъюванты могут быть применены для увеличения иммунологического ответа, как описано выше.
Сразу после получения подходящего препарата становится возможным выделение определенных антител из множества антител с помощью известных методов разделения, таких как аффинная хроматография, пэннинг, абсорбция и т.п. Таким образом, для дополнительного исследования могут быть получены индивидуальные виды антитела, например, для секвенирования для получения аминокислотных последовательностей одного или более CDR.
Антитела настоящего изобретения предпочтительно содержат моноклональные антитела. Моноклональные антитела могут быть приготовлены с помощью технологии гибридом, такой как описана Kohler et al., Nature 256:495 (1975); U.S. Пат. США No.4,376,110; Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988); и Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-CeIl Hybridomas, Elsevier (1981), с помощью методов рекомбинантных ДНК, например, с помощью изготовления и применения трансфектом, или других способов, известных специалисту. Другие примеры и способы, которые могут быть применены для продуцирования моноклональных антител, включают, не ограничиваясь перечисленным, метод человеческих В-клеточных гибридом (Kosbor et al., Immunology Today 4:72 (1983); и Cole et al., Proc Natl Acad Sci USA 80:2026 (1983)), и метод EBV-гибридом (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp.77-96, Alan R. Liss (1985)). Такие антитела могут принадлежать к любому классу иммуноглобулинов, включая IgG, IgM, IgE, IgA и IgD, и любому их подклассу. Гибридома, продуцирующая mAb изобретения, может культивироваться in vitro или in vivo.
В гибридомной модели хозяин, такой как мышь, гуманизированная мышь, трансгенная мышь с генами человеческой иммунной системы, лошадь, овца, хомяк, кролик, крыса, верблюд или любое другое подходящее животное-хозяин, иммунизируется для появления лимфоцитов, которые продуцируют, или способны продуцировать, антитела, которые специфически связывают удлиненный гликосфинголипид I типа.
В ином случае лимфоциты могут быть иммунизированы in vitro. Лимфоциты затем сливают с миеломными клетками с помощью подходящего средства для слияния, такого как полиэтиленгликоль, для образования гибридомной клетки (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, pp.59-103 (1986)).
В общем, изготовление антителопродуцирующих гибридом либо из лимфоцитов периферической крови («PBL»), которые используются, если необходимы клетки человеческого происхождения, либо из клеток селезенки или лимфатического узла, которые используются, если необходимы источники нечеловеческого происхождения. Иммортализованные клеточные линии, как правило, являются трансформированными клетками млекопитающих, особенно миеломные клетки, происходящие из грызунов, коров или людей. Как правило, используют миеломную клеточную линию из крысы или мыши. Гибридомные клетки могут культивироваться в подходящей культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или более веществ, которые ингибируют рост или выживание не слитых, иммортализованных клеток. Например, если родительские клетки потеряли фермент, гипоксантингуанин-фосфорибозилтрансферазу (HGPRT или HPRT), то культуральная среда для гибридом, как правило, будет включать гипоксантин, аминоптерин и тимидин («НАТ-среда»), вещества, которые предотвращают рост дефицитных по HGPRT клеток.
Предпочтительными иммортализованными клеточными линиями являются те, которые эффективно сливаются, поддерживают стабильный высокий уровень продуцирования антитела выбранными антителопродуцирующими клетками и которые являются чувствительными к среде, такой как среда HAT. Среди миеломных клеточных линий есть мышиные миеломные линии, такие как те, что получены из МОРС-21 и МРС-11 мышиных опухолей, которые можно получить в Центре Распространения Клеток Института Солка, Сан-Диего, Калифорния, и клетки SP2/0, FO или X63-Ag8-653, которые можно получить в Американской Коллекции Типовых Культур, Манассас, Виргиния. Также может быть применена мышиная миеломная клеточная линия NSO (Европейская Коллекция Клеточных культур, Солсбери, Уилшир, Великобритания).
Клеточные линии человеческой миеломы и мышино-человеческой гетеромиеломы также были описаны для продуцирования человеческих моноклональных антител (Kozbor, J Immunol 133:3001 (1984); и Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc, pp.51-63 (1987)).
Альтернативной для получения гибридом является применение вместо химического слияния электрического слияния. Вместо химического слияния В клетки могут быть имммортализованы с помощью, например, вируса Эпштейна-Барр, или другого трансформирующего гена, см., например, Zurawaki et al., in Monoclonal Antibodies, ed., Kennett et al., Plenum Press, pp.19-33 (1980). Трансгенные мыши, экспрессирующие иммуноглобулины, и мыши с тяжелой комбинированной иммунной недостаточностью (SCID), трансплантированные человеческими В-лимфоцитами, также могут применяться.
Культуральную среду, в которой растут гибридомные клетки, проверяют на предмет продуцирования моноклональных антител, направленных против удлиненного гликосфинголипида I типа. Специфичность связывания моноклональных антител, продуцируемых гибридомными клетками, может быть определена иммунопреципитацией, или с помощью in vitro анализа связывания, такого как радиоиммунный анализ (РИА), флюороцитометрический анализ (FACS), иммуноферментный анализ (ИФА). Такие методы известны в данной области и находятся в пределах навыков специалиста. Также может быть применена система «Biacore», что известно в данной области. Сродство связывания моноклонального антитела с удлиненным гликосфинголипидом I типа может быть определена, например, с помощью анализа Скэтчарда (Munson et al., Anal Biochem 107:220(1980)).
После определения гибридомных клеток, которые обладают требуемой специфичностью, сродством и/или активностью, клоны могут быть субклонированы процедурой предельных разведений и выращены стандартными способами (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, pp.59-103 (1986)). Подходящие культуральные среды включают, например, среду Игла, модифицированную Дульбекко (DMEM), или RPMI-1640. Кроме того, гибридомные клетки могут расти in vivo в виде асцитных опухолей в животных.
Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, являются разделенными подходящим способом или выделенными из культуральной среды, асцитной жидкости или сыворотки обычными способами очистки иммуноглобулинов, такими как, например, сефароза с белком А, сефароза с белком G, хроматография на гидроксилапатите, гель-фильтрация, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография.
Для получения моноклональных антител в данной области существует множество способов и, таким образом, изобретение не ограничено только лишь получением в гибридомах. Например, моноклональные антитела могут быть получены посредством методов рекомбинантных ДНК, таких как описанные в Пат. США No.4,816,567. В ином случае, человеческие антитела могут быть получены из трансгенных животных, таких как КМ-мыши, описанные выше. В этом контексте термин «моноклональное антитело» относится к антителу, полученному из одиночного эукариотического, вирусного или прокариотического клона.
b
a
b
a
3
Таким образом, с помощью человеческих опухолевых клеток, известных своей экспрессией структуры с удлиненной цепью I типа, таких как клетки Colo205, или соединения, содержащего удлиненную цепь I типа, такого как гликосфинголипид, такой как Le/Le, используемых в качестве антигена, инбредных или трансгенных мышей иммунизируют и стимулируют, как это известно в данной области. Получали селезенку, сливали клетки с миеломными клетками, получали гибридомы и культивировали последние. Клеточные надосадочные жидкости скринировали посредством ИФА с помощью, например, Le/Le, использованного в качестве захватывающего реактива. Положительные клоны амплифицировали. IMH2 является примером мышиного моноклонального тела IgG, которое специфично связывает структуру с удлиненной цепью I типа.
1
С помощью трансгенной мышиной модели человеческие антитела могут быть получены иммунизацией трансгенных мышей иммуногеном в виде протяженной цепи I типа. Такие антитела могут быть получены на платной основе, например, от «Medarex», Нью-Джерси и «Amgen», Калифорния. С помощью КМ-мышей GNX-8 (IgG) моноклональное антитело было выбрано для дальнейшего описания характеристик и применения.
y
x
y
GNX-8 является цитотоксическим антителом. В анализах на клетках рака толстой кишки Соlо205, используемых в качестве мишеней, антитело GNX-8 лизировало клетки злокачественной клеточной линии, а в концентрации, по меньшей мере, 50 мкг/мл антитело лизировало все клетки в культуре. GNX-8 не связывается с эритроцитами. Антитело связывает клетки колоректального рака, клетки рака молочной железы и клетки рака легких. В отличие от IMH2 GNX-8 не связывается с Le-Le или Le.
ДНК, кодирующую моноклональные антитела изобретения, легко выделяли и секвенировали с помощью обычных процедур (например, с помощью олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связывать гены, кодирующие тяжелую или легкую цепи мышиных антител, или такие же цепи из человеческих, гуманизированных или других источников) (Innis et al. in PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic (1990) and Sanger et al., Proc Natl Acad Sci 74:5463 (1977)). Гибридомные клетки могут служить источником такой ДНК.
После выделения ДНК может быть помещена в экспрессирующие векторы, которые затем трансфицируют в клетки-хозяева, такие как клетки Е.coli, клетки NSO, клетки COS, клетки яичников китайского хомячка (СНО) или клетки миеломы, которые без этого не производят белок иммуноглобулина, для получения синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. ДНК также может быть модифицирована, например, заменой кодирующей последовательности константных доменов тяжелой и легкой цепей в местах, гомологичных мышиным последовательностям (Пат. США No. 4,816,567 и Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA 81:6851 (1984)), или ковалентным объединением с кодирующей последовательностью иммуноглобулина, всей или частью кодирующей последовательности неиммуноглобулинового полипептида. Такой неиммуноглобулиновый полипептид может быть заменен на константные домены антитела изобретения, или может быть заменен на вариабельные домены одного сайта узнавания удлиненного гликосфинголипида антитела изобретения для получения химерного бивалентного антитела.
Антитела могут быть моновалентными антителами. Способы получения моновалентных антител хорошо известны в данной области. Например, один способ включает рекомбинантную экспрессию иммуноглобулиновой легкой цепи и модифицированной тяжелой цепи. Тяжелая цепь укорачивается, как правило, в любой точке Fc-области с тем, чтобы предотвратить перекрестное связывание тяжелых цепей. В ином случае, соответствующие цистеиновые остатки заменяют на другой аминокислотный остаток или удаляют, с тем, чтобы предотвратить перекрестное связывание.
ab
(ab')2
ab
(ab')2
(ab')2
H1
ab')2
(ab')2
(ab')2
Фрагменты антител, которые распознают специфические эпитопы, могут быть получены известными методами. Традиционно, эти фрагменты получают посредством протеолитического расщепления интактных антител (см., например, Morimoto et al., J Biochem Biophys Methods 24:107 (1992); и Brennan et al. Science 229:81 (1985)). Например, фрагменты F и F изобретения могут быть получены протеолитическим расщеплением иммуноглобулиновых молекул, с помощью ферментов, таких как папаин (для получения F-фрагментов) или пепсина (для получения F-фрагментов). F-фрагменты содержат вариабельную область, константную область легкой цепи и C-домен тяжелой цепи. Однако эти фрагменты могут быть получены напрямую рекомбинантными клетками-хозяевами. Например, фрагменты антитела могут быть выделены из фаговой библиотеки антитела. В ином случае, F(-SH фрагменты могут быть непосредственно выделены из Е.coli и химически связаны с образованием F-фрагментов (Carter et al., Bio/Technology 10: 163 (1992). В соответствии с другим подходом F-фрагменты могут быть выделены напрямую из рекомбинантной клеточной культуры. Другие способы для получения фрагментов антитела будут очевидны для квалифицированного практика. В другом воплощении антитела выбора являются одноцепочечным Fv-фрагментом, см., например, WO 93/16185.
Для некоторых применений, включая in vivo применение антител в человеке и in vitro анализы обнаружения, предпочтительным может оказаться применение химерных, гуманизированных или человеческих антител. Способы получения химерных антител известны в данной области, см., например, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., J Immunol Methods 125:191 (1989) и Пат. США No. 5,807,715; 4,816,567 и 4,816397.
Гуманизированные антитела получают из молекул антител, полученных из видов, исключая человека, которые связывают удлиненный гликосфинголипид I типа, из которых один или более CDR вставляются в FR-области молекулы человеческого иммуноглобулина. Антитела могут быть гуманизированы с помощью различных методов, известных в данной области, включая, например, пересадка CDR (ЕРО 239,400; WO 91/09967; и Пат. США No. 5,225,539; 5,530,101 и 5,585,089), облицовка или изменение поверхности (ЕРО 592,106; ЕРО 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28:489 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7:805 (1994); и Roguska et al., Proc Natl Acad Sci USA 91:969 (1994)) и перетасовку цепей (U.S. Пат. США No.5,565,332).
Гуманизированное антитело имеет один или более аминокислотных остатков из источника, который не является человеком. Аминокислотные остатки из источника, который не является человеком, часто называются «импортированными» остатками, которые, как правило, берутся из «импортирующего» вариабельного домена. В принципе, гуманизация может быть осуществлена в соответствии со способами Winter et al. (Jones et al., Nature 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); и Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), заменой нечеловеческих CDR или частей последовательностей CDR на соответствующие последовательности человеческого антитела. Соответственно, такие «гуманизированные» антитела являются химерными антителами (Пат. США No. 4,816,567), в которых заменили существенно меньше чем интактный вариабельный домен, соответствующей последовательностью из нечеловеческого вида. На практике, гуманизированные антитела, как правило, являются человеческими антителами, в которых некоторые остатки в CDR и возможно некоторые остатки FR заменены на аналогичные участки в антителах грызунов. Константная область тяжелой цепи и шарнирная область могут быть из любого класса или подкласса для получения требуемого эффекта, такого как частичная эффекторная функция.
Часто остатки каркаса в человеческой каркасной области могут быть заменены соответствующим остатком из антитела донора CDR, для того чтобы изменить и, возможно, улучшить связывание с антигеном. Каркасные замены идентифицируются способом, известным в данной области, например моделированием взаимодействий CDR и каркасных остатков, для обнаружения каркасных остатков, важных для связывания антигена, и сравнением последовательностей для обнаружения необычных каркасных остатков в определенных позициях, см., например, Пат. США No. 5,585,089 и Riechmann et al., Nature 332:323 (1988).
Также предпочтительно, чтобы гуманизированные антитела сохраняли высокое сродство к удлиненному гликосфинголипиду I типа и сохраняли или приобретали другие благоприятные биологические свойства. Таким образом, гуманизированные антитела могут быть получены процессом анализа родительских последовательностей и различных концептуальных производных гуманизированных антител с помощью трехмерных моделей родительской и гуманизированной последовательностей. Гипотетические трехмерные иммуноглобулиновые модели широко доступны и хорошо знакомы специалистам в данной области. Также доступны компьютерные программы, которые иллюстрируют и отображают возможные трехмерные конформационные структуры выбранных кандидатных иммуноглобулиновых последовательностей. Просмотр выведенных данных позволяет анализировать вероятную роль некоторых остатков в функционировании кандидатной иммуноглобулиновой последовательности, т.е. проводить анализ остатков, которые влияют на способность кандидатного иммуноглобулина связывать удлиненный гликосфинголипид I типа. Таким образом, FR-остатки могут быть выбраны и объединены из реципиента и импортируемых последовательностей так, чтобы требуемая характеристика антитела, такая как повышенное сродство, к целевому антигену, увеличивалась, несмотря на то что это CDR-остатки, которые напрямую и наиболее существенно влияют на связывание с удлиненным гликосфинголипидом I типа. Также CDR-области могут быть модифицированы, чтобы содержать одну или более аминокислот, которые отличаются от тех, что получены из родительского антитела, из которого получен CDR, для обеспечения усиленных или отличных интересующих свойств, таких как, например, связывание с большим сродством или с большей авидностью.
4
Некоторые части константных областей антитела могут быть обработаны и изменены для получения гомологов, производных, фрагментов антитела и т.п. со свойствами, отличными от или лучшими, чем те, что наблюдались в родительском антителе. Так, например, во многих антителах IgG около шарнирной области образуются внутрицепочечные дисульфидные связи. Внутрицепочечная связь может дестабилизировать родительскую бивалентную молекулу, образуя моновалентные молекулы, содержащие тяжелую цепь с соответствующей легкой цепью. Такие молекулы могут реассоциировать, но на случайной основе.
1
Другой набор аминокислот, подходящий для модификации, включает аминокислоты в области шарнира, которые влияют на функции антитела, такие как связывание молекулы тяжелой цепи, с Fc-рецептором, и интернализация связанного антитела. Такие аминокислоты включают, в молекулах IgG, остатки от около 233 до около 237 (Glu-Leu-Leu-Gly-Gly, SEQ ID NO:1); от около 252 до около 256 (Met-Ile-Ser-Arg-Thr, SEQ ID NO:2) и от около 318 (Glu) до около 331 (Pro), включая, например, Lys320, Lys 322 и Pro329.
Полностью человеческие антитела особенно востребованы для терапевтической обработки пациентов-людей. Человеческие антитела могут быть сделаны с помощью различных способов, известных в данной области, включая способы фагового дисплея, описанные выше, с помощью библиотек антител, полученных из человеческих иммуноглобилиновых последовательностей, см. Пат.США No. 4,444,887 и 4,716,111; и WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 и WO 91/10741. Методы Cole et al. и Boerder et al. также доступны для изготовления человеческих моноклональных антител (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss (1985) и Boemer et al., J Immunol 147:86 (1991)).
Человеческие антитела также могут быть получены с помощью трансгенных мышей, которые неспособны экспрессировать функциональные эндогенные иммуноглобулины, но которые экспрессируют некоторые человеческие иммуноглобулиновые гены. Например, комплексы человеческих иммуноглобулиновых генов тяжелой и легкой цепей могут быть введены, случайно или гомологичной рекомбинацией, в мышиные эмбриональные стволовые клетки. В ином случае, человеческая вариабельная область, константная область и дополнительная область могут быть введены в мышиные эмбриональные стволовые клетки, в дополнение к человеческим генам тяжелой и легкой цепей. Мышиные иммуноглобулиновые гены тяжелой и легкой цепей могут быть обработаны, с тем, чтобы быть нефункциональными отдельно или одновременно с введением человеческого иммуноглобулинового локуса гомологичной рекомбинацией. В частности, гомозиготная делеция JH-области предотвращает эндогенное производство антител. Измененные эмбриональные стволовые клетки наращивают и микроинъецируют в бластоцисты для получения химерных мышей. Химерных мышей затем скрещивают для получения гомозиготоного потомства, которое экспрессирует человеческие антитела, см., например, Jakobovitis et al., Proc Natl Acad Sci USA 90:2551 (1993); Jakobovitis et al., Nature 362:255 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol 7:33 (1993); и Duchosal et al., Nature 355:258 (1992)).
Трансгенных мышей затем иммунизируют в обычном режиме гликосфинголипидом I типа, например, всем или частью удлиненного гликосфинголипида I типа, или содержащего его мембранного препарата. Моноклональные антитела, направленные против гликосфинголипида I типа, могут быть получены из иммунизированных, трансгенных мышей с помощью обычной гибридомной технологии. Человеческие иммуноглобулиновые трансгены, собранные в трансгенных мышах, подвергаются реаранжировке в ходе дифференцировки В-клеток и последовательно подвергаются переключению между классами и соматическим мутациям. Таким образом, применение такого метода возможно для продуцирования терапевтически полезных антител IgG, IgA, IgM и IgE. Обзорную информацию см. в Lonberg et al., Int Rev Immunol 13:65-93 (1995). Для обсуждения получения человеческих антител и человеческих моноклональных антител и протоколов для получения таких антител см., например, WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; и WO 96/33735; EPO No.0598877; и Пат. США No.5,413,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; 5,885,793; 5,916,771 и 5,939,598. Кроме того, компании, такие как «Amgen» (Фремонт, Калифорния), «Genpharm» (Сан-Хосе, Калифорния) и «Medarex, Inc.» (Принстон, Нью Джерси), могут быть привлечены для получения человеческих антител, направленных против удлиненного гликосфинголипида I типа, с помощью технологии, подобной описанной выше.
Также, человеческие mAb могут быть получены иммунизацией мышей, которым были трансплантированы человеческие лейкоциты периферической крови, спленоциты или костный мозг (например, методом «trioma», «XTL Biopharmaceuticals», Израиль).
Полностью человеческие антитела, которые распознают выбранный эпитоп, могут быть получены с помощью метода, называемого «управляемый отбор». В этом подходе выбранное нечеловеческое моноклональное антитело, например мышиное антитело, используется для управления отбором полностью человеческого антитела, распознающего тот же эпитоп (Jespers et al., Bio/Technology 12:899 (1988)).
При использовании рекомбинатных методов вариант антитела может продуцироваться внутриклеточно, в периплазмическое пространство, либо секретироваться напрямую в среду. Если антитело продуцируется внутриклеточно, на первом этапе удаляется дисперсный дебрис, представленный либо хозяйскими клетками, либо лизированными клетками, например, центрифугированием или ультрафильтрацией. Carter et al., Bio/Technology 10: 163 (1992), описывают процедуру выделения антител, которые секретируются в периплазматическое пространство Е. coli. Короче говоря, клеточная паста подвергается действию ацетата натрия (рН 3,5) и ЭДТА. Клеточный дебрис может быть удален центрифугированием. Если вариант антитела секретируется в среду, то надосадочную жидкость из таких экспрессирующих систем, как правило, концентрируют с помощью коммерчески доступного фильтра для концентрации белка, например, с помощью блока ультрафильтрации «Amicon» или «Millipore Pellicon». Ингибитор протеаз, такой как PMSF, может быть включен на любой из вышеуказанных этапов для ингибирования протеолиза, а антибиотики могут быть включены для предотвращения роста случайных контаминантов.
1
2
4
3
3
Приготовленная из клеток композиция с антителом может быть очищена с помощью, например, хроматографии на гидроксилапатите, гель-электрофореза, диализа, аффинной хроматографии. Возможность применения протеина А или протеина G в качестве аффинного лиганда зависит от вида и изотипа иммунглобулинового Fc-домена, присутствующего в антителе. Протеин А может быть использован для очистки антител, в основе которых лежат тяжелые цепи IgG, IgG или IgG (Lindmark et al., J. Immunol. 62:1 (1983)). Протеин G может быть применен для мышиных изотипов и для человеческих IgG (Guss et al., EMBO J 5: 1567. (1986)). Матрицей, к которой прикрепляется аффинный лиганд, чаще всего является агароза, но также существуют другие варианты матриц. Механически устойчивые матрицы, такие как стекло с контролируемым размером пор или поли(стиролдивинил)бензол, позволяют использовать, по сравнению с агарозой, высокие скорости потока и более короткие периоды проведения процесса. Если вариант антитела содержит СН-домен, то полезной для очистки является смола «Bakerbond ABXTM» (JT Baker; Филлипсбург, Нью-Джерси). Также доступны другие методы очистки белков, такие как фракционирование на ионообменной колонке, преципитация этанолом, обращеннофазовая ВЭЖХ, хроматография на силикагеле, хроматография на гепарин-агарозе, хроматография на анионообменной и катиоонообменной смоле (например, на колонке с полиаспарагиновой кислотой), хроматофокусирование, ДСН-ПААГ и преципитация сульфатом аммония, в зависимости от антитела или варианта, который должен быть извлечен.
После какой-либо предварительной стадии(ий), смесь, содержащая антитело или вариант интереса и контаминанты, может быть подвергнута гидрофобной хроматографии при низком рН с помощью буфера элюции при рН в диапазоне около 2,5-4,5, предпочтительно осуществленной при низких концентрациях солей (например, около 0-0,25 М соли).
ab
Кроме того, антитела изобретения могут, в свою очередь, быть использованы для образования антиидиотипических антител, которые «имитируют» удлиненный гликосфинголипид I типа, с помощью методов, хорошо известных специалистам в данной области (см., например, Greenspan et al., FASEB J 7:437 (1989) и Nissinoff, J Immunol 147:2429 (1991)). Например, антитела, которые связывают и конкурентно ингибируют мультимеризацию и/или связывание лиганда с протяженным гликосфинголипидом I типа, могут быть применены для образования антиидиотипов, которые «имитируют» удлиненный гликосфинголипид I типа. Такие нейтрализующие антиидиотипы или F-фрагменты таких антиидиотипов могут быть применены в терапевтических или диагностических схемах лечения.
Антитела настоящего изобретения могут быть биспецифичными антителами. Биспецифические антитела могут быть моноклональными, предпочтительно человеческими или гуманизированными, антителами, которые обладают специфичностью связывания, по меньшей мере, с двумя различными антигенами. В настоящем изобретении одна из специфичностей связывания направлена против удлиненного гликосфинголипида I типа, тогда как другая специфичность может быть против какого-либо другого антигена, например против белка клеточной поверхности, рецептора, рецепторной субъединицы, лиганда, тканеспецифичного антигена, вирусного белка, вирускодируемого белка оболочки, фармакологически активного агента, такого как лекарственное средство, бактериальнополученный белок, белок бактериальной поверхности и т.п.
Способы изготовления биспецифичных антител хорошо известны. Традиционно, рекомбинантное получение биспецифичных антител основано на коэкспрессии двух пар иммуноглобулиновых тяжелых/легких цепей, где две тяжелые цепи обладают различными специфичностями (Milstein et al., Nature 305:537 (1983)). Из-за случайной реаранжировки иммуноглобулиновых тяжелой и легкой цепей гибридомы (квадромы), продуцирующие потенциальную смесь около десяти различных молекул антител, из которых, возможно, только одно будет иметь правильную биспецифичную структуру. Очистка правильной молекулы, как правило, осуществляется стадиями аффинной хроматографии. Подобные процедуры раскрыты в WO 93/08829 и в Traunecker et al., EMBO J 10:3655 (1991). Другие способы для изготовления биспецифичных антител представлены, например, в работе Kufer et al., Trends Biotech 22:238-244, 2004.
H2
H3
H1
Вариабельные домены антител с требуемыми специфичностями связывания могут быть слиты с последовательностями иммуноглобулиновых константных доменов. Слияние предпочтительно осуществляется с константным доменом иммуноглобулиновой тяжелой цепи, содержащей, по меньшей мере, часть шарнира, C- и C-области. Это может происходить, если константная область тяжелой цепи (C), содержащая сайт, необходимый для связывания с легкой цепью, присутствует, по меньшей мере, в одной из химер. ДНК, кодирующую химеры иммуноглобулиновых тяжелых цепей и, при необходимости, иммуноглобулиновую легкую цепь, вставляются в отдельные экспрессирующие векторы и совместно трансформируются в подходящий организм-хозяин. Для дополнительных деталей образования биспецифичных антител см., например, работу Suresh et al., Meth Enzym 121:210 (1986).
Гетероконъюгатные антитела также предусмотрены настоящим изобретением. Гетероконъюгатные антитела состоят из двух ковалентно связанных антител. Такие антитела были предложены, например, для нацеливания клеток иммунной системы на нежелательные клетки (Пат. США No.4,676,980). Предполагается, что антитела могут быть приготовлены in vitro с помощью известных способов синтетической белковой химии, включая те, которые включают перекрестно связывающие агенты. Например, иммунотоксины могут быть сконструированы с помощью реакции дисульфидного обмена или путем образования тиоэфирной связи. Примеры подходящих реактивов для этой цели включают иминотиолат и метил-4-меркаптобутиримид, и те, что описаны, например, в Пат. США No.4,676,980.
Кроме того, можно получать однодоменные антитела к удлиненному гликосфинголипиду I типа. Примеры такой технологии были описаны в WO 9425591 для антител, полученных из тяжелой цепи иммуноглобулинов Camelidae, а также в US 20030130496, описывающем выделение однодоменных полноразмерных человеческих антител из фаговых библиотек.
v
v
ab
В ином случае, на практике могут быть осуществлены методы, описанные для получения одноцепочечных антител (Пат. США No.4,946,778; Bird, Science 242:423 (1988); Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85:5879 (1988) и Ward et al., Nature 334:544 (1989)). Одноцепочечные антитела образуются посредством связывания фрагментов тяжелой и легкой цепей F-области посредством аминокислотного мостика, что в результате дает одноцепочечный полипептид. Методы сборки функциональных F-фрагментов в Е. coli также могут быть применены (Skerra et al., Science 242: 1038 (1988)). Одноцепочечные антитела («scFv») и способ их конструирования описаны, например, в Пат. США No.4,946,778. В ином случае F могут быть сконструированы и экспрессированы с помощью подобных средств. Все полностью и частично человеческие антитела могут быть менее иммунногенными, чем полностью мышиные антитела, а фрагменты и одноцепочечные антитела также могут быть менее иммуногенными.
Рассматриваемое изобретение охватывает антитела, рекомбинантно слитые или химически конъюгированные (включая как ковалентные, так и нековалентные конъюгации) с полипептидом. Слитые или конъюгированные антитела настоящего изобретения могут быть применены для упрощения очистки, см., например, WO 93/21232; ЕР 439,095; Naramura et al., Immunol Lett 39:91 (1994); Пат.США No. 5,474,981; Gillies et al., Proc Natl Acad Sci USA 89: 1428 (1992); и Fell et al., J Immunol 146:2446 (1991).
Очистка может быть облегчена применением распознаваемого маркера или метки. Например, маркером может быть аминокислотная последовательность, такая как гексагистидиновый пептид, например, как метка, представленная в векторе pQE (Qiagen, Inc., Чатсуорт, Калифорния), среди других, множество которых являются коммерчески доступными, Gentz et al., Proc Natl Acad Sci USA 86:821 (1989). Другие пептидные метки, полезные при очистке, включают, не ограничиваясь перечисленным, метку «НА», которая соответствует эпитопу, полученному из белка гемагглютинина вируса гриппа (Wilson et al., Cell 37:767 (1984)), и метку «flag».
Антитела или фрагменты антитела могут быть выделены из фаговой библиотеки антител, образованной с помощью методов, описанных в работе McCafferty et al., Nature 348:552 (1990). Clarkson et al., Nature 352:624 (1991) и Marks et al., J Mol Biol 222:581 (1991) описывают выделение мышиных и человеческих антител, соответственно, с помощью фаговых библиотек. Последующие публикации описывают получение человеческих антител с высоким сродством (нМ диапазон) с помощью перетасовки цепей (Marks et al., Bio/Technology 10:779 (1992)), а также с помощью комбинаторной инфекции и in vivo рекомбинации в качестве стратегии для конструирования очень больших фаговых библиотек (Waterhouse et al., Nucl Acids Res 21:2265 (1993)). Таким образом, методы являются жизнеспособными альтернативами традиционным методам моноклональных гибридом антитела для выделения моноклональных антител.
Кандидатные антитела против удлиненного гликосфинголипида I типа могут быть протестированы с помощью ИФА, клеточного сортера с возбуждением флуоресценции, вестерн-блоттинга или других иммунохимических способов, известных в данной области. Таким образом, В-клетки или клетки, экспрессирующие удлиненный гликосфинголипид I типа, могут быть применены для обнаружения связывания антитела с ним, с помощью известного метода, или подходящих мембранных препаратов, содержащих удлиненный гликосфинголипид I типа или его часть, или с помощью очищенных или выделенных структур цепей I типа, которые могут быть прикреплены к твердой фазе и использованы в качестве захватывающего элемента в анализе, сконфигурированном в качестве проектного решения.
Для определения того, связывает ли гомолог антитела человеческий удлиненный гликосфинголипид I типа, может быть применен обычный анализ связывания. Полезные анализы связывания удлиненного гликосфинголипида I типа включают анализы с помощью клеточного сортера с возбуждением флуоресценции, анализы с помощью ИФА, радиоиммуноанализы и т.п., которые обнаруживают связывание антитела, и на основании этого функции, с человеческим протяженным гликосфинголипидом I типа. Полноразмерные и растворимые формы человеческого гликосфинголипида I типа, указанного в данном документе, являются полезными в таких анализах. Связывание антитела или гомолога с протяженным гликосфинголипидом I типа, или с его растворимыми фрагментами, удобно может быть обнаружено посредством применения второго антитела, специфичного к иммуноглобулинам видов, из которых получены антитело или гомолог. Второе антитело может нести детектируемую метку или может быть сконфигурировано так, чтобы быть обнаруженным.
Способность антитела или гомолога связывать человеческий удлиненный гликосфинголипид I типа можно оценить проверкой его способности связывать клетки с человеческим удлиненным гликосфинголипидом I типа. Подходящими клетками с удлиненным гликосфинголипидом I типа для применения в определении того, может ли определенное антитело или гомолог связывать человеческий удлиненный гликосфинголипид I типа, являются доступные клетки культуры ткани млекопитающего, экспрессирующие удлиненный гликосфинголипид I типа, например, на клеточной поверхности.
Связывание антитела или гомолога с клетками с удлиненным гликосфинголипидом I типа может быть определено окрашиванием клеток, например, с флюоресцентно-меченным вторичным антителом, специфичным к иммуноглобулинам того вида, из которого получен тестируемый гомолог антитела. Активируемый флюоресценцией клеточный сортер (fluorescence activated cell sorter, «FACS») может быть применен для обнаружения и количественной оценки любого связывания, см. в общих чертах, Shapiro, Practical Flow Cytometry, Alan R. Liss, Inc., New York, N.Y. (1985).
Для определения, вызывает ли определенное антитело или гомолог значительное уменьшение числа циркулирующих in vivo клеток с удлиненным гликосфинголипидом I типа, количество циркулирующих клеток с удлиненным гликосфинголипидом I типа, выделенных из млекопитающего в пределах 24 часов после введения антитела или гомолога млекопитающему, обладающему нормальной иммунной функцией, определяется количественно и сравнивается с количеством перед введением, или количеством в контрольном млекопитающем, которому вводили антитело, совпадающее по изотипу, или гомолог нерелевантной специфичности вместо антитела или гомолога рассматриваемого изобретения. Количественная оценка клеток с удлиненным гликосфинголипидом I типа у животных, которым вводили антитела против удлиненного гликосфинголипида I типа или его функциональную часть или производное, может быть получена, например, окрашиванием полученных клеток флюоресцентно-меченными антителами, которые связывают антитела против удлиненного гликосфинголипида I типа, а также меченные антитела, специфичные к Т-клетками и В-клеткам, с последующим FACS-анализом.
Антитела рассматриваемого изобретения могут быть описаны или указаны посредством эпитопа(ов) или части(ей) удлиненного гликосфинголипида I типа, которые антитело распознает или специфически связывает. Эпитоп(ы) может быть определен, как описано в данном документе, например, физическими средствами, такими как масс-спектрометрия, композиционный анализ сахаридов, молекул, с которыми связываются сахара, конформационные эпитопы и т.п.
Антитела рассматриваемого изобретения также могут быть описаны или указаны по показателю перекрестной реактивности. Антитела, которые связывают удлиненные гликосфинголипиды I типа, которые имеют, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 65%, по меньшей мере, 60%, по меньшей мере, 55%, по меньшей мере, 50% идентичности (рассчитанной с помощью способов, известных в данной области и описанных в данном документе) относительно удлиненного гликосфинголипида I типа, также включаются в рассматриваемое изобретение.
D
D
-7
-6
-5
-8
-15
-8
-12
-9
-11
-8
-10
Антитела рассматриваемого изобретения также могут быть описаны или указаны по показателю сродства связывания с интересующим удлиненным гликосфинголипидом I типа. Антитела против удлиненного гликосфинголипида I типа могут связывать с Kменьше чем около 10 М, меньше чем около 10 М или меньше чем около 10 М. Более высокие значения сродства связывания в антителе интереса могут быть полезными, так же как и те, что с равновесной константой диссоциации или K от около 10 до около 10 М или больше, от около 10 до около 10 М, от около 10 до около 10 М, или от около 10 до около 10 М. Изобретение также обеспечивает антитела, которые полностью ингибируют связывание антитела с эпитопом изобретения, как определено способом, известным в данной области для определения конкурентного связывания, например, иммуноанализами, описанными в данном документе. В предпочтительных воплощениях антитело конкурентно ингибирует связывание с эпитопом, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 75%, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 60% или, по меньшей мере, на 50%.
Рассматриваемое изобретение также включает конъюгаты, содержащие антитело интереса. Конъюгаты содержат два первичных компонента, антитело интереса и второй компонент, который может быть связывающим клетку агентом, цитотоксичным агентом, фармакологически активным агентом, лекарственным средством и т.д.
Используемый в данном документе термин «агент, связывающий клетки» относится к агенту, который специфически распознает или связывает молекулу на клеточной поверхности. Таким образом, связывающий клетки агент может быть агентом, который связывает CD-антиген, патогенный антиген, такой как вирусный антиген, дифференцирующий антиген, опухолевый антиген, клеткоспецифичный антиген, тканеспецифичный антиген и Ig или Ig-подобную молекулу и т.п.
Связывающие клетки агенты могут быть любого известного в настоящее время типа, или типа, который станет известным, и включают пептиды, непептиды, сахариды, нуклеиновые кислоты, лиганды, рецепторы и т.п., или их комбинации. Связывающий клетки агент может быть любым соединением, которое связывает клетку, либо специфическим, либо неспецифическим образом. В общем, агентами могут быть антитела (особенно моноклональные антитела), лимфокины, гормоны, факторы роста, витамины, молекулы, транспортирующие питательные вещества (например, трансферрин), или любая другая связывающая клетку молекула или вещество.
ab
ab'
(ab')2
v
Другие примеры связывающих клетки агентов, которые могут быть применены, включают: поликлональные антитела; моноклональные антитела и фрагменты антител, такие как F, F, F и F-фрагменты (Parham, J. Immunol. 131:2895-2902 (1983); Spring et al., J. Immunol. 113:470-478 (1974); и Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89: 230-244 (1960)).
Второй компонент также может быть цитотоксичным агентом. Термин «цитотоксичный агент», используемый в данном документе, относится к веществу, которое уменьшает или блокирует функцию или рост клеток и/или приводит к разрушению клеток. Таким образом, цитотоксичным агентом может быть таксол, майтансиноид, например, DM1 или DM4, СС-1065 или аналог СС-1065, рицин, лекарственное средство, митомицин С и т.п. В некоторых воплощениях цитотоксичный агент, как и какой-либо связывающий агент конъюгата рассматриваемого изобретения, ковалентно прикреплен, напрямую или через расщепляемый или не расщепляемый линкер, с антителом интереса.
Примеры подходящих майтансиноидов включают майтансинол или аналоги майтансинола. Майтансиноиды ингибируют образование микротрубочек и являются высоко токсичными для клеток млекопитающих.
Примеры подходящих аналогов майтансинола включают те, которые обладают модифицированным ароматическим кольцом, и те, которые обладают модификациями в других позициях. Такие подходящие майтансиноиды раскрыты в Пат. США No.4,424,219; 4,256,746; 4,294,757; 4,307,016; 4,313,946; 4,315,929; 4,331,598; 4,361,650; 4,362,663; 4,364,866; 4,450,254; 4,322,348; 4,371,533; 6,333,410; 5,475,092; 5,585,499 и 5,846,545.
Примеры подходящих аналогов майтансинола, обладающих модифицированным ароматическим кольцом, включают: (1) С-19-дехлоро (Пат. США No. 4,256,746) (полученный, например, восстановлением LAH ансамутоцина Р2); (2) С-20-гидрокси (или С-20-деметил)+/-С-19-дехлоро (Пат. США №4,361,650 и 4,307,016) (полученный, например, деметилированием с помощью Streptomyces или Actinomyces или дехлорированием с помощью литийалюминийгидрида (lithium aluminum hydride (LAH)); и (3) С-20-деметокси, С-20-ацилокси (-OCOR), +/-дехлоро (Пат. США No.4,294,757) (полученный путем ацилирования с использованием ацилхлоридов).
2
2
5
2
2
2
Примеры подходящих аналогов майтансинола, обладающие модификациями в других позициях, включают: (1) C-9-SH (Пат. США No.4,424,219) (полученные реакцией майтансинола с помощью HS или PS); (2) С-14-алкоксиметил(деметокси/CHOR) (Пат. США No.4,331,598); (3) С-14-гидроксиметил или ацилоксиметил (CHOH или СНОАс) (Пат. США No.4,450,254) (полученный из Nocardia); (4) С-15-гидрокси/ацилокси (Пат. США No.4,364,866) (полученный конверсией майтансинола при помощи Streptomyces); (5) С-15-метокси (Пат. США №4,313,946 и 4,315,929) (выделенный из Trewia nudiflora); (6) С-18-N-деметил (Пат. США №4,362,663 и 4,322,348) (полученный деметилированием майтансинола при помощи Streptomyces) и (7) 4,5-деокси (Пат. США No 4,371,533) (полученный восстановлением майтансинола трихлоридом титана/литийалюминийгидридом).
Цитотоксичные конъюгаты могут быть получены in vitro методами. Для присоединения цитотоксичного агента, лекарственного средства или пролекарства к антителу, как правило, используется связывающая группа. Подходящие связывающие группы известны в данной области и включают дисульфидные группы, тиоэфирные группы, кислотолабильные группы, фотолабильные группы, пептидазолабильные группы и эстеразолабильные группы. Например, конъюгаты могут быть сконструированы с помощью реакции дисульфидного обмена или образованием тиоэфирной связи между антителом интереса и лекарственным соединением или пролекарством.
Молекула, конъюгированная с антителом интереса, может быть молекулой с фармакологической активностью, такой как лекарственный препарат, такой как малая молекула или биологическое вещество. Таким образом, биологическое вещество может быть, например, цитокином. Молекула может быть пролекарством, таким как эфир лекарственного средства. Молекула может быть радионуклидом.
Как отмечалось выше, изобретение обеспечивает выделенные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих антитело или его функциональный вариант, как раскрыто в данном документе, векторные конструкции, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептиды, связывающие удлиненный гликосфинголипид I типа настоящего изобретения, клетки-хозяева, содержащие такой вектор, и рекомбинантные методы для получения полипептида, который связывает удлиненные гликосфинголипиды I типа.
Вектор обычно содержит компоненты, известные в данной области, и, как правило, включает, не ограничиваясь перечисленным, один или более следующих компонентов: сигнальную последовательность, точку начала репликации, промотор, полиА-последовательность, один или более маркерных или селективных генов, последовательности, облегчающие и/или усиливающие трансляцию, энхансерный элемент и т.п. Таким образом, экспрессирующие векторы включают нуклеотидную последовательность, функционально связанную с такими подходящими транскрипционными или трансляционными регуляторными нуклеотидными последовательностями, как те, что получены из генов млекопитающих, микробов, вирусов и насекомых. Примеры дополнительных регуляторных последовательностей включают операторы, рибосомальные сайты связывания с мРНК и/или другие подходящие последовательности, которые контролируют транскрипцию и трансляцию, например инициацию и терминацию. Нуклеотидные последовательности являются «функционально связанными», если регуляторная последовательность функционально относится к нуклеотидной последовательности для соответствующего полипептида. Таким образом, промоторная нуклеотидная последовательность функционально связана, например, с последовательностью тяжелой цепи антитела, если промоторная нуклеотидная последовательность контролирует транскрипцию этой нуклеотидной последовательности.
Кроме того, последовательности, кодирующие соответствующие сигнальные пептиды, которые не связаны естественным образом с последовательностями тяжелой и/или легкой цепей антитела, могут быть включены в экспрессирующие вектора. Например, нуклеотидная последовательность для сигнального пептида (секретируемый лидер) может быть слита в рамке считывания с полипептидной последовательностью так, чтобы антитело секретировалось в периплазматическое пространство или в среду.
Сигнальные пептиды, которые являются функциональными в целевых клетках-хозяевах, усиливают внеклеточную секрецию соответствующего антитела или его части. Сигнальный пептид может быть отщеплен от полипептида при секреции антитела из клетки. Примеры таких секреторных сигналов хорошо известны и включают, например, те, что описаны в Пат. США No.5,698,435; 5,698,417 и 6,204,023.
Вектор может быть плазмидой, одноцепочечным или двухцепочечным вирусным вектором, одноцепочечным или двухцепочечным РНК- или ДНК-фаговым вектором, фагемидой, космидой или другим носителем трансгена, представляющего интерес. Такие векторы могут быть введены в клетки в качестве полинуклеотидов с помощью хорошо известных методов для введения ДНК и РНК в клетки. Векторы, в случае фаговых и вирусных векторов, также могут быть введены в клетки в виде упакованного или инкапсулированного вируса, или вирусоподобной частицы с помощью хорошо известных методов для инфекции и трансдукции. Вирусные векторы могут быть репликативно-компетентными или реплекативно-дефектными. В последнем случае, размножение вируса, в общем, происходит только в комплементарных клетках-хозяевах и с помощью множества векторов, несущих различные вирусные компоненты, необходимые для продуцирования частиц. Бесклеточные системы трансляции также могут быть использованы для продуцирования белка с помощью РНК, полученной из настоящих ДНК-конструкций, представляющих интерес (см. также WO 86/05807 и WO 89/01036; и Пат. США No.5,122,464).
Антитела настоящего изобретения могут быть экспрессированы в любой подходящей клетке-хозяине. Примеры клеток-хозяев, полезных для рассматриваемого изобретения, включают прокариотические, дрожжевые или эукариотические клетки и включают, не ограничиваясь перечисленным, микроорганизмы, такие как бактерии (например, Е.coli, В.subtilis, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia и Shigella, а также Bacilli, Pseudomonas и Streptomyces), трансформированные экспресирующими векторами на основе ДНК бактериофага, плазмидной ДНК, космидной ДНК, которые содержат последовательности, кодирующие антитело интереса; дрожжи (например, Saccharomyces, Pichia, Actinomycetes, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Candida, Trichoderma, Neurospora и мицелиальные грибы, такие как Neurospora, Penicillium, Tolypocladium и Aspergillus, трансформированные рекомбинантными дрожжевыми экспрессирующими векторами, которые содержат последовательности, кодирующие антитело; системы клеток насекомых, инфицированных рекомбинантными вирусными экспрессирующими векторами (например, Baculovirus), которые содержат последовательности, кодирующие антитело; системы растительных клеток с рекомбинантными вирусными экспрессирующими векторами (например, вирус мозаики цветной капусты, CaMV; или вирус табачной мозаики, TMV) или трансформированные рекомбинантными плазмидными экспрессирующими векторами (например, Ti-плазмидой), которые содержат последовательности, кодирующие антитело; или системы клеток млекопитающих (например, клетки COS, СНО, ВНK, 293 или 3Т3), содержащие рекомбинантные экспрессирующие конструкции, содержащие промоторы, полученные из генома клеток млекопитающих (например, промотор металлотионеина) или из вирусов млекопитающих (например, поздний промотор аденовируса; или 7.5K. промотор вируса вакцинии).
Экспрессирующие векторы для применения в прокариотических клетках-хозяевах в общем содержат один или более фенотипических селективных маркерных генов. Фенотипическим селективным маркерным геном является, например, ген, кодирующий белок, который придает устойчивость к антибиотику или который восполняет автотрофную потребность. Примеры полезных экспрессирующих векторов для прокаритических клеток-хозяев включают те, которые получены из коммерчески доступных плазмид, таких как pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Упсала, Швеция), pGEMl (Promega Biotec, Мэдисон, Висконсин), рЕТ (Novagen, Мэдисон, Висконсин) и pRSET (Invitrogen, Карсбад, Калифорния), ряда векторов (Studier, J Mol Biol 219:37 (1991); и Schoepfer, Gene 124:83 (1993)). Промоторные последовательности, обычно используемые в векторах для рекомбинантной экспрессии в прокариотических клетках-хозяевах, включают Т7 промотор (Rosenberg et al., Gene 56:125 (1987)), промотор β-лактамазы (пенициллиназы), лактозный промотор (Chang et al., Nature 275:615 (1978); и Goeddel et al., Nature 281:544 (1979)), систему триптофанового промотора (trp) (Goeddel et al., Nucl Acids Res 8:4057 (1980)) и tac промотор (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1990)).
+
Дрожжевые векторы часто содержат последовательность начала репликации, например, из дрожжевой плазмиды 2µ, автономную репликативную последовательность, промоторную область, последовательности полиаденилирования, последовательности терминации транскрипции и ген селективного маркера. Подходящие промоторные последовательности для дрожжевых векторов включают, среди прочего, промоторы для металлотионеина, 3-фосфоглицераткиназы (Hitzeman et al., J Biol Chem 255:2073 (1980)) или для других гликолитических ферментов (Holland et al., Biochem 17:4900 (1978)), таких как энолаза, глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа, гексокиназа, пируватдекарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкозо-6-фосфатизомераза, 3-фосфоглицератмутаза, пируваткиназа, триозфосфатизомераза, фосфоглюкозоизомераза и глюкокиназа. Другие подходящие векторы и промоторы для применения в дрожжевой экспрессии дополнительно описаны в Fleer et al., Gene 107:285 (1991). В данной области хорошо известны другие подходящие промоторы и векторы для дрожжей или протоколов дрожжевой трансформации. Протоколы трансформации дрожжей хорошо известны. Один такой протокол описан в Hinnen et al., Proc Natl Acad Sci 75:1929 (1978), в котором отбирают трансформанты в селективной среде с Trp.
Любая эукариротическая клеточная культура является работоспособной, будь то культура из позвоночных или беспозвоночных. Примеры включают клетки растений и насекомых (Luckow et al., Bio/Technology 6:47 (1988); Miller et al., Genetic Engineering, Setlow et al., eds., vol.8, pp.277-9, Plenum Publishing (1986); и Maeda et al., Nature 315:592 (1985)). Например, для получения гетерологичных белков может быть применена бакуловирусная система. В системе насекомого Autographa califomica вирус ядерного полиэдроза (AcNPV) может быть применен в качестве вектора для экспрессии инородных генов. Вирус растет в клетках Spodoptera frugiperda. Кодирующая антитело последовательность может быть клонирована под контролем промотора AcNPV (например, промотора полиэдрина). Другие хозяева, которые были обнаружены, включают Aedes, Drosophila melanogaster и Bombyx mori. Для трансфекции широкодоступными являются различные вирусные штаммы, например, L-1 вариант AcNPV и штамм Вm-5 из Bombyx mori NPV. Более того, культуры растительных клеток хлопка, кукурузы, картофеля, сои, петунии, помидора, водорослей, ряски и табака также могут быть использованы в качестве хозяина, что известно в данной области.
Клетки позвоночных и выращивание клеток позвоночных в культуре (тканевой культуре) может быть рутинной процедурой, хотя есть привередливые клеточные линии, которые требуют, например, специализированной среды с уникальными факторами, фидерными клетками и т.п., см. Tissue Culture, Kruse et al., eds., Academic Press (1973). Примерами полезных линий клеток-хозяев из млекопитающих являются клетки почек обезьян; человеческих эмбриональных почек, почек детеныша хомяка; яичников китайского хомяка (СНО, Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77:4216 (1980)); мышиные клетки Сертоли, клетки рака шейки матки человека (например, HeLa); клетки почки собаки; клетки легких человека; клетки печени человека; клетки опухоли молочной железы мыши и NSO клетки.
Клетки-хозяева трансформируют вектором для получения антитела и культивируют в обычной питательной среде, содержащей факторы роста, витамины, минералы и т.п., а также подходящие индукторы для используемых клеток и векторов. Часто используемые промоторные и энхансерные последовательности получают, например, из вируса полиомы, аденовируса 2, вируса обезьян 40 (SV40) и человеческого цитомегаловируса (CMV). Для обеспечения других генетических элементов для экспрессии последовательностей структурных генов в клетке-хозяине млекопитающего могут быть применены последовательности ДНК, полученные из вирусного генома SV40, например точка начала репликации SV40, ранний и поздний промотор, энхансер, сайты сплайсинга и полиаденилирования. Вирусные ранний и поздний промоторы особенно полезны, потому что оба легко получаются из вирусного генома в качестве фрагментов, которые могут также содержать вирусную точку начала репликации. Примерные экспрессирующие векторы для применения в клетках-хозяевах из млекопитающих коммерчески доступны.
Коммерчески доступная среда, такая как «Ham's F10», минимальная поддерживающая среда (Minimal Essential Medium (MEM)), RPMI-1640 и модифицированная Дульбекко среда Игла (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)) подходит для культивирования клеток-хозяев. Кроме того, любые среды, описанные в Ham et al., Meth Enzymol 58:44 (1979), Barhes et al., Anal Biochem 102:255 (1980) и в Пат. США No. 4,767.704; 4,657,866; 4,560,655; 5,122,469; 5,712,163 или 6,048,728, могут быть применены в качестве культуральной среды для клеток-хозяев. Любые такие среды могут быть дополнены при необходимости гормонами и/или другими факторами роста (такими как инсулин, трансферин или эпидермальный фактор роста), солями (такими как хлориды, такие как натрий, кальций или магний хлорид; и фосфаты), буферами (такими как HEPES), нуклеотидами (такими как аденозин и тимидин), антибиотиками, микроэлементами (которые могут быть определены как неорганические соединения, как правило, присутствующие в конечных концентрациях в микромолярном диапазоне) и глюкозой или эквивалентным источником энергии. Любые другие необходимые добавки могут быть включены в соответствующих концентрациях, в зависимости от проектного решения. Культуральные условия, такие как температура, рН и т.п., являются, как известно в данной области, подходящими для клеток и позволяют осуществлять требуемую экспрессию трансгена.
Полинуклеотиды, представляющие интерес, могут быть получены, и нуклеотидная последовательность полинуклеотидов определяется любым способом, известным в данной области. Например, если нуклеотидная последовательность антитела известна, то полинуклеотид, кодирующий антитело, может быть собран из химически синтезированных олигонуклеотидов (например, как описано в Kutmeier et al., Bio/Techniques 17:242 (1994)) с последующей амплификацией лигированных олигонуклеотидов, например, с помощью ПЦР.
В ином случае, полинуклеотид, кодирующий антитело, может быть получен из нуклеиновой кислоты, экспрессирующей антитело клетки. Если клон, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую определенное антитело, не доступен, но последовательность молекулы антитела известна, нуклеиновая кислота, кодирующая иммуноглобулин, может быть получена из подходящего источника, такого как библиотека, которая может быть библиотекой, специфичной для антителопродуцирующих клеток, таких как гибридомные клетки, которые отобраны для экспрессии антитела изобретения. Для ПЦР-амплификации могут быть сконструированы подходящие праймеры. Амплифицированные нуклеиновые кислоты, полученные ПЦР, затем могут быть клонированы в реплицирующиеся векторы для клонирования с помощью любого способа, известного в данной области.
Как только определяют нуклеотидную последовательность антитела и соответствующую аминокислотную последовательность, нуклеотидную последовательность антитела можно обрабатывать для получения интересующих эквивалентов, описанных в данном документе, с помощью способов, известных в данной области для обработки нуклеотидных последовательностей, например, с помощью методов рекомбинантных ДНК, сайт-направленного мутагенеза, ПЦР и т.п. (см., например, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1990); и Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1998)) для получения антител, обладающих различными аминокислотными последовательностями, например, для создания аминокислотных замен, делеций и/или вставок.
Для определения последовательностей CDR аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой и/или легкой цепей может быть проверена хорошо известными способами, например, сравнением известных аминокислотных последовательностей других вариабельных областей тяжелой и легкой цепей для определения областей гипервариабельности последовательности. С помощью рутинных методов рекомбинантных ДНК одна или более CDR могут быть вставлены в каркасные области, например в человеческие каркасные области для гуманизации нечеловеческого антитела, как описано выше. Полинуклеотид, представляющий интерес, полученный комбинированием каркасных областей и одного или более CDR, кодирует молекулу, которая специфически связывает удлиненный гликосфинголипид I типа, или, по меньшей мере, углеводные эпитопы и структуру, распознаваемую посредством этого. Например, такие способы могут быть применены для создания аминокислотных замен или делеций одного или более остатков цистеина, участвующих во внутрицепочечной дисульфидной связи для получения молекул антитела, с отсутствием одной или более внутрицепочечных дисульфидных связей.
Антитела или фрагменты антитела изобретения могут быть применены для обнаружения удлиненного гликосфинголипида I типа и, следовательно, клеток, экспрессирующих удлиненный гликосфинголипид I типа, в биологическом образце in vitro или in vivo. В одном воплощении антитело против удлиненного гликосфинголипида I типа изобретения применяется для определения наличия и уровня удлиненного гликосфинголипида I типа в ткани или в клетках, полученных из ткани. Уровни удлиненного гликосфинголипида I типа в ткани или биопсии могут быть определены, например, иммуноанализом с антителами или фрагментами антител изобретения. Ткань или ее биопсия может быть заморожена или зафиксирована. Тот же самый или другие способы могут быть применены для определения других свойств удлиненного гликосфинголипида I типа, таких как его уровень, клеточная локализация и т.п.
Вышеописанный способ может быть применен, например, для диагностики злокачественного новообразования у объекта, у которого известно или у которого подозревается злокачественное новообразование, в котором уровень удлиненного гликосфинголипида I типа, измеренный в указанном пациенте, сравнивается с уровнем нормального эталонного объекта или стандарта.
Рассматриваемое изобретение дополнительно обеспечивает моноклональные антитела, гуманизированные антитела, и их эпитопсвязывающие фрагменты, которые дополнительно метятся для применения в исследовательских или диагностических приложениях. В некоторых воплощениях метка является, например, радиометкой, флюорофором, хроматофором, агентом для имэджинга или ионом металла.
Также обеспечивается способ диагностики, в котором указанные меченные антитела или их эпитопсвязывающие фрагменты вводятся объекту, у которого подозревается злокачественное новообразование, артрит, аутоиммунные заболевания или другие заболевания, связанные с, вызванные или ассоциированные с экспрессией и/или функцией удлиненного гликосфинголипида I типа, и распределение метки внутри тела измеряется или подвергается мониторингу.
Антитело рассматриваемого изобретения или его фрагмент могут быть применены в качестве агентов для аффинной очистки. В этом процессе антитела иммобилизуют на твердой фазе, например на дектсране или агарозе, или на фильтровальной бумаге, способами, известными в данной области. Иммобилизованное антитело контактирует с образцом, содержащим удлиненный гликосфинголипид I типа или клетки, несущие его, подлежащие очистке, и затем подложку промывают подходящим растворителем, который удаляет по существу весь материал в образце за исключением удлиненного гликосфинголипида I типа или клеток, подлежащих очистке, который связан с представляющим интерес иммобилизованным антителом. Наконец, подложку промывают другим подходящим растворителем, таким как глициновый буфер, рН 5,0, который высвободит удлиненный гликосфинголипид I типа или клетки от представляющего интерес антитела.
36
14
125
3
131
Для диагностических приложений антитело, представляющее интерес, как правило, будет помечено с помощью детектируемой группировки или маркера. Доступно множество меток, которые, в общем, могут быть сгруппированы в следующие категории: (а) радиоизотопы, такие как S, С, I, H и I (антитело может быть помечено радиоизотопом с помощью способа, описанного, например, в Current Protocols in Immunology, vol.12, Coligen et al., ed., Wiley-Interscience, New York (1991), a радиоактивность может мыть измерена с помощью сцинциляционного счетчика); (b) флюоресцентные метки, такие как редкоземельные хелаты, (хелаты европия), флюоресцеин и его производные, родамин и его производные, дансил, лиссамин, фикоэритрин и «Texas Red», флюоресцентные метки могут быть конъюгированы с антителом с помощью метода, раскрытого в Current Protocols in Immunology, выше, например, где флюоресцентная метка может быть количественно оценена с помощью флюориметра; и (с) доступны различные метки на основе субстратов ферментов (в Пат. США No. 4,275,149 дан обзор), причем фермент, в общем, катализирует химическое изменение хромогенного субстрата, которое может быть измерено с помощью различных методов, например, фермент может катализировать изменение цвета субстрата, которое может быть измерено спектрофотометрически, или фермент может изменить флюоресценцию или хемилюминисценцию субстрата. Известны методы для количественной оценки изменений флюоресценции, например, с помощью люминометра, или метка как донор передает энергию флюоресцентному акцептору. Примеры ферментных меток включают люциферазы (например, люциферазу светлячков и бактериальную люциферазу; Пат. США No.4737456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, малатдегидрогеназу, уреазу, пероксидазу, такую как пероксидаза хрена (HRPO), щелочную фосфатазу, β-галактозидазу, глюкоамилазу, лизоцим, сахаридооксидазы (например, глюкозооксидазу, галактозооксидазу и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу), гетероциклические оксидазы (такие как уриказы и ксантиноксидазы), лактопероксидазу, микропероксидазу и т.п. Методы для конъюгации ферментов с антителами описаны в O'Sullivan et al., Meth Enz, ed. Langone & Van Vunakis, Academic Press, New York, 73 (1981).
Для применения таких меток доступны подходящие субстраты, такие как: [1] для пероксидазы хрена пероксид водорода в качестве субстрата, где пероксид водорода окисляет предшественник красителя (например, ортофенилендиамин (OPD) или 3,3',5,5'-тетраметилбензидин гидрохлорид (ТМВ); (II) для щелочной фосфатазы (АР) п-нитрофенилфосфат в качестве хромогенного субстрата; и (III) β-D-галактозидаза (β-D-Gal) с хромогенным субстратом (например, п-нитрофенил-β-D-галактозидом) или флуорогенным субстратом, таким как 4-метилумбеллиферил-β-D-галактозид.
Другие фермент-субстратные комбинации доступны специалистам в данной области. Для общего обзора см. Пат. США №4,275,149 и 4,318,980.
Иногда метку конъюгируют с антителом опосредованно. Например, антитело может быть конъюгировано с биотином и с любым из репортеров, упомянутых выше, может быть конъюгировано с авидином или наоборот. Биотин связывает селективно авидин и таким образом метка может быть конъюгирована с антителом непрямым образом. Различные авидины известны в данной области. В ином случае, для достижения непрямой конъюгации метки антитело может быть конъюгировано с малым гаптеном (например, дигоксином), а одна из числа различных типов меток или репортеров, упомянутых выше, конъюгируется с антителом против дигоксина. Таким образом, непрямая конъюгация метки с антителом или мутеином может быть достигнута с помощью вторичного антитела.
В другом воплощении изобретения антитело не требует мечения, и присутствие его может быть обнаружено с помощью меченого антитела, которое связывает антитело, с помощью другой формы второго антитела.
Антитела настоящего изобретения могут быть использованы в любом известном аналитическом способе, таком как анализы конкурентного связывания, прямые или непрямые сэндвич-анализы и анализы иммунопреципитации. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques (CRC Press, Inc. 1987).
Конкурентно-связывающие анализы основываются на способности меченого стандарта конкурировать с тестируемым образцом за связывание с ограниченным количеством антитела. Количество антигена в тестируемом образце обратно пропорционально количеству стандарта, который связывается с антителом. Для облегчения определения количества связываемого стандарта антитело, в общем, переходит в нерастворимую форму до или после конкуренции. В результате стандартный и тестируемый образцы, которые связаны с антителами, могут быть удобно отделены от стандартного и тестируемого образцов, которые остаются несвязанными.
Сэндвич-анализы включают применение двух антител, каждое из которых способно связывать отличающуюся иммуногенную часть, детерминанту или эпитоп мишени, которую необходимо обнаружить. В сэндвич-анализе тестируемый образец, который необходимо проанализировать, связывается первым антителом, которое иммобилизуется напрямую или не напрямую с твердой подложкой, а после этого второе антитело, прямо или непрямо, меченное, связывается со связанным тестируемым образцом, таким образом формируя нерастворимый комплекс из трех частей, см., например, Пат. США No.4,376,110. Второе антитело может быть само по себе меченным с помощью детектируемой группировки (прямые сэндвич-анализы) или может быть измерено с помощью антитела против иммуноглобулина или другого подходящего члена пары связывания (например, антитело/антиген, рецептор/лиганд, фермент/субстрат), который связывается с детектируемой группировкой (непрямой сэндвич-анализ). Например, одним типом сэндвич-анализа является ИФА-анализ, в случае которого детектируемой группировкой является фермент.
Для иммуногистохимиии клетка или образец ткани может быть свежим или замороженным или может быть залитым в парафин и зафиксированным с помощью консерванта, такого как, например, формалин.
111
99
14
131
3
32
35
Антитела могут также применяться в диагностических анализах in vivo. В общем, антитело или его вариант метят с помощью радионуклеотида (такого как In, Tc, С, I, H, P или S), так что участки экспрессии удлиненного гликосфинголипида I типа могут быть локализованы с помощью, например, иммуносцинтиграфии и гамма-камеры.
Рассматриваемое изобретение также включает наборы, например, содержащие антитело, его фрагмент, гомолог, его производное и т.д., такое как меченый или цитотоксичный конъюгат, и инструкции для применения антитела, конъюгата, для цитолиза или мечения определенных типов клеток и т.п. Инструкции могут включать руководства по применению антитела, конъюагата и т.д. in vitro, in vivo или ex vivo. Антитело может быть в жидком виде или в твердом виде, как, правило, в лиофилизированном виде. Набор может содержать другие подходящие реактивы, такие как буфер, раствор для восстановления и другие необходимые ингредиенты для целевого применения. Предполагается упакованная комбинация реактивов в заранее определенных количествах с инструкциями для их применения, например, для терапевтического применения для осуществления диагностического анализа. Если антитело мечено, например, ферментом, то набор может включать субстраты и кофакторы, необходимые для фермента (например, субстратного предшественника, который дает детектируемый хромофор или флюорофор). Кроме того, могут быть добавлены другие добавки, такие как стабилизаторы, буферы (например, блокирующий буфер или лизирующий буфер) и т.п. Относительные количества различных реактивов могут различаться для обеспечения концентраций раствора реактива, который предоставляет пользовательскую гибкость, экономию пространства, экономию реактивов и т.п. Реактивы могут быть предоставлены в виде сухих порошков, обычно лиофилизированных, включая наполнители, которые при растворении обеспечивают раствор реагента, обладающий подходящей концентрацией.
Антитела настоящего изобретения могут быть применены при лечении млекопитающих. В одном воплощении антитело или эквивалент интереса вводится нечеловеческому млекопитающему в целях получения, например, преклинических данных. Примерные, не являющиеся людьми, млекопитающие, которые должны быть обработаны, включают не являющихся людьми приматов, собак, кошек, грызунов и других млекопитающих, на которых проводятся преклинические исследования. Такие млекопитающие могут лечь в основу животных моделей для болезней, которые необходимо лечить с помощью антитела, или могут быть использованы в исследованиях токсичности антитела интереса. В каждом из этих воплощений исследования по эскалации дозы могут быть осуществлены в млекопитающих. Продукт, представляющий интерес, может также обладать терапевтическим применением в этих животных.
Антитело, с или без второго компонента, такого как терапевтическая группировка, конъюгированная с ним, вводимое отдельно или в комбинации с цитотоксическим фактором(ами), может применяться в качестве терапевтического. Настоящее изобретение направлено на терапию на основе антител, которая включает введение антител изобретения животному, млекопитающему или человеку, для лечения заболевания, нарушения или состояния, опосредованного или ассоциированного с протяженным гликосфинголипидом I типа. Животное или объект может быть млекопитающим, которое нуждается в определенном лечении, например, млекопитающим, у которого было диагностировано определенное заболевание, например, заболевание, связанное с удлиненным гликосфинголипидом I типа, или заболевание, ассоциированное с аномальной экспрессией и функцией структуры удлиненной цепи I типа. Антитела, направленные против удлиненного гликосфинголипида I типа, являются полезными, например, для профилактики или лечения, например, злокачественных опухолевых и аутоиммунных расстройств. Например, введение терапевтически приемлемой дозы антитела против удлиненного гликосфинголипида I типа рассматриваемого изобретения, или коктейля множества рассматриваемых антител или их эквивалентов, или в комбинации с другими антителами из различных источников, или в комбинации с не являющимся антителом лекарственным средством, таким как противовоспалительное лекарственное средство, цитотоксический агент, антибиотик и т.п., таким как платиносодержащее лекарственное средство, метотрексат и т.п., симптомы заболевания могут быть уменьшены или предотвращены у обрабатываемого млекопитающего, особенно у человека.
Терапевтические соединения изобретения включают, но не ограничиваются перечисленным, антитела изобретения (включая фрагменты, аналоги, эквиваленты или их производные, как описано в данном документе) и нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела изобретения, как описано в данном документе (включая фрагменты, аналоги и их производные) и антиидиотипические антитела, как описано в данном документе. Антитело изобретения может быть применено для лечения, ингибирования или предотвращения заболеваний, расстройств или состояний, связанных с аберрантной экспрессией и/или активностью удлиненного гликосфинголипида I типа, включая, но, не ограничиваясь перечисленным, любое одно или более заболеваний, расстройств или состояний, описанных в данном документе. Лечение и/или профилактика заболеваний, расстройств или состояний, ассоциированных с нарушенной экспрессией и/или активностью удлиненного гликосфинголипида I типа, включает, но не ограничивается перечисленным, облегчение, по меньшей мере, одного симптома, ассоциированного с этими заболеваниями, расстройствами или состояниями. Антитела изобретения могут быть обеспечены в фармацевтически приемлемых композициях, как это известно в данной области или как описано в данном документе. Термин «физиологически приемлемый», «фармакологически приемлемый», «фармацевтически приемлемый» и т.п. означает одобренное регулирующим агентством федеральных или региональных органов государственного управления или перечисленное в Фармакопее США или в других общепризнанных фармакопеях для применения на животных, а конкретнее на людях.
Антитело против удлиненного гликосфинголипида I типа может быть введено млекопитающему в любой приемлемой форме. Способы внедрения включают, но не ограничиваются перечисленным, парентеральное, подкожное, внутрибрюшинное, внутрилегочное, интраназальное, эпидуральное, ингаляцию и пероральные пути и при необходимости для иммуносупрессивного лечения введение через пораженные ткани. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутрикожное, внутривенное, внутриартериальное или внутриперитониальное введение. Антитела или композиции могут быть введены любым обычным путем, например инфузией или болюсной инъекцией, абсорбцией через эпителиальные или мукослизистые выстилки (например, оральную слизистую, ректальную и кишечную слизистую и т.п.) и могут быть введены вместе с другими биологически активными агентами. Введение может быть системным или местным. Кроме того, может потребоваться ввести терапевтические антитела или композиции изобретения в центральную нервную систему любым подходящим путем, включая интравентрикулярную и интратекальную инъекцию; интравентрикулярная инъекция может быть облегчена интравентрикулярным катетером, например, прикрепленным к резервуару, такому как резервуар Оммайя. Кроме того, антитело может быть надлежащим способом введено пульсовой инфузией, особенно со снижающимися дозами антитела. Предпочтительно дозирование производится инъекцией, предпочтительно внутривенными или подкожными инъекциями, в частности, в зависимости от того, является ли введение краткосрочным или долгосрочным.
Различные другие системы доставки известны и могут быть применены для введения антитела настоящего изобретения, включая, например, инкапсуляцию в липосомы, микрочастицы, микрокапсулы и т.п. (см. Langer, Science 249:1527 (1990)); экспрессию антитела, его мутеина или его интересующей антигенсвязывающей части на липосоме, частице, капсуле и т.п. для получения носителя для таргетинга, Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein et al., eds., p.353-365 (1989); и Lopez-Berestein, ibid., p.317-327; рекомбинантные клетки, способные экспрессировать соединение, см., например, Wu et al., J Biol Chem 262:4429 (1987); конструкцию нуклеиновой кислоты, как части ретровирусного или другого вектора; и т.п.
Активные ингредиенты также могут быть включены в приготовленные микрокапсулы, например, методами коацервации или межфазной полимеризации, например, микрокапсула из гидроксиметилцеллюлозы или желатина и микрокапсула из поли-(метилметацилата), соответственно, в коллоидных системах доставки лекарственных средств (например, липосомах, альбуминовых микросферах, микроэмульсиях, наночастицах и нанокапсулах) или в макроэмульсиях. Такие методы раскрыты в Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. (1980). Если на липосоме или частице представлено антитело, представляющее интерес, то липосомой может быть введено любое множество соединений, таких как не являющееся антителом лекарственное средство, лекарственное средство на основе малой молекулы и т.п. Рассматриваемое антитело может, таким образом, выполнять функцию таргетинга.
Также может использоваться введение через легкие, например, путем применения ингалятора или небулайзера и состава с аэрозольным агентом. Антитело также может быть введено в легкие пациента в форме композиции в виде сухого порошка, см., например, Пат. США No. 6,514,496.
В конкретном воплощении может потребоваться ввести терапевтические антитела или композиции изобретения местно в области, нуждающейся в лечении; это может быть достигнуто, например, и не ради ограничения, локальной инфузией, местным применением, инъекцией, посредством катетера, посредством суппозитория или посредством имланта, где указанный имлант состоит из пористого, непористого или желатинового материала, включая мембраны, такие как силастиковые мембраны или волокна. Предпочтительно, если при введении антитела изобретения внимание уделяется применению материалов, с которыми белок не абсорбируется или адсорбируется.
В еще одном воплощении антитело может быть доставлено в системе с контролируемым высвобождением. В одном воплощении может быть применен насос (см. Langer, Science 249:1527 (1990); Sefton, CRC Crit Ref Biomed Eng 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); and Saudek et al., N Engl J Med 321:574 (1989)). В другом воплощении могут быть применены полимерные материалы (см. Medical Applications of Controlled Release, Langer et al., eds., CRC Press (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen et al., eds., Wiley (1984); Ranger et al., J Macromol Sci Rev Macromol Chem 23:61 (1983); см. также Levy et al., Science 228:190 (1985); During et al., Ann Neurol 25:351 (1989); и Howard et al., J Neurosurg 71:105 (1989)). В еще одном воплощении система контролируемого высвобождения может быть помещена в непосредственной близости от терапевтической мишени.
Могут быть приготовлены препараты с замедленным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащих антитело, где матрицы присутствуют в виде формованных изделий, например, пленок или матриц. Примеры матриц с замедленным высвобождением включают полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидрокиэтилметакрилат), поли(виниловый спирт), полиакрилаты (Пат. США No.3,773,919), кополимеры L-глутаминовой кислоты и этил-L-глутамата, недеградируемого этилен-винил ацетата, деградируемые кополимеры молочной и гликолевой кислот (такие как инъецируемые микросферы, состоящие из кополимера молочной и гликолевой кислот) и поли-D-(-)-3-гидроксимасляную кислоту. Хотя полимеры, такие как этилен-винилацетат и кополимер молочной и гликолевой кислот, позволяют молекулам высвобождаться в течение 100 дней, некоторые гидрогели высвобождают белки в течение более коротких периодов времени. Могут быть разработаны рациональные стратегии для стабилизации в зависимости от используемого механизма. Например, если обнаружилось, что за механизм агрегации отвечает образование межмолекулярной S-S связи через тиосульфидный обмен, то стабилизация может быть достигнута модификацией сульгидрильных остатков, лифилилизацией из кислых растворов, контролем влажности, с помощью соответствующих добавок, аминокислотной замены и разработкой композиций полимерной матрицы.
Терапевтические составы полипептида или антитела могут быть приготовлены для хранения в виде лиофилизированных составов или водных растворов смешиванием полипептида, обладающего требуемой степенью чистоты, с необязательными «фармацевтически приемлемыми» носителями, разбавителями, наполнителями или стабилизаторами, как правило, используемыми в данной области, т.е. буферными агентами, стабилизирующими агентами, консервантами, изотоническими агентами, неионными детергентами, антиоксидантами и другими различными добавками, см. Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Osol, ed. (1980). Такие добавки, в общем, являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях, следовательно, наполнители, разбавители, носители и т.п. являются фармацевтически приемлемыми.
«Выделенное» или «очищенное» антитело является по существу свободным от клеточного материала или других контаминирующих белков из клеточного или тканевого источника или из среды, из которой получен белок, или является по существу свободным от химических предшественников или других химических веществ, если синтезировано химически. Выражение «по существу свободный от клеточного материала» включает препараты антитела, в которых полипептид/белок отделяется от клеточных компонентов клетки, из которой он выделяется или в которой он рекомбинантно продуцируется. Таким образом, антитело, которое является по существу свободным от клеточного материала, включает препараты антитела, имеющие менее чем около 30%, 20%, 10%, 5%, 2,5% или 1% (по сухой массе) контаминирующего белка или клеточного или субклеточного материала. Если антитело продуцируется рекомбинантно, то также предпочтительно свободно от культуральной среды, т.е. культуральная среда составляет меньше чем около 20%, 10%, 5%, 2,5% или 1% от объема белкового препарата. Если антитело получают химическим синтезом, то оно предпочтительно по существу свободно от химических предшественников или других химических веществ и реактивов, т.е. антитело интереса отделено от химических предшественников или других химических веществ, которые вовлечены в синтез белка. Соответственно, такие препараты антитела имеют менее чем около 30%, 20%, 10%, 5% или 1% (по сухой массе) химических предшественников или соединений, отличных от антитела, представляющего интерес. В предпочтительном воплощении настоящего изобретения антитела выделяются или очищаются.
Использованное в данном документе выражение «от низких до недетектируемых уровней агрегации» относится к образцам, содержащим не более чем 5%, не более чем 4%, не более чем 3%, не более чем 2%, не более чем 1% и часто не более чем 0,5% агрегации антитела или его варианта, т.е. двух или более молекул антител или их вариантов, соединенных или слитых вместе, по массе белка, если измерять, например, высокоэффективной эксклюзионной хроматографией (high performance size exclusion chromatography (HPSEC)). Используемый в данном документе термин "от низких до недетектируемых уровней фрагментации" относится к образцам, содержащим от равного или до большего чем 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% молекулы интактного антитела или его варианта, общего белка, например, в одиночном пике, если определять HPSEC, или в двух (2) пиках (тяжелой или легкой цепи), с помощью, например, восстанавливающего капилярного гель-электрофореза (reduced capillary gel electrophoresis (rCGE)) и не содержащего других одиночных пиков, содержащих более чем 5%, более чем 4%, более чем, 3%, более чем 2%, более чем 1%, или более чем 0,5% от общего белка, в каждом. rCGE, используемый в данном документе, относится к капилярному гель-электрофорезу в восстанавливающих условиях, достаточных для восстановления дисульфидных связей в антителе или молекуле типа антитела, или полученной из антитела.
(ab')2
ab
Рассматриваемое изобретение обеспечивает способы для приготовления жидких составов антитела или его связывающего гликосфинголипид I типа фрагмента, где указанные способы содержат концентрирование фракции очищенного антитела до конечной концентрации около 15 мг/мл, 20 мг/мл, около 30 мг/мл, 40 мг/мл, 50 мг/мл, 60 мг/мл, около 70 мг/мл, 80 мг/мл, около 90 мг/мл, 100 мг/мл, около 200 мг/мл, около 250 мг/мл, около 300 мг/мл или более, с помощью, например, полупроницаемой мембраны с соответствующим порогом молекулярной массы (mw) (например, порог 30 кДа, для их F-фрагментов; и порог 10 кДа для F-фрагментов) и, необязательно, диафильтрацию фракции концентрированного антитела в буфере состава с помощью той же самой мембраны.
Кроме того, настоящее изобретение также охватывает стабильные жидкие составы продуктов интереса, которые могут иметь увеличенный период полужизни in vivo. Таким образом, антитело интереса имеет время полужизни в объекте, предпочтительно человеке, больше чем 3 дня, больше чем 7 дней, больше чем 10 дней, больше чем 15 дней, больше чем 25 дней, больше чем 30 дней, больше чем 35 дней, больше чем 40 дней, больше чем 45 дней, больше чем 2 месяца, больше чем 3 месяца, больше чем 4 месяца, больше чем 5 месяцев или еще больше.
Используемые в данном документе термины «стабильность» и «стабильный» в контексте жидкого состава, содержащего антитело против удлиненного гликосфинголипида I типа или его связывающий фрагмент, относятся к устойчивости антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в составе к термическому и химическому разворачиванию, агрегации, деградации или фрагментации в заданных условиях производства, изготовления, транспортировки и хранения. «Стабильные» составы изобретения сохраняют биологическую активность, равную или большую чем 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 99,5% в заданных условиях производства, изготовления, транспортировки и хранения. Стабильность указанного препарата антитела может быть оценена по степеням агрегации, деградации или фрагментации способами, известными специалистам в данной области, включая, но, не ограничиваясь перечисленным, rCGE, электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ) и HPSEC, по сравнению с эталоном, в течение определенного периода времени в соответствии с выбранными условиями хранения, в соответствии с проектным решением.
Рассматриваемое изобретение охватывает жидкие составы, обладающие стабильностью при температурах коммерческого рефрижератора или холодильника, который можно найти в кабинете врача или в лаборатории, например, от около -20°С до около 5°С, указанную стабильность оценивали, например, с помощью высокоэффективной эксклюзионной хроматографии (HPSEC), для целей хранения, например, на срок около 60 дней, около 120 дней, около 180 дней, около года, около 2 лет или более. Жидкие составы настоящего изобретения также демонстрируют стабильность, оцененную, например, посредством HSPEC, при комнатных температурах, в течение, по меньшей мере, нескольких часов, например, около часа, около двух часов или около трех часов до применения.
Термин «носитель» относится к растворителю, адъюванту, наполнителю или носителю, с которым вводится терапевтическое средство. Такие физиологические носители могут быть стерильными жидкостями, такими как вода или масла, включая масла нефтяного, животного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. Вода является подходящим носителем, если фармацевтическая композиция вводится внутривенно. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также могут быть использованы в качестве жидких носителей, особенно для инъецируемых растворов. Подходящие фармацевтические наполнители включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду этанол и т.п. Композиция, если требуется, также может содержать небольшие количества увлажняющих или эмульгирущих агентов, или буферных агентов для поддержания рН. Композиции могут принимать форму растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, составов с замедленным высвобождением, депо и т.п. Рецептура композиции может быть составлена в виде суппозитория, с традиционными связующими и носителями, такими как триглицериды. Пероральные составы могут включать стандартные носители, такие как фармацевтической категории маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, натрия сахарин, целлюлозу, карбонат натрия и т.д., ароматизаторы, красители, отдушки и т.п. Примеры подходящих носителей описаны в «Remington's Pharmaceutical Sciences», Martin. Такие композиции будут содержать эффективное количество антитела предпочтительно в очищенной форме, вместе с подходящим количеством носителя с тем, чтобы обеспечить форму для надлежащего введения пациенту. Как известно в данной области, состав будет создан с учетом способа введения.
Буферные агенты помогают поддерживать рН в диапазоне, который аппроксимирует физиологические условия или условия, способствующие стабильности антитела. Буферы предпочтительно присутствуют в концентрации в диапазоне от около 2 мМ до около 50 мМ. Подходящие буферные агенты для применения в рассматриваемом изобретении включают как органические, так и неорганические кислоты и их соли, такие как, например, цитратные буферы (например, смесь мононатриевого цитрата с динатриевым цитратом, смесь лимонной кислоты-тринатриевого цитрата, смесь лимонной кислоты-мононатриевого цитрата и т.п.) сукцинатные буферы (например, смесь янтарной кислоты-мононатриевого сукцината, смесь янтарной кислоты-гидроксида натрия, янтарной кислоты-динатриевого сукцината и т.п.), тартратные буферы (например, смесь винной кислоты-тартрата натрия, смесь винной кислоты-тартрата калия, смесь винной кислоты-гидроксида натрия и т.п.), фумаратные буферы (например, смесь фумаровой кислоты-мононатриевого фумарата, смесь фумаровой кислоты-динатриевого фумарата, смесь мононатриевого фумарата-динатриевого фумарата и т.п.), глюконатные буферы (например, смесь глюконовой кислоты-глюканата натрия, смесь глюконовой кислоты-гидроксида натрия, смесь глюконовой кислоты-глюконата калия и т.п.), оксалатные буферы (например, смесь щавелевой кислоты-оксалата натрия, смесь щавелевой кислоты-оксалата калия и т.п.), лактатные буферы (например, смесь молочной кислоты-лактата калия и т.п.) и ацетатные буферы (например, смесь уксусной кислоты-ацетата натрия, смесь уксусной кислоты-гидроксида натрия и т.п.). Могут быть применены фосфатные буферы, карбонатные буферы, гистидиновые буферы, соли триметиламина, такие как Tris, HEPES и другие известные буферы.
Для замедления микробного роста могут быть добавлены консерванты в количествах в диапазоне от около 0,2% до около 1% (мас./об.). Подходящие консерванты для применения в настоящем изобретении включают фенол, бензиловый спирт, м-крезол, метилпарабен, пропилпарабен, октадецилдиметилбензилхлорид аммония, галогениды бензалкония (например, хлорид, бромид и йодид), гексаметония хлорид, алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен, катехин, резорцин, циклогексанол и 3-пентанол.
Изотонические агенты присутствуют для обеспечения физиологической изотоничности жидких композиций рассматриваемого изобретения и включают сахароспирты, такие как трех или более атомные сахароспирты, такие как глицерин, эритрит, арабит, ксилит, сорбит и маннит. Сахароспирты могут присутствовать в количестве между от около 0,1% до около 25% по массе, предпочтительно от около 1% до около 5% с учетом относительных количеств других ингредиентов.
Стабилизаторы относятся к широкой категории наполнителей, которые могут по функциям находится в диапазоне от агента-наполнителя до добавки, которая солюбилизирует терапевтический агент или помогает предотвратить денатурацию или прилипание к стенке контейнера. Типичными стабилизаторами могут быть сахароспирты; аминокислоты, такие как аргинин, лизин, глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аланин, орнитин, L-лейцин, 2-фенилаланин, глутаминовая кислота, треонин и т.п.; органические сахара и сахарные спирты, такие как лактоза, трегалоза, стахиоза, арабит, эритрит, маннит, сорбит, ксилит, рибит, мио-инозитол, галактит, глицерин и т.п., включая циклитолы, такие как инозитол; полиэтиленгликоль; аминокислотные полимеры; серосодержащие восстанавливающие агенты, такие как мочевина, глутатион, тиоктовая кислота, тиогликолят натрия, тиоглицерин, α-монотиоглицерин и тиосульфат натрия; низкомолекулярные полипептиды (т.е. <10 остатков); белки, такие как человеческий сывороточный альбумин, бычий сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофобные полимеры, такие как поливинилпирролидон, сахариды, моносахариды, такие как ксилоза, манноза, фруктоза, глюкоза; дисахариды, такие как лактоза, мальтоза и сахароза; трисахариды, такие как раффиноза; полисахариды, такие как дестран и т.п. Стабилизаторы могут присутствовать в диапазоне от около 0,1 до около 10,000 мас./мас. на часть активного белка.
Дополнительные разные инертные наполнители могут включать агенты-наполнители (например, агар, желатин, крахмал и т.п.), хелатирующие агенты (например, ЭДТА), антиоксиданты (например, аскорбиновая кислота, метионин или витамин Е) и вспомогательные растворители.
Используемый в данном документе термин «поверхностно-активное вещество» относится к органическим веществам, обладающим амфипатическими структурами, а именно состоящие из групп с противоположными тенденциями при растворении, как правило, состоящие из маслорастворимой углеводородной цепи и водорастворимой ионной группы. Поверхностно-активные вещества могут быть классифицированы в зависимости от заряда поверхности активной части на анионные, катионные и неионогенные поверхностно-активные вещества. Поверхностно-активные вещества часто используются в качестве смачивающих, эмульгирующих, солюбилизирующих и диспергирующих агентов для различных фармацевтических композиций и препаратов, биологических материалов, которые обсуждались в данном документе.

Неионные поверхностно-активные и детергенты (также известные как «увлажняющие агенты») могут быть добавлены, чтобы помочь растворить терапевтический агент, а также для защиты терапевтических белков против агитационно-индуцированной агрегации, что также позволяет составу подвергаться касательным поверхностным напряжениям, не вызывая денатурации белка. Подходящие неионные поверхностно-активные вещества включают полисорбаты (20, 80 и т.д.), полиоксамеры (184, 188 и т.д.), полиолы Pluronic и моноэфиры полиоксиэтиленсорбитана (TWEEN-20, TWEEN-80 и т.д.). Неионные поверхностно-активные вещества могут присутствовать в диапазоне от 0,05 мг/мл до 1,0 мг/мл, предпочтительно от около 0,07 мг/мл до 0,2 мг/мл.
2
4
Используемый в данном документе термин «неорганическая соль» относится к любому соединению, не содержащему углерод, которое является результатом замены части или всех кислотных водородов или кислоты на металл или группу, действующую как металл, и к часто применяемому в качестве соединения для корректировки тоничности в фармацевтических композициях и препаратах биологических материалов. Наиболее распространенными неорганическими солями являются NaCl, KCl, NaHPO и т.п.
Настоящее изобретение предусматривает жидкие составы связывающего соединения против удлиненного гликосфинголипида I типа или его фрагмента, обладающие значением рН в диапазоне от около 5,0 до около 7,0, или от около 5,5 до 6,5, или от около 5,8 до около 6,2, или около 6,0.
Состав по данному документу также может содержать больше одного активного соединения при необходимости лечения определенного симптома, предпочтительно может содержать те соединения, которые имеют дополняющие активности и которые не оказывают отрицательного воздействия друг на друга. Например, может быть необходимо дополнительно предоставить иммуносупрессирующий агент. Такие молекулы в комбинации присутствуют в надлежащих количествах, которые являются эффективными для предназначенной цели. Состав также может содержать другое лекарственное средство, или малую молекулу, фармакологический агент, такой как антинеопластическое лекарственное средство, такое как цисплатин.
Термин «малая молекула» и аналогичные термины включают, но не ограничиваются перечисленным, пептиды, пептидомиметики, аминокислоты, аналоги аминокислот, органические соединения, фармакологически активные вещества, такие как лекарственные средства, полинуклеотиды, аналоги полинуклеотидов, нуклеотиды, аналоги нуклеотидов, органические и неорганические соединения (т.е., в том числе, гетероорганические и/ металлоорганические соединения) с молекулярной массой менее чем около 10000 г/моль, органические и неорганические соединения, имеющие молекулярную массу менее чем около 5000 г/моль, органические и неорганические соединения, имеющие молекулярную массу менее чем 1000 г/моль, органические и неорганические соединения, имеющие молекулярную массу менее чем около 500 г/моль, и соли, сложные эфиры и другие фармацевтически приемлемые формы таких соединений.
Таким образом, в случае злокачественного новообразования антитела изобретения могут быть введены отдельно или в комбинации с другими типами средств для лечения злокачественных новообразований, включая обычные химиотерапевтические средства (паклитаксел, карбоплатин, цисплатин и доксорубицин), анти-EGFR агенты (гефитиниб, эрлотиниб и цетуксимаб), антиангиогенезные агенты (бевацизумаб и сунитиниб), а также иммуномодуляторы, такие как интерферон-α и талидомид.
Используемые в данном документе термины «терапевтический агент» и «терапевтические агенты» относятся к любому агенту(ам), которые могут применяться при лечении, управлении или облегчении заболевания, расстройства, недуга и т.п., ассоциированных с аберрантной экспрессией, метаболизмом и, в общем, активностью удлиненного гликосфинголипида I типа. Также включенными являются известные соединения с фармакологическим эффектом при лечении заболевания и т.п., которые ассоциированы с абберантной экспрессией удлиненного гликосфинголипида I типа, метаболизмом и активностью.
Рецептура с антителом или его вариантом необязательно составляется с одним или несколькими средствами, используемыми в настоящее время для профилактики или лечения рассматриваемого заболевания. Эффективное количество таких других агентов зависит от количества антитела, присутствующего в составе, типа расстройства или лечения и других факторов, обсуждаемых выше. Как правило, они используются в тех же дозах и с теми же путями введения, что и используемые выше в данном документе или от около 1 до 99% от используемых до настоящего времени доз.
Составы, которые будут применяться для введения in vivo, должны быть стерильными. Это может быть осуществлено, например, фильтрацией через стерильные фильтровальные мембраны. Например, жидкие составы настоящего изобретения могут быть стерилизованы фильтрацией через 0,2 мкм или 0,22 мкм фильтр.
213
Кроме того, антитела рассматриваемого изобретения могут быть конъюгированы с различными эффекторными молекулами, такими как гетерологичные полипептиды, лекарственные средства, радионуклеотиды или токсины, см., например, WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; Пат. США No. 5,314,995 и ЕРО 396,387. Антитело или его фрагмент может быть конъюгировано с терапевтической составляющей, такой как цитотоксин (например, с цитостатическим агентом или агентом, разрушающим клетки), терапевтический агент или радиоактивный ион металла (например, α-излучатели, такие как, например, Bi). Цитотоксин или цитотоксический агент включает любой агент, который отрицательно сказывается на клетках. Примеры включают паклитаксел, цитохалазин В, грамицидин D, этидиум бромид, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин и их аналоги или гомологи. Терапевтические средства включают, не ограничиваясь перечисленным, антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-фторурацил и декарбазин), алкилирующие агенты (например, мехлорэтамин, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (BSNU) и ломустин (CCNU), циулофосфамид, бусульфан, дибромоманнитол, стрептозотоцин, митомицин С и цис-дихлородиамин платина (II) (ДДП) цисплатин), антрациклины (например, даунорубицин, дауномицин и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин, актиномицин, блеомицин, митрамицин и антрамицин (АМС)) и анти-митотические агенты (например, винкристин и винбластин).
Для продления циркуляции антитела в сыворотке in vivo могут быть применены различные методы. Например, молекулы инертного полимера, такого как высокомолекулярный полиэтиленгликоль (ПЭГ), могут быть прикреплены к антителу с или без мультифункционального линкера, либо посредством сайт-специфической конъюгации ПЭГ с N-концом или с С-концом антитела или через ε-аминогруппы, присутствующие на лизиновых остатках. Может быть применена дериватизация линейного или разветвленного полимера, которая приводит к минимальной потере биологической активности. Степень конъюгации может быть легко проверена ДСН-ПААГ и масс-спектрометрией для обеспечения надлежащей конъюгации ПЭГ-молекул с антителами. Непрореагировавший ПЭГ может быть отделен от пэгилированного антитела гель-фильтрацией или ионобменной хроматографией. ПЭГ-дериватизованные антитела могут быть проверены на связывающую активность, а также на эффективность in vivo, с помощью способов, известных специалистам в данной области, например, с помощью описанных в данном документе иммуноанализов.
c
c
с
Антитело, обладающее повышенным периодом полужизни in vivo, также может быть получено путем введения одной или более аминокислотных модификаций (т.е. замен, вставок или делеций) в константный домен IgG, или в его FR-связывающий фрагмент (такой как F или фрагмент шарнирного F-домена), см., например, WO 98/23289; WO 97/34631 и Пат. США No.6,277,375.
Кроме того, антитело может быть конъюгировано с альбумином для получения антитела, более стабильного in vivo или обладающего более длинным периодом полужизни in vivo. Методы известны в данной области, см., например, WO 93/15199, WO 93/15200 и WO 01/77137; и ЕРО 413622. Антитело также может быть модифицировано, например, гликозилированием, ацетилированием, фосфорилированием, амидированием, дериватизацией известными защитными/блокирующими группами, протеолитическим расщеплением, связью с клеточным лигандом или другим белком и т.п.
Методы конъюгирования такой терапевтической составляющей с антителами хорошо известны, см., например, Arhon et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Arhon et al., в Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), Alan R. Liss (1985); Hellstrom et al., в Controlled Drug Delivery, 2nd ed., Robinson et al., eds., Marcel Dekker (1987); Thorpe, в Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al., eds. (1985); Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy, Baldwin et al., eds., Academic Press (1985); и Thorpe et al., Immunol Rev 62:119 (1982). В ином случае, антитело может быть конъюгировано со вторым антителом с образованием гетероконъюгата антитела, такого как бифункциональное антитело, см., например, Пат. США No. 4,676,980.
Конъюгаты изобретения могут быть применены для модификации данного биологического ответа, а терапевтический агент или лекарственная составляющая не должны рассматриваться как ограниченные классическими химическими терапевтическими агентами. Например, лекарственная составляющая может быть белком или полипептидом, обладающим требуемой биологической активностью. Такие белки могут включать, например, токсин, такой как абрин, рицин А, экзотоксин Pseudomonas или дифтерийный токсин; белок, такой как фактор некроза опухолей, α-интерферон, β-интерферон, фактор роста нервов, тромбоцитарный фактор роста, тканевой активатор плазминогена, апоптотический агент, например, TNF-α, TNF-β, AIM I (WO 97/33899), AIM II (WO 97/34911), Fas-лиганд (Takahashi et al., Int Immunol, 6:1567 (1994)), VEGF (WO 99/23105); тромботический агент; антиангиогенный агент, например, ангиостатин или эндостатин; модификаторы биологического ответа, такие как, например, лимфокины, интерлейкин-1 (IL-1), интерлейкин-2 (IL-2), интерлейкин-6 (IL-6), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимурующий фактор (GM-CSF), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (GCSF) или другие факторы роста.
Антитело или вариантная композиция будет формулирована, дозирована и введена в соответствии с добросовестной медицинской практикой. Факторы для рассмотрения в этом контексте включают конкретное расстройство, которое лечат, конкретное млекопитающее, которое лечат, клиническое состояние индивидуального пациента, причина заболевания, участок доставки агента, способ введения, план введения и другие факторы, известные практикующим врачам. «Терапевтически эффективное количество» вводимого антитела или варианта будет регулироваться такими соображениями и может быть минимальным количеством, необходимым для предотвращения, улучшения или лечения заболевания, состояния или расстройства, связанного с удлиненным гликосфинголипидом I типа.
В данном документе термин «эффективное количество» относится к количеству лекарственного действия (например, профилактического или терапевтического агента), которое является достаточным для уменьшения тяжести и/или длительности заболевания, связанного или ассоциированного с удлиненным гликосфинголипидом I типа, которое облегчает один или более его симптомов, которое предотвращает развитие заболевания, связанного или ассоциированного с удлиненным гликосфинголипидом I типа, или которое приводит к регрессии заболевания, связанного или ассоциированного с удлиненным гликосфинголипидом I типа, или которого достаточно для предотвращения развития, рецидива, возникновения или прогрессии заболевания, связанного или ассоциированного с удлиненным гликосфинголипидом I типа, или одного или более его симптомов, или которое усиливает или улучшает профилактический и/или терапевтичечкий эффект(ы) другой терапии (например, эффект другого терапевтического агента), полезной для лечения заболевания, связанного или ассоциированного с удлиненным гликолипидом I типа. Например, представляющее интерес лечение может уменьшить симптом исходя из базовой линии или нормального уровня, по меньшей мере, приблизительно на 5%, предпочтительно, по меньшей мере, 10%, по меньшей мере, 15%, по меньшей мере, 20%, по меньшей мере, 25%, по меньшей мере, 30%, по меньшей мере, 35%, по меньшей мере, 40%, по меньшей мере, 45%, по меньшей мере, 50%, по меньшей мере, 55%, по меньшей мере, 60%, по меньшей мере, 65%, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, или, по меньшей мере, 100%. В еще одном воплощении эффективное количество терапевтического или профилактического агента уменьшает симптом заболевания, связанного или ассоциированного с удлиненным гликосфинголипидом I типа, таким как злокачественное новообразование, на, по меньшей мере, около 5%, предпочтительно, по меньшей мере, 10%, по меньшей мере, 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере, 25%, по меньшей мере, 30%, по меньшей мере, 35%, по меньшей мере, 40%, по меньшей мере, 45%, по меньшей мере, 50%, по меньшей мере, 55%, по меньшей мере, 60%, по меньшей мере, 65%, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, или, по меньшей мере, 100%. Также в данном документе в качестве эквивалента применяется термин «терапевтически эффективное количество».
Количество терапевтического полипептида, антитела или его фрагмента, которые будут эффективными при применении или лечении определенного заболевания или состояния, будет зависеть от природы заболевания или состояния и может быть определено стандартными клиническими методами. Где возможно, кривая доза-эффект и фармакологические композиции изобретения могут вначале быть полученными in vitro. Если подходящая животная модель доступна, то опять же кривая доза-эффект может быть получена и применена для экстраполяции подходящей человеческой дозы практиктическими способами, известными в данной области. Однако, основываясь на общем знании в данной области, фармакологическая композиция, эффективная в содействии уменьшению воспалительного действия, например, может обеспечить местную концентрацию терапевтического агента от около 5 до около 20 нг/мл и предпочтительно между от около 10 до около 20 нг/мл.
В предпочтительном воплощении водный раствор терапевтического полипептида, антитела или его фрагмента может быть введен подкожной инъекцией. Каждая доза может находиться в диапазоне от около 0,5 мг до около 50 мг на килограмм массы тела, или более предпочтительно от около 3 мг до около 30 мг на кг массы тела. Доза может быть установлена эмпирически для конкретного заболевания, популяции пациентов, режима введения и т.п. практикуемыми фармацевтическими способами, известными в данной области.
План дозирования для подкожного введения может варьировать от одного раза в неделю до ежедневного многократного, в зависимости от числа клинических факторов, включая тип заболевания, тяжесть заболевания и чувствительность объекта к терапевтическому агенту.
В одном воплощении композиция составляется в соответствии с рутинными процедурами, например, для фармацевтической композиции, адаптированной для внутривенного введения людям. Как правило, композиции для внутривенного введения являются растворами в стерильном изотоническом водном буфере. Где необходимо, композиция может также включать солюбилизирующий агент и локальный анастетик, такой как лидокаин, или другой «-каиновый» анастетик для облегчения боли в месте инъекции. В общем, ингредиенты предоставляются либо отдельно, либо смешанные вместе в стандартную лекарственную форму, например, в качестве сухого лиофилизированного порошка или концентрата в отдельном контейнере, таком как ампула или пакет-саше, с указанием количества активного ингредиента. Если композиция вводится инфузией, то она может дозироваться при помощи инфузионного флакона, содержащего стерильную фармацевтического качества воду или физиологический раствор. Если композиция вводится инъекцией, то ампула стерильной воды для инъекции или физраствора может быть представлена, например, в наборе, так чтобы ингредиенты могли быть смешаны до введения.
Изобретение также предусматривает, что жидкий состав настоящего изобретения упакован в запечатанный контейнер, такой как ампула или пакет-саше, с указанием количества интересующего продукта. Жидкие составы рассматриваемого изобретения могут быть в запечатанном контейнере с указанием количества и концентрации антитела или фрагмента антитела. Жидкий состав рассматриваемого изобретения может поставляться в запечатанном контейнере, по меньшей мере, с около 15 мг/мл, 20 мг/мл, 30 мг/мл, 40 мг/мл, 50 мг/мл, 60 мг/мл, 70 мг/мл, 80 мг/мл, 90 мг/мл, 100 мг/мл, 150 мг/мл, 200 мг/мл, 250 мг/мл, или 300 мг/мл антитела против удлиненного гликосфинголипида I типа, например, в объеме около 1 мл, 2 мл, 3 мл, 4 мл, 5 мл, 6 мл, 7 мл, 8 мл, 9 мл, 10 мл, 15 мл или 20 мл.
Предоставляется изделие, содержащее материалы, полезные для лечения заболеваний, описанных выше. Изделие содержит контейнер и этикетку. Подходящие контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы и пробирки. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер, содержащий композицию, которая является эффективной для диагностики, профилактики или лечения состояния или заболевания, связанного с удлиненным гликосфинголипидом I типа, и может иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может быть резервуаром для внутривенного раствора или флаконом с пробкой прокалываемой иглой для подкожных инъекций). Этикетка на контейнере или связанная с контейнером указывает на то, что композиция применяется для лечения выбранного состояния. Изделие дополнительно может содержать второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как фосфатно-солевой буферный раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Изделие может дополнительно включать другие материалы, желательные с коммерческой и пользовательской точки зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и листки-вкладыши с инструкцией по применению.
В другом аспекте изобретения нуклеиновые кислоты, содержащие последовательности, кодирующие антитела или их функциональные производные, вводятся путем генной терапии для лечения, ингибирования или профилактики заболевания или расстройства, ассоциированного с абберантной экспрессией и/или активностью удлиненного гликосфинголипида I типа. Генная терапия относится к терапии, осуществляемой введением пациенту экспрессируемой или способной экспрессироваться нуклеиновой кислоты, представляющей интерес. В ином случае, клетки можно обработать для того, чтобы они несли генные последовательности, и ввести в хозяина. В воплощении изобретения нуклеиновые кислоты, полученные кодируемым белком, в клетках-хозяевах, являющихся мишенью, и посредством клеток-хозяев, являющихся мишенью, которые опосредуют терапевтический эффект. Любые доступные способы генной терапии могут быть применены в соответствии с рассматриваемым изобретением.
Для общих сведений о способах генной терапии см. Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12:488 (1993); Wu et al., Biotherapy 3:87 (1991); Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 32:573 (1993); Mulligan, Science 260:926 (1993); Morgan et al., Ann Rev Biochem 62:191 (1993); и May, TIBTECH 11:155 (1993).
В одном аспекте соединение содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие антитело, или его функциональные связывающие фрагменты, где указанные нуклеотидные последовательности являются частью экспрессирующих векторов, которые экспрессируют антитело или фрагменты или химерные белки или их тяжелые или легкие цепи в подходящем хозяине. В частности, такие нуклеотидные последовательности обладают промоторами, функционально связанными с антителом или антигенсвязывающей кодирующей областью, где указанный промотор является индуцируемым или конститутивным и, необязательно, тканеспецифичным, а также обладают другими регуляторными последовательностями.
В другом конкретном воплощении применяются молекулы нуклеиновой кислоты, в которых кодирующие антитело последовательности или любые другие требуемые последовательности фланкируются областями, которые обеспечивают гомологичную рекомбинацию на требуемом участке в геноме, таким образом, обеспечивая интеграцию и внутрихромосомную экспрессию кодирующих антитела нуклеиновых кислот (Koller et al., Proc Natl Acad Sci USA 86:8932 (1989); Zijlistra et al., Nature 342:435 (1989)). В конкретных воплощениях экспрессированная молекула антитела является одноцепочечным антителом; в ином случае, последовательности нуклеиновой кислоты включают последовательности, кодирующие как тяжелую, так и легкую цепи антитела или их фрагменты. Альтернативные способы интеграции включают применение определенных транскрипционных факторов, специфических последовательностей нуклеиновых кислот, цинковых пальцев и т.п.
Доставка нуклеиновых кислот в пациента может быть либо прямой, в случае которой пациент напрямую экспонируется нуклеиновой кислоте или несущим нуклеиновую кислоту векторам, или косвенной, в случае которой клетки сначала трансформируются нуклеиновой кислотой in vitro, а затем трансплантируются пациенту.
В одном воплощении последовательности нуклеиновой кислоты напрямую вводятся in vivo и экспрессируются для получения кодируемого продукта. Это может быть достигнуто с помощью любого из множества способов, известных в данной области, например конструированием антитела, кодирующего последовательности как части соответствующего экспрессирующего нуклеиновую кислоту вектора, и введением вектора, так чтобы вектор стал внутриклеточным, например, посредством инфекции с помощью дефектных или аттенюированных ретровирусных или других вирусных векторов (см. Пат. США No.4,980,286), посредством прямой инъекции «голой» ДНК, посредством применения бомбардировки микрочастицами (например, генной пушкой; «Biolistic», Dupont), с помощью невирусных векторов, таких как синтетические композиции, содержащие амфипатическое соединение, которое связывает гидрофильную нуклеиновую кислоту и обладает способностью сливаться с клетками, как правило, содержащими гидрофобную часть для объединения с мембранами, покрытие липидами или рецепторами клеточной поверхности или средствами для трансфекции, инкапсуляцию в липосомах, микрочастицах, или микрокапсулах, посредством введения вектора, связанного с пептидом, который известен как входящий в ядро, посредством введения вектора, связанного с лигандом, подвергаемым рецепторопосредованному эндоцитозу (см., например, Wu et al., J Biol Chem 262:4429 (1987)) (который может быть применен для нацеливания на типы клеток, специфически экспрессирующие рецепторы) и т.п. В другом воплощении могут быть образованы комплексы нуклеиновой кислоты-лиганда, в которых лиганд содержит сливающий вирусный пептид, разрушающий эндосомы и тем самым позволяющий нуклеиновой кислоте избежать лизосомальной деградации. В еще одном воплощении нуклеиновая кислота может быть нацелена in vivo на клеткоспецифическое поглощение и экспрессию путем таргетинга конкретного рецептора (см., например, WO 92/06180; WO 92/22635; WO 92/20316; WO 93/14188 и WO 93/20221).
Что касается векторов, то, например, может быть применен лентивирусный вектор, что известно в данной области. Лентивирусные векторы содержат компоненты для упаковки вирусного генома и интеграции в ДНК клетки-хозяина. Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело, которое будет применяться в генной терапии, клонируют в один или более векторов, которые облегчают доставку гена в пациента. Например, лентивирусный вектор может быть использован для доставки трансгена в гематопоэтические стволовые клетки. Ссылки, иллюстрирующие применение ретровирусных векторов в генной терапии, являются следующими: Clowes et al., J Clin Invest 93:644 (1994); Kiem et al., Blood 83:1467 (1994); Salmons et al., Human Gene Therapy 4:129 (1993); and Grossman et al., Curr Opin Gen and Dev 3:110 (1993).
Аденовирусы также могут применяться в рассматриваемом изобретении. Мишени для основанной на аденовирусах системе доставки включают, например, печень, центральную нервную систему, эндотелиальные клетки и мышцы. Аденовирусы инфицируют неделящиеся клетки, что является преимуществом по сравнению с ретровирусными векторами. Kozarsky et al., Curr Opin Gen Dev 3:499 (1993) представили обзор генной терапии на основе аденовирусов. Bout et al., Human Gene Therapy 5:3 (1994) показали применение аденовирусных векторов для переноса генов в дыхательный эпителий макак-резусов. Другие случаи применения аденовирусов в генной терапии могут быть найдены в Rosenfeld et al., Science 252:431 (1991); Rosenfeld et al., Cell 68:143 (1992); Mastrangeli et al., J Clin Invest 91:225 (1993); WO 94/12649; и Wang et al., Gene Therapy 2:775(1995).
Адено-ассоциированные вирусы (ААВ) также можно использовать в генной терапии (Walsh et al., Proc Soc Exp Biol Med 204:289 (1993); и U.S. Пат. США No. 5,436.146; 6,632,670 и 6,642,051).
Другой подход к генной терапии заключается в переносе гена в клетки тканевой культуры способами, такими как электропорация, липофекция, кальцийфосфат-опосредованная трансфекция или вирусная инфекция. Как правило, способ переноса включает перенос селективного маркера в клетки. Клетки затем помещают в условия селекции для выделения тех клеток, которые приобрели и экспрессируют перенесенный ген. Эти клетки затем доставляются пациенту.
Таким образом, нуклеиновая кислота может быть введена в клетку до введения in vivo полученной рекомбинантной клетки. Такое введение может быть проведено любым способом, известным в данной области, включая, но не ограничиваясь перечисленным, трансфекцию, электропорацию, микроинъекции, заражение вирусными векторами или векторами на основе бактериофагов, содержащих последовательности нуклеиновых кислот, слияние клеток, хромосом-опосредованный перенос генов, микроэлемент-опосредованный перенос генов, слияние сферопластов и т.д. В данной области известно множество методов для введения инородных генов в клетки (см., например, Loeffler et al., Meth Enzymol 217:599 (1993); Cohen et al., Meth Enzymol 217:618 (1993); и Cline, Pharm Ther 29:69 (1985)), которые могут быть применены в соответствии с настоящим изобретением, при условии, что необходимые функции развития и физиологии клеток-реципиентов не являются разрушенными. Метод должен обеспечить стабильный перенос нуклеиновой кислоты в клетку, так что нуклеиновая кислота, экспрессируемая клеткой, наследуется и экспрессируется клеточным потомством.
Полученные в результате рекомбинантные клетки могут быть доставлены пациенту различными способами, известными в данной области. Рекомбинантные клетки крови (например, гематопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники) предпочтительно вводятся внутривенно, например, как это известно в области трансплантации костного мозга. Количество клеток, предусмотренное для применения, зависит от требуемого эффекта, состояния пациента и т.д. и может быть определено специалистом в данной области.
Клетки, в которые нуклеиновая кислота может быть введена для целей генной терапии, охватывают любой требуемый доступный тип клеток и включают, но не ограничиваются перечисленным, эпителиальные клетки, кератиноциты, фибробласты, мышечные клетки, гепатоциты, клетки крови, такие как Т-лимфоциты, В-лимфоциты, моноциты, макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы, мегакариоциты и гранулоциты, различные стволовые клетки и клетки-предшественники, в частности гематопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники, например полученные из костного мозга, пуповинной крови, периферической крови, эмбриональной печени и т.п.
В одном воплощении клетка, применяемая для клеточной терапии, является аутологичной для пациента. Нуклеотидные последовательности, кодирующие антитело рассматриваемого изобретения и введенные в клетки, так чтобы трансген экспрессировался клетками или их потомками, и рекомбинантные клетки затем вводят in vivo для терапевтического эффекта. В конкретном воплощении применяются стволовые клетки или клетки-предшественники. Любые стволовые клетки и/или клетки-предшественники, которые можно выделить и содержать in vitro, могут потенциально применяться в соответствии с воплощением рассматриваемого изобретения (см., например, WO 94/08598; Stemple et al., Cell 71:973 (1992); Rheinwald Meth Cell Bio 21А:229 (1980); и Pittelkow et al., Mayo Clinic Proc 61:771 (1986)). Так как удлиненный гликосфинголипид I типа экспрессируется, например, на В-клетках, то клетки крови и клетки костного мозга подходят в качестве подходящих клеток-хозяев. Однако объем притязаний рассматриваемого изобретения относительно применения стволовых клеток-хозяев не предусматривает изготовление и применение трансгена для изготовления трансгенного организма путем введения трансгена, представляющего интерес, в эмбрионы и/или эмбриональные стволовые клетки.
Изобретение, таким образом, обеспечивает способы лечения профилактики и облегчения заболеваний, связанных и ассоциированных с удлиненным гликосфинголипидом I типа или одним или несколькими симптомами, посредством введения объекту эффективного количества, например, жидкого состава, антитела или его варианта изобретения. Объект предпочтительно является млекопитающим, таким как не приматы (например, коровы, свиньи, лошади, кошки, собаки, крысы и т.д.) и приматы (например, обезьяны, такие как яванский макак, и человек). В предпочтительном воплощении объектом является человек.
Удлиненный гликосфинголипид I типа также экспрессируется на некоторых злокачественных клетках, например, из поджелудочной железы, толстой кишки и мочевого пузыря, а также при Т-клеточных лейкемиях (Qinping et al., Oncogene 24:573-584, 2005), а стимуляция удлиненного гликосфинголипида I типа коррелирует с пролиферацией клеток карциномы, Meijer et al., Cane Res 66:9576-9582, 2006.
Таким образом, антитело интереса или его производное могут применяться для контроля пролиферации злокачественных клеток, экспрессирующих удлиненный гликосфинголипид 1 типа, если рак идентифицирован путем определения наличия экспрессии удлиненного гликосфинголипида I типа с помощью указанных в данном документе диагностических анализов. Антитело интереса может уменьшить инфильтрацию злокачественных клеток, уменьшить устойчивость к апоптозу и минимизировать пролиферацию. Таким пациентам затем вводят количество антитела, представляющего интерес, или его производного, которое ингибирует пролиферацию клеток злокачественных новообразований, как описано в данном документе. Как указано в данном документе, антитело или его антигенсвязывающая часть могут быть введены пациенту различными путями, включая введение полипептида, полинуклеотида и т.п. Фактически любое злокачественное новообразование, которое экспрессирует интересующий эпитоп I типа, может быть обнаружено и/или обработано антителом, представляющим интерес. Например, злокачественная клетка может быть эпителиальной клеткой. Эпителиальная клетка может быть обнаружена в любой злокачественной клетке любого органного или тканевого происхождения, такого как толстая кишка, прямая кишка, пищевод, легкое, простата, молочная железа, поджелудочная железа, полость рта, влагалище, желудочно-кишечный тракт в целом, мочевыводящий тракт и т.п. Однако не следует ограничивать злокачественное образование эпителиальной клеткой, при условии, что злокачественная клетка экспрессирует представляющий интерес эпитоп I типа.
Далее изобретение будет представлено в виде примеров для помощи специалисту следующими неограничивающими примерами, которые отображают некоторые воплощения, посредством которого или в которых рассматриваемое изобретение может быть осуществлено на практике.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1: ПОЛУЧЕНИЕ ИММУНОГЕНА
Клетки Colo205 (АТСС) (Semple et al., Cancer Res 38: 1345-1355, 1978) выращивали на среде RPMI 1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Собранные клетки отмывали дважды PBS и хранили при -20°С до применения. Клеточные осадки экстрагировали с помощью изопропанола-гексана-воды (IHW) (55:25:20) с последующим разделением по Фолчу, хроматографией на «ДЭАЭ Сефадекс» и ВЭЖХ на колонке «Iatrobead 6RS-8010». Градиентная элюция находящейся в верхней фазе нейтральной фракции осуществляется в IHW от 55:40:5 до 55:25:20 в течение 200 минут. Фракции отбирают и объединяют в соответствии с миграцией в ВЭТСХ в хлороформе-метаноле-воде (50:40:10). Удлиненные гликосфинголипиды I типа дополнительно очищают препаративной ТСХ на пластинах для ВЭТСХ «Merck» (Silica Gel 60, Merck, Дармштадт, Германия), см. Пат. США No.6,083,929.
a
Положительную полосу (по иммуноокрашиванию антителом mAb IMH2), которая мигрирует чуть ниже димерного антигена Le, очищали, как указано в данном документе. [00293] Клетки колоректальной аденокарциномы Соlо205 (АТСС CCL-222) и DLD-1 (АТСС CCL-221) культивировали в среде RPMI 1640 (Invitrogen Co., Cat. No.31800), дополненной 1 мМ пируватом натрия (Invitrogen Co., Cat. No.11360). Другие клетки колоректальной карциномы SW1116 (АТСС CCL-233) и НТ-29 (АТСС НТВ-38), и полученные из легких клетки Т84 (АТСС, CCL-248) отдельно поддерживали в среде «Leibovitz's L-15» (Invitrogen Co., Cat. No.41300), среду «McCoy's 5a» (Invitrogen Co., Cat. No.12330) и среде «DMEM/F12» (Invitrogen Co., Cat. No.12400). Клетки карциномы желудка КАТО III (АТСС НТВ-103) культивируют в среде «IMDM» (Invitrogen Co., Cat. No.12200). Все используемые в исследованиях среды дополняли 10% эмбриональной телячьей сывороткой.
ПРИМЕР 2: ПОЛУЧЕНИЕ МЫШИНЫХ АНТИТЕЛ ПРОТИВ УДЛИНЕННОГО ГЛИКОСФИНГОЛИПИДА I ТИПА
КМ-мышей (Kirin Brewery Co., Ltd.) получали перекрестным скрещиванием дважды трансхромосомных мышей и трансгенных мышей. КМ-мыши имеют человеческие хромосомные фрагменты, содержащие весь локус тяжелой цепи иммуноглобулина человека и YAC-фрагмент с половиной локуса легкой цепи каппа иммуноглобулина человека. КМ-мыши сконструированы таким образом, чтобы не экспрессировать ни эндогенную тяжелую цепь иммуноглобулина, ни легкую цепь каппа. Все животных содержали и обрабатывали в соответствии с правилами и положениями, принятыми в данной области.
6
Клетки Colo205 вводили внутрибрюшинно в КМ-мышей каждые 3 недели (5×10клеток/инъекцию) 4 инъекциями с последующей инъекцией цепочечных гликосфинголипидов I типа, которые выделяли из клеток Colo205 и адсорбировали на липополисахариде (Sigma, L-7011) (Young et al., J. Exp. Med. 150:1008-1019, 1979), каждую неделю по 8 инъекций. Титры против нейтральных гликосфинголипидов Соlо205 в иммунизированных мышах контролировали посредством ИФА, с помощью конъюгата антитела против каппа-цепи человека с HRP (Southern Biotechnology Associates, Cat. No.9220-05) в качестве вторичного антитела до достижения титра 1:6000. Через три дня после последней инъекции спленоциты из стимулированных мышей сливали с миеломными миелоидными клетками P3/NS1/1-Ag4-1 (NS-I) (ATCC TIB-18) путем осуществления на практике способов, известных в данной области. Гибридомы скринировали ИФА с помощью 96-луночных планшетов для ИФА (Corstar, Cat. No.2592), покрытых нейтральным гликолипидом Colo205. Мышиные антитела против IgG человека, конъюгированные с HRP, применяли в качестве вторичного антитела (Southern Biotechnology Associates, Cat. No.9040-05), а тетраметилбензиден (ТМВ) (Kem-Zn-Tec Diagnostics, Cat. No.4390) применяли в качестве субстрата. Надосадочные жидкости гибридом, демонстрирующие высокую реактивность с нейтральными гликолипидами Colo205, дополнительно подтверждали иммуноокрашиванием на ВЭТСХ и проточной цитометрией. Клоны, сильно окрашивающие протяженные цепочечные гликолипиды I типа и демонстрирующие сильное связывание с поверхностью клеток Colo205, неоднократно субклонировали предельным разведением до получения стабильных клонов. Одним стабильным клоном является GNX-8.
Пример 3: АНТИТЕЛО GNX-8
Моноклональное антитело очищали из культуральной надосадочной жидкости с помощью Сефарозы с Протеином A (GE Healthcare 17-129-79-02) с элюцией градиентом рН в соответствии с процедурами, предложенными производителем. Каждую фракцию собирали, а наличие антитела проверяли с помощью ИФА. Фракции с активностью, связывающей нейтральные гликолипиды Colo205, объединяли и диализовали против PBS (рН 7,4). Очищенные антитела разделяли на аликвоты и хранили при -20°С.
Концентрацию моноклонального антитела определяли с помощью набора «Bio-Rad Protein Assay kit» (Bio-Rad, Cat. No. 500-0006) с помощью IgG в качестве стандарта в соответствии с процедурами, рекомендованными производителем.
1
Изотип GNX-8 определяли с помощью ИФА. GNX-8 является человеческим IgG, a легкой цепью является каппа.
Очищенное GNX-8 наносили на 10% ДСН-полиакриламидные гели после кипячения в 2Х ДСН-буфере для загрузки в гель с (восстанавливающие условия) или без (невосстанавливающие условия) бета-меркаптоэтанола. Электрофорез проводили с помощью электрофоретической системы «Minutesi-PROTEAN3» (BIO-RAD) в соответствии с рекомендациями производителя.
GNX-8, разделенное в восстанавливающих гелях ДСН-ПААГ, переносили на нитроцеллюлозные (НЦ) мембраны (Amersham) и блокировали с 3% обезжиренным молоком в PBS. Мембрану инкубировали с вторичным антителом в течение 1 часа при комнатной температуре. Меченное HRP козье антитело против IgG (γ) человека (Zymed, 62-8420) в разведении 1:5000 и меченное HRP кроличье против антитела IgG человека с каппа цепью (DAKO, P0129) в разведении 1:2000 отдельно применяли для обнаружения тяжелой цепи и легкой цепи GNX-8. Набор «Western Lightning™ Chemiluminescence Reagent Plus» (PerkinElmer Life Sciences, Cat. No. NEL 105) применяли для получения сигнала на пленке «BioMax Light Film» (KODAK, Cat. No.1788207).
В восстанавливающих условиях молекулярная масса легкой цепи GNX-8 и тяжелой цепи оценивается по IgG. GNX-8 является человеческим моноклональным антителом по вестерн-блоттингу с использованием конъюгата козьего антитела против IgG (γ) человека с HRP и конъюгата кроличьего антитела против каппа-цепи человека с HRP, использованных отдельно в качестве вторичных антител. GNX-8 является человеческим антителом по ИФА-изотипированию.
pI-анализ GNX-8 проводили с помощью «PhastSystem» (Pharmacia). Вкратце, образец антитела и рI стандарт наносили на «IEF PhastGel 3-9» с помощью гребенки «PhastGel Sample applicator 8/1 comb» и разделяли в соответствии с протоколом производителя. Гель затем окрашивали серебром в проявочной установке «PhastSystem Development Unit» (Pharmacia) в соответствии с протоколом изготовителя.
pI-анализ выявляет множественные полоски в диапазоне рН от 8,15 до 8,65, указывая на возможность посттрансляционных модификаций антитела. Высокое значение pI указывает на то, что GNX-8 будет растворимым при физиологических значениях рН.
5
c
Для обнаружения активности связывания клеток 2×10 клеток промывали PBS и инкубировали с различными концентрациями антитела в течение 30 минут при комнатной температуре. После отмывки PBS меченные FITC козьи антитела против IgG (F) человека в разведении 1:3000 (ICN, Cat no.55198) добавляли в каждый образец клеток в течение дополнительных 30 минут при комнатной температуре. Для исследований CDC клетки после обработки антителами отмывали три раза PBS и инкубировали с 1 мкл раствора иодида пропидия (Sigma-Aldrich, P4846) в течение 30 минут. После конечной отмывки PBS клетки анализировали на проточном цитометре (BD, FACSort). Результаты обрабатывали с помощью «CELLQuest 3.3» (BD).
ПРИМЕР 4: АНАЛИЗ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ
4
Клеточные линии рака толстой кишки человека, SW1116, Соlо205 и DLD-1, рассевали в 48-луночном планшете (Corning Costar) с плотностью 2×10 клеток/лунку. После культивирования в течение ночи клетки инкубировали в 500 мкл среды с 25% неинактивированной человеческой сыворотки при различных концентрациях антитела в течение 2 часов. После отмывки PBS оставшиеся живые клетки подсчитывали с помощью окрашивания раствором иодида пропидия (PI) (Sigma-Aldrich, P4846) и анализировали проточной цитометрией. Нормальные человеческие IgG, очищенные от нормальной человеческой сыворотки, применяли в качесте отрицательного контроля.
51
6
При альтернативном анализе клетки-мишени метили инкубацией в объеме около 100 мкл Cr в течение около 90 минут при температуре 37°С. После 3-кратной отмывки и инкубации (около 1 часа при 37°С) клетки (около 1×10 на мл) суспендировали в RPMI-1640, дополненной около 25 мМ буфером HEPES и около 3% бычьим сывороточным альбумином. Около 20 мкл меченых клеток, около 100 мкл mAb и 25% термоинактивированной человеческой сыворотки смешивают в лунках плашек с U-образным дном (Corning, N. Y.). Неспецифическое мышиное Ig (Sigma, Сент Луис, Миссури) может применяться в качестве отрицательного контроля. После около 4 часов инкубации планшеты центрифугировали (500×g, 2 мин) с помощью подвесного держателя планшетов в центрифуге и радиоактивность в около 100 мкл надосадочной жидкости в каждой лунке измеряли с помощью гамма-счетчика. Каждая экспериментальная группа может быть протестирована трижды. Процент специфического лизиса может быть рассчитан в соответствии с формулой ([А-В]×100)/С, где А = имп/мин в лизированных экспериментальных клетках; В = имп/мин в нелизированных клетках-мишенях и С = имп/мин во всех клетках-мишенях. Спонтанное высвобождение предпочтительно не должно превышать 15% от максимально высвобождающейся радиоактивности.

ADCC-анализы осуществляли с помощью анализа высвобождения лактатдегидрогеназы (ЛДГ) (Promega, CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay) с помощью человеческих мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) в качестве эффекторных клеток, приготовленных из здоровых доноров с помощью «Ficoll-Paque» (GE, 71-7167-00). Анализ количественно измеряет лактатдегидрогеназу (ЛДГ), стабильный цитозольный белок, который высвобождается при лизисе клеток. Высвобожденный ЛДГ в культуральной надосадочной жидкости измеряется с помощью 30-минутного сопряженного ферментного анализа, который в результате приводит к превращению соли тетразолия (INT) в продукт красный формазан. Количество образованной окраски пропорционально числу лизированных клеток.
4

E
T
T
E
T
Клетки Colo205, применяемые в качестве клеток-мишеней, распределяли по 96-луночным планшетам с U-образным дном (2×10 клеток/лунку) и инкубировали с антителами в присутствии РВМС с различным соотношениями Э/М (эффекторные клетки/клетки-мишени) в течение 4 часов при 37°С. Активность ЛДГ в надосадочной жидкости измеряли с помощью набора для нерадиоактивного анализа цитотоксичности «CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay». Процент специфического цитолиза рассчитывается в соответствии со следующей формулой: % специфического лизиса = 100Х(E-S-S-)/(M-S), где Е является экспериментальным высвобождением (активность в надосадочной жидкости из клеток-мишеней, инкубированных с антителом и эффекторными клетками), S является спонтанным высвобождением в присутствии эффекторных клеток (активность в надосадочной жидкости из эффекторных клеток со средой отдельно), S является спонтанным высвобождением клеток-мишеней (активность в надосадочной жидкости клеток-мишеней, инкубированных со средой отдельно) и М является максимальным высвобождением из клеток-мишеней (активность, высвобожденная из клеток-мишеней, лизированных 9% Triton X-100).
Противоопухолевую активность GNX-8 in vitro оценивали с помощью анализа CDC. Обработка клеток колоректального рака человека, SW1116, Соlо205 и DLD-1, с помощью GNX-8 в присутствии 25% человеческой сыворотки, приводит к частичному лизису клеток дозозависимым способом. Результаты указывают на то, что GNX-8 убивает клетки-мишени посредством комплемент-зависимого цитолиза.
CDC-эффект на клетках SW1116 и Соlо205 в некоторых экспериментах сильнее, чем на клетках DLD-1. Жизнеспособность клеток обратно пропорциональна уровню экспрессии антигена GNX-8. CDC-эффект GNX-8 и уровни экспрессии антигена GNX-8 на трех линиях колоректального рака демонстрируют, что злокачественные клетки с более высокой экспрессией антигена GNX-8 более чувствительны к цитотоксичности, а те, у которых более низкая экспрессия антигена GNX-8, имеют более высокую жизнеспособность. Результаты приводят к выводу, что противоопухолевая активность GNX-8 может зависеть от уровня экспрессии антигена GNX-8. Пациенты с более высокой экспрессией антигена GNX-8 на опухолевых клетках могут быть обработаны отдельно GNX-8, в то время как при опухолях, экспрессирующих более низкие уровни антигена GNX-8, пользу может принести комбинаторная терапия с одним или несколькими другими противоопухолевыми лекарственными средствами в дополнение к антителу GNX-8.
ADCC-активность человеческих мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) оценивали против линии Соlо205 человеческого колоректального рака в присутствии GNX-8. ADCC-активность с IMH2 использовали как положительный контроль, а человеческие IgG - как отрицательный контроль.
GNX-8 индуцируют сильную ADCC-активность против клеток Colo205. Цитотоксический эффект коррелирует положительно как с соотношением Э/М, так и с концентрацией GNX-8. Стопроцентный лизис наблюдается при Э/М около 20/1. Максимальный эффект ADCC, а также тенденцию, наблюдаемую при около 50% лизиса, наблюдали при концентрации около 5 мкг/мл GNX-8 и при около 50 мкг/мл IMH2, соответственно. Контрольные человеческие IgG демонстрируют отсутствие цитотоксического эффекта независимо от соотношения Э/М или от концентрации IgG. Доза GNX-8 для достижения 50% лизиса меньше чем 1/10 требуемой дозы для IMH2.
ПРИМЕР 5: АНАЛИЗ СРОДСТВА «BIACORE»
Гликосфинголипиды I типа прикрепляли к чипу. Затем моноклональное антитело наносили на чип для кинетических измерений и анализа последовательности эпитопа в реакции связывания антитело-антиген, следуя рекомендациям производителя (GE Healthcare, Пискатауэй, Нью-Джерси).
ПРИМЕР 6: IN VIVO АНАЛИЗ
Противоопухолевую активность GNX-8 оценивали на ксенографической модели с Colo205.
6
2
Клетки Colo205 отмывали дважды PBS и разводили до плотности клеток 5×10/100 мкл в PBS. Самок голых мышей в возрасте 6-8 недель инокулировали подкожно 100 мкл суспензии клеток Colo205 в боковую область. Размеры опухолей измеряли три раза в неделю с помощью штангенциркуля и массы опухолей (мг) оценивали как (ширина × длина)/2. GNX-8 или нормальные человеческие IgG внутрибрюшинно инъецировали в несущих опухоли голых мышей в соответствии с определенными дозами и расписаниями.
6
Для оценки противоопухолевой эффективности GNX-8 in vivo злокачественные клетки (5×10 клеток/мышь) инъецировали в голых мышей и обрабатывали либо GNX-8 (группа обработки, 8 мышей/группу), либо нормальными человеческими IgG (контрольная группа, 7 мышей/группой) 24 часа после прививки опухоли. Пять доз (300 мкг/мышь) с 24-часовыми интервалами, а затем четыре дозы (600 мкг/мышь) с 48-часовыми интервалами инъецировали в обе группы.
В обработанных GNX-8 мышах опухолевый рост значительно ингибируется. Группа обработки достигает медианного значения массы опухоли, выраженной в виде отношения О/К (обработка/контроль), 23% на 11 день и остается на этом приблизительном уровне до конца исследования. Значение О/К<42% считали достоверным при демонстрации противоопухолевой активности.
Половина (4/8) мышей в группе обработки GNX-8 достигала продолжительного безопухолевого выживания более 50 дней. С другой стороны, размер опухоли контрольной группы животных увеличивался в ходе исследования.
Похожее исследование проводили с клетками Colo205 на ксенографической модели на голых мышах. Первая доза GNX-8 дается при размере опухоли от 80 до 100 мг. GNX-8 (группа обработки) и нормальные человеческие IgG (контрольная группа) инъецировали однократно (300 мкг/мышь) ежедневно в течение пяти дней и двумя одинаковыми дозами на 17 и 21 день.
Значительное ингибирование опухоли также наблюдали в группе обработки, хотя обработки прекращали всего лишь после 5 доз. Медианное значение массы опухоли, выраженное в виде отношения О/К (Обработка/Контроль), составляет меньше чем 42% после 10 дней и до конца исследования.
Для определения, вносит ли вклад эффекторная функция хозяина на эффективность GNX-8, мыши SCID, несущие ксенотрансплантаты из Colo205, обрабатывали GNX-8 и нормальными IgG в концентрации 600 мкг/мышь дважды в неделю в течение трех недель. Размер опухоли измеряли дважды каждую неделю до достижения размера опухоли, равной 10% от массы тела, которая рассматривалась как конечная точка исследования.
Выживаемость увеличилась в обрабатываемой группе.
Для изучения местонахождения эпитопа GNX-8 в колоректальных раках человека проанализировали несколько клеточных линий колоректального рака человека.
Например, ингибирование in vivo DLD-1 посредством GNX-8 является значимым.
ПРИМЕР 7: АНТИГЕН GNХ-8
c
Для анализа клеточного гликопротеина культивируемые клетки соскабливали с флаконов Т-75 и отмывали дважды в PBS, а потом обрабатывали лизирующим буфером (50 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 150 мM NaCl, 1% NP-40, 0,5% дезоксихолат натрия, 0,1% SDS и 1 мМ PMSF). Лизаты пропускали через иглу 26 размера несколько раз для разрушения любых больших агрегатов. Концентрацию белка определяли с помощью набора «Protein Assay Kit» (Bio-Rad). Лизаты, содержащие одинаковое количество белков, разделяли на геле и анализировали вестерн-блоттингом с GNX-8 в качестве первичного антитела и мышиного антитела против IgG (F) человека, меченного пероксидазой хрена (Southern Biotechnology Associates, #9040-05), использованного в качестве вторичного антитела. Набор «Western Lightning™ Chemiluminescence Reagent Plus» (PerkinElmer Life Sciences, Cat. No. NEL 105) применяли для получения сигнала на пленке «BioMax Light Film» (KODAK, Cat. No. 1788207).
2
4
Нейтральные гликолипиды (2 мкл/образец) наносили на пластину ВЭТСХ (Merck, 1.05642, силикагель 60 F254), обрабатывали мобильной фазой, содержащей хлороформ:метанол:воду в соотношении 50:40:10 (об.:об.:об.). Для окраски гликанов в гликолипидах 0.2% орсин (Sigma, О-1875) в 10% HSO распыляли на пластину для ВЭТСХ и инкубировали в течение 10 минут при 110°С в печи. Для иммуноокрашивания пластину для ВЭТСХ вначале фиксировали 0,5% поли(изобутилметакрилатом) (Aldrich, 181544) в хлороформ:гексане 1:9 (об.:об.) в течение 45 секунд, с последующим блокированием в течение 10 минут в 3% BSA/PBS. Затем пластины отмывали PBS и инкубировали с первичными антителами при комнатной температуре в течение 1 часа с последующей инкубацией с биотинилированным вторичным антителом при комнатной температуре в течение 1 часа. Набор «Avidin-Biotin Complex kit» (Vector Laboratories, Бурлингейм, Калифорния) применяли для усиления сигналов вторичного антитела. Пластину инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут с последующим проявлением цвета с помощью набора для иммуноокрашивания «HRP-1000 kit» (Konica Minolta, 130990) в соответствии с протоколом производителя.
2
К лиофилизированному образцу добавляли 20 мкл 48% фтористого водорода (HF) (Merck), а затем смесь инкубировали при 4°С в течение 48 часов. В конце реакции HF удаляли с помощью газа N. Дефукозилированные гликолипиды применяли для исследования специфичности GNX-8.
Нейтральные гликолипиды Colo205 обрабатывали с помощью HF и анализировали масс-спектрометрией MALDI-TOF (времяпролетная масс-спектрометрия с лазерной ионизацией и десорбцией с использованием матрицы) для подтверждения удаления фукозы. Иммуноокрашивание на ТСХ осуществляли для анализа специфичности GNX-8, направленной на нейтральные гликолипиды Colo205 до и после обработки HF.
GNX-8 распознают нерасщепленные гликолипиды, но не дефукозилированные формы, исходя из это предполагается, что эпитоп GNX-8 является углеводной составляющей, а фукоза является существенным компонентом этой структуры.
2
4
a
b
a
a
b
a
a
a
a
a
b
a
Специфичность GNX-8 далее характеризовали иммуноокрашиванием после ВЭТСХ на нейтральных и моносиалированных гликолипидах, выделенных из клеток Colo205. Сто граммов клеток Colo205 собирали и экстрагировали из них фракции гликолипидов. Гликолипиды Colo205 разделяли на ТСХ и окрашивали углеводы с помощью орциналя/HSO. Позиции Le, Le, Le-Le и Lе-Le определяли в соответствии с Stroud et al. (1992) (выше). Сиалил-Le (SLe) выявляли с помощью окрашивания моноклональным антителом NKH3 (Пат. США No. 5,240,833) и позднее идентифицировали с помощью MALDI-MS. Иммуноокрашивание ВЭТСХ тех же самых фракций гликолипидов проводили с помощью: антител CF4C4 (Пат. США No. 5,011,920) (анти-Le), Т218 (Abeam, Кэмбридж, Массачусетс) (анти-Le), IMH2 (Stroud et al., 1992, выше) (анти-Le-Le) и GNX-8.
a
b
x
y
b
b
a
Результаты показывают, что GNX-8 сильно реагирует с гликолипидами с удлиненной цепью I типа. GNX-8 не связывает Le удлиненных цепей I типа. Моносиалированные гликолипиды клеток Colo205 не распознаются GNX-8. GNX-8 демонстрирует очень сильную перекрестную реактивность с Le при высоких концентрациях (0,6 мкг/мл). В отличие от IMH2, GNX-8 не связывается с Le или Le. GNX-8 связывает удлиненную цепь, содержащую Le. GNX-8 связывает Le-Le.
b
a
x
b
x
x
x
b
a
a
a
В дополнение к иммуноокрашиванию ТСХ, эпитоп GNX-8 характеризовали конкурентным ИФА с помощью синтетических гликанов Le, Le-Le, Le-Le и Le-Le, использованных в качестве ингибиторов, и смеси гликолипидов Le-Le/Le-Le, использованной в качестве положительного контроля.
b
x
b
b
b
Результаты показывают, что GNX-8 слабо перекрестно реагирует с Le-Le при высоких концентрациях ингибитора, но не имеет реактивность к другим протестированным синтетическим гликанам, включая синтетические гликаны Le. Активность связывания GNX-8 с удлиненным Le в 1000 раз выше, чем активность с простым Le.
b
b
Исходя из результатов, можно сделать вывод, что эпитоп GNX-8 по всей вероятности является структурой Le на удлиненной цепи I типа, с фукозилированием, но не является простым Le.
ПРИМЕР 8: РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ПО КЛЕТКАМ И ТКАНЯМ
Фиксированные в формалине залитые в парафин срезы нормальных и опухолевых тканей получали, например, из «US Biomax».
2
2
Эрреи, фиксированных в формалине, залитых в парафин тканей нормальных и злокачественных тканей человека блокировали с помощью 0,1% обезжиренного молока в PBS в течение 30 минут. После дополнительных 10 минут инкубации с 3% HO тканевые эрреи отмывали дважды в PBS перед инкубацией образцов в течение 1 часа с 0.1% разведенным в BSA/PBS биотинилированным GNX-8. Затем образцы тканей реагировали с биотин-стрептавидин-пероксидазным комплексом (АВС kit. Vector, #PK-6100) в течение 30 минут для усиления сигнала. Набор «DAB PLUS Substrate Kit» (Zymed #00-2020) применяли для визуализации иммунореактивного окрашивания в соответствии с протоколом производителя. Проводили контрастное окрашивание гематоксилином. Результаты определяли визуализацией под световым микроскопом.
Экспрессию антигена GNX-8 на человеческих злокачественных клетках оценивали с помощью проточной цитометрии. Множество клеточных линий колоректального рака и опухоли желудка, такие как Colo205, HT-29, DLD-1, SW1116, Т84 и KАТО III, отдельно проверяли на экспрессию антигена GNX-8 посредством проточной цитометрии.
Анализы, проведенные с помощью проточной цитометрии, показывают, что GNX-8 демонстрирует активность связывания со всеми протестированными злокачественными клеточными линиями. Однако связывание значительно сильнее с клетками SW1116, Colo205 и DLD-1, чем с другими протестированными клеточными линиями злокачественных опухолей человека.
Кроме того, экспрессию антигена GNX-8 тестировали на HL60 (промиелоцитарной клеточной линии), MCF-7 (клеточной линии рака молочной железы) и на PANC-I (клеточной линии рака поджелудочной железы), а также на мышиной клеточной линии рака толстой кишки СТ26. GNX-8 не связывается с этими четырьмя клеточными линиями.
Две клеточные линии колоректального рака, Colo205 и SW1116, анализировали вестерн-блоттингом. Две клеточные линии демонстрируют сильную связывающую активность с GNX-8 при анализах проточной цитометрией.
Результаты демонстрируют присутствие антигена GNX-8 на гликопротеине Colo205 и SW1116 в диапазоне молекулярных масс от 32 до >175 кДа. Соответственно, GNX-8 антигены находятся не только в гликолипидах, но также и в гликопротеинах.
Множество срезов из различных органов, включая нормальные ткани и ткани злокачественных новообразований, окрашивали отдельно с помощью GNX-8. Паттерны окрашивания в срезах тканей оценивали по интенсивности окрашивания и частоте положительных клеток.
Окрашивание сортировали по шкале 1+ (10-20%), 2+ (20-50%) или 3+ (>50%), тогда как частоту классифицировали на основе процента положительных клеток в каждом срезе.
Сильную корреляцию наблюдали между экспрессией антигена GNX-8 в первичных и метастатических колоректальных карциномах. Проводили иммуногистохимическое окрашивание панели срезов тканей от пациента с колоректальным раком.
Антиген GNX-8 экспрессируется не только в тканях колоректального рака, но также в сопредельных тканях. Например, полип, следующий за злокачественной областью, окрашивается GNX-8. Однако никакого окрашивания не наблюдалось в дистальных нормальных тканях. Следовательно, можно сделать вывод, что GNX-8 идентифицирует трансформированные клетки или клетки, подвергшиеся трансформации до того, как произойдут распознаваемые изменения в клеточной морфологии.
Экспрессия антигена GNX-8 также изучалась при различных степенях злокачественности.
Антиген GNX-8 экспрессируется в каждой стадии злокачественной трансформации.
GNX-8 не связывает нормальные толстую кишку, прямую кишку, желудок, тонкий кишечник, печень, пищевод, легкое, простату или молочную железу.
Пятьдесят пять процентов (44/76) образцов рака толстой кишки окрасились GNX-8;
47% образцов толстой кишки; 57% метастатических образцов рака толстой кишки; 53% образцов рака желудка; 29% образцов рака пищевода; 22% образцов рака легкого; 4% образцов рака простаты; 17% образцов рака молочной железы и 67% образцов поджелудочной железы окрасились GNX-8. GNX-8 не связывается с образцами рака тонкого кишечника, печени и почек.
Таблица 1
Специфичность GNX-8 на нормальных человеческих тканях
Нормальные ткани
Человеческие ткани
Число случаев (кол-во положительных/ кол-во протестированных)
Толстая кишка
14/102
Пищевод
3/4*
Молочная железа
13/56<sup>§</sup>
Поджелудочная ж-за
4/12<sup>§</sup>
Почка
11/63<sup>#</sup>
Прямая кишка
1/106
Тонкий кишечник
0/2
Печень
0/4
Легкое
0/3
Простата
0/6
* окрашивание кератинизации многослойного плоского эпителия
§ окрашивание эпителиальных клеток системы протоков/молочных протоков
# окрашивание эпителиальных клеток системы протоков.
Таблица 2.
Специфичность GNX-8 на злокачественных человеческих тканях
Человеческие злокачественные ткани
Число случаев (кол-во положительных/ кол-во протестированных)
Интенсивность окрашивания и локализация
Толстая кишка
44/76
3+(5), 2+(12), 1+(27)
Прямая кишка
50/107
3+(13), 2+(20), 1+(17)
Тонкий кишечник
0/10
Печень
0/12
Почка
0/3
Толстая кишка (метастатическая)
27/47
2+(9),1+(18)
Пищевод
4/14
2-+(1), 1+(3)
Легкое
10/45
3+(1), 2+(5), 1+(4)
Простата
2/45
2+(2)
Молочная железа
7/45
3+(1), 2+(4), 1+(2)
Поджелудочная ж-за
8/12
2+(3), 1+(5)
ПРИМЕР 9: КЛОНИРОВАНИЕ И СЕКВЕНИРОВАНИЕ GNX-8
6
Клетки GNX-8-продуцирующей гибридомы рутинно культивировали в IMDM (Invitrogen), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки с низким содержанием IgG (HyClone). Для приготовления РНК для синтеза кДНК вначале собирали 1×10 клеток гибридомы центрифугированием на низкой скорости (1000 об./мин, 5 мин). Затем из клеточного осадка с помощью реактива «TRIZOL» (Invitrogen) в соответствии с протоколом изготовителя выделяли общую РНК. Первые цепи кДНК синтезировали на очищенном образце РНК с помощью набора «SMART RACE cDNA Amplification Kit» (BD Biosciences-Clontech). Вкратце, 1 мкг общей РНК инкубировали с олигонуклеотидными праймерами, с 1 мкл «5'-CDS» и 1 мкл «SMART IIA», при 70°С в течение 2 минут. После добавления 2 мкл 5× буфера для синтеза первой цепи, 1 мкл 20 мМ ДТТ, 1 мкл 10 мМ dNTP и 1 мкл обратной транскриптазы «PowerScript RT» добавляли к смеси РНК/праймеры. Затем образец инкубировали при 42°С в течение 1,5 часов. Реакцию синтеза первой цепи кДНК останавливали добавлением 100 мкл трицинового буфера и инкубацией при 72°С в течение 7 минут.
кДНК, кодирующую фрагмент тяжелой цепи GNX-8, аплифицировали ПЦР с помощью «UPM» (набор «BD SMART RACE cDNA Amplication Kit») и праймера на 3'-конец тяжелой цепи, СН1, SEQ ID NO:3. Реакцию ПЦР проводили при 94°С в течение 30 секунд, при 58°С в течение 30 секунд, 72°С в течение 3 минут и этот цикл повторяли 26 раз.
кДНК вариабельной области тяжелой цепи реамплифицировали из 1 мкл вышеуказанного продукта реакции в присутствии «NUP» (набор «SMART RACE amplification kit») и праймера на среднюю часть тяжелой цепи СН1, SEQ ID NO:4. Реакцию ПЦР проводили при 94°С в течение 15 секунд, при 68°С в течение 30 секунд и этот цикл повторяли 25 раз. Амплифицированный продукт очищали с помощью набора «PCR purification kit» (GeneMark), а нуклеотидную последовательность определяли с помощью праймера на 5'-конец тяжелой цепи CH1, SEQ ID NO:5.
Основываясь на информации о последовательности, кДНК полнормазмерной тяжелой цепи специфически амплифицировали ПЦР из ранее приготовленных первых цепей кДНК, с заново синтезированными праймерами, SEQ ID NO:6, и для конца гена тяжелой цепи SEQ ID NO:7, с помощью ферментной системы для ПЦР «BD Advantage™ 2 PCR Enzyme System» (BD Biosciences).
Реакцию ПЦР проводили при 94°С в течение 40 секунд, при 60°С в течение 30 секунд, 72°С в течение 100 секунд и этот цикл повторяли 35 раз.
кДНК амплифицированной полноразмерной тяжелой цепи вначале дважды расщепляли с помощью EcoRI и Xbal. После очистки из геля извлеченную кДНК тяжелой цепи лигировали в вектор pCIneo (Promega) в тех же сайтах для получения экспрессирующего вектора pCI-GNX-8.Н3. Вставку последовательности кДНК подтверждали с помощью праймера, гибридизующегося выше сайта множественного клонирования, SEQ ID NO:8, и праймера ниже сайта множественного клонирования, SEQ ID NO:9. кДНК тяжелой цепи GNX-8 и предсказанная аминокислотная последовательность показаны в Таблице 3 как последовательности с SEQ ID NO:14 и 15, соответственно.
Для определения последовательностей кДНК легкой цепи пептид легкой цепи GNX-8 подвергали масс-спектрометрическому анализу и поиску по базам данных. В соответствии с информацией об идентификации белка легкая цепь GNX-8 является гомологичной мышиной λ-цепи. Синтезировали праймер, фланкирующий 5'-конец константной области мышиного лямбда гена, SEQ ID NO:10. кДНК, включающую вариабельную область и часть константной области гена легкой цепи, амплифицировали из первых цепей кДНК, описанных выше, с помощью тачдаун-ПЦР. Реакцию ПЦР проводили вначале 5 циклов по 30 секунд при 94°С, 90 секунд при 72°С, затем 5 циклов по 30 секунд при 94°С, 30 секунд при 66°С, 90 секунд при 72°С и затем цикл 30 секунд при 94°С, 30 секунд при 63°С и 90 секунд 72°С, повторяли 27 раз. Амплифицированные фрагменты ПЦР затем вводили в вектор уТ&А (Yeastern Biotech) для определения положительных клонов.
Четыре клона с ожидаемым размером выбрали для определения последовательности с праймером SEQ ID NO:11.
Результаты говорят о том, что все четыре клона имеют идентичную кДНК со структурой, гомологичной 5'-концу известных генов легкой цепи.
Для восстановления кДНК полноразмерной легкой цепи синтезировали новый набор праймеров, SEQ ID NO:12 и SEQ ID NO:13, и кДНК описанную выше, применяли для получения только вариабельной области гена легкой цепи с помощью ПЦР. Реакция ПЦР включает 30 циклов при 94°С в течение 30 секунд, 60°С в течение 30 секунд, 72°С в течение 1 минуты.
кДНК амплифицированной вариабельной области легкой цепи с внедренными сайтами ферментов рестрикции EcoRI и BsiWI расщепляли с помощью соответствующих ферментов. После очистки в агарозном геле амплифицированный кДНК фрагмент вариабельной области лигировали по тем же сайтам в вектор pCIck (экспрессирующий вектор на основе pCIneo со вставкой человеческого константной области К по сайтам Xbal и NotI) для получения экспрессирующего вектора pCIck-GNX-8.mλ. Осуществляли подтверждение секвенированием и установленная нуклеотидная, а также аминокислотная последовательности легкой цепи GNX-8 представлены в SEQ ID NO:16 и 17, соответственно.
Одиночный вектор, который экспрессирует гены как тяжелой, так и легкой цепей рекомбинантного антитела GNX-8, конструировали либо с неомициновым геном (pCIck-GNX-8 neo), либо с геном DHFR (pCIck-GNX-8 DHFR), использованными в качестве селекционных маркеров. Вектор с легкой цепью pCIck-GNX-8.mλ линеаризовали с помощью BglII с последующим дефосфорилированием по 5' концу с помощью фосфатазы из кишечника теленка (CIP). Вектор с тяжелой цепью pCI-GNX-8.Н3 расщепляли с помощью BglII и NgoMIV. Фрагмент BglII-NgoMIV, содержащий CMV-промотор, кДНК полноразмерной тяжелой цепи и SV40 полиА выделяли посредством экстракции из геля и вводили в линеаризованный вектор с легкой цепью лигированием по тупым концам для образования pCIck-GNX-8 neo. Затем получали вектор pCIck-GNX-8 DHFR, полученный удалением гена неомицина расщеплением с помощью NgoMTV/ClaI вектора pCIck-GNX-8 neo и заменой на ген DHFR. Мини-ген DHFR вырезали из вектора pdhfr3.2 (ATCC No.37166) с помощью гидролиза HindIII/SalI, разделяли и извлекали экстракцией из геля. Оба фрагмента обрабатывали фрагментом Кленова для получения тупых концов, затем ген DFHR лигировали в разрезанный по NgoMIV/ClaI фрагмент pCIck-GNX-8 nео с лигированием по тупым концам.
После секвенирования легкой и тяжелой цепей нуклеиновые кислоты могут быть перекодированы для оптимизации экспрессии, например, в специфических человеческих клетках-хозяевах.
ПРИМЕР 10: ТРАНСФЕКТОМЫ
6
6
2
Клетки NS0 выращивали до плотности 1×10 клеток/мл. Клетки поддерживали в фазе экспоненциального роста и среду меняли за день до трансфекции. В день трансфекции 40×10 клеток промывали. Затем 10 мг линеаризованной нуклеиновой кислоты, содержащей, например, ДНК легкой цепи и линеаризованную ДНК тяжелой цепи добавляли к клеточной суспензии (объем общей ДНК должен быть менее 50 мкл) и культуру инкубировали на льду в течение 15 минут. ДНК и клеточную смесь переносили в охлажденную кювету (0,4 см) и применяли электрический пульс (750 В и 25 мкФ). Кювету размещали на льду непосредственно после электрического пульса и выдерживали на льду в течение 10-15 минут. Клетки собирали и рассевали. Клетки инкубировали в инкубаторе с 5% CO в течение 12-16 часов или до появления колоний. Надосадочную жидкость клеточных колоний или клеток, выращенных в суспензионной культуре, тестировали с помощью ИФА, а положительные трансфектомы клонировали в свежей среде. Затем проводили скрининг положительных трансфектом либо титриметрическим ИФА, либо путем проведения анализа «Biacore». Размноженные трансфектомы поддерживали во встряхиваемых флаконах и антитело или его производное собирали из надосадочной жидкости.
ПРИМЕР 11: ФАРМАКОКИНЕТИКА
Крыс рандомизированно разделяли на две группы (четыре крысы/группа). Животные получали 1 или 10 мг/кг GNX-8 в виде одиночной внутривенной болюсной инъекции через вену хвоста. Образцы крови отбирали через 0, 5, 15 и 30 минут и через 1, 2, 4, 6, 24, 30, 72, 144, 168, 216, 240, 312, 336 и 360 часов. Сыворотку собирали и хранили при -20°С до проведения анализа концентрации GNX-8. Концентрацию GNX-8 определяли с помощью ИФА.
131
GNX-8 метили I методом «IODO-Gen».
131
Голых мышей использовали для исследований биораспределения и видеографии. Пять миллионов клеток Colo205 инокулировали подкожно. Когда опухоль достигала размера 0,5 г, проводили исследования по биораспределению. Для исследования по биораспределению мышей инъецировали в хвостовую вену 10 мкКи/2,3 мкг меченного I GNX-8. Пять мышей умерщвляли на 6, 24, 48, 72 и 96 час после инъекции. Образцы крови брали сразу перед умерщвлением мышей. Опухоли и органы (мозг, кожу, мускулы, кости, сердце, легкие, поджелудочную железу, глаз, надпочечник, хвост, селезенку, печень, мочевой пузырь, желудок, тонкий кишечник и толстый кишечник) удаляли сразу же и взвешивали. Наличие радиоактивномеченного антитела в опухоли, органе и крови отдельно подсчитывали в γ-счетчике (Packard). Стандарты подсчитывали каждый раз с тканями и опухолями. Радиоактивности тканей выражали как процент инъецируемой дозы на грамм органа (%ИД/г).
131
Видеографические исследования по имэджингу осуществляли с помощью системы видеографии на животных «microSPECT single photon emission computerized tomography X-SPECT» (Gamma Medica Inc. США) и с помощью рентгеновской компьютеризированной томографии «microCT». Голым мышам, несущим опухоли Соlо205, инъецировали внутривенно 200 мКи/5,5 мг/100 мл меченного I GNX-8 через хвостовую вену. Изображения получали через 1, 6, 24, 48, 72 и 96 часов. Фармакокинетические (ФК) исследования проводили для GNX-8 в крысах, мышах SCID и голых мышах посредством одиночного внутривенного введения. Концентрацию сыворотки GNX-8 анализировали с помощью ИФА.
max
Двухкомпонентная модель обеспечивает хорошее совпадение данных и дает ФК-параметры, суммированные в Таблицах 4 и 5. Дозозависимое увеличение C наблюдали после одиночного внутривенного введения от 1,0 до 10 мг/кг GNX-8 в крысах. GNX-8 выводится из сыворотки в конечным периодом полужизни 3,81 и 4,98 дней при дозе 1 и 10 мг/кг, соответственно.
1/2
1/2
1/2
Фармакокинетические параметры GNX-8 после введения голым мышам и мышам SCID с или без несущих опухоли из Colo205 мышами представлены с Т, что составляет около одного дня в обоих видах с опухолью. Для не несущих опухоли животных значения Т составляли 58,09 часов в мышах SCID и 98,31 часов в голых мышах, соответственно. Из фармакокинетических параметров T значительно длиннее у ненесущих опухоли мышей, чем у мышей с опухолями.
Таблица 4
Фармакокинетические параметры в крысах
Параметр
1 мг/кг в.в.
10 мг/кг в.в.
Т<sub>mах</sub> (минуты)
5
5
С<sub>mах</sub> (мкг/мл)
9,49
102,08
T<sub>1/2</sub> конечная (дни)
3,81
4,98
Таблица 5
Фармакокинетические параметры в мышах SCID и в голых мышах (в.в. введение 5 мг/кг GNX-8)
Мышь SCID
Голая мышь
Наличие опухоли
-
-
-
С<sub>mах</sub> (мкг/мл)
76,45
72,52
76,5
84,4
Т<sub>mах</sub> (минуты)
5
5
5
30
T<sub>1/2</sub> (элиминация) (часы)
22,99
58,09
26,73
98,31
Исследования биораспределения проводили на голых мышах, несущих ксенотрансплант Colo205, для оценки активного таргетинга опухоли in vivo и специфичности GNX-8.
131
Наиболее высокий уровень I-GNX-8 радиоактивности детектировали в плазме во всех временных точках, 6 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч и 96 ч. Через 6 часов около 60% инъецируемых доз на грамм (%ИД/г) детектировали в плазме. Через 48, 72 и 96 часов %ИД/г для плазмы составил около 20%. Уровень в плазме значительно выше, чем в других органах, мозге, коже, мускулах, кости, сердце, легких, поджелудочной железе, глазе, надпочечниках, хвосте, селезенке, почках, печени, мочевом пузыре, желудке, тонком и толстом кишечнике, где %ИД/г во всех временных точках во всех органах не превышает 5% %ИД/г. Радиоактивность уменьшается с течением времени в плазме и в других органах, за исключением опухоли. Радиоактивность плазмы уменьшается приблизительно на 70% между 6 и 96 часами.
131
Радиоактивность опухоли изначально выше, чем в нормальных органах. Наивысшее поглощение опухолью наблюдали через 48 часов после инъекции I-GNX-8 и поддерживали в устойчивом состоянии, пока радиоактивность других органов уменьшалась.
131
Следовательно, соотношение опухоль/орган увеличивается в других органах. Быстрое падение радиоактивности наблюдали в плазме, сердце, легких, надпочечниках, хвосте, селезенке, почках и печени между 6 и 24 часами. С другой стороны, соотношения опухоль/плазма увеличивались примерно в 4 раза с 6 по 96 час после инъекции. В почках не наблюдали накопление I-GNX-8.
131
131
Активность таргетинга опухоли in vivo в голых мышах с опухолями из Colo205 изучали с помощью видиографии. Эксперимент зависимости от времени проводили для мониторинга распределения I-GNX-S. Результат также говорит о том, что большая часть I-GNX-8 находится в крови, и таргетинг опухоли хорошо заметен между 24 и 72 часами после инъекции.
In vivo данные указывают на то, что большая часть GNX-8 остается в крови после инъекции. В различных нормальных органах отсутствует значимое неспецифическое связывание.
Более того, GNX-8 поражает опухоль из Colo205 очень быстро после внутривенной инъекции и поддерживает мечение на стабильном уровне в пределах 96 часов.
ПРИМЕР 12: ТОКСИЧНОСТЬ
Изучение токсичности однократной дозы осуществляли на самцах и самках мышей BALB/c AnN Crl BR (6 мышей/группу) 8-9-недельного возраста. Мышам внутривенно инъецировали GNX-8 в дозе 150 мг/кг или отдельно носитель (PBS). Массу тела для всех мышей измеряли на 1, 8 и 16 день исследования до умерщвления. Мышей наблюдали ежедневно на наличие признаков заболеваемости или смертности.
Исследование токсичности повторных доз проводили на самцах крыс Sprague-Dawley Crl CD (SD) (6 крыс/группу) 8-недельного возраста. Каждой группе вводили носитель (PBS) или 3, 15 или 75 мг/кг/дозу GNX-8 дважды в неделю в течение 4 недель. Всех животных проверяли ежедневно на смертность и любые находки записывали индивидуально. Крыс взвешивали еженедельно в течение периодов предварительной обработки и обработки, и конечную массу после ночного голодания получали при умерщвлении. Образцы крови собирали после умерщвления и оценивали в них гематологические и клинические биохимические параметры. Достоверность различий в массе тела и во всех тестируемых параметрах определяли по t-критерию Стьюдента.
max
max
Для определения перекрестной реактивности GNX-8 на нормальных человеческих тканях применяли очень высокую дозу (150 мкг/мл) биотинилированного GNX-8. Тканевой эррей с 72 человеческими тканями (24 типа нормальных органов, взятых от 3 нормальных человеческих индивидуумов) (US Biomax FDA 801-1) окрашивали с помощью GNX-8. На основании результатов C фармакокинетического исследования GNX-8 применяли при 150 мкг/мл для гарантии того, что GNX-8 при C не будет иметь серьезной перекрестной реактивности с нормальными человеческими тканями. Такая концентрация намного выше, чем регулярно применяемые в иммуногистохимических исследованиях.
От слабого до среднего окрашивания GNX-8 наблюдали на нескольких человеческих тканях эпителиального происхождения, включая эпителий слизистой желудочно-кишечного тракта, эпителиальные клетки молочных протоков и кератинизированные клетки многослойного плоского эпителия. В соответствии с предыдущими выводами Finstad et al. (Clin. Cancer Res., 3:1433-1442, 1997), антитела, введенные в циркулирующую кровь, демонстрируют специфическую локализацию на клетках карциномы и не накапливаются в антигенположительных, прилегающих нормальных эпителиальных клетках. Также антитела не пересекают базальную мембрану. Следовательно, окрашивание эпителиальных клеток протоков в нормальной ткани с помощью GNX-8 не рассматривается как вредное.
Два дополнительных исследования проводили для определения перекрестной реактивности GNX-8 на нормальных человеческих клетках крови. Все тестируемые клетки крови от доноров с четырьмя различными типами крови (АВО) демонстрировали отрицательный ответ на GNX-8. Результаты подтверждают, что GNX-8 не связывается с клетками крови. Следовательно, GNX-8, вводимый в систему кровообращения, не приводит к повреждению клеток.
Для изучения безопасности GNX-8 in vivo два исследования проводили для определения острого и подострого эффектов токсичности.
Токсичность одиночной дозы GNX-8 тестировали на мышах BALB/c в дозе 150 мкг/мл. Мышей наблюдали один раз в день и не обнаружили ни одной смерти до планового умерщвления. Все мыши теряли массу в течение периода исследования, и не было отмечено значительных различий в средней потере массы тела между группой обработки GNX-8 и контрольной группой.
Исследование токсичности повторной дозы GNX-8 проводили на крысах Sprague Dawley Crl CD. Шесть животных в возрасте 8 недель разделяли на группы. Одной группе вводили носитель (PBS) дважды в неделю в течение четырех недель. Группы 2, 3 и 4 получали GNX-8 в PBS в концентрации 3, 15 и 75 мг/кг/дозу, соответственно, дважды в неделю в течение четырех недель. Всех животных проверяли ежедневно на смертность и все находки записывали. Крыс взвешивали еженедельно в течение периодов предварительной обработки и обработки, и конечную массу после ночного голодания получали при умерщвлении. Образцы крови собирали после умерщвления и оценивали в них гематологические и клинические химические параметры. Достоверность различий в массе тела и во всех измеренных параметрах анализировали с помощью t-критерия Стьюдента.
Нет никаких признаков токсичности, связанных с обработкой GNX-8. Анализ конечной потери массы тела указывает на отсутствие разницы между обрабатываемой и контрольной группами. Образцы крови контрольной группы и группы с высокой дозой брали до эвтаназии после ночного голодания и анализировали гематологический и клинический биохимический профили.
Между группой с высокой дозой и контрольной группой нет статистически значимых различий по количеству гемоглобина, гематокриту, количеству эритроцитов, среднему гематокритному числу, среднему эритроцитарному числу и средней концентрации гемоглобина в эритроците. Результаты указывают на то, что гематологическая токсичность не индуцируется повторным введением высоких доз GNX-8.
Для анализов клинической химии средние значения для параметров контрольной группы и группы с высокой дозой указаны в Таблице 6. Статистически значимое увеличение общего белка отмечено в группе с высокой дозой, что может быть результатом повторных инъекций высокой дозы антитела. Кроме того, также наблюдали незначительное увеличение альбумина. Однако значение все же оставалось в нормальных пределах для крыс. Данные клинической химии не демонстрируют значительного повреждения метаболизма и функции экскреции после повторной инъекции высокой дозы GNX-8.
Как гематологические анализы, так и анализы клинической химии подтверждают безопасность повторного введения высокой дозы GNX-8 в течение 4-недельного периода.
Таблица 6
Клинический химический анализ
Наименование
Контроль
Высокая доза
Среднее
Станд. откл.
Среднее
Станд. откл.
альбумин (г/дл)
3,3
0,4
3,9
0,2
ALT(GPT) (ед./л)
118,6
50,0
67,6
6,0
AST(GOT) (ед./л)
372,0
203,8
323,3
118,2
общий билирубин (мг/дц)
0,3
0,1
0,6
0,2
азот мочевины крови (мг/дц)
12,3
5,8
11,2
1,5
Са (мг/дл)
11,0
0,2
11,2
0,2
Cl<sup>-</sup> (ммоль/л)
108,0
2,1
106,0
2,2
холестерин (мг/дл)
96,6
9,2
86,4
18,7
креатинин (мг/дл)
1,2
0,7
1,1
0,5
K (ммоль/л)
4,9
0,6
4,9
0,5
Na<sup>+</sup> (ммоль/л)
144,6
2,7
148,2
4,2
фосфор (мг/дл)
8,4
0,6
7,4
0,9
общий белок (г/дл)
6,3
0,3
7,1
0,2
ПРИМЕР 13: МАСШТАБИРОВАНИЕ
Для получения стабильной клеточной линии для крупномасштабного производства GNX-8 получали клеточные линии NS0 и СНО, экспрессирующие рекомбинантный GNX-8 (rGNX-8). Вкратце, кДНК, кодирующую как тяжелую, так и легкую цепи GNX-8, клонировали из исходной гибридомы. Выделенные гены антитела затем пересобирали в экспрессирующих векторах. Молекулярную массу rGNX-8, очищенного из среды, кондиционированной трансфицированными клетками NS0, подтверждали ДСН-ПААГ. Специфичность, активность связывания и эффективность rGNX-8 и исходной гибридомы GNX-8 сравнивали с помощью ВЭТСХ, иммуноокрашивания, проточной цитометрии и CDC-анализа.
Между исходным и рекомбинантным антителами GNX-8 различия отсутствуют.
Затем с помощью MALDI-MS анализировали профили N-гликозилирования rGNX-8 и GNX-8.
Данные демонстрируют очень похожий профиль N-связанного сахара между двумя антителами. Почти все N-гликаны двух антител содержат основную фукозилированную структуру, но не содержат концевых сиаловых кислот.
-
6
260
Дефицитные по дигидрофолатредуктазе клетки яичников китайского хомяка (CHO/dhfr) (ATCC CRL-9096) поддерживали в среде IMDM, содержащей 5% FBS и дополненной 100 нМ гипоксантином и 16 мкМ тимидином. Для приготовления клеточных линий, продуцирующих GNX-8, экспрессирующий вектор pCIck-GNX-8 DHFR лианеризовали посредством BamHI и по поглощению OD определяли в растворе концентрацию извлеченной ДНК. Примерно 1,2×10 клеток CHO/dhfr- трансфицировали 10 мкг линеаризованной ДНК и 30 мкл средства для трансфекции «Fugene6» (Roche) в соответствии с инструкциями производителя. После 48 часов культуральную среду заменяли IMDM, содержащей 5% диализованную фетальную бычью сыворотку для отбора трансфектантов. Отбор продолжали в течение примерно двух недель до получения стабильных колоний. Множество колоний выкалывали и культивировали в той же самой селективной среде в 48-луночных планшетах. Индивидуальные клоны СНО подвергали скринингу на предмет экспрессии rGNX-8 посредством антиген-специфичной ИФА с помощью HRP меченных антител против IgG(Fc) человека в качестве второго антитела.
Клон СНО, который экспрессирует высокие уровни антитела, выбирали для последующей амплификации гена с помощью метотрексата (МТХ). Амплификация гена в присутствии 10 нМ МТХ в результате дала более чем 30-кратное увеличение секреции rGNX-8. Стабильный клон СНО называется CHO-rGNX-8.5M10.
Клетки CHO-rGNX-8.5M10 позднее адаптировали для бессывороточной культуры во встряхиваемых флаконах и получали максимальных выход примерно 120 мкг/мл GNX-8 из 14-дневной культуры. Культуральный супернатант собирали и очищали с помощью хроматографии с Протеином А. Антитело rGNX-8, очищенное из культурального супернатанта СНО хроматографией с протеином А, продемонстрировало ожидаемые полосы пептидов легкой и тяжелой цепей на ДСН-ПААГ.
Специалист в данной области распознает или будет способен выявить с использованием не более чем рутинного экспериментирования множество эквивалентов конкретных воплощений изобретения, описанных в настоящем документе. Подразумевается, что такие эквиваленты охвачены нижеследующей формулой изобретения.