СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГО ПРЕПАРАТА ФИЦИНА И N-МАЛЕОИЛХИТОЗАНА В ВИДЕ ГУСТОГО РАСТВОРА
METHOD FOR OBTAINING FICIN AND N-MALEOILCHITOSAN HYBRID PREPARATION IN THE FORM OF A DENSE SOLUTION

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в фармацевтической промышленности, медицинской практике при создании лекарственных препаратов для профилактики инфекционных заболеваний органов дыхания.
Фицин (КФ 3.4.22.3) - цистеиновая протеаза, которую выделяют из латекса фиговых деревьев (Ficus species). Данный фермент содержит одну полипептидную цепь массой ~25 кДа, которая свернута с образованием глобулярного белка и включает два домена. В состав активного центра фицина входит триада аминокислот - Cys, His и Asp.Для молекулы энзима оптимум рН составляет 6.7, оптимальная температура - от 45 до 55°С [С.М. Панкова, М.Г. Холявка, М.С. Кондратьев, Ю.М. Вышкворкина, А.Н. Лукин, В.Г. Артюхов Изучение процессов УФ-модификацик фицина, свободного и иммобилизованного на матрице хитозана // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2020. Т. 60. №4. С. 411-417]. Фицин обладает антимикробной активностью против i рамположительных и грамотрицательных бактерий [Н. Zarea, А.А. Moosavi-Movahedi, М. Salami Autolysis control and structural changes of purified ficin from Iranian fig latex with synthetic inhibitors // Int. J. Biol. Macromolec. 2016. V 84. P. 464-471]. Известна пероральная композиция для предотвращения и уменьшения адгезии бактерий к поверхностям ротовой полости, включающая фицин [Патент RU 2007126845 А, МПК A61K 8/66, дата публ. заявки 27.01.2009, Бюл. №3].
Биотехнологическое производство, направленное на получение стабильных ферментных препаратов, в настоящее время развивается высокими темпами. Перспективной задачей биотехнологии является создание биокатализаторов на основе иммобилизованных ферментов для использования в медицинских и фармакологических целях. Преимущество иммобилизованных энзимов перед растворенными заключается в их более высокой стабильности по отношению к различным физико-химическим факторам [Z. Ashkan, R. Hemmati, A. Homaei Immobilization of enzymes on nanoinorganic support materials: An update// International Journal of Biological Macromolecules. - 2021. V. 168. - P. 708-721].
Хитозан - это полисахарид животного происхождения, обладающий ценными свойствами: нетоксичностью, неантигенностью, высокой сорбционной способностью, совместимостью с большинством лекарственных средств, антибактериальным и противогрибковым действием. Показано, что с увеличением количества аминогрупп в молекуле хитозана усиливалась его инактивирующая способность по отношению к фаговым инфекциям [З.М. Кочкина, С.Н. Чирков Влияние хитозана на фаговые инфекции. Материалы 5-ой конф. «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана». М: ВНИРО 25-27 мая 1999. С. 1511]. Обнаружено, что препараты с хитозаном активировали продукцию цитокинов [Е. Nishimura, S. Nishimura, Н. Seo Macrophage activation with multi-porous beads prepared from partially deacetylated chitin. J. Biomed. Mater. - Res. - 1986. Vol. 20. 9. P. 1359-13721].
N-малеоилхитозан является ацильным производным природного полимера хитозана. За счет ковалентной модификации свободной аминогруппы полисахарида остатком малеиновой кислоты повышается способность итогового продукта к растворению в воде. Это свойство позволяет расширить диапазон значений рН для получения гомогенных систем на основе N-малеоилхитозана в водных средах, что важно для создания новых фармацевтических форм лекарственных препаратов. Также, как и прочие природные полисахариды, TV-малеоилхитозан способен образовывать прочные эластичные пористые пленки и, кроме того, известно, что N-малеоилхитозан является биосовместимым и имеет высокую адгезию к фибробластам кожи человека [Zhu, A., Pan, Y., Liao, Т., Zhao, F., & Chen, Т. (2008). The synthesis and characterization of polymerizable and biocompatible N-maleicacyl-chitosan. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials, 85B(2), 489-495.]. Отдельно стоит отметить простоту синтеза этого производного хитозана, а также доступность реактивов для его получения.
Существует способ получения гетерогенного препарата на основе фицина, обладающего ранозаживляющим и регенерирующим действием [Патент RU 2677858 С2, СПК A61K 31/74 (2006.01); A61K 38/46 (2006.01); А61Р 17/02 (2006.01); C12N 11/08 (2006.01), опубл. 22.01.2019, Бюл. №3], включающий иммобилизацию фицина в буферном растворе на матрицу ионообменных волокон ВИОН КН-1 в соотношении 20 мл буферного раствора фермента в концентрации 1 мг/мл на 1 г волокон, при этом в качестве буферного раствора использовался 0.05 М трис-HCl буфер с рН 7.0; инкубирование проводится в течение 24 часов при комнатной температуре с периодическим перемешиванием; образовавшийся осадок промывают 0.05 М трис 110 буфером с рН 7.0 до отсутствия в промывных водах фицина.
Известен способ получения средства та основе фицина и низкомолекулярного хитозана 50-190 кДа, который позволяет сократить расход противовоспалительного, ранозаживляющего средства благодаря пролонгированному действию и высокой стабильности получаемого препарата [Патент RU 2769243 С1, СПК A61K 31/722 (2021.08); A61K 38/46 (2021.08); A61K 38/48 (2021.08); A61K 31/56 (2021.08); А61Р 17/02 (2021.08), опубл. 29.03.2022, Бюл. №10]. Он включает иммобилизацию энзима в буферном растворе на матрицу кислоторастворимого низкомолекулярного хитозана 50-190 кДа в соотношении 20 мл буферного раствора фицина в концентрации 1 мг/мл на 1 г хитозана, при этом в качестве буферного раствора используют 0.05 М боратный буфер с добавлением KCl с рН 8.0; инкубирование в течение 24 часов при комнатной температуре с периодическим перемешиванием; промывание образовавшегося осадка 0.05 М боратным буфером с добавлением KCl с рН 8.0 до отсутствия в промывных водах фицина.
Существует способ получения гетерогенного биокатализатора на основе фицина, иммобилизованного на ионообменных смолах [Патент RU 2769734 С1, СПК C12N 11/10 (2022.01); C12N 9/50 (2022.01), опубл. 05.04.2022, Бюл. №10], включающий адсорбционную иммобилизацию фицина в буферном растворе на матрицу ионообменной смолы, инкубацию при комнатной температуре, промывку образовавшегося осадка буфером, при этом иммобилизацию проводят на матрицу воздушно-сухой ионообменной смолы АВ-17-2П или АВ-16-ГС, а в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0.05 М фосфатный буфер для ионообменной смолы АВ-17-2П, рН 11.0 или 0.05 М NaOH-KCl буфер для АВ-16-ГС.
Недостатком данных способов является тот же, что в итоге получается нерастворимая форма фермента, которая не дает возможность проводить реакции на твердых субстратах.
Известен способ получения иммобилизование то ферментного препарата на основе фицина, гиалуроновой кислоты и полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами [Патент RU 2744457 C1, A61K 38/00, A61K 38/46, A61K 47/36, C12N 11/08, A61I 17/02, опубл. 09.03.2021, Бюл. №7], включающий иммобилизацию ферментного препарата на основе фицина, полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами, и гиалуроновой кислоты, растворение фицина в водном растворе низкомолекулярной гиалуроновой кислоты 300 кДа. или среднемолекулярной гиалуроновой кислоты 500 к Да, или высокомолекулярной гиалуроновой кислоты 800 кДа в соотношении 10 мг энзима на 2 мл водного раствора гиалуроновой кислоты различной молекулярной массы в концентрации 1.5%, при перемешивании до полного растворения при комнатной температуре; проведение иммобилизации фицина путем добавления к полученной смеси графт-сополимера карбоксиметилцеллюлозы с молекулярной массой 50-100 кДа (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с молекулярной массой 50-100 кДа с N-винилимидазолом (ВИ) или N,N-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) в количестве от 100 до 290 мг для получения жидкого препарата или от 300 до 500 мг для получения геля. Недостатком способа является высокая стоимость гиалуроновой кислоты и полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами.
Существует способ стабилизации протеаз для использования в косметологических целях [US 2011/0177052]. Недостатком способа является использование 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида, который вызывает серьезные ожоги кожи и повреждение глаз, может приводить к аллергическим кожным реакциям, при вдыхании может вызывать аллергию, симптомы астмы или затруднение дыхания, что ограничивает применение препарата в косметологии.
В качестве прототипа служил способ получения гетерогенного препарата в виде гелей на основе фицина и карбоксиметилцеллюлозы [Патент RU 2771183 С1, СПК C12N 11/04 (2022.02); C12N 1 /12 (2022.02); A61K 38/46 (2022.02), опубл. 28.04.2022, Бюл. №13], вклк. чающий иммобилизацию ферментного препарата в буферном растворе в соотношении 20 мл раствора фермента в концентрации 3 мг/мл на 1 г носителя, в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0.05 М боратный буфер с добавлением 0.1 М KCl с рН 9.0; инкубация проводится в течение 2 часов при комнатной температуре с периодическим перемешиванием; образовавшийся осадок промывают 0.05 М трис-HCl буфером (рН 7.5) до отсутствия в промывных водах белка.
В отличие от прототипа, предлагаемый нами способ позволяет получить иммобилизованный фицин в другой форме, т.е. не в виде геля, а в форме густого раствора, включающего только иммобилизованный (стабилизированный) фицин и полностью отмытого от его нестабилизированной (неиммобилизованной) формы. Кроме того, заявленное изобретение предназначено для расширения числа полисахаридов, используемых для стабилизации препаратов фицина в медицинских целях.
Технический результат заявленного изобретения заключается в разработке способа получения гибридного препарата иммобилизованного фицина и N-малеоилхитозана в виде густого раствора с абсолютной вязкостью 50-100 МПа×с, включающего только иммобилизованный (стабилизированный) фицин, и полностью отмытого от его нестабилизированной (неиммобилизованной) формы, обладающего высокой растворимостью в воде в широком диапазоне рН.
Технический результат достигается тем, что в способе получения гибридного препарата фицина и N-малеоилхитозана в виде густого раствора, включающем иммобилизацию ферментного препарата фицина в буферном растворе с носителем, инкубирование при комнатной температуре в течение 2 часов и промывку, согласно изобретению, иммобилизацию фицина проводят путем комлексообразования в густой раствор N-малеоилхитозана с молекулярной массой 200 кДа в соотношении 13 мл раствора фицина в концентрации 2 мг/мл, полученного растворением в буфере, на 1 г сухого N-малеоилхитозана, предварительно растворенного в 10 мл буфера, при постоянном перемешивании со скоростью 250 об/мин; в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0.05 М гл щиновый буфер с рН 10.0; образовавшийся в процессе инкубирования препарат в виде густого раствора промывают с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка шириной 34 мм, вместимостью 3.7 мл на 10 мм длины, с диаметром пор 25 кДа против 0.05 М трис-HCl буфера с рН 7.5, из расчета, что для промывки 21 мл полученного препарата используют 400 мл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7.5, диализ ведут в течение 8 часов, после чего буфер меняют на порцию свежего в объеме 400 мл и продолжают диализ еще в течение 16 часов до отсутствия в промывном растворе свободного фицина.
Фиг. 1. Диаграмма значений содержания белка (в мг на 1 г носителя) в гибридных препаратах в виде густого раствора фицина и N-малеоилхитозана с различными молекулярными массами.
Фиг. 2. Диаграмма значений общей активности (в ед на 1 мл раствора) гибридных препаратов в виде густого раствора фицина и N-малеоилхитозана с различными молекулярными массами.
Пример реализации способа.
В качестве объекта исследования был выбран фицин фирмы «Sigma-Aldrich», субстратом для гидролиза служил азоказеин фирмы «Sigma-Aldrich». Для синтеза N-малеоилхитозана был использован хитозан фирмы «Биопрогресс» со средней молекулярной массой 600 кДа и степенью деацетилирования 0.85.
Синтез N-малеоилхитозана осуществляли по следующей методике.
Для получения хитозана с различными молекулярными массами использовали кислотный гидролиз исходного полис 1харида. Навеску хитозана массой 1 г со средней молекулярной массой 600 кД растворяли в 100 мл 2%-ного масс, водного раствора уксусной кислоты, после чего переносили раствор в кругл о донную колбу, снабженную обратным холодильником, добавляли 50 мл 0.1 М водного раствора HCl и кипятили в течение 10 минут для получения хитозана со средней молекулярной массой 350 кДа или 20 минут для получения хитозана со средней молекулярной мае юй 200 кДа. После смесь охлаждали до комнатной температуры, раствор нейтрализовали 30 мл 25%-ного масс, водного раствора аммиака до слабощелочного значения рН (~ 8). Полимер из реакционной массы выделяли осаждением в 500 мл изопропилового спирта ЧДА, после чего промывали 100 мл дистиллированной воды и 50 мл 96%-ного об. этилового спирта и сушили в вакуумном сушильном шкафу при 55°С до постоянной массы.
Молекулярные массы деструктированного хитозана определяли общепринятым вискозиметрическим методом с помощью вискозиметра Уббелоде в смеси водных растворов 0.3 М уксусной кислоты и 0.2 М ацетата натрия при 25°С. Из данных вискозиметрии с помощью уравнения Марка-Куна-Хаувинка-Сакурады вычисляли значения молекулярных масс:
-5
где [η] - характеристическая вязкость, для, рассчитанная из данных вискозиметрии, М - средневязкостная молекулярная масса полимера, К и а -константы, равные 82×10 дл/г и 0.76 соответственно [Sorokin A., Lavlinskaya М, Polymer Bulletin, 2022, Vol. 79, pp. 407-427. DOI: 10.1007/s00289-020-03521-9.].
Для получения N-малеоилхитозана навеску хитозанов с молекулярной массой 200, 350 или 600 кДа массой 1.6 г растворяли в 100 мл 2%-ного масс, водного раствора уксусной кислоты и перемешивали до полного растворения хитозана. Затем растворяли 3 г малеинового ангидрида в 50 мл ацетона ЧДА и вносили в раствор хитозана. Смесь выдерживали 4 часа при комнатной температуре. Полимер выделяли осаждением в 500 мл 4-метил-2-пентанона ЧДА, после чего промывали 50 мл 96%-ным об. эти лового спирта и сушили в вакуумном сушильном шкафу при 55°С до постоян ой массы.
-1
-1
Подтверждение предполагаемой структуры N-малеоилхитозана осуществляли с помощью метода ИК-спек гроскопии. ИК-спектры регистрировали в диапазоне частот 4000-400 см на спектрометре Bruker Vertex 70 с Фурье-преобразователем (Bruker Optics, Германия) методом нарушенного полного внутреннего отражения с шагом регистрации 2 см.
Степень замещения полученного полимера определяли титриметрически [Sorokin A., Lavlinskaya М., Polyvier Bulletin, 2022, Vol. 79, pp.407-427. DOI: 10.1007/s00289-020-03521-9.].
Комплексообразование фицина и JV-малеоилхитозана осуществляли следующим образом. К 1 г TV-малеоилхитозана с молекулярной массой 200,350 или 600 кДа, предварительно растворенного в 10 мл 0.05 М глицинового буфера с рН 10.0, добавляли 10 мл раствора фермента в концентрации 2 мг/мл, приготовленного растворением фицина в 0.05 М глициновом буфере с рН 10.0, инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре при постоянном перемешивании со скоростью 250 об/мин. После окончания инкубации образовавшийся препарат в виде густого раствора очищали от несвязанного фермента с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка Spectra/Рог 6 Standard RC, шириной 34 мм, вместимостью 3.7 мл на 10 мм длины, изготовленного из регенерированной целлюлозы, с диаметром пор 25 кДа против 400 мл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7.5 в течение 8 часов, после чего буфер меняли на 400 мл свежего и продолжали диализ еще в течение 16 часов до отсутствия в промывном растворе свободного фицина. Для промывки 21 мл полученного препарата использовали 800 мл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7.5. По истечении этого времени осуществляли контроль наличия белка в промывных водах с помощью спектрофотометра СФ-2000 при Х- 280 нм.
Содержание белка в гибридных препаратах фицина определяли методом Лоури [Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Faar A.L., Randall R.J. Protein measurement with folin-phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. - V. 193. - P. 265-275.].
Определение протеазной активности фицин проводили на субстрате азоказеине (Sigma, США) [Sabirova A.R., Ruda:ova N.L., Balaban N.P., Ilyinskaya O.N., Demidyuk I.V., Kostrov S.V., Ruden kaya G.N., Sharipova M.R. A novel secreted metzincin metalloproteinase from Bacillus intermedins II FEBS Lett. - 2010 - V. 584 (21), P. 4419^1425]. К 50 мг образца добавляли 200 мкл 0.05 М трис-HCl буфера с рН 7.5, 800 мкл азоказеина (0.5% масс, в 0.05 М трис-HCl буфере, рН 7.5) и инкубировали 2 часа n и 37°С. Далее добавляли 800 мкл трихлоруксусной кислоты (ТХУ) (5% масс), инкубировали 10 минут при 4°С, затем центрифугировали в течение 3 мин при 11700 g для удаления негидролизованного азоказеина. К 1200 мкл супернатанта добавляли 240 мкл раствора NaOH (3% масс.) для нейтрализации кислоты, после чего измеряли оптическую плотность опытной пробы при 410 нм в 10 мм кювете. Контрольная проба содержала 800 мкл азоказеина, 800 мкл ТХУ, 50 мг образца и 200 мкл буфера (комплексообразованный фермент в контрольную пробу вносили последним, остальные операции для нее делали аналогично опытным пробам).
Единицей протеазной активности служило количество фицина, которое в условиях эксперимента гидролизует 1 мкМ азоказеина за 1 мин. Протеазную активность рассчитывали по формуле:
A=D* 1000/120/200,
где A - протеазная активность препарата, мкМ/мин,
D - оптическая плотность раствора при 410 нм,
120 - время инкубации в минутах,
200 - объем пробы, мкл,
1000 - коэффициент для пересчета в мкМ.
Все экспериментальные исследования осуществляли минимум в 8-кратной повторное™. Статистическая обработка полученных результатов проводилась при уровне значимости 5% с использованием t-критерия Стьюдента.
Для получения гибридных препаратов фицина и N-малеоилхитозана с разными молекулярными массами в сачестве среды для комплексообразования мы использовали 0.05 М пи циновый буфер с рН 10.0. Результаты отражены на фиг. 1,2.
Анализ содержания белка в гибридных лрепаратах показал, что наибольшее количество фицина (в мг на г носителя) связывается с N-малеоилхитозаном с молекулярной массой 200 кДа (фиг. 1).
Активность фицина (в ед на мл раствора) оказалась выше при его комплексообразовании с N-малеоилхитозаном с молекулярной массой 200 кДа (фиг. 2).
Мы сравнили полученные результаты по определению каталитической активности и содержания белка для препаратов фицина в густом растворе N-малеоилхитозана. Оптимальное соотношение содержания белка (мг на г носителя) и активности (в ед на мл раствора) получено при включении фицина в густой раствор N-малеоилхитозана с молекулярной массой 200 кДа.
Таким образом, была разработана методика получения гибридного препарата фицина и N-малеоилхитозана в виде густого раствора с абсолютной вязкостью 50-100 МПахс, включающего только иммобилизованный (стабилизированный) фицин и полностью отмытого от его нестабилизированной (неиммобилизованной) формы, т.к. после диализа 21 мл препарата против 800 мл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7.5 исключается переход фермента из фазы носителя в раствор, что позволяет проводить реакции, получая продукт, не "загрязненный" ферментом.