Способ определения наличия генетической предрасположенности к долголетию человека
METHOD FOR DETERMINING THE PRESENCE OF A GENETIC PREDISPOSITION TO HUMAN LONGEVITY

Изобретение относится к молекулярной биологии и медицине, а именно к медицинской генетике, диагностике, геронтологии. Изобретение представляет собой способ определения наличия генетической предрасположенности к долголетию человека. С выделенной из биологического материала человека ДНК проводят полимеразно-цепную реакцию в реальном времени в присутствии олигонуклеотидных зондов и праймеров и анализируют полиморфизм rs2802288 гена FOXO3A методом аллельной дискриминации.
Изобретение обеспечивает получение новых критериев оценки предполагаемой продолжительности жизни на основе генетических факторов, на основе данных о генетическом варианте локуса rs2802288.
Долголетие человека является многофакторным фенотипом, на который влияют как генетические, так и экологические факторы. Помимо статуса АРОЕ, изменение в гене FOXO3A является единственным подтвержденным генетическим фактором, способствующим увеличенной продолжительности жизни человека.  С, Flachsbart F, Caliebe А, Schreiber S, Nebel A, Krawczak M. Adjustment for smoking does not alter the FOXO3A association with longevity. [1]
rs2802288 - это однонуклеотидный полиморфизм (SNP) в гене FOXO3A, кодирующем белок, который является эволюционно консервативным ключевым регулятором сигнального пути инсулин-IGF1. Он играет важную роль в репарации ДНК и апоптозе в ответ на повреждение ДНК и окислительный стресс. Кроме того, FOXO3A может выступать в качестве супрессора образования злокачественных опухолей, и было установлено, что активность FOXO3A подавляется при различных раковых заболеваниях. [1]
Различные исследования показали высокий уровень корреляции между присутствием в геноме человека редкого аллеля rs2802288 и долголетием как для мужчин, так и для женщин. Присутствие хотя бы одной копии аллеля rs2802288(A) увеличивает вероятность дожить до 100 лет в ~1.5 раза. [1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9]
В изученной доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа определения наличия генетической предрасположенности к долголетию человека на основе полиморфизма rs2802288.
В патенте JP 5233666 B2 Life expectancy calculation device, portable terminal device, life expectancy calculation method, and life expectancy calculation program (дата публикации 2013-07-10) предложен прибор, оценивающий продолжительность жизни человека при помощи вычислений, основанных на информации о пульсе. [10] Недостатком данного метода является необходимость приобретения и ношения прибора для регистрации данных, недостаточная репрезентативность такого физиологического фактора, как пульс, в силу влияния множества внешних и внутренних факторов на него и недостаточная информативность, так как метод не включает генетические маркеры и не позволяет оценить передачу данного признака потомкам.
В заявке WO 2007061941 A2 System and method for estimating life expectancy and providing customized advice for improving life expectancy, 18.11.2005 предложена система, которая рассчитывает и предоставляет человеку оценку ожидаемой продолжительности жизни человека на основе ответов человека на вопросник. [11] Недостатком данного метода является субъективность оценки и недостаточная информативность, так как метод не включает генетические маркеры и не позволяет оценить передачу данного признака потомкам.
В заявке US 2007241912 A1 «Apparatus and method for calculating life expectancy in mobile communication terminal)), 22.01.2007 предложен прибор, оценивающий продолжительность жизни человека при помощи вычислений, основанных на введенной пользователем информации, такой как текущее состояние пользователя, привычки питания, физические упражнения и окружающая среда. Данные о текущем состоянии пользователя могут быть такими, как пол пользователя, дата рождения, рост и вес. [12] Недостатком данного метода является необходимость приобретения и использования прибора для регистрации данных, субъективность оценки и недостаточная информативность, так как метод не включает генетические маркеры и не позволяет оценить передачу данного признака потомкам.
Методом, позволяющим проанализировать состояние полиморфизмов rs2251746 и rs2427837 является секвенирование по Сэнгеру - метод, применяемый для детекции любых изменений нуклеотидной последовательности, разработанный Ф. Сэнгером в 1977 году и широко использующийся для изучения нуклеотидной последовательности ДНК человека. Sanger F. "Determination of nucleotide sequences in DNA". Biosci Rep. - 2004. [13] Недостатками данного метода являются его трудоемкость, необходимость в приобретении дорогостоящего оборудования и реактивов, значительно более долгое получение результатов и повышенные риски контаминации лаборатории продуктами полимеразно-цепной реакции (ПЦР) и реакций секвенирования.
За прототип нами был выбран патент США №5538848 (US 5538848 A, Kenneth J. Livak, Susan J., A. Flood, Jeffrey Marmaro, Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe, 23.07.1996), представляющий собой метод анализа ДНК путем проведения полимеразно-цепной реакции в реальном времени в присутствии меченых флуорофорами, аллель-специфичных (TaqMan) зондов и праймеров. [14] Недостатком прототипа является то, что для использования описанного в прототипе метода на практике, с целью исследования различных полиморфизмов, требуется разработка TaqMan зондов и праймеров для каждого отдельного исследуемого полиморфизма.
Технической задачей изобретения является определение возможности наличия генетической предрасположенности к долголетию человека по данным о состоянии полиморфизма rs2802288 точным, простым и быстрым способом.
Техническим результатом изобретения является разработка TaqMan зондов и праймеров для анализа полиморфизма rs2802288 методом аллельной дискриминации при помощи следующих TaqMan зондов и праймеров:
Probe 1: FAM-CTGCAGTAGAAGTTGGCAGTGCTACTGTG-BHQ1
Probe 2: ROX-CTGCGGTAGAAGTTGGCAGTGCTACTGTG-BHQ2
Pr Fw: CAGCATGCAGGGGAGGACTGTG
Pr rev: TCAGGCTTGTACCCAGAGTTGTC,
а затем прогнозирование наличия генетической предрасположенности к долголетию человека. Прогнозируют наличие генетической предрасположенности к долголетию человека, которая увеличивает в ~1.5 раза вероятность дожить до 100 лет в случае выявления генотипа AA(rs2802288) или AG(rs2802288) и отсутствие генетической предрасположенности к долголетию человека, которая увеличивает в ~1.5 раза вероятность дожить до 100 лет в случае выявления генотипа GG(rs2802288).
Описание фигур.
Фиг. 1. Аллельная дискриминация методом детекции TaqMan зондов по данным величин RFU каждого зонда на амплификаторе CFX96 с детектирующей системой в режиме реального времени полиморфизма rs2251746, где:
- отрицательный контроль,
- гомозиготы GG,
- гетерозиготы AG,
- гомозиготы АА.
Осуществление изобретения
Для достижения указанного технического результата был разработан способ определения наличия генетической предрасположенности к долголетию человека, который осуществляется следующим образом:
1. Выделение ДНК из биологического материала пациента
Выделение ДНК из биологического материала пациента осуществляется при помощи коммерческого набора Gene Jet Whole Blood Genomic DNA Purification Mini Kit фирмы ThermoFisher Scientific или любым альтернативным методом выделения ДНК, например, методом фенол-хлороформной экстракции по Мэтью.
2. Анализ полиморфизма rs2802288
Анализ полиморфизма rs2802288 проводят методом ГТЦР в реальном времени на амплификаторе Bio-Rad CFX96 Real-Time System или аналогичном амплификаторе, с последующим анализом методом аллельной дискриминации.
Для исследования полиморфизма rs2802288 авторами были разработаны следующие TaqMan зонды и праймеры:
Зонды:
Probe 1: FAM-CTGCAGTAGAAGTTGGCAGTGCTACTGTG-BHQ1
Probe 2: ROX-CTGCGGTAGAAGTTGGCAGTGCTACTGTG-BHQ2
Праймеры:
Pr Fw: CAGCATGCAGGGGAGGACTGTG
Pr rev: TCAGGCTTGTACCCAGAGTTGTC
Реакционная смесь объемом 10 мкл включает в себя:
1. ДНК = 2.8 мкл,
2. Pr Fw = 1 мкл,
3. Pr rev = 1 мкл,
4. Probe 1 = 0.1 мкл,
5. Probe 2 = 0.1 мкл,
6. iTaq Universal Probes supermix фирмы Biorad = 5 мкл,
После денатурации (3 минуты при t=95°C) выполняют 35 циклов амплификации по схеме: 10 секунд при t=95°C, 30 секунд при t=64°C, регистрация флуоресценции
При проведении ПЦР в амплификаторе Bio-Rad CFX96 Real-Time System с флюоресцентной детекцией генотипирование осуществляют методом TaqMan зондов по величине RFU (относительных единиц флуоресценции). Для rs2802288 зонд с флуоресцентным красителем FAM соответствует аллелю А, зонд с красителем ROX - аллелю G.
Изобретение охарактеризовано на фигуре 1. На фигуре видно четкое разделение образцов на кластеры, где кластер  соответствует отрицательному контролю, кластер  - гомозиготам GG, не имеющим генетической предрасположенности к долголетию человека, которая увеличивает в ~1.5 раза вероятность дожить до 100 лет, кластер  - гетерозиготам AG, имеющим генетическую предрасположенность к долголетию человека, которая увеличивает в ~1.5 раза вероятность дожить до 100 лет, а кластер  - гомозиготам АА, имеющим генетическую предрасположенность к долголетию человека, которая увеличивает в ~1.5 раза вероятность дожить до 100 лет.
3. Прогнозирование риска развития заболеваний, связанных с уровнем сывороточного IgE
rs2251746
В случае выявления генотипа АА прогнозируется наличие генетической предрасположенности к долголетию человека, которая увеличивает в ~1.5 раза вероятность дожить до 100 лет.
В случае выявления генотипа AG прогнозируется наличие генетической предрасположенности к долголетию, которая увеличивает в ~1.5 раза вероятность дожить до 100 лет.
В случае выявления генотипа GG прогнозируется отсутствие генетической предрасположенности к долголетию человека, которая увеличивает в ~1.5 раза вероятность дожить до 100 лет.
В качестве примеров применения разработанного способа приведено исследование ДНК добровольцев, не являющихся родственниками, для которых был проведен анализ полиморфизма генов rs2251746 и rs2427837.
Пример 1.
У пациента N13 была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров было выявлено, что генотип пациента по локусу rs2802288 - АА.
Выявленный генотип позволяет предположить наличие генетической предрасположенности к долголетию человека, которая увеличивает в ~1.5 раза вероятность дожить до 100 лет. Полученные результаты были подтверждены секвенированием.
Пример 2.
У пациента N4 была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров было выявлено, что генотип пациента по локусу rs2802288 - AG. Выявленный генотип позволяет предположить наличие генетической предрасположенности к долголетию человека, которая увеличивает в ~1.5 раза вероятность дожить до 100 лет. Полученные результаты были подтверждены секвенированием.
Пример 3.
У пациента N3 была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров было выявлено, что генотип пациента по локусу rs2802288 - GG. Выявленный генотип позволяет предположить отсутствие генетической предрасположенности к долголетию человека, которая увеличивает в ~1.5 раза вероятность дожить до 100 лет. Полученные результаты были подтверждены секвенированием.
Разработанный нами метод обладает следующими преимуществами:
1. Позволяет оценить генетическую предрасположенность к долголетию,
2. Является точным, простым, быстрым и недорогим в исполнении,
3. Не требует медицинских знаний, сбора анамнеза или присутствия пациента,
4. Может быть проведен с использованием различных видов биологического материала, содержащих ДНК пациента (венозная кровь, буккальный эпителий, волосяные фолликулы и др.),
5. Может использоваться для любой группы населения,
6. Позволяет оценить вероятность передачи данного признака потомкам,
7. Результат исследования не зависит от текущего состояния здоровья пациента.
Список литературы:
1.  С, Flachsbart F, Caliebe A, Schreiber S, Nebel A, Krawczak M. Adjustment for smoking does not alter the FOXO3A association with longevity. Age (Dordr). 2014; 36(2):911-921. doi:10.1007/s11357-013-9578-z
2. Sun L, Hu C, Qian Y, et al. Age-Based Differences in the Genetic Determinants of Glycemic Control: A Case of FOXO3 Variations. PLoS One. 2015; 10(5):e0126696. Published 2015 May 20. doi: 10.1371/journal.pone.0126696
3. Bao JM, Song XL, Hong YQ, et al. Association between FOXO3A gene polymorphisms and human longevity: a meta-analysis. Asian J Androl. 2014; 16(3):446-452. doi:10.4103/1008-682X.123673
4. Sanese P, Forte G, Disciglio V, Grossi V, Simone C. FOXO3 on the Road to Longevity: Lessons From SNPs and Chromatin Hubs. Comput Struct Biotechnol J. 2019; 17:737-745. Published 2019 Jun 13. doi:10.1016/j.csbj.2019.06.011
5. Flachsbart F, Caliebe A, Kleindorp R, et al. Association of FOXO3A variation with human longevity confirmed in German centenarians. Proc Natl Acad Sci USA. 2009; 106(8):2700-2705. doi: 10.1073/pnas.0809594106
6. Zhao S, Bao J, Song X. AB126. Association between FOXO3A gene polymorphisms and human longevity: a meta-analysis. Transl Androl Urol. 2016; 5(Suppl 1):AB126. doi:10.21037/tau.2016.s126
7. Lin R, Zhang Y, Yan D, et al. Genetic Association Analysis of Common Variants in FOX03 Related to Longevity in a Chinese Population. PLoS One. 2016; 11(12):e0167918. Published 2016 Dec 9. doi: 10.1371/journal.pone.0167918
8. Chung WH, Dao RL, Chen LK, Hung SI. The role of genetic variants in human longevity. Ageing Res Rev. 2010; 9 Suppl LS67-S78. doi: 10.1016/j.arr.2010.08.001
9. Martins R, Lithgow GJ, Link W. Long live FOXO: unraveling the role of FOXO proteins in aging and longevity. Aging Cell. 2016; 15(2): 196-207. doi: 10.1111/acel.12427
10. JP5233666B2 (дата публикации 2013-07-10) LIFE EXPECTANCY CALCULATION DEVICE, PORTABLE TERMINAL DEVICE, LIFE EXPECTANCY CALCULATION METHOD, AND LIFE EXPECTANCY CALCULATION PROGRAM
11. WO 2007061941 A2 System and method for estimating life expectancy and providing customized advice for improving life expectancy, 18.11.2005
12. US 2007241912 A1 Apparatus and method for calculating life expectancy in mobile communication terminal, 22.01.2007
13. Sanger F. "Determination of nucleotide sequences in DNA". Biosci Rep. - 2004. - V. 24(4-5). - P.237-253
14. Патент США №5538848, Kenneth J. Livak, Susan J., A. Flood, Jeffrey Marmaro, METHOD FOR DETECTING NUCLEIC ACID AMPLIFICATION USING SELF-QUENCHING FLUORESCENCE PROBE, 23.07.1996