Модифицированные нуклеозиды в химиотерапии

клеток заключается в следующем: клетки включают в альгинатные капли, дающие сферические гранулы при действии Ca2+. Эти гранулы одевают полупроницаемыми мембранами, затем удаляют Ca2+. Полимерная структура альгината рассыпается на мономеры, диффундирующие через мембрану в раствор.

С целью усовершенствования препаративной формы биопестицида «Бета-протектин» получены иммобилизованные в альгинате натрия клетки бактерий-антагонистов B. subtilis БИМ В-439. Для этого коллоидный раствор альгината натрия, содержащий культуру-продуцент, был добавлен в 0,2 молярный раствор хлорида кальция и получены гранулы с включенными в них бактериальными клетками, обладающие выраженной антимикробной активностью и подавляющей рост фитопатогенного гриба -Fusarium redolens - возбудителя кагатной

гнили сахарной свеклы. Установлена зависимость степени подавления патогенных грибов от размера альгинатных гранул и содержания в них альгината. Максимальная степень угнетения патогена коррелировала с диаметром гранул и возрастала по мере его увеличения от 3 до 7 мм. Показана также высокая выживаемость иммобилизованных бактерий при хранении и интродукции в почву.

Благодаря тонкопористой структуре и большому содержанию активного опалового кремнезема в качестве адсорбционного материала применяется трепел -рыхлая или слабо сцементированная, тонкопористая опаловая осадочная порода, состоящая из мелких сферических опаловых телец (глобул) размером 0,01-0,001 мм с примесью глинистых минералов, глауконита, кварца, полевых шпатов. Трепел - природный сорбент, в составе которого 75-96% активного

кремнезема, гамма микро- и макроэлементов - фосфор, калий, кальций, магний, медь, марганец, железо, цинк, кобальт. Используется в качестве наполнителя медицинских препаратов при производстве биопестицидов, для обогащения рационов молодняка крупного рогатого скота. Введение трепела в состав культуральной жидкости бактерий В. subtilis БИМ В-439 в соотношении 1:1 обеспечивает получение высокоактивной сухой формы «Бетапро-тектина» с титром 1,11010, что на порядок превосходит титр биопестицида в жидкой форме (1,Ш КОЕ/мл).

Применение методов математического моделирования, иммобилизации бактериальных клеток способствует активизации процесса на 25-30% и получению высокоэффективной и технологичной формы отечественного биопестицида «Бетапротектин», обеспечивая его конкурентоспособность на рынке.

Модифицированные нуклеозиды в химиотерапии

Елена

Калиниченко,

замдиректора Института биоорганической химии НАН Беларуси, доктор химических наук, лауреат Государственной премии Республики Беларусь

Установление структуры дезоксири-бонуклеиновой кислоты, выяснение генетического кода и механизма реализации наследственной информации в бесконечное многообразие белков, постоянно углубляющееся понимание биохимии вирусной инфекции и трансформации нормальной клетки в злокачественную обусловили огромный интерес исследователей к изучению нуклеиновых кислот и их компонентов

- нуклеозидов. Последние, как правило, не проявляют биологической активности и, как считалось долгое время, не могут служить источником химиотерапевтических средств. В середине 40-х гг. XX в. предположили, что внесение ряда изменений в углеводную и/или гетероциклическую часть молекулы может привести к соединениям с интересными биологическими свойствами. Это был период зарождения и успешного

развития теории антиметаболитов - аналогов природных соединений метаболитов, изменение структуры которых может приводить к ингибированию метаболических путей. Такой подход к поиску биологически активных соединений дал позитивные результаты, и уже к началу 60-х первые препараты для лечения вирусных инфекций и онкогематологических заболеваний вошли в медицинскую практику.

Рис. 1. Аналоги пуриновых нуклеозидов

В лаборатории химии нуклеотидов и полинуклеотидов Института биоорганической химии НАН Беларуси с 1970 г. проводится комплексное изучение химии, биохимии и биотехнологии компонентов нуклеиновых кислот (КНК). В результате исследований предложены новые высокоэффективные методы, позволившие осуществить синтез разнообразных аналогов нуклеозидов, нуклеотидов и олигонуклео-тидов, нашедших применение в медицине и сельском хозяйстве.

Разработка новых методов синтеза с целью модификации природных нуклеозидов - одно из основных направлений поиска биологически активных соединений в ряду КНК. Так, обработка аденозина

хлорангидридом ацетилсалициловом кислоты давала хлорпроизводное аденозина, последующее восстановление которого позволило получить нуклеозидный антибиотик Кордицепин. Трансформация цис-диольной группировки цитидина приводила вместо ожидаемого хлорпроизвод-ного к циклоцитидину, противолейкозному препарату, известному под названием Анцитабин. Композиция Анцитабина с использованием в качестве основы модифицированной целлюлозы позволила ученым ИБОХ и НИИ ФХП БГУ совместно с РУП «Белмедпрепараты» создать оригинальную глазную мазь Цитосорбин, обладающую цитостатическим действием.

Обработка циклоцитидина раствором щелочи приводила к размыканию цикла с образованием Цитарабина. Эта простая схема стала лучшей технологией по производству фармсубстанции онкогематоло-гического препарата Цитарабин, который недаром называют краеугольным камнем в лечении лейкозов у взрослых и детей. В 1998 г. технология получения фармсуб-станции и лекарственной формы внедрена на РУП «Белмедпрепараты».

Химические методы синтеза компонентов нуклеиновых кислот, несмотря на значительный прогресс в этой области, продолжают оставаться весьма трудоемкими. Внимание ученых все

Рис. 2. Метаболизм цитарабина и лейкладина в клетках

больше привлекают ферментативные методы, которые используют в качестве биокатализаторов ферменты обмена нуклеиновых кислот бактерий, грибов и дрожжей. Исследователи Института биоорганической химии и Института микробиологии предложили и экспериментально обосновали высокоэффективный химико-энзиматический подход к получению модифицированных компонентов нуклеиновых кислот, синтез которых только химически или ферментативно затруднен или невозможен. Метод предполагает оригинальное сочетание приемов биотехнологии и тонкого органического синтеза, объединяет преимущества химической и биологической технологий. При этом в качестве биокатализаторов, как правило, используются не малодоступные очищенные ферменты, а цельные (интактные) клетки микроорганизмов. Применение химико-энзиматического подхода позволило разработать высокоэффективные технологии получения как ряда новых соединений, так и известных, но малодоступных ранее нуклеозидных антибиотиков. Среди них - препараты для лечения онкогематологических заболеваний Лейкладин (Кладрибин), Флударабел, Ара-аденозин (Видарибин), Ара-гуанозин и получаемый из него химическим путем новый препарат для лечения Т-клеточных лимфом Неларабин.

Природные нуклеозиды дезоксиаде-нозин или аденозин достаточно быстро дезаминируются в клетке аденозинде-заминазой до неактивного инозина. Введение атома хлора во второе положение пуринового гетероцикла дезоксиаденози-на решило проблему устойчивости кла-дрибина к воздействию аденозиндезами-назы. Учитывая, что уровень активности дезоксицитидинкиназы в лимфоцитах значительно выше уровня 5'-нуклеотидазы, в клетке быстро накапливаются все три фосфорилированные формы кладрибина. Именно такое различие в уровнях указанных ферментов в лимфоцитах и обусловливает высокую специфичность действия кладрибина в отношении данного вида клеток.

Механизм действия флударабина фосфата во многом схож с действием кла-дрибина. Введение атома фтора во вто-

Таблица 1. Антилейкемическая активность пуриновых нуклеозидов на модели лимфоидной лейкемии и1210

Препарат Доза препарата и схема «лечения» Продолжительность выживания мышей (дни), M ± m Т/С (О/К X 100%), р

Контроль Р-р NaCl 0,45% 7,1 ± 1,57 100

Флударабел 300/48 х 4 18,0 ± 2,53 207; <0,001

Лейкладин 30/48 х 4 12,7 ± 1,37 146; <0,001

Неларабин 450/48 х 4 7,6 ± 0,52 107; >0,05

рое положение привело к стабильности препарата к действию аденозиндезамина-зы. В плазме крови флударабел вначале дефосфорилируется 5'-нуклеотидазой, а далее под действием киназ фосфорилиру-ется до соответствующего 5'-трифосфата.

Неларабин является депо-формой ара-гуанозина (ара-Г), который из-за низкой растворимости не нашел широкого применения. В клетке под действием аденозин-дезаминазы он расщепляется до активного ара-Г Хотя механизм действия неларабина во многом подобен действию вышеназванных препаратов, однако мишени, на которые он воздействует, отличны.

Флударабел в дозе (300 мг/кг в/в по стандартной схеме), адекватной терапевтической дозе для человека, обеспечивает самый высокий антилейкемический эффект на модели мышиной лимфо-лейкемии. Количественный критерий эффективности флударабела в прямом параллельном сравнении с двумя другими пуриновыми нуклеозидами составляет 207%. Важно отметить, что потеря массы тела у опытных мышей была такой же несущественной, как и у животных контрольной группы, а величина отношения показателей средней продолжительности жизни (207%, р<0,001) в 2,4 раза превышает ту же величину (О/К<85%), характерную для антилейкемических средств, проявляющих токсический кумулятивный эффект. Такой эффект, как свидетельствуют предклинические данные, полученные в химиотерапевтическом эксперименте, у флударабела как антинеопластического препарата отсутствует. Данная генерация перевиваемой опухоли является адекватной и информативной моделью для пред-клинического испытания и отбора препаратов, селективно влияющих на течение В-клеточного хронического лимфолейкоза и неходжкинских лимфом. Лейкладин по антилейкемической эффективности на модели мышиного лимфолейкоза Ц1210 значительно уступает активности флуда-рабела.

Введенный в адекватной клинической дозе (30 мг/кг в/в по стандартной схеме) Лейкладин проявляет антилей-кемический эффект по критерию увеличения продолжительности жизни «лей-козных» мышей, который равен 146%. С

увеличением дозы препарата (15-30 мг/кг в/в) пропорционального дозозависимого усиления антилейкемического эффекта не выявлено. Таким образом, Лейкладин по способности увеличивать продолжительность жизни «лейкозных» мышей в прямом параллельном сравнении с Флударабелом уступает последнему более чем в 2 раза. Показано, что модель мышиной лимфолейкемии L1210 in vivo прогностически малоценна для экстраполяции результатов на человека, если специфическая активность модифицированного нуклеозида проявляет себя в терапии волосатоклеточного лейкоза и острой миелоидной лейкемии. О неадекватности модели мышиной лимфо-лейкемии L1210 для предклинического испытания Кладрибина сообщали также зарубежные исследователи.

В опытах in vivo с имплантированными клетками мышиного лимфолейкоза L1210 Неларабин даже в максимально приемлемой дозе (с учетом соотношения между дозами у животных и человека) - 450-900 мг/кг в/в по стандартной схеме - статистически значимого антилейкемического эффекта не проявил (табл. 1). При двукратном увеличении дозы гибель опытных мышей наступала быстрее, чем у животных контрольной группы.

Результаты испытания прямой цито-токсичности пуриновых нуклеозидов in vitro на культуре стабильной линии клеток лейкоза человека MOLT-4 представлены в табл. 2. Отечественный Неларабин по ци-тотоксической активности идентичен зарубежному препарату Арранон (неларабин).

Флударабел в культуре Т-лимфобластных клеток лейкоза человека проявлял весьма умеренный цитотоксический эффект, который после достижения уровня ингиби-рования роста клеток до 30% не выявил пропорционального дозозависимого увеличения эффекта.

Цитотоксический эффект Лейклади-на, оцениваемый in vitro методом прямого подсчета бластных клеток в культуре Т-лимфолейкоза человека MOLT-4, свидетельствует о том, что препарат инги-бирует рост бластных клеток на 50% по сравнению с интактным контролем при достижении концентрации препарата 1050,0 ± 210,0 мкМ. Следовательно, по избирательности влияния на клетки Т-лимфобластного лейкоза человека Неларабин впечатляюще превосходит едва ли не самый активный антилейкемический препарат Лейкладин.

Основываясь на фундаментальных исследованиях сотрудников ИБОХ и Института микробиологии, разработавших оригинальную высокоэффективную химико-энзиматическую технологию получения модифицированных нуклеозидов, осуществлены синтез, наработка и выпуск субстанций Лейкладина, Флударабела, разработаны готовые, в том числе и оригинальные, лекарственные формы анти-лейкемических препаратов.

Несмотря на значительнее успехи биотехнологических подходов к синтезу нуклеозидов, в ряде случаев ферменты проявляют свою селективность и не всегда могут акцептировать модифицированные сахара или гетерооснования. Поэтому в лаборато-

Таблица 2. Цитотоксический эффект пуриновых нуклеозидов in vitro на клетках Т-лимфолейкоза человека

Наименование препарата IC50, мкМ, ингибирующая рост клеток лейкоза MOLT-4

Неларабин 0,97 ± 0,15

Флударабел 0,91 ± 0,1 *

Лейкладин 1050,0 ± 210,0

рии химии нуклеотидов и полинуклеотидов ИБОХ проводятся работы, направленные на создание оригинальных технологий тонкого органического синтеза биологически значимых соединений.

Введение фтора в молекулу нукле-озида приводит к увеличению ее химической и метаболической стабильности, изменению биологической активности фторированного нуклеозида, а в отдельных случаях - к улучшению противоопухолевой и противовирусной активности. Фторированные нуклеозиды обладают необычными стереоэлектронными свойствами, что, в свою очередь, приводит к ограничениям конформационного равновесия молекулы, и одна предпочтительная конформация фуранозного цикла характерна для таких нуклеозидов в растворе. Положение атома фтора в углеводном фрагменте нуклеозида - решающий фактор для проявления потенциального биологического эффекта и возможного медицинского применения фтордезокси-нуклеозидного аналога.

Аналог 2'-фтор-арабиноаденозина с атомом хлора во втором положении гетероциклического основания, известный как Кло-фарабин, обладает высокой активностью в отношении ряда опухолевых клеточных линий и используется в качестве эффективного терапевтического средства нового поколения при лечении острой лейкемии у детей. Из доступных производных фтор-арабинофуранозы в Беларуси разработан и запатентован оригинальный препаративный метод синтеза фармсубстанции клофара-бина. В рамках Государственной программы «Импортозамещающая фармпродукция» (2010-2014 гг.) организуется выпуск фарм-субстанции и лекарственной формы отечественного препарата Клофарабин.

* Определяется только IC30

В настоящее время в клиническую и исследовательскую практику входит новый химиотерапевтический агент -пеметрексед (торговая марка АлимтаТМ), являющийся структурным аналогом фолиевой кислоты, содержащий 7-деза-загуанин. Противоопухолевая активность пеметрекседа обусловлена нарушением фолатзависимых метаболических процессов, существенных для клеточной репликации.

Опыты с клеточной линией мезоте-лиомы MSTO-211H продемонстрировали синергические эффекты при комбинировании пеметрекседа с цисплатином, а также эффективность в отношении злокачественной мезотелиомы плевры. Пеметрексед стал первым препаратом, специально разработанным для лечения этого заболевания. В 2003 г. он был одобрен Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA) для лечения

злокачественной мезотелиомы плевры. В рамках Государственной программы «Импортозамещающая фармпродукция» разрабатывается технология производства фармсубстанции и лекарственной формы отечественного препарата Пеме-трексед.

Еще один модифицированный ну-клеозид - Азацитидин (коммерческий препарат - Vidaza, Celgene, Швейцария). Гипометилирование аберрантно метилированных генов ДНК, участвующих в процессах дифференциации и апоптоза клеток, а также регулирование нормального клеточного цикла способствует ре-экспрессии генов и восстановлению онкосупрессорных функций неопластических клеток. Препарат показан при миело-диспластическом синдроме (МДС), разных формах МДС, особенно эффективен для пациентов с промежуточным и высоким риском. Особо следует отметить, что применение Азацитидина препятствует развитию острого миелобластного лейкоза у больных МДС, а также, по данным Европейской организации по исследованию и лечению рака, существенно улучшает качество жизни пациентов.

Учитывая важность работ по созданию высокоэффективных противоопухолевых препаратов, постановлением Совета Министро в Республики Беларусь от 25.04.2007 г. №523 и Указом Президента Республики Беларусь от 16.10.2008 г. №562 Институту биоорганической химии поручено реконструировать помещения опытного производства ИБОХ НАН Беларуси для создания технологии и организации малотоннажного производства новых фармацевтических субстанций. В 2011 г. открылся научно-производственный центр «ХимФармСинтез» по выпуску высокотехнологичных фармацевтических субстанций и готовых лекарственных форм на их основе.

Научно-производственный центр работает в области тонкого органического синтеза и обладает уникальными производственными мощностями, позволяющими осуществлять полный цикл: от лабораторных разработок молекул до изготовления и коммерциализации готовых препаратов, которые заменят дорогие импортные аналоги.