Визуализация экспериментальных опухолей на установке для диффузионной флуоресцентной томографии

ВИЗУАЛИЗАЦИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ОПУХОЛЕЙ НА УСТАНОВКЕ ДЛЯ ДИФФУЗИОННОЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ТОМОГРАФИИ

М.В. Ширманова1'2, Е.В. Загайнова1, М.А. Сироткина1, М.С. Клешнин3, А.Г.Орлова1' 3, И.В. Балалаева2 1 Нижегородская государственная медицинская академия 2 Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского 3 Институт прикладной физики РАН e-mail: Shirmanovam@mail. ru

Работа посвящена оценке возможности визуализации опухолей in vivo с использованием фотосенсибилизатора Фотосенс на установке для диффузионной флуоресцентной томографии (ДФТ). Продемонстрирована возможность детектирования флуоресцирующих объектов (инъекций и капсул) в глубине биоткани. Получены прижизненные изображения мышей с трансплантированной подкожно опухолью карциномой легких Льюис. Избирательное накопление фотосенса в опухолевой ткани и его флуоресценция привели к визуализации опухоли. Высокий уровень флуоресценции обнаружен в органах брюшной полости. Результаты ДФТ-исследования подтверждены данными стандартного метода спектрометрии органов и тканей.

Особое внимание во всем мире уделяется развитию оптических методов визуализации флуоресценции на уровне целого организма (whole-body imaging). Получение флуоресцентных изображений осуществляется либо с помощью цифровой камеры, сфокусированной на поверхности тела, либо методами флуоресцентной диффузионной томографии. Данные подходы перспективны в экспериментальной онкологии для неинвазивной прижизненной визуализации флуоресцентно-меченных опухолей: наблюдения опухолевого роста и регресса на фоне лечебного воздействия, изучения ангиогенеза и метастазирования, оценки оптических и фармакокинетических свойств новых фотосенсибилизаторов.

Необходимым условием флуоресцентной визуализации опухолей является введение флуоресцентных меток в опухолевую ткань [1]. Наиболее предпочтительны для флуоресцентной визуализации флуорофоры, имеющие интенсивное поглощение и флуоресценцию в красной и ближней инфракрасной области спектра. Поскольку биологические ткани являются наиболее прозрачными для данного диапазона, это открывает возможность визуализации более глубоких очагов.

В качестве флуорофоров для визуализации опухолей in vivo могут использоваться соединения различной химической природы: цианиновые красители [2], флуоресцирующие белки [3], полупроводниковые нанокристаллы [4] и др. Немногочисленные литературные сведения указывают на возможность применения для этих целей фотосенсибилизаторов [5].

Ввиду физиологических и биохимических особенностей неопластические ткани способны селективно накапливать и удерживать фотосенсибилизаторы. Это создает условия для обнаружения опухолей по флуоресценции фотосенсибилизатора и лежит в основе флуоресцентной диагностики [6, 7].

В клинике широко применяются фотосенсибилизаторы из класса фталоцианинов. Они характеризуются высоким квантовым выходом флуоресценции и величиной экстинкции, определяющими эффективность флуоресцентной диагностики, относительно простой и дешевой технологией производства, химической стабильностью и имеют интенсивный максимум поглощения в длинноволновой части спектра (Xmax > 670 нм), то есть в области большей световой проницаемости тканей [8].

Цель работы состояла в оценке возможности визуализации экспериментальных опухолей с применением фотосенсибилизатора Фотосенс на установке для диффузионной флуоресцентной томографии (ДФТ).

Материалы и методы. Метод диффузионной флуоресцентной томографии (ДФТ) основан на получении информации о флуоресцирующих объектах в биоткани на глубине до нескольких сантиметров с миллиметровым разрешением на основе обработки сигнала от прошедшего через ткань лазерного излучения. Работа выполнена на диффузионном флуоресцентном томографе ФДТ-2М, разработанном в Институте прикладной физики Российской академии наук (г. Н.Новгород). В ДФТ-установке источниками излучения являются лазеры красного и ближнего ИК-диапазона. Регистрация флуоресцентного сигнала осуществляется с помощью охлаждаемого высокочувствительного фотоэлектронного умножителя (Hamamatsu H7422-20). Для разделения спектров облучения и флуоресценции используется комбинация интерференционных и абсорбционных фильтров. Сканирование объекта в конфигурации "на просвет" обеспечивается синхронным движением источника и детектора. Конструкция установки позволяет производить замену источников и фильтров в системе сканирования и подбирать оптимальные по своим оптическим характеристикам для конкретного флуорофора. Для процедуры сканирования животное после предварительной депиляции помещается между двумя стеклянными пластинами (расстояние между пластинами 1.2 см) с легким прижатием.

Объектом исследования служили мыши гибриды линии BDF1 массой 22-25 г -интактные и с трансплантированной подкожно опухолью карциномой легких Льюис (РОНЦ им. Блохина).

В качестве флуоресцирующего маркера опухоли использован отечественный фотосенсибилизатор Фотосенс (ФГУП «ГНЦ «НИОПИК»), представляющий собой раствор смеси натриевых солей сульфированного фталоцианина алюминия. Фотосенс обладает интенсивной полосой поглощения в красной области спектра с максимумом в водном растворе при 675 нм и флуоресценцией в области 670-685 нм.

На первом этапе работы были выполнены модельные эксперименты на интактных животных post mortem. Флуоресцирующими обьектами служили подкожная инъекция фотосенса в область бедра и стеклянная капсула (наружный диаметр 2.5 мм), заполненная раствором фотосенса и помещенная в пищевод животного. Контролем служил физиологический раствор.

На втором этапе выполнялись эксперименты на животных-опухоленосителях in vivo. Фотосенс вводили животным однократно внутривенно в дозе 1 мг/кг на 10-й день после трансплантации опухоли. Сканирование на ДФТ-установке проводили с шагом 1 мм до введения фотосенсибилизатора (контроль) и через 24 ч. По окончании ДФТ-наблюдения для контроля накопления и распределения фотосенсибилизатора выполняли анализ спектров ex vivo образцов органов и тканей на волоконном спектрометре QE65000 (США) в области 660-760 нм при облучении лазерным светом на 635 нм.

Результаты. В ряде наших предыдущих работ показана возможность метода ДФТ для визуализации флуоресцирующих объектов в глубине биотканей. Ранее в экспериментах на модельных средах и мелких лабораторных животных в качестве флуорофоров использовались полупроводниковые коллоидные нанокристаллы [9] и флуоресцирующие белки [10]. В данной работе демонстрируется возможность применения в качестве опухолевого маркера фотосенсибилизатора фталоцианиновой природы, который широко применяется к клинической практике для флуоресцентной диагностики и фотодинамической терапии рака.

С учетом спектральных характеристик фотосенсибилизатора в ДФТ-установке подобраны и апробированы элементы для возбуждения и приема флуоресцентного сигнала: полупроводниковый лазер с длиной волны 635 нм и фильтр 710/50 нм соответственно. На первом этапе работы в ходе модельных

экспериментов на животных post mortem получены двумерные изображения флуоресцирующих объектов, имитирующих опухоль, в глубине биоткани (рис. 1). Инъекция фотосенса и капсула с фотосенсом на изображениях выглядят как очень яркие контрастные области, тогда как в контроле с физраствором изображение мыши выглядит темным.

а б

Рис. 1. Флуоресцентное изображение мыши post mortem с помещенными в пищевод капсулами, содержащими: а - физраствор (контроль) б - 0.001% раствор фотосенса. Локализация капсул показана пунктирной линией. Размер изображений 3.5х3 см.

Модельные эксперименты показали, что указанная комбинация лазер/фильтр является эффективной для возбуждения флуоресценции фотосенса и разделения спектров накачки и флуоресценции. В свою очередь характеристики флуоресценции фотосенсибилизатора (квантовый выход, спектральные свойства) позволяют детектировать ее из глубоких слоев биоткани. Таким образом, модельные эксперименты на животных post mortem продемонстрировали принципиальную возможность визуализации методом ДФТ флуоресценции органического фотосенсибилизатора фталоцианиновой природы и применения его в качестве флуорофора для визуализации глубоко локализованных опухолей.

В ходе экспериментов in vivo на установке для ДФТ получены изображения мышей с трансплантированной подкожно опухолью- карциномой легких Льюис. В контроле до введения фотосенсибилизатора изображение в целом выглядит темным, с низким уровнем сигнала. Отдельные участки тела имеют более высокую интенсивность сигнала и выглядят светлее. Это касается натянутой кожи в области подмышечных впадин и области брюшной полости ввиду их большей прозрачности для возбуждающего лазерного излучения. После внутривенного введения фотосенса и избирательного накопления его в опухолевой ткани на изображениях отчетливо визуализируется опухоль. При этом центральная часть опухоли с некрозом выглядит темной, а периферическая, накапливающая фотосенс, светлой. Очень яркую засветку создает натянутая кожа. Свечение кожи определяется как ее высокой прозрачностью для возбуждающего света, так и накоплением в ней фотосенсибилизатора (даже в очень малых количествах). Также методом ДФТ детектируется флуоресценция в органах брюшной полости.

Результаты ДФТ-исследования подтверждены стандартным методом спектрометрии изолированных органов и тканей. Минимальный уровень флуоресценции, обусловленный присутствием фотосенсибилизатора, отмечался в мышцах и почках. Наиболее высокая интенсивность флуоресценции наблюдалась в опухолевой ткани и печени.

Заключение. Полученные результаты демонстрируют возможность метода ДФТ для неинвазивной визуализации опухолей in vivo с использованием в качестве флуоресцентного маркера опухоли фотосенсибилизатора Фотосенс.

Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ (№№ 07-02-01262, 07-0201146) и Федерального Агентства по Науке и Инновациям (проект № 02.522.11.2002).

1. Rao J., Dragulescu-Andrasi A., Yao H. Fluorescence imaging in vivo: recent advances // Current Opinion in Biotechnology. 2007. 18. 17-25.

2. Ballou B., Fisher G., Waggoner A., et al. Tumor labeling in vivo using cyanine-conjugated monoclonal antibodies // Cancer Immunol. Immunother. 1995. 41 (4) 257263.

3. Hoffman R.M. Green fluorescent protein imaging of tumor cells in mice // Lab Animal 2002. 31. 34-41.

4. Gao X.H., Cui Y.Y., Levenson R.M., Chung L.W.K., and Nie S.M. In vivo cancer targeting and. imaging with semiconductor quantum dots // Nat. Biotechnol. 2004. 22. 969-976.

5. Pogue B.W., Gibbs S.L., Chen B., Savellano M. Fluorescence Imaging In Vivo: Raster Scanned Point-Source Imaging Provides More Accurate Quantification than Broad Beam Geometries // Technology in Cancer Research & Treatment. 2004. 3 (1). 15-21.

6. Миронов А.Ф. Фотодинамическая терапия рака - новый эффективный метод диагностики и лечения злокачественных опухолей // Соросовский образовательный журн. 1996. 8. 32-40.

7. Loschenov V.B., Konov V.I., Prokhorov A.M. Photodynamic therapy and fluorescence diagnostics // Laser Physics. 2000. 10 (6). 1188-1207.

8. Lukyanets E.A. Phthalocyanines as Photosensitizers in the Photodynamic Therapy of Cancer // J. Porphyrins Phthalocyanines. 1999. 3. 424-432.

9. Turchin I.V., Balalaeva I.V., Vasil'ev R.B., et.al. Imaging of QDs-labeled tumors in small animals by fluorescence diffuse tomography // Laser Physics Letters. 2006. 3 (4). 208 - 211.

10. Turchin I.V., Plehanov V.I., Orlova A.G., et.al. Fluorescence diffuse tomography of small animals with DsRed2 fluorescent protein // Laser Physics. 2006. 16 (5). 741-746.

IMAGING OF TUMOR MODEL IN VIVO USING DIFFUSE FLUORESCENCE

TOMOGRAPHY SETUP

M.V. Shirmanova12, E.V. Zagainova1, M.A. Sirotkina2, M.S. Kleshnin3, A.G. Orlova1,3, I.V. Balalaeva2

1 Nizhny Novgorod State Medical Academy 2 N.I. Lobachevsky State University of Nizhny Novgorod 3 Institute of Applied Physics of RAS e-mail: S hirmanovam@mail. ru

This work is devoted to in vivo fluorescence imaging of tumors with photosensitizer Photosens by means of diffuse fluorescence tomography (DFT). We demonstrate the possibility of DFT method for detection of fluorescent objects (injection and capsule) in the deep animal tissues. In vivo fluorescence images of mice with subcutaneous tumor carcinoma Lewis were obtained. A selective accumulation of Photosens in tumor after i.v. injection and its fluorescence led to tumor visualization on the image. Quite high fluorescence signal was also detected in abdominal cavity region. The results of DFT method were confirmed by the spectrometry of ex vivo tissue samples.