СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ ОЧИЩЕННОГО (ОБЕСЦВЕЧЕННОГО) СУХОГО СОКА ЛИСТА АЛОЭ ВЕРА
METHODS OF TREATMENT WITH APPLICATION OF PURIFIED (DECOLOURIZED) DRY JUICE OF ALOE VERA LEAF

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Область техники, к которой относится изобретение
[0001] Алоэ вера применяется в качестве традиционного лечебного средства для, среди прочего, заживления ран, поддержания здоровья желудочно-кишечного тракта и заживления повреждений желудочно-кишечного тракта. Однако о биологической активности и механизме действия алоэ вера известно мало. Поскольку алоэ является природным компонентом, его состав варьирует в зависимости от условий роста, а также процесса изготовления. Доступна весьма ограниченная информация о связи химического состава и биологической активности. Настоящий документ представляет собой часть исследования, целью которого была попытка систематически изучить состав, биологическую активность алоэ вера и соотнести его состав и функции.
[0002] Настоящий документ относится к избирательному наращиванию короткоцепочечных жирных кислот посредством бактериальной ферментации компонента очищенного (обесцвеченного) сока листа алоэ вера. В настоящем документе также обсуждается влияние на восстановление сообществ микробиоты в кишечнике или стимуляции специфичных иммунных функций слизистой оболочки, что вносит вклад в лечение конкретных состояний. В настоящем документе также обсуждается потенциал биологически значимой антиоксидантной защиты и иммуномодуляторной (т.е. как иммуностимулирующей, так и противовоспалительной) активности раскрытой композиции.
[0003] Симулятор микробной экосистемы кишечника человека (Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem, SHIME) представляет собой непрерывную модель in vitro и содержит последовательность из пяти реакторов, имитирующих различные части желудочно-кишечного тракта человека. Модель SHIME интенсивно применяется в течение более 15 лет в рамках как научных, так и промышленных проектов, и она была валидирована по параметрам in vivo. После стабилизации микробного сообщества в различных участках ободочной кишки (colon) в трех компартментах ободочной кишки устанавливается репрезентативное микробное сообщество, которое различается в различных участках ободочной кишки составом и функциями. В настоящем документе оценивают возможные свойства ежедневных повторяющихся доз алоэ вера. Модель SHIME позволяет проводить культивирование сложной микробной экосистемы кишечника в течение сравнительно длительного периода времени и в репрезентативных условиях. SHIME также позволяет имитировать повторяющееся пероральное поступление исследуемого материала.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ОПРЕДЕЛЕННЫХ АСПЕКТОВ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0004] В одном аспекте раскрыта композиция, которая содержит, например, обесцвеченный сок алоэ вера, концентрат алоэ вера и одно или более вспомогательных веществ. В некоторых вариантах реализации композиция также содержит модификатор кислотности. В некоторых вариантах реализации концентрат алоэ вера представляет собой чистый сок алоэ вера, 2-кратный концентрат сока алоэ вера, 25-кратный концентрат сока алоэ вера, 50-кратный концентрат сока алоэ вера, 75-кратный концентрат сока алоэ вера, 100-кратный концентрат сока алоэ вера, 125-кратный концентрат сока алоэ вера, 150-кратный концентрат сока алоэ вера, 175-кратный концентрат сока алоэ вера или 200-кратный концентрат сока алоэ вера.
[0005] В некоторых вариантах реализации вспомогательное вещество представляет собой консервант. В некоторых вариантах реализации консервант представляет собой сорбиновую кислоту, соль сорбиновой кислоты, бензойную кислоту, соль бензойной кислоты, молочную кислоту, соль молочной кислоты, лимонную кислоту, соль лимонной кислоты, яблочную кислоту, соль яблочной кислоты, уксусную кислоту, соль уксусной кислоты, винную кислоту, соль винной кислоты, экстракт розмарина, экстракт любистка, хитозан, эфирное масло шалфея, тимоловое масло или низин. В некоторых вариантах реализации концентрация вспомогательного вещества составляет 0,01-2%. В некоторых вариантах реализации концентрация вспомогательного вещества составляет 0,01-0,5%. В некоторых вариантах реализации вспомогательное вещество представляет собой вкусоароматическое вещество. В некоторых вариантах реализации вкусоароматическое вещество представляет собой одно или более веществ из сахара, меда, фруктозы, декстрозы, мальтодекстрина или камедей. В некоторых вариантах реализации концентрация вкусоароматического вещества составляет 0,1-50%. В некоторых вариантах реализации концентрация вкусоароматического вещества составляет 0,1-20%. В некоторых вариантах реализации вспомогательное вещество представляет собой порошок целлюлозы, модифицированный крахмал, микрокристаллическую целлюлозу, стеарат магния, стеариновую кислоту, кроскармеллозу натрия, карбонат кальция, дикальция фосфат или диоксид кремния.
[0006] В некоторых вариантах реализации модификатор кислотности представляет собой лимонную кислоту, соль лимонной кислоты, яблочную кислоту, соль яблочной кислоты, уксусную кислоту, соль уксусной кислоты, молочную кислоту, соль молочной кислоты, винную кислоту или соль винной кислоты. В некоторых вариантах реализации концентрация модификатора кислотности составляет 0,1-10%. В некоторых вариантах реализации концентрация модификатора кислотности составляет 0,2-5%.
[0007] В некоторых вариантах реализации сок алоэ вера представляет собой жидкий сок, концентрат сока или концентрат сухого сока. В некоторых вариантах реализации сок алоэ вера получен из цельного листа алоэ вера. В некоторых вариантах реализации сок алоэ вера получен из внутреннего геля алоэ вера. В некоторых вариантах реализации сок алоэ вера содержит не более 10 ч./млн алоина. В некоторых вариантах реализации сок алоэ вера содержит не более 3 ч./млн алоина. В некоторых вариантах реализации сок алоэ вера содержит по меньшей мере 5% ацетилированного ацеманнана. В некоторых вариантах реализации сок алоэ вера содержит ацетилированный ацеманнан с молекулярной массой от 50000 Дальтон до 10000000 Дальтон. В некоторых вариантах реализации сок алоэ вера содержит ацетилированный ацеманнан с молекулярной массой от 100000 до 5000000 Дальтон.
[0008] В другом аспекте раскрыта питательная добавка, которая содержит, например, обесцвеченный сок алоэ вера, концентрат алоэ вера и одно или более вспомогательных веществ. В некоторых вариантах реализации питательная добавка представляет собой таблетку, капсулу, мягкую таблетку, жевательную таблетку, таблетку, растворяющуюся в полости рта, порошок или жидкость. В некоторых вариантах реализации количество обесцвеченного сока алоэ вера составляет 1-500 г. В некоторых вариантах реализации количество обесцвеченного сока алоэ вера составляет 5-300 г. В некоторых вариантах реализации количество концентрата обесцвеченного сухого сока алоэ вера составляет 10-500 мг. В некоторых вариантах реализации количество концентрата обесцвеченного сухого сока алоэ вера составляет 50-300 мг.
[0009] В настоящем документе также раскрыт способ улучшения состояния и количества микробиома у млекопитающего. Способ включает введение эффективного количества композиции, содержащей обесцвеченный сок алоэ вера, концентрат алоэ вера и одно или более вспомогательных веществ.
[0010] В настоящем документе также раскрыт способ обеспечения (индкуции) благоприятного эффекта в отношении микробиома человека. Способ включает введение млекопитающему композиции, причем указанная композиция содержит обесцвеченный сок алоэ вера, концентрат алоэ вера и одно или более вспомогательных веществ.
[0011] В некоторых вариантах реализации благоприятный эффект в отношении микробиома человека представляет собой увеличение образования короткоцепочечных жирных кислот. В некоторых вариантах реализации благоприятный эффект в отношении микробиома человека представляет собой увеличение суммарной микробной популяции в ободочной кишке. В некоторых вариантах реализации благоприятный эффект в отношении микробиома человека представляет собой увеличение образования ацетата в проксимальном отделе ободочной кишки. В некоторых вариантах реализации благоприятный эффект в отношении микробиома человека представляет собой увеличение образования пропионата в проксимальном отделе ободочной кишки. В некоторых вариантах реализации благоприятный эффект в отношении микробиома человека представляет собой увеличение общей (суммарной) популяции бактерий в проксимальном отделе ободочной кишки. В некоторых вариантах реализации благоприятный эффект в отношении микробиома человека представляет собой увеличение популяции временной концентрации бифидобактерий в проксимальном отделе ободочной кишки. В некоторых вариантах реализации благоприятный эффект в отношении микробиома человека представляет собой мощный противовоспалительный ответ в кишечнике. В некоторых вариантах реализации благоприятный эффект в отношении микробиома человека представляет собой снижение проницаемости барьера кишечника в системе совместного культивирования клеток Соса-2 и макрофагов ТНР1. В некоторых вариантах реализации проницаемость стенки кишечника измеряют на основании параклеточного транспорта красителя Lucifer Yellow в системе совместного культивирования клеток Сасо-2 и макрофагов ТНР1. В некоторых вариантах реализации благоприятный эффект в отношении микробиома человека представляет собой успокаивающее действие на кишечник.
[0012] В другом аспекте в настоящем документе также раскрыт способ обеспечения благоприятного эффекта в отношении млекопитающего. Способ включает введение млекопитающему композиции, причем указанная композиция содержит обесцвеченный сок алоэ вера, концентрат алоэ вера и одно или более вспомогательных веществ.
[0013] В некоторых вариантах реализации благоприятный эффект для млекопитающего представляет собой благоприятный антиоксидантный эффект. В некоторых вариантах реализации благоприятный антиоксидантный эффект представляет собой биологически значимую антиоксидантную защиту в условиях окислительного стресса. В некоторых вариантах реализации благоприятный антиоксидантный эффект представляет собой активаторные и ингибиторные сигналы иммунным клеткам. В некоторых вариантах реализации благоприятный антиоксидантный эффект представляет собой индукцию двухфазного ответа иммунных клеток. В некоторых вариантах реализации противовоспалительным соединениям допустимо демонстрировать ответ исключительно в более низких дозах, тогда как активирующие иммунитет вещества активны в различном диапазоне доз. В некоторых вариантах реализации благоприятный антиоксидантный эффект представляет собой мощный противовоспалительный ответ в кишечнике.
[0014] В некоторых вариантах реализации благоприятный эффект для млекопитающего представляет собой противовоспалительную активность концентрата обесцвеченного сока листа алоэ вера, концентрата сока внутренней части листа алоэ вера и сухого геля внутренней части листа. В некоторых вариантах реализации благоприятный эффект в отношении иммунной системы человека представляет собой снижение продукции воспалительных цитокинов и хемокинов мононуклеарными клетками периферической крови (МКПК) при совместном культивировании с провоспалительным стимулирующим фактором, таким как липополисахарид (ЛПС). В некоторых вариантах реализации благоприятный эффект для млекопитающего представляет собой иммуномодуляторную, т.е. как иммуностимулирующую, так и противовоспалительную, активность концентрата внутренней части листа алоэ вера и полисахарида, т.е. обогащенных ацеманнаном фракций концентрата обесцвеченного сока листа алоэ вера и концентрата сока внутренней части листа алоэ вера, соответственно. В некоторых вариантах реализации благоприятный эффект в отношении иммунной системы человека представляет собой как увеличение продукции воспалительных цитокинов и хемокинов, так и увеличение продукции противовоспалительных цитокинов мононуклеарными клетками периферической крови (МКПК) при отсутствии какого-либо провоспалительного стимула.
[0015] В некоторых вариантах реализации благоприятный эффект для млекопитающего представляет собой иммуностимулирующую активность обесцвеченного сока листа алоэ вера. В некоторых вариантах реализации благоприятный эффект в отношении иммунной системы человека представляет собой активацию иммунных клеток, которые включают клетки-природные киллеры (NK, natural killer), Т-лимфоциты и Т-лимфоциты - природные киллеры (NKT, natural killer T-lymphocytes), соответственно.
[0016] В некоторых вариантах реализации благоприятный эффект для млекопитающего представляет собой противовоспалительную активность обесцвеченного сока листа алоэ вера. В некоторых вариантах реализации благоприятный эффект в отношении иммунной системы мыши представляет собой увеличение продукции противовоспалительных цитокинов типа Th2, таких как ИЛ-10 и ИЛ-5, из совместной культуры дендритных клеток (ДК) и CD4(+) Т-клеток, а также снижение продукции ИФН-γ, цитокина типа Th1. Согласно некоторому варианту реализации благоприятный эффект в отношении иммунной системы мыши представляет собой стимуляцию переключения или поляризации воспалительных макрофагов M1 в противовоспалительные макрофаги М2.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0017] На фигуре 1 представлена стандартная установка (SHIME), содержащая 5 последовательных реакторов, которые имитируют различные участки кишечника человека.
[0018] На фигуре 2 представлен общий вид установки TWINSHIME, которая содержит две параллельные системы SHIME. Каждый реактор SHIME содержит 5 сосудов, имитирующих, соответственно, желудок, тонкий кишечник, восходящую ободочную кишку, поперечную ободочную кишку и нисходящую ободочную кишку.
[0019] На фигуре 3 представлен дизайн TripleSHIME, в котором обычная установка TWINSHIME модифицирована в 3 проксимальных отдела ободочной кишки (ПОТК) и 3 дистальных отдела ободочной кишки (ДОТК) с целью сравнения 3 различных режимов лечения в одном устройстве.
[0020] На фигуре 4 представлена система совместного культивирования клеток Сасо-2 и макрофагов ТНР1, состоящая из апикальной (АП) и базолатеральной (БЛ) стороны.
[0021] На фигуре 5 представлены концентрации (ммоль/л) ацетата в проксимальном (ПОТК) и дистальном (ДОТК) отделе ободочной кишки SHIME, в которые вводили исследуемые продукты. Данные представлены для каждой недели эксперимента (среднее значение и стандартное отклонение; n=3). Столбцы столбчатого графика обозначены числами от 1 до 6 и соответствуют подписям в представленной легенде. Столбцы на графике представлены в следующем порядке 1) ПОТК Алоэ 3 порц.; 2) ПОТК Алоэ 6 порц.; 3) ПОТК Эпикор; 4) ДОТК Алоэ 3 порц.; 5) ДОТК Алоэ 6 порц.; и 6) ДОТК Эпикор.
[0022] На фигуре 6 представлены концентрации (ммоль/л) пропионата в проксимальном и дистальном отделе ободочной кишки SHIME, в которые вводили исследуемые продукты. Данные представлены для каждой недели эксперимента (среднее значение и стандартное отклонение; n=3). Столбцы столбчатого графика обозначены числами от 1 до 6 и соответствуют подписям в представленной легенде. Столбцы на графике представлены в следующем порядке 1) ПОТК Алоэ 3 порц.; 2) ПОТК Алоэ 6 порц.; 3) ПОТК Эпикор; 4) ДОТК Алоэ 3 порц.; 5) ДОТК Алоэ 6 порц.; и 6) ДОТК Эпикор.
[0023] На фигуре 7 представлены концентрации (ммоль/л) бутирата в проксимальном и дистальном отделе ободочной кишки SHIME, в которые вводили исследуемые продукты. Данные представлены для каждой недели эксперимента (среднее значение и стандартное отклонение; n=3). Столбцы столбчатого графика обозначены числами от 1 до 6 и соответствуют подписям в представленной легенде. Столбцы на графике представлены в следующем порядке 1) ПОТК Алоэ 3 порц.; 2) ПОТК Алоэ 6 порц.; 3) ПОТК Эпикор; 4) ДОТК Алоэ 3 порц.; 5) ДОТК Алоэ 6 порц.; и 6) ДОТК Эпикор.
[0024] На фигуре 8 представлены концентрации (ммоль/л) суммарных КЖК (короткоцепочечных жирных кислот) в проксимальном и дистальном отделе ободочной кишки SHIME, в которые вводили исследуемые продукты. Данные представлены для каждой недели эксперимента (среднее значение и стандартное отклонение; n=3). Столбцы столбчатого графика обозначены числами от 1 до 6 и соответствуют подписям в представленной легенде. Столбцы на графике представлены в следующем порядке 1) ПОТК Алоэ 3 порц.; 2) ПОТК Алоэ 6 порц.; 3) ПОТК Эпикор; 4) ДОТК Алоэ 3 порц.; 5) ДОТК Алоэ 6 порц.; и 6) ДОТК Эпикор.
[0025] На фигуре 9 представлена концентрация лактата/молочной кислоты в проксимальном отделе ободочной кишки (ПОТК) и дистальном отделе ободочной кишки (ДОТК) SHIME, в которые вводили продукт Алоэ или Эпикор. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение для контрольного периода, для первых 3 недель лечения и последних 3 недель лечения. Значительные отличия в продукции лактата (КОНТРОЛЬ по сравнению с ЛЕЧЕНИЕМ) не наблюдались (Р>0,05). Столбцы столбчатого графика обозначены числами от 1 до 6 и соответствуют подписям в представленной легенде. Столбцы на графике представлены в следующем порядке 1) ПОТК Алоэ 3 порц.; 2) ПОТК Алоэ 6 порц.; 3) ПОТК Эпикор; 4) ДОТК Алоэ 3 порц.; 5) ДОТК Алоэ 6 порц.; и 6) ДОТК Эпикор.
4
+
[0026] На фигуре 10А представлены концентрации аммония (мг NH/л) в проксимальном и дистальном отделе ободочной кишки TripleSHIME. Данные представлены для каждой недели эксперимента. Значительные отличия в продукции аммония (КОНТРОЛЬ по сравнению с ЛЕЧЕНИЕМ) отмечены * для Р<0,05. Столбцы столбчатого графика обозначены числами от 1 до 6 и соответствуют подписям в представленной легенде. Столбцы на графике представлены в следующем порядке 1) ПОТК Алоэ 3 порц.; 2) ПОТК Алоэ 6 порц.; 3) ПОТК Эпикор; 4) ДОТК Алоэ 3 порц.; 5) ДОТК Алоэ 6 порц.; и 6) ДОТК Эпикор.
4
+
[0027] На фигуре 10В представлены концентрации аммония (мг NH/л) в проксимальном и дистальном отделе ободочной кишки TripleSHIME. Данные представлены для периода эксперимента. Значительные отличия в продукции аммония (КОНТРОЛЬ по сравнению с ЛЕЧЕНИЕМ) отмечены * для Р<0,05. Контроль (К) и Лечение (Л) отмечены над столбцами на столбчатом графике.
[0028] На фигуре 11А представлено потребление кислоты и основания в проксимальном (ПОТК) и дистальном отделе (ДОТК) ободочной кишки SHIME, в которые вводили 3 порции алоэ (ПОТК3 или ДОТК3). Данные представлены в виде среднего потребления в течение контрольного периода (К), первых 3 недель лечения (Л1-3) и последних 3 недель лечения (Л4-6). Подписи: 1) ПОТК3 кислота; 2) ПОТК3 основание; 3) ДОТК3 кислота; и 4) ДОТК3 основание.
[0029] На фигуре 11В представлено потребление кислоты и основания в проксимальном (ПОТК) и дистальном отделе (ДОТК) ободочной кишки SHIME, в которые вводили 6 порций алоэ (ПОТК6 или ДОТК6). Данные представлены в виде среднего потребления в течение контрольного периода (К), первых 3 недель лечения (Л1-3) и последних 3 недель лечения (Л4-6). Подписи: 1) ПОТК6 кислота; 2) ПОТК6 основание; 3) ДОТК6 кислота; и 4) ДОТК6 основание.
[0030] На фигуре 11С представлено потребление кислоты и основания в проксимальном (ПОТК) и дистальном отделе (ДОТК) ободочной кишки SHIME, в которые вводили Эпикор (ПОТКЭпи или ДОТКЭпи). Данные представлены в виде среднего потребления в течение контрольного периода (К), первых 3 недель лечения (Л1-3) и последних 3 недель лечения (Л4-6). Подписи: 1) ПОТКПпи кислота; 2) ПОТКПпи основание; 3) ДОТКЭпи кислота; и 4) ДОТКЭпи основание.
[0031] На фигуре 12А представлены данные кПЦР относительно внутриполостной концентрации суммарных бактерий в отделении TripleSHIME, в которое вводили 3 порции алоэ. Данные представлены для каждой недели эксперимента в каждом компартменте ободочной кишки. Варианты лечения обозначены над столбцами графика: 1) Контроль 1; 2) Контроль 2; 3) Лечение 1; 4) Лечение 2; 5) Лечение 3; 6) Лечение 4; 7) Лечение 5; и 8) Лечение 6.
[0032] На фигуре 12В представлены данные кПЦР относительно внутриполостной концентрации бактероидов в отделении TripleSHIME, в которое вводили 3 порции алоэ. Данные представлены для каждой недели эксперимента в каждом компартменте ободочной кишки. Варианты лечения обозначены над столбцами графика: 1) Контроль 1; 2) Контроль 2; 3) Лечение 1; 4) Лечение 2; 5) Лечение 3; 6) Лечение 4; 7) Лечение 5; и 8) Лечение 6.
[0033] На фигуре 12С представлены данные кПЦР относительно внутриполостной концентрации фирмикутов в отделении TripleSHIME, в которое вводили 3 порции алоэ. Данные представлены для каждой недели эксперимента в каждом компартменте ободочной кишки. Варианты лечения обозначены над столбцами графика: 1) Контроль 1; 2) Контроль 2; 3) Лечение 1; 4) Лечение 2; 5) Лечение 3; 6) Лечение 4; 7) Лечение 5; и 8) Лечение 6.
[0034] На фигуре 12D представлены данные кПЦР относительно внутриполостной концентрации лактобацилл в отделении TripleSHIME, в которое вводили 3 порции алоэ. Данные представлены для каждой недели эксперимента в каждом компартменте ободочной кишки. Варианты лечения обозначены над столбцами графика: 1) Контроль 1; 2) Контроль 2; 3) Лечение 1; 4) Лечение 2; 5) Лечение 3; 6) Лечение 4; 7) Лечение 5; и 8) Лечение 6.
[0035] На фигуре 12Е представлены данные кПЦР относительно внутриполостной концентрации бифидобактерий в отделении TripleSHIME, в которое вводили 3 порции алоэ. Данные представлены для каждой недели эксперимента в каждом компартменте ободочной кишки. Варианты лечения обозначены над столбцами графика: 1) Контроль 1; 2) Контроль 2; 3) Лечение 1; 4) Лечение 2; 5) Лечение 3; 6) Лечение 4; 7) Лечение 5; и 8) Лечение 6.
[0036] На фигуре 13А представлены данные кПЦР относительно внутриполостной концентрации суммарных бактерий в отделении TripleSHIME, в которое вводили 6 порций алоэ. Данные представлены для каждой недели эксперимента в каждом компартменте ободочной кишки. Варианты лечения обозначены над столбцами графика: 1) Контроль 1; 2) Контроль 2; 3) Лечение 1; 4) Лечение 2; 5) Лечение 3; 6) Лечение 4; 7) Лечение 5; и 8) Лечение 6.
[0037] На фигуре 13В представлены данные кПЦР относительно внутриполостной концентрации бактероидов в отделении TripleSHIME, в которое вводили 6 порций алоэ. Данные представлены для каждой недели эксперимента в каждом компартменте ободочной кишки. Варианты лечения обозначены над столбцами графика: 1) Контроль 1; 2) Контроль 2; 3) Лечение 1; 4) Лечение 2; 5) Лечение 3; 6) Лечение 4; 7) Лечение 5; и 8) Лечение 6.
[0038] На фигуре 13С представлены данные кПЦР относительно внутриполостной концентрации фирмикутов в отделении TripleSHIME, в которое вводили 6 порций алоэ. Данные представлены для каждой недели эксперимента в каждом компартменте ободочной кишки. Варианты лечения обозначены над столбцами графика: 1) Контроль 1; 2) Контроль 2; 3) Лечение 1; 4) Лечение 2; 5) Лечение 3; 6) Лечение 4; 7) Лечение 5; и 8) Лечение 6.
[0039] На фигуре 13D представлены данные кПЦР относительно внутриполостной концентрации лактобацилл в отделении TripleSHIME, в которое вводили 6 порций алоэ. Данные представлены для каждой недели эксперимента в каждом компартменте ободочной кишки. Варианты лечения обозначены над столбцами графика: 1) Контроль 1; 2) Контроль 2; 3) Лечение 1; 4) Лечение 2; 5) Лечение 3; 6) Лечение 4; 7) Лечение 5; и 8) Лечение 6.
[0040] На фигуре 13Е представлены данные кПЦР относительно внутриполостной концентрации бифидобактерий в отделении TripleSHIME, в которое вводили 6 порций алоэ. Данные представлены для каждой недели эксперимента в каждом компартменте ободочной кишки. Варианты лечения обозначены над столбцами графика: 1) Контроль 1; 2) Контроль 2; 3) Лечение 1; 4) Лечение 2; 5) Лечение 3; 6) Лечение 4; 7) Лечение 5; и 8) Лечение 6.
[0041] На фигуре 14А представлены данные кПЦР относительно внутриполостной концентрации суммарных бактерий в отделении TripleSHIME, в которое вводили Эпикор. Данные представлены для каждой недели эксперимента в каждом компартменте ободочной кишки. Варианты лечения обозначены над столбцами графика: 1) Контроль 1; 2) Контроль 2; 3) Лечение 1; 4) Лечение 2; 5) Лечение 3; 6) Лечение 4; 7) Лечение 5; и 8) Лечение 6.
[0042] На фигуре 14В представлены данные кПЦР относительно внутриполостной концентрации бактероидов в отделении TripleSHIME, в которое вводили Эпикор. Данные представлены для каждой недели эксперимента в каждом компартменте ободочной кишки. Варианты лечения обозначены над столбцами графика: 1) Контроль 1; 2) Контроль 2; 3) Лечение 1; 4) Лечение 2; 5) Лечение 3; 6) Лечение 4; 7) Лечение 5; и 8) Лечение 6.
[0043] На фигуре 14С представлены данные кПЦР относительно внутриполостной концентрации фирмикутов в отделении TripleSHIME, в которое вводили Эпикор. Данные представлены для каждой недели эксперимента в каждом компартменте ободочной кишки. Варианты лечения обозначены над столбцами графика: 1) Контроль 1; 2) Контроль 2; 3) Лечение 1; 4) Лечение 2; 5) Лечение 3; 6) Лечение 4; 7) Лечение 5; и 8) Лечение 6.
[0044] На фигуре 14D представлены данные кПЦР относительно внутриполостной концентрации лактобацилл в отделении TripleSHIME, в которое вводили Эпикор. Данные представлены для каждой недели эксперимента в каждом компартменте ободочной кишки. Варианты лечения обозначены над столбцами графика: 1) Контроль 1; 2) Контроль 2; 3) Лечение 1; 4) Лечение 2; 5) Лечение 3; 6) Лечение 4; 7) Лечение 5; и 8) Лечение 6.
[0045] На фигуре 14Е представлены данные кПЦР относительно внутриполостной концентрации бифидобактерий в отделении TripleSHIME, в которое вводили Эпикор. Данные представлены для каждой недели эксперимента в каждом компартменте ободочной кишки. Варианты лечения обозначены над столбцами графика: 1) Контроль 1; 2) Контроль 2; 3) Лечение 1; 4) Лечение 2; 5) Лечение 3; 6) Лечение 4; 7) Лечение 5; и 8) Лечение 6.
[0046] На фигуре 15 представлен дизайн анализа образцов для измерения: ТЭЭС (трансэпителиального электрического сопротивления, 24 ч), параклеточного транспорта красителя Lucifer Yellow (24 ч) и иммунных маркеров (через 6 ч воздействия ЛПС, липополисахарида), т.е. ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ФНО-α и активности
[0047] На фигуре 16 представлена схема функционирования ТЭЭС.
[0048] На фигуре 17 представлен синдром повышенной проницаемости кишечника и воспалительный каскад.
[0049] На фигуре 18 представлен каскад воспаления ФНО-α.
[0050] На фигурах 19А-19В представлен (фиг. 19А) ТЭЭС и (фиг. 19В) параклеточный транспорт красителя Lucifer Yellow (ЛЖ) в контрольных экспериментах (PC, ростовая среда и NaB, бутират натрия) и на не ферментированных исследуемых продуктах - Алоэ 1 (0,507 г/л), Алоэ 2 (1,014 г/л) и ЭпиКор (1,5 г/л). ТЭЭС и транспорт ЛЖ измеряли через 24 ч после предварительной обработки совместных культур в двух независимых экспериментах; нз: не значимо. Статистическая значимость для транспорта ЛЖ не была установлена.
[0051] На фигурах 19С-19F представлен ИЛ-10 (фиг. 19С), ИЛ-6 (фиг. 19С и 19D), ИЛ-8 (фиг. 19С и 19Е) и ФНО-α (фиг. 19С и 19F) в контрольных экспериментах (PC, ЛПС, NaB и ГК, гидрокортизон) и на неферментированных исследуемых продуктах - Алоэ 1 (0,507 г/л), Алоэ 2 (1,014 г/л) и ЭпиКор (1,5 г/л). Цитокины измеряли через 6 ч после обработки совместных культур, которые сначала предварительно обрабатывали исследуемыми продуктами в течение 24 ч, ЛПС; нз: не значимо.
[0052] На фигуре 19G представлена активность  в контрольных экспериментах (PC, ЛПС, NaB и ГК) и на неферментированных исследуемых продуктах - Алоэ 1 (0,507 г/л), Алоэ 2 (1,014 г/л) и ЭпиКор (1,5 г/л). Активность NF-RB измеряли через 6 ч после обработки совместных культур, которые сначала предварительно обрабатывали исследуемыми продуктами в течение 24 ч, ЛПС; нз: не значимо.
[0053] На фигурах 19H-19I представлен ТЭЭС (ФИГ. 19Н) и параклеточный транспорт красителя Lucifer Yellow (ЛЖ) (ФИГ. 191) на совместных культурах, обработанных образцами, отобранными из SHIME, в который вводили Алоэ 1 (изначально вводили в дозе 0,507 г/л), Алоэ 2 (изначально вводили в дозе 1,014 г/л) и ЭпиКор (изначально вводили в дозе 1,5 г/л). ТЭЭС и транспорт ЛЖ измеряли через 24 ч после предварительной обработки совместных культур в двух независимых экспериментах; нз: не значимо.
[0054] На фигурах 19J-19N представлен ИЛ-10 (ФИГ. 19J), ИЛ-6 (ФИГ. 19K), ИЛ-8 (ФИГ. 19L), ФНО-α (ФИГ. 19М) и активность  (ФИГ. 19N) на совместных культурах, обработанных образцами, отобранными из SHIME, в который вводили Алоэ 1 (изначально вводили в дозе 0,507 г/л), Алоэ 2 (изначально вводили в дозе 1,014 г/л) и ЭпиКор (изначально вводили в дозе 1,5 г/л). Цитокины измеряли через 6 ч после обработки совместных культур, которые сначала предварительно обрабатывали исследуемыми образцами в течение 24 ч, ЛПС; нз: не значимо. Статистическая значимость в случае ИЛ-6 и ИЛ-8 не была установлена.
[0055] На фигуре 20 представлен объединенный двойной график анализа главных компонент (АГК)/корреляции (71,6%).
[0056] На фигуре 21 графически представлен краткий обзор эффекта исследуемых продуктов в отношении параметров хозяина. Желтые ячейки (Ж) представляют собой = 1,0 и изображают контроли: PC или ЛПС для непереваренных продуктов или для образцов, собранных в течение контрольного периода для SHIME; зеленые (З) ячейки представляют собой значения >1, то есть увеличение относительно контроля; красные (К) ячейки представляют собой значения <1, то есть уменьшение относительно контроля. Степень изменения относительно 1,0 представлена интенсивностью цвета. Квадраты заполнены буквами Ж, З или К для обозначения желтого, красного или зеленого. Отсутствие буквы означает, что квадрат является белым.
[0057] Фигура 22 представляет собой диаграмму, демонстрирующую клеточный анализ антиоксидантной защиты.
[0058] Фигура 23 представляет собой диаграмму, демонстрирующую механизмы, посредством которых природные продукты могут оказывать влияние на АФК (активные формы кислорода) ИМЯ (полиморфноядерных) клеток.
[0059] Фигура 24 является графическим представлением общей антиоксидантной способности исследованных продуктов. Верхний график демонстрирует необработанные продукты. Средний график демонстрирует продукты и контроль, отобранные в течение процесса пищеварения in vitro. Нижний график демонстрирует все данные, объединенные в наложенный график для сравнения.
[0060] Фигура 25 является графическим представлением клеточной антиоксидантной защиты (анализ САР-е) исследованных продуктов. Верхний график демонстрирует необработанные продукты. Средний график демонстрирует продукты и контроль, отобранные в течение процесса пищеварения in vitro. Нижний график демонстрирует все данные, объединенные в наложенный график для сравнения.
[0061] На фигуре 26 представлена презентация данных от проточного цитометра Attune acoustic. Точечные диаграммы представляют относительный размер клеток вдоль оси X и относительную зернистость клеток вдоль оси Y. Живые и функциональные ПМЯ клетки помещали в область, которая определяет электронный «гейт» для анализа данных образования АФК. Пример, представленный слева, характеризует образец здоровых ПМЯ клеток, когда обработка клеток исследуемым продуктом не нарушала целостность клеток, и в образце присутствовало устойчивое количество клеток. Точечная диаграмма справа демонстрирует, что ПМЯ клетки, обработанные наивысшей дозой ПIV (переваренного in vitro) цельного листа, претерпели клеточную смерть, и в области, которая определяет живые и функциональные ПМЯ клетки, осталось менее 10% клеток. Даже те несколько оставшихся клеток, вероятно, претерпели клеточную смерть и не функционировали нормальным образом. Данные продемонстрировали, что клетки образовывали большие количества АФК. Данные для этой дозы ПIV ЦЛ (цельного листа) отмечены «X» на графиках данных на фигуре 27 и фигуре 30.
[0062] Фигура 27 является графическим представлением анализа активных форм кислорода. ПМЯ клетки применяли для демонстрации эффектов продуктов в отношении образования АФК в условиях окислительного стресса. Результаты представляют собой наложенные графики исследованных продуктов с применением ПМЯ клеток от каждого донора. Аналогичные ответы наблюдались у 2 из 3 доноров, исследование которых проводили, у которых продукт внутренней части листа и его ПIV продукт характеризовались более устойчивой противовоспалительной активностью, чем цельный лист и его ПIV продукт. В связи с клеточной смертью, которая наблюдалась в некоторых культурах под воздействием более высоких доз определенных продуктов (например, ЦЛ-ПIV), данные об АФК для данных культур являются недействительными и отмечены «X» на соответствующих точках данных на графиках на фигуре 27.
2
2
2
2
2
2
2
2
[0063] Фигура 28 является графическим представлением анализа активных форм кислорода (АФК) с применением ПМЯ клеток человека от здоровых доноров в условиях окислительного стресса. На столбчатых графиках представлено внутриклеточное образование АФК в клетках под воздействием продукта цельного листа по сравнению с необработанными (НО) контрольными клетками и обработанными HO (HO) культурами положительного контроля. Когда исследуемый продукт запускал увеличение или уменьшение образования АФК, которое в значительной степени отличалось от контролей HO, это отмечали * р<0,05, ** р<0,01. Тонкая линия над столбчатыми графиками обозначает согласованность данных в пределах анализа в течение времени для контролей HO, анализ которых проводили до (слева) и после (справа) всех образцов продукта.
2
2
2
2
2
2
2
2
[0064] Фигура 29 является графическим представлением анализа активных форм кислорода (АФК) с применением ПМЯ клеток человека от здоровых доноров в условиях окислительного стресса. На столбчатых графиках представлено внутриклеточное образование АФК в клетках после осуществления контакта с продуктом внутренней части листа по сравнению с необработанными (НО) контрольными клетками и обработанными HO (HO) культурами положительного контроля. Когда исследуемый продукт запускал увеличение или уменьшение образования АФК, которое в значительной степени отличалось от контролей HO, это отмечали * р<0,05, ** р<0,01. Тонкая линия над столбчатыми графиками обозначает согласованность данных в пределах анализа в течение времени для контролей HO, анализ которых проводили до (слева) и после (справа) всех образцов продукта.
2
2
2
2
2
2
2
2
[0065] Фигура 30 является графическим представлением анализа активных форм кислорода (АФК) с применением ПМЯ клеток человека от здоровых доноров в условиях окислительного стресса. На столбчатых графиках представлено внутриклеточное образование АФК в клетках после осуществления контакта с переваренным продуктом цельного листа по сравнению с необработанными (НО) контрольными клетками и обработанными HO (HO) культурами положительного контроля. Когда исследуемый продукт запускал увеличение или уменьшение образования АФК, которое в значительной степени отличалось от контролей HO, это отмечали * р<0,05, ** р<0,01. Тонкая линия на столбчатых графиках обозначает согласованность данных в пределах анализа в течение времени для контролей HO, анализ которых проводили до (слева) и после (справа) всех образцов продукта.
2
2
2
2
2
2
2
2
[0066] Фигура 31 является графическим представлением анализа активных форм кислорода (АФК) с применением ПМЯ клеток человека от здоровых доноров в условиях окислительного стресса. На столбчатых графиках представлено внутриклеточное образование АФК в клетках после осуществления контакта с переваренным продуктом внутренней части листа по сравнению с необработанными (НО) контрольными клетками и обработанными HO (HO) культурами положительного контроля. Когда исследуемый продукт запускал увеличение или уменьшение образования АФК, которое в значительной степени отличалось от контролей HO, это отмечали * р<0,05, ** р<0,01. Тонкая линия обозначает согласованность данных в пределах анализа в течение времени для контроля HO.
2
2
2
2
2
2
2
2
[0067] Фигура 32 является графическим представлением анализа активных форм кислорода (АФК) с применением ПМЯ клеток человека от здоровых доноров в условиях окислительного стресса. На столбчатых графиках представлено внутриклеточное образование АФК в клетках после осуществления контакта с контролем - буфером для переваривания, по сравнению с необработанными (НО) контрольными клетками и обработанными HO (HO) культурами положительного контроля. Когда исследуемый продукт запускал увеличение или уменьшение образования АФК, которое в значительной степени отличалось от контролей HO, это отмечали * р<0,05, ** р<0,01. Тонкая линия обозначает согласованность данных в пределах анализа в течение времени для контролей HO, анализ которых проводили до (слева) и после (справа) всех образцов продукта.
[0068] Фигура 33А(I) является графическим представлением анализа цитокинов с применением клеток МКПК человека от здорового донора. На столбчатом графике представлена средняя концентрация MIP-1α, хемокина, который секретируется из МКПК в культуральную среду через 24 часа после обработки клеток 100 мкг/мл сухого сока обесцвеченного листа алоэ вера в присутствии 50 пг/мл липополисахарида (ЛПС), стимулятора воспаления. Представлено среднее значение из двух повторов для каждого цитокина.
[0069] Фигура 33А(II) является графическим представлением анализа цитокинов с применением МКПК клеток человека от здорового донора. На столбчатом графике представлена средняя концентрация ФНО-α, хемокина, который секретируется из МКПК в культуральную среду через 24 часа после обработки клеток 100 мкг/мл сухого сока обесцвеченного листа алоэ вера в присутствии 50 пг/мл липополисахарида (ЛПС), стимулятора воспаления. Представлено среднее значение из двух повторов для каждого цитокина.
[0070] Фигура 33А(III) является графическим представлением анализа цитокинов с применением клеток МКПК человека от здорового донора. На столбчатом графике представлена средняя концентрация MIP-1α, цитокина, который секретируется из МКПК в культуральную среду через 24 часа после обработки клеток 100 мкг/мл сухого сока обесцвеченного листа алоэ вера, обогащенного полисахаридом (ПС), в присутствии 50 пг/мл липополисахарида (ЛПС), стимулятора воспаления. Представлено среднее значение из двух повторов для каждого цитокина.
[0071] Фигура 33A(IV) является графическим представлением анализа цитокинов с применением клеток МКПК человека от здорового донора. На столбчатом графике представлена средняя концентрация ФНО-α через 24 часа после обработки клеток 100 мкг/мл сухого сока обесцвеченного листа алоэ вера, обогащенного полисахаридом (ПС), в присутствии 50 пг/мл липополисахарида (ЛПС), стимулятора воспаления. Представлено среднее значение из двух повторов для каждого цитокина.
[0072] Фигура 33В(I) является графическим представлением анализа цитокинов с применением клеток МКПК человека от здорового донора. На столбчатом графике представлена средняя концентрация MIP-1α, цитокина, который секретируется из МКПК в культуральную среду через 24 часа после обработки клеток 100 мкг/мл концентрата сока внутренней части листа алоэ вера в присутствии 50 пг/мл липополисахарида (ЛПС), стимулятора воспаления. Представлено среднее значение из двух повторов для каждого цитокина.
[0073] Фигура 33В(II) является графическим представлением анализа цитокинов с применением клеток МКПК человека от здорового донора. На столбчатом графике представлена средняя концентрация ФНО-α, хемокина, который секретируется из МКПК в культуральную среду через 24 часа после обработки клеток 100 мкг/мл концентрата сока внутренней части листа алоэ вера в присутствии 50 пг/мл липополисахарида (ЛПС), стимулятора воспаления. Представлено среднее значение из двух повторов для каждого цитокина.
[0074] Фигура 33B(III) является графическим представлением анализа цитокинов с применением клеток МКПК человека от здорового донора. На столбчатом графике представлена средняя концентрация ИЛ-10 через 24 часа после обработки клеток 100 мкг/мл концентрата сока внутренней части листа алоэ вера, обогащенного полисахаридом (ПС), в присутствии 50 пг/мл липополисахарида (ЛПС), стимулятора воспаления. Представлено среднее значение из двух повторов для каждого цитокина.
[0075] Фигура 33С(I-V) является графическим представлением анализа цитокинов с применением клеток МКПК человека от здорового донора. На столбчатом графике представлена средняя концентрация цитокинов и хемокинов [ИЛ-1β (I), ФНО-α (II), ИЛ-6 (III), ИЛ-10 (IV) и MIP-1α (V)], которые секретируются из МКПК в культуральную среду через 24 часа после обработки клеток 100 мкг/мл концентрата сока внутренней части листа алоэ вера при отсутствии стимулятора воспаления. Представлено среднее значение из двух повторов для каждого цитокина.
[0076] Фигура 34А является графическим представлением результатов анализа методом многопараметровой проточной цитометрии с применением флуоресцентных моноклональных антител, специфичных в отношении маркеров поверхности клетки CD3, CD25, CD56 и CD69, соответственно. Моноклональные антитела против CD3 и против CD56 применяли для определения CD3(-)CD56(+) NK-клеток в МКПК здорового донора, тогда как антитела против CD25 и против CD69 применяли для отслеживания статуса активации. На графике откладывали среднее значение из трех повторов для каждой концентрации.
[0077] Фигура 34 В является графическим представлением анализа методом многопараметровой проточной цитометрии с применением флуоресцентных моноклональных антител, специфичных в отношении маркеров поверхности клетки CD3, CD25, CD56 и CD69, соответственно. Моноклональные антитела против CD3 и против CD56 применяли для определения CD3(+)CD56(+)NKT-клеток в МКПК здорового донора, тогда как антитела против CD25 и против CD69 применяли для отслеживания статуса активации. На графике откладывали среднее значение из трех повторов для каждой концентрации.
[0078] Фигура 35А является графическим представлением анализа цитокинов для измерения продукции цитокинов типа Th1 (ИФН-γ) и Th2 (ИЛ-5 и ИЛ-10) из совместных культур CD4 Т-лимфоцитов и полученных из костного мозга ДК мыши, активированных ЛПС, при отсутствии или в присутствии композиции сока листа алоэ вера (Алоэ1 или Алоэ2). На столбчатом графике представлена средняя концентрация из трех повторов для каждого цитокина, секретированного из совместных культур в среду в течение 24 часов.
[0079] Фигура 35 В является графическим представлением анализа активности аргиназы для измерения поляризации и функции полученных из костного мозга мыши макрофагов, активированных ЛПС, при отсутствии или в присутствии композиции сока листа алоэ вера (Алоэ1 или Алоэ2). На столбчатом графике представлена средняя продукция мочевины (мкг/5 00000 клеток) из трех повторов для каждого анализа.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ОПРЕДЕЛЕННЫХ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ РЕАЛИЗАЦИИ
I. Введение
[0080] Подходы in vitro для исследования желудочно-кишечного (ЖК) тракта и микробных процессов в кишечнике обеспечивают прекрасную экспериментальную модель для исследования возможных свойств избранных компонентов пищи. Применение надлежащим образом сконструированных непрерывных моделей позволяет проводить всестороннее исследование биологической активности избранных молекул в кишке в репрезентативных окружающих условиях. Более того, последние достижения моделирования in vitro также позволяют сочетать исследование взаимодействий бактерия-хозяин с непрерывной моделью, посредством этого дополнительно повышая научную эффективность и коммерческую значимость.
[0081] На сегодняшний день проводят исследования повышенной проницаемости кишечника, поскольку, как полагают, данное состояние вовлечено в серьезные проблемы со здоровьем или заболевания, такие как синдром хронической усталости, СКР (синдром раздраженного кишечника), метаболические расстройства, воспалительные заболевания кишечника, диабет 1 типа, аллергии, астма и аутоиммунные заболевания. Фактически, повышенная проницаемость кишечника определяет связь между нарушением функции кишечного барьера и развитием аутоиммунных и воспалительных заболеваний. Эпителий сохраняет свою функцию селективного барьера посредством образования сложных белок-белковых сетей, которые механически связывают смежные клетки и уплотняют межклеточное пространство. Ненадлежащее функционирование или регуляция плотных контактов может приводить к увеличению межклеточного пространства и прохождению элементов полости через барьер с последующим местным и системным воспалением.
[0082] Хроническое воспаление представляет собой патологическое состояние, которое характеризуется непрерывным активным воспалительным ответом и разрушением ткани. Множество исследований позволяют предположить, что хроническое воспаление может играть важную роль в широком множестве возрастных заболеваний, включая диабет, сердечно-сосудистые и аутоиммунные заболевания. Воспалительные процессы индуцируют окислительный стресс и снижают антиоксидантную способность клеток. Образующиеся в повышенных количествах свободные радикалы вступают в реакцию с жирными кислотами и белками мембраны клетки, постоянно нарушая их функцию. Кроме того, свободные радикалы могут приводить к мутациям и повреждению ДНК, что может являться предрасполагающим фактором возникновения рака и возрастных заболеваний.
[0083] Множество иммунных клеток, включая макрофаги, нейтрофилы и эозинофилы, участвуют в патогенезе хронического воспаления напрямую или посредством продукции воспалительных цитокинов. Прямые иммуномодуляторные эффекты и регуляцию иммунного и воспалительного процесса под действием алоэ вера можно измерять посредством прямой клеточной активации NK-клеток, NKT-клеток, Т-лимфоцитов, моноцитов и макрофагов.
[0084] В настоящем изобретении оценивают возможные свойства ежедневных повторяющихся доз алоэ вера. Модель SHIME позволяет проводить аппроксимацию и культивирование сложной микробной экосистемы кишечника в течение длительного периода времени и в репрезентативных условиях. SHIME также позволяет имитировать повторяющееся пероральное поступление исследуемого материала. В настоящем изобретении оценивали состав и активность микробного сообщества под действием повторяющегося введения доз алоэ вера и эффект в отношении проницаемости кишечного барьера и воспаления. Метод анализа Фолина-Чокальтеу представляет собой метод измерения суммарного содержания фенолов в материале, которое является показателем антиоксидантной способности материала. Для оценки антиоксидантного потенциала можно провести клеточный анализ антиоксидантной защиты. В данном анализе измеряют исключительно антиоксиданты, способные пересекать липидный бислой мембраны клетки, которые поступают в клетки и обеспечивают биологически значимую антиоксидантную защиту в условиях окислительного стресса.
[0085] Композиция, раскрытая в настоящем документе, характеризуется несколькими преимуществами. Одно из преимуществ заключается в продукции короткоцепочечных жирных кислот. Композиции согласно настоящему изобретению демонстрируют линейный эффект дозы в отношении продукции как суммарных, так и индивидуальных короткоцепочечных жирных кислот. Также введение (или пероральное поступление) очищенного (обесцвеченного) сухого сока листа алоэ вера приводит к более высокой продукции ацетата и пропионата в проксимальном отделе ободочной кишки. Другое преимущество композиции, раскрытой в настоящем документе, заключается в ее влиянии на состав микроорганизмов кишки. В концентрации 0,507 г/л исследуемый образец привел к незначительному увеличению количества суммарных бактерий в проксимальном отделе ободочной кишки, главным образом, связанному с увеличением количества бактероидов. Наблюдался временный максимум концентрации бифидобактерий через две недели лечения. В концентрации 1,014 г/л очищенный (обесцвеченный) сухой сок листа алоэ вера приводит к увеличению количества суммарных бактерий (бактероидов и фирмикутов) и временной концентрации бифидобактерий. Еще одно преимущество раскрытой в настоящем документе композиции заключается в ее положительном эффекте в отношении целостности барьера Сасо-2. В концентрации 1,014 г/л неферментированный очищенный (обесцвеченный) сухой сок листа алоэ вера может поддерживать трансэпителиальное электрическое сопротивление (ТЭЭС) посредством защиты клеток Сасо-2 от повреждения, индуцированного клетками ТНР1, тем самым оказывая положительный эффект в отношении целостности барьера Сасо-2. Другое преимущество композиций, раскрытых в настоящем документе, включает их положительный эффект в отношении уровней ИЛ-10, уровней ИЛ-6, уровней ИЛ-8 и уровней ФНО-α. В концентрации 1,014 г/л неферментированный очищенный (обесцвеченный) сухой сок листа алоэ вера способен увеличивать индуцированные ЛПС уровни ИЛ-10 (подлинного противовоспалительного цитокина), поддерживать уровни ИЛ-6 и снижать индуцированные ЛПС уровни ИЛ-8 и ФНО-α. Еще одно преимущество раскрытой в настоящем документе композиции заключается в обеспечении биологически значимой антиоксидантной защиты в условиях окислительного стресса.
[0086] В настоящем документе также оцениваются противовоспалительные и иммуномодуляторные свойства композиции, раскрытой в настоящем документе, которые измеряют в анализе высвобождения цитокинов с применением популяции иммунных клеток, называемых мононуклеарными клетками периферической крови (МКПК). Клетки культивировали в присутствии липополисахарида (ЛПС) или полиинозиновой : полицитидиловой (поли I:С) кислоты, мощных стимуляторов воспаления, имитирующих бактериальную инфекцию и вирусное заражение, соответственно, и обрабатывали исследуемым материалом алоэ. Концентрацию цитокина или хемокина, секретируемых МКПК, измеряли посредством твердофазного иммуноферментного анализа (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA). Иммунологический анализ на основе МКПК позволил выявить следующие преимущества композиции алоэ. Во-первых, в диапазоне концентраций от 10 мкг/мл до 100 мкг/мл концентрат сока листа алоэ вера, который содержал от 4,3 до 55,9 процентов полисахаридов, продемонстрировал противовоспалительную и/или иммуномодуляторную активность (как иммуностимулирующую, так и противовоспалительную), поскольку он снижал стимулированную ЛПС экспрессию MIP-1α и/или ФНО-α в МКПК. Во-вторых, в диапазоне концентраций от 0,1 мкг/мл до 100 мкг/мл концентрат сока внутренней части листа алоэ вера, который содержал от 8,8 до 82 процентов полисахаридов, продемонстрировал противовоспалительную и/или иммуномодуляторную активность (как иммуностимулирующую, так и противовоспалительную), поскольку он снижал стимулированную ЛПС экспрессию ФНО-α и MIP-1α в МКПК, одновременно увеличивая уровень ИЛ-10, если содержание полисахарида являлось более высоким.
[0087] Затем иммуномодуляторные активности композиции, раскрытой в настоящем документе, оценивали методом многопараметровой проточной цитометрии для определения природы иммунных клеток и статуса их активации (фигуры 34А-34В). МКПК, полученные от здорового донора, культивировали с от 0,004 мг/мл до 2 мг/мл концентрата сока листа алоэ вера. С целью обнаружения клеток природных киллеров [NK, CD3(-)/CD56(+)] и NKT [CD3(+)/CD56(+)] (которые являлись важными не только для врожденных, но также для адаптивных иммунных ответов), применяли моноклональные антитела против CD3 и против CD56. С другой стороны, применяли моноклональные антитела против CD25 и против CD69 для определения того, могут ли данные иммунные клетки напрямую активироваться концентратом сока листа алоэ вера. Анализ методом проточной цитометрии позволил выявить следующие преимущества композиции алоэ. Во-первых, концентрат сока листа алоэ вера напрямую активировал NK-клетки, которые являются важными для первичной защиты против патогенных микроорганизмов и абнормальных клеток, таких как раковые клетки, возникающие в организме. Во-вторых, композиция алоэ напрямую активировала NKT-клетки, которые играют важную роль в регуляции аутоиммунных заболеваний, атеросклероза и рака.
[0088] Противовоспалительную активность композиции, раскрытой в настоящем документе, также анализировали на основании продукции цитокинов типа Th1 и Th2 из CD4 Т-клеток, культивируемых совместно с дендритными клетками (ДК), активированных ЛПС, при отсутствии или в присутствии концентрата сока листа алоэ вера (0,507 мг/мл) (фигура 35А). Анализ цитокинов позволил выявить следующие преимущества композиции алоэ. Во-первых, композиция алоэ в значительной степени повышала продукцию противовоспалительных цитокинов типа Th2, таких как ИЛ-10 и ИЛ-5. Во-вторых, композиция алоэ в значительной степени снижала продукцию воспалительных цитокинов типа Th1, таких как ИФН-γ. В-третьих, композиция алоэ приводила к дифференциации противовоспалительных толерогенных ДК. С другой стороны, противовоспалительную активность композиции, раскрытой в настоящем документе, дополнительно оценивали посредством анализа активности аргиназы, в котором измеряли продукцию мочевины (мкг) в макрофагах (500000 клеток), активированных ЛПС, при отсутствии или в присутствии концентрата сока листа алоэ вера (0,507 мг/мл). Анализ аргиназы позволил выявить следующее преимущество композиции алоэ, которая способствовала переключению или поляризации воспалительных макрофагов M1 в противовоспалительные макрофаги М2.
II. Продукт алоэ
[0089] Продукт алоэ, раскрытый в настоящем документе, включает обесцвеченный алоэ вера, концентрат сока алоэ вера, обогащенные полисахаридами фракции обесцвеченного алоэ вера и концентрата сока алоэ вера, внутреннюю часть листа алоэ вера и одно или более вспомогательных веществ.
[0090] Сок алоэ вера может представлять собой жидкий сок, концентрат сока или концентрат сухого сока. В некоторых вариантах реализации сок алоэ вера может содержать не более 3 ч./млн алоина. В некоторых вариантах реализации сок алоэ вера может содержать не более приблизительно 10 ч./млн алоина. В некоторых вариантах реализации сок алоэ вера может содержать не более приблизительно 1 ч./млн, 2 ч./млн, 4 ч./млн, 5 ч./млн, 6 ч./млн, 7 ч./млн, 8 ч./млн или 9 ч./млн алоина.
[0091] Сок алоэ вера может содержать по меньшей мере 5% ацетилированного ацеманнана. В некоторых вариантах реализации молекулярная масса ацетилированного ацеманнана может составлять от 50000 Дальтон до 10000000 Дальтон. В некоторых вариантах реализации молекулярная масса ацетилированного ацеманнана может составлять от 100000 до 5000000 Дальтон. В некоторых вариантах реализации молекулярная масса ацетилированного ацеманнана может составлять 50000, 100000, 150000, 200000, 250000, 300000, 350000, 400000, 450000, 500000, 550000, 600000, 650000, 700000, 750000, 800000, 850000, 900000, 950000, 1000000, 1050000, 1100000, 1150000, 1200000, 1250000, 1300000, 1350000, 1400000, 1450000, 1500000, 1550000, 1600000, 1650000, 1700000, 1750000, 1800000, 1850000, 1900000, 1950000, 1000000, 2000000, 2050000, 2100000, 2150000, 2200000, 2250000, 2300000, 2350000, 2400000, 2450000, 2500000, 2550000, 2600000, 2650000, 2700000, 2750000, 2800000, 2850000, 2900000, 2950000, 3000000, 3050000, 3100000, 3150000, 3200000, 3250000, 3300000, 3350000, 3400000, 3450000, 3500000, 3550000, 3600000, 3650000, 3700000, 3750000, 3800000, 3850000, 30900000, 3950000, 4000000, 4050000, 4100000, 4150000, 4200000, 4250000, 4300000, 4350000, 4400000, 4450000, 4500000, 4550000, 4600000, 4650000, 4700000, 4750000, 4800000, 4850000, 4900000, 4950000, 5000000 Дальтон или любое число в промежутке между данными значениями.
[0092] Концентрат алоэ вера может представлять собой чистый сок алоэ вера. Сок алоэ вера может представлять собой 2-кратный концентрат сока алоэ вера. Сок алоэ вера может представлять собой приблизительно 5-кратный, 10-кратный, 15-кратный, 20-кратный, 25-кратный, 30-кратный, 35-кратный, 40-кратный, 45-кратный, 50-кратный, 55-кратный, 60-кратный, 65-кратный, 70-кратный, 75-кратный, 80-кратный, 85-кратный, 90-кратный, 95-кратный, 100-кратный, 5-кратный, 10-кратный, 15-кратный, 20-кратный, 25-кратный, 30-кратный, 35-кратный, 40-кратный, 45-кратный, 50-кратный, 55-кратный, 60-кратный, 65-кратный, 70-кратный, 75-кратный, 80-кратный, 85-кратный, 90-кратный, 95-кратный, 100-кратный, 105-кратный, 110-кратный, 115-кратный, 120-кратный, 125-кратный, 130-кратный, 135-кратный, 140-кратный, 145-кратный, 150-кратный, 155-кратный, 160-кратный, 165-кратный, 170-кратный, 175-кратный, 180-кратный, 185-кратный, 190-кратный, 195-кратный, 200-кратный концентрат сока алоэ вера или любое число в промежутке между данными значениями.
[0093] Продукт алоэ вера может также содержать модификатор кислотности. Модификатор кислотности может представлять собой лимонную кислоту, соль лимонной кислоты, яблочную кислоту, соль яблочной кислоты, уксусную кислоту, соль уксусной кислоты, молочную кислоту, соль молочной кислоты, винную кислоту или соль винной кислоты, муравьиную кислоту и соль, пропионовую кислоту и соль, масляную кислоту и соль, валериановую кислоту и соль, фосфорную кислоту и соль Согласно одному варианту реализации концентрация модификатора кислотности может составлять 0,1-10%. В некоторых вариантах реализации концентрация модификатора кислотности может составлять 0,2-5%. Согласно другому варианту реализации концентрация модификатора кислотности может составлять точно или приблизительно 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1,0%, 1,1%, 1,2%, 1,3%, 1,4%, 1,5%, 1,6%, 1,7%, 1,8%, 1,9%, 2,0%, 2,1%, 2,2%, 2,3%, 2,4%, 2,5%, 2,6%, 2,7%, 2,8%, 2,9%, 3,0%, 3,1%, 3,2%, 3,3%, 3,4%, 3,5%, 3,6%, 3,7%, 3,8%, 3,9%, 4,0%, 4,1%, 4,2%, 4,3%, 4,4%, 4,5%, 4,6%, 4,7%, 4,8%, 4,9%, 5,0%, 5,1%, 5,2%, 5,3%, 5,4%, 5,5%, 5,6%, 5,7%, 5,8%, 5,9%, 6,0%, 6,1%, 6,2%, 6,3%, 6,4%, 6,5%, 6,6%, 6,7%, 6,8%, 6,9%, 7,0%, 7,1%, 7,2%, 7,3%, 7,4%, 7,5%, 7,6%, 7,7%, 7,8%, 7,9%, 8,0%, 8,1%, 8,2%, 8,3%, 8,4%, 8,5%, 8,6%, 8,7%, 8,8%, 8,9%, 9,0%, 9,1%, 9,2%, 9,3%, 9,4%, 9,5%, 9,6%, 9,7%, 9,8%, 9,9%, 10,0% или любое число в промежутке между данными значениями.
[0094] В некоторых вариантах реализации концентрация вспомогательного вещества составляет 0,01-2%. В некоторых вариантах реализации концентрация вспомогательного вещества составляет 0,01-0,5%. Согласно другому варианту реализации концентрация модификатора кислотности может составлять точно или приблизительно 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1,0%, 1,1%, 1,2%, 1,3%, 1,4%, 1,5%, 1,6%, 1,7%, 1,8%, 1,9%, 2,0% или любое число в промежутке между данными значениями.
[0095] В некоторых вариантах реализации вспомогательное вещество в продукте алоэ вера представляет собой консервант. Консервант может представлять собой сорбиновую кислоту, соль сорбиновой кислоты, бензойную кислоту, соль бензойной кислоты, молочную кислоту, соль молочной кислоты, лимонную кислоту, соль лимонной кислоты, яблочную кислоту, соль яблочной кислоты, уксусную кислоту, соль уксусной кислоты, винную кислоту, соль винной кислоты, экстракт розмарина, экстракт любистка, хитозан, эфирное масло шалфея, тимоловое масло, низин, е-полилизин, экстракт косточек винограда, экстракт ягод годжи и или комбинацию указанных веществ.
[0096] В некоторых вариантах реализации вспомогательное вещество представляет собой порошок целлюлозы, модифицированный крахмал, микрокристаллическую целлюлозу, стеарат магния, стеариновую кислоту, кроскармеллозу натрия, карбонат кальция, дикальция фосфат или диоксид кремния.
[0097] В некоторых вариантах реализации продукт Алоэ вера содержит вкусоароматическое вещество. В некоторых вариантах реализации вкусоароматическое вещество представляет собой одно или более веществ из сахара, меда, фруктозы, декстрозы, мальтодекстрина или камедей, природных и/или искусственных вкусоароматических веществ, определенных в разделе 21 свода федеральных правил США 101.22(a)(3) и в регламенте (ЕС) №1334/2008.
[0098] В некоторых вариантах реализации концентрация вкусоароматического вещества составляет 0,1-50%. Согласно другому варианту реализации концентрация вкусоароматического вещества может составлять точно или приблизительно 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1,0%, 1,1%, 1,2%, 1,3%, 1,4%, 1,5%, 1,6%, 1,7%, 1,8%, 1,9%, 2,0%, 2,1%, 2,2%, 2,3%, 2,4%, 2,5%, 2,6%, 2,7%, 2,8%, 2,9%, 3,0%, 3,1%, 3,2%, 3,3%, 3,4%, 3,5%, 3,6%, 3,7%, 3,8%, 3,9%, 4,0%, 4,1%, 4,2%, 4,3%, 4,4%, 4,5%, 4,6%, 4,7%, 4,8%, 4,9%, 5,0%, 5,1%, 5,2%, 5,3%, 5,4%, 5,5%, 5,6%, 5,7%, 5,8%, 5,9%, 6,0%, 6,1%, 6,2%, 6,3%, 6,4%, 6,5%, 6,6%, 6,7%, 6,8%, 6,9%, 7,0%, 7,1%, 7,2%, 7,3%, 7,4%, 7,5%, 7,6%, 7,7%, 7,8%, 7,9%, 8,0%, 8,1%, 8,2%, 8,3%, 8,4%, 8,5%, 8,6%, 8,7%, 8,8%, 8,9%, 9,0%, 9,1%, 9,2%, 9,3%, 9,4%, 9,5%, 9,6%, 9,7%, 9,8%, 9,9%, 10,0%, 10,1%, 10,2%, 10,3%, 10,4%, 10,5%, 10,6%, 10,7%, 10,8%, 10,9%,11,0%, 11,1%, 11,2%, 11,3%, 11,4%, 11,5%, 11,6%, 11,7%, 11,8%, 11,9%,12,0%, 12,1%, 12,2%, 12,3%, 12,4%, 12,5%, 12,6%, 12,7%, 12,8%, 12,9%,13,0%, 13,1%, 13,2%, 13,3%, 13,4%, 13,5%, 13,6%, 13,7%, 13,8%, 13,9%, 14,0%, 14,1%, 14,2%, 14,3%, 14,4%, 14,5%, 14,6%, 14,7%, 14,8%, 14,9%, 15,0%, 15,1%, 15,2%, 15,3%, 15,4%, 15,5%, 15,6%, 15,7%, 15,8%, 15,9%, 16,0%, 16,1%, 16,2%, 16,3%, 16,4%, 16,5%, 16,6%, 16,7%, 16,8%, 16,9%, 17,0%, 17,1%, 17,2%, 17,3%, 17,4%, 17,5%, 17,6%, 17,7%, 17,8%, 17,9%, 18,0%, 18,1%, 18,2%, 18,3%, 18,4%, 18,5%, 18,6%, 18,7%, 18,8%, 18,9%, 19,0%, 19,1%, 19,2%, 19,3%, 19,4%, 19,5%, 19,6%, 19,7%, 19,8%, 19,9%, 20,0%, 20,1%, 20,2%, 20,3%, 20,4%, 20,5%, 20,6%, 20,7%, 20,8%, 20,9%, 21,0%, 21,1%, 21,2%, 21,3%, 21,4%, 21,5%, 21,6%, 21,7%, 21,8%, 21,9%, 22,0%, 22,1%, 22,2%, 22,3%, 22,4%, 22,5%, 22,6%, 22,7%, 22,8%, 22,9%, 23,0%, 23,1%, 23,2%, 23,3%, 23,4%, 23,5%, 23,6%, 23,7%, 23,8%, 23,9%, 24,0%, 24,1%, 24,2%, 24,3%, 24,4%, 24,5%, 24,6%, 24,7%, 24,8%, 24,9%, 25,0%, 25,1%, 25,2%, 25,3%, 25,4%, 25,5%, 25,6%, 25,7%, 25,8%, 25,9%, 26,0%, 26,1%, 26,2%, 26,3%, 26,4%, 26,5%, 26,6%, 26,7%, 26,8%, 26,9%, 27,0%, 27,1%, 27,2%, 27,3%, 27,4%, 27,5%, 27,6%, 27,7%, 27,8%, 27,9%,28,0%, 28,1%, 28,2%, 28,3%, 28,4%, 28,5%, 28,6%, 28,7%, 28,8%, 28,9%, 29,0%, 29,1%, 29,2%, 29,3%, 29,4%, 29,5%, 29,6%, 29,7%, 29,8%, 29,9%, 30,0%, 30,1%, 30,2%, 30,3%, 30,4%, 30,5%, 30,6%, 30,7%, 30,8%, 30,9%, 31,0%, 31,1%, 31,2%, 31,3%, 31,4%, 31,5%, 31,6%, 31,7%, 31,8%, 31,9%, 32,0%, 32,1%, 32,2%, 32,3%, 32,4%, 32,5%, 32,6%, 32,7%, 32,8%, 32,9%, 33,0%, 33,1%, 33,2%, 33,3%, 33,4%, 33,5%, 33,6%, 33,7%, 33,8%, 33,9%, 34,0%, 34,1%, 34,2%, 34,3%, 34,4%, 34,5%, 34,6%, 34,7%, 34,8%, 34,9%, 35,0%, 35,1%, 35,2%, 35,3%, 35,4%, 35,5%, 35,6%, 35,7%, 35,8%, 35,9%, 36,0%, 36,1%, 36,2%, 36,3%, 36,4%, 36,5%, 36,6%, 36,7%, 36,8%, 36,9%, 37,0%, 37,1%, 37,2%, 37,3%, 37,4%, 37,5%, 37,6%, 37,7%, 37,8%, 37,9%, 38,0%, 38,1%, 38,2%, 38,3%, 38,4%, 38,5%, 38,6%, 38,7%, 38,8%, 38,9%, 39,0%, 39,1%, 39,2%, 39,3%, 39,4%, 39,5%, 39,6%, 39,7%, 39,8%, 39,9%, 40,0%, 40,1%, 40,2%, 40,3%, 40,4%, 40,5%, 40,6%, 40,7%, 40,8%, 40,9%, 41,0%, 41,1%, 41,2%, 41,3%, 41,4%, 41,5%, 41,6%, 41,7%, 41,8%, 41,9%, 42,0%, 42,1%, 42,2%, 42,3%, 42,4%, 42,5%, 42,6%, 42,7%, 42,8%, 42,9%, 43,0%, 43,1%, 43,2%, 43,3%, 43,4%, 43,5%, 43,6%, 43,7%, 43,8%, 43,9%, 44,0%, 44,1%, 44,2%, 44,3%, 44,4%, 44,5%, 44,6%, 44,7%, 44,8%, 44,9%, 45,0%, 45,1%, 45,2%, 45,3%, 45,4%, 45,5%, 45,6%, 45,7%, 45,8%, 45,9%, 46,0%, 46,1%, 46,2%, 46,3%, 46,4%, 46,5%, 46,6%, 46,7%, 46,8%, 46,9%, 47,0%, 47,1%, 47,2%, 47,3%, 47,4%, 47,5%, 47,6%, 47,7%, 47,8%, 47,9%, 48,0%, 48,1%, 48,2%, 48,3%, 48,4%, 48,5%, 48,6%, 48,7%, 48,8%, 48,9%, 49,0%, 49,1%, 49,2%, 49,3%, 49,4%, 49,5%, 49,6%, 49,7%, 49,8%, 49,9%, 50,0% или любое число в промежутке между данными значениями.
[0099] Композицию алоэ вера можно применять в качестве компонента питательной добавки. Питательная добавка может представлять собой таблетку, капсулу, мягкую таблетку, жевательную таблетку, растворяющуюся во рту таблетку, таблетку для рассасывания, порошок или жидкость.
[0100] В некоторых вариантах реализации количество обесцвеченного сока алоэ вера в питательной добавке составляет 1-500 г. В некоторых вариантах реализации количество обесцвеченного сока алоэ вера в питательной добавке составляет 5-300 г. В некоторых вариантах реализации количество обесцвеченного сока алоэ вера в питательной добавке составляет точно или приблизительно 1 г, 5 г, 10 г, 15 г, 20 г, 25 г, 30 г, 35 г, 40 г, 45 г, 50 г, 55 г, 60 г, 65 г, 70 г, 75 г, 80 г, 85 г, 90 г, 95 г, 100 г, 105 г, 110 г, 115 г, 120 г, 125 г, 130 г, 135 г, 140 г, 145 г, 150 г, 155 г, 160 г, 165 г, 170 г, 175 г, 180 г, 185 г, 190 г, 195 г, 200 г, 205 г, 210 г, 215 г, 220 г, 225 г, 230 г, 235 г, 240 г, 245 г, 250 г, 255 г, 260 г, 265 г, 270 г, 275 г, 280 г, 285 г, 290 г, 295 г, 300 г, 305 г, 310 г, 315 г, 320 г, 325 г, 330 г, 335 г, 340 г, 345 г, 350 г, 355 г, 360 г, 365 г, 370 г, 375 г, 380 г, 385 г, 390 г, 395 г, 400 г, 405 г, 410 г, 415 г, 420 г, 425 г, 430 г, 435 г, 440 г, 445 г, 450 г, 455 г, 460 г, 465 г, 470 г, 475 г, 480 г, 485 г, 490 г, 495 г, 500 г или любое число в промежутке между данными значениями.
[0101] В некоторых вариантах реализации количество обесцвеченного сока алоэ вера в питательной добавке составляет 1-5 мг. В некоторых вариантах реализации количество обесцвеченного сока алоэ вера в питательной добавке составляет 50-300 мг.
III. Получение продукта алоэ вера
[0102] Согласно одному варианту реализации продукт алоэ вера можно получить в большом резервуаре для смешивания, таком как резервуар для смешивания объемом 2000 галлонов. В резервуар при перемешивании содержимого резервуара можно добавить сок алоэ вера и вспомогательные вещества. Затем в резервуар можно добавить одно или более вкусоароматических веществ. Конечный рН смеси может составлять приблизительно 2,9-3,4. Конечный рН смеси может составлять точно или приблизительно 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3 или 3,4 или любое число в промежутке между данными значениями. Можно добавить воду, чтобы наполнить резервуар для смешивания до полной емкости. Содержимое резервуара можно затем подвергнуть обработке в теплообменном устройстве при температуре точно или приблизительно 195°F для образования продукта. Перед розливом продукт можно охладить до температуры окружающей среды.
[0103] Согласно другому варианту реализации продукт Алоэ вера можно получить в большом резервуаре для смешивания, таком как резервуар для смешивания из нержавеющей стали объемом 40 галлонов. В резервуар при перемешивании содержимого резервуара можно добавить сок алоэ вера и вспомогательные вещества. При перемешивании можно добавить очищенный порошок сухого сока алоэ вера и одно или более вкусоароматических веществ. Перемешивание можно продолжать до тех пор, пока порошок сухого сока алоэ вера и одно или более вкусоароматических веществ не растворятся полностью. Также можно добавить дополнительные вкусоароматические вещества и/или подсластители. Можно добавить воду, чтобы наполнить резервуар для смешивания до полной емкости. Содержимое резервуара можно затем подвергнуть обработке в теплообменном устройстве при температуре точно или приблизительно 195°F для образования продукта и можно охладить перед розливом до температуры окружающей среды.
[0104] Согласно другому варианту реализации продукт алоэ вера можно получить в измельчителе. В измельчитель можно добавить порошок сухого сока алоэ вера, мальтодекстрин и сахар и перемешивать в течение точно или приблизительно 5 минут. Перемешивание можно продолжать в течение точно или приблизительно 6, 7, 8, 9 или 10 минут. В полиэтиленовом пакете или другом подходящем контейнере можно объединить вспомогательные вещества, вещества, предотвращающие слеживаемость, красящие вещества и вкусоароматические вещества. Затем содержимое полиэтиленового пакета можно добавить в измельчитель. Содержимое измельчителя можно перемешивать до гомогенности для образования конечного продукта. Конечный продукт можно объединить с точно или приблизительно 4-8 унциями воды для употребления. В некоторых вариантах реализации конечный продукт можно объединить с точно или приблизительно 5, 6 или 7 унциями воды для употребления.
[0105] Согласно одному варианту реализации продукт Алоэ вера можно получить в v-образном измельчителе. В измельчитель можно добавить очищенный порошок сухого сока алоэ вера, вспомогательные вещества и вещества, предотвращающие слеживаемость, и перемешивать в течение точно или приблизительно 10 минут. Содержимое можно перемешивать в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 минут или любое число в промежутке между данными значениями. В измельчитель можно добавить смазывающие вещества, и содержимое можно перемешивать в течение точно или приблизительно 4 дополнительных минут для образования необработанного порошка. Необработанный порошок можно затем инкапсулировать в твердую капсулу №«0» с заданной массой содержимого точно или приблизительно 474 мг. Масса содержимого может варьировать от точно или приблизительно 450,3 мг до 497,7 мг. Масса содержимого может составлять точно или приблизительно 450 мг, 455 мг, 460 мг, 465 мг, 470 мг, 475 мг, 480 мг, 485 мг или 490 мг или любое число в промежутке между данными значениями. Время дезинтеграции полученной в итоге капсулы может составлять точно или приблизительно не более 30 минут. Время дезинтеграции полученной в итоге капсулы может составлять точно или приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 минут или любое число в промежутке между данными значениями.
[0106] Согласно другому варианту реализации продукт Алоэ вера можно получить в v-образном измельчителе. В измельчитель можно добавить очищенный порошок сухого сока алоэ вера, вспомогательные вещества, объемообразующие вещества и связывающие вещества и перемешивать в течение точно или приблизительно 15 минут. Содержимое можно перемешивать в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 минут или любое число в промежутке между данными значениями. В измельчитель можно добавить смазывающие вещества, и содержимое можно перемешивать в течение точно или приблизительно 3 дополнительных минут для образования необработанного продукта. Необработанный продукт можно поместить в переносной контейнер для таблетирования. Таблетирование можно осуществлять с помощью пресса для таблетирования, эксплуатируемого в соответствии с обычными процедурами. Пресс можно настроить для получения заданной массы таблетки точно или приблизительно 607 мг. Пресс можно настроить для получения заданной массы таблетки точно или приблизительно от 576,7 мг до 637,4 мг. Пресс можно настроить для получения заданной массы таблетки точно или приблизительно 575 мг, 580 мг, 585 мг, 590 мг, 595 мг, 600 мг, 605 мг, 610 мг, 615 мг, 620 мг, 625 мг, 630 мг, 635 мг или 640 мг или любое число в промежутке между данными значениями. Твердость таблетки может составлять точно или приблизительно 6-12 килопонд. Твердость таблетки может составлять точно или приблизительно 6 килопонд, 7 килопонд, 8 килопонд, 9 килопонд, 10 килопонд, 11 килопонд или 12 килопонд или любое количество килопонд в пределах диапазона, определяемого любыми двумя из вышеупомянутых значений. Время дезинтеграции таблетки может составлять точно или приблизительно не более 30 минут. Время дезинтеграции таблетки может составлять точно или приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 минут или любое число в промежутке между данными значениями.
[0107] В некоторых вариантах реализации сок цельного листа алоэ вера можно изготовить из зрелых листьев алоэ вера. Зрелые листья алоэ вера можно собрать и транспортировать на перерабатывающий завод в течение точно или приблизительно 24 часов после сбора. Листья можно промыть и продезинфицировать хлорированной водой. Верхушку и черешок листьев можно удалить механическим способом. Затем оставшуюся часть листа можно пропустить через гомогенизатор, а после этого направить в резервуар для обработки. В резервуар можно добавить подходящее количество фермента при температуре точно или приблизительно 50-60°С. Через точно или приблизительно 30 минут температуру можно увеличить до точно или приблизительно 85°С. Затем сырой сок можно пропустить через устройство для окончательной обработки с целью удаления клеточных волокон. После этого сок можно пропустить через активированный уголь с целью удаления алоина до содержания больше, чем точно или приблизительно 0,1 ч./млн. Затем сок можно применять в исходном виде. В некоторых вариантах реализации сок можно дополнительно концентрировать посредством выпаривания в вакууме до концентрата сока алоэ вера.
[0108] В некоторых вариантах реализации сухой сок из листьев алоэ вера можно изготовить из зрелых листьев алоэ вера. Зрелые листья алоэ вера можно собрать и транспортировать на перерабатывающий завод в течение точно или приблизительно 24 часов после сбора. Листья можно промыть и продезинфицировать хлорированной водой. Верхушку и черешок листьев можно удалить механическим способом. Затем оставшуюся часть листа можно пропустить через гомогенизатор, а после этого направить в резервуар для обработки. В резервуар можно добавить подходящее количество фермента при температуре точно или приблизительно 50-60°С. Через точно или приблизительно 30 минут температуру можно увеличить до точно или приблизительно 85°С. Затем сырой сок можно пропустить через устройство для окончательной обработки с целью удаления клеточных волокон. После этого сок можно пропустить через активированный уголь с целью удаления алоина до содержания больше, чем точно или приблизительно 0,1 ч./млн. Затем сок можно применять в исходном виде. Сок можно дополнительно переработать в порошок сухого сока алоэ вера методом сухого распыления.
[0109] В некоторых вариантах реализации сок внутренней части листа алоэ вера можно изготовить из природных листьев алоэ вера. Зрелые листья алоэ вера можно собрать и транспортировать на перерабатывающий завод в течение точно или приблизительно 24 часов после сбора. Листья можно промыть и продезинфицировать хлорированной водой. Верхушку и черешок листьев можно удалить механическим способом. Затем оставшуюся часть листа можно пропустить через гомогенизатор, а после этого направить в резервуар для обработки. В резервуар можно добавить подходящее количество фермента при температуре точно или приблизительно 50-60°С. Через точно или приблизительно 30 минут температуру можно увеличить до точно или приблизительно 85°С. Затем сырой сок можно пропустить через устройство для окончательной обработки с целью удаления клеточных волокон. После этого сок можно пропустить через активированный уголь с целью удаления алоина до содержания больше, чем точно или приблизительно 0,1 ч./млн. Затем сок можно применять в исходном виде. В некоторых вариантах реализации сок можно дополнительно концентрировать посредством выпаривания в вакууме до концентрата сока алоэ вера.
[0110] В некоторых вариантах реализации сок внутренней части листа алоэ вера можно изготовить из природных листьев алоэ вера. Зрелые листья алоэ вера можно собрать и транспортировать на перерабатывающий завод в течение точно или приблизительно 24 часов после сбора. Листья можно промыть и продезинфицировать хлорированной водой. Верхушку и черешок листьев можно удалить механическим способом. Затем оставшуюся часть листа можно пропустить через гомогенизатор, а после этого направить в резервуар для обработки. В резервуар можно добавить подходящее количество фермента при температуре точно или приблизительно 50-60°С. Через точно или приблизительно 30 минут температуру можно увеличить до точно или приблизительно 85°С. Затем сырой сок можно пропустить через устройство для окончательной обработки с целью удаления клеточных волокон. После этого сок можно пропустить через активированный уголь с целью удаления алоина до содержания больше, чем точно или приблизительно 0,1 ч./млн. Затем сок можно применять в исходном виде. Сок можно дополнительно переработать в порошок сухого сока алоэ вера методом сухого распыления.
[0111] В некоторых вариантах реализации обогащенные ПС фракции алоэ вера можно получить посредством растворения сухого сока алоэ вера в 85% этиловом спирте. Затем раствор можно центрифугировать, супернатант отбросить, а не растворимое в этаноле твердое вещество можно собрать. Твердое вещество можно высушить посредством соответствующих способов высушивания, таких как лиофилизация или технология reflectance window drying (высушивание в окне отражения).
IV. Лечение
[0112] В некоторых вариантах реализации композицию алоэ вера, описанную в настоящем документе, можно вводить млекопитающему для улучшения состояния и количества микробиома. В некоторых вариантах реализации млекопитающее представляет собой человека.
[0113] В некоторых вариантах реализации композицию алоэ вера, описанную в настоящем документе, можно вводить млекопитающему для вызова благоприятных эффектов в отношении микробиома человека. Такие благоприятные эффекты в отношении микробиома человека включают, без ограничения: увеличение продукции короткоцепочечных жирных кислот, увеличение суммарной микробной популяции в ободочной кишке, увеличение продукции ацетата в проксимальном отделе ободочной кишки, увеличение продукции пропионата в проксимальном отделе ободочной кишки, увеличение популяции суммарных бактерий в проксимальном отделе ободочной кишки, увеличение популяции временной концентрации бифидобактерий в проксимальном отделе ободочной кишки, мощный противовоспалительный ответ в кишечнике, снижение проницаемости барьера кишечника в системе совместного культивирования клеток Соса-2 и макрофагов ТНР1 или успокаивающее действие на кишечник. Проницаемость стенки кишечника можно измерять любым подходящим способом, известным специалисту в данной области техники. В некоторых вариантах реализации проницаемость стенки кишечника можно измерять на основании параклеточного транспорта красителя Lucifer Yellow в системе совместного культивирования клеток Сасо-2 и макрофагов ТНР1.
[0114] В некоторых вариантах реализации композицию алоэ вера, описанную в настоящем документе, можно вводить млекопитающему для обеспечения благоприятного эффекта у млекопитающего. Благоприятный эффект может представлять собой благоприятный антиоксидантный эффект. Такие антиоксидантные благоприятные эффекты включают, без ограничения: биологически значимую антиоксидантную защиту в условиях окислительного стресса, активаторные и ингибиторные сигналы иммунным клеткам, индукцию двухфазного ответа иммунных клеток, где противовоспалительные соединенияя могут демонстрировать ответ исключительно в более низких дозах, тогда как активирующие иммунитет вещества активны в различном диапазоне доз, и мощный противовоспалительный ответ в кишечнике.
[0115] В некоторых вариантах реализации композицию алоэ вера, раскрытую в настоящем документе, можно применять для лечения повышенной проницаемости кишечника или других связанных симптомов.
[0116] В некоторых вариантах реализации композицию алоэ вера, раскрытую в настоящем документе, можно применять для лечения хронического воспаления, иммунодефицита, иммунологических нарушений или других связанных симптомов.
V. Эксперимент SHIME
[0117] С целью оценки возможных свойств ежедневных повторяющихся доз раскрытого в настоящем документе продукта алоэ можно применять систему SHIME. Система SHIME представляет собой непрерывную модель in vitro, которая позволяет культивировать сложную микробную экосистему кишечника в течение длительного периода времени и в репрезентативных условиях. Более того, система SHIME позволяет имитировать повторяющееся пероральное поступление исследуемого продукта. Установка реактора представляет собой желудочно-кишечный тракт взрослого человека.
[0118] SHIME состоит из последовательности пяти реакторов, имитирующих различные части желудочно-кишечного тракта человека, как представлено на фигуре 1. Первые два реактора работают согласно принципу наполнения и опорожнения для имитации различных этапов поглощения и переваривания пищи с перистальтическими насосами, которые добавляют определенное количество пищи SHIME (140 мл 3 раза в день), а также жидкость поджелудочной железы и желчь (60 мл 3 раза в день), соответственно, в компартмент желудка (V1) и двенадцатиперстной кишки (V2) и опорожняют соответствующие реакторы через установленные интервалы времени. Последние три компартмента представляют собой реакторы с непрерывным перемешиванием с постоянным объемом и контролем рН. Время выдерживания и рН различных сосудов выбирают с целью имитации условий in vivo в различных частях желудочно-кишечного тракта. Совокупное время пребывания в последних трех сосудах, имитирующих толстый кишечник, составляет 72 ч. После инокуляции фекальной микробиоты данные реакторы имитируют восходящую (V3), поперечную (V4) и нисходящую (V5) ободочную кишку. Получение инокулюма, время выдерживания, рН, параметры температуры и условия питательной композиции реактора представлены в следующей таблице.
[0119] Систему SHIME интенсивно применяли в течение более 15 лет в рамках как научных, так и промышленных проектов, и она была подтверждена с использованием параметров in vivo. После стабилизации микробного сообщества в различных участках ободочной кишки в трех компартментах ободочной кишки устанавливается репрезентативное микробное сообщество, которое отличается в различных участках ободочной кишки составом и функциями.
А. Анализ состава и активности микробного сообщества
[0120] В течение всего эксперимента можно контролировать множество микробных параметров. Данные измерения могут являться необходимыми для оценки рабочих характеристик модели и обеспечения мониторинга основных изменений состава и активности микробного сообщества в связи с лечением по сравнению с контрольным периодом.
[0121] Образцы короткоцепочечных жирных кислот (КЖК) могут быть отобраны 3 раза в неделю из всех компартментов ободочной кишки для анализа концентрации уксусной кислоты, пропионовой кислоты, изомасляной кислоты, масляной кислоты, изовалериановой кислоты, валериановой кислоты, изокапроновой кислоты и капроновой кислоты. Более того, 3 раза в неделю можно отбирать образцы из желудка и тонкого кишечника для оценки того, высвобождаются или нет КЖК, запасенные в продуктах, в верхних отделах ЖКТ.
[0122] Аммоний представляет собой один из маркеров протеолиза. Для проведения анализа аммония можно отбирать образцы 3 раза в неделю из всех компартментов ободочной кишки. Поскольку продукция аммония является, главным образом, результатом разрушения белка и связана с прямыми и опосредованными пагубными эффектами в отношении здоровья, снижение продукции аммония следует считать благоприятным. Дополнительно, концентрации аммония в SHIME можно также рассматривать в качестве маркера ограниченной доступности субстрата для бактерий в течение периода лечения или в качестве маркера специфической ферментации продукта самого по себе.
[0123] Кишечник человека содержит как продуцирующие лактат, так и утилизирующие лактат бактерии. Лактат продуцируется молочнокислыми бактериями и снижает рН окружающей среды, выступая также в качестве антимикробного средства. Другие микроорганизмы могут также быстро превращать лактат в ацетат, бутират и пропионат. Образцы можно отбирать 1 раз в неделю из всех компартментов ободочной кишки.
[0124] Потребление кислоты и основания можно регистрировать для оценки закисления ободочной кишки в течение эксперимента.
[0125] Дополнительные образцы можно отбирать для анализа взаимодействия хозяин-бактерия и эффекта исследуемых продуктов в отношении потенциальных маркеров, связанных с воспалением и проницаемостью стенки кишечника.
В. Состав микробного сообщества
[0126] Количественная ПЦР (кПЦР) представляет собой молекулярную методику, основанную на амплификации специфичных бактериальных последовательностей (генов 16S рРНК), в сочетании с количественным определением числа данных специфичных последовательностей в микробной экосистеме в различные временные точки. кПЦР, как правило, применяют для количественного определения суммарного бактериального сообщества, конкретных групп бактерий или конкретных видов бактерий. Поскольку данная методика не зависит от (отсутствия) способности бактерий поддаваться культивированию, данные, полученные этим методом, обеспечивают более достоверный обзор количественных эффектов в отношении микробного сообщества в связи с конкретными вариантами лечения.
[0127] Для контроля суммарных бактерий, бифидобактерий, лактобацилл, фирмикутов и бактероидов можно применять конкретные протоколы количественной ПЦР (кПЦР).
С. Анализы взаимодействия хозяин-микробиота
[0128] Образцы, отобранные из различных участков ободочной кишки системы SHIME, применяли для оценки эффекта исследуемых продуктов в отношении воспаления кишки. Например, на фигуре 4 представлена модель совместной культуры.
[0129] Для установки системы клетки Сасо-2 можно выращивать в полупроницаемых вкладышах до подобного эритроцитам созревания. Через 14 дней может образоваться функциональный поляризованный монослой, а затем вкладыши можно поместить сверху на активированные ТНР-1-макрофаги. Присутствие ТНР1 может вызвать повреждение эпителия Сасо-2, что нарушает целостность барьера (снижает ТЭЭС). Наконец, с базолатеральной (БЛ) стороны можно добавить ЛПС, чтобы вызвать воспаление (увеличение уровней провоспалительных цитокинов).
[0130] Эту имитирующую ВЗК (воспалительное заболевание кишечника) модель можно применять для исследования эффекта веществ, которые могут защищать целостность эпителиального барьера кишечника (посредством вызова увеличения ТЭЭС) и могут снижать воспаление (посредством снижения уровня провоспалительных цитокинов и посредством увеличения уровня противовоспалительных цитокинов). Можно проводить анализы посредством осуществления контакта суспензии SHIME со слоем клеток. Уникальный аспект данного подхода заключается в том, что становится возможной оценка эффекта, вызванного продуктом и его метаболитами, которые продуцируются микробиотой кишки в течение этапов пищеварения (а не только чистым продуктом самим по себе). Проводимые анализы могут включать:
• Измерения трансэпителиального электрического сопротивления (ТЭЭС) как показателя целостности однослойной мембраны энтероцитов и снижения проницаемости.
• Оценку проникновения красителя Lucifer Yellow в БЛ компартмент как показателя проницаемости монослоя.
• Измерение продукции цитокинов в БЛ компартменте (ИЛ-8, ИЛ-6, ТФР-β, ИЛ-10) и активности NF-κВ после осуществления контакта с суспензией SHIME.
D. Короткоцепочечные жирные кислоты (КЖК)
[0131] КЖК представляют собой обычные конечные продукты преимущественно сахарорасщепляющей ферментации под действием бактерий кишечника. Профили КЖК состоят, главным образом, из ацетата, пропионата и бутирата с незначительными количествами изомасляной, валериановой и изовалериановой кислоты. Хотя ацетат может поглощаться из кишки и использоваться хозяином в качестве энергетического субстрата, бутират выступает в качестве главного источника энергии для эпителия кишки и оказывает подтвержденные эффекты против воспаления и рака ободочной кишки. Наконец, пропионат характеризуется подобной бутирату местной активностью в кишке, однако он также транспортируется в печень, где, как было показано, оказывает положительные эффекты, направленные на снижение уровня холестерола, и эффекты гликемического контроля. По этой причине бутират и пропионат считают более благоприятными для здоровья хозяина по сравнению с ацетатом, и благоприятной считают модуляцию профилей микробной ферментации в кишке в сторону увеличения продукции бутирата и/или пропионата.
E. Анализ лактата
[0132] Кишечник человека содержит как продуцирующие лактат, так и утилизирующие лактат бактерии. Лактат продуцируется молочнокислыми бактериями и снижает рН окружающей среды, выступая также в качестве антимикробного средства. Другие микроорганизмы могут также быстро превращать лактат в ацетат, бутират и пропионат.
[0133] Лактат представляет собой промежуточный продукт метаболизма для продукции других КЖК, и вследствие этого его концентрация колеблется в течение времени. Временное накопление лактата также зависит от метаболических возможностей микробного сообщества и каждого реактора ободочной кишки.
F. Изменение рН в режиме реального времени
[0134] Чтобы убедиться, что поддерживаются оптимальные окружающие условия, рН в системе SHIME контролировали с помощью рН-метров в следующих диапазонах: 5,6-5,9 (ПООК); 6,5-6,8 (ДООК). Однако после стабилизации микробного сообщества в различных реакторах (начиная с 2 недель после инокуляции) микробное сообщество может саморегулироваться, и потребление кислоты и основания обычно является низким.
[0135] В течение лечения, когда бактерии приспосабливаются к исследуемому продукту и продуцируют, например, увеличенные количества КЖК, окружающая среда в реакторах может подкисляться, что приводит к дополнительному контролю рН посредством введения в соответствующие реакторы большего количества основания. В данном контексте степень подкисления в течение эксперимента можно использовать в качестве показателя интенсивности метаболизма бактерий.
G. Анализ состава микробного сообщества
[0136] кПЦР представляет собой молекулярную методику, основанную на амплификации специфичных бактериальных последовательностей (генов 16S рРНК) в сочетании с количественным определением числа данных специфичных последовательностей в микробной экосистеме в различные временные точки. Поскольку данная методика не зависит от (отсутствия) способности бактерий поддаваться культивированию, данные, полученные этим методом, обеспечивают более достоверный обзор количественных эффектов в отношении микробного сообщества.
H. Эффект в отношении модуляции стенки кишечника
1. Проницаемость кишечного барьера и воспаление
[0137] Образцы, отобранные из различных компартментов SHIME, можно привести в контакт с монослоем клеток Сасо-2 для оценки эффекта исследуемого продукта и его метаболитов в отношении проницаемости стенки кишечника. Данный эффект обычно оценивают на уровне плотных контактов. Последние представляют собой белки, которые удерживают смежные эпителиальные клетки вместе, посредством этого образуя практически непроницаемый барьер для жидкостей. Трансэпителиальное электрическое сопротивление (ТЭЭС) позволяет проводить измерение «плотности» данных структур, причем более высокое ТЭЭС соответствует более плотному барьеру. Когда возникает повреждение, данные белки изменяются, и барьерная функция утрачивается. В данном случае ТЭЭС снижается, и параклеточный транспорт (между клетками) жидкостей может увеличиться, как представлено на фигуре 16. Более того, эффект в отношении проницаемости кишечного барьера можно наблюдать посредством анализа параклеточного транспорта красителя Lucifer Yellow (ЛЖ). Химическое, механическое или запускаемое патогенами нарушение барьера может привести к поступлению бактерий из полости в собственную пластинку, как представлено на фигуре 17. Это активирует иммунную систему, которая переключается с физиологического «толерогенного» воспаления на пагубное патологическое воспаление.
[0138] Будет запущен каскад передачи воспалительных сигналов с продукцией сигнальных молекул, таких как провоспалительные цитокины (например, ФНО-α и ИЛ-1). Это вызовет продукцию хемокинов (таких как ИЛ-8) и молекул адгезии, что в свою очередь приведет к рекрутированию нейтрофилов и к продукции активных форм кислорода (АФК). АФК необходимы для уничтожения бактерий и для заполнения возможных повреждений в эпителиальной стенке; однако могут также вызывать разрушение ткани и приводить к воспалению.
[0139] Вследствие этого будут активированы цитокины, вовлеченные в устранение воспаления. Среди них присутствуют ИЛ-6 и ИЛ-10:
- ИЛ-6 посредством активации МСР-1 приведет к рекрутированию моноцитов/макрофагов, что будет способствовать клиренсу нейтрофилов. ИЛ-6 также способен ингибировать продукцию провоспалительных цитокинов, таких как ИЛ-1. Более того, ИЛ-6 оказывает положительный эффект в отношении регенерации эпителия кишечника и заживления ран.
- ИЛ-10 способен подавлять некоторые клетки врожденной и адаптивной иммунных систем, индуцировать активацию противовоспалительных молекул и усиливать функцию Т-регуляторных клеток (Treg), которые в свою очередь восстанавливают иммунный гомеостаз.
[0140] Когда эти механизмы выключения нарушены, и иммунный гомеостаз не может быть восстановлен, может возникнуть патология кишки, что может привести к хроническому воспалению. Применительно к воспалению ФНО-α представляет собой один из наиболее важных и опасных цитокинов, продуцируемых иммунной системой, поскольку он способен усиливать воспаление, как представлено на фигуре 18.
[0141] При отсутствии противодействия ФНО-α может привести к хроническому воспалению, а в случае острого воспаления даже к смерти. По этой причине терапию против ФНО-α широко применяют при некоторых хронических воспалительных состояниях, таких как ревматоидный артрит, анкилозирующий спондилит, воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) и псориаз. При ВЗК, например, терапию против ФНО-α обычно применяют для лечения хронического воспаления. Однако данная терапия характеризуется несколькими побочными эффектами: длительной потерей ответа на действие препарата, большей подверженностью инфекциям и большей частотой возникновения злокачественных новообразований (поскольку ФНО-α представляет собой противоопухолевую молекулу).
ПРИМЕРЫ
Пример 1
[0142] В резервуар для смешивания объемом 2000 галлонов добавляли 7442,5 кг очищенного сока алоэ вера. При включенной мешалке в резервуар добавляли 7,72 кг бензоата натрия и 7,72 кг сорбата калия. В партию добавляли вкусоароматические вещества. Добавляли 23,2 кг цитрата натрия и приблизительно 120-125 кг лимонной кислоты для получения конечного рН от 2,9 до 3,4. Добавляли воду для достижения заданного объема конечной массы партии. Получали 2000 галлонов конечного продукта. Затем смесь пропускали через теплообменное устройство при температуре 195°F и охлаждали до температуры окружающей среды перед розливом.
Пример 2
[0143] В резервуар для смешивания из нержавеющей стали объемом 40 галлонов закачивали 110 кг очищенной воды. При включенной мешалке в резервуар добавляли 0,12 кг бензоата натрия и 0,12 кг сорбата калия. При постоянном перемешивании добавляли 0,55 кг очищенного порошка сухого сока алоэ вера и 2,66 кг лимонной кислоты и перемешивали до полного растворения. Затем добавляли вкусоароматические вещества и подсластители. Получали 30 галлонов конечного продукта. Затем смесь пропускали через теплообменное устройство при температуре 195°F и охлаждали до температуры окружающей среды перед розливом.
Пример 3
[0144] В измельчитель добавляли 66,8 кг мальтодекстрина, 25 кг сахара, 5,63 кг очищенного порошка сухого сока алоэ и перемешивали в течение 5-10 минут. В полиэтиленовом пакете объединяли 0,53 кг яблочной кислоты, 0,25 кг бета-каротина, диоксид кремния и вкусоароматические вещества, а затем добавляли в измельчитель. Смесь перемешивали до однородности. 4 г порошка перемешивали с 4-8 жидкими унциями воды.
Пример 4
[0145] В v-образный измельчитель добавляли 383,6 кг порошка целлюлозы, 72,3 кг очищенного порошка сухого сока алоэ вера и 8,05 кг диоксида кремния, а затем перемешивали в течение 10 минут. После этого в измельчитель добавляли 5,05 кг стеарата магния и перемешивали в течение еще 4 минут. Порошок переносили в место для хранения для инкапсуляции. Порошок инкапсулировали в твердую капсулу №«0» с заданной массой содержимого 474 мг (диапазон от 450,3 мг до 497,7 мг). Время дезинтеграции капсулы составляло не более 30 минут.
Пример 5
[0146] В v-образный измельчитель добавляли 433,3 кг микрокристаллической целлюлозы, 72,3 кг очищенного порошка сухого сока алоэ вера, 16 кг крое карме л лозы натрия и 79,8 кг карбоната кальция. Смесь перемешивали в течение 15 минут. Затем в измельчитель добавляли 6 кг стеарата магния, и смесь перемешивали в течение еще 3 минут. Перемешанную смесь переносили в переносной контейнер для таблетирования. Пресс для таблетирования использовали в соответствии с обычной процедурой. Пресс настраивали для получения заданной массы таблетки 607 мг с диапазоном от 576,7 мг до 637,4 мг. Твердость таблетки составляла 6-12 килопонд, время дезинтеграции - не более 30 минут.
Пример 6
[0147] Сок цельного листа алоэ вера или порошок сухого сока из цельного листа алоэ вера получали следующим образом: зрелые листья собирали и транспортировали на перерабатывающий завод в течение 24 часов после сбора. Листья промывали и дезинфицировали хлорированной водой. Верхушку и черешок листа удаляли механическим способом. Оставшуюся часть листа пропускали через гомогенизатор, а после этого направляли в резервуар для обработки. При температуре от температуры окружающей среды до 60°С в резервуар добавляли от 0 до 500 г фермента. После удаления целлюлозного материала температуру сока повышали до 95°С. Сок пропускали через колонку с активированным углем с целью удаления алоина до содержания не более 0,1 ч./млн. Сок можно было применять в исходном виде. Однако его дополнительно концентрировали посредством выпаривания в вакууме до концентрата сока алоэ вера. В качестве альтернативы, сок можно было дополнительно переработать в порошок сухого сока алоэ вера методом сухого распыления, лиофилизации или технологии высушивания в окне отражения.
Пример 7
[0148] Сок внутренней части листа алоэ вера или порошок сухого сока внутренней части листа алоэ вера получали следующим образом: зрелые листья собирали и транспортировали на перерабатывающий завод в течение 24 часов после сбора. Листья промывали и дезинфицировали хлорированной водой. Верхушку, черешок и внешнюю кожицу листа удаляли механическим способом. Мякоть листа пропускали через гомогенизатор, а после этого направляли в резервуар для обработки. При температуре от температуры окружающей среды до 60°С в резервуар добавляли от 0 до 100 г фермента. После удаления целлюлозного материала температуру сока повышали до 85°С. Сок пропускали через колонку со смолой с целью удаления алоина до содержания не более 0,1 ч./млн. Сок можно было применять в исходном виде. Однако его дополнительно перерабатывали в порошок сухого сока алоэ вера методом сухого распыления.
Пример 8 - Оценка эффекта продукта на основе алоэ в желудочно-кишечном тракте человека с применением технологической платформы SHIME.
[0149] Целью данного эксперимента являлось сравнение следующих образцов:
• Эпикор (компания Embria, США) в дозе 1,5 г/л в среде SHIME; положительный контроль, который продемонстрировал иммуномодуляторные/противовоспалительные эффекты
• Материал алоэ, 3 порции в день (= 0,507 г/л в среде SHIME), как определено периодическими культурами; и
• Материал алоэ, в идеальном случае в дозе 6 порций в день (= 1,014 г/л в среде SHIME), как определено периодическими культурами.
[0150] Для применения в данном эксперименте систему TWINSHIME, представленную на фигуре 2, модифицировали в TripleSHIME. В TripleSHIME 6 компартментов ободочной кишки выступали в качестве серии ПООК-ДООК, ПООК-ДООК и ПООК-ДООК (ПООК = проксимальный отдел ободочной кишки; ДООК = дистальный отдел ободочной кишки) вместо классической серии восходящей, поперечной и нисходящей ободочной кишки, как представлено на фигуре 3.
[0151] Эксперимент SHIME включал 3 стадии: начало; контроль; и лечение. После инокуляции в реакторы ободочной кишки соответствующего фекального образца (от того же донора, которого использовали в эксперименте с краткосрочной партией), начальный период длительностью две недели позволял микробному сообществу дифференцироваться в различных реакторах в зависимости от местных окружающих условий. Эксперимент начинали в течение контрольного периода, в котором в модель вводили дозы стандартной пищи SHIME в течение 14 дней. Обычная базовая среда содержала следующие компоненты: арабиногалактан (1 г/л), пектин (2 г/л), ксилан (1 г/л), крахмал (4,2 г/л), глюкозу (0,4 г/л), дрожжевой экстракт (3 г/л), пептон (1 г/л), муцин (4 г/л), цистеин (0,5 г/л). Анализ образцов в течение данного периода времени позволил определить исходные состав и активность микробного сообщества в различных реакторах, которые затем использовали в качестве контроля для сравнения с результатами лечения. В течение периода эксперимента реактор SHIME эксплуатировали в обычных условиях, но с модифицированным рационом с добавлением исследуемых продуктов каждый день. Принимая во внимание низкую дозу каждой порции, лечение SHIME обеспечивали в течение 6 недель, чтобы максимизировать вероятность получения точной картины эффекта препарата в желудочно-кишечном тракте.
[0152] На фигуре 5, фигуре 6, фигуре 7 и фигуре 8 представлена продукция ацетата, пропионата, бутирата и суммарных КЖК для каждой недели эксперимента в различных компартментах SHIME.
[0153] Проводили анализ для измерения трансэпителиального электрического сопротивления (ТЭЭС) как показателя целостности однослойной мембраны энтероцитов и снижения проницаемости.
[0154] Оценка проникновения красителя Lucifer Yellow в БЛ компартмент представляет собой показатель проницаемости монослоя. Оценивали измерение продукции цитокинов в БЛ компартменте (ИЛ-8, ИЛ-6, ТФР-β, ИЛ-10) и активность NF-κВ после осуществления контакта с суспензией SHIME.
[0155] Данные сравнивали посредством анализов Т-критерия, как представлено на фигуре 22, для оценки изменений между периодами контроля и лечения. Принимая во внимание возможный замедленный эффект вариантов лечения по причине низких доз исследуемых продуктов, проводили статистическое сравнение между контролем и полным периодом лечения или последними 5, 4 или 3 неделями лечения.
[0156] Все продукты привели к увеличению продукции суммарных КЖК, даже несмотря на то, что данное увеличение являлось статистически значимым исключительно в ПООК для 6 порций алоэ и в дистальном отделе ободочной кишки для 3 и 6 порций алоэ.
[0157] Продукт алоэ привел к более высокой продукции ацетата в проксимальном отделе ободочной кишки, причем 6 порций оказывали более мощный эффект по сравнению с 3. Напротив, в присутствии Эпикора статистически значимые изменения концентраций ацетата не наблюдались.
[0158] При изучении пропионата единственным продуктом, который привел к статистически значимому увеличению, являлись 6 порций алоэ в проксимальном отделе ободочной кишки.
[0159] Наконец, продукт Алоэ и Эпикор также отличались применительно к эффектам в отношении бутирата. Фактически, в то время как 3 порции алоэ являлись эффективными для повышения концентрации бутирата как в проксимальном, так и в дистальном отделе ободочной кишки, Эпикор привел к статистически значимому эффекту исключительно в ДООК. В отличие от результата, наблюдаемого в случае 3 порций, 6 порций алоэ не продемонстрировали какой-либо бутирогенный эффект.
[0160] При изучении одной недели лечения на фигуре 5, фигуре 6, фигуре 7 и фигуре 8, как представляется, все продукты могут достичь максимальный эффект через 2 недели лечения, и, вследствие этого, для обеспечения данных эффектов необходимы повторяющиеся дозы продуктов.
[0161] Анализ концентраций лактата в различных участках ободочной кишки на протяжении всего курса эксперимента представлен на фигуре 9. Введение исследуемых продуктов в TripleSHIME не оказывало существенное влияние на концентрацию лактата в различных компартментах ободочной кишки.
[0162] Анализ концентраций аммония в различных имитированных участках ободочной кишки на протяжении всего курса эксперимента представлен на фигуре 10А и фигуре 10В как для недели эксперимента, так и для периода эксперимента (КОНТРОЛЬ по сравнению с ЛЕЧЕНИЕМ).
[0163] Все исследуемые продукты привели к подобной тенденции к увеличению продукции аммония как в проксимальном, так и в дистальном компартменте ободочной кишки. Данное увеличение являлось статистически значимым для 3 порций алоэ в ПООК и для 6 порций алоэ и для Эпикора в ДООК.
[0164] Анализ потребления кислоты и основания в различных участках ободочной кишки на протяжении всего курса эксперимента представлен на фигуре 11А, фигуре 11В, и в качестве потребления NaOH и HCl для каждого из отделений TripleSHIME. Данные представлены в виде среднего потребления в течение контрольного периода, первых 3 недель лечения и последних 3 недель лечения.
[0165] В присутствии всех исследуемых продуктов потребление основания всегда было выше по сравнению с кислотой; это свидетельствует, что произошли метаболические процессы, связанные с закислением ободочной кишки.
[0166] Однако, поскольку между контролем и лечением значительные различия не наблюдались, изменения, вызванные исследуемыми продуктами, не приводили к значительному дисбалансу микробного метаболизма в различных сегментах ободочной кишки.
[0167] Этот результат согласуется с ранее представленными данными, согласно которым увеличение уровня КЖК уравновешивалось увеличенной протеолитической активностью.
Анализ состава микробного сообщества
[0168] Образцы из каждого компартмента ободочной кишки SHIME собирали один раз в неделю для оценки эффекта вариантов лечения в отношении состава полостного микробного сообщества посредством количественной ПЦР (кПЦР) с целью определения суммарных бактерий, бактероидов, фирмикутов, бифидобактерий и лактобацилл. Состав полостного микробного сообщества анализировали с применением анализа методом количественной ПЦР.
[0169] Данные представлены на фигурах 12А-12Е, фигурах 13А-13Е и фигурах 14А-14Е для каждой недели эксперимента (2 недели контроля и 6 недель лечения). Анализ данных кПЦР, представленных на фигурах 12А-12Е, фигурах 13А-13Е и фигурах 14А-14Е, продемонстрировал следующие тенденции:
• Алоэ (3 порции) привело к незначительному увеличению количества суммарных бактерий в ПООК, в то время как в ДООК изменения не наблюдались. Незначительное увеличение может быть связано, главным образом, с увеличением количества бактероидов, в то время как влияние на фирмикуты отсутствовало. Продукт не продемонстрировал какой-либо лактобациллогенный эффект. Наблюдался временный максимум концентрации бифидобактерий через 2 недели лечения.
• Алоэ (6 порций) привело к увеличению количества суммарных бактерий как в ПООК, так и в ДООК (+0,2 log). Данное увеличение может быть в первую очередь связано с увеличением количества бактероидов и фирмикутов. В случае 3 порций продукт не продемонстрировал какой-либо лактобациллогенный эффект. Наблюдалось временное увеличение концентрации бифидобактерий как в ПООК, так и в ДООК. По сравнению с 3 порциями в данном случае возможно наблюдать дозозависимый эффект. Фактически в случае 6 порций концентрация бифидобактерий являлась более высокой (по сравнению с исходным контрольным периодом) в течение недели 1, 2 и 3 лечения в ПООК и в течение недели 2 и 3 в ДООК.
• Эпикор привел к замедленному эффекту в отношении суммарных бактерий в ПООК (вплоть до 0,2 log в течение недели 4, 5 и 6 лечения). Данное увеличение было связано с более высокой концентрацией как бактероидов (+0,7 log), так и фирмикутов. Продукт не продемонстрировал какой-либо лактобациллогенный эффект. В случае 3 порций алоэ наблюдался временный максимум концентрации бифидобактерий через 2 недели лечения как в ПООК, так и в ДООК.
[0170] В связи с незначительными изменениями количества различных проанализированных групп бактерий также могло возникнуть качественное изменение (т.е. изменение видов). Возможные качественные изменения можно исследовать посредством методики фингерпринтинга (т.е. DGGE, denaturating gradient gel electrophoresis, электрофореза в градиенте денатурирующего геля).
Эффект в отношении модуляции стенки кишечника - проницаемости кишечного барьера и воспаления
[0171] Данные представлены следующим образом:
1. Первый блок графиков (фигуры 19A-19G) иллюстрирует контроли эксперимента: ростовую среду (PC), липополисахарид (ЛПС), бутират натрия (NaB) и гидрокортизон (ГК), а также необработанные исследуемые продукты (алоэ и ЭпиКор) (без пищеварения/ферментации):
• Две концентрации алоэ исследовали напрямую на клетках: 0,507 г/л (Ало1) и 1,014 г/л (Ало2)
• Одну концентрацию ЭпиКора исследовали напрямую на клетках: 1,5 г/л.
• Все продукты являлись свежеприготовленными в среде для культивирования клеток и стерилизованными фильтрацией.
• На всех графиках результаты нормировали к контролю (PC в случае ТЭЭС и ЛЖ, ЛПС в случае иммунных маркеров); таким образом, контроли были заданы как 1,0, и исследуемые условия представлены в виде кратности изменений.
• Статистическую значимость исследовали с применением однофакторного дисперсионного анализа ANOVA с апостериорным критерием Даннетта: *, ** и *** представляют собой р<0,05, р<0,01 и р<0,001, соответственно
2. Второй блок графиков (фигуры 19H-19N) иллюстрирует результаты, полученные для образцов SHIME:
• Все значения нормировали к соответствующему контрольному периоду. Вследствие этого контрольные образцы были заданы как 1,0, и варианты лечения представлены в виде кратности изменений.
• Статистическую значимость исследовали с применением t-критерия Стьюдента (К по сравнению с Л): *, ** и *** представляют собой р<0,05, р<0,01 и р<0,001, соответственно.
• На всех графиках: К: контрольный период; Л: период лечения; ПООК: проксимальный отдел ободочной кишки; ДООК: дистальный отдел ободочной кишки.
[0172] Как и ожидалось, контроль - ростовая среда (PC) продемонстрировал приблизительно 20% снижения ТЭЭС через 24 ч в связи с повреждением, вызванным активированными клетками ТНР1 на клетках Сасо-2 (не показано). Бутират натрия (NaB; положительный контроль) был способен защищать клетки Сасо-2 от данного повреждения и поддерживать ТЭЭС монослоя при введении в низких дозах (р<0,05) (фиг. 19А-19N). Как можно видеть, все чистые исследуемые продукты - алоэ и ЭпиКор также были способны защищать монослой от данного повреждения посредством поддержания ТЭЭС (несмотря на то, что результат являлся значимым исключительно для Алоэ 2 и ЭпиКора), и оба продемонстрировали уровни, аналогичные NaB.
[0173] Однако ни один из исследуемых продуктов практически не затрагивал параклеточный транспорт малых молекул, таких как ЛЖ; несмотря на это, Алоэ 2 продемонстрировал умеренное снижение параклеточного транспорта ЛЖ, что согласуется с увеличением, наблюдаемым для ТЭЭС.
[0174] Как представлено на фигурах 19С-19F, NaB стимулировал активность NF-KB (эффект, опосредованный ослаблением ингибиторной активности гистондеацетилазы (HDAC) в отношении хроматина). Это приводило к увеличению ацетилирования факторов транскрипции, таких как  и, как следствие, к увеличению транскрипционной активности. Эффекты NaB в отношении цитокинов и хемокинов являлись зависимыми от клеточной линии и включали как про-, так и противовоспалительные эффекты. Здесь, NaB вызывал увеличение продукции всех цитокинов; данный эффект, возможно, был опосредован увеличением транскрипции генов, индуцированной
[0175] Эффекты алоэ и ЭпиКора представлялись цитокин-зависимыми. Например, алоэ, как известно, обладает противовоспалительными свойствами, что было также очевидно в данном эксперименте, в особенности, в наивысшей исследованной концентрации (Алоэ 2). С одной стороны, Алоэ (2) было способно к увеличению уровня индуцированного ЛПС ИЛ-10, а с другой стороны, - к незначительному снижению уровня индуцированного ЛПС ИЛ-6 (хотя данное снижение и не являлось значимым), ИЛ-8 и ФНО-α. Однако отметим, что данный эффект не представлялся зависимым от модуляции активности NF-αB, а вместо этого мог быть опосредован посттранскрипционным или посттрансляционным механизмом. ЭпиКор в виде чистого продукта, как представляется, в исследуемой дозе не влиял в значительной степени на индуцированные ЛПС цитокины, за исключением ФНО-α, который, как представляется, индуцировался в высокой степени. Наконец, как и ожидалось, ЛПС (полученная из бактерий молекула) был способен к увеличению секреции про- и противовоспалительных цитокинов и к обеспечения активности  Напротив, гидрокортизон (ГК), который представляет собой кортикостероид, выступал в качестве иммуносупрессанта посредством остановки секреции всех индуцированных ЛПС иммунных маркеров (возможно, посредством снижения активности ), как представлено на фигуре 19G.
[0176] В отличие от результатов, полученных с чистыми продуктами, полученные в результате ферментации метаболиты алоэ не были способны защищать монослой Сасо-2 от повреждения, вызванного клетками ТНР-1; напротив, образцы лечения, как представляется, вызывали незначительное снижение ТЭЭС по сравнению с соответствующими контрольными образцами; лишь образец из дистального отдела ободочной кишки для Алоэ 2 представлялся исключением (хотя и незначимым), как представлено на фигурах 19Н-19I.
[0177] Параклеточный транспорт ЛЖ согласовывался с результатами ТЭЭС для полученных из алоэ образцов.
[0178] Напротив, метаболиты, полученные в результате ферментации ЭпиКора, не продемонстрировали эффект в отношении ТЭЭС, но продемонстрировали эффект в отношении транспорта ЛЖ, в особенности, образец, отобранный из реактора дистального отдела ободочной кишки, который продемонстрировал снижение проницаемости в отношении ЛЖ по сравнению с соответствующим контролем.
[0179] При оценке продукции цитокинов, как представлено на фигурах 19J-19N, ФНО-α, как представляется, характеризовался более нестабильным результатом: его уровень снижался под действием Алоэ 1_ПООК и увеличивался под действием Алоэ 1_ДООК, тогда как Алоэ 2 продемонстрировал противоположный результат (увеличение в случае Алоэ 2_ПООК и снижение в случае Алоэ 2_ДООК). Напротив, полученные в результате ферментации алоэ метаболиты оказывали умеренное влияние или вообще не оказывали влияния на ИЛ-8 и активность NF-αB.
[0180] При изучении ИЛ-10 и ИЛ-6, с одной стороны, эффекты продуктов, полученных в результате ферментации алоэ, в отношении индуцированных ЛПС цитокинов представлялись зависимыми от реактора ободочной кишки. С другой стороны, две концентрации, как представляется, характеризовались практически противоположным результатом: в то время как ИЛ-10 и ИЛ-6 были индуцированы образцами Алоэ 1 как из ПООК, так и из ДООК, их уровень снижался под действием Алоэ 2 обоих образцов ободочной кишки. В отличие от необработанного продукта, полученные из ЭпиКора метаболиты были способны снижать индуцированные ЛПС уровни ФНО-α в совместных культурах, как наблюдалось ранее.
[0181] Наконец, с целью исследования подобия между наблюдениями (образцами) и корреляции между переменными (измерениями) получали объединенный двойной график АГК/корреляции, как представлено на фигуре 20. На двойном графике откладывали переменные в качестве векторов и наблюдения в качестве точек.
[0182] При сведении к двум компонентам данные приблизительно на 70% объяснялись первыми двумя компонентами, причем на первый компонент приходилось практически 40% дисперсии в исходных 7 переменных. Переменными, которые вносили наибольший вклад в первый компонент, являлись ТЭЭС, ИЛ-8 и ИЛ-10, тогда как  ФНО-α и ИЛ-6 вносили наибольший вклад во второй компонент. Первый компонент, главным образом, отделял необработанные продукты от остальных, за исключением Алоэ 2_ДООК, который образовывал группу с Алоэ 1 и 2.
[0183] Целью данного эксперимента являлось сравнение 2 доз продукта алоэ и продукта, продемонстрировавшего иммуномодуляторные свойства (т.е. ЭпиКора от компании Embria), применительно к составу и активности микробного сообщества кишки и модуляции стенки кишечника хозяина с точки зрения воспаления и проницаемости барьера.
[0184] Все продукты привели к увеличению продукции суммарных КЖК. Более конкретно, алоэ привел к более высокой продукции ацетата в ПООК (причем 6 порций оказывали более мощный эффект по сравнению с 3), более высокой продукции пропионата в ПООК (6 порций) и более высокой продукции бутирата (ЭпиКор и 3 порции алоэ). Чтобы вызвать данные эффекты, были необходимы повторяющиеся дозы продуктов.
[0185] Введение исследуемых продуктов не оказывало заметное влияние на концентрацию лактата.
[0186] Все исследуемые продукты привели к подобной тенденции к увеличению продукции аммония как в проксимальном, так и в дистальном компартменте ободочной кишки. Данное увеличение являлось статистически значимым в случае 3 порций алоэ в ПООК и в случае 6 порций алоэ и Эпикора в ДООК.
[0187] В присутствии всех исследуемых продуктов потребление основания всегда было выше по сравнению с кислотой; это свидетельствует, что произошли метаболические процессы, связанные с закислением ободочной кишки. Однако изменения, вызванные исследуемыми продуктами, не приводили к значительному дисбалансу микробного метаболизма в различных сегментах ободочной кишки.
[0188] Алоэ (3 порции) привело к незначительному увеличению количества суммарных бактерий в ПООК, главным образом, связанному с увеличением количества бактероидов. Наблюдался временный максимум концентрации бифидобактерий через 2 недели лечения. Алоэ (6 порций) привело к увеличению количества суммарных бактерий как в ПООК, так и в ДООК, главным образом, связанному с увеличением количества бактероидов и фирмикутов. Наблюдалось временное увеличение концентрации бифидобактерий как в ПООК, так и в ДООК. Эпикор привел к замедленному эффекту в отношении суммарных бактерий в ПООК. Данное увеличение было связано с более высокой концентрацией как бактероидов (+0,7 log), так и фирмикутов. Наблюдался временный максимум концентрации бифидобактерий через 2 недели лечения.
[0189] Наблюдаемые микробные параметры согласовывались с тем, что наблюдали ранее в случае ЭпиКора (с применением отличного донора для SHIME), и тем, что наблюдали в краткосрочном предварительном анализе, который проводили с различными дозами продукта алоэ, с точки зрения увеличения продукции суммарных КЖК, пропионогенного эффекта и отсутствия ингибирующего эффекта в отношении микроб йоты кишки.
[0190] Нормированные значения для всех измерений обобщены на фигуре 21, на которой данные были преобразованы в градиенты цвета. При исследовании необработанных препаратов более высокие концентрации алоэ (1,014 г/л) продемонстрировали наиболее интересные результаты по сравнению с низкими концентрациями алоэ (0,507 г/л) и ЭпиКором (1,5 г/л):
• Алоэ было способно поддерживать ТЭЭС (посредством защиты клеток Сасо-2 от повреждения, вызванного клетками ТНР1), посредством этого оказывая положительный эффект в отношении целостности барьера Сасо-2.
• Алоэ также было способно увеличивать индуцированные ЛПС уровни ИЛ-10 (подлинного противовоспалительного цитокина), поддерживать уровни ИЛ-6 и снижать индуцированные ЛПС уровни ИЛ-8 и ФНО-α, причем результаты для последнего цитокина являются наиболее значительными, как представлено на фигуре 21.
• Полученные результаты согласовывались с признанными противовоспалительными эффектами алоэ. Однако после ферментации некоторые из данных результатов больше не наблюдались, за исключением образца Алоэ 2_ДООК, который в общих результатах наиболее близко походил на большинство необработанных алоэ (2). Вследствие этого данные эффекты, наиболее вероятно, имели место в тонком кишечнике, где продукт еще находится в наиболее интактной форме.
Пример 8 - Документирование биологических свойств двух исследуемых продуктов на основе алоэ: продукта на основе цельного листа (ЦЛ) алоэ и продукта на основе внутренней части листа (ВЧЛ) алоэ.
[0191] Целью данного эксперимента являлось сравнение основных результатов анализа двух продуктов на основе алоэ, продукта цельного листа и продукта внутренней части листа, для обеспечения понимания эффектов дозы для двух необработанных продуктов, а также их продуктов пищеварения in vitro, с применением избранных антиоксидантных и противовоспалительных биоанализов.
[0192] Изначально было важно понять, поступают ли соединения из исследуемых продуктов/фракций в живые клетки или опосредуют действие посредством передачи клеточных сигналов на уровне мембраны клетки. Было также важно узнать эффект дозы для обоих типов клеточных событий с целью оптимизации доз для последующих биоанализов.
[0193] Параллельно проводили три следующих анализа исследуемых продуктов:
1. Антиоксидантной способности;
2. Клеточной антиоксидантной защиты и биодоступности с применением анализа САР-е;
3. Эффекта в отношении клеточной продукции активных форм кислорода (АФК).
[0194] Сравнивали следующие исследуемые продукты:
[0195] При подготовке к добавлению необработанных порошков в культуры клеток непосредственно перед применением в данный день исследования проводили следующую процедуру: часть каждого порошка массой 500 мг диспергировали в 5 мл физиологического солевого раствора (ФБР) и помещали на шейкер на час, чтобы позволить водным соединениям раствориться в буфере. После инкубации твердые вещества удаляли посредством центрифугирования с последующей стерилизующей фильтрацией через фильтр с размером пор 0,22 микрон.
[0196] Переваренные in vitro (ПIV) продукты получали следующим образом: после того как продукты смешивали с ФБР в течение 1 часа (описано выше) добавляли амилазу слюны человека (3,9 мк/мл), и продукты помещали в температуру 37°С на 10 минут. Затем добавляли хлористоводородную кислоту для снижения рН образцов до 2,0 и добавляли пепсин свиньи (1,3 мг/мл) для имитации условий пищеварения в желудке. Затем образцы помещали на шейкер при температуре 37°С и встряхивали в течение 2 часов с целью имитации пищеварения в желудке. После этого фермент пепсин необратимо инактивировали, повышая рН образцов до 7,0 с применением бикарбоната натрия. Аликвоты ПIV продуктов хранили в замороженном виде при температуре -20°С, и одну аликвоту каждого продукта оттаивали непосредственно перед применением в данный день анализа.
Общая антиоксидантная способность
[0197] Продукты исследовали в анализе Фолина-Чокальтеу (также известен как анализ общей антиоксидантной способности или анализ суммарных фенолов). В данном анализе для измерения антиоксидантов применяли реактив Фолина-Чокальтеу. Анализ проводили посредством добавления фенольного реактива Фолина-Чокальтеу к серийным разведениям экстракта, тщательного перемешивания и инкубации в течение 5 минут. Добавляли карбонат натрия, что запускало химическую реакцию с образованием окрашивания. Реакции позволяли протекать в течение 30 минут при температуре 37°С. Оптическое поглощение измеряли при длине волны 765 нм в колориметрическом устройстве для считывания планшетов. В качестве эталона использовали галловую кислоту, и данные представляли в эквивалентах галловой кислоты на грамм продукта.
Клеточный анализ антиоксидантной защиты
[0198] Применяемый способ позволяет проводить оценку антиоксидантного потенциала и сравним с тестом ORAC (oxygen radical absorbance capacity, способность поглощать радикалы кислорода), однако позволяет проводить измерение антиоксидантов, которые были способны пересекать липидный бислой мембраны клетки, поступать в клетки и обеспечивать биологически значимую антиоксидантную защиту в условиях окислительного стресса.
[0199] Биоанализ САР-е был разработан специально для работы с природными продуктами и компонентами. Способ применяли в отношении множества типов природных продуктов и компонентов, и результаты были опубликованы в рецензируемой научной литературе.
[0200] В качестве модельного типа клетки применяли красные клетки крови (ККК). ККК представляют собой инертный тип клеток в отличие от других типов клеток, таких как ПМЯ клетки. Данный анализ, как представлено на фигуре 22, в частности, был разработан для обеспечения оценки антиоксидантов из сложных природных продуктов в клеточной системе.
[0201] Свежеочищенные ККК человека промывали несколько раз в физиологическом солевом растворе, а затем осуществляли контакт ККК с исследуемыми продуктами. В течение инкубации с исследуемым продуктом любые антиоксидантные соединения, способные пересекать мембрану клетки, могли поступать внутрь ККК. Затем ККК промывали с целью удаления соединений, которые не поглощались клетками, и нагружали красителем DCF-DA, который начинал флуоресцировать под воздействием активных форм кислорода. Окисление запускали добавлением генератора пероксильных свободных радикалов ААРН. Оценивали интенсивность флуоресценции. Низкая интенсивность флуоресценции необработанных контрольных клеток выступала в качестве исходного уровня, и ККК, обработанные ААРН самим по себе, выступали в качестве положительного контроля максимального окислительного повреждения.
[0202] Если после осуществления контакта с исследуемым продуктом, а затем - осуществления контакта с ААРН наблюдалось снижение интенсивности флуоресценции ККК, это свидетельствовало, что исследуемый продукт содержал антиоксиданты, способные проникать в клетки и защищать их от окислительного повреждения.
Эффект в отношении образования свободных радикалов воспалительными клетками
[0203] Многие природные продукты с антиоксидантной способностью также снижают образование АФК в воспалительных клетках. Однако другие продукты могут фактически повышать образование АФК, несмотря на антиоксидантную способность, и это может свидетельствовать об интересном взаимодействии между поддержанием механизмов антимикробной защиты и антиоксидантной способностью.
[0204] Таким образом, природные продукты могут влиять на образование АФК ПМЯ клетками посредством трех различных механизмов (как представлено на фигуре 23):
1. Нейтрализации АФК посредством прямого антиоксидантного эффекта;
2. Запуска противовоспалительного клеточного сигнала, приводящего к снижению образования АФК;
3. Запуска иммунной реакции, приводящей к усилению образования АФК.
[0205] Для исследования эффектов продукта в отношении образования АФК применяли полиморфноядерные (ПМЯ) клетки человека. У людей данный тип клеток составляет приблизительно 70% от белых клеток крови. После определенных воспалительных стимулов ПМЯ клетки продуцируют большие количества АФК.
2
2
2
2
[0206] Осуществляли контакт свежеочищенных ПМЯ клеток человека с исследуемыми продуктами. В течение инкубации с исследуемым продуктом любые антиоксидантные соединения, способные пересекать мембрану клетки, могли поступать внутрь ПМЯ клеток, и соединения, которые запускали событие передачи сигналов, могли запустить такую передачу. Затем клетки промывали, нагружали красителем DCF-DA, который начинал флуоресцировать под воздействием АФК. Образование АФК запускали добавлением HO. Интенсивность флуоресценции ПМЯ клеток оценивали методом проточной цитометрии. Низкая интенсивность флуоресценции необработанных контрольных клеток выступала в качестве исходного уровня, и ПМЯ клетки, обработанные HO самой по себе, выступали в качестве положительного контроля.
2
2
2
2
[0207] Если после осуществления контакта с экстрактом, а затем - после осуществления контакта с HO интенсивность флуоресценции ПМЯ клеток была снижена по сравнению с HO самой по себе, это свидетельствовало, что исследуемый продукт оказывал противовоспалительные эффекты.
2
2
[0208] Напротив, если после осуществления контакта с исследуемым продуктом интенсивность флуоресценции ПМЯ клеток увеличивалась по сравнению с HO самой по себе, это свидетельствовало, что исследуемый продукт оказывал провоспалительные эффекты посредством усиления данного аспекта механизмов антимикробной иммунной защиты.
[0209] Анализ проводили трижды на клетках от различных здоровых доноров.
Общая антиоксидантная способность
[0210] На фигуре 24 представлены результаты относительно общей антиоксидантной способности для двух необработанных продуктов (верхний график), затем для двух продуктов, отобранных в течение процесса пищеварения (средний график), и наложение всех исследуемых продуктов (нижний график). Необработанные продукты представлены сплошными линиями, тогда как продукты, отобранные в течение процесса пищеварения in vitro (ПIV), представлены пунктирными линиями. Контроль буфер/реактив для пищеварения in vitro представлен точечной пунктирной линией.
[0211] Продукт цельного листа (ЦЛ) продемонстрировал приблизительно в два раза более высокую антиоксидантную способность, чем продукт внутренней части листа (ВЧЛ).
[0212] При сравнении ПIV цельного листа и ПIV внутренней части листа друг с другом и с контролем, буфером ФБР-ПIV, ПIV цельный лист характеризовался хорошей антиоксидантной способностью, тогда как продукт ПIV внутренней части листа продемонстрировал в данном анализе результаты, весьма подобные контролю, буферу ФБР-ПIV.
Клеточный анализ антиоксидантной защиты
[0213] На фигуре 25 представлены результаты относительно клеточной антиоксидантной защиты для двух необработанных продуктов (верхний график), затем для двух продуктов, отобранных в течение процесса пищеварения (средний график), и наложение всех продуктов (нижний график). Необработанные продукты представлены сплошными линиями, тогда как продукты, отобранные в течение процесса пищеварения in vitro (ПIV), представлены пунктирными линиями. Контроль буфер/реактив для пищеварения in vitro представлен точечной пунктирной линией.
[0214] Продукт цельного листа (ЦЛ) продемонстрировал умеренную клеточную антиоксидантную защиту в наивысших дозах. Однако в данных дозах наблюдалась некоторая степень лизиса клеток.
[0215] Ни один из других продуктов/переваренных фракций не продемонстрировал в данном анализе клеточную антиоксидантную защиту.
[0216] Полученные данные выступали в качестве важнейшего фундамента для интерпретации механизмов действия в анализе АФК.
Эффект в отношении образования свободных радикалов воспалительными клетками
2
2
2
2
[0217] В данном анализе, если после осуществления контакта с экстрактом, а затем - после осуществления контакта с HO интенсивность флуоресценции ПМЯ клеток была снижена по сравнению с HO самой по себе, это свидетельствовало, что исследуемый продукт оказывал противовоспалительные эффекты.
2
2
[0218] Напротив, если после осуществления контакта с исследуемым продуктом интенсивность флуоресценции ПМЯ клеток была увеличена по сравнению с HO самой по себе, это свидетельствовало, что исследуемый продукт оказывал провоспалительные эффекты посредством усиления данного аспекта механизмов антимикробной иммунной защиты. Примечание: ЦЛ-ПIV в более высоких дозах вызывал гибель ПМЯ клеток.
[0219] В некоторых культурах наблюдалась некоторая степень гибели клеток под воздействием более высоких доз определенных продуктов (например, 2 г/л ЦЛ-ПIV). На фигуре 26 представлены примеры гистограмм проточной цитометрии образцов с хорошей жизнеспособностью ПМЯ клеток по сравнению с плохой жизнеспособностью (повышенная гибель клеток). Данные АФК из культур с интенсивной гибелью клеток являются недействительными и отмечены «X» на соответствующих точках данных на графиках данных на фигуре 27 и фигуре 30.
Общая антиоксидантная способность
[0220] Продукт цельного листа (ЦЛ) продемонстрировал более высокую антиоксидантную способность, чем продукт внутренней части листа (ВЧЛ), оба как в необработанном состоянии, так и в переваренной форме.
[0221] Продукт внутренней части листа (ВЧЛ) продемонстрировал приблизительно лишь половину антиоксидантной способности продукта цельного листа (ЦЛ); данная антиоксидантная способность исчезала после переваривания.
Клеточный анализ антиоксидантной защиты
[0222] Результаты анализа САР-е продемонстрировали, что только необработанный продукт цельного листа (ЦЛ) содержал антиоксиданты, которые были способны пересекать липидный бислой мембраны клетки, поступать в клетки и обеспечивать биологически значимую антиоксидантную защиту в условиях окислительного стресса.
[0223] Ни продукт внутренней части листа, ни переваренные фракции какого-либо продукта не содержали антиоксиданты, способные обеспечивать клеточную антиоксидантную защиту.
Эффект в отношении образования свободных радикалов воспалительными клетками
[0224] Как представлено на диаграмме на фигуре 23, иммунные клетки могут получать как активаторные, так и ингибиторные сигналы от сложных природных продуктов, и часто наблюдается двухфазный эффект дозы, при котором мощным противовоспалительным соединениям позволяют продемонстрировать ответ исключительно в более низких дозах, когда активирующие иммунитет вещества (как правило, активные в различном диапазоне доз) были разведены в большей степени и больше не перевешивали противовоспалительные сигналы.
[0225] Продукты как цельного листа (ЦЛ), так и внутренней части листа (ВЧЛ) продемонстрировали данный U-образный эффект дозы в культурах клеток от двух из трех здоровых доноров крови. Противовоспалительные эффекты ВЧЛ являлись более мощными, чем ЦЛ; это может быть обусловлено либо более высокими уровнями противовоспалительных соединений в ВЧЛ, либо более высокими уровнями иммуноактивирующих соединений в ЦЛ.
[0226] Примечательно, что ПIV ЦЛ продемонстрировал более мощный противовоспалительный ответ, чем необработанный ЦЛ, в культурах клеток от всех трех доноров.
Пример 9 - Оценка эффекта различных композиций алоэ в отношении стимулированной ЛПС экспрессии цитокинов в МКПК.
[0227] Целью данного эксперимента являлась оценка противовоспалительного и иммуномодуляторного эффекта обесцвеченного сока листа алоэ вера, концентрата сока внутренней части листа алоэ вера и их фракций, которые характеризовались высоким содержанием полисахаридов (т.е. ацеманнана).
[0228] Исследовали следующие продукты:
[0229] Для исследования эффекта вышеуказанных материалов алоэ в отношении экспрессии различных цитокинов, стимулированных 50 пг/мл липополисахарида (ЛПС), применяли мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) человека от здорового мужчины. МКПК представляют собой популяции иммунных клеток, которые включают лимфоциты (Т-клетки, В-клетки и NK-клетки), моноциты и дендритные клетки. У людей частота каждой из данных субпопуляций варьирует среди различных индивидуумов.
[0230] Анализ цитокинов проводили следующим образом. Каждый материал алоэ разводили в культуральной среде и добавляли к МКПК до конечной концентрации от 1 мкг до 100 мкг/мл. После инкубации в течение 1 часа при температуре 37°С некоторые клетки обрабатывали 50 пг/мл ЛПС, провоспалительного стимула, тогда как другие клетки продолжали культивировать при отсутствии ЛПС. Через 24 часа инкубации супернатанты собирали и анализировали в отношении цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-6, MIP-1α, ФНО-α, ИЛ-8 и ИЛ-10). Контроль представлял собой ЛПС при анализе противовоспалительной активности препаратов алоэ или культуральную среду при анализе прямого эффекта препарата алоэ в отношении МКПК. Каждое значение представляло собой среднее значение результатов в двух повторах для каждого исследуемого цитокина.
Эффект композиции алоэ в отношении воспалительной стимуляции ЛПС секреции цитокинов в МКПК
[0231] Столбчатые графики на фигурах 33A(I)-33C(V) демонстрируют значительное изменение стимулированной ЛПС экспрессии цитокинов, которое было вызвано обработкой МКПК исследуемыми материалами алоэ, обесцвеченным соком листа алоэ вера (Алоэ 100х) и обогащенными полисахаридом (ПС) препаратами (Алоэ 100х ПС и Алоэ 200х ПС), полученными из обесцвеченного сока листа алоэ вера и концентрата сока внутренней части листа алоэ вера, соответственно.
[0232] Обесцвеченный сок листа алоэ вера и его обогащенный полисахаридами препарат (Алоэ 100х ПС) снижали стимулированную ЛПС экспрессию как MIP-1α, так и ФНО-α; это свидетельствует, что материалы алоэ оказывали противовоспалительный эффект.
[0233] Обогащенный полисахаридами препарат (Алоэ 200х ПС), полученный из концентрата сока внутренней части листа алоэ вера, снижал стимулированную ЛПС экспрессию MIP-1α и ФНО-α и увеличивал уровни ИЛ-10; это свидетельствует, что материал алоэ оказывал мощный противовоспалительный эффект.
Эффект композиции алоэ в отношении секреции цитокинов в МКПК
[0234] Столбчатые графики на фигурах 34А-34В демонстрируют значительное изменение стационарной экспрессии цитокинов, которое было вызвано обработкой МКПК исследуемыми материалами алоэ, обесцвеченным соком листа алоэ вера (Алоэ 100х) и обогащенными полисахаридами препаратами (Алоэ 100х ПС и Алоэ 200х ПС), полученными из обесцвеченного сока листа алоэ вера и концентрата сока внутренней части листа алоэ вера, соответственно.
[0235] При отсутствии внешнего провоспалительного стимула фракция (Алоэ 100х ПС) обесцвеченного сока листа алоэ вера, которая характеризовалась высоким содержанием полисахарида (т.е. ацеманнана), в значительной степени повышала стационарную экспрессию как провоспалительных (ИЛ-1β, ФНО-α, ИЛ-6, MIP-1α), так и противовоспалительных (ИЛ-10) цитокинов; это свидетельствует, что материал алоэ оказывал иммуномодуляторный эффект.
[0236] При отсутствии внешнего провоспалительного стимула фракция (Алоэ 200х ПС) концентрата сока внутренней части листа алоэ вера, которая характеризовалась высоким содержанием полисахарида (т.е. ацеманнана), в значительной степени повышала стационарную экспрессию как провоспалительных (ИЛ-1β, ФНО-α, ИЛ-6, MIP-1α), так и противовоспалительных (ИЛ-10) цитокинов; это свидетельствует, что материал алоэ оказывал иммуномодуляторный эффект.
[0237] Введение обесцвеченного сока листа алоэ вера напрямую активировало NK- и NKT-клетки; это свидетельствует, что материал алоэ оказывал иммуномодуляторный эффект даже при отсутствии какого-либо стимула (например, ЛПС) не только в отношении врожденных иммунных ответов на патологические микроорганизмы, такие как бактерии и вирусы, и на абнормальные клетки, такие как раковые клетки, возникающие в организме, но также в отношении адаптивных иммунных ответов на аутоиммунные заболевания, такие как диабет, атеросклероз и рак.
Эффект обесцвеченного сока листа алоэ вера в отношении иммунного гомеостаза
[0238] Введение обесцвеченного сока листа алоэ вера приводило к дифференциации противовоспалительных толерогенных ДК в присутствии ЛПС, вследствие чего их взаимодействие с CD4 Т-клетками приводило к в значительной степени повышенной продукции противовоспалительных Th2-цитокинов, таких как ИЛ-10 и ИЛ-5, и к в значительной степени сниженной продукции воспалительного ИФН-γ, Th1-цитокина. Данные результаты свидетельствуют, что употребление человеком концентрата сока листа алоэ вера может усилить иммунный гомеостаз посредством периферической толерантности слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта.
[0239] Введение обесцвеченного сока листа алоэ вера в значительной степени нивелировало супрессивный эффект ЛПС в отношении активности аргиназы активированных ЛПС макрофагов; это свидетельствует, что композиция алоэ может способствовать переключению или поляризации воспалительных макрофагов M1 в противовоспалительные макрофаги М2.
Пример 10 - Оценка биологически значимых антиоксидантных и иммуномодуляторных эффектов препаратов обесцвеченного листа и внутренней части листа алоэ вера с применением множества методик in vitro
[0240] Антиоксидантную активность препаратов обесцвеченного листа (Л) и внутренней части листа (ВЧЛ) алоэ вера оценивали применительно к общей антиоксидантной способности методом Фолина-Чокальтеу и применительно к клеточной антиоксидантной защите с применением эритроцитов человека. Прямые иммуномодуляторные эффекты оценивали посредством обработки мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) человека от трех здоровых доноров каждым из препаратов алоэ вера в течение 24 часов с последующим анализом методом многопараметровой проточной цитометрии, в котором оценивали статус активации (т.е. экспрессию CD25 и CD69) различных популяций иммунных клеток [клеток-природных киллеров ((NK) (CD3-/CD56+), NKT-клеток (CD3+/CD56+) и Т-лимфоцитов (CD3+/CD56-)], которые сортировали посредством двойного окрашивания моноклональными антителами, специфичными в отношении CD3 и CD56. Для измерения уровней про- и противовоспалительных цитокинов в супернатантах культуры МКПК применяли панель цитокинов. С целью исследования любых противовоспалительных эффектов каждого препарата алоэ вера применяли подобные способы анализа за исключением того, что МКПК предварительно обрабатывали препаратом алоэ вера, а затем стимулировали липополисахаридом (ЛПС) или полиинозиновой : полицитидиловой (поли I:С) кислотой для имитации бактериального и вирусного заражения, соответственно.
[0241] Л продемонстрировал более высокую общую антиоксидантную способность, чем ВЧЛ. Л продемонстрировал антиоксидантную защиту в клеточном анализе. Л продемонстрировал значительную нестимулированную и стимулированную ЛПС и поли I:С иммуномодуляторную активность, включая увеличение активации иммунных клеток и уровней цитокинов по сравнению с ВЧЛ. Препарат обесцвеченного листа алоэ вера продемонстрировал более высокую антиоксидантную и иммуномодуляторную активность, чем препарат внутренней части листа.
[0242] В приведенном выше описании представлены подробности определенных вариантов реализации композиций и способов, раскрытых в настоящем документе. Однако следует понимать, что вне зависимости оттого, насколько подробно изложено приведенное выше описание в тексте, композиции и способы можно реализовать на практике множеством путей. Необходимо отметить, как также утверждается выше, что следует понимать, что использование конкретной технологии при описании определенных свойств или аспектов настоящего изобретения не подразумевает, что терминология, предопределенная в настоящем документе, ограничена для включения каких-либо конкретных характеристик свойств или аспектов технологии, с которыми связана данная терминология.
[0243] Специалистам в данной области техники очевидно, что в рамках объема описанной технологии возможны различные модификации и изменения. Предполагается, что такие модификации и изменения относятся к объему вариантов реализации. Специалистам в данной области техники также очевидно, что части, включенные в один вариант реализации, являются взаимозаменяемыми с другими вариантами реализации; одна или более частей из описанного варианта реализации могут быть включены в другие описанные варианты реализации в любой комбинации. Например, любой из различных компонентов, описанных в настоящем документе и/или представленных на фигурах, можно объединить, заменить или исключить из других вариантов реализации. В приведенном выше описании раскрыты некоторые композиции, способы и материалы согласно настоящему изобретению. Настоящее изобретение может подвергаться модификациям в композициях, способах и материалах, а также изменениям в способах изготовления и оборудовании. Такие модификации будут очевидны специалистам в данной области на основании рассмотрения настоящего изобретения или реализации настоящего изобретения, раскрытого в настоящем документе, на практике. Следовательно, не предполагается, что настоящее изобретение ограничено конкретными вариантами реализации, раскрытыми в настоящем документе, но предполагается, что оно охватывает все модификации и альтернативы, которые относятся к истинному объему и духу настоящего изобретения, как оно реализовано в прилагаемой формуле изобретения. Заявитель оставляет за собой право подавать формулу изобретения, направленную на комбинации и субкомбинации раскрытых изобретений, которые, как считается, являются новыми и неочевидными. Изобретения, реализованные в других комбинациях и субкомбинациях черт, функций, элементов и/или свойств, могут быть заявлены посредством изменения данной формулы изобретения или предъявления новой формулы изобретения в настоящей заявке или в родственной заявке. Такую измененную или новую формулу изобретения, будь то направленную на то же изобретение или отличное изобретение, и вне зависимости от того, является ли она отличной, более широкой, более узкой или эквивалентной исходному объему формулы изобретения, считают относящейся к предмету изобретений, описанных в настоящем документе.