Ингибиторы топопизомераз как лекарственные средства, механизм их действия

ИНГИБИТОРЫ ТОПОИЗОМЕРАЗ КАК ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА, МЕХАНИЗМ ИХ ДЕЙСТВИЯ

© В. И. Ващенко

Российская Военно-медицинская академия, Санкт-Петербург

Ключевые слова_________________________________________

лекарственные средства, топоизомеразы, камптотецин, адриамицин, этопозид

Ващенко В.И. Ингибиторы топоизомераз как лекарственные средства, механизм их действия // Обзоры по клин, фармакол. и лек. терапии. — 2003. — Т. 2. — №4. — С. 2-14.

В обзоре рассмотрены некоторые особенности топоизомераз. Представлены структурные формулы основных ингибиторов топоизомераз, в том числе их лекарственных форм. Функциональная характеристика ингибиторов приводится в связи с их практическими возможностями при лечении онкопатологий.

Библ. 151 назв.

ВВЕДЕНИЕ

Завершающие десятилетия XX века были ознаменованы важнейшими открытиями молекулярных биологов, которые не только доказали генетическую детерминированность фенотипа на уровне первичной последовательности ДНК [20], но и установли факт взаимосвязи топологических преобразований ссДНК с изменением многочисленных функций высокоорганизованного живого существа. Объединенными усилиями молекулярных биологов, физиков и математиков установлено, что основным элементом топологии ДНК является ее сверхспирапизация[54, 69, 139, 140]. Значительный вклад в разработку этой проблемы внесли российские научные коллективы Франка-Каменецкого и Лучника [7, 10, 15, 21]. В экспериментах, выполненных в ведущих научных центрах мира, было показано, что контроль за внутриклеточной сверхспирализацией ДНК осуществляет особая высокоспециализированная группа ферментов под общим названием топоизомеразы [12, 72, 146]. Этими, без сомнения, фундаментальными работами установлено, что топоизомеразы требуются в процессе функционирования живой клетки: при репликации, транскрипции и рекомбинации ДНК, а также играют существенную роль в структурной организации хромосом и их преобразованиях: конденсации-деконденсации и сегрегации [15, 105, 108, 134]. Достигнутый в настоящее время прогресс в расшифровке свойств и предназначения топоизомераз бази-

руется в немалой степени на большом количестве клинических исследований, так как в 60-е годы было обнаружено, что ингибиторы топоизомераз можно применять в качестве лечебных онкопрепаратов [38, 117,120, 125]. Повсеместное использование этих препаратов в онкоцентрах разных стран стало общепринятым, так как было установлено, что количественное содержание топоизомераз в опухолевых и здоровых клетках человека различно. В современных условиях поиск новых лекарственных средств из числа ингибиторов топоизомераз осуществляется вначале как отбор наиболее эффективных из них по блокированию основной функции ферментов. В свою очередь, перспективными считают такие препараты, которые оказывают лечебный эффект при моделировании терапевтических схём на экспериментальных животных [45, 46].

СТРУКТУРА ТОПОИЗОМЕРАЗ И ИХ ОСНОВНЫЕ ФУНКЦИИ

Топоизомеразы представлены в клетках живых организмов практически из всех таксономических групп растений и животных, включая гетеротрофы горячих источников. От E.coli до Homo sapiens — все клетки содержат два специализированных класса ферментов: топо I и топо II, которые существенно различаются по своим механическим и физическим свойствам.

Ферменты I типа, включающие топоизомеразы эукариот топо I и топо III, бактериальные топо I, топо III и топо V, по своему составу мономеры (за исключением некоторых растений [32]) и работают при отсутствии высо-коэнергетического кофактора. Главным признаком, характеризующим топоизомеразы I типа, является их способность осуществлять кратковременные однонитевые разрывы ДНК и измененять степень спирализации (Lk) на одну единицу [47, 75, 103, 124]. В настоящее время расшифрована аминокислотная последовательность топо I человека (рис. 1), определены главные функциональные участки данного монопептида, имеющего молекулярный вес 100 кД. Обнаружен и картирован ген, контролирующий этот фермент. Установлено, что он расположен на 20-й хромосоме — 20q12-13.2.,

Ферменты II типа — это топо II эукариот, а также бактериальные: ДНК-гираза и топо IV. Они представляют собой белки, состоящие из нескольких субъединиц, которым необходима АТФ для полной каталитической ак-

Catalytic tyrosine: 723

F361S G363C

G503S D583G

U II 1

D533G

N722S

G717V

і— T729A T729I

Ш

NH2

NTS

1-11 12-19 20-51 52-93 94-111 112-144 145-169 170-205 206-244245-284285-325

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

F361S G363C

ll

G503S D533G

D583G

Catalytic tyrasine: 723

N722S " G717V

T729A

-T729I

326-387 388-436 437-484 485-546 547-569 570-608 609-650 651-682683-732 733-765

18 19 20

12 13

14 15

Рис. 1. Первичная структура топоизомеразы I человека:

А — первичная структура фермента; Б — картированные участки хромосомы 20ц 12-13.2, кодирующие топо I.

Буквенные и цифровые обозначения над стрелками — это картированные участки, контролирующие известные функции фермента

тивности. Основным признаком, характеризующим топоизомеразы II типа, является способность образовывать одномоментно двунитевые разрывы в ДНК и изменять Lk на две единицы [29, 94, 110, 144]. Ферменты II типа регулируют изменение спирализации отрицательно и положительно сверхспирализованной ДНК и, кроме того, могут ликвидировать узлы и переплетения тяжей Д^К. К концу XX века была определена первичная структура целого ряда ферментов топо II из разных фенотипических групп (рис. 2). При этом установлено, что самую высокую функциональную специализацию имеют топоизомеразы млекопитающих. Они представленны двумя изоформами: топо Ма с молекулярным весом 170 кД и топоИр с молекулярным весом 180 кД [48, 58,

108, 111]. Обе контролируются геном, локализованным на 17-й хромосоме — 17 q21-22. Получены убедительные данные о разной чувствительности ферментов топо Па и lip к действию лекарственных препаратов: этопози-да и тенипозида, типичных ингибиторов функциональной активности топоизомераз II типа [52, 55, 78, 148].

Общепризнано, что несмотря на различие катаболи-ческих механизмов и клеточных функций топо I и топо II, имеется главный признак, характеризующий все типы топоизомераз, — это способ образования функционально-активного расщепляемого комплекса. Это ключевое звено биохимической машины, осуществляющей топологические преобразования ссДНК. Поскольку в процессе ее работы образуются кратковременные разрывы цепей ДНК, то при наличии любых дефектов в первичной последовательности ДНК структурно-функциональная целостность генетического материала нарушается необратимо. Вместе с тем существуют и другие ферменты, способные вызывать неустранимые деструктивные изменения в первичной последовательности ДНК, образуя

в ней одно- или двуцепочечные разрывы,, приводящие к нестабильности генетического аппарата [5,48,96], а при превышении критической величины количества этих разрывов — к гибели клетки. Таким образом, топоизомеразы отличаются от всех ныне известных «деструктивных» ферментов тем, что при топологических преобразованиях ссДНК они образуют лишь мгновенные кратковременные разрывы, которые впоследствии ликвидируются в ходе нормальной работы расщепляемого комплекса. При естественных условиях эти ковалентные

Количество аминокислотных остатков

No, of

TR Y r і . residue

GyrB If і I 804

Е. coli. 393 TRY

dvr A I I І І 875

V8-A V8-B* ’ v . v V R571 V8vCNLS

S. cerevisiae |* II I I ' II»! 1429

NLS E410 E680 V ~1200 NLS NLS

S. pombe I 1 1 1І1ЙІІІ 1484

V

Human а |!І 11 H 1 1530

Human $ |il JL „ I _ _L 17627

EGDSA....PLRGK

Рис. 2. Первичная структура типичных топоизомераз II про и эукариот, mono Па и Пр изоформы топоизомераз II человека:

EGDSA ... PLRGK — участок ферментов, определяющий связывание с ДНК; Y — точка разделения на структурные и функциональные домены

димеры фермент-ДНК являются обычными каталитическими интермедиатами и постоянно существуют в небольших количествах в живой клетке [89, 90]. Следует отметить также, что реализация летальности этих интермедиатов, индуцируемая ингибиторами (блокаторами), осуществляется двумя конкурирующими механизмами репарации разрывов в процессе репликации и при конкурентном связывании хеликазами участков ДНК [61, 84], ответственных за ковалентную связь с топоизоме-разами. В ходе репарации разрушается расщепляемый комплекс, и бывшие восстанавливаемые одно- и двух-нитевые разрывы преобразуются в невосстанавливае-мые, что вызывает появление потенциально-летальных двухцепочечных участков, имеющих небольшую длину и удерживаемых вместе при помощи ДНК-белковых сшивок [48, 80, 83]. Непрерывная продукция таких потенциально-летальных участков приводит к блокированию дальнейшей репарации и рекомбинации [60, 109]. В свою очередь это стимулирует сестринский хроматид-ный обмен, генерацию обширных инсерций и делеций и заканчивается транслокациями и хромосомными аберрациями [3, 11, 12]. По мнению современных исследователей, значительная (критическая) концентрация таких перманентно нестабильных участков запускает (или является сигналом) серию событий, кульминацией которых, в конечном счете, является клеточная гибель по типу апоптоза или некроза [3, 22, 56, 74].

Таким образом, результаты исследований предшествующих лет подтверждают дуалистичность функций топоизомераз. С одной стороны, эти ферменты необходимы для правильного функционирования ДНК — носителя генной.информации, а с другой, — являются непременными участниками процесса индуцированной гибели клетки. В гипотетической схеме известного американского биохимика и онколога ОвИегс^ [68] достаточно убедительно отражена последовательность конформационных перестроек ссДНК при образовании тройного комплекса в присутствии ингибиторов топоизомераз I и II класса и связь этого процесса с механизмом гибели клеток по типу апоптоза или некроза (рис. 3). Имеющиеся к настоящему времени данные хорошо согласуются с представленной схемой и подтверждают тот факт, что существуют три вероятных пути формирования тройного комплекса.

Во-первых, препараты (лекарства) могут специфически связываться с комплексом топо-ДНК через промежуточную связь либо с ферментом, либо с ДНК независимо от способа образования димера. Такой порядок подтверждают результаты исследований, полученные при взаимодействии камптотецина с топо I [14, 26, 35, 75]. При образовании тройного комплекса камптотецина с димером топо-ДНК обнаруживались преимущественно (около 100%) только продукты препарат -> топо-ДНК.

Во-вторых, ингибитор может становиться частью тройного комплекса непосредственно при связывании с ДНК. Экспериментально установлено что, около трети препаратов из веществ-ингибиторов, для которых мишенями являются тоПоизомеразы, непосредственно взаимодействуют с нуклеиновыми кислотами [48, 52, 53].

Topoisomerase I Topoisomerase II

Рис. 3. Схема взаимодействия лекарственных препаратов с топоизомеразами и ссДНК ¡по Froelich-Ammon, Osheroff, /995/:

Ha схеме: сверху вниз — порядок взаимодействия; слева — для толоизомеразы I; справа — для толоиэомераэы II; в квадратных скобках — образование тройного комплекса

В-третьих, препарат может вступать в тройной комплекс путем: предварительного образования димера со своими мишенями — топоизомеразами. Такой механизм подтверждают данные по взаимодействию топо II с ее ингибиторами: интоплицином и эллиптицином. В качестве доказательства принимают следующие факты. Во-первых, показано, что фермент вступает в комплекс с препаратом при отсутствии ДНК. Во-вторых, установлено, что константа диссоциации эллиптицина при образовании бинарного комплекса эллиптицин-топо II на порядок ниже величины, зарегистрированной для этой связи в тройном комплексе [100].

Рассмотренная выше схема и экспериментальные данные, подтверждающие отдельные ее элементы, свидетельствуют о том, что способ формирования тройного комплекса при взаимодействии ингибиторов (лекарственных препаратов) с ссДНК, по-видимому, является ключевым звеном гибели опухолевых клеток в процессе достижения желаемого лечебного эффекта [39, 116].

Обнаружение тройных (расщепляемых) комплексов на ранних этапах взаимодействия этопозида с ДНК позволяет утверждать, что препарат действительно вызывает временные разрывы в ДНК и поэтому блокирует религацию [85, 110, 130, 143]. Исследования ази-доаналогов амсакрина и алкилированных производных камптотецина позволили установить, что эти препараты своими кросс-звеньями связывались с ДНК в точке разрыва, однако реакция происходила лишь в присутствии бинарных комплексов препарат-топоизомераза [66, 118, 141]. В пользу такой последовательности образования тройного комплекса свидетельствуют результаты картирования сайтов в ДНК, специфичных к топоизомеразе в точке разрыва [50, 142]. Дополни-

тельным ¡фактом, подтверждающим такой порядок взаимодействия, являются, например, данные, полученные при изучении действия саинтопина [88,95]. Кроме того, опубликованы результаты и других экспериментов, подтверждающие именно такой порядок взаимодействия препаратов с димером топо-ДНК при образовании тройного комплекса. Так, в процессе генетического анализа получены точечные мутации, картированные на участках генов, контролирующих топо I, ДНК-гиразу и топо II, наличие которых вызывало у животных и бактерий лекарственную резистентность или приводило к гиперчувствительности [33-35, 104, 150].

С другой стороны, в ряде других экспериментов получены данные, подтверждающие обратный порядок взаимодействия лекарств с топоизомеразами и ДНК при образовании тройного комплекса. Установлено, что многие из ферментов, которые исследовались в составе бинарных комплексов препарат-фермент, имели высокую каталитическую активность. Этот результат наводит на мысль, что существует преимущественное взаимодействие препарата непосредственно с ферментом. При помощи метода флюоресцентной спектроскопии изучали взаимодействие эллиптицина и кам-птотеци^а с ферментом при образовании димеров топо И-эллиптицин и топо 1-камптотецин и показали, что именно фермент определяет протонацию препарата в тройном комплексе. Определили также время жизни ковалентной связи препарат —» фермент в бинарном и в тройном комплексе, которое в обоих случаях оказалось практически одинаковым [68].

Значительное число работ посвящено раскрытию интимных механизмов образования расщепляемого комплекса. Так, например, новобиоцин ослабляет взаимодействие между ДНК-гиразой и АТФ [112], акларуби-цин блокирует топо П-ДНК связывание [97,98], 1СЯР-193 блокирует рециклирование топо II [83,110]. Такие вещества, как гуинолоны и эллиптицин, преимущественно увеличивают скорость образования разрывов в ДНК и практически не оказывают действия на религацию ДНК [51,52, 114]. Сравнительные исследования по действию этих препаратов на ДНК-гиразу пока не проводились. СледуеТ| также учитывать тот факт, что хотя высокие концентрации блокаторов топоизомераз ингибируют и другие ферментативные функции, в том числе АТФ-гид-ролиз и реакцию переноса цепей [51, 53, 110], они отличаются от ингибиторов топоизомераз тем, что не полностью блокируют каталитическую активность. Исследова-телями-цитологами было продемонстрировано, что ингибиторы топоизомераз от их блокаторов можно отличить по цитотоксическому критерию [99, 106].

Однако несмотря на столь убедительные биохимические и генетические данные, до настоящего времени не обнаружено прямой зависимости между цитотоксичностью (т. е. лечебной эффективностью) препаратов, прочностью их связи в расщепляемом комплексе и способом образования тройчного комплекса [43, 122, 125]. Следовательно, до сих пор остается открытой и весьма актуальной проблема реального способа взаимодействия препаратов с ДНК (ссДНК-?) в присутствии ферментов. Имеющиеся результаты позволяют предполо-

жить, что ссДНК, по-видимому, служит хранилищем для применяемых ингибиторов и блокаторов топоизомераз, а усиление их цитотоксического действия происходит за счет увеличения локальной концентрации лекарства около фермента, взаимодействующего с ДНК.

ПРЕПАРАТЫ (ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА) - ИНГИБИТОРЫ ТОПО I

В настоящее время ингибиторы топо I представляют пока немногочисленную группу веществ (рис. 4). Однако некоторые из них обладают высокой индивидуальной специфичностью к ферменту. Самым известным и широко используемым в клинике ингибитором-лекарством является камптотецин и отдельные его производные (рис. 4Б).

Камптотецин — это очищенный препарат из экстракта СатрШЬеса accuminata и по химической структуре является этиловым эфиром 10-гидроксикамптоде-цин-10-(1,4'-бипиперидин)-1'-карбоновой кислоты. Кроме основного свойства ингибировать, топо I может также блокировать репликацию ДНК на стадии Б-фазы клеточного цикла. Исходный препарат и его аналоги достаточно широко применяются в качестве лекарств 2-го ряда при лечении лейкемии и метастазирующего рака кишечника [3, 16, 18, 71]. Тем не менее эти препараты, по-прежнему, рассматриваются как перспективные ан-тинеопластические лекарства для лечения и других онкопатологий, против которых они в настоящее время еще не используются [4,41,44,71,73]. Для камптотеци-на и его производных подробно изучен порядок его взаимодействия с ссДНК при образовании расщепляемого комплекса и определена специфическая последовательность ДНК этого связывающего участка: ЦГТА. Сравнительно недавно фармакологами изучены новые аналоги камптотецина, такие как топотекан и иринотекан, которые имеют большую растворимость и период полу-выведения, а также повышенную реакционную эффективность лактонных колец и большую их стабильность в крови человека [41, 70, 123, 149].

Эти данные существенно повышают шансы на открытие новых перспективных лекарств на основе химических модификаций камптотецина и других ингибиторов топо I.

ИНГИБИТОРЫ ТОПО II И ЛЕКАРСТВА НА ИХ ОСНОВЕ

Препараты — ингибиторы топо II составляют наиболее обширную группу веществ, которые по своему химическому составу весьма разнообразны. Исторически первыми были отктыты интеркаляторы и антибиотики-ингибиторы ДНК-гиразы. Их свойства и химическая структура исследовались параллельно с открытием ссДНК и ее топологических преобразований [6, 12, 37, 139]. На рисунке 5А представлены классические интеркаляторы, часть из которых оказывают сильный ингибирующий эффект на работу ДНК-гиразы бактерий и дрожжей. Результаты этих многочисленных и разнообразных

НАУЧНЫЕ ОБЗОРЫ

Индолокарбазолы

Compounds X R1 R2 R3 R4* RS* topi Interi

NB-506 CO NHCHO H OH A H +++ ++

ED-110 CO H H OH A H ++ ++

ВЕ-13793С CO H H OH A H + - .

Rebeccamycin CO H H Cl В H + +

КТ6006 CH2 H OH H XC/ +++. +

K252a CH2 H H H _ _

Staurosporine CH2 H H H _

7-Hydroxy-. Staurosporine (UCN-010 . CHOH H H H xO/

’А » O-GLUCOSE

В =

с =

СООСН, ОН 3

.О.

СН3

оси,

HNCH,

осн„

fi-Lapachone

Menadione

Velutin

ОН О

Acetylshikonin

Q, \

xno-c-

OH

Corilagin

Puc. 4A. Структура основных ингибиторов mono I, находящихся на стадии доклинических исследований

Рис. 4Б. Структура основных ингибиторов mono I и лекарственных препаратов на основе камптотецина

исследований открыли для врачей два способа использования ингибиторов топо I! в качестве лекарств.

Во-пёрвых, ингибиторы ДНК-гиразы (топо II) оказались эффективными препаратами против бактериальных инфекций. Основой структуры этих ранних препаратов (антибиотиков-хинолонов) является налидиксовая кислота с весьма посредственной онкотерапевтической эффективностью. Последовательное совершенствование производных налидиксовой кислоты — фторхиноло-нов привело к соединениям, которые имеют обширную антибактериальную активность. Это семейство хиноло-новых производных ципрофлоксацина (рис. 6). Наиболее известными из них являются лекарственные формы оральных антибиотиков: ципрофлоксацина, норфлокса-цина и ципрофлокса, которые обладают выраженным бактерицидным действием и весьма эффективно предотвращают размножение грамположительных и гра-мотрицательных бактерий и поэтому используются довольно часто в клинике [16, 18, 71].

Во-вторых, лекарственные формы ингибиторов топо II из других химических соединений являются эффективными препаратами для лечения онкопатологий весьма широкого профиля. В настоящее время из тысяч изученных веществ-ингибиторов топо II получены сотни препаратов с выраженным лечебным эффектом. Эти разнообразные препараты классифицируются по нескольким основным группам (рис. 6). Такие препараты, какэтопо-зид, доксорубицин, амсакрин, митоксантрон являются общепринятыми лекарствами, широко применяемыми для системного (комплексного) лечения опухолей человека [9, 16, 18]. Необходимо отметить еще одну важную особеность препаратов (блокаторов) и ингибиторов. Так, повышение уровня топоизомераз вызывает преобразование клеток гиперчувствительных к лекарствам-ядам в резистентные к этим препаратам [86, 87, 126] и, наоборот, уменьшение уровня ферментов способствует превращению резистентных к ингибиторам клеток в ги-перчувствительные [33, 73, 119].

Следует отметить, что в отличие от ингибиторов топо I, препараты-ингибиторы топо II не обладают строгой специфичностью и в большинстве случаев ингибируют ферментативную активность обеих топоизомераз [111, 113, 125]. Имеются также данные, подтверждающие мнение, что гуинолоны являются наиболее изученным классом лекарств, для которых продемонстрировано действие

на топоизомеразы как эукариот, так и прокариот [16,79]. Именно эти их свойства привлекают врачей-онкологов, так как дают надежду на синтез лекарства с более низкой токсичностью, чем каждый из препаратов, иденти-фицированых как ингибиторы топо I и топо II. Так как для упомянутых лекарств доказано дифференцированное воздействие на изоформы топо II in vitro, то предположили, что при клиническом использовании они окажут преимущественное действие на топо На [58]. Однако в более поздних публикациях появились данные, свидетельствующие о том, что и топо П(3 в качестве мишени также может играть значимую роль в лечебном действии этих препаратов [42, 55, 86, 111]. Можно отметить, что роль топоизомераз эукариот, как мишени для препаратов-гуинолонов (их ингибирующий эффект, как известно, является неспецифичным) по-прежнему неясна и подлежит дальнейшему изучению. Правда, уже имеются данные, полученные при изучениии эффективности гуинолонов и их аналогов против топоизомеразы II и IV, которые наводят на мысль о необходимости применять эти препараты для усиления лечебного эффекта других антинеопластических лекарств [67, 79, 145]. В скором времени к используемым в клинике препаратам можно будет причислить соединение СР-115953, для которого мишенью служит топо II [107]. По своей структуре препарат СР-115,953 относится к классу гуинолонов и поэтому действует не только на топо II, но и на ДНК-гиразу. Экспериментально установлено, что его ингибирующий эффект больше, чем у этопози-да [110]. Кроме того, все интенсивнее изучается препарат саинтопин — типичный представитель группы веществ, которые избирают мишенями обе эукариотические топоизомеразы, т. е. топо I и топо II [95]. Уже разработаны его первые лекарственные формы, которые проходят предклинические испытания. Значительно расширились поиски новых лекарственных препаратов среди группы карбазолов [92, 101].

В-третьих, существует, по нашему мнению, еще один перспективный путь для комбинированного применения ингибиторов топо I и топо II. Так, еще в 80-десятые годы мы выдвинули гипотезу, что при одновременной работе топо I и топо II между обеими типами топоизомераз существует функционально-сбалансированное динамическое равновесие [1,2]. Недавно эта гипотеза экспериментально подтверждена. В опытах in situ на живых бактериаль-

Антрациклины и его производные О ОН О

СН2ОН

Подофиллин и его производные

Взаимодействие ссДНК mono II

Doxorubicin Nh2 +++ +++ R R1

Adriamicin NH3 ++ +++ Etoposide (VP-16) OH OCH3

Cyanomorpholino Dihydroxy-etoposide OH OH

Doxorubicin NH40CN ++ - Etoposide-quinone 0 0

В

Сэинтопин и его производные О

Saintopin* Saintopin Е

USE1022

R1

Н

Н

Межкаланты

Саркозин

L—Пролин L—Метилвалин L—Пролин L—Метилвалин

D—Валин

Я2

R3

Взаимодействие с mono 1 mono II

ОН

ОН

О

o-s=o

н

гсн,

о

++

++

он

Примечание. * — Препараты используются в клинике

Рис 5. Структурные формулы основных соединений и онкопрепаратов — ингибиторов mono II

ных клетках удалось продемонстрировать, что плотность сверхспирализации хромосомы Е.соН (ее топологическая структура) уравновешивается разнонаправленными действиями двух форм топоизомераз: топо I, которая снимает отрицательные 1_к, и ДНК-гиразы (топо II), которая восстанавливает количество этих сверхвитков [82, 112].

Таким образом, осознанно комбинируя применение химио- и радиотерапии в терапевтических схемах можно не только снизить цитоксичность лекарственных препаратов, но и повысить их лечебную эффективность. Во всяком случае уже появились отдельные работы, в которых продемонстрирован подобный подход [25,28,40,127].

ЛЕКАРСТВЕННАЯ РЕЗИСТЕНТНОСТЬ И ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ

К настоящему времени установлено, что каждый из этих процессов очень важен для использования лекарств и представляет собой сложный комплекс по взаимодействию различных биохимических механизмов клетки. Наибольшего прогресса в выяснении деталей лекарственной резистентности, гиперчувствительности и внутриклеточной фармакокинетики удалось достичь при использовании генетического и ингибиторного анализа.

Информация по лекарственной резистентности или гиперчувствительностИ лекарственных препаратов к то-поизомеразам получена практически полностью методами генетического анализа. Для выполнения таких исследований использовали предварительно выделенные из клинических образцов и картированные ферменты. При анализе сравнивали данные экспериментарных лабораторных исследований, в которых использовались образцы со случайными мутациями, с результатами картирования дефектных ферментов, полученных при помощи сайтнаправленного мутагенеза белкового пула из образцов от больных, имеющих измененную лекарственную чувствительность. Первоначально большая часть исследований (была основана на анализе камптотецина и его аналогов;. Установлено, что участок взаимодействия то-поизомеразы с лекарством расположен вблизи активного сайта, состоящего из нескольких тирозинов и, как полагают, он является определяющим в лекарственной чувствительности. Однако в некоторых работах приводятся доказательства, что и другие высококонсервативные участки важны для лекарственного взаимодействия [75, 88]. При|изучении гуинолонов были идентифицированы два сайта для ДНК-гиразы, которые отвечали за резистентность к этим препаратам. Один участок обнаружен в gyrA субъединице и расположен рядом с серином 83. Мутации по' этой позиции очень часто регистрировались в клинических изолятах и всегда коррелировали с высоким уровнем [лекарственной резистентности. Дефектная то-поизомераза сильно ослабляла прочность связи гуинолонов в тройном комплексе [89, 133, 138]. Второй сайт был установлен в gyrB субъединице. Мутация по нему вызывала эффекты, свойственные мутации по gyrA, кроме того! на этом же участке дугВ была картирована дополнительная мутация, вызывающая лекарственную гиперчувствительность [138]. В структурных доменах то-поизомераз эукариот, гомологичных gyrA и gyrB субъединицам ДНК-гиразы, также были идентифицированы аналогичные мутации, однако они были разбросаны на участке в несколько сотен нуклеотидов [27,82,144]. Пока мало убедительных данных, объясняющих механизм связи мутации в топо II с изменением лекарственной чувствительности. Можно отметить мутацию, связанную с уменьшением лекарственного аффинитета [57] и другую [62,76], вызывающую увеличение аффинитета вместе со снижением уровня ДНК-религации. И хотя опубликован-

: . i i

•: 1 I

О ОН

Рис. 6. Антибактериальные лекарства — ингибиторы ДНК-гиразы: структурная формула ципрофлоксацина и его производных

ные результаты «сверхточного» исследования топоизо-меразных мутаций не вызывают сомнения, однако с точки зрения биохимика трудно представить, чтобы один аминокислотный остаток при взаимодействии с лекарством давал очень прочную связь [19,22]. Во всяком случае, расположение активных участков доменов реконструированной конформационной структуры топо II и данные по взаимодействию новобиоцина с ферментом не согласуются с результатами генетического анализа точечных мутаций [31,36].

ИНГИБИТОРЫ ТОПОИЗОМЕРАЗ И ПРОЦЕСС КЛЕТОЧНОЙ ГИБЕЛИ

Исследования последних лет показали, что патогенез многих болезней человека, в том числе рака, аутоиммунных заболеваний и вирусных инфекций связан с неспособностью клеток подвергаться апоптозу [8, 23, 24]. Снижение способности к апоптозу у опухолевых клеток играет важную роль в развитиии многих опухолей, однако реализуется с помощью различных механизмов, анализ которых полезен для оценки существующих и поиска новых путей лечения онкологических заболеваний. Всемирную известность получили работы последнего десятилетия, особенно эксперименты генетиков, которые раскрыли многие интимные механизмы генетического контроля программированной гибели (апоптоза) клеток [17, 22, 64,77,129]. Исследователи полагают, как это видно на одной из схем (рис. 7), что несмотря на одну из центральных ролей белка Р-53 важное место в развитиии процесса индуцированного апоптоза играют семейства генов Bcl-2, Ras и РКС [8, 65, 121, 131, 136].

Сравнительно хорошо изученным механизмом подавления апоптоза является повышение ауто- и пара-кринной экспрессии ростовых факторов и рецепторов к ним, возникающее в опухолевых клетках вследствии активации онкогенов. Примером такого механизма блокирования программы гибели клеток и образования опухоли является хронический миелолейкоз. При активации онкогена в результате траслокации t (9, 22) образуется химерный ген bcr-abl, продуктом которого является измененный онкобелок, обладающий повышенной тиро-зинкиназной активностью и служащий важным звеном в передаче сигналов, блокирующих апоптоз клетки.

Другим механизмом нарушения апоптоза в опухолевых клетках является мутация в генах Bcl-2, контролирующих программированную клеточную гибель. Полагают, что их сверхэкспрессия лежит в основе развития не только В-клеточной фолликулярной лимфомы человека, но И многих других опухолей. Онкогенная трансформация клетки часто сопровождается мутацией в гене Р-53 и превращает его из индуктора в ингибитор апоптоза.

Особый интерес для понимания трансформации функций апоптоза при развитиии опухолевого процесса представляет промиелоцитарный острый лейкоз. В ходе экспериментов было установлено, что при образовании опухоли происходит слияние PML-гена (хромосома 15) с рецепторами ретиноевой кислоты (хромосома 17). В ре-

Phase I Insult Generation

Phase II Signal Transduction

L-Asparaginase Colchicine

Taxol  Microtubules Vincristine

Doxorubicin

5-Fluorouracil

Bleomycin

- Protein Synthesis

Phase III Decision and Execution

Apoptosis

Bcl-2, PKC, Ras,,

DNA-------P53

Methotrexate . and Point

Etoooside Ara-C

Mitomycin С

Hydroxyurea

RNA

6-Mercaptopurine

Irradiation-------?

Heat shock----------- Other proteins?

Molecular

Sensors

of

Damage

and

injury

Decision

Point

Proteases

Senescence?/

Differentiation?

Рис. 7. Схема генного контроля программированной клеточной гибели [по Наппип V., 1997]

зультате образуется химерный ген РМ1_-ЯАЯА, являющийся маркером данного заболевания. В последующих работах показано, что поломка в 6-м интроне РМ1_-гена сопровождается высокой чувствительностью к действию значительных доз трансретиноевой кислоты. Предположили, что избирательная чувствительность опухолевых клеток промиелоцитарного острого лейкоза связано с активацией гена Р-53 в этих клетках. Однако в других экспериментах было продемонстрировано, что существуют и иные мутации, в том числе и в самом гене Р-53. Это приводит к переключению сигнала от активации апоп-тоза к полному его блокированию.

В последующем было установлено, что состояние структуры ДНК, ферментов, ее стабилизирующих, а также микроокружения представляют один из важных этапов как естественной, так и программированной клеточной гибели [22, 23, 68, 71, 77]. Кроме того, экспериментаторов заинтересовал тот факт, что значительное число генов, контролирующих апоптоз, расположено на 17-й хромосоме, имеющей, как уже установлено, генытопоизомеразы II. Поэтому расширились исследования по выяснению роли топоизомераз и их ингибиторов в многоэтапном процессе программированной клеточной гибели [34, 36, 80, 87]. И хотя предыдущий анализ лекарственных препаратов продемонстрировал избирательность их свойств по сравнению с классическими ингибиторами топоизомераз, тем не менее выяснение функциональных особенностей препаратов и ингибиторов топоизомераз в процессе апоп-

тоза проводится по единому принципу ингибиторного анализа[49, 128, 132, 137]. Пока неясно, в какой мере полученные в подобных работах доказательства взаимодействия, например, новобиоцина стопо II дрожжей можно распространить на уже используемые в клинической практике антинеопластические препараты. Поэтому весьма актуальны дальнейшие исследования по обнаружению и картированию специфичных участков взаимодействия топоизомераз как со старыми, так и вновь синтезированными препаратами.

Резюмируя, можно выделить несколько критериев, которые рекомендуется учитывать при подборе терапевтических средств в процессе совершенствования лечебных программ. Во-первых, это наличие надежных данных о связи между количеством применяемого ингибитора (блокатора) топоизомераз и гибелью опухолевых клеток по механизму апоптоза. Во-вторых, учет результатов экспериментов [13, 91, 97, 151], подтверждающих механизм множественной лекарственной резистентности и роль Р-53, каспаз, Р-гликопротеина и топоизомераз в топогических преобразованиях ссДНК на разных этапах процесса индуцированной гибели опухолевых клеток. В-третьих, обмен опытом при совершенствовании программ лечения онкологических больных. Примеры такого сотрудничества врачей-радиологов и биохимиков в процессе осуществления комплексных лечебных программ, в которых были использованы данные о свойствах ингибиторов и блокаторов топоизомераз, уже имеются [81, 86, 93, 135].

ЛИТЕРАТУРА

¡ 23.

1. Ващёнко В.И., Щедрина Л.В., Комар В.Е.

Топоизомераза II — ее роль в конформационных 24.

изменениях суперспиральной ДНК лимфоцитов после g-облучения // Биополимеры и клетка. — 1985. —

Т. 1, № 4. - С. 203-207. 25.

2. Ващенко В. И. Методы исследования сверх-

спиральной ДНК эукариот // Проблемы криобиологию. - 1996. - № 4. - С. 16-24. 26.

3. Владимирская Е.В., Масчан A.A., Румянцев А.Г. Апоптоз

и его роль в развитии опухолевого роста // Гэматол. и трансфузиол. — 1997. — Т. 42, Ns 5. — С. 4-9. 27.

4. Бычков М. Б. Топотекан — ингибитор топоизоме-

разы I — новый противоопухолевый препарат // Совр. онкология. — 1999. — Ns 1. — С. 23-27. 28.

5. Вилёнчик М. М. Нестабильность ДНК и отдаленные последствия воздействия излучений. — М.:

Энергоатомиздат, 1987. — 192с.

6. Волков С.Н. Развитие нелинейной конформационной 29.

динамики ДНК// Биополимеры и клетка. — 1990. —

Т. 6, INs 4. -С. 21-31.

7. Вологодский A.B. Топология и физические свойства кольцевых ДНК. — М.: Наука, 1988.— 192с. 30.

8. Волянский Ю.Л., Колотова Т.Ю., Васильев Н.В.

Молекулярные механизмы программированной

клеточной гибели //Успехи совр. биол. — 1994. — 31.

Т. 114, вып. 6. - С. 693-704.

9. Гершанович М.Л., Филов В.А., Акимов М.А., Аки- 32.

мов A.A. Введение в фармакотерапию злокачественных опухолей. — СПб.: Сотис, 1999. — 152 с.

10. ГлаЗер В.М., Лучник А.Н. Изменение топологического

числа сцепления замкнутых петель ДНК при дифференцировке клеток мышиной эритролейкемии // 33.

ДАН СССР. - 1980. - Т. 250, № 5. - С. 1247-1250..

11. Животовский Б.Д. Молекулярные механизмы индуци-

рованной радиацией программируемой гибели клеток: Автореф. дис. ... д-ра биол. наук. — Л., 1988. — 42 с. 34.

12. Кафиани К.А., Бронштейн И.Б. ДНК-топоизомеразы и механизм действия антинеопластических соединений //

Успехи биол. химии. — 1988. — Т. 29. — С. 84-112. 35.

13. Ли С.-Х., Чанг К.Т., Квон О.Ю., Квон Т.К. Этопозид-завйсимая активация каспазы-3 в опухолевых клетках не связана с активацией каспазы-1 // Experím.

Oncol. - 2002. - Т. 24, Ns 2. - Р. 15-107.

14. ЛитовчикЛ.В., Александрова Е.С., Габибов А.Г., 36.

Бронштейн И. Б. Исследование взаимодействия камптотецина с топоизомеразой I методом флуоресцентной спектроскопии //ДАН. — 1995.— 37.

Т. 340, № 2. - С. 271-272.

15. Лучник А.Н. Изменение сверхспирализации ДНК при 38.

дифференцировке, старении и злокачественной трансформации // Онтогенез. — 1983. — Т. 14,

Ns 3. - С. 227-237.

16. Машковский М.Д. Лекарственные, средства. — 14-е 39.

изд., пере раб., испр. и дополн.В 2 т. — М.: Новая

Волна, 2002. — Т. 2. — 608 с.

17. Осипова Е.Ю. Клеточные модели оценки уровня и

характера апоптоза клеток крови человека: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. — М., 2003. — 48 с. 40.

18. Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России: Справочник/М.: АстраФармСервис, 2002. — 1536 с.

19. Уманский С. Р. Апоптоз: молекулярные и клеточные механизмы // Мол.биол. — 1996. — Т. 30, вып. 3. — С. 487-502. 41.

20. Уотсон Дж. Молекулярная биология гена: Пер. с англ. /

Под ред. акад. В.А. Энгельгардта. — М.: Мир, 1978. — 720 с.

21. Франк-Каменецкий М.Д. Теоретические модели ДНК. — 42.

М.: ВИНИТИ. Сер. Молекулярная биология, 1979. —

Т. 15. - С. 42-73.

22. Хансон К. П. Программированная клеточная гибель (апоптоз): молекулярные механизмы и роль в биологии

и медицине // Вопр. мед. химии. — 1997. — Т. 43, вып. 5,- С. 402-415.

Хансон К. П. Апоптоз: современное состояние проблемы // Известия АН. Сер. биол. — 1998. —

№2.-С. 134-141.

Хансон К. П. Роль апоптоза в старении и возрастной патологии // Успехи геронтол. — 1999. — Вып. 3. —

С. 103-110.

Швемберг И.Н., Гинкул Л.Б. Апоптоз: роль в нормальном онтогенезе и патологии // Вопросы онкологии. — 2002. — Т. 48, № 2. — С. 159-171. Якубовская Е.А., Куделина И.А., Бронштейн И.Б., Габибов А. Г. Новый подход к исследованию кинетики топо-изомеразы I //ДАН. - 1998. - Т. 361, № 6. - С. 837-838. Якубовская Е.А., Габибов А.Г. Топоизомеразы. Механизмы изменения топологии ДНК// Мол. биология. - 1999. - Т. 38, № 3. - С. 368-384.

Abe Y., TakahashiJ., FukudaH. etal. A phase II study of cisplatin, oral administration of etoposide, OK-432 and radiation therapy for inoperable stage III non-smal cell lung cancer//Int.

J. Clin. Oncol. - 1998. - Vol. 3, N6,- P. 365-369.

Adams D.E., Sheckhtman E.M., Zechiedrich E.L. et at. The role of topoisomerase IY in partitioning bacterial repli-cons and the structure of catenated intermediates in DNA replication//Cell. - 1992. - Vol. 71, N2.- P. 277-288. Anderson R.D., Berger N.A. Quantitation of spindle-inhibiting effects of metal compounds by chromosome length measurements. — 1994. — Vol. 98, N 2. — P. 215-218.

Austin C.A., Marst K.L. Eukaryotic DNA topoisomerase libeta//BioEssays. - 1998. Vol. 20, N 3. - P. 215-226. Balestrazzi A.,Ressegotti V.,Panzarasa L.,Carbonera D. Isolation and functional analysis of the 5*-flanking region of carrot top 1 b gene coding for the b isoform of DNA topoisomerase I// Biochim. Biophys. Acta. — 2003. —

Vol. 1625, N2.-P. 197-202.

Beck W. Т., Kim R., Chen M. Novel action of inhibitors of DNA topoisomerase II in drug-resistant tumor cells // Cancer Chemother. Pharmacol. — 1994. — Vol. 34 (Suppl). - P. S14-S18.

Beck IV. Т., Danks M.K., Wolverton J.S. et al. Drug resistance associated with altered DNA topoisomerase II// Adv. Enzyme Regul. - 1993. - Vol. 33. - P. 113-127. BjornstiM. A., BenedettiP.,Viglianti G.A.,Wang J.C. Expression of human DNA topoisomerase I in yeast cells lacking yeast DNA topoisomerase: restoration of sensitivity of the cells to the antitumor drug camptothecin // Cancer Res. - 1989. - Vol. 49. -N 12. - P. 6318-6323.

Berger J.М., Wang J.C. Recent developments in DNA topoisomerase II structure and mechanism // Curr. Opin. Struct. Biol. - 1996. - Vol. 6, N 1,-P. 84-90.

Berger J.M. Structure of DNA topoisomerases // Biochim. Biophys. Acta. - 1998. - Vol. 1400, N 1-3. - P. 3-18. Bertrand R., Kerrigan D., Sarang М., Pommier Y. Cell death induced by topoisomerase inhibitors. Role of calcium in mammalian cells // Biochem. Pharm. — 1991. — Vol. 42,

N 1,- P. 77-85.

Boersen L. Cook J.G. Common regulation of apoptosis signaling induced by CD95 and the DNA-damaging stimuli etoposide and gamma-radiation downstream from caspase-8 activation //J. Biol. Chem. — 1999. -f Vol. 274, N20. - P. 14255-14261. |

Boothman D.A., Fukumaga N., Wang M. Down-regulation of topoisomerse I in mammalian cells following ionizing radiation // Cancer Res. — 1994. — Vol. 54, N 17. —

P. 4618-4626.

Brogden R.N., Wiseman L.R. Topotecan.A review of itspotential in advanced ovarian cancer// Drugs. —

1998. - Vol. 56, N4.- P. 709-723.

Broun G.A., Mcpherson J.P., Gu L, Hedley D.W. et al. Relationship of DNA topoisomerase II alpha and beta expression to cytotoxicity of antineoplastic agents in human acute lymphoblastic leukemia cell lines// Cancer Res. - 1995. - Vol. 55, N 1,-P. 78-82.

43. Burden D.A., Osherof N. Mechanism of action of eukaryotic topoisomerase II and drugs targeted

to the enzyme // Biochim. Biophys. Acta — 1998. —

Vol. 1400, N 1-3. - P. 139-154.

44. Carbonero-Garcia R., Supko J.C. Current perspectives on the clinical experience, pharmacology and continued development of the camptothecins // Clin. Cancer Res. — 2002. - Vol. 8, N3,- P. 641-666.

45. Capranico G., Zunino F. Abnormal red cells in blood of men subjected to stimulated dives // Eur. J. Cancer. — 1992. — Vol. 12. - P. 2055-2060.

46. Capranico G., Giaccone G., Zunino F., Garattini S.D. etal. DNA topoisomerase inhibitors // Cancer Chemother and Biol. Res. Modifiers. — 1996. — Vol. 16. — P. 68-87.

47. Champoux J.J. Topoisomerse inhibition by phenolic metabolites: a potential mechanism for benzene«s clastogenic effects//Carcinogenesis. 1995.— Vol. 16,

N 10. -P. 2301-2307.

48. Chen A.Y., Liu L.F. DNA topoisomerases: essential enzymes and lethal targets//Ann. Rev. Pharmacol.

Toxicol. - 1994. - Vol. 34. - P. 191-218.

49. Cheson B.D. Standard and low-dose chemotherapy for the treatment of myelodysplastic syndromes // Leukemia Res. - 1998. - Vol. 22. - Suppl. 1.- P. S17-S21.

50. Cline S.D., Osheroff N. Cytosine arabinoside lesions are pesition-specific topoisomerase II poisons and stimulate DNA cleavage mediated by the human type II enzymes // J. Biol. Chem. - 1999. - Vol. 274, N 42. - P. 29740-29743.

51. Corbett A. H., Osheroff N. When good enzymes go bad: conversion of topoisomerase II to a cellular toxin by antineoplastic drugs // Chem. Res. Toxicol. — 1993. —

I/O/. 6, N5.- P. 585-597.

52. Corbett A. H., Hong D., Osherof N. Mechanism of action of eukaryotic topoisomerase II and drugs targeted to the enzyme // J. Biol. Chem. — 1993. — Vol. 268, N 1-3. —

P. 14394-14398.

53. Corbett A. H., Osherof N. Mechanism of action of eukaryotic topoisomerase II and drugs targeted to the enzyme // Biochim. Biophys. Acta. — 1999. — Vol. 1400,

N 1-3. - P. 139-154.

54. Cozzarelli N. R. DNA gyrase and the supercoiling of DNA // Science. - 1980. - Vol. 207, N4434. - P. 953-960.

55. Danks M.K., Qiu J., Catapano C. V., Schmidt C.A. et al. Subcellular distribution of the alpha and beta topoisomerase ll-DNA complexes, stabilized by VM-26 // Biochem. Pharmacol. - 1994. - Vol. 48, N9.- P. 1785-1795.

56. DarzynkiewiczZ., Juan G., LiX. etal. Cytometry in cell necro-biology: analysis of apoptosis and accidental cell death (necrosis) // Cytometry. — 1997. — Vol. 27, N 1. — P. 1-20.

57. DNA topoisomerases in cancer / Ed. by Potmesil M. and Kohn K.W., Oxford University Press. London, 1991. — 376 p.

58. Drake F.H., Hofmann G.A., Bartus H.G. et al. Biochemical and pharmacological properties of p170 and p180 forms of topoisomerase II // Biochemistry. — 1989. —

Vol. 28, N2.-P. 8154-8160.

59. Drake F.H. Protein tracking-induced supercoiling of DNA: a tool to regulate DNA transactions in vivo?// 1989. —

Vol. 16, N 2.- P. 91-99.

60. Downes C.S., Johnson R.T. DNA topoisomerases and DNA repair // BioEssays. — 1988. — Vol. 8, N 6. — P. 179-184.

61. Duguet M. When helicase and topoisomerase meet! //

J. Cell Science. - 1997. - Vol. 110. - P. 1345-1350.

62. Eckardt J. R. Role of non histone proteins in the chromosomal events of mitosis // FASEB J. — 1994, —

Vol 8, N 12. - P. 947-956.

63. Elsea S.H., Hsiung Y. Nitiss J.L. A yeast type topoisomerase selected for resistance to quinolones.Mutation of histidine 1012 to tyrosine confers resistance to nonintercalative drugs but hypersensitivity to ellipticine//J. Biol. Chem. —

1995. - Vol. 270, N4. - P. 1913-1920.

64. Ferguson L.R., Bagulev B.C. Topoisomerase II enzymes and mutagenicity//Environ. Mol. Mutagen. — 1994. — Vol. 24, N4.- P. 245-261.

65. Ferguson L.R. Inhibitors of topoisomerase II enzymes: a unique group of environmental mutagens and carcinogens // Mut. Res. - 1998. - Vol. 400. - N 1-2. - P. 271-278.

66. Freudenreich C.H., Kreuzer K.N. Localization at an aminoacridine antitumor agent in a type II topoisomerase-DNA complex // Proc. Natl. Acad. Sci. — 1994. —

Vol. 91, N23. - P. 11007-11011.

67. Ferrero L., Cameron B., Manse B., LagneauxD. etal.

Cloning and primary structure of Staphylococcus aureus DNA topoisomerase IY: a primary target of fluoroquinolones // Mol. Microbiol. - 1994. - Vol. 13, N4. - P. 641-653.

68. Froelich-Ammon S.J., Osheroff N. Topoisomerase poisons: harnessing the dark side of enzyme mechanismt// J. Biol. Chem. - 1995. - Vol. 270, N37. - P. 21429-21432.

69. Fuller F.B. The writhing number of a space curve // Proc. Nat. Acad. Sci. - 1971. - Vol. 68, N4. - P. 815-819.

70. Garcia-Carbonero R., Supko J.C. Current perspectives on the clinical experience, pharmacology, and continued development of the camptothecins // Clin. Cancer Res. — 2002. - Vol. 8, N3,- P. 641-661.

71. Gattoa B., Capranico G., Palumbo M. Drugs acting on DNA topoisomerases: recent advancrs and future perspectives // Curr. Pharm. Des. - 1999. - Vol. 5, N3,- P. 195-215.

72. Gellert M. DNA topoisomerases // Ann. Rev. Biochem. — 1981,- Vol. 50. - P. 879-910.

73. GieselerF., Bauer E.. NuesslerV., Clark M. Molecular effects of topoisomerase inhibitors in AML cell lines: coreelation of apoptosis with topoisomerase II activity but not with DNA damage // Leukemia. — 1999. — Vol. 13,

N 11.- P. 1859-1863.

74. Granville D.Z., Carthy C.M., Hunt D.W., McManus B.H. Apoptosis: molecular aspects of cell death and disease // Lab. Invest. - 1998. - Vol. 78, N 8. - P. 893-913.

75. Gupta M., Fujimori A., Pommier Y. Eukaryotic DNA topoisomerase I//Biochim. Biophys. Acta. — 1995. —

Vol. 1262, N 1,- P. 1-14.

76. Hannun Y.A. Apoptosis and the dilemma of cancer chemotherapy//Blood. - 1997. - Vol. 89, N6.- P. 1845-1853.

77. Hengartner M., Horwitz H. Apoptosis and the // Cell. —

1994. - Vol. 76, N4.- P. 665-676.

78. Hopfner R., Mousli M., Jeltsch J.M., Voulgaris A. et al. ICB

90, a novel human CCAAT binding protein, involved in the regulation of topoisomerase lib expression // Cancer Research. - 2000. - Vol. 60, N 1,-P. 121-128.

79. Ouinolone Antimicrobial Agents / Ed. by Hooper D. S.,

Wolf son J.S. American Society for Microbiology. — Washington, 1993. —317 p.

80. Howard M.T. Organization of mammalian chromosomal DNA: superhelical and folded circular DNA subunits from the interphase cell nuclei // 1991. — Vol. 37, N3. — P. 421-432.

81. Hooper D.S., Wolf son J.S. Fluoroquinolone antimicrobial agents//N. Engl. J. Med. - 1991. - Vol. 324, N 6.-

P. 384-394.

82. Hsiung Y., Elsea S.H., Osheroff N., Nitiss J.L. A mutation in yeast TOP2 homologous to a quinolone-resistant mutationin bacteria.Mutation of the am/no acid homologous to Ser83 of Escherichia coli gyrA alters sensitivity to eukaryotic topoisomerase inhibitors // J. Biol. Chem. - 1995. - Vol. 270, N35. - P. 20359-20364.

83. Ishida R., Hamatake M., Wasserman R.A. etal. DNA topoisomerase II is the molecular target of bisdioxo-piperazine derivatives ICRF-159 and ICRF-193 in Saccharomyces cerevisiae // Cancer Res. — 1995. —

Vol. 55, N 11.-P. 2299-2303.

84. Jasin M. Chromosome breaks and genomic instability// Cancer Invest. - 2000. - Vol. 18, N1.-P. 78-86.

85. Jensen P.B., Sehested M. DNA topoisomerase II rescue by catalytic inhibitors: a new strategy to improve the antithumor selectivity of etoposide // Biochem.

Pharmacol. - 1997. - Vol. 54, N7.-P. 755-759.

86. Kaufman S.H., Gore S.D., Hiller C.B., Jones R.J., Zwelling L.A. Topoisomerase II and the response to antileukemic therapy// Leuk.Lymphoma. - 1998. - Vol. 29, N 3-4. - P. 217-237.

87. Kaufman S.H. Cell death induced by topoisomerase-targeted drugs: more questions than auswers // Biochim. Biophys. Acta. - 1998,- Vol. 100, N 1-3. - P. 195-211.

88. Knab A.M., Fertala J., Bjornsti M.A. A camptothecin-resistant DNA topoisomerase I mutant exhibits altered sensitivities to other DNA topoisomerase poison //

J. Biol. Chem. - 1995. - Vol. 270, N11.- P, 6141-6148.

89. Kingma P. S., OsheroffN. The response of eukaryotic topoisomerases to DNA damage // Biochim. Biophys.

Acta. - 1998. - Vol. 1400, N1-3,- P. 223-232.

90. Kingma P.S., Burden D.A., Osheroff N. Binding of etoposide to topoisomerase II in absence of DNA: decreased affinity as a mechanism of drug resistance // Biochem. - 1999. - Vol. 38, N 12. - C. 3457-3461.

91. Kuo M.L., Shen S.C., Yang C.H., Chuang S.E. etal. Bcl-2 prevents topoisomerase II inhibitor GL331-induced apoptosis is mediated by down-regulation of poly(ADP-ribose) polymerase activity // Oncogene. — 1998. —

Vol. 17, N 17. - P. 2225-2234.

92. Kurz E.U., Wilson S.E., Leader K.B. et at. The histone diacetylase inhibitor sodium butyrate induces DNA topoisomerase II alpha expression and confers hypersensitivity to etoposide in human leukemic cell, lines // Mol. Cancer Ther. - 2001. - Vol. 1,N2.~ P. 121-131.

93. Lamond J.L., Wang M., Kinsella T.J., Bootman D.A. Concentration and timing dependence of lethality enhancement between topotecan, a topoisomerase I inhibitor, and ionizing radiation // Int. J. Radiation Oncology Biol’ Phys. - 1996. - Vol. 36, N2.-P. 361-368.

94. Lamond J.L., WangM., Kinsella T.J., Bootman D.A. Radiation lethality enhancement with 9-amino-camptothecin: comparison to other topoisomerase I inhibitors // Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. —

1996. - Vol. 36, N2,- P. 369-376.

95. Leteurtre F., Fujimori A., Tanizawa A., Chhabra A.

et at. Saintopin, a dual inhitor of DNA topoisomerases / and

II, as a probe for drug-enzyme interactions // J. Biol.

Chem. - 1994. - Vol. 269. - P. 28702-28707.

96. Liu X., Zou H., Slanghter C., Wang X. DFF, a hetero-dimeric protein that functions downstream of caspa-se-3 to trigger DNA fragmentation during apoptosis//

Cell. - 1997. - Vol. 89, N2.- P. 175-184.

97. Maxwell A. The molecular basis of quinolone action //

J. Anthimicrob. Chemother. — 1992. — Vol. 30. — P. 409-414.

98. Maxwell A. DNA gyrase as a drug target // Biochem. Soc.  Trands. - 1999. - Vol. 27, N2.-P. 48-53.

99. Morris E.J., Geller H.M. Induction of neuronal apoptosis by camptothecin, an inhibitor of DNA topoisomerase I: evidence for cell cycle-independent toxicity// J. Cell Biol. - 1996. - Vol. 134, N3,- P. 757-770.

100. Nabievl., Chourpal., RiouJ. F. etal. Molecular interactions of DNA topoisomerase I and II inhibitor with DNA and topoisomerases and ternary complexes: binding modes and biological effcts for intoplicine derivatives //

Biochem. - 1994. - Vol. 33, N 30. - P. 9013-9023.

101. Nakamura K., Sugumi H., Yamaguchi A. etal. Antitumor activity of ER-37328, a novel carbazole topoisomerase II inhibitor// Mol. Cancer Ther. -2002. - Vol. 1, N3.-P. 169-175.

102. Negri C., Ide T., Anzai K. etal. Supercoiled DNA folded by nonhistone proteins in cultured mouse carcinoma cells // 1995. - Vol. 84, N1.-P. 145-157.

103. NgS.W., Liu Y., Hasselblatt K.T. etal. A new human topoisomerase III that interacts with SGS1 protein // Nucl. Acid Res. - 1999. - Vol. 27, N 4. - P. 993-1000.

104. Nitiss J.L. Using yeast ti study resistance to topoisome rase ll-targeting drugs // Cancer emother. Pharmacol. —

1994. - Vol. 34 (Suppl). S6-S13.

105. Nitiss J.L. Roles of DNA topoisomerases in hromosomal replication and segregation // Adv. Pharmacol. — 1994. — Vol. 29A. - P. 103-134.

106. Nitiss J.L., Liu Y.X., Hsiung Y. A temperature sensitive topoisomerae II allele confers temperature dependent drug resistance on amsacrine and etoposide: a genetic system

for determining the targets of topoisomerase II inhibitors // Cancer Res. - 1993. - Vol. 54, N 1,-P. 89-93.

107. Nitiss J.L., PourquierP., PommierY. Aclacinomycin A stabilizes topoisomerase I covalent complex // Biochem. —

1997. - Vol. 57, N 20. - P. 4564-4569.

108. Null A.P., Hudson J., Gorbsky G.J. Both alpha and beta isoform of mammalian DNA topoisomerase II assiciate with chromosomes in mitosis // Cell Growth Differ. — 2002. — Vol. 13, N7.- P. 325-333.

109. OsheroffN. Effect of antineoplastic agents on the DNA cleavage/religation equilibrium of eukaryotic topoisomerase II: inhibition of DNA religation by etoposide // Biochem. — 1989. - Vol. 28, N 23. - P. 6157-6160.

110. Osheroff N., Robinson M.J., Zechiedrich E.L. Mechanism of the topoisomerase ll-mediated DNA cleavage-religation reaction: inhibition of DNA religation by antineoplastic drugs / DNA London, topoisomerases in cancer. Oxford University Press. — 1991. — P. 312-324.

111. Padget K., Pearson A.D., Austin C.A. Quantitation of DNA topoisomerase lialpha and beta in human leukemia cells by immunoblotting // Leukemia. — 2000. — Vol. 14, N 11. —

P. 1997-2005.

112. Reece R.J., Maxwell A. DNA gyrase: structure and function// Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. — 1991. — Vol. 26, N 3-4. —

P. 335-375.

113. Ripley L.S. Deletion and duplication sequences induced in CHO cells by teniposide (VM-26) a topoisomerase II targeting drug, can be explained by the processing of DNA nicks produced by the drug-topoisomerase interaction // Mutat. Res. - 1994. - Vol. 312, N 2. - P. 67-78.

114. Robinson M.J., Corbet A.H., OsheroffN. Effects of quinolone derivatives on eukaryotic topoisomerase II. A novel mechanism for enhancement of enzyme-mediated DNA cleavage // Biochemistry. — 1993. — Vol. 32,

N 22. - P. 3638-3643.

115. Roca J., Ishida R., Berger J.M., Andoh T. etal. Antitumor bisdi-oxopiperazines inhibit yeast DNA topoisomerase II by trapping the enzyme in the form of the a closed protein clamp//

Proc, Natl. Acad. Sci. - 1994. - Vol. 91, N5.-P. 1781-1785.

116. RofflerS.R., ChanJ., YehM.Y. Potentiation of radio-immunotherapy by inhibition of topoisomerase I // Cancer Res. - 1994. - Vol. 54, N 5. - P. 1276-1285.

117. Pommier Y. DNA topoisomerase I and II in cancer chemotherapy: update and perspectives // Cancer Chemother. Pharmacol. - 1993. - Vol. 32, N 2. - P. 103-108.

118. Pommier Y., Kohlhagen G., Kohn K.W. etal. Interaction of an alkylating camptothecin derivative with a DNA base at topoisomerase l-DNA cleavage sites // Proc, Natl. Acad. Sci. - 1995. - Vol. 92, N 19. - P. 8861-8865.

119. PommierY. Cellular determinants of sensitivity and resistance to DNA topoisomerase inhibitors // Cancer Chemother. Pharmacol. — 1993. — Vol. 32. — P. 103-108.

120. PommierY. Topoisomerase inhibitors // Biochim. Biophys. Acta. - 1998. - Vol. 1400. - P. 83-106.

121. Porta C.L., Dolfini E., Comolli R. Inhibition of protein kinase C-a isoform enhances the P-glycoprotein expression and the survival of LoVo human colon adenocarcinoma cells to doxorubicin exposure // Br. J. Cancer. — 1998. —

Vol. 78, N 10. - P. 1283-1287.

122. Potmesil M., Kohn K.W. DNA topoisomerases in cancer/ Oxford University Press, New York, 1991. 530 p.

123. RowinskyE.K., GrochowL.B., Hendricks C.B. etal. Phase I and pharmacological studies of topotecan: a novel topoisomerase I inhibitor//J. Clin. Oncol. — 1992. —

Vol. 10.-P. 647-656.

124. Schlick T. Modelling superhelical DNA: recent analytical and dynamic approaches//Curr. Opin. Struct. Biol. —

1995. - Vol. 5, N2,- P. 245-262.

125. SinhaB.K. Topoisomerase inhibitors.A review of their therapeutic potential in cancer// Drugs. — 1995. —

Vol. 49, N 1,- P. 11-19.

126. Skibo E.B., Huang X., Martinez R. etal. Pirimidinoquina-zoline-based antitumor agents. Design of topoisomerase II

to DNA cross-linkers with activity against protein kinases //

J. Med. Chem. - 2002. - Vol. 45, N 25. - P. 5543-5555.

127. Snyder R.D.,Grdina P.J. Further evidence that the 139.

radioprotective aminothiol, WR-1065, catalytically

inactivates mammalian topoisomerase II // Cancer 140.

Research. - 2000. - Vol. 60, N5,- P. 1186-1188.

128. SolaryE., Bertrand R., Kohn K.W., Pommier Y. Differential induction of apoptosis in undifferentiated and differentiated 141. HL-60 cells by DNA topoisomerase I and II inhibitors //

Blood. - 1993. - Vol. 81, N5.- P. 1359-1368.

129. Solovyan V.T., BezvenyukZ.A., Salminen A. et al. The role

of topoisomerase II in the excision of DNA loop domains 142.

during apoptosis // J. Biol. Chem. — 2002. — Vol. 277,

N24. - P. 21458-21467.

130. Sorensen B.S., Sinding J., Andersen A.H. et al, Node of 143.

action of topoisomerase ll-targeting agents at a specific

DNA sequence. Uncoupling the DNA binding, cleavage and religation events //J. Mol. Biol. — 1992. — Vol. 228, N 3. —

P. 778-786. 144.

131. Soussi Т. P53 antibodies in the sera of patients with various types of cancer: A review// Cancer Res. — 2000. —

Vol. 60, N7.-P. 1777-1719. 145.

132. Sunami Т., Nishio K., Kauzawa F., Fukuoka K. et al.

Combination effects of TAS-103, a novel dual topoisomerase I and II inhibitors, with other anticancer agents on human small

cell lung cancer cells// Cancer Chemother. Pharmacol. — 146.

1999. - Vol. 43, N5.- P. 394-401.

133. Strumberg D., NitissJ.L., Rose A., Nicklaus M.C. etal.

Mutation of a conversed serine residue in a quinolone- 147.

resistant type II topoisomerase alters the enzyme-DNA and drug interactions // J. Biol. Chem. — 1999. — Vol. 274,

N 11,- P. 7292-7301. 148.

134. Tateno H., Kamiguchi Y. Abnormal chromosome migration and chromosome aberrations in mouse oocytes during meiosis II in the presence of topoisomerase II inhibitor ICRF-193 //Mut. Res. - 2002. - Vol. 502, N 1-2. - P. 1-9.

135. Thilmann H.N., Popanda O. Doxorubicin ana gamma raus 149.

increase the level of DNA topoisomerase lialpha in nuclei of normal and xeroderma pigmentosum fibroblasts // J. Cancer

Res. Clin. Oncol. - 1998. - Vol. 124, N7.-P. 355-366.

136. Waddick K.G., Uekun F.M. Innovative treatment programs 150.

against cancer I. Ras oncoprotein as a molecular target// Biochem. Pharmacology. — 1998. — Vol. 56, N 11. —

P. 1411-1426.

137. Walker J.A., Nitiss J.L. DNA topoisomerase II as a target for 151. cancer chemotherapy // Cancer Invest. — 2002. — Vol. 20,

N4.- P. 570-589.

138. Willmott C.J., Maxwell A. A single point mutation in DNA-gyraseA protein greatly reduces binding of fluoroquinolones

to the gyrase-DNA complex //Antimicrob.Agents Chemother. - 1993. - Vol. 37, N1,-P. 126-127.

WangJ.C. DNA topoisomerases // Annu. Rev. Biochem. —

1996. - Vol. 65. - P. 635-692.

Wang J.C. Cellular roles of DNA topoisomerases: a molecular perspective // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. —

2002. - Vol. 3, N6,- P. 430-440.

Wang X., Zhon X., Hecht S.M. Role of the 20-hydroxyl groups in camptothecin binding by the topoisomerase I-DNA binary complex // Biochemistry. — 1999. — Vol. 31,

N 14. - P. 4374-4381.

Wang Y., Van Ness B. Site-specific cleavage of supercoiled DNA by ascorbate/Cu[ll] // Nucl. Acid Res. — 1989. —

Vol. 17, N 17.-P. 6915- 6926.

Wang Y., Rea T., Bian J., GrayS., Sun Y. Identification of the genes resposive to etoposide-induced apoptosis: application of DNA chip technology // FEBS Lett. —

1999. - Vol. 445, N 2-3. - P. 269-273.

Watt P.M., Hickson I.D. Structure and function of type II DNA topoisomerases // Biochem. J. — 1994. —

Vol. 303, N3,- P. 681-695.

Weigel L.M., Anderson G.L., Tenover F.C. DNA gyrase and topoisomerase IY mutations associated with fluoroquinolone resistance in Proteus mirabilis // Antimicrob. Agents Chemother. - 2002. - Vol. 46, N 8. - P. 2582-2587.

Wigley D.B. Structure and mechanism of DNA topoisomerases // Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. —

1995. - Vol. 24. - P. 185-208.

Williams N.L., Maxwell A. Probing the two-gate mechanism of DNA gyrase using cysteine cross-linking //

Biochemistry. - 1999. - Vol. 38, N41. - P. 13502-13511. Willmor E. Etoposide targets topoisomerase lialpha and libeta in leukemic cells: isoform-specific cleavable complexes visualized and quatified in situ by a novel immunofluorescence technique // Mol. Pharmacol. —

1998. - Vol. 54, N 1,- P. 78-85.

Yao S., Murali D., Seetharamulu P. et al. Topotecan lactone selectively binds to double- and single-stranded DNA in the absense of topoisomerase I// Cancer Res. — 1998. —

Vol. 58, N17,- P. 3782-3786.

Yoshida H., BogakiM., Nakamura M., Yamanaka L.M. etal. Quinolone resistance-determining region in the DNA gyrase gyrB gene of Escherichia coli // Antimicrob. Agents Chemother. - 1991. - Vol. 35, N 8. - P. 1647-11650. Yuwen H., Hsia C.C., Nakashiura Y., Evangelista A. etal. Binding of mild-type p53 by topoisomerase II and overexpression of topoisomerase II in human hepatocellular carcinoma // Biochem. Biophys. Res.

Comm. - 1997. - Vol. 234, N 1. — P. 194-197.