СПОСОБ ИНДУКЦИИ АПОПТОТИЧЕСКОЙ ГИБЕЛИ КЛЕТОК МЕЛАНОМЫ КОЖИ
METHOD OF INDUCING APOPTOTIC DEATH OF SKIN MELANOMA CELLS

Изобретение относится к медицине, в частности к дерматологии, и может применяться в диагностике и терапии меланомы кожи.
Известно, что одним из наиболее перспективных методов терапии меланомы кожи является применение ингибиторов МАРК-киназного сигнального механизма. Мутагенная активация МАРК киназного пути наблюдается более чем в 90% меланом, и наиболее часто активация происходит через мутации генов NRAS или BRAF [Atkins М.В., Elder D.E., Essner R., et al. Innovations and challenges in melanoma: summary statement from the first Cambridge conference. Clinical Cancer Research 2006; 12:2291-6; Hingorani S.R., Jacobetz M.A., Robertson G.P. et al. Suppression of BRAF(V599E) in human melanoma abrogates transformation. Cancer Research 2003;63:5198-202]. Наиболее эффективными из ингибиторов МАРК сигнального пути признаны ингибиторы МЕК-киназы, в частности, один из наиболее специфичных ингибиторов U0126 используется для индукции гибели клеток меланомы и для селективного и системного лечения меланомы кожи (US patent 7612035 F:\patent\MAPK_mel.htm). Недостатком данного способа является отсутствие эффекта на процессы клеточной пролиферации (не отмечалось снижения уровня пролиферации) в клеточных линиях, имеющих дикий тип гена BRAF и N-Ras.
Наиболее близким к предлагаемому является способ, использующий периферические бензодиазепиновые рецепторы (ПБР или Translocator Protein, TsPO) в качестве патогенетической мишени для снижения пролиферации клеток опухоли. В частности, использовался специфический лиганд TsPO РК111195, который показал свою эффективность в качестве ингибитора пролиферации опухолевых клеток (на примере клеточной линии рака молочной железы) в микромолярной концентрации (US patent 7267977 F:\patent\BZ_3.htm). Кроме того, РК111195 является нетоксичным, что выгодно отличает его от других химиотерапевтических препаратов. Однако современные схемы терапии меланомы, как правило, включают несколько терапевтических мишеней для более эффективного воздействия на уровень пролиферации и апоптоза. А в поисковых источниках не рассматривалась возможность комбинированного подхода к терапии.
Задача предлагаемого способа - повышение уровня апоптотической гибели клеток меланомы кожи.
Поставленную задачу решают за счет того, что методом ТТДРФ анализа определяют наличие мутации гена BRAF V600E у пациента с меланомой кожи и при ее наличии для индукции апоптоза дополнительно с РК11195 используют ингибитор МЕК киназы U0126 в концентрации: РК11195 10 nmol/L, UO12610 µmol/L.
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.
Определяют BRAF статус у пациента с меланомой кожи, при этом используют разновидность Полимеразной цепной реакции (ПЦР) - ПДРФ анализ. Далее используют человеческую культуру клеток меланомы кожи SK-MEL-1 (American Type Cells Collection), имеющую мутацию гена BRAF V600E для экспериментальной комбинированной терапии, включающей в себя использование ингибиторов МАРК киназного сигнального пути: в частности, ингибиторов МЕК киназы UO 126 в концентрации 10 µmol/L и лиганда РК11195 в концентрации 10 nmol/L.
Предлагаемый способ иллюстрируется следующим примером.
Определяли BRAF статус 27 пациентов с меланомой кожи Красноярского краевого онкологического диспансера. Для этого биоптаты меланомы кожи после хирургического иссечения опухоли подвергали фиксации для получения гистологических срезов. Из полученных срезов далее проводили выделение ДНК с использованием комплекта реагентов ДНК-сорб В (AmpliSens, ФГУН ЦНИИЭ Ростпотребнадзора). Для выявления мутации использовали метод определения полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ анализ, RFLP-restriction fragment length polymorphism), описанный Nagasaka Т. et al. [J Clin Oncol 22:4584-4594]. Праймеры Mt-F, Wt-R и Mt-R (ООО «Сибэнзим», Новосибирск) были созданы для представления сайта рестрикции Btsl (BioLabs, New England) в диком аллеле для анализа гена BRAF V600E. Амплификацию проводили на амплификаторе BIS Termocycler в объеме 25 мкл, содержащем ПЦР буфер, 1.5 ммоль/л MgCl2 (ФГУН ЦНИИЭ Ростпотребнадзора), 0.2 мкмоль/л каждого праймера Mt-F и Wt-R, 0.1 ммоль/л dNTPs (5х dNTPs mix, ФГУН ЦНИИЭ Ростпотребнадзора), 0.625 единицы TaqF полимеразы (ФГУН ЦНИИЭ Ростпотребнадзора) и 50 нг выделенной ДНК. Условия ПНР были следующими: 95°С - 11 мин и 30 циклов: 95°С - 30 сек, 58°С - 30 сек, 72°С - 30 сек и 5 мин при 72°С. Полученные ампликоны переосаждали по стандартной методике и подвергали рестрикции с помощью рестриктазы Btsl при температуре 55°С в течение 6 часов. Далее проводили второй этап анализа со второй парой праймеров Mt-F и Mt-R в тех же условиях. После амплификации продукты второго этапа ПНР переосаждались и подвергали рестрикции в тех же условиях. В случае присутствия мутации гена BRAF V600E продукты ПЦР массой 130 нуклеотидных пар (base pair, bp) разрезались на фрагменты массой 112 и 18 нуклеотидных пар, в случае отсутствия данной мутации продукты рестрикции были следующие: 78, 34 и 18 нуклеотидных пар.
В результате путем использования ПДРФ анализа для определения мутации гена BRAF V600E мы выявили мутацию у 26 (96%) из 27 пациентов с меланомой кожи. Мутация отсутствовала лишь в 1 случае (4%). Кроме того, меланомы были гетерозиготными, т.е. продукты амплификации разрезались на фрагменты 112 и 18 bp, что говорит о присутствии мутации, и в то же время после амплификации со второй парой праймеров продукты ПЦР рестрицировались на фрагменты 78, 34 и 18 bp, что говорит о ее отсутствии. Либо были гомозиготные образцы, и в результате рестрикции получались фрагменты лишь 112 и 18 bp. Учитывая то, что данная мутация является активирующей, даже в случае гетерозиготного генотипа происходит активация сигнального каскада МАРК, что приводит к неограниченной пролиферации меланоцитов.
2
2
6
Далее на втором этапе работы для демонстрации преимуществ комбинированной терапии UO 126 и РК11195 мы использовали человеческую культуру клеток меланомы кожи SK-MEL-1 (АТСС). Данная культура меланомы кожи имеет мутацию BRAF V600E, что было подтверждено результатами ПДРФ анализа. Клетки выращивали в среде RPMI 1640 с 10% содержанием фетальной бычьей сыворотки с добавлением 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,25 мкг/мл амфотерицина при 37°С в СО инкубаторе (5% СО). Клетки рассеивали в чашки Петри с плотностью 2-4*10 кл/мл за 24 часа до начала эксперимента. К суспензии клеток добавляли TsPO лиганд РК11195 (Sigma) в концентрации 10 µmol/L, 100 nmol/L и 10 nmol/L. Отдельно к суспензии клеток добавляли блокатор МАРК - U0126 (Sigma) в концентрации 10 и 50 µmol/L. И, кроме того, проводили инкубирование суспензии клеток одновременно блокатором МАРК U0126 и лигандом РК111195, в концентрациях 10 µmol/L и 10 nmol/L соответственно. Для сравнения брали контрольную группу, в которой клетки оставляли без терапии. Через 72 часа осуществляли центрифугирование клеток контрольной и опытных групп в течение 10 минут со скоростью 1,5 тыс/об, клеточный осадок промывали в холодном фосфатно-солевом буфере.
Для оценки эффективности терапии оценивали выраженность апоптоза, уровень пролиферации. Для оценки уровня апоптоза использовали окраску акридиновым оранжевым/бромистым этидием (Gerbu Biothechnick GmbH, MP Biomedicals Inc.). Определяли процент апоптотических клеток, их ядра окрашивались в оранжевый цвет. Ядра живых клеток окрашивались в зеленый цвет. Визуализацию проводили с помощью флюоресцентного микроскопа Primo Star (Carl Zeiss MicroImaging GmbH), подсчитывали число апоптотических клеток на 100 визуализируемых клеток.
Для оценки уровня пролиферативной активности клеток проводили иммуноцитохимическое окрашивание с антителами к PCNA (маркер пролиферации). Для этого после промывания клетки переносили на стекла и высушивали в парах формалина для фиксации в течение 30 минут. После этого проводили окрашивание с моноклональными антителами к PCNA (Novocastra, разведение 1:200).
В результате после инкубации клеток меланомы с РК11195 и с U0126 во всех концентрациях наблюдали повышение уровня апоптоза в 5 и 6 раз соответственно, регистрируемого как появление оранжевой окраски ядра (Табл.2, 3). В случае комбинации РК11195 и U0126 происходило более интенсивное повышение числа апоптоз-положительных клеток в 8 раз (40% апоптотических клеток) (Табл.3). Полученные данные говорят о значимом преимуществе сочетанного применения РК111195 и U0126, данные терапевтические агенты синергетически активируют апоптоз, при самых минимальных концентрациях.
Таблица 1
Показатели уровня апоптоза в клетках меланомы после инкубации с РК11195 и UO126
Контроль
После инкубации UO126 в концентрации
После инкубации РК11195 в концентрации
10 µmol/L
50 µmol/L
10 nmol/L
100 nmol/L
10 µmol/L
Число апоптоз-положительных клеток, %
5
33**
14,7*
24*
26*
26,6*
Примечание: После инкубации с лигандом РК111195 во всех концентрациях происходило достоверное повышение уровня апоптоза в 5 раз во всех концентрациях в сравнении с показателями контрольной. После инкубации с U0126 в концентрации 10 µmol/L наблюдали повышение уровня апоптоза в 6 раз.
* - отличия от значения контрольной группы достоверны (р<0,001).
Примечание: После инкубации с U0126 в концентрации 10 µmol/L наблюдали повышение уровня апоптоза в 6 раз и регистрировали снижение экспрессии PCNA, при этом более выраженный эффект снижения экспрессии маркера клеточной пролиферации в 3-3,5 раза наблюдался после инкубации с U0126 в концентрации 50 µmol/L.
* отличия от значения контрольной группы достоверны (р<0,05).
** отличия от значения контрольной группы достоверны (р<0,001).
Таблица 2
Уровни апоптоза, пролиферации и TsPO в клетках меланомы после инкубации с РК111195 и UO126
Контроль
РК11195+UO12610 nmol/L и 10 µmol/L
Число апоптоз-положительных клеток, %
5
40**
Число PCNA<sup>+ </sup>клеток, %
80
62*
Примечание: В группе сочетанного применения РК11195 и U0126 происходило более интенсивное повышение числа апоптоз-положительных клеток в 8 раз (40% апоптотических клеток). Уровень клеточной пролиферации снижался, но лишь на 25%.
* - отличия от значения контрольной группы достоверны (р<0,05).
** отличия от значения контрольной группы достоверны (р<0,001).
При определении уровня клеточной пролиферации также отмечался положительный эффект после инкубации как с РК11195, так и с U0126. Регистрировали снижение экспрессии PCNA, что определяли как достоверное уменьшение количества положительно-окрашенных клеток (Табл.1, 2). При этом более выраженный эффект снижения экспрессии маркера клеточной пролиферации в 3-3,5 раза наблюдался после инкубации с U0126 в концентрации 50 µmol/L и после инкубации с РК111195 в концентрации 10 µmol/L и 100 nmol/L. В группе сочетанного применения данных терапевтических агентов в более низких концентрациях (10 µmol/L и 10 nmol/L) также происходило снижение экспрессии, но лишь на 25%, что сопоставимо с результатами, полученными после монотерапии РК11195 и U0126 (Табл.1, 2, 3).
Таблица 3
Уровень пролиферации в клетках меланомы после инкубации с РК111195 и UO126
Контроль
После инкубации UO126 в концентрации
После инкубации РК111195 в концентрации
10 µmol/L
50 µmol/L
10 nmol/L
100 nmol/L
10 µmol/L
Число PCNA<sup>+</sup> клеток, %
80
59*
24*
62*
28*
22**
Примечание: После инкубации с лигандом РК11195 во всех концентрациях происходило достоверное снижение экспрессии PCNA во всех концентрациях в сравнении с показателями контрольной группы. При этом более выраженный эффект снижения экспрессии маркера клеточной пролиферации в 3-3,5 раза наблюдался после инкубации с РК11195 в концентрации 10 µmol/L и 100 nmol/L.
После инкубации с U0126 в концентрации 10 µmol/L регистрировали снижение экспрессии PCNA, при этом более выраженный эффект снижения экспрессии маркера клеточной пролиферации в 3-3,5 раза наблюдался после инкубации с U0126 в концентрации 50 µmol/L.
* отличия от значения контрольной группы достоверны (р<0,05).
** отличия от значения контрольной группы достоверны (р<0,001).
Таким образом, предлагаемый способ индукции апоптотической гибели клеток меланомы кожи позволяет эффективно воздействовать на процессы апоптоза и клеточной пролиферации меланомы кожи, что влияет на эффективность терапии в целом.